ES3041276T3 - Methods for analyzing nucleic acid molecules - Google Patents

Methods for analyzing nucleic acid molecules

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ES3041276T3 ES20885631T ES20885631T ES3041276T3 ES 3041276 T3 ES3041276 T3 ES 3041276T3 ES 20885631 T ES20885631 T ES 20885631T ES 20885631 T ES20885631 T ES 20885631T ES 3041276 T3 ES3041276 T3 ES 3041276T3
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extracellular nucleic
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Maximilian Diehn
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Leland Stanford Junior University
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Abstract

Se describen los procesos y materiales para la detección de cáncer mediante biopsia. En algunos casos, se pueden secuenciar los ácidos nucleicos libres de células, y el resultado de la secuenciación se puede utilizar para detectar secuencias derivadas de una neoplasia. La detección de variantes somáticas que ocurren en fase puede indicar la presencia de cáncer en una exploración diagnóstica, lo que permite realizar una intervención clínica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de análisis de moléculas de ácidos nucleicos
Referencia cruzada
Antecedentes
Los análisis de sangre no invasivos que pueden detectar alteraciones somáticas (p. ej., ácidos nucleicos mutados) basados en el análisis de ácidos nucleicos extracelulares (p. ej., ácido desoxirribonucleico extracelular [ADNec] y ácido ribonucleico extracelular [ARNec]) son candidatos atractivos para aplicaciones de cribado del cáncer debido a la relativa facilidad de obtención de muestras biológicas (p. ej., líquidos biológicos). Los ácidos nucleicos tumorales circulantes (p. ej., ADNtc o ARNtc; es decir, ácidos nucleicos procedentes de células cancerosas) pueden ser biomarcadores sensibles y específicos en numerosos subtipos de cáncer. Sin embargo, los métodos actuales de detección de la enfermedad mínima residual (EMR) a partir del ADNtc pueden verse limitados por uno o más factores, tales como bajas cantidades de ADN de entrada y altas tasas de error de fondo.
Enfoques recientes han mejorado el rendimiento de EMR de ADNtc mediante el rastreo de múltiples mutaciones somáticas con secuenciación con supresión de errores, dando lugar a límites de detección tan bajos como 4 partes en 100000 a partir de un aporte limitado de ADNec. La detección de la enfermedad residual durante o después del tratamiento es una herramienta poderosa, representando la EMR detectable un signo pronóstico adverso incluso durante la remisión radiográfica. Sin embargo, los límites actuales de detección pueden ser insuficientes para detectar universalmente la enfermedad residual en pacientes destinados a la recaída o avance de la enfermedad. Esta "pérdida de detección" se ejemplifica en el linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), donde la detección de ADNtc tras dos ciclos de terapia con intención curativa es un fuerte marcador pronóstico. A pesar de esto, casi un tercio de los pacientes que experimentan una progresión de la enfermedad no tienen ADNtc detectable en este punto de referencia, que representan "falsos negativos". Se han observado tasas similares de falsos negativos en el cáncer de colon y el cáncer de mama.
El documento US 2018/265928 A1 (SCHNALL-LEVIN MICHAEL [US]ET AL.) 20 de septiembre de 2018, desvela un método informático para el análisis de secuencias de ADNec para variantes en fase. Las variantes en fase detectadas están asociadas al cáncer, tal como cáncer de pulmón, por ejemplo, y se usan para diagnosticar.
Sumario
La presente divulgación proporciona métodos y sistemas para analizar ácidos nucleicos extracelulares (p. ej., ADNec, ARNec) de un sujeto, en donde solo se reivindican los métodos. Los métodos y sistemas de la presente divulgación pueden utilizar los resultados de la secuenciación obtenidos del sujeto para detectar ácidos nucleicos procedentes del cáncer (p. ej., ADNtc, ARNtc) para, p. ej., el diagnóstico de enfermedades, el seguimiento de enfermedades o la determinación de tratamientos para el sujeto. Los métodos y sistemas de la presente divulgación pueden presentar una mayor sensibilidad, especificidad y/o fiabilidad de la detección de ácidos nucleicos procedentes del cáncer. La invención reivindicada proporciona un método como se define en las reivindicaciones adjuntas 1 a 15. Cualquier pasaje o referencia en la presente divulgación que se refiera a métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía se hace únicamente con fines ilustrativos y para una mejor comprensión de la invención reivindicada, pero estos métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía no forman parte de la invención reivindicada.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, al menos aproximadamente el 10 % de las moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 100 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método (que no forma parte de la invención reivindicada; solo con fines ilustrativos y para una mejor comprensión de la invención reivindicada) que comprende: (a) obtener, mediante un sistema informático, datos de secuenciación derivados de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtienen o derivan de un sujeto; (b) procesar, mediante el sistema informático, los datos de secuenciación para identificar una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares, en donde cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende una pluralidad de variantes en fase relativas a una secuencia genómica de referencia que están separadas por al menos un nucleótido; y (c) analizar, mediante el sistema informático, la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas para determinar un estado del sujeto.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método (que no forma parte de la invención reivindicada; solo con fines ilustrativos y para una mejor comprensión de la invención reivindicada) que comprende: (a) obtener datos de secuenciación derivados de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtienen o derivan de un sujeto; (b) procesar los datos de secuenciación para identificar una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares con un límite de detección de menos de aproximadamente 1 de cada 50000 observaciones de los datos de secuenciación; y (c) analizar la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas para determinar un estado del sujeto.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el límite de detección de la etapa de identificación es inferior a aproximadamente 1 entre 100000, inferior a aproximadamente 1 entre 500000, inferior a aproximadamente 1 entre 1000000, inferior a aproximadamente 1 entre 1500000 o inferior a aproximadamente 1 entre 2000000 de observaciones de los datos de secuenciación.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende una pluralidad de variantes en fase en relación con una secuencia genómica de referencia. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, una primera variante en fase de la pluralidad de variantes en fase y una segunda variante en fase de la pluralidad de variantes en fase están separadas por al menos un nucleótido.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, los procesos (a) a (c) se realizan mediante un sistema informático.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, los datos de secuenciación se generan a partir de la amplificación de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, los datos de secuenciación se generan a partir de la reacción en cadena de la polimerasa. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, los datos de secuenciación se generan a partir de la secuenciación de amplicones.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, los datos de secuenciación se generan a partir de la secuenciación de nueva generación (SNG). Como alternativa, en algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, los datos de secuenciación se generan a partir de SNG no basada en hibridación.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, los datos de secuenciación se generan sin usar código de barras molecular de al menos una parte de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, los datos de secuenciación se obtienen sin usar código de barras de la muestra de al menos una parte de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, los datos de secuenciación se obtienen sin eliminar o suprimir por ordenador (i) el error de fondo o (ii) el error de secuenciación. En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar una afección de un sujeto, comprendiendo el método (que no forma parte de la invención reivindicada; solo con fines ilustrativos y para una mejor comprensión de la invención reivindicada): (a) identificar al sujeto para el tratamiento de la afección, en donde se ha determinado que el sujeto tiene la afección basándose en la identificación de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtiene o deriva del sujeto, en donde cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas comprende una pluralidad de variantes en fase con respecto a una secuencia genómica de referencia que están separadas por al menos un nucleótido, y en donde una presencia de la pluralidad de variantes en fase es indicativa de la afección del sujeto; y (b) someter al sujeto al tratamiento en función de la identificación de (a).
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para supervisar la evolución de una afección de un sujeto, comprendiendo el método (que no forma parte de la invención reivindicada; solo con fines ilustrativos y para una mejor comprensión de la invención reivindicada): (a) determinar un primer estado de la afección del sujeto basado en la identificación de un primer conjunto de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de una primera pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtiene o deriva del sujeto; (b) determinar un segundo estado de la afección del sujeto basándose en la identificación de un segundo conjunto de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares a partir de una segunda pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtiene o deriva del sujeto, en donde la segunda pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares se obtienen del sujeto después de la obtención de la primera pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares del sujeto; y (c) determinar la evolución de la afección basándose en el primer estado de la afección y el segundo estado de la afección, en donde cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende una pluralidad de variantes en fase relativas a una secuencia genómica de referencia que están separadas por al menos un nucleótido. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la evolución de la afección es un empeoramiento de la afección.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la evolución de la afección es, al menos, una remisión parcial de la afección.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la presencia de la pluralidad de variantes en fase es indicativa del primer estado o del segundo estado de la afección del sujeto.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la segunda pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares se obtiene del sujeto al menos aproximadamente 1 semana, al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 3 semanas, al menos aproximadamente 4 semanas, al menos aproximadamente 2 meses o al menos aproximadamente 3 meses después de obtener la primera pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares del sujeto.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el sujeto se somete a un tratamiento para la afección (i) antes de obtener la segunda pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares del sujeto y (ii) después de obtener la primera pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares del sujeto.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la evolución de la afección es indicativa de una enfermedad residual mínima de la afección del sujeto. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la evolución de la afección es indicativa de la carga tumoral o de cáncer del sujeto.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares se capturan de entre la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares con un conjunto de sondas de ácido nucleico, en donde el conjunto de sondas de ácido nucleico está configurado para hibridar con al menos una parte de moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprende uno o más regiones genómicas asociadas con la afección.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método (que no forma parte de la invención reivindicada; solo con fines ilustrativos y para una mejor comprensión de la invención reivindicada) que comprende: (a) proporcionar una mezcla que comprende (1) un conjunto de sondas de ácido nucleico y (2) una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtiene o deriva de un sujeto, en donde una sonda individual de ácido nucleico del conjunto de sondas de ácido nucleico está diseñada para hibridar con al menos una parte de una molécula diana de ácido nucleico extracelular que comprende una pluralidad de variantes en fase con respecto a una secuencia genómica de referencia que están separadas por al menos un nucleótido, y en donde la sonda individual de ácido nucleico comprende un agente indicador activable, seleccionándose la activación del agente indicador activable del grupo que consiste en: (i) hibridación de la sonda de ácido nucleico individual con la pluralidad de variantes en fase y (ii) deshibridación de al menos una parte de la sonda de ácido nucleico individual que se ha hibridado con la pluralidad de variantes en fase; (b) detectar el agente indicador activable que se activa, para identificar una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares, en donde cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende la pluralidad de variantes en fase; y (c) analizar la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas para determinar un estado del sujeto.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método (que no forma parte de la invención reivindicada; solo con fines ilustrativos y para una mejor comprensión de la invención reivindicada) que comprende: (a) proporcionar una mezcla que comprende (1) un conjunto de sondas de ácido nucleico y (2) una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtiene o deriva de un sujeto, en donde una sonda individual de ácido nucleico del conjunto de sondas de ácido nucleico está diseñada para hibridar con al menos una parte de una molécula diana de ácido nucleico extracelular que comprende una pluralidad de variantes en fase con respecto a una secuencia genómica de referencia, y en donde la sonda individual de ácido nucleico comprende un agente indicador activable, seleccionándose la activación del agente indicador activable del grupo que consiste en: (i) hibridación de la sonda de ácido nucleico individual con la pluralidad de variantes en fase y (ii) deshibridación de al menos una parte de la sonda de ácido nucleico individual que se ha hibridado con la pluralidad de variantes en fase; (b) detectar el agente indicador activable que se activa, para identificar una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares, en donde cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende la pluralidad de variantes en fase, en donde un límite de detección de la etapa de identificación es inferior a aproximadamente 1 entre 50000 moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares; y (c) analizar la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas para determinar un estado del sujeto.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el límite de detección de la etapa de identificación es inferior a aproximadamente 1 entre 100000, inferior a aproximadamente 1 entre 500000, inferior a aproximadamente 1 entre 1000000, inferior a aproximadamente 1 entre 1500000 o inferior a aproximadamente 1 entre 2000000 de moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, una primera variante en fase de la pluralidad de variantes en fase y una segunda variante en fase de la pluralidad de variantes en fase están separadas por al menos un nucleótido.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el agente indicador activable se activa tras la hibridación de la sonda de ácido nucleico individual con la pluralidad de variantes en fase. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el agente indicador activable se activa tras la deshibridación de al menos una parte de la sonda de ácido nucleico individual que se ha hibridado con la pluralidad de variantes en fase.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el método comprende además mezclar (1) el conjunto de sondas de ácido nucleico y (2) la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el agente indicador activable es un fluoróforo.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el análisis de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas comprende analizar (i) la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas y (ii) otras moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que no comprenden la pluralidad de variantes en fase como variables diferentes. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el análisis de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas no se basa en otras moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que no comprenden la pluralidad de variantes en fase.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, un número de la pluralidad de variantes en fase de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas es indicativo de la afección del sujeto. En algunas realizaciones, una relación entre (i) el número de la pluralidad de variantes en fase de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares y (ii) un número de variantes de un solo nucleótido (SNV) de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares es indicativa de la afección del sujeto.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, una frecuencia de la pluralidad de variantes en fase de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas es indicativa de la afección del sujeto. En algunas realizaciones, la frecuencia es indicativa de una célula enferma asociada a la afección. En algunas realizaciones, la enfermedad es un linfoma difuso de linfocitos B grandes, y en donde la frecuencia es indicativa de si la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares provienen de linfocitos B de centro germinativo (GCB) o de linfocitos B activados (ABC).
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el origen genómico de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas es indicativo de la afección del sujeto.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, las variantes en fase primera y segunda están separadas por al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 nucleótidos. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, las variantes en fase primera y segunda están separadas por como máximo aproximadamente 180, como máximo aproximadamente 170, como máximo aproximadamente 160, como máximo aproximadamente 150 o como máximo aproximadamente 140 nucleótidos.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 % o al aproximadamente el 50 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden una pluralidad de variantes en fase comprende una variante de un solo nucleótido (SNV) que está al menos a 2 nucleótidos de distancia de una SNV adyacente.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la pluralidad de variantes en fase comprende al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20 o al menos 25 variantes en fase dentro de la misma molécula de ácido nucleico extracelular.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas comprenden al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 50, al menos 100, al menos 500 o al menos 1000 moléculas de ácido nucleico extracelulares.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la secuencia genómica de referencia se obtiene de una cohorte de referencia. En algunas realizaciones, la secuencia genómica de referencia comprende una secuencia consenso de la cohorte de referencia. En algunas realizaciones, la secuencia genómica de referencia comprende al menos una parte del genoma humano hg19, genoma hg18, genoma hg17, genoma hg16 o genoma hg38.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la secuencia genómica de referencia se obtiene de una muestra del sujeto.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la muestra es una muestra sana. En algunas realizaciones, la muestra comprende una célula sana. En algunas realizaciones, la célula sana comprende un leucocito sano.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la muestra es una muestra enferma. En algunas realizaciones, la muestra enferma comprende una célula enferma. En algunas realizaciones, la célula enferma comprende una célula tumoral. En algunas realizaciones, la muestra enferma comprende un tumor sólido.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico se diseña basándose en la pluralidad de variantes en fase que se identifican comparando (i) datos de secuenciación de un tumor sólido, linfoma o neoplasia hemática y (ii) datos de secuenciación de una célula sana del sujeto o de una cohorte sana. En algunas realizaciones, la célula sana es del sujeto. En algunas realizaciones, la célula sana es de la cohorte sana.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico está diseñado para hibridar con al menos una parte de las secuencias de locus genómicos asociados con la afección. En algunas realizaciones, se sabe que los locus genómicos asociados a la afección presentan hipermutación somática anómala cuando el sujeto tiene la afección.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico está diseñado para hibridar con al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 100 % de (i) las regiones genómicas identificadas en la tabla 1, (ii) las regiones genómicas identificadas en la tabla 3 o (iii) las regiones genómicas que se ha identificado que tienen una pluralidad de variantes en fase en la tabla 3.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, cada sonda de ácido nucleico del conjunto de sondas de ácido nucleico tiene al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia o aproximadamente un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de sonda seleccionada de la tabla 6.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico comprende al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 % o al menos aproximadamente el 90 % de las secuencias de sonda de la tabla 6.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el método comprende además determinar que el sujeto tiene la afección o determinar un grado o estado de la afección del sujeto, basándose en la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas que comprenden la pluralidad de variantes en fase. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar que la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares proceden de una muestra asociada a la afección, basándose en la realización de un análisis de modelo estadístico de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas. En algunas realizaciones, el análisis del modelo estadístico comprende un análisis estadístico de Montecarlo.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el método comprende además el seguimiento de la evolución de la afección del sujeto basándose en la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el método comprende además la realización de un procedimiento diferente para confirmar la afección del sujeto. En algunas realizaciones, el procedimiento diferente comprende un análisis de sangre, una prueba genética, captura de imágenes médicas, exploración física o biopsia tisular.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el método comprende además determinar un tratamiento para la afección del sujeto basándose en la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el sujeto se ha sometido a un tratamiento para la afección antes de (a).
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el tratamiento comprende quimioterapia, radioterapia, quimiorradioterapia, inmunoterapia, terapia celular adoptiva, hormonoterapia, terapia farmacológica dirigida, cirugía, trasplante, transfusión o vigilancia médica.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende una pluralidad de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) extracelulares.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la afección comprende una enfermedad.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares procede de una muestra corporal del sujeto. En algunas realizaciones, la muestra corporal comprende plasma, suero, sangre, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, saliva, orina o heces. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el sujeto es un mamífero. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el sujeto es un ser humano.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la enfermedad comprende una neoplasia, cáncer o tumor. En algunas realizaciones, la afección comprende un tumor sólido. En algunas realizaciones, la afección comprende un linfoma. En algunas realizaciones, la afección comprende un linfoma de linfocitos B. En algunas realizaciones, la afección comprende un subtipo de linfoma de linfocitos B seleccionado del grupo que comprende el linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, linfoma de Burkitt y leucemia linfocítica crónica de linfocitos B.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la pluralidad de variantes en fase se ha identificado anteriormente como derivadas de tumores a partir de la secuenciación de una muestra tumoral previa o de una muestra de ácido nucleico extracelular.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición (que no forma parte de la invención reivindicada; solo con fines ilustrativos y para una mejor comprensión de la invención reivindicada) que comprende un conjunto de cebos que comprende un conjunto de sondas de ácido nucleico diseñadas para capturar moléculas de ADN extracelulares derivadas de, al menos, aproximadamente el 5 % de las regiones genómicas establecidas en (i) las regiones genómicas identificadas en la tabla 1, (ii) las regiones genómicas identificadas en la tabla 3 o (iii) las regiones genómicas que se ha identificado que tienen una pluralidad de variantes en fase en la tabla 3.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico está diseñado para extraer moléculas de ADN extracelular procedentes de al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 100 % de las regiones genómicas establecidas en (i) las regiones genómicas identificadas en la tabla 1, (ii) las regiones genómicas identificadas en la tabla 3 o (iii) las regiones genómicas que se ha identificado que tienen una pluralidad de variantes en fase en la tabla 3.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico está diseñado para capturar una o más moléculas de ADN extracelular procedentes de como máximo aproximadamente el 10 %, como máximo aproximadamente el 20 %, como máximo aproximadamente el 30 %, como máximo aproximadamente el 40 %, como máximo aproximadamente el 50 %, como máximo aproximadamente el 60 %, como máximo aproximadamente el 70 %, como máximo aproximadamente el 80 %, como máximo aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 100 % de las regiones genómicas establecidas en (i) las regiones genómicas identificadas en la tabla 1, (ii) las regiones genómicas identificadas en la tabla 3 o (iii) las regiones genómicas que se ha identificado que tienen una pluralidad de variantes en fase en la tabla 3.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, el conjunto de cebos comprende como máximo 5, como máximo 10, como máximo 50, como máximo 100, como máximo 500, como máximo 1000 o como máximo 2000 sondas de ácido nucleico.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, una sonda de ácido nucleico individual del conjunto de sondas de ácido nucleico comprende un marcador de extracción.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, el marcador de extracción comprende un código de barras de ácido nucleico.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, el marcador de extracción comprende biotina.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, cada una de las moléculas de ADN extracelular tiene entre aproximadamente 100 nucleótidos y aproximadamente 180 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, las regiones genómicas están asociadas a una afección.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, las regiones genómicas presentan hipermutación somática anómala cuando un sujeto tiene la afección.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, la afección comprende un linfoma de linfocitos B. En algunas realizaciones, la afección comprende un subtipo de linfoma de linfocitos B seleccionado del grupo que comprende el linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, linfoma de Burkitt y leucemia linfocítica crónica de linfocitos B.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, la composición comprende además una pluralidad de moléculas de ADN extracelular obtenidas o derivadas de un sujeto.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para realizar un procedimiento clínico en un individuo, comprendiendo el método (que no forma parte de la invención reivindicada; solo con fines ilustrativos y para una mejor comprensión de la invención reivindicada): (a) obtener o haber obtenido un resultado de secuenciación dirigida de una colección de moléculas de ácido nucleico extracelulares, en donde la colección de moléculas de ácido nucleico extracelulares proviene de una biopsia líquida o de desecho de un individuo, y en donde la secuenciación dirigida se realiza utilizando sondas de ácido nucleico para extraer secuencias de locus genómicos conocidos por experimentar hipermutación somática anómala en un cáncer de linfocitos B; (b) identificar o haber identificado una pluralidad de variantes en fase dentro del resultado de la secuenciación de ácido nucleico extracelular; (c) determinar o haber determinado, utilizando un modelo estadístico y las variantes en fases identificadas, que el resultado de la secuenciación del ácido nucleico extracelular contiene nucleótidos procedentes de una neoplasia; y (d) realizar un procedimiento clínico en el individuo para confirmar la presencia del cáncer de linfocitos B, basándose en la determinación de que el resultado de la secuenciación del ácido nucleico extracelular contiene secuencias de ácido nucleico probablemente procedentes del cáncer de linfocitos B.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, la biopsia es de sangre, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, orina o heces.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, los locus genómicos se seleccionan de (i) las regiones genómicas identificadas en la tabla 1, (ii) las regiones genómicas identificadas en la tabla 3 o (iii) las regiones genómicas que se ha identificado que tienen una pluralidad de variantes en fase en la tabla 3.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, las secuencias de las sondas de ácido nucleico se seleccionan de la tabla 6.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, el procedimiento clínico es un análisis de sangre, captura de imágenes médicas o una exploración física.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar a un individuo de un cáncer de linfocitos B, comprendiendo el método (que no forma parte de la invención reivindicada; solo con fines ilustrativos y para una mejor comprensión de la invención reivindicada): (a) obtener o haber obtenido un resultado de secuenciación dirigida de una colección de moléculas de ácido nucleico extracelulares, en donde la colección de moléculas de ácido nucleico extracelulares proviene de una biopsia líquida o de desecho de un individuo, y en donde la secuenciación dirigida se realiza utilizando sondas de ácido nucleico para extraer secuencias de locus genómicos conocidos por experimentar hipermutación somática anómala en un cáncer de linfocitos B; (b) identificar o haber identificado una pluralidad de variantes en fase dentro del resultado de la secuenciación de ácido nucleico extracelular; (c) determinar o haber determinado, utilizando un modelo estadístico y las variantes en fases identificadas, que el resultado de la secuenciación del ácido nucleico extracelular contiene nucleótidos procedentes de una neoplasia; y (d) tratar al individuo para reducir el cáncer de linfocitos B, basándose en la determinación de que el resultado de la secuenciación del ácido nucleico extracelular contiene secuencias de ácido nucleico procedentes del cáncer de linfocitos B.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, la biopsia es de sangre, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, orina o heces.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, los locus genómicos se seleccionan de (i) las regiones genómicas identificadas en la tabla 1, (ii) las regiones genómicas identificadas en la tabla 3 o (iii) las regiones genómicas que se ha identificado que tienen una pluralidad de variantes en fase en la tabla 3.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, las secuencias de las sondas de ácido nucleico se seleccionan de la tabla 6.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, el tratamiento es quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, hormonoterapia, terapia farmacológica dirigida o vigilancia médica. En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para detectar la enfermedad residual mínima cancerosa en un individuo y para tratar al individuo de un cáncer, comprendiendo el método (que no forma parte de la invención reivindicada; solo con fines ilustrativos y para una mejor comprensión de la invención reivindicada): (a) obtener o haber obtenido un resultado de secuenciación dirigida de una colección de moléculas de ácido nucleico extracelulares, en donde la colección de moléculas de ácido nucleico extracelulares proceden de una biopsia líquida o de residuos de un individuo, en donde la biopsia líquida o de residuos se obtiene después de una serie de tratamientos para detectar una enfermedad residual mínima, y en donde la secuenciación de direccionamiento se realiza utilizando sondas de ácido nucleico para extraer secuencias de locus genómicos que se ha determinado que contienen una pluralidad de variantes en fase, según determine un resultado de secuenciación previo en una biopsia anterior derivada del cáncer; (b) identificar o que tiene identificado al menos un conjunto de la pluralidad de variantes en fase dentro del resultado de la secuenciación de ácido nucleico extracelular; y (c) tratar al individuo para reducir el cáncer, basándose en la determinación de que el resultado de la secuenciación del ácido nucleico extracelular contiene secuencias de ácido nucleico procedentes del cáncer.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, la biopsia líquida o de residuos es una de sangre, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, orina o heces.
En algunas realizaciones de cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, el tratamiento es quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, hormonoterapia, terapia farmacológica dirigida o vigilancia médica. En un aspecto, la presente divulgación proporciona un producto de programa informático (que no forma parte de la invención reivindicada; solo con fines ilustrativos y para una mejor comprensión de la invención reivindicada) que comprende un medio no transitorio legible por ordenador que tiene un código ejecutable por ordenador codificado en el mismo, el código ejecutable por ordenador adaptado para que se ejecute para implementar uno cualquiera de los métodos desvelado en el presente documento.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un sistema (que no forma parte de la invención reivindicada; solo con fines ilustrativos y para una mejor comprensión de la invención reivindicada) que comprende uno o más procesadores informáticos y una memoria informática acoplada al mismo, en donde la memoria informática comprende código ejecutable por máquina que, tras su ejecución por el o los procesadores informáticos, implementa uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento.
Los aspectos y ventajas de la presente divulgación resultarán fácilmente evidentes para los expertos en esta técnica a partir de la siguiente descripción detallada, en donde solo se muestran y describen realizaciones ilustrativas de la presente divulgación. Como se comprenderá, la presente divulgación tiene capacidad para otras realizaciones diferentes, y sus varios detalles son susceptibles de modificaciones en diversos aspectos obvios, todo ello sin desviarse de la divulgación. Por consiguiente, los dibujos y la descripción han de considerarse ilustrativos por naturaleza y no restrictivos.
Breve descripción de los dibujos
Diversas características de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos (también "figura" y "FIG." en el presente documento), de los que:
laFIG.1ilustra el descubrimiento de variantes en fase y sus firmas mutacionales mediante el análisis de datos de secuenciación del genoma completo. laFIG.1A.es una viñeta que representa la diferencia entre la detección de una variante de un solo nucleótido (SNV) (arriba) y múltiples variantes "en fase" (VF; abajo) en moléculas individuales de ADN extracelular. En teoría, la detección de una VF es un evento más específico que la detección de una SNV aislada. LaFIG.1B.es un gráfico de dispersión que muestra la distribución del número de FV a partir de datos de SGC para 24 histologías diferentes de cáncer, normalizados con respecto al número total de SNV. Las barras muestran el valor de la mediana y el intervalo intercuartílico. (LF-LNH, linfoma folicular; LDLBG-LNH, linfoma difuso de linfocitos B grandes; LNH-Burkitt, linfoma de Burkitt; CCE-pulmón, cáncer pulmonar de células escamosas; Adeno-pulmón, adenocarcinoma de pulmón; CCR-riñón, carcinoma de células renales; Osteosarchueso, osteosarcoma; CHC-hígado, carcinoma hepatocelular; Adeno-mama, adenocarcinoma de mama; Adenopanc, adenocarcinoma pancreático; CCE-cabeza, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; Adenoovario, adenocarcinoma de ovario; Adeno-eso, adenocarcinoma de esófago; Adeno-útero, adenocarcinoma de útero; Adeno-estómago, adenocarcinoma de estómago; LLC, leucemia linfocítica crónica; Adeno-colorrect, adenocarcinoma colorrectal; Adeno-prost, adenocarcinoma de próstata; GBM-SNC, glioblastoma multiforme; Endocrino-panc, tumor neuroendocrino pancreático; Adeno-tir, adenocarcinoma de tiroides; PiloAstro-SNC, piloastrocitoma; Medulo-SNC, meduloblastoma). LaFIG. 1C.es un gráfico cromático que demuestra el enriquecimiento en firmas mutacionales de sustitución de una sola base (SBS) para F frente a SNV individuales en múltiples tipos de cáncer. En azul se representan las firmas enriquecidas en VF en histologías específicas; el gris más oscuro representa las firmas sin fase, las SNV individuales están enriquecidas; y el rojo representa las SNV que aparecen de forma aislada. Solo se muestran las firmas que tienen una diferencia significativa entre las VF y las SNV sin fase tras corregir con respecto a múltiples hipótesis; otras firmas son grises. Las firmas asociadas al tabaquismo, AID/AICDA y APOBEC, están indicadas. LaFIG.1D.demuestra diagramas de barras que muestran la distribución de VF que se producen en regiones estereotipadas en todo el genoma en neoplasias linfoides B y adenocarcinoma de pulmón. En este gráfico, el genoma se dividió en grupos de 1000 pb y se calculó la fracción de muestras de una histología determinada con una VF en cada grupo de 1000 pb. Solo se muestran los grupos que tienen al menos una frecuencia de recurrencia del 2 % en cualquier subtipo de cáncer. Los locus genómicos clave también están marcados. LaFIG. 1E.es una comparación de la secuenciación de dúplex con la secuenciación de variantes en fase. Un esquema que compara la secuenciación con supresión de errores mediante secuenciación de dúplex frente a la recuperación de variantes en fase. En la secuenciación de dúplex, se requiere la recuperación de una única SNV observada en ambas hebras de una doble hélice de ADN original (es decir, entrans). Esto requiere la recuperación independiente de dos moléculas mediante secuenciación, ya que las hebras positiva y negativa de la molécula de ADN original pasan por la preparación de la biblioteca y la PCR de forma independiente. Por el contrario, la recuperación de VF requiere que se observen múltiples SNV en la misma cadena de ADN (es decir, encis). Por lo tanto, la recuperación de solo la hebra positiva o negativa (en lugar de ambas) es suficiente para la identificación de las VF.
LaFIG. 2ilustra el diseño, la validación y la aplicación de la secuenciación de enriquecimiento de variantes en fase. LaFIG.2Aes un esquema del diseño para PhasED-Seq. Se agregaron datos de SGC de muestras tumorales de LDLBG(izquierda),y se identificaron áreas de posibles VF recurrentes(centro).A continuación se diseñó un ensayo que captura las regiones genómicas que contienen VF de forma más recurrente(derecha),que dio lugar a un enriquecimiento ~7500x en VF en comparación con SGC. Elpanel superior derechomuestra el número esperado por ordenador de FV por caso por kilobase de tamaño de panel (eje de ordenadas) para tamaños de panel crecientes (eje de abscisas). La línea discontinua muestra las regiones seleccionadas en el panel de PhasED-Seq. Elpanel inferior derechomuestra el número total de VF previstas por caso (eje de ordenadas, evaluado por ordenador a partir de datos de SGC, para tamaños de panel crecientes (eje de ordenadas). El área oscura muestra las regiones seleccionadas en el panel PhasED-Seq. LaFIG.2Bilustra dos paneles que muestran el rendimiento de SNV (izquierda) y VF (derecha) para secuenciar ADN tumoral y de línea germinal coincidente mediante un panel CAPP-Seq de linfoma previamente establecido o PhasED-Seq; los valores se evalúan por ordenador limitando la SGC al espacio diana de interés. Las VF del panel derecho incluyen acontecimientos en fase de dobletes, tripletes y cuadrupletes. LaFIG. 2Cmuestra el rendimiento de SNV (izquierda) y VF (derecha) de la secuenciación experimental de ADN tumoral y/o extracelular de CAPP-Seq frente a PhasED-Seq, similar a laFIG.2B.LaFIG.2Des un diagrama de dispersión que muestra la frecuencia de VF por ubicación genómica (en grupos de 1000 pb) para pacientes con LDLBG, identificados por SGC o identificados por PhasED-Seq. Las VF enIGH, BCL2, MYCyBCL6están resaltadas. LaFIG.2Eilustra gráficos de dispersión que comparan la frecuencia de VF por ubicación genómica (en grupos de 50 pb) para pacientes con diferentes tipos de linfomas. Los círculos coloreados muestran la frecuencia relativa de VF en grupos de 50 pb desde un gen de interés específico; los otros círculos (grises) muestran la frecuencia relativa de VF en intervalos de 50 pb desde el resto del panel de secuenciación PhasED-Seq. LaFIG. 2Filustra diagramas de volcán que resumen la diferencia en la frecuencia relativa de VF en locus genéticos específicos entre tipos de linfoma, incluyendo ABC-LDLBG frente a GCB-LDLBG (gris oscuro, izquierda); LPMB frente a LDLBG (gris oscuro, centro); y LH frente a LDLBG (gris oscuro, derecha). El eje de abscisas muestra el enriquecimiento relativo en FV en un locus específico, mientras que el eje de ordenadas muestra la significación estadística de esta asociación. (Ejemplo 10).
LaFIG.3ilustra el rendimiento técnico de PhasED-Seq para la detección de enfermedades. LaFIG.3Ailustra un gráfico de barras que muestra el rendimiento de la secuenciación de captura híbrida para la recuperación de oligonucleótidos sintéticos de 150 pb de dos locus(MYCyBCL6)con grado creciente de mutación / bases no de referencia. Las barras de error representan el intervalo de confianza del 95 % (n = 3 réplicas de cada afección en muestras distintas). LaFIG. 3Bilustra un gráfico que demuestra la tasa de error de fondo (ejemplo 10)para diferentes tipos de supresión de errores desde 12 muestras de ADN extracelular de control sanas secuenciadas en el panel PhasED-Seq. "PhasED-Seq 2x" o "dobletes" representa la detección de dos mutaciones en fase en la misma molécula de ADN; "PhasED-Seq 3x" o "tripletes" representa la detección de tres mutaciones en fase en la misma molécula de ADN. LaFIG.3Cilustra un diagrama de barras que muestra la profundidad de la recuperación molecular única (p. ej., la profundidad tras la eliminación de duplicados de PCR mediada por código de barras) a partir de datos de secuenciación de 12 muestras de ADN extracelular para diferentes tipos de supresión de errores, incluida la desduplicación de códigos de barras, secuenciación bicatenaria y recuperación de VF de distancia máxima creciente entre SNV en fase. LaFIG.3Dilustra un diagrama de barras que muestra la fracción acumulativa de VF que tiene una distancia máxima entre SNV inferior al número de pares de bases mostrado en el eje de abscisas. LaFIG. 3Eilustra un gráfico que demuestra los resultados de una serie de diluciones limitantes que simula muestras de ADN extracelular que contienen fracciones tumorales específicas de pacientes de 1 x 10<-3>a 0,5 x 10<-6>; en cada dilución se utilizaron muestras de ADNec de 3 pacientes independientes. Los mismos datos de secuenciación se analizaron utilizando diversos métodos de supresión de errores para recuperar las fracciones tumorales esperadas, incluidos iDES, secuenciación bicatenaria y PhasED-Seq (ambas para la recuperación de moléculas dobletes y tripletes). Los puntos y las barras de error representan la media, el mínimo y el máximo en las tres mutaciones tumorales específicas de pacientes consideradas. La diferencia entre las fracciones tumorales observadas y esperadas para la muestra <1:10000 se comparó mediante la prueba de la t para datos emparejados. *,p<0,05, **,p<0,005, ***,p<0,0005. LaFIG. 3Filustra un diagrama que demuestra la señal de fondo para la detección de alelos específicos de tumor en 12 muestras sanas de ADN extracelular no relacionadas, y la muestra sana de ADNec utilizada para series de diluciones limitantes (n = 13 muestras totales). En cada muestra, se evaluaron las SNV o VF específicas de tumor de las 3 muestras de pacientes utilizadas en el experimento de dilución limitante mostrado en laFIG. 3E,para un total de 39 evaluaciones. Las barras representan la media aritmética de las 39 evaluaciones; comparación estadística realizada mediante la prueba de Wilcoxon para datos independientes. *,p<0,05, **,p<0,005, ***,p<0,0005. LaFIG.3Gilustra un gráfico que muestra la tasa teórica de detección para una muestra con un número determinado de regiones que contienen VF, según un muestreo binomial simple. Este gráfico se obtiene suponiendo una profundidad de secuenciación única de 5000x (línea), junto con un número variable de regiones independientes de 150 pb que contienen VF, de 3 regiones (azul) a 67 regiones (morado). Los límites de confianza consideran una profundidad de 4000-6000x; se supone también una tasa de falsos positivos del 5 %. LaFIG.3Hilustra un gráfico que muestra la tasa de detección observada (eje de ordenadas) para una muestra de una fracción tumoral verdadera dada (eje de abscisas), con un número variable de regiones que contienen FV. Para cada número de regiones indicadoras de tumores entre 3 y 67, este número de ventanas de 150 pb se muestreó aleatoriamente desde cada una de las 3 listas de indicadores de VF específicas de pacientes 25 veces y se usó para evaluar la detección de tumores en cada dilución. Los puntos rellenos representan experimentos de series de diluciones "húmedos", mientras que los puntos abiertos representan experimentos de dilución por ordenador. Los puntos y las barras de error representan la media, el mínimo y el máximo en las tres listas de indicadores de VF específicas de pacientes utilizadas en el muestreo original. LaFIG.
3Iilustra un diagrama de dispersión que compara la tasa de detección predicha frente a la observada para las muestras de las series de diluciones mostradas en los paneles de laFIG. 3Gy laFIG. 3H.En elejemplo 10se ofrecen detalles adicionales de este experimento.
LaFIG. 4ilustra la aplicación clínica de PhasED-Seq para la detección ultrasensible de la enfermedad y la monitorización de la respuesta en LDLBG. LaFIG. 4Ailustra un gráfico que muestra los niveles de ADNtc de un paciente con LDLBG que responde a, y posteriormente recae, inmunoquimioterapia de primera línea. Los niveles medidos mediante CAPP-Seq se muestran en círculos grises más oscuros, mientras que los niveles medidos mediante PhasED-Seq se muestran en círculos grises más claros. Los círculos abiertos representan niveles indetectables mediante CAPP-Seq. LaFIG.4Bilustra un gráfico de dispersión univariante que muestra la fracción alélica tumoral media medida por PhasED-Seq para muestras clínicas en puntos temporales de enfermedad mínima (es decir, después de 1 o 2 ciclos de terapia). El gráfico se divide entre muestras detectadas y no detectadas por CAPP-Seq estándar; valor de la p de la prueba de Wilcoxon para datos independientes. LaFIG.
4Cilustra un diagrama de barras que muestra la fracción de pacientes con LDLBG que tienen ADNtc detectable mediante CAPP-Seq después de 1 o 2 ciclos de tratamiento (barras gris oscuro), así como la fracción de pacientes adicionales con enfermedad detectable al añadir PhasED-Seq a CAPP-Seq estándar (barras grises medias). El valor de la p representa una prueba exacta de Fisher para la detección mediante CAPP-Seq sola frente a la combinación de PhasED-Seq y CAPP-Seq en 171 muestras tras 1 o 2 ciclos de tratamiento. LaFIG.4Dilustra un gráfico en cascada que muestra el cambio en los niveles de ADNtc medidos mediante CAPP-Seq tras 2 ciclos de tratamiento de primera línea en pacientes con LDLBG. Los pacientes con ADNtc indetectable mediante CAPP-Seq se muestran como "ND" ("no detectado"), en colores más oscuros. Los colores de las barras también indican los resultados clínicos finales de estos pacientes. LaFIG. 4Eilustra un gráfico de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia sin episodios para 52 pacientes con LDLBG con ADNtc indetectable medido mediante CAPP-Seq después de 2 ciclos. LaFIG.4Filustra un gráfico de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia sin episodios de los 52 pacientes mostrados en laFIG.4E(ADNtc indetectable mediante CAPP-Seq) estratificados por detección de ADNtc mediante PhasED-Seq en este mismo punto temporal (ciclo 3, día 1). LaFIG.4Gilustra un gráfico de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia sin episodios para 89 pacientes con LDLBG estratificados por ADNtc en el ciclo 3, día 1, separados en 3 estratos: pacientes que no logran una respuesta molecular importante (gris oscuro), pacientes con una respuesta molecular importante que aún tienen ADNtc detectable mediante PhasED-Seq y/o CAPP-Seq (gris claro) y pacientes que tienen una remisión molecular estricta (ADNtc indetectable mediante PhasED-Seq y CAPP-Seq; gris medio).
LaFIG.5ilustra la enumeración de SNV y VF en diversos cánceres a partir de SGC. LasFIG.5A-Cilustran gráficos de dispersión univariantes que muestran el número de SNV(FIG. 5A),VF(FIG. 5B)y VF, teniendo en cuenta el número total de SNV(FIG. 5C),a partir de datos de SGC para 24 histologías diferentes de cáncer. Las barras muestran el valor de la mediana y el intervalo intercuartílico. (LF-LNH, linfoma folicular; LDLBG-LNH, linfoma difuso de linfocitos B grandes; LNH-Burkitt, linfoma de Burkitt; CCE-pulmón, cáncer pulmonar de células escamosas; Adeno-pulmón, adenocarcinoma de pulmón; CCR-riñón, carcinoma de células renales; Osteosarc-hueso, osteosarcoma; CHC-hígado, carcinoma hepatocelular; Adeno-mama, adenocarcinoma de mama; Adeno-panc, adenocarcinoma pancreático; CCE-cabeza, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; Adeno-ovario, adenocarcinoma de ovario; Adeno-eso, adenocarcinoma de esófago; Adeno-útero, adenocarcinoma de útero; Adeno-estómago, adenocarcinoma de estómago; LLC, leucemia linfocítica crónica; Adeno-colorrect, adenocarcinoma colorrectal; Adeno-prost, adenocarcinoma de próstata; GBM-SNC, glioblastoma multiforme; Endocrino-panc, tumor neuroendocrino pancreático; Adeno-tir, adenocarcinoma de tiroides; PiloAstro-SNC, piloastrocitoma; Medulo-SNC, meduloblastoma).
LaFIG. 6ilustra la contribución de las firmas mutacionales en SNV en fase y sin fase en SGC(FIG. 6A-6WW).
Diagramas de dispersión que muestran la contribución de las firmas mutacionales de sustitución de una sola base (SBS) establecidas a las SNV observadas en las VF, mostradas en colores oscuros, y SNV vistas fuera de las posibles relaciones en fase, mostradas en colores claros, de SGC. Esto se presenta para 49 firmas mutacionales de SBS en 24 subtipos de cáncer. Las firmas mutacionales que muestran una diferencia significativa en la contribución entre SNV en fase y sin fase tras la corrección de la evaluación de hipótesis múltiple se indican con un *. Estas cifras representan los datos brutos resumidos en la FIG.1C.
LaFIG.7ilustra la distribución de las VF en regiones estereotipadas de todo el genoma. Los diagramas de barras muestran la distribución de las VF en regiones estereotipadas del genoma de múltiples tipos de cáncer. En este gráfico, el genoma se dividió en grupos de 1000 pb y se calculó la fracción de muestras de una histología determinada con una VF en cada grupo de 1000 pb. Solo se muestran los grupos que tienen al menos una frecuencia de recurrencia del 2 % en cualquier subtipo de cáncer. Las histologías mostradas son como en laFIG.
1E;también se muestran los subtipos de linfocitos B activados (ABC) y de linfocitos B de centro germinal (GCB) del LDLBG.
LaFIG.8ilustra la cantidad y ubicación genómica de VF a partir de SGC en neoplasias linfoides malignas. LaFIG.
8Ailustra un diagrama de barras que muestra el número de regiones independientes de 1000 pb en todo el genoma que contienen VF de forma recurrente para LDLBG, LF, LB y LLC (n = 68, 74, 36 y 151 respectivamente). LasFIG.
8B-Dilustran gráficos que muestran la frecuencia de VF para múltiples neoplasias linfoides malignas con relaciones con locus genéticos específicos, incluyendo laFIG.8B:BCL2,laFIG.8C:MYC,y laFIG. 8D:ID3.La ubicación del transcrito de un gen determinado se muestra debajo del gráfico en gris; los exones se muestran en gris más oscuro. * indica una región con un número significativamente mayor de VF en una determinada histología del cáncer en comparación con todas las demás histologías mediante la prueba exacta de Fisher (p<0,05). LaFIG.
8E,similar a lasFIG.8B-D,estos gráficos muestran la frecuencia de VF en los distintos subtipos de linfoma. En este caso, se muestra el locusIGH, que consiste en partesIGHV, IGHDyIGHJ, para los LDLBG de subtipo ABC y GCB (n = 25 y 25, respectivamente). Se muestran las regiones de codificación de las partes de Ig, que incluyen las regiones constantes de Ig y los genes V. (LDLBG, linfoma difuso de linfocitos B grandes; LF, linfoma folicular; LB, linfoma de Burkitt, LLC, leucemia linfocítica crónica).
LaFIG. 9ilustra el rendimiento de PhasED-Seq para la recuperación de VF en linfomas. LaFIG. 9Ailustra un diagrama de dispersión univariante que muestra la fracción de todas las VF en todo el genoma identificadas por SGC (n = 79) que fueron recuperados por el panel CAPP-Seq<8>de linfoma notificado anteriormente (izquierda) en comparación con PhasED-Seq (derecha). LaFIG.9Bilustra el rendimiento esperado de SNV por caso identificadas a partir de SGC utilizando un panel CAPP-Seq de linfoma previamente establecido o el panel PhasED-Seq. LaFIG. 9Cilustra el rendimiento esperado de VF por caso identificadas a partir de SGC utilizando un panel CAPP-Seq de linfoma previamente establecido o el panel PhasED-Seq. Los datos de tres cohortes independientes públicamente disponibles se muestran en lasFIG. 9A-9C.LasFIG. 9D-9Filustran gráficos que muestran el perfeccionamiento de la recuperación de VF por PhasED-Seq en comparación con CAPP-Seq en 16 pacientes secuenciados por ambos ensayos. Esto incluye el perfeccionamiento de d) dos SNV en fase (p. ej., 2x o "VF de dobletes"), e) tres SNV en fase (3x o "VF de tripletes") y f) cuatro SNV en fase (p. ej., 4x o "VF de cuadrupletes"). LasFIG.9G-9Kilustran paneles que muestran el número de SNV y VF identificadas para pacientes con diferentes tipos de linfomas. Estos paneles muestran el número de g) SNV, h) VF de dobletes, i) VF de tripletes, j) VF de cuadrupletes y k) todas las VF. *,p<0,05; **,p<0,01, ***,p<0,001. (LDLBG, linfoma difuso de linfocitos B grandes; GCB, LDLBG de tipo linfocitos B de centro germinal; ABC, LDLBG de tipo linfocitos B activados; LPMB, linfoma mediastínico primario de linfocitos B; LH, linfoma de Hodgkin).
LaFIG.10ilustra las diferencias específicas de ubicación en las VF entre ABC-LDLBG y GCB-LDLBG(FIG.10A-10Y).Similar a laFIG.2D,estos gráficos de dispersión comparan la frecuencia de VF por ubicación genómica (en grupos de 50 pb) para pacientes con diferentes tipos de linfomas; en esta figura, se muestra la diferencia entre ABC-LDLBG y GCB-LDLBG. Los círculos rojos muestran la frecuencia relativa de VF en grupos de 50 pb a partir de un gen de interés específico; los otros círculos (grises) muestran la frecuencia relativa de VF en grupos de 50 pb a partir del resto del panel de secuenciación PhasED-Seq. Solo se muestran los genes con una diferencia estadísticamente significativa en las VF entre ABC-LDLBG y GCB-LDLBG. Los valores de la p representan una prueba de Wilcoxon para datos independientes de grupos de 50 pb de un gen determinado frente a todos los demás grupos de 50 pb; véase elejemplo 10.
LaFIG.11ilustra las diferencias específicas de ubicación en las VF entre LDLBG y LPMB(FIG.11A-11X).Similar a laFIG. 2D,estos gráficos de dispersión comparan la frecuencia de VF por ubicación genómica (en grupos de 50 pb) para pacientes con diferentes tipos de linfomas; en esta figura, se muestra la diferencia entre LDLBG y LPMB. Los círculos azules muestran la frecuencia relativa de VF en grupos de 50 pb a partir de un gen de interés específico; los otros círculos (grises) muestran la frecuencia relativa de VF en intervalos de 50 pb desde el resto del panel de secuenciación PhasED-Seq. Solo se muestran los genes con una diferencia estadísticamente significativa en las VF entre LDLBG y LPMB. Los valores de la p representan una prueba de Wilcoxon para datos independientes de grupos de 50 pb de un gen determinado frente a todos los demás grupos de 50 pb; véase elejemplo 10.
LaFIG. 12ilustra las diferencias específicas de ubicación en las VF entre LDLBG y LH. Similar a laFig. 2D,los gráficos de dispersión de lasFIG.12A-12NNcomparan la frecuencia de VF por ubicación genómica (en grupos de 50 pb) para pacientes con diferentes tipos de linfomas; en esta figura, se muestra la diferencia entre LDLBG y LH. Los círculos verdes muestran la frecuencia relativa de VF en grupos de 50 pb a partir de un gen de interés específico; los otros círculos (grises) muestran la frecuencia relativa de VF en grupos de 50 pb a partir del resto del panel de secuenciación PhasED-Seq. Solo se muestran los genes con una diferencia estadísticamente significativa en las VF entre LDLBG y LH. Los valores de la p representan una prueba de Wilcoxon para datos independientes de grupos de 50 pb de un gen determinado frente a todos los demás grupos de 50 pb; véase elejemplo 10.
LaFIG.13ilustra diferencias en las VF entre tipos de linfoma en mutaciones en el locusIGH. Esta figura muestra la frecuencia de VF de PhasED-Seq a través del locus@IGHpara diferentes tipos de linfomas de linfocitos B. La pista inferior muestra la estructura del locus@IGHy partes del gen, incluidos los genes constantes de Ig y los genes V. La siguiente pista (esbozada) muestra la frecuencia de VF en esta región genómica a partir de datos de SGC (cohorte ICGC). El resto de las pistas muestran la frecuencia de VF a partir de datos de secuenciación dirigida PhasED-Seq, que incluyen 1) LDLBG, GCB-LDLBG, LBA-LDLBG, LPMB y LH. Las regiones diana del panel PhasED-Seq se muestran en la parte superior. Las partes de inmunoglobulina seleccionadas con VF enriquecidas en histologías específicas están etiquetadas (es decir,IGHV4-34, Sε, Sγ3ySγ1).
LaFIG. 14ilustra aspectos técnicos de PhasED-Seq mediante secuenciación por captura híbrida. LaFIG. 14Amuestra un gráfico de la energía teórica de unión para polímeros de 150 unidades típicos en todo el genoma con una fracción creciente de bases mutadas desde el genoma de referencia. Las mutaciones estaban repartidas por todo el polímero de 150 unidades, agrupadas en un extremo de la secuencia, agrupadas en el centro de la secuencia o de forma aleatoria en toda la secuencia. Los puntos y las barras de error representan la mediana y los intervalos intercuartílicos de 10000 simulaciones informáticas. LaFIG. 14Bilustra un gráfico que muestra dos histogramas de parámetros de sumario de la tasa de mutación de ventanas de 151 pb a lo largo del panel PhasED-Seq en todos los pacientes de este estudio. El histograma gris claro muestra el porcentaje máximo mutado en cualquier ventana de 151 pb para todos los pacientes de este estudio; el histograma gris oscuro muestra la tasa de mutación del percentil 95 en todas las ventanas mutadas de 151 pb. LaFIG.14Ces un gráfico que muestra el percentil de la tasa de mutación en todas las ventanas mutadas de 151 pb en todos los pacientes de este estudio. LaFIG. 14Dilustra gráficos cromáticos que muestran la tasa de error relativa (como log10(tasa de error)) para SNV individuales (izquierda, "ROJO"), VF de dobletes (centro, "AMARILLO") y VF de tripletes (derecha, "AZUL"). La FIG. 14D demuestra que el análisis basado en la pluralidad de variantes en fase (es decir, VF dobles o de tripletes) produce una tasa de error menor que el análisis basado en SNV individuales. Además, la FIG. 14D demuestra que el análisis que utiliza un mayor número de conjuntos de variantes en fase (p. ej., VF de tripletes etiquetadas como "AZUL") produce una tasa de error menor que el análisis basado en un menor número de conjuntos de variantes en fase (p. ej., VF de dobletes etiquetadas como "AMARILLO"). Se muestra la tasa de error de SNV individuales a partir de la secuenciación con múltiples métodos de supresión de errores, incluida la desduplicación de códigos de barras, iDES y secuenciación de doble cadena. Las tasas de error se resumen según el tipo de mutación. En el caso de las VF de tripletes, los ejes de abscisas y ordenadas del gráfico cromático representan el primer y segundo tipo de alteración de bases en la VF; la tercera alteración se promedia sobre los 12 cambios de base posibles. LaFIG.14Eilustra un gráfico que muestra la tasa de error para VF de dobletes/2x en función de la distancia genómica entre las SNV componentes.
LasFIG. 15y16ilustran la comparación de la cuantificación de ADNtc mediante PhasED-Seq con CAPP-Seq y aplicaciones clínicas. LaFIG. 15ilustra la tasa de detección de ADNtc de muestras de pretratamiento en 107 pacientes con linfomas de linfocitos B grandes mediante CAPP-Seq estándar (verde), así como PhasED-Seq utilizando dobletes (azul claro), tripletes (azul medio) y cuadrupletes (azul oscuro). También se muestra la especificidad de la detección de ADNtc. En las dos parcelas inferiores, se muestra la tasa de detección falsa en 40 muestras de ADNec de controles sanos retenidas. El tamaño de cada barra en estos dos gráficos muestra la tasa de detección de mutaciones de ADNec específicas del paciente en estos 40 controles retenidos, en los 107 casos. LaFIG.16Ailustra una tabla que resume la sensibilidad y especificidad para la detección de ADNtc en muestras de pretratamiento mediante CAPP-Seq y PhasED-Seq utilizando dobletes, tripletes y cuadrupletes, como se muestra en el panel A. La sensibilidad se calcula en los 107 casos, mientras que la especificidad se calcula para las 40 muestras de control retenidas, evaluando para cada una de las 107 listas de mutaciones específicas de pacientes independientes, para un total de 4280 pruebas independientes. LaFIG. 16Bilustra un diagrama de dispersión que muestra la cantidad de ADNtc (medida como log10(equivalentes de genoma haploide/ml)) medida por CAPP-Seq frente a PhasED-Seq en muestras individuales. Las muestras tomadas antes del ciclo 1 de la terapia de RCHOP (es decir, pretratamiento), antes del ciclo 2 y antes del ciclo 3, se muestran en colores independientes (azul, verde y rojo, respectivamente; 278 muestras totales). Los niveles indetectables caen sobre los ejes. Se muestran la correlación de Spearman y el valor de lap.
LaFIG.17ilustra la detección de ADNtc tras dos ciclos de terapia sistémica. LaFIG.17Ailustra un diagrama de dispersión que muestra el factor de cambio logarítmico de ADNtc tras 2 ciclos de tratamiento (es decir, la respuesta molecular mayor o RMMa) medido mediante CAPP-Seq o PhasED-Seq para pacientes que reciben tratamiento con RCHOP. Las líneas discontinuas muestran el umbral previamente establecido de una reducción de 2,5 log en el ADNtc para RMMa. Las muestras indetectables caen sobre los ejes; el coeficiente de correlación representa un rho de Spearman para las 33 muestras detectadas tanto por CAPP-Seq como por PhasED-Seq. LaFIG.17Bilustra tablas de 2 por 2 que resumen la tasa de detección de muestras de ADNtc tras 2 ciclos de terapia mediante PhasED-Seq frente a CAPP-Seq. Los pacientes con avance posterior de la enfermedad se muestran en el panel inferior, mientras que los pacientes sin avance posterior de la enfermedad se muestran en el panel superior. LaFIG. 17Cilustra gráficos de barras que muestran el área bajo la curva de eficacia diagnóstica (ABC) para la clasificación de pacientes para la supervivencia sin episodios a los 24 meses basada en CAPP-Seq (colores claros) o PhasED-Seq (colores oscuros) después de 2 ciclos de terapia. Se muestra la clasificación de todos los pacientes (n = 89, izquierda) y solo de los pacientes que logran una RMMa (n = 69, derecha). LaFIG.17Dilustra los gráficos de Kaplan-Meier que muestran la supervivencia sin episodios de 69 pacientes que alcanzaron una RMMa estratificados por detección de ADNtc con CAPP-Seq (arriba) o PhasED-Seq (abajo).
LaFIG. 18ilustra la detección de ADNtc tras un ciclo de terapia sistémica. LaFIG. 18Ailustra un diagrama de dispersión que muestra el factor de cambio logarítmico de ADNtc tras 1 ciclo de tratamiento (es decir, la respuesta molecular temprana o RMT) medido mediante CAPP-Seq o PhasED-Seq para pacientes que reciben tratamiento con RCHOP. Las líneas discontinuas muestran el umbral previamente establecido de una reducción de 2 log en el ADNtc para RMT. Las muestras indetectables caen sobre los ejes; el coeficiente de correlación representa un rho de Spearman para las 45 muestras detectadas tanto por CAPP-Seq como por PhasED-Seq. LaFIG.18Bilustra tablas de 2 por 2 que resumen la tasa de detección de muestras de ADNtc tras 1 ciclo de terapia mediante PhasED-Seq frente a CAPP-Seq. Los pacientes con avance posterior de la enfermedad se muestran en rojo, mientras que los pacientes sin avance posterior de la enfermedad se muestran en azul. LaFIG.18Cilustra gráficos de barras que muestran el área bajo la curva de eficacia diagnóstica (ABC) para la clasificación de pacientes para la supervivencia sin episodios a los 24 meses basada en CAPP-Seq (colores claros) o PhasED-Seq (colores oscuros) después de 1 ciclo de terapia. Se muestra la clasificación de todos los pacientes (n = 82, izquierda) y solo de los pacientes que logran una RMT (n = 63, derecha). LaFIG.18Dilustra los gráficos de Kaplan-Meier que muestran la supervivencia sin episodios de 63 pacientes que alcanzaron una RMT estratificados por detección de ADNtc con CAPP-Seq (arriba) o PhasED-Seq (abajo). LaFIG.18Eilustra un gráfico en cascada que muestra el cambio en los niveles de ADNtc medidos mediante CAPP-Seq tras 1 ciclo de tratamiento de primera línea en pacientes con LDLBG. Los pacientes con ADNtc indetectable mediante CAPP-Seq se muestran como "ND" ("no detectado"), en colores más oscuros. Los colores de las barras también indican los resultados clínicos finales de estos pacientes. LaFIG.18Filustra un gráfico de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia sin episodios para 33 pacientes con LDLBG con ADNtc indetectable medido mediante CAPP-Seq después de 1 ciclo de tratamiento. LaFIG.18Gilustra un gráfico de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia sin episodios de los 33 pacientes mostrados en laFIG.
18F(ADNtc indetectable mediante CAPP-Seq) estratificados por detección de ADNtc mediante PhasED-Seq en este mismo punto temporal (ciclo 2, día 1). LaFIG. 18Hilustra un gráfico de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia sin episodios para 82 pacientes con LDLBG estratificados por ADNtc en el ciclo 2, día 1 separada en 3 estratos: pacientes que no logran una respuesta molecular temprana, pacientes con una respuesta molecular temprana que aún tienen ADNtc detectable mediante PhasED-Seq y/o CAPP-Seq, y pacientes que tienen una remisión molecular estricta (ADNtc indetectable mediante PhasED-Seq y CAPP-Seq).
LaFIG.19ilustra una fracción de pacientes donde PhasED-Seq alcanzaría un LOD menor que la secuenciación bicatenaria rastreando SNV basadas en datos de PCAWG (secuenciación del genoma completo) a partir de los cuales se cuantificó el número de SNV y variantes en fase (VF) en diferentes tipos de tumores.
LaFIG. 20ilustra el perfeccionamiento de los LOD conseguido en los cánceres de pulmón (adenocarcinoma, abreviado "A", y carcinoma de células escamosas, abreviado "S"), en comparación con la secuenciación bicatenaria de datos de secuenciación del genoma completo.
LaFIG. 21ilustra datos empíricos de un experimento donde se realizó SGC en tejido tumoral y se diseñaron paneles personalizados para 5 pacientes con tumores sólidos (5 cánceres de pulmón) para examinar y comparar los LOD de CAPP-Seq personalizado frente a PhasED-Seq, que mostraron un LOD ~10X menor usando PhasED-Seq en 5/5 pacientes.
LaFIG. 22Ailustra una viñeta de paciente ilustrativa de prueba de principio que compara el uso de CAPP-Seq personalizado y PhasED-Seq para la vigilancia de la enfermedad en cáncer de pulmón, que muestra una detección más temprana de la recaída usando PhasED-Seq.
LaFIG. 22Bilustra una viñeta de paciente ilustrativa de prueba de principio que compara el uso de CAPP-Seq personalizado y PhasED-Seq para la detección precoz de la enfermedad en el cáncer de mama, que muestra una detección más temprana de la enfermedad con PhasED-Seq.
LasFIG.23A-23Bilustran que el método descrito en el presente documento (p. ej., el método representado que da lugar aFIG.3EyFIG.3F)no requiere la supresión de errores mediada por código de barras.
LaFIG.24ilustra un diagrama de flujo de un proceso para realizar una intervención clínica y/o tratamiento en un individuo basado en la detección de secuencias de ácido nucleico tumoral circulante en un resultado de secuenciación de acuerdo con una realización.
LasFIG.25A-25Cmuestran diagramas de flujo ilustrativos de métodos para determinar una afección de un sujeto basándose en una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden una pluralidad de variantes. LaFIG.25Dmuestra un diagrama de flujo ilustrativo de un método para tratar una afección de un sujeto basándose en una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden una pluralidad de variantes.
LaFIG.25Emuestra un diagrama de flujo ilustrativo de un método para determinar la evolución (p. ej., avance o remisión) de una afección de un sujeto basándose en una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden una pluralidad de variantes.
LasFIG.25Fy25Gmuestran diagramas de flujo ilustrativos de métodos para determinar una afección de un sujeto basándose en una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden una pluralidad de variantes. LasFIG. 26Ay26Bilustran esquemáticamente diferentes sondas fluorescentes para identificar una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden una pluralidad de variantes en fase.
LaFIG. 27muestra un sistema informático que está programado o configurado de otro modo para implementar métodos proporcionados en el presente documento.
Descripción detallada
Aunque diversas realizaciones de la invención se han mostrado y descrito en el presente documento, será obvio para los expertos en la materia que dichas realizaciones se proporcionan solamente a modo de ejemplo. Numerosas variaciones, cambios y sustituciones se les presentarán ahora a los expertos en la materia sin desviarse de la invención. Debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en el presente documento, siempre que las alternativas entren dentro del ámbito definido por las reivindicaciones adjuntas.
Las expresiones "alrededor de" o "aproximadamente" generalmente significan dentro de un margen de error aceptable para el valor en particular, que puede depender en parte de cómo se mida o determine el valor, p. ej., de las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar más/menos 1 o más de 1 desviación típica, según la practica en la técnica. Como alternativa, "aproximadamente" puede significar un intervalo de hasta el 20 %, hasta el 10 %, hasta el 5 % o hasta el 1 % de un valor dado. Como alternativa, particularmente con respecto a los sistemas o procesos biológicos, la expresión puede significar dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces y más preferentemente dentro de 2 veces, de un valor. Cuando se describan valores particulares en la solicitud y en las reivindicaciones, salvo que se especifique lo contrario, se puede asumir el término "aproximadamente" dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular.
Las expresiones "variantes fásicas", "variantes en fase", "VF" o "variantes somáticas en fase", como se usan indistintamente en el presente documento, se refiere generalmente a dos o más mutaciones (p. ej., SNV o indeles) que se producen encis(es decir, en la misma cadena de una molécula de ácido nucleico) dentro de una única molécula de ácido nucleico extracelular. En algunos casos, una molécula de ácido nucleico extracelular puede ser una molécula de ácido desoxirribonucleico extracelular (ADNec). En algunos casos, una molécula de ADNec puede proceder de un tejido enfermo, tal como un tumor (p. ej., una molécula de ADN tumoral circulante (ADNtc)).
Las expresiones "muestra biológica" o "muestra corporal", como se usan indistintamente en el presente documento, se refiere en general a una muestra de tejido o líquido procedente de un sujeto. Se puede obtener una muestra biológica directamente del sujeto. Como alternativa, una muestra biológica puede obtenerse del sujeto (p. ej., procesando una muestra biológica inicial obtenida del sujeto). La muestra biológica puede ser o puede incluir una o más moléculas de ácido nucleico, tales como moléculas de ADN o de ácido ribonucleico (ARN). La muestra biológica puede derivarse de cualquier órgano, tejido o líquido biológico. Una muestra biológica puede comprender, por ejemplo, un líquido corporal o una muestra de tejido sólido. Un ejemplo de muestra de tejido sólido es una muestra tumoral, p. ej., de una biopsia de tumor sólido. Entre los ejemplos no limitativos de líquidos corporales se incluye sangre, suero, plasma, células tumorales, saliva, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, fluido prostático, líquido seminal, leche, esputo, heces, lágrimas y derivados de estos. En algunos casos, una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares, como se ha divulgado en el presente documento, pueden proceder de una muestra biológica
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere en general a cualquier animal, mamífero o ser humano. Un sujeto puede tener, tener potencialmente o sospecharse que tiene una o más afecciones, tales como una enfermedad. En algunos casos, una afección del sujeto puede ser cáncer, un síntoma o síntomas asociados al cáncer, o asintomático con respecto al cáncer o no diagnosticado (p. ej., no diagnosticado de cáncer). En algunos casos, el sujeto puede tener cáncer, el sujeto puede mostrar uno o varios síntomas asociados al cáncer, el sujeto puede estar exento de síntomas asociados al cáncer, o el sujeto puede no estar diagnosticado de cáncer. En algunos ejemplos, el sujeto es un ser humano.
La expresión "ADN extracelular" o "ADNec", como se usan indistintamente en el presente documento, se refiere en general a fragmentos de ADN que circulan libremente en el torrente sanguíneo de un sujeto. Los fragmentos de ADN extracelulares pueden tener protección dinucleosómica (p. ej., un tamaño de fragmento de al menos 240 pares de bases ("pb")). Estos fragmentos de ADNec con protección dinucleosómica probablemente no se cortaron entre el nucleosoma, lo que dio lugar a una mayor longitud del fragmento (p. ej., con una distribución de tamaños normalmente centrada en torno a 334 pb). Los fragmentos de ADN extracelulares pueden tener protección mononucleosómica (p. ej., un tamaño de fragmento de menos de 240 pares de bases ("pb")). Estos fragmentos de ADNec con protección mononucleosómica probablemente se cortaron entre el nucleosoma, lo que dio lugar a una menor longitud del fragmento (p. ej., con una distribución de tamaños normalmente centrada en torno a 167 pb).
La expresión "datos de secuenciación", como se usa en el presente documento, se refiere en general a "lecturas de secuencias en bruto" y/o "secuencias consenso" de ácidos nucleicos, tales como ácidos nucleicos extracelulares o derivados de los mismos. Las lecturas de secuencias en bruto son el resultado de un secuenciador de ADN y normalmente incluyen secuencias redundantes de la misma molécula progenitora, por ejemplo, tras la amplificación. Las "secuencias de consenso" son secuencias derivadas de secuencias redundantes de una molécula progenitora que se pretende que representen la secuencia de la molécula progenitora original. Las secuencias de consenso pueden producirse por votación (en donde cada nucleótido mayoritario, p. ej., el nucleótido más habitualmente observado en una posición de base determinada, entre las secuencias es el nucleótido consenso) u otros enfoques tales como la comparación con un genoma de referencia. En algunos casos, las secuencias de consenso pueden producirse marcando las moléculas progenitoras originales con etiquetas moleculares únicas o no únicas, que permiten el seguimiento de las secuencias de la descendencia (p. ej., después de la amplificación) mediante el seguimiento de la etiqueta y/o el uso de la información interna de lectura de secuencia.
La expresión "secuencia genómica de referencia", como se usa en el presente documento, se refiere en general a una secuencia de nucleótidos con la que se comparan las secuencias de nucleótidos de un sujeto.
La expresión "región genómica", como se usa en el presente documento, se refiere en general a cualquier región (p. ej., intervalo de ubicaciones de pares de bases) de un genoma, p. ej., un genoma completo, un cromosoma, un gen o un exón. Una región genómica puede ser contigua o no contigua. Un "locus genético" (o "locus") puede ser una parte o la totalidad de una región genómica (p. ej., un gen, una parte de un gen o un solo nucleótido de un gen).
El término "verosimilitud", como se usa en el presente documento, se refiere en general a una probabilidad, una probabilidad relativa, una presencia o una ausencia, o un grado.
La expresión "biopsia líquida", como se usa en el presente documento, se refiere en general a una prueba o ensayo de laboratorio no invasivo o mínimamente invasivo (p. ej., de una muestra biológica o de ácidos nucleicos extracelulares). Los ensayos de "biopsia líquida" pueden notificar detecciones o mediciones (p. ej., frecuencias alélicas menores, expresión génica o expresión proteica) de uno o más genes marcadores asociados a una afección de un sujeto (p. ej., genes marcadores de cáncer o asociados a tumores).
A. Introducción
Las modificaciones (p. ej., mutaciones) del ADN genómico pueden manifestarse en la formación y/o progresión de una o más afecciones (p. ej., una enfermedad, tal como cáncer o tumor) de un sujeto. La presente divulgación proporciona métodos y sistemas para analizar moléculas de ácido nucleico extracelulares, tales como ADNec, de un sujeto para determinar la presencia o ausencia de una afección del mismo, pronóstico de una afección diagnosticada al sujeto, evolución de la afección del sujeto a lo largo del tiempo, tratamiento terapéutico de una afección diagnosticada al sujeto o resultado previsto del tratamiento de una afección del sujeto.
Se han desarrollado análisis de ácidos nucleicos extracelulares, tales como ADNec, con amplias aplicaciones en, p. ej., pruebas prenatales, trasplante de órganos, enfermedades infecciosas y oncología. En el contexto de la detección o el seguimiento de una enfermedad de un sujeto, tal como cáncer, el ADN tumoral circulante (ADNtc) puede ser un biomarcador sensible y específico en numerosos tipos de cáncer. En algunos casos, el ADNtc puede utilizarse para detectar la presencia de enfermedad mínima residual (EMR) o la carga tumoral después del tratamiento, tal como quimioterapias o resección quirúrgica de tumores sólidos. Sin embargo, el límite de detección (LOD) para el análisis de ADNtc puede verse restringido por una serie de factores, entre los que se incluyen (i) bajas cantidades de entrada de ADN procedentes de una extracción de sangre típica y (ii) las tasas de error de fondo de la secuenciación.
En algunos casos, la detección del cáncer basada en el ADNtc puede perfeccionarse mediante el seguimiento de múltiples mutaciones somáticas con secuenciación con supresión de errores, p. ej., con LOD de aproximadamente 2 partes en 100000 a partir de la entrada de ADNec mientras se usan paneles comerciales o ensayos personalizados. Sin embargo, en algunos casos, el LOD actual del ADNtc de interés puede ser insuficiente para detectar universalmente la EMR en pacientes destinados a la recaída o avance de la enfermedad. Por ejemplo, dicha "pérdida de detección" puede ejemplificarse en el linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG). Para el LDLBG, la detección intermedia de ADNtc después de solo dos ciclos de terapia con intención curativa puede representar una respuesta molecular mayor (RMMa) y puede ser un fuerte marcador de pronóstico de los resultados clínicos finales. A pesar de esto, casi un tercio de los pacientes que finalmente experimentan avance de la enfermedad no tienen ADNtc detectable en este hito intermedio utilizando las técnicas disponibles (p. ej., Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing (CAPP-Seq)), lo que representa mediciones "falsas negativas". También se han observado dichas tasas elevadas de falsos negativos en pacientes con LDLBG mediante métodos alternativos, tales como el seguimiento del ADNtc a través de reordenamientos de genes de inmunoglobulina. Por lo tanto, existe la necesidad de perfeccionar los métodos de detección del cáncer basados en el ADNtc con una mayor sensibilidad.
Las variantes somáticas detectadas en ambas cadenas complementarias de las dobles cadenas de ADN parental pueden utilizarse para reducir el LOD de la detección de ADNtc, aumentando de este modo ventajosamente la sensibilidad de la detección del ADNtc. Esta "secuenciación bicatenaria" puede reducir el perfil de error de fondo debido al requisito de dos eventos concordantes para la detección de una variante de un solo nucleótido (SNV). Sin embargo, el enfoque de secuenciación bicatenaria por sí solo puede verse limitado por una recuperación ineficaz de las dobles cadenas de ADN, ya que la recuperación de ambas hebras originales puede producirse en una minoría de todas las moléculas recuperadas. Por lo tanto, la secuenciación bicatenaria puede ser subóptima e ineficiente para la detección de ADNtc en el mundo real con una cantidad limitada de muestra de partida, donde el ADN de entrada de volúmenes de sangre prácticos (p. ej., entre aproximadamente 4000 y aproximadamente 8000 genomas por tubo de extracción de sangre estándar de 10 mililitros (ml)) es limitada y es esencial la máxima recuperación de genomas.
Por lo tanto, sigue existiendo una importante necesidad insatisfecha de detección y análisis de ADNtc con bajo LOD (p. ej., que produzca de este modo una alta sensibilidad) para determinar, por ejemplo, la presencia o ausencia de una enfermedad de un sujeto, el pronóstico de la enfermedad, el tratamiento de la enfermedad y/o el resultado previsto del tratamiento.
B. Métodos y sistemas para determinar o controlar una afección, en donde solo se reivindican los métodos
La presente divulgación describe métodos y sistemas para detectar y analizar ácidos nucleicos extracelulares con una pluralidad de variantes en fase como característica de una afección de un sujeto. En algunos aspectos, las moléculas de ácido nucleico extracelulares pueden comprender moléculas de ADNec, tales como moléculas de ADNtc. Los métodos y sistemas divulgados en el presente documento pueden utilizar datos de secuenciación procedentes de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares del sujeto para identificar un subconjunto de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que tiene la pluralidad de variantes en fase, para determinar de este modo la afección del sujeto. Los métodos y sistemas divulgados en el presente documento pueden detectar directamente y, en algunos casos, extraer (o capturar) dicho subconjunto de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que presentan la pluralidad de variantes en fase, para determinar de este modo la afección del sujeto con o sin secuenciación. Los métodos y sistemas divulgados en el presente documento pueden reducir la tasa de error de fondo que suele producirse durante la detección y el análisis de moléculas de ácido nucleico extracelulares, tales como ADNec.
En algunos aspectos, se proporcionan métodos y sistemas para la secuenciación de ácidos nucleicos sin células y la detección del cáncer. En algunas realizaciones, pueden extraerse ácidos nucleicos extracelulares (p. ej., ADNec o ARNec) de una biopsia líquida de un individuo y prepararse para la secuenciación. Los resultados de la secuenciación de los ácidos nucleicos extracelulares pueden analizarse para detectar variantes somáticas en fase (es decir, variantes en fase, como se divulga en el presente documento) como indicación de secuencias de ácidos nucleicos tumorales circulantes (ADNtc o ARNtc) (es decir, secuencias que derivan de o proceden de ácidos nucleicos de una célula cancerosa). Por consiguiente, en algunos casos, el cáncer puede detectarse en el individuo extrayendo una biopsia líquida del individuo y secuenciando los ácidos nucleicos extracelulares derivados de esa biopsia líquida para detectar secuencias de ácidos nucleicos tumorales circulantes, y la presencia de secuencias de ácidos nucleicos tumorales circulantes puede indicar que el individuo tiene cáncer (p. ej., un tipo específico de cáncer). En algunos casos, se puede determinar y/o realizar una intervención clínica y/o un tratamiento en el individuo basándose en la detección del cáncer.
Como se divulga en el presente documento, la presencia de variantes somáticas en fase puede ser un fuerte indicio de que los ácidos nucleicos que contienen dichas variantes en fase proceden de una muestra corporal con una afección, tal como una célula cancerosa (o, como alternativa, que los ácidos nucleicos proceden de una muestra corporal obtenida o derivada de un sujeto con una afección, tal como cáncer). La detección de variantes somáticas en fase puede mejorar la relación señal-ruido de los métodos de detección de ácidos nucleicos extracelulares (p. ej., reduciendo o eliminando las señales falsas de "ruido"), ya que puede ser improbable que se produzcan mutaciones en fase dentro de una pequeña ventana genética que es aproximadamente del tamaño de una molécula típica de ácido nucleico extracelular (p. ej., aproximadamente 170 pb o menos).
En algunos aspectos, una serie de regiones genómicas pueden usarse como puntos calientes para la detección de variantes en fase, especialmente en diversos tipos de cáncer, p. ej., linfomas. En algunos casos, enzimas (p. ej., AID, Apobec3a) pueden mutagenizar de forma estereotípica el ADN en genes y ubicaciones específicas, lo que conduce al desarrollo de determinados tipos de cáncer. Por consiguiente, los ácidos nucleicos extracelulares derivados de dichas regiones genómicas activas pueden capturarse o dirigirse (p. ej., con o sin secuenciación profunda) para la detección y/o el seguimiento del cáncer. Como alternativa, puede realizarse secuenciación de captura o dirigida en regiones en las que se han detectado previamente variantes en fase de una fuente cancerosa (p. ej., tumor) de un individuo en particular con el fin de detectar cáncer en dicho individuo.
En algunos aspectos, puede realizarse secuenciación de captura en ácidos nucleicos extracelulares como diagnóstico de cribado. En algunos casos, se puede desarrollar y usar un diagnóstico de cribado para detectar ácidos nucleicos tumorales circulantes para cánceres que tienen regiones estereotipadas de variantes en fase. En algunos casos, la secuenciación de captura en ácidos nucleicos extracelulares se realiza como diagnóstico para detectar EMR o carga tumoral para determinar si una enfermedad en particular está presente durante o después del tratamiento. En algunos casos, puede realizarse secuenciación de captura en ácidos nucleicos extracelulares como diagnóstico para determinar la evolución (p. ej., avance o remisión) de un tratamiento.
En algunos aspectos, los resultados de la secuenciación de ácido nucleico extracelular pueden analizarse para detectar si existen variantes de un solo nucleótido (SNV) somáticas en fase u otras mutaciones o variantes (p. ej., indeles) dentro de la muestra de ácido nucleico extracelular. En algunos casos, la presencia de SNV somáticos particulares u otras variantes puede ser indicativa de secuencias de ácido nucleico tumorales circulantes y, por tanto, indicativa de un tumor presente en el sujeto. En algunos casos, pueden detectarse un mínimo de dos variantes en fase en una molécula de ácido nucleico extracelular. En algunos casos, pueden detectarse un mínimo de tres variantes en fase en una molécula de ácido nucleico extracelular. En algunos casos, pueden detectarse un mínimo de cuatro variantes en fase en una molécula de ácido nucleico extracelular. En algunos casos, pueden detectarse un mínimo de cinco o más variantes en fase en una molécula de ácido nucleico extracelular. En algunos casos, cuanto mayor sea el número de variantes en fase detectadas en una molécula de ácido nucleico extracelular, mayor es la probabilidad de que la molécula de ácido nucleico extracelular proceda de cáncer, a diferencia de detectar una secuencia inocua de variantes somáticas que surgen de la preparación molecular de la biblioteca de secuencias o de errores biológicos aleatorios. Por consiguiente, la probabilidad de detección de falsos positivos puede disminuir con la detección de más variantes en fase dentro de una molécula (p. ej., aumentando de este modo la especificidad de la detección).
En algunos aspectos, un resultado de secuenciación de ácido nucleico extracelular puede analizarse para detectar si existe una inserción o deleción de una o más nucleobases (es decir, indel) dentro de la muestra de ácido nucleico extracelular, p. ej., con respecto a una secuencia genómica de referencia. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, en algunos casos, la presencia de indeles en una molécula de ácido nucleico extracelular (p. ej., ADNec) puede ser indicativa de una afección de un sujeto, p. ej., una enfermedad tal como cáncer. En algunos casos, una variación genética como resultado de un indel puede tratarse como una variante o mutación y, de este modo, dos indeles pueden tratarse como dos variantes en fase, como se divulga en el presente documento. En algunos ejemplos, dentro de una molécula de ácido nucleico extracelular, una primera variación genética de un primer indel (una variante de primera fase) y una segunda variación genética de un segundo indel (una variante de segunda fase) pueden estar separadas entre sí por al menos 1 nucleótido.
Dentro de una única molécula de ácido nucleico extracelular (p. ej., una única molécula de ADNec), como se divulga en el presente documento, una primera variante en fase puede ser una SNV y una segunda variante en fase puede ser una parte de un polimorfismo de nucleótidos pequeño diferente, p. ej., otra SNV o una parte de una variante multinucleotídica (MNV). Una variante multinucleotídica puede ser un conjunto de dos o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5 o más) variantes adyacentes existentes dentro de la misma hebra de molécula de ácido nucleico. En algunos casos, la primera variante en fase y la segunda variante en fase pueden ser partes de la misma MNV dentro de la única molécula de ácido nucleico extracelular. En algunos casos, la primera variante en fase y la segunda variante en fase pueden ser de dos MNV diferentes dentro de la única molécula de ácido nucleico extracelular.
En algunos aspectos, puede utilizarse un método estadístico para calcular la probabilidad de que las variantes en fase detectadas procedan de un cáncer y no sean aleatorias o artificiales (p. ej., de un error de secuenciación o preparación de la muestra). En algunos casos, se puede utilizar un método de muestreo de Montecarlo para determinar la probabilidad de que las variantes en fase detectadas procedan de un cáncer y no sean aleatorias o artificiales.
Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan identificación o detección de ácidos nucleicos extracelulares (p. ej., molécula de ADNec) con una pluralidad de variantes en fase, p. ej., de una biopsia líquida de un sujeto. En algunos casos, una primera variante en fase de la pluralidad de variantes en fase y una segunda variante en fase de la pluralidad de variantes en fase pueden estar directamente adyacentes entre sí (p. ej., SNV vecinas). En algunos casos, una primera variante en fase de la pluralidad de variantes en fase y una segunda variante en fase de la pluralidad de variantes en fase pueden estar separadas por al menos un nucleótido. La separación entre la primera variante en fase y la segunda variante en fase puede estar limitada por la longitud de la molécula de ácido nucleico extracelular.
Dentro de una única molécula de ácido nucleico extracelular (p. ej., una única molécula de ADNec), como se divulga en el presente documento, una primera variante en fase y una segunda variante en fase pueden estar separadas entre sí por al menos o hasta aproximadamente 1 nucleótido, al menos o hasta aproximadamente 2 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 3 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 4 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 5 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 6 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 7 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 8 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 9 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 10 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 11 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 12 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 13 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 14 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 15 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 20 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 25 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 30 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 35 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 40 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 45 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 50 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 60 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 70 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 80 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 90 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 100 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 110 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 120 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 130 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 140 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 150 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 160 nucleótidos, al menos o hasta aproximadamente 170 nucleótidos o al menos o hasta aproximadamente 180 nucleótidos. Como alternativa, o adicionalmente, dentro de una única molécula de ácido nucleico extracelular, una primera variante en fase y una segunda variante en fase pueden no estar separadas, o no es necesario que lo estén, por uno o más nucleótidos y, por lo tanto, pueden estar directamente adyacentes entre sí.
Una única molécula de ácido nucleico extracelular (p. ej., una única molécula de ADNec), como se divulga en el presente documento, puede comprender al menos o hasta aproximadamente 2 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 3 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 4 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 5 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 6 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 7 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 8 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 9 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 10 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 12 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 12 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 13 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 14 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 15 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 20 variantes en fase o al menos o hasta aproximadamente 25 variantes en fase dentro de la misma molécula.
De una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares obtenidas (p. ej., de una biopsia líquida de un sujeto), pueden identificarse dos o más (p. ej., 10 o más, 1000 o más, 10000 o más) moléculas de ácido nucleico extracelulares que tienen un promedio de al menos o hasta aproximadamente 2 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 3 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 4 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 5 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 6 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 7 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 8 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 9 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 10 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 12 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 12 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 13 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 14 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 15 variantes en fase, al menos o hasta aproximadamente 20 variantes en fase o al menos o hasta aproximadamente 25 variantes en fase por cada molécula de ácido nucleico extracelular que se ha identificado que comprende una pluralidad de variantes en fase.
En algunos casos, puede obtenerse una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares (p. ej., moléculas de ADNec) a partir de una muestra biológica de un sujeto (p. ej., tumor sólido o biopsia líquida). De la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares, al menos o hasta 1, al menos o hasta 2, al menos o hasta 3, al menos o hasta 4, al menos o hasta 5, al menos o hasta 6, al menos o hasta 7, al menos o hasta 8, al menos o hasta 9, al menos o hasta 10, al menos o hasta 15, al menos o hasta 20, al menos o hasta 25, al menos o hasta 30, al menos o hasta 35, al menos o hasta 40, al menos o hasta 45, al menos o hasta 50, al menos o hasta 60, al menos o hasta 70, al menos o hasta 80, al menos o hasta 90, al menos o hasta 100, al menos o hasta 150, al menos o hasta 200, al menos o hasta 300, al menos o hasta 400, al menos o hasta 500, al menos o hasta 600, al menos o hasta 700, al menos o hasta 800, al menos o hasta 900, al menos o hasta 1000, al menos o hasta 5000, al menos o hasta 10000, al menos o hasta 50000 o al menos o hasta 100000 moléculas de ácido nucleico extracelulares pueden identificarse, de modo que cada molécula de ácido nucleico extracelular identificada comprenda la pluralidad de variantes en fase, como se divulga en el presente documento.
En algunos casos, puede obtenerse una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares (p. ej., moléculas de ADNec) a partir de una muestra biológica de un sujeto (p. ej., tumor sólido o biopsia líquida). De la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares, al menos o hasta 1, al menos o hasta 2, al menos o hasta 3, al menos o hasta 4, al menos o hasta 5, al menos o hasta 6, al menos o hasta 7, al menos o hasta 8, al menos o hasta 9, al menos o hasta 10, al menos o hasta 15, al menos o hasta 20, al menos o hasta 25, al menos o hasta 30, al menos o hasta 35, al menos o hasta 40, al menos o hasta 45, al menos o hasta 50, al menos o hasta 60, al menos o hasta 70, al menos o hasta 80, al menos o hasta 90, al menos o hasta 100, al menos o hasta 150, al menos o hasta 200, al menos o hasta 300, al menos o hasta 400, al menos o hasta 500, al menos o hasta 600, al menos o hasta 700, al menos o hasta 800, al menos o hasta 900 o al menos o hasta 1000 moléculas de ácido nucleico extracelulares pueden identificarse a partir de una región genómica diana (p. ej., un locus genómico diana), de modo que cada molécula de ácido nucleico extracelular identificada comprenda la pluralidad de variantes en fase, como se divulga en el presente documento.
LasFIG.1Ay1Eilustran esquemáticamente ejemplos de (i) una molécula de ADNec que comprende una SNV y (ii) otra molécula de ADNec que comprende una pluralidad de variantes en fase. Cada variante identificada dentro del ADNec puede indicar la presencia de una o más mutaciones genéticas en la célula de la que procede el ADNec. En realizaciones alternativas, uno o más de las variantes en fase pueden ser una inserción o deleción (indel) en lugar de una SNV.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para determinar una afección de un sujeto, como se muestra en el diagrama de flujo 2510 de laFIG.25A.El método puede comprender (a) obtener, mediante un sistema informático, datos de secuenciación derivados de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtiene o deriva del sujeto (proceso 2512). El método puede comprender además (b) procesar, mediante el sistema informático, los datos de secuenciación para identificar una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares, en donde cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas comprende una pluralidad de variantes en fase con respecto a una secuencia genómica de referencia (proceso 2514). En algunos casos, al menos una parte de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares puede comprender una primera variante en fase de la pluralidad de variantes en fase y una segunda variante en fase de la pluralidad de variantes en fase que están separadas por al menos un nucleótido, como se divulga en el presente documento. El método puede comprender opcionalmente (c) analizar, mediante el sistema informático, al menos una parte de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas para determinar la afección del sujeto (proceso 2516).
En algunos casos, al menos o hasta aproximadamente el 5 %, al menos o hasta aproximadamente el 10 %, al menos o hasta aproximadamente el 15 %, al menos o hasta aproximadamente el 20 %, al menos o hasta aproximadamente el 25 %, al menos o hasta aproximadamente el 30 %, al menos o hasta aproximadamente el 35 %, al menos o hasta aproximadamente el 40 %, al menos o hasta aproximadamente el 45 %, al menos o hasta aproximadamente el 50 %, al menos o hasta aproximadamente el 60 %, al menos o hasta aproximadamente el 70 %, al menos o hasta aproximadamente el 80 %, al menos o hasta aproximadamente el 90 %, al menos o hasta aproximadamente el 95 %, al menos o hasta aproximadamente el 99 % y/o aproximadamente el 100 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares puede comprender una primera variante en fase de la pluralidad de variantes en fase y una segunda variante en fase de la pluralidad de variantes en fase que están separadas por al menos un nucleótido, como se divulga en el presente documento. En algunos ejemplos, una pluralidad de variantes en fase dentro de una única molécula de ADNec puede comprender (i) una primera pluralidad de variantes en fase que están separadas por al menos un nucleótido entre sí y (ii) una segunda pluralidad de variantes en fase que son adyacentes entre sí (p. ej., dos variantes en fase dentro de una MNV). En algunos ejemplos, una pluralidad de variantes en fase dentro de una única molécula de ADNec puede consistir en variantes en fase separadas entre sí por al menos un nucleótido.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para determinar una afección del sujeto, como se muestra en el diagrama de flujo 2520 de laFIG.25B.El método puede comprender (a) obtener, mediante un sistema informático, datos de secuenciación derivados de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtiene o deriva de un sujeto (proceso 2522). El método puede comprender además (b) procesar, mediante el sistema informático, los datos de secuenciación para identificar una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares, en donde cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende una pluralidad de variantes en fase con respecto a una secuencia genómica de referencia (proceso 2524). En algunos casos, una primera variante en fase de la pluralidad de variantes en fase y una segunda variante en fase de la pluralidad de variantes en fase pueden estar separadas por al menos un nucleótido, como se divulga en el presente documento. El método puede comprender opcionalmente (c) analizar, mediante el sistema informático, al menos una parte de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas para determinar la afección del sujeto (proceso 2526).
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para determinar una afección de un sujeto, como se muestra en el diagrama de flujo 2530 de laFIG.25C.El método puede comprender (a) obtener datos de secuenciación derivados de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtiene o deriva del sujeto (proceso 2532). El método puede comprender además (b) procesar los datos de secuenciación para identificar una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares con un LOD inferior a aproximadamente 1 de 50000 observaciones (o moléculas de ácido nucleico extracelulares) a partir de los datos de secuenciación (proceso 2534). En algunos casos, cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende una pluralidad de variantes en fase en relación con una secuencia genómica de referencia. El método puede comprender opcionalmente (c) analizar al menos una parte de las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas para determinar la afección del sujeto (proceso 2536).
En algunos casos, el LOD de la operación de identificación de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares, como se divulga en el presente documento, puede ser inferior a aproximadamente 1 de cada 60000, inferior a 1 de cada 70000, inferior a 10 de cada 80000, inferior a 1 de cada 90000, inferior a 1 de cada 100000, inferior a 1 de cada 150000, inferior a 1 de cada 200000, inferior a 1 de cada 300000, inferior a 1 de cada 400000, inferior a 1 de cada 500000, inferior a 1 de cada 600000, inferior a 1 de cada 700000, inferior a 1 de cada 800000, inferior a 1 de cada 900000, inferior a 1 de cada 1000000, inferior a 1 de cada 1000000, inferior a 1 de cada 1100000, inferior a 1 de cada 1200000, inferior a 1 de cada 1300000, inferior a 1 de cada 1400000, inferior a 1 de cada 1500000 o inferior a 1 de cada 2000000 de observaciones de los datos de secuenciación.
En algunos casos, al menos una molécula de ácidos nucleico extracelular de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas puede comprender una primera variante en fase de la pluralidad de variantes en fase y una segunda variante en fase de la pluralidad de variantes en fase que están separadas por al menos un nucleótido, como se divulga en el presente documento.
En algunos casos, una o más de las operaciones (a) a (c) del método en cuestión pueden ser realizadas por un sistema informático. En un ejemplo, todas las operaciones (a) a (c) del método en cuestión pueden ser realizadas por el sistema informático.
Los datos de secuenciación, como se divulgan en el presente documento, pueden obtenerse a partir de uno o más métodos de secuenciación. Un método de secuenciación puede ser un método de secuenciación de primera generación (p. ej., secuenciación de Maxam-Gilbert, secuenciación de Sanger). Un método de secuenciación puede ser un método de secuenciación de alto rendimiento, tal como la secuenciación de nueva generación (SNG) (p. ej., secuenciación por síntesis). Un método de secuenciación de alto rendimiento puede secuenciar simultáneamente (o de forma sustancialmente simultánea) al menos aproximadamente 10000, al menos aproximadamente 100000, al menos aproximadamente 1 millón, al menos aproximadamente 10 millones, al menos aproximadamente 100 millones, al menos aproximadamente 1000 millones o más moléculas polinucleotídicas (es decir, moléculas de ácido nucleico extracelulares o derivados de las mismas). La SNG puede ser cualquier número de generación de tecnologías de secuenciación (p. ej., tecnologías de secuenciación de segunda generación, tecnologías de secuenciación de tercera generación, tecnologías de secuenciación de cuarta generación, etc.). Entre los ejemplos no limitativos de métodos de secuenciación de alto rendimiento se incluye la secuenciación masiva de firmas en paralelo, secuenciación por colonia de polimerasa, pirosecuenciación, secuenciación por síntesis, síntesis combinatoria de anclaje y sonda (cPAS), secuenciación por ligamiento (p. ej., secuenciación por ligamiento y detección de oligonucleótidos (SOLiD)), secuenciación por semiconductores (p. ej., secuenciación por semiconductores Ion Torrent), secuenciación por nanobolas de ADN y secuenciación de moléculas individuales, secuenciación por hibridación.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, los datos de secuenciación pueden obtenerse basándose en cualquiera de los métodos de secuenciación divulgados que utilizan la amplificación de ácido nucleico (p. ej., la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). Los ejemplos no limitativos de tales métodos de secuenciación pueden incluir la pirosecuenciación 454, secuenciación por colonia de polimerasa y secuenciación SoLiD. En algunos casos, los amplicones (p. ej., derivados de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtiene o deriva del sujeto, como se divulga en el presente documento) que corresponden a una región genómica de interés (p. ej., una región genómica asociada a una enfermedad) pueden generarse mediante PCR, opcionalmente agruparse, y posteriormente secuenciarse para generar datos de secuenciación. En algunos ejemplos, debido a que las regiones de interés se amplifican en amplicones mediante PCR antes de secuenciarse, la muestra de ácido nucleico ya está enriquecida con respecto a la región de interés y, por lo tanto, puede que no sea necesaria ninguna mezcla adicional (p. ej., hibridación) antes de la secuenciación (p. ej., SNG no basada en hibridación). Como alternativa, puede realizarse adicionalmente un agrupamiento mediante hibridación para un enriquecimiento adicional antes de la secuenciación. Como alternativa, los datos de secuenciación pueden obtenerse sin generar copias de PCR, p. ej., mediante secuenciación cPAS.
Varias realizaciones utilizan técnicas de hibridación de captura para realizar secuenciación dirigida. Al realizar la secuenciación en ácidos nucleicos extracelulares, para mejorar la resolución en locus genómicos particulares, los productos de la biblioteca pueden capturarse mediante hibridación antes de la secuenciación. La hibridación de captura puede ser particularmente útil cuando se trata de detectar variantes raras y/o somáticas en fase de una muestra en locus genómicos particulares. En algunas situaciones, la detección de variantes raras y/o somáticas en fase es indicativa del origen de los ácidos nucleicos, incluyendo ácidos nucleicos procedentes de una fuente de cáncer. Por consiguiente, la hibridación por captura es una herramienta que puede mejorar la detección de ácidos nucleicos tumorales circulantes dentro de ácidos nucleicos extracelulares.
Diversos tipos de cáncer experimentan repetidamente hipermutaciones somáticas aberrantes en locus genómicos particulares. Por ejemplo, la enzima desaminasa inducida por activación induce hipermutación somática aberrante en linfocitos B, que da lugar a diversos linfomas de linfocitos B, incluyendo, aunque no de forma limitativa, linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular (LF), linfoma de Burkitt (LB) y leucemia linfocítica crónica (LLC) de linfocitos B. Por consiguiente, en numerosas realizaciones, las sondas están diseñadas para detectar (o capturar) locus genómicos conocidos por experimentar hipermutación somática aberrante en un linfoma. LaFIG.1Dy latabla 1describen una serie de regiones que experimentan hipermutación somática aberrante en LDLBG, LF, LB y CLL. En latabla 6se proporciona una lista de sondas de ácido nucleico que pueden utilizarse para extraer (o capturar) locus genómicos para detectar hipermutaciones somáticas aberrantes en cánceres de linfocitos B.
La secuenciación de captura también puede realizarse utilizando sondas de ácido nucleico personalizadas diseñadas para detectar la existencia del cáncer de un individuo. Una persona que tiene un cáncer puede someterse a una biopsia y a una secuenciación para detectar variantes somáticas de fase que se hayan acumulado en el cáncer. En función del resultado de la secuenciación, de acuerdo con una serie de realizaciones, se diseñan y sintetizan sondas de ácido nucleico capaces de extraer los locus genómicos, incluidas las posiciones de las variantes en fase. Estas sondas de ácido nucleico diseñadas y sintetizadas de forma personalizada pueden utilizarse para detectar ácidos nucleicos tumorales circulantes desde una biopsia líquida de ese individuo. Por consiguiente, las sondas de ácido nucleico personalizadas pueden ser útiles para determinar la respuesta al tratamiento y/o detectar la ERM después del tratamiento.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, los datos de secuenciación pueden obtenerse basándose en cualquier método de secuenciación que utilice adaptadores. Las muestras de ácido nucleico (p. ej., la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares procedentes del sujeto, como se divulga en el presente documento) pueden conjugarse con uno o más adaptadores (o secuencias adaptadoras) para reconocer (p. ej., mediante hibridación) la muestra o cualquier derivado de la misma (p. ej., amplicones). En algunos ejemplos, las muestras de ácido nucleico pueden marcarse con un código de barras molecular, p. ej., de modo que cada molécula de ácido nucleico extracelular de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares pueda tener un código de barras único. Como alternativa, o adicionalmente, las muestras de ácido nucleico pueden marcarse con un código de barras de muestra, p. ej., de modo que la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares del sujeto (p. ej., una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares obtenidas de un tejido corporal específico del sujeto) pueden tener el mismo código de barras.
En realizaciones alternativas, los métodos de identificación de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase, como se divulgan en el presente documento, pueden realizarse sin código de barras molecular, sin código de barras de la muestra o sin código de barras molecular ni código de barras de la muestra, al menos en parte debido a la alta especificidad y el bajo LOD conseguidos al basarse en la identificación de las variantes en fase en contraposición a, p. ej., una única SNV.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, los datos de secuenciación pueden obtenerse y analizarse sin eliminar o suprimir por ordenador (i) el error de fondo y/o (ii) el error de secuenciación, al menos en parte debido a la alta especificidad y el bajo LOD conseguidos al basarse en la identificación de las variantes en fase en contraposición a, p. ej., una única SNV o indel.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el uso de la pluralidad de variantes como condición para identificar moléculas de ácido nucleico extracelulares diana con mutaciones específicas de interés sin métodos informáticos de supresión de errores puede producir una tasa de error de fondo inferior a la de (i) la desduplicación por código de barras, (ii) supresión digital de errores integrada o (iii) secuenciación bicatenaria al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, al menos aproximadamente 90 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 400 veces, al menos aproximadamente 600 veces, al menos aproximadamente 800 veces o al menos aproximadamente 1000 veces. Este enfoque puede aumentar ventajosamente la relación señal-ruido (incrementando de este modo la sensibilidad y/o especificidad) de la identificación de moléculas de ácido nucleico extracelulares diana con mutaciones específicas de interés.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el aumento de un número mínimo de variantes en fase (p. ej., el aumento de al menos dos variantes en fase a al menos tres variantes en fase) por molécula de ácido nucleico extracelular necesario como condición para identificar moléculas de ácido nucleico extracelulares diana con mutaciones específicas de interés puede reducir la tasa de error de fondo en al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, al menos aproximadamente 90 veces o al menos aproximadamente 100 veces. Este enfoque puede aumentar ventajosamente la relación señal-ruido (incrementando de este modo la sensibilidad y/o especificidad) de la identificación de moléculas de ácido nucleico extracelulares diana con mutaciones específicas de interés.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar una afección de un sujeto, como se muestra en el diagrama de flujo 2540 de laFIG.25D.El método puede comprender (a) identificar al sujeto para el tratamiento de la afección, en donde se ha determinado que el sujeto tiene la afección basándose en la identificación de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtiene o deriva del sujeto (proceso 2542). Cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas puede comprender una pluralidad de variantes en fase en relación con una secuencia genómica de referencia. Al menos una parte (p. ej., parcial o la totalidad) de la pluralidad de variantes en fase puede estar separada por al menos un nucleótido, de modo que una primera variante en fase de la pluralidad de variantes en fase y una segunda variante en fase de la pluralidad de variantes en fase están separadas por al menos un nucleótido, como se divulga en el presente documento. En algunos casos, la presencia de la pluralidad de variantes en fase es indicativa de la afección (p. ej., una enfermedad, tal como el cáncer) del sujeto. El método puede comprender además (b) someter al sujeto al tratamiento basado en la etapa (a) (proceso 2544). Se divulgan ejemplos de dicho tratamiento de la afección del sujeto en otra parte de la presente divulgación.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para controlar la evolución (es decir, el avance o la remisión) de una afección de un sujeto, como se muestra en el diagrama de flujo 2550 de laFIG. 25E.El método puede comprender (a) determinar un primer estado de la afección del sujeto basándose en la identificación de un primer conjunto de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares a partir de una primera pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtiene o deriva del sujeto (proceso 2552). El método puede comprender además (b) determinar un segundo estado de la afección del sujeto basándose en la identificación de un segundo conjunto de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares a partir de una segunda pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtiene o deriva del sujeto (proceso 2554). La segunda pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares puede obtenerse del sujeto después de obtener la primera pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares del sujeto. El método puede comprender opcionalmente (c) determinar la evolución (p. ej., el avance o la remisión) de la afección basándose al menos en parte en el primer estado de la afección y el segundo estado de la afección (proceso 2556). En algunos casos, cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas (p. ej., cada una del primer conjunto de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, cada una del segundo conjunto de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas) puede comprender una pluralidad de variantes en fase en relación con una secuencia genómica de referencia. Al menos una parte (p. ej., parcial o la totalidad) de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas pueden estar separadas por al menos un nucleótido, como se divulga en el presente documento. En algunos casos, la presencia de la pluralidad de variantes en fase puede ser indicativa de un estado de la afección del sujeto
En algunos casos, la primera pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares del sujeto puede obtenerse (p. ej., mediante biopsia de sangre) y analizarse para determinar (p. ej., diagnosticar) un primer estado de la afección (p. ej., una enfermedad, tal como el cáncer) del sujeto. La primera pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares puede analizarse mediante cualquiera de los métodos divulgados en el presente documento (p. ej., con o sin secuenciación) para identificar el primer conjunto de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprende la pluralidad de variantes en fase, y la presencia o características del primer conjunto de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares puede utilizarse para determinar el primer estado de la afección (p. ej., un diagnóstico inicial) del sujeto. En función del primer estado determinado de la afección, el sujeto puede someterse a uno o más tratamientos (p. ej., quimioterapia) como se divulga en el presente documento. Después de uno o más tratamientos, puede obtenerse la segunda pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares del sujeto.
En algunos casos, el sujeto puede someterse a al menos o hasta aproximadamente 1 tratamiento, al menos o hasta aproximadamente 2 tratamientos, al menos o hasta aproximadamente 3 tratamientos, al menos o hasta aproximadamente 4 tratamientos, al menos o hasta aproximadamente 5 tratamientos, al menos o hasta aproximadamente 6 tratamientos, al menos o hasta aproximadamente 7 tratamientos, al menos o hasta aproximadamente 8 tratamientos, al menos o hasta aproximadamente 9 tratamientos o al menos o hasta aproximadamente 10 tratamientos basándose en el primer estado determinado de la afección. En algunos casos, el sujeto puede someterse a una pluralidad de tratamientos basándose en el primer estado determinado de la afección, y un primer tratamiento de la pluralidad de tratamientos y un segundo tratamiento de la pluralidad de tratamientos pueden estar separados por al menos o hasta aproximadamente 1 día, al menos o hasta aproximadamente 7 días, al menos o hasta aproximadamente 2 semanas, al menos o hasta aproximadamente 3 semanas, al menos o hasta aproximadamente 4 semanas, al menos o hasta aproximadamente 2 meses, al menos o hasta aproximadamente 3 meses, al menos o hasta aproximadamente 4 meses, al menos o hasta aproximadamente 5 meses, al menos o hasta aproximadamente 6 meses, al menos o hasta aproximadamente 12 meses, al menos o hasta aproximadamente 2 años, al menos o hasta aproximadamente 3 años, al menos o hasta aproximadamente 4 años, al menos o hasta aproximadamente 5 años o al menos o hasta aproximadamente 10 años. La pluralidad de tratamientos para el sujeto puede ser la misma. Como alternativa, la pluralidad de tratamientos puede ser diferente según el tipo de fármaco (p. ej., diferentes fármacos quimioterápicos), la dosis del fármaco (p. ej., aumento de la dosis, disminución de la dosis), presencia o ausencia de un agente coterapéutico (p. ej., quimioterapia e inmunoterapia), modos de administración (p. ej., intravenosa frente a oral), frecuencia de administración (p. ej., diaria, semanal, mensual), etc.
En algunos casos, el sujeto no puede ni necesita ser tratado para la afección entre la determinación del primer estado de la afección y la determinación del segundo estado de la afección. Por ejemplo, sin ningún tratamiento intermedio, puede contenerse la segunda pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares (p. ej., mediante biopsia líquida) del sujeto para confirmar si el sujeto aún presenta indicios del primer estado de la afección.
En algunos casos, la segunda pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares del sujeto puede obtenerse (p. ej., mediante biopsia de sangre) al menos o hasta aproximadamente 1 día, al menos o hasta aproximadamente 7 días, al menos o hasta aproximadamente 2 semanas, al menos o hasta aproximadamente 3 semanas, al menos o hasta aproximadamente 4 semanas, al menos o hasta aproximadamente 2 meses, al menos o hasta aproximadamente 3 meses, al menos o hasta aproximadamente 4 meses, al menos o hasta aproximadamente 5 meses, al menos o hasta aproximadamente 6 meses, al menos o hasta aproximadamente 12 meses, al menos o hasta aproximadamente 2 años, al menos o hasta aproximadamente 3 años, al menos o hasta aproximadamente 4 años, al menos o hasta aproximadamente 5 años o al menos o hasta aproximadamente 10 años después de obtener la primera pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares del sujeto.
En algunos casos, al menos o hasta aproximadamente 2, al menos o hasta aproximadamente 3, al menos o hasta aproximadamente 4, al menos o hasta aproximadamente 5, al menos o hasta aproximadamente 6, al menos o hasta aproximadamente 7, al menos o hasta aproximadamente 8, al menos o hasta aproximadamente 9 o al menos o hasta aproximadamente 10 muestras diferentes que comprenden una pluralidad de moléculas de ácido nucleico (p. ej., al menos la primera pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares y la segunda pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares) pueden obtenerse a lo largo del tiempo (p. ej., una vez al mes durante 6 meses, una vez cada dos meses durante un año, una vez cada tres meses durante un año, una vez cada 6 meses durante uno o más años, etc.) para controlar la evolución de la afección del sujeto, como se divulga en el presente documento.
En algunos casos, la etapa de determinar la evolución de la afección basándose en el primer estado de la afección y el segundo estado de la afección puede comprender comparar una o más características del primer estado y el segundo estado de la afección, tales como, por ejemplo, (i) un número total de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase en cada estado (p. ej., por igual peso o volumen de la muestra biológica de origen, por igual número de moléculas de ácido nucleico extracelulares iniciales analizadas, etc.), (ii) un número promedio de la pluralidad de variantes en fase por cada molécula de ácido nucleico extracelular que se ha identificado que comprenden una pluralidad de variantes en fase (es decir, dos o más variantes en fase), o (iii) un número de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase dividido por un número total de moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden una mutación que se solapa con alguna de la pluralidad de variantes en fase (es decir, frecuencia alélica de variantes en fase). Basándose en dicha comparación, se puede determinar la EMR de la enfermedad (p. ej., cáncer o tumor) del sujeto. Por ejemplo, se puede determinar la carga tumoral o de cáncer del sujeto basándose en dicha comparación.
En algunos casos, la evolución de la afección puede ser el avance o empeoramiento de la afección. En un ejemplo, el empeoramiento de la enfermedad puede comprender el desarrollo de un cáncer desde una fase anterior a una fase posterior, tal como de un cáncer en estadio I a un cáncer en estadio III. En otro ejemplo, el empeoramiento de la afección puede comprender el aumento de tamaño (p. ej., volumen) de un tumor sólido. Sin embargo, en un ejemplo diferente, el empeoramiento de la afección puede comprender la metástasis del cáncer desde una ubicación a otra dentro del cuerpo del sujeto.
En algunos ejemplos, (i) un número total de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase del segundo estado de la afección del sujeto puede ser superior a (ii) un número total de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase del primer estado de la afección del sujeto en al menos o hasta aproximadamente 0,1 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,2 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,3 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,4 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,5 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,6 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,7 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,8 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,9 veces, al menos o hasta aproximadamente 1 veces, al menos o hasta aproximadamente 2 veces, al menos o hasta aproximadamente 3 veces, al menos o hasta aproximadamente 4 veces, al menos o hasta aproximadamente 5 veces, al menos o hasta aproximadamente 6 veces, al menos o hasta aproximadamente 7 veces, al menos o hasta aproximadamente 8 veces, al menos o hasta aproximadamente 9 veces, al menos o hasta aproximadamente 10 veces, al menos o hasta aproximadamente 15 veces, al menos o hasta aproximadamente 20 veces, al menos o hasta aproximadamente 30 veces, al menos o hasta aproximadamente 40 veces, al menos o hasta aproximadamente 50 veces, al menos o hasta aproximadamente 60 veces, al menos o hasta aproximadamente 70 veces, al menos o hasta aproximadamente 80 veces, al menos o hasta aproximadamente 90 veces, al menos o hasta aproximadamente 100 veces, al menos o hasta aproximadamente 200 veces, al menos o hasta aproximadamente 300 veces, al menos o hasta aproximadamente 400 veces o al menos o hasta aproximadamente 500 veces.
En algunos ejemplos, (i) un número medio de la pluralidad de variantes en fase por cada molécula de ácido nucleico extracelular que se ha identificado que comprenden una pluralidad de variantes en fase del segundo estado de la afección del sujeto puede ser superior a (ii) un número promedio de la pluralidad de variantes en fase por cada molécula de ácido nucleico extracelular que se ha identificado que comprenden una pluralidad de variantes en fase del primer estado de la afección del sujeto en al menos o hasta aproximadamente 0,1 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,2 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,3 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,4 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,5 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,6 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,7 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,8 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,9 veces, al menos o hasta aproximadamente 1 veces, al menos o hasta aproximadamente 2 veces, al menos o hasta aproximadamente 3 veces, al menos o hasta aproximadamente 4 veces, al menos o hasta aproximadamente 5 veces, al menos o hasta aproximadamente 6 veces, al menos o hasta aproximadamente 7 veces, al menos o hasta aproximadamente 8 veces, al menos o hasta aproximadamente 9 veces, al menos o hasta aproximadamente 10 veces, al menos o hasta aproximadamente 15 veces, al menos o hasta aproximadamente 20 veces, al menos o hasta aproximadamente 30 veces, al menos o hasta aproximadamente 40 veces, al menos o hasta aproximadamente 50 veces, al menos o hasta aproximadamente 60 veces, al menos o hasta aproximadamente 70 veces, al menos o hasta aproximadamente 80 veces, al menos o hasta aproximadamente 90 veces, al menos o hasta aproximadamente 100 veces, al menos o hasta aproximadamente 200 veces, al menos o hasta aproximadamente 300 veces, al menos o hasta aproximadamente 400 veces o al menos o hasta aproximadamente 500 veces.
En algunos casos, la evolución de la afección puede ser una remisión o al menos una remisión parcial de la afección. En un ejemplo, la remisión al menos parcial de la afección puede comprender la reducción de un cáncer de un estado avanzado a un estadio anterior, tal como de un cáncer en estadio IV a un cáncer en estadio II. Como alternativa, la remisión al menos parcial de la afección puede ser la remisión completa del cáncer. En otro ejemplo, la remisión al menos parcial de la afección puede comprender la disminución del tamaño (p. ej., del volumen) de un tumor sólido.
En algunos ejemplos, (i) un número total de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase del segundo estado de la afección del sujeto puede ser inferior a (ii) un número total de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase del primer estado de la afección del sujeto en al menos o hasta aproximadamente 0,1 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,2 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,3 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,4 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,5 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,6 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,7 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,8 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,9 veces, al menos o hasta aproximadamente 1 veces, al menos o hasta aproximadamente 2 veces, al menos o hasta aproximadamente 3 veces, al menos o hasta aproximadamente 4 veces, al menos o hasta aproximadamente 5 veces, al menos o hasta aproximadamente 6 veces, al menos o hasta aproximadamente 7 veces, al menos o hasta aproximadamente 8 veces, al menos o hasta aproximadamente 9 veces, al menos o hasta aproximadamente 10 veces, al menos o hasta aproximadamente 15 veces, al menos o hasta aproximadamente 20 veces, al menos o hasta aproximadamente 30 veces, al menos o hasta aproximadamente 40 veces, al menos o hasta aproximadamente 50 veces, al menos o hasta aproximadamente 60 veces, al menos o hasta aproximadamente 70 veces, al menos o hasta aproximadamente 80 veces, al menos o hasta aproximadamente 90 veces, al menos o hasta aproximadamente 100 veces, al menos o hasta aproximadamente 200 veces, al menos o hasta aproximadamente 300 veces, al menos o hasta aproximadamente 400 veces o al menos o hasta aproximadamente 500 veces.
En algunos ejemplos, (i) un número medio de la pluralidad de variantes en fase por cada molécula de ácido nucleico extracelular que se ha identificado que comprenden una pluralidad de variantes en fase del segundo estado de la afección del sujeto puede ser inferior a (ii) un número promedio de la pluralidad de variantes en fase por cada molécula de ácido nucleico extracelular que se ha identificado que comprenden una pluralidad de variantes en fase del primer estado de la afección del sujeto en al menos o hasta aproximadamente 0,1 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,2 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,3 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,4 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,5 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,6 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,7 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,8 veces, al menos o hasta aproximadamente 0,9 veces, al menos o hasta aproximadamente 1 veces, al menos o hasta aproximadamente 2 veces, al menos o hasta aproximadamente 3 veces, al menos o hasta aproximadamente 4 veces, al menos o hasta aproximadamente 5 veces, al menos o hasta aproximadamente 6 veces, al menos o hasta aproximadamente 7 veces, al menos o hasta aproximadamente 8 veces, al menos o hasta aproximadamente 9 veces, al menos o hasta aproximadamente 10 veces, al menos o hasta aproximadamente 15 veces, al menos o hasta aproximadamente 20 veces, al menos o hasta aproximadamente 30 veces, al menos o hasta aproximadamente 40 veces, al menos o hasta aproximadamente 50 veces, al menos o hasta aproximadamente 60 veces, al menos o hasta aproximadamente 70 veces, al menos o hasta aproximadamente 80 veces, al menos o hasta aproximadamente 90 veces, al menos o hasta aproximadamente 100 veces, al menos o hasta aproximadamente 200 veces, al menos o hasta aproximadamente 300 veces, al menos o hasta aproximadamente 400 veces o al menos o hasta aproximadamente 500 veces.
En algunos casos, la evolución de la afección puede seguir siendo sustancialmente igual entre los dos estados de la afección del sujeto. En algunos ejemplos, (i) un número total de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase del segundo estado de la afección del sujeto puede ser aproximadamente igual a (ii) un número total de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase del primer estado de la afección del sujeto. En algunos ejemplos, (i) un número medio de la pluralidad de variantes en fase por cada molécula de ácido nucleico extracelular que se ha identificado que comprenden una pluralidad de variantes en fase del segundo estado de la afección del sujeto puede ser aproximadamente igual a (ii) un número promedio de la pluralidad de variantes en fase por cada molécula de ácido nucleico extracelular que se ha identificado que comprenden una pluralidad de variantes en fase del primer estado de la afección del sujeto.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden identificarse a partir de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares mediante uno o más métodos de secuenciación. Como alternativa, o adicionalmente, la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden identificarse mediante extracción desde (o captura de entre) la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares con un conjunto de sondas de ácido nucleico. El método de extracción (o de captura) a través del conjunto de sondas de ácido nucleico puede ser suficiente para identificar la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares de interés sin secuenciar. En algunos casos, el conjunto de sondas de ácido nucleico puede configurarse para hibridar con al menos una parte de moléculas de ácido nucleico extracelulares (es decir, ADNec) de una o más regiones genómicas asociadas con la afección del sujeto. Por ello, la presencia de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares que han sido extraídas por el conjunto de sondas de ácido nucleico puede ser una indicación de que la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares proceden de la afección (p. ej., ADNtc o ARNtc). Se divulgan detalles adicionales del conjunto de sondas nucleicas en otra parte de la presente divulgación.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, basándose en los datos de secuenciación derivados de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares (p. ej., ADNec) que se obtienen o derivan del sujeto, (i) pueden separarse la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase, por ordenador, desde (ii) otra u otras moléculas de ácido nucleico extracelulares que no se ha identificado que comprendan la pluralidad de variantes en fase (o una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares que no comprendan la pluralidad de variantes en fase). En algunos casos, el método puede comprender además generar un dato adicional que comprenda información de secuenciación de solo (i) la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase. En algunos casos, el método puede comprender además generar un dato diferente que comprenda información de secuenciación de solo (ii) la otra u otras moléculas de ácido nucleico extracelulares que no se haya identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase (o la otra u otras moléculas de ácido nucleico extracelulares que no comprenden la pluralidad de variantes en fase).
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para determinar una afección del sujeto, como se muestra en el diagrama de flujo 2560 de laFIG.25F.El método puede comprender (a) proporcionar una mezcla que comprenda (1) un conjunto de sondas de ácido nucleico y (2) una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares obtenidas o derivadas del sujeto (proceso 2562). En algunos casos, una sonda de ácido nucleico individual del conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse para hibridar con una molécula diana de ácido nucleico extracelular que comprende una pluralidad de variantes en fase con respecto a una secuencia genómica de referencia que están separadas por al menos un nucleótido. Por ello, una primera variante en fase de la pluralidad de variantes en fase y una segunda variante en fase de la pluralidad de variantes en fase pueden estar separadas por al menos un nucleótido, como se divulga en el presente documento. En algunos casos, la sonda de ácido nucleico individual puede comprender un agente indicador activable. El agente indicador activable puede activarse mediante una de las dos acciones siguientes: (i) hibridación de la sonda de ácido nucleico individual con la pluralidad de variantes en fase y (ii) deshibridación de al menos una parte de la sonda de ácido nucleico individual que se ha hibridado con la pluralidad de variantes en fase. El método puede comprender además (b) detectar el agente indicador activado, para identificar una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares (proceso 2564). Cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares puede comprender la pluralidad de variantes en fase. El método puede comprender opcionalmente (c) analizar al menos una parte de las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas para determinar la afección del sujeto (proceso 2566).
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para determinar una afección del sujeto, como se muestra en el diagrama de flujo 2570 de laFIG.25G.El método puede comprender (a) proporcionar una mezcla que comprenda (1) un conjunto de sondas de ácido nucleico y (2) una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares obtenidas o derivadas del sujeto (proceso 2572). En algunos casos, una sonda de ácido nucleico individual del conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse para hibridar con una molécula diana de ácido nucleico extracelular que comprende una pluralidad de variantes en fase con respecto a una secuencia genómica de referencia. En algunos casos, la sonda de ácido nucleico individual puede comprender un agente indicador activable. El agente indicador activable puede activarse mediante una de las dos acciones siguientes: (i) hibridación de la sonda de ácido nucleico individual con la pluralidad de variantes en fase y (ii) deshibridación de al menos una parte de la sonda de ácido nucleico individual que se ha hibridado con la pluralidad de variantes en fase. El método puede comprender además (b) detectar el agente indicador activado, para identificar una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares (proceso 2574). Cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares puede comprender la pluralidad de variantes en fase, y un LOD de la etapa de identificación puede ser inferior a aproximadamente 1 de cada 50000 moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares, como se divulga en el presente documento. El método puede comprender opcionalmente (c) analizar al menos una parte de las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas para determinar la afección del sujeto (proceso 2576).
En algunos casos, una primera variante en fase de la pluralidad de variantes en fase y una segunda variante en fase de la pluralidad de variantes en fase están separadas por al menos un nucleótido, como se divulga en el presente documento.
En algunos casos, el LOD de la etapa de identificación de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares, como se divulga en el presente documento, puede ser inferior a aproximadamente 1 de cada 60000, inferior a 1 de cada 70000, inferior a 10 de cada 80000, inferior a 1 de cada 90000, inferior a 1 de cada 100000, inferior a 1 de cada 150000, inferior a 1 de cada 200000, inferior a 1 de cada 300000, inferior a 1 de cada 400000, inferior a 1 de cada 500000, inferior a 1 de cada 600000, inferior a 1 de cada 700000, inferior a 1 de cada 800000, inferior a 1 de cada 900000, inferior a 1 de cada 1000000, inferior a 1 de cada 1000000, inferior a 1 de cada 1100000, inferior a 1 de cada 1200000, inferior a 1 de cada 1300000, inferior a 1 de cada 1400000, inferior a 1 de cada 1500000, inferior a 1 de cada 2000000, inferior a 1 de cada 2500000, inferior a 1 de cada 3000000, inferior a 1 de cada 4000000 o inferior a 1 de cada 5000000 de moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares. En general, un método de detección con un LOD inferior tiene una mayor sensibilidad de dicha detección.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el método puede comprender además mezclar (1) el conjunto de sondas de ácido nucleico y (2) la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el agente indicador activable de una sonda de ácido nucleico puede activarse tras la hibridación de la sonda de ácido nucleico individual con la pluralidad de variantes en fase. Los ejemplos no limitativos de dicha sonda de ácido nucleico pueden incluir una baliza molecular, sonda eclipse, sonda amplifluor, cebador de PCR scorpions y cebador fluorogénico de PCR light upon extension (cebador LUX).
Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede ser una baliza molecular, como se muestra en laFIG.26A. La baliza molecular puede ser una sonda oligonucleotídica marcada con fluorescencia (p. ej., marcada con colorante) que comprende complementariedad con una molécula diana de ácido nucleico extracelular 2603 en una región que comprende la pluralidad de variantes en fase. La baliza molecular puede tener una longitud de entre aproximadamente 25 nucleótidos y aproximadamente 50 nucleótidos. La baliza molecular también puede diseñarse para que sea parcialmente autocomplementaria, de modo que forme una estructura en horquilla con un tallo 2601a y un bucle 2601b. Los extremos 5' y 3' de la sonda de baliza molecular pueden tener secuencias complementarias (es decir, aproximadamente 5-6 nucleótidos) que forman la estructura de tallo 2601a. La porción de bucle 2601b de la horquilla puede diseñarse para hibridar específicamente con una parte (p. ej., aproximadamente 15-30 nucleótidos) de la secuencia diana que comprende dos o más variantes en fase. La horquilla puede diseñarse para hibridar con una parte que comprende al menos 2, 3, 4, 5 o más variantes en fase. En el extremo 5' de la sonda de la sonda de baliza molecular puede unirse una molécula indicadora fluorescente y en el extremo 3' de la sonda de baliza molecular puede unirse un inactivador que apague la fluorescencia del indicador fluorescente. Por lo tanto, la formación de la horquilla puede unir el indicador fluorescente y el inactivador, de modo que no se emita fluorescencia. Sin embargo, durante la operación de hibridación de la reacción de amplificación de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtiene o deriva del sujeto, la parte en bucle de la baliza molecular puede unirse a su secuencia diana, provocando la desnaturalización del tallo. Por lo tanto, el indicador y el inactivador pueden separarse, suprimiendo la inactivación, y el indicador fluorescente se activa y es detectable. Debido a que la fluorescencia del indicador fluorescente se emite desde la sonda de baliza molecular solo cuando la sonda está unida a la secuencia diana, la cantidad o el nivel de fluorescencia detectado puede ser proporcional a la cantidad de diana en la reacción (p. ej., (i) un número total de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase en cada estado o (ii) un número promedio de la pluralidad de variantes en fase por cada molécula de ácido nucleico extracelular que se ha identificado que comprende una pluralidad de variantes en fase, como se divulga en el presente documento).
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el agente indicador activable puede activarse tras la deshibridación de al menos una parte de la sonda de ácido nucleico individual que se ha hibridado con la pluralidad de variantes en fase. Dicho de otro modo, una vez que la sonda de ácido nucleico individual se hibrida con la parte de la molécula de ácido nucleico extracelular diana que comprende la pluralidad de variantes en fase, la deshibridación de al menos una parte de la sonda de ácido nucleico individual y el ácido nucleico extracelular diana puede activar el agente indicador activable. Los ejemplos no limitativos de dicha sonda de ácido nucleico pueden incluir una sonda de hidrólisis (p. ej., sonda TaqMan), sondas de hibridación doble y cebador de PCR QZyme.
Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede ser una sonda de hidrólisis, como se muestra en laFIG.26B. La sonda de hidrólisis 2611 puede ser una sonda oligonucleotídica marcada con fluorescencia que puede hibridar específicamente con una parte (p. ej., entre aproximadamente 10 y aproximadamente 25 nucleótidos) de la molécula de ácido nucleico extracelular diana 2613, en donde la parte hibridada comprende dos o más variantes en fase. La sonda de hidrólisis 2611 puede marcarse con un indicador fluorescente en el extremo 5' y un inactivador en el extremo 3'. Cuando la sonda de hidrólisis está intacta (p. ej., no escindida), la fluorescencia del indicador se apaga debido a su proximidad al inactivador(FIG. 26B).Durante la operación de hibridación de la reacción de amplificación de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares obtenidas o derivadas del sujeto, la actividad 5' → 3' exonucleasa de determinadas polimerasas termoestables (p. ej., Taq o Tth). La reacción de amplificación de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares obtenidas o derivadas del sujeto puede incluir una operación combinada de hibridación/extensión durante la cual la sonda de hidrólisis se hibrida con la molécula de ácido nucleico extracelular diana, y la actividad 5' → 3' exonucleasa específica de ADNbc de una polimerasa termoestable (p. ej., Taq o Tth) escinde el indicador fluorescente de la sonda de hidrólisis. Como resultado, el indicador fluorescente se separa del inactivador, lo que da lugar a una señal de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de diana en la muestra (p. ej., (i) un número total de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase en cada estado o (ii) un número promedio de la pluralidad de variantes en fase por cada molécula de ácido nucleico extracelular que se ha identificado que comprende una pluralidad de variantes en fase, como se divulga en el presente documento).
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el agente indicador puede comprender un indicador fluorescente. Los ejemplos no limitativos de indicador fluorescente incluyen amidita de fluoresceína (FAM, 2-[3-(dimetilamino)-6-dimetiliminio-xanten-9-il]benzoato TAMRA, (2E)-2-[(2E,4E)-5-(2-terc-butil-9-etil-6,8,8-trimetil-pirano[3,2-g]quinolin-1-io-4-il)penta-2,4-dienilideno]-1-(6-hidroxi-6-oxo-hexil)-3,3-dimetil-indolina-5-sulfonato Dy 750, 6-carboxi-2',4,4',5',7,7'-hexaclorofluoresceína, 4,5,6,7-Tetraclorofluoresceína TET<™>, éster succinimidílico de cloruro ácido de sulforrodamina 101 Texas Red-X, colorantes ALEXA, colorantes BODIPY, colorantes de cianina, Rodamina 123 (clorhidrato), colorantes Well RED, MAX y TEX 613. En algunos casos, el agente indicador comprende además un inactivador, como se divulga en el presente documento. Entre los ejemplos no limitativos de inactivadores puede incluirse el Black Hole Quencher, inactivador Iowa Black y cloruro de 4-dimetilaminoazobenceno-4'-sulfonilo (DABCYL).
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, cualquier reacción de PCR que utilice el conjunto de sondas de ácido nucleico puede realizarse mediante PCR en tiempo real (qPCR). Como alternativa, la reacción de PCR que utiliza el conjunto de sondas de ácido nucleico puede realizarse mediante PCR digital (dPCR).
En laFIG.24se proporciona un diagrama de flujo ilustrativo de un proceso para realizar una intervención clínica y/o tratamiento basado en la detección de ácidos nucleicos tumorales circulantes en una muestra biológica de un individuo. En varias realizaciones, la detección de ácidos nucleicos tumorales circulantes viene determinada por la detección de variantes somáticas en fase en una muestra de ácido nucleico extracelular. En muchas realizaciones, la detección de ácidos nucleicos tumorales circulantes indica que el cáncer está presente y, por tanto, se puede llevar a cabo la intervención clínica y/o el tratamiento adecuados.
Haciendo referencia a laFIG. 24,el proceso 2400 puede comenzar con la obtención, preparación y secuenciación (2401) de ácidos nucleicos extracelulares obtenidos a partir de una biopsia no invasiva (p. ej., biopsia líquida o de residuos), utilizando un enfoque de secuenciación de captura a través de regiones que se ha mostrado que albergan una pluralidad de mutaciones o variantes genéticas que se producen en fase. En varias realizaciones, se extrae ADNec y/o ARNec de plasma, sangre, linfa, saliva, orina, heces y/o cualquier otro líquido corporal adecuado. Los ácidos nucleicos extracelulares pueden aislarse y purificarse por cualquier medio adecuado. En algunas realizaciones, se utiliza la purificación en columna (p. ej., kit de ácido nucleico circulante QIAamp de Qiagen, Hilden, Alemania). En algunas realizaciones, los fragmentos de ARN aislados pueden convertirse en ADN complementario para su posterior análisis.
En algunas realizaciones, se extrae una biopsia antes de cualquier indicio de cáncer. En algunas realizaciones, se extrae una biopsia para realizar un cribado precoz con el fin de detectar un cáncer. En algunas realizaciones, se extrae una biopsia para detectar si existe cáncer residual tras un tratamiento. En algunas realizaciones, durante el tratamiento se extrae una biopsia para determinar si el tratamiento está proporcionando la respuesta deseada. Puede realizarse el cribado de cualquier cáncer en particular. En algunas realizaciones, se realiza cribado para detectar un cáncer que desarrolla variantes somáticas en fase en regiones estereotípicas del genoma, tales como (por ejemplo) el linfoma. En algunas realizaciones, se realiza cribado para detectar un cáncer en el que se han descubierto variantes somáticas en fase utilizando una biopsia de cáncer extraída previamente.
En algunas realizaciones, se extrae una biopsia de un individuo con un riesgo determinado de padecer cáncer, tal como los que tienen antecedentes familiares del trastorno o tienen determinados factores de riesgo (p. ej., exposición a carcinógenos). En muchas realizaciones, se extrae una biopsia de cualquier individuo dentro de la población general. En algunas realizaciones, se extrae una biopsia de individuos dentro de un grupo de edad particular con mayor riesgo de cáncer, tales como, por ejemplo, personas mayores de 50 años. En algunas realizaciones, se extrae una biopsia de un individuo al que se le ha diagnosticado y tratado un cáncer.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos extracelulares extraídos se preparan para la secuenciación. Por consiguiente, los ácidos nucleicos extracelulares se convierten en una biblioteca molecular para secuenciación. En algunas realizaciones, se unen adaptadores y/o cebadores a los ácidos nucleicos extracelulares para facilitar la secuenciación. En algunas realizaciones, se va a realizar la secuenciación dirigida de locus genómicos particulares y, por lo tanto, las secuencias particulares correspondientes a los locus particulares se capturan mediante hibridación antes de la secuenciación (p. ej., secuenciación de captura). En algunas realizaciones, se realiza secuenciación de captura utilizando un conjunto de sondas que extraen (o capturan) regiones que se ha descubierto que albergan habitualmente variantes en fase para un cáncer en particular (p. ej., linfoma). En algunas realizaciones, se realiza secuenciación de captura utilizando un conjunto de sondas que extraen (o capturan) regiones que se ha descubierto que albergan variantes en fase, como se ha determinado anteriormente mediante la secuenciación de una biopsia del cáncer. En la sección titulada "Secuenciación por captura" se ofrece un análisis más detallado de la secuenciación por captura y las sondas.
En algunas realizaciones, puede utilizarse cualquier técnica de secuenciación adecuada que pueda detectar variantes en fase indicativas de ácidos nucleicos tumorales circulantes. Las técnicas de secuenciación incluyen, aunque no de forma limitativa, la secuenciación 454, secuenciación con Illumina, secuenciación SOLiD, secuenciación con Ion Torrent, secuenciación de una lectura, secuenciación de extremos emparejados, etc.
El proceso 2400 analiza (2403) el resultado de la secuenciación de ácidos nucleicos extracelulares para detectar secuencias de ácidos nucleicos tumorales circulantes, determinada por la detección de variantes somáticas en fase. Debido a que los cánceres crecen y se expanden activamente, las células neoplásicas suelen liberar biomoléculas (especialmente ácidos nucleicos) en la vasculatura, la linfa y/o los sistemas de residuos. Además, debido a las limitaciones biofísicas de su entorno local, las células neoplásicas suelen romperse, liberando su contenido celular interno en la vasculatura, la linfa y/o los sistemas de residuos. Por consiguiente, es posible detectar tumores primarios distales y/o metástasis a partir de una biopsia líquida o de residuos.
La detección de secuencias de ácidos nucleicos tumorales circulantes indica que hay un cáncer presente en el individuo examinado. Por consiguiente, basándose en la detección de ácidos nucleicos tumorales circulantes, puede realizarse una intervención clínica y/o un tratamiento (2405). En varias realizaciones, se realiza un procedimiento clínico, tal como (por ejemplo) un análisis de sangre, una prueba genética, captura de imágenes médicas, exploración física, una biopsia tumoral o cualquier combinación de los mismos. En varias realizaciones, se realizan diagnósticos para determinar el estadio concreto del cáncer. En varias realizaciones, se realiza un tratamiento, tal como (por ejemplo) la quimioterapia, radioterapia, quimiorradioterapia, inmunoterapia, hormonoterapia, terapia farmacológica dirigida, cirugía, trasplante, transfusión, vigilancia médica o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, una persona es evaluada y/o tratada por un profesional médico, tal como un doctor, médico, medico asistente, enfermera practicante, personal de enfermería, cuidador, dietista o similares.
Diversas realizaciones de la presente divulgación están dirigidas a utilizar la detección del cáncer para realizar intervenciones clínicas. En varias realizaciones, un individuo se somete a una biopsia líquida o de residuos examinada y procesada mediante métodos descritos en el presente documento para indicar que el individuo tiene cáncer y que, por tanto, debe realizarse una intervención. Las intervenciones clínicas incluyen procedimientos y tratamientos clínicos. Los procedimientos clínicos incluyen, aunque no de forma limitativa, análisis de sangre, una prueba genética, captura de imágenes médicas, exámenes físicos y biopsias tumorales. Los tratamientos incluyen, aunque no de forma limitativa, la quimioterapia, radioterapia, quimiorradioterapia, inmunoterapia, hormonoterapia, terapia farmacológica dirigida, cirugía, trasplante, transfusión y vigilancia médica. En varias realizaciones, se realizan diagnósticos para determinar el estadio concreto del cáncer. En algunas realizaciones, una persona es evaluada y/o tratada por un profesional médico, tal como un doctor, médico, medico asistente, enfermera practicante, personal de enfermería, cuidador, dietista o similares.
En varias realizaciones descritas en el presente documento se puede detectar un cáncer utilizando un resultado de secuenciación de ácidos nucleicos extracelulares procedentes de sangre, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, orina o heces. En muchas realizaciones, el cáncer se detecta cuando un resultado de secuenciación tiene una o más variantes somáticas presentes en fase dentro de una ventana genética corta, tal como la longitud de una molécula extracelular (es decir, aproximadamente 170 pb). En numerosas realizaciones, se utiliza un método estadístico para determinar si la presencia de variantes en fase procede de una fuente cancerosa (en contraposición a un artefacto molecular u otra fuente biológica). En diversas realizaciones se utiliza un método de muestreo de Montecarlo como método estadístico para determinar si un resultado de secuenciación de ácidos nucleicos extracelulares incluye secuencias de ácidos nucleicos tumorales circulantes en función de una puntuación determinada por la presencia de variantes en fase. Por consiguiente, en varias realizaciones, los ácidos nucleicos extracelulares se extraen, se procesan y se secuencian, y el resultado de la secuenciación se analiza para detectar el cáncer. Este proceso es especialmente útil en un entorno clínico para proporcionar una exploración diagnóstica.
Un procedimiento ilustrativo para una exploración diagnóstica de un individuo para un cáncer de linfocitos B es el siguiente:
(a) extraer biopsia líquida o de residuos de un individuo,
(b) preparar y realizar la secuenciación dirigida de ácidos nucleicos extracelulares procedentes de biopsia utilizando sondas de ácido nucleico específicas para el cáncer de linfocitos B,
(c) detectar variantes en fase en un resultado de secuenciación que sean indicativas de secuencias de ácido nucleico tumoral circulante, y
(d) realizar intervenciones clínicas basadas en la detección de secuencias de ácidos nucleicos tumorales circulantes.
Un procedimiento ilustrativo para una exploración diagnóstica personalizada de un individuo para un cáncer que se ha secuenciado previamente para detectar variantes en fase en locus genómicos particulares es el siguiente:
extraer una biopsia de cáncer de un individuo
secuenciar la biopsia de cáncer para detectar variantes en fase que se hayan acumulado en el cáncer
(a) diseñar y sintetizar sondas de ácido nucleico para locus genómicos que incluyan las posiciones de las variantes fásicas detectadas,
(b) extraer biopsia líquida o de residuos del individuo,
(c) preparar y realizar secuenciación dirigida de ácidos nucleicos extracelulares procedentes de la biopsia utilizando las sondas de ácidos nucleicos diseñadas y sintetizadas,
(d) detectar variantes en fase en un resultado de secuenciación que sean indicativas de secuencias de ácido nucleico tumoral circulante, y
(e) realizar intervenciones clínicas basadas en la detección de secuencias de ácidos nucleicos tumorales circulantes.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, al menos una parte de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase puede analizarse adicionalmente para determinar el estado del sujeto. No obstante, solo se reivindican los métodos caracterizados según las reivindicaciones adjuntas. En tal análisis, (i) la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas y (ii) otras moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que no comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden analizarse como variables diferentes. En algunos casos, una relación de (i) un número de las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas y (ii) un número de las otras moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que no comprenden la pluralidad de variantes en fase puede utilizarse como factor para determinar la afección del sujeto. En algunos casos, la comparación de (i) una posición o posiciones de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas con respecto a la secuencia genómica de referencia y (ii) una posición o posiciones de las otras moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que no comprenden la pluralidad de variantes en fase con respecto a la secuencia genómica de referencia puede utilizarse como factor para determinar la afección del sujeto.
Como alternativa, en algunos casos, el análisis de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas que comprenden la pluralidad de variantes en fase para determinar la afección del sujeto puede no basarse, y no es necesario que lo haga, en las otras moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que no comprenden la pluralidad de variantes en fase. Como se divulga en el presente documento, los ejemplos no limitativos de información o características de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden incluir (i) un número total de tales moléculas de ácido nucleico extracelulares y (ii) un número promedio de la pluralidad de variantes en fase por cada molécula de ácido nucleico en la población de moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas.
Por lo tanto, en algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, un número de la pluralidad de variantes en fase de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que tiene la pluralidad de variantes en fase puede ser indicativo de la afección del sujeto. En algunos casos, una relación entre (i) el número de la pluralidad de variantes en fase de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares y (ii) un número de variantes de un solo nucleótido de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares puede ser indicativa de la afección del sujeto. Por ejemplo, una afección en particular (p. ej., linfoma folicular) puede presentar una relación de firmas diferente a la de otra afección (p. ej., cáncer de mama). En algunos ejemplos, para cáncer o tumor sólido, la relación como se divulga en el presente documento puede estar entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,20. En algunos ejemplos, para cáncer o tumor sólido, la relación como se divulga en el presente documento puede ser de aproximadamente 0,01, aproximadamente 0,02, aproximadamente 0,03, aproximadamente 0,04, aproximadamente 0,05, aproximadamente 0,06, aproximadamente 0,07, aproximadamente 0,08, aproximadamente 0,09, aproximadamente 0,10, aproximadamente 0,11, aproximadamente 0,12, aproximadamente 0,13, aproximadamente 0,14, aproximadamente 0,15, aproximadamente 0,16, aproximadamente 0,17, aproximadamente 0,18, aproximadamente 0,19 o aproximadamente 0,20. En algunos ejemplos, para cáncer o tumor sólido, la relación como se divulga en el presente documento puede ser al menos o hasta aproximadamente 0,01, al menos o hasta aproximadamente 0,02, al menos o hasta aproximadamente 0,03, al menos o hasta aproximadamente 0,04, al menos o hasta aproximadamente 0,05, al menos o hasta aproximadamente 0,06, al menos o hasta aproximadamente 0,07, al menos o hasta aproximadamente 0,08, al menos o hasta aproximadamente 0,09, al menos o hasta aproximadamente 0,10, al menos o hasta aproximadamente 0,11, al menos o hasta aproximadamente 0,12, al menos o hasta aproximadamente 0,13, al menos o hasta aproximadamente 0,14, al menos o hasta aproximadamente 0,15, al menos o hasta aproximadamente 0,16, al menos o hasta aproximadamente 0,17, al menos o hasta aproximadamente 0,18, al menos o hasta aproximadamente 0,19 o al menos o hasta aproximadamente 0,20.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la frecuencia de la pluralidad de variantes en fase en la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que se han identificado puede ser indicativa de la afección del sujeto. En algunos casos, basándose en los datos de secuenciación divulgados en el presente documento, una frecuencia promedio de la pluralidad de variantes en fase por una longitud de grupo predeterminada (p. ej., un grupo de aproximadamente 50 pares de bases) dentro de cada una de las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas puede ser indicativa de la afección del sujeto. En algunos casos, basándose en los datos de secuenciación divulgados en el presente documento, una frecuencia promedio de la pluralidad de variantes en fase por una longitud de grupo predeterminada (p. ej., un grupo de aproximadamente 50 pares de bases) dentro de cada una de las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas que se asocian con un gen en particular (p. ej., BCL2, PIM1) puede ser indicativa de la afección del sujeto. El tamaño del grupo puede ser de aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70 o aproximadamente 80.
En algunos ejemplos, una primera afección (p. ej., linfoma de Hodgkin o LH) puede presentar una primera frecuencia promedio y una segunda afección (p. ej., LDLBG) puede presentar una frecuencia promedio diferente, permitiendo de este modo identificar y/o determinar si el sujeto tiene o se sospecha que tiene una afección en particular. Sin embargo, solo se reivindican los métodos que no se refieren a una neoplasia hematológica. En algunos ejemplos, un primer subtipo de una enfermedad puede presentar una primera frecuencia promedio y un segundo subtipo de la misma enfermedad puede presentar una frecuencia promedio diferente, permitiendo de este modo identificar y/o determinar si el sujeto tiene o se sospecha que tiene un subtipo particular de la enfermedad. Por ejemplo, el sujeto puede tener LDLBG y una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares derivadas de LDLBG de linfocitos B de centro germinal (LBCG) o LDLBG de linfocitos B activadas (LBCB) pueden tener una frecuencia media diferente de la pluralidad de variante de fase por una longitud de grupo predeterminada, como se divulga en el presente documento.
En algún ejemplo, una afección del sujeto puede tener un número predeterminado de variantes en fase que abarcan locus genómicos predeterminados (es decir, una frecuencia predeterminada de variantes en fase). Cuando la frecuencia predeterminada de variantes en fase coincide con una frecuencia de la pluralidad de variantes en fase en la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que se han identificado a partir de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares procedentes del sujeto, esto puede indicar que el sujeto tiene dicha afección.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que se ha identificado que comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden analizarse para determinar su origen genómico (p. ej., de qué locus génico proceden). El origen genómico de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que se han identificado puede ser indicativo de la afección del sujeto, ya que diferentes enfermedades pueden tener la pluralidad de variantes en fase en diferentes genes de firma. Por ejemplo, un sujeto puede tener LDLBG GCB, y una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares originadas de GCB del sujeto pueden tener las variantes en fase prevalentes en el gen BCL2, mientras que una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares originadas a partir de ABC del mismo sujeto pueden no comprender tantas variantes en fase en el gen BCL2 como las procedentes de GCB. Por otro lado, un sujeto puede tener LDLBG ABC, y una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares originadas de ABC del sujeto pueden tener las variantes en fase prevalentes en el gen PIM1, mientras que una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares originadas a partir de GCB del mismo sujeto pueden no comprender tantas variantes en fase en el gen PIM1 como las procedentes de GCB.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, al menos o hasta aproximadamente el 10 %, al menos o hasta aproximadamente el 15 %, al menos o hasta aproximadamente el 20 %, al menos o hasta aproximadamente el 25 %, al menos o hasta aproximadamente el 30 %, al menos o hasta aproximadamente el 35 %, al menos o hasta aproximadamente el 40 %, al menos o hasta aproximadamente el 45 %, al menos o hasta aproximadamente el 50 %, al menos o hasta aproximadamente el 55 %, al menos o hasta aproximadamente el 60 %, al menos o hasta aproximadamente el 65 %, al menos o hasta aproximadamente el 70 %, al menos o hasta aproximadamente el 75 %, al menos o hasta aproximadamente el 80 %, al menos o hasta aproximadamente el 85 %, al menos o hasta aproximadamente el 90 %, al menos o hasta aproximadamente el 95 %, al menos o hasta aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden comprender una variante de un solo nucleótido (SNV) que está al menos a 2 nucleótidos de distancia de una SNV adyacente.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, al menos o hasta aproximadamente el 5 %, al menos o hasta aproximadamente el 10 %, al menos o hasta aproximadamente el 15 %, al menos o hasta aproximadamente el 20 %, al menos o hasta aproximadamente el 25 %, al menos o hasta aproximadamente el 30 %, al menos o hasta aproximadamente el 35 %, al menos o hasta aproximadamente el 40 %, al menos o hasta aproximadamente el 45 % o al menos o hasta aproximadamente el 50 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden comprender una variante de un solo nucleótido (SNV) que está al menos a 3 nucleótidos de distancia de una SNV adyacente.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, al menos o hasta aproximadamente el 5 %, al menos o hasta aproximadamente el 10 %, al menos o hasta aproximadamente el 15 %, al menos o hasta aproximadamente el 20 %, al menos o hasta aproximadamente el 25 %, al menos o hasta aproximadamente el 30 %, al menos o hasta aproximadamente el 35 %, al menos o hasta aproximadamente el 40 %, al menos o hasta aproximadamente el 45 % o al menos o hasta aproximadamente el 50 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden comprender una variante de un solo nucleótido (SNV) que está al menos a 4 nucleótidos de distancia de una SNV adyacente.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, al menos o hasta aproximadamente el 5 %, al menos o hasta aproximadamente el 10 %, al menos o hasta aproximadamente el 15 %, al menos o hasta aproximadamente el 20 %, al menos o hasta aproximadamente el 25 %, al menos o hasta aproximadamente el 30 %, al menos o hasta aproximadamente el 35 %, al menos o hasta aproximadamente el 40 %, al menos o hasta aproximadamente el 45 % o al menos o hasta aproximadamente el 50 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden comprender una variante de un solo nucleótido (SNV) que está al menos a 5 nucleótidos de distancia de una SNV adyacente.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, al menos o hasta aproximadamente el 5 %, al menos o hasta aproximadamente el 10 %, al menos o hasta aproximadamente el 15 %, al menos o hasta aproximadamente el 20 %, al menos o hasta aproximadamente el 25 %, al menos o hasta aproximadamente el 30 %, al menos o hasta aproximadamente el 35 %, al menos o hasta aproximadamente el 40 %, al menos o hasta aproximadamente el 45 % o al menos o hasta aproximadamente el 50 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden comprender una variante de un solo nucleótido (SNV) que está al menos a 6 nucleótidos de distancia de una SNV adyacente.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, al menos o hasta aproximadamente el 5 %, al menos o hasta aproximadamente el 10 %, al menos o hasta aproximadamente el 15 %, al menos o hasta aproximadamente el 20 %, al menos o hasta aproximadamente el 25 %, al menos o hasta aproximadamente el 30 %, al menos o hasta aproximadamente el 35 %, al menos o hasta aproximadamente el 40 %, al menos o hasta aproximadamente el 45 % o al menos o hasta aproximadamente el 50 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden comprender una variante de un solo nucleótido (SNV) que está al menos a 7 nucleótidos de distancia de una SNV adyacente.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, al menos o hasta aproximadamente el 5 %, al menos o hasta aproximadamente el 10 %, al menos o hasta aproximadamente el 15 %, al menos o hasta aproximadamente el 20 %, al menos o hasta aproximadamente el 25 %, al menos o hasta aproximadamente el 30 %, al menos o hasta aproximadamente el 35 %, al menos o hasta aproximadamente el 40 %, al menos o hasta aproximadamente el 45 % o al menos o hasta aproximadamente el 50 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden comprender una variante de un solo nucleótido (SNV) que está al menos a 8 nucleótidos de distancia de una SNV adyacente.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, al menos o hasta aproximadamente el 5 %, al menos o hasta aproximadamente el 10 %, al menos o hasta aproximadamente el 15 %, al menos o hasta aproximadamente el 20 %, al menos o hasta aproximadamente el 25 %, al menos o hasta aproximadamente el 30 %, al menos o hasta aproximadamente el 35 %, al menos o hasta aproximadamente el 40 %, al menos o hasta aproximadamente el 45 % o al menos o hasta aproximadamente el 50 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden comprender una variante de un solo nucleótido (SNV) que está al menos a 9 nucleótidos de distancia de una SNV adyacente.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, al menos o hasta aproximadamente el 5 %, al menos o hasta aproximadamente el 10 %, al menos o hasta aproximadamente el 15 %, al menos o hasta aproximadamente el 20 %, al menos o hasta aproximadamente el 25 %, al menos o hasta aproximadamente el 30 %, al menos o hasta aproximadamente el 35 %, al menos o hasta aproximadamente el 40 %, al menos o hasta aproximadamente el 45 % o al menos o hasta aproximadamente el 50 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase pueden comprender una variante de un solo nucleótido (SNV) que está al menos a 10 nucleótidos de distancia de una SNV adyacente.
C. Secuencia genómica de referencia
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la secuencia genómica de referencia puede ser al menos una parte de una base de datos de secuencias de ácidos nucleicos (es decir, un genoma de referencia), cuya base de datos se ensambla a partir de datos genéticos y está previsto que represente el genoma de una cohorte de referencia. En algunos casos, una cohorte de referencia puede ser una colección de individuos de un genotipo, haplotipo, características demográficas, sexo, nacionalidad, edad, etnia, familiares, estado físico (p. ej., sano o se le ha diagnosticado que tiene la misma enfermedad o una diferente, tal como un tipo específico de cáncer) u otras agrupaciones específicos o variables. Una secuencia genómica de referencia, como se ha descrito en el presente documento, puede ser un mosaico (o una secuencia consenso) de los genomas de dos o más individuos. La secuencia genómica de referencia puede comprender al menos una parte de un genoma de referencia disponible públicamente o de un genoma de referencia privado. Entre los ejemplos no limitativos de un genoma humano de referencia se incluyen hg19, hg18, hg17, hg16 y hg38.
En algunos ejemplos, la secuencia genómica de referencia puede comprender al menos o hasta aproximadamente 500 nucleobases, al menos o hasta aproximadamente 1 kilobase (kb), al menos o hasta aproximadamente 2 kb, al menos o hasta aproximadamente 3 kb, al menos o hasta aproximadamente 4 kb, al menos o hasta aproximadamente 5 kb, al menos o hasta aproximadamente 6 kb, al menos o hasta aproximadamente 7 kb, al menos o hasta aproximadamente 8 kb, al menos o hasta aproximadamente 9 kb, al menos o hasta aproximadamente 10 kb, al menos o hasta aproximadamente 20 kb, al menos o hasta aproximadamente 30 kb, al menos o hasta aproximadamente 40 kb, al menos o hasta aproximadamente 50 kb, al menos o hasta aproximadamente 60 kb, al menos o hasta aproximadamente 70 kb, al menos o hasta aproximadamente 80 kb, al menos o hasta aproximadamente 90 kb, al menos o hasta aproximadamente 100 kb, al menos o hasta aproximadamente 200 kb, al menos o hasta aproximadamente 300 kb, al menos o hasta aproximadamente 400 kb, al menos o hasta aproximadamente 500 kb, al menos o hasta aproximadamente 600 kb, al menos o hasta aproximadamente 700 kb, al menos o hasta aproximadamente 800 kb, al menos o hasta aproximadamente 900 kb, al menos o hasta aproximadamente 1000 kb, al menos o hasta aproximadamente 2000 kb, al menos o hasta aproximadamente 3000 kb, al menos o hasta aproximadamente 4000 kb, al menos o hasta aproximadamente 5000 kb, al menos o hasta aproximadamente 6000 kb, al menos o hasta aproximadamente 7000 kb, al menos o hasta aproximadamente 8000 kb, al menos o hasta aproximadamente 9000 kb, al menos o hasta aproximadamente 10000 kb, al menos o hasta aproximadamente 20000 kb, al menos o hasta aproximadamente 30000 kb, al menos o hasta aproximadamente 40000 kb, al menos o hasta aproximadamente 50000 kb, al menos o hasta aproximadamente 60000 kb, al menos o hasta aproximadamente 70000 kb, al menos o hasta aproximadamente 80000 kb, al menos o hasta aproximadamente 90 000 kb o al menos o hasta aproximadamente 100000 kb.
En algunos casos, la secuencia genómica de referencia puede ser el genoma de referencia completo o una parte (p. ej., una parte relevante para la afección de interés) del genoma. Por ejemplo, la secuencia genómica de referencia puede consistir en al menos 1, 2, 3, 4, 5 o más genes que experimentan hipermutación somática aberrante en determinados tipos de cáncer. En algunos casos, la secuencia genómica de referencia puede ser una secuencia cromosómica completa o un fragmento de la misma. En algunos casos, la secuencia genómica de referencia puede comprender dos o más (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5 o más) partes diferentes del genoma de referencia que no son adyacentes entre sí (p. ej., dentro del mismo cromosoma o de cromosomas diferentes).
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la secuencia genómica de referencia puede ser al menos una parte de un genoma de referencia de un individuo seleccionado, tal como un individuo sano o el sujeto de cualquiera de los métodos como se divulga en el presente documento.
En algunos casos, la secuencia genómica de referencia puede proceder de un individuo que no sea el sujeto (p. ej., un individuo sano de control). Como alternativa, en algunos casos, la secuencia genómica de referencia puede proceder de una muestra del sujeto. En algunos ejemplos, la muestra puede ser una muestra sana del sujeto. La muestra sana del sujeto puede ser cualquier célula del sujeto que esté sana, p. ej., un leucocito sano. Comparando los datos de secuenciación de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares (p. ej., moléculas de ADNec) del sujeto con al menos una parte de la secuencia genómica de una célula sana del mismo sujeto, se pueden identificar y analizar una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase, como se divulga en el presente documento. En algunos ejemplos, la muestra puede ser una muestra enferma del sujeto, tal como una célula enferma (p. ej., una célula tumoral) o un tumor sólido. La secuencia genómica de referencia puede obtenerse de la secuenciación de al menos una parte de una célula enferma del sujeto o de la secuenciación de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares obtenidas del tumor sólido del sujeto. Una vez diagnosticado que el sujeto tiene una afección en particular (p. ej., una enfermedad), la secuencia genómica de referencia del sujeto que comprende la pluralidad de variantes en fase puede utilizarse para determinar si el sujeto sigue presentando las mismas variantes en fase en momentos futuros. En este contexto, cualquier nueva variante en fase identificada entre la secuencia genómica de referencia "enferma" del sujeto y las nuevas moléculas de ácido nucleico extracelulares obtenidas o derivadas del sujeto puede indicar un grado reducido de hipermutación somática aberrante en locus genómicos particulares (p. ej., al menos una remisión parcial).
En diversas realizaciones, pueden realizarse exploraciones diagnósticas para cualquier tipo de neoplasia, incluyendo, aunque no de forma limitativa, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), cáncer de ano, astrocitomas, carcinoma basocelular, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de mama, linfoma de Burkitt, cáncer cervicouterino, leucemia linfocítica crónica (LLC) y leucemia mielógena crónica (LMC), neoplasias mieloproliferativas crónicas, cáncer colorrectal, linfoma difuso de linfocitos B grandes, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, sarcoma de Ewing, cáncer de las trompas de Falopio, linfoma folicular, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tricoleucemia, cáncer hepatocelular, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, cáncer de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de boca, neuroblastoma, linfoma no hodgkiniano, cáncer de pulmón no microcítico, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, tumores neuroendocrinos pancreáticos, cáncer de faringe, tumor de la hipófisis, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de células renales, retinoblastoma, cáncer de piel, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de intestino delgado, cáncer escamoso de cuello, linfoma de linfocitos T, cáncer de testículo, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer vaginal y tumores vasculares.
En varias realizaciones, se utiliza una exploración diagnóstica para detectar precozmente el cáncer. En algunas realizaciones, una exploración diagnóstica detecta el cáncer en personas que tienen estadio I, II o III de cáncer. En algunas realizaciones, se utiliza una exploración diagnóstica para detectar la EMR o la carga tumoral. En algunas realizaciones, se utiliza una exploración diagnóstica para determinar la evolución (p. ej., avance o remisión) del tratamiento. En función de la exploración diagnóstica, puede realizarse un procedimiento clínico y/o un tratamiento.
D. Sondas de ácido nucleico
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse basándose en cualquiera de las secuencias genómicas de referencia de la presente divulgación. En algunos casos, el conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse basándose en la pluralidad de variantes en fase que se han identificado comparando (i) datos de secuenciación de un tumor sólido del sujeto y (ii) datos de secuenciación de una célula sana del sujeto o de una cohorte sana, como se divulga en el presente documento. El conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse basándose en la pluralidad de variantes en fase que se han identificado comparando (i) datos de secuenciación de un tumor sólido del sujeto y (ii) datos de secuenciación de una célula sana del sujeto. El conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse basándose en la pluralidad de variantes en fase que se han identificado comparando (i) datos de secuenciación de un tumor sólido del sujeto y (ii) datos de secuenciación de una célula sana de una cohorte sana.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico está diseñado para hibridar con secuencias de locus genómicos asociados a la enfermedad. Como se divulga en el presente documento, puede determinarse que los locus genómicos asociados a la afección experimentan o presentan hipermutación somática aberrante cuando el sujeto tiene la afección. Como alternativa, el conjunto de sondas de ácido nucleico está diseñado para hibridar con secuencias de regiones estereotipadas.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse para hibridar con al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % de las regiones genómicas identificadas en la tabla 1.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse para hibridar con al menos una parte de moléculas de ácido nucleico extracelulares (p. ej., ADNec) derivadas de al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % de las regiones genómicas identificadas en la tabla 1.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, cada sonda de ácido nucleico del conjunto de sondas de ácido nucleico puede tener al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 55 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia, al menos aproximadamente un 99 % o aproximadamente un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de sonda seleccionada de la tabla 6.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico puede comprender al menos aproximadamente el 1 %, al menos aproximadamente el 2 %, al menos aproximadamente el 3 %, al menos aproximadamente el 4 %, al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 6 %, al menos aproximadamente el 7 %, al menos aproximadamente el 8 %, al menos aproximadamente el 9 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % de las secuencias de sonda de la tabla 6.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse para abarcar una o más regiones genómicas diana que comprendan al menos o hasta aproximadamente 500 nucleobases, al menos o hasta aproximadamente 1 kilobase (kb), al menos o hasta aproximadamente 2 kb, al menos o hasta aproximadamente 3 kb, al menos o hasta aproximadamente 4 kb, al menos o hasta aproximadamente 5 kb, al menos o hasta aproximadamente 6 kb, al menos o hasta aproximadamente 7 kb, al menos o hasta aproximadamente 8 kb, al menos o hasta aproximadamente 9 kb, al menos o hasta aproximadamente 10 kb, al menos o hasta aproximadamente 20 kb, al menos o hasta aproximadamente 30 kb, al menos o hasta aproximadamente 40 kb, al menos o hasta aproximadamente 50 kb, al menos o hasta aproximadamente 60 kb, al menos o hasta aproximadamente 70 kb, al menos o hasta aproximadamente 80 kb, al menos o hasta aproximadamente 90 kb, al menos o hasta aproximadamente 100 kb, al menos o hasta aproximadamente 200 kb, al menos o hasta aproximadamente 300 kb, al menos o hasta aproximadamente 400 kb o al menos o hasta aproximadamente 500 kb.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, una región genómica diana (p. ej., un locus genómico diana) de la o las regiones genómicas diana puede comprender como máximo aproximadamente 200 nucleobases, como máximo aproximadamente 300 nucleobases, 400 nucleobases, como máximo aproximadamente 500 nucleobases, como máximo aproximadamente 600 nucleobases, como máximo aproximadamente 700 nucleobases, como máximo aproximadamente 800 nucleobases, como máximo aproximadamente 900 nucleobases, como máximo aproximadamente 1 kb, como máximo aproximadamente 2 kb, como máximo aproximadamente 3 kb, como máximo aproximadamente 4 kb, como máximo aproximadamente 5 kb, como máximo aproximadamente 6 kb, como máximo aproximadamente 7 kb, como máximo aproximadamente 8 kb, como máximo aproximadamente 9 kb, como máximo aproximadamente 10 kb, como máximo aproximadamente 11 kb, como máximo aproximadamente 12 kb, como máximo aproximadamente 13 kb, como máximo aproximadamente 14 kb, como máximo aproximadamente 15 kb, como máximo aproximadamente 16 kb, como máximo aproximadamente 17 kb, como máximo aproximadamente 18 kb, como máximo aproximadamente 19 kb, como máximo aproximadamente 20 kb, como máximo aproximadamente 25 kb, como máximo aproximadamente 30 kb, como máximo aproximadamente 35 kb, como máximo aproximadamente 40 kb, como máximo aproximadamente 45 kb, como máximo aproximadamente 50 kb o como máximo aproximadamente 100 kb.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico puede comprender al menos o hasta aproximadamente 10, al menos o hasta aproximadamente 20, al menos o hasta aproximadamente 30, al menos o hasta aproximadamente 40, al menos o hasta aproximadamente 50, al menos o hasta aproximadamente 60, al menos o hasta aproximadamente 70, al menos o hasta aproximadamente 80, al menos o hasta aproximadamente 90, al menos o hasta aproximadamente 100, al menos o hasta aproximadamente 200, al menos o hasta aproximadamente 300, al menos o hasta aproximadamente 400, al menos o hasta aproximadamente 500, al menos o hasta aproximadamente 600, al menos o hasta aproximadamente 700, al menos o hasta aproximadamente 800, al menos o hasta aproximadamente 900, al menos o hasta aproximadamente 1000, al menos o hasta aproximadamente 2000, al menos o hasta aproximadamente 3000, al menos o hasta aproximadamente 4000 o al menos o hasta aproximadamente 5000 sondas de ácido nucleico diferentes diseñadas para hibridar con diferentes secuencias de ácido nucleico diana.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el conjunto de sondas de ácido nucleico puede tener una longitud de al menos o hasta aproximadamente 50, al menos o hasta aproximadamente 55, al menos o hasta aproximadamente 60, al menos o hasta aproximadamente 65, al menos o hasta aproximadamente 70, al menos o hasta aproximadamente 75, al menos o hasta aproximadamente 80, al menos o hasta aproximadamente 85, al menos o hasta aproximadamente 90, al menos o hasta aproximadamente 95 o al menos o hasta aproximadamente 100 nucleótidos.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición que comprende un conjunto de cebos que comprende una cualquiera del conjunto de sondas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento. La composición que comprende dicho conjunto de cebos puede utilizarse para cualquiera de los métodos divulgados en el presente documento. En algunos casos, el conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse para extraer (o capturar) moléculas de ADNec. En algunos casos, el conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse para extraer (o capturar) moléculas de ARNec.
En algunas realizaciones, el conjunto de cebos puede comprender un conjunto de sondas de ácido nucleico diseñadas para extraer moléculas de ácido nucleico extracelulares (p. ej., ADNec) derivadas de regiones genómicas expuestas en la tabla 1. El conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse para extraer moléculas de ácido nucleico extracelulares derivadas de al menos o hasta aproximadamente el 1 %, al menos o hasta aproximadamente el 2 %, al menos o hasta aproximadamente el 3 %, al menos o hasta aproximadamente el 4 %, al menos o hasta aproximadamente el 5 %, al menos o hasta aproximadamente el 6 %, al menos o hasta aproximadamente el 7 %, al menos o hasta aproximadamente el 8 %, al menos o hasta aproximadamente el 9 %, al menos o hasta aproximadamente el 10 %, al menos o hasta aproximadamente el 15 %, al menos o hasta aproximadamente el 20 %, al menos o hasta aproximadamente el 25 %, al menos o hasta aproximadamente el 30 %, al menos o hasta aproximadamente el 35 %, al menos o hasta aproximadamente el 40 %, al menos o hasta aproximadamente el 45 %, al menos o hasta aproximadamente el 50 %, al menos o hasta aproximadamente el 55 %, al menos o hasta aproximadamente el 60 %, al menos o hasta aproximadamente el 65 %, al menos o hasta aproximadamente el 70 %, al menos o hasta aproximadamente el 75 %, al menos o hasta aproximadamente el 80 %, al menos o hasta aproximadamente el 85 %, al menos o hasta aproximadamente el 90 %, al menos o hasta aproximadamente el 95 %, al menos o hasta aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % de las regiones genómicas expuestas en la tabla 1. En algunos casos, el conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse para extraer moléculas de ADNec. En algunos casos, el conjunto de sondas de ácido nucleico puede diseñarse para extraer moléculas de ARNec.
En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, una sonda de ácido nucleico individual (o cada sonda de ácido nucleico) del conjunto de sondas de ácido nucleico puede comprender un marcador de extracción. El marcador de extracción puede usarse para enriquecer una muestra (p. ej., una muestra que comprende la pluralidad de moléculas de ácido nucleico obtenidas o derivadas del sujeto) para un subconjunto específico (p. ej., para moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase como se divulga en el presente documento).
En algunos casos, el marcador de extracción puede comprender un código de barras de ácido nucleico (p. ej., en uno o ambos lados de la sonda de ácido nucleico). Utilizando perlas o sustratos que comprenden secuencias de ácido nucleico que tienen complementariedad con el código de barras de ácido nucleico, el código de barras de ácido nucleico puede usarse para extraer y enriquecer cualquier sonda de ácido nucleico que esté hibridada con una molécula diana de ácido nucleico extracelular. Como alternativa, o adicionalmente, el código de barras de ácido nucleico puede utilizarse para identificar la molécula de ácido nucleico extracelular diana a partir de cualquier dato de secuenciación (p. ej., secuenciación por amplificación) obtenido mediante el uso de cualquiera del conjunto de sondas de ácido nucleico divulgadas en el presente documento.
En algunos casos, el marcador de extracción puede comprender una fracción diana de afinidad que puede ser específicamente reconocida por y unirse a una fracción de unión por afinidad. La fracción de unión de afinidad puede unirse específicamente a la fracción diana de afinidad para formar un par de afinidad. En algunos casos, utilizando perlas o sustratos que comprendan la fracción de unión por afinidad, la fracción diana de afinidad puede usarse para extraer y enriquecer cualquier sonda de ácido nucleico hibridada con una molécula diana de ácido nucleico extracelular. Como alternativa, el marcador de extracción puede comprender la fracción de unión por afinidad, mientras que las perlas/sustratos pueden comprender la fracción diana de afinidad. Los ejemplos no limitativos del par de afinidad pueden incluir biotina/avidina, anticuerpo/antígeno, biotina/estreptavidina, metal/quelante, ligando/receptor, ácido nucleico y proteína de unión, y ácidos nucleicos complementarios. En un ejemplo, el marcador de extracción puede comprender biotina.
En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, la longitud de una molécula de ácido nucleico extracelular diana (p. ej., ADNec) que se va a extraer mediante cualquier sonda de ácido nucleico en cuestión puede ser de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos. La longitud de la molécula de ácido nucleico extracelular diana puede ser de al menos aproximadamente 100 nucleótidos. La longitud de la molécula de ácido nucleico extracelular diana puede ser de como máximo aproximadamente 200 nucleótidos. La longitud de la molécula de ácido nucleico extracelular diana puede ser de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 110 nucleótidos, de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 120 nucleótidos, de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 130 nucleótidos, de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 140 nucleótidos, de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 150 nucleótidos, de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 160 nucleótidos, de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 170 nucleótidos, de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 180 nucleótidos, de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 190 nucleótidos, de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 110 nucleótidos a aproximadamente 120 nucleótidos, de aproximadamente 110 nucleótidos a aproximadamente 130 nucleótidos, de aproximadamente 110 nucleótidos a aproximadamente 140 nucleótidos, de aproximadamente 110 nucleótidos a aproximadamente 150 nucleótidos, de aproximadamente 110 nucleótidos a aproximadamente 160 nucleótidos, de aproximadamente 110 nucleótidos a aproximadamente 170 nucleótidos, de aproximadamente 110 nucleótidos a aproximadamente 180 nucleótidos, de aproximadamente 110 nucleótidos a aproximadamente 190 nucleótidos, de aproximadamente 110 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 120 nucleótidos a aproximadamente 130 nucleótidos, de aproximadamente 120 nucleótidos a aproximadamente 140 nucleótidos, de aproximadamente 120 nucleótidos a aproximadamente 150 nucleótidos, de aproximadamente 120 nucleótidos a aproximadamente 160 nucleótidos, de aproximadamente 120 nucleótidos a aproximadamente 170 nucleótidos, de aproximadamente 120 nucleótidos a aproximadamente 180 nucleótidos, de aproximadamente 120 nucleótidos a aproximadamente 190 nucleótidos, de aproximadamente 120 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 130 nucleótidos a aproximadamente 140 nucleótidos, de aproximadamente 130 nucleótidos a aproximadamente 150 nucleótidos, de aproximadamente 130 nucleótidos a aproximadamente 160 nucleótidos, de aproximadamente 130 nucleótidos a aproximadamente 170 nucleótidos, de aproximadamente 130 nucleótidos a aproximadamente 180 nucleótidos, de aproximadamente 130 nucleótidos a aproximadamente 190 nucleótidos, de aproximadamente 130 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 140 nucleótidos a aproximadamente 150 nucleótidos, de aproximadamente 140 nucleótidos a aproximadamente 160 nucleótidos, de aproximadamente 140 nucleótidos a aproximadamente 170 nucleótidos, de aproximadamente 140 nucleótidos a aproximadamente 180 nucleótidos, de aproximadamente 140 nucleótidos a aproximadamente 190 nucleótidos, de aproximadamente 140 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 150 nucleótidos a aproximadamente 160 nucleótidos, de aproximadamente 150 nucleótidos a aproximadamente 170 nucleótidos, de aproximadamente 150 nucleótidos a aproximadamente 180 nucleótidos, de aproximadamente 150 nucleótidos a aproximadamente 190 nucleótidos, de aproximadamente 150 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 160 nucleótidos a aproximadamente 170 nucleótidos, de aproximadamente 160 nucleótidos a aproximadamente 180 nucleótidos, de aproximadamente 160 nucleótidos a aproximadamente 190 nucleótidos, de aproximadamente 160 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 170 nucleótidos a aproximadamente 180 nucleótidos, de aproximadamente 170 nucleótidos a aproximadamente 190 nucleótidos, de aproximadamente 170 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos, de aproximadamente 180 nucleótidos a aproximadamente 190 nucleótidos, de aproximadamente 180 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos o de aproximadamente 190 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos. La longitud de la molécula de ácido nucleico extracelular diana puede ser de aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 110 nucleótidos, aproximadamente 120 nucleótidos, aproximadamente 130 nucleótidos, aproximadamente 140 nucleótidos, aproximadamente 150 nucleótidos, aproximadamente 160 nucleótidos, aproximadamente 170 nucleótidos, aproximadamente 180 nucleótidos, aproximadamente 190 nucleótidos o aproximadamente 200 nucleótidos. En algunos ejemplos, la longitud de la molécula de ácido nucleico extracelular diana puede variar entre aproximadamente 100 nucleótidos y aproximadamente 180 nucleótidos.
En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, las regiones genómicas pueden asociarse a una afección. Se puede determinar que las regiones genómicas presentan hipermutación somática aberrante cuando un sujeto tiene la afección. Por ejemplo, la afección puede comprender el linfoma de linfocitos B o un subtipo del mismo, tal como el linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, linfoma de Burkitt y leucemia linfocítica crónica de linfocitos B. A continuación se ofrecen más detalles sobre la afección.
En algunas realizaciones de una cualquiera de las composiciones desveladas en el presente documento, la composición comprende además la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares (p. ej., ADNec) obtenidas o derivadas del sujeto.
E. Aplicaciones diagnósticas o terapéuticas
Una serie de realizaciones se dirigen a la realización de una exploración diagnóstica en ácidos nucleicos extracelulares de un individuo y, a continuación, basándose en los resultados de la exploración, indicar la presencia de cáncer, realizar más procedimientos clínicos y/o tratar al individuo. De acuerdo con diversas realizaciones, pueden detectarse numerosos tipos de neoplasias.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el método puede comprender determinar que el sujeto tiene la afección o determinar un grado o estado de la afección del sujeto, basándose en la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase. En algunos casos, el método puede comprender además determinar que la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares (cada una de las cuales se ha identificado que comprende una pluralidad de variantes en fase) derivan de una muestra asociada con la afección (p. ej., cáncer), basándose en un análisis de modelo estadístico (es decir, un análisis molecular). Por ejemplo, el método puede comprender usar uno o más algoritmos (p. ej., simulación de Montecarlo) para determinar una primera probabilidad de que un ácido nucleico extracelular identificado como poseedor de una pluralidad de variantes en fase esté asociado con una primera afección o se origine a partir de ella (p. ej., 80 %) y una segunda probabilidad de que el mismo ácido nucleico extracelular esté asociado con una segunda afección o se origine a partir de ella (o a partir de una célula sana) (p. ej., 20 %). En algunos casos, el método puede comprender determinar una verosimilitud o probabilidad de que el sujeto tenga una o más afecciones basándose en el análisis de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares, cada una de las cuales se ha identificado que comprende una pluralidad de variantes en fase (es decir, macroanálisis o análisis global). Por ejemplo, el método puede comprender usar uno o más algoritmos (p. ej., que comprenden uno o más modelos matemáticos como se divulga en el presente documento, tales como el muestreo binomial) para analizar una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares, cada una de las cuales se ha identificado que comprende una pluralidad de variantes en fase, para determinar de este modo una primera probabilidad de que el sujeto tenga una primera afección (p. ej., 80 %) y una segunda probabilidad de que el sujeto tenga una segunda afección (o esté sano) (p. ej., 20 %).
El análisis del modelo estadístico como se divulga en el presente documento puede ser una solución aproximada mediante una aproximación numérica, tal como un modelo binomial, un modelo ternario, una simulación de Montecarlo o un método de diferencias limitadas. En un ejemplo, el análisis del modelo estadístico como se utiliza en el presente documento puede ser un análisis estadístico de Montecarlo. En otro ejemplo, el análisis del modelo estadístico como se utiliza en el presente documento puede ser un análisis de modelo binomial o ternario.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el método puede comprender el seguimiento de la evolución de la afección del sujeto en función de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, de modo que cada una de las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas comprenda una pluralidad de variantes en fase. En algunos casos, la evolución de la afección puede ser el empeoramiento de la afección, como se describe en la presente divulgación (p. ej., avance de un cáncer en estadio I a un cáncer en estadio III). En algunos casos, la evolución de la afección puede ser al menos una remisión parcial de la afección, como se describe en la presente divulgación (p. ej., descenso de un cáncer en estadio IV a un cáncer en estadio II). Como alternativa, en algunos casos, la evolución de la afección puede ser prácticamente la misma entre dos momentos distintos, como se describe en la presente divulgación. En un ejemplo, el método puede comprender determinar las verosimilitudes o probabilidades de diferentes avances de la afección del sujeto. Por ejemplo, el método puede comprender usar uno o más algoritmos (p. ej., que comprenden uno o más modelos matemáticos como se divulga en el presente documento, tales como el muestreo binomial) para determinar una primera probabilidad de que la afección del sujeto sea peor que antes (p. ej., 20 %), una segunda probabilidad de remisión al menos parcial de la afección (p. ej., 70 %) y una tercera probabilidad de que la afección del sujeto sea la misma que antes (p. ej., 10 %).
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el método puede comprender realizar un procedimiento diferente (p. ej., procedimientos diagnósticos de seguimiento) para confirmar la afección del sujeto, afección que se ha determinado y/o cuyo progreso se ha supervisado, como se proporciona en la presente divulgación. Los ejemplos no limitativos de un procedimiento diferente pueden incluir una exploración física, captura de imágenes médicas, una prueba genética, mamografía, endoscopia, muestras de heces, prueba de Papanicolaou, análisis de sangre de alfa-fetoproteína, prueba de CA-125, prueba del antígeno específico de la próstata (AEP), extracción de biopsia, aspiración de médula ósea y pruebas de detección de marcadores tumorales. La captura de imágenes médicas incluye, aunque no de forma limitativa, las radiografías, resonancia magnética (RM), tomografía computarizada (TC), ecografía y tomografía por emisión de positrones (TEP). La endoscopia incluye, aunque no de forma limitativa, la broncoscopia, colonoscopia, colposcopia, cistoscopia, esofagoscopia, gastroscopia, laparoscopia, neuroendoscopia, proctoscopia y sigmoidoscopia.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el método puede comprender determinar un tratamiento para la afección del sujeto en función de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, comprendiendo cada molécula de ácido nucleico extracelular identificada una pluralidad de variantes en fase. En algunos casos, el tratamiento puede determinarse basándose en (i) la afección determinada del sujeto y/o (ii) la evolución determinada de la afección del sujeto. Además, el tratamiento puede determinarse en función de uno o más factores adicionales de los siguientes: sexo, nacionalidad, edad, etnia y otros estados físicos del sujeto. En algunos ejemplos, el tratamiento puede determinarse en función de uno o más rasgos de la pluralidad de variantes en fase de las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, como se divulga en el presente documento.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el sujeto puede no haber sido sometido a ningún tratamiento para la afección, p. ej., el sujeto puede no haber sido diagnosticado de la afección (p. ej., un linfoma). En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, el sujeto puede haber sido sometido a un tratamiento para la afección antes de cualquier método de la presente divulgación. En algunos casos, los métodos divulgados en el presente documento pueden realizarse para controlar el progreso de la afección que se le ha diagnosticado al sujeto, para, de este modo, (i) determinar la eficacia del tratamiento anterior y (ii) evaluar si se debe mantener el tratamiento, modificar el tratamiento o cancelar el tratamiento en favor de un nuevo tratamiento.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, los ejemplos no limitativos de un tratamiento (p. ej., tratamiento previo, nuevo tratamiento que se determinará basándose en los métodos de la presente divulgación, etc.) pueden incluir quimioterapia, radioterapia, quimiorradioterapia, inmunoterapia, terapia celular adoptiva (p. ej., terapia con linfocitos T receptores de antígeno quimérico (CAR), terapia con linfocitos NK CAR, terapia con linfocitos T con receptores de linfocitos T (TCR) modificados, etc.) terapia hormonal, terapia farmacológica dirigida, cirugía, trasplante, transfusión o vigilancia médica.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la afección puede comprender una enfermedad. En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la afección puede comprender una neoplasia, cáncer o tumor. En un ejemplo, la afección puede comprender un tumor sólido. En otro ejemplo, la afección puede comprender un linfoma, tal como linfoma de linfocitos B (LLB). Sin embargo, solo los métodos que no se están relacionados con una neoplasia hematológica caracterizaron los métodos de las reivindicaciones adjuntas. Como ejemplos no limitativos de LLB se pueden incluir linfoma difuso de linfocitos B grandes (LDLBG), linfoma folicular (LF), linfoma de Burkitt (LB), leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (LLC), linfoma de linfocitos B de la zona marginal (LZM) y linfoma de células del manto (LCM).
Como se divulga en el presente documento, un tratamiento para una afección del sujeto puede comprender la administración al sujeto de uno o más agentes terapéuticos. El o los fármacos terapéuticos pueden administrarse al sujeto por una o más de las siguientes vías: oral, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, transdérmica, intramuscular, liposomal, a través de suministro local por catéter o stent, por vía subcutánea, por vía intraadiposa y por vía intratecal.
Los ejemplos no limitativos de los fármacos terapéuticos pueden incluir agentes citotóxicos, agentes quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes utilizados en radioterapia, agentes antiangiogénesis, agentes apoptóticos, agentes antitubulina y otros agentes para tratar el cáncer, por ejemplo, anticuerpos anti-CD20, anticuerpos anti-PD1 (p. ej., Pembrolizumab) inhibidores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (p. ej., GLEEVEC<™>(mesilato de imatinib)), un inhibidor de COX-2 (p. ej., celecoxib), interferones, citocinas, antagonistas (p. ej., anticuerpos neutralizantes) que se unen a una o más de las siguientes dianas PDGFR-β, BlyS, APRIL, receptor(es) de BCMA, TRAIL/Apo2, otros agentes químicos bioactivos y orgánicos y similares.
Los ejemplos no limitativos de un agente citotóxico pueden incluir isótopos radiactivos (p. ej., At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterápicos, p. ej., metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos, tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal.
Los ejemplos no limitativos de un agente quimioterápico pueden incluir agentes alquilantes tales como tiotepa y CYTOXAN<®>ciclofosfamida; alquilsulfonatos, tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL<®>); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético de topotecán (HYCAMTIN<®>), CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR<®>), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos, adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (concretamente, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiína; espongistatina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediína; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una espiramicina; así como cromóforo de neocarcinostatina y cromóforos de antibióticos de enediína relacionados con cromoproteína), aclacinomicinas, actinomicina, antramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN<®>(incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolin-doxorubicina y desoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; eflornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidracida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK<®>(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2''-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verrucarina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE<®>, FILDESIN<®>); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, taxanos, incluyendo TAXOL<®>paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), \ABRAXANE<™>sin Cremophor, formulación de paclitaxel de nanopartículas modificadas por ingeniería genética con albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.) y TAXOTERE<®>doxetaxel (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina (GEMZAR<®>); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN<®>); platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN<®>); oxaliplatino; leucovorina; vinorelbina (NAVELBINE<®>); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico; capecitabina (XELODA<®>); sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura para una pauta de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN<™>) combinado con 5-FU y leucovorina.
Los ejemplos de "agentes quimioterápicos" también pueden incluir "agentes antihormonales" o "agentes terapéuticos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer y, con frecuencia, se presentan en forma de tratamiento sistémico o de todo el cuerpo. Pueden ser, en sí, hormonas. Los ejemplos incluyen antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM, por sus siglas en inglés), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluido NOLVADEX<®>tamoxifeno), EVISTA<®>raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y FARESTON<®>toremifeno; anti-progesteronas; reguladores negativos del receptor de estrógenos (ERD); agentes que funcionan suprimiendo o anulando los ovarios, por ejemplo, agonistas de la hormona liberadora de hormona leutinizante (LHRH), tales como el acetato de leuprolida (LUPRON<®>y ELIGARD), acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE<®>acetato de megestrol, exemestano AROMASIN<®>, formestanio, fadrozol, vorozol RIVISOR<®>, FEMARA<®>letrozol y ARIMIDEX<®>anastrozol. Además, dicha definición de agentes quimioterápicos incluye bifosfonatos como el clodronato (por ejemplo, BONEFOS<®>u OSTAC<®>), DIDROCAL<®>etidronato, NE-58095, ZOMETA<®>ácido zoledrónico/zoledronato, FOSAMAX<®>alendronato, AREDIA<®>pamidronato, SKELID<®>tiludronato o ACTONEL<®>risedronato; así como troxacitabina (un análogo nucleosídico de 1,3-dioxolano citosina); oligonucleótidos antisentido, particularmente, los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR); vacunas, tales como la vacuna THERATOPE<®>y vacunas de terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN<®>, vacuna LEUVECTIN<®>y vacuna VAXID<®>; LURTOTECAN<®>inhibidor de la topoisomerasa 1; ABARELIX<®>rmRH; ditosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña de tirosina cinasa dual de ErbB-2 y EGFR, también conocido como GW572016); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Los ejemplos de un agente quimioterápico también pueden incluir anticuerpos tales como alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN<®>, Genentech); cetuximab (ERBITUX<®>, Imclone); panitumumab (VECTIBIX<®>, Amgen), rituximab (RITUXAN<®>, Genentech/Biogen Idec), pertuzumab (OMNITARG<®>, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN<®>, Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia) y el conjugado de anticuerpo y fármaco, gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG<®>, Wyeth). Los anticuerpos monoclonales humanizados adicionales con potencial terapéutico como agentes en combinación con los compuestos de la invención incluyen: apofizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bivatuzumab mertansina, cantuzumab mertansina, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, feMzumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicina, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, ocrelizumab, omalizumab, palivizumab, pascolizumab, pecfusituzumab, pectuzumab, pexelizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resivizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, tacatuzumab tetraxetán, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, tucotuzumab celmoleucina, tucusituzumab, umavizumab, urtoxazumab, ustekinumab, visilizumab y el anti-interleucina-12 (ABT-874/J695, Wyeth Research y Abbott Laboratories) que es una secuencia recombinante exclusivamente humana, anticuerpo IgG1λ de longitud completa modificado genéticamente para reconocer la proteína interleucina-12 p40.
Los ejemplos de un agente quimioterápico también pueden incluir "inhibidores de la tirosina cinasa", tales como un agente dirigido al EGFR (p. ej., molécula pequeña, anticuerpo, etc.); inhibidor de tirosina cinasa de HER2 de molécula pequeña tal como TAK165 disponible en Takeda; CP-724714, un inhibidor selectivo oral de tirosina cinasa receptora de ErbB2 (Pfizer y OSI); inhibidores de HER duales tales como EKB-569 (disponibles en Wyeth) que se une preferentemente a EGFR pero inhibe células que sobreexpresan tanto HER2 como EGFR; lapatinib (GSK572016; disponible en Glaxo-SmithKline), un inhibidor de tirosina cinasa de HER2 y EGFR oral; PKI-166 (disponible en Novartis); pan-inhibidores de HER, tales como canertinib (CI-1033; Pharmacia); inhibidores de Raf-1, tales como el agente antisentido ISIS-5132, disponible en ISIS Pharmaceuticals, que inhibe la señalización de Raf-1; inhibidores de TK no dirigidos a HER, tales como imatinib mesilato (GLEEVEC<®>, disponible en Glaxo SmithKline); inhibidores de tirosina cinasa multidirigidos tales como sunitinib (SUTENT<®>, disponible en Pfizer); inhibidores de tirosina cinasa receptora de VEGF, tales como vatalanib (PTK787/ZK222584, disponible en Novartis/Schering AG); inhibidor I de cinasa regulada extracelular MAPK CI-1040 (disponible en Pharmacia); quinazolinas, tales como PD 153035,4-(3-cloroanilino) quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d] pirimidinas; curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis (4-fluoroanilino)ftalimida); tirfostinas que contienen restos de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lamber); moléculas antisentido (p. ej., las que se unen a un ácido nucleico que codifica HER); quinoxalinas (patente de EE. UU. N.º 5804396); trifostinas (patente de EE. UU. N.º 5804396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); pan-inhibidores de HER, tales como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de imatinib (Gleevec<®>); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxinib (Pfizer); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); y rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE<®>).
Los ejemplos de un agente quimioterápico también pueden incluir dexametasona, interferones, colchicina, metoprina, ciclosporina, anfotericina, metronidazol, alemtuzumab, alitretinoína, alopurinol, amifostina, trióxido de arsénico, asparaginasa, BCG vivo, bevacuzimab, bexaroteno, cladribina, clofarabina, darbepoetina alfa, denileucina, dexrazoxano, epoetina alfa, elotinib, filgrastim, acetato de histrelina, ibritumomab, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, lenalidomida, levamisol, mesna, metoxsaleno, nandrolona, nelarabina, nofetumomab, oprelvekina, palifermina, pamidronato, pegademasa, pegaspargasa, pegfilgrastim, pemetrexed disódico, plicamicina, porfímero sódico, quinacrina, rasburicasa, sargramostim, temozolomida, VM-26, 6-TG, toremifeno, tretinoína, ATRA, valrubicina, zoledronato y ácido zoledrónico y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Los ejemplos de un agente quimioterápico también pueden incluir hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, acetato de cortisona, pivalato de tixocortol, acetónido de triamcinolona, alcohol de triamcinolona, mometasona, amcinonida, budesonida, desonida, fluocinonida, acetónido de fluocinolona, betametasona, fosfato sódico de betametasona, dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, fluocortolona, hidrocortisona-17-butirato, hidrocortisona-17-valerato, dipropionato de aclometasona, valerato de betametasona, dipropionato de betametasona, prednicarbato, clobetasona-17-butirato, clobetasol-17-propionato, fluocortolona caproato, fluocortolona pivalato y fluprednideno acetato; péptidos antiinflamatorios inmunoselectivos (ImSAID), tales como fenilalanina-glutamina-glicina (FEG) y su forma D-isomérica (feG) (IMULAN BioTherapeutics, LLC); fármacos contra el reuma, tales como azatioprina, ciclosporina (ciclosporina A), D-penicilamina, sales de oro, hidroxicloroquina, leflunomida, minociclina, sulfasalazina, bloqueantes del factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), tales como etanercept (ENBREL<®>), infliximab (REMICADE<®>), adalimumab (HUMIRA<®>), certolizumab pegol (CIMZIA<®>), golimumab (SIMPONI<®>), bloqueantes de interleucina 1 (IL-1) tales como anakinra (KINERET<®>), bloqueantes de la coestimulación de linfocitos T tales como abatacept (ORENCIA<®>), bloqueantes de interleucina 6 (IL-6) tales como tocilizumab (ACTEMERA<®>); bloqueantes de interleucina 13 (IL-13) tales como lebrikizumab; bloqueantes de interferón alfa (IFN) tales como rontalizumab; bloqueantes de integrina beta 7, tales como rhuMAb Beta7; bloqueantes de la vía de IgE tales como Anti-M1 prima; bloqueantes de LTa3 homotrimérica secretada y de heterotrímero de LTa/β2 unidos a membrana, tales como anti-linfotoxina alfa (LTa); agentes de investigación misceláneos tales como tioplatino, PS-341, fenilbutirato, ET-18-OCH3, o inhibidores de la famesil transferasa (L-739749, L-744832); polifenoles tales como quercetina, resveratrol, piceatanol, galato de epigalocatequina, teaflavinas, flavanoles, procianidinas, ácido betulínico y derivados de los mismos; inhibidores de la autofagia tales como cloroquina; delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL<®>); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); podofilotoxina; tegafur (UFTORAL<®>); bexaroteno (TARGRETIN<®>); bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS<®>u OSTAC<®>), etidronato (DIDROCAL<®>), NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA<®>), alendronato (FOSAMAX<®>), pamidronato (AREDIA<®>), tiludronato (SKELID<®>) o risedronato (ACTONEL<®>); receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas tales como la vacuna THERATOPE<®>; perifosina, inhibidor de la COX-2 (p. ej., celecoxib o etoricoxib), inhibidor del proteasoma (p. ej., PS341); CCI-779; tipifamib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersen sódico (GENASENSE<®>); pixantrona; inhibidores de la farnesil transferasa tales como lonafamib (SCH 6636, SARASAR<™>); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores.
De acuerdo con muchas realizaciones, una vez indicado el diagnóstico de cáncer, se pueden realizar varios tratamientos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, cirugía, resección, quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, terapia dirigida, hormonoterapia, trasplante de células madre y transfusión de sangre. En algunas realizaciones, se administra un agente antineoplásico y/o quimioterápico, incluyendo, aunque no de forma limitativa, agentes alquilantes, agentes de platino, taxanos, agentes de la vinca, fármacos antiestrogénicos, inhibidores de la aromatasa, agentes supresores ováricos, agentes endocrinos/hormonales, agentes de terapia con bifosfonatos y agentes de terapia biológica dirigida. Las medicaciones incluyen, pero sin limitación, ciclofosfamida, fluorouracilo (o 5-fluorouracilo o 5-FU), metotrexato, tiotepa, carboplatino, cisplatino, taxanos, paclitaxel, paclitaxel unido a proteína, docetaxel, vinorelbina, tamoxifeno, raloxifeno, toremifeno, fulvestrant, gemcitabina, irinotecán, ixabepilona, temozolomida, topotecán, vincristina, vinblastina, eribulina, mutamicina, capecitabina, capecitabina, anastrozol, exemestano, letrozol, leuprorelina, abarelix, buserelina, goserelina, acetato de megestrol, risedronato, pamidronato, ibandronato, alendronato, zoledronato, tykerb, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, valrubicina mitoxantrona, bevacizumab, cetuximab, ipilimumab, ado-trastuzumab emtansina, afatinib, aldesleucina, alectinib, alemtuzumab, atezolizumab, avelumab, axtinib, belimumab, belinostat, bevacizumab, blinatumomab, bortezomib, bosutinib, brentuximab vedotina, brigatinib, cabozantinib, canakinumab, carfilzomib, certinib, cetuximab, cobimetinib, crizotinib, dabrafenib, daratumumab, dasatinib, denosumab, dinutuximab, durvalumab, elotuzumab, enasidenib, erlotinib, everolimus, gefitinib, ibritumomab tiuxetán, ibrutinib, idelalisib, imatinib, ipilimumab, ixazomib, lapatinib, lenvatinib, midostaurina, necitumumab, neratinib, nilotinib, niraparib, nivolumab, obinutuzumab, ofatumumab, olaparib, olaratumab, osimertinib, palbociclib, panitumumab, panobinostat, pembrolizumab, pertuzumab, ponatinib, ramucirumab, regorafenib, ribociclib, rituximab, romidepsina, rucaparib, ruxolitinib, siltuximab, sipuleucel-T, sonidegib, sorafenib, temsirolimus, tocilizumab, tofacitinib, tositumomab, trametinib, trastuzumab, vandetanib, vemurafenib, venetoclax, vismodegib, vorinostat y ziv-aflibercept. De acuerdo con diversas realizaciones, un individuo puede ser tratado mediante un único medicamento o una combinación de medicamentos descritos en el presente documento. Una combinación de tratamiento habitual es ciclofosfamida, metotrexato y 5-fluorouracilo (CMF).
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico extracelulares (p. ej., ADNec, ARNec) puede obtenerse de una célula. Por ejemplo, se puede obtener una muestra celular o de tejido de un sujeto y procesarla para eliminar todas las células de la muestra, produciendo de este modo moléculas de ácido nucleico extracelulares derivadas de la muestra.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, una secuencia genómica de referencia puede proceder de una célula de un individuo. El individuo puede ser un control sano o el sujeto que está siendo sometido a los métodos divulgados en el presente documento para determinar o supervisar la evolución de una afección.
Una célula puede ser una célula sana. Como alternativa, una célula puede ser una célula enferma. Una célula enferma puede tener alteraciones metabólicas, de expresión génica y/o de características morfológicas. Una célula enferma puede ser una célula cancerosa, una célula diabética y una célula apoptótica. Una célula enferma puede ser una célula de un sujeto enfermo. Entre las enfermedades ilustrativas se pueden incluir los trastornos sanguíneos, cánceres, trastornos metabólicos, trastornos oculares, trastornos orgánicos, trastornos musculoesqueléticos, enfermedades cardíacas y similares.
Una célula puede ser una célula de mamífero o derivada de una célula de mamífero. Una célula puede ser una célula de roedor o derivada de una célula de roedor. Una célula puede ser una célula humana o derivada de una célula humana. Una célula puede ser una célula procariota o derivada de una célula procariota. Una célula puede ser una célula bacteriana o puede derivar de una célula bacteriana. Una célula puede ser una célula arquea o derivada de una célula arquea. Una célula puede ser una célula eucariota o derivada de una célula eucariota. Una célula puede ser una célula madre pluripotente. Una célula puede ser una célula vegetal o derivada de una célula vegetal. Una célula puede ser una célula animal o derivada de una célula animal. Una célula puede ser una célula de invertebrado o derivada de una célula de invertebrado. Una célula puede ser una célula de vertebrado o derivada de una célula de vertebrado. Una célula puede ser una célula microbiana o derivada de una célula microbiana. Una célula puede ser una célula fúngica o derivada de una célula fúngica. Una célula puede proceder de un órgano o tejido específico.
Algunos ejemplos no limitativos de célula(s) pueden incluir células linfoides, tales como linfocito B, linfocito T (linfocito T citotóxico, linfocito T citolítico natural, linfocito T regulador, linfocito T auxiliar), linfocito citolítico natural, linfocitos citolíticos inducidos por citocinas (CIK); células mieloides, tales como granulocitos (granulocito basófilo, granulocito eosinófilo, granulocito neutrófilo/neutrófilo hipersegmentado), monocito/macrófago, glóbulo rojo (reticulocito), mastocito, trombocito/megacariocito, célula dendrítica; células del sistema endocrino, incluido el tiroides (célula epitelial tiroidea, célula parafolicular), paratiroides (célula principal paratiroidea, célula oxífila), suprarrenal (célula cromafín), células pineales (pinealocitos); células del sistema nervioso, incluidos neurogliocitos (astrocitos, microglía), célula neurosecretora magnocelular, célula estrellada, célula de Boettcher e hipófisis (gonadotropo, corticotropo, tirotropo, somatotropo, lactotrofo); células del sistema respiratorio, incluidos el neumocito (neumocito de tipo I, neumocito de tipo II), célula exocrina bronquiolar, célula caliciforme, macrófago alveolar; células del sistema circulatorio, incluidos el miocardiocito, pericito; células del aparato digestivo, incluidas del estómago (célula principal gástrica, célula parietal), célula caliciforme, célula de Paneth, células G, células D, células ECL, células I, células K, células S; células enteroendocrinas, incluidas la célula enterocromafín, célula APUD, de hígado (hepatocito, célula de Kupffer), cartílago/hueso/músculo; células óseas, incluido el osteoblasto, osteocito, osteoclasto, dientes (cementoblasto, ameloblasto); células de cartílago, incluidos el condroblasto, condrocito; células de la piel, incluidos el tricocito, queratinocito, melanocito (nevocito); células musculares, incluido el miocito; células del sistema urinario, incluidos el podocito, célula yuxtaglomerular, célula mesangial intraglomerular/célula mesangial extraglomerular, célula del borde en cepillo del túbulo proximal renal, célula de la mácula densa; células del aparato reproductor, incluidos el espermatozoide, célula de Sertoli, célula de Leydig, óvulo; y otras células, incluidos el adipocito, fibroblasto, célula tendinosa, queratinocito epidérmico (célula epidérmica diferenciadora), célula basal epidérmica (célula madre), queratinocito de las uñas, célula basal del lecho ungueal (célula madre), célula medular del tallo piloso, célula cortical del tallo piloso, célula cuticular del tallo piloso, célula cuticular de la vaina radicular del pelo, célula de la vaina radicular del pelo de la capa de Huxley, célula de la vaina radicular del pelo de la capa de Henle, célula externa de la vaina radicular del pelo, célula de la matriz del pelo (célula madre), células epiteliales de barrera estratificada húmeda, célula epitelial superficial del epitelio escamoso estratificado de la córnea, lengua, cavidad bucal, esófago, canal anal, uretra distal y vagina, célula basal (célula madre) de los epitelios de la córnea, lengua, cavidad bucal, esófago, canal anal, uretra distal y vagina, célula del epitelio urinario (que recubre la vejiga urinaria y los conductos urinarios), células epiteliales secretoras exocrinas, célula mucosa de la glándula salival (secreción rica en polisacáridos), célula serosa de la glándula salival (secreción rica en enzimas glucoproteicas), célula de la glándula de Von Ebner en la lengua (lavado de las papilas gustativas), célula de la glándula mamaria (secreción de leche), célula de la glándula lagrimal (secreción lagrimal), célula de la glándula ceruminosa del oído (secreción de cera), célula oscura de la glándula sudorípara exocrina (secreción de glucoproteínas), célula clara de la glándula sudorípara exocrina (secreción de moléculas pequeñas), célula de la glándula sudorípara apocrina (secreción odorífera, sensible a las hormonas sexuales), glándula de Moll en el párpado (glándula sudorípara especializada), célula de la glándula sebácea (secreción de sebo rico en lípidos), célula de la glándula de Bowman en la nariz (lavado del epitelio olfativo), célula de la glándula de Brunner en el duodeno (enzimas y moco alcalino), célula de la vesícula seminal (segrega componentes del líquido seminal, incluida la fructosa para la natación de los espermatozoides), célula de la glándula prostática (segrega componentes del líquido seminal), célula de la glándula bulbouretral (secreción mucosa), célula de la glándula de Bartolino (secreción lubricante vaginal), célula de glándula de Littre (secreción mucosa), célula del endometrio uterino (secreción de carbohidratos), célula caliciforme aislada del tubo digestivo y las vías respiratorias (secreción mucosa), célula mucosa de revestimiento del estómago (secreción mucosa), célula zimógena de la glándula gástrica (secreción de pepsinógeno), célula oxíntica de la glándula gástrica (secreción de ácido clorhídrico), célula acinar pancreática (secreción de bicarbonato y enzimas digestivas), célula de Paneth del intestino delgado (secreción de lisozima), neumocito pulmonar de tipo II (secreción de tensioactivo), célula exocrina bronquiolar de pulmón, células secretoras de hormonas, células de la hipófisis anterior, somatotropos, lactotropos, tirotropos, gonadotropos, corticotropos, célula hipofisaria intermedia, células neurosecretoras magnocelulares, células intestinales y de las vías respiratorias, células de la glándula tiroidea, célula epitelial tiroidea, célula parafolicular, células de la glándula paratiroidea, célula principal paratiroidea, célula oxófila, células de la glándula suprarrenal, células cromafines, célula de Leydig de los testículos, célula de la teca interna del folículo ovárico, célula del cuerpo lúteo del folículo ovárico roto, células luteínicas de la granulosa, células luteínicas de la teca, célula yuxtaglomerular (secreción de renina), célula de la mácula densa del riñón, células de metabolismo y almacenamiento, células de función barrera (pulmón, intestino, glándulas exocrinas y aparato genitourinario), riñón, neumocito de tipo I (que reviste el espacio aéreo del pulmón), célula del conducto pancreático (célula centroacinar), célula del conducto no estriado (de glándula sudorípara, glándula salival, glándula mamaria, etc.), célula del conducto (de la vesícula seminal, próstata, etc.), células epiteliales que revisten las cavidades internas cerradas del cuerpo, células ciliadas con función propulsora, células de secreción de matriz extracelular, células contráctiles; células del músculo esquelético, célula madre, células del músculo cardíaco, células sanguíneas y del sistema inmunitario, eritrocito (glóbulo rojo), megacariocito (precursor de las plaquetas), monocito, macrófago del tejido conjuntivo (diferentes tipos), célula epidérmica de Langerhans, osteoclasto (en el hueso), célula dendrítica (en los tejidos linfoides), microgliocito (en el sistema nervioso central), granulocito neutrófilo, granulocito eosinófilo, granulocito basófilo, mastocito, linfocito T auxiliar, linfocito T supresor, linfocito T citotóxico, linfocito T citolítico natural, linfocito B, linfocito citolítico natural, reticulocito, células madre y progenitores comprometidos para la sangre y el sistema inmunitario (diferentes tipos), células madre pluripotentes, células madre totipotentes, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas, células transductoras sensoriales, células neuronales autónomas, células de soporte de los órganos de los sentidos y de las neuronas periféricas, neuronas y neurogliocitos del sistema nervioso central, células del cristalino, células pigmentarias, melanocito, célula epitelial pigmentada de la retina, células germinales, oogonio/ovocito, espermátida, espermatocito, célula espermatogónica (célula madre del espermatocito), espermatozoide, células de Sertoli, célula folicular ovárica, célula de Sertoli (en testículo), célula epitelial del timo, células intersticiales y células renales intersticiales.
En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento, la afección puede ser un cáncer o un tumor. Sin embargo, solo no una neoplasia hematológica caracterizó el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Los ejemplos no limitativos de dicha afección pueden incluir el acantoma, carcinoma de células acínicas, neuroma acústico, melanoma lentiginoso acral, acroespiroma, leucemia eosinofílica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia monocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda con maduración, leucemia mieloide aguda de células dendríticas, leucemia mieloide aguda, leucemia promielocítica aguda, adamantinoma, adenocarcinoma, carcinoma adenoideo quístico, adenoma, tumor odontogénico adenomatoide, carcinoma adrenocortical, leucemia de linfocitos T del adulto, leucemia agresiva de linfocitos NK, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con SIDA, sarcoma alveolar de partes blandas, fibroma ameloblástico, cáncer de ano, linfoma anaplásico de células grandes, cáncer de tiroides anaplásico, linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T, angiomiolipoma, angiosarcoma, cáncer de apéndice, astrocitoma, tumor teratoide/rabdoide atípico, carcinoma basocelular, carcinoma de tipo basaloide, leucemia de linfocitos B, linfoma de linfocitos B, carcinoma de los conductos papilares, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, blastoma, cáncer de hueso, tumor óseo, glioma del tronco encefálico, tumor de cerebro, cáncer de mama, tumor de Brenner, tumor bronquial, carcinoma bronquioloalveolar, osteítis fibrosa quística, linfoma de Burkitt, cáncer de sitio primario desconocido, tumor carcinoide, carcinoma, carcinoma localizado, carcinoma del pene, carcinoma de sitio primario desconocido, carcinosarcoma, enfermedad de Castleman, tumor embrionario del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, cáncer cervicouterino, colangiocarcinoma, condroma, condrosarcoma, cordoma, coriocarcinoma, papiloma del plexo coroideo, leucemia linfocítica crónica, leucemia monocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastorno mieloproliferativo crónico, leucemia neutrofílica crónica, tumor de células claras, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma cutáneo de linfocitos T, enfermedad de Degos, dermatofibrosarcoma protuberante, quiste dermoide, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, linfoma difuso de linfocitos B grandes, tumor neuroepitelial disembrioplástico, carcinoma embrionario, tumor del seno endodérmico, cáncer de endometrio, cáncer de endometrio uterino, tumor endometrioide, linfoma de linfocitos T asociado a enteropatía, ependimoblastoma, ependimoma, sarcoma epitelioide, eritroleucemia, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, familia de tumor de Ewing, familia del sarcoma de Ewing, sarcoma de Ewing, tumor de células germinales extracraneales, tumor de células germinales extragonadales, cáncer del conducto biliar extrahepático, enfermedad de Paget extramamaria, cáncer de las trompas de falopio, fetus in fetu, fibroma, fibrosarcoma, linfoma folicular, cáncer de tiroides folicular, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vesícula biliar, ganglioglioma, ganglioneuroma, cáncer gástrico, linfoma gástrico, cáncer gastrointestinal, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal, tumor de células germinales, germinoma, coriocarcinoma gestacional, tumor trofoblástico gestacional, tumor de células gigantes del hueso, glioblastoma multiforme, glioma, gliomatosis cerebral, tumor glómico, glucagonoma, gonadoblastoma, tumor de células de la granulosa, tricoleucemia, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cardíaco, hemangioblastoma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, neoplasia hematológica, carcinoma hepatocelular, linfoma hepatosplénico de linfocitos T, síndrome hereditario de cáncer de mama y ovario, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma hipotalámico, cáncer de mama inflamatorio, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes, tumores de células de los islotes, leucemia mielomonocítica juvenil, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, tumor de Klatskin, tumor de Krukenberg, cáncer de laringe, cáncer de laringe, melanoma sobre lentigo maligno, leucemia, leucemia, cáncer de labio y de la cavidad oral, liposarcoma, cáncer de pulmón, luteoma, linfangioma, linfangiosarcoma, linfoepitelioma, leucemia linfoide, linfoma, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno, histiocitoma fibroso maligno de hueso, glioma maligno, mesotelioma maligno, tumor maligno de la vaina del nervio periférico, tumor rabdoide maligno, tumor tritón maligno, linfoma MALT, linfoma de células del manto, leucemia de mastocitos, tumor mediastínico de células germinales, tumor mediastínico, cáncer medular de tiroides, meduloblastoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, melanoma, meningioma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con tumor primario oculto, carcinoma urotelial metastásico, tumor mulleriano mixto, leucemia monocítica, cáncer de boca, cáncer mucinoso, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, mieloma múltiple, micosis fungoide, micosis fungoide, enfermedad mielodisplásica, síndromes mielodisplásicos, leucemia mieloide, sarcoma mieloide, enfermedad mieloproliferativa, mixoma, cáncer de la cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, carcinoma nasofaríngeo, neoplasia, neurinoma, neuroblastoma, neuroblastoma, neurofibroma, neuroma, melanoma nodular, linfoma no hodgkiniano, linfoma no hodgkiniano, cáncer de piel distinto de melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, oncología ocular, oligoastrocitoma, oligodendroglioma, oncocitoma, meningioma de la vaina del nervio óptico, cáncer oral, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de ovario, cáncer de ovario epitelial, tumor de células germinales ováricas, tumor ovárico de bajo potencial maligno, enfermedad de Paget de mama, tumor de Pancoast, cáncer de páncreas, cáncer de páncreas, cáncer papilar de tiroides, papilomatosis, paraganglioma, cáncer de seno paranasal, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, tumor de células epitelioides perivasculares, cáncer de faringe, feocromocitoma, tumor del parénquima pineal de diferenciación intermedia, pineoblastoma, pituicitoma, adenoma hipofisario, tumor de la hipófisis, neoplasia de células plasmáticas, blastoma pleuropulmonar, poliembrioma, linfoma linfoblástico de linfocitos T precursores, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma de efusión primario, cáncer hepatocelular primario, cáncer de hígado primario, cáncer peritoneal primario, tumor neuroectodérmico primitivo, cáncer de próstata, pseudomixoma peritoneal, cáncer de recto, carcinoma de células renales, carcinoma de las vías respiratorias que implica el gen NUT en el cromosoma 15, retinoblastoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, transformación de Richter, teratoma sacrococcígeo, cáncer de glándula salival, sarcoma, schwannomatosis, carcinoma de las glándulas sebáceas, neoplasia secundaria, seminoma, tumor seroso, tumor de células de Sertoli-Leydig, tumor del estroma del cordón sexual, síndrome de Sezary, carcinoma de células en anillo de sello, cáncer de piel, tumor de células pequeñas redondas y azules, carcinoma microcítico, cáncer de pulmón microcítico, linfoma de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, somatostatinoma, verruga del hollín, tumor de la médula espinal, tumor espinal, linfoma esplénico de la zona marginal, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago, melanoma de diseminación superficial, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, tumor de superficie epitelial-estromal, sarcoma sinovial, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T, leucemia de linfocitos T granulares grandes, leucemia de linfocitos T, linfoma de linfocitos T, leucemia prolinfocítica de linfocitos T, teratoma, cáncer linfático terminal, cáncer de testículo, tecoma, cáncer de garganta, carcinoma tímico, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, carcinoma de células transicionales, cáncer de uraco, cáncer uretral, neoplasia urogenital, sarcoma uterino, melanoma uveal, cáncer de vagina, síndrome de Verner Morrison, carcinoma verrugoso, glioma de la vía visual, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenström, tumor de Warthin y tumor de Wilms.
De acuerdo con diversas realizaciones, pueden detectarse numerosos tipos de neoplasias, incluyendo, aunque no de forma limitativa, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), cáncer de ano, astrocitomas, carcinoma basocelular, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de mama, linfoma de Burkitt, cáncer cervicouterino, leucemia linfocítica crónica (LLC) y leucemia mielógena crónica (LMC), neoplasias mieloproliferativas crónicas, cáncer colorrectal, linfoma difuso de linfocitos B grandes, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, estesioneuroblastoma, sarcoma de Ewing, cáncer de las trompas de Falopio, linfoma folicular, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tricoleucemia, cáncer hepatocelular, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, histiocitosis de células de Langerhans, cáncer de laringe, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma, cáncer de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de boca, neuroblastoma, linfoma no hodgkiniano, cáncer de pulmón no microcítico, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, tumores neuroendocrinos pancreáticos, cáncer de faringe, tumor de la hipófisis, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de células renales, retinoblastoma, cáncer de piel, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de intestino delgado, cáncer escamoso de cuello, linfoma de linfocitos T, cáncer de testículo, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer vaginal y tumores vasculares.
Muchas realizaciones están dirigidas a exploraciones de diagnóstico o de diagnóstico complementario realizadas durante el tratamiento del cáncer de un individuo. Al realizar exploraciones diagnósticas durante el tratamiento, se puede controlar la capacidad del agente para tratar el crecimiento del cáncer. La mayoría de los agentes terapéuticos antineoplásicos provocan la muerte y necrosis de las células neoplásicas, lo que debería liberar mayores cantidades de ácidos nucleicos de estas células en las muestras analizadas. Por consiguiente, el nivel de ácidos nucleicos tumorales circulantes puede controlarse a lo largo del tiempo, ya que el nivel debería aumentar durante los primeros tratamientos y empezar a disminuir a medida que se reduce el número de células cancerosas. En algunas realizaciones, los tratamientos se ajustan en función del efecto del tratamiento sobre las células cancerosas. Por ejemplo, si el tratamiento no es citotóxico para las células neoplásicas, se puede aumentar la dosis o administrar un agente con mayor citotoxicidad. Como alternativa, si la citotoxicidad de las células cancerosas es buena pero los efectos secundarios no deseados son elevados, se puede disminuir la dosis o administrar un agente con menos efectos secundarios.
Diversas realizaciones también están dirigidas a exploraciones diagnósticas realizadas después del tratamiento de un individuo para detectar la enfermedad residual y/o la recurrencia del cáncer. Si una exploración diagnóstica indica un cáncer residual y/o recurrente, pueden realizarse otras pruebas diagnósticas y/o tratamientos como se describe en el presente documento. Si el cáncer y/o el individuo son susceptibles de recidiva, pueden realizarse exploraciones diagnósticas con frecuencia para controlar cualquier posible recaída.
F. Sistemas informáticos
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un producto de programa informático, que se reivindica en sí, que comprende un medio no transitorio legible por ordenador que tiene codificado un código ejecutable por ordenador, el código ejecutable por ordenador adaptado para ser ejecutado para poner en práctica cualquiera de los métodos anteriores.
La presente divulgación proporciona sistemas informáticos que están programados para implementar métodos de la divulgación. El sistema puede, en algunos casos, incluir componentes tales como un procesador, un módulo de entrada para introducir datos de secuenciación o datos derivados de los mismos, un medio legible por ordenador que contiene instrucciones que, cuando las ejecuta el procesador, realizan un algoritmo sobre la entrada relativa a una o más moléculas de ácidos nucleicos extracelulares, y un módulo de salida que proporciona uno o más indicios asociados a la afección.
LaFIG.27muestra un sistema informático 2701 que está programado o configurado de otro modo para implementar parcialmente o todos los métodos divulgados en el presente documento. El sistema informático 2701 puede regular diversos aspectos de la presente divulgación, tales como, por ejemplo, (i) identificar, a partir de datos de secuenciación derivados de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares, una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase, (ii) analizar cualquiera de las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, (iii) determinar una afección del sujeto basándose al menos en parte en las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, (iv) supervisar la evolución de la afección del sujeto basándose al menos en parte en las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, (v) identificar al sujeto basándose al menos en parte en las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, o (vi) determinar un tratamiento adecuado de la afección del sujeto basándose al menos en parte en las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas. El sistema informático 2701 puede ser un dispositivo electrónico de un usuario o un sistema informático que se encuentra a distancia con respecto al dispositivo electrónico. El dispositivo electrónico puede ser un dispositivo electrónico móvil.
El sistema informático 2701 incluye una unidad central de procesamiento (CPU, también "procesador" y "procesador informático" en el presente documento) 2705, que puede ser un procesador de un solo núcleo o de múltiples núcleos, o una pluralidad de procesadores para procesamiento en paralelo. El sistema informático 2701 incluye también memoria o ubicación de memoria 2710 (p. ej., memoria de acceso aleatorio, memoria de solo lectura, memoria flash), unidad de almacenamiento electrónico 2715 (p. ej., disco duro), interfaz de comunicaciones 2720 (p. ej., adaptador de red) para comunicarse con uno o más sistemas adicionales, y dispositivos periféricos 2725, tales como una caché, otra memoria, almacenamiento de datos y/o adaptadores de pantalla electrónicos. La memoria 2710, la unidad de almacenamiento 2715, la interfaz 2720 y los dispositivos periféricos 2725 están en comunicación con la CPU 2705 a través de un bus de comunicaciones (líneas continuas), tal como una placa base. La unidad de almacenamiento 2715 puede ser una unidad de almacenamiento de datos (o depósito de datos) para almacenar datos. El sistema informático 2701 puede estar acoplado operativamente a una red informática ("red") 2730 con la ayuda de la interfaz de comunicaciones 2720. La red 2730 puede ser Internet, una internet y/o extranet, o una intranet y/o extranet que esté en comunicación con Internet. La red 2730 en algunos casos es una red de telecomunicaciones y/o datos. La red 2730 puede incluir uno o más servidores informáticos, que pueden habilitar la computación distribuida, tal como la computación en la nube. La red 2730, en algunos casos con ayuda del sistema informático 2701, puede implementar una red punto a punto, que puede permitir que los dispositivos acoplados al sistema informático 2701 se comporten como un cliente o como un servidor.
La CPU 2705 puede ejecutar una secuencia de instrucciones legibles por máquina, que puede plasmarse en un programa o software. Las instrucciones pueden almacenarse en una ubicación de memoria, tal como la memoria 2710. Las instrucciones pueden dirigirse a la CPU 2705, que posteriormente puede programar o configurar de otro modo la CPU 2705 para implementar métodos de la presente divulgación. Los ejemplos de operaciones realizadas por la CPU 2705 pueden incluir buscar, descodificar, ejecutar y postescritura.
La CPU 2705 puede formar parte de un circuito, tal como un circuito integrado. En el circuito se pueden incluir uno o más componentes adicionales del sistema 2701. En algunos casos, el circuito es un circuito integrado de aplicación específica (ASIC).
La unidad de almacenamiento 2715 puede almacenar archivos, tales como controladores, bibliotecas y programas guardados. La unidad de almacenamiento 2715 puede almacenar datos del usuario, p. ej., preferencias y programas de usuario. El sistema informático 2701 en algunos casos puede incluir una o más unidades de almacenamiento de datos adicionales que son externas al sistema informático 2701, tales como ubicadas en un servidor remoto que está en comunicación con el sistema informático 2701 a través de una intranet o de Internet.
El sistema informático 2701 puede comunicarse con uno o más sistemas informáticos remotos a través de la red 2730. Por ejemplo, el sistema informático 2701 puede comunicarse con un sistema informático remoto de un usuario. Entre los ejemplos de sistemas informáticos remotos se incluyen los ordenadores personales (p. ej., PC portátiles), pizarras o tabletas (p. ej., Apple<®>iPad, Samsung<®>Galaxy Tab), teléfonos, teléfonos inteligentes (p. ej., Apple<®>iPhone, dispositivo con Android, Blackberry<®>) o asistentes digitales personales. El usuario puede acceder al sistema informático 2701 a través de la red 2730.
Los métodos que se describen en el presente documento se pueden implementar mediante un código ejecutable por máquina (p. ej., procesador informático) almacenado en una ubicación de almacenamiento electrónico del sistema informático 2701, tal como, por ejemplo, en la memoria 2710 o en la unidad de almacenamiento electrónica 2715. El código ejecutable o legible por máquina puede proporcionarse en forma de software. Durante su uso, el código puede ser ejecutado por el procesador 2705. En algunos casos, el código puede recuperarse de la unidad de almacenamiento 2715 y almacenarse en la memoria 2710 para que el procesador 2705 tenga fácil acceso. En algunas situaciones, puede excluirse la unidad de almacenamiento electrónica 2715 y las instrucciones ejecutables por máquina se almacenan en la memoria 2710.
El código puede precompilarse y configurarse para usar con una máquina que tiene un procesador adaptado para ejecutar el código, o puede compilarse durante el tiempo de ejecución. El código puede suministrarse en un lenguaje de programación que puede seleccionarse para permitir que el código se ejecute de forma precompilada o compilada.
Algunos aspectos de los sistemas y métodos provistos en el presente documento, tales como el sistema informático 2701, pueden plasmarse en la programación. Diversos aspectos de la tecnología pueden considerarse "productos" o "artículos de fabricación" normalmente en forma de código ejecutable por máquina (o procesador) y/o datos asociados que se transportan o incorporan en un tipo de medio legible por máquina. El código ejecutable por máquina puede almacenarse en una unidad de almacenamiento electrónico, tal como una memoria (p. ej., memoria de solo lectura, memoria de acceso aleatorio, memoria flash) o un disco duro. Los medios de tipo "almacenamiento" pueden incluir cualquiera o todas las memorias tangibles de los ordenadores, procesadores o similares, o módulos asociados de las mismas, tales como diversas memorias semiconductoras, unidades de cinta, unidades de disco y similares, que puede proporcionar almacenamiento no transitorio en cualquier momento para la programación del software. En ocasiones, la totalidad o parte del software puede comunicarse a través de Internet o de otras redes de telecomunicaciones. Tales comunicaciones, por ejemplo, pueden permitir la carga del software desde un ordenador o procesador a otro, por ejemplo, desde un servidor de gestión o un ordenador central a la plataforma informática de un servidor de aplicaciones. Por lo tanto, otro tipo de soporte que puede llevar los elementos de software incluye el óptico, el eléctrico y las ondas electromagnéticas, tal como se usan a través de interfaces físicas entre dispositivos locales, a través de redes terrestres por cable y ópticas y de diversos enlaces aéreos. Los elementos físicos que transportan tales ondas, tales como enlaces por cable o inalámbricos, enlaces ópticos o similares, también pueden considerarse soportes portadores del software. Como se usan en el presente documento, a menos que se restrinjan a medios tangibles, no transitorios, de "almacenamiento", las expresiones tales como "soporte legible" por ordenador o máquina se refieren a cualquier soporte que participe en el suministro de instrucciones a un procesador para su ejecución.
En consecuencia, un medio legible por máquina, tal como código ejecutable por ordenador, puede adoptar muchas formas, incluyendo, pero sin limitación, un medio de almacenamiento tangible, un medio de onda portadora o un medio de transmisión físico. Los medios de almacenamiento no volátiles incluyen, por ejemplo, discos ópticos o magnéticos, tales como cualquiera de los dispositivos de almacenamiento en cualquier ordenador o similares, tales como los que se pueden usar para implementar las bases de datos, etc. mostrados en los dibujos. Los medios de almacenamiento volátiles incluyen memoria dinámica, tal como la memoria principal de dicha plataforma de ordenador. Los medios de transmisión tangibles incluyen cables coaxiales; cable de cobre y fibras ópticas, incluidos los cables que forman un bus dentro de un sistema informático. Los medios de transmisión de onda portadora pueden tomar la forma de señales eléctricas o electromagnéticas, u ondas acústicas o de luz, tales como las generadas durante las comunicaciones de datos por radiofrecuencia (RF) e infrarrojos (IR). Las formas comunes de medios legibles por ordenador incluyen, por ejemplo: un disquete, un disco flexible, disco duro, cinta magnética, cualquier otro medio magnético, un CD-ROM, DVD o DVD-ROM, cualquier otro medio óptico, tarjetas de papel perforadas, cualquier otro medio de almacenamiento físico con patrones de orificios, una RAM, una ROM, una PROM y una EPROM, una FLASH-EPROM, cualquier otro chip o cartucho de memoria, una onda portadora que transmita datos o instrucciones, cables o enlaces que transporten dicha onda portadora, o cualquier otro medio desde el cual un ordenador pueda leer código y/o datos de programación. Muchas de estas formas de medios legibles por ordenador pueden estar implicadas en llevar una o más secuencias de una o más instrucciones a un procesador para su ejecución.
El sistema informático 2701 puede incluir o estar en comunicación con una pantalla electrónica 2735 que incluye una interfaz de usuario (UI) 2740 para proporcionar, por ejemplo, (i) análisis de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, (ii) una afección determinada del sujeto basándose al menos en parte en las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, (iii) una evolución determinada de la afección del sujeto basándose al menos en parte en las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, (iv) el sujeto identificado que se sospecha que tiene la afección basándose en al menos en parte en las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, o (v) un tratamiento determinado de la afección del sujeto basado al menos en parte en las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas. Los ejemplos de UI incluyen, sin limitación, una interfaz gráfica de usuario (GUI) y una interfaz de usuario basada en web.
Los métodos y sistemas de la presente divulgación pueden implementarse mediante uno o más algoritmos. Un algoritmo puede implementarse mediante software al ser ejecutado por la unidad central de procesamiento 2705. El algoritmo puede, por ejemplo, (i) identificar, a partir de datos de secuenciación derivados de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares, una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden la pluralidad de variantes en fase, (ii) analizar cualquiera de las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, (iii) determinar una afección del sujeto basándose al menos en parte en las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, (iv) supervisar la evolución de la afección del sujeto basándose al menos en parte en las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, (v) identificar al sujeto basándose al menos en parte en las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas, o (vi) determinar un tratamiento adecuado de la afección del sujeto basándose al menos en parte en las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustrativos son representativos de realizaciones de la estimulación, sistemas y métodos descritos en el presente documento y no se entienden de forma excluyente.
Ejemplo 1: Distribución genómica de las variantes en fase
Se describe una alternativa a la secuenciación bicatenaria para reducir la tasa de error de fondo que implica la detección de "variantes en fase" (VF), donde se producen dos o más mutaciones encis(es decir, en la misma cadena de ADNFIG.1AyFIG.1E).De modo similar a la secuenciación bicatenaria, este método proporciona perfiles de error más bajos debido a la detección concordante de dos acontecimientos no de referencia separados en moléculas individuales. Sin embargo, a diferencia de la secuenciación bicatenaria, ambos acontecimientos se producen en el mismo par de lecturas de secuenciación, aumentando de este modo la eficiencia de la recuperación del genoma. Las mutaciones en fase están presentes en diversos tipos de cáncer, pero se dan en partes estereotipadas del genoma en neoplasias malignas de linfocitos B, probablemente debido a una hipermutación somática aberrante (aSHM) y específica dirigida por la desaminasa inducida por activación (AID). Se identifican las regiones más comunes de aSHM en los linfomas no hodgkinianas (LNH) de linfocitos B. En el presente documento se describe la secuenciación de enriquecimiento y detección de variantes en fases (PhasED-Seq), un método novedoso para detectar ADNtc mediante variantes en fase a fracciones tumorales del orden de partes por millón. En el presente documento se describe la demostración de que PhasED-Seq puede mejorar significativamente la detección de ADNtc en muestras clínicas tanto durante el tratamiento como antes de la recaída de la enfermedad.
Para identificar neoplasias malignas donde las VF pueden mejorar potencialmente la detección de la enfermedad, se evaluó la frecuencia de las VF en los distintos tipos de cáncer. Se analizaron los datos de secuenciación del genoma completo disponibles públicamente para identificar conjuntos de variantes que se producen a una distancia de <170 pb entre sí, que representa la longitud habitual de un único fragmento de ADNec que consiste en un único nucleosoma central y un conector asociado. La frecuencia de estas "variantes potenciales en fase",(ejemplo 10)que controla el número total de SNV, de 2538 tumores de 24 histologías oncológicas, incluidos tumores sólidos y neoplasias hematológicas malignos(FIG. 1B, FIG. 5ytabla 1)se identificó y resumió. Las VF se enriquecieron de forma más significativa en dos linfomas de linfocitos B (LDLBG y linfoma folicular, LF,p<0,05 frente a todas las demás histologías), un grupo de enfermedades con hipermutación impulsada por AID/AICDA.
Ejemplo 2: Mecanismos mutacionales subyacentes a las VF
Para investigar el origen de las VF, se compararon las firmas mutacionales de sustitución de una sola base (SBS) que contribuyen a SNV que se producen a una distancia de 170 pb de otra SNV, y SNV que se producen de forma aislada (p. ej., que no tienen otra SNV a una distancia de 170 pb) (ejemplo 10). Como se esperaba, las VF estaban muy enriquecidas en varias firmas mutacionales asociadas a mutaciones agrupadas. Las firmas de mutaciones agrupadas asociadas a la actividad de AID (SBS84 y SBS85) estaban significativamente enriquecidas en VF procedentes de linfomas de linfocitos B y LLC, mientras que las firmas asociadas a la actividad de APOBEC3B (SBS2 y SBS13), otro mecanismo de hipermutación de kataegis, estaban significativamente enriquecidas en VF de múltiples histologías de cáncer sólido, incluidos los adenocarcinomas de ovario, páncreas, próstata y mama(FIG.1CyFIG. 6A-6WW).Las firmas de mutaciones agrupadas asociadas a la actividad de AID (SBS84 y SBS85) estaban enriquecidas en VF halladas en linfomas y LLC, mientras que las firmas asociadas a la actividad de APOBEC3B (SBS2 y SBS13) estaban significativamente enriquecidas en cáncer de mama(FIG. 1CyFIG. 6A-6WW).Las VF de múltiples tipos tumorales también se asociaron con el SBS4, una firma asociada al consumo de tabaco. Asimismo, entre las VF en múltiples histologías tumorales, se observaron nuevos enriquecimientos en varias otras firmas sin mecanismos claramente asociados (p. ej., SBS24, SBS37, SBS38 y SBS39). Por el contrario, las firmas mutacionales asociadas al envejecimiento, tales como SBS1 y SBS5, estaban significativamente enriquecidas en SNV aisladas.
Ejemplo 3: Las VF aparecen en regiones genómicas estereotipadas de los cánceres linfoides
Para evaluar la distribución genómica de las VF potenciales, estos acontecimientos se dividieron primero en regiones de 1 kb para visualizar su frecuencia en los distintos tipos de tumores. Se observó una distribución sorprendentemente estereotipada de las VF en neoplasias linfoides individuales (p. ej., LDLBG, LF, linfoma de Burkitt (LB) y leucemia linfocítica crónica (CLL);FIG.1DyFIG.7).Por el contrario, en general, los cánceres no linfoides no presentaron una recidiva sustancial de VF agrupadas en regiones estereotipadas. Esta falta de estereotipia en la posición de las VF fue cierta incluso cuando se consideraron los melanomas y los cánceres de pulmón, enfermedades con VF frecuentes.
De manera destacable, la mayoría de las regiones hipermutadas eran compartidas entre los tres subtipos de linfoma, con las mayores densidades observadas en dianas conocidas de aSHM, incluidas BCL2, BCL6 y MYC, así como los locus de inmunoglobulina (Ig) que codifican las cadenas pesadas y ligeras IGH, IGK e IGL(tabla 2). Sorprendentemente, determinadas regiones dentro de los locus de Ig estaban densamente mutadas en casi todos los pacientes con linfoma, así como en pacientes con LLC(FIG. 1D).Entre los subtipos de linfoma, los tumores LDLBG albergaban el mayor número de regiones de 1 kb que contenían VF de forma recurrente(FIG.8A),coherente con el mayor número de genes mutados de forma recurrente que se observaba en este tipo de tumor. En total, se identificaron 1639 regiones únicas de 1 kb que contenían VF de forma recurrente en neoplasias linfoides B. Entre estas regiones de 1 kb asociadas a linfomas, cerca de un tercio cayó en áreas genómicas previamente asociadas con SHM fisiológico o aberrante en linfocitos B. Concretamente, el 19 % (315/1639) se ubicaron en regiones Ig, mientras que el 13 % (218/1639) se encontraban en partes de 68 dianas previamente identificadas de aSHM(tabla 2). Mientras que la mayoría de las VF cayeron en regiones no codificantes del genoma, también se identificaron locus adicionales afectados de forma recurrente no descritos previamente como dianas de aSHM, incluidas XBP1, LPP y AICDA, entre otras.
La distribución de las VF dentro de cada neoplasia linfoide maligna se correlacionó con características oncogénicas asociadas a la fisiopatología distintiva de la enfermedad correspondiente. Por ejemplo, los casos de LF, en los que más del 90 % de los tumores albergan fusiones oncogénicas de BCL2, eran significativamente más propensos a contener variantes en fase en BCL2 que otras neoplasias linfoides malignas(FIG. 1DyFIG. 8B). De forma similar, significativamente más linfomas de Burkitt (LB) albergaban VF en MYC e ID3, dos genes impulsores fuertemente asociados a la patogenia del LB, que otras neoplasias linfoides malignas(FIG. 1DyFIG. 8C-8D).Los subtipos moleculares de LDLBG asociados a células de origen distintas también demostraron distribuciones distintas de VF(tabla 2). Concretamente, aunque los LDLBG de linfocitos B de tipo centro germinal (GCB) y de linfocitos B de tipo activado (ABC) albergaban frecuencias similares de VF en general (mediana de 798 frente a 516, p = 0,37), en los ABC-LDLBG se observó un enriquecimiento significativo de VF en las regiones teloméricas de cambio de clase IGH (Sγ1 y Sγ3), coherente con informes anteriores41(FIG. 8E). Por el contrario, los GCB-LDLBG albergaban más haplotipos en fase en las regiones centroméricas de cambio de clase IGH (Sα2 y Sε) y en BCL2.
Ejemplo 4: Diseño y validación de un panel PhasED-Seq para linfoma
Para validar estas regiones ricas en VF y evaluar su utilidad para la detección de enfermedades a partir de ADNtc, se diseñó un panel de secuenciación dirigido a VF potenciales identificadas dentro de SGC de tres cohortes independientes de pacientes con LDLBG, así como en pacientes con LLC(FIG.2Ayejemplo 10). Este panel final de secuenciación de enriquecimiento y detección de variantes en fase (PhasED-Seq) se centró en ~115 kb de espacio genómico centrado en las VF, junto con ~200 kb adicionales dirigidos a genes con mutaciones recurrentes en los LNH-B(tabla 3). Aunque los 115 kb de espacio dedicados a la captura de FV solo abarcan el 0,0035 % del genoma humano, capturan el 26 % de las variantes en fase observadas en neoplasias de linfocitos B maduras perfiladas por SGC(FIG 9A),produciendo de este modo un enriquecimiento de VF de ~7500 veces por PhasED-Seq sobre SGC.
La recuperación esperada de SNV y VF se comparó con el selector CAPP-Seq comunicado previamente y diseñado para maximizar las SNV por paciente en linfomas de linfocitos B(FIG.9A-C). Cuando se consideran diversos LNH-B con datos de SGC disponibles, PhasED-Seq recuperó 3,0 veces más SNV (81 frente a 27) y 2,9 veces más VF (50 frente a 17) en el caso mediano que el panel CAPP-Seq anterior. Esta observación subraya la importancia de incluir partes no codificantes del genoma para una recuperación máxima de las mutaciones. Para validar experimentalmente estas mejoras del rendimiento, se perfilaron 16 muestras de ADN tumoral o plasmático pretratamiento de pacientes con LDLBG(tabla 4). Ambos paneles CAPP-Seq y PhasED-Seq se aplicaron a cada muestra en paralelo y a continuación se secuenciaron hasta profundidades moleculares únicas elevadas(FIG. 2B). En comparación con el enriquecimiento esperado establecido a partir de SGC, se observaron mejoras similares en el rendimiento de SNV por PhasED-Seq en comparación con CAPP-Seq (2,7x; mediana 304,5 frente a 114). Sin embargo, al enumerar las VF observadas en fragmentos individuales de ADN secuenciado, se halló una mejora a favor de PhasED-Seq más allá de la esperada a partir del SGC (7,7x; mediana de 5554 frente a 719,5 FV/caso). Esta mejora puede deberse a: 1) la mayor profundidad de secuenciación en la secuenciación dirigida, que conduce a una mejora en la detección de alelos raros, o 2) la enumeración de VF de orden superior en la secuenciación dirigida con PhasED-Seq o CAPP-Seq, que no se tuvo en cuenta en el diseño del SGC (es decir, >2 SNV por fragmento;FIG. 9D-9F).Asimismo, a través de ventanas de 1 kb en el panel, se observó una correlación robusta entre la frecuencia de VF potenciales en datos de SGC y VF de secuenciación dirigida mediante PhasED-Seq a través de 101 muestras de LDLBG(FIG. 2C), lo que valida aún más la frecuencia y distribución de las VF en las neoplasias malignas de linfocitos B.
Ejemplo 5: Diferencias en las variantes en fase entre los subtipos de linfoma
Habiendo validado el panel PhasED-Seq, se examinaron las diferencias biológicas de las VF entre diversas neoplasias de linfocitos B, incluidos el LDLBG (n=101), el linfoma de primario mediastínico de linfocitos B (LPMB) (n=16) y el linfoma de Hodgkin clásico (LHc) (n=23). El número de SNV identificadas por caso no fue significativamente diferente entre los subtipos de linfoma(FIG.9G-9K).Sin embargo, al considerar los haplotipos mutacionales, el LHc tenía una carga significativamente menor de VF que el LDLBG o el LPMB. Además de esta disparidad cuantitativa, también se observaron diferencias en las localizaciones genómicas de las VF entre los distintos subtipos de linfoma de linfocitos B(FIG. 2D-2EyFIG. 10-12).Esto incluía asociaciones biológicas previamente establecidas en subtipos de LDLBG, incluidos VF más frecuentes en BCL2 en el LDCGB de tipo GCB que en el de tipo ABC, con la asociación opuesta observada para PIM1. También se observaron FV más frecuentes en CIITA en LPMB en comparación con LDLBG, un gen en el que los puntos de rotura son comunes en LPMB. También se observaron enriquecimientos relativos en todo el locus IGH, con una mayor frecuencia de VF en las regiones Sγ3 y Sγ1 en el ABC-LDLBG (en comparación con el GCB-LDLBG) y, curiosamente, VF más frecuentes en el locus Sε en LHc en comparación con LDLBG(FIG.2EyFIG.
13).En total, después de corregir con respecto a las pruebas de hipótesis múltiples, se hallaron enriquecimientos relativos significativos en 25 locus genéticos entre ABC- y GCB-LDLBG, 24 entre LDLBG y LPMB y 40 entre LDLBG y LHc(FIG.10-12).
Ejemplo 6: Recuperación de variantes en fase mediante PhasED-Seq
Para facilitar la detección de ADNtc mediante VF, se desea una recuperación eficaz de las moléculas de ADN. La secuenciación por captura híbrida es potencialmente sensible a los emparejamientos incorrectos del ADN, con mutaciones crecientes que disminuyen la eficacia de la hibridación. De hecho, los puntos calientes de AID pueden contener una tasa de mutación local del 5-10 %, con tasas aún más elevadas en determinadas regiones de IGH. Para evaluar empíricamente el efecto de la tasa de mutación en la eficiencia de captura, se simuló por ordenador la hibridación de ADN de polímeros de 150 unidades con tasas de mutación variables. Como se esperaba, la energía de unión predicha disminuyó con un número creciente de mutaciones(FIG 14A).De manera destacable, las mutaciones distribuidas aleatoriamente tenían un mayor efecto sobre la energía de unión que las mutaciones agrupadas. Para evaluar el efecto de esta menor afinidad de unión, se sintetizaron oligonucleótidos de ADN de 150 unidades con una diferencia de 0 a 10 % con respecto a la secuencia de referencia en MYC y BCL6, dos locus que son dianas de aSHM. Para evaluar el caso más desfavorable para la hibridación, las bases no de referencia se distribuyeron aleatoriamente y no en grupos(Ejemplo 10).A continuación, se capturó una mezcla equimolar de estos oligonucleótidos con el panel PhasED-Seq. Se forma concordante con las predicciones informáticas, el aumento de las tasas de mutación se tradujo en una disminución de la eficiencia de captura(FIG. 3A).Las moléculas con una tasa de mutación del 5 % se capturaron con una eficacia del 85 % en relación con sus homólogas totalmente naturales, mientras que las moléculas con un 10 % de mutación se capturaron con solo un 27 % de eficiencia relativa. Para evaluar la prevalencia de este grado de mutación en tumores humanos, se examinó la distribución de variantes en panel en 140 pacientes con linfomas de linfocitos B, calculando la fracción de bases mutadas en ventanas solapantes de 151 pb(ejemplo 10). Solo el 7 % (10/140) de los pacientes tenía alguna ventana de 151 pb que superaba el 10 % de tasa de mutación(FIG.
14B-C).De hecho, en el experimento con oligonucleótidos sintéticos, una tasa de mutación del 5 % se recuperó casi tan eficazmente como la secuencia natural. En más de la mitad de los casos considerados, ningún locus tuvo una tasa de mutación >5 % en ninguna ventana, mientras que en todos los casos >90 % de las ventanas tenían <5 % de mutaciones. En general, estas observaciones indican que la mayoría de las mutaciones en fase son recuperables mediante una captura híbrida eficaz, a pesar de los sesgos de hibridación.
Ejemplo 7: Perfil de error y límite de detección para la secuenciación de variantes en fase
Los métodos anteriores de secuenciación con alta supresión de errores aplicados al ADNec han utilizado una combinación de métodos moleculares e informáticos para la supresión de errores (p. ej., supresión digital integrada de errores, iDES) o la recuperación molecular bicatenaria. Sin embargo, cada uno de ellos tiene limitaciones, tanto para la detección de acontecimientos en fracciones tumorales ultrabajas como para la recuperación eficaz de las moléculas de ADN originales, que son consideraciones importantes para el análisis de ADNec cuando el ADN de entrada es limitado. Se comparó el perfil de error y la recuperación de genomas de entrada de muestras de ADNec plasmático de 12 adultos sanos mediante PhasED-Seq con iDES-CAPP-Seq y secuenciación bicatenaria. Mientras que la CAPP-Seq mejorada con iDES tenía un perfil de error de fondo más bajo que la desduplicación por código de barras sola, la secuenciación bicatenaria ofreció la tasa de error de fondo más baja para sustituciones de un solo nucleótido no de referencia(FIG.3B,3,3 x 10<-5>frente a 1,2 x 10<-5>,p<0,0001). Sin embargo, la tasa de errores en fase, p. ej., múltiples bases no de referencia en el mismo fragmento de secuenciación, fue significativamente inferior a la tasa de errores individuales en los datos de CAPP-Seq mejorados con iDES o en los datos de secuenciación bicatenaria. Esto fue cierto para la incidencia tanto de dos (VF 2x o de "doblete") como de tres (VF 3x o de "triplete") sustituciones en la misma molécula de ADN(FIG.3B,8,0 x 10<-7>y 3,4 x 10<-8>respectivamente,p<0,0001). Los errores de fase que contenían sustituciones de transición C a T o T a C fueron más frecuentes que otros tipos de VF(FIG.
14D).De manera destacable, la tasa de errores VF de doblete en ADNec también se correlacionó con la distancia entre posiciones, con la tasa de error VF más alta compuesta por SNV vecinas (p. ej., DNV) y una tasa de error decreciente al aumentar la distancia entre las variantes constituyentes(FIG. 14E).Al considerar la profundidad molecular única, la secuenciación bicatenaria recuperó solo el 19 % de todos los fragmentos únicos de ADNec(FIG.
3C).Por el contrario, la profundidad única de las VF dentro de una distancia genómica de <20 pb era casi idéntica a la profundidad de las posiciones individuales (p. ej., moléculas que cubren SNV individuales). De forma similar, las VF de hasta 80 pb de tamaño tenían una profundidad superior al 50 % de la mediana de profundidad molecular única para una muestra. De manera destacada, casi la mitad (48 %) de todas las VF se encontraban dentro de un intervalo de 80 pb, lo que demuestra su utilidad para la detección de enfermedades a partir de muestras de ADNec de entrada limitada(FIG.3D).
Para comparar cuantitativamente el rendimiento de PhasED-Seq con métodos alternativos para la detección de ADNtc, se generaron diluciones limitantes de ADNtc de 3 pacientes con linfoma en ADNec de controles sanos, lo que dio lugar a fracciones tumorales esperadas entre el 0,1 % y el 0,00005 % (1 parte en 2000000;(Ejemplo 10).La fracción tumoral esperada se comparó con el contenido tumoral estimado en cada una de estas diluciones utilizando PhasED-Seq para rastrear las VF derivadas de tumores, así como con métodos de detección con supresión de errores en función de SNV individuales (p. ej., CAPP-Seq mejorada con iDES o secuenciación bicatenaria;FIG.3E).Todos los métodos funcionaron igual de bien hasta fracciones tumorales del 0,01 % (1 parte en 10000). Sin embargo, por debajo de este nivel (p. ej., 0,001 %, 0,0002 %, 0,0001 % y 0,00005 %), tanto PhasED-Seq como la secuenciación bicatenaria superaron significativamente a CAPP-Seq mejorada con iDES (p<0,0001 para bicatenaria, '2x' PhasED-Seq y '3x' PhasED-Seq;FIG.3E).Además, en comparación con la secuenciación bicatenaria, el seguimiento de 2 o 3 variantes en fase (es decir, 2x y 3x PhasED-Seq) identificó con mayor precisión el contenido tumoral esperado, con una linealidad superior hasta 1 parte en 2000000 (P = 0,005 para bicatenaria frente a 2x PhasED-Seq, P = 0,002 para 3x PhasED-Seq)(ejemplo 10).Se evaluó la especificidad de las VF buscando pruebas de SNV o VF derivadas de tumores en muestras de ADNec de 12 sujetos de control sanos no emparentados y el control sano utilizado para la dilución limitante. En este caso, de nuevo, tanto 2x- como 3x-PhasED-Seq mostraron niveles de señal de fondo significativamente más bajos que CAPP-Seq y la secuenciación bicatenaria(FIG.3F).Esta menor tasa de error y de fondo de las VF mejora el límite de detección para la detección de enfermedades por ADNtc. En algunos casos, el método de ensayos de ADNec basados en secuenciación descrito en el presente documento (p. ej., el método representado enFIG.3EyFIG.3F)no requiere códigos de barras moleculares para lograr una supresión de errores excelente y límites de detección bajos. La señal evaluada por el método sin código de barras utilizó series de diluciones limitantes de 1:1000 a 5:10000000, y controles "en blanco"(FIG.23A-23B).
Esta serie de diluciones se usó para evaluar el límite de detección para un número determinado de VF(FIG.3G-3I).
Cuando se considera un conjunto de VF dentro de regiones de 150 pares de bases (pb), la probabilidad de detección de una muestra determinada puede modelizarse con precisión mediante un muestreo binomial, teniendo en cuenta tanto la profundidad de secuenciación como el número de regiones de 150 pb con VF(ejemplo 10).
Ejemplo 8: Mejoras de la detección de la enfermedad mínima residual de baja carga
Para probar la utilidad del LOD más bajo ofrecido por PhasED-Seq para la detección de EMR de carga ultrabaja desde ADNec, se secuenciaron muestras seriadas de ADN extracelular de un paciente sometido a terapia de primera línea para LDLBG(FIG. 4A). Usando CAPP-Seq, este paciente tenía ADNtc indetectable después de un solo ciclo de tratamiento, con múltiples muestras posteriores durante y después del tratamiento también indetectables. Este paciente tuvo una reaparición posterior de ADNtc detectable >250 días después del inicio de la terapia, con eventual avance clínico y radiográfico de la enfermedad 5 meses después, lo que indica mediciones en serie falsamente negativas con CAPP-Seq. Sorprendentemente, las cuatro muestras de plasma que fueron indetectables mediante CAPP-Seq durante y después del tratamiento tenían niveles detectables de ADNtc mediante PhasED-Seq, con fracciones alélicas medias tan bajas como 6 partes en 1000000. Este aumento de la sensibilidad mejoró el plazo de detección de la enfermedad mediante ADNtc en comparación con la vigilancia radiográfica de 5 con CAPP-Seq a 10 meses con PhasED-Seq.
A continuación, se evaluó el rendimiento de la detección de ADNtc mediante PhasED-Seq en una cohorte de 107 pacientes con linfomas de linfocitos B grandes y muestras de sangre disponibles tras 1 o 2 ciclos de inmunoquimioterapia convencional. De manera destacada, los niveles de ADNtc medidos mediante PhasED-Seq estaban muy correlacionados con los medidos por CAPP-Seq. En total, se evaluaron 443 muestras de ADN tumoral, de línea germinal y extracelulares, incluido el ADNcf antes del tratamiento (n = 107) y después de 1 o 2 ciclos de tratamiento (n = 82 y 89). Antes del tratamiento, los VF específicos de cada paciente fueron detectables mediante PhasED-Seq en el 98 % de las muestras, con una especificidad del 95 % en ADNec de controles sanos(FIG. 15y16A).De manera destacada, los niveles de ADNtc medidos mediante PhasED-Seq estaban muy correlacionados con los medidos por CAPP-Seq, teniendo en cuenta tanto las muestras previas como las posteriores al tratamiento (Spearman rho=0,91,FIG.16B).A continuación, se compararon los niveles cuantitativos de ADNtc medidos mediante PhasED-Seq y CAPP-Seq a partir de muestras de ADNec tras el inicio del tratamiento. En total, el 72 % (78/108) de las muestras con ADNtc detectable mediante PhasED-Seq después de 1 o 2 ciclos también se detectaron mediante CAPP-Seq convencional(FIG.4B).Entre las 108 muestras detectadas por PhasED-Seq, la carga de enfermedad fue significativamente menor en las que tenían niveles de ADNtc indetectables (28 %) frente a detectables (72 %) mediante CAPP-Seq convencional, con una diferencia >10x en la mediana de los niveles de ADNtc (fracción tumoral 2,2 x 10<-4>frente a 1,2 x 10<-5>,p<0,001,FIG. 4B).En total, un 16 % (13/82) adicional de muestras tras 1 ciclo de tratamiento y un 19 % (17/89) de muestras tras 2 ciclos de tratamiento tenían ADNtc detectable al comparar PhasED-Seq con CAPP-Seq(FIG.4C).
Los criterios de respuesta molecular del ADNtc se han descrito anteriormente para pacientes con LDLBG utilizando CAPP-Seq, incluida la Respuesta Molecular Mayor (RMMa), definida como una reducción de 2,5 log en el ADNtc tras 2 ciclos de tratamiento22. Mientras que la RMMa en este punto temporal es pronóstico de resultados, muchos pacientes tienen ADNtc indetectable mediante CAPP-Seq en este punto de referencia(FIG. 4D-4E).De manera destacada, incluso en pacientes con ADNtc indetectable mediante CAPP-Seq, la detección de niveles ultrabajos ocultos de ADNtc mediante PhasED-Seq fue pronóstica para los resultados, incluida la supervivencia global y sin episodios(FIG.4D).De hecho, en los 89 pacientes con una muestra disponible desde este punto temporal, el 58 % (52/89) tenía ADNtc indetectable mediante CAPP-Seq en su evaluación intermedia de RMMa, tras completar 2 de los 6 ciclos de terapia previstos. Usando PhasED-Seq, el 33 % (17/52) de las muestras no detectadas por CAPP-Seq tenía pruebas de ADNtc según las VF, con niveles tan bajos como ~3:1000000(FIG. 17A-17D), estos 17 casos detectados adicionalmente por PhasED-Seq representan potenciales pruebas falsas negativas por CAPP-Seq. Se observaron resultados similares en el momento de la Respuesta Molecular Temprana (RMT) (es decir, después de 1 ciclo de tratamiento,FIG.18A-18H).
Si bien la detección de ADNtc en el LDLBG después de 1 o 2 ciclos de terapia es un marcador pronóstico adverso conocido, los resultados para los pacientes con ADNtc indetectable en estos momentos son heterogéneos(FIG.4EyFIG.18F).De manera destacada, incluso en pacientes con ADNtc indetectable mediante CAPP-Seq tras 1 o 2 ciclos de tratamiento, la detección de niveles ultrabajos de ADNtc mediante PhasED-Seq fue fuertemente pronóstica para los resultados, incluida la supervivencia sin episodios(FIG.4F, FIG.17C-D, FIG.18C-DyFIG.18G).Al combinar la detección mediante PhasED-Seq con el umbral de RMMa descrito anteriormente, los pacientes podían estratificarse en tres grupos: pacientes que no alcanzaban la RMMa, pacientes que alcanzan la RMMa pero con ADNtc persistente y pacientes con ADNtc indetectable(FIG.4G).Curiosamente, mientras que los pacientes que no alcanzaban la RMMa presentaban un riesgo especialmente elevado de padecer acontecimientos tempranos a pesar del tratamiento planificado adicional de primera línea (p. ej., dentro del primer año de tratamiento), los pacientes con niveles persistentemente bajos de ADNtc parecían tener un mayor riesgo de recaídas o acontecimientos de avance posteriores. Por el contrario, los pacientes con ADNtc indetectable tras 2 ciclos de tratamiento mediante PhasED-Seq tuvieron resultados abrumadoramente favorables, con un 95 % libre de episodios y un 97 % de supervivencia global a los 5 años. Se observaron resultados similares en el punto temporal de RMT tras 1 ciclo de terapia(FIG.18H).
Ejemplo 9: Realizaciones ilustrativas de detección de mutaciones utilizando la secuenciación de nueva generación (SNG) cuando la mutación no es una subestación de una sola base, sino un par de mutaciones
En muchos casos, una limitación del rastreo de ADNec puede ser la limitación del número de moléculas disponibles para la detección. Adicionalmente, existen múltiples limitaciones potenciales en el rastreo de moléculas tumorales a partir de ADN extracelular, incluyendo no solo el perfil de errores de secuenciación, sino también el número de moléculas disponibles para la detección. El número de moléculas disponibles para la detección, aquí denominado número de "fragmentos evaluables", puede considerarse tanto una función del número de genomas únicos recuperados (p. ej., profundidad única de secuenciación) como del número de mutaciones somáticas rastreadas. Más específicamente, el número de fragmentos evaluables es igual a: EF = d * n.
Donde d = la profundidad molecular única considerada y n = el número de alteraciones somáticas rastreadas. Para las muestras típicas de ADN extracelular, a menudo se recuperan menos de 10000 genomas únicos (d), que requiere cualquier método sensible para rastrear múltiples alteraciones (n). Asimismo, como se ha indicado anteriormente, la principal limitación de la secuenciación bicatenaria es la dificultad para recuperar una profundidad molecular única suficiente (d); por lo tanto, desde una muestra de plasma normalmente con profundidad bicatenaria de ~1500x, incluso si se siguen 100 alteraciones somáticas, solo hay 150000 fragmentos evaluables. Por lo tanto, en estas circunstancias, la sensibilidad está limitada por el número de moléculas disponibles para la detección. Por el contrario, otros métodos tales como CAPP-Seq potenciado por iDES tienen en cuenta todas las moléculas recuperadas. En este caso, se pueden recuperar hasta 5000-6000x genomas haploides únicos. Por lo tanto, el número de fragmentos evaluables, rastreando las mismas 100 alteraciones somáticas, puede ser de 500000-600000x. Sin embargo, el perfil de errores de la secuenciación monocatenaria, incluso con supresión de errores, permite la detección a niveles de, como mucho, 1 parte en 50000. Por lo tanto, los métodos destinados a perfeccionar los límites de detección del ADNtc deben superar tanto el perfil de error de la secuenciación como la recuperación de suficientes fragmentos evaluables para utilizar dichos perfiles de error más bajos.
Para remediar esta aparente deficiencia, el método de PhasED-Seq, como se describe en la presente divulgación, tiene en cuenta neoplasias linfoides y era aplicable a otras histologías cancerosas, (p. ej., utilizando un enfoque "personalizado"). Para un enfoque personalizado, se utilizaron oligonucleótidos de captura híbrida a medida (o cebadores para amplicones de PCR) para capturar mutaciones somáticas personalizadas identificadas a partir de la secuenciación del exoma o del genoma completo. Se volvió a analizar el conjunto de datos del PCAWG evaluado en busca de SNV que se produjeran en un intervalo de 170 pb en el espacio genómico. Se observó que, en 14 de las 24 histologías de cáncer consideradas, la mediana de los casos contenía más de 100 posibles variantes en fase, incluido en varios tumores sólidos tales como el melanoma (mediana 2072), el carcinoma de células escamosas de pulmón (1268), el adenocarcinoma de pulmón (644,5) y el adenocarcinoma colorrectal (216,5).
A continuación, se evaluó el límite de detección esperado en todos los casos del conjunto de datos del PCAWG utilizando secuenciación bicatenaria o PhasED-Seq. De nuevo, el límite de detección se definió por el número esperado de fragmentos evaluables, por lo que depende tanto del número de variantes rastreadas como de la profundidad esperada de la secuenciación. Utilización de los datos de las condiciones optimizadas de captura de híbridos, se construyó un modelo para predecir la profundidad molecular desduplicada (monocatenaria) y de dúplex (bicatenaria) esperada con una entrada de ADN y un número de lecturas de secuenciación dados. Usando esto, junto con el número de SNV o posibles VF del conjunto de datos de PCAWG, para cada caso, se evaluó qué método daría lugar a un mayor número de fragmentos evaluables y, por lo tanto, a un límite de detección superior. Los resultados de este ejercicio, suponiendo 64 nanogramos (ng) de entrada total de ADNec y un total de 20 millones de lecturas de secuenciación, se muestran en laFIG. 19.De manera destacable, en la mayoría de los tipos de cáncer (18/24 histologías), PhasED-Seq tenía un límite de detección más bajo que la secuenciación bicatenaria. Cabe destacar que esto incluía no solo los linfomas de linfocitos B, sino tumores sólidos comunes, incluidos el carcinoma de células escamosas de pulmón y el adenocarcinoma, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma esofágico y gástrico, y adenocarcinoma de mama, entre otros. De hecho, tomando como ejemplo concreto los cánceres de pulmón, se encontró un límite de detección casi 10 veces menor para la mediana de casos de cáncer de pulmón de células escamosas y adenocarcinoma utilizando PhasED-Seq en comparación con la secuenciación bicatenaria(FIG. 20).
Tanto PhasED-Seq como la secuenciación bicatenaria utilizando un enfoque personalizado tenían un límite de detección más bajo que los enfoques no personalizados (p. ej., CAPP-Seq potenciado con iDES).
Para seguir confirmando la aplicabilidad de las variantes en fase y PhasED-Seq en diversos tumores sólidos, se realizó SGC (20-30x) en ADN tumoral y normal emparejado para identificar VF de cinco pacientes con tumores sólidos en los que se predijo que tenían una baja carga de ADNtc antes del tratamiento (cáncer de pulmón (n = 5)). Tras identificar las VF potenciales en cada caso, se diseñó a continuación un conjunto de oligonucleótidos de captura híbridos personalizados para realizar la resecuenciación dirigida del ADN tumoral y normal con el fin de validar las VF candidatas. Por último, se secuenciaron muestras de plasma de los 5 pacientes hasta una profundidad molecular única y elevada utilizando PhasED-Seq personalizado para detectar ADNtc. Considerando estos cinco casos de cáncer de pulmón, el enfoque PhasED-Seq logró un perfeccionamiento de ~10 veces en la sensibilidad analítica, logrando una mediana de LOD del 0,00018 % en comparación con el 0,0019 % utilizando CAPP-Seq personalizado(FIG.21).
Para demostrar la importancia clínica de este perfeccionamiento del límite de detección del ADNtc a partir de PhasED-Seq en tumores sólidos, se analizaron muestras seriadas de plasma de un paciente con adenocarcinoma de pulmón en estadio 3 tratado con quimiorradioterapia con intención curativa (LUP814) utilizando tanto CAPP-Seq como PhasED-Seq. Como se ha expuesto anteriormente, tanto CAPP-Seq como PhasED-Seq cuantificaron un nivel similar de ADNtc antes de la terapia (~1 % de fracción tumoral). Sin embargo, 3 muestras posteriores tras el inicio de la terapia tenían ADNtc indetectable mediante CAPP-Seq convencional, incluidas muestras durante y después de la quimiorradiación y durante la inmunoterapia adyuvante con Durvalumab. A pesar de la falta de enfermedad detectable por CAPP-Seq, el paciente tiene enfermedad recurrente confirmada mediante biopsia tras una respuesta radiográfica inicial. Sin embargo, al analizar estas mismas muestras con PhasED-Seq, se detectó enfermedad residual molecular en 3/3 (100 %) de las muestras, con una fracción tumoral media tan baja como 0,00016 % (1,6 partes por millón). Asimismo, la tendencia en la cuantificación del ADNtc reflejaba la evolución de la enfermedad del paciente, con una respuesta inicial a la quimiorradioterapia pero progresión de la enfermedad durante la inmunoterapia. De manera destacada, la enfermedad de este paciente siguió siendo detectable en todos los puntos temporales, con enfermedad detectable al finalizar la quimiorradioterapia 8 meses antes del avance de la enfermedad confirmado por biopsia del paciente(FIG.22).
Ejemplo 10: Métodos de enriquecimiento de variantes en fase para mejorar la detección de enfermedades a partir de ADN extracelular
10(a): Análisis de secuenciación del genoma completo
10(a)(1): Identificación de variantes en fase potenciales mediante datos de secuenciación del genoma completoLos datos de secuenciación del genoma completo se obtuvieron de dos fuentes. Los datos de neoplasias linfoides (linfoma difuso de linfocitos B grandes, LDLBG; linfoma folicular, LF; linfoma de Burkitt, LB; leucemia linfocítica crónica, CLL) se descargaron del portal de datos del International Cancer Genome Consortium (ICGC) el 7 de mayo de 2018. Los datos de todas las demás histologías formaron parte del pananálisis de cáncer de genomas completos (PCAWG, por sus siglas en inglés) y se descargaron el 11 de noviembre de 2019. Solo se tuvieron en cuenta las histologías del cáncer con al menos 35 casos disponibles; en latabla 1se ofrecen detalles del conjunto de datos considerado. Todas las muestras tenían mutaciones somáticas detectadas a partir de SGC utilizando genotipos tumorales y normales emparejados. Las consultas se limitaron a las sustituciones de bases obtenidas a partir de SGC (variantes de nucleótidos individuales, dobles, triples y oligonucleótidos; SNV, DNV, TNV y ONV). Una vez identificados de este modo los casos y variantes de interés, a continuación, se identificó el número de variantes en fase (VF) potenciales en cada tumor. Para que actúen como VF en una única molécula de ADN extracelular (ADNec), dos variantes, tales como dos variantes de un solo nucleótido (SNV) deben producirse generalmente dentro de una distancia genómica inferior a la longitud de una molécula típica de ADNec (~170 pb). Por lo tanto, las VF potenciales se definieron como dos variantes que aparecían en el mismo cromosoma dentro de una distancia genómica de <170 pb. DNV, TNV y ONV se consideraron el conjunto de sus respectivas SNV componentes. El número de SNV así como la identidad de las VF potenciales para cada caso se detallan en latabla 1.El número en bruto de SNV y VF potenciales, así como el número de VF potenciales teniendo en cuenta el número de SNV, se muestran en laFIG.5A-C.
10(a)(2): Firmas mutacionales de variantes en fase a partir de SGC
Para evaluar los procesos mutacionales asociados a las mutaciones en fase y sin fase en diferentes tipos/subtipos de cáncer, las firmas mutacionales de sustituciones de una sola base (SBS) se enumeraron para cada caso de SGC descrito anteriormente utilizando el paquete R 'deconstructSigs'. La lista de SNV de cada paciente se dividió primero en dos grupos: 1) SNV contenidas dentro de una posible VF; es decir, con una SNV adyacente o SNV "vecina más cercana" a <170 pb de distancia y 2) SNV aisladas (es decir, sin fase), definidas como las que se producen a ≥170 pb de distancia de la SNV adyacente más cercana. A continuación se aplicó 'DeconstructSigs' utilizando las 49 firmas SBS descritas en COSMIC (excluyendo las firmas vinculadas a posibles artefactos de secuenciación) para evaluar la contribución de cada firma SBS tanto a las SNV candidatas en fase como a las SNV no en fase para cada paciente. Para comparar la contribución de cada firma SBS a SNV en fase y aisladas, se realizó una prueba de Wilcoxon para datos emparejados para comparar la contribución relativa de cada firma SBS entre estas dos categorías para cada tipo de cáncer(FIG. 6A-6WW).Para tener en cuenta múltiples hipótesis, se aplicó la corrección de Bonferroni, considerando significativa cualquier firma SBS que difiriera en la contribución a SNV en fase frente a SNV sin fase si la prueba de Wilcoxon para datos emparejados daba como resultado un valor de la p de <0,05/49 o 0,001. Las distribuciones de estas comparaciones, junto con pruebas de significación, se representan en lasFIG.6A-6WW.En laFIG.1Cse muestra también un sumario de este análisis mediante la visualización de un gráfico cromático, donde el "calor" representa la diferencia entre la contribución media de la firma SBS a las variantes en fase y la contribución media a las variantes aisladas/sin fase.
10(a)(3): Distribución genómica de variantes en fase a partir de SGC
Se evaluó la frecuencia de recurrencia de las VF en cada tipo de cáncer a través del genoma dentro de cada tipo de tumor. Concretamente, el genoma humano (compilación GRCh37 / hg19) se dividió primero en grupos de 1 kb (3095689 grupos en total); a continuación, para cada muestra, se contó el número de VF (según la definición anterior) que contenía cada grupo de 1 kb. Para este análisis, se incluyó cualquiera de las VF con al menos uno de sus SNV constituyentes dentro del grupo de interés de 1 kb. A continuación se calculó la fracción de pacientes cuyos tumores albergaban una VF para cada tipo de cáncer dentro de cada grupo genómico. Para identificar los grupos de 1 kb que albergan VF de forma recurrente en los pacientes, se representó gráficamente la fracción de pacientes que contenían VF en cada grupo de 1 kb frente a las coordenadas genómicas(FIG. 1DyFIG. 7); para este análisis, solo se representaron grupos donde al menos el 2 % de las muestras contenían una VF en al menos un subtipo de cáncer.
10(a)(4): Identificación de grupos recurrentes de 1 kb con variantes en fase
Para identificar los grupos de 1 kb que contienen VF de forma recurrente en neoplasias linfoides B, se utilizaron datos de SGC de las siguientes enfermedades: LDLBG, LF, LB y LLC. Se consideró que cualquier grupo de 1 kb en el que hubiera >1 muestra de estos tipos tumorales contenía de forma recurrente VF de neoplasias linfoides B. Las coordenadas genómicas de los intervalos de 1 kb que contienen VF recurrentes en neoplasias linfoides malignas se enumeran en latabla 2,y se representan gráficamente en laFIG.8A.
10(b): Diseño del panel PhasED-Seq para neoplasias linfoides B
10(b)(1): Identificación de VF recurrentes a partir de datos de SGC a mayor resolución
Dada la prevalencia de VF potenciales recurrentes a partir de datos de SGC en neoplasias malignas de linfocitos B, se diseñó un enfoque de secuenciación dirigido para su captura mediada por hibridación -Phased variant Enrichment Sequencing (PhasED-Seq)- para enriquecer estos acontecimientos de VF específicos a partir de ADN tumoral o extracelular. Además de los datos del ICGC descritos anteriormente, en este diseño también se utilizaron datos de SGC de otras fuentes, incluyendo tanto los LNH de linfocitos B como la LLC.
También se examinó la experiencia previa con la secuenciación dirigida a partir de ADNec en LNH. Se identificaron los pares de SNV que se producían a una distancia <170 pb en cada muestra tumoral de linfocitos B. A continuación, las "ventanas" genómicas que contenían VF se identificaron de la siguiente manera: para cada cromosoma, las VF se ordenaron por coordenadas genómicas relativas al genoma de referencia. A continuación, se identificó la posición más baja (es decir, la más a la izquierda) para cualquier VF en cualquier paciente; esto definió la coordenada izquierda (5') sembrando una ventana de interés deseada, para captura del genoma. A continuación, esta ventana se amplió haciendo crecer su extremo 3' para capturar VF sucesivos hasta alcanzar un hueco de ≥340 pb, con 340 pb elegidos como captura de dos fragmentos sucesivos de tamaño cromatosómico de ~170 pb. Cuando se llegó a tal hueco, se inició una nueva ventana, y este proceso iterativo de adición de VF vecinas se repitió de nuevo hasta que se alcanzó el siguiente hueco de ≥340 pb. El resultado fue un archivo BED de ventanas genómicas que contenía todos las VF posibles de todas las muestras consideradas. Por último, cada ventana se rellenó adicionalmente con 50 pb a cada lado, para permitir una captura eficaz de las secuencias flanqueantes en situaciones poco frecuentes en las que las secuencias intervinientes repetitivas o mal mapeadas podrían impedir su selección directa para el enriquecimiento. Habiendo identificado las regiones de interés que contenían VF potenciales, cada ventana se dividió a continuación en segmentos de 170 pb (p. ej., el tamaño aproximado de una molécula cromatosómica de ADNec). A continuación, se enumeró en cada caso el número de casos que contenían una VF. Para cada región de 170 pb, la región en el diseño final del panel de secuenciación se incluyó si se cumplía uno o más de los siguientes criterios: 1) al menos un paciente contenía una VF en la región de 170 pb en 3 de 5 conjuntos de datos independientes, 2) al menos un paciente contenía una VF en la región en 2 de 5 conjuntos de datos independientes si uno de los conjuntos de datos era experiencia CAPP-Seq previa, o 3) al menos un paciente contenía una VF en la región en 2 de 5 conjuntos de datos independientes, con un total de al menos 3 pacientes que contenían una VF en la región. El resultado fueron 691 "losetas", representando cada loseta una región genómica de 170 pb. Estas losetas, junto con ~200 kb adicionales de espacio genómico dirigido a genes impulsores mutados de forma recurrente en el LNH-B, se combinaron en un panel unificado de secuenciación dirigida como se ha descrito anteriormente tanto para genotipado tumoral como de ADNec utilizando NimbleDesign (Roche NimbleGen). Las coordenadas finales de este panel se proporcionan en latabla 3.
10(b)(2): Comparación del rendimiento de PhasED-Seq y CAPP-Seq en el rendimiento de VF
Para evaluar el rendimiento de PhasED-Seq para capturar tanto SNV como VF en comparación con el selector CAPP-Seq previamente notificado para linfomas de linfocitos B, se cuantificó el número previsto tanto de SNV como de VF que pueden recuperarse con cada panel limitando la SGC por ordenador a las dianas de captura de cada enfoque (FIG.9A-C). A continuación, se comparó el número previsto de variantes mediante la prueba de Wilcoxon para datos emparejados. Tanto CAPP-Seq como PhasED-Seq se realizaron también en 16 muestras de pacientes con LDLBG. En estas muestras, se secuenció ADN tumoral o plasmático, junto con ADN de línea germinal coincidente. El número de variantes resultante se comparó de nuevo mediante la prueba de Wilcoxon para datos emparejados (FIG. 2ByFIG.9D-9E). La profundidad de secuenciación de las muestras incluidas en este análisis se proporciona en lastablas 4.
10(c): Identificación de variantes en fase a partir de datos de secuenciación dirigida
10(c)(1): Inscripción de pacientes y recogida de muestras clínicas
En este estudio participaron pacientes con linfomas de linfocitos B en tratamiento de primera línea procedentes de seis centros de Norteamérica y Europa, incluida la Universidad de Stanford, el MD Anderson Cancer Center, el Instituto Nacional del Cáncer, la Universidad de Piamonte Oriental (Italia), Hospital Universitario de Essen (Alemania) y CHU Dijon (Francia). En total, en este estudio se incluyeron 343 muestras de ADN extracelular, 73 tumorales y 183 de línea germinal de 183 pacientes. Todas las muestras de pacientes se recogieron con el consentimiento informado por escrito para usarlas en investigación y fueron aprobadas por las Juntas de Revisión Institucional correspondientes de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Se aisló ADN extracelular, tumoral y de la línea germinal como se ha descrito anteriormente. Todas las imágenes radiográficas se realizaron como parte de la atención clínica convencional.10(c)(2): Preparación y secuenciación de bibliotecas
Para generar bibliotecas de secuenciación y datos de secuenciación dirigidos, se aplicó CAPP-Seq como se ha descrito anteriormente. En resumen, se usó ADN extracelular, tumoral y de línea germinal para construir bibliotecas de secuenciación mediante reparación de extremos, adición de cola de A y ligamiento del adaptador siguiendo las instrucciones del fabricante del Kit KAPA Hyper Prep con ligamiento realizado durante una noche a 4 °C. Se usaron adaptadores de CAPP-Seq con identificadores moleculares únicos (UMID) para el código de barras de las dobles cadenas de ADN únicas y la posterior desduplicación de los pares de lecturas de secuenciación. A continuación se realizó la captura híbrida (SeqCap EZ Choice; NimbleGen) utilizando el panel PhasED-Seq descrito anteriormente. La captura de afinidad se realizó según el protocolo del fabricante, realizando todas las hibridaciones a 47 °C en un termociclador Eppendorf. Después del enriquecimiento, las bibliotecas se secuenciaron utilizando un instrumento Illumina HiSeq4000 con lecturas de extremos emparejados (PE) de 2x150 pb.
10(c)(3): Preprocesamiento y alineación
Los archivos FASTQ se desmultiplexaron y los UMID se extrajeron utilizando un proceso personalizado como se ha descrito anteriormente. Tras la desmultiplexación, las lecturas se alinearon con el genoma humano (estructura GRCh37 / hg19) utilizando BWA ALN. La supresión de errores mediada por código de barras molecular y el pulido de fondo (es decir, supresión de errores digital integrada; iDES) se realizaron a continuación como se ha descrito anteriormente.
10(c)(4): Identificación de variantes en fase y cuantificación alélica
Después de generar archivos de alineación con supresión de errores UMID (p. ej., archivos BAM), se identificaron las VF de cada muestra del siguiente modo. En primer lugar, se realizó la secuenciación de la línea germinal emparejada de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) no implicadas para identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) constitutivos específicos de cada paciente. Estos se definieron como posiciones no de referencia con una fracción alélica variante (FAV) superior al 40 % con una profundidad de al menos 10, o una FAV superior al 0,25 % con una profundidad de al menos 100. A continuación, las VF se identificaron a partir de los datos a nivel de lectura para una muestra de interés. Tras la supresión de errores mediada por UMID, cada extremo emparejado (PE) individual leyó e identificó todas las posiciones no de referencia utilizando 'samtools calmd'. Se utilizaron datos de PE en lugar de lecturas individuales para identificar las variantes que se producen en la misma molécula de ADN molde, que puede quedar posteriormente en la lectura 1 o en la lectura 2. Se consideró que cualquier par de lecturas que contuviera ≥2 posiciones no de referencia representaba una posible VF somática. Para lecturas con >2 posiciones no de referencia, cada permutación de tamaño ≥2 se consideró independientemente: es decir, si se identificaron 4 posiciones no de referencia en un par de lecturas, se consideraron de forma independiente todas las combinaciones de 2 SNV (es decir, variantes en fase de "doblete") y todas las combinaciones de 3 SNV (es decir, variantes en fase de "triplete"). Las VF que contenían SNP potenciales de la línea germinal también se eliminaron del siguiente modo: si en un n-mero dado (es decir,nSNV en fase en una molécula dada) ≥n-1 de las variantes componentes se identificaron como SNP de línea germinal, el VF fue redactado. Esta estrategia de filtrado garantiza que para cualquier VF restante, al menos 2 de las SNV componentes no se observaron en la línea germinal, como resulta relevante tanto para la sensibilidad como para la especificidad.
Las VF somáticas potenciales se filtraron utilizando un enfoque heurístico de listas negras al considerar los datos de secuenciación de 170 muestras de ADN de línea germinal que sirvieron de control. En cada una de estas muestras, las VF se identificaron en pares de lecturas como se ha descrito anteriormente, pero sin filtrar por línea germinal coincidente. Cualquier VF que se produjera en una o más lecturas de extremos emparejados, en una o más de estas muestras de control, se incluyó en la lista negra y se eliminó de las listas de VF somáticas específicas de pacientes. Para calcular la FAV de cada VF, se calculó un numerador que representaba el número de moléculas de ADN que contenían una FV de interés sobre un denominador que representaba el número total de moléculas de ADN que cubrían la región genómica de interés. Es decir, el numerador es simplemente el número total de pares de lectura desduplicados que contienen una VF determinada, mientras que el denominador es el número de pares de lectura que abarcan el locus genómico de una VF determinada.
10(c)(5): Genotipado de variantes en fase a partir de muestras de pretratamiento
La estrategia anterior dio lugar a una lista de VF de ≥1 de profundidad de lectura en cada muestra. Para identificar VF que sirvan como indicadores somáticos específicos de tumores para el seguimiento de enfermedades, para cada caso se identificó una muestra de "genotipado óptimo", bien ADN procedente de una biopsia de tejido tumoral (preferido) o bien ADN extracelular previo al tratamiento. Tras identificar todos las VF posibles en la "mejor muestra de genotipado", la lista de especificidad se filtró adicionalmente de la siguiente manera. Para cualquier conjunto de VF n-mérico, si ≥n-1 de las SNV constituyentes estaban presentes como SNP de línea germinal en las 170 muestras de control descritas anteriormente, se eliminaba la VF. Asimismo, solo se tuvieron en cuenta las FV que cumplían los siguientes criterios: 1) FA > 1 %; 2) profundidad del locus de VF de ≥100 pares de lectura y 3) al menos una SNV componente debe estar en el espacio diana. Por último, 4) se evaluó el apoyo de lectura de cualquiera de las VF que cumplían estos criterios en una cohorte de 12 muestras de ADNec de controles sanos. Si en >1 de estas 12 muestras estaba presente algún apoyo de lectura, se eliminaba la VF. Para el genotipado a partir de muestras de ADN extracelular identificadas como baja fracción tumoral por SNV (es decir, <1 % de FA media en todas las SNV), el umbral de FA para determinar las VF se relajó a >0,2 %. Este filtrado dio lugar a las listas de VF utilizadas para el seguimiento de la enfermedad y la detección de EMR.
10(c)(6): Determinación de la fracción tumoral en una muestra a partir variantes en fase
Para la evaluación de una muestra para la detección de enfermedad mínima residual (EMR) con conocimiento previo del genotipo tumoral, se puede evaluar la presencia de cualquiera de las VF identificadas en la mejor muestra de genotipado pretratamiento en la muestra de EMR de interés. Dada una lista dekposibles VF derivadas de tumores observadas en la mejor muestra de genotipado, se determinaron todos los pares de lecturas que cubrían al menos 1 de laskVF posibles. Este valor, d, puede considerarse como la "profundidad informativa" agregada en todas las VF atravesadas por moléculas de ADNec en un experimento PhasED-Seq. A continuación, se evaluó cuántos de estos pares de lecturadcontenían realmente uno o más de loskVF posibles; este valor, x, representa el número de moléculas derivadas de tumores que contienen VF somáticas en una muestra determinada. El número de moléculas procedentes de tumores que contienen VF dividido por la profundidad informativa- x/d- es, por tanto, la fracción tumoral variante en fase (FAVF) en una muestra dada. Para la detección de EMR en cada muestra, la FAVF se calculó independientemente para las VF de doblete, triplete y cuadruplete.
10(c)(7): Simulación de Montecarlo de la significación empírica de la detección de VF dentro de una muestra
Para evaluar la significación estadística de la detección de VF derivadas de tumores en cualquier muestra, se aplicó un enfoque empírico de prueba de significación. Primero se definió un estadístico de prueba f de la siguiente manera: a partir de una lista dada de k posibles VF derivadas de tumores observadas en la mejor muestra de genotipado, se calculó la media aritmética de las fracciones alélicas en las k VF (fracción alélica definida como el número de pares de lecturas que contienen una VF individual (xi) sobre el número de pares de lecturas que abarcan las posiciones de VF (di)):
para evaluar la hipótesis de quefno es significativamente diferente de la tasa de error de fondo de VF similares evaluadas desde la misma muestra. Se utilizó un enfoque de Montecarlo para desarrollar una distribución nula y realizar pruebas estadísticas de la siguiente manera:
1. Dado un conjunto dekVF, {pv1...pvi...pvk}, una lista "alternativa" de VF, {pv'1...pv'i...pv'k}, se generó de modo que para cada VF alternativa tenía el mismo tipo de cambio de base y distancia entre SNV que la VF de prueba. Por ejemplo, si una VF de doblete, chr14:106329929 C>T y chr14:106329977 G>A, se identificó en la muestra de genotipado y se buscaron dos posiciones alternativas a la misma distancia genómica (aquí, 48 pb) con las bases de referencia C y G, y se evaluaron los pares de lecturas con los mismos tipos de cambios de base (es decir, C>T y G>A), utilizando el esquema de búsqueda heurística que se indica a continuación.
2. Para cada tumorpvien el conjunto dek,se identificaron 50 alternativas de este tipo. Esto se realizó con un algoritmo de búsqueda aleatoria para explorar el espacio genómico e identificar alternativas. Para encontrar estas 50 alternativas, se identificó una posición aleatoria en el mismo cromosoma que la pruebapviy a continuación se buscaron los mismos tipos de bases de referencia a la misma distancia genómica como se ha descrito anteriormente. Se utilizó la sintenia de las VF observadas/alternas para tener en cuenta la variación regional de SHM/aSHM, así como la variación del número de copias, como posibles factores de confusión de la distribución nula. Se excluyeron posiciones alternativas que se identificaron como SNP de línea germinal, definido como el que tiene FA > 5 %.
3. Después de identificar 50 de tales alternativas para cadapvi,se generaron 10000 permutaciones aleatorias de 1 alternativa para cada una de laskVF originales y se calculó la fracción de variante en fasef'para estas listas de alternativas en la muestra de interés que se estaba evaluando para detectar la presencia de EMR, como se ha descrito anteriormente.
4. Se calculó un valor de la p empírico, definido como la fracción de veces que se observa que la verdadera fracción de la variante en fasefes inferior o igual a la alternativaf'en las 10000 listas aleatorias de VF como medida empírica de la significación de la EMR en la muestra de sangre de interés.
Aunque que esta comparación resultante es una medida de la significación para la detección de VF de la lista de indicadores tumorales en comparación con la tasa de error de VF de fondo definida empíricamentedentro dela muestra de interés, también se evaluó su relación con la especificidad de la detecciónentrecasos y muestras de control, como se describe a continuación.
10(c)(8): Evaluación de la especificidad de PhasED-Seq
Para determinar la especificidad de la enfermedad y la detección de EMR mediante PhasED-Seq, en primer lugar se identificaron las VF específicas de 107 pacientes con LDLBG utilizando ADN tumoral o plasmático previo al tratamiento junto con muestras emparejadas de línea germinal. A continuación, se evaluaron 40 muestras independientes de ADN plasmático de individuos sanos para detectar la presencia de estas VF específicas de pacientes, utilizando el método de Montecarlo descrito anteriormente. Se determinó empíricamente un umbral para los valores de la p a partir de Montecarlo de modo que se alcanzara una especificidad del 95 % para la detección de la enfermedad a partir de las VF de doblete, triplete y cuadruplete. El umbral del valor de la p que arroja una especificidad ≥95 % para cada tamaño de VF fue el siguiente: <0,041 para los dobletes, <1 para los tripletes y <1 para los cuadrupletes. Los resultados de esta especificidad en análisis de ADNec de control se muestran en lasFIG.15 y 16.
10(c)(9): Cálculo de las tasas de error
Para evaluar el perfil de error tanto de SNV aisladas como de VF, se examinó la tasa de observación de bases no de referencia de cada tipo de variante en todas las lecturas. Para SNV aisladas, la tasa de error para cada posible cambio de baseen1>n1se calculó como la fracción de bases en la diana con alelo de referencian1 que mutan a alelo alternativon1', al considerar todos los posibles cambios de base del alelo de referencia. Las posiciones con una tasa de alelos no de referencia superior al 5 % se clasificaron como probables eventos de línea germinal y se excluyeron del análisis de la tasa de error. Una tasa de error global, definida como la tasa de mutación desde el alelo de referencia hg19 a cualquier alelo alternativo, también se calculó.
Para variantes en fase, se realizó un cálculo similar. Para la tasa de error de un tipo dado de variante en fase compuesta porkcambios de base constitutivos {en1>n1'...enk>nk'}, la tasa de error se calculó determinando el número de casos del tipo de cambio de base (es decir, el numerador), así como el número de casos posibles para el cambio de base (es decir, el denominador). Para calcular el numerador,N,se contó el número de apariciones de la VF de interés en todos los pares de lecturas de una muestra determinada. Por ejemplo, para calcular la tasa de error de los dobletes en fase C>T y G>A, primero se contó el número de pares de lecturas que incluyentantouna C de referencia mutada a una T como una G de referencia mutada a una A.
Para calcular el denominador,D,también se calculó el número de casos posibles de este tipo de variante en fase; esto se realizó primero para cada par de lecturasi,y a continuación se sumaron todos los pares de lecturas. Una VF conkcomponentes puede resumirse como una que tiene determinado conjunto de bases de referenciapA, pC, pG, pT,dondepNes el número de cada base de referencia en la VF. De forma similar, un par de lecturas dado contiene un determinado conjunto de bases de referenciabA, bC, bG, bT,dondepNes el número de cada base de referencia en el par de lectura. Por lo tanto, para cada par de lectura de una muestra determinada, el número de posibles apariciones del tipo VF de interés puede calcularse de forma combinatoria como:
Por ejemplo, dado un par de lectura con 40 A de referencia, 50 C de referencia, 45 G de referencia y 35 T de referencia. El número de posiciones para una VF C>T y G>A es:
El denominador agregado, D, para el cálculo de la tasa de error es, entonces, simplemente la suma de este valor sobre todos los pares de lectura. La tasa de error para este tipo de VF es entonces simplementeN/D.
10(d): Diferencias en las variantes en fase entre los subtipos de linfoma
Para comparar la distribución de variantes en fase en diferentes tipos de linfomas, se identificaron VF específicos de tumor en 101 LDLBG, 16 LPMB y 23 pacientes con LHc mediante secuenciación de muestras de biopsia tumoral y/o ADN extracelular previo al tratamiento y muestras emparejadas de línea germinal. Tras identificar estas VF específicas de tumor, su distribución fue la evaluada en todo el panel de secuenciación dirigida. El panel se dividió primero en grupos de 50 pb; para cada paciente, se determinó a continuación si cada paciente tenía indicios de una VF dentro del grupo de 50 pb, definidos como al menos un componente de la VF dentro del grupo. Además, se determinó el gen más cercano a cada grupo de 50 pb, en función de la anotación GENCODEv19 del genoma de referencia.
Para evaluar cómo varía la distribución de VF entre subtipos de linfoma a nivel de genes específicos, se examinó la distribución de las VF en los grupos de 50 pb que abarcaban cada gen (o el gen más cercano). Por ejemplo, dado un gen determinado con n grupos de 50 pb de este tipo representados en un panel de secuenciación dirigida. Para cada grupo, primero se determinó la fracción de pacientes,f, en cada tipo de linfoma con una VF dentro del grupo de 50 pb, es decir, determinar {ftipo1,1, ...ftipo1,n} y {ttipo2,1, ...ftipo2,n}. A continuación, se compararon dos histologías cualesquiera para determinar la fracción de casos que presentaban VF en el conjunto de intervalos de 50 pb asignados a cada gen. Estas comparaciones se representan para genes individuales en gráficos específicos de genes en laFIG. 2Dy lasFIG.10-12.
El enriquecimiento en VF se comparó estadísticamente en un tipo o subtipo específico de linfoma frente a otro calculando la diferencia en la fracción de pacientes que contienen una VF en cada intervalo de 50 pb en todos los intervalos cedidos a un gen (es decir, que se solapan con un gen determinado o con un gen determinado más cercano). Concretamente, para cualquier comparación entre dos tipos de linfoma (tipo1ytipo2), este conjunto de diferencias en la tasa de VF se identificó por primera vez entre las histologías {ftipo1,1- ftipo2,1...ftipo1,n- ftipo2,n}. Este conjunto de diferencias específicas de genes en la frecuencia de VF se comparó entre tipos de linfoma con la distribución de todos los demás intervalos de 50 pb en el panel de secuenciación mediante la prueba de Wilcoxon para datos independientes. Para esta prueba, el conjunto dengrupos de 50 pb asignados a un gen determinado se comparó con todos los demás grupos de 50 pb (es decir, 6755 - n, ya que hay 6755 grupos de 50 pb en el panel de secuenciación). Este valor de la p, junto con la diferencia media en la fracción de pacientes con una VF en cada grupo para cada gen entre histologías, se representa como un diagrama de volcán en laFIG. 2E.Para explicar la diferencia global en la tasa de VF entre las distintas histologías, la diferencia media en la fracción de pacientes con una VF entre histologías se centró en 0 restando la diferencia media en todos los genes.
10(e): Sesgo de hibridación
Para evaluar el efecto de las mutaciones en la eficiencia de la hibridación, la afinidad de las moléculas mutadas por los cebos de captura naturales por ordenador se estimó primero considerando los fragmentos de ADN que albergan mutaciones de 0-30 % en todo el fragmento. Para cada condición de mutación en este intervalo, primero se muestrearon aleatoriamente 10000 regiones, cada una de 150 pb de longitud, de todo el genoma. A continuación se mutaron por ordenador estas regiones de 150 unidades para simular la tasa de mutación deseada de 3 formas diferentes: 1) mutando bases "agrupadas" o contiguas a partir de los extremos de una secuencia, 2) mutando bases agrupadas a partir de la mitad de la secuencia, o 3) mutando bases seleccionadas en posiciones aleatorias a lo largo de la secuencia. A continuación, se utilizó el paqueteenergy.cpara calcular la energía de unión teórica (kcal/mol) entre las secuencias mutadas y las naturales, al basarse en un modelo de vecino más próximo que emplea parámetros termodinámicos establecidos (FIG.14A).
Este experimento informático se replicó a continuación probando los efectos de las mismas tasas de mutaciónin vitro.Concretamente, se sintetizaron e hibridaron oligonucleótidos (IDT) para formar dobles cadenas de ADN con un 0-10 % de mutaciones en posiciones definidas con respecto a la secuencia del genoma humano de referencia. A continuación, estas moléculas de ADN sintético se capturaron juntas a concentraciones equimolares y se cuantificó la eficiencia relativa de captura de las dobles cadenas mutadas en comparación con la especie natural, sin mutar (FIG. 3A). Se seleccionaron dos conjuntos de secuencias oligonucleotídicas de regiones codificantes deBCL6yMYCpara capturar hipermutaciones somáticas aberrantes mediadas por AID asociadas con cada gen (tabla 5); la conservación de la capacidad de mapeo de las especies mutadas se garantizó mediante BWA ALN. Estas dobles cadenas de oligonucleótidos sintéticos se sometieron a continuación a la preparación de bibliotecas, después se capturaron y se secuenciaron mediante PhasED-Seq, realizado por triplicado utilizando muestras distintas. Esto permitió evaluar la eficiencia relativa de la captura híbrida y la recuperación molecular en comparación directa con moléculas naturales idénticas al genoma de referencia.
10(f): Evaluación del límite de detección con series de diluciones limitantes
Para definir empíricamente la sensibilidad analítica de PhasED-Seq, se utilizó una serie de diluciones limitadas de ADN extracelular de 3 pacientes que se añadieron a ADN extracelular de controles sanos a concentraciones definidas. La serie de diluciones contenía muestras con una fracción tumoral media esperada del 0,1 %, 0,01 %, 0,001 %, 0,0002 %, 0,0001 %, y 0,00005 % o en un intervalo de 1 parte en 1000 a 1 parte en 2000000. Se proporcionan las características de la secuenciación y cuantificación del ADNtc mediante CAPP-Seq, secuenciación bicatenaria y PhasED-Seq. Para comparar el rendimiento de cada método, se calculó la diferencia, δ, entre la fracción tumoral observada y la esperada para cada pacienteia cada concentración de diluciónj:
Este valor se calculó para pacientesi= {1,2,3} y concentracionesj= {0,001 %, 0,0002 %, 0,0001 %, 0,00005 %} para cada método de detección de ADNtc (CAPP-Seq, bicatenaria, PhasED-Seq de doblete y PhasED-Seq de triplete). A continuación, se comparó el rendimiento de cada método entre sí mediante la prueba de la t para datos emparejados en este conjunto de pacientes y concentraciones.
10(g): Modelo para predecir la probabilidad de detección de un conjunto determinado de variantes en fasePara construir un modelo matemático para predecir la probabilidad de detección de una muestra de interés determinada, se partió del supuesto común de que la detección de ADNec puede considerarse un proceso aleatorio basado en un muestreo binomial. Sin embargo, a diferencia de las SNV que se producen a grandes distancias genómicas entre sí, la detección de las VF puede ser muy interdependiente, especialmente cuando las VF están degradadas (es decir, cuando dos VF comparten componentes de SNV) o se producen muy cerca. Para tener en cuenta esto, solo se consideraron "indicadores tumorales" independientes las VF que presentaban una separación de >150 pb entre sí. El número de "indicadores tumorales" para permitir la detección de la enfermedad en una muestra dada puede determinarse por lo tanto de la siguiente manera. El panel PhasED-Seq se dividió en grupos de 150 pb. A continuación, cada VF de la lista de indicadores de un paciente determinado se convirtió en una coordenada BED, que consiste en la posición inicial (definida como el componente SNV más a la izquierda) y la posición final (definida como el componente SNV más a la derecha). Para cada VF, se determinó el grupo de 150 pb del panel selector PhasED-Seq que contenía la VF; si una VF abarcaba dos o más grupos de 150 pb, se asignó a ambos grupos. El número de indicadores tumorales independientes se definió a continuación como el número de grupos separados de 150 pb que contenían una VF específica del tumor.
A continuación, se desarrolló un modelo matemático que comparaba la probabilidad de detección esperada para una muestra determinada en una fracción tumoral dada con un número determinado de indicadores tumorales independientes (p. ej., grupos de 150 pb). Con un número dado de indicadores tumoralesr,a una fracción tumoral determinadaf, con una determinada profundidad de secuenciación d, la probabilidad de detectar 1 o más moléculas de ADN extracelulares que contengan una FV específica del tumor puede definirse como:
basado en un muestreo binomial simple. Sin embargo, como el método de detección de ADNtc se entrenó para tener una tasa de falsos positivos del 5 %, este término de tasa de falsos positivos también se añadió al modelo:
LaFIG. 3Gmuestra los resultados de este modelo para un intervalo de indicadores tumoralesrde 3 a 67 a una profundidad d de 5000. El límite de confianza de este gráfico muestra soluciones para un intervalo de profundidad d de 4000 a 6000.
Para validar empíricamente este modelo evaluando la probabilidad de detección de la enfermedad, se utilizaron muestras de series de diluciones limitantes. En esta serie de diluciones, 3 muestras de ADNec de pacientes, cada una de los cuales contenía VF específicas del paciente, se añadieron al ADNec de controles sanos. Para cada lista de VF específicas del paciente, se realizaron 25 submuestreos aleatorios de los grupos de 150 pb que contenían VF específicos de pacientes para generar listas de indicadores que contenían números variables de indicadores específicos de tumores. Se seleccionó un número máximo de grupos de 67 para permitir el muestreo de las 3 listas de VF específicas de pacientes, seguido de la reducción del número de grupos en 2x o 3x por operación. Esto dio lugar a listas de indicadores que contenían VF específicos de pacientes de 3, 6, 17, 34 o 67 grupos independientes de 150 pb. A continuación, se evaluó la detección de la enfermedad utilizando cada una de estas listas de VF específicas de pacientes de tamaño creciente en cada una de las muestras de dilución limitante "húmeda" desde 1:1000 hasta 1:1000000 (FIG.3H,círculos cerrados). Se crearon además mezclas por ordenador utilizando lecturas de secuenciación de muestras de dilución limitante con contenido tumoral esperado variable, y de nuevo se evaluó la probabilidad de detección de la enfermedad utilizando listas de indicadores de VF submuestreadas específicas de pacientes de longitudes variables (círculos abiertos). Para este experimento, los archivos bam tanto de dilución "húmeda" como "por ordenador" se submuestrearon para lograr una profundidad de ~4000-6000x para corresponder con la profundidad modelada. La media y desviación estándar final de la profundidad en todos los archivos bam de submuestreo fue de 4214x 789. La probabilidad de detección se resumió en todas las pruebas a una determinada fracción tumoral esperada, para una determinada lista de VF específica de paciente. Para cada dilución dada, se consideraron múltiples conjuntos de lecturas muestreados de forma independiente para permitir una estimación superior de la verdadera probabilidad de detección. Concretamente, en latabla 7se consideró el siguiente número de réplicas en cada dilución indicada.
Tabla 7.Réplicas en cada dilución para predecir la probabilidad de detección de un conjunto dado de variantes en fase.
El número total de pruebas, para cada lista de VF específica del paciente, es, por lo tanto, el número de listas de VF submuestreadas aleatoriamente (p. ej., 25) multiplicado por el número de archivos bam submuestreados de forma independiente; este número figura en la tabla anterior. En laFIG.3H, los puntos y las barras de error representan la media, el mínimo y el máximo en los tres pacientes. La concordancia entre la probabilidad predicha de detección de la enfermedad a partir del modelo matemático teórico y las muestras en húmedo y por ordenador que valida este modelo, se muestra en laFIG.31.
10(h): Análisis estadísticos y disponibilidad de software
Todos los valores de la p indicados en este manuscrito son de dos caras, salvo que se indique lo contrario. Las comparaciones de muestras y poblaciones emparejadas se realizaron mediante la prueba de Wilcoxon para datos emparejados; las comparaciones de muestras extraídas de poblaciones no relacionadas se realizaron mediante la prueba de Wilcoxon para datos independientes. Las comparaciones de muestras emparejadas se realizaron mediante la prueba de la t para datos emparejados. Las probabilidades de supervivencia se estimaron utilizando el método de Kaplan-Meier; la supervivencia de los grupos de pacientes en función de los niveles de ADNtc se comparó mediante la prueba de orden logarítmico. Otras pruebas estadísticas se indican en el texto del manuscrito cuando se utilizan. Todos los análisis se realizaron mediante MATLAB, versión 2018b, R Statistical Software versión 3.4.1, y GraphPad Prism, versión 8.0.2. La contribución de los procesos mutacionales conocidos a las SNV en fase y aisladas desde SGC se evaluó con el paquete R deconstruct Sigs usando el conjunto de firmas COSMIC (v2) como se describe. El cálculo del ABC teniendo en cuenta la supervivencia y la censura se realizó utilizando el paquete R 'survivalROC' versión 1.0.3 con la configuración predeterminada. Una versión ejecutable del software PhasED-Seq, desarrollado en C++17, está disponible en phasedseq(dot)stanford(dot)edu.
Ejemplo 11
En el presente documento se proporcionan detalles adicionales de las tablas descritas a lo largo de la presente divulgación:
TABLA 1:Regiones de interés de 1000 pb en todo el genoma que contienen variantes en fase (VF) potenciales en diversas neoplasias linfoides. Solo se muestran las regiones que contienen > 1 sujeto con una VF. Las coordenadas están en hg19. Se han marcado regiones de los genes previamente identificados como dianas de la desaminasa inducida por activación (AID). Las regiones que contienen VF en > 5 % de los sujetos en cualquier histología (LB, LLC, LDLBG, LF) también están marcadas. LB, linfoma de Burkitt; LLC, leucemia linfocítica crónica; LDLBG, linfoma difuso de linfocitos B grandes; LF, linfoma folicular.
TABLA 2:regiones de interés de 1000 pb en todo el genoma que contienen variantes en fase (VF) potenciales en los subtipos ABC y GCB de LDLBG. Solo se muestran las regiones que contienen > 1 sujeto con una VF. Las coordenadas están en hg19. Se han marcado regiones de los genes previamente identificados como dianas de la AID. ABC, subtipo de linfocitos B activados; GCB, subtipo de linfocitos B de centro germinal.
TABLA 3:Las regiones utilizadas para el reactivo de captura PhasED-Seq descritas en este artículo centrado en neoplasias linfoides malignas. Las coordenadas están en hg19. También se muestra el gen más cercano y el motivo de su inclusión (variantes en fase frente a genotipado general de LDLBG).
TABLA 4:Enriquecimiento de VF en locus genéticos en todo el panel de secuenciación dirigida PhasED-Seq para diferentes tipos de linfomas de linfocitos B (LDLBG, incluidos los subtipos ABC y GCB, LPMB y LHc). El selector PhasED-Seq se dividió en grupos de 50 pb en coordenadas hg19, y cada grupo se marcó por gen o gen más cercano. Se muestra la media de la fracción de casos de una histología determinada con una VF en todos los grupos de 50 pb. La significación se determinó mediante una prueba del orden (U de Mann-Whitney) de grupos de 50 pb para un gen determinado frente al resto del panel de secuenciación. Se muestran los valores de la p no corregidos; se realizó corrección de evaluación de hipótesis múltiples mediante el método de Bonferroni. LDLBG, linfoma difuso de linfocitos B grandes; LPMB, linfoma mediastínico primario de linfocitos B; LHc, linfoma de Hodgkin clásico; ABC, LDLBG de linfocitos B activados; GCB, LDLBG de linfocitos B de centro germinal.
TABLA 5:Secuencias de oligonucleótidos sintetizados para evaluar la hibridación y el sesgo de recuperación molecular con el aumento de la carga mutacional (SEQ ID NO: 1331-1358).
TABLA 6:Sondas de ácido nucleico para secuenciación por captura de cánceres de linfocitos B (SEQ ID NO: 0001-1330).
Aunque las realizaciones preferidas de la presente invención se han mostrado y descrito en el presente documento, será obvio para los expertos en la materia que dichas realizaciones se proporcionan solamente a modo de ejemplo. No está previsto que la invención se limite a los ejemplos específicos proporcionados en la memoria descriptiva. Mientras que la invención se ha descrito con referencia a la memoria descriptiva antes mencionada, las descripciones e ilustraciones de las realizaciones expuestas en el presente documento no deben considerarse en sentido restrictivo. Numerosas variaciones, cambios y sustituciones se les presentarán ahora a los expertos en la materia sin desviare de la invención. Asimismo, se entenderá que todos los aspectos de la invención no se limitan a las representaciones específicas, configuraciones o proporciones relativas establecidas en el presente documento que dependen de diversas condiciones y variables. Debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en el presente documento en la práctica la invención. Por lo tanto, se contempla que la invención abarque también cualquiera de dichas alternativas, modificaciones, variaciones o equivalentes. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención y que los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes estén cubiertos de ese modo.
Tabla 3

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método que comprende:
(a) obtener, mediante un sistema informático, datos de secuenciación derivados de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que se obtienen o derivan de un sujeto;
(b) procesar, mediante la aplicación de un código comprendido en el sistema informático, los datos de secuenciación para identificar una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares, en donde cada una de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende una pluralidad de variantes en fase en relación con una secuencia genómica de referencia, en donde al menos aproximadamente el 10 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende una primera variante en fase de la pluralidad de variantes en fase y una segunda variante en fase de la pluralidad de variantes en fase que están separadas por al menos un nucleótido y en donde la primera variante en fase de la pluralidad de variantes en fase y la segunda variante en fase de la pluralidad de variantes en fase están en un intervalo de 170 pares de bases entre sí; y
(c) analizar, mediante la aplicación de un código comprendido en el sistema informático, la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas para determinar una afección del sujeto, en donde la afección comprende un cáncer que no es una neoplasia hematológica.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende además separar, por ordenador, (i) al menos una parte de una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas de (ii) una o más moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que no se ha identificado que comprendan la pluralidad de variantes en fase y que comprende además, opcionalmente, analizar, mediante el sistema informático, (i) y (ii) como variables diferentes.
3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el análisis de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas no se basa en otras moléculas de ácido nucleico extracelulares de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares que no se ha identificado que comprendan la pluralidad de variantes en fase.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde los datos de secuenciación se obtienen sin eliminación ni supresión por ordenador de (i) error de fondo o (ii) error de secuenciación.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde un número de la pluralidad de variantes en fase de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas es indicativo de la afección del sujeto, opcionalmente en donde una relación entre (i) el número de la pluralidad de variantes en fase de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas y (ii) un número de variantes de un solo nucleótido (SNV) de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas es indicativa de la afección del sujeto.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde una frecuencia de la pluralidad de variantes en fase en la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas es indicativa de la afección del sujeto.
7. El método de la reivindicación 1, en donde el al menos aproximadamente 10 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende al menos aproximadamente un 50 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares, opcionalmente, en donde el al menos aproximadamente 10 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende al menos aproximadamente un 100 % de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la primera y la segunda variantes en fase están separadas por al menos 2 nucleótidos y/o en donde la primera variante en fase y la segunda variante en fase están separadas como máximo por aproximadamente 160 nucleótidos.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la secuencia genómica de referencia procede de una cohorte de referencia y comprende al menos una parte del genoma humano hg19, genoma hg18, genoma hg17, genoma hg16 o genoma hg38.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la secuencia genómica de referencia procede de una muestra del sujeto, opcionalmente de una célula sana del sujeto.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la pluralidad de moléculas de ácido nucleico extracelulares comprende una pluralidad de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) extracelulares.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la afección comprende un tumor sólido.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el cáncer no es un linfoma y/o es un cáncer de pulmón, un cáncer colorrectal, un cáncer gastrointestinal, un cáncer de esófago o un cáncer de mama.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además determinar, mediante la aplicación de un código comprendido en el ordenador, que el sujeto tiene la afección o determinar un grado o estado de la afección del sujeto, basándose en la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas que comprenden la pluralidad de variantes en fase, en donde la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas proceden de una muestra asociada a la afección, basándose en la realización de un análisis de modelo estadístico de la o las moléculas de ácido nucleico extracelulares identificadas.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además capturar la pluralidad de ácidos nucleicos extracelulares con un conjunto de sondas de hibridación para obtener los datos de secuenciación, en donde el conjunto de sondas de ácido nucleico está configurado para hibridar con al menos una parte de moléculas de ácido nucleico extracelulares que comprenden una o más regiones genómicas asociadas con la afección y, opcionalmente, en donde el conjunto de sondas de ácido nucleico está diseñado basándose en la pluralidad de variantes en fase que se identifican comparando (i) datos de secuenciación de una muestra tumoral del sujeto y (ii) datos de secuenciación de una célula sana del sujeto o de una cohorte sana.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TR201907106T4 (tr) 2014-03-14 2019-06-21 Caredx Inc Bir transplant alıcısında immünosüpresif terapileri izleme yöntemleri.
GB2627085B (en) 2019-11-06 2024-11-13 Univ Leland Stanford Junior Methods and systems for analysing nucleic acid molecules
US11783912B2 (en) 2021-05-05 2023-10-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and systems for analyzing nucleic acid molecules
KR20230064172A (ko) * 2021-11-03 2023-05-10 주식회사 지씨지놈 세포유리 핵산단편 위치별 서열 빈도 및 크기를 이용한 암 진단 방법
AU2022410636A1 (en) * 2021-12-15 2024-06-06 The Johns Hopkins University Single molecule genome- wide mutation and fragmentation profiles of cell-free dna
CN114974421B (zh) * 2022-05-20 2024-04-30 南开大学 基于扩散-降噪的单细胞转录组测序数据补插方法及系统
KR20230172174A (ko) * 2022-06-15 2023-12-22 주식회사 지씨지놈 무세포 핵산의 단일염기변이를 이용한 암 진단 및 암 종 예측방법
CN115181800B (zh) * 2022-07-11 2025-06-13 南京世和基因生物技术股份有限公司 基因标志物在非小细胞肺癌预后效果预测中的应用、预测装置以及计算机可读取介质
GB202212094D0 (en) * 2022-08-19 2022-10-05 Inivata Ltd Method of detecting cancer DNA in a sample
CN116466085A (zh) * 2022-11-28 2023-07-21 中国人民解放军海军军医大学第三附属医院 一种四基因的生物标志物组合及其在肝癌治疗中的应用
KR102630597B1 (ko) * 2023-08-22 2024-01-29 주식회사 지놈인사이트테크놀로지 종양 정보를 활용한 미세 잔존 질환 탐지 방법 및 장치
US20250140343A1 (en) * 2023-10-30 2025-05-01 Myriad Women's Health, Inc. Methods for improving minimal residual disease assays
WO2025245136A1 (en) * 2024-05-22 2025-11-27 Foresight Diagnostics Inc. Methods and systems for adjuvant therapy
WO2026019737A1 (en) * 2024-07-16 2026-01-22 Myriad Women's Health, Inc. Targeted depletion sequencing for use in minimum residual disease assays
WO2026072949A1 (en) * 2024-09-27 2026-04-02 Roche Sequencing Solutions, Inc. Multi-modal risk stratification of minimum residual disease

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA233975A (en) 1923-09-04 Rightmire Franklin Anti-skid chain tightener
CA241076A (en) 1924-06-24 Carter Formby King Otis Calculating apparatus
CA188298A (en) 1918-04-08 1919-01-14 William H. Bot Grain separator
US5804396A (en) 1994-10-12 1998-09-08 Sugen, Inc. Assay for agents active in proliferative disorders
US6171856B1 (en) 1997-07-30 2001-01-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to no-mediated cytotoxicity
DE10032165A1 (de) 2000-07-01 2002-01-10 Beiersdorf Ag Verwendung von physiologisch verträglichen Sulfinsäuren als Antioxidans oder Radikalfänger in kosmetischen oder dermatologischen Zubereitungen
EP1456364B1 (en) 2001-12-21 2011-03-23 The Wellcome Trust Mutations in the b-raf gene
ES2425749T3 (es) 2004-03-31 2013-10-17 The General Hospital Corporation Método para determinar la respuesta del cáncer a tratamientos dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
WO2011103236A2 (en) 2010-02-18 2011-08-25 The Johns Hopkins University Personalized tumor biomarkers
US20190010543A1 (en) * 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
ES2523140T3 (es) 2010-09-21 2014-11-21 Population Genetics Technologies Ltd. Aumento de la confianza en las identificaciones de alelos con el recuento molecular
KR102759126B1 (ko) 2010-12-30 2025-01-24 파운데이션 메디신 인코포레이티드 종양 샘플의 다유전자 분석의 최적화
ES2986436T3 (es) 2011-04-15 2024-11-11 Univ Johns Hopkins Sistema de secuenciación segura
WO2013123442A1 (en) 2012-02-17 2013-08-22 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for accurately identifying mutations
PT2828218T (pt) 2012-03-20 2020-11-11 Univ Washington Through Its Center For Commercialization Métodos para baixar a taxa de erro da sequenciação paralela massiva de adn utilizando sequenciação duplex de consensus
CN104781421B (zh) 2012-09-04 2020-06-05 夸登特健康公司 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US20160040229A1 (en) 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
EP4414990A3 (en) 2013-01-17 2024-11-06 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
WO2014121091A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 The Regents Of The University Of California Methods for genome assembly and haplotype phasing
WO2014151117A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Identification and use of circulating nucleic acid tumor markers
ES2660989T3 (es) 2013-12-28 2018-03-27 Guardant Health, Inc. Métodos y sistemas para detectar variantes genéticas
CA2945962C (en) * 2014-04-21 2023-08-29 Natera, Inc. Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments
JP6681841B2 (ja) * 2014-05-09 2020-04-15 ライフコーデックス アーゲー 特別な細胞タイプに由来するｄｎａの検出とそれに関連する方法
EP4170044B1 (en) * 2014-06-06 2026-03-11 Cornell University Method for identification and enumeration of nucleic acid sequence, expression, copy, or dna methylation changes, using combined nuclease, ligase, polymerase, and sequencing reactions
CA2953469A1 (en) * 2014-06-26 2015-12-30 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
CN107075730A (zh) 2014-09-12 2017-08-18 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 循环核酸的鉴定及用途
WO2016049878A1 (zh) * 2014-09-30 2016-04-07 深圳华大基因科技有限公司 一种基于snp分型的亲子鉴定方法及应用
JP2017533714A (ja) 2014-11-12 2017-11-16 ネオゲノミクス ラボラトリーズ， インコーポレイテッド 末梢血血漿ｄｎａのディープシーケンシングは、骨髄異形成症候群の診断を確認するうえで信頼性が高い
WO2016130578A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 10X Genomics, Inc. Systems and methods for determining structural variation and phasing using variant call data
EP3288455B1 (en) 2015-05-01 2023-12-06 Guardant Health, Inc. Diagnostic methods
CA3002740A1 (en) 2015-10-19 2017-04-27 Dovetail Genomics, Llc Methods for genome assembly, haplotype phasing, and target independent nucleic acid detection
US10260088B2 (en) 2015-10-30 2019-04-16 New England Biolabs, Inc. Compositions and methods for analyzing modified nucleotides
LT3368688T (lt) 2015-10-30 2021-03-10 New England Biolabs, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti modifikuotų citozinų nustatymui sekvenavimu
AU2016363113A1 (en) 2015-12-03 2018-06-07 Alfred Health Monitoring treatment or progression of myeloma
CA3006792A1 (en) 2015-12-08 2017-06-15 Twinstrand Biosciences, Inc. Improved adapters, methods, and compositions for duplex sequencing
CN116640847A (zh) 2016-02-02 2023-08-25 夸登特健康公司 癌症进化检测和诊断
EP3430170B1 (en) * 2016-03-16 2023-08-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for genome characterization
US11299783B2 (en) 2016-05-27 2022-04-12 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
WO2017205823A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Personalis, Inc. Personalized genetic testing
US9850523B1 (en) 2016-09-30 2017-12-26 Guardant Health, Inc. Methods for multi-resolution analysis of cell-free nucleic acids
EP3528950A4 (en) 2016-10-24 2020-05-27 Biomatrica, INC. STABILIZATION OF NUCLEIC ACIDS ON PAPER
IL269431B2 (en) 2017-03-23 2025-05-01 Univ Washington Methods for targeted nucleic acid sequence enrichment with applications to error corrected nucleic acid sequencing
US11342047B2 (en) * 2017-04-21 2022-05-24 Illumina, Inc. Using cell-free DNA fragment size to detect tumor-associated variant
GB2578038B (en) 2017-06-16 2022-11-23 Life Technologies Corp Control nucleic acids, and compositions, kits, and uses thereof
US10457955B2 (en) 2017-06-28 2019-10-29 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
CA3075932A1 (en) 2017-09-20 2019-03-28 Guardant Health, Inc. Methods and systems for differentiating somatic and germline variants
WO2019170773A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 Cancer Research Technology Limited Improvements in variant detection
CN109337983A (zh) * 2018-11-29 2019-02-15 优葆优保健康科技(宁波)有限公司 检测人甲状腺癌循环肿瘤dna的探针组合及其捕获测序系统
CN113728115A (zh) * 2019-01-25 2021-11-30 格里尔公司 侦测癌症、癌症来源组织及/或癌症细胞类型
KR102526906B1 (ko) * 2019-04-05 2023-05-02 주식회사 제놉시 Cfdna를 이용한 유방암 진단방법
CN110055312B (zh) * 2019-04-09 2022-11-15 嘉兴雅康博医学检验所有限公司 用于检测egfr基因c797s和t790m顺反式突变的引物、探针及试剂盒
WO2021003485A1 (en) 2019-07-03 2021-01-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods to assess clinical outcome based upon updated probabilities and treatments thereof
GB2627085B (en) 2019-11-06 2024-11-13 Univ Leland Stanford Junior Methods and systems for analysing nucleic acid molecules
EP4660324A3 (en) 2020-02-24 2026-02-18 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Methods of analyzing cell free nucleic acids and applications thereof
US11783912B2 (en) 2021-05-05 2023-10-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and systems for analyzing nucleic acid molecules
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