ES3041303T3 - Compositions and methods for immune checkpoint inhibition - Google Patents

Compositions and methods for immune checkpoint inhibition

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ES3041303T3 ES19865804T ES19865804T ES3041303T3 ES 3041303 T3 ES3041303 T3 ES 3041303T3 ES 19865804 T ES19865804 T ES 19865804T ES 19865804 T ES19865804 T ES 19865804T ES 3041303 T3 ES3041303 T3 ES 3041303T3
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Abstract

Composiciones y métodos terapéuticos para el tratamiento del cáncer, por ejemplo, del cáncer de páncreas, que utilizan nanopartículas unidas a ácidos nucleicos inhibidores, por ejemplo, ARNip, dirigidos a una molécula de punto de control inmunológico, por ejemplo, el ligando 1 de muerte celular programada (PD-L1). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para la inhibición de puntos de control inmunitario
REIVINDICACIÓN DE PRIORIDAD
Esta solicitud reivindica el beneficio de las Solicitudes de Patente de EE. UU. N° de Serie 62/728.459, presentada el 7 de septiembre de 2018, y 62/790.953, presentada el 10 de enero de 2019.
CAMPO TÉCNICO
Se describen en el presente documento composiciones terapéuticas y el uso de nanopartículas ligadas a ácidos nucleicos inhibidores, p. ej., ARNsi, que se dirigen a una molécula de punto de control inmunitario, el ligando 1 de muerte celular programada 1 (PD-L1), para tratar el cáncer, p. ej. el cáncer pancreático.
ANTECEDENTES
En los últimos tiempos se ha visto un avance impresionante en el tratamiento de diversas neoplasias malignas usando inmunoterapia. Uno de los enfoques más prometedores implica los inhibidores de puntos de control inmunitario. A pesar de la esperanza de la inhibición de puntos de control para la inmunoterapia del cáncer, la respuesta generalmente es variable, con un gran número de pacientes que no responden. Ejemplos notables de inhibidores de PD-L1 aprobados por la FDA incluyen atezolizumab, para el cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) metastásico 21, y durvalumab para el carcinoma urotelial localmente avanzado o metastásico 22. Sin embargo, a pesar de los resultados alentadores iniciales y la aprobación por vía rápida del atezolizumab para el cáncer vesical 2124, el ensayo de confirmación no conseguía su criterio principal de valoración de supervivencia general 25. De forma similar, un ensayo en fase III de durvalumab con tremelimumab como tratamiento de primera línea del cáncer de pulmón no microcítico no cumplía su criterio principal de valoración de supervivencia sin progresión 26.
Luo, Xin, y cols, International journal of nanomedicine (2017): 5331 -5343, describe nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas en polietilenimina funcionalizada con ácido fólico como agentes teranósticos para resonancia magnética y el aporte de ARNsi de PD-L1 para el cáncer gástrico.
COMPENDIO
La presente invención se define mediante las reivindicaciones independientes. Las reivindicaciones dependientes representan otras realizaciones de la invención.
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento, diagnóstico o cirugía se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para el uso en un método para el tratamiento, el diagnóstico o la cirugía del cuerpo de un ser humano o un animal. Cualquier materia que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solamente con fines informativos.
Se describen en el presente documento estrategias para tratar el cáncer que incluyen combinar agentes quimioterapéuticos tales como gemcitabina y un inhibidor de moléculas de puntos de control inmunitario, un inhibidor del ligando de muerte programada 1 (PD-L1), denominado MN-siPDL1. Como ejemplo, MN-siPDL1 incorpora ARN interferente pequeño contra PD-L1 (siPDL1) conjugado a un nanovehículo magnético (MN). Según se muestra en el presente documento, el aporte de MN-siPDL1 a tumores puede comprobarse semicuantitativamente mediante obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI) no invasiva, debido a que el vehículo MN es superparamagnético. Una terapia combinada que consiste en agentes quimioterapéuticos tales como gemcitabina y MN-siPDL1 en un modelo de cáncer pancreático murino singénico daba como resultado una reducción significativa en el crecimiento tumoral y un incremento en la supervivencia. Después de la optimización de la dosis, se conseguía una reducción de 90% en el volumen tumoral 3 semanas después del comienzo del tratamiento. Mientras que 100% de los animales de control había sucumbido a sus tumores para la semana 6 después del comienzo del tratamiento, no había mortalidad en el grupo experimental para la semana 5, y 67% de los animales de experimentación sobrevivían durante 12 semanas. Estos métodos pueden usarse es una enfermedad intratable para la que no existan tratamientos eficaces y que se caracterice por una supervivencia a 5 años de solo 1%.
Según la invención, se proporcionan en el presente documento nanopartículas terapéuticas, donde dichas nanopartículas tienen un diámetro de entre 10 nm y 30 nm; y comprenden un núcleo de óxido de hierro, un revestimiento polimérico que comprende dextrano, y un ácido nucleico inhibidor que se dirige a una molécula de punto de control inmunitario, donde la molécula de punto de control inmunitario es ligando 1 de muerte celular programada 1 (PD-L1), que está ligado covalentemente a la nanopartícula.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende una secuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos complementarios a SEQ ID NO:1.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende al menos un nucleótido modificado, donde el al menos un nucleótido modificado comprende al menos una modificación en su base y/o al menos una modificación en su azúcar, o donde el al menos un nucleótido modificado comprende una modificación en un átomo que forma un enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos contiguos en el ácido nucleico.
En algunas realizaciones, el al menos un nucleótido modificado es un nucleótido bloqueado.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico es una molécula de ARN interferente pequeño (ARNsi).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico está ligado covalentemente a la nanopartícula a través de un resto químico que comprende un enlace disulfuro o un enlace tioéter.
En algunas realizaciones, la nanopartícula es magnética.
Según la invención, se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento, y opcionalmente un agente quimioterapéutico, , opcionalmente donde el agente quimioterapéutico es gemcitabina.
Según la invención, se proporcionan las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento en combinación con un agente quimioterapéutico, para el uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de piel, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de estómago, cáncer de tiroides y cáncer uterino.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen obtener imágenes de un tejido del sujeto para determinar una localización o un número de células cancerosas en el sujeto, o una localización de las nanopartículas terapéuticas en el sujeto.
En algunas realizaciones, la nanopartícula terapéutica se administra en dos o más dosis al sujeto, y opcionalmente donde la nanopartícula terapéutica se administra al sujeto al menos una vez a la semana.
En algunas realizaciones, la nanopartícula terapéutica se administra al sujeto mediante administración intravenosa, subcutánea, intraarterial, intramuscular o intraperitoneal.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer pancreático.
En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico es gemcitabina.
El término "magnética" se usa para describir una composición que es sensible a un campo magnético. Las composiciones magnéticas (cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento) contienen un material que es paramagnético, superparamagnético o ferromagnético. Las composiciones magnéticas contienen un óxido metálico seleccionado del grupo de óxidos de Fe(II).
El término "paramagnética" se usa para describir una composición que desarrolla un momento magnético solamente en presencia de un campo magnético aplicado externamente.
El término "ferromagnética" o "ferromagnética" se usa para describir una composición que es fuertemente sensible a campos magnéticos y es capaz de retener propiedades magnéticas (un momento magnético) después de que se haya retirado un campo magnético aplicado externamente.
Por el término "nanopartícula" se entiende un objeto que tiene un diámetro entre 10 nm y 30 nm, entre 10 nm y 20 nm, entre 10 nm y 15 nm. Las nanopartículas incluyen las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento. Por el término "nanopartícula magnética" se entiende una nanopartícula (cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento) que es magnética (según se define en el presente documento). Nanopartículas magnéticas se describen en el presente documento.
Por el término "revestimiento polimérico" se entiende al menos una capa molecular (p. ej., homogénea o heterogénea) de al menos un polímero, dextrano, aplicada a una superficie de un objeto tridimensional (p. ej., un objeto tridimensional que contiene un material magnético, tal como un óxido metálico). Métodos para aplicar un revestimiento polimérico a un objeto (p. ej., un objeto tridimensional que contiene un material magnético) se describen en el presente documento y también son conocidos en la técnica.
Por el término "ácido nucleico" se entiende cualquier polinucleótido mono- o bicatenario (p. ej., ADN o ARN, ADNc, de origen semisintético o sintético). El término ácido nucleico incluye oligonucleótidos que contienen al menos un nucleótido modificado (p. ej., que contienen una modificación en la base y/o una modificación en el azúcar) y/o una modificación en el enlace fosfodiéster que liga dos nucleótidos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede contener al menos un nucleótido bloqueado (LNA). Ejemplos no limitativos de ácidos nucleicos se describen en el presente documento. Ejemplos adicionales de ácidos nucleicos son conocidos en la técnica.
Por el término "nucleótido modificado" se entiende un nucleótido de ADN o ARN que contiene al menos una modificación en su base y/o al menos una modificación en su azúcar (ribosa o desoxirribosa). Un nucleótido modificado también puede contener una modificación en un átomo que forma un enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos adyacentes en una secuencia de ácido nucleico.
Por el término "fluoróforo" se entiende una molécula que absorbe luz a una primera longitud de onda y emite luz a una segunda longitud de onda, donde la primera longitud de onda es más corta (energía superior) que la segunda longitud de onda. En algunas realizaciones, la primera longitud de onda absorbida por el fluoróforo puede estar en el intervalo infrarrojo cercano. Ejemplos no limitativos de fluoróforos se describen en el presente documento. Ejemplos adicionales de fluoróforos son conocidos en la técnica.
Por el término "luz en el infrarrojo cercano" se entiende luz con una longitud de onda de entre aproximadamente 600 nm y aproximadamente 3.000 nm.
Por el término "péptido dirigido" se entiende un péptido que está unido por una molécula (p. ej., proteína, azúcar o lípido, o una combinación de los mismos) presente en o sobre la membrana plasmática de una célula diana (p. ej., una célula cancerosa). Según se describe en el presente documento, un péptido dirigido puede estar ligado covalentemente a una molécula o composición secundaria (p. ej., cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento) para dirigir la molécula o composición secundaria a una célula diana (p. ej., una célula cancerosa). En algunas realizaciones, un péptido dirigido que está ligado covalentemente a una molécula o composición secundaria (p. ej., cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento) da como resultado la captación de la molécula o composición secundaria por la célula diana (p. ej., captación celular por endocitosis o pinocitosis). Ejemplos no limitativos de péptidos dirigidos se describen en el presente documento. Ejemplos adicionales de péptidos dirigidos son conocidos en la técnica.
Por el término "ARN interferente pequeño" o "ARNsi" se entiende una molécula de ácido nucleico bicatenaria que es capaz de mediar en la interferencia de ARN en una célula. El proceso de interferencia de ARN se describe en Ebalshir y cols. (Nature 411:494-498, 2001). Cada cadena de ARNsi puede tener una longitud de entre 19 y 23 nucleótidos. Según se usa en el presente documento, las moléculas de ARNsi no necesitan limitarse a las moléculas que contienen solo nucleótidos de ARN naturales o endógenos, sino que puede abarcar además nucleótidos químicamente modificados. Ejemplos no limitativos de ARNsi se describen en el presente documento. Ejemplos adicionales de ARNsi son conocidos en la técnica.
Por la expresión "crecimiento tumoral" se entiende la expansión de masa tumoral en un sujeto. Ejemplos no limitativos de crecimiento tumoral incluyen: la formación de nuevas células tumorales, la proliferación de células tumorales existentes, la resistencia a la apoptosis en células tumorales existentes. Métodos ejemplares para detectar y determinar el crecimiento tumoral se describen en el presente documento. Métodos adicionales para detectar y determinar el crecimiento tumoral son conocidos en la técnica.
Por el término "metástasis" se entiende la migración de una célula cancerosa presente en un tumor primario a un tejido secundario no adyacente en un sujeto. Ejemplos no limitativos de metástasis incluyen: metástasis desde un tumor primario hasta un ganglio linfático (p. ej., un ganglio linfático regional), tejido óseo, tejido pulmonar, tejido hepático o tejido cerebral. El término metástasis también incluye la migración de una célula cancerosa metastásica encontrada en un ganglio linfático hasta un tejido secundario (p. ej., tejido óseo, tejido hepático o tejido cerebral). En algunas realizaciones no limitativas, la célula cancerosa presente en un tumor primario es una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer de riñón, una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer de piel, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer rectal, una célula de cáncer de estómago, una célula de cáncer de tiroides o una célula de cáncer de útero. Aspectos y ejemplos adicionales de metástasis son conocidos en la técnica o se describen en el presente documento.
Por el término "tumor primario" se entiende un tumor presente en la zona anatómica en la que comienza la progresión del tumor y avanza para dar una masa cancerosa. En algunas realizaciones, un médico puede no ser capaz de identificar claramente la zona del tumor primario en un sujeto.
Por el término "tumor metastásico" se entiende un tumor en un sujeto que se originaba a partir de una célula tumoral que se metastasizaba desde un tumor primario en un sujeto. En algunas realizaciones, un médico puede no ser capaz de identificar claramente la zona del tumor primario en un sujeto.
Por el término "ganglio linfático" se entiende un pequeño órgano esférico u ovalado del sistema inmunitario que contiene una variedad de células, incluyendo linfocitos B, linfocitos T y macrófagos, que está conectado al sistema linfático mediante vasos linfáticos. En un mamífero está presente una variedad de ganglios linfáticos, incluyendo, pero no limitados a: ganglios linfáticos axilares (p. ej., glándulas laterales, glándulas anteriores o pectorales, glándulas posteriores o subescapulares, glándulas centrales o intermedias o glándulas mediales o subclaviculares), ganglios linfáticos centinela, ganglios linfáticos submandibulares, ganglios linfáticos cervicales anteriores, ganglios linfáticos cervicales posteriores, ganglios linfáticos supraclaviculares, ganglios linfáticos submentonianos, ganglios linfáticos femorales, ganglios linfáticos mesentéricos, ganglios linfáticos mediastínicos, ganglios linfáticos inguinales, ganglios linfáticos subsegmentarios, ganglios linfáticos segmentarios, ganglios linfáticos lobulares, ganglios linfáticos interlobulares, ganglios linfáticos hiliares, glándulas supratrocleares, glándulas deltoideopectorales, ganglios linfáticos inguinales superficiales, ganglios linfáticos inguinales profundos, ganglios linfáticos braquiales y ganglios linfáticos poplíteos
Por el término "obtención de imágenes" se entiende la visualización de al menos un tejido de un sujeto usando una técnica biofísica (p. ej., absorción y/o emisión de energía electromagnética). Realizaciones no limitativas de obtención de imágenes incluyen: obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía computarizada de rayos X y obtención de imágenes óptica.
Por la expresión "estabilización del tamaño tumoral" se entiende que un tumor ha alcanzado un estadio en el que solamente hay un cambio insignificante o indetectable en el volumen total o aproximado de un tumor en un sujeto a lo largo del tiempo.
Por la expresión "velocidad de crecimiento tumoral" se entiende un cambio en el volumen total o aproximado de un tumor o un cambio en el número total o aproximado de células presentes en un tumor a lo largo del tiempo en un sujeto. La velocidad de crecimiento tumoral se puede determinar usando los métodos ejemplares descritos en el presente documento. Métodos adicionales para determinar la velocidad de crecimiento tumoral son conocidos en la técnica.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por un experto normal en la técnica a la que pertenece esta invención. Se describen en el presente documento métodos y materiales para el uso en la presente invención; también se pueden usar otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, métodos, y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos. En caso de conflicto entre la presente memoria descriptiva y una referencia mencionada en el presente documento, dominará la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones.
Otras particularidades y ventajas de la invención se harán evidentes a partir de la descripción detallada y las figuras siguientes, y a partir de las reivindicaciones.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1A-B. Estructura, síntesis y caracterización de MN-siPDL1 ejemplar. A. Se sintetizó MN-siPDL1 mediante conjugación secuencial de nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas revestidas con dextrano aminado de 20 nm al conector lábil heterobifuncional SPDP y ARNsi contra PD-L1. B. Caracterización de MN-siPDL1.
FIG. 2A-C. Aporte guiado por imágenes de MN-ARNsi a tumores. A. Mapas de T2 de animales que tienen tumores. La localización de MN-siPDL1 en tejido tumoral provocaba el acortamiento del tiempo de relajación T2 y daba como resultado un contraste negativo en comparación con la imagen de antes del contraste. B. Mediciones de la concentración de MN-siPDL1 sobre la región de interés (ROI) del tumor en animales de experimentación y de control durante las primeras 3 semanas de tratamiento. La velocidad de acumulación de MN-siPDL1 era 1,5 veces más rápida que la de MN-siSCR durante las primeras tres semanas de tratamiento. C. Mediciones de la concentración de MN-siPDL1 sobre la región de interés (ROI) del tumor en animales de experimentación y de control durante las semanas 3-12 de tratamiento. La concentración del agente en el grupo de control tratado con MN-siSCR disminuía 5,1 veces más rápidamente que en el grupo de experimentación tratado con MN-siPDL1.
FIG. 3A-D. Tratamiento combinado con gemcitabina y MN-siPDL1. A. Imágenes de MR ponderadas a T2 con código de color representativas durante el transcurso del tratamiento. B. Cambio en el volumen tumoral durante el tratamiento. La respuesta era significativamente diferente entre el MN-siPDL1 activo a dosis altas y el agente terapéutico MN-siSCR inactivo con gemcitabina comenzando tan pronto como la semana 2. En el grupo de MN-siPDL1 a dosis bajas, esta diferencia era evidente después de la semana 6. C. Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier que demuestra una mejora en la supervivencia en animales tratados con MN-siPDL1+gemcitabina frente a MN-siSCR+gemcitabina. D. Fotografías de ratones que tienen tumores a la semana 6 que demuestran necrosis y ulceración en los tumores de control.
FIG. 4A-B. Inmunofluorescencia de tumores procedentes de ratones tratados con MN-siPDL1 y gemcitabina. A. Micrografías representativas y B. Análisis cuantitativo de la intensidad de la señal de fluorescencia que demuestra una inhibición de PD-L1, una incorporación y activación de TILO, una atenuación de Treg y una inhibición de la proliferación de células tumorales eficaces. TL: linfocitos T; CTL: linfocitos T citotóxicos; Treg: células T reguladoras; Ki-67: proliferación.
FIG. 5A-D. Tratamiento combinado con gemcitabina y MN-siPDL1. Cambio en el volumen tumoral durante el tratamiento para cada uno de los grupos de tratamiento. A, pacientes que responden a altas dosis de MN-siPDL1; B, pacientes que no responden a altas dosis de MN-siPDL1; C, baja dosis de MN-siPDL1; D, MN-siSCR (control mezclado). El tamaño de la muestra para el estudio era 6. En el grupo de dosis alta, había 2 ratones que no respondían, es decir, sus volúmenes tumorales no remitían; sus resultados se muestran en la Fig. 5B.
FIG. 6. Esquema con detalles adicionales de la preparación de un nanofármaco ejemplar (MN-siPDL1) para la inhibición de ARNm de PD-L1 en células cancerosas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Aunque siguen siendo muy prometedores, los resultados clínicos con inhibidores de puntos de control han demostrado variabilidad en la respuesta. El cáncer pancreático, en particular, ha resultado resistente a enfoques inmunoterapéuticos iniciales.
El cáncer pancreático es la cuarta causa principal de muerte relacionada con el cáncer en los Estados Unidos con una tasa de supervivencia global a 5 años de solo 8%.1 La resección quirúrgica sigue siendo el tratamiento de elección para pacientes con enfermedad resecable. Sin embargo, menos de 20% de los pacientes diagnosticados están cualificados para resecciones curativas,230% de los pacientes presentan enfermedad regional y 50% presentan metástasis distales 3 con tasas de supervivencia de 11% y 2%, respectivamente.1 Se ha postulado que las razones tras este mal pronóstico implican el estadio avanzado en el momento del diagnóstico,2 y resistencia a quimioterapias estándar.4 Se concibe que existen múltiples factores que confieren quimiorresistencia: la formación de un estroma desmoplástico que limita el aporte de fármaco, la activación de células estrelladas pancreáticas por especies reactivas del oxígeno, citocinas y/o factores de crecimiento, y la secreción por células estrelladas activadas de moléculas de señalización inmunosupresoras.45 Debido a la biología tumoral compleja del cáncer pancreático, han surgido múltiples quimioterapias combinadas. Como tales, FOLFIRINOX (una combinación que consiste en 5-fluorouracilo, leucovorina, irinotecán y oxaliplatino) y gemcitabina/nab-paclitaxel han mostrado mejoras en la supervivencia global en comparación con el tratamiento monoterapéutico con gemcitabina estándar.67 Sin embargo, estas terapias combinadas dependen mucho de la salud general del paciente y el beneficio de supervivencia global para las últimas terapias de combinación citotóxicas es solamente ~2-5 meses.
En el cáncer pancreático, los avances en las terapias basadas en inhibidores de puntos de control han mostrado resultados clínicos decepcionantes. En un estudio en Fase II, la monoterapia con anti-CTLA-4, ipilimumab, era ineficaz sin pacientes que respondan resultantes del estudio.27 De forma similar, en un estudio en Fase I multicéntrico, se administró intravenosamente un anticuerpo anti-PDL-1 en una variedad de pacientes con cáncer avanzado. De los 14 pacientes con cáncer pancreático incorporados, no existen respuestas objetivas presentadas.28
A la luz del enorme sufrimiento provocado por esta enfermedad y el progreso moderado conseguido hasta ahora con tratamientos citotóxicos, está claro que se necesita explorar enfoques transformadores radicales para una terapia que ataque la enfermedad desde múltiples ángulos.
La última década ha visto un enorme progreso en el campo de la inmunoterapia del cáncer. De hecho, la inmunoterapia representa el nuevo enfoque de tratamiento del cáncer más prometedor desde el desarrollo de las primeras quimioterapias en los años 40. Los inhibidores de puntos de control han funcionado contra cánceres letales tales como melanoma y algunos cánceres de pulmón - a veces con un éxito considerable - y se están probando en muchos otros tipos de cáncer.89 Pero el cáncer pancreático ha resultado difícil de tratar con fármacos convencionales y ha sido resistente a los enfoques inmunoterapéuticos iniciales. Parcialmente, la razón de esto es el complejo microambiente tumoral que caracteriza al adenocarcinoma pancreático. Sobre todo, la presencia de estroma tumoral desmoplástico que es tanto de naturaleza inmunosupresora como una barrera física para la infiltración de anticuerpos y linfocitos T.10 Por consiguiente, es importante diseñar enfoques alternativos que combinen:
inhibidores de puntos de control innovadores que se puedan aportar eficazmente a células tumorales y macrófagos residentes en tumores y estrategias que potencien la penetración de linfocitos T en el tumor.
Se presenta en el presente documento una estrategia alternativa que se basa en la combinación de agentes quimioterapéuticos, p. ej., gemcitabina (Gem), 5-fluorouracilo, FOLFIRINOX, y un nuevo inhibidor de puntos de control inmunitario, el inhibidor de PD-L1 (denominado MN-siPDL1), que incorpora un vehículo en nanopartículas que se aporta con alta eficacia a las células tumoralesin vivo11-19, donde inhibe postranscripcionalmente la expresión de moléculas de puntos de control inmunitario, PD-L1, sobre células tumorales a través del mecanismo de interferencia de ARN. El enfoque es ventajoso sobre micromoléculas o anticuerpos debido a que el componente de ARNsi inhibe el antígeno diana a nivel postranscripcional y no a nivel proteico. Además, el mecanismo de ARNi es catalítico y necesita el aporte de cantidades solo picomolares de ARNsi a la célula tumoral para la supresión del antígeno diana. En contraste, las micromoléculas o los anticuerpos requieren conseguir una relación molar de al menos 1:1 de antígeno con respecto a molécula terapéutica y podrían ser ineficaces en presencia de un incremento compensatorio en la expresión del antígeno diana por la célula tumoral.
En el estudio actual, se administraron 7 semanas de terapia combinada que consiste en gemcitabina y MN-siPDL1 en un modelo singénico de cáncer pancreático murino. Este enfoque daba como resultado morbilidad y toxicidad significativamente inferiores, conduciendo a la regresión tumoral y a una mejora considerable en la supervivencia. En particular, después de la optimización de la dosis, se conseguía una reducción de 90% en el volumen tumoral 3 semanas después del comienzo del tratamiento. Mientras que 100% de los animales de control habían sucumbido a sus tumores para la semana 6 después del comienzo del tratamiento, no existía mortalidad en el grupo experimental para la semana 5, y 67% de los animales de experimentación sobrevivían durante 12 semanas.
La metodología descrita representa una herramienta integrada para el aporte de fármacos, una guía en imágenes del procedimiento de aporte y un biomarcador sincrónico de la respuesta terapéutica.
Composiciones
Se proporcionan en el presente documento nanopartículas terapéuticas que tienen un diámetro de entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 30 nm, entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 25 nm, entre aproximadamente 15 nm y aproximadamente 25 nm, entre aproximadamente 20 nm y aproximadamente 25 nm, y contienen un revestimiento polimérico que comprende dextrano, y un ácido nucleico que contiene al menos 10 (p. ej., al menos 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21) nucleótidos contiguos dentro de una secuencia que es complementaria a una molécula de punto de control inmunitario humana, PD-L1.
PD-L1
PD-L1 también se conoce como CD274, B7-H; B7H1; PDL1; PDCD1L1; y PDCD1LG1. Secuencias ejemplares para PD-L1 humano se proporcionan en los N° de Registro GenBank del NCBI mostrados en la Tabla A.
Tabla A- Secuencias ejemplares para PD-L1 humano
Según las notas de referencia del NCBI, la variante 1 es el transcrito más largo y codifica la isoforma más larga (precursor de la isoforma a). La variante 2 carece de un exón alternativo en el marco en la región codificante 5', en comparación con la variante 1, dando como resultado la isoforma de proteína b más corta. La variante 4 carece de varios exones y su exón 3' terminal se extiende más allá de un sitio de empalme que se usa en la variante 1, dando como resultado una nueva región codificante 3' y una nueva UTR 3' en comparación con la variante 1, y codifica la isoforma c (que es más corta y tiene un extremo C distinto en comparación con la isoforma a).
En los presentes métodos y composiciones, puede usarse ARNsi que se dirige a cualquiera o todas las anteriores (p. ej., que se dirige a una región que es común a las tres anteriores). La secuencia del ARNm de la variante 1 humana es como sigue:
i agttctgcgc agcttcccga ggctccgcac cagccgcgct tctgtccgcc tgcagggcat
61 tocagaaaga tgaggat.at.t r.gr.r.gr.or.r.r. af.att.oar.ga o.cr.act.ggca rr.r.gct.gaac
121 gcatttactg tcacggttcc caaggaccta tatgtggtag agtatggtag caatatgaca
181 attgaatgca aattcccagt agaaaaacaa ttagacctgg ctgcactaat tgtctattgg
241 gaaatggagg ataagaacat tattcaattt gtgcatggag aggaagacct gaaggttcag
301 catagtagct acagacagag ggcccggctg ttgaaggacc agctctccct gggaaatgct
361 gcacttcaga tcacagatgt gaaattgcag gatgcagggg tgtaccgctg catgatcagc
421 tatggtggtg ccgactacaa gcgaattact gtgaaagtca atgccccata caacaaaatc
481 aaccaaagaa ttttggttgt ggatccagtc acctctgaac atgaactgac atgtcaggct
541 gagggctacc ccaaggcega agtcatctgg acaagcagtg aceatcaagt cctgagtggt
601 aagar.canna ocaoc.aatt.ooaagagagag gagaagr.ttf.t.oaatgtgaocagoacactg
6C1 agaatcaaca caacaactaa tgagattttc tactgcactt ttaggagatt agatcctgag
721 gaaaaccat.a cagctgaat.t. ggtcatccca gaactacctc tggcacat.cc t.ccaaat.gaa
781 aggactcact tggtaattct gggagccatc ttattatgcc ttggtgtagc actgacattc
841 atcttccgtt taagaaaagg gagaatgatg gatgtgaaaa aatgtggcat ccaagataca
SOI aactcaaaga agcaaagtga tacacatttg gaggagacgt aatccagcat tggaacttct
961 gatcttcaag cagggattct caacctgtgg tttaggggtt catcggggct gagcgtgaca
1021 agaggaagga atgggcccgt gggatgcagg caatgtggga cttaaaaggc ccaagcactg
1081 aaaatggaac ctggcgaaag cagaggagga gaatgaagaa agatggagtc aaacagggag
1141 cctggaggga gaccttgata ctttcaaatg cctgaggggc tcatcgacgc ctgtgacagg
1201 gagaaaggat acttctgaac aaggagcctc caagcaaatc atccattgct catcctagga
1261 agacgggttg agaatcccta atttgagggt cagttcctgc agaagtgccc tttgcctcca
1321 ctcaatgcct caatttgttt tctgcatgac tgagagtctc agtgttggaa cgggacagta
1381 tttatgtatg agtttttcct atttattttg agtctgtgag gtcttcttgt catgtgagtg
1441 tggttgtgaa tgatttcttt tgaagatata ttgtagtaga tgttacaatt ttgtcgccaa
1501 actaaacttg ctgcttaatg atttgctcac atctagtaaa acatggagta tttgtaaggt
1561 gcttggtctc ctctataact acaagtatac attggaagca taaagatcaa accgttggtt
1621 gcataggatg tcacctttat ttaacccatt aatactctgg ttgacctaat cttattctca
1681 gacctcaagt gtctgtgcag tatctgttcc atttaaatat cagctttaca attatgtggt
1741 agcctacaca cataatctca tttcatcgct gtaaccaccc tgttgtgata accactatta
1801 ttttacccat cgtacagctg aggaagcaaa cagattaagt aacttgccca aaccagtaaa
1861 tagcagacct cagactgcca cccactgtcc ttttataata caatttacag ctatatttta
1921 ctttaagcaa ttcttttatt caaaaaccat ttattaagtg cccttgcaat atcaatcgct
1981 gtgccaggca ttgaatctac agatgtgagc aagacaaagt acctgtcctc aaggagctca
2041 tagtataatg aggagattaa caagaaaatg tattattaca atttagtcca gtgtcatagc
2101 ataaggatga tgcgagggga aaacccgagc agtgttgcca agaggaggaa ataggccaat
2161 gtggtctggg acggttggat atacttaaac atcttaataa tcagagtaat tttcatttac
2221 aaagagaggt cggtacttaa aataaccctg aaaaataaca ctggaattcc ttttctagca
2281 ttatatttat tcctgatttg cctttgccat ataatctaat gcttgtttat atagtgtctg
2341 gtattgttta acagttctgt cttttctatt taaatgccac taaattttaa attcatacct
2401 ttccatgatt caaaattcaa aagatcccat gggagatggt tggaaaatct ccacttcatc
2461 ctccaagcca ttcaagtttc ctttccagaa gcaactgcta ctgcctttca ttcatatgtt
2521 cttctaaaga tagtctacat ttggaaatgt atgttaaaag cacgtatttt taaaattttt
2581 ttcctaaata gtaacacatt gtatgtctgc tgtgtacttt gctattttta tttattttag
2641 tgtttcttat atagcagatg gaatgaattt gaagttccca gggctgagga tccatgcctt
2701 ctttgtttct aagttatctt tcccatagct tttcattatc tttcatatga tccagtatat
2761 gttaaatatg tcctacatat acatttagac aaccaccatt tgttaagtat ttgctctagg
2821 acagagtttg gatttgttta tgtttgctca aaaggagacc catgggctct ccagggtgca
2881 ctgagtcaat ctagtcctaa aaagcaatct tattattaac tctgtatgac agaatcatgt
2941 ctggaacttt tgttttctgc tttctgtcaa gtataaactt cactttgatg ctgtacttgc
3001 aaaatcacat tttctttctg gaaattccgg cagtgtacct tgactgctag ctaccctgtg
3061 ccagaaaagc ctcattcgtt gtgcttgaac ccttgaatgc caccagctgt catcactaca
3121 cagccctcct aagaggcttc ctggaggttt cgagattcag atgccctggg agatcccaga
3181 gtttcctttc cctcttggcc atattctggt gtcaatgaca aggagtacct tggctttgcc
3241 acatgtcaag gctgaagaaa cagtgtctcc aacagagctc cttgtgttat ctgtttgtac
3301 atgtgcattt gtacagtaat tggtgtgaca gtgttctttg tgtgaattac aggcaagaat
3361 tgtggctgag caaggcacat agtctactca gtctattcct aagtcctaac tcctccttgt
3421 ggtgttggat ttgtaaggca ctttatccct tttgtctcat gtttcatcgt aaatggcata
3481 ggcagagatg atacctaatt ctgcatttga ttgtcacttt ttgtacctgc attaatttaa
3541 taaaatattc ttatttattt tgttacttgg tacaccagca tgtccatttt cttgtttatt
3601 ttgtgtttaa taaaatgttc agtttaacat ccca (SEQ ID
NO:1)
Tabla B - Secuencias ejemplares para otras moléculas de puntos de control inmunitario (no forman parte de la invención)
Aunque los presentes métodos ejemplifican sujetos humanos, otros sujetos mamíferos, p. ej., sujetos veterinarios tales como gatos, perros, caballos, cerdos y ovejas, también pueden tratarse usando los presentes métodos. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico se dirige a una secuencia procedente de la misma especie que el sujeto que se va a tratar.
En algunas realizaciones, las nanopartículas terapéuticas proporcionadas en el presente documento pueden ser esféricas o elipsoidales, o pueden tener una conformación amorfa. En algunas realizaciones, las nanopartículas terapéuticas proporcionadas en el presente documento pueden tener un diámetro (entre dos puntos cualesquiera sobre la superficie exterior de la nanopartícula terapéutica) de entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 30 nm, entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 25 nm, entre aproximadamente 15 nm y aproximadamente 25 nm o entre aproximadamente 20 nm y aproximadamente 25 nm. Las nanopartículas terapéuticas que tienen un diámetro de entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 30 nm se localizan en los ganglios linfáticos en un sujeto.
En algunas realizaciones, las composiciones pueden contener una mezcla de dos o más de las diferentes nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, las composiciones contienen al menos una nanopartícula terapéutica que contiene al menos 10 nucleótidos contiguos dentro de la secuencia diana ligados covalentemente a la nanopartícula (una nanopartícula para disminuir los niveles de miR-10b en una célula diana), y al menos una nanopartícula terapéutica que contiene una secuencia que es complementaria a una secuencia de al menos otros 10 nucleótidos contiguos presentes dentro de una secuencia.
Las nanopartículas terapéuticas son magnéticas (p. ej., contienen un núcleo de material magnético).
Nanopartículas
En algunas realizaciones, cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento puede contener un núcleo de un material magnético (p. ej., una nanopartícula magnética terapéutica). En algunas realizaciones, el material o la partícula magnéticos pueden contener un material diamagnético, paramagnético, superparamagnético o ferromagnético que es sensible a un campo magnético. Ejemplos no limitativos de nanopartículas magnéticas terapéuticas contienen un núcleo de material magnético que contiene un óxido metálico seleccionado del grupo de: magnetita; ferritas (p. ej., ferritas de manganeso, cobalto y níquel); óxidos de Fe(II), y hematita, y aleaciones metálicas de los mismos. El núcleo de material magnético puede formarse convirtiendo sales metálicas en óxidos metálicos usando métodos conocidos en la técnica (p. ej., Kieslich y cols., Inorg. Chem. 2011). En algunas realizaciones, las nanopartículas contienen oro revestido con ciclodextrina o puntos cuánticos. Ejemplos no limitativos de métodos que se pueden usar para generar nanopartículas magnéticas terapéuticas se describen en Medarova y cols., Methods Mol. Biol.555:1-13, 2009; y Medarova y cols., Nature Protocols 1:429-431,2006. Materiales magnéticos y métodos adicionales para elaborar materiales magnéticos son conocidos en la técnica. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, se pueden obtener imágenes en un sujeto de la posición o localización de las nanopartículas magnéticas terapéuticas (p. ej., obtener imágenes en un sujeto después de la administración de una o más dosis de una nanopartícula magnética terapéutica).
En algunas realizaciones, que no forman parte de la invención, las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento no contienen material magnético. En algunas realizaciones, una nanopartícula terapéutica puede contener, en parte, un núcleo que contiene un polímero (p. ej., poli(ácido láctico-co-glicólico)). Los expertos apreciarán que se puede usar cualquier número materiales conocidos en la técnica para preparar nanopartículas, incluyendo, pero no limitados a, gomas (p. ej., arábiga, guar), quitosano, gelatina, alginato sódico y albúmina. Polímeros adicionales que se pueden usar para generar las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento son conocidos en la técnica. Por ejemplo, polímeros que se pueden usar para generar las nanopartículas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a, materiales celulósicos, poli(2-metacrilato de hidroxietilo), poli(N-vinilpirrolidona), poli(metacrilato de metilo), poli(alcohol vinílico), poli(ácido acrílico), poliacrilamida, poli(etileno-co-acetato de vinilo), poli(etilenglicol), poli(ácido metacrílico), polilactidas (PLA), poliglicolidas (PGA), poli(lactida-co-glicolidas) (PLGA), polianhídridos, poliortoésteres, policianoacrilato y policaprolactona.
Los expertos apreciarán que el material usado en la composición de las nanopartículas, los métodos de preparación, el revestimiento y los métodos para controlar el tamaño de las nanopartículas pueden variar sustancialmente. Sin embargo, estos métodos son muy conocidos por los expertos en la técnica. Elementos clave incluyen la biodegradabilidad, el perfil de toxicidad y la farmacocinética/farmacodinámica de las nanopartículas. La composición y/o el tamaño de las nanopartículas son determinantes clave de su destino biológico. Por ejemplo, las nanopartículas más grandes típicamente son absorbidas y degradadas por el hígado, mientras que las nanopartículas más pequeñas (<30 nm de diámetro) típicamente circulan durante mucho tiempo (a veces una semivida en sangre por encima de 24 h en seres humanos) y se acumulan en los ganglios linfáticos y el intersticio de órganos con vasculatura hiperpermeable, tales como tumores.
Revestimientos poliméricos
Las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento contienen un revestimiento polimérico sobre el material magnético nuclear (p. ej., sobre la superficie de un material magnético). El material polimérico puede ser adecuado para enlazarse o acoplarse a uno o más agentes biológicos (p. ej., tales como cualquiera de los ácidos nucleicos, fluoróforos o péptidos dirigidos descritos en el presente documento). Uno o más agentes biológicos (p. ej., un ácido nucleico, fluoróforo o péptido dirigido) pueden fijarse al revestimiento polimérico mediante acoplamiento químico (enlaces covalentes).
En algunas realizaciones, las nanopartículas terapéuticas se forman mediante un método que incluye revestir el núcleo de material magnético con un polímero que es relativamente estable en agua. En algunas realizaciones, las nanopartículas terapéuticas se forman mediante un método que incluye revestir un material magnético con un polímero o absorber el material magnético en una resina polimérica termoplástica que tiene grupos reductores sobre la misma. También se puede aplicar un revestimiento a un material magnético usando los métodos descritos en las Pat. EE. UU. N25.834.121, 5.395.688, 5.356.713, 5.318.797, 5.283.079, 5.232.789, 5.091.206, 4.965.007, 4.774.265, 4.770.183, 4.654.267, 4.554.088, 4.490.436, 4.336.173 y 4.421.660; y el documento WO 10/111066.
Métodos para la síntesis de nanopartículas de óxido de hierro incluyen, por ejemplo, métodos físicos y químicos. Por ejemplo, los óxidos de hierro pueden prepararse mediante coprecipitación de sales de Fe2+ y Fe3+ en solución acuosa. El núcleo resultante consiste en magnetita (Fe3O4), maghemita (Y-Fe2O3) o una mezcla de las dos. El contenido de sales aniónicas (cloruros, nitratos, sulfatos etc.), la relación de Fe2+ y Fe3+, el pH y la fuerza iónica en la solución acuosa representan todos un papel en el control del tamaño. Es importante evitar la oxidación de las nanopartículas sintetizadas y proteger sus propiedades magnéticas llevando a cabo la reacción en un ambiente libre de oxígeno bajo un gas inerte tal como nitrógeno o argón. Los materiales de revestimiento se pueden añadir durante el procedimiento de coprecipitación a fin de evitar la aglomeración de las nanopartículas de óxido de hierro en micropartículas. Los expertos apreciarán que puede usarse cualquier número de materiales de revestimiento superficial conocidos para estabilizar nanopartículas de óxido de hierro, entre los cuales están polímeros sintéticos y naturales, tales como, por ejemplo, dextrano.
Por ejemplo, la Pat. EE. UU. N° 4.421.660 apunta que las partículas revestidas con polímero de un material inorgánico se preparan convencionalmente (1) tratando el sólido inorgánico con ácido, una combinación de ácido y base, alcohol o una solución de polímero; (2) dispersando un monómero polimerizable por adición en una dispersión acuosa de un sólido inorgánico tratado y (3) sometiendo la dispersión resultante a condiciones de polimerización en emulsión. (col.
1, líneas 21 -27) La Pat. EE. UU. N° 4.421.660 también divulga un método para revestir nanopartículas inorgánicas con un polímero, que comprende las etapas de (1) emulsionar un monómero hidrófobo polimerizable en emulsión en una dispersión acuosa coloidal de partículas discretas de un sólido inorgánico y (2) someter la emulsión resultante a condiciones de polimerización en emulsión para formar una dispersión acuosa coloidal fluida estable de las partículas sólidas inorgánicas dispersadas en una matriz de un polímero insoluble en agua del monómero hidrófobo (col. 1, líneas 42-50).
Alternativamente, se puede obtener comercialmente material magnético revestido con polímero que cumpla los requisitos de tamaño iniciales. Por ejemplo, nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas ultrapequeñas disponibles comercialmente incluyen NC100150 Injection (Nycomed Amersham, Amersham Health) y Ferumoxytol (AMAG Pharmaceuticals, Inc.).
Según la invención, el revestimiento polimérico comprende dextrano. En algunas realizaciones, el revestimiento polimérico es dextrano.
Ácidos nucleicos
Las nanopartículas terapéuticas proporcionadas contienen al menos un ácido nucleico que comprende una secuencia que es complementaria a al menos 10 (p. ej., al menos 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22) nucleótidos contiguos dentro de una secuencia de una molécula de punto de control inmunitario, una secuencia de PD-L1, p. ej., SEQ ID NO: 1, que está ligada covalentemente a la nanopartícula. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico ligada covalentemente contiene una secuencia que es complementaria a la totalidad o parte de un ARNm que codifica una proteína de un punto de control inmunitario (p. ej., cualquiera de las proteínas de punto de control inmunitario descritas en el presente documento). Por ejemplo, el ácido nucleico ligado covalentemente puede ser complementario a la totalidad o parte de una región no codificante de la cadena codificante de una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de punto de control inmunitario (p. ej., cualquiera de las proteínas de punto de control inmunitario descritas en el presente documento). Las regiones no codificantes ("regiones no traducidas 5' y 3'") son las secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante en un gen y no son traducidas en aminoácidos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico ligado covalentemente a la nanopartícula terapéutica es complementario al codón de inicio de la traducción o una secuencia que codifica los aminoácidos 1 a 5 de una proteína de punto de control inmunitario (p. ej. cualquiera de las proteínas de punto de control inmunitario descritas en el presente documento).
El ácido nucleico enlazado puede ser monocatenario o bicatenario. En algunas realizaciones, el ácido nucleico tiene una longitud total de entre 23 nucleótidos y 50 nucleótidos (p. ej., entre 23-30 nucleótidos, entre 30-40 nucleótidos y entre 40-50 nucleótidos). En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede ser un ARN antisentido o ARNsi.
Moléculas de ácido nucleico antisentido pueden ligarse covalentemente a las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento.
Basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento (p. ej., las secuencias para moléculas de punto de control inmunitario humanas, PD-L1, p. ej., SEQ ID NO:1 y las otras secuencias de las Tablas A y B), un experto en la técnica puede elegir y sintetizar fácilmente cualquiera de un número de moléculas antisentido apropiadas (p. ej., moléculas antisentido para dirigirse a una molécula de punto de control inmunitario, PD-L1). Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido que se dirige a PD-L1 puede contener una secuencia complementaria a al menos 10 (p. ej., al menos 15 o 20) nucleótidos contiguos presentes en SEQ ID NO: 1 o una secuencia para PD-L1 conocida en la técnica.
Un ácido nucleico antisentido puede construirse usando síntesis química y reacciones de ligación enzimáticas usando procedimientos conocidos en la técnica .Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (p. ej., un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos presentes en la naturaleza o nucleótidos modificados (p. ej., cualquiera de los oligonucleótidos modificados descritos en el presente documento) diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y de sentido, p. ej., pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARNA transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés). En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico antisentido descritas en el presente documento se pueden hibridar a un ácido nucleico diana mediante complementariedades nucleotídicas convencionales y formar un dúplex estable.
Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser una molécula de ácido nucleico anomérica a. Una molécula de ácido nucleico anomérica a forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en los que, contrariamente a las unidades p habituales, las cadenas corren en paralelo entre sí (Gaultier y cols., Nucleic Acids Res. 15:6625-6641, 1987). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-O-metilribonucleótido (Inoue y cols., Nucleic Acids Res., 15:6131-6148, 1987) o un análogo quimérico de ARN-ADN (Inoue y cols., FEES Lett. 215:327-330, 1987).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un ARN interferente pequeño (ARNsi). ARNi es un proceso en el ARN se degrada en células anfitrionas. Para disminuir la expresión de un ARN, ARN bicatenario (ARNds) que contiene una secuencia correspondiente a una porción del ARN diana (p. ej., una molécula de punto de control inmunitario, p. ej., PD-L1 humano) se introduce en una célula. El ARNds se digiere en dúplex de 21-23 nucleótidos denominados ARN interferentes cortos (o ARNsi), que se unen a un complejo de nucleasa para formar lo que se conoce como el complejo de silenciamiento inducido por ARN (o RISC). El RISC se dirige al ARN diana endógeno mediante interacciones de apareamiento de bases entre una de las cadenas de ARNsi y el ARN endógeno. A continuación, escinde el ARN endógeno a aproximadamente 12 nucleótidos desde el extremo 3' del ARNsi (véanse Sharp y cols., Genes Dev.
15:485-490, 2001, y Hammond y cols., Nature Rev. Gen. 2:110-119, 2001).
Se pueden usar técnicas estándar de biología molecular para generar ARNsi. Los ARN interferentes cortos se pueden sintetizar químicamente, producir recombinantemente, p. ej., expresando ARN a partir de un ADN de plantilla, como un plásmido, u obtener de proveedores comerciales tales como Dharmacon. El ARN usado para mediar en ARNi puede incluir nucleótidos modificados (p. ej., cualquiera de los nucleótidos modificados descritos en el presente documento), tales como nucleótidos de fosforotioato. Las moléculas de ARNsi usadas para disminuir los niveles de miR-10b humano maduro pueden variar de varias maneras. Por ejemplo, pueden incluir un grupo hidroxilo 3' y cadenas de 21,22 o 23 nucleótidos consecutivos. Pueden tener extremos romos o incluir un extremo saliente en el extremo 3', el extremo 5' o ambos extremos. Por ejemplo, al menos una cadena de la molécula de ARN puede tener un saliente 3' de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 nucleótidos (p. ej., 1-5, 1-3, 2-4 o 3-5 nucleótidos (ya sean nucleótidos de pirimidina o purina) de longitud). Cuando ambas cadenas incluyen un saliente, la longitud de los salientes puede ser la misma o diferente para cada cadena. Para mejorar adicionalmente la estabilidad de los dúplex de ARN, los salientes 3' se pueden estabilizar contra la degradación (por ejemplo, incluyendo nucleótidos de purina, tales como nucleótidos de adenosina o guanosina, o reemplazando nucleótidos de pirimidina por nucleótidos modificados (p. ej., la sustitución de salientes 3' de dos nucleótidos de uridina por 2'-desoxitimidina es tolerada y no afecta a la eficacia del RNAi). Se puede usar cualquier ARNsi siempre que tenga suficiente homología con la diana de interés. No hay un límite superior en la longitud del ARNsi que se puede usar (por ejemplo, el ARNsi puede variar de aproximadamente 21-50, 50-100, 100-250, 250-500 o 500-1000 pares de bases).
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico puede contener al menos un nucleótido modificado (un nucleótido que contiene una base o azúcar modificados). En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico puede contener al menos una modificación en la cadena principal de fosfato (fosfodiéster). La introducción de estas modificaciones puede incrementar la estabilidad, o mejorar la hibridación o la solubilidad de la molécula de ácido nucleico.
Las moléculas descritas en el presente documento pueden contener uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) nucleótidos modificados. Los nucleótidos modificados pueden contener una base modificada o un azúcar modificados. Ejemplos no limitativos de bases modificadas incluyen: 8-oxo-N6-metiladenina, 7-desazaxantina, 7-desazaguanina, N4,N4-etanocitosina, N6,N6-etano-2,6-diaminopurina, 5-alquil(C3-C6)-citosina, pseudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, B-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, B-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina.
Ejemplos no limitativos adicionales de bases modificadas incluyen las nucleobases descritas en las Pat. EE. UU. N° 5.432.272 y 3.687.808, Freier y cols., Nucleic Acid Res. 25:4429-4443, 1997; Sanghvi, Antisense Research and Application, Capítulo 15, Ed. S. T. Crooke y B. Lebleu, CRC Press, 1993; Englisch, y cols., Angewandte Chemie 30:613-722, 1991, Kroschwitz, Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, John Wiley & Sons, pp.
858-859, 1990; y Cook, Anti-Cancer Drug Design 6:585-607, 1991. Ejemplos no limitativos adicionales de bases modificadas incluyen bases universales (p. ej., 3-nitropirrol y 5-nitroindol). Otras bases modificadas incluyen derivados de pireno y piridiloxazol, pirenilo, derivados de pirenilmetilglicerol, y similares. Otras bases universales preferidas incluyen pirrol, diazol o derivados de triazol, incluyendo las bases universales conocidas en la técnica.
En algunas realizaciones, el nucleótido modificado puede contener una modificación en su resto glucídico. Ejemplos no limitativos de nucleótidos modificados que contienen un azúcar modificado son nucleótidos bloqueados (LNA). Monómeros de LNA se describen en el documento WO 99/14226 y las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. UU. N220110076675, 20100286044, 20100279895, 20100267018, 20100261175, 20100035968, 20090286753, 20090023594, 20080096191, 20030092905, 20020128381 y 20020115080. Ejemplos no limitativos adicionales de LNA se divulgan en la Patente de EE. UU. N° 6.043.060, la Patente de EE. u U. N° 6.268.490, los documentos WO 01/07455, WO 01/00641, WO 98/39352, WO 00/56746, WO 00/56748 y WO 00/66604, así como en Morita y cols., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12(1 ):73-76, 2002; Hakansson y cols., Bioorg. Med. Chem. Lett. 11(7):935-938, 2001; Koshkin y cols., J. Org. Chem. 66(25):8504-8512, 2001; Kvaerno y cols., J. Org. Chem. 66(16):5498-5503, 2001; Hakansson y cols., J. Org. Chem. 65(17):5161 -5166, 2000; Kvaerno y cols., J. Org. Chem. 65(17):5167-5176, 2000; Pfundheller y cols., Nucleosides Nucleotides 18(9):2017-2030, 1999; y Kumar y cols., Bioorg. Med. Chem. Lett.
8(16):2219-2222, 1998. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado es un monómero de oxi-LNA, tal como los descritos en el documento WO 03/020739.
Los nucleótidos modificados también pueden incluir antagómiros (análogos de ARN monocatenario conjugados a colesterol modificados con 2'-O-metilo); ALN ( -L-LNA); ADA (2'-N-adamantilmetilcarbonil-2'-amino-LNA); Py R (2'-N-pirenil-1-metil-2'-amino-LNA); OX (oxetan-LNA); ENA (2'-O, ácido nucleico con puente de etileno 4"-C); AEn A (2'-desoxi-2'-N, 4'-C-etilen-LNA); CLNA (2',4'-carbocíclico-LNA); y CENA (2',4'-carbocíclico-ENA); ADN modificados con HM (4'-C-hidroximetil-ADN); ARN sustituidos en 2' (con 2'-O-metilo, 2'-fluoro, 2'-aminoetoximetilo, 2'-aminopropoximetilo, 2'-aminoetilo, 2'-guanidinoetilo, 2'-cianoetilo, 2'-aminopropilo); y RNA con modificaciones radicales del anillo glucídico de ribosa, tales como un ácido nucleico desbloqueado (u NA), ácido nucleico con altriol (ANA) y ácido nucleico con hexitol (HNA) (véase Bramsen y cols., Nucleic Acids Res. 37:2867-81,2009).
Las moléculas descritas en el presente documento también pueden contener una modificación en la cadena principal de fosfodiéster. Por ejemplo, al menos un enlace entre dos cualesquiera nucleótidos contiguos (adyacentes) en la molécula puede esta conectado por un resto que contiene de 2 a 4 grupos/átomos seleccionados del grupo de: -CH<2>-, -O-, -S-, -NRH-, >C=O, >C=NRH, >C=S, -Si(R")2-, -SO-, -S(O)2-, -P(O)2-, - PO(BHa)-, -P(O,S)-, -P(S)2-, -PO(R")-, -PO(OCH3)- y - PO(NHRH)-, donde RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C<1-4>, y R" se selecciona de alquilo C<1-6>y fenilo. Ejemplos ilustrativos de estos enlaces son -CH<2>-CH<2>-CH<2>-, -CH<2>-CO-CH<2>-, -CH<2>-CHOH-CH<2>-, -O-CH<2>-O-, -O-CH<2>-CH<2>-, -O-CH<2>-CH= (incluyendo R5 cuando se usa como enlace a un monómero subsiguiente), -CH<2>-CH<2>-O-, -NRh-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NRh-, -CH2-NRh-CH2-, -O-CH2-CH2-NRh-, -NRh-CO-O-, - NRH-CO-NRH-, -NRH-CS-NRH-, -NRH-C(=NRH)-NRH-, -NRH-CO-CH2-NRH-, -O-CO-O-, -O-CO-CH2-O-, -O-CH2-COO-, -CH2-CO-NRH-, -O-CO-NRH-, -NR<h>-CO-CH<2>-, -O-CH<2>-CO-NR<h>-, -O-CH<2>-CH<2>-NR<h>-, -CH=N-O-, -CH<2>-NR<h>-O-, -CH<2>-O-N= (incluyendo R5 cuando se usa como enlace a un monómero subsiguiente), -CH<2>-O-NRH-, -Co -NRh-CH<2>-, -CH<2>-NRh-O-, - CH<2>-NRH-CO-, -O-NRH-CH<2>-, -O-NRH-, -O-CH<2>-S-, -S-CH<2>-O-, -CH<2>-CH<2>-S-, -O-CH<2>-CH<2>-S-, -S-CH<2>-CH= (incluyendo R5 cuando se usa como enlace a un monómero subsiguiente), -S-CH<2>-CH<2>-, -S-CH<2>-CH<2>-O-, -S-CH<2>-CH<2>-S-, -CH<2>-S-CH<2>-, -CH<2>-SO-CH<2>-, -CH2-SO2-CH2-, -O-SO-O-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-CH2-, -O-S(O)2-NRH-, -NRH-S(O)2-CH2-, -O-S(O)2-CH2-, -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)2-S-, -S-P(O)2-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)2-S-, -O-PO(R")-O-, - O-PO(OCH3)-O-, -O-PO-(OCH2CH3)-O-, -O-PO(OCH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRN)-O-, -O-P(O)<2>-NRH-, -NRH-P(O)<2>-O-, -O-P(O,NRH)2-O-, -CH2-P(O)2-0-, -O-P(O)<2>-CH<2>-, and -O-Si(R")<2>-O-; entre los cuales -CH<2>-CO-NRH-, -CH<2>-NRH-O-, -S-CH<2>-O-, -O-P(O)<2>-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)<2>-O-, - NRH-P(O)<2>-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(CHa)-O- y -O-PO(NHRN)-O-, donde RH se selecciona de hidrógeno y alquilo C<1-4>, y R" se selecciona de alquilo C<1-6>y fenilo. Ejemplos ilustrativos adicionales se dan en Mesmaeker y cols., Curr. Opin. Struct. Biol. 5:343-355, 1995; y Freier y cols., Nucleic Acids nucleicos Research 25:4429-43, 1997. El lado izquierdo del enlace internucleosídico está unido al anillo de 5 miembros como sustituyente P* en la posición 3', mientras que el lado derecho está unido a la posición 5' de un monómero precedente.
En algunas realizaciones, la cadena principal de fosfato de desoxirribosa del ácido nucleico se puede modificar para generar ácidos nucleicos peptídicos (véase Hyrup y cols., Bioorganic & Medicinal Chem. 4(1): 5-23, 1996). Los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) son miméticos de ácido nucleico, p. ej., miméticos de ADN, en los que la cadena principal de fosfato de desoxirribosa se reemplaza por una cadena principal pseudopeptídica y solo se retienen las cuatro nucleobases naturales. La cadena principal neutra de los PNA permite la hibridación específica a ADN y ARN bajo condiciones de baja fuerza iónica. La síntesis de oligómeros de PNA se puede realizar usando protocolos estándar de síntesis de péptidos en fase sólida, p. ej., según se describe en Hyrup y cols., 1996, anteriormente; Perry-O'Keefe y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:14670-675, 1996.
Los PNA pueden modificarse, p. ej., para potenciar su estabilidad o captación celular, mediante el enlace de grupos lipófilos u otros grupos auxiliares al PNA, mediante la formación de quimeras PNA-ADN, o mediante el uso de liposomas u otras técnicas de aporte conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden generarse quimeras de PNA-ADN que pueden combinar las propiedades ventajosas del PNA y el ADN. Estas quimeras permiten que las enzimas de reconocimiento de ADN, por ejemplo, la ARNasa H, interactúen con la porción de ADN, mientras que la porción de PNA proporcionaría alta afinidad y especificidad de unión. Las quimeras de PNA-ADN pueden ligarse usando conectores de longitudes apropiadas seleccionadas en cuanto al apilamiento de bases, el número de enlaces entre las nucleobases y la orientación (Hyrup, 1996, anteriormente). La síntesis de quimeras de PNA-ADN puede realizarse como se describe en Hyrup, 1996, anteriormente, y Finn y cols., Nucleic Acids Res. 24:3357-63, 1996. Por ejemplo, una cadena de ADN puede sintetizarse sobre un soporte sólido usando la química estándar de acoplamiento de fosforamidita y análogos nucleosídicos modificados. Compuestos tales como fosforamidita de 5'-(4-metoxitritil)amino-5'-desoxitimidina pueden usarse como enlace entre el PNA y el extremo 5' del ADN (Mag y cols., Nucleic Acids Res., 17:5973-88, 1989). Los monómeros de PNA se acoplan a continuación de forma gradual para producir una molécula quimérica con un segmento de PNA 5' y un segmento de ADN 3' (Finn y cols., Nucleic Acids Res. 24:3357-63, 1996). Alternativamente, pueden sintetizarse moléculas quiméricas con un segmento de ADN 5' y un segmento de PNA 3' (Peterser y cois., Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124, 1975).
En algunas realizaciones, cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento se puede modificar en el extremo bien 3' o bien 5' (dependiendo de cómo el ácido nucleico esté ligado covalentemente a la nanopartícula terapéutica) mediante cualquier tipo de modificación conocida en la técnica. Por ejemplo, cualquier extremo puede finalizar con un grupo protector, enlazarse a un grupo de conexión flexible, o enlazarse a un grupo reactivo para ayudar en el enlace a la superficie del sustrato (el revestimiento polimérico). Ejemplos no limitativos de grupos de bloqueo 3' o 5' incluyen: 2-amino-2-oxietilo, 2-aminobenzoílo, 4-aminobenzoílo, acetilo, acetiloxi, (acetilamino)metilo, 3-(9-acridinilo), triciclo[3.3.1.1 (3,7)]dec-1 -iloxi, 2-aminoetilo, propenilo, (9-antracenilmetoxi)carbonilo, (1,1-dimimetilpropoxi)carbonilo, (1,1-dimetilpropoxi)carbonilo, [1 -metil-1 -[4-(fenilazo)fenil]etoxi]carbonilo, bromoacetilo, (benzoilamino)metilo, (2-bromoetoxi)carbonilo, (difenilmetoxi)carbonilo, 1-metil-3-oxo-3-fenil-1-propenilo, (3-bromo-2-nitrofenil)tio, (1,1-dimetiletoxi)carbonilo, [[(1,1-dimetiletoxi)carbonil]amino]etilo, 2-(fenilmetoxi)fenoxi, (1 =[1,1'-bifenil]-4-il-1-metiletoxi)carbonilo, bromo, (4-bromofenil)sulfonilo, 1H-benzotriazol-1-ilo, [(fenilmetil)tio]carbonilo, [(fenilmetil)tio]metilo, 2-metilpropilo, 1, 1 -dimetiletilo, benzoílo, difenilmetilo, fenilmetilo, carboxiacetilo, aminocarbonilo, clorodifluoroacetilo, trifluorometilo, ciclohexilcarbonilo, cicloheptilo, ciclohexilo, ciclohexilacetilo, cloro, carboximetilo, ciclopentilcarbonilo, ciclopentilo, ciclopropilmetilo, etoxicarbonilo, etilo, fluoro, formilo, 1-oxohexilo, yodo, metilo, 2-metoxi-2-oxoetilo, nitro, azido, fenilo, 2-carboxibenzoílo, 4-piridinilmetilo, 2-piperidinilo, propilo, 1 -metiletilo, sulfo y etenilo. Ejemplos adicionales de grupos de bloqueo 5' y 3' son conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los grupos de bloqueo 5' o 3' evitan la degradación de la molécula por nucleasas.
Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden sintetizarse usando cualquier método conocido en la técnica para sintetizar ácidos nucleicos (véanse, por ejemplo, Usman y cols., J. Am. Chem. Soc. 109:7845, 1987; Scaringe y cols., Nucleic Acid Res. 18:5433, 1990; Wincott y cols., Methods Mol. Biol. 74:59, 1997; y Milligan, Nucleic Acid Res. 21:8783, 1987). Estos usan típicamente grupos protectores y de acoplamiento comunes para ácidos nucleicos. La síntesis puede realizarse en equipos comerciales diseñados para este fin, por ejemplo, un sintetizador 394 de Applied Biosystems, Inc., usando los protocolos proporcionados por el fabricante. Métodos adicionales para sintetizar las moléculas descritas en el presente documento son conocidos en la técnica. Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden solicitarse especialmente a proveedores comerciales que sintetizan oligonucleótidos.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico está enlazado a la nanopartícula terapéutica en su extremo 5'. En algunas realizaciones, el ácido nucleico está enlazado a la nanopartícula terapéutica en su extremo 3'. En algunas realizaciones, el ácido nucleico está enlazado a la nanopartícula terapéutica a través de una base presente en el ácido nucleico.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico (p. ej., cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento) está enlazado a la nanopartícula terapéutica (p. ej., al revestimiento polimérico de la nanopartícula terapéutica) a través de un resto químico que contiene un enlace tioéter o un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, el ácido nucleico está enlazado a la nanopartícula terapéutica a través de un resto químico que contiene un enlace amida. Restos químicos adicionales que se pueden usar para enlazar covalentemente un ácido nucleico a una nanopartícula terapéutica son conocidos en la técnica.
Puede usarse una variedad de métodos diferentes para enlazar covalentemente un ácido nucleico a una nanopartícula terapéutica. Ejemplos no limitativos de métodos que se pueden usar para enlazar un ácido nucleico a una partícula magnética se describen en el documento EP 0937097; US RE41005; Lund y cols., Nucleic Acid Res. 16:10861, 1998; Todt y cols., Methods Mol. Biol. 529:81 -100, 2009; Brody y cols., J. Biotechnol. 74:5-13, 2000; Ghosh y cols., Nucleic Acids Res. 15:5353-5372, 1987; la Patente de EE. UU. N25.900.481; la Patente de EE. UU. N27.569.341; la Patente de EE. UU. N° 6.995.248; la Patente de EE. UU. N° 6.818.394; la Patente de EE. UU. N° 6.811.980; la Patente de EE. UU. N° 5.900.481; y la Patente de EE. UU. N° 4.818.681. En algunas realizaciones, se usa carboiimida para el enlace en el extremo de un ácido nucleico a una nanopartícula terapéutica. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se enlaza a la nanopartícula terapéutica a través de la reacción de una de sus bases con un resto activado presente sobre la superficie de la nanopartícula terapéutica (p. ej., la reacción de una base electrófila con un resto nucleófilo sobre la superficie de la nanopartícula terapéutica, o la reacción de una base nucleófila con un residuo electrófilo sobre la superficie de la nanopartícula terapéutica). En algunas realizaciones, un ácido nucleico modificado con NH<2>en 5’ está enlazado a una nanopartícula terapéutica que contiene grupos hidroxilo activados por CNBr (véase, p. ej., Lund y cols., anteriormente). Métodos adicionales para enlazar un ácido nucleico modificado con amino a una nanopartícula terapéutica se describen posteriormente. En algunas realizaciones, un ácido nucleico fosfatado en 5' se enlaza a una nanopartícula terapéutica que contiene grupos hidroxilo en presencia de una carbodiimida (véase, p. ej., Lund y cols., anteriormente). Otros métodos para enlazar un ácido nucleico a una nanopartícula terapéutica incluyen el enlace mediado por carboiimida de un ácido nucleico fosfatado en 5' a un grupo NH<2>sobre una nanopartícula terapéutica, y el enlace mediado por carboiimida de un ácido nucleico 5'-NH2 a una nanopartícula terapéutica que tiene grupos carboxilo (véase, p. ej., Lund y cols., anteriormente).
En métodos ejemplares, se puede producir un ácido nucleico que contiene un grupo amina reactiva o tiol reactivo. La amina o el tiol en el ácido nucleico puede estar ligado a otro grupo reactivo. Dos estrategias comunes para realizar esta reacción son ligar el ácido nucleico a un resto reactivo similar (amina a amina o tiol a tiol), lo que se denomina enlace homobifuncional, o ligar el ácido nucleico a un grupo opuesto (amina a tiol o tiol a amina), conocido como enlace heterobifuncional. Ambas técnicas se pueden usar para enlazar un ácido nucleico a una nanopartícula terapéutica (véanse, por ejemplo, Misra y cois., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18:5217-5221, 2008; Mirsa y cois., Anal. Biochem. 369:248-255, 2007; Mirsa y cois., Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:3749-3753, 2007; y Choithani y cois., Methods Mol Biol. 381:133-163, 2007).
Las técnicas de enlace tradicionales, especialmente para grupos amina, se han basado en enlaces homobifuncionales. Una de las técnicas más comunes ha sido el uso de bisaldehídos tales como glutaraldehído. El suberato de disuccinimidilo (DSS), comercializado por Syngene (Frederick, MD) como tecnología de sonda de ácido nucleico sintética (SNAP), o el reactivo diisocianato de p-fenileno también se pueden usar para generar un enlace covalente entre el ácido nucleico y la nanopartícula terapéutica. La N,N'-o-fenilendimaleimida se puede usar para reticular grupos tiol. Con todos los agentes de reticulación homobifuncionales, el ácido nucleico se activa inicialmente y a continuación se añade a la nanopartícula terapéutica (véanse, por ejemplo, Swami y cols., Int. J. Pharm. 374:125-138, 2009, Todt y cols., Methods Mol. Biol. 529:81 -100, 2009; y Limanskií, Biofizika 51:225-235, 2006).
Los conectores heterobifuncionales también pueden usarse para enlazar un ácido nucleico a una nanopartícula terapéutica. Por ejemplo, el 3-(2-piridilditio)proprionato de N-succinidimidilo (SPDP) se enlaza inicialmente a una amina primaria para dar un compuesto modificado con tiol. A continuación, este puede reaccionar con un tiol para intercambiar el piridiltiol por el tiol entrante (véanse, por ejemplo, Nostrum y cols., J. Control Release 15;153(1 ):93-102, 2011, y Berthold y cols., Bioconjug. Chem. 21:1933-1938, 2010).
Un enfoque alternativo para el uso del tiol ha sido una reacción de intercambio de tiol. Si un ácido nucleico tiolado se introduce en una nanopartícula terapéutica disulfurada, se puede producir una reacción de intercambio de disulfuro que conduce a que el ácido nucleico se una covalentemente a la nanopartícula terapéutica mediante un enlace disulfuro. Están disponibles múltiples químicas de reticulación potenciales para la reticulación heterobifuncional de aminas y tioles. Generalmente, estos procedimientos se han usado con un nucleótido tiolado. Reactivos típicamente empleados han sido NHS (éster de N-hidroxisuccinimida), MBS (éster de m-maleimidobenzoil-N-succinimida) y SPDP (un sistema basado en disulfuro de piridilo). Los conectores heterobifuncionales usados comúnmente se basan en un ácido nucleico aminado. Métodos adicionales para ligar covalentemente un ácido nucleico a una nanopartícula terapéutica son conocidos en la técnica.
Péptido dirigido
En algunas realizaciones, la nanopartícula terapéutica contiene además un péptido dirigido ligado covalentemente, p. ej., según se describe en el documento WO2013/016126. Por el término "péptido dirigido" se entiende un péptido que se une a una molécula (p. ej., proteína, azúcar o lípido o una combinación de los mismos) presente en o sobre la membrana plasmática de una célula diana (p. ej., una célula cancerosa). Según se describe en el presente documento, un péptido dirigido se puede ligar covalentemente a una molécula o composición secundaria (p. ej., cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento) para dirigir la molécula o composición secundaria a una célula diana (p. ej., una célula cancerosa). En algunas realizaciones, un péptido dirigido que se liga covalentemente a una molécula o composición secundaria (p. ej., cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento) da como resultado la captación de la molécula o composición secundaria por la célula diana (p. ej., captación celular por endocitosis o pinocitosis). Ejemplos no limitativos de péptidos dirigidos se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, el péptido dirigido contiene un péptido RGD, un péptido EPPT, NILHNHPYGTVG (SEQ ID NO: 2), SNPFSKPYGLTV (SEQ ID NO: 3), GLHESTFTQRRL (SEQ ID NO: 4), YPHYSLPGSSTL (SEQ ID NO: 5), SSLEPWHRTTSR (SEQ ID NO: 6), LPLALPRHNASV (SEQ ID NO: 7) o pAla-(Arg)7-Cys (SEQ ID NO: 8). En algunas realizaciones, el péptido dirigido está ligado covalentemente a la nanopartícula a través de un resto químico que contiene un enlace disulfuro. En algunas realizaciones, la nanopartícula terapéutica es magnética. Ejemplos adicionales de péptidos dirigidos y métodos para enlazarlos a la nanopartícula son conocidos en la técnica, p. ej., el documento WO2013/016126.
Composiciones farmacéuticas
También se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que contienen una nanopartícula terapéutica como la descrita en el presente documento. Dos o más (p. ej., dos, tres o cuatro) de cualquiera de los tipos de nanopartículas terapéuticas descritos en el presente documento pueden estar presentes en una composición farmacéutica en cualquier combinación. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de cualquier manera conocida en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas se formulan para que sean compatibles con la vía de administración pretendida (p. ej., intravenosa, intraarterial, intramuscular, intradérmica, subcutánea o intraperitoneal). Las composiciones pueden incluir un diluyente estéril (p. ej., agua o solución salina estériles), un aceite no volátil, polietilenglicol, glicerol, propilenglicol u otros disolventes sintéticos, agentes antibacterianos o antifúngicos tales como alcohol bencílico o metilparabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares, antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico, agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético, tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes isotónicos tales como azúcares (p. ej., dextrosa), polialcoholes (p. ej., manitol o sorbitol), o sales (p. ej., cloruro sódico), o cualquier combinación de los mismos. Las suspensiones liposómicas también pueden usarse como vehículos farmacéuticamente aceptables (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. N° 4.522.811). Las preparaciones de las composiciones pueden formularse y envasarse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis. Cuando se requiera (como, por ejemplo, en las formulaciones inyectables), puede mantenerse una fluidez apropiada mediante, por ejemplo, el uso de un revestimiento tal como lecitina o un tensioactivo. La absorción de las nanopartículas terapéuticas puede prolongarse mediante la inclusión de un agente que retrase la absorción (p. ej., monoestearato de aluminio y gelatina). Alternativamente, la liberación controlada se puede lograr mediante implantes y sistemas de aporte microencapsulados, que pueden incluir polímeros biocompatibles biodegradables (p. ej., etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico); Alza Corporation y Nova Pharmaceutical, Inc.).
Las composiciones que contienen una o más de cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento se pueden formular para administración parenteral (p. ej., intravenosa, intraarterial, intramuscular, intradérmica, subcutánea o intraperitoneal) en forma unitaria de dosificación (es decir, unidades físicamente discretas que contienen una cantidad predeterminada de compuesto activo para facilidad de administración y uniformidad de dosificación).
La toxicidad y la eficacia terapéutica de las composiciones pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación (p. ej., monos). Por ejemplo, se pueden determinar la DL50 (dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población): siendo el índice terapéutico la relación DL50:DE50. Se prefieren agentes que exhiban altos índices terapéuticos. Cuando un agente exhibe un efecto secundario indeseable, se debe tener cuidado para minimizar el daño potencial (es decir, reducir los efectos secundarios no deseados). La toxicidad y la eficacia terapéutica pueden determinarse mediante otros procedimientos farmacéuticos estándar.
Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios con animales se pueden usar para formular una dosificación apropiada de cualquier agente determinado para su uso en un sujeto (por ejemplo, un ser humano). Una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más (p. ej., una, dos, tres o cuatro) nanopartículas terapéuticas (p. ej., cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento) será una cantidad que trate disminuya la invasión de células cancerosas o la metástasis en un sujeto que tenga cáncer (p. ej., cáncer de mama) en un sujeto (p. ej., un ser humano), trate un cáncer metastásico en un ganglio linfático en un sujeto, disminuya o estabilice el tamaño de un tumor metastásico en un ganglio linfático en un sujeto, disminuya la velocidad de crecimiento de un tumor metastásico en un ganglio linfático en un sujeto, disminuya la gravedad, frecuencia y/o duración de uno o más síntomas de un cáncer metastásico en un ganglio linfático en un sujeto en un sujeto (p. ej., un ser humano), o disminuya el número de síntomas de un cáncer metastásico en un ganglio linfático en un sujeto (p. ej., en comparación con un sujeto de control que tenga la misma enfermedad pero no reciba tratamiento o reciba un tratamiento diferente, o el mismo sujeto antes del tratamiento).
La eficacia y la dosificación de cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento pueden ser determinadas por un profesional sanitario usando métodos conocidos en la técnica, así como mediante la observación de uno o más síntomas de cáncer metastásico en un ganglio linfático en un sujeto (p. ej., un ser humano). Ciertos factores pueden influir en la dosificación y la cronología requeridas para tratar eficazmente a un sujeto (p. ej., la gravedad de la enfermedad o el trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y la presencia de otras enfermedades).
Dosis ejemplares incluyen cantidades en miligramos o microgramos de cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento por kilogramo de peso del sujeto. Aunque estas dosis abarcan un amplio intervalo, un experto normal en la técnica comprenderá que los agentes terapéuticos, incluyendo las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento, varían en su potencia, y las cantidades eficaces pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. Típicamente, se administran dosis relativamente bajas al principio, y el profesional sanitario responsable (en el caso de una aplicación terapéutica) o un investigador (cuando aún trabaja en la fase de desarrollo) puede incrementar posteriormente y gradualmente la dosis hasta obtener una respuesta apropiada. Además, se entiende que el nivel de dosis específico para cada sujeto particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del sujeto, el momento de administración, la vía de administración, la velocidad de excreción y la semivida de las nanopartículas terapéuticasin vivo.
Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para la administración.
Métodos de tratamiento
Se descubrió que las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento disminuyen el crecimiento del cáncer. A la vista de este descubrimiento, se proporcionan en el presente documento dichas nanopartículas terapéuticas y un agente quimioterapéutico para el uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto. Realizaciones específicas y diversos aspectos de estos métodos se describen posteriormente.
Uso médico para heating cáncer
El uso médico incluye generalmente la identificación de un sujeto que tiene un tumor, por ejemplo, un cáncer. Según se usa en el presente documento, el término "cáncer" se refiere a células que tienen capacidad de crecimiento autónomo; es decir, un estado o condición anormal caracterizado por un crecimiento celular de rápida proliferación. Los estados de enfermedad hiperproliferativos y neoplásicos pueden clasificarse como patológicos, es decir, que caracterizan o constituyen un estado de enfermedad, o pueden clasificarse como no patológicos, es decir, una desviación de la normalidad pero no asociada a un estado de enfermedad. En general, un cáncer se asociará a la presencia de uno o más tumores, es decir, masas celulares anormales. Se entiende que el término "tumor" incluye todo tipo de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos con transformación maligna, independientemente del tipo histopatológico o el estadio de invasividad. Las células "hiperproliferativas patológicas" se presentan en estados de enfermedad caracterizados por el crecimiento de tumores malignos. Aunque el presente estudio se centró en el cáncer pancreático debido a su pronóstico desalentador y la falta de avances contra su forma metastásica, las composiciones y los métodos presentes son ampliamente aplicables a neoplasias malignas sólidas. Así, el cáncer puede ser cualquier tipo de tumor sólido, incluyendo, pero no limitado a, cáncer de mama, colon, riñón, pulmón, piel, ovario, páncreas, recto, estómago, tiroides o útero.
Los tumores incluyen neoplasias malignas de diversos sistemas orgánicos, tales como las que afectan al pulmón, la mama, el tiroides, el sistema linfoide, el tracto gastrointestinal y el tracto genitourinario, así como adenocarcinomas, que incluyen neoplasias malignas tales como la mayoría de los cánceres de colon, carcinoma de células renales, cáncer de próstata y/o tumores testiculares, carcinoma de pulmón no microcítico, cáncer de intestino delgado y cáncer de esófago. El término "carcinoma" se reconoce en la técnica y se refiere a neoplasias malignas de tejidos epiteliales o endocrinos, incluyendo carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas testiculares, carcinomas de mama, carcinomas prostáticos, carcinomas del sistema endocrino y melanomas. En algunas realizaciones, la enfermedad es carcinoma o melanoma renal. Carcinomas ejemplares incluyen los que se forman a partir de tejido de cuello uterino, pulmón, próstata, mama, cabeza y cuello, colon y ovario. El término también incluye carcinosarcomas, p. ej., que incluyen tumores malignos compuestos por tejidos carcinomatosos y sarcomatosos. Un “adenocarcinoma” se refiere a un carcinoma derivado de tejido glandular o en el que las células tumorales forman estructuras glandulares reconocibles. El término “sarcoma” se reconoce en la técnica y se refiere a tumores malignos de origen mesenquimal.
En algunas realizaciones, los cánceres evaluados o tratados mediante los métodos descritos en el presente documento incluyen cánceres epiteliales, tales como cáncer de pulmón (p. ej., cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC)), cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, cáncer pancreático (p. ej., adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC)) o cáncer ovárico. Las neoplasias malignas epiteliales son cánceres que afectan a los tejidos epiteliales.
Un cáncer puede ser diagnosticado en un sujeto por un profesional sanitario (p. ej., un médico, un asociado médico, una enfermera o un técnico de laboratorio) usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un cáncer metastásico puede ser diagnosticado en un sujeto, en parte, mediante la observación o detección de al menos un síntoma de cáncer en un sujeto según se conoce en la técnica. Un cáncer también puede ser diagnosticado en un sujeto usando una variedad de técnicas de obtención de imágenes (p. ej., solas o en combinación con la observación de uno o más síntomas de cáncer en un sujeto). Por ejemplo, la presencia de un cáncer puede ser detectada en un sujeto mediante tomografía computarizada, obtención de imágenes por resonancia magnética, tomografía de emisión positrónica y rayos X. Un cáncer también puede ser diagnosticado realizando una biopsia de tejido del sujeto. Un cáncer también puede ser diagnosticado a partir de biomarcadores séricos, tales como CA19.9, CEA, PSA, etc.
En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir determinar si el cáncer expresa o sobreexpresa una molécula de punto de control inmunitario, p. ej., PD-L1. Métodos para detectar la expresión de una molécula de punto de control inmunitario, p. ej., PD-L1, en un cáncer, p. ej., en una biopsia u otra muestra que comprende células procedentes del cáncer, son conocidos en la técnica, p. ej., incluyendo inmunohistoquímica (IHC) disponible comercialmente o desarrollada en el laboratorio; véase , p. ej., Udall y cols., Diagn Pathol. 2018; 13: 12. El nivel se puede comparar con un nivel umbral o de referencia, y si se observan un nivel de expresión de una molécula de punto de control inmunitario, p. ej., PD-L1, por encima del nivel umbral o de referencia, el sujeto puede seleccionarse para un tratamiento según se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir determinar si el cáncer tiene altos niveles de inestabilidad de microsatélites (MSI), p. ej., según se describe en Kawakami y cols., Curr Treat Options Oncol. 2015 Jul;16(7):30; Zeinalian y cols., Adv Biomed Res. 2018; 7: 28, y seleccionar un tratamiento del cáncer que tenga alta MSI o que tenga niveles de MSI por encima de un nivel umbral o de referencia..
Una cualquiera o más de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento se pueden administrar a un sujeto que tenga cáncer. La una o más nanopartículas terapéuticas se pueden administrar a un sujeto en un centro sanitario (p. ej., en un hospital o una clínica) o en una residencia de ancianos. En algunas realizaciones, se ha diagnosticado previamente que el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto ya ha recibido tratamiento terapéutico para el cáncer. En algunas realizaciones, uno o más tumores se han extirpado quirúrgicamente antes del tratamiento con una de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento.
En algunas realizaciones, la administración de al menos una nanopartícula terapéutica da como resultado una disminución (p. ej., una disminución significativa u observable) del tamaño de un tumor, una estabilización del tamaño (p. ej., ningún cambio significativo u observable en el tamaño) de un tumor o una disminución (p. ej., una disminución detectable u observable) de la velocidad de crecimiento de un tumor presente en un sujeto. Un profesional sanitario puede comprobar el tamaño y/o los cambios en el tamaño de un tumor en un sujeto usando una variedad de técnicas de obtención de imágenes, incluyendo, pero no limitadas a: tomografía computarizada, obtención de imágenes por resonancia magnética, tomografía de emisión positrónica y rayos X. Por ejemplo, el tamaño de un tumor de un sujeto se puede determinar antes y después de la terapia a fin de determinar si ha habido una disminución o estabilización del tamaño del tumor en el sujeto en respuesta a la terapia. La velocidad de crecimiento de un tumor se puede comparar con la velocidad de crecimiento de un tumor en otro sujeto o población de sujetos que no reciben tratamiento o que reciben un tratamiento diferente. Una disminución en la velocidad de crecimiento de un tumor también puede determinarse comparando la velocidad de crecimiento de un tumor antes y después de un tratamiento terapéutico (p. ej., tratamiento con cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento). En algunas realizaciones, la visualización de un tumor puede realizarse usando técnicas de obtención de imágenes que utilizan una sonda o molécula marcada que se une específicamente a las células cancerosas en el tumor (p. ej., un anticuerpo marcado que se une selectivamente a un epítopo presente sobre la superficie de la célula cancerosa).
En algunas realizaciones, la administración de una nanopartícula terapéutica al sujeto disminuye el riesgo de desarrollar un cáncer metastásico (p. ej., un cáncer metastásico en un ganglio linfático) en un sujeto que tenga (p. ej., diagnosticado o que tenga) un cáncer primario (p. ej., cáncer de mama primario) (p. ej., en comparación con la velocidad de desarrollo de un cáncer metastásico en un sujeto que tenga un cáncer primario similar pero que no reciba tratamiento o que reciba un tratamiento alternativo). Una disminución del riesgo de desarrollar un tumor metastásico en un sujeto que tenga un cáncer primario también puede compararse con la velocidad de formación de cáncer metastásico en una población de sujetos que no reciban terapia o que reciban una forma alternativa de terapia contra el cáncer.
Un profesional sanitario también puede evaluar la eficacia del tratamiento terapéutico de un cáncer observando una disminución en el número de síntomas de cáncer en el sujeto u observando una disminución en la gravedad, frecuencia y/o duración de uno o más síntomas de un cáncer en un sujeto. Una variedad de síntomas de un cáncer son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento.
En algunas realizaciones, la administración puede dar como resultado un incremento (p. ej., un incremento significativo) de la esperanza de vida o la probabilidad de supervivencia o de un cáncer en un sujeto (p. ej., en comparación con una población de sujetos que tienen un cáncer similar pero que reciben un tratamiento terapéutico diferente o ningún tratamiento terapéutico). En algunas realizaciones, la administración puede dar como resultado un mejor pronóstico para un sujeto que tiene un cáncer (p. ej., en comparación con una población de sujetos con un cáncer similar pero que reciben un tratamiento terapéutico diferente o ningún tratamiento terapéutico).
Dosificación, administración y composiciones
En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la nanopartícula terapéutica puede ser administrada por un profesional sanitario (p. ej., un médico, un asociado médico, una enfermera o un trabajador de un laboratorio o una clínica), el sujeto (es decir, autoadministración) o un amigo o familiar del sujeto. La administración se puede realizar en un entorno clínico (p. ej., en una clínica o un hospital) en un centro tutelado o en una farmacia.
En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la nanopartícula terapéutica se administra a un sujeto que ha sido diagnosticado de cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto ha sido diagnosticado de cáncer de mama o cáncer pancreático. En algunas realizaciones no limitativas, el sujeto es un hombre o una mujer, un adulto, un adolescente o un niño. El sujeto puede haber experimentado uno o más síntomas de un cáncer o cáncer metastásico (p. ej., un cáncer metastásico en un ganglio linfático). El sujeto también puede estar diagnosticado de un estadio grave o avanzado de cáncer (p. ej., un cáncer primario o metastásico). En algunas realizaciones, puede haberse identificado que el sujeto tiene un tumor metastásico presente en al menos un ganglio linfático. En algunas realizaciones, el sujeto puede haber sufrido ya una resección quirúrgica, p. ej., pancreatectomía, linfectomía y/o mastectomía parcial o total.
En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, al sujeto se le administra al menos una (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o 30) dosis de una composición que contiene al menos una (p. ej., una, dos, tres o cuatro) de cualquiera de la partículas magnéticas o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la al menos una partícula magnética o composición farmacéutica (p. ej., cualquiera de las partículas magnéticas o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento) se puede administrar intravenosamente, intaarterialmente, subcutáneamente, intraperitonealmente o intramuscularmente al sujeto. En algunas realizaciones, la al menos partícula magnética o composición farmacéutica se administra (inyecta) directamente en un ganglio linfático en un sujeto.
En algunas realizaciones, al sujeto se le administra al menos una nanopartícula terapéutica o composición farmacéutica (p. ej., cualquiera de las nanopartículas terapéuticas o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento) y al menos un agente terapéutico adicional. El al menos un agente terapéutico adicional puede ser un agente quimioterapéutico. Por el término "agente quimioterapéutico" se entiende una molécula que se puede usar para reducir la velocidad de crecimiento del cáncer o para inducir o mediar en la muerte (p. ej., necrosis o apoptosis) de células cancerosas en un sujeto (p. ej., un ser humano). En ejemplos no limitativos, un agente quimioterapéutico puede ser una micromolécula, una proteína (p. ej., un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, o un derivado o conjugado de los mismos), un ácido nucleico, o cualquier combinación de los mismos. Ejemplos no limitativos de agentes quimioterapéuticos incluyen uno o más agentes alquilantes; antraciclinas; disruptores del citoesqueleto (taxanos); epotilonas; inhibidores de histona desacetilasa; inhibidores de topoisomerasa I; inhibidores de topoisomerasa II; inhibidores de cinasa; análogos de nucleótidos y análogos de precursores; antibióticos peptídicos; agentes a base de platino; retinoides; y/o alcaloides de las vincas y derivados; o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico es un análogo de nucleótido o análogo de precursor, por ejemplo, azacitidina; azatioprina; capecitabina; citarabina; doxifluridina; fluorouracilo; gemcitabina; hidroxiurea; mercaptopurina; metotrexato; o tioguanina. Otros ejemplos incluyen ciclofosfamida, mecloretamina, clorabucilo, melfalán, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, valrubicina, paclitaxel, docetaxel, etopósido, tenipósido, taflupósido, bleomicina, carboplatino, cisplatino, oxaliplatino, ácido retinoico, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina y bevacizumab (o un fragmento de unión a antígeno del mismo). Ejemplos adicionales de agentes quimioterapéuticos son conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se elige basándose en el tipo de cáncer o basándose en el análisis genético del cáncer; por ejemplo, para el cáncer pancreático, pueden administrarse uno o más de ABRAXANE (paclitaxel unido a albúmina), Gemzar (gemcitabina), capecitabina, 5-FU (fluorouracilo) y ONIVYDE (inyección liposómica de irinotecán), o combinaciones de los mismos, p. ej., FOLFIRINOX, una combinación de tres fármacos quimioterapéuticos (5-FU/leucovorina, irinotecán y oxaliplatino), o FOLFIRINOX modificado (mFOLFIRINOX). Además, podrían usarse combinaciones de dianas que pueden funcionar sinérgicamente mediante mecanismos complementarios. Por ejemplo, pueden usarse terapias combinadas que alteran físicamente el microambiente tumoral mediante degradación enzimática a través de hialuronidasa humana recombinante (PEGPH20),3031 u otros agentes quimioterapéuticos alternativos y/o inhibidores de puntos de control alternativos que pueden promover un efecto sinérgico en la activación de células T (p. ej., anti-PD-1 y/o anti-CTLA-4).
Los métodos y las composiciones también pueden incluir la administración de un analgésico (p. ej., acetaminofeno, diclofenaco, diflunisal, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolaco, meclofenamato, ácido mefenámico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina, celecoxib, buprenorfina, butorfanol, codeína, hidrocodona, hidromorfona, levorfanol, meperidina, metadona, morfina, nalbufina, oxicodona, oximorfona, pentazocina, propoxifeno y tramadol).
En algunas realizaciones, al menos un agente terapéutico adicional y al menos una nanopartícula terapéutica (p. ej., cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento) se administran en la misma composición (p. ej., la misma composición farmacéutica). En algunas realizaciones, el al menos un agente terapéutico adicional y la al menos una nanopartícula terapéutica se administran al sujeto usando diferentes vías de administración (p. ej., al menos un agente terapéutico adicional aportado mediante administración oral y al menos una nanopartícula terapéutica aportada mediante administración intravenosa).
En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la al menos una nanopartícula terapéutica o composición farmacéutica (p. ej., cualquiera de las nanopartículas terapéuticas o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento) y, opcionalmente, al menos un agente terapéutico adicional se pueden administrar al sujeto al menos una vez a la semana (p. ej., una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana, una vez al día, dos veces al día o tres veces al día). En algunas realizaciones, al menos dos nanopartículas terapéuticas diferentes se administran en la misma composición (p. ej., una composición líquida). En algunas realizaciones, al menos una nanopartícula terapéutica y al menos un agente terapéutico adicional se administran en la misma composición (p. ej., una composición líquida). En algunas realizaciones, la al menos una nanopartícula terapéutica y el al menos un agente terapéutico adicional se administran en dos composiciones diferentes (p. ej., una composición líquida que contiene al menos una nanopartícula terapéutica y una composición oral sólida que contiene al menos un agente terapéutico adicional). En algunas realizaciones, el al menos un agente terapéutico adicional se administra como una píldora, un comprimido o una cápsula. En algunas realizaciones, el al menos un agente terapéutico adicional se administra en una formulación oral de liberación sostenida.
En algunas realizaciones, el uno o más agentes terapéuticos adicionales se pueden administrar al sujeto antes de administrar la al menos una nanopartícula terapéutica o composición farmacéutica (p. ej., cualquiera de las nanopartículas terapéuticas o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento). En algunas realizaciones, el uno o más agentes terapéuticos adicionales se pueden administrar al sujeto después de administrar la al menos una nanopartícula terapéutica o composición farmacéutica (p. ej., cualquiera de las partículas magnéticas o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento). En algunas realizaciones, el uno o más agentes terapéuticos adicionales y la al menos una nanopartícula terapéutica o composición farmacéutica (p. ej., cualquiera de las nanopartículas terapéuticas o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento) se administran al sujeto de modo que haya un solapamiento en el período bioactivo del uno o más agentes terapéuticos adicionales y la al menos una nanopartícula terapéutica (p. ej., cualquiera de las nanopartículas terapéuticas descritas en el presente documento) en el sujeto.
En algunas realizaciones, al sujeto se le puede administrar la al menos una nanopartícula terapéutica o composición farmacéutica (p. ej., cualquiera de las nanopartículas terapéuticas o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento) a lo largo de un período prolongado (p. ej., a lo largo de un período de al menos 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años o 10 años). Un profesional médico experto puede determinar la duración del período de tratamiento usando cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para diagnosticar o seguir la eficacia del tratamiento (p. ej., usando los métodos anteriores y los conocidos en la técnica). Según se describe en el presente documento, un profesional médico experto también puede cambiar la identidad y el número (p. ej., incrementar o disminuir) de nanopartículas terapéuticas (y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales) administradas al sujeto y también puede ajustar (p. ej., incrementar o disminuir) la dosificación o frecuencia de administración de al menos una nanopartícula terapéutica (y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales) al sujeto basándose en una evaluación de la eficacia del tratamiento (p. ej., usando cualquiera de los métodos descritos en el presente documento y conocidos en la técnica). Un profesional médico experto puede determinar además cuándo interrumpir el tratamiento (p. ej., cuando los síntomas del sujeto se disminuyan significativamente).
Comprobación de la terapia
Una ventaja clave adicional del presente enfoque terapéutico deriva del hecho de que presenta la oportunidad única de desarrollar un protocolo de tratamiento guiado por imagen clínicamente importante, que combina el conocimiento acerca de la biodisponibilidad del fármaco en el tejido diana y el resultado terapéutico. Esta capacidad se hace posible por el hecho de MN-siPDL1 incorpora un vehículo de nanopartículas superparamagnéticas de 20 nm, que garantiza un aporte muy eficaz a las células tumorales y cuya acumulación en los tejidos puede comprobarse mediante MRI cuantitativa no invasiva. Esta capacidad es única en el contexto de todos los demás enfoques terapéuticos disponibles, que no presentan la posibilidad de medir de forma no invasiva la biodisponibilidad del fármaco durante el tratamiento. Según se ilustra en el presente estudio, el conocimiento acerca de la concentración relativa de MN-siPDL1 en el tejido a través del parámetro d-R2 permitió el desarrollo y la optimización de un protocolo terapéutico asociado con la regresión tumoral duradera. Simultáneamente, la<m>R<i>anatómica permitió la medición objetiva del volumen tumoral como biomarcador morfológico de respuesta. Sin embargo, la aplicación de protocolos dinámicos de obtención de imágenes por MR podría usarse fácilmente para medir también variables fisiológicas relacionadas con el flujo sanguíneo tumoral y la permeabilidad microvascular.
Así, los presentes métodos pueden incluir el uso de modalidades de obtención de imágenes que detectan las nanopartículas magnéticas.
EJEMPLOS
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
MÉTODOS
Oligonucleótidos de ARN interferente pequeño (ARNsi)
La secuencia del oligonucleótido de ARNsi contrapd-l1(siPDL1; PM = 13.788,9 g/mol), consistía en 5'-TioMC6-D/GGUCAACGCCACAGCGAAUUU-3' (secuencia de sentido; SEQ ID NO:2) y 5'-PAUUCGCUGUGGCGUUGACCUU-3' (secuencia antisentido; SEQ ID NO:3). La secuencia del oligonucleótido de ARNsi mezclado (siSCR; PM = 13.728,8 g/mol) era 5'-TioMC6-D/UGGUUUACAUGUCGACUAAUU-3' (secuencia de sentido; SEQ ID NO:4) y 5'-PUUAGUCGACAUGUAAACCAUU-3' (secuencia antisentido; SEQ ID N<o>:5). Ambos ARNsi fueron diseñados y sintetizados por Dharmacon (Lafayette, CO). El disulfuro C6 modificador con 5'-Tiol (5'-TioMC6) se introdujo en las secuencias de sentido para la conjugación a nanopartículas magnéticas.
Síntesis de nanopartículas magnéticas (MN) revestidas con dextrano
La MN se sintetizó siguiendo un protocolo publicado previamente 20. Brevemente, 30 ml de Dextan-T10 (0,3 g ml-1, Pharmacosmos A/S, Holbaek, Dinamarca) se mezclaron con 1 ml de FeCl<3>.<6>H<2>O (0,65 g ml-1, Sigma, Saint Louis, MO) mientras se barría con gas argón durante una hora. Se añadió 1 ml de FeCl<2>.<4>H<2>O (0,4 g ml-1, Sigma) a la mezcla y se añadieron gota a gota 15 ml de NH<4>OH (28%, Sigma) frío a la mezcla agitada. La temperatura se incrementó hasta 85°C durante 1 h para comenzar la formación de una dispersión en nanopartículas y a continuación se enfrió hasta temperatura ambiente. Las nanopartículas magnéticas se concentraron hasta 20 ml usando unidades ultracentrífugas Amicon (PMCO 30 kDa; Millipore, Darmstadt, Alemania). Las nanopartículas magnéticas revestidas con dextrano resultantes se reticularon mediante epiclorhidrina (14 ml, 8 h, Sigma) y se aminaron con adición posterior de NH<4>OH (28%, 60 ml). Las nanopartículas magnéticas (MN) aminadas se purificaron mediante diálisis y se concentraron usando unidades ultracentrífugas Amicon. Las propiedades de la MN eran como sigue: concentración, 10,94 mg ml-1 como Fe; el número de grupos amina por MN, 64; relaxividad (R2), 82,5 mM-1s-1; tamaño de la MN, 20,3±0,6 nm (sistema NanoSight LM-10 ysoftwareNanoparticles Tracking Analysis software (Ver. 3.2), Malvern, Reino Unido).
Síntesis y caracterización de nanofármacos
La síntesis de nanofármacos se llevaba a cabo según un protocolo publicado previamente 20. Véanse también la Fig. 1A y la Fig. 6. Brevemente, la MN se conjugó al conector heterobifuncional 3-[2-piridilditio]-propionato de Nsuccinimidilo (SPDP, Thermoscientific Co., Rockford, IL), que se utilizó para la ligación de oligonucleótidos de ARNsi activados. El SPDP se disolvió en DMSO anhidro y se incubó con MN, que tiene un grupo piridilditio para formar un enlace disulfuro lábil a la reducción con los oligonucleótidos de ARNsi. El 5'-TioMC6 de los oligonucleótidos de ARNsi se activó para liberar el tiol a través de tratamiento con TCEP (Thermoscientific Co., Rockford, IL) al 3% en PBS libre de nucleasas. Los oligonucleótidos de ARNsi se purificaron usando un método de precipitación de acetato amónico/etanol. Después de la activación con TCEP y la purificación, cada oligonucleótido (siPDL1 y siSCR) se disolvió en agua y se incubó con la MN modificada con SPDP durante la noche para preparar nanofármacos (MN-siPDL1 y MN-siSCR). Los oligonucleótidos se añadieron a MN en dos relaciones diferentes para obtener nanofármacos que incorporan 2,1±0,4 (dosis baja) o 4,8±0,7 (dosis alta) oligonucleótidos de ARNsi por MN, según se cuantifica mediante el método de análisis por electroforesis 20. El nanofármaco se preparó recientemente cada semana. El tamaño del MN-siPDL1/SCR final era 23,2±0,9 nm.
Líneas celulares
La línea celular de adenocarcinoma ductal pancreático murino, PAN 02 (NCI, Frederick, MD), se cultivó en medio de cultivo RPMI 1640 (Sigma), complementado con FBS (Thermoscientific, Waltham, MA) al 10%, antibióticos (Invitrogen, Carlsbad, CA) al 1% y L-glutamina 2 mM, siguiendo las instrucciones del proveedor. El medio se cambió 3 veces por semana y se tripsinizó para subcultivo una vez a la semana.
Tinción tisular inmunohistológica y microscopía de fluorescencia
Se adquirieron anticuerpos primarios y secundarios de Abcam (Cambridge, MA) e incluían: anti-CD3 (N° Cat.: AB16669), anti-CD8 (N2 Cat.: AB25478), anti-FoxP3 (N2 Cat.: AB75763), Granzyme B (N2 Cat.: AB4069), anti-Ki67 (N2 Cat.: AB16667) y anti-PDL1 (N° Cat.: AB80276) como anticuerpos primarios, anti-(IgG de rata) caprino H&L (preadsorbido en Dylight 488, AB98420) y anti-(IgG de conejo) caprino H&L (preadsorbido en Dylight 488, AB96899) como anticuerpos secundarios.
La tinción tisular inmunohistológica se realizó siguiendo el protocolo para cada biomarcador. Brevemente, los tejidos tumorales extirpados se embebieron en el compuesto Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA) y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Los tejidos se cortaron en secciones de 7 gm y se fijaron en formaldehído al 4% durante 10 min. La permeabilización con detergente se realizó utilizando Triton X-100 al 0,1% en PBS, cuando fuera necesario. Después de bloquear con suero caprino al 5% en albúmina sérica bovina al 0,5% en PBS, cada corte se incubó con el anticuerpo primario correspondiente (dilución 1/200) a 5°C durante la noche. Cada corte se incubó con el anticuerpo secundario (dilución 1/200) durante 60 min y se montó con el medio de montaje Vectashield con DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Los cortes se analizaron usando un microscopio de fluorescencia Nikon E400 (Nikon, Tokio, Japón), equipado con los conjuntos de filtros necesarios (MVI Inc., Avon, MA). Las imágenes se adquirieron con una cámara de dispositivo de carga acoplada (CDA) con sensibilidad al infrarrojo cercano (SPOT 7.4 Slider RTKE; Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI). Las imágenes se analizaron usando elsoftwareSPOT 4.0 Advance versión (Diagnostic Instruments) e ImageJ (versión 1.51c, NIH).
Obtención de imágenes por MR in vivo
Se obtuvieron imágenes de MR antes y después de cada tratamiento semanal con MN-siPDL1/SCR usando un imán con orificio horizontal Bruker 9.4T (Magnex Scientific) con inserto de gradiente y operado usando elsoftwareParaVision 5.1. Los ratones formaban tumores 2 semanas después de la inoculación y se comprobó mediante obtención de imágenes por MR la medición cuantitativa de los volúmenes tumorales, utilizando un protocolo ponderado en T<1>de adquisición rápida con mejora de la relajación (RARE) (TE = 8,5 ms, TR = 2500 ms, número de promedio = 4, factor RAR<e>= 4, FOV = 4 x 4 cm2, tamaño de la matriz = 128 x 128 píxeles, número de cortes = 50, grosor de corte = 0,5 mm y grosor entre cortes = 0,5 mm) y un protocolo ponderado en T<2>(TE = 8,5 ms, TR = 7500 ms, número de promedio = 4, factor RARE = 16, FOV = 4 x 4 cm2, tamaño de la matriz = 128 x 128 píxeles, número de cortes = 50, grosor de corte = 0,5 mm y grosor entre cortes = 0,5 mm, ángulo de giro = 162 grados). Se recogieron mapas ponderados en T2 multiecográficos de múltiples cortes (MSME) con los siguientes parámetros: TE=8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72 y 80 ms, TR=4500 ms, número de cortes = 5, orientación del corte = axial, número de promedio = 1, factor RARE = 1, campo de visión = 4 x 4 cm2, tamaño de la matriz = 128 x 128 píxeles, grosor de corte = 0,5 mm, grosor entre cortes = 0,5 mm, ángulo de giro = 128 grados). La medición de los volúmenes tumorales y las reconstrucciones de los mapas de T2 fueron realizadas por dos investigadores independientes que desconocían la identidad de la muestra para considerar la variabilidad en la selección de la región de interés (ROI). Los mapas de T2 y los tiempos de relajación T2 en los tumores se calcularon usando elsoftwareImageJ (Ver. 1.50c, NIH). La velocidad de relajación R2 se obtuvo como la recíproca del tiempo de relajación. En consecuencia, el cambio en la velocidad de relajación (AR2) es proporcional a la concentración de óxido de hierro en la MN. AR2 se calculó usando las siguientes ecuaciones: S=S<ü>Exp(TE/T<2>), AR2= 1/T2,1- 1/T2,2=(1/TE)*ln(S1/S2), y se correlacionó con la concentración de MN siguiendo la ecuación: AR2= r2^A[Cj. Todos los valores de AR2 se calcularon con relación a la semana 0.
Modelo con animales
Se implantó una línea celular de cáncer pancreático murino Pan02 (0,25 x 106 células) en el costado derecho de ratones hembra de seis semanas (C57Bl/6, n = 12). Una semana después de la inyección celular, el tamaño tumoral se comprobó mediante mediciones con calibrador. El volumen tumoral se calculó según la ecuación: Volumen = 0,5 x L x W2, donde L es la longitud y W la anchura. El tratamiento se inició una vez que los volúmenes tumorales alcanzaban 50 mm3, según se estimaba usando un calibrador. Posteriormente, se midió el volumen tumoral mediante MRI una vez que los ratones se incorporaban en el estudio y antes y después de cada tratamiento semanal. Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales y fueron aprobados por the Institutional Animal Care and Use Committee del Massachusetts General Hospital.
Terapia
Los ratones (n = 6) fueron asignados aleatoriamente a un grupo experimental (tratado con MN-siPDL1 gemcitabina) o a un grupo de control (tratado con MN-siSCR gemcitabina). Los ratones del grupo experimental fueron tratados con MN-siPDL1 en dosis baja (10 mg kg-1 como hierro; 520 nmoles/kg de ARNsi) en solución con gemcitabina (333,3 mg/kg), o con MN-siPDL1 en dosis alta (10 mg kg-1 como hierro; 937 nmoles/kg de ARNsi) en solución con gemcitabina (333,3 mg/kg). Los ratones del grupo de control recibían MN-siSCR y gemcitabina en las mismas dosis. En ambos casos, los fármacos se administraron como una mezcla de nanofármaco y gemcitabina a través de la vena caudal (inyección i.v.) semanalmente. Después de la semana 7, se suspendió la coadministración de gemcitabina para evitar exceder la dosis máxima tolerada, y solo se administró el nanofármaco hasta el final del estudio. Todos los ratones fueron comprobados semanalmente mediante obtención de imágenes por resonancia magnética para seguir los cambios en el volumen tumoral durante un máximo de 12 semanas después del primer tratamiento o hasta que los animales estuvieran moribundos.
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± s.d. o s.e.m., cuando se indique. Las comparaciones estadísticas se llevaron a cabo usando una prueba bilateral de la t (SigmaStat 3.0; Systat Software, Richmond, CA). Un valor de P < 0,05 se consideraba estadísticamente significativo.
Ejemplo 1. Inhibición de PD-L1 mediada por RNAi para la inmunoterapia del cáncer pancreático.
MN-siPDL1 se puede aportarin vivoa tumores primarios y el aporte se puede comprobar mediante MRI no invasiva.
A fin de administrar satisfactoriamente cantidades terapéuticas de ARNsi a las células tumorales tras la inyección intravenosa, fue necesario optimizar el diseño de MN-siPDL1 en cuanto al tamaño hidrodinámico, el método de conjugación y el número de oligonucleótidos de ARNsi por nanopartícula. Un esquema sintético ejemplar de MN-siPDL1 se ilustra en la Fig. 1A. Para asegurar tiempos de circulación prolongados (>4 h) y una difusión eficaz a través del endotelio vascular y a través del intersticio tumoral, se diseñó MN-siPDL1 de forma que su tamaño final después de la conjugación secuencial con el conector de SPDP y el oligonucleótido fuera 23,2 ± 0,9 nm. El número de oligonucleótidos de ARNsi por nanopartícula se ajustó a no más de 4,8 ± 0,7 con el objetivo de minimizar la interferencia estérica con la bioconjugación. Este diseño está optimizado para mejorar la captación del nanofármaco por el tejido tumoral mediante el efecto de penetración-retención mejoradas (EPR). Además, el conector de SPDP se eligió debido a su naturaleza reducible, que garantiza la disociación del oligonucleótido desde la nanopartícula en las células cancerosas y una entrada eficaz en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Finalmente, para permitir la detección de MN-siPDL1 mediante obtención de imágenes por resonancia magnética, se ajustó la relaxividad (R2) de la preparación final variando las proporciones de [Fe3+]/[Fe2 ] para conseguir una R2 de 82,5 mM-1s-1 (Fig. 1B).
Con el fin de establecer un protocolo terapéutico eficaz, se necesitaba confirmar el aporte de MN-siPDL1 al tejido tumoral pancreático y demostrar la capacidad de la MRI para medir semicuantitativamente la biodisponibilidad de MN-siPDL1 en tumores. Se probó la hipótesis de los presentes inventores usando el modelo singénico de cáncer pancreático PAN02. Estos animales formaron tumores 2 semanas después de la inoculación y fueron comprobados mediante obtención de imágenes de MR, usando protocolos ponderados en T<2>monoecográficos y multiecográficos. La diferencia en la velocidad de relajación (AR2) se calculó usando las siguientes ecuaciones: S=S0 Exp(TE/T2), AR<2>= 1/T2,1- 1/T2,2=(1/TE)*Ln(S1/S2) y AR<2>= ^ A [C ]. Para la visualización de la distribución de MN-<síp>D<l>1 en el tejido tumoral, se reconstruyeron mapas de T2 a partir del conjunto de imágenes ponderadas en T<2>multiecográficas.
Según se muestra en la Fig. 2A, la localización de MN-siPDL1 en el tejido tumoral provocaba un acortamiento del tiempo de relajación T2 y daba como resultado un contraste negativo en comparación con la imagen antes del contraste. La concentración de MN-siPDL1 derivada de AR2 mostraba un incremento lineal durante las primeras tres semanas. La velocidad de acumulación de MN-siPDL1 era 1,5 veces más rápida que la de MN-siSCR durante ese período (Fig. 2B). Puesto que la concentración del nanofármaco en las células tumorales refleja principalmente la dilución debida a la división celular, la mayor velocidad de crecimiento de los tumores de control tratados con MN-siSCR conducía probablemente al incremento más lento observado en la concentración a lo largo del tiempo en este grupo. Esta diferencia era más pronunciada en los estadios posteriores de crecimiento tumoral, lo que respalda aún más esta hipótesis. La velocidad de disminución de la concentración, reflejo de la rápida dilución del nanofármaco debido a la división de las células tumorales en el grupo de control tratado con MN-siSCR, era 5,1 veces mayor que en el grupo experimental tratado con MN-siPDL1, lo que indica un crecimiento más rápido del tumor en los animales de control (Fig. 2C).
El tratamiento combinado con gemcitabina y MN-siPDL1 es eficaz en un modelo singénico de cáncer pancreático.
Los presentes estudios terapéuticos ilustraban el potencial del tratamiento combinado con gemcitabina y MN-siPDL1 en el cáncer pancreático. En estos estudios, se generó un modelo singénico de cáncer pancreático implantando la línea celular de cáncer pancreático murino PAN02 en el costado derecho de ratones C57BL/6 hembra de seis semanas.
Para determinar si el tratamiento con gemcitabina en combinación con MN-siPDL1 podía inhibir el crecimiento tumoral, los ratones fueron tratados con gemcitabina en solución con una dosis baja de MN-siPDL1 o siSCR (10 mg/kg de Fe; 520 nmoles/kg de ARNsi en ambos grupos) o una dosis alta de MN-siPDL1 o siSCR (10 mg/kg de Fe, 937 nmoles/kg de ARNsi en ambos grupos) aportadas intravenosamente a través de la vena caudal (i.v.). El tratamiento combinado se inició cuando el tamaño tumoral alcanzaba >50 mm3, según se mide mediante obtención de imágenes por MR anatómica, y se continuó durante 12 semanas. En todos los estudios terapéuticos, el cambio en el volumen tumoral se comprobaba mediante obtención de imágenes por MR anatómica antes de la administración de cada tratamiento semanal (Fig. 3A).
Los ratones cotratados con MN-siPDL1 y gemcitabina demostraron una inhibición significativa del crecimiento tumoral, con relación a los controles con MN-siSCR inactivo (P < 0,05). Esta diferencia era evidente a la semana 2 desde el inicio del tratamiento, cuando el volumen tumoral había disminuido desde 52,8 ± 6,7 mm3 en la semana 0 hasta 5,3 ± 0,8 mm3 en la semana 2 (p = 0,012). La diferencia persistía durante todo el estudio (p < 0,05). Los volúmenes tumorales en el grupo de dosis baja no eran diferentes de los del control con MN-siSCR hasta la semana 6 (Figs. 3A-B y Figs.
5A-D).
En el grupo de MN-siPDL1 a dosis alta, 67 % de los ratones mostraba una respuesta objetiva al tratamiento, definida como inhibición del crecimiento tumoral. El 33 % de los ratones no respondía y moría después de 6 semanas, lo que indica la variabilidad de la respuesta. Las constantes de tiempo del crecimiento tumoral estratificando a los animales de experimentación según la respuesta se presentan en la Tabla I.
Tabla I. Constantes de velocidad de crecimiento tumoral en animales tratados con MN-siPDL1 o MN-siSCR y gemcitabina.
Finalmente, la ventaja del tratamiento combinado se observaba claramente cuando se evaluaba la supervivencia de los animales (Fig 3C). El 67% de los ratones tratados con gemcitabina y MN-siPDL1 (dosis alta) sobrevivía hasta la semana 12. El 67% de los ratones tratados con gemcitabina y MN-siPDL1 (dosis baja) sobrevivía hasta la semana 8. Todos los ratones de control tratados con MN-siSCR y gemcitabina sucumbía para la semana 6.
De forma interesante, todos los ratones del grupo tratado con gemcitabina y MN-siSCR desarrollaban grandes tumores necróticos, presumiblemente debido a la alta velocidad de crecimiento tumoral. No se observaron necrosis ni ulceración tumorales en los animales de experimentación (Fig. 3D).
El tratamiento combinado prevenía la inactivación de células T citotóxicas
Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento sobre la respuesta inmunitaria antitumoral, los presentes inventores analizaron biomarcadores tisulares de incorporación y activación de células inmunitarias en los tumores de ratones tratados. Después del tratamiento combinado con MN-siPDL1 y gemcitabina, la expresión de PD-L1 se reducía significativamente. Había evidencia de una incorporación de linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) CD8+ y un incremento de la citotoxicidad mediada celularmente, según se evidencia por niveles superiores de Granzyme B. La infiltración tumoral por células T reguladoras (T reg) Foxp3+ inmunosupresoras también se reducía significativamente. Finalmente, se inhibía la proliferación de células tumorales (Figs. 4A-B). Cabe destacar que la expresión de estos biomarcadores en animales que no responden tratados con MN-siPDL1 y gemcitabina a dosis altas era intermedia entre los animales de control y los animales de experimentación en regresión, lo que sugiere que existe un nivel crítico de inhibición de PD-L1 necesario para observar la respuesta macroscópica (Fig. 4A-B). Estos resultados sugería que el efecto terapéutico observado era el resultado de la inducción satisfactoria de una respuesta inmunitaria antitumoral.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una nanopartícula terapéutica, donde dicha nanopartícula:
tiene un diámetro de entre 10 nm y 30 nm; y
comprende un núcleo de óxido de hierro, un revestimiento polimérico que comprende dextrano, y un ácido nucleico inhibidor que se dirige a una molécula de punto de control inmunitario, donde la molécula de punto de control inmunitario es ligando 1 de muerte celular programada 1 (PD-L1), que está ligado covalentemente a la nanopartícula.
2. La nanopartícula terapéutica según la reivindicación 1, donde el ácido nucleico comprende una secuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos complementarios a SEQ ID NO:1.
3. La nanopartícula terapéutica según la reivindicación 1, donde el ácido nucleico comprende al menos un nucleótido modificado, donde el al menos un nucleótido modificado comprende al menos una modificación en su base y/o al menos una modificación en su azúcar, o donde el al menos un nucleótido modificado comprende una modificación en un átomo que forma un enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos adyacentes en el ácido nucleico.
4. La nanopartícula terapéutica según la reivindicación 3, donde el al menos un nucleótido modificado es un nucleótido bloqueado.
5. La nanopartícula terapéutica según la reivindicación 1, donde el ácido nucleico es una molécula de ARN interferente pequeño (ARNsi).
6. La nanopartícula terapéutica según la reivindicación 1, donde el ácido nucleico está ligado covalentemente a la nanopartícula a través de un resto químico que comprende un enlace disulfuro o un enlace tioéter.
7. La nanopartícula terapéutica según la reivindicación 1, donde la nanopartícula es magnética.
8. Una composición farmacéutica que comprende la nanopartícula terapéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y opcionalmente un agente quimioterapéutico, opcionalmente donde el agente quimioterapéutico es gemcitabina.
9. La nanopartícula terapéutica según las reivindicaciones 1-7, y un agente quimioterapéutico, para el uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.
10. La nanopartícula terapéutica y el agente quimioterapéutico para el uso según la reivindicación 9, donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de piel, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de estómago, cáncer de tiroides y cáncer uterino.
11. La nanopartícula terapéutica y el agente quimioterapéutico para el uso según la reivindicación 9, que comprende además obtener imágenes del sujeto para determinar una localización o número de células cancerosas en el sujeto, o una localización de las nanopartículas terapéuticas en el sujeto.
12. La nanopartícula terapéutica y el agente quimioterapéutico para el uso según la reivindicación 9, donde la nanopartícula terapéutica se administra en dos o más dosis al sujeto, opcionalmente donde la nanopartícula terapéutica se administra al sujeto al menos una vez a la semana.
13. La nanopartícula terapéutica y el agente quimioterapéutico para el uso según la reivindicación 9, donde la nanopartícula terapéutica se administra al sujeto mediante administración intravenosa, subcutánea, intraarterial, intramuscular o intraperitoneal.
14. La nanopartícula terapéutica y el agente quimioterapéutico para el uso según la reivindicación 9, donde el sujeto tiene cáncer pancreático.
15. La nanopartícula terapéutica y el agente quimioterapéutico para el uso según la reivindicación 9, donde el agente quimioterapéutico es gemcitabina.
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