ES3040723T3

ES3040723T3 - Perfusion culturing methods and uses thereof

Info

Publication number: ES3040723T3
Application number: ES15731177T
Authority: ES
Inventors: Agata Villiger-Oberbek; Jianguo Yang; Yang Yang; Gabrielle Lornzo
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2014-06-06
Filing date: 2015-06-05
Publication date: 2025-11-04
Anticipated expiration: 2035-06-05
Also published as: RU2708919C2; MX2016016142A; RU2019138327A; WO2015188106A2; JP7350810B2; TW202204596A; AU2021205004A1; US20210324328A1; US20240287451A1; EP3152293B1; RU2016152238A3; KR102611855B1; BR112016028512A8; US12006510B2; US20160017280A1; EP3152293A2; SG11201610167WA; IL249384A0; EP3152293C0; TW201614062A

Abstract

Aquí se describen métodos de cultivo de células de mamíferos y diversos métodos que utilizan dichos métodos de cultivo. También se proporcionan placas de cultivo celular de pocillos múltiples, por ejemplo, para su uso en métodos de cultivo por perfusión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de cultivo en perfusión y usos de los mismos

CAMPO TÉCNICO

[0001]Esta invención se refiere a métodos de biología molecular, a desarrollo de procesos de cultivo celular, y a fabricación de proteínas recombinantes.

ANTECEDENTES

[0002]Las células de mamífero que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante se utilizan a menudo para producir proteínas terapéutica o comercialmente importantes. Aunque durante años se han utilizado varios sistemas de cultivo celular de alto rendimiento (HT) dentro de la industria biotecnológica para procesos por lotes alimentados, no se sabe que exista ningún modelo de HT para un cultivo celular basado en perfusión que utilice una placa de múltiples pocillos.

SUMARIO

[0003]La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que cultivar una célula de ovario de hámster chino (CHO) en una placa de múltiples pocillos de la manera específica descrita en el presente documento da como resultado una densidad de células viables y producción de proteína recombinante sustancialmente mejoradas, y proporciona un modelo preciso del rendimiento del cultivo en biorreactores de producción de perfusión a gran escala. En vista de este descubrimiento, en el presente documento se proporcionan métodos para cultivar una célula CHO, métodos para producir una proteína recombinante y métodos para probar un procedimiento de fabricación para fabricar una proteína recombinante. También se proporcionan, pero no abarcados por las reivindicaciones, sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos que se pueden utilizar, por ejemplo, para realizar cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.

[0004]En el presente documento se proporcionan métodos de perfusión para cultivar una célula de ovario de hámster chino (CHO) que incluyen: proporcionar una placa de múltiples pocillos que incluye al menos un pocillo que contiene una célula CHO dispuesta en un primer medio de cultivo líquido, en el que el primer medio de cultivo líquido ocupa aproximadamente el 5% aaproximadamente el 70%del volumen del pocilio; incubar la placa de múltiples pocillos durante un período de tiempo a aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C y con una agitación rotatoria de aproximadamente 320 revoluciones por minuto (RPM) a aproximadamente 500 RPM; y continuamente, durante el período de tiempo, retirar un primer volumen del primer medio de cultivo líquido y añadir al primer medio de cultivo líquido un segundo volumen de un segundo medio de cultivo líquido, en donde el primer volumen del primer medio de cultivo líquido retirado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido son aproximadamente iguales, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido está sustancialmente libre de células CHO, y el método da como resultado una densidad de células viables de entre 15 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml en el pocillo. En algunas realizaciones de estos métodos, la célula CHO contiene un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante (por ejemplo, una inmunoglobulina, una enzima, un factor de crecimiento, un fragmento de proteína, o una proteína modificada por ingeniería genética).

[0005]También se proporcionan métodos para producir una proteína recombinante que incluyen: proporcionar una placa de múltiples pocillos que incluye al menos un pocillo que contiene una célula CHO dispuesta en un primer medio de cultivo líquido, donde el primer medio de cultivo líquido ocupa aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 70 % del volumen del pocillo y la célula CHO contiene un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante; incubar la placa de múltiples pocillos durante un período de tiempo a aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C y con una agitación rotatoria de aproximadamente 320 revoluciones por minuto (RPM) a aproximadamente 500 RPM; continuamente, durante el período de tiempo, retirar un primer volumen del primer medio de cultivo líquido y añadir al primer medio de cultivo líquido un segundo volumen de un segundo medio de cultivo líquido, en donde el primer volumen del primer medio de cultivo líquido retirado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido gregado son aproximadamente iguales, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido está sustancialmente libre de células CHO, y el método da como resultado una densidad de células viables de entre 15 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml en el pocillo; y recuperar la proteína recombinante de la célula CHO o del primer o segundo medio de cultivo. En algunas realizaciones de estos métodos, la proteína recombinante (por ejemplo, una inmunoglobulina, una enzima, un factor de crecimiento, un fragmento proteico, o una proteína modificada por ingeniería genética) se recupera de la célula CHO. En algunas realizaciones de estos métodos, la proteína recombinante (por ejemplo, una inmunoglobulina segregada, una enzima segregada, un factor de crecimiento segregado, un fragmento proteico segregado, o una proteína modificada por ingeniería genética segregada) se recupera del primer o segundo medio de cultivo líquido.

[0006]También se proporcionan métodos para probar un procedimiento de fabricación para fabricar una proteína recombinante que incluyen: proporcionar una placa de múltiples pocillos que incluye al menos un pocillo que contiene una célula CHO dispuesta en un primer medio de cultivo líquido, donde el primer medio de cultivo líquido ocupa aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 70 % del volumen del pocilio y la célula CHO contiene un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante; incubar la placa de múltiples pocilios durante un período de tiempo a aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C y con una agitación rotatoria de aproximadamente 320 revoluciones por minuto (RPM) a aproximadamente 500 RPM; continua o periódicamente, durante el período de tiempo, retirar un primer volumen del primer medio de cultivo líquido y añadir al primer medio de cultivo líquido un segundo volumen de un segundo medio de cultivo líquido, en donde el primer volumen del primer medio de cultivo líquido retirado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido gregado son aproximadamente iguales, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido está sustancialmente libre de células CHO, y el método da como resultado una densidad de células viables de entre 15 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml en el pocillo; detectar la proteína recombinante en la célula CHO o en el primer o segundo medio de cultivo líquido; y comparar la cantidad de proteína recombinante presente en la célula CHO o en el primer o segundo medio de cultivo líquido con un nivel de referencia de proteína recombinante. En algunas realizaciones de estos métodos, el nivel de referencia de proteína recombinante es un nivel de proteína recombinante producido utilizando un método de cultivo diferente. En algunas realizaciones de estos métodos, el método de cultivo diferente utiliza un primer o segundo medio de cultivo líquido diferente, una temperatura diferente, un nivel diferente de agitación, o una placa de múltiples pocillos diferente. En algunas realizaciones de estos métodos, el método de cultivo diferente utiliza diferentes materias primas, agentes antiaglomerantes, o medios de cultivo líquidos definidos químicamente. En algunas realizaciones, estos métodos se pueden utilizar, por ejemplo, para realizar experimentos de cultivo celular de alto rendimiento para realizar un estudio de diseño de experimento (DOE) o de calidad por diseño (QDB). En algunas realizaciones de estos métodos, la proteína recombinante (por ejemplo, una inmunoglobulina segregada, una enzima segregada, un factor de crecimiento segregado, un fragmento de proteína segregada, o una proteína modificada segregada) se detecta en el primer o segundo medio de cultivo líquido. En algunas realizaciones de estos métodos, la proteína recombinante (por ejemplo, una inmunoglobulina, una enzima, un factor de crecimiento, un fragmento proteico, o una proteína modificada por ingeniería genética) se detecta en la célula.

[0007]En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido está sustancialmente libre de células CHO. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el primer medio de cultivo líquido ocupa aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 60 % del volumen del pocillo. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en este documento, la agitación rotatoria es de aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 400 RPM. En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la eliminación del primer volumen del primer medio de cultivo líquido y la adición del segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido se realiza simultáneamente. En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la eliminación del primer volumen del primer medio de cultivo líquido y la adición del segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido se realiza de forma continua. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido aumentan con el tiempo.

[0008]En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la placa de múltiples pocillos se incuba durante un período de tiempo superior a 7 días, y en los días 1 a 3 de incubación, en cada período de 24 horas, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido está entre aproximadamente 30 % y aproximadamente 50 % del volumen del primer medio de cultivo líquido; en los días 4 a 6 de incubación, en cada período de 24 horas, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido está entre aproximadamente el 40 % y aproximadamente el 70 % del volumen del primer medio de cultivo líquido; y a partir del día 7 de incubación, en cada período de 24 horas, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido está entre aproximadamente el 90% y aproximadamente el 150% del volumen del primer medio de cultivo líquido. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en este documento, el pocillo tiene un volumen de entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 18 ml (por ejemplo, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 7 ml o entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 3,5 ml). En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la placa de múltiples pocillos es una placa de 6 pocillos, una placa de 12 pocillos, una placa de 24 pocillos, una placa de 48 pocillos o una placa de 96 pocillos. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la placa de múltiples pocillos es una placa de pocillo profundo. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el diámetro del fondo del pocillo está entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 35 mm (p. ej., de aproximadamente 12 mm a aproximadamente 50 mm). En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la altura del pocillo es de aproximadamente 12 mm a aproximadamente 50 mm. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la célula CHO se suspende en aproximadamente 150 gl a aproximadamente 15 ml (por ejemplo, de aproximadamente 150 gl a aproximadamente 10 ml, de aproximadamente 150 gl a aproximadamente 5 ml, o de aproximadamente 150 gl a aproximadamente 150 gl) del primer medio de cultivo.

[0009]En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el primer medio de cultivo líquido y/o segundo medio de cultivo líquido se selecciona del grupo que consiste en: un medio de cultivo líquido químicamente definido, un medio de cultivo líquido sin suero, un medio de cultivo líquido que contiene suero, un medio de cultivo líquido libre de componentes derivados de animales, y un medio libre de proteínas. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, después de aproximadamente las primeras 24 a 48 horas del período de tiempo, en cada período de 24 horas, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido es de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 150 % del volumen del primer medio de cultivo líquido. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la agitación se interrumpe durante un período de tiempo de al menos 30 segundos antes de eliminar el primer volumen del primer medio de cultivo líquido. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la placa de múltiples pocillos se sella con una membrana desechable permeable a gas o una capa de silicona permeable a gas. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en este documento, el pocillo tiene un fondo plano o un fondo redondo.

[0010]Algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento incluyen además añadir periódicamente un volumen adicional de segundo medio de cultivo líquido a cada uno de la pluralidad de pocillos con el fin de compensar cualquier disminución en el volumen del primer medio de cultivo líquido debido a la evaporación. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la eliminación del primer volumen del primer medio de cultivo líquido y la adición al primer medio de cultivo líquido del segundo volumen del medio de cultivo líquido se realiza utilizando un dispositivo automatizado. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la placa de múltiples pocillos es cualquiera de los sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en este documento, el método da como resultado una densidad de células viables de entre 15 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml en el pocillo.

[0011]También se proporcionan métodos para cultivar una célula CHO, que incluyen: cultivar en un procedimiento de perfusión en gradiente una célula CHO suspendida en un medio de cultivo líquido dispuesto dentro de un pocillo de una placa de múltiples pocillos en condiciones que generan en el medio una fuerza de cizallamiento del fluido y una concentración de oxígeno disuelto (O2) que es esencialmente la misma que se logra en un medio que ocupa de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 25 % del volumen de un pocillo de fondo cuadrado que tiene un diámetro de entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 35 mm y una altura de entre aproximadamente 40 mm y aproximadamente 50 mm, cuando el pocillo de fondo cuadrado se incuba a una temperatura de aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C, y se agita rotatoriamente a una frecuencia de aproximadamente 320 revoluciones por minuto (RPM) a aproximadamente 360 RPM. En algunas realizaciones de estos métodos, la célula de ovario de hámster chino (CHO) es una célula CHO que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante (por ejemplo, una inmunoglobulina, una enzima, un factor de crecimiento, un fragmento de proteína, o una proteína modificada por ingeniería genética)).

[0012]También se proporcionan métodos para producir una proteína recombinante, que incluyen: cultivar en un procedimiento de perfusión en gradiente una célula CHO suspendida en un medio de cultivo líquido dispuesto dentro de un pocillo de una placa de múltiples pocillos en condiciones que generan en el medio una fuerza pura fluida y una concentración de oxígeno disuelto (O2) que es esencialmente la misma que se logra en un medio que ocupa de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 25 % del volumen de un pocillo de fondo cuadrado que tiene un diámetro de entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 35 mm y una altura de entre aproximadamente 40 mm y aproximadamente 50 mm, cuando el pocillo de fondo cuadrado se incuba a una temperatura de aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C, y se agita rotatoriamente a una frecuencia de aproximadamente 320 revoluciones por minuto (RPM) a aproximadamente 360 RPM, y recuperar la proteína recombinante de la célula CHO o del medio de cultivo líquido. En algunas realizaciones de cualquiera de estos métodos, la proteína recombinante (por ejemplo, una inmunoglobulina, una enzima, un factor de crecimiento, un fragmento proteico, o una proteína modificada por ingeniería genética) se recupera de la célula CHO. En algunas realizaciones de cualquiera de estos métodos, la proteína recombinante (por ejemplo, una inmunoglobulina segregada, una enzima segregada, un factor de crecimiento segregado, un fragmento de proteína segregada, o una proteína modificada segregada) se recupera del medio de cultivo líquido.

[0013]En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la placa de múltiples pocillos se selecciona de una placa de 6 pocillos, una placa de 12 pocillos, una placa de 24 pocillos, una placa de 48 pocillos o una placa de 96 pocillos. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la placa de múltiples pocillos es una placa de pocillo profundo. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el medio de cultivo líquido se selecciona del grupo que consiste en: un medio de cultivo líquido químicamente definido, un medio de cultivo líquido sin suero, un medio de cultivo líquido que contiene suero, un medio de cultivo líquido libre de componentes derivados de animales, y un medio libre de proteínas. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la placa de múltiples pocillos se sella con una membrana desechable permeable a gas o una capa de silicona permeable a gas. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la placa de múltiples pocillos comprende pocillos que tienen un fondo plano o un fondo redondo. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la placa de múltiples pocillos es uno de los sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en este documento, el cultivo da como resultado una densidad de células viables de entre 15 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml en el pocillo.

[0014]También se proporcionan sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos útiles para usar cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, que incluyen: una placa de soporte unitaria que incluye una primera superficie que incluye una pluralidad de aberturas; una pluralidad de recipientes de cultivo dispuestos dentro de la placa de soporte y configurados para albergar cultivos celulares que tienen un volumen de entre aproximadamente 200 gl y aproximadamente 18 ml de volumen, en donde cada abertura se empareja con y define una abertura en cada recipiente de cultivo, y en donde cada recipiente de cultivo incluye además al menos un puerto configurado para acomodar un flujo de fluido dentro y/o fuera del recipiente de cultivo. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, la placa de soporte unitaria está configurada para incluir un depósito para alojar y suministrar líquido al puerto. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el recipiente de cultivo incluye al menos el primer y segundo puertos, en donde el primer puerto está configurado para acomodar un flujo unidireccional de fluido en el recipiente de cultivo y el segundo puerto está configurado para acomodar un flujo unidireccional de fluido fuera del recipiente de cultivo. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el puerto incluye un filtro configurado para evitar selectivamente que las células fluyan dentro y fuera del recipiente de cultivo. En algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento, el primer y segundo puertos comprenden cada uno un filtro configurado para evitar selectivamente que las células fluyan dentro y fuera del recipiente de cultivo. Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en el presente documento incluyen además al menos un conducto dispuesto dentro de la placa de soporte unitaria y en conexión fluida con el puerto, en donde el conducto está configurado para fluir fluido hacia y/o desde el recipiente de cultivo. Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en este documento incluyen además al menos un regulador de flujo de fluido conectado operativamente al menos a un puerto. Algunas realizaciones de cualquiera de los sistemas descritos en este documento incluyen además al menos un medidor de flujo de fluido conectado operativamente a al menos un conducto.

[0015]Tal como se utiliza aquí, la palabra "un" antes de un sustantivo representa uno o más de los sustantivos en particular. Por ejemplo, la frase "una célula de mamífero" representa "una o más células de mamífero".

[0016]La expresión "célula de mamífero" significa cualquier célula de o derivada de cualquier mamífero (p. ej., un ser humano, un hámster, un ratón, un mono verde, una rata, un cerdo, una vaca o un conejo). En algunas realizaciones, una célula de mamífero puede ser una célula inmortalizada. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula diferenciada. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula indiferenciada.

[0017]El término "día 0" significa el punto temporal en el que una célula de mamífero se siembra en el primer medio de cultivo líquido.

[0018]El término "día 1" significa un período de tiempo entre el día 0 y aproximadamente 24 horas después de la siembra de una célula de mamífero en el primer medio de cultivo líquido.

[0019]El término "día 2" significa un período de tiempo de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 48 horas después de la siembra de una célula de mamífero en el primer medio de cultivo líquido.

[0020]El término "día 3" significa un período de tiempo de aproximadamente 48 horas a aproximadamente 72 horas después de la siembra de una célula de mamífero en el primer medio de cultivo líquido.

[0021]El término "día 4" significa un período de tiempo de aproximadamente 72 horas a aproximadamente 96 horas después de la siembra de una célula de mamífero en el primer medio de cultivo líquido. El término para cada día adicional ("día 5", "día 6", "día 7", etc.) significa un período de tiempo que oscila durante un período adicional de aproximadamente 24 horas desde el final del día inmediatamente anterior.

[0022]El término "sustancialmente libre" significa una composición (por ejemplo, un medio de cultivo líquido) que está al menos o aproximadamente 90 % libre (por ejemplo, al menos o aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o al menos o aproximadamente 99 % libre, o aproximadamente 100 % libre) de una sustancia específica (por ejemplo, una célula de mamífero).

[0023]El término "volumen 0,5x" significa aproximadamente el 50 % del volumen. El término "volumen 0,6x" significa aproximadamente el 60 % del volumen. Del mismo modo, 0,7x, 0,8x, 0,9x y 1,0x significan aproximadamente el 70 %, 80 %, 90 % o 100 % del volumen, respectivamente.

[0024]El término "cultivo" o "cultivo celular" se refiere al mantenimiento o crecimiento de una célula de mamífero en un conjunto controlado de condiciones físicas.

[0025]El término "medio de cultivo líquido" significa un fluido que contiene suficientes nutrientes para permitir que una célula de mamífero crezcain vitro.Por ejemplo, un medio de cultivo líquido puede contener uno o más de: aminoácidos (p. ej., 20 aminoácidos), una purina (p. ej., hipoxantina), una pirimidina (p. ej., timidina), colina, inositol, tiamina, ácido fólico, biotina, calcio, niacinamida, piridoxina, riboflavina, timidina, cianocobalamina, piruvato, ácido lipoico, magnesio, glucosa, sodio, sulfato, sulfato de sodio, sulfato, sulfato de sodio, potasio, sulfato de hierro, sulfato de cobre, sulfato de zinc y bicarbonato de sodio. En algunas realizaciones, un medio de cultivo líquido puede contener suero de un mamífero. En algunas realizaciones, un medio de cultivo líquido no contiene suero u otro extracto de un mamífero (un medio de cultivo líquido definido). En algunas realizaciones, un medio de cultivo líquido puede contener oligometales, una hormona de crecimiento de mamífero y/o un factor de crecimiento de mamífero. En el presente documento se describen ejemplos no limitantes de medio de cultivo líquido. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de medio de cultivo líquido, y están disponibles comercialmente. Un medio de cultivo líquido puede contener cualquier densidad de células de mamífero. Por ejemplo, como se utiliza en el presente documento, un primer volumen del primer medio de cultivo eliminado del pocillo puede estar sustancialmente libre de células de mamífero.

[0026]La expresión "primer medio de cultivo líquido" significa un volumen de medio de cultivo líquido que es adecuado para el cultivo de una célula de mamífero.

[0027]La expresión "segundo medio de cultivo líquido" significa un volumen de medio de cultivo líquido que es adecuado para el cultivo de una célula de mamífero que está separado del volumen del primer medio de cultivo líquido antes de cualquier mezcla del primer y segundo medio de cultivo líquido.

[0028]La expresión "medio de cultivo líquido libre de componentes derivados de animales" significa un medio de cultivo líquido que no contiene ningún componente (p. ej., proteínas o suero) derivado de un mamífero.

[0029]La expresión "medio de cultivo líquido sin suero" significa un medio de cultivo líquido que no contiene el suero de un mamífero.

[0030]La expresión "medio de cultivo líquido que contiene suero" significa un medio de cultivo líquido que contiene un suero de mamífero.

[0031]La expresión "medio de cultivo líquido definido químicamente" significa un medio de cultivo líquido en el que se conocen todos los componentes químicos. Por ejemplo, un medio de cultivo líquido químicamente definido no contiene suero bovino fetal, seroalbúmina bovina o seroalbúmina humana, ya que estas preparaciones normalmente contienen una mezcla compleja de albúminas y lípidos.

[0032]La expresión "medio de cultivo líquido sin proteínas" significa un medio de cultivo líquido que no contiene ninguna proteína (p. ej., ninguna proteína detectable).

[0033]El término "agitación" significa el movimiento de una placa de múltiples pocillos que contiene al menos un pocillo que contiene un medio de cultivo líquido con el fin de aumentar la concentración de O2 disuelta en el medio de cultivo líquido. La agitación, tal como la agitación rotatoria, se puede realizar utilizando cualquier método conocido de la técnica, por ejemplo un instrumento que mueve la placa de múltiples pocillos en un movimiento circular o elipsoidal, tal como un agitador giratorio. En el presente documento se describen dispositivos ilustrativos que se pueden utilizar para agitar una placa de múltiples pocillos. También se conocen en la técnica ejemplos adicionales de dichos dispositivos, y están disponibles comercialmente.

[0034]El término "inmunoglobulina" significa un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de al menos 15 aminoácidos (p. ej., al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoácidos) de una proteína de inmunoglobulina (p. ej., una secuencia de dominio variable, una secuencia marco, o una secuencia de dominio constante). La inmunoglobulina puede incluir, por ejemplo, al menos 15 aminoácidos de una inmunoglobulina de cadena ligera, por ejemplo al menos 15 aminoácidos de una inmunoglobulina de cadena pesada. La inmunoglobulina puede ser un anticuerpo aislado (por ejemplo, una IgG, IgE, IgD, IgA o IgM). La inmunoglobulina puede ser una subclase de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). La inmunoglobulina puede ser un fragmento de anticuerpos, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, o un fragmento scFv. La inmunoglobulina también puede ser un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico, o un anticuerpo dímero, trímero o multímero, o un diacuerpo, un Affibody® o un Nanobody ®. La inmunoglobulina también puede ser una proteína modificada por ingeniería genética que contiene al menos un dominio de inmunoglobulina (por ejemplo, una proteína de fusión). Se describen en este documento ejemplos no limitantes de inmunoglobulinas, y se conocen ejemplos adicionales de inmunoglobulinas en la técnica.

[0035]El término "fragmento de proteína" o "fragmento de polipéptido" significa una porción de una secuencia polipeptídica que tiene al menos o aproximadamente 4 aminoácidos, al menos o aproximadamente 5 aminoácidos, al menos o aproximadamente 6 aminoácidos, al menos o aproximadamente 7 aminoácidos, al menos o aproximadamente 8 aminoácidos, al menos o aproximadamente 9 aminoácidos, al menos o aproximadamente 10 aminoácidos, al menos o aproximadamente 11 aminoácidos, al menos o aproximadamente 12 aminoácidos, al menos o aproximadamente 13 aminoácidos, al menos o aproximadamente 14 aminoácidos, al menos o aproximadamente 15 aminoácidos, al menos o aproximadamente 16 aminoácidos, al menos o aproximadamente 17 aminoácidos, al menos o aproximadamente 18 aminoácidos, al menos o aproximadamente 19 aminoácidos, o al menos o aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, o más de 20 aminoácidos de longitud. Se puede producir un fragmento de proteína recombinante utilizando cualquiera de los métodos descritos en este documento.

[0036]El término "proteína modificada por ingeniería genética" significa un polipéptido que no está codificado naturalmente por un ácido nucleico endógeno presente dentro de un organismo (por ejemplo, un mamífero). Los ejemplos de proteínas modificadas por ingeniería genética incluyen enzimas (por ejemplo, con una o más sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de aminoácidos que dan como resultado un aumento en la estabilidad y/o actividad catalítica de la enzima modificada por ingeniería genética), proteínas de fusión, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos divalentes, anticuerpos trivalentes, o un diacuerpo), y proteínas de unión a antígeno que contienen al menos una secuencia de andamiaje recombinante.

[0037]El término "fuerza de cizallamiento del fluido" significa una tensión causada por un líquido que fluye aproximadamente paralelo a una superficie (por ejemplo, una superficie de una célula o una superficie de un pocillo). La fuerza de cizallamiento del fluido se define generalmente como la fuerza aplicada dividida entre el área de sección transversal del material con el área paralela al vector de fuerza aplicado. En el presente documento se describen métodos ilustrativos para calcular la fuerza de cizallamiento del fluido, y se conocen en la técnica

[0038]La expresión "concentración de O2 disuelto" o "concentración de oxígeno disuelto" significa la cantidad de gas de oxígeno disuelto en un medio de cultivo líquido (por ejemplo, cualquiera de los medios de cultivo líquidos descritos en el presente documento o conocidos en la técnica). En el presente documento se describen métodos no limitativos para medir la concentración de O2 disuelto en un medio de cultivo líquido, y se conocen otros en la técnica

[0039]El término "recuperar" significa purificar o aislar parcialmente (p. ej., al menos o aproximadamente un 5 %, p. ej., al menos o aproximadamente un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o al menos o aproximadamente un 95 % pura en peso) una proteína recombinante de uno o más componentes presentes en el medio de cultivo celular (p. ej., proteínas de células de mamífero o del medio de cultivo) o uno o más otros componentes (por ejemplo, ADN, ARN u otras proteínas) presentes en un lisado de células de mamíferos. En el presente documento se describen métodos no limitativos para recuperar una proteína de un medio de cultivo líquido o de un lisado de células de mamífero, y se conocen otros en la técnica

[0040]El término "proteína segregada" o "proteína recombinante segregada" significa una proteína o una proteína recombinante que contenía originalmente al menos una secuencia señal de secreción cuando se traduce dentro de una célula de mamífero, y a través, al menos en parte, de la escisión enzimática de la secuencia señal de secreción en la célula de mamífero, se libera al espacio extracelular (por ejemplo, un medio de cultivo líquido).

[0041]La expresión "gradiente de perfusión" se refiere al cambio incremental (por ejemplo, aumento o disminución) en el volumen del medio de cultivo eliminado y añadido durante períodos incrementales (por ejemplo, un período de aproximadamente 24 horas, un período de entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 horas, o un período de más de 24 horas) durante el período de cultivo (por ejemplo, la tasa de realimentación del medio de cultivo diariamente). Por ejemplo, una realización de un procedimiento de perfusión en gradiente puede implicar protocolos de realimentación de la siguiente manera: días 1-3 realimentación de aproximadamente 0.5x volumen de reactor del medio de cultivo (RV)/día, días 4-6 realimentación de aproximadamente 0.7x RV/día, y día 7 y siguientes realimentación de aproximadamente 1.0x RV/día. Este ejemplo particular puede variar con respecto al número de días que tienen una determinada velocidad de realimentación y/o con respecto a la velocidad de realimentación durante un período particular de 24 horas. La fracción de medio eliminado y reemplazado cada día puede variar dependiendo de las células particulares que se cultivan, la densidad de siembra inicial y la densidad celular en un momento particular. "RV" o "volumen del reactor" significa el volumen del medio de cultivo presente al inicio del procedimiento de cultivo (por ejemplo, el volumen total del medio de cultivo presente después de la siembra).

[0042]La expresión "cultivo por lote alimentado" significa la adición incremental o continua de un segundo medio de cultivo líquido a un cultivo celular inicial sin eliminación sustancial o significativa del primer medio de cultivo líquido del cultivo celular. En algunas realizaciones de cultivo por lote alimentado, el segundo medio de cultivo líquido es el mismo que el primer medio de cultivo líquido. En algunas realizaciones de cultivo por lote alimentado, el segundo medio de cultivo líquido es una forma concentrada del primer medio de cultivo líquido. En algunas realizaciones de cultivo por lote alimentado, el segundo medio de cultivo líquido se añade como un polvo seco.

[0043]"Tasa de productividad específica" o "SPR", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la masa o actividad enzimática de una proteína recombinante producida por célula de mamífero al día. La SPR para un anticuerpo recombinante generalmente se mide como masa/célula/día. La SPR para una enzima recombinante generalmente se mide como unidades/célula/día o (unidades/masa)/célula/día.

[0044]"Tasa de productividad volumétrica" o "VPR", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la masa o actividad enzimática de la proteína recombinante producida por volumen de cultivo (por ejemplo, por l de volumen de biorreactor, recipiente o tubo) por día. La VPR para un anticuerpo recombinante generalmente se mide como masa/l/día. La VPR para una enzima recombinante generalmente se mide como unidades/l/día o masa/l/día.

[0045]El término "microportador" significa una partícula (por ejemplo, un polímero orgánico) que tiene un tamaño de entre 20 gm a aproximadamente 1000 gm que contiene una superficie que es permisiva o promueve la unión de una célula de mamífero (por ejemplo, cualquiera de las células de mamífero descritas en el presente documento o conocidas en la técnica). Un microportador puede contener uno o más poros (por ejemplo, poros con un diámetro promedio de aproximadamente 10 gm a aproximadamente 100 gm). Se describen aquí ejemplos no limitativos de microportadores. Se conocen otros ejemplos de microportadores en la técnica. Un microportador puede contener, por ejemplo, un polímero (por ejemplo, celulosa, polietilenglicol o ácido poli-(láctico-co-glicólico)).

[0046]Salvo que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece esta invención. En el presente documento se describen métodos y materiales para uso en la presente invención; también se pueden utilizar otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones.

[0047]Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y figuras, y de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0048]

La Figura 1 es un diagrama esquemático de una vista superior de un sistema de placa de múltiples pocillos ilustrativo.

La Figura 2 es un diagrama esquemático de una vista lateral de un sistema de placa de múltiples pocillos ilustrativo.

La Figura 3 es un diagrama esquemático de una vista lateral de un sistema de placa de múltiples pocillos alternativo.

La Figura 4 es un diagrama esquemático de una vista lateral de un sistema de placa de múltiples pocillos alternativo.

La Figura 5 es un gráfico de la densidad de células viables durante dos días de perfusión de células cultivadas en un tubo de agitación de 50 ml que contiene medio de cultivo de 10 ml y agitado a 160 RPM o una placa de 96 pocillos profundos de fondo redondo que contiene 200 gl o 300 gl de medio de cultivo y agitada a 330 RPM, y cultivadas durante diferentes velocidades de realimentación por lotes. Las barras de error representan una desviación estándar de n = 2.

La Figura 6 es un gráfico de la densidad de células viables en el punto final de un cultivo de dos días de células cultivadas por perfusión en una placa de 96 pocillos profundos de fondo redondo que contiene 200 gl o 300 gl de medio de cultivo y agitada a 330 RPM, y cultivada a diferentes velocidades de realimentación por lotes (2 x 0,5 volúmenes de reactor/día o 1 volumen de reactor/día). Las barras de error representan una desviación estándar de n = 2.

La Figura 7 es un gráfico del porcentaje de viabilidad celular de un cultivo de 11 días de perfusión celular cultivado en una placa de 96 pocillos profundos de fondo redondo que contiene 300 gl de medio de cultivo y agitado a 360 RPM, o en un tubo de agitación que contiene 10 ml de medio de cultivo y agitado a 160 RPM. Las barras de error representan una desviación estándar de n = 2 para los cultivos de tubo de agitación y n = 8 para los cultivos de placa de 96 pocillos de fondo redondo.

La Figura 8 es la densidad de células viables de cultivos de un cultivo de 11 días de perfusión celular cultivado en una placa de 96 pocillos profundos de fondo redondo que contiene 300 gl de medio de cultivo y agitado a 360 RPM, o en un tubo de agitación que contiene 10 ml de medio de cultivo y agitado a 160 RPM. Las barras de error representan una desviación estándar de n = 2 para los cultivos de tubo de agitación y n = 8 para los cultivos de 96 pocillos profundos de fondo redondo.

La Figura 9 es un gráfico de la velocidad de realimentación (en volumen o volúmenes de reactor) utilizada en cada día de un cultivo de 15 días en el protocolo de velocidad de realimentación modificada y el protocolo de velocidad de realimentación de control.

La Figura 10 es un gráfico de la densidad de células viables a lo largo del tiempo de células cultivadas en placas de 96 pocillos de fondo cuadrado o de fondo redondo que contienen 200 gl, 300 gl o 500 gl de medio de cultivo, agitadas a 330 RPM o 360 RPM y selladas usando el sistema Applikon o una membrana desechable; o cultivadas en tubos de agitación de control. Las barras de error representan la desviación estándar de n = 3.

La Figura 11 un gráfico del porcentaje de células viables a lo largo del tiempo de células cultivadas en placas de 96 pocillos de fondo cuadrado o de fondo redondo que contienen 200 gl, 300 gl o 500 gl de medio de cultivo, agitadas a 330 RPM o 360 RPM y selladas usando el sistema Applikon o una membrana desechable; o cultivadas en tubos de agitación de control. Las barras de error representan la desviación estándar de n = 3.

La Figura 12 es un gráfico de la densidad celular viable a lo largo del tiempo de células cultivadas en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado o de fondo redondo que contienen 200 gl, 300 gl o 500 gl de medio de cultivo, agitadas a 330 RPM o 360 RPM y selladas usando el sistema Applikon o una membrana desechable; o cultivadas en tubos de agitación de control. Las barras de error representan la desviación estándar de n = 3.

La Figura 13 un gráfico del porcentaje de células viables a lo largo del tiempo de células cultivadas en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado o de fondo redondo que contienen 200 gl, 300 gl o 500 gl de medio de cultivo, agitadas a 330 RPM o 360 RPM y selladas usando el sistema Applikon o una membrana desechable; o cultivadas en tubos de agitación de control. Las barras de error representan la desviación estándar de n = 3.

La Figura 14 es un gráfico de la densidad de células viables a lo largo del tiempo de células cultivadas en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado que contienen 300 gl o 500 gl de medio de cultivo y se agitan a 320 RPM, 330 RPM o 340 RPM; o se cultivan en tubos de agitación de control. Las barras de error representan una desviación estándar de n = 3.

La Figura 15 es un gráfico de la densidad de células viables a lo largo del tiempo de células cultivadas en placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo que contienen 100 gl, 200 gl o 300 gl de medio de cultivo CD CHO y agitadas a 320 RPM, 340 RPM o 360 RPM, o células cultivadas en un tubo de agitación (con la perfusión de medios realizada utilizando la velocidad de realimentación de control o la velocidad de realimentación modificada). Las barras de error representan una desviación estándar de n = 2.

La Figura 16 es un gráfico de la densidad de células viables a lo largo del tiempo de células cultivadas en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado que contienen 200 gl, 400 gl o 600 gl de medio de cultivo CD CHO y agitadas a 320 RPM, 340 RPM o 360 RPM, o células cultivadas en un tubo de agitación (con la perfusión de medios realizada utilizando la velocidad de realimentación de control o la velocidad de realimentación modificada). Las barras de error representan una desviación estándar de n = 2.

La Figura 17 es un gráfico de la densidad de células viables integrada de células cultivadas en placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo que contienen 100 gl, 200 gl o 300 gl de medio de cultivo CD CHO y agitadas a 320 RPM, 340 RPM o 360 RPM, o células cultivadas en un tubo de agitación (con la perfusión de medios realizada utilizando la velocidad de realimentación de control o la velocidad de realimentación modificada). Las barras de error representan una desviación estándar de n = 2.

La Figura 18 es un gráfico de la densidad de células viables integrada de células cultivadas en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado que contienen 200 gl, 400 gl o 600 gl de medio de cultivo CD CHO y agitadas a 320 RPM, 340 RPM o 360 RPM, o células cultivadas en un tubo de agitación (con la perfusión de medios realizada utilizando la velocidad de realimentación de control o la velocidad de realimentación modificada). Las barras de error representan una desviación estándar de n = 2.

La Figura 19 es un gráfico de la tasa de productividad volumétrica de células cultivadas en placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo que contienen 100 gl, 200 gl o 300 gl de medio de cultivo CD CHO y agitadas a 320 RPM, 340 RPM o 360 RPM, o células cultivadas en un tubo de agitación (con la perfusión de medios realizada a la velocidad de realimentación de control o la velocidad de realimentación modificada). Las barras de error representan una desviación estándar de n = 2.

La Figura 20 es un gráfico de la tasa de productividad volumétrica de células cultivadas en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado que contienen 200 gl, 400 gl o 600 gl de medio de cultivo CD CHO y agitadas a 320 RPM, 340 RPM o 360 RPM, o células cultivadas en un tubo de agitación (con la perfusión de medios realizada a la velocidad de realimentación de control o la velocidad de realimentación modificada). Las barras de error representan una desviación estándar de n = 2.

La Figura 21 es un gráfico de la tasa de productividad específica de células cultivadas en placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo que contienen 100 gl, 200 gl o 300 gl de medio de cultivo CD CHO y agitadas a 320 RPM, 340 RPM o 360 RPM, o células cultivadas en un tubo de agitación (con la perfusión de medios realizada a la velocidad de realimentación de control o la velocidad de realimentación modificada). Las barras de error representan una desviación estándar de n = 2.

La Figura 22 es un gráfico de la tasa de productividad específica de células cultivadas en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado que contienen 200 gl, 400 gl o 600 gl de medio de cultivo CD CHO y agitadas a 320 RPM, 340 RPM o 360 RPM, o células cultivadas en un tubo de agitación (con la perfusión de medios realizada a la velocidad de realimentación de control o la velocidad de realimentación modificada). Las barras de error representan una desviación estándar de n = 2.

La Figura 23 es un gráfico del ajuste de los datos en tiempo real para modelar predicciones de densidad de células viables.

La Figura 24 es un gráfico del ajuste de los datos en tiempo real para modelar predicciones de la tasa de productividad volumétrica.

La Figura 25 es un conjunto de doce gráficos que muestran las mejores condiciones de funcionamiento basadas en la introducción de datos empíricos en un modelo estadístico teniendo en cuenta las desviaciones estándar.

La Figura 26 es un gráfico del perfil de densidad de células viables de una línea celular de mamífero que produce un anticuerpo monoclonal recombinante en 500 pl de uno o una variedad de medio de cultivo diferente colocado en una placa de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado y agitada a una frecuencia de 330 RPM. Los datos de control representan el medio CD CHO.

La Figura 27 es un gráfico del perfil de densidad de células viables de una línea celular de mamífero que produce una enzima recombinante en una placa de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado y agitada a una frecuencia de 330 RPM. Los datos de control representan el medio CD CHO.

La Figura 28 es un gráfico del título (mg/ml) de un cultivo de una línea celular de mamífero que produce un anticuerpo monoclonal recombinante en 500 pl de uno o una variedad de medio de cultivo diferente colocado en una placa de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado y agitada a una frecuencia de 330 RPM. Los datos de control representan el medio CD CHO.

La Figura 29 es un gráfico del título (mg/ml) de un cultivo de una línea celular de mamífero que produce una enzima recombinante en 500 pl de uno o una variedad de medio de cultivo diferente colocado en una placa de 96 pocillos profundos con fondo cuadrado y agitada a una frecuencia de 330 RPM. Los datos de control representan el medio CD CHO.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0049]En el presente documento se proporcionan métodos mejorados para cultivar una célula CHO en una placa de múltiples pocillos. Los métodos de cultivo pueden lograr una concentración de células CHO viables (por ejemplo, en el medio de cultivo líquido, por ejemplo, el primer medio de cultivo líquido, o una combinación del primer y segundo medio de cultivo líquido) similar a la lograda mediante un biorreactor de perfusión de producción a mayor escala, por ejemplo, una densidad de células CHO viables mayor que 15 x 106 células/ml, mayor que 20 x 106 células/ml, mayor que 25 x 106 células/ml, mayor que 30 x 106 células/ml, mayor que 35 x 106 células/ml, mayor que 40 x 106 células/ml, mayor que 45 x 106 células/ml, mayor que 50 x 106 células/ml, mayor que 55 x 106 células/ml, o mayor que 60 x 106 células/ml. Por ejemplo, el método de cultivo puede dar como resultado una concentración de células CHO viables de entre 15 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml, entre 15 x 106 células/ml y 55 x 106 células/ml, entre 15 x 106 células/ml y 50 x 106 células/ml, entre 15 x 106 células/ml y 45 x 106 células/ml, entre 15 x 106 células/ml y 40 x 106 células/ml, entre 15 x 106 células/ml y 35 x 106 células/ml, entre 20 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml, entre 20 x 106 células/ml y 55 x 106 células/ml, entre 20 x 106 células/ml y 50 x 106 células/ml, entre 20 x 106 células/ml y 45 x 106 células/ml, entre 20 x 106 células/ml y 40 x 106 células/ml, entre 25 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml,=entre 25 x 106 células/ml y 55 x 106 células/ml, entre 25 x 106 células/ml y 50 x 106 células/ml, entre 25 x 106 células/ml y 45 x 106 células/ml, entre 30 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml, entre 30 x 106 células/ml y 55 x 106 células/ml, entre 30 x 106 células/ml y 50 x 106 células/ml, entre 35 x 106 células/ml y 70 x 106 células/ml, entre 35 x 106 células/ml y 65 x 106 células/ml, entre 35 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml, entre 35 x 106 células/ml y 55 x 106 células/ml, entre 40 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml, entre 40 x 106 células/ml y 55 x 106 células/ml. Se pueden utilizar una variedad de métodos diferentes conocidos para determinar la densidad celular o densidad de células viables. Por ejemplo, la muestra del cultivo celular se puede diluir en tampón fisiológico, la suspensión celular diluida se coloca en un hemocitómetro, y las células se cuentan utilizando microscopía de luz. En otro método, la densidad de células viables se puede determinar utilizando un método similar, pero incluyendo en el tampón fisiológico un colorante que es absorbido selectivamente por células no viables (por ejemplo, azul de tripano, tal como el método de Vi-CELL de Beckman Coulter (véase el sitio web de Beckman Coulter)). En otro ejemplo más, la densidad celular o densidad de células viables se puede determinar utilizando citometría de flujo asistida por fluorescencia (p. ej., GUAVA de Merck Millipore (véase el sitio web de Millipore) y otros métodos de recuento celular.

[0050]En algunas realizaciones, el método de cultivo da como resultado una tasa de productividad específica significativamente mejorada. Por ejemplo, la tasa de productividad específica lograda por los métodos proporcionados en el presente documento es al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, o 100 veces mayor que la tasa de productividad específica lograda en condiciones sustancialmente iguales de cultivo, pero sin eliminar un volumen del primer medio de cultivo y sin añadir un segundo volumen del segundo medio de cultivo. La productividad lograda mediante los presentes métodos puede ser de al menos 10 000 unidades/l, al menos 15000 unidades/l, al menos aproximadamente 20000 unidades/l, al menos aproximadamente 25 000 unidades/l, al menos aproximadamente 30000 unidades/l, al menos aproximadamente 35 000 unidades/l o al menos aproximadamente 40 000 unidades/l (en el primer y/o segundo medio de cultivo líquido). En algunas realizaciones, la productividad lograda mediante los presentes métodos puede ser de al menos 1 g/l, al menos 1,5 g/l, al menos 2,0 g/l, al menos 2,5 g/l, al menos 3,0 g/l, al menos 4,0 g/l, al menos 4,5 g/l, o al menos 5,0 g/l.

[0051]La actividad biológica de una proteína recombinante se puede evaluar utilizando una variedad de métodos conocidos en la técnica, y dependerá de la actividad de la proteína recombinante específica. Por ejemplo, la actividad biológica de una proteína recombinante que es una inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) se puede determinar midiendo la afinidad del anticuerpo por unirse a su epítopo específico (por ejemplo, utilizando Biocore o ensayos inmunoadsorbentes ligados a enzimas competitivos). La proteína recombinante puede ser una enzima (por ejemplo, una galactosidasa recombinante, por ejemplo, una alfa-galactosidasa recombinante), y la actividad biológica puede determinarse midiendo la actividad enzimática (por ejemplo, determinando la constante de velocidad catalítica de la enzima midiendo una disminución en la concentración de un sustrato detectable o un aumento en la concentración de un producto detectable (por ejemplo, utilizando espectrofotometría o emisión de luz). Por ejemplo, la actividad biológica de una galactosidasa recombinante se puede detectar midiendo una disminución en el nivel de globotriasilceramida (GL-3) o galabiosilceramida, o un aumento en el nivel de ceramida dihexósido o galactosa.

[0052]También se proporcionan sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos que se pueden utilizar para realizar, por ejemplo, cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.

Métodos para probar un procedimiento de fabricación

[0053]En el presente documento se proporcionan métodos para probar un procedimiento de fabricación para producir una proteína recombinante (por ejemplo, cualquiera de las proteínas recombinantes descritas en el presente documento o conocidas en la técnica). Estos métodos incluyen realizar un método para producir una proteína recombinante descrita en el presente documento y, durante el método y/o después, detectar o medir al menos una (p. ej., dos, tres cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce) lectura de cultivo (p. ej., la cantidad de proteína recombinante en la célula o en el primer y/o segundo medio de cultivo, consumo de glucosa, concentración de células viables, producción de lactato, tasa de productividad volumétrica, tasa de productividad específica, rendimiento de lactato a partir de glucosa, concentración de glutamina, concentración de glutamato, pH del medio de cultivo, presión parcial o concentración de CO2 disuelto, concentración o presión parcial de O2 disuelto, transferencia de masa de metabolitos, y balance de masa de metabolitos); y comparar la al menos una lectura de cultivo con un nivel de referencia de la al menos una (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o trece) lectura de cultivo (p. ej., un nivel de referencia de la cantidad de proteína recombinante presente (p. ej., detectada) en la célula o en el primer y/o segundo medio de cultivo, consumo de glucosa, concentración de células viables, producción de lactato, tasa de productividad volumétrica, tasa de productividad específica, rendimiento de lactato a partir de glucosa, concentración de glutamina, concentración de glutamato, pH del medio de cultivo, concentración o presión parcial de CO2 disuelto, concentración o presión parcial de O2 disuelto, transferencia de masa de metabolitos, y equilibrio de masa de metabolitos).

[0054]Los profesionales expertos apreciarán que cualquiera de los diversos parámetros de cultivo (p. ej., placas, volúmenes, velocidades o frecuencias de reemplazo de volúmenes de cultivo, frecuencias de agitación, temperaturas, medios, concentraciones de CO2, y ángulo del reactor) descritos en el presente documento se puede utilizar en cualquier combinación para realizar estos métodos.

[0055]El nivel de referencia de la al menos una lectura de cultivo (p. ej., cantidad de proteína recombinante en la célula o en el primer y/o segundo medio de cultivo, consumo de glucosa, concentración de células viables, producción de lactato, tasa de productividad volumétrica, tasa de productividad específica, rendimiento de lactato a partir de glucosa, concentración de glutamina, concentración de glutamato, pH del medio de cultivo, concentración o presión parcial de CO2 disuelto, concentración o presión parcial de O2 disuelto, transferencia de masa de metabolitos, y balance de masa de metabolitos) puede ser un nivel producido utilizando un método de cultivo diferente, p. ej., un método de cultivo que utiliza al menos un parámetro de cultivo diferente (p. ej., un primer y/o segundo medio de cultivo líquido diferente, una célula de mamífero diferente, una frecuencia y/o tipo de agitación diferente, una placa de múltiples pocillos diferente, una tasa de perfusión o realimentación de lote diferente (p. ej., 10 % a 200 % del volumen del pocillo o del primer volumen del medio de cultivo líquido durante un período de tiempo de 24 horas u otro período de tiempo incremental), y cualquiera de los otros parámetros de cultivo descritos en este documento). La cantidad de referencia de proteína recombinante puede ser, por ejemplo, un nivel de proteína recombinante producida utilizando un conjunto de parámetros de cultivo que dan como resultado un nivel diferente de O2 disuelto y/o un nivel diferente de esfuerzo cortante del líquido.

[0056]Los métodos descritos en este documento se pueden utilizar para probar el efecto de cualquier componente o característica de un procedimiento de fabricación. Por ejemplo, el método descrito en este documento se puede utilizar para probar el efecto de diferentes materias primas, niveles de agitación, placas de múltiples pocillos, agentes antiaglomerantes, medios de cultivo (por ejemplo, medios de cultivo químicamente definidos) o elementos o compuestos nutritivos en al menos una lectura de cultivo (por ejemplo, cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, por ejemplo, el efecto sobre la producción de proteína recombinante y/o el crecimiento de células CHO). Por ejemplo, se proporcionan aquí métodos para probar la eficacia de un primer o segundo medio de cultivo líquido, un ingrediente bruto o suplemento presente en un primer o segundo medio de cultivo líquido, o una fuente de una célula CHO para su uso en un método de producción de una proteína recombinante que incluye proporcionar una placa de múltiples pocillos que contiene al menos un pocillo que contiene una célula CHO dispuesta en un primer medio de cultivo líquido que ocupa aproximadamente entre el 5 % y el 70%del volumen del pocilio; incubar la placa de múltiples pocilios durante un período de tiempo a aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C con una agitación rotatoria de aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 500 RPM; continuamente, durante el período de tiempo, retirar un primer volumen del primer medio de cultivo líquido y añadir al primer medio de cultivo líquido un segundo volumen de un segundo medio de cultivo líquido, donde el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido son aproximadamente iguales, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido está sustancialmente libre de células CHO, y el método da como resultado una densidad de células viables de entre 15 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml en el pocillo; detectar o determinar al menos una lectura de cultivo (p. ej., cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, p. ej., la cantidad de proteína recombinante en la célula o en el primer y/o segundo medio de cultivo); comparar la al menos una lectura de cultivo con un nivel de referencia de la al menos una lectura de cultivo (p. ej., cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, p. ej., cantidad de proteína recombinante en la célula o en el primer y/o segundo medio de cultivo líquido) producido por un método de cultivo diferente que utiliza uno o más de un primer o segundo medio de cultivo líquido diferente, o una fuente diferente de una célula CHO; e identificar el primer o segundo medio de cultivo líquido, el ingrediente bruto o suplemento presente en el primer o segundo medio de cultivo líquido, o la fuente de la célula CHO que está asociada con un cambio beneficioso (por ejemplo, aumento o disminución) en la al menos una lectura de cultivo (por ejemplo, una mayor cantidad de proteína recombinante) en comparación con el nivel de referencia como eficaz para su uso en un método de producción de una proteína recombinante. Por ejemplo, un aumento en el nivel de proteína recombinante, un aumento en la concentración de células viables, un aumento en la tasa de productividad volumétrica, un aumento en la tasa de productividad específica y un aumento en el consumo de glucosa en comparación con el nivel de referencia indica que el primer o segundo medio de cultivo líquido, el ingrediente bruto o suplemento presente en un primer o segundo medio de cultivo líquido, o la fuente de la célula CHO son eficaces para su uso en un método de producción de una proteína recombinante.

[0057]Los métodos descritos en este documento también se pueden usar para probar el efecto de cambiar cualquiera de los diversos parámetros de cultivo celular descritos en este documento o conocidos en la técnica (por ejemplo, el volumen, la altura, el diámetro o la forma del fondo de un pocillo, la frecuencia o el tipo de agitación, la fuerza de cizallamiento, la densidad de siembra del cultivo, el pH del primer o segundo medio de cultivo líquido, la concentración o presión parcial de O2 disuelto, el revestimiento de la superficie interna del pocillo, los diversos contenidos dentro de un medio de cultivo líquido (por ejemplo, el primer y/o segundo medio de cultivo líquido), el tipo o línea de células CHO, la exposición al CO2 o la concentración o presión parcial de CO2 disuelto, la temperatura, el volumen del medio de cultivo líquido (por ejemplo, el volumen del primer y/o segundo medio de cultivo líquido) y/o la velocidad o frecuencia de eliminación del primer volumen del primer medio de cultivo y adición del segundo volumen del segundo medio de cultivo al primer medio de cultivo). Los métodos también se pueden utilizar para probar la calidad del agua utilizada para preparar el medio de cultivo líquido (por ejemplo, el primer y/o segundo medio de cultivo líquido) y/o el efecto de diferentes oligometales en el medio de cultivo líquido en al menos una lectura de cultivo (por ejemplo, cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, por ejemplo, el efecto sobre la producción de proteína recombinante y/o el crecimiento de células CHO). Los métodos también se pueden utilizar para probar el efecto de un factor de crecimiento o una hormona de crecimiento en al menos una lectura de cultivo (por ejemplo, cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, por ejemplo, el efecto sobre la producción de proteína recombinante y/o el crecimiento de células CHO). El método también se puede utilizar para probar procedimientos de filtración y filtros utilizados para preparar el primer y/o segundo medio de cultivo líquido. El método también se puede utilizar para probar la estabilidad del medio de cultivo líquido y el efecto de un medio de cultivo líquido sobre las funciones biológicas (por ejemplo, al menos una de cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, por ejemplo, el efecto sobre la producción de proteína recombinante y/o el crecimiento de células CHO). El método también se puede utilizar para examinar varias líneas celulares recombinantes y bancos de células para determinar su capacidad de producir una proteína recombinante deseada (por ejemplo, una proteína terapéutica segregada deseada). Como se señala aquí, el método también se puede utilizar para examinar cualquier parámetro del proceso de cultivo celular, incluidos, pero sin limitarse a, el tipo y la frecuencia de agitación, la fuerza de cizallamiento, la velocidad y el volumen de perfusión, la densidad de siembra del cultivo, y otros.

[0058]El método descrito en este documento también se puede utilizar para comprobar la presencia de un contaminante en un primer o segundo medio de cultivo líquido, una materia prima utilizada para generar un primer o segundo medio de cultivo líquido, o una fuente de una célula CHO. Por ejemplo, en el presente documento se proporcionan métodos para probar la presencia de un contaminante en un primer o segundo medio de cultivo líquido, materias primas utilizadas para generar un primer o segundo medio de cultivo líquido, o una fuente de una célula CHO, que incluyen proporcionar una placa de múltiples pocillos que contiene al menos un pocillo que contiene una célula CHO suspendida en un primer medio de cultivo líquido que ocupa aproximadamente entre el 5%y el 70%del volumen del pocilio; incubar la placa de múltiples pocilios durante un período de tiempo a aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C y con una agitación de aproximadamente 320 revoluciones por minuto (RPM) a aproximadamente 500 RPM; de forma continua, durante el período de tiempo, retirar un primer volumen del primer medio de cultivo líquido y añadir al primer medio de cultivo líquido un segundo volumen de un segundo medio de cultivo líquido, donde el primer volumen del primer medio de cultivo líquido retirado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido son aproximadamente iguales, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido está sustancialmente libre de células CHO, y el método da como resultado una densidad de células viables de entre 15 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml en el pocillo; detectar o determinar al menos una lectura de cultivo (por ejemplo, cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, por ejemplo, la cantidad de proteína recombinante en la célula o en el primer y/o segundo medio de cultivo líquido); comparar la al menos una lectura de cultivo con un nivel de referencia de la al menos una lectura de cultivo (por ejemplo, cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, por ejemplo, cantidad de proteína recombinante presente en la célula o en el primer y/o segundo medio de cultivo) producida por un método de cultivo diferente que utiliza uno o más de un primer o segundo medio de cultivo líquido diferente, diferentes materias primas para generar el primer o segundo medio de cultivo líquido, o una fuente diferente de la célula CHO; e identificar el primer o segundo medio de cultivo líquido, las materias primas utilizadas para generar el primer o segundo medio de cultivo líquido o la fuente de una célula CHO como que contienen un contaminante cuando el nivel del al menos un parámetro de cultivo se cambia perjudicialmente (por ejemplo, aumenta o disminuye) en comparación con el nivel de referencia. Por ejemplo, una disminución en la producción de proteína recombinante (por ejemplo, una disminución en la proteína recombinante en la célula o en el primer y/o segundo medio de cultivo), la tasa de productividad volumétrica o la concentración de células viables en comparación con el nivel de referencia es un cambio perjudicial que indica la presencia de un contaminante en el primer o segundo medio de cultivo líquido, una materia prima utilizada para generar el primer o segundo medio de cultivo líquido, o la fuente de la célula CHO. Algunos métodos incluyen además uno o más ensayos para determinar la identidad del contaminante presente en el primer o segundo medio de cultivo líquido, la materia prima utilizada para generar el primer o segundo medio de cultivo líquido, o la fuente de la célula CHO. El contaminante puede ser un contaminante biológico (p. ej., una micobacteria, un hongo, una bacteria, un virus, o una célula de mamífero no deseada). El contaminante también puede ser una sustancia no caracterizada físicamente.

[0059]Los métodos se pueden utilizar para realizar experimentos de cultivo celular de alto rendimiento para realizar un diseño de experimento (DOE) o una optimización de calidad por diseño (QBD) de los métodos de cultivo celular. Por ejemplo, en el presente documento se proporcionan métodos para optimizar un procedimiento de fabricación para producir una proteína recombinante que incluye proporcionar una placa de múltiples pocillos que contiene al menos un pocillo que contiene una célula CHO suspendida en un primer medio de cultivo líquido que ocupa aproximadamente entre el 5 % y el 70 % del volumen del pocillo; incubar la placa de múltiples pocillos durante un período de tiempo a aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C y con una agitación rotatoria de aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 500 RPM; continuamente, durante el período de tiempo, retirar un primer volumen del primer medio de cultivo líquido y añadir al primer medio de cultivo líquido un segundo volumen de un segundo medio de cultivo líquido, donde el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido son aproximadamente iguales, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido está sustancialmente libre de células CHO, y el método da como resultado una densidad de células viables de entre 15 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml en el pocillo; detectar al menos una lectura de cultivo (por ejemplo, cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, por ejemplo, cantidad de proteína recombinante en la célula o en el primer y/o segundo medio de cultivo líquido); comparar la al menos una lectura de cultivo con un nivel de referencia de la al menos una lectura de cultivo (por ejemplo, cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, p. ej., cantidad de proteína recombinante presente en la célula o en el primer y/o segundo medio de cultivo líquido) producido por un método de cultivo diferente; e identificar y eliminar o alterar en el procedimiento de fabricación cualquier componente o parámetro de cultivo que esté asociado con un cambio perjudicial (p. ej., aumento o disminución) en la al menos una lectura de cultivo (p. ej., cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, p. ej., cantidad de proteína recombinante producida) en comparación con el nivel de referencia de la al menos una lectura de cultivo (p. ej., cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, p. ej., proteína recombinante producida), o identificar y añadir a un procedimiento de fabricación cualquier componente o parámetro de cultivo que esté asociado con un cambio beneficioso (p. ej., aumento o disminución) en la al menos una lectura de cultivo (p. ej., cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, p. ej., cantidad de proteína recombinante producida) en comparación con el nivel de referencia de la al menos una lectura de cultivo (p. ej., cualquiera de las lecturas de cultivo descritas en este documento, p. ej., proteína recombinante producida). Por ejemplo, un aumento en la cantidad de proteína recombinante producida, la tasa de productividad volumétrica, la tasa de productividad específica o la concentración de células viables es un cambio beneficioso en una lectura de cultivo, y una disminución en la cantidad de proteína recombinante producida, la tasa de productividad volumétrica, la tasa de productividad específica o la concentración de células viables es un cambio perjudicial en una lectura de cultivo. En algunos casos, el método se utiliza para identificar de una manera de alto rendimiento condiciones de cultivo celular optimizadas que se pueden utilizar para la producción a mayor escala (por ejemplo, biorreactor) de una proteína recombinante.

[0060]En cualquiera de los métodos descritos en esta sección, el nivel de referencia de al menos una lectura de cultivo puede ser de un cultivo de mayor escala (por ejemplo, un biorreactor de perfusión, por ejemplo, un biorreactor de perfusión de 2000 l, un biorreactor de perfusión de 40 l o un biorreactor de perfusión de 12 l). En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en esta sección, la célula CHO se cultiva en una placa de múltiples pocillos utilizando cualquiera de los métodos descritos en este documento durante el mismo período de tiempo en que se realiza un cultivo a mayor escala (cultivo en paralelo). Por ejemplo, el inóculo utilizado para inocular la placa de múltiples pocillos en cualquiera de los métodos descritos en este documento también se utiliza para inocular un biorreactor de perfusión de mayor escala aproximadamente al mismo tiempo.

[0061]En una realización, el inóculo que se utiliza para sembrar los pocillos se obtiene de un cultivo de mayor escala (por ejemplo, un biorreactor de perfusión de mayor escala). Por ejemplo, una alícuota de un cultivo a mayor escala en cualquier momento (por ejemplo, extraída durante la fase de crecimiento, la fase de transición (por ejemplo, un período opcional cuando el cultivo se está trasladando a un conjunto diferente de condiciones de crecimiento, por ejemplo, un medio de cultivo líquido y/o temperatura diferente), o la fase de cosecha) y se utiliza para inocular el o los pocillos (por ejemplo, se utiliza para iniciar un cultivo en placa de múltiples pocillos satélite). Se puede extraer una alícuota del cultivo a mayor escala durante la fase de crecimiento y usarla para inocular o sembrar una placa de múltiples pocillos que contenga al menos un pocillo que contenga un medio de cultivo líquido, y luego el o los pocillos se incuban en condiciones que replican o son similares a las condiciones de la fase de crecimiento empleadas en el cultivo a mayor escala. Alternativamente, o adicionalmente, se puede retirar una alícuota del cultivo a mayor escala durante una fase de transición y utilizarla para inocular o sembrar una placa de múltiples pocillos que contenga al menos un pocillo que contenga un medio de cultivo líquido, y luego el o los pocillos se incuban en condiciones que replican o son similares a las condiciones de la fase de transición empleadas en el cultivo a mayor escala. Alternativamente, o adicionalmente, se puede retirar una alícuota del cultivo a mayor escala durante la fase de cosecha y utilizarla para inocular o sembrar una placa de múltiples pocillos que contenga al menos un pocillo que contenga un medio de cultivo líquido, y luego el o los pocillos se incuban en condiciones que replican o son similares a las condiciones de la fase de cosecha empleadas en el cultivo a mayor escala. En cualquiera de estos métodos, se pueden alterar uno o más parámetros de cultivo en los métodos utilizados para cultivar la célula CHO en la placa de múltiples pocillos (en comparación con los parámetros de cultivo o componentes utilizados para cultivar la célula CHO en el cultivo a mayor escala), se mide al menos una lectura de cultivo, y la al menos una lectura de cultivo se compara con la al menos una lectura de cultivo determinada para el cultivo a mayor escala. Como pueden apreciar los expertos en la técnica, estos métodos se pueden usar para probar el efecto de un parámetro o componente de cultivo específico en al menos una lectura de cultivo durante una o más fases específicas del proceso de cultivo (por ejemplo, el efecto de uno o más parámetros de cultivo y/o componente(s) de cultivo en al menos una lectura de cultivo durante la fase de crecimiento, la fase de transición opcional y/o la fase de cosecha).

[0062]En ciertas realizaciones, estos métodos también se pueden realizar para determinar si hay un contaminante presente en el biorreactor a gran escala, determinando o detectando al menos una lectura de cultivo en la placa de múltiples pocillos (por ejemplo, inoculada con una alícuota del cultivo del biorreactor a gran escala o el mismo banco de células congeladas utilizado para inocular el biorreactor a gran escala), comparando al menos una lectura de cultivo con un nivel de referencia de la al menos una lectura de cultivo (por ejemplo, un nivel de la al menos una lectura de cultivo de un cultivo que está sustancialmente libre de contaminación), e identificando el biorreactor a gran escala como que contiene un contaminante cuando la al menos una lectura de cultivo en el pocillo en comparación con el nivel de referencia de la al menos una lectura de cultivo indica que hay un contaminante presente en el pocillo. El contaminante puede ser, por ejemplo, un contaminante biológico, tal como un virus, un hongo, una célula de mamífero no deseada, o una bacteria, tal como una micobacteria. El contaminante puede ser, por ejemplo, un vesivirus.

Sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos

[0063]La presente memoria descriptiva proporciona sistemas de placas de cultivo de células de múltiples pocillos ejemplares útiles para cultivar una célula CHO (por ejemplo, utilizando cualquiera de los métodos descritos en este documento). Estos sistemas están diseñados para permitir la extracción continua o periódica de fluido (por ejemplo, un primer medio de cultivo líquido) presente en un recipiente o recipientes de cultivo y la adición a dicho recipiente o recipientes de cultivo de un fluido (por ejemplo, un segundo medio de cultivo líquido) a través de al menos un puerto configurado para acomodar un flujo de fluido dentro y/o fuera del recipiente o recipientes de cultivo.

Sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos a modo de ejemplo

[0064]En la FIG. 1 se proporciona una vista superior de un ejemplo no limitante de un sistema de placa de cultivo celular de múltiples pocillos1. El sistema de placa de cultivo celular de múltiples pocillos1incluye una placa de soporte unitaria2que comprende una superficie3que tiene una pluralidad de aberturas4. Las aberturas se pueden disponer en cualquier formato y, si bien la FIG. 1 muestra aberturas en formato de línea y fila, los expertos apreciarán que se puede emplear cualquier configuración de aberturas.

[0065]En la FIG. 2 se muestra una vista lateral de un sistema de placa de cultivo de múltiples pocillos ilustrativo

11. El sistema de placa de cultivo de múltiples pocillos11incluye una placa de soporte unitaria2que tiene una

superficie3que incluye una pluralidad de aberturas4. La placa de soporte unitaria2puede estar hecha de

cualquier material biológicamente compatible (por ejemplo, poliestireno o cualquier otro material biológicamente compatible conocido en la técnica). La placa de soporte unitaria2puede tener al menos 2 aberturas4(por ejemplo,

4, 6, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 24, 36, 48, 60, 72 o 96 aberturas4) o puede tener al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 , 24, 36, 48

o 96 aberturas4. El sistema de placa de cultivo de múltiples pocillos11que se muestra en la FIG. 2 también tiene

una pluralidad de recipientes de cultivo 5 que están formados o dispuestos dentro de la placa de soporte2y configurados para albergar cultivos celulares (por ejemplo, cualquiera de las células de mamíferos ejemplares y/o

medios de cultivo de tejidos descritos en este documento). Los recipientes5pueden configurarse para albergar

cultivos celulares de cualquier volumen, por ejemplo, aquellos que tienen un volumen de entre aproximadamente

0,3 ml y aproximadamente 25 ml (por ejemplo, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 24 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 22 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 20 ml,

entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 18 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 16

ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 14 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente

12 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 8 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 6 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 5 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 4 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 3 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 2 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 1 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 25 ml, entre aproximadamente 0,5 ml

y aproximadamente 24 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 22 ml, entre aproximadamente 0,5

ml y aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 20 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 18

ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 16 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente

14 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 12 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 8 ml, entre aproximadamente 0,5 ml

y aproximadamente 6 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 5 ml, entre aproximadamente 0,5 ml

y aproximadamente 4 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 3 ml, entre aproximadamente 0,5 ml

y aproximadamente 2 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 1 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 25 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 24 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 22 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 20 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 18 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 16 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 14 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 12 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 8 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 7 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 6 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 5 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 4 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 3,5 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 3 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 2,5 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 2 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 1,5 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 25 ml, entre entre aproximadamente

1,5 ml y aproximadamente 24 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 22 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 20 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 18 ml,

entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 16 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 14

ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 12 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente

10 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 8 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente

6 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 5 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente

4 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 3,5 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente

3 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 2,5 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente

2.0 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 25 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 24 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 22 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente

20 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 18 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente

16 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 14 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente

12 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente

8 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 6 ml, o entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 5

mL), donde cada abertura3está emparejada con y define una abertura en cada recipiente de cultivo4.

[0066]El o los recipientes de cultivo5pueden tener diferentes formas. Ejemplos no limitativos de formas del o de

los recipientes de cultivo pueden ser una forma sustancialmente cilíndrica o cilíndrica con un extremo opuesto al

de la abertura4, es decir, plana, hemisférica, piramidal o cónica. El diámetro de la abertura4puede ser, por ejemplo,

de entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 50 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 45 mm, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 40 mm, entre aproximadamente

4.0 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 20

mm, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 15 mm, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 10 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 50 mm, entre aproximadamente

6.0 mm y aproximadamente 45 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 40 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 20 mm, entre aproximadamente 6.0 mm y aproximadamente 15 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 10 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 50 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 45 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 40 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 20 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 15 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 50 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 45 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 40 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 20 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 50 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 45 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 40 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 25 mm, o entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 20 mm). El o los recipientes de cultivo5pueden tener una altura de entre 1 cm y aproximadamente 12 cm (por ejemplo, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 10 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 8 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 7 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 6 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 5 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 4 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 3 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 12 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 10 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 8 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 7 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 6 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 5 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 4 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 3 cm, entre aproximadamente 1.5 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 10 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 8 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 7 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 6 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 5 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 4 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 3 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 12 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 10 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 8 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 7 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 6 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 5 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 4 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 3 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 12 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 10 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 8 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 7 cm, entre aproximadamente 2.5 cm y aproximadamente 6 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 5 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 4 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente 12 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente 10 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente 8 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente 7 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente 6 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente 5 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente 12 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente 10 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente 8 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente 7 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente 6 cm, entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 12 cm, entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 10 cm, entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 8 cm, o entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 7 cm).

[0067]El sistema de placa de cultivo celular de múltiples pocillos11que se muestra en la FIG. 2 también incluye un puerto6, por ejemplo, una válvula de una o dos vías, configurada para acomodar un flujo de fluido dentro y fuera del recipiente de cultivo5. El puerto6se puede conectar de manera fluida al recipiente de cultivo5en cualquier ubicación. Un sistema de placa de cultivo celular de múltiples pocillos descrito en este documento puede tener al menos uno, por ejemplo, dos, tres o al menos cuatro puertos6conectados de manera fluida a cada recipiente de cultivo5. En la FIG. 2 y FIG. 3 se muestran posiciones ejemplares para la conexión de un puerto6a un recipiente de cultivo5. Un puerto6se puede configurar para que fluya fluido en una dirección (por ejemplo, dentro o fuera del recipiente de cultivo5) o en ambas direcciones (dentro y fuera del recipiente de cultivo5). En algunas realizaciones, un primer puerto6puede configurarse para acomodar un flujo unidireccional hacia el recipiente de cultivo5y el segundo puerto6está configurado para acomodar un flujo unidireccional hacia fuera del recipiente de cultivo5.

[0068]La FIG. 3 muestra un sistema de placa de cultivo celular de múltiples pocilios12que incluye un filtro8configurado para evitar selectivamente que las células fluyan dentro y fuera del recipiente de cultivo5. Un filtro8puede ser cualquiera de los microfiltros o nanofiltros conocidos en la técnica utilizados para filtrar células de mamíferos. Un sistema de placa de cultivo celular de múltiples pocillos que tiene dos o más puertos6puede tener un filtro8configurado en o dentro de cada puerto6para evitar selectivamente que las células fluyan dentro y fuera del recipiente de cultivo5.

[0069]Los sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos12y13que se muestran en la FIG. 2 y la FIG. 3, respectivamente, también incluyen al menos un conducto7dispuesto dentro de la placa de soporte unitaria2y en comunicación fluida con el puerto6, en donde el conducto7está configurado para hacer fluir fluido hacia y desde el recipiente de cultivo5. En algunos ejemplos, un sistema de placa de cultivo celular de múltiples pocillos puede tener un conducto7en comunicación fluida con cada puerto6(por ejemplo, configurado para hacer fluir fluido hacia y/o desde cada recipiente de cultivo5).

[0070]Los sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos proporcionados en este documento pueden incluir además al menos un regulador de flujo de fluido vinculado operativamente al puerto o puertos6. Los sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos proporcionados en este documento pueden incluir además al menos un regulador de flujo de fluido conectado operativamente al conducto o conductos 7. Los ejemplos no limitativos de reguladores de flujo de fluido pueden controlar el caudal y/o la dirección del flujo de fluido detectando cambios en el volumen y/o la presión del fluido dentro de los recipientes de cultivo5. En algunos ejemplos, los reguladores de flujo de fluido se pueden programar para hacer fluir el fluido a una velocidad específica durante un período de tiempo específico en una dirección de flujo específica (por ejemplo, dentro y/o fuera del o de los recipientes de cultivo5).

[0071]En algunas realizaciones, la placa de soporte unitaria2está configurada para incluir un depósito para alojar y suministrar líquido al puerto o puertos6o conductos 7. En algunos ejemplos, el sistema de placa de cultivo celular de múltiples pocillos incluye un depósito para alojar y suministrar líquido al o a los puertos6o conductos7configurado de manera que sea externo a la placa de soporte unitaria2y conectado de manera fluida a los puertos6o conductos7, respectivamente (en donde el o los puertos 6 o conductos 7 realizan la función de hacer fluir un fluido hacia el interior del o de los recipientes de cultivo5). En algunas realizaciones, la placa de soporte unitaria2está configurada para incluir un depósito para alojar y almacenar un líquido extraído del o de los recipientes de cultivo5, donde el depósito para alojar y almacenar un líquido extraído es externo a la placa de soporte unitaria2y está conectado de manera fluida al o a los puertos6o conductos7(donde el o los puertos6o conductos7realizan la función de hacer fluir un fluido fuera del o de los recipientes de cultivo5).

[0072]En la FIG. 4 se muestra una placa de soporte unitaria ejemplar2configurada para incluir un depósito interno9para alojar y suministrar líquido al puerto o puertos6. La placa de soporte unitaria2en la FIG. 4 incluye además un puerto de intercambio10para retirar o añadir un líquido al depósito interno9. Una placa de soporte unitaria que incluye un depósito interno9puede incluir puertos de intercambio unidireccionales y/o bidireccionales10(por ejemplo, válvulas unidireccionales o bidireccionales). Por ejemplo, una placa de soporte unitaria2que incluye un depósito interno9puede tener un primer puerto de intercambio10que permite el flujo de líquido hacia el depósito interno, y un segundo puerto de intercambio que permite el flujo de líquido fuera del depósito interno. En otro ejemplo, una placa de soporte unitaria2que incluye un depósito interno9puede tener un único puerto de intercambio bidireccional10que permite el flujo de líquido dentro y fuera del depósito interno10. El fluido presente en el depósito interno10puede fluir hacia dentro y/o hacia fuera del o de los recipientes5mediante el uso de uno o más puertos6y/o conductos 7.

[0073]En algunos ejemplos, la placa de cultivo celular de múltiples pocillos comprende además una placa de cubierta configurada para cubrir la placa de soporte unitaria2y la o las aberturas4(por ejemplo, todas las aberturas4en la placa de soporte unitaria2), evitar la contaminación (por ejemplo, bacteriana (por ejemplo, micobacteriana), viral o fúngica) del o de los recipientes de cultivo5, y permitir el intercambio de gases entre el o los recipientes de cultivo5y el entorno externo. En algunas realizaciones, la placa de cultivo de múltiples pocillos comprende además una membrana desechable permeable a los gases o una capa de silicona permeable a los gases dispuesta entre la placa de cubierta y la placa de soporte unitaria2para evitar la contaminación del o de los recipientes de cultivo5, al tiempo que permite el intercambio de gases entre el o los recipientes de cultivo5y el entorno externo.

[0074]Un fluido puede fluir a través de cualquiera de los sistemas (por ejemplo, dentro y/o fuera del sistema, por ejemplo, dentro y/o fuera de un puerto6, dentro y/o fuera de un conducto7, o dentro y/o fuera de un puerto de intercambio10) descritos en este documento utilizando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica para, por ejemplo, presión de fluido, presión de aire, fuerza gravitacional y presión mecánica. Por ejemplo, el fluido puede moverse a través de cualquiera de los sistemas descritos aquí utilizando una bomba, fuerza gravitacional, fuerza centrífuga o presión mecánica. Son bien conocidos en la técnica métodos adicionales para hacer fluir un fluido a través de cualquiera de los sistemas descritos en este documento.

Métodos de cultivo de una célula CHO

[0075]En un método que es ejemplar de los descritos en este documento, primero se proporciona una placa de múltiples pocillos. Se añade un primer medio de cultivo líquido al pocillo o pocillos de manera que el medio ocupe entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 70 % (por ejemplo, entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 65 %, entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 60 %, entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 55 %, entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 50 %, entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 45 %, entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 40 %, entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 35 %, entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 30 %, entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 70 %, entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 65 %, entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 60 %, entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 55 %, entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 50 %, entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 45 %, entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 40 %, entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 35 %, entre aproximadamente el 15 % y aproximadamente el 15 % 70 %, entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 65 %, entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 60 %, entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 55 %, entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 50 %, entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 45 %, entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 40 %, entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 70 %, entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 65 %, entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 60 %, entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 55 %, entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 50 %, entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 45 %, entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 70 %, entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 65 %, entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 60 %, entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 55 %, o entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 50 %) del volumen del pocillo. Se añade al menos una célula CHO al primer medio de cultivo líquido, es decir, antes de añadir el medio al pocillo o después. La placa de múltiples pocillos se incuba durante un período de tiempo a aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C y se agita, por ejemplo, en un dispositivo de agitación rotatorio, a aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 500 RPM (por ejemplo, cualquiera de los intervalos ejemplares de agitación descritos en este documento). Las células pueden incubarse, por ejemplo, en una incubadora, tal como una incubadora de agitación con un diámetro de recorrido (órbita) de aproximadamente 3 mm y aproximadamente 50 mm. Durante la incubación, de forma continua o periódica, se retira un primer volumen del primer medio de cultivo líquido (p. ej., que contenga cualquier concentración de células CHO, p. ej., un primer volumen del primer medio de cultivo líquido que esté o se haya preparado sustancialmente libre de células CHO) y se añade un segundo volumen de un segundo medio de cultivo líquido al primer medio de cultivo líquido. Normalmente, el primer y el segundo volumen son aproximadamente iguales, pero pueden variar en una pequeña cantidad, por ejemplo, aproximadamente 1 % y aproximadamente 10 % (por ejemplo, aproximadamente 1 % y aproximadamente 8 %, aproximadamente 1 % y aproximadamente 5 %, o aproximadamente 1 % y aproximadamente 3 %) cuando se comparan el primer y el segundo volumen. En algunas realizaciones, el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido es menor (por ejemplo, como máximo aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 % menos) que el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado. Como se sabe en la técnica, el término incubar puede incluir períodos cortos de tiempo (por ejemplo, como máximo 1 minuto, como máximo 2 minutos, como máximo 3 minutos, como máximo 4 minutos, como máximo 5 minutos, como máximo 10 minutos, como máximo 20 minutos, como máximo 30 minutos, como máximo 40 minutos, como máximo 50 minutos o como máximo 1 hora) en los que una placa de múltiples pocillos que contiene la célula CHO y el medio de cultivo líquido se retira de una incubadora para retirar el primer volumen del primer medio de cultivo líquido y añadir el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido. En algunos ejemplos, el término incubar no incluye períodos cortos de tiempo en los cuales una placa de múltiples pocillos que contiene la célula CHO y el medio de cultivo líquido se retira de una incubadora para retirar el primer volumen del primer medio de cultivo líquido y añadir el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido (por ejemplo, a través del uso de un sistema de placa de cultivo de múltiples pocillos descrito en este documento).

[0076]A continuación se describen varios ejemplos no limitativos de cada aspecto de estos métodos de cultivo. Los aspectos ejemplares de los métodos proporcionados en este documento se pueden utilizar en cualquier combinación sin limitación.

Medios de cultivo

[0077]Los medios de cultivo líquidos son conocidos en la técnica. El primer y/o segundo medio de cultivo de tejidos se puede complementar con un suero de mamífero (por ejemplo, suero bovino fetal y suero bovino) y/o una hormona de crecimiento o un factor de crecimiento (por ejemplo, insulina, transferrina y factor de crecimiento epidérmico). Alternativamente o además, el primer y/o segundo medio de cultivo líquido puede ser un medio de cultivo líquido químicamente definido, un medio de cultivo líquido libre de componentes derivados de animales, un medio de cultivo líquido sin suero, un medio de cultivo líquido que contiene suero o un medio de cultivo líquido libre de proteínas. Se encuentran disponibles comercialmente ejemplos no limitativos de medios de cultivo líquidos químicamente definidos, medios de cultivo líquidos libres de componentes derivados de animales, medios de cultivo líquidos sin suero y medios de cultivo líquidos que contienen suero.

[0078]Un medio de cultivo líquido generalmente contiene una fuente de energía (por ejemplo, un hidrato de carbono, tal como la glucosa), aminoácidos esenciales (por ejemplo, el conjunto básico de veinte aminoácidos más cisteína), vitaminas y/u otros compuestos orgánicos requeridos en concentraciones bajas, ácidos grasos libres y/u oligoelementos. El primer y/o segundo medio de cultivo líquido puede, si se desea, complementarse con, por ejemplo, una hormona o factor de crecimiento de mamíferos (por ejemplo, insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales y tampones (por ejemplo, sales de calcio, magnesio y fosfato), nucleósidos y bases (por ejemplo, adenosina, timidina e hipoxantina), hidrolizados de proteínas y tejidos, y/o cualquier combinación de estos aditivos.

[0079]Los ejemplos no limitativos de medios de cultivo líquidos que son particularmente útiles en los métodos descritos actualmente incluyen, por ejemplo, CD CHO, Opti CHO y Forti CHO (todos disponibles en Life Technologies; Grand Island, NY), medio Hycell CHO (Thermo Fisher Scientific, Inc.; Waltham, MA), medio Ex-cell CD CHO Fusion (Sigma-Aldrich Co.; St. Louis, MO) y medio PowerCHO (Lonza Group, Ltd.; Basilea, Suiza). Los componentes del medio que también pueden ser útiles en los métodos actuales incluyen, pero no se limitan a, hidrolizados químicamente definidos (CD), por ejemplo, peptona CD, polipéptidos CD (dos o más aminoácidos) y factores de crecimiento CD. En la técnica se conocen ejemplos adicionales de medios de cultivo de tejidos líquidos y de componentes de medios.

[0080]En algunos ejemplos de cualquiera de los métodos descritos en este documento, la célula CHO se suspende en aproximadamente 100 gl a aproximadamente 25 ml (por ejemplo, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 20 ml, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 15 ml, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 10 ml, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 8 ml, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 6 ml, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 4 ml, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 3 ml, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 2,5 ml, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 2,0 ml, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 1,5 ml, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 1,0 ml, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 800 gl, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 600 gl, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 500 gl, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 400 gl, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 300 gl, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 250 gl, aproximadamente 100 gl a aproximadamente 200 gl, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 25 ml, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 20 ml, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 15 ml, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 10 ml, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 8 ml, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 6 ml, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 4 ml, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 3 ml, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 2,5 ml, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 2,0 ml, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 1,5 ml, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 1,0 ml, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 800 gl, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 600 gl, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 500 gl, aproximadamente 150 gl y aproximadamente 400 gl, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 300 gl, aproximadamente 150 gl a aproximadamente 200 gl, aproximadamente 250 gl a aproximadamente 25 ml, aproximadamente 250 gl a aproximadamente 20 ml, aproximadamente 250 gl a aproximadamente 15 ml, aproximadamente 250 gl a aproximadamente 10 ml, aproximadamente 250 gl a aproximadamente 8 ml, aproximadamente 250 gl a aproximadamente 6 ml, aproximadamente 250 gl a aproximadamente 5 ml, aproximadamente 250 gl a aproximadamente 4 ml, aproximadamente 250 gl a aproximadamente 3 ml, aproximadamente 250 gl a aproximadamente 2,5 ml, aproximadamente 250 gl a aproximadamente 2 ml, aproximadamente 250 gl a aproximadamente 1 mL, aproximadamente 500 gl a aproximadamente 25 ml, aproximadamente 500 gl a aproximadamente 20 ml, aproximadamente 500 gl a aproximadamente 15 ml, aproximadamente 500 gl a aproximadamente 10 ml, aproximadamente 500 gl a aproximadamente 8 ml, aproximadamente 500 gl a aproximadamente 6 ml, aproximadamente 500 gl a aproximadamente 5 ml, aproximadamente 500 gl a aproximadamente 4 ml, aproximadamente 500 gl a aproximadamente 3 ml, aproximadamente 500 gl a aproximadamente 2,5 ml, aproximadamente 500 gl a aproximadamente 2 ml, aproximadamente 500 gl a aproximadamente 1 ml, aproximadamente 1 ml a aproximadamente 25 ml, aproximadamente 1 ml a aproximadamente 20 ml, aproximadamente 1 ml a aproximadamente 15 ml, aproximadamente 1 ml a aproximadamente 10 ml, aproximadamente 1 ml a aproximadamente 8 ml, aproximadamente 1 ml a aproximadamente 6 ml, aproximadamente 1 ml a aproximadamente 5 ml, aproximadamente 1 ml a aproximadamente 4 ml, aproximadamente 1 ml a aproximadamente 3 ml, aproximadamente 1 ml a aproximadamente 2,5 ml o aproximadamente 1 ml a aproximadamente 2 mL) del primer medio de cultivo.

[0081]Los expertos apreciarán que el primer medio de cultivo líquido y el segundo medio de cultivo líquido descritos en este documento pueden ser el mismo tipo de medio o medios diferentes.

Microportadores

[0082]En algunos ejemplos en los que la célula CHO es una célula adherente, el primer y/o segundo medio de cultivo líquido incluye una pluralidad de microportadores. Por ejemplo, el pocillo puede contener una concentración final de microportadores de, p. ej., aproximadamente 1,0 g/l a aproximadamente 15,0 g/l (p. ej., una concentración final en el matraz de agitación de entre aproximadamente 1,0 g/l a aproximadamente 2,5 g/l, aproximadamente 1,0 g/l a aproximadamente 2,0 g/l, aproximadamente 1,0 g/l a aproximadamente 1,75 g/l, aproximadamente 1,0 g/l a aproximadamente 1,5 g/l, aproximadamente 1,0 g/l a aproximadamente 1,25 g/l, aproximadamente 2,5 g/l a 5,0 g/l, aproximadamente 5,0 g/l a aproximadamente 7,5 g/l, aproximadamente 7, 5 g/l a aproximadamente 10,0 g/l, aproximadamente 10,0 g/l a aproximadamente 12,5 g/l, aproximadamente 12,5 g/l a aproximadamente 15,0 g/l, aproximadamente 1,0 g/l a aproximadamente 5,0 g/l, aproximadamente 5,0 g/l a aproximadamente 10,0 g/l, aproximadamente 10,0 g/l a aproximadamente 15,0 g/l, aproximadamente 2,5 g/l a aproximadamente 3,5 g/l, aproximadamente 3,0 g/l a aproximadamente 4,0 g/l, aproximadamente 4,0 g/l a aproximadamente 5,0 g/l, aproximadamente 5,0 g/l a aproximadamente 6,0 g/l, aproximadamente 6,0 g/l a aproximadamente 7,0 g/l, aproximadamente 7,0 g/l a aproximadamente 8,0 g/l, aproximadamente 8,0 g/l a aproximadamente 9,0 g/l, aproximadamente 9,0 g/l a aproximadamente 10,0 g/l, aproximadamente 10,0 g/l a aproximadamente 11,0 g/l, aproximadamente 11,0 g/l a aproximadamente 12,0 g/l, aproximadamente 12,0 g/l a aproximadamente 13,0 g/l, aproximadamente 13,0 g/l a aproximadamente 14,0 g/l, o aproximadamente 14,0 g/l a aproximadamente 15,0 g/l).

[0083]En algunas realizaciones, la pluralidad de microportadores puede tener un diámetro promedio de entre aproximadamente 20 gm y aproximadamente 1 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 20 gm y aproximadamente 250 gm, entre aproximadamente 100 gm y aproximadamente 250 gm, entre aproximadamente 150 gm y aproximadamente 250 gm, entre aproximadamente 250 gm y 500 gm, entre aproximadamente 200 gm y aproximadamente 300 gm, entre aproximadamente 750 gm y 1 mm, entre aproximadamente 200 gm y aproximadamente 800 gm, entre aproximadamente 200 gm y aproximadamente 500 gm, o entre aproximadamente 500 gm y aproximadamente 800 gm), donde los microportadores tienen una superficie que es permisiva o promueve la unión de una célula CHO. En algunos ejemplos, un microportador puede contener uno o más poros (p. ej., uno o más poros con un diámetro promedio de aproximadamente 10 gm a aproximadamente 100 gm (p. ej., entre aproximadamente 10 gm y 20 gm, aproximadamente 20 gm a aproximadamente 30 gm, aproximadamente 30 gm a aproximadamente 40 gm, aproximadamente 50 gm a aproximadamente 60 gm, aproximadamente 60 gm a aproximadamente 70 gm, aproximadamente 70 gm a aproximadamente 80 gm, aproximadamente 80 gm a aproximadamente 90 gm, aproximadamente 90 gm a aproximadamente 100 gm, aproximadamente 10 gm a aproximadamente 45 gm, aproximadamente 45 gm a aproximadamente 80 gm, aproximadamente 25 gM a aproximadamente 35 gm, o aproximadamente 30 gm)). En algunas realizaciones, la superficie de la pluralidad de microportadores y/o la superficie de uno o más poros en la pluralidad de microportadores están recubiertas con un agente que promueve la unión de una célula CHO al microportador (por ejemplo, la unión a la superficie exterior de los microportadores y/o la superficie de los poros en el microportador). Los ejemplos de dichos agentes que se pueden utilizar para promover la unión de una célula CHO incluyen, entre otros, gelatina, colágeno, poli-L-ornitina, poliestireno y laminina.

[0084]En algunos ejemplos, los microportadores tienen un área superficial de unión celular efectiva promedio de entre aproximadamente 0,5 m2/g seco y 2,0 m2/g seco (por ejemplo, entre aproximadamente 0,75 m2/g seco y 1,25 m2/seco, entre aproximadamente 1,0 m2/g seco y aproximadamente 1,5 m2/seco, entre aproximadamente 1,25 m2/seco y aproximadamente 1,5 m2/seco, aproximadamente 1,5 m2/seco y aproximadamente 2,0 m2/seco, o aproximadamente 1,1 m2/seco). En algunos ejemplos, los microportadores tienen un volumen promedio de aproximadamente 10 ml/g seco a aproximadamente 70 ml/g seco (por ejemplo, aproximadamente 10 ml/g seco a aproximadamente 20 ml/g seco, aproximadamente 20 ml/g seco a aproximadamente 30 ml/g seco, aproximadamente 30 ml/g seco a aproximadamente 40 ml/g seco, aproximadamente 40 ml/g seco a aproximadamente 50 ml/g seco, aproximadamente 50 ml/g seco a aproximadamente 60 ml/g seco, aproximadamente 60 ml/g seco a aproximadamente 70 ml/g seco, aproximadamente 10 ml/g seco a aproximadamente 40 ml/g seco, aproximadamente 30 ml/g seco a aproximadamente 40 ml/g seco, aproximadamente 40 ml/g seco a aproximadamente 70 ml/g seco, o aproximadamente 40 ml/g seco). En algunas realizaciones, la densidad relativa promedio de los microportadores está entre 0,8 g/ml y aproximadamente 1,2 g/ml (por ejemplo, aproximadamente 0,8 g/ml a aproximadamente 0,9 g/ml, aproximadamente 0,9 g/ml a aproximadamente 1,0 g/ml, aproximadamente 1,0 g/ml a aproximadamente 1,1 g/ml, aproximadamente 1,0 g/ml, aproximadamente 1,1 g/ml a aproximadamente 1,2 g/ml, aproximadamente 0,95 g/ml a aproximadamente 1,05 g/ml o aproximadamente 1,03 g/ml).

[0085]En algunas realizaciones, los microportadores tienen forma aproximadamente esférica o elipsoidal. En otros ejemplos, los microportadores tienen una superficie desgastada o rugosa con pequeñas protuberancias que aumentan la superficie exterior total del microportador. En algunas realizaciones, los microportadores tienen una estructura de red. En algunos ejemplos, los microportadores son higroscópicos. En algunos ejemplos, los microportadores contienen celulosa. En algunas realizaciones, los microportadores tienen una superficie exterior y/o los poros del microportador tienen una superficie que está cargada positivamente (por ejemplo, cargada positivamente debido a la presencia de grupos N,N,-dietilaminoetilo). En algunos ejemplos, los microportadores tienen una estructura tipo red o similar a una red o a una telaraña. Los microportadores pueden tener una densidad de carga promedio de aproximadamente 0,5 me/g a aproximadamente 2,5 me/g (por ejemplo, aproximadamente 0,5 me/g a aproximadamente 1,5 meq/g, aproximadamente 0,75 meq/g a aproximadamente 1,25 meq/g, aproximadamente 1,1 meq/g, aproximadamente 1,5 meq/g a aproximadamente 2,5 meq/g, aproximadamente 1,5 meq/g a aproximadamente 2,0 meq/g, aproximadamente 1,8 meq/g, aproximadamente 0,5 meq/g a aproximadamente 1,0 meq/g, o aproximadamente 1,0 meq/g a aproximadamente 1,5 meq/g).

[0086]En algunos casos, el microportador puede contener un polímero natural y/o un polímero sintético. Los ejemplos no limitativos de polímeros sintéticos incluyen polietilenglicol (PEG), óxido de polietileno, polietilenimina, dietilenglicol, trietilenglicol, polialcalenglicol, óxido de polialcalino, alcohol polivinílico, polifosfato de sodio, polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, polimetacrilato de hidroxipropilo, poliacrilato de hidroxietilo, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, poliglicerina, poliaspartamida, copolímero de polioxietileno-polioxipropileno (poloxámero), ácidos carboxílicos (p. ej., ácido acrílico, ácido metacrílico, ácido itacónico y ácido maleico), polioxietilenos, óxido de polietileno, ácidos monodicarboxílicos etilénicos insaturados, ácido poliláctico (PLA), óxido de polipropileno, poli(lactida-co-glicolida) (PLGA), poli(épsilon-caprolactona), poli(etiletileno), polibutadieno, poliglicolida, polimetilacrilato, polivinilbutiléter, poliestireno, policiclopentadienilmetilnorborneno, polietilenopropileno, polietileno, poliisobutileno, polisiloxano, acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de propilo, acrilato de n-butilo, acrilato de isobutilo, acrilato de 2-etilo, acrilato de t-butilo, metacrilatos (p. ej., metacrilato de etilo, metacrilato de n-butilo y metacrilato de isobutilo), acrilonitrilos, metacrilonitrilo, vinilos (p. ej., acetato de vinilo, vinilversatato, vinilpropionato, vinilformamida, vinilacetamida, vinilpiridinas y vinilimidazol), aminoalquilos (por ejemplo, acrilatos de aminoalquilo, metacrilatos de aminoalquilo y aminoalquil(met)acrilamidas), estirenos, polialcalinglicol, óxido polialcalino, y ácidos lácticos. Los ejemplos no limitativos de polímeros naturales incluyen celulosa, lecitina y ácido hialurónico. Un microportador puede contener una mezcla de diferentes polímeros (por ejemplo, cualquier combinación de uno o más polímeros descritos en este documento o conocidos en la técnica) en la misma o diferentes proporciones. Cualquiera de los microportadores descritos en este documento puede contener un núcleo que contiene uno o más polímeros (por ejemplo, cualquiera de los polímeros descritos en este documento o conocidos en la técnica) y una capa exterior que contiene uno o más polímeros diferentes (por ejemplo, cualquiera de los polímeros descritos en este documento o conocidos en la técnica).

[0087]Los microportadores ejemplares no limitativos que se pueden utilizar en cualquiera de los métodos descritos en este documento incluyen CytoPoreTM 1 y CytoPoreTM 2 (disponibles en Ge Healthcare, Life Sciences, Piscataway, Nueva Jersey). Existen ejemplos adicionales de microportadores que pueden usarse en cualquiera de los métodos descritos en este documento que están disponibles públicamente y son conocidos en la técnica.

Placas de múltiples pocilios

[0088]En la técnica se conocen diversas placas de múltiples pocillos, y se pueden utilizar en cualquiera de los métodos descritos en este documento. Por ejemplo, una placa de múltiples pocillos puede ser una placa de 2 pocillos, una placa de 4 pocillos, una placa de 6 pocillos, una placa de 8 pocillos, una placa de 9 pocillos, una placa de 10 pocillos, una placa de 12 pocillos, una placa de 15 pocillos, una placa de 18 pocillos, una placa de 20 pocillos, una placa de 24 pocillos, una placa de 36 pocillos, una placa de 48 pocillos, una placa de 60 pocillos, una placa de 72 pocillos o una placa de 96 pocillos. En algunos ejemplos, el pocillo tiene un volumen (un volumen interno) de entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 25 ml (por ejemplo, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 24 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 22 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 20 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 18 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 16 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 14 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 12 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 8 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 6 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 5 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 4 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 3 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 2 ml, entre aproximadamente 0,3 ml y aproximadamente 1 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 25 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 24 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 22 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 20 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 18 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 16 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 14 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 12 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 8 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 6 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 5 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 4 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 3 ml, entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 2 ml , entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 1 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 25 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 24 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 22 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 20 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 18 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 16 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 14 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 12 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 8 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 7 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 6 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 5 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 4 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 3,5 ml, entre entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 3 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 2,5 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 2 ml, entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 1,5 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 25 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 24 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 22 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 20 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 18 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 16 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 14 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 12 ml, entre aproximadamente 1,5 ml

y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 8 ml, entre aproximadamente 1,5

ml y aproximadamente 6 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 5 ml, entre aproximadamente 1,5

ml y aproximadamente 4 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 3,5 ml, entre aproximadamente

1.5 ml y aproximadamente 3 ml, entre aproximadamente 1,5 ml y aproximadamente 2,5 ml, entre aproximadamente

1.5 ml y aproximadamente 2,0 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 25 ml, entre aproximadamente

2 ml y aproximadamente 24 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 22 ml, entre aproximadamente

2 ml y aproximadamente 20 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 18 ml, entre aproximadamente

2 ml y aproximadamente 16 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 14 ml, entre aproximadamente

2 ml y aproximadamente 12 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente

2 ml y aproximadamente 8 ml, entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 6 ml, o entre aproximadamente 2

ml y aproximadamente 5 ml).

[0089]En algunos ejemplos, la placa de múltiples pocillos es una placa de pocillos profundos. Por ejemplo, la

altura interna de un pocillo en una placa de pocillos profundos puede estar entre 1 cm y aproximadamente 12 cm

(por ejemplo, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 10 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 8 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 7 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 6 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 5 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 4 cm, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 3 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 12 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 1,2

cm y aproximadamente 10 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente

1,2 cm y aproximadamente 8 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 7 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 6 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 5 cm,

entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 4 cm, entre aproximadamente 1,2 cm y aproximadamente 3

cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente

10 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 8 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 7 cm, entre aproximadamente 1,5 cm

y aproximadamente 6 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 5 cm, entre aproximadamente 1,5

cm y aproximadamente 4 cm, entre aproximadamente 1,5 cm y aproximadamente 3 cm, entre aproximadamente

2 cm y aproximadamente 12 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente

2 cm y aproximadamente 10 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente

2 cm y aproximadamente 8 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 7 cm, entre aproximadamente

2 cm y aproximadamente 6 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 5 cm, entre aproximadamente

2 cm y aproximadamente 4 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 3 cm, entre aproximadamente

2.5 cm y aproximadamente 12 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 10 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 9 cm,

entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 8 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 7

cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 6 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente

5 cm, entre aproximadamente 2,5 cm y aproximadamente 4 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente

12 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente

10 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente

8 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente 7 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente

6 cm, entre aproximadamente 3 cm y aproximadamente 5 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente

12 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente

10 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente 9 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente

8 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente 7 cm, entre aproximadamente 4 cm y aproximadamente

6 cm, entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 12 cm, entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 11 cm, entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 10 cm, entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente

9 cm, entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente 8 cm, o entre aproximadamente 5 cm y aproximadamente

7 cm).

[0090]En algunos ejemplos, el pocillo (por ejemplo, en una placa de múltiples pocillos de pocillos profundos) puede

tener un fondo plano (también llamado fondo cuadrado), un fondo redondo (también llamado fondo hemisférico),

un fondo cónico o un fondo piramidal. En algunas realizaciones, el diámetro de cualquiera de los pocillos descritos

en este documento puede estar entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 50 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 45 mm, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 40

mm, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente

4.0 mm y aproximadamente 20 mm, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 15 mm, entre aproximadamente 4,0 mm y aproximadamente 10 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 50

mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 45 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 40 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente

6.0 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 20

mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 15 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 10 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 50 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 45 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 40 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 20 mm, entre aproximadamente 8 mm y aproximadamente 15 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 50 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 45 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 40 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 20 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 50 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 45 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 40 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 25 mm, o entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 20 mm).

[0091]En algunos ejemplos, la placa de múltiples pocillos está sellada (por ejemplo, sellada con una membrana desechable permeable a gas o una capa de silicona permeable a gas). En los Ejemplos se describen ejemplos no limitativos de materiales utilizados para sellar una placa de múltiples pocillos. Los materiales adicionales utilizados para sellar una placa de múltiples pocillos son bien conocidos en la técnica.

[0092]La superficie interior de los pocillos puede tener al menos un recubrimiento (por ejemplo, al menos un recubrimiento de gelatina, colágeno, poli-L-ornitina, poliestireno y laminina). Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de placas de múltiples pocillos (por ejemplo, diferentes formas y dimensiones del o de los pocillos) y revestimientos de superficies interiores del o de los pocillos, y se pueden utilizar en los presentes métodos.

Agitación

[0093]Los métodos descritos en este documento requieren la agitación rotatoria del cultivo que contiene la célula CHO y el primer y/o segundo medio de cultivo líquido. La agitación rotatoria puede ocurrir a una frecuencia de aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 500 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 480 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 460 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 400 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 380 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 500 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 480 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 460 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 400 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 380 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 500 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 480 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 460 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 400 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 500 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 480 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 460 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 380 RPM a aproximadamente 500 RPM, aproximadamente 380 RPM a aproximadamente 480 RPM, aproximadamente 380 RPM a aproximadamente 460 RPM, aproximadamente 380 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 400 RPM a aproximadamente 500 RPM, aproximadamente 400 RPM a aproximadamente 480 RPM, o aproximadamente 400 RPM a aproximadamente 460 RPM) (por ejemplo, en una incubadora, tal como una incubadora de agitación con un diámetro de recorrido (órbita) de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 50 mm).

[0094]Como se puede apreciar en la técnica, el nivel de agitación (por ejemplo, velocidad RPM) se puede variar dependiendo del tamaño y la forma del pocillo (por ejemplo, uno o más del diámetro, forma y altura del pocillo) y el diámetro de recorrido (órbita) de la incubadora que se utiliza para realizar la incubación. Por ejemplo, un diámetro de recorrido (órbita) más pequeño puede requerir un mayor nivel de agitación (por ejemplo, una mayor velocidad de RPM), mientras que un diámetro de recorrido (órbita) más grande puede requerir un menor nivel de agitación (por ejemplo, una menor velocidad de RPM) para lograr un nivel similar de fuerza de cizallamiento del fluido y concentración de O2 disuelto. En otro ejemplo, un pocillo que tiene un diámetro mayor puede requerir una velocidad de RPM menor, mientras que un pocillo que tiene un diámetro menor puede requerir una velocidad de RPM mayor para lograr un nivel similar de fuerza de cizallamiento del fluido y concentración de O2 disuelto.

[0095]En algunas realizaciones, la incubación se realiza utilizando una incubadora de tubo de agitación con un diámetro de recorrido (órbita) de entre aproximadamente 3 mm y aproximadamente 50 mm (p. ej., entre aproximadamente 3 mm y aproximadamente 25 mm, o entre aproximadamente 25 mm y aproximadamente 50 mm) y una agitación de entre aproximadamente 320 RPM y aproximadamente 500 RPM (p. ej., entre aproximadamente 320 RPM y aproximadamente 480 RPM, entre aproximadamente 320 RPM y aproximadamente 460 RPM, aproximadamente 320 RPM y aproximadamente 400 RPM, entre aproximadamente 320 RPM y aproximadamente 380 RPM, entre aproximadamente 320 RPM y aproximadamente 360 RPM, entre aproximadamente 320 RPM y aproximadamente 350 RPM, entre aproximadamente 320 RPM y aproximadamente 340 RPM, entre aproximadamente 330 RPM y aproximadamente 500 RPM, entre aproximadamente 330 RPM y aproximadamente 480 RPM, entre aproximadamente 330 RPM y aproximadamente 460 RPM, entre aproximadamente 330 RPM y aproximadamente 440 RPM, entre aproximadamente 330 RPM y aproximadamente 420 RPM, entre aproximadamente 330 RPM y aproximadamente 400 RPM, entre aproximadamente 330 RPM y aproximadamente 380 RPM, entre aproximadamente 330 RPM y aproximadamente 370 RPM, entre aproximadamente 330 RPM y aproximadamente 360 RPM, entre aproximadamente 330 RPM y aproximadamente 350 RPM, entre aproximadamente 340 RPM y aproximadamente 500 RPM, entre aproximadamente 340 RPM y aproximadamente 480 RPM, 340 RPM y aproximadamente 460 RPM, entre aproximadamente 340 RPM y aproximadamente 440 RPM, entre aproximadamente 340 RPM y aproximadamente 420 RPM, entre aproximadamente 340 RPM y aproximadamente 400 RPM, entre aproximadamente 340 RPM y aproximadamente 380 RPM, entre aproximadamente 340 RPM y aproximadamente 370 RPM, entre aproximadamente 340 RPM y aproximadamente 360 RPM, entre aproximadamente 350 RPM y aproximadamente 500 RPM, entre aproximadamente 350 RPM y aproximadamente 480 RPM, entre aproximadamente 350 RPM y aproximadamente 460 RPM, entre aproximadamente 350 RPM y aproximadamente 440 RPM, entre aproximadamente 350 RPM y aproximadamente 420 RPM, entre aproximadamente 350 RPM y aproximadamente 400 RPM, entre aproximadamente 350 RPM y aproximadamente 390 RPM, entre aproximadamente 350 RPM y aproximadamente 380 RPM, entre aproximadamente 350 RPM y aproximadamente 370 RPM, entre aproximadamente 360 RPM y aproximadamente 500 RPM, entre aproximadamente 360 RPM y aproximadamente 480 RPM, entre aproximadamente 360 RPM y aproximadamente 460 RPM, entre aproximadamente 360 RPM y aproximadamente 440 RPM, entre aproximadamente 360 RPM y aproximadamente 420 RPM, entre aproximadamente 360 RPM y aproximadamente 400 RPM, entre aproximadamente 360 RPM y aproximadamente 380 RPM, o entre aproximadamente 400 RPM y aproximadamente 500 RPM). La agitación rotatoria se puede realizar, por ejemplo, utilizando agitación circular rotatoria o agitación elipsoidal rotatoria. La agitación puede realizarse de forma continua o periódica.

[0096]La agitación rotatoria de la placa de múltiples pocillos puede dar como resultado esencialmente la misma fuerza de cizallamiento del fluido y concentración de oxígeno disuelto (O2) que la lograda en un pocillo de fondo cuadrado que tiene un diámetro de entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 35 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 20 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 15 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 20 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 20 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 20 mm y aproximadamente 30 mm, o entre aproximadamente 25 mm y aproximadamente 35 mm) y una altura de entre aproximadamente 40 mm y aproximadamente 50 mm (p. ej., entre aproximadamente 40 mm y aproximadamente 45 mm o entre aproximadamente 45 mm y aproximadamente 50 mm) que contiene un medio de cultivo líquido que ocupa aproximadamente entre el 10 % y aproximadamente el 40 % (p. ej., aproximadamente entre el 10 % y aproximadamente el 35 %, aproximadamente entre el 10 % y aproximadamente el 30 %, aproximadamente entre el 10 % y aproximadamente el 25 %, aproximadamente entre el 10 % y aproximadamente el 20 %, aproximadamente entre el 10 % y aproximadamente el 15 %, entre aproximadamente el 15 % y aproximadamente el 40 %, aproximadamente entre el 15 % y aproximadamente el 35 %, aproximadamente entre el 15 % y aproximadamente el 30 %, aproximadamente entre el 15 % y aproximadamente el 25 %, aproximadamente entre el 15 % y aproximadamente el 20 %, aproximadamente entre el 20 % y aproximadamente el 40 %, aproximadamente entre el 20 % y aproximadamente el 35 %, aproximadamente entre el 20 % y aproximadamente el 30 %, aproximadamente entre el 20 % y aproximadamente el 25 %, aproximadamente entre el 25 % y aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 35 %, o entre aproximadamente el 35 % y aproximadamente el 40 %) del volumen del pocillo incubado a una temperatura de aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C, y agitado a una frecuencia de aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 450 RPM (por ejemplo, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 400 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 390 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 380 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 370 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 360 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 350 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 340 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 330 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 400 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 390 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 380 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 370 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 360 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 350 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 340 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 400 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 390 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 380 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 370 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 360 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 350 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 400 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 390 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 380 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 370 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 360 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 400 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 390 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 380 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 370 RPM, aproximadamente 370 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 370 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 370 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 370 RPM a aproximadamente 390 RPM, aproximadamente 390 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 390 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 390 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 410 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 410 RPM a aproximadamente 430 RPM, o aproximadamente 430 RPM a aproximadamente 450 RPM).

[0097]La agitación rotatoria se puede realizar utilizando una incubadora controlada con atmósfera humidificada (por ejemplo, a una humedad de más de 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, o una humedad del 100 %) con un dispositivo mecánico que proporciona la agitación de una o más de las placas de múltiples pocillos que contienen la célula CHO y un medio de cultivo líquido (por ejemplo, el primer y/o segundo medio de cultivo líquido).

Temperatura

[0098]Los métodos de cultivo descritos en este documento pueden realizarse a una temperatura de aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C. Los expertos comprenderán que la temperatura puede modificarse en momentos específicos del método de cultivo, por ejemplo cada hora o cada día. Por ejemplo, la temperatura se puede cambiar o desplazar (por ejemplo, aumentar o disminuir) aproximadamente un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, siete días, ocho días, nueve días, diez días, once días, doce días, catorce días, quince días, dieciséis días, diecisiete días, dieciocho días, diecinueve días o aproximadamente veinte días o más después de la siembra inicial del pocillo con la célula CHO). Por ejemplo, la temperatura puede desplazarse hacia arriba (por ejemplo, un cambio de hasta o aproximadamente 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o hasta o aproximadamente 20 grados C). Por ejemplo, la temperatura se puede desplazar hacia abajo (por ejemplo, un cambio de hasta o aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o hasta o aproximadamente 20 °C).

Eliminación y reemplazo del medio de cultivo

[0099]Los métodos descritos en este documento incluyen retirar de los pocillos un primer volumen de un primer medio de cultivo líquido (por ejemplo, que contenga cualquier concentración de células CHO, por ejemplo, un primer volumen de un primer medio de cultivo líquido que esté sustancialmente libre de células) y añadir al primer medio de cultivo líquido un segundo volumen de un segundo medio de cultivo líquido. La eliminación y la adición se pueden realizar de forma simultánea o secuencial, o una combinación de ambas. Además, la eliminación y adición se pueden realizar de forma continua (p. ej., a una velocidad que extrae y reemplaza un volumen de entre el 0,1 % y el 700 % (p. ej., entre el 1 % y el 600 %, entre el 1 % y el 500 %, entre el 1 % y el 400 %, entre el 1 % y el 350 %, entre el 1 % y el 300 %, entre el 1 % y el 250 %, entre el 1 % y el 100 %, entre el 100 % y el 200 %, entre el 5 % y el 150 %, entre el 10 % y el 50 %, entre el 15 % y el 40 %, entre el 8 % y el 80 %, o entre el 4 % y el 30 %) del volumen del pocillo o del primer volumen de medio de cultivo líquido durante cualquier período de tiempo determinado (p. ej., durante un período de 24 horas, durante un período de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas, o durante un período de tiempo incremental de más de 24 horas)) o periódicamente (por ejemplo, una vez cada tres días, una vez cada dos días, una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día o cinco veces al día), o cualquier combinación de las mismas. Cuando se realiza periódicamente, el volumen que se extrae o reemplaza (por ejemplo, dentro de un período de aproximadamente 24 horas, dentro de un período de tiempo incremental de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 24 horas, o dentro de un período de tiempo incremental de más de 24 horas) puede estar, p. ej., entre el 0,1 % y el 700 % (p. ej., entre el 1 % y el 700 %, entre el 1 % y el 600 %, entre el 1 % y el 500 %, entre el 1 % y el 400 %, entre el 1 % y el 300 %, entre el 1 % y el 200 %, entre el 1 % y el 100 %, entre el 100 % y el 200 %, entre el 5 % y el 150 %, entre el 10 % y el 50 %, entre el 15 % y el 40 %, entre el 8 % y el 80 %, o entre el 4 % y el 30 %) del volumen del pocillo o del primer volumen de medio de cultivo líquido. El primer volumen del primer medio de cultivo líquido extraído y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido pueden, en algunos casos, mantenerse aproximadamente iguales durante cada período de 24 horas (o, como alternativa, un período de tiempo incremental de alrededor de 1 hora a alrededor de 24 horas o un período de tiempo incremental de más de 24 horas) durante todo o parte del período de cultivo. Como se sabe en la técnica, la velocidad a la que se extrae el primer volumen del primer medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) y la velocidad a la que se añade el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) se pueden variar. La velocidad a la que se extrae el primer volumen del primer medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) y la velocidad a la que se añade el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido (volumen/unidad de tiempo) pueden ser aproximadamente la misma o pueden ser diferentes.

[0100]Alternativamente, el volumen extraído y añadido pueden cambiar (por ejemplo, aumentar gradualmente) durante cada período de 24 horas (o alternativamente, un período de tiempo incremental de entre 1 hora y aproximadamente 24 horas o un período de tiempo incremental de más de 24 horas) durante el período de cultivo. Se describen aquí ejemplos no limitativos de métodos que incluyen un aumento gradual de los volúmenes. Por ejemplo, el volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido dentro de cada período de 24 horas (o alternativamente, un período de tiempo incremental de entre aproximadamente 1 hora y más de 24 horas o un período de tiempo incremental de más de 24 horas) durante el período de cultivo se puede aumentar (por ejemplo, gradualmente o mediante incrementos escalonados) durante el período de cultivo desde un volumen que está entre el 0,5 % y aproximadamente el 30 % del volumen del pocillo o el volumen del primer medio de cultivo líquido hasta aproximadamente el 30 % y aproximadamente el 200 % del volumen del pocillo o el volumen del primer medio de cultivo líquido.

[0101]En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en este documento, la placa de múltiples pocillos se incuba durante un período de tiempo mayor a 7 días, y en los días 1 a 3 de incubación, en cada período de 24 horas, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido está entre aproximadamente el 30 % y aproximadamente el 50 % del volumen del primer medio de cultivo líquido; en los días 4 a 6 de la incubación, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido está entre aproximadamente el 30 % y aproximadamente el 50 % del volumen del primer medio de cultivo líquido; y en el día 7 y posteriores de la incubación, en cada período de 24 horas, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido está entre aproximadamente el 90 % y aproximadamente el 150 % del volumen del primer medio de cultivo líquido.

[0102]En otros ejemplos, después de aproximadamente las primeras 24 a 48 horas del período de tiempo, en cada período de 24 horas, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido es de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 300 % (por ejemplo, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 280 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 260 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 240 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 220 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 200 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 180 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 160 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 150 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 140 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 120 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 100 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 60 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 300 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 280 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 260 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 240 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 220 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 200 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 180 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 160 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 140 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 120 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 300 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 280 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 260 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 240 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 220 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 200 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 180 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 160 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 140 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 120 '%, aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 %, o aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 % del volumen del primer medio de cultivo líquido.

[0103]Los expertos apreciarán que el primer medio de cultivo líquido y el segundo medio de cultivo líquido pueden ser el mismo tipo de medio. En otros casos, el primer medio de cultivo líquido y el segundo medio de cultivo líquido pueden ser diferentes.

[0104]El primer volumen del primer medio de cultivo líquido se puede retirar, por ejemplo, centrifugando (por ejemplo, centrifugación a baja velocidad en un balde oscilante) la placa de múltiples pocillos y retirando el primer volumen del primer cultivo líquido que está sustancialmente libre de células del sobrenadante. Alternativamente o además, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido se puede eliminar mediante filtración o flujo por gravedad del primer volumen del primer medio de cultivo líquido a través de una membrana estéril con un corte de peso molecular que excluye la célula CHO. Alternativamente o además, el primer medio de cultivo líquido se puede retirar cesando la agitación durante un período de tiempo de al menos 30 segundos (por ejemplo, al menos un minuto, al menos dos minutos, al menos tres minutos, al menos cuatro minutos o al menos cinco minutos) antes de retirar el primer volumen del primer medio de cultivo líquido. El primer volumen del primer medio de cultivo líquido se puede extraer manualmente (por ejemplo, aspirando o pipeteando el primer volumen del primer medio de cultivo líquido del pocillo) o de manera automatizada (por ejemplo, utilizando un dispositivo automatizado o cualquiera de los sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos descritos en este documento).

[0105]El segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido se puede añadir al primer medio de cultivo líquido, por ejemplo, mediante una bomba de perfusión. El segundo medio de cultivo líquido se puede añadir al primer medio de cultivo líquido manualmente (por ejemplo, pipeteando el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido directamente sobre el primer medio de cultivo líquido) o de manera automatizada (por ejemplo, usando un dispositivo automatizado o cualquiera de los sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos descritos en este documento).

[0106]En algunos ejemplos, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido se puede retirar y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido se puede añadir al primer medio de cultivo líquido utilizando cualquiera de los sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos proporcionados en este documento.

[0107]En algunos casos, la eliminación del primer volumen del primer medio de cultivo líquido (por ejemplo, un primer volumen del primer medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células CHO) y la adición al primer medio de cultivo líquido de un segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido no se produce dentro de al menos 1 hora (por ejemplo, dentro de las 2 horas, dentro de las 3 horas, dentro de las 4 horas, dentro de las 5 horas, dentro de las 6 horas, dentro de las 7 horas, dentro de las 8 horas, dentro de las 9 horas, dentro de las 10 horas, dentro de las 12 horas, dentro de las 14 horas, dentro de las 16 horas, dentro de las 18 horas, dentro de las 24 horas, dentro de las 36 horas, dentro de las 48 horas, dentro de las 72 horas, dentro de las 96 horas o después de 96 horas) de la siembra del o de los pocillos con una célula CHO.

[0108]Algunas realizaciones incluyen además añadir periódicamente un volumen adicional de segundo medio de cultivo líquido a cada uno de la pluralidad de pocillos para compensar cualquier disminución en el volumen del primer medio de cultivo líquido debido a la evaporación. Por ejemplo, se puede añadir un volumen adicional de segundo medio de cultivo líquido a cada pocillo, por ejemplo, al menos una vez cada 24 horas, al menos una vez cada 48 horas, al menos una vez cada 72 horas o al menos una vez cada 96 horas. Este volumen adicional de segundo medio de cultivo líquido se puede añadir de manera manual o automatizada (por ejemplo, utilizando un dispositivo automatizado o cualquiera de los sistemas de placas de cultivo celular de múltiples pocillos descritos en este documento).

CO2

[0109]Los métodos descritos en este documento pueden incluir además la incubación de la placa de múltiples pocillos en una atmósfera que contenga como máximo o aproximadamente 15 % de CO2 (por ejemplo, como máximo o aproximadamente 14 % de CO2, 12 % de CO2, 10 % de CO2, 8 % de CO2, 6 % de CO2, 5 % de CO2, 4 % de CO2, 3 % de CO2, 2 % de CO2, o como máximo o aproximadamente 1 % de CO2). Además, cualquiera de los métodos descritos en este documento puede incluir la incubación de la placa de múltiples pocillos en una atmósfera humidificada (por ejemplo, al menos o aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 85 %, 80 %, 85 %, 90 %, o al menos o aproximadamente 95 % de humedad, o aproximadamente 100 % de humedad).

Dispositivos ejemplares

[0110]Los ejemplos no limitativos de dispositivos que se pueden utilizar para realizar los métodos de cultivo descritos en este documento incluyen: Appropriate Technical Resources (Maryland, EE. UU.) distribuye la incubadora de agitación INFORS Multiron (INFORS; Basilea, Suiza) y la incubadora de agitación Kuhner (Kuhner AG; Basilea, Suiza). Los ejemplos no limitativos de dispositivos que pueden usarse para realizar los métodos de cultivo incluyen una incubadora rotatoria con un diámetro de recorrido (órbita) de entre aproximadamente 3 mm y aproximadamente 50 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 1 mm y aproximadamente 25 mm, o entre aproximadamente 25 mm y aproximadamente 50 mm). En la técnica se conocen ejemplos adicionales de incubadoras de agitación e incubadoras de cultivos rodantes.

O2 disuelto y fuerza de cizallamiento del líquido

[0111]También se proporcionan métodos de cultivo que incluyen cultivar en un proceso de perfusión en gradiente una célula CHO suspendida en un medio de cultivo líquido dispuesto dentro de un pocillo de una placa de múltiples pocillos en condiciones que generan en el medio una fuerza de cizallamiento del fluido y una concentración de oxígeno disuelto (O2) que son las mismas (o esencialmente las mismas) que las logradas en un medio que ocupa aproximadamente entre el 10 % y aproximadamente 40 % (por ejemplo, aproximadamente 10 % y aproximadamente aproximadamente 10 % y aproximadamente 30 %, aproximadamente 10 % y aproximadamente aproximadamente 10 % y aproximadamente 20 %, aproximadamente 10 % y aproximadamente aproximadamente 15 % y aproximadamente 40 %, aproximadamente 15 % y aproximadamente aproximadamente 15 % y aproximadamente 30 %, aproximadamente 15 % y aproximadamente aproximadamente 15 % y aproximadamente 20 %, aproximadamente 20 % y aproximadamente aproximadamente 20 % y aproximadamente 35 %, aproximadamente 20 % y aproximadamente aproximadamente 20 % y aproximadamente 25 %, aproximadamente 20 % y aproximadamente aproximadamente 20 % y aproximadamente 35 %, aproximadamente 20 % y aproximadamente 30 %, aproximadamente el 20 % y aproximadamente 25 %, aproximadamente 25 % y aproximadamente 40 %, aproximadamente 25 % y aproximadamente 35 %, aproximadamente 25 % y aproximadamente 30 %, aproximadamente 30 % y aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 % y aproximadamente 35 %, o entre aproximadamente 35 % y aproximadamente 40 %) del volumen de un pocillo de refondo cuadrado que tiene un diámetro de entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 35 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 20 mm, entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 15 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 10 mm y aproximadamente 20 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 35 mm, entre entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 30 mm, entre aproximadamente 15 mm y aproximadamente 25 mm, entre aproximadamente 20 mm y aproximadamente 35 mm, entre aproximadamente 20 mm y aproximadamente 30 mm, o entre aproximadamente 25 mm y aproximadamente 35 mm) y una altura de entre aproximadamente 40 mm y aproximadamente 50 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 40 mm y aproximadamente 45 mm o entre aproximadamente 45 mm y aproximadamente 50 mm), incubado a una temperatura de aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C, y agitado a una frecuencia de aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 450 RPM (por ejemplo, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 400 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 390 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 380 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 370 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 360 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 350 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 340 RPM, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 330 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 400 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 390 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 380 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 370 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 360 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 350 RPM, aproximadamente 330 RPM a aproximadamente 340 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 400 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 390 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 380 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 370 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 360 RPM, aproximadamente 340 RPM a aproximadamente 350 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 400 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 390 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 380 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 370 RPM, aproximadamente 350 RPM a aproximadamente 360 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 440 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 420 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 400 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 390 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 380 RPM, aproximadamente 360 RPM a aproximadamente 370 RPM, aproximadamente 370 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 370 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 370 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 370 RPM a aproximadamente 390 RPM, aproximadamente 390 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 390 RPM a aproximadamente 430 RPM, aproximadamente 390 RPM a aproximadamente 410 RPM, aproximadamente 410 RPM a aproximadamente 450 RPM, aproximadamente 410 RPM a aproximadamente 430 RPM, o aproximadamente 430 RPM a aproximadamente 450 RPM).

[0112]Como se sabe en la técnica, se pueden ajustar diversos parámetros de cultivo celular para lograr una concentración específica de O2 disuelto y una fuerza de cizallamiento del fluido específica. Ejemplos no limitativos de dichos parámetros que se pueden ajustar incluyen: el volumen del pocillo, el volumen del medio de cultivo líquido, la forma del pocilio (por ejemplo, uno o más del diámetro, la altura y la forma del fondo del pocilio), el tipo de agitación (por ejemplo, agitación circular rotatoria y/o agitación elipsoidal rotatoria), la frecuencia de agitación,

el tipo de medio de cultivo líquido, el revestimiento interior del pocillo y la temperatura del medio de cultivo líquido.

Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de dichos parámetros de cultivo. Cualquier combinación de parámetros de cultivo descritos en este documento o conocidos en la técnica se puede combinar de cualquier

manera para lograr en el medio de cultivo una fuerza de cizallamiento del fluido y una concentración de oxígeno

disuelto (O2) que sea la misma (o esencialmente la misma) que la lograda en un medio que ocupa aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 40 % (por ejemplo, aproximadamente el 15 % y aproximadamente

el 25 %) del volumen de un pocillo de fondo cuadrado que tiene un diámetro de entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 35 mm y una altura de entre aproximadamente 40 mm y aproximadamente 50 mm, incubado a

una temperatura de aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C y agitado a una frecuencia de aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 450 RPM (por ejemplo, aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 360 RPM).

[0113]Los niveles de O2 disuelto en un medio de cultivo líquido se pueden detectar utilizando una variedad de

métodos diferentes. Por ejemplo, el O2 disuelto se puede medir utilizando un electrodo o sonda de O2 disuelto (por

ejemplo, las sondas y electrodos de O2 disponibles de Eutech Instruments, la sonda de oxígeno disuelto WD-35201 -80, el sensor de ozono/oxígeno disuelto Rosemount Analytical serie 499, y el electrodo de oxígeno disuelto

DO705 de Extech). Los métodos de calibración y uso de las sondas y electrodos de O2 se pueden realizar siguiendo

las instrucciones del fabricante.

[0114]La fuerza de cizallamiento del fluido en un medio de cultivo líquido se puede calcular utilizando métodos conocidos en la técnica. Un ejemplo no limitativo de un libro de texto adecuado que describe el cálculo de la fuerza

de cizallamiento del líquido en un medio de cultivo líquido se describe en Fluid Mechanics, Robert A. Granger, 1995,

Dover Publications, Inc., Mineola, NY, y Fundamentals of Fluid Mechanics, Bruce R. Munson et al., John Wiley &

Sons, Inc., 2009.

Métodos de producción de una proteína recombinante

[0115]También se proporcionan aquí métodos para producir una proteína recombinante, que incluyen cultivar una

célula que es capaz de producir la proteína recombinante utilizando un método descrito aquí. Una vez realizado el

método, la proteína recombinante se puede recuperar de la célula CHO y/o del primer o segundo medio de cultivo.

En algunas realizaciones, la proteína recombinante se recupera del primer y/o segundo medio de cultivo líquido en

cualquier momento dado durante el método de cultivo (por ejemplo, se recupera del primer y/o segundo medio de

cultivo líquido en uno o más de los días 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,2 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 de cultivo, o después de más de 100 días de cultivo). Algunas realizaciones de estos métodos incluyen además añadir un volumen de un tercer medio de

cultivo o un volumen de un cuarto medio de cultivo líquido, pero en cada caso el volumen total de medio de cultivo

líquido en el pocillo debe ser aproximadamente igual o menor que el volumen del primer medio de cultivo líquido.

[0116]Los expertos apreciarán que cualquiera de los diversos parámetros de cultivo (por ejemplo, placas de

múltiples pocillos, pocillos, volúmenes, tasas o frecuencias de reemplazo de volúmenes de cultivo, frecuencias de agitación, temperaturas, medios y concentraciones de CO2 descritos en este documento) se pueden utilizar en

cualquier combinación para realizar estos métodos.

[0117]Un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante se puede introducir en una célula CHO utilizando

una amplia variedad de métodos conocidos en biología molecular y genética molecular. Los ejemplos no limitativos

incluyen transfección (por ejemplo, lipofección), transducción (por ejemplo, infección por lentivirus, adenovirus o retrovirus) y electroporación. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica una proteína recombinante no está

integrado de forma estable en un cromosoma de la célula CHO (transfección transitoria); mientras que en otros, el

ácido nucleico está integrado. Alternativamente o además, el ácido nucleico que codifica una proteína recombinante puede estar presente en un plásmido y/o en un cromosoma artificial de mamífero (por ejemplo, un cromosoma artificial humano). Alternativamente o además, el ácido nucleico se puede introducir en la célula

utilizando un vector viral (por ejemplo, un vector de lentivirus, retrovirus o adenovirus). El ácido nucleico puede

estar unido operativamente a una secuencia promotora (por ejemplo, un promotor fuerte, tal como un promotor de

p-actina y un promotor de CMV, o un promotor inducible). Un vector que contiene el ácido nucleico puede, si se

desea, contener también un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen que confiere resistencia a higromicina, puromicina o neomicina a la célula CHO).

[0118]En algunos casos, la proteína recombinante es una proteína segregada y es liberada por la célula CHO en

el medio extracelular (por ejemplo, el primer y/o segundo medio de cultivo líquido). Por ejemplo, una secuencia de

ácido nucleico que codifica una proteína recombinante soluble puede contener una secuencia que codifica un

péptido señal de secreción en el extremo N o C de la proteína recombinante, que es escindido por una enzima

presente en la célula CHO y posteriormente liberado en el medio extracelular (por ejemplo, el primer y/o segundo

medio de cultivo líquido). Por ejemplo, dicha proteína recombinante segregada puede ser una inmunoglobulina segregada, una enzima segregada, un factor de crecimiento segregado, un fragmento de proteína segregado, o una proteína diseñada segregada. En otros casos, la proteína recombinante es una proteína soluble que no se segrega, y la proteína recombinante se recupera dentro de la célula CHO. Por ejemplo, una proteína recombinante que no se segrega puede ser una inmunoglobulina, una enzima, un factor de crecimiento, un fragmento de proteína o una proteína modificada por ingeniería genética.

[0119]Los ejemplos no limitativos de proteínas recombinantes que pueden producirse mediante los métodos proporcionados en este documento incluyen inmunoglobulinas (incluidas inmunoglobulinas de cadena ligera y pesada, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, cualquiera de los fragmentos de anticuerpos descritos en este documento), enzimas (por ejemplo, una galactosidasa (por ejemplo, una alfa-galactosidasa), Myozyme o Cerezyme), proteínas (por ejemplo, un factor de crecimiento, eritropoyetina humana, factor de necrosis tumoral (TNF) o un interferón alfa o beta), una proteína modificada por ingeniería genética, o proteínas inmunogénicas o antigénicas o fragmentos de proteínas (por ejemplo, proteínas para usar en una vacuna). En algunas realizaciones, la proteína recombinante es un polipéptido de unión a antígeno diseñado que contiene al menos un andamiaje de proteína recombinante multifuncional (véanse, por ejemplo, las proteínas de unión a antígeno recombinantes descritas en Gebauer et al., Current Opin. Chem. Biol. 13:245-255, 2009; y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2012/0164066). Ejemplos no limitativos de proteínas recombinantes que son anticuerpos incluyen: panitumumab, omalizumab, abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, adecatumumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, alacizumab, alemtuzumab, alirocumab, altumomab, amatuximab, anatumomab, apolizumab, atinumab, tocilizumab, basilizimab, bectumomab, belimumab, bevacizumab, biciromab, canakinumab, cetuximab, daclizumab, densumab, eculizumab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, ertumaxomab, etaracizumab, golimumab, infliximab, natalizumab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranibizumab, rituximab, tocilizumab, y trastuzumab. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de anticuerpos terapéuticos que pueden producirse mediante los métodos descritos en este documento. Ejemplos no limitativos adicionales de proteínas recombinantes que pueden producirse mediante los presentes métodos incluyen: alglucosidasa alfa, laronidasa, abatacept, galsulfasa, lutropina alfa, factor antihemofílico, agalsidasa beta, interferón beta-1a, darbepoetina alfa, tenecteplasa, etanercept, factor de coagulación IX, hormona estimulante del folículo, interferón beta-1a, imiglucerasa, dornasa alfa, epoetina alfa, y alteplasa.

[0120]Se puede recuperar una proteína recombinante soluble segregada del medio de cultivo líquido (por ejemplo, el primer y/o segundo medio de cultivo líquido) eliminando o separando físicamente de otro modo el medio de cultivo líquido de las células CHO. En la técnica se conocen diversos métodos para extraer medio de cultivo líquido de células de mamíferos, incluidos, por ejemplo, centrifugación, filtración, pipeteo y/o aspiración. La proteína recombinante segregada puede luego recuperarse y purificarse aún más del medio de cultivo líquido utilizando una variedad de técnicas bioquímicas que incluyen diversos tipos de cromatografía (por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de intercambio catiónico, o cromatografía de intercambio aniónico) y/o filtración (por ejemplo, filtración de corte de peso molecular).

[0121]Para recuperar una proteína recombinante intracelular, se puede lisar la célula CHO. En la técnica se conoce una amplia variedad de métodos para lisar células de mamíferos, incluidos, por ejemplo, sonicación y/o lisis por detergente, enzimática y/o química. Una proteína recombinante se puede purificar a partir de un lisado de células CHO utilizando una variedad de métodos bioquímicos conocidos en la técnica, que generalmente comienzan con una etapa de centrifugación para eliminar los desechos celulares, y luego una o más etapas adicionales (por ejemplo, uno o más tipos de cromatografía (por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de intercambio catiónico, o cromatografía de intercambio aniónico) y/o filtración (por ejemplo, filtración de corte de peso molecular)).

[0122]En algunas realizaciones, la proteína recombinante recuperada es al menos o aproximadamente 50 % pura en peso, por ejemplo, al menos o aproximadamente 55 % pura en peso, al menos 60 % pura en peso, al menos 65 % pura en peso, al menos 70 % pura en peso, al menos 75 % pura en peso, al menos 80 % pura en peso, al menos 85 % pura en peso, al menos 90 % pura en peso, al menos 95 % pura en peso, al menos 96 % pura en peso, al menos 97 % pura en peso, al menos 98 % pura en peso, o al menos o aproximadamente 99 % pura en peso, o más de 99 % pura en peso.

EJEMPLOS

[0123]La invención se describe más detalladamente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplo 1. Propiedades beneficiosas de un método de cultivo ejemplar

[0124]Se realizaron experimentos para generar un modelo de alto rendimiento a pequeña escala de cultivos de perfusión y para determinar si dichos cultivos pueden alcanzar densidades celulares similares a las de los cultivos de perfusión de producción.

Materiales y métodos

Cultivo celular en suspensión de galactosidasa recombinante

[0125]La misma línea celular clonal que produjo galactosidas recombinante se usó en cada ejecución del proceso de cultivo celular, y el medio de cultivo utilizado en cada ejecución del proceso de cultivo celular se detalla en la Tabla 1.

Tabla 1.Medios de cultivo utilizados en los estudios.

Equipos y reactivos

[0126]Los siguientes equipos y reactivos se utilizaron en las ejecuciones del proceso de cultivo celular descritos en este ejemplo: incubadora con agitación Multitron (Appropriate Technical Resources, Inc.) (modelo n.° AJ125), Cellometer® Auto1000 (Nexcelom Bioscience LLC), centrífuga Beckman Coulter Allegra (modelo n.° Allegra X-14 R), Biorreactores TubeSpin® 50 (Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Suiza), microplacas MASTERBLOCK® de 96 pocillos de 2 ml (Griener Bio One, Frickenhausen, Alemania), microplacas MASTERBLOCK® de 96 pocillos de 1 ml (Griener Bio One, Frickenhausen, Alemania), microscopio de sobremesa de luz blanca Olympus (modelo n.° BH-s), microscopio de sobremesa de luz blanca Olympus (modelo n.° BX40), microscopio de sobremesa de luz blanca Olympus (modelo n.° BX41), solución de azul tripán al 0,4 % (Sigma), solución de azul tripán al 0,2 % (Sigma), cámara de hematocitómetro Reichert Bright-Line®, cubreobjetos de microscopio Thermo Scientific, contador de laboratorio Fisher Scientific, software SAS® JMP (versión X), dispositivo de sujeción de placa de microtitulación Applikon MicroFlask (Applikon Biotechnology Inc.), AeraSeal, sellos de membrana desechables microporosos (Phenix Research Products), estación de trabajo de automatización de laboratorio Beckman Coulter Biomek® 3000, pipeta RAININ Pipetting 360° Pipet-Lite™ XLS™ (Mettler Toledo), pipeta Ergenomic de alto rendimiento (VWR®) y depósito de reactivos (VistaLab Technologies).

Métodos

[0127]Se realizaron estudios para probar un intervalo de condiciones variables de agitación (RPM), forma del pocillo y volumen de trabajo. Los estudios se diseñaron para cubrir los intervalos de agitación de entre 320 RPM a 360 RPM, pocillos de fondo redondo (volumen nominal de 1 ml) o de fondo cuadrado (volumen nominal de 2 ml), y entre 100 gl a 600 gl de volumen de trabajo. La ejecución I del proceso de cultivo celular se realizó para determinar una base para las condiciones de operación de placas de pocillos profundos de fondo redondo (volumen nominal de 1 ml). La ejecución II del proceso de cultivo celular se llevó a cabo para determinar la capacidad de las placas de pocillos profundos de fondo redondo para soportar cultivos de células de alta densidad. La ejecución III del proceso de cultivo celular se llevó a cabo para establecer intervalos de parámetros para la optimización del diseño, así como para comparar el dispositivo de sujeción de la microplaca Applikon MicroFlask (Applikon Biotechnology, Inc., Foster City, CA) con los sellos de membrana microporosos estériles (AeraSeal, Phenix Research Products, Candler NC). Las ejecuciones IV y V del proceso de cultivo celular se diseñaron con fines de optimización del modelo.

[0128]La ejecución V del proceso de cultivo celular se diseñó utilizando la herramienta de diseño personalizado del software JMP. El modelo fue diseñado como un I-óptimo con dos variables continuas (velocidad de agitación y volumen de trabajo) y una respuesta categórica (forma del pocillo) teniendo en cuenta interacciones de tercer orden. Los límites inferior y superior se establecieron de acuerdo con la Tabla 2 (con los volúmenes de trabajo enumerados como una fracción del volumen total del recipiente). El diseño se personalizó para tener una potencia de 2 para tener en cuenta cualquier relación no lineal entre las variables. Por último, el estudio se diseñó para tener un total de 15 condiciones por experimento (seis para pocillos de fondo redondo y nueve para pocillos de fondo cuadrado) ejecutadas por duplicado.

Tabla 2. Configuraciones de variables continuas utilizadas en JMP.

[0129]Todos los recipientes se inocularon a 5 x 106 células viables/ml utilizando células de cultivos de semillas expandidos en matraces de agitación durante 9, 10, 7, 0 y 7 pasadas para las ejecuciones 1-5 del proceso de cultivo celular, respectivamente, después de la descongelación de los viales de los bancos de células. Los cultivos celulares se mantuvieron en un ambiente controlado de 5 % de CO2, 37 °C y 80 % de humedad relativa en una incubadora con agitación. Se ejecutó una condición de control de tubo agitado con cada experimento con un volumen de trabajo constante de 10 ml por tubo, con un ángulo de agitación de 45° y una agitación de 160 RPM. Para todos los experimentos (a menos que se indique lo contrario), la evaporación se tuvo en cuenta de acuerdo con la Tabla 3.

Tabla 3. Suplementación por evaporación

[0130]Para la ejecución I del proceso de cultivo celular, una placa de pocillo profundo de fondo redondo se inoculó a 5 x 105 células viables/ml y 1 x 106 células viables/ml. A partir del día 1 después de la inoculación, se tomaron muestras diarias de los cultivos (10 pl) para determinar la densidad de células viables (VCD) mediante recuento manual (exclusión con azul tripán) durante 2 días.

[0131]Para la ejecución II del proceso de cultivo celular, a partir del primer día después de la inoculación, se tomaron muestras de los cultivos diariamente (10 pl) para determinar la VCD mediante recuento manual durante 11 días. Tras el recuento celular, las placas se centrifugaron a ~233 xg durante 5 minutos, y el medio usado se eliminó. El medio de cultivo se intercambió en las proporciones descritas en la Tabla 4.

[0132]Se utilizaron placas de pocillos profundos de fondo redondo (1 ml) y placas de pocillos profundos de fondo cuadrado (2 ml) para las ejecuciones III y IV del proceso de cultivo celular. A partir del primer día posterior a la inoculación, se tomaron muestras de los cultivos todos los lunes, miércoles y viernes (programa 2-2-3) (10 pl) para determinar la VCD a través de Cellometer® Auto 1000. Tras el recuento celular, las placas se centrifugaron a ~233 xg durante 5 minutos, y los medios usados se eliminaron. El medio de cultivo se intercambió en las proporciones descritas en la Tabla 4.

[0133]Para la ejecución V del proceso de cultivo celular, se utilizó el manipulador de líquidos Biomek 3000. A partir del primer día posterior a la inoculación, se tomaron muestras de los cultivos todos los lunes, miércoles y viernes (0,10 x volumen de trabajo) para determinar la VCD a través de Cellometer® Auto 1000. Tras el recuento celular, las placas se centrifugaron a ~233 xg durante 5 minutos, y los medios agotados retirados se usaron inmediatamente o se almacenaron a -80 °C hasta que se realizaron ensayos de actividad de a-galactosidasa humana recombinante (rha-Gal) para determinar el título del producto. El medio de cultivo se intercambió en las proporciones descritas en la Tabla 5, y las tasas de productividad volumétrica y específica de rha-Gal se calcularon utilizando las ecuaciones 1 y 2 a continuación. Además, las densidades de células viables integradas (IVCD) se calcularon utilizando la ecuación 3 a continuación.

Tabla 4. Programa de realimentación por lotes

Tabla 5. Programa de realimentación por lotes modificado

VPR -Título * PREcuación 1

SPRVPREcuación 2

Xv

Ecuación 3

PR:

tasa de perfusión

VPR:

Tasa de productividad volumétrica (U/l/d)

Título:

Actividad dea-Gal rh (U/l)

SPR:

Tasa de productividad específica (U/E9 células/d)

Xv:

Recuento de células viables (E6 células/ml)

IVCD:

Densidad de células viables integrada (células-d/ml)

t:

Tiempo (d)

Recuento celular manual

La cámara del hemocitómetro y el cubreobjetos se limpiaron con alcohol isopropílico (IPA). Las esquinas de los cubreobjetos se humedecieron con IPA y se fijaron al hemocitómetro. Las muestras de células se mezclaron homogéneamente con 1:1 con 0,4 % de azul tripán. Se transfirió una alícuota de 10 |jl a una cámara de hemocitómetro. Las células se contaron en los cuatro cuadrados exteriores más grandes: cada cuadrado exterior grande contenía una cuadrícula de 16 cuadrados más pequeños. Las células que se encontraban en los límites del cuadrado más grande se contaron sólo en dos de los cuatro lados. Las células sin color se contaron como viables, mientras que las teñidas en azul se consideraron muertas. El porcentaje de viabilidad y la densidad de células viables se calcularon utilizando las ecuaciones 4 y 5 a continuación.

Células totales yEcuación 4

íCélulas viables \

Densidad de células = ---------------------------- • Factor de dilución • 10 E c u a c ió n 5

<viables ^Cuadrados contados>J

[0135]Células totales: Suma de células viables y células muertas

Conteo de células Nexcelom Cellometer

[0136]Las muestras de células se mezclaron homogéneamente 1:1 con 0,2 % de azul tripán. Se transfirió una alícuota de 20 |jl de la mezcla a portaobjetos específicos del instrumento. Las células se contaron en las cuatro imágenes tomadas por una cámara digital incorporada en el instrumento. Las células sin color se contaron como viables, mientras que las teñidas de azul se consideraron muertas.

Análisis estadístico

[0137]El análisis estadístico se realizó utilizando el software JMP Las respuestas utilizadas fueron la densidad máxima de células viables (VCD o X<v>) y la tasa de productividad volumétrica (VPR) con deseabilidad maximizada. El modelo estadístico se evaluó a través de la función 'Ajustar modelo' con un informe de detección de efectos. Las 'Estimaciones de parámetros ordenados' informaron los factores que afectaron significativamente las variables de respuesta, lo que se determina estadísticamente a través de una prueba de la t. Por último, el 'Perfilador de predicción' traza las tendencias independientes de los efectos de los parámetros sobre las variables de respuesta y utiliza el modelo para predecir las mejores condiciones mediante la maximización de la función de deseabilidad.

Resultados

Ejecución I del proceso de cultivo celular

[0138]En este experimento, el día 27 después de la descongelación del vial, se utilizó una línea de células CHO rha-Gal (en el medio CD CHO) para inocular los recipientes en tres condiciones diferentes (Tabla 6). Se siguió el perfil de proliferación del cultivo celular durante 11 días.

Tabla 6. Proceso de cultivo celular I Condiciones de prueba

[0139]Los perfiles de densidad de células viables de los cultivos mantenidos en medio CD CHO durante once días se muestran en la Figura 5. Se observó crecimiento en todos los cultivos experimentales. Para las células sembradas a 5 x 105 células/ml, hubo un crecimiento mínimo en ambos volúmenes de trabajo (200 j l y 300 jl) alcanzando una VCD de 1 x 106 células/ml. Esto sugiere que las células son capaces de crecer a bajas densidades de siembra en las placas de pocillos profundos de fondo redondo. Los cultivos sembrados a 1 x 106 células/ml también exhibieron crecimiento el día 2, teniendo un mejor crecimiento los cultivos que se realimentarron dos veces al día a 0,5 RV (Figura 6). Los cultivos realimentados dos veces al día alcanzaron una VCD superior a 2 x 106 células/ml en el día 2: 2,7 x 106 células/ml a 200 j l y 2,3 x 106 células/ml a 300 jl. Los cultivos realimentados a aproximadamente 1,0 RV/día tuvieron una VCD mucho menor en el día 2, lo que también podría haber sido resultado de una pérdida involuntaria de células durante la eliminación del medio gastado. Estos datos indican que una tasa de perfusión de 2 x 0,5 RV/día permite un mejor crecimiento celular que una tasa de perfusión de 1,0 RV/día. Estos datos sugieren que las placas de 96 pocillos profundos de 1 ml y fondo redondo son capaces de soportar el crecimiento celular. A lo largo del experimento, se observó que los cultivos presentaban pequeños peletes de células cuando se retiraban inmediatamente de la incubadora con agitación, posiblemente debido a una agitación insuficiente. Esta observación sugiere que se debe utilizar una velocidad de agitación más alta para las placas de pocillos profundos de 1 ml de fondo redondo.

Ejecución II del proceso de cultivo celular

[0140]Se realizó un conjunto de experimentos para optimizar la tasa de perfusión utilizada para cultivar células en placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo (1 ml). En estos experimentos, se utilizaron células rha-Gal (el día 30 después de la descongelación del vial) en medio CD CHO para inocular pocillos de placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo y tubos de agitación (como se describe en la Tabla 7). El rendimiento del cultivo celular se evaluó en un proceso de realimentación por lotes de 11 días.

Tabla 7. Condiciones de prueba de la ejecución del proceso de cultivo celular

[0141]Todos los cultivos mantuvieron un porcentaje de viabilidad celular superior al 85 % (Figura 7). Los perfiles de densidad de células viables de los cultivos de 11 días de las células mantenidas en medio CD CHO se muestran en la Figura 8. Se observó crecimiento en todos los cultivos hasta el día 9, cuando el crecimiento celular del control experimental (cultivo en tubo agitado) se estabilizó en una densidad máxima de 25 x 106 células/ml. El cultivo en placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo exhibió una tasa de crecimiento más lenta que el control experimental, alcanzando una VCD máxima de 8 x 106 células/ml. El día 8, se añadió un bolo (50 gl) de medio a los cultivos de placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo, teniendo en cuenta la pérdida por evaporación.

[0142]Estos datos para la placa de 96 pocillos profundos de fondo redondo sugieren que se debe ajustar el programa de realimentación. En la Figura 9 y la Tabla 3 se muestra un programa de realimentación modificado.

Ejecución III del proceso de cultivo celular

[0143]Se realizó un conjunto de experimentos para optimizar la tasa de realimentación utilizada para cultivar células en placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo. Estos experimentos se realizaron utilizando placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo de 1 ml y de fondo cuadrado de 2 ml y el protocolo de velocidad de realimentación modificado que se muestra en la Figura 9. El día 8 después de la descongelación del vial, las células rha-Gal en medio de cultivo CD CHO se utilizaron para inocular ambos tipos de placas de pocillos profundos y tubos de agitación (véase la Tabla 8). Los cultivos de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado contenían un volumen de cultivo de 300 gl o 500 gl, mientras que los cultivos de 96 pocillos profundos de fondo redondo contenían un volumen de cultivo de 200 gl o 300 gl (volumen nominal de 1 ml). Los pocillos se sellaron utilizando el sistema Applikon o utilizando membranas AeraSeal. Todos los cultivos en placas de 96 pocillos profundos se agitaron a 330 RPM o 360 RPM. El crecimiento del cultivo celular se midió durante 9 días. Todos los recuentos de células viables para los cultivos en placas de 96 pocillos profundos se contaron en pocillos triplicados y se promediaron.

[0144]Los perfiles de densidad de células viables de los cultivos celulares de 15 días se muestran en la Figura 10. Se exhibieron perfiles de crecimiento similares para los cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado cubiertos usando el sistema Applikon o cubiertos usando sellos de membrana desechables (ubicados dentro de una desviación estándar (1 SD) entre sí). La mayor densidad de células viables en el formato de placa de 96 pocillos fue una densidad de células viables de 35 x 106 células/ml, que se logró en las placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado el día 15. La mayor densidad de células viables alcanzada en los cultivos en tubo de agitación de control fue 21 x 106 células/ml el día 10. Los cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado también se asemejaron mucho al perfil de crecimiento de los cultivos en tubos de agitación de control hasta el día 13. Sin embargo, los cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado se parecían al control histórico del tubo de agitación (n = 11) durante todo el proceso de 15 días. Los dos cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado que más se parecían a los cultivos de control de tubo de agitación históricos utilizaron cubiertas de membrana desechables y se agitaron a 330 RPM y tenían un volumen de cultivo de 300 gl o 500 gl.

[0145]Los cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo en este experimento no exhibieron un crecimiento comparable al de los cultivos en tubos de agitación de control. La mayor densidad de células viables observada en los cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo fue 14 x 106 células/ml el día 15. Todos los cultivos mantuvieron un porcentaje de viabilidad celular superior al 85 % (Figura 11), hasta entrar en la fase de declive. A diferencia del control del tubo de agitación, los cultivos en ambas formas de pocillo continuaron proliferando más allá del día 14, alcanzando densidades de células viables de 50 x 106 células/ml (fondo cuadrado) y 17 x 106 células/ml el día 20 (fondo redondo) (Figuras 12 y 13). Estos datos indican que las placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo son capaces de soportar altas densidades celulares.

Tabla 8. Condiciones de prueba de la ejecución III del proceso de cultivo celular

Ejecución IV del proceso de cultivo celular

[0146]Se realizó un conjunto adicional de experimentos para optimizar el crecimiento celular en placas de 96 pocilios profundos de fondo cuadrado (volumen nominal de 2 ml). En estos experimentos, el día 1 después de la descongelación del vial, las células en medio de cultivo CD CHO se utilizaron para inocular placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado y tubos de agitación (n = 3) (véase la Tabla 9). El volumen de cultivo utilizado en estos experimentos fue 300 pl o 500 pl, y los cultivos se agitaron a 320 RPM, 330 RPM o 340 RPM. El crecimiento celular en los cultivos se evaluó durante 14 días. Todos los recuentos de células viables de los cultivos se contaron a partir de pocillos triplicados y se promediaron.

Tabla 9. Condiciones de prueba de la ejecución IV del proceso de cultivo celular

[0147]Los perfiles de densidad de células viables de los cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado durante 14 días se muestran en la Figura 14. Se exhibieron perfiles de crecimiento similares para todas las condiciones probadas hasta el día 7. Después del día 7, los cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado que tenían un volumen de cultivo de 500 pl y agitados a 320 RPM o 330 RPM demostraron un mejor crecimiento celular. Aunque todas las condiciones de cultivo probadas continuaron proliferando después del día 13, alcanzando una densidad de células viables de 30 x 106 células/ml a 35 x 106 células/ml, las dos condiciones de cultivo con mejor rendimiento del crecimiento alcanzaron densidades de células viables superiores a 40 x 106 células/ml. Las densidades de células viables logradas en los cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado con un volumen de cultivo de 500 pl y una velocidad de agitación de 320 RPM o 330 RPM superaron las densidades de células viables observadas históricamente en cultivos de la misma línea celular en tubos de agitación (dentro de 1 desviación estándar) después del día 12. Hasta el día 12 de los cultivos, se observaron patrones de crecimiento similares en los cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado que tenían un volumen de cultivo de 500 pl y una velocidad de agitación de 320 RPM o 330 RPM y en los cultivos en tubo de agitación.

Ejecución V del proceso de cultivo celular

[0148]Se realizó un conjunto adicional de experimentos para optimizar las condiciones operativas del cultivo celular (véase la descripción de los métodos de Diseño de experimentos más arriba). En estos experimentos, el día 21 después de la descongelación del vial, se utilizaron células en CD CHO para inocular placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado o redondo, o tubos de agitación. Las condiciones de operación para cada cultivo probado se muestran en la Tabla 10. Cada una de las placas de 96 pocillos profundos probadas se cubrió con membranas desechables AeraSeal. Los cultivos en tubo de agitación sirvieron como control (n = 4): un conjunto de dos cultivos en tubo de agitación siguió el programa de realimentación de control, y otro conjunto de dos cultivos en tubo de agitación siguió la tasa de realimentación modificada utilizada en las placas de 96 pocillos profundos (que se muestra en la Figura 9). Todas las condiciones se probaron por duplicado. El crecimiento celular se evaluó en un proceso de realimentación por lotes de 9 días.

Tabla 10. Condiciones probadas de la ejecución V del proceso de cultivo celular

[0149]Los perfiles de densidad de células viables de los cultivos de 15 días de células mantenidas en medio CD CHO enumerados en la Tabla 10 se muestran en las Figuras 15 y 16. Los cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo no tuvieron tan buen desempeño como los cultivos de fondo cuadrado en las condiciones probadas actualmente (Figura 15 y Figura 16, respectivamente). La mayor densidad de células viables alcanzada en las placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo fue 20 x 106 células/ml para los cultivos de 100 pl agitados a 360 RPM. Los cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado tuvieron densidades de células viables comparables (dentro de 1 desviación estándar) (cuando se utilizó la tasa de realimentación modificada descrita anteriormente) en comparación con los cultivos en tubos de agitación de control, con una densidad máxima de células viables cercana a 40 x 106 células/ml. El mejor rendimiento del cultivo de células de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado se logró utilizando un volumen de cultivo de 400 pl y una agitación de 320 RPM o 340 RPM, alcanzando una densidad máxima de células viables de aproximadamente 50 x 106 células/ml el día 15. Además, el cultivo en tubo de agitación de 96 pocillos profundos con fondo cuadrado y volumen de cultivo de 600 pl y agitación de 340 RPM dio como resultado un crecimiento celular de hasta 27 x 106 células/ml el día 13 y produjo resultados comparables a los cultivos de control en tubo de agitación (tasa de realimentación de control) que alcanzaron una densidad máxima de células viables de 31 x 106 células/ml. Todos los cultivos probados mantuvieron un porcentaje de células viables mayor que 85 %. La comparación entre la densidad de células viables integradas para los cultivos de control en tubo de agitación y los cultivos de 96 pocillos profundos se muestra en las Figuras 17 y 18.

[0150]Los perfiles de tasa de productividad volumétrica de los cultivos de 15 días de células cultivadas en CD CHO se muestran en las Figuras 19 y 20. Como se esperaba en función del crecimiento de células viables, los cultivos cultivados en placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo tuvieron menor productividad (Figura 19). La mejor tasa de productividad volumétrica de 22000 unidades/l/día se observó el día 15 en cultivos cultivados en placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo en 100 pl de medio de cultivo y con una agitación de 320 RPM (Figura 19). Sin embargo, un cultivo en una placa de 96 pocillos profundos de fondo redondo que tenía el mismo volumen de cultivo y agitación tuvo una tasa de productividad volumétrica baja (< 5000 unidades/l/día) durante los días previos. Se observaron tasas de productividad volumétrica mejoradas en los cultivos de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado (Figura 20) que siguieron de cerca los perfiles de crecimiento. Se observó una actividad comparable (40000 unidades/l/día en el día 15) para los cultivos cuyos patrones de crecimiento se parecían mucho a los cultivos en tubo agitado (los cultivos de fondo cuadrado con un volumen de 600 gl y agitados a 340 RPM). Varios cultivos con un retraso inicial en el crecimiento, pero en última instancia con una densidad máxima de células viables similar a los cultivos de tubo de agitación de control (cultivos de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado que tienen un volumen de 400 gl y una agitación de 340 RPM, o un volumen de 400 gl o 600 gl y una agitación de 360 RPM) exhibieron una tasa de productividad volumétrica similar hasta el día 13 (alcanzando una tasa de productividad volumétrica de aproximadamente 40 000 unidades/l/día). Después del día 13, la tasa de productividad volumétrica disminuyó excepto para los cultivos cultivados a un volumen de 400 gl y agitados a 360 RPM. que alcanzó una productividad volumétrica de 60 000 unidades/l/día al día 15. La mejor productividad se observó en los cultivos de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado con un volumen de 400 gl y agitados a 320 RPM, que alcanzaron una tasa de productividad volumétrica de 67000 unidades/l/día en el día 15.

[0151]La mayoría de las condiciones para los cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo redondo exhibieron tasas de productividad específica (SPR) comparables o inferiores en comparación con los cultivos en tubos agitados de control, con la excepción de los cultivos cultivados en un volumen de 100 gl y agitados a 320 RPM, o un volumen de 300 gl y agitados a 360 RPM (Figura 21). Estos cultivos presentaron una mayor tasa de productividad específica el día 15. Los cinco cultivos en placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado con una tasa de productividad volumétrica comparable o mayor también exhibieron una tasa de productividad específica comparable o mayor en comparación con los cultivos en tubos de agitación de control (1600 unidades/1 x 109 células/día) (Figura 22).

[0152]Los datos recopilados se incorporaron al diseño experimental del JMP, para predecir la mejor condición operativa basándose en el análisis estadístico. La mejor condición operativa se predijo utilizando tres respuestas: densidad máxima de células viables, tasa máxima de productividad volumétrica y tasa máxima de productividad específica. Todos los límites de respuesta se establecieron para maximizar el resultado. En primer lugar, los datos se ajustaron al modelo como se muestra en las Figuras 23 y 24. Los datos recopilados para la densidad de células viables (Figura 23) y la tasa de productividad volumétrica (Figura 24) se ajustan bien al modelo. El análisis estadístico (prueba de la t) reveló que la forma del pocillo y el volumen de trabajo afectaron significativamente tanto la densidad de células viables como la productividad, mientras que la velocidad de agitación afectó significativamente sólo la productividad.

[0153]Las mejores condiciones de operación se predijeron utilizando el perfilador JMP (Figura 25). Según el análisis, el mejor rendimiento celular debería obtenerse cuando se utilizan placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado con un volumen de trabajo de 440 gl y agitadas a 360 RPM. Teniendo en cuenta las desviaciones estándar y manteniendo la misma deseabilidad, el mejor rango operativo para placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado es un volumen de trabajo entre alrededor de 350 gl y alrededor de 550 gl, y una velocidad de agitación entre alrededor de 320 RPM y alrededor de 360 RPM.

[0154]En resumen, los datos muestran que los métodos proporcionados actualmente se pueden utilizar como modelo de cultivos celulares en biorreactores de perfusión a mayor escala (por ejemplo, logrando densidades celulares similares durante un período de tiempo similar). Los métodos proporcionados actualmente se pueden utilizar para el cribado de alto rendimiento de medios de cultivo de tejidos (y componentes dentro de los medios de cultivo de tejidos).

Ejemplo 2. Uso de métodos de cultivo de 96 pocillos profundos para evaluar el medio de cultivo

[0155]Se realizó un conjunto adicional de experimentos para probar una variedad de medios de cultivo de tejidos diferentes utilizando los métodos de cultivo de 96 pocillos profundos descritos en este documento. En estos experimentos, se utilizó una línea de células de mamífero recombinantes que producía un anticuerpo monoclonal (célula productora de mAb) o una línea de células de mamífero recombinantes que producía una enzima (célula productora de enzima) para inocular placas de 96 pocillos profundos de fondo cuadrado, y las células se cultivaron durante una semana en 500 gl de uno de al menos 102 medios de cultivo de tejidos diferentes con agitación a 330 RPM. El control en estos experimentos fue la densidad de células viables lograda utilizando la misma placa de 96 pocillos profundos, el mismo medio de cultivo, la línea celular de muestra y el medio CD CHO. Tanto la densidad de células viables como el título del cultivo se midieron durante siete días.

[0156]Los datos de las Figuras 26-29 muestran que los métodos de cultivo de 96 pocillos profundos descritos en el presente documento son capaces de cribar el efecto de diferentes medios de cultivo tisular sobre la densidad de células viables y la productividad de las células cultivadas.

OTRAS REALIZACIONES

[0157]Se debe entender que, si bien la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior tiene por objeto ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que está definido por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de cultivo por perfusión de una célula de ovario de hámster chino (CHO), comprendiendo el método: proporcionar una placa de múltiples pocillos que comprende al menos un pocillo que comprende una célula CHO dispuesta en un primer medio de cultivo líquido, en donde el primer medio de cultivo líquido ocupa de aproximadamente el 5% aaproximadamente el 70%del volumen del pocilio;

Incubar la placa de múltiples pocillos durante un período de tiempo a aproximadamente 31 °C a aproximadamente 40 °C y con una agitación rotatoria de aproximadamente 320 revoluciones por minuto (RPM) a aproximadamente 500 RPM; y

continuamente, durante el período de tiempo, eliminar un primer volumen del primer medio de cultivo líquido y añadir al primer medio de cultivo líquido un segundo volumen de un segundo medio de cultivo líquido, en donde el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido son aproximadamente iguales, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido está sustancialmente libre de células CHO, y el método da como resultado una densidad de células viables de entre 15 x 106 células/ml y 60 x 106 células/ml en el pocillo.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la célula CHO contiene un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante, y el método comprende además recuperar la proteína recombinante de la célula CHO o del primer o segundo medio de cultivo.

3. El método de la reivindicación 2, que comprende además:

detectar la proteína recombinante en la célula CHO o en el primer o segundo medio de cultivo líquido; y comparar la cantidad de proteína recombinante presente en la célula CHO o en el primer o segundo medio de cultivo líquido con un nivel de referencia de proteína recombinante, por ejemplo, un nivel de proteína recombinante producido utilizando un método de cultivo diferente.

4. El método de la reivindicación 1 o 3, en el que el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido aumentan con el tiempo.

5. El método de la reivindicación 1 o 3, en donde:

la placa de múltiples pocillos se incuba durante un período de tiempo superior a 7 días, y en los días 1 a 3 de incubación, en cada período de 24 horas, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido está entre aproximadamente el 30 % y aproximadamente el 50 % del volumen del primer medio de cultivo líquido;

en los días 4 a 6 de la incubación, en cada período de 24 horas, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido está entre aproximadamente el 40 % y aproximadamente el 70 % del volumen del primer medio de cultivo líquido; y

el día 7 y posteriores a la incubación, en cada período de 24 horas, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido es de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 150 % del volumen del primer medio de cultivo líquido.

6. El método de la reivindicación 1 o 3, en el que la placa de múltiples pocillos es una placa de pocillos profundos.

7. El método de la reivindicación 1 o 3, en donde:

el diámetro del fondo del pocillo está entre aproximadamente 6,0 mm y aproximadamente 35 mm;

la altura de la pared es aproximadamente 12 mm y aproximadamente 50 mm; o

el pocillo tiene un volumen de aproximadamente 1 ml y aproximadamente 18 ml.

8. El método de la reivindicación 1 o 3, en donde la célula CHO se suspende en aproximadamente 150 pl a aproximadamente 15 ml del primer medio de cultivo.

9. El método de la reivindicación 1 o 3, en donde después de aproximadamente las primeras 24 a 48 horas del período de tiempo, en cada período de 24 horas, el primer volumen del primer medio de cultivo líquido eliminado y el segundo volumen del segundo medio de cultivo líquido añadido es aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 150 % del volumen del primer medio de cultivo líquido.

10.El método de la reivindicación 1 o 3, en donde que la placa multipocillo está sellada con una membrana desechable permeable a gas o una capa de silicona permeable a gas.

11.El método de la reivindicación 1 o 3, en donde el pocillo tiene un fondo plano o un fondo redondo.

12.El método de la reivindicación 1, en donde la agitación rotatoria es de aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 400 RPM.

13.El método de la reivindicación 12, en donde la agitación rotatoria es de aproximadamente 320 RPM a aproximadamente 380 RPM.

14.El método de la reivindicación 1, en donde el primer medio de cultivo líquido ocupa aproximadamente entre el 10 % y aproximadamente el 60 % del volumen del pocillo.