ES3041077T3 - Methods for detecting renal disease - Google Patents

Methods for detecting renal disease

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ES3041077T3 ES16787315T ES16787315T ES3041077T3 ES 3041077 T3 ES3041077 T3 ES 3041077T3 ES 16787315 T ES16787315 T ES 16787315T ES 16787315 T ES16787315 T ES 16787315T ES 3041077 T3 ES3041077 T3 ES 3041077T3
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Mahalakshmi Yerramilli
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John Quinn
Murthy Yerramilli
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Idexx Laboratories Inc
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Abstract

Métodos para determinar la función renal en un sujeto animal, el método incluye medir la concentración de ácido β-aminoisobutírico (β-aminoisobutirato) (BAIB) en muestras de pacientes y determinar la presencia, probabilidad o progresión de la enfermedad renal como resultado del daño estructural o la mortalidad asociada con la enfermedad renal. Los métodos también incluyen medir la concentración de BAIB en combinación con dimetilarginina simétrica (SDMA) y determinar la enfermedad renal en función de las concentraciones de BAIB y SDMA en las muestras. También se divulgan anticuerpos anti-BAIB, conjugados de BAIB y métodos de ensayo que utilizan los anticuerpos y conjugados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para detectar una enfermedad renal
Antecedentes
Campo
La divulgación se refiere generalmente a la determinación de la función renal. Más particularmente, la divulgación se refiere a métodos para diagnosticar y determinar la evolución de una enfermedad renal.
Técnica relacionada
Es importante poder medir la función renal de manera rápida y exacta. Por ejemplo, la dosificación de fármacos debe adaptarse para pacientes con insuficiencia renal. Por tanto, realizar una evaluación exacta de la función renal es un requisito en la medicina clínica. Sin embargo, el diagnóstico de la insuficiencia renal se ve obstaculizado por la falta de marcadores fiables y/o pruebas de diagnóstico disponibles. En la práctica clínica, la creatinina en suero se usa normalmente para evaluar la función renal. Sin embargo, el uso de creatinina en suero puede verse afectado por la imprecisión, ya que los datos pueden estar sujetos a un grado de variabilidad relativamente alto. Además, se sabe que hasta el 75 % de la función renal puede perderse en el momento en que se aumenta la creatinina. Gejyoet al.(Clinical Nephrology. 1977. 8: 520-525) describen marcadores, entre estos el ácido p-aminoisobutírico, mediante cromatografía con el fin de determinar la glomerulonefritis en muestras de pacientes. El documento WO2013/086365 divulga el diagnóstico de nefropatía temprana mediante la medición de la concentración de diversos aminoácidos, entre estos BAIB, en muestras de sangre de sujetos que van a someterse a prueba frente a controles sanos usando espectrometría de masas.
Por consiguiente, los inventores han identificado una necesidad en la técnica de métodos para evaluar la función renal con una precisión aumentada.
Sumario
En un aspecto, la invención se refiere a un métodoin vitropara determinar si un animal canino o felino está padeciendo una enfermedad renal como resultado de daño estructural o glomerulonefritis, comprendiendo el método medir ácido p-aminoisobutírico (BAIB) en una muestra de orina o una muestra de sangre del animal y determinar la enfermedad renal basándose en la concentración de BAIB en la muestra, que comprende además comparar la concentración de BAIB en la muestra con una concentración de referencia relacionada con la concentración de BAIB en muestras de animales sanos, en donde la medición comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-BAIB y determinar la unión o la cantidad de unión entre el anticuerpo y BAIB en la muestra, en donde, además, el anticuerpo anti-BAIB se produce contra un conjugado que comprende BAIB y una proteína portadora, BAIB y polilisina, o BAIB y glutaraldehído, y en donde el daño estructural es el resultado de inflamación, fibrosis, herida, cálculos renales, o infiltración por cáncer.
En otro aspecto, la invención se refiere a un métodoin vitropara diagnosticar una enfermedad renal que es el resultado de daño estructural o glomerulonefritis en un sujeto animal canino o felino, comprendiendo el método: poner en contacto una muestra de orina o sangre obtenida del sujeto con un anticuerpo anti-BAIB y determinar la unión o la cantidad de unión entre el anticuerpo y BAIB en la muestra, en donde el anticuerpo se produce contra un conjugado que comprende BAIB y una proteína portadora, BAIB y polilisina, o BAIB y glutaraldehído; medir la concentración de BAIB en la muestra; comparar el nivel de BAIB con una concentración de referencia de BAIB en sujetos sanos; y diagnosticar un trastorno renal que es el resultado de daño estructural o glomerulonefritis donde el valor de BAIB en la muestra está por encima de la concentración de referencia y en donde el daño estructural es el resultado de inflamación, fibrosis, herida, cálculos renales, o infiltración por cáncer.
En los diversos aspectos de la divulgación, la concentración de referencia puede reflejar el 95° percentil de la concentración de BAIB en animales sanos. Además, la enfermedad renal es el resultado de daño estructural. El daño estructural puede ser el resultado de inflamación, fibrosis, herida, cálculos renales (tales como cálculos de oxalato), o infiltración por cánceres. Alternativamente, la enfermedad renal es glomerulonefritis.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un métodoin vitropara determinar si un sujeto animal canino o felino está padeciendo una enfermedad renal debido a daño estructural o glomerulonefritis, comprendiendo el método: medir la concentración de BAIB y dimetilarginina simétrica (SDMA) en una muestra de orina o sangre obtenida del sujeto; en donde la medición comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-BAIB producido contra un conjugado que comprende BAIB y una proteína portadora, BAIB y polilisina, o BAIB y glutaraldehído; y determinar la unión o la cantidad de unión entre el anticuerpo anti-BAIB y BAIB en la muestra; y determinar la enfermedad renal cuando la razón de la concentración de BAIB [BAIB] con respecto a la concentración de SDMA [SDMA] es mayor de 0,15 o cuando la razón de [SDMA] con respecto a [BAIB] es menor de 7, y en donde el daño estructural es el resultado de inflamación, fibrosis, herida, cálculos renales, o infiltración por cáncer.
Además, la invención se refiere a un métodoin vitro paradiagnosticar un trastorno renal que es una pérdida de función renal debido a daño estructural en un sujeto animal canino o felino, comprendiendo el método: medir la concentración de uno o más de BAIB y SDMA en una muestra de orina o sangre obtenida del sujeto; en donde la medición comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-BAIB producido contra un conjugado de BAIB y una proteína portadora, BAIB y polilisina, o BAIB y glutaraldehído, y determinar la unión o la cantidad de unión entre el anticuerpo anti-BAIB y BAIB en la muestra; comparar el nivel BAIB y SDMA con concentraciones de referencia de BAIB y SDMA en sujetos sanos; diagnosticar la pérdida de función renal cuando la concentración de SDMA en la muestra está por encima de la concentración de referencia de SDMA y diagnosticar que la pérdida de función renal es el resultado de daño estructural cuando la concentración de BAIB en la muestra está por encima de la concentración de referencia de BAIB y en donde el daño estructural es el resultado de inflamación, fibrosis, herida, cálculos renales, o infiltración por cáncer.
En realizaciones, el animal es un felino y la concentración de referencia para BAIB es de 2,0 pg/dl, o el animal es un canino y la concentración de referencia para BAIB es de 1,2 pg/dl, y/o en donde la concentración de referencia para SDMA es de 14 pg/dl.
Además, la proteína portadora es preferiblemente una de KLH y BSA.
La invención también se refiere a un métodoin vitropara determinar la presencia o cantidad de BAIB en una muestra, comprendiendo el método poner en contacto un anticuerpo producido contra un conjugado de BAIB con la muestra y determinar la unión o la cantidad de unión entre el anticuerpo y BAIB en la muestra, que comprende además poner en contacto la muestra y el anticuerpo con un conjugado que comprende BAIB y un marcador detectable, en donde la muestra es una muestra de orina o una muestra de sangre de un animal canino o felino que padece una enfermedad renal debido a daño estructural o glomerulonefritis, en donde, además, el anticuerpo se produce contra un conjugado de BAIB y una proteína portadora, BAIB y polilisina, o BAIB y glutaraldehído, y en donde el daño estructural es el resultado de inflamación, fibrosis, herida, o infiltración por cáncer.
En realizaciones, la muestra de sangre es suero o plasma.
En realizaciones adicionales, al menos una de la concentración de referencia de BAIB y la concentración de referencia de SDMA, si se mide, refleja el 95° percentil de la concentración de BAIB y SDMA en muestras de animales sanos.
Además, el anticuerpo puede comprender un marcador.
Descripción
La divulgación se refiere generalmente a la determinación de la función renal. Más particularmente, la divulgación se refiere a métodos para diagnosticar y determinar una enfermedad renal tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
En diversos aspectos, la divulgación se refiere al uso de ácido p-aminoisobutírico (BAIB), también conocido como paminoisobutirato, para determinar o diagnosticar una enfermedad renal en un sujeto animal canino o felino. BAIB es un marcador para el daño estructural renal que conduce a una pérdida de nefronas y, por tanto, un marcador para cáncer de riñón, carcinoma renal, carcinoma renal metastásico de riñón, infiltración neoplásica del riñón, inflamación del riñón, nefritis hipoplasmocitaria intersticial, inflamación glomerular, y fibrosis renal.
Además, la dimetilarginina simétrica (SDMA) en muestras de sangre de animales, es decir, gatos y perros, se usa junto con BAIB para mejorar la exactitud de pronóstico.
SDMA es el isómero estructural del inhibidor de óxido nítrico sintetasa (NOS) endógeno, la dimetilarginina asimétrica (ADMA). Tanto ADMA como SDMA derivan de la metilación intranuclear de residuos de L-arginina y se liberan en el citoplasma después de la proteólisis. SDMA es producida por la proteína-arginina metiltransferasa 5 (PRMT 5) y PRMT 7. Las proteínas que portan metilargininas, tales como SDM<a>, ADMA y monometilarginina, desempeñan un papel en el procesamiento del ARN, el transporte de proteínas y la transducción de señales (Bedford y Richard, Mol. Cell 2005, 18(3):263-72). La SDMA libre que resulta de la degradación de tales proteínas metiladas se elimina principalmente por medio de la excreción renal, mientras que ADMA se metaboliza en gran medida. ADMA está fuertemente correlacionada con factores de riesgo para la arteriopatía coronaria (CAD), tales como hipertensión, hipercolesterolemia, hiperhomocisteinemia, resistencia a la insulina, edad, y presión arterial media. SDMA está correlacionada con parámetros de la función renal, tales como la tasa de filtración glomerular (GFR), el aclaramiento de inulina, y el aclaramiento de creatinina.
BAIB puede ser un marcador para daño o lesiones en el riñón, incluso cuando la función renal (por ejemplo, tal como se indica mediante SDMA) está dentro del intervalo de referencia normal.
Antes de describir aspectos adicionales de la divulgación, a continuación se definen una variedad de términos: BAIB es ácido p-aminoisobutírico (P-aminoisobutirato). La estructura de BAIB es:
BSA es albúmina sérica bovina.
La enfermedad renal implica la pérdida de la función de nefronas (eficiencia de filtración) con o sin daño estructural. El daño estructural puede estar provocado por lesiones, inflamación, fibrosis, herida, infiltración, y otras fuentes. Mientras que el cáncer puede ser una causa del daño estructural, el propio cáncer no está identificado generalmente como una enfermedad renal.
Los cálculos renales se refieren a cálculos en cualquier parte de la anatomía renal o urinaria, incluyendo nefrolitos, nefrolitos dentro de un túbulo o uréter, y cálculos en la vejiga. Los cálculos renales conducen frecuentemente a daño estructural y enfermedad renal.
CMIA es inmunoensayo magnético quimioluminiscente.
DIPEA es N,N-diisopropiletilamina.
DMF es dimetilformamida.
EIA es inmunoensayo enzimático.
ELISA es ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas.
ESI-EM es espectrometría de masas con ionización por electropulverización.
FPIA es inmunoensayo de polarización de fluorescencia.
GFR es tasa de filtración glomerular.
HATU es hexafluorofosfato de (1H-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluranio-metanamininio.
KLH es hemocianina de lapa californiana.
MEIA es inmunoensayo enzimático de micropartículas.
PBS es solución salina tamponada con fosfato.
RIA es radioinmunoensayo.
SDMA es dimetilarginina simétrica. La estructura de SDMA es:
SDMA libre se refiere a SDMA que no forma parte de una cadena polipeptídica. Uno o más residuos de aminoácidos de SDMA pueden estar presentes en un polipéptido.
TFA es ácido trifluoroacético.
El término “análogo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a un compuesto en el que uno o más átomos individuales se han reemplazado por un(os) átomo(s) diferente(s) o por un(os) grupo(s) funcional(es) diferente(s). Por ejemplo, un análogo puede ser una forma modificada del analito que puede competir con el analito por un receptor, proporcionando la modificación un medio para unir el analito a otro resto, tal como un marcador o soporte sólido. El análogo de analito puede unirse a un anticuerpo de una manera similar al analito. El término “anticuerpo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a una glicoproteína producida por células linfocíticas B en respuesta a la exposición a un antígeno y se une específicamente a ese antígeno. El término “anticuerpo” se usa en su sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada.
Tal como se usa en el presente documento, “anticuerpo anti-BAIB”, “porción de anticuerpo anti-BAIB” o “fragmento de anticuerpo anti-BAIB” y/o “variante de anticuerpo anti-BAIB” y similares incluyen cualquier proteína o péptido que contiene una molécula que comprende al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como, pero sin limitarse a, una región determinante de la complementariedad (CDR) de una región constante de cadena pesada o cadena ligera, una región de entramado, o cualquier porción de las mismas, que se una específicamente a BAIB. Tal como se usa en el presente documento, “anticuerpo anti-SDMA”, “porción de anticuerpo anti-SDMA” o “fragmento de anticuerpo anti-SDMA” y/o “variante de anticuerpo anti-SDMA” y similares incluyen cualquier proteína o péptido que contiene una molécula que comprende al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como, pero sin limitarse a, una región determinante de la complementariedad (CDR) de una región constante de cadena pesada o cadena ligera, una región de entramado, o cualquier porción de las mismas, que se una específicamente a SDMA.
El término “fragmento de anticuerpo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente el dominio de unión a antígeno o dominio variable del mismo. Específicamente, por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden incluir los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos de fragmentos de anticuerpos.
El término “antígeno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a una sustancia que, en condiciones apropiadas, es capaz de reaccionar con un anticuerpo específico para el antígeno.
El término “analito”, tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a la sustancia, o a un conjunto de sustancias, en una muestra que son detectadas y/o medidas.
El término “animal” tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a un animal no humano que es un canino o un felino.
El término “muestra”, tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a una muestra de orina o cualquier líquido derivado de la sangre, incluyendo, pero sin limitarse a, sangre completa, plasma, y suero. Para proporcionar suero para su uso en los métodos de la divulgación, se obtienen una o más muestras de suero del sujeto animal. Las muestras de suero pueden obtenerse, por ejemplo, del sujeto animal como muestras de sangre, luego pueden separarse para proporcionar suero. En determinadas realizaciones, el suero puede medirse sin separación de la sangre. Tal como apreciará el experto en la técnica, una muestra obtenida individual puede dividirse o puede usarse de otra manera para realizar numerosas mediciones de concentración. Alternativamente, pueden obtenerse una pluralidad de muestras del sujeto animal, midiéndose (al menos) una muestra para cada analito de interés, o para numerosos analitos secuencialmente, en paralelo o simultáneamente. En determinados casos, las muestras se obtienen del animal aproximadamente al mismo tiempo (por ejemplo, en el plazo de 60 minutos, en el plazo de 30 minutos, o incluso en el plazo de 10 minutos entre sí).
El término “reactividad cruzada”, tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a la capacidad de un sitio de unión a antígeno individual de un anticuerpo para reaccionar con más de un determinante antigénico o la capacidad de una población de moléculas de anticuerpo para reaccionar con más de un antígeno. En general, las reacciones cruzadas surgen debido a que (i) el antígeno que reacciona de manera cruzada comparte un epítopo en común con el antígeno inmunizante o (ii) tiene un epítopo el cual es estructuralmente similar a uno en el antígeno inmunizante (multiespecificidad).
El término “inmunoensayo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a una prueba que emplea complejos de anticuerpos y antígenos para generar una respuesta medible. Un “complejo anticuerpo:antígeno” puede usarse de manera intercambiable con el término “inmunocomplejo”. Los inmunoensayos, en general, incluyen inmunoensayos no competitivos, inmunoensayos competitivos, inmunoensayos homogéneos, e inmunoensayos heterogéneos. En los “inmunoensayos competitivos”, un analito (o antígeno) no marcado en la muestra de prueba se mide para determinar su capacidad para competir con un antígeno marcado en el inmunoensayo. El antígeno no marcado bloquea la capacidad del antígeno marcado para unirse debido a que el sitio de unión en el anticuerpo ya está ocupado. En los “inmunoensayos competitivos”, la cantidad de antígeno presente en la muestra de prueba está relacionada inversamente con la cantidad de señal generada a partir del marcador.
Los inmunoensayos que requieren la separación de complejos anticuerpo:antígeno unidos se denominan generalmente “inmunoensayos heterogéneos”, y los inmunoensayos que no requieren la separación de complejos anticuerpo:antígeno se denominan generalmente “inmunoensayos homogéneos”. Un experto en la técnica entendería fácilmente los diversos formatos de inmunoensayo.
“Poner en contacto”, tal como se usa en el presente documento, se usa en su aspecto más amplio para referirse a la combinación de reactivos en cualquier orden a menos que se especifique de otra manera en el presente documento.
El término “inmunocomplejos”, tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a los complejos formados por la unión de moléculas de antígenos y anticuerpos, con o sin la fijación del complemento. Cuando uno de cualquiera del anticuerpo o el antígeno está marcado, el marcador se asocia con el inmunocomplejo como resultado de la unión entre el antígeno y el anticuerpo. Por tanto, cuando el anticuerpo está marcado, el marcador se asocia con el antígeno como resultado de la unión. De manera similar, cuando el antígeno está marcado (por ejemplo, un análogo de analito que tiene un marcador), el marcador se asocia con el anticuerpo como resultado de la unión entre el antígeno y el anticuerpo.
El término “marcador”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto, una composición, o un soporte sólido detectable, que puede conjugarse de manera directa o indirecta (por ejemplo, a través de medios covalentes o no covalentes, solo o encapsulado) con un anticuerpo, análogo de BAIB, análogo de SDMA, o antígeno de la divulgación. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisotópicos, colorante quimioluminiscente, marcadores electroquímicos, quelatos de metal, partículas de látex, o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar una alteración química de un compuesto o una composición de sustrato que es detectable (por ejemplo, enzimas tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, y similares). El marcador empleado en la presente divulgación puede ser, pero no se limita a: fosfatasa alcalina; glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (“G6PDH”); peroxidasa de rábano picante (HRP); agentes quimioluminiscentes tales como isoluminol, agentes fluorescentes tales como compuestos de fluoresceína y rodamina; ribozimas; y colorantes. El marcador también puede ser una molécula de unión específica que por sí misma puede ser detectable (por ejemplo, biotina, avidina, estreptavidina, digioxigenina, maltosa, oligohistidina, 2,4-dinitrobenceno, fenilarsenato, ADNmc, ADNbc, y similares). El marcador puede unirse a otra molécula o soporte sólido y éste se elige por características específicas que permiten la detección de la molécula marcada. El uso de un marcador produce una señal que puede detectarse por medios tales como la detección de radiación electromagnética o visualización directa, y que puede medirse opcionalmente.
El término “anticuerpo monoclonal”, tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un sitio antigénico individual. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra epítopos diferentes, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un epítopo individual en el antígeno. El modificador “monoclonal” se refiere solamente al carácter del anticuerpo y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Específicamente, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse por medio de metodologías de hibridoma, o pueden producirse por medio de métodos de ADN recombinante, o pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando técnicas conocidas.
El término “polipéptido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a una molécula que tiene una secuencia de aminoácidos unida por enlaces peptídicos. Este término incluye proteínas, proteínas de fusión, oligopéptidos, péptidos cíclicos, y derivados de polipéptidos. Los anticuerpos y derivados de anticuerpos se comentan anteriormente en una sección independiente, pero los anticuerpos y derivados de anticuerpos se tratan, con los propósitos de la divulgación, como una subclase de los polipéptidos y derivados de polipéptidos.
El término “soporte sólido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una matriz no acuosa a que puede adherirse el anticuerpo o análogo de SDMA de la presente divulgación. Los ejemplos del soporte sólido incluyen soportes formados parcial o completamente por vidrio (por ejemplo, vidrio de tamaño de poro controlado), polímeros sintéticos y naturales, polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, poli(alcoholes vinílicos) y siliconas, partículas magnéticas, partículas de látex, tiras cromatográficas, placas de microtitulación de poliestireno, o cualquier otra sustancia que permita que los antígenos y/o anticuerpos unidos se laven o separen de los materiales no unidos. En determinadas realizaciones, dependiendo de la aplicación, el soporte sólido puede ser el pocillo de una placa de ensayo o puede ser una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad).
“Receptor” se refiere a cualquier compuesto o composición capaz de reconocer una organización espacial y polar particular de una molécula, por ejemplo, un sitio epitópico o determinante. Los receptores ilustrativos incluyen anticuerpos, fragmentos Fab, y similares.
“Especificidad de unión” o “unión específica” se refiere al reconocimiento sustancial de una primera molécula por una segunda molécula, por ejemplo, un polipéptido y un anticuerpo policlonal o monoclonal, o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento Fv, Fv de cadena sencilla, Fab' o F(ab')2) específico para el polipéptido. Por ejemplo, “especificidad”, tal como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a la capacidad de un sitio de combinación de anticuerpo individual para reaccionar únicamente con un determinante antigénico o la capacidad de una población de moléculas de anticuerpo para reaccionar únicamente con un antígeno. En general, existe un alto grado de especificidad en las reacciones antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos pueden distinguir diferencias en (i) la estructura primaria de un antígeno, (ii) formas isoméricas de un antígeno, y (iii) la estructura secundaria y terciaria de un antígeno. Las reacciones anticuerpo-antígeno que muestran alta especificidad muestran una baja reactividad cruzada.
“Unión sustancial” o “unido sustancialmente” se refiere a una cantidad de unión o reconocimiento específico entre moléculas en una mezcla de ensayo en condiciones de ensayo particulares. En su aspecto más amplio, unión sustancial se refiere a la diferencia entre la incapacidad de una primera molécula para unirse a o reconocer una segunda molécula, y la capacidad de la primera molécula para unirse a o reconocer una tercera molécula, de tal manera que la diferencia es suficiente para permitir que se lleve a cabo un ensayo significativo que distingue la unión específica en un conjunto particular de condiciones de ensayo, que incluye las concentraciones relativas de las moléculas, y el tiempo y la temperatura de una incubación. En otro aspecto, una molécula es sustancialmente incapaz de unirse a o reconocer otra molécula en un sentido de reactividad cruzada donde la primera molécula muestra una reactividad hacia una segunda molécula que es menor del 25 %, menor del 10 %, menor del 5 % o menor del 1 % de la reactividad mostrada hacia una tercera molécula en un conjunto particular de condiciones de ensayo. La unión específica puede someterse a prueba usando una variedad de métodos ampliamente conocidos, por ejemplo, un ensayo inmunohistoquímico, un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), o un ensayo de inmunotransferencia de tipo Western.
El término “sal”, tal como se usa en el presente documento, significa una sal formada entre un grupo funcional ácido y un grupo funcional básico de un compuesto. Las sales ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, sales de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, y pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). El término “sal” también se refiere a una sal formada entre un compuesto que tiene un grupo funcional ácido, tal como un grupo funcional ácido carboxílico, y una base inorgánica u orgánica. Las bases adecuadas incluyen, pero no se limitan a, hidróxidos de metales alcalinos tales como sodio, potasio, y litio, hidróxidos de metales alcalinotérreos tales como calcio y magnesio; hidróxidos de otros metales tales como aluminio y zinc; amoniaco, y aminas orgánicas, tales como mono-, di- o trialquilaminas no sustituidas o sustituidas con hidroxilo; diciclohexilamina; tributilamina; piridina; N-metil-N-etilamina; dietilamina; trietilamina; mono-, bis- o tris-(2-hidroxi-alquil inferior-aminas), tales como mono-, bis- o tris-(2-hidroxietil)amina, 2-hidroxi-terc-butilamina o tris-(hidroximetil)metilamina, N,N-di-alquil inferior-N-(hidroxialquil inferior)-aminas, tales como N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)amina o tri-(2-hidroxietil)amina; N-metil-D-glucamina; y aminoácidos tales como arginina, lisina, y similares.
Continuando con la invención, en un aspecto, la invención se refiere a un métodoin vitropara determinar si un animal canino o felino está padeciendo una enfermedad renal como resultado de daño estructural o glomerulonefritis, comprendiendo el método medir BAIB en una muestra de orina o una muestra de sangre del animal y determinar la enfermedad renal basándose en la concentración de BAIB en la muestra, que comprende además comparar la concentración de BAIB en la muestra con una concentración de referencia relacionada con la concentración de BAIB en muestras de animales sanos, en donde la medición comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-BAIB y determinar la unión o la cantidad de unión entre el anticuerpo y BAIB en la muestra, en donde, además, el anticuerpo anti-BAIB se produce contra un conjugado que comprende BAIB y una proteína portadora, BAIB y polilisina, o BAIB y glutaraldehído; y en donde el daño estructural es el resultado de inflamación, fibrosis, herida, cálculos renales, o infiltración por cáncer. En un aspecto, el límite de referencia superior representa el 95° percentil de una población de los sujetos felinos sanos. Puede considerarse que un sujeto que tiene una concentración de BAIB [BAIB] en sangre u orina superior al límite de referencia padece un trastorno renal, tal como daño estructural renal. Para los sujetos felinos, el límite de referencia del 95° percentil puede ser aproximadamente 2,0 pg/dl para BAIB para una población de felinos. Los intervalos para el 95° percentil pueden incluir, por ejemplo, aproximadamente 1,5-2,5 pg/dl, en particular aproximadamente 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4 y 2,5 pg/dl. Para los caninos, el 95° percentil es aproximadamente 1,0-2,0 pg/dl, en particular aproximadamente 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 y 2,0 pg/dl.
Otro aspecto de la divulgación incluye el uso de una combinación de BAIB y SDMA para determinar trastornos renales. En este aspecto, los intervalos de referencia tanto para BAIB como para SDMA pueden ser conocidos u obtenerse de una población de sujetos sanos. Un valor para la concentración de BAIB y la concentración de SDMA superior al valor de referencia puede ser indicativo de un trastorno renal. Un límite de referencia superior apropiado que representa el 95° percentil en sujetos sanos para SDMA puede ser, por ejemplo, 14 pg/dl. Véase el documento WO2015/035115. Una razón [BAIB]/[S<d>MA] mayor de 0,15, o una razón [SDMA]/[BAIB] menor de 7, es indicativa de un trastorno renal. Las concentraciones elevadas de BAIB en presencia de concentraciones normales de SDMA pueden indicar daño estructural incluso con una función renal normal. Las concentraciones disminuidas de BAIB en presencia de una concentración elevada de SDMA pueden ser indicativas de pérdida de la función de nefronas en ausencia de daño estructural.
En el presente documento también se describe un método para diagnosticar cálculos renales. El método incluye medir la concentración de BAIB en una muestra de un sujeto y determinar si el sujeto tiene una concentración de BAIB superior a un límite de referencia. Los niveles elevados de BAIB superiores al límite de referencia son indicativos de daño estructural, que puede estar provocado por cálculos renales. El análisis adicional mediante ecografía, TAC o radiografía del riñón puede ser confirmatorio en ausencia de otros síntomas de cálculos renales.
Los métodos de la invención pueden aplicarse para determinar la concentración de BAIB en dos o más muestras obtenidas del sujeto respectivo, durante el transcurso de minutos, horas, días, semanas, meses o años. El diagnóstico o la evolución de la enfermedad renal puede determinarse basándose en la concentración de BAIB en las muestras. Cuando la concentración de BAIB en las muestras está aumentando a través de la serie de muestras, puede determinarse que la enfermedad renal, tal como daño estructural renal, está empeorando. La mortalidad o muerte prematura también puede predecirse basándose en la concentración creciente de BAIB en la serie de muestras.
La divulgación también se refiere a un dispositivo de cálculo para realizar el cálculo o determinar razones tal como se describe en el presente documento o para diagnosticar una enfermedad o disfunción renal. El dispositivo de cálculo incluye un almacenamiento de memoria para instrucciones de software que, cuando se ejecutan, calculan un valor a partir de una ecuación que puede usarse para conducir a una determinación de un estado patológico.
En determinadas realizaciones, la concentración de SDMA libre se determina usando los métodos inmunológicos, dispositivos y kits descritos en la patente estadounidense n.° 8.481.690, el documento WO2015/035155, y la solicitud de patente provisional estadounidense 62/118.832 presentada el 20 de febrero de 2015. El método puede incluir controles, calibradores o patrones que comprenden uno o más análogos de SDMA. En particular, el método puede realizarse usando técnicas de inmunoensayo bien conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, el uso de microplacas y dispositivos de flujo lateral. Los sujetos animales de los que se obtienen las muestras para detectar SDMA incluyen sujetos animales no humanos caninos y felinos.
Las muestras pueden analizarse usando un ensayo modificado basado en el sistema de inmunoensayo homogéneo EMIT® (técnica de inmunoensayo enzimático multiplicado). En un ensayo EMIT® tradicional, una muestra que contiene el analito se pone en contacto con un anticuerpo anti-analito, un conjugado del analito y una enzima, y un sustrato que produce una señal cuando entra en contacto con la enzima. La unión del anticuerpo al conjugado inhibe o reduce la actividad enzimática. Cuando el analito está presente en la muestra, el analito de la muestra compite con el analito conjugado por la unión al anticuerpo, lo que da como resultado la generación de más señal de la enzima/sustrato. Cuando no está presente un analito, puede producirse más unión entre el anticuerpo y el conjugado para limitar o impedir la generación de señales. Por tanto, se genera más señal cuando está presente más analito. Los ensayos cinéticos pueden usar la tasa de generación de señales como indicador de la presencia o cantidad de analito en una muestra.
En un aspecto, una señal se mide como absorbancia a una longitud de onda específica para un sistema enzima/sustrato tal como se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, la medición de absorbancia a 340 nm para un sistema enzima/sustrato G6PDH/NAD proporcionará un valor para la cantidad relativa de conversión de NAD en NADH en presencia de G6PDH, que puede usarse para proporcionar una velocidad de reacción que refleja la conversión del sustrato por la enzima.
La velocidad de reacción puede determinarse al medir la señal (por ejemplo, absorbancia) en una pluralidad de puntos de tiempo durante la reacción mediada por enzimas. La determinación del tiempo y el intervalo de medición de señal están dentro de la experiencia en la técnica teniendo en cuenta la concentración de los reactivos y la temperatura del ensayo. Por ejemplo, la velocidad puede determinarse al medir la absorbancia comenzando aproximadamente 2-10 minutos después de la combinación de la muestra (o calibrador) y todos los reactivos a temperatura ambiente y medirse cada 5-60 segundos durante 1-15 minutos adicionales. La velocidad de reacción puede expresarse como el cambio en la absorbancia a lo largo del tiempo. Por ejemplo, la absorbancia puede medirse comenzando aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 minutos después de la combinación de la muestra (o calibrador) y todos los reactivos. La absorbancia se mide normalmente en intervalos de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ó 60 segundos durante aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 minutos. Cada uno de estos tiempos puede extenderse o acortarse, dependiendo de las condiciones de reacción, el analito, y los reactivos.
Según una realización de la divulgación, el analito es BAIB o SDMA, y el sistema enzima-conjugado es G6PDH/NAD. Véase la solicitud de patente provisional estadounidense 62/118.832 presentada el 20 de febrero de 2015 y la solicitud de patente estadounidense 15/048.209 presentada el 19 de febrero de 2016. En esta realización, un análogo de BAIB o SDMA se conjuga con G6PDH y se usa como conjugado en los ensayos con el fin de determinar la presencia o cantidad de BAIB o SDMA en muestras de suero o plasma de animales tales como humanos, gatos y perros. En un aspecto de esta realización, los calibradores se preparan al combinar cantidades conocidas de BAIB o SDMA con una matriz de calibrador (por ejemplo, suero destilado).
Además, un formato de ensayo en fase sólida es una técnica de ensayo de unión usada habitualmente. Existen una variedad de dispositivos y procedimientos de ensayo en donde se indica la presencia de un analito (por ejemplo, BAIB o SDMA) por la unión del analito a un conjugado y/o un elemento de unión complementario inmovilizado. En un aspecto particular, el elemento de unión inmovilizado (por ejemplo, un anticuerpo anti-BAIB o anti-SDMA) se une, o es unido durante el ensayo, a una fase sólida tal como un pocillo de reacción, una tira reactiva, una tira de prueba, una almohadilla de flujo continuo, papel, matriz de fibra u otro material de fase sólida adecuado. La reacción de unión entre BAIB o SDMA en la muestra y el anticuerpo inmovilizado se determina al añadir a la muestra una cantidad de un análogo de BAIB o SDMA, que incluye BAIB o SDMA conjugado con un marcador. Después de poner en contacto la mezcla de la muestra y el análogo de BAIB o SDMA con la fase sólida, la mezcla y la fase sólida se incuban para permitir la unión entre el anticuerpo inmovilizado, BAIB o SDMA, y el análogo de BAIB o SDMA. Después de la incubación, los reactantes no unidos se retiran de la fase sólida. Se mide la cantidad del marcador que se asocia con el anticuerpo a través de la unión del anticuerpo al análogo. La cantidad del marcador asociado con el anticuerpo es inversamente proporcional a la cantidad de BAIB o SDMA en la muestra. En determinadas realizaciones, BAIB y SDMA se marcan diferencialmente y miden simultáneamente según la divulgación anterior. En otras realizaciones, BAIB y SDMA se miden solos, secuencialmente, o en paralelo.
La inmovilización de uno o más anticuerpos contra BAIB o SDMA sobre un dispositivo o soporte sólido se realiza de modo que los anticuerpos no se eliminarán mediante lavado por la muestra, el diluyente y/o los procedimientos de lavado. Uno o más anticuerpos pueden adherirse a una superficie mediante adsorción física (es decir, sin el uso de enlazadores químicos) o mediante unión química (es decir, con el uso de enlazadores químicos). La unión química puede generar una adhesión más fuerte de anticuerpos sobre una superficie y proporcionar una orientación y conformación definidas de las moléculas unidas a la superficie.
En otra realización, los anticuerpos contra BAIB o SDMA producidos en una especie particular se unen a un soporte sólido mediante interacción con un anticuerpo anti-IgG de especie que se une al soporte. En un aspecto particular, los anticuerpos anti-BAIB o anti-SDMA se producen en conejos, y el soporte tiene unido al mismo un anticuerpo anti-IgG de conejo que reconoce el anticuerpo anti-BAIB o anti-SDMA producido en conejos. En este aspecto, el anticuerpo puede estar en forma de un anticuerpo antisuero obtenido de la especie. Los anticuerpos anti-BAIB o anti-SDMA pueden aplicarse a la fase sólida que tiene el anticuerpo anti-IgG de especie antes de la adición de la muestra a la fase sólida, o los anticuerpos anti-BAIB o anti-SDMA pueden mezclarse con la muestra antes de la adición de la muestra a la fase sólida. En cualquier caso, los anticuerpos anti-BAIB o anti-SDMA se unen a la fase sólida a través de la unión al anticuerpo anti-IgG de especie en la fase sólida.
En otra realización, uno o más anticuerpos marcados pueden mezclarse con una muestra de prueba antes de la aplicación de la mezcla a un soporte sólido. En este caso, un análogo de BAIB o SDMA puede adherirse al soporte sólido de modo que el análogo no se eliminará mediante lavado por la muestra, el diluyente y/o los procedimientos de lavado. Los anticuerpos marcados en la muestra se unen a BAIB o SDMA en la muestra y, por tanto, no están disponibles para la unión con el análogo de BAIB o SDMA en el soporte sólido. Después de la aplicación de la mezcla al soporte sólido, y una incubación apropiada, la mezcla se lava del soporte sólido. Los anticuerpos que no se han unido al BAIB o la SDMA de la muestra se unirán al análogo de BAIB o SDMA en el soporte sólido. La presencia o cantidad de BAIB o SDMA en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de anticuerpo que se ha unido al análogo de BAIB o SDMA. La señal asociada con el marcador en el anticuerpo puede medirse mediante el método apropiado.
La detección de los complejos anticuerpo:antígeno puede lograrse a través de una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, turbidimetría, marcaje enzimático, radiomarcaje, luminiscencia, o fluorescencia. Las metodologías de inmunoensayo son conocidas por los expertos habituales en la técnica y se aprecia que incluyen, pero no se limitan a, radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA), inmunoensayos de polarización de fluorescencia (FPIA), inmunoensayos enzimáticos de micropartículas (MEIA), ensayos de tecnología de inmunoensayo enzimático multiplicado (EMIT), ensayos inmunoturbidimétricos o de aglutinación, inmunoensayos basados en oro coloidal que incluyen dispositivos de flujo lateral e inmunoensayos magnéticos quimioluminiscentes (CMIA). En RIA, un anticuerpo o antígeno se marca con radiactividad y se usa en un formato competitivo o no competitivo. En EIA, un anticuerpo o antígeno se marca con una enzima que convierte un sustrato en un producto con una señal resultante que se mide, tal como un cambio en el color. En FPIA, un antígeno se marca con un marcador fluorescente y compite con el antígeno no marcado de la muestra. La cantidad de analito medida es inversamente proporcional a la cantidad de señal medida. En MEIA, una micropartícula en fase sólida se recubre con anticuerpos contra un antígeno de interés y se usa para capturar el analito. El anticuerpo para la detección se marca con una enzima como en el método de EIA. La concentración de analito medida es proporcional a la cantidad de señal medida. En CMIA, un marcador quimioluminiscente se conjuga con el anticuerpo o antígeno, y produce luz cuando se combina con su sustrato. CMIA puede configurarse en un formato competitivo o no competitivo, y produce resultados que son inversa o directamente proporcionales a la cantidad de analito presente, respectivamente.
También se conocen bien el uso de tiras de prueba impregnadas con reactivo en ensayos de unión específica. En tales procedimientos, una muestra de prueba se aplica a una porción de la tira de prueba y se permite que migre o absorba por fuerzas capilares a través del material de la tira. Por tanto, el analito que va a detectarse o medirse pasa a través o a lo largo del material, posiblemente con la ayuda de un disolvente de elución que puede ser la propia muestra de prueba o una disolución añadida por separado. El analito migra al interior de una zona de captura o detección en la tira de prueba, en donde está inmovilizado un elemento de unión complementario para el analito. El grado en que se une el analito en la zona de reacción puede determinarse con la ayuda del conjugado que también puede incorporarse en la tira de prueba o que puede aplicarse por separado. En una realización, un anticuerpo específico para BAIB o SDMA se inmoviliza en un soporte sólido en una ubicación distinta. Después de la adición de la muestra, la detección de complejos BAIB-anticuerpo o SDMA-anticuerpo en el soporte sólido puede ser mediante cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.726.010 describe un ejemplo de un dispositivo de flujo lateral, el dispositivo de inmunoensayo SNAP® (IDEXX Laboratories).
Otras tecnologías de detección emplean partículas o microperlas magnéticas, por ejemplo, perlas poliméricas impregnadas con óxido de hierro superparamagnéticas. Estas perlas se asocian con, por ejemplo, una pareja de unión específica para el analito. Las perlas se unen con los analitos objetivo en la muestra que está sometiéndose a prueba y luego se aíslan o separan normalmente de la disolución de manera magnética. Una vez que se ha producido el aislamiento, puede llevarse a cabo otra prueba, que incluye la observación de imágenes o marcadores particulares, ya sea directamente de manera óptica o por medio de una cámara.
En realizaciones adicionales, los análogos de BAIB o SDMA, particularmente los análogos de BAIB o SDMA que contienen tiol, que contienen hidroxilo, que contienen amino y que contienen carboxilato, hacen posible que BAlB o SDMA se una con otra molécula (objetivo de conjugación), tal como una proteína activada, para formar un conjugado de BAIB o SDMA. Los análogos de BAIB o SDMA descritos en el presente documento hacen posible que BAIB o SDMA se una con un objetivo de conjugación tal como una proteína, un polipéptido, un marcador detectable, un soporte sólido, y similares, para proporcionar el conjugado de BAIB o SDMA. Los conjugados de BAIB o SDMA descritos en el presente documento pueden usarse para producir anticuerpos para su uso en inmunoensayos específicos para BAIB o SDMA. Los análogos de BAIB o SDMA también pueden conjugarse con un marcador para su uso en inmunoensayos específicos para BAIB o SDMA.
Para producir un anticuerpo anti-BAIB, se conjuga BAIB con una proteína portadora para formar un inmunógeno “hapteno-portador” que puede usarse para estimular una respuesta inmunitaria a un epítopo que incluye BAIB. Las proteínas inmunógenas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, BSA, KLH, y ovoalbúmina. Los protocolos para conjugar haptenos a proteínas inmunógenas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow y D. Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY, 1988) páginas 78-87).
Los análogos de SDMA adecuados se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense 8.481.690 y el documento WO2015/035155.
Los análogos de BAIB incluyen, por ejemplo, BAIB-tiol (extremo amino y extremo carboxilo) y BAIB-FMOC (fluorenilmetiloxicarbonilo), mostrados a continuación:
Estos análogos pueden usarse para preparar conjugados de BAIB incluyendo, por ejemplo, los siguientes: un conjugado glutaraldehído-BAIB, un conjugado polilisina-BAIB, un conjugado BAIB (extremo amino)-BSA, un conjugado BAIB (extremo carboxilo)-BSA; un conjugado BAIB (extremo amino)-KLH, un conjugado BAIB (extremo carboxilo)-KLH, un conjugado BAIB-G6PDH, y BAIB conjugado con una partícula. A continuación se muestran las estructuras de varios de estos conjugados.
En una realización alternativa, los análogos de BAIB y/o SDMA se unen a un marcador detectable. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisotópicos, colorante quimioluminiscente, marcadores electroquímicos, quelatos de metal, partículas de látex, o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, pueden catalizar una alteración química de un compuesto o una composición de sustrato que es detectable (por ejemplo, enzimas tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, y similares). El marcador puede ser una molécula de unión específica que por sí misma puede ser detectable (por ejemplo, biotina, avidina, estreptavidina, digioxigenina, maltosa, oligohistidina, 2,4-dinitrobenceno, fenilarsenato, ADNmc, ADNbc, etc). SDMA y/o BAIB pueden unirse a un marcador detectable usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Un conjugado de los análogos de SDMA y BAIB y KLH o BSA se usa como inmunógeno para generar anticuerpos que se unen sustancialmente a BAIB y SDMA (es decir, anticuerpos anti-BAIB y anti-SDMA). Los anticuerpos anti-SDMA y los anticuerpos anti-BAIB que son útiles en los métodos de la divulgación se caracterizan por una unión de alta afinidad a BAIB y SDMA. Por consiguiente, en el presente documento se describen anticuerpos anti-BAIB y anticuerpos anti-SDMA aislados, recombinantes, sintéticos, y/o producidosin vivo,así como métodos para producir y usar tales anticuerpos. Los anticuerpos descritos en el presente documento son útiles, por ejemplo, como reactivos en ensayos para la determinación de SDMA y BAIB en muestras de sujetos animales caninos y felinos. En una realización, los anticuerpos generados son capaces de detectar BAIB y SDMA libre (es decir, SDMA que no forma parte de una cadena polipeptídica).
Los métodos para producir los anticuerpos incluyen el uso de uno o más conjugados de BAIB y SDMA como inmunógenos para estimular una respuesta inmunitaria. Los métodos incluyen administrar uno o más conjugados de BAIB y SDMA a un animal usando un protocolo de inmunización adecuado, y separar un anticuerpo apropiado de un(os) líquido(s) corporal(es) del animal. Alternativamente, los conjugados pueden usarse en métodos de presentación en fagos para seleccionar fagos que presentan sobre su superficie un anticuerpo apropiado, seguido de la separación de secuencias de ácidos nucleicos que codifican para al menos una región de dominio variable de un anticuerpo apropiado. Los métodos de presentación en fagos son bien conocidos por los expertos habituales en la técnica (véase, por ejemplo, Antibody Phage Display; Methods in Molecular Biology, vol. 178, O'Brien, Philippa M.; Aitken, Robert (eds.) 2002). Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante métodos conocidos generalmente en la técnica.
Los análogos de BAIB y SDMA descritos en el presente documento pueden unirse a un marcador para proporcionar un conjugado detectable para su uso en ensayos de unión a receptores, tales como inmunoensayos para BAIB y SDMA. De manera similar, los anticuerpos anti-BAIB y anti-SDMA pueden unirse a un marcador para proporcionar anticuerpos anti-SDMA y anticuerpos anti-BAIB detectables para su uso en ensayos de unión a receptores, tales como inmunoensayos. Los análogos y anticuerpos pueden unirse a un marcador usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, Immunochemical Protocolos; Methods in Molecular Biology, vol. 295, editado por R. Burns (2005)). Los conjugados detectables o anticuerpos anti-SDMA detectables pueden usarse en diversos formatos de ensayo homogéneos y/o competitivos para generar una señal que está relacionada con la presencia o cantidad de BAIB y/o SDMA en una muestra de prueba.
En una realización específica, las metodologías de inmunoensayo son inmunoensayos competitivos para la detección de anticuerpos anti-BAIB y anti-SDMA. El inmunoensayo competitivo puede llevarse a cabo de la siguiente manera ilustrativa. Una muestra, procedente de un líquido corporal de animal, se pone en contacto con un análogo de BAIB o un análogo de SDMA conjugado con un soporte sólido y con un anticuerpo anti-BAIB y anti-SDMA conjugado con un marcador detectable. Los anticuerpos de interés, presentes en la muestra, compiten con los anticuerpos anti-BAIB y anti-SDMA conjugados con un marcador detectable por la unión con los análogos conjugados con un soporte sólido. La cantidad del marcador asociado con el soporte sólido puede determinarse después de separar los anticuerpos no unidos y el soporte sólido. En una realización alternativa, el inmunoensayo competitivo se lleva a cabo de la siguiente manera ilustrativa. Una muestra, procedente de un líquido corporal de animal, que contiene BAIB y SDMA, se pone en contacto con un análogo de BAIB o un análogo de SDMA unido a un marcador detectable y luego con un anticuerpo anti-BAIB o anti-SDMA conjugado con un soporte sólido. SDMA o BAIB en la muestra compite con SDMA o BAIB en el soporte sólido por la unión con el conjugado de BAIB o SDMA unido a un anticuerpo marcado. En cualquier caso, la señal obtenida está inversamente relacionada con la cantidad de BAIB o SDMA presente en la muestra.
Tal como se describe en el presente documento, la concentración de creatinina en suero puede medirse en una variedad de maneras, tal como conoce el experto en la técnica. Por ejemplo, un analizador de química Catalyst DxTM o un analizador de química VetTest® puede usarse con portaobjetos secos adaptados para someter a prueba la creatinina, por ejemplo, aquellos disponibles comercialmente de IDEXX Laboratories. También pueden usarse otros analizadores y portaobjetos, tales como el analizador VITROS® 950 y los portaobjetos VITROS® CREA disponibles de Ortho Clinical Diagnostics, y el analizador COBAS® y kits relacionados de Roche Diagnostics. También pueden usarse ensayos enzimáticos en húmedo. Por ejemplo, el experto en la técnica puede usar un método enzimático de química en húmedo en un analizador Integra 800. Un ensayo particular se basa en un sistema creatininasa/creatinasa/sarcosina oxidasa con detección a 552 nm y determinación de blanco de absorbancia a 659 nm. El experto en la técnica también puede usar métodos colorimétricos, por ejemplo, aquellos basados en picrato tales como el ensayo de Jaffe. También pueden usarse otros métodos conocidos por el experto en la técnica, tales como aquellos descritos en la publicación de patente estadounidense n.° 2005/0266574 y la patente estadounidense n.° 4.818.703, para medir la concentración de creatinina. En determinados aspectos, la medición de la concentración de creatinina se realiza usando la espectrometría de masas por dilución isotópica.
Ejemplos
Ejemplo 1: Ensayo de cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL-EM) para los niveles de BAIB en suero (ejemplo comparativo, no forma parte de la invención)
Se optimizó un ensayo de cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL-EM) para medir los niveles de BAIB en suero.
El suero destilado de canino se preparó de la siguiente manera: se cargó el suero de canino comercial no tratado (500 ml) en un tubo de diálisis SNAKESKIN™ de 61 cm (dos pies) (MWCO de 3,5 K, D.I. seco de 35 mm) (Thermo Scientific) y se dializó frente a tampón PBS (20 l) con 20 g de polvo de carbón a 4 °C durante al menos seis horas. El procedimiento se repitió tres veces cambiando el tampón y el carbón. La concentración de BAIB en el suero se midió mediante CL-EM antes y después de la diálisis. En el suero antes de la diálisis, la concentración de BAIB era de 2-3 |jg/dl. Después de la diálisis, la concentración de BAIB era inferior al límite de detección. El suero de canino destilado en carbón vegetal se almacenó a -80 °C para su uso.
Se generó una curva de calibración de CL-EM según el siguiente procedimiento.
Se preparó un patrón interno disolviendo D3-BAIB (BAIB marcado con 3 átomos de deuterio) 50 jg/dl (CDN ISOTOPES, número de producto D-7229) en agua.
Se prepararon patrones de ensayo preparando en primer lugar una disolución de BAIB 1 mg/ml en agua. Se transfirieron 8 j l de esta disolución a 7992 j l de suero de canino destilado y se diluyeron en serie en suero destilado (preparado anteriormente) para generar la serie de dilución de la tabla 1.
Tabla 1
Se prepararon muestras para CL-EM según lo siguiente:
1. Se transfirieron 50 |jl de muestras de prueba o patrones de referencia a viales.
2. Se añadieron 50 j l de disolución de patrón interno al vial y se mezcló a fondo la disolución.
3. Se añadieron 300 j l de acetonitrilo puro al vial y se mezcló a fondo la disolución.
4. Se centrifugaron los viales a 3.000 x g durante 20 minutos, se decantó el sobrenadante, se filtró (0,2 jm), y se sometió a CL-EM en las condiciones descritas a continuación.
Se ejecutó la CL-EM en las siguientes condiciones:
Fase móvil A: agua, ácido fórmico al 0,1 %, ácido perfluoroheptanoico 0,5 mM (Sigma 342041-5G)
Fase móvil B: acetonitrilo, ácido fórmico al 0,1 %
Columna: Acquity CSH C181,7 jm, 2,1x30 mm (Waters 186005295)
Tipo de barrido: MRM
Modo de barrido: positivo
Fuente de iones: turbo-pulverización
Volumen de inyección: 2 j l
Flujo: 1 ml/min
Temp. de columna: 20 °C
Temp. de refrigerador: 15 °C
% de B Inicial: 0 %
Programa temporal
Tiempo (min) Módulo Eventos Parámetro
1,00 Bombas Conc. de la bomba B 5
2,20 Bombas Conc. de la bomba B 100
2,50 Bombas Conc. de la bomba B 100
2,60 Bombas Conc. de la bomba B 0
4,00 Controlador de sistema Detención
Iniciar al 0 % de B a tiempo 0 min. Aumentar el gradiente hasta el 5 % de B en 1 min. Aumentar el gradiente hasta el 100 % de B durante 1,2 min (marca de 2,20 min). Permanecer al 100 % de B durante 0,3 min (marca de 2,5 min), luego regresar a las condiciones iniciales (0 % de B).
Ejemplo 2: Medición de BAIB en felinos sanos y enfermos (ejemplo comparativo, no forma parte de la invención) Se determinaron los niveles de referencia de BAIB en sujetos felinos normales en 58 gatos de ambos sexos, y de diversas razas. Se recogieron muestras de suero, se sometieron a CL-EM tal como se describió anteriormente, y se compararon las muestras de prueba individuales con patrones (medidos anteriormente) para determinar los niveles de BAIB. El límite de referencia superior basado en el 95° percentil para esta población fue de 2,0 jg/dl.
También se midió la concentración de BAIB [BAIB] en suero en felinos que padecían una enfermedad renal en diez felinos mediante CL-EM. Además, se midió la concentración de SDMA [SDMA] mediante CL-EM.
Los niveles de BAIB y SDMA se muestran en la tabla 2.
Tabla 2
El límite de referencia superior para la concentración de SDMA [SDMA] en felinos es de 14 |jg/dl, que representa el 95° percentil de la concentración de SDMA en sujetos sanos. Véase el documento WO2015/035115.
Los niveles elevados de BAIB son un marcador de la gravedad del daño estructural renal y son un pronóstico de mortalidad. Las razones [SDMA]/[BAIB] inferiores a aproximadamente 7 indican un daño funcional, así como estructural, en una enfermedad renal. Las razones [BAlB]/[SDMA] superiores a aproximadamente 0,15 también indican la pérdida funcional con daño estructural en una enfermedad renal. Las razones [BAIB]/[SDMA] más altas reflejan una probabilidad aumentada de muerte prematura, en donde las razones [BAIB]/[SDMA] más bajas reflejan una probabilidad disminuida de muerte prematura. El límite de referencia para la razón [SDMA]/[BAIB] en felinos es de 7. El límite de referencia para la razón [BAIB]/[SDMA] en felinos es de 0,15.
Ejemplo 3: BAIB en felinos con cálculos renales
Se determinaron los niveles de BAIB en suero en diversos momentos para sujetos felinos que padecían cálculos renales. La concentración elevada de BAIB en suero fue indicativa de cálculos renales tal como se muestra en la tabla 3.
Tabla 3
Ejemplo 4: Niveles de BAIB en sujetos felinos que padecen glomerulonefritis (ejemplo comparativo, no forma parte de la invención)
Cuatro pacientes felinos y un paciente canino murieron como resultado de una enfermedad renal. Después de la muerte de los pacientes, la necropsia dio como resultado un diagnóstico de glomerulonefritis. Se midieron SDMA, BAIB y CRE (tal como se describió anteriormente) de manera retrospectiva en muestras depositadas en banco recogidas antes de la muerte de los pacientes. BAIB estaba elevado en estos pacientes tal como se muestra en la tabla 4.
Tabla 4
Ejemplo 5: Niveles de BAIB en caninos con trastorno renal
Se determinaron los niveles de referencia de BAIB en sujetos caninos normales en 136 perros de ambos sexos, y de diversas razas. Se recogieron muestras de suero y se analizaron mediante CL-EM tal como se describió anteriormente. El límite de referencia superior basado en el 95° percentil para esta población fue de 1,24 pg/dl. Se sabe que la presencia de una discordancia entre las concentraciones de SDMA en suero y CRE en suero (es decir, una razón [SDMA]/[CRE] alta y SDMA en suero superior a lo normal) es indicativa de un riesgo de muerte prematura. Véase el documento WO2015/035155. Por consiguiente, se midieron BAIB, CRE y SDMA en suero en 13 perros con diversos niveles de SDMA y CRE. Se calculó la razón [BAIB]/[SDMA]. Estos datos se presentan en la tabla 5.
Tabla 5
* [SDMA]/[CRE] > 10 y SDMA > 14 pg/dl
Posteriormente se monitorizó la cohorte de caninos. En perros que mostraban una discordancia de [SDMA]:[CRE], BAIB estaba elevado por encima del valor de corte normal. En perros que mostraban una discordancia de [SDMA]:[CRE], la razón [BAIB]/[SDMA] estaba elevada con respecto a los perros que no mostraban la discordancia. En el seguimiento, se notificó que los perros que mostraban una discordancia de [SDMA]:[CRE] estaban muertos. Se determinó que una razón [BAIB]/[SDMA] mayor de 1,5 es indicativa de una disfunción renal y un riesgo de muerte prematura. Una concentración elevada de BAIB en suero es indicativa de una disfunción renal y un riesgo de muerte prematura.
Ejemplo 6: Medición de BAIB y SDMA en pacientes con cáncer
Se midieron BAIB y SDMA en el suero de siete pacientes caninos y seis pacientes felinos que se presentaron en la clínica local con una variedad de cánceres.
De los siete pacientes caninos con cáncer, sólo uno (C6) tuvo niveles de BAIB por encima del límite superior del intervalo de referencia normal (3,6 pg/ml). Se descubrió que el paciente canino con cáncer C6 tenía carcinoma renal metastásico, es decir, C6 fue el único canino en el grupo donde el cáncer se había diseminado a los riñones.
De los seis pacientes felinos con cáncer, tres pacientes con descubrimientos histopatológicos renales positivos (carcinoma renal metastásico, nefritis linfoplasmocitaria intersticial, inflamación, fibrosis) tuvieron niveles elevados de BAIB (F3, F4 y F5) por encima del intervalo de referencia (2,0 pg/dl). Los tres pacientes con histopatología renal normal tuvieron niveles de BAIB dentro de la referencia normal.
Tabla 6
Ejemplo 7: Preparación del conjugado BAIB-G6PDH
Se prepararon conjugados de BAIB y G6PDH mediante la conjugación del análogo de BAIB SDMA-SH con G6PDH activada con SIA en presencia de NAD y G6P.
Preactivación de la enzima con SIA: se disolvió un vial de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) (12 mg) en 3 ml de tampón MES (50 mM, pH 8,0) y se hizo girar durante 1 hora para garantizar que la enzima se disolviera completamente. Se mantuvo la disolución de enzima sobre hielo hasta que fue necesario. Se añadieron 4,5 ml adicionales de tampón MES (50 mM, pH 8,0) a la disolución de enzima, se mezclaron bien a través de agitación con vórtex (5 segundos) y se mantuvo la disolución sobre hielo durante 10 minutos. Se disolvieron 100 mg de G6P en 1 ml de agua desionizada y se mantuvieron sobre hielo durante 10 min. Se disolvieron 200 mg de NADH en 1 ml de agua desionizada y se mantuvieron sobre hielo durante 10 min. Se añadieron 0,68 ml de disolución de G6P y 0,34 ml de disolución de NADH a la disolución de enzima, se mezclaron bien a través de agitación con vórtice (5 segundos) y se mantuvieron sobre hielo durante 10 min. Se disolvió un vial de SIA (50 mg) en 0,5 ml de DMSO (100 mg/ml). Se añadieron 0,14 ml de disolución de SIA a la disolución de enzima, se mezclaron bien a través de agitación con vórtice (5 segundos), se cubrieron con una hoja delgada de aluminio, y se hicieron girar a temperatura ambiente durante 2 horas. Se transfirió la disolución a un casete de diálisis G2 Slide-A-Lyzer y se dializó durante cinco horas frente a tampón PBS (4 l) a 4 °C en la oscuridad. Se cambió el tampón a PBS nueva (4 l) y se dializó la disolución a 4 °C durante la noche en la oscuridad. Se cambió el tampón de diálisis a MES (4 l, 25 mM, pH 8,0) y se dializó la disolución durante 3 horas a 4 °C. Se retiraron 12,5 ml de la disolución de enzima del casete de diálisis y se añadieron 0,32 ml de tampón MES (1 M, pH 8,0) y 0,32 ml de EDTA (0,2 M, pH 8,0) para llevar la concentración final de la disolución a MES 50 mM y EDTA 5 mM. Si es necesario, si la disolución de enzima es menor de 12,5 ml, los volúmenes de MES y EDTA pueden ajustarse por consiguiente. Se desgasificó la disolución con argón durante 5 minutos.
Se preparó el análogo BAIB-SH (extremo carboxilo) tal como se describe en el ejemplo 12 y se acopló a la enzima activada de la siguiente manera: se disolvió BAIB-SH (400 eq., 0,096 mmol, 15,6 mg) en agua (0,156 ml) y se añadió a la disolución de enzima G6PDH activada con SIA. Se agitó la reacción a 4 °C durante 36 h. Se formó el conjugado BAIB-G6PDH y se purificó mediante diálisis frente a PBS (4 l) durante 6 h a 4 °C con cambio de tampón en tres ocasiones.
Ejemplo 8: Preparación del conjugado glutaraldehído-BAIB
Se preparó un conjugado glutaraldehído-BAIB con BAIB 2 mg/ml en PBS 20 mM con NaCl 0,15 M (5 ml, 10 mg en total) con 25 |jl (6,25 mg) de glutaraldehído añadido (25 % en agua). Después de haber reaccionado a temperatura ambiente durante 1 h, se añadió NaBH4 (4 eq. de BAIB, 0,776 mmol, 48 mg) y se agitó la mezcla de reacción a 4 °C durante 18 h.
Se preparó un conjugado polilisina-BAIB según el siguiente esquema de reacción a una concentración de 0,1 mg/ml en agua.
Se disolvió Fmoc-BAIB (5 mg) en agua (5 ml) y se añadieron EDC (2 mg) y Sulfo-NHS (3 mg). Se agitó la disolución a temperatura ambiente durante 15 min y luego se añadió una disolución de polilisina (20 ml, 0,1 %) y luego se agitó la mezcla durante 3 horas a temperatura ambiente. A la disolución se le añadió piperidina hasta una concentración final del 20 % y se incubó durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. Luego se dializó la disolución de reacción en un casete de diálisis con un MWCO de 10K (30 ml) frente a PBS (4 l) a 4 °C y se cambió el tampón en dos ocasiones.
Ejemplo 10: Preparación del conjugado partícula-BAIB
Se mezclaron 0,4 ml de partículas al 5 % de sólidos con 0,8 ml de BAIB a una concentración de 5 mg/ml en 2,8 ml de tampón fosfato 50 mM y se mezclaron por volteo a 4 °C durante dos días.
Ejemplo 11: Síntesis de BAIB-tiol (extremo amino) y BAIB conjugado con BSA
Se preparó un inmunógeno a modo de ejemplo, el conjugado BAIB (extremo amino)-BSA, según el siguiente procedimiento.
En primer lugar, se preparó un análogo BAIB-SH (extremo amino) según el siguiente esquema de reacción y el método descrito a continuación.
1. Se disolvieron 22 mg (0,216 mmol) de BAIB (n.° de catálogo de Sigma-Aldrich 217794) en PBS (4 ml).
2. Se disolvieron 50 mg (0,216 mmol) de SATA (S-acetiltioacetato de N-succinimidilo, n.° de catálogo de Thermo PD199377) en DMSO (0,4 ml) y se añadieron a la disolución de BAIB.
3. Se invirtió la reacción durante 30 minutos a 20 °C.
4. Luego se trató la reacción con una disolución de desacetilación (0,9 ml, hidroxilamina 0,5 M, EDTA 25 mM en PBS, pH 7,3).
5. Se invirtió la reacción durante 4 horas a 4 °C para proporcionar BAIB-SH (extremo amino).
Se acopló BAIB-SH a BSA de la siguiente manera:
1. Se añadió 1 ml de la disolución de reacción a un vial de BSA activada con maleimida (5 mg) (n.° de catálogo de Sigma-Aldrich 054M4801V) y se invirtió la reacción durante 18 horas a 2 °C.
3. Se colocó el conjugado en un casete de diálisis de 3 ml con un corte de 10 MW y se dializó frente a PBS (4 l) a 4 °C durante 48 horas.
4. Se determinó la eficiencia de acoplamiento mediante la prueba de Ellman según métodos conocidos en la técnica usando disolución de tiol en exceso de la etapa 6 anterior: 10 j l de muestra 20 |jl de reactivo de Ellman 70 |jl de tampón DTNB, luego se leyó a 412 nm.
Ejemplo 12: Síntesis de BAIB-tiol (extremo carboxilo) y BAIB conjugado con BSA
Se preparó un inmunógeno a modo de ejemplo, el conjugado BAIB (extremo carboxilo)-BSA, según el siguiente procedimiento.
Preparación de resina de BAIB:
Se preparó resina de BAIB-SH según el siguiente esquema de reacción general y tal como se describe a continuación.
1. Se invirtió una mezcla que comprendía 150 mg (0,28 mmol) de BAIB (n.° de catálogo de Sigma-Aldrich 217794), 400 mg (0,31 mmol) de Fmoc-Cl (Fluka BCBH6153V), 0,41 ml (0,47 mmol) de DIPEA (n.° de catálogo de Sigma-Aldrich 77996JJ) y 18 ml de DMF (n.° de catálogo de Sigma-Aldrich 23185) durante 3 horas a 20 °C.
2. Se añadió lo siguiente a la mezcla anterior: 1,2 g (0,093 mmol) de resina de 4-metoxi-tritilo (Novabiochem S6013887 348) y 530 mg (0,28 mmol) de HATU (Novabiochem S8446513 309). Se invirtió la disolución resultante durante 18 horas adicionales a 20 °C.
3. Luego se añadió piperidina al 20 % en DMF y se invirtió durante 15 min (3 x 18 ml).
4. Después de la incubación, se lavó la resina con DMF (4 x 18 ml), luego MeOH (4 x 18 ml), y se secó para proporcionar 0,95 g de resina de BAIB-SH.
Síntesis del conjugado BAIB (extremo carboxilo)-BSA
1. Se añadieron 200 mg de resina de BAIB-SH a 4 mide TFA (n.° de catálogo de Sigma-Aldrich 91707).
2. Se invirtió la mezcla de BAIB-TFA a 20 °C durante 1 h.
3. Se secó la reacción para proporcionar 20 mg del análogo BAIB-tiol.
4. Se disolvió el tiol de la etapa 3 en PBS (4 ml).
6. Se añadió la disolución de tiol a cuatro viales de BSA activada con maleimida (20 mg) (n.° de catálogo de Sigma-Aldrich 054M4801V) y se invirtió la reacción durante 18 horas a 4 °C. Se conservó la disolución en exceso para la prueba de Ellman: 10 pl de muestra 20 pl de reactivo de Ellman 70 pl de tampón DTNB, luego se leyó a 412 nm.
7. Se colocó el conjugado en un casete de diálisis de 3 ml con un corte de 10 MW y se dializó frente a PBS (4 l) a 4 °C durante 48 horas.
8. Se determinó la eficiencia de acoplamiento mediante la prueba de Ellman según métodos conocidos en la técnica usando disolución de tiol en exceso de la etapa 5 anterior: 10 pl de muestra 20 pl de reactivo de Ellman 70 pl de tampón DTNB, luego se leyó a 412 nm.
Ejemplo 13: Síntesis de BAIB conjugado con KLH
Se preparó un inmunógeno a modo de ejemplo, el conjugado BAIB (extremo carboxilo)-KLH, según el siguiente procedimiento:
1. Se añadieron 100 mg de resina de BAIB-SH (véase el ejemplo 11 anterior) a 2 ml de TFA (n.° de catálogo de Sigma-Aldrich SHBD1537V).
2. Se invirtió la mezcla de BAIB-TFA a 20 °C durante 1 hora, y se eliminó por filtración la resina y se lavó con 0,5 ml de acetonitrilo.
3. Se secó la reacción para proporcionar 15 mg de BAIB-SH como un aceite transparente.
4. Se disolvió el aceite de la etapa 3 en PBS (3 ml) para formar una disolución de BAIB-tiol.
5. Se añadieron 2 ml de la disolución de tiol a 10 mg de KLH activada con maleimida (n.° de catálogo de Sigma-Aldrich 072M4796) y se invirtió la reacción durante 18 horas a 4 °C.
6. Se colocó el conjugado en un casete de diálisis de 3 ml con un corte de 10 MW y se dializó frente a PBS (4 l) a 4 °C durante 48 horas.
7. Se determinó la eficiencia de acoplamiento mediante la prueba de Ellman según métodos conocidos en la técnica usando disolución de tiol en exceso de la etapa 5 anterior: 10 pl de muestra 20 pl de reactivo de Ellman 70 pl de tampón DTNB, luego se leyó a 412 nm.
Ejemplo 14: Método para generar anticuerpos policlonales anti-BAIB
El protocolo de inmunización para generar los anticuerpos policlonales anti-BAIB puede llevarse a cabo según el siguiente protocolo, que es bien conocido por los expertos en la técnica. Los conejos se inmunizan con, por ejemplo, uno de los inmunógenos de los ejemplos 8-12 anteriores, u otro antígeno específico para BAIB. En cada caso, las inmunizaciones a modo de ejemplo se realizan inyectando 0,5 mg del inmunógeno en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) mezclada con 1 ml de adyuvante completo de Freund. Cada animal puede recibir 20 30 inyecciones intradérmicas en su lomo afeitado. A cada animal puede administrársele un refuerzo de 0,25 mg de inmunógeno en 1 ml de PBS mezclada con un mismo volumen de adyuvante incompleto de Freund en las patas traseras. Las inyecciones de refuerzo pueden administrarse cada mes después de la inyección primaria. Pueden extraerse muestras de prueba de 5 ml de sangre de cada conejo 7-10 días después de cada refuerzo. Pueden extraerse muestras de producción de 40 ml de cada conejo después de la tercera inyección de refuerzo, cuando el título de antisuero fue mayor de aproximadamente 1:2000. El título de antisuero es la dilución de antisuero que genera la curva de calibración más pronunciada para el ensayo.
Ejemplo 15: Preparación de anticuerpos monoclonales anti-BAIB
Los métodos para producir anticuerpos monoclonales se encuentran dentro de la experiencia en la técnica. En realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido contra el conjugado glutaraldehído-BAIB, el conjugado polilisina-BAIB, el conjugado BAIB (extremo amino)-BSA, el conjugado de BAIB (extremo carboxilo)-BSA, el conjugado BAIB (extremo amino)-KLH, o el conjugado de BAIB (extremo carboxilo)-KLH. Los anticuerpos pueden purificarse y caracterizarse usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Ejemplo 16: Preparación de antisueros anti-BAIB de conejo
La especificidad de los anticuerpos anti-BAIB se mostró con un ensayo de unión usando un suero de conejo anti-BAIB producido contra una mezcla de conjugado BAIB (extremo amino)-KLH y conjugado BAIB (extremo carboxilo)-KLH. Se pesó BAIB y se disolvió en PBS, pH 7,4, hasta 1,0 mg/ml y se diluyó adicionalmente hasta 50 pg/ml. Se incubó una suspensión de proteína A (rPA) se incubó con antisuero de conejo anti-BAIB para capturar IgG. En el control negativo, se incubó la suspensión de proteína A (rPA) con PBS. Después de las incubaciones, se añadieron seiscientos (600) pl de la suspensión de rPA a columnas Micro Spin y se centrifugaron para retirar el líquido. Se añadieron trescientos (300) pl de BAIB 50 pg/ml a las columnas y se incubaron durante 100 minutos a 25 °C. Luego se centrifugaron las columnas y se recogió el flujo continuo. Luego se preparó el flujo continuo para el análisis mediante CL-EM de la siguiente manera. Se mezclaron cincuenta (50) pl de cada muestra de flujo continuo con 50 pl de patrón interno de BAIB en una placa de 96 pocillos, luego se centrifugaron a 3.000 x g durante 20 minutos. Luego se añadieron 300 pl de acetonitrilo a cada muestra en la placa, y luego se sonicó la placa durante 20 minutos. Luego se centrifugó la placa a 3.000 x g durante 20 minutos. Luego se filtraron 300 pl del sobrenadante mediante carga en un filtro de placa de 96 pocillos (0,45 pm) y se centrifugaron a 3.000 x g durante 20 minutos. Después de la filtración, luego se secó la placa durante 4 horas en un dispositivo SpeedVac. Después del secado, se añadieron 50 pl de una disolución de acetonitrilo al 20% a cada muestra. Luego se ejecutaron las muestras en CL-EM. Tal como se muestra a continuación en la tabla 7, la columna de anticuerpo anti-BAIB:rProtA unió un 6,6 % más de BAIB que la columna de rProtA de control.
Tabla 7
Cualquier valor numérico expuesto en el presente documento incluye todos los valores desde el valor más bajo hasta el valor más alto en incrementos de una unidad siempre que exista una separación de al menos dos unidades entre cualquier valor más bajo y cualquier valor más alto. Como un ejemplo, si se establece que la concentración de un componente o valor de una variable de procedimiento tal como, por ejemplo, el tamaño, el tamaño de ángulo, la presión, el tiempo, y similares, es de, por ejemplo, desde 1 hasta 90, específicamente desde 20 hasta 80, más específicamente desde 30 hasta 70, se pretende que los valores tales como de 15 a 85, de 22 a 68, de 43 a 51, de 30 a 32, etc., sean enumerados expresamente en esta memoria descriptiva. Para valores que son menores de uno, se considera que una unidad es 0,0001, 0,001, 0,01 ó 0,1, según sea apropiado. Estos son sólo ejemplos de lo que se pretende específicamente y debe considerarse que todas las posibles combinaciones de valores numéricos entre el valor más bajo y el valor más alto enumerados se establecen expresamente en esta solicitud de una manera similar.

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    i.Métodoin vitropara determinar si un animal canino o felino está padeciendo una enfermedad renal como resultado de daño estructural o glomerulonefritis, comprendiendo el método medir ácido p-aminoisobutírico (BAIB) en una muestra de orina o una muestra de sangre del animal y determinar la enfermedad renal basándose en la concentración de BAIB en la muestra, que comprende además comparar la concentración de BAIB en la muestra con una concentración de referencia relacionada con la concentración de BAIB en muestras de animales sanos,
    en donde la medición comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-BAIB y determinar la unión o la cantidad de unión entre el anticuerpo y BAIB en la muestra,
    en donde, además, el anticuerpo anti-BAIB se produce contra un conjugado que comprende BAIB y una proteína portadora, BAIB y polilisina, o BAIB y glutaraldehído, y en donde el daño estructural es el resultado de inflamación, fibrosis, herida, cálculos renales, o infiltración por cáncer.
  2. 2. Métodoin vitropara diagnosticar una enfermedad renal que es el resultado de daño estructural o glomerulonefritis en un sujeto animal canino o felino, comprendiendo el método:
    poner en contacto una muestra de orina o sangre obtenida del sujeto con un anticuerpo anti-BAIB y determinar la unión o la cantidad de unión entre el anticuerpo y BAIB en la muestra, en donde el anticuerpo se produce contra un conjugado que comprende BAIB y una proteína portadora, BAIB y polilisina, o BAIB y glutaraldehído;
    medir la concentración de BAIB en la muestra; comparar el nivel de BAIB con una concentración de referencia de BAIB en sujetos sanos;
    y
    diagnosticar un trastorno renal que es el resultado de daño estructural o glomerulonefritis donde el valor de BAIB en la muestra está por encima de la concentración de referencia y en donde el daño estructural es el resultado de inflamación, fibrosis, herida, cálculos renales, o infiltración por cáncer.
  3. 3. Métodoin vitropara determinar si un sujeto animal canino o felino está padeciendo una enfermedad renal debido a daño estructural o glomerulonefritis, comprendiendo el método:
    medir la concentración de BAIB y dimetilarginina simétrica (SDMA) en una muestra de orina o sangre obtenida del sujeto;
    en donde la medición comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-BAIB producido contra un conjugado que comprende BAIB y una proteína portadora, BAIB y polilisina, o BAIB y glutaraldehído, y
    determinar la unión o la cantidad de unión entre el anticuerpo anti-BAIB y BAIB en la muestra; y determinar la enfermedad renal cuando la razón de la concentración de BAIB [BAIB] con respecto a la concentración de SDMA [SDMA] es mayor de 0,15 o cuando la razón de [SDMA] con respecto a [BAIB] es menor de 7, y en donde el daño estructural es el resultado de inflamación, fibrosis, herida, cálculos renales, o infiltración por cáncer.
  4. 4. Métodoin vitropara diagnosticar un trastorno renal que es una pérdida de función renal debido a daño estructural en un sujeto animal canino o felino, comprendiendo el método: medir la concentración de uno o más de BAIB y SDMA en una muestra de orina o sangre obtenida del sujeto; en donde la medición comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-BAIB producido contra un conjugado de BAIB y una proteína portadora, BAIB y polilisina, o BAIB y glutaraldehído, y
    determinar la unión o la cantidad de unión entre el anticuerpo anti-BAIB y BAIB en la muestra; comparar el nivel BAIB y SDMA con concentraciones de referencia de BAIB y SDMA en sujetos sanos; diagnosticar la pérdida de función renal cuando la concentración de SDMA en la muestra está por encima de la concentración de referencia de SDMA, y
    diagnosticar que la pérdida de función renal es el resultado de daño estructural cuando la concentración de BAIB en la muestra está por encima de la concentración de referencia de BAIB y en donde el daño estructural es el resultado de inflamación, fibrosis, herida, cálculos renales, o infiltración por cáncer.
  5. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la concentración de referencia refleja el 95° percentil de la concentración de BAIB en animales sanos.
  6. 6. Método según la reivindicación 5, en donde el animal es un felino y la concentración de referencia para BAIB es de 2,0 pg/dl, o en donde el animal es un canino y la concentración de referencia para BAIB es de 1,2 pg/dl, y/o en donde la concentración de referencia para SDMA es de 14 pg/dl.
  7. 7. Método según la reivindicación 1, en donde la proteína portadora es preferiblemente una de KLH y BSA. 8. Métodoin vitropara determinar la presencia o cantidad de BAIB en una muestra, comprendiendo el método poner en contacto un anticuerpo producido contra un conjugado de BAIB con la muestra y determinar la unión o la cantidad de unión entre el anticuerpo y BAIB en la muestra, que comprende además poner en contacto la muestra y el anticuerpo con un conjugado que comprende BAIB y un marcador detectable, en donde la muestra es una muestra de orina o una muestra de sangre de un animal canino o felino que padece una enfermedad renal debido a daño estructural o glomerulonefritis,
  8. en donde, además, el anticuerpo se produce contra un conjugado de BAIB y una proteína portadora, BAIB y polilisina, o BAIB y glutaraldehído, y en donde el daño estructural es el resultado de inflamación, fibrosis, herida, cálculos renales, o infiltración por cáncer.
  9. 9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la muestra de sangre es suero o plasma.
  10. 10. Método según la reivindicación 5, en donde al menos una de la concentración de referencia de BAIB y la concentración de referencia de SDMA, si se mide, refleja el 95° percentil de la concentración de BAIB y SDMA en muestras de animales sanos.
  11. 11. Método según la reivindicación 8, en donde el anticuerpo comprende un marcador.
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