ES3041461T3 - Cardiovascular event risk prediction - Google Patents

Abstract

Se proporcionan biomarcadores, métodos, dispositivos, reactivos, sistemas y kits utilizados para evaluar a un individuo con insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (ICFEp) o con insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida (ICFEr) para la predicción del riesgo de desarrollar un evento cardiovascular (CV) durante un período de 90 días, 180 días o 1 año. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Predicción del riesgo de acontecimiento cardiovascular

Campo de la invención

La presente solicitud se refiere en general a la detección de biomarcadores y a un método de evaluación del riesgo de un futuro acontecimiento cardiovascular en un individuo con insuficiencia cardíaca crónica y, más específicamente, a uno o más biomarcadores, métodos, dispositivos, reactivos, sistemas y kits utilizados para evaluar a un individuo con el fin de predecir el riesgo de desarrollar un acontecimiento cardiovascular (CV). Dichos acontecimientos incluyen, aunque no de forma limitativa, la hospitalización y la muerte.

Antecedentes

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en Estados Unidos. Existen varios predictores importantes del riesgo de acontecimientos primarios (D'Agostino, Ret al.,"General Cardiovascular Risk Profile for Use in Primary Care: The Framingham Heart Study" Circulation 117:743-53 (2008); y Ridker, P.et al.,"Development and Validation of Improved Algorithms for the Assessment of Global Cardiovascular Risk in Women" JAMA 297(6):611-619 (2007)) y acontecimientos secundarios (Shlipak, M.et al."Biomarkers to Predict Recurrent Cardiovascular Disease: The Heart & Soul Study" Am. J. Med. 121:50-57 (2008)) que se utilizan ampliamente en la práctica clínica y en ensayos terapéuticos. Por desgracia, las curvas características operativas del receptor, los cocientes de riesgos y la concordancia muestran que el rendimiento de los factores de riesgo y biomarcadores existentes es modesto (AUC de ~0,75 significa que estos factores están sólo a medio camino entre el lanzamiento de una moneda y la perfección). Además de la necesidad de mejorar el rendimiento diagnóstico, existe la necesidad de un producto de riesgo que sea a la vez a corto plazo y que responda personalmente dentro de los individuos a intervenciones beneficiosas (y destructivas) y a los cambios en el estilo de vida. La ecuación de Framingham, utilizada habitualmente, tiene tres problemas principales. En primer lugar, es demasiado a largo plazo: ofrece cálculos de riesgo a 10 años, pero los seres humanos descuentan los riesgos futuros y son reacios a hacer modificaciones de comportamiento y estilo de vida basadas en ellos. En segundo lugar, es poco sensible a las intervenciones: depende en gran medida de la edad cronológica, que no puede disminuir; y el sexo, que no puede cambiar. En tercer lugar, dentro de la población de alto riesgo prevista en el presente documento, los factores de Framingham no discriminan bien entre riesgo alto y bajo: el cociente de riesgos entre cuartiles altos y bajos es sólo de 2, y cuando se intenta usar las puntuaciones de Framingham para personalizar el riesgo estratificando a los sujetos en estratos más finos (deciles, por ejemplo), las tasas de acontecimientos observadas son similares para muchos de los deciles.

Los factores de riesgo de las enfermedades cardiovasculares se utilizan ampliamente para determinar la intensidad y la naturaleza de los tratamientos médicos, y su uso ha contribuido sin duda a la reducción de la morbimortalidad cardiovascular que se ha observado en las dos últimas décadas. Estos factores se han combinado de forma rutinaria en algoritmos, pero por desgracia no recogen todo el riesgo (la presentación inicial más frecuente de las cardiopatías sigue siendo la muerte). De hecho, probablemente sólo capten la mitad del riesgo. Un área bajo la curva r Oc de ~0,76 es normalmente típica para tales factores de riesgo en prevención primaria, con resultados mucho peores en prevención secundaria (normalmente, 0,62), números sólo alrededor de un cuarto a la mitad del rendimiento entre el lanzamiento de una moneda a 0,5 y la perfección a 1,0.

De manera adicional, en el estudio de Framingham (Wanget al.,"Multiple Biomarkers for the Prediction of First Major Cardiovascular Events and Death" N. Eng. J. Med. 355:2631-2637

(2006)) en 3209 personas, la adición de 10 biomarcadores (CRP, BNP, NT-proBNP, aldosterona, renina, fibrinógeno, dímero D, inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1, homocisteína y el cociente albúmina/creatinina en orina) no mejoraron significativamente el AUC cuando se añadieron a los factores de riesgo existentes: el AUC para los acontecimientos de 0-5 años fue de 0,76 con la edad, el sexo y los factores de riesgo convencionales y 0,77 con la mejor combinación de biomarcadores añadidos a la mezcla, y para la prevención secundaria la situación es peor.

La identificación precoz de los pacientes con mayor riesgo de sufrir un acontecimiento cardiovascular dentro de un intervalo de 1 año es importante porque un tratamiento más agresivo de los individuos con riesgo elevado puede mejorar los resultados. Por lo tanto, el tratamiento óptimo requiere una intervención agresiva para reducir el riesgo de un acontecimiento cardiovascular en los pacientes que se considera que tienen un riesgo más elevado, mientras que los pacientes con menor riesgo de sufrir un acontecimiento cardiovascular pueden ahorrarse tratamientos caros y potencialmente invasivos, que probablemente no tengan ningún efecto ventajoso para el paciente.

La selección de biomarcadores para la predicción del riesgo de padecer una enfermedad o afección específica dentro de un periodo de tiempo definido implica, en primer lugar, la identificación de marcadores que tengan una relación medible y estadísticamente significativa con la probabilidad y/o el momento de un acontecimiento para una aplicación médica específica. Los biomarcadores pueden incluir moléculas secretadas o excretadas que se encuentran en la vía causal de la afección de interés, o que se encuentran en una fase posterior o paralela al desarrollo o progresión de la enfermedad o afección, o ambas. Se liberan en el torrente sanguíneo desde el tejido cardiovascular o desde otros órganos y tejidos circundantes y células circulantes en respuesta a los procesos biológicos que predisponen a un acontecimiento cardiovascular o pueden reflejar efectos posteriores de la fisiopatología, tales como un deterioro de la función renal. Los biomarcadores pueden incluir moléculas pequeñas, péptidos, proteínas y ácidos nucleicos. Algunos de los principales problemas que afectan a la identificación de biomarcadores incluyen el ajuste excesivo de los datos disponibles y el sesgo en los datos.

Se han utilizado diversos métodos para intentar identificar biomarcadores y diagnosticar o predecir el riesgo de que tenga una enfermedad o afección. Para marcadores basados en proteínas, incluyen electroforesis bidimensional, espectrometría de masas y métodos de inmunoensayo. Para marcadores de ácidos nucleicos, se incluyen perfiles de expresión de ARNm, perfiles de microARN, FISH, análisis en serie de la expresión génica (SAGE), matrices de expresión génica a gran escala, secuenciación génica y genotipado (SNP o análisis de pequeñas variantes).

La utilidad de la electroforesis bidimensional se ve limitada por la baja sensibilidad de detección; problemas de solubilidad de las proteínas, carga e hidrofobicidad; reproducibilidad del gel; y la posibilidad de que una sola mancha represente varias proteínas. Para espectrometría de masas, en función del formato utilizado, las limitaciones giran en torno al tratamiento y la separación de las muestras, la sensibilidad a las proteínas de baja abundancia, las consideraciones de la relación señal/ruido y la imposibilidad de identificar inmediatamente la proteína detectada. Las limitaciones de los métodos de inmunoensayo para el descubrimiento de biomarcadores se centran en la incapacidad de los ensayos multiplex basados en anticuerpos para medir un gran número de analitos. Se podría simplemente imprimir una matriz de anticuerpos de alta calidad y, sin sándwich, medir los analitos unidos a esos anticuerpos. (Esto sería el equivalente formal de usar un genoma completo de secuencias de ácido nucleico para medir por hibridación todas las secuencias de ADN o ARN de un organismo o una célula. El experimento de hibridación funciona porque la hibridación puede ser una prueba rigurosa de identidad). Sin embargo, incluso los mejores anticuerpos no suelen ser lo suficientemente estrictos a la hora de seleccionar a sus compañeros de unión para que funcionen en el contexto de la sangre o incluso de los extractos celulares, ya que el conjunto de proteínas de esas matrices tiene abundancias muy variables, lo que puede dar lugar a una mala relación señal/ruido. Por lo tanto, hay que utilizar un enfoque diferente con los enfoques basados en inmunoensayos para el descubrimiento de biomarcadores, habría que usar ensayos ELISA multiplexados (es decir, sándwiches) para obtener el rigor suficiente para medir muchos analitos simultáneamente y decidir qué analitos son realmente biomarcadores. Los inmunoensayos en sándwich no se escalan a alto contenido, por lo que el descubrimiento de biomarcadores mediante inmunoensayos en sándwich estrictos no es posible utilizando formatos de matriz estándar. Por último, los reactivos de anticuerpos están sujetos a una variabilidad sustancial de los lotes y a la inestabilidad de los reactivos. La presente plataforma para el descubrimiento de biomarcadores proteicos supera este problema.

Muchos de estos métodos dependen o requieren algún tipo de fraccionamiento de la muestra antes del análisis. Por lo tanto, la preparación de muestras necesaria para llevar a cabo un estudio suficientemente potente diseñado para identificar y descubrir biomarcadores estadísticamente relevantes en una serie de poblaciones de muestras bien definidas es extremadamente difícil, costoso y lento. Durante el fraccionamiento, puede introducirse una amplia gama de variabilidad en las distintas muestras. Por ejemplo, un marcador potencial podría ser inestable para el proceso, la concentración del marcador podría modificarse, podría producirse una agregación o desagregación inadecuada, y podría producirse una contaminación inadvertida de la muestra y, por tanto, oscurecer los cambios sutiles que se anticipan en las primeras fases de la enfermedad.

Está ampliamente aceptado que los métodos de descubrimiento y detección de biomarcadores que utilizan estas tecnologías tienen serias limitaciones para la identificación de biomarcadores diagnósticos o predictivos. Estas limitaciones incluyen la incapacidad de detectar biomarcadores de baja abundancia, la incapacidad de cubrir de forma coherente todo el rango dinámico del proteoma, la irreproducibilidad en el procesamiento y fraccionamiento de las muestras y la irreproducibilidad general y falta de solidez del método. Además, estos estudios han introducido sesgos en los datos y no han abordado adecuadamente la complejidad de las poblaciones de muestra, incluidos los controles adecuados, en cuanto a la distribución y aleatorización necesarias para identificar y validar biomarcadores dentro de una población de enfermedades diana.

Aunque los esfuerzos encaminados al descubrimiento de biomarcadores nuevos y eficaces se han prolongado durante varias décadas, los esfuerzos han sido en gran medida infructuosos. Normalmente, los biomarcadores de diversas enfermedades se han identificado en laboratorios académicos, normalmente a través de un descubrimiento accidental mientras se realiza una investigación básica sobre algún proceso patológico. Debido al descubrimiento y con pequeñas cantidades de datos clínicos, se publicaron artículos que sugerían la identificación de un nuevo biomarcador. La mayoría de estos biomarcadores propuestos, sin embargo, no se han confirmado como biomarcadores reales o útiles, principalmente porque el reducido número de muestras clínicas analizadas sólo proporciona una débil prueba estadística de que se ha encontrado de hecho un biomarcador eficaz. Es decir, la identificación inicial no era rigurosa con respecto a los elementos básicos de la estadística.

Basándose en la historia de los esfuerzos fallidos de descubrimiento de biomarcadores, se han propuesto teorías que promueven aún más la comprensión general de que los biomarcadores para el diagnóstico, el pronóstico o la predicción del riesgo de desarrollar enfermedades y afecciones son poco frecuentes y difíciles de encontrar. La investigación de biomarcadores basada en geles 2D o espectrometría de masas apoya estas nociones. Muy pocos biomarcadores útiles han sido identificados a través de estos enfoques. Sin embargo, se suele pasar por alto que el gel 2D y la espectrometría de masas miden proteínas que están presentes en la sangre en concentraciones de aproximadamente 1 nM y mayores, y que este conjunto de proteínas puede muy bien ser el que tenga menos probabilidades de cambiar con la enfermedad o el desarrollo de una afección concreta. Además de la plataforma de descubrimiento instantáneo de biomarcadores, no existen plataformas de descubrimiento de biomarcadores proteómicos capaces de medir con precisión los niveles de expresión de proteínas a concentraciones mucho más bajas.

Se conoce mucho sobre las vías bioquímicas de la compleja biología humana. Muchas vías bioquímicas culminan o son iniciadas por proteínas secretadas que actúan localmente dentro de la patología; por ejemplo, se segregan factores de crecimiento para estimular la replicación de otras células de la patología, y otros factores para protegerse del sistema inmunitario, etc. Aunque muchas de estas proteínas secretadas actúan de forma paracrina, algunas operan a distancia en el cuerpo. Un experto en la técnica con conocimientos básicos de las vías bioquímicas comprendería que muchas proteínas específicas de patologías deberían existir en la sangre en concentraciones inferiores (incluso muy inferiores) a los límites de detección de los geles 2D y la espectrometría de masas. Lo que debe preceder a la identificación de este número relativamente abundante de biomarcadores de enfermedades es una plataforma proteómica que pueda analizar proteínas en concentraciones inferiores a las detectables mediante geles 2D o espectrometría de masas.

La insuficiencia cardíaca crónica, también conocida como insuficiencia cardíaca congestiva (ICC), se produce cuando el corazón no puede bombear suficiente sangre y oxígeno para mantener las funciones normales de otros órganos y es la causa más frecuente de hospitalización en personas mayores de 65 años. La fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI), medida por ecocardiograma, muestra la cantidad de sangre que bombea el ventrículo izquierdo con cada contracción del corazón. Basado en el nivel de la fracción de eyección (FE), la IC puede clasificarse en IC con fracción de eyección reducida, ICFEr (FEVI <40 %); IC con fracción de eyección preservada, ICFEp (FEVI> 50 %); e IC con fracción de eyección media, HFmrEF (FEVI del 40 % al 49 %).

Tal cual se ha indicado anteriormente, los acontecimientos cardiovasculares pueden impedirse con un tratamiento agresivo si se puede determinar con precisión la propensión a sufrirlos, y dirigiendo esas intervenciones a las personas que más las necesitan y/o alejándolas de las que menos las necesitan, se puede mejorar el perfeccionamiento de los recursos médicos y, al mismo tiempo, reducir los costes. Adicionalmente, cuando el paciente tiene conocimiento de información precisa y a corto plazo sobre su probabilidad personal de sufrir acontecimientos cardiovasculares, esto es menos negable que la información a largo plazo basada en la población y conducirá a un mejor perfeccionamiento del estilo de vida y a un mayor cumplimiento de la medicación, lo que se sumará a los beneficios. Las pruebas con múltiples marcadores existentes requieren la recogida de múltiples muestras de un individuo o que una muestra se reparta entre varios ensayos. De manera óptima, un perfeccionamiento de la prueba sólo requeriría una única muestra de sangre, orina u otro tipo de muestra, y un único ensayo. En consecuencia, existe la necesidad de biomarcadores, métodos, dispositivos, reactivos, sistemas y kits que permiten la predicción de acontecimientos cardiovasculares dentro de un periodo de 1 año.

El documento WO 2013/049674 A1 se refiere a un método para evaluar el riesgo de un futuro acontecimiento CV.

Adamoet al.,J Am Coll Cardiol. 2020 Oct 27;76(17):1982-1994 se refiere a firmas proteómicas de la insuficiencia cardíaca en relación con la fracción de eyección del ventrículo izquierdo.

El documento EP 1884 777 se refiere a métodos para evaluar el riesgo de intervenciones cardíacas basados en el Factor de Crecimiento-Diferenciación-15 (GDF-15).

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

La presente solicitud incluye biomarcadores, métodos, reactivos, dispositivos, sistemas y kits para la predicción del riesgo de un individuo con insuficiencia cardíaca crónica, tal como insuficiencia cardíaca crónica estable, que tiene un acontecimiento cardiovascular (CV) dentro de un periodo de 90 días, un periodo de 180 días o un periodo de 1 año. Los biomarcadores de la presente solicitud se identificaron utilizando un ensayo multiplex basado en un aptámero de velocidad de eliminación lenta que se describe detalladamente en el presente documento. Utilizando el método multiplex de identificación de biomarcadores basado en aptámeros de baja velocidad descrito en el presente documento, la presente solicitud describe un conjunto de biomarcadores útiles para predecir la probabilidad de un acontecimiento CV en pacientes con insuficiencia cardíaca crónica, tal como insuficiencia cardíaca crónica estable, en un periodo de 90 días, 180 días o 1 año.

En algunas realizaciones, el individuo tiene insuficiencia cardíaca crónica estable con fracción de eyección preservada (ICFEp). En algunas realizaciones descritas en el presente documento pero no reivindicadas explícitamente, el individuo tiene una fracción de eyección reducida (ICFEr). En algunas realizaciones, se predice el pronóstico de mortalidad a 1 año del individuo.

Las enfermedades cardiovasculares afectan a múltiples procesos biológicos y tejidos. Ejemplos de sistemas y procesos biológicos asociados a las enfermedades cardiovasculares son inflamación, trombosis, angiogénesis asociada a la enfermedad, activación de plaquetas, activación de macrófagos, respuesta aguda del hígado, remodelación de la matriz extracelular y función renal. Estos procesos pueden observarse en función del sexo, el estado menopáusico y la edad, y según el estado de la coagulación y la función vascular. Dado que estos sistemas se comunican parcialmente a través de sistemas de señalización basados en proteínas, y pueden medirse múltiples proteínas en una sola muestra de sangre, la invención proporciona una única muestra, ensayo único basado en múltiples proteínas centrado en proteínas de los sistemas y procesos biológicos específicos implicados en la insuficiencia cardíaca crónica.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento pero no reivindicadas explícitamente, se proporcionan métodos para cribar en un sujeto el riesgo de un acontecimiento cardiovascular (CV), comprendiendo dicho método la formación de un panel de biomarcadores que tiene N proteínas biomarcadoras y la detección del nivel de cada una de las N proteínas biomarcadoras en una muestra del sujeto, en donde N es al menos 2, y en donde a) al menos dos de las N proteínas biomarcadoras se seleccionan entre HCC-1, RNAS6, PAP1, SVEP1 y ATL2; o b) al menos una de las N proteínas biomarcadoras se selecciona entre HCC-1, RNAS6, PAP1, SVEP1 y ATL2, y al menos una de las N proteínas biomarcadoras N se selecciona entre pro-BNP N-terminal, RSPO4, Bn P, MIC-1, FABPA, ILRL1, ANGP2, HE4, TAGL, RNAS1 y TSP2.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento pero no reivindicadas explícitamente, se proporcionan métodos para predecir la probabilidad de que un sujeto sufra un acontecimiento CV, comprendiendo dicho método la formación de un panel de biomarcadores que tiene N proteínas biomarcadoras y la detección del nivel de cada una de las N proteínas biomarcadoras en una muestra del sujeto, en donde N es al menos 2, y en donde a) al menos dos de las N proteínas biomarcadoras se seleccionan entre HCC-1, RNAS6, PAP1, SVEP1 y ATL2; o b) al menos una de las N proteínas biomarcadoras se selecciona entre HCC-1, RNAS6, PAP1, SVEP1 y ATL2, y al menos una de las N proteínas biomarcadoras N se selecciona entre pro-BNP N-terminal, RSPO4, B<n>P, MIC-1, FABPA, ILRL1, ANGP2, HE4, TAGL, RNAS1 y TSP2.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento pero no reivindicadas explícitamente, al menos dos de las N proteínas biomarcadoras son RNAS6 y PAP1. En algunas realizaciones, al menos dos de las N proteínas biomarcadoras son RNAS6 y ATL2. En algunas realizaciones, al menos dos de las N proteínas biomarcadoras son HCC-1 y PAP1. En algunas realizaciones, al menos dos de las N proteínas biomarcadoras son HCC-1 y ATL2. En algunas realizaciones, al menos dos de las N proteínas biomarcadoras son HCC-1 y RNAS6. En algunas realizaciones, al menos dos de las N proteínas biomarcadoras son PAP1 y SVEP1. En algunas realizaciones, al menos dos de las N proteínas biomarcadoras son HCC-1 y SVEP1. En algunas realizaciones, al menos dos de las N proteínas biomarcadoras son RNAS6 y SVEP1. En algunas realizaciones, al menos dos de las N proteínas biomarcadoras son PAP1 y ATL2. En algunas realizaciones, todas las N proteínas biomarcadoras se seleccionan entre HCC-1, RNAS6, PAP1, SVEP1, ATL2, pro-BNP N-terminal, RSPO4, BNP, MIC-1, FABPA, ILRL1, ANGP2, HE4, TAGL, RNAS1 y TSP2. En algunas realizaciones, una de las N proteínas biomarcadoras es MIC-1. En algunas realizaciones, una de las N proteínas biomarcadoras es RNAS1. En cualquiera de las realizaciones anteriores, N es 2, N es 3, N es 4, N es 5, N es 6, N es 7, N es 8, N es 9, N es 10, N es 11, N es 12, N es 13, N es 14, N es 15 o N es 16. En algunas realizaciones, el sujeto tiene insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida.

En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para predecir, cribando el riesgo de un acontecimiento cardiovascular (CV) en un sujeto, comprendiendo el método la formación de un panel de biomarcadores que tiene N proteínas biomarcadoras y la detección del nivel de cada una de las N proteínas biomarcadoras en una muestra del sujeto, en donde N es al menos 3, en donde al menos una de las N proteínas biomarcadoras se selecciona entre RET y CRDL1, y al menos una de las proteínas N biomarcadoras es MIC-1, y al menos una de las proteínas N biomarcadoras se selecciona entre tetranectina, pro-BNP N-terminal, TNNT2, CA125, SLPI, HE4, MMP-12, HSPB6, WISP-2, GHR y IGFBP-2.

En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para predecir la probabilidad de que un sujeto sufra un acontecimiento CV, comprendiendo el método la formación de un panel de biomarcadores que tiene N proteínas biomarcadoras y la detección del nivel de cada una de las N proteínas biomarcadoras en una muestra del sujeto, en donde N es al menos 3, en donde al menos una de las N proteínas biomarcadoras se selecciona entre RET y CRDL1, y al menos una de las proteínas N biomarcadoras es MIC-1, y al menos una de las proteínas N biomarcadoras se selecciona entre tetranectina, pro-BNP N-terminal, TNNT2, CA125, SLPI, HE4, MMP-12, HSPB6, WISP-2, GHR y IGFBP-2.

En realizaciones de la invención, al menos dos de las N proteínas biomarcadoras son RET y CRDL1 y al menos una de las N proteínas biomarcadoras es MIC-1. En algunas realizaciones, una de las N proteínas biomarcadoras es HE4. En algunas realizaciones, una de las N proteínas biomarcadoras es tetranectina. En algunas realizaciones, una de las N proteínas biomarcadoras es GHR. En algunas realizaciones, una de las N proteínas biomarcadoras es CA125. En algunas realizaciones, una de las N proteínas biomarcadoras es pro-BNP N-terminal. En algunas realizaciones, una de las N proteínas biomarcadoras es IGFBP-2. En algunas realizaciones, una de las N proteínas biomarcadoras es WISP-2. En algunas realizaciones, una de las N proteínas biomarcadoras es TNNT2. En algunas realizaciones, una de las N proteínas biomarcadoras es HSPB6. En algunas realizaciones, una de las N proteínas biomarcadoras es SLPI. En algunas realizaciones, una de las N proteínas biomarcadoras es MMP-12. En algunas realizaciones, todas las N proteínas biomarcadoras se seleccionan entre RET, CRDL1, tetranectina, pro-BNP N-terminal, TNNT2, CA125, MIC-1, SLPI, HE4, MMP-12, HSPB6, WISP-2, GHR y IGFBP-2. En cualquiera de las enmiendas anteriores, N es 3, N es 4, N es 5, N es 6, N es 7, N es 8, N es 9, N es 10, N es 11, N es 12, N es 13 o N es 14. En realizaciones de la invención, el sujeto sufre insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada.

En diversas realizaciones, el acontecimiento CV es la muerte.

En algunas realizaciones, el riesgo o la probabilidad de que el sujeto sufra un acontecimiento CV dentro de 1 año desde la fecha en que se tomó la muestra del sujeto se cribó o se predijo. En algunas realizaciones, el riesgo o la probabilidad de que el sujeto sufra un acontecimiento CV dentro de 180 días desde la fecha en que se tomó la muestra del sujeto se cribó o se predijo. En algunas realizaciones, el riesgo o la probabilidad de que el sujeto sufra un acontecimiento CV dentro de 90 días desde la fecha en que se tomó la muestra del sujeto se cribó o se predijo. En algunas realizaciones, el riesgo o la probabilidad de que el sujeto sufra un CV en el plazo de 1 año, 180 días o 90 días desde la fecha en que se tomó la muestra del sujeto es alto si los niveles de cada una de al menos 2 de las N proteínas biomarcadoras son anormales en relación con un nivel de control de la proteína biomarcadora respectiva. En algunas realizaciones, el riesgo o la probabilidad de que el sujeto sufra un CV en el plazo de 1 año, 180 días o 90 días desde la fecha en que se tomó la muestra del sujeto es alto si los niveles de cada una de las N proteínas biomarcadoras son anormales en relación con un nivel de control de la proteína biomarcadora respectiva. En algunas realizaciones, el riesgo o la probabilidad de que el sujeto sufra un acontecimiento CV en el plazo de 1 año, 180 días o 90 días desde la fecha en que se tomó la muestra del sujeto se calcula como una probabilidad de supervivencia a 1 año, 180 días o 90 días a partir de la fecha en que se tomó la muestra del sujeto.

En realizaciones de la invención, la muestra es una muestra de suero. En algunas realizaciones, el método se realizain vitro.

En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto las proteínas biomarcadoras de la muestra procedente del sujeto con un conjunto de reactivos de captura, en donde cada reactivo de captura del conjunto de reactivos de captura se une específicamente a una proteína biomarcadora detectada. En algunas realizaciones, dos de los reactivos de captura se unen a la misma proteína biomarcadora que se está detectando. En algunas realizaciones, dos reactivos de captura se unen específicamente a SVEP1 y en donde los dos reactivos de captura son aptámeros que comprenden secuencias diferentes. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto las proteínas biomarcadoras de la muestra procedente del sujeto con un conjunto de reactivos de captura, en donde cada reactivo de captura del conjunto de reactivos de captura se une específicamente a una proteína biomarcadora diferente que se esté detectando. En algunas realizaciones, cada reactivo de captura es un anticuerpo o un aptámero. En algunas realizaciones, cada reactivo de captura de biomarcadores es un aptámero. En algunas realizaciones, al menos un aptámero es un aptámero de velocidad de disociación lenta. En algunas realizaciones, al menos un aptámero de velocidad de disociación lenta comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos 10 nucleótidos con modificaciones. En algunas realizaciones, cada aptámero de velocidad de disociación lenta se une a su proteína diana con una velocidad de disociación (t1^ ) de • 30 minutos, • 60 minutos, • 90 minutos, • 120 minutos, • 150 minutos, • 180 minutos, • 210 minutos o • 240 minutos.

En algunas realizaciones, el riesgo o la probabilidad de un acontecimiento CV se basa en los niveles de biomarcadores detectados y en al menos un elemento de información biomédica adicional seleccionado desde a) información correspondiente a descriptores físicos del sujeto, b) información correspondiente a un cambio de peso del sujeto, c) información correspondiente a la etnia del sujeto, d) información correspondiente al sexo del sujeto, e) información correspondiente al historial de tabaquismo del sujeto, f) información correspondiente al historial de consumo de alcohol del sujeto, g) información correspondiente al historial profesional del sujeto, h) información correspondiente a los antecedentes familiares del sujeto de enfermedades cardiovasculares u otras afecciones del sistema circulatorio, i) información correspondiente a la presencia o ausencia en el sujeto de al menos un marcador genético correlacionado con un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular en el sujeto o en un miembro de su familia, j) información correspondiente a los síntomas clínicos del sujeto, k) información correspondiente a otras pruebas de laboratorio, l) información correspondiente a los valores de expresión génica del sujeto y m) información correspondiente al consumo por parte del sujeto de factores de riesgo cardiovascular conocidos, tales como una dieta rica en grasas saturadas, rica en sal, rica en colesterol, n) información correspondiente a los resultados de las imágenes del sujeto obtenidas mediante técnicas se seleccionan del grupo que consiste en el electrocardiograma, ecocardiografía, ecografía carotídea para el grosor de la íntima-media, dilatación mediada por flujo, velocidad de la onda de pulso, índice tobillobrazo, ecocardiografía de esfuerzo, imágenes de perfusión miocárdica, calcio coronario mediante TC, angiografía por TC de alta resolución, imágenes por resonancia magnética y otras modalidades de imagen, o) información relativa a la medicación del sujeto, p) información correspondiente a la edad del sujeto y q) información relativa a la función renal del sujeto.

En algunas realizaciones, el al menos un elemento de información biomédica adicional es información correspondiente a la edad del sujeto. En algunas realizaciones, el método comprende la determinación del riesgo o la probabilidad de que se produzca un acontecimiento CV con el fin de determinar una prima de seguro médico o de seguro de vida. En algunas realizaciones, el método comprende además la determinación de la cobertura o la prima del seguro médico o del seguro de vida. En algunas realizaciones, el método comprende además usar la información resultante del método para predecir y/o gestionar la utilización de los recursos médicos. En algunas realizaciones, el método comprende además usar la información resultante del método para tomar la decisión de adquirir o comprar una consulta médica, hospital o empresa.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento pero no reivindicadas explícitamente, se proporciona un kit, comprendiendo el kit N reactivos de captura de proteínas biomarcadoras, en donde N es al menos 2 y en donde al menos uno de los reactivos de captura se une a HCC-1, RNAS6, PAP1, SVEP1 o ATL2, y al menos uno de los reactivos de captura se une a pro-BNP N-terminal, RSPO4, BNP, MIC-1, FABPA, ILRL1, ANGP2, HE4, TAGL, RNAS1 o TSP2. En algunas realizaciones, dos de los reactivos de captura se unen a SVEP1 y cada uno de los reactivos de captura restantes se une a una proteína diferente seleccionada de HCC-1, RNAS6, PAP1, ATL2, pro-BNP N-terminal,<r>S<p>O4, BNP, MIC-1, FABPA, ILRL1, ANGP2, HE4, TAGL, RNAS1 y TSP2. En algunas realizaciones, se proporciona un kit, comprendiendo el kit N reactivos de captura de proteínas biomarcadoras, en donde N es al menos 2 y en donde al menos uno de los reactivos de captura se une a r Et o CRDL1 y al menos uno de los reactivos de captura se une a tetranectina, pro-BNP N-terminal, TNNT2, CA125, MIC-1, SLPI, HE4, MMP-12, HSPB6, WISP-2, GHR o IGFBP-2. En algunas realizaciones, cada reactivo de captura se une a una proteína biomarcadora diferente. En algunas realizaciones, N es 2, N es 3, N es 4, N es 5, N es 6, N es 7, N es 8, N es 9, N es 10, N es 11, N es 12, N es 13, N es 14, N es 15, N es 16 o N es 17. En algunas realizaciones, N es 2, N es 3 o N es 4 o N es 5 o N es 6 o N es 7 o N es 8 o N es 9 o N es 10 o N es 11 o N es 12 o N es 13 o N es 14.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento pero no reivindicadas explícitamente, cada uno de los N reactivos de captura de proteínas biomarcadoras se une específicamente a una proteína biomarcadora seleccionada de la Tabla 1. En algunas realizaciones de la invención, cada uno de los N reactivos de captura de proteínas biomarcadoras se une específicamente a una proteína biomarcadora seleccionada de la Tabla 2. En algunas realizaciones, cada uno de los N reactivos de captura de biomarcadores es un anticuerpo o un aptámero. En algunas realizaciones, cada reactivo de captura de biomarcadores es un aptámero. En algunas realizaciones, al menos un aptámero es un aptámero de velocidad de disociación lenta. En algunas realizaciones, al menos un aptámero de velocidad de disociación lenta comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos 10 nucleótidos con modificaciones. En algunas realizaciones, en donde cada aptámero de velocidad de disociación lenta se une a su proteína diana con una velocidad de disociación (t1^ ) de • 30 minutos, • 60 minutos, • 90 minutos, • 120 minutos, • 150 minutos, • 180 minutos, • 210 minutos o • 240 minutos. En algunas realizaciones, el kit es para su uso en la detección de las N proteínas biomarcadoras en una muestra de un sujeto. En algunas realizaciones, el kit es para su uso en la determinación del riesgo o probabilidad del sujeto de experimentar un acontecimiento CV dentro de 1 año desde la fecha en que se tomó la muestra del sujeto, en donde el sujeto sufre insuficiencia cardíaca. En algunas realizaciones, el acontecimiento CV es la muerte. En algunas realizaciones, el sujeto tiene insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida. En algunas realizaciones, el sujeto sufre insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la probabilidad de supervivencia Kaplan-Meier observada del conjunto de datos de entrenamiento del modelo ICFEr, con los individuos divididos en cuartiles según la probabilidad de acontecimiento prevista a los 365 días. Los cuartiles 1° y 4° se describen con la línea superior (Cuartil 1), segunda línea inferior (Cuartil 2), tercera línea inferior (Cuartil 3) y línea inferior (Cuartil 4).

Las Figuras 2A-2B muestran las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para cada cuartil del conjunto de datos de validación para el modelo de ICFEr. Las regiones sombreadas de la Figura 2B representan intervalos de confianza del 95 % de las estimaciones de Kaplan-Meier.

La Figura 3 muestra la probabilidad de supervivencia Kaplan-Meier observada del conjunto de datos de entrenamiento del modelo ICFEp, con los individuos divididos en cuartiles según la probabilidad de acontecimiento prevista a los 365 días. Los cuartiles 1° y 4° se describen con la línea superior (Cuartil 1), segunda línea inferior (Cuartil 2), tercera línea inferior (Cuartil 3) y línea inferior (Cuartil 4). Las regiones sombreadas representan intervalos de confianza del 95 % de las estimaciones de Kaplan-Meier.

La Figura 4 muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para cada cuartil del conjunto de datos de validación para el modelo de ICFEp. Las regiones sombreadas representan intervalos de confianza del 95 % de las estimaciones de Kaplan-Meier.

La Figura 5 ilustra un sistema informático de ejemplo no limitativo para usar con varios métodos implementados en ordenador descritos en el presente documento.

La Figura 6 ilustra un ensayo de ejemplo no limitativo con aptámeros que puede usarse para detectar uno o más biomarcadores en una muestra biológica.

Las Figuras 7-9 muestran ciertas pirimidinas modificadas de ejemplo que pueden incorporarse a los aptámeros, tal como los aptámeros de velocidad de disociación lenta.

Descripción detallada

Aunque la invención se describirá junto con determinadas realizaciones representativas, se entenderá que la invención se define mediante las reivindicaciones y no se limita a esas realizaciones.

Un experto en la materia reconocerá que muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos actualmente pueden utilizarse en la práctica de la presente invención. La presente invención no se limita en modo alguno a los métodos y materiales descritos.

A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquiera de los métodos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o el ensayo de la invención, determinados métodos, dispositivos y materiales se describen en el presente documento.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "contiene", "que contiene", y cualquier variación de los mismos, pretenden abarcar una inclusión no exclusiva, de modo que un proceso, método, producto por proceso o composiciones de materia que comprende, incluye o contiene un elemento o una lista de elementos puede incluir otros elementos no enumerados expresamente.

La presente solicitud incluye biomarcadores, métodos, dispositivos, reactivos, sistemas y kits para la predicción del riesgo de acontecimientos CV a corto plazo dentro de un periodo de tiempo definido, tal como dentro de 90 días, 180 días o 1 año.

Como se usan en el presente documento, un "acontecimiento cardiovascular" o "acontecimiento CV" engloba ampliamente ictus, un accidente isquémico transitorio (AIT), un infarto de miocardio (IM), muerte y/u hospitalización por insuficiencia cardíaca, en un sujeto con insuficiencia cardíaca crónica. En algunas realizaciones, un "acontecimiento cardiovascular" es la hospitalización por insuficiencia cardíaca o la muerte. En algunas realizaciones, un "acontecimiento cardiovascular" es la hospitalización por insuficiencia cardíaca. En algunas realizaciones, un "acontecimiento cardiovascular" es la muerte.

Como se usan en el presente documento, la expresión "insuficiencia cardíaca" o "IC" se refiere a un síndrome clínico complejo que resulta de cualquier alteración estructural o funcional del llenado ventricular o de la eyección de sangre. Las manifestaciones típicas de la IC son disnea y fatiga, que puede limitar la tolerancia al ejercicio y la retención de líquidos, y que puede provocar congestión pulmonar y/o esplácnica y/o edema periférico. El síndrome clínico de la IC puede deberse a trastornos del pericardio, miocardio, endocardio, válvulas cardíacas o grandes vasos, o de ciertas anomalías metabólicas. Muchos pacientes con IC tienen síntomas debidos al deterioro de la función miocárdica del ventrículo izquierdo (VI). (Yancyet al.,Guía 2013 de la ACCF/AHA para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca: A report of the American college of cardiology foundation/American heart association task force on practice guidelines. J Amer College Cardiol, 62(16), e147-e239. (2013).) Como se usan en el presente documento, la expresión "insuficiencia cardiaca crónica" o "ICC" se refiere a una insuficiencia cardiaca crónica estable, a menos que se indique lo contrario.

Como se usan en el presente documento, la expresión "fracción de eyección" o "FE" se refiere a la fracción (porcentaje) de sangre de salida bombeada desde el corazón con cada contracción. Se suele medir mediante ecocardiograma y sirve como medida general de la función cardiaca de un sujeto. Puede medirse como la cantidad de sangre que se bombea desde el ventrículo izquierdo del corazón con cada contracción. Puede medirse como la cantidad de sangre que se bombea desde el ventrículo izquierdo del corazón hacia los pulmones. Como se usan en el presente documento, la expresión "fracción de eyección" o "FE" se refiere a la fracción de eyección del ventrículo izquierdo, a menos que se indique de otro modo. Los pacientes con una fracción de eyección del 50 % o superior se clasifican como "insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada" (ICFEp) y los pacientes con una fracción de eyección del y los pacientes con una fracción de eyección inferior al 40 % se clasifican como "insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida" (ICFEr). (Ponikowski P, Voors A, Anker S,et al.2016 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure. Eur J Heart Fail. 2016; 37: 2129-200.)

En algunas realizaciones, los biomarcadores se proporcionan para usar solos o en varias combinaciones para evaluar el riesgo o la probabilidad de un acontecimiento CV futuro dentro de un periodo de tiempo de 1 año con acontecimientos CV definidos como hospitalización por insuficiencia cardiaca o muerte. Como se describe en detalle a continuación, las realizaciones de ejemplo incluyen los biomarcadores proporcionados en la Tabla 1 o en la Tabla 2.

Aunque algunos de los biomarcadores de acontecimientos CV descritos pueden ser útiles por sí solos para evaluar el riesgo o la probabilidad de un acontecimiento CV, en el presente documento también se describen métodos para agrupar múltiples subconjuntos de biomarcadores de acontecimientos CV, donde cada agrupación o selección de subconjuntos es útil como panel de dos o más biomarcadores, se denominan indistintamente en el presente documento "panel de biomarcadores" y "panel". En algunas realizaciones, el acontecimiento CV es la muerte. Por lo tanto, diversas realizaciones proporcionan combinaciones que comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece, al menos catorce, al menos quince o los dieciséis biomarcadores de la Tabla 1. Otras diversas realizaciones proporcionan combinaciones que comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece o los catorce biomarcadores de la Tabla 2.

"Muestra biológica", "muestra" y "muestra de ensayo" se usan en el presente documento indistintamente para referirse a cualquier material, líquido biológico, tejido o célula obtenidos o derivados de otro modo de un individuo. Esto incluye sangre (incluida sangre entera, leucocitos, células mononucleares de sangre periférica, capa leucocitaria, plasma y suero), esputo, lágrimas, moco, lavados nasales, aspirado nasal, orina, saliva, lavados peritoneales, ascitis, fluido quístico, fluido glandular, líquido linfático, aspirado bronquial, líquido sinovial, aspirado articular, secreciones de órganos, células, un extracto celular y líquido cefalorraquídeo. Esto incluye también fracciones separadas experimentalmente de todo lo anterior. Por ejemplo, una muestra de sangre puede fraccionarse en suero, plasma o en fracciones que contengan tipos particulares de células sanguíneas, tales como glóbulos rojos o glóbulos blancos (leucocitos). En algunas realizaciones, una muestra de sangre es una mancha de sangre seca. En algunas realizaciones, una muestra de plasma es una mancha de plasma seca. En algunas realizaciones, una muestra puede ser una combinación de muestras de un individuo, tal como una combinación de una muestra de tejido y de fluido. La expresión "muestra biológica" incluye también los materiales que contienen material sólido homogeneizado, tal como una muestra de heces, una muestra de tejido o una biopsia de tejido, por ejemplo. La expresión "muestra biológica" incluye también los materiales derivados de un cultivo de tejidos o de células. Pueden emplearse cualesquiera métodos adecuados para obtener una muestra biológica; los métodos de ejemplo incluyen, por ejemplo, flebotomía, hisopo (por ejemplo, hisopo bucal) y un procedimiento de biopsia por aspiración con aguja fina. Entre los tejidos susceptibles de aspiración con aguja fina se incluyen ganglios linfáticos, pulmón, tiroides, mama, páncreas e hígado. También se pueden recoger muestras, por ejemplo, mediante microdisección (por ejemplo, microdisección por captura láser (LCM) o microdisección láser (LMD)), lavado de la vejiga, frotis (por ejemplo, un frotis PAP) o lavado ductal. Una "muestra biológica" obtenida o derivada de un individuo incluye cualquier muestra de este tipo que haya sido procesada de cualquier manera adecuada después de haber sido obtenida del individuo. En algunas realizaciones, una muestra biológica es una muestra de plasma.

Además, en algunas realizaciones, una muestra biológica puede obtenerse tomando muestras biológicas de varios individuos y agrupándolas, o agrupando una alícuota de la muestra biológica de cada individuo. La muestra agrupada puede tratarse como se describe en el presente documento para una muestra de un solo individuo, y, por ejemplo, si se establece un mal pronóstico en la muestra agrupada, a continuación, cada muestra biológica individual puede volver a analizarse para determinar qué individuo(s) tiene(n) un riesgo mayor o menor de sufrir un acontecimiento CV, tal como la muerte.

A efectos de esta memoria descriptiva, se entiende que la expresión "datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo" significa que los datos en alguna forma se derivan de, o se generaron usando, la muestra biológica del individuo. Los datos pueden haber sido reformateados, revisados o alterados matemáticamente en algún grado después de haber sido generados, tal como la conversión de unidades de un sistema de medición a unidades de otro sistema de medición; pero, se entiende que los datos se derivan de, o se generaron usando, la muestra biológica.

"Diana", "molécula diana" y "analito" se usan en el presente documento indistintamente para hacer referencia a cualquier molécula de interés que pueda estar presente en una muestra biológica. Una "molécula de interés" incluye cualquier variación menor de una molécula en particular, tal como, en el caso de una proteína, por ejemplo, pequeñas variaciones en la secuencia de aminoácidos, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje, que no altera sustancialmente la identidad de la molécula. Una "molécula diana", "diana" o "analito" se refiere a un conjunto de copias de un tipo o especie de molécula o estructura multimolecular. Entre las moléculas diana de ejemplo se incluyen proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos, polisacáridos, glicoproteínas, hormonas, receptores, antígenos, anticuerpos, affybodies, imitadores de anticuerpos, virus, los patógenos, sustancias tóxicas, sustratos, metabolitos, análogos del estado de transición, cofactores, inhibidores, fármacos, colorantes, nutrientes, factores de crecimiento, células, tejidos y cualquier fragmento o porción de cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, una molécula diana es una proteína, en cuyo caso la molécula diana puede denominarse "proteína diana".

Como se usan en el presente documento, un "agente de captura" o "reactivo de captura" se refiere a una molécula capaz de unirse específicamente a un biomarcador. Un "reactivo de captura de proteínas diana" se refiere a una molécula capaz de unirse específicamente a una proteína diana. Entre los reactivos de captura de ejemplo no limitantes se incluyen aptámeros, anticuerpos, adnectinas, anquirinas, otros miméticos de anticuerpos y otras estructuras de soporte de proteínas, autoanticuerpos, quimeras, moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, lectinas, receptores de unión a ligandos, polímeros con huella molecular, avímeros, peptidomiméticos, receptores hormonales, receptores de citoquinas, receptores sintéticos, y modificaciones y fragmentos de cualquiera de los reactivos de captura mencionados. En algunas realizaciones, un reactivo de captura se selecciona entre un aptámero y un anticuerpo.

El término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos de longitud completa de cualquier especie y a fragmentos y derivados de dichos anticuerpos, incluidos fragmentos Fab, fragmentos F(ab')<2>, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fv y fragmentos Fv de cadena simple. El término "anticuerpo" también se refiere a los anticuerpos derivados sintéticamente, tales como anticuerpos y fragmentos derivados de la exposición en fagos, affybodies, nanocuerpos, etc.

Como se usan en el presente documento, "marcador" y "biomarcador" se usan indistintamente para hacer referencia a una molécula diana que indica o es signo de un proceso normal o anormal en un individuo o de una enfermedad u otra afección en un individuo. Más específicamente, un "marcador" o "biomarcador" es un parámetro anatómico, fisiológico, bioquímico o molecular asociado a la presencia de un estado o proceso fisiológico específico, ya sea normal o anormal, y, si es anormal, si es crónico o agudo. Los biomarcadores son detectables y medibles mediante diversos métodos, incluidos los ensayos de laboratorio y el diagnóstico médico por imagen. En algunas realizaciones, un biomarcador es una proteína diana.

Como se usan en el presente documento, "nivel de biomarcador" y "nivel" se refieren a una medición que se realiza utilizando cualquier método analítico para detectar el biomarcador en una muestra biológica y que indica la presencia, ausencia, cantidad o concentración absoluta, cantidad o concentración relativa, título, un nivel, un nivel de expresión, una relación de los niveles medidos o similares, de, para o correspondiente al biomarcador en la muestra biológica. La naturaleza exacta del "nivel" depende del diseño y los componentes específicos del método analítico concreto empleado para detectar el biomarcador.

Cuando un biomarcador indica o es signo de un proceso anormal o de una enfermedad u otra afección en un individuo, dicho biomarcador se describe generalmente como sobreexpresado o subexpresado en comparación con un nivel o valor de expresión del biomarcador que indica o es signo de un proceso normal o de la ausencia de una enfermedad u otra afección en un individuo. "Regulación positiva", "regulado de forma positiva", "sobreexpresión", "sobreexpresado" y cualquiera de sus variaciones se utilizan indistintamente para referirse a un valor o nivel de un biomarcador en una muestra biológica que es superior a un valor o nivel (o intervalo de valores o niveles) del biomarcador que se detecta normalmente en muestras biológicas similares de individuos sanos o normales. Los términos y expresiones también pueden referirse a un valor o nivel de un biomarcador en una muestra biológica que es mayor que un valor o nivel (o intervalo de valores o niveles) del biomarcador que puede detectarse en una fase diferente de una enfermedad concreta.

"Regulación negativa", "regulado de forma negativa", "subexpresión", "sobreexpresado" y cualquiera de sus variaciones se utilizan indistintamente para referirse a un valor o nivel de un biomarcador en una muestra biológica que es inferior a un valor o nivel (o intervalo de valores o niveles) del biomarcador que se detecta normalmente en muestras biológicas similares de individuos sanos o normales. Los términos y expresiones también pueden referirse a un valor o nivel de un biomarcador en una muestra biológica que es menor que un valor o nivel (o intervalo de valores o niveles) del biomarcador que puede detectarse en una fase diferente de una enfermedad concreta.

Además, un biomarcador que está sobreexpresado o subexpresado también puede denominarse "diferencialmente expresado" o que tiene un "nivel diferencial" o un "valor diferencial" en comparación con un nivel o valor de expresión "normal" del biomarcador que indica o es un signo de un proceso normal o de ausencia de una enfermedad u otra afección en un individuo. Por lo tanto, la "expresión diferencial" de un biomarcador también puede denominarse variación desde un nivel de expresión "normal" del biomarcador.

Un "nivel de control" de una molécula diana se refiere al nivel de la molécula diana en el mismo tipo de muestra procedente de un individuo que no padece la enfermedad o afección, o de un individuo del que no se sospecha que padezca la enfermedad o afección o que corre el riesgo de padecerla, o de un individuo que ha tenido un acontecimiento cardiovascular primario o primero pero no un acontecimiento cardiovascular secundario, o de un individuo que padece una enfermedad cardiovascular estable. El nivel de control puede referirse al nivel medio de la molécula diana en muestras de una población de individuos que no tiene la enfermedad o afección, o que no es sospechosa de tener la enfermedad o afección o que corre el riesgo de sufrirla o que ha tenido un acontecimiento cardiovascular primario o primero pero no un acontecimiento cardiovascular secundario, o que tiene una enfermedad cardiovascular estable o una combinación de las mismas.

Como se usan en el presente documento, "individuo", "sujeto", y "paciente" se usan indistintamente para referirse a un mamífero. Un individuo mamífero puede ser humano o no humano. En diversas realizaciones, el individuo es un ser humano. Un individuo sano o normal es un individuo en el que la enfermedad o afección de interés (incluidas, por ejemplo, insuficiencia cardiaca crónica y acontecimientos cardiovasculares tales como infarto de miocardio, ictus y hospitalización por insuficiencia cardiaca) no es detectable por los métodos de diagnóstico convencionales.

"Diagnosticar", "que diagnostica", "diagnóstico" y sus variaciones se refieren a la detección, determinación o reconocimiento del estado o condición de salud de una persona basándose en uno o más signos, síntomas, datos u otra información relativa a dicho individuo. El estado de salud de un individuo puede diagnosticarse como sano/normal (es decir, un diagnóstico de ausencia de una enfermedad o afección) o diagnosticado como enfermo/anormal (es decir, un diagnóstico de la presencia o una evaluación de las características, de una enfermedad o afección). Los términos "diagnosticar", "que diagnostica", "diagnóstico", etc., abarcan, con respecto a una enfermedad o afección en particular, la detección inicial de la enfermedad; la caracterización o clasificación de la enfermedad; la detección de la progresión, remisión o recurrencia de la enfermedad; y la detección de la respuesta de la enfermedad tras la administración de un tratamiento o terapia al individuo. La predicción del riesgo de un acontecimiento CV incluye distinguir a los individuos que tienen un mayor riesgo de un acontecimiento CV de los individuos que no lo tienen.

"Pronosticar", "que pronostica", "pronóstico" y sus variantes se refieren a la predicción de la evolución futura de una enfermedad o afección en un individuo que la tiene (por ejemplo, predecir la supervivencia del paciente), y tales términos abarcan la evaluación de la respuesta de la enfermedad o afección tras la administración de un tratamiento o terapia al individuo.

"Evaluar", "que evalúa", "evaluación" y sus variantes abarcan tanto "diagnosticar" como "pronosticar" y también comprenden determinaciones o predicciones sobre la evolución futura de una enfermedad o afección en una persona que no la padece, así como determinaciones o predicciones sobre el riesgo de que una enfermedad o afección reaparezca en una persona que aparentemente se ha curado de la enfermedad o a la que se le ha resuelto la afección. El término "evaluar" abarca también la valoración de la respuesta de un individuo a una terapia, tal como, por ejemplo, predecir si es probable que un individuo responda favorablemente a un agente terapéutico o es improbable que responda a un agente terapéutico (o experimentará efectos secundarios tóxicos o no deseables de otro tipo, por ejemplo), seleccionar un agente terapéutico para su administración a un individuo, o supervisar o determinar la respuesta de un individuo a una terapia que se le ha administrado. Por lo tanto, "evaluar" el riesgo de un acontecimiento CV puede incluir, por ejemplo, cualquiera de los siguientes: predecir el riesgo futuro de un acontecimiento CV en un individuo; predecir el riesgo de un acontecimiento CV en un individuo que aparentemente no tiene problemas CV; predecir un tipo particular de acontecimiento CV; predecir el tiempo hasta un acontecimiento CV; o determinar o predecir la respuesta de un individuo a un tratamiento CV o seleccionar un tratamiento CV para administrar a un individuo basándose en una determinación de los valores del biomarcador derivados de la muestra biológica del individuo. La evaluación del riesgo de un acontecimiento CV puede incluir realizaciones tales como la evaluación del riesgo de un acontecimiento CV en una escala continua, o la clasificación del riesgo de un acontecimiento CV en clasificaciones escalonadas. La clasificación del riesgo incluye, por ejemplo, la clasificación en dos o más clasificaciones, tal como "Sin riesgo elevado de un acontecimiento CV"; "riesgo elevado de un acontecimiento CV"; y/o "riesgo de acontecimiento CV por debajo de la media". En algunas realizaciones, la evaluación del riesgo de un acontecimiento CV es para un periodo definido. Los periodos definidos a modo de ejemplo no limitativos incluyen 90 días, 180 días y 1 año. En diversas realizaciones, el acontecimiento CV es la muerte.

Como se usan en el presente documento, "información biomédica adicional" se refiere a uno o más evaluaciones de un individuo, distintos del uso de cualquiera de los biomarcadores descritos en el presente documento, que se asocian con el riesgo CV o, más específicamente, riesgo de acontecimientos CV. "Información biomédica adicional" incluye cualquiera de los siguientes: descriptores físicos de un individuo, incluyendo la estatura y/o el peso de un individuo; la edad de un individuo; el sexo de un individuo; el cambio en el peso; la etnia de un individuo; historial laboral; los antecedentes familiares de enfermedades cardiovasculares (u otros trastornos del sistema circulatorio); la presencia de uno o varios marcadores genéticos correlacionados con un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular (u otros trastornos del sistema circulatorio) en el individuo o en un miembro de su familia alteraciones del grosor de la íntima carotídea; síntomas clínicos tales como dolor torácico, valores de expresión génica asociados a ganancia o pérdida de peso; descriptores físicos de un individuo, incluidos los descriptores físicamente observados mediante imágenes radiológicas; estado de tabaquismo; historial de consumo de alcohol; historial laboral; hábitos alimentarios, ingesta de sal, grasas saturadas y colesterol; consumo de cafeína; e información de pruebas de imagen tal como electrocardiograma, ecocardiografía, ecografía carotídea para el grosor de la íntima-media, dilatación mediada por flujo, velocidad de la onda de pulso, índice tobillo-brazo, ecocardiografía de esfuerzo, imágenes de perfusión miocárdica, calcio coronario mediante TC, angiografía por TC de alta resolución, imágenes por resonancia magnética y otras modalidades de imagen; y la medicación del individuo. Análisis de los niveles de biomarcadores junto con una evaluación de cualquier información biomédica adicional, incluidas otras pruebas de laboratorio (por ejemplo, pruebas de HDL, LDL, niveles de CRP, pruebas de Nt-proBNP, pruebas de BNP, pruebas de troponina de alta sensibilidad, pruebas de galectina-3, análisis de seroalbúmina, pruebas de creatina), pueden, por ejemplo, mejorar la sensibilidad, especificidad y/o AUC para la predicción de acontecimientos CV en comparación con las pruebas de biomarcadores solas o la evaluación de cualquier elemento particular de información biomédica adicional sola (por ejemplo, imágenes del espesor de la íntima carotídea). Puede obtenerse información biomédica adicional de un individuo utilizando técnicas rutinarias conocidas en la técnica, tal como de la propia persona mediante el uso de un cuestionario rutinario para pacientes o un cuestionario de historial médico, etc., o de un médico, etc. El análisis de los niveles de biomarcadores junto con una evaluación de cualquier información biomédica adicional puede, por ejemplo, mejorar la sensibilidad, la especificidad y/o los umbrales para la predicción de acontecimientos CV (u otros usos relacionados con el sistema cardiovascular) en comparación con las pruebas de biomarcadores por sí solas o la evaluación de cualquier elemento particular de información biomédica adicional por sí sola (por ejemplo, imágenes de TC solo).

Como se usan en el presente documento, "detectar" o "determinar" con respecto a un valor de un biomarcador incluye el uso tanto del instrumento utilizado para observar y registrar una señal correspondiente al nivel de un biomarcador como del material o materiales necesarios para generar dicha señal. En diversas realizaciones, el nivel del biomarcador se detecta utilizando cualquier método adecuado, incluidos fluorescencia, quimioluminiscencia, resonancia de plasmón superficial, ondas acústicas superficiales, espectrometría de masas, espectroscopia de infrarrojos, espectroscopia Raman, microscopia de fuerza atómica, microscopía de barrido en túnel, métodos de detección electroquímica, resonancia magnética nuclear, puntos cuánticos y similares.

"Soporte sólido" se refiere en el presente documento a cualquier sustrato que tenga una superficie a la que puedan adherirse moléculas, directa o indirectamente, mediante enlaces covalentes o no covalentes. Un "soporte sólido" puede tener diversos formatos físicos, que puede incluir, por ejemplo, una membrana; un chip (por ejemplo, un chip proteínico); un portaobjetos (por ejemplo, un portaobjetos o cubreobjetos de vidrio); una columna; una partícula que contiene poros o cavidades huecas, sólidas o semisólidas, tal como, por ejemplo, una esfera; un gel; una fibra, incluyendo un material de fibra óptica; una matriz; y un receptáculo para muestras. Los receptáculos para muestras de ejemplo incluyen pocillos para muestras, tubos, capilares, viales y cualquier otro recipiente, ranura o hendidura capaz de contener una muestra. Un receptáculo para muestras puede estar contenido en una plataforma multimuestras, tal como una placa de microtitulación, portaobjetos, dispositivo de microfluidos y similares. Un soporte puede estar compuesto por un material natural o sintético, un material orgánico o inorgánico. La composición del soporte sólido sobre el que se fijan los reactivos de captura depende generalmente del método de fijación (por ejemplo, unión covalente). Otros receptáculos de ejemplo incluyen microgotículas y emulsiones oleosas/acuosas controladas por microfluidos o en volumen dentro de las cuales pueden realizarse ensayos y manipulaciones relacionadas. Entre los soportes sólidos adecuados se incluyen, por ejemplo, plásticos, resinas, polisacáridos, sílice o materiales a base de sílice, vidrio funcionalizado, silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos, membranas, nailon, fibras naturales (tales como, por ejemplo, seda, lana y algodón), polímeros y similares. El material que compone el soporte sólido puede incluir grupos reactivos tales como, por ejemplo, grupos carboxi, amino o hidroxilo, que se usan para fijar los reactivos de captura. Los soportes sólidos poliméricos pueden incluir, por ejemplo, poliestireno, tetraftalato de polietilenglicol, acetato de polivinilo, cloruro de polivinilo, polivinilpirrolidona, poliacrilonitrilo, poli(metacrilato de metilo), politetrafluoroetileno, caucho de butilo, caucho de estireno-butadieno, caucho natural, polietileno, polipropileno, (poli)tetrafluoroetileno, (poli)vinilidenfluoruro, policarbonato y polimetilpenteno. Las partículas de soporte sólido adecuadas que pueden usarse incluyen, por ejemplo, partículas codificadas, tales como partículas codificadas de tipo Luminex®, partículas magnéticas y partículas de vidrio.

Usos ilustrativos de los biomarcadores

En varias realizaciones de ejemplo, se proporcionan métodos para evaluar el riesgo de un acontecimiento CV en un individuo mediante la detección de uno o más valores de biomarcadores correspondientes a uno o más biomarcadores que están presentes en la circulación de un individuo, tal como en sangre, suero o plasma, por cualquiera de los métodos analíticos, incluyendo cualquiera de los métodos analíticos descritos en el presente documento. Estos biomarcadores, por ejemplo, se expresan de forma diferencial en individuos con mayor riesgo de sufrir un acontecimiento CV en comparación con individuos sin mayor riesgo de sufrir un acontecimiento CV. Se puede usar la detección de la expresión diferencial de un biomarcador en un individuo, por ejemplo, para permitir la predicción del riesgo de un acontecimiento CV dentro de un plazo de 90 días, 180 días o un plazo de 1 año. En diversas realizaciones, el acontecimiento CV es la hospitalización por insuficiencia cardiaca o la muerte. En diversas realizaciones, el acontecimiento CV es la muerte.

Además de analizar los niveles de biomarcadores como prueba diagnóstica independiente, los niveles de biomarcadores también pueden realizarse junto con la determinación de polimorfismos de nucleótido único (SNP) u otras lesiones o variabilidad genéticas que sean indicativas de un mayor riesgo de susceptibilidad a una enfermedad o afección. (Véase, por ejemplo, Amoset al.,Nature Genetics 40, 616-622 (2009)).

Los niveles de biomarcadores también pueden usarse junto con el cribado radiológico. Los niveles de biomarcadores también pueden usarse junto con síntomas relevantes o pruebas genéticas. La detección de cualquiera de los biomarcadores descritos en el presente documento puede ser útil una vez evaluado el riesgo de acontecimiento CV para guiar la atención clínica adecuada del individuo, incluyendo el aumento a niveles más agresivos de atención en individuos de alto riesgo después de que se haya determinado el riesgo de acontecimiento CV. Además de analizar los niveles de biomarcadores junto con síntomas o factores de riesgo relevantes, la información relativa a los biomarcadores también puede evaluarse junto con otros tipos de datos, en particular los datos que indican el riesgo de un individuo de sufrir acontecimientos cardiovasculares (por ejemplo, historial clínico del paciente, síntomas, antecedentes familiares de enfermedades cardiovasculares, antecedentes de tabaquismo o consumo de alcohol, factores de riesgo tales como la presencia de uno o varios marcadores genéticos y/o el estado de otros biomarcadores, etc.). Estos diversos datos pueden evaluarse mediante métodos automatizados, tales como un programa informático/software, que puede estar incorporado en un ordenador u otro aparato/dispositivo.

Las pruebas de biomarcadores también pueden asociarse a directrices y algoritmos de riesgo cardiovascular actualmente en uso en la práctica clínica. Por ejemplo, la puntuación de riesgo de Framingham utiliza factores de riesgo para proporcionar una puntuación de riesgo, tales factores de riesgo, incluidos los niveles de colesterol LDL y HDL, niveles de glucosa alterados, tabaquismo, presión arterial sistólica y diabetes. La frecuencia de pacientes de alto riesgo aumenta con la edad los varones comprenden una mayor proporción de pacientes de alto riesgo que las mujeres.

Cualquiera de los biomarcadores descritos puede usarse también en pruebas de imagen. Por ejemplo, puede acoplarse un agente de formación de imágenes a cualquiera de los biomarcadores descritos, que pueden utilizarse para ayudar a predecir el riesgo de sufrir un acontecimiento cardiovascular, controlar la respuesta a las intervenciones terapéuticas, seleccionar poblaciones diana en un ensayo clínico, entre otros usos.

Detección y determinación de biomarcadores y niveles de biomarcadores

Un nivel de biomarcador para los biomarcadores descritos en el presente documento puede detectarse utilizando cualquiera de diversos métodos analíticos conocidos. En una realización, se detecta el valor de un biomarcador utilizando un reactivo de captura. En diversas realizaciones, el reactivo de captura puede exponerse al biomarcador en solución o puede exponerse al biomarcador mientras el reactivo de captura está inmovilizado en un soporte sólido. En otras realizaciones, el reactivo de captura contiene una característica que es reactiva con una característica secundaria en un soporte sólido. En estas realizaciones, el reactivo de captura puede exponerse al biomarcador en solución y a continuación la característica del reactivo de captura puede utilizarse junto con la característica secundaria del soporte sólido para inmovilizar el biomarcador en el soporte sólido. El reactivo de captura se selecciona en función del tipo de análisis que se vaya a realizar. Los reactivos de captura incluyen, aunque no de forma limitativa, aptámeros, anticuerpos, adnectinas, anquirinas, otros miméticos de anticuerpos y otras estructuras de soporte de proteínas, autoanticuerpos, quimeras, moléculas pequeñas, fragmentos F(ab')<2>, fragmentos de anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fv, fragmentos Fv monocatenarios, ácidos nucleicos, lectinas, receptores de unión a ligandos, affybodies, nanocuerpos, polímeros con huella molecular, avímeros, peptidomiméticos, receptores hormonales, receptores de citoquinas y receptores sintéticos, así como sus modificaciones y fragmentos.

En algunas realizaciones, se detecta un nivel de biomarcador utilizando un complejo de reactivo biomarcador/captura.

En algunas realizaciones, el nivel del biomarcador se deriva del complejo biomarcador/reactivo de captura y se detecta indirectamente, tal como, por ejemplo, como resultado de una reacción que es posterior a la interacción biomarcador/reactivo de captura, pero depende de la formación del complejo biomarcador/reactivo de captura.

En algunas realizaciones, el nivel del biomarcador se detecta directamente a partir del biomarcador en una muestra biológica.

En algunas realizaciones, los biomarcadores se detectan utilizando un formato multiplexado que permite la detección simultánea de dos o más biomarcadores en una muestra biológica. En algunas realizaciones del formato multiplexado, se inmovilizan los reactivos de captura, directa o indirectamente, de forma covalente o no covalente, en lugares discretos sobre un soporte sólido. En algunas realizaciones, un formato multiplexado usa soportes sólidos discretos donde cada soporte sólido tiene un reactivo de captura único asociado a ese soporte sólido, tal como, por ejemplo, puntos cuánticos. En algunas realizaciones, se usa un dispositivo individual para la detección de cada uno de los múltiples biomarcadores a detectar en una muestra biológica. Los dispositivos individuales pueden configurarse para permitir el procesamiento simultáneo de cada biomarcador de la muestra biológica. Por ejemplo, una placa de microtitulación puede usarse de tal manera que cada pocillo de la placa se usa para analizar de forma única uno o más biomarcadores a detectar en una muestra biológica.

En una o más de las realizaciones anteriores, puede utilizarse un marcador fluorescente para marcar un componente del complejo biomarcador/reactivo de captura para permitir la detección del nivel del biomarcador. En diversas realizaciones, el marcador fluorescente puede conjugarse con un reactivo de captura específico para cualquiera de los biomarcadores descritos en el presente documento utilizando técnicas conocidas y el marcador fluorescente puede utilizarse entonces para detectar el nivel del biomarcador correspondiente. Los marcadores fluorescentes adecuados incluyen quelatos de tierras raras, fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, aloficocianina, PBXL-3, Qdot 605, lisamina, ficoeritrina, rojo Texas y otros compuestos similares.

En algunas realizaciones, el marcador fluorescente es una molécula de colorante fluorescente. En algunas realizaciones, la molécula de colorante fluorescente incluye al menos un sistema de anillo de indolio sustituido en el que el sustituyente en el carbono 3 del anillo de indolio contiene un grupo químicamente reactivo o una sustancia conjugada. En algunas realizaciones, la molécula colorante incluye una molécula de AlexFluor, tal como, por ejemplo, AlexaFluor 488, AlexaFluor 532, AlexaFluor 647, AlexaFluor 680 o AlexaFluor 700. En otras realizaciones, la molécula colorante incluye un primer tipo y un segundo tipo de molécula colorante, tal como, por ejemplo, dos moléculas diferentes de AlexaFluor. En algunas realizaciones, la molécula colorante incluye un primer tipo y un segundo tipo de molécula colorante y las dos moléculas colorantes tienen espectros de emisión diferentes.

La fluorescencia puede medirse con diversos instrumentos compatibles con una amplia gama de formatos de ensayo. Por ejemplo, se han diseñado espectrofluorímetros para analizar placas de microtitulación, portaobjetos de microscopio, matrices impresas, cubetas, etc. Véase Principles of Fluorescence Spectroscopy, de J.R. Lakowicz, Springer Science Business Media, Inc., 2004. Véase Bioluminescence & Chemiluminescence: Progress & Current Applications; Philip E. Stanley y Larry J. Kricka editors, World Scientific Publishing Company, enero de 2002.

En una o más realizaciones, opcionalmente, puede utilizarse un marcador de quimioluminiscencia para marcar un componente del complejo biomarcador/captura y permitir la detección de un nivel de biomarcador. Los materiales quimioluminiscentes adecuados incluyen cualquiera de cloruro de oxalilo, rodamina 6G, Ru(bipy)32+, TMAE (tetraquis(dimetilamino)etileno), pirogalol (1,2,3-trihidroxibenceno), lucigenina, peroxioxalatos, oxalatos de arilo, ésteres de acridinio, dioxetanos y otros.

En algunas realizaciones, el método de detección incluye una combinación enzima/sustrato que genera una señal detectable que corresponde al nivel del biomarcador. Por lo general, la enzima cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse mediante diversas técnicas, incluidas espectrofotometría, fluorescencia y quimioluminiscencia. Las enzimas adecuadas incluyen, por ejemplo, luciferasas, luciferina, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, uricasa, xantina oxidasa, lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares.

En algunas realizaciones, el método de detección puede ser una combinación de fluorescencia, quimioluminiscencia, combinaciones de radionucleidos o enzimas/sustratos que generan una señal medible. En algunas realizaciones, la señalización multimodal podría tener características únicas y ventajosas en los formatos de ensayo de biomarcadores.

En algunas realizaciones, los niveles de biomarcadores para los biomarcadores descritos en el presente documento pueden detectarse utilizando cualquier método analítico, incluidos, ensayos de aptámeros singleplex, ensayos de aptámeros multiplex, inmunoensayos singleplex o multiplex, perfilado de expresión de ARNm, perfilado de expresión de ARNmi, análisis por espectrometría de masas, métodos histológicos/citológicos, etc., como se trata a continuación.

Determinación de los niveles de biomarcadores mediante ensayos basados en aptámeros

Los ensayos dirigidos a la detección y cuantificación de moléculas fisiológicamente significativas en muestras biológicas y de otro tipo son herramientas importantes en la investigación científica y en el ámbito sanitario. Una clase de tales ensayos implica el uso de una micromatriz que incluye uno o más aptámeros inmovilizados en un soporte sólido. Cada uno de los aptámeros es capaz de unirse a una molécula diana de forma muy específica y con una afinidad muy elevada. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.475.096 titulada "Ligandos de ácidos nucleicos"; véanse también, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 6.242.246, la patente de Estados Unidos N.° 6.458.543 y la patente de Estados Unidos N.° 6.503.715, cada una de ellas titulada "Biochip de diagnóstico de ligando de ácido nucleico". Una vez que la micromatriz entra en contacto con una muestra, los aptámeros se unen a sus respectivas moléculas diana presentes en la muestra y de este modo permiten determinar un nivel de biomarcador correspondiente a un biomarcador.

Como se usan en el presente documento, un "aptámero" se refiere a un ácido nucleico que tiene una afinidad de unión específica por una molécula diana. Se reconoce que las interacciones de afinidad son una cuestión de grado; sin embargo, en este contexto, la "afinidad de unión específica" de un aptámero por su diana significa que el aptámero se une a su diana generalmente con un grado de afinidad mucho mayor que el que se une a otros componentes de una muestra de ensayo. Un "aptámero" es un conjunto de copias de un tipo o especie de molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos en particular. Un aptámero puede incluir cualquier número adecuado de nucleótidos, incluyendo cualquier número de nucleótidos modificados químicamente. "Aptámeros" se refiere a más de un conjunto de moléculas de este tipo. Diferentes aptámeros pueden tener el mismo o diferente número de nucleótidos. Los aptámeros pueden ser ADN o ARN o ácidos nucleicos modificados químicamente y pueden ser monocatenarios, bicatenarios o contienen regiones de doble cadena, y pueden incluir estructuras ordenadas superiores. Un aptámero también puede ser un fotoaptámero, en el que se incluye un grupo funcional fotorreactivo o químicamente reactivo en el aptámero para permitir su unión covalente a su diana correspondiente. Cualquiera de los métodos de aptámeros divulgados en el presente documento puede incluir el uso de dos o más aptámeros que se unen específicamente a la misma molécula diana. Como se describirá adicionalmente más adelante, un aptámero puede incluir un marcador. Si un aptámero incluye un marcador, no es necesario que todas las copias del aptámero tengan el mismo marcador. De manera adicional, si diferentes aptámeros incluyen cada uno un marcador, estos aptámeros diferentes pueden tener el mismo marcador o un marcador diferente.

Un aptámero puede identificarse usando cualquier método conocido, incluido el proceso SELEX. Una vez identificados, un aptámero puede prepararse o sintetizarse de acuerdo con cualquier método conocido, incluyendo métodos de síntesis química y métodos de síntesis enzimática.

Los términos "SELEX" y "proceso SELEX" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse en general a una combinación de (1) la selección de aptámeros que interactúan con una molécula diana de forma deseable, por ejemplo, uniéndose con gran afinidad a una proteína, con (2) la amplificación de esos ácidos nucleicos seleccionados. El proceso SELEX puede utilizarse para identificar aptámeros con alta afinidad por una diana o biomarcador específico.

SELEX generalmente incluye la preparación de una mezcla candidata de ácidos nucleicos, unión de la mezcla candidata a la molécula diana deseada para formar un complejo de afinidad, separación de los complejos de afinidad de los ácidos nucleicos candidatos no unidos, separación y aislamiento del ácido nucleico del complejo de afinidad, purificación del ácido nucleico e identificación de una secuencia específica de aptámeros. El proceso puede incluir múltiples rondas para refinar aún más la afinidad del aptámero seleccionado. El proceso puede incluir etapas de amplificación en uno o más puntos del proceso. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.475.096, titulada "Ligandos de ácidos nucleicos". El proceso SELEX puede utilizarse para generar un aptámero que se una covalentemente a su diana, así como un aptámero que se una no covalentemente a su diana. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.705.337 titulada "Evolución sistemática de ligandos de ácidos nucleicos mediante enriquecimiento exponencial": Chemi-SELEX".

El proceso SELEX puede usarse para identificar aptámeros de alta afinidad que contengan nucleótidos modificados que confieran mejores características al aptámero, tal como, por ejemplo, mayor estabilidadin vivoo mejores características de administración. Ejemplos de tales modificaciones incluyen sustituciones químicas en las posiciones ribosa y/o fosfato y/o base. Los aptámeros identificados mediante el proceso SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en la patente de Estados Unidos N.° 5.660.985, titulada "Ligandos de ácido nucleico de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados", que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en las posiciones 5'- y 2'- de las pirimidinas. La patente de Estados Unidos N.° 5.580.737, véase anteriormente, describe aptámeros altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino (2'-NH2), 2'-fluoro (2'-F), y/o 2'-O-metilo (2'-OMe). Véase también, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20090098549, titulada "SELEX y PHOTOSELEX", que describe bibliotecas de ácidos nucleicos que tienen propiedades físicas y químicas ampliadas y su uso en SELEX y photoSELEX.

SELEX también puede usarse para identificar aptámeros que tengan características deseables de velocidad de disociación. Véase la patente de Estados Unidos n.° 20090004667, titulada "Método para generar aptámeros con mejores velocidades de disociación", en el que se describen métodos SELEX perfeccionados para generar aptámeros capaces de unirse a moléculas diana. Se describen métodos para producir aptámeros y fotoaptámeros que tienen velocidades de disociación más lentas desde sus respectivas moléculas diana. Los métodos implican poner en contacto la mezcla candidata con la molécula diana, lo que permite la formación de complejos de ácido nucleico-diana y llevar a cabo un proceso de enriquecimiento de velocidad de disociación lenta en donde los complejos ácido nucleicoobjetivo con velocidades de disociación rápidas se disociarán y no volverán a formarse, mientras que los complejos con velocidades de disociación lentas permanecerán intactos. Adicionalmente, los métodos incluyen el uso de nucleótidos modificados en la producción de mezclas de ácidos nucleicos candidatos para generar aptámeros con una velocidad de disociación mejorada. Los nucleótidos modificados de ejemplo no limitantes incluyen, por ejemplo, las pirimidinas modificadas mostradas en las Figuras 7-9. En algunas realizaciones, un aptámero comprende al menos un nucleótido con una modificación, tal como una modificación de base. En algunas realizaciones, un aptámero comprende al menos un nucleótido con una modificación hidrofóbica, tal como una modificación de base hidrofóbica, lo que permite contactos hidrofóbicos con una proteína diana. Tales contactos hidrofóbicos, en algunas realizaciones, contribuyen a una mayor afinidad y/o a una unión más lenta del aptámero. En la Figura 7 se muestran nucleótidos de ejemplo no limitantes con modificaciones hidrofóbicas. En algunas realizaciones, un aptámero comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos 10 nucleótidos con modificaciones hidrofóbicas, donde cada modificación hidrofóbica puede ser igual o diferente de las demás. En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos 10 modificaciones hidrofóbicas en un aptámero pueden seleccionarse independientemente de las modificaciones hidrofóbicas que se muestran en la Figura 7.

En algunas realizaciones, el aptámero es un aptámero de velocidad de disociación lenta. En algunas realizaciones, un aptámero de velocidad de disociación lenta (incluye un aptámero que comprende al menos un nucleótido con una modificación hidrofóbica) tiene una velocidad de disociación (t1^ ) de • 30 minutos, • 60 minutos, • 90 minutos, • 120 minutos, • 150 minutos, • 180 minutos, • 210 minutos o • 240 minutos.

En algunas realizaciones, un ensayo emplea aptámeros que incluyen grupos funcionales fotorreactivos que permiten a los aptámeros unirse covalentemente o "fotocruzarse" a sus moléculas diana. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 6.544.776 titulada "Biochip diagnóstico de ligando de ácido nucleico". Estos aptámeros fotorreactivos también se denominan fotoaptámeros. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.763.177, la patente de Estados Unidos N.° 6.001.577 y la patente de Estados Unidos N.° 6.291.184, cada una de ellas titulada "Evolución sistemática de ligandos de ácidos nucleicos mediante enriquecimiento exponencial": Fotoselección de ligandos de ácidos nucleicos y SELEX en solución"; véase también, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 6.458.539, titulada "Fotoselección de ligandos de ácidos nucleicos". Una vez que la micromatriz ha entrado en contacto con la muestra y los fotoaptámeros han tenido la oportunidad de unirse a sus moléculas diana, los fotoaptámeros se fotoactivan y el soporte sólido se lava para eliminar cualquier molécula unida de forma no específica. Pueden utilizarse condiciones de lavado duras, ya que las moléculas diana que se unen a los fotoaptámeros no suelen eliminarse, debido a los enlaces covalentes creados por el grupo o grupos funcionales fotoactivados en los fotoaptámeros. De esta manera, el ensayo permite detectar un nivel de biomarcador correspondiente a un biomarcador en la muestra problema.

En algunos formatos de ensayo, los aptámeros se inmovilizan en el soporte sólido antes de entrar en contacto con la muestra. En determinadas circunstancias, sin embargo, la inmovilización de los aptámeros antes del contacto con la muestra puede no proporcionar un ensayo óptimo. Por ejemplo, la preinmovilización de los aptámeros puede dar lugar a una mezcla ineficaz de los aptámeros con las moléculas diana en la superficie del soporte sólido, tal vez dando lugar a largos tiempos de reacción y, por lo tanto, periodos de incubación prolongados para permitir una unión eficaz de los aptámeros a sus moléculas diana. Además, cuando se emplean fotoaptámeros en el ensayo y en función del material utilizado como soporte sólido, el soporte sólido puede tender a dispersar o absorber la luz utilizada para efectuar la formación de enlaces covalentes entre los fotoaptámeros y sus moléculas diana. De manera adicional, en función del método empleado, la detección de moléculas diana unidas a sus aptámeros puede estar sujeta a imprecisiones, ya que la superficie del soporte sólido también puede verse expuesta y afectada por los agentes de marcaje que se utilicen. Por último, la inmovilización de los aptámeros en el soporte sólido implica generalmente una etapa de preparación de los aptámeros (es decir, la inmovilización) antes de la exposición de los aptámeros a la muestra, y esta etapa de preparación puede afectar a la actividad o funcionalidad de los aptámeros.

También se han descrito ensayos con aptámeros que permiten a un aptámero capturar su diana en solución y a continuación emplear pasos de separación diseñados para eliminar componentes específicos de la mezcla aptámerodiana antes de la detección (véase el n.° de publicación de Estados Unidos 20090042206), titulada "Análisis multiplex de muestras de ensayo"). Los métodos de ensayo con aptámeros descritos permiten la detección y cuantificación de una diana de ácido no nucleico (por ejemplo, una proteína diana) en una muestra problema mediante la detección y cuantificación de un ácido nucleico (es decir, un aptámero). Los métodos descritos crean un sustituto de ácido nucleico (es decir, el aptámero) para detectar y cuantificar una diana de ácido no nucleico, permitiendo así la amplia variedad de tecnologías de ácidos nucleicos, incluida la amplificación, para aplicarse a una gama más amplia de dianas deseadas, incluidas las dianas proteicas.

Los aptámeros pueden construirse para facilitar la separación de los componentes del ensayo de un complejo de biomarcador aptámero (o complejo covalente de biomarcador fotoaptámero) y permitir el aislamiento del aptámero para su detección y/o cuantificación. En una realización, estas construcciones pueden incluir un elemento escindible o liberable dentro de la secuencia de aptámeros. En otras realizaciones, pueden introducirse funcionalidades adicionales en el aptámero, por ejemplo, un componente marcado o detectable, un componente separador o un marcador de unión específica o un elemento de inmovilización. Por ejemplo, el aptámero puede incluir un marcador conectado al aptámero a través de una fracción escindible, un marcador, un componente separador que separa el marcador y la fracción escindible. En una realización, un elemento escindible es un enlazador fotoescindible. El enlazador fotoescindible puede unirse a una fracción de biotina y a una sección separadora, puede incluir un grupo NHS para la derivatización de aminas y puede usarse para introducir un grupo biotina en un aptámero, permitiendo de este modo la liberación del aptámero posteriormente en un método de ensayo.

Los ensayos homogéneos, realizados con todos los componentes del ensayo en solución, no requieren la separación de la muestra y los reactivos antes de la detección de la señal. Estos métodos son rápidos y fáciles de usar. Estos métodos generan una señal basada en un reactivo de captura o unión molecular que reacciona con su diana específica. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, los reactivos de captura molecular comprenden uno o más aptámeros y/o anticuerpos y/o similares y la diana específica de cada uno de los uno o más aptámeros y/o anticuerpos y/o similares puede ser un biomarcador mostrado en la Tabla 1 o en la Tabla 2.

En algunas realizaciones, un método para la generación de señales aprovecha el cambio de señal de anisotropía debido a la interacción de un reactivo de captura marcado con fluoróforo con su diana biomarcadora específica. Cuando la captura marcada reacciona con su diana, el aumento del peso molecular hace que el movimiento de rotación del fluoróforo unido al complejo sea mucho más lento, lo que cambia el valor de la anisotropía. Controlando el cambio de anisotropía, pueden usarse los acontecimientos de unión para medir cuantitativamente los biomarcadores en soluciones. Otros métodos incluyen ensayos de polarización de fluorescencia, métodos de balizas moleculares, extinción de fluorescencia resuelta en el tiempo, quimioluminiscencia, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, y similares.

Un ensayo de ejemplo de aptámeros en solución que puede usarse para detectar el nivel de un biomarcador en una muestra biológica incluye lo siguiente: (a) preparar una mezcla poniendo en contacto la muestra biológica con un aptámero que incluye un primer marcador y tiene una afinidad específica por el biomarcador, en donde se forma un complejo de afinidad de aptámeros cuando el biomarcador está presente en la muestra; (b) exponer la mezcla a un primer soporte sólido que incluye un primer elemento de captura y permitir que el primer marcador se asocie con el primer elemento de captura; (c) eliminar cualquier componente de la mezcla que no esté asociado al primer soporte sólido; (d) fijar un segundo marcador al componente biomarcador del complejo de afinidad de aptámeros; (e) liberar el complejo de afinidad de aptámeros del primer soporte sólido; (f) exponer el complejo de afinidad de aptámeros liberado a un segundo soporte sólido que incluye un segundo elemento de captura y permitir que el segundo marcador se asocie con el segundo elemento de captura; (g) eliminar cualquier aptámero que no esté en forma de complejo de la mezcla separando el aptámero que no está en forma de complejo del complejo de afinidad de aptámeros; (h) eluir el aptámero del soporte sólido; y (i) detectar el biomarcador detectando el componente aptámero del complejo de afinidad de aptámeros.

Puede usarse cualquier medio conocido en la técnica para detectar un valor biomarcador mediante la detección del componente aptámero de un complejo de afinidad de aptámeros. Para detectar el componente aptámero de un complejo de afinidad pueden usarse varios métodos de detección, tal como, por ejemplo, ensayos de hibridación, espectroscopia de masas o QPCR. En algunas realizaciones, los métodos de secuenciación de ácidos nucleicos pueden usarse para detectar el componente aptámero de un complejo de afinidad de aptámeros y de este modo detectar un valor biomarcador. Resumiendo, una muestra de ensayo puede someterse a cualquier tipo de método de secuenciación de ácidos nucleicos para identificar y cuantificar la secuencia o secuencias de uno o más aptámeros presentes en la muestra de ensayo. En algunas realizaciones, la secuencia incluye la molécula de aptámero completa o cualquier porción de la molécula que pueda utilizarse para identificar la molécula de forma única. En otras realizaciones, la secuenciación identificadora es una secuencia específica añadida al aptámero; tales secuencias se denominan a menudo "marcadores". "códigos de barras", o "códigos postales". En algunas realizaciones, el método de secuenciación incluye etapas enzimáticas para amplificar la secuencia del aptámero o para convertir cualquier tipo de ácido nucleico, incluidos el ARN y el ADN que contienen modificaciones químicas en cualquier posición, a cualquier otro tipo de ácido nucleico apropiado para la secuenciación.

En algunas realizaciones, el método de secuenciación incluye una o más etapas de clonación. En otras realizaciones, el método de secuenciación incluye un método de secuenciación directa sin clonación.

En algunas realizaciones, el método de secuenciación incluye un enfoque dirigido con cebadores específicos dirigidos a uno o más aptámeros de la muestra de ensayo. En otras realizaciones, el método de secuenciación incluye un enfoque de tipo aleatorio dirigido a todos los aptámeros de la muestra de ensayo.

En algunas realizaciones, el método de secuenciación incluye etapas enzimáticas para amplificar la molécula diana de la secuenciación. En otras realizaciones, el método de secuenciación secuencia directamente moléculas individuales. Un método de ejemplo basado en la secuenciación de ácidos nucleicos que puede usarse para detectar un valor de biomarcador correspondiente a un biomarcador en una muestra biológica incluye lo siguiente: (a) convertir una mezcla de aptámeros que contienen nucleótidos químicamente modificados en ácidos nucleicos no modificados con una etapa enzimática; (b) secuenciar de forma aleatoria los ácidos nucleicos no modificados resultantes con una plataforma de secuenciación masivamente paralela tal como, por ejemplo, el sistema de secuenciación 454 (454 Life Sciences/Roche), el sistema de secuenciación Illumina (Illumina), el sistema de secuenciación ABI SOLiD (Applied Biosystems), el HeliScope Single Molecule Sequencer (Helicos Biosciences), o el sistema de secuenciación Pacific Biosciences Real Time Single-Molecule Sequencing (Pacific BioSciences) o el sistema de secuenciación Polonator G Sequencing (Dover Systems); y (c) identificar y cuantificar los aptámeros presentes en la mezcla por secuencia específica y recuento de secuencias.

En el ejemplo 1 se describe un ejemplo no limitante de método para detectar biomarcadores en una muestra biológica utilizando aptámeros. VéasetambiénKraemeret al.,2011, PLoS One 6(10): e26332.

Determinación de los niveles de biomarcadores mediante inmunoensayos

Los métodos de inmunoensayo se basan en la reacción de un anticuerpo con su diana o analito correspondiente y pueden detectar el analito en una muestra dependiendo del formato específico del ensayo. Para mejorar la especificidad y la sensibilidad de un método de ensayo basado en la inmunorreactividad, a menudo se usan anticuerpos monoclonales y sus fragmentos debido a su reconocimiento específico de epítopos. También se han utilizado con éxito en diversos inmunoensayos anticuerpos policlonales debido a su mayor afinidad por la diana en comparación con los anticuerpos monoclonales. Se han diseñado inmunoensayos para su uso con una amplia gama de matrices de muestras biológicas. Se han diseñado formatos de inmunoensayo para proporcionar resultados cualitativos, semicuantitativos y cuantitativos.

Los resultados cuantitativos se generan mediante el uso de una curva estándar creada con concentraciones conocidas del analito específico que se desea detectar. La respuesta o señal de una muestra desconocida se traza sobre la curva estándar, y se establece una cantidad o nivel correspondiente a la diana en la muestra desconocida.

Se han diseñado numerosos formatos de inmunoensayo. ELISA o EIA pueden ser cuantitativos para la detección de un analito. Este método se basa en la fijación de un marcador al analito o al anticuerpo y el componente del marcador incluye, bien directa o indirectamente, una enzima. Las pruebas ELISA pueden tener un formato para la detección directa, indirecta, competitiva o en sándwich del analito. Otros métodos se basan en marcadores tales como, por ejemplo, radioisótopos (I125) o fluorescencia. Técnicas adicionales incluyen, por ejemplo, aglutinación, nefelometría, turbidimetría, transferencia Western, inmunoprecipitación, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, citometría de flujo, ensayo Luminex y otros (véase ImmunoAssay: A Practical Guide, editado por Brian Law, publicada por Taylor y Francis, Ltd., edición 2005).

Los formatos de ensayo de ejemplo incluyen ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), radioinmunoensayo, inmunoensayos de fluorescencia, quimioluminiscencia y de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) o FRET resuelta en el tiempo (TR-FRET). Entre los ejemplos de procedimientos para detectar biomarcadores se incluyen inmunoprecipitación de biomarcadores seguida de métodos cuantitativos que permiten discriminar el tamaño y el nivel de péptidos, tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar, electrocromatografía plana y similares.

Los métodos de detección y/o cuantificación de un marcador detectable o de un material generador de señales dependen de la naturaleza del marcador. Los productos de reacciones catalizadas por enzimas apropiadas (cuando el marcador detectable es una enzima; véase anteriormente) pueden ser, sin limitación, fluorescentes, luminiscentes o radiactivos o pueden absorber luz visible o ultravioleta. Ejemplos de detectores adecuados para detectar tales marcadores detectables incluyen, sin limitación, película de rayos x, contadores de radiactividad, contadores de centelleo, espectrofotómetros, colorímetros, fluorómetros, luminómetros y densitómetros.

Cualquiera de los métodos de detección puede realizarse en cualquier formato que permita cualquier preparación adecuada, procesamiento y análisis de las reacciones. Esto se puede realizar, por ejemplo, en placas de ensayo de varios pocillos (por ejemplo, 96 pocillos o 386 pocillos) o usando cualquier matriz o micromatriz adecuada. Las soluciones madre para diversos agentes pueden hacerse manual o robóticamente y los posteriores pipeteado, dilución, mezclado, distribución, lavado, incubación, lectura de muestras, recogida y análisis de los datos pueden realizarse de forma robotizada mediante programas informáticos de análisis disponibles en el mercado, robótica, e instrumentación de detección capaz de detectar un marcador detectable.

Determinación de los niveles de biomarcadores mediante perfiles de expresión génica

La medición del ARNm en una muestra biológica puede, en algunas realizaciones, utilizarse como sustituto para la detección del nivel de la proteína correspondiente en la muestra biológica. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un biomarcador o panel de biomarcadores descrito en el presente documento puede detectarse mediante la detección del ARN apropiado.

En algunas realizaciones, los niveles de expresión del ARNm se miden mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-PCR seguida de qPCR). La RT-PCR se utiliza para crear un ADNc a partir del ARNm. El ADNc puede utilizarse en un ensayo qPCR para producir fluorescencia a medida que avanza el proceso de amplificación del ADN. Por comparación con una curva estándar, la qPCR puede producir una medición absoluta tal como el número de copias de ARNm por célula. Se han usado trasferencias Northern, micromatriz, ensayos de invasores y RT-PCR combinada con electroforesis capilar para medir los niveles de expresión del ARNm en una muestra. Véase Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004.

Detección de biomarcadores usando tecnologías de imagen molecular in vivo

En algunas realizaciones, un biomarcador descrito en el presente documento puede utilizarse en pruebas de imagen molecular. Por ejemplo, un agente de formación de imágenes puede acoplarse a un reactivo de captura, que puede usarse para detectar el biomarcadorin vivo.

Las tecnologías de imagen in vivoproporcionan métodos no invasivos para determinar el estado de una enfermedad en particular en el cuerpo de un individuo. Por ejemplo, porciones enteras del cuerpo, o incluso todo el cuerpo, puede verse como una imagen tridimensional, proporcionando de este modo valiosa información sobre la morfología y las estructuras del cuerpo. Tales tecnologías pueden combinarse con la detección de los biomarcadores descritos en el presente documento para proporcionar información relativa al biomarcadorin vivo.

El uso de tecnologías de imagen molecularin vivose está ampliando gracias a diversos avances tecnológicos. Estos avances incluyen el desarrollo de nuevos agentes o marcadores de contraste, tales como radiomarcadores y/o marcadores fluorescentes, que puede proporcionar fuertes señales dentro de cuerpo; y el desarrollo de nuevas y potentes tecnologías de imagen, que puede detectar y analizar estas señales desde el exterior del cuerpo, con suficiente sensibilidad y precisión para proporcionar información útil. El agente de contraste puede visualizarse en un sistema de imagen adecuado, proporcionando de este modo una imagen de la porción o porciones del cuerpo en las que se encuentra el agente de contraste. El agente de contraste puede estar unido o asociado a un reactivo de captura, tal como un aptámero o un anticuerpo, por ejemplo, y/o con un péptido o proteína, o un oligonucleótido (por ejemplo, para la detección de la expresión génica), o un complejo que contenga cualquiera de ellas con una o más macromoléculas y/u otras formas de partículas.

El agente de contraste también puede contener un átomo radiactivo que es útil para obtener imágenes. Entre los átomos radiactivos adecuados se incluyen tecnecio-99m o yodo-123 para estudios gammagráficos. Otras moléculas fácilmente detectables incluyen, por ejemplo, marcadores de espín para imágenes por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) tales como, por ejemplo, yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Tales marcadores son bien conocidos en la técnica y podrían ser seleccionados fácilmente por un experto habitual en la materia.

Las técnicas de imagen estándar incluyen, aunque no de forma limitativa, resonancia magnética, exploraciones de tomografía computarizada, tomografía de emisión de positrones (PET), tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y similares. Para las pruebas de imagen diagnósticain vivo,el tipo de instrumento de detección disponible es un factor importante a la hora de seleccionar un determinado agente de contraste, tal como un radionucleido determinado y el biomarcador concreto al que se dirige (proteína, ARNm y similares). El radionucleido elegido normalmente tiene un tipo de desintegración detectable por un tipo determinado de instrumento. Asimismo, a la hora de seleccionar un radionucleido para el diagnósticoin vivo,su semivida debe ser lo suficientemente larga como para permitir la detección en el momento de máxima captación por el tejido diana, pero lo suficientemente corta como para minimizar la radiación nociva del huésped.

Entre las técnicas de imagen de ejemplo se incluyen, aunque no de forma limitativa, PET y SPECT, que son técnicas de diagnóstico por imagen en las que se administra un radionucleido sintética o localmente a un individuo. La captación posterior de la radiosonda se mide a lo largo del tiempo y se utiliza para obtener información sobre el tejido diana y el biomarcador. Debido a las emisiones de alta energía (rayos gamma) de los isótopos específicos empleados y a la sensibilidad y sofisticación de los instrumentos utilizados para detectarlos, la distribución bidimensional de la radiactividad puede inferirse desde el exterior del cuerpo.

Los nucleidos emisores de positrones más utilizados en PET incluyen, por ejemplo, carbono-11, nitrógeno-13, oxígeno-15 y flúor-18. Los isótopos que decaen por captura de electrones y/o emisión gamma se usan en SPECT e incluyen, por ejemplo yodo-123 y tecnecio-99m. Un ejemplo de método para marcar aminoácidos con tecnecio-99m es la reducción del ion pertecnetato en presencia de un precursor quelante para formar el complejo lábil tecnecio-99mprecursor, que, a su vez, reacciona con el grupo de unión metálico de un péptido quimiotáctico modificado bifuncionalmente para formar un conjugado tecnecio-99m-péptido quimiotáctico.

Los anticuerpos se usan frecuentemente para tales métodos de diagnóstico por imagenin vivo.La preparación y uso de anticuerpos para el diagnósticoin vivoson bien conocidos en la técnica.

De manera similar, los aptámeros pueden usarse para tales métodos de diagnóstico por imagenin vivo.Por ejemplo, un aptámero que se utilizó para identificar un biomarcador particular descrito en el presente documento puede marcarse adecuadamente e inyectarse en un individuo para detectar el biomarcadorin vivo.El marcador utilizado se seleccionará en función de la modalidad de imagen que se vaya a utilizar, como se ha descrito previamente. Los agentes de imagen dirigidos por aptámeros podrían tener características únicas y ventajosas que se refieren a la penetración en los tejidos, distribución tisular, cinética, eliminación, potencia y selectividad en comparación con otros agentes de imagen.

Estas técnicas también pueden realizarse opcionalmente con oligonucleótidos marcados, por ejemplo, para la detección de la expresión génica mediante imágenes con oligonucleótidos antisentido. Estos métodos se usan para la hibridaciónin situ,por ejemplo, con moléculas fluorescentes o radionucleidos como marcador. Otros métodos para la detección de la expresión génica incluyen, por ejemplo, detección de la actividad de un gen indicador.

Otro tipo general de tecnología de imagen es la imagen óptica, en la que las señales fluorescentes dentro del sujeto son detectadas por un dispositivo óptico externo al sujeto. Estas señales pueden deberse a la fluorescencia real y/o a la bioluminiscencia. El perfeccionamiento de la sensibilidad de los dispositivos de detección óptica ha aumentado la utilidad de las imágenes ópticas para los ensayos de diagnósticoin vivo.

Para una revisión de otras técnicas, véase N. Blow, Nature Methods, 6, 465-469, 2009.

Determinación de los niveles de biomarcadores mediante métodos de espectrometría de masas

Se pueden utilizar diversas configuraciones de espectrómetros de masas para detectar los niveles de biomarcadores. Existen varios tipos de espectrómetros de masas o pueden fabricarse con diversas configuraciones. En general, un espectrómetro de masas tiene los siguientes componentes principales: una entrada de muestra, una fuente de iones, un analizador de masas, un detector, un sistema de vacío, un sistema de control de instrumentos y un sistema de datos. Diferencia en la entrada de la muestra, la fuente de iones y el analizador de masas definen generalmente el tipo de instrumento y sus capacidades. Por ejemplo, una entrada puede ser una fuente de cromatografía líquida en columna capilar o puede ser una sonda directa o una etapa tal como la utilizada en la desorción láser asistida por matriz. Las fuentes de iones comunes son, por ejemplo, electropulverización, incluidas nanopulverización y micropulverización o desorción por láser asistida por matriz. Los analizadores de masas comunes incluyen un filtro de masas cuadrupolar, analizador de masas de trampa de iones y analizador de masas de tiempo de vuelo. Otros métodos de espectrometría de masas adicionales son bien conocidos en la técnica (véase Burlingameet al.Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter y Sherman, New York (2000)).

Los biomarcadores de proteínas y los niveles de biomarcadores pueden detectarse y medirse mediante cualquiera de los métodos siguientes: espectrometría de masas por ionización de electropulverización (ESI-MS), ESI-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS), espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización láser mejorada en superficie (SELDI-TOF-MS), desorción/ionización sobre silicio (DIOS), espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS), tiempo de vuelo cuadrupolar (Q-TOF), tecnología de tiempo de vuelo en tándem (TOF/TOF), llamado ultraflex III TOF/TOF, espectrometría de masas por ionización química a presión atmosférica (APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS)N, espectrometría de masas por fotoionización a presión atmosférica (APPI-MS), APPI-MS/MS y APPI-(MS)N, espectrometría de masas cuadrupolar, espectrometría de masas por transformada de Fourier (FTMS), espectrometría de masas cuantitativa y espectrometría de masas con trampa de iones.

Las estrategias de preparación de muestras se utilizan para marcar y enriquecer las muestras antes de la caracterización por espectroscopia de masas de los biomarcadores proteínicos y la determinación de los niveles de biomarcadores. Los métodos de marcaje incluyen, aunque no de forma limitativa, el marcaje isobárico para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) y el marcaje de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular (SILAC). Los reactivos de captura utilizados para enriquecer selectivamente las muestras en busca de proteínas candidatas a biomarcadores antes del análisis espectroscópico de masas incluyen, aunque no de forma limitativa, aptámeros, anticuerpos, sondas de ácido nucleico, quimeras, moléculas pequeñas, un fragmento F(ab')<2>, un fragmento de anticuerpo monocatenario, un fragmento Fv, un fragmento Fv monocatenario, un ácido nucleico, una lectina, un receptor de unión a ligando, affybodies, nanocuerpos, anquirinas, anticuerpos de dominio, estructuras de soporte de anticuerpos alternativas (por ejemplo. diacuerpos, etc.) polímeros con huella molecular, avímeros, peptidomiméticos, peptoides, ácidos nucleicos peptídicos, ácido nucleico de treosa, un receptor hormonal, receptores de citoquinas y receptores sintéticos, así como sus modificaciones y fragmentos.

Determinación de los niveles de biomarcadores mediante un ensayo de ligadura de proximidad

Se puede utilizar un ensayo de ligadura por proximidad para determinar los valores de los biomarcadores. Resumiendo, una muestra de ensayo se pone en contacto con un par de sondas de afinidad que pueden ser un par de anticuerpos o un par de aptámeros, con cada miembro del par ampliado con un oligonucleótido. Las dianas para el par de sondas de afinidad pueden ser dos determinantes distintos en una proteína o un determinante en cada una de dos proteínas diferentes, que pueden existir como complejos homo- o hetero-multiméricos. Cuando las sondas se unen a los determinantes diana, los extremos libres de las extensiones de oligonucleótidos se acercan suficientemente para hibridarse. La hibridación de las extensiones de oligonucleótidos se ve facilitada por un oligonucleótido conector común que sirve para unir las extensiones de oligonucleótidos cuando están situadas suficientemente cerca. Una vez hibridadas las extensiones oligonucleotídicas de las sondas, los extremos de las extensiones se unen mediante ligadura enzimática del ADN.

Cada extensión de oligonucleótido comprende un sitio de cebado para la amplificación por PCR. Una vez ligadas las extensiones de oligonucleótidos, los oligonucleótidos forman una secuencia continua de ADN que, mediante amplificación por PCR, revela información sobre la identidad y la cantidad de la proteína diana, así como, información relativa a las interacciones proteína-proteína cuando los determinantes diana se encuentran en dos proteínas diferentes. La ligadura de proximidad puede proporcionar un ensayo altamente sensible y específico para la concentración de proteínas en tiempo real y la información de interacción mediante el uso de PCR en tiempo real. A las sondas que no se unen a los determinantes de interés no se les acercan las correspondientes extensiones de oligonucleótidos y no se puede proceder a la ligadura ni a la amplificación por PCR, por lo que no se produce ninguna señal.

Los ensayos anteriores permiten detectar valores de biomarcadores que son útiles en métodos de predicción del riesgo 0 la probabilidad de acontecimientos CV, donde los métodos comprenden la detección, en una muestra biológica de un individuo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece, al menos catorce, al menos quince o los dieciséis biomarcadores seleccionados entre los biomarcadores de la Tabla 1; o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece o los catorce biomarcadores seleccionados entre los biomarcadores de la Tabla 2, en donde una clasificación, como se describe a continuación, usando los valores de los biomarcadores indica si el individuo tiene un riesgo elevado de sufrir un acontecimiento CV dentro de un plazo de 90 días, 180 días o 1 año. De acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, los valores de los biomarcadores pueden detectarse y clasificarse individualmente o pueden detectarse y clasificarse colectivamente, como, por ejemplo, en un formato de ensayo multiplex.

Clasificación de biomarcadores y cálculo de puntuaciones de enfermedad

En algunas realizaciones, una "firma" de biomarcadores para una prueba diagnóstica determinada contiene un conjunto de biomarcadores, cada biomarcador que tiene niveles característicos en las poblaciones de interés. Niveles característicos, en algunas realizaciones, pueden hacer referencia a la media o promedio de los niveles de biomarcadores de los individuos de un grupo en particular. En algunas realizaciones, un método de diagnóstico descrito en el presente documento puede utilizarse para asignar una muestra desconocida de un individuo a uno de dos grupos, con mayor riesgo de sufrir un acontecimiento CV o no.

La asignación de una muestra a uno de dos o más grupos se conoce como clasificación, y el procedimiento utilizado para llevar a cabo esta asignación se conoce como clasificador o método de clasificación. Los métodos de clasificación también se denominan métodos de puntuación. Existen muchos métodos de clasificación que pueden usarse para construir un clasificador de diagnóstico desde un conjunto de niveles de biomarcadores. En algunos casos, los métodos de clasificación se realizan mediante técnicas de aprendizaje supervisado en las que se recoge un conjunto de datos mediante muestras obtenidas de individuos dentro de dos (o más, para estados de clasificación múltiples) grupos distintos que se desea distinguir. Puesto que la clase (grupo o población) a la que pertenece cada muestra se conoce de antemano para cada muestra, el método de clasificación puede entrenarse para dar la respuesta de clasificación deseada. También es posible usar técnicas de aprendizaje no supervisado para producir un clasificador de diagnóstico.

Entre los métodos habituales para desarrollar clasificadores de diagnóstico se incluyen los árboles de decisión; agregación potenciación bosques; aprendizaje basado en inferencia de reglas; ventanas Parzen; modelos lineales; logística; métodos de redes neuronales; agrupación no supervisada; K-medias; jerárquico ascendente/descendente; aprendizaje semisupervisado; métodos de prototipado; vecino más cercano; estimación de la densidad del núcleo; máquinas de vectores de soporte; modelos ocultos de Markov; aprendizaje Boltzmann; y los clasificadores pueden combinarse simplemente o de forma que minimicen funciones objetivo particulares. Para una revisión, véase, por ejemplo, Pattern Classification, R.O. Duda,et al.,editores, John Wiley & Sons, 2.a edición, 2001; véase también, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie,et al.,editores, Springer Science+Business Media, LLC, 2.a edición, 2009.

Para producir un clasificador utilizando técnicas de aprendizaje supervisado, se obtiene un conjunto de muestras denominadas datos de entrenamiento. En el contexto de las pruebas de diagnóstico, los datos de entrenamiento incluyen muestras de los distintos grupos (clases) a los que posteriormente se cederán muestras desconocidas. Por ejemplo, las muestras recogidas de individuos de una población de control y de individuos de una población con una enfermedad particular pueden constituir datos de entrenamiento para desarrollar un clasificador que pueda clasificar muestras desconocidas (o, de manera más particular, los individuos de los que se obtuvieron las muestras) como que tiene la enfermedad o que está libre de ella. El desarrollo del clasificador desde los datos de entrenamiento se conoce como entrenamiento del clasificador. Los detalles específicos sobre el entrenamiento del clasificador dependen de la naturaleza de la técnica de aprendizaje supervisado. El entrenamiento de un clasificador de Bayes ingenuo es un ejemplo de tal técnica de aprendizaje supervisado (véase, por ejemplo, Pattern Classification, R.O. Duda,et al.,editores, John Wiley & Sons, 2.a edición, 2001; véase también, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie,et al.,editores, Springer Science+Business Media, LLC, 2.a edición, 2009). Se describe el entrenamiento de un clasificador de Bayes ingenuo, por ejemplo, en las publicaciones de Estados Unidos n.°: 2012/0101002 y 2012/0077695.

Dado que normalmente hay muchos más niveles potenciales de biomarcadores que muestras en un conjunto de entrenamiento, hay que tener cuidado para evitar un sobreajuste. El sobreajuste se produce cuando un modelo estadístico describe un error aleatorio o ruido en lugar de la relación subyacente. El sobreajuste puede evitarse de varias maneras, incluyendo, por ejemplo, limitación del número de biomarcadores utilizados en el desarrollo del clasificador, asumiendo que las respuestas de los biomarcadores son independientes entre sí, limitando la complejidad del modelo estadístico subyacente empleado y garantizando que el modelo estadístico subyacente se ajusta a los datos.

Un ejemplo ilustrativo del desarrollo de una prueba de diagnóstico utilizando un conjunto de biomarcadores incluye la aplicación de un clasificador de Bayes ingenuo, un clasificador probabilístico simple basado en el teorema de Bayes con tratamiento independiente estricto de los biomarcadores. Cada biomarcador se describe mediante una función de densidad de probabilidad (pdf, por sus siglas en inglés) dependiente de la clase para los valores UFR medidos o los valores log UFR (unidades de fluorescencia relativa) en cada clase. Se supone que las pdf conjuntas para el conjunto de biomarcadores de una clase son el producto de las pdf individuales dependientes de la clase para cada biomarcador. Entrenar un clasificador de Bayes ingenuo en este contexto equivale a asignar parámetros ("parametrización") para caracterizar las pdf dependientes de la clase. Se puede usar cualquier modelo subyacente para las pdf dependientes de la clase, pero, en general, el modelo debería ajustarse a los datos observados en el conjunto de entrenamiento.

El rendimiento del clasificador de Bayes ingenuo depende del número y la calidad de los biomarcadores utilizados para construir y entrenar el clasificador. Un único biomarcador se comportará de acuerdo con su distancia KS (Kolmogorov-Smirnov). La adición de biomarcadores posteriores con buenas distancias KS (>0,3, por ejemplo), en general, mejorará el perfeccionamiento de la clasificación si los biomarcadores añadidos posteriormente son independientes del primer biomarcador. Usar la sensibilidad más la especificidad como puntuación de clasificación, se pueden generar muchos clasificadores de alta puntuación con una variación de un algoritmo codicioso. (Un algoritmo codicioso es cualquier algoritmo que sigue la metaheurística de resolución de problemas de hacer la elección localmente óptima en cada etapa con la esperanza de encontrar el óptimo global).

Otra forma de representar el rendimiento de un clasificador es mediante una característica operativa del receptor (ROC, por sus siglas en inglés), o simplemente curva ROC o gráfico ROC. La ROC es un gráfico de la sensibilidad o tasa de verdaderos positivos, frente a la tasa de falsos positivos (1 - especificidad o 1 - tasa de verdaderos negativos), para un sistema clasificador binario a medida que varía su umbral de discriminación. La ROC también puede representarse de forma equivalente trazando la fracción de verdaderos positivos de los positivos (TPR = tasa de verdaderos positivos) frente a la fracción de falsos positivos de los negativos (FPR = tasa de falsos positivos). También se conoce como curva característica de funcionamiento relativo, porque se trata de una comparación de dos características de funcionamiento (TPR y FPR) a medida que cambia el criterio. El área bajo la curva ROC (AUC) se utiliza habitualmente como medida resumen de la precisión diagnóstica. Puede tomar valores de 0,0 a 1,0. El AUC tiene una propiedad estadística importante: el AUC de un clasificador es equivalente a la probabilidad de que el clasificador clasifique un caso positivo elegido al azar más alto que un caso negativo elegido al azar (Fawcett T, 2006. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters 27: 861-874). Esto equivale a la prueba de rangos de Wilcoxon (Hanley, J.A., McNeil, B.J., 1982. The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve. Radiology 143, 29-36.). Otra forma de describir el rendimiento de una prueba diagnóstica en relación con un estándar de referencia conocido es el índice de reclasificación neta: la capacidad de la nueva prueba para aumentar o disminuir correctamente el riesgo en comparación con la prueba estándar de referencia. Véase, por ejemplo, Pencinaet al.,2011, Stat. Med. 30: 11-21. Mientras que el AUC bajo la curva ROC es óptimo para evaluar el rendimiento de un clasificador de 2 clases, la medicina estratificada y personalizada se basa en la inferencia de que la población contiene más clases que 2. Para este tipo de comparaciones puede utilizarse más adecuadamente el cociente de riesgos de los cuartiles superiores frente a los inferiores (u otras estratificaciones como los deciles).

Las predicciones de riesgo y probabilidad que se permiten en el presente documento pueden aplicarse a individuos en atención primaria o en centros cardiovasculares especializados, o incluso directamente al consumidor. En algunas realizaciones, los clasificadores utilizados para predecir acontecimientos pueden requerir cierta calibración en función de la población a la que se apliquen; por ejemplo, puede haber variaciones debidas a la etnia o la geografía. Tales calibraciones, en algunas realizaciones, pueden establecerse de antemano a partir de estudios de grandes poblaciones, por lo que cuando se aplican a un paciente individual se incorporan antes de hacer una predicción del riesgo. Se toma una muestra de sangre venosa, se procesa adecuadamente y se analiza como se describe en el presente documento. Una vez finalizado el análisis, las predicciones de riesgo pueden hacerse matemáticamente, con o sin la incorporación de otros metadatos de historias clínicas descritos en el presente documento, tales como los genéticos o demográficos. Son posibles varias formas de salida de la información en función del nivel de conocimientos del consumidor. Para los consumidores que buscan el tipo de salida más sencillo, la información puede ser, en algunas realizaciones, "es probable que esta persona tenga un acontecimiento en los próximos x días (donde x es 90-365), sí/no" o, como alternativa, parecido a un "semáforo" rojo/naranja/verde o su equivalente verbal o escrito tal como riesgo alto/medio/bajo. Para los consumidores que buscan más detalles, en algunas realizaciones, el riesgo puede presentarse como un número o un gráfico que ilustra la probabilidad de un acontecimiento por unidad de tiempo como una puntuación continua, o un mayor número de estratos (tales como deciles), y/o el tiempo medio hasta el acontecimiento y/o el tipo de acontecimiento más probable. En algunas realizaciones, el resultado puede incluir recomendaciones terapéuticas. El seguimiento longitudinal de un mismo paciente a lo largo del tiempo permitirá elaborar gráficos que muestren la respuesta a las intervenciones o a los cambios en el estilo de vida. En algunas realizaciones, se puede proporcionar más de un tipo de salida al mismo tiempo para satisfacer las necesidades del paciente y de los distintos miembros del equipo asistencial con diferentes niveles de experiencia.

En algunas realizaciones, los biomarcadores mostrados en la Tabla 2 se detectan en una muestra de sangre (una muestra de suero) de un sujeto, por ejemplo, usando aptámeros, tal como los aptámeros de velocidad de disociación lenta. Los valores de log UFR se usan para calcular el riesgo o la probabilidad de que un individuo tenga un acontecimiento CV, o un índice pronóstico (IP).

Dado el IP, la probabilidad de que el sujeto sufra un acontecimiento cardiovascular (acontecimiento CV) en los próximos "t" días viene dada por la fórmula:

donde IP es elíndice pronóstico(o predictor lineal) y s es el parámetro de escala asociado para la distribución de valores extremos. En diversas realizaciones, "t" es de 90 a 365 días.

Kits

Cualquier combinación de los biomarcadores descritos en el presente documento puede detectarse utilizando un kit adecuado, tal como para su uso en la realización de los métodos divulgados en el presente documento. Adicionalmente, cualquiera de los kits puede contener uno o más marcadores detectables como se describe en el presente documento, tal como una fracción fluorescente, etc.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento pero no reivindicadas explícitamente, un kit incluye (a) uno o más reactivos de captura (tales como, por ejemplo, al menos un aptámero o anticuerpo) para detectar uno o más biomarcadores en una muestra biológica, en donde los biomarcadores incluyen al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece, al menos catorce, al menos quince o los dieciséis biomarcadores seleccionados entre los biomarcadores de la Tabla 1; o al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece o los catorce biomarcadores seleccionados entre los biomarcadores de la Tabla 2 y opcionalmente (b) uno o más productos de software o programas informáticos para clasificar al individuo del que se obtuvo la muestra biológica como teniendo o no teniendo un riesgo aumentado de un acontecimiento CV o para determinar la probabilidad de que el individuo tenga un riesgo aumentado de un acontecimiento CV, como se describirá más adelante en el presente documento.

Como alternativa, en lugar de uno o más productos de programas informáticos, se pueden proporcionar uno o más instrucciones para que una persona realice manualmente las etapas anteriores.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento pero no reivindicadas explícitamente, un kit comprende un soporte sólido, al menos un reactivo de captura, y un material generador de señales. El kit también puede incluir instrucciones de uso de los dispositivos y reactivos, manipulación de la muestra y análisis de los datos. Además, el kit puede usarse con un sistema informático o software para analizar e informar del resultado del análisis de la muestra biológica.

Los kits pueden contener también uno o más reactivos (por ejemplo, tampones de solubilización, detergentes, lavados o tampones) para procesar una muestra biológica. Cualquiera de los kits descritos en el presente documento también puede incluir, por ejemplo, tampones, agentes bloqueantes, materiales de la matriz de espectrometría de masas, agentes de captura de anticuerpos, muestras de control positivas, muestras de control negativas, software e información tales como protocolos, datos de guía y datos de referencia.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento pero no reivindicadas explícitamente, para el análisis del estado de riesgo de acontecimientos CV, en donde los kits comprenden cebadores PCR para uno o más aptámeros específicos de los biomarcadores descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, un kit puede incluir además instrucciones de uso y correlación de los biomarcadores con la predicción del riesgo de un acontecimiento CV. En algunas realizaciones, un kit puede incluir también una matriz de ADN que contenga el complemento de uno o más de los aptámeros específicos para los biomarcadores descritos en el presente documento, reactivos y/o enzimas para amplificar o aislar el ADN de la muestra. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir reactivos para la PCR en tiempo real, por ejemplo, sondas TaqMan y/o cebadores, y enzimas.

Por ejemplo, un kit puede comprender (a) reactivos que comprenden al menos un reactivo de captura para determinar el nivel de uno o más biomarcadores en una muestra problema, y opcionalmente (b) uno o más algoritmos o programas informáticos para realizar los pasos de comparación de la cantidad de cada biomarcador cuantificado en la muestra problema con uno o más puntos de corte predeterminados. En algunas realizaciones, un algoritmo o programa informático asigna una puntuación a cada biomarcador cuantificado basándose en dicha comparación y, en algunas realizaciones, combina las puntuaciones asignadas a cada biomarcador cuantificado para obtener una puntuación total. Además, en algunas realizaciones, un algoritmo o programa informático compara la puntuación total con una puntuación predeterminada y utiliza la comparación para determinar si un individuo tiene un mayor riesgo de sufrir un acontecimiento CV. Como alternativa, en lugar de uno o más algoritmos o programas informáticos, se pueden proporcionar uno o más instrucciones para que una persona realice manualmente las etapas anteriores.

Paneles de biomarcadores

En algunas realizaciones descritas en el presente documento pero no reivindicadas explícitamente, se detectan uno o más de los biomarcadores enumerados en la Tabla 1. En algunas realizaciones, los uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 1 se detectan en una muestra de un individuo que tiene ICFEr. En algunas realizaciones, se detectan todos los biomarcadores enumerados en la Tabla 1. En algunas realizaciones, se detecta el nivel de cada una de las proteínas enumeradas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, la detección de uno o más biomarcadores o de todos los biomarcadores se realiza para determinar el riesgo o la probabilidad de que un sujeto tenga un acontecimiento CV dentro de un periodo de tiempo definido. En algunas de dichas realizaciones, el periodo de tiempo definido es de 90 días, 180 días o un año. En algunas realizaciones, el periodo de tiempo definido es de un año. En algunas realizaciones, el acontecimiento CV es la muerte.

Tabla 1

continuación

En algunas realizaciones, se detectan uno o más de los biomarcadores enumerados en la Tabla 2. En algunas realizaciones, los uno o más biomarcadores enumerados en la Tabla 2 se detectan en una muestra de un individuo que tiene ICFEr. En algunas realizaciones, se detectan todos los biomarcadores enumerados en la Tabla que figura a continuación. En algunas realizaciones, se detecta el nivel de cada una de las proteínas enumeradas en la Tabla 2. En algunas realizaciones, la detección de uno o más biomarcadores o de todos los biomarcadores se realiza para determinar el riesgo o la probabilidad de que un sujeto tenga un acontecimiento CV dentro de un periodo de tiempo definido. En algunas de dichas realizaciones, el periodo de tiempo definido es de 90 días, 180 días o un año. En algunas realizaciones, el periodo de tiempo definido es de un año. En algunas realizaciones, el acontecimiento CV es la muerte.

Tabla 2

Métodos y programas informáticos

Un método para evaluar el riesgo o la probabilidad de un acontecimiento CV en un individuo puede comprender lo siguiente: 1) obtener una muestra biológica; 2) realizar un método analítico para detectar y medir un biomarcador o conjunto de biomarcadores de un panel en la muestra biológica; 3) opcionalmente, realizar cualquier normalización o estandarización de datos; 4) determinar el nivel de cada biomarcador; y 5) comunicar los resultados. En algunas realizaciones, los resultados se calibran en función de la población/etnia del sujeto. En algunas realizaciones, los niveles de biomarcadores se combinan de algún modo y se notifica un único valor para los niveles de biomarcadores combinados. En este enfoque, en algunas realizaciones, la puntuación puede ser un único número determinado a partir de la integración de todos los biomarcadores que se compara con un valor umbral preestablecido que es una indicación de la presencia o ausencia de enfermedad. O la puntuación diagnóstica o predictiva puede ser una serie de barras que representan cada una un valor de biomarcador y el patrón de las respuestas puede compararse con un patrón preestablecido para determinar la presencia o ausencia de enfermedad, afección o el aumento del riesgo (o no) de un acontecimiento.

Al menos algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento pueden implementarse con el uso de un ordenador. En la Figura 5 se muestra un ejemplo de un sistema informático 100. Con referencia a la figura 5, el sistema 100 se muestra comprendido por elementos de hardware que están eléctricamente acoplados a través del bus 108, incluyendo un procesador 101, dispositivo de entrada 102, dispositivo de salida 103, dispositivo de almacenamiento 104, lector de medios de almacenamiento legible por ordenador 105a, sistema de comunicaciones 106, aceleración del procesamiento (por ejemplo, DSP o procesadores de propósito especial) 107 y memoria 109. El lector de medios de almacenamiento legible por ordenador 105a está además acoplado al medio de almacenamiento legible por ordenador 105b, la combinación que representa globalmente dispositivos de almacenamiento remotos, locales, fijos y/o extraíbles más medios de almacenamiento, memoria, etc. para contener de forma temporal y/o más permanente información legible por ordenador, que pueden incluir el dispositivo de almacenamiento 104, memoria 109 y/o cualquier otro recurso accesible del sistema 100 de este tipo. El sistema 100 comprende también elementos de software (que se muestran como ubicados actualmente dentro de la memoria de trabajo 191) incluyendo un sistema operativo 192 y otro código 193, tales como programas, datos y similares.

Con respecto a la figura 5, el sistema 100 tiene una gran flexibilidad y capacidad de configuración. Por lo tanto, por ejemplo, una única arquitectura podría utilizarse para implementar uno o más servidores que pueden configurarse aún más de acuerdo con los protocolos actualmente deseables, variaciones del protocolo, extensiones, etc. Sin embargo, será evidente para los expertos en la materia que las realizaciones bien pueden utilizarse de acuerdo con requisitos de aplicación más específicos. Por ejemplo, uno o más elementos del sistema pueden implementarse como subelementos dentro de un componente del sistema 100 (por ejemplo, dentro del sistema de comunicaciones 106). También se puede utilizar hardware personalizado y/o implementar elementos particulares en hardware, software o ambos. Además, mientras que puede emplearse la conexión a otros dispositivos informáticos tales como dispositivos de entrada/salida de red (no mostrados), debe entenderse que también podrían utilizarse conexiones cableadas, inalámbricas, por módem y/o de otro tipo con otros dispositivos informáticos.

En un aspecto, el sistema puede comprender una base de datos que comprenda rasgos de biomarcadores característicos de la predicción del riesgo de un acontecimiento CV. Los datos del biomarcador (o la información del biomarcador) pueden utilizarse como entrada al ordenador para usarlos como parte de un método implementado por ordenador. Los datos de biomarcadores pueden incluir los datos como se describe en el presente documento.

En un aspecto, el sistema comprende además uno o más dispositivos para proporcionar datos de entrada a uno o más procesadores.

El sistema comprende además una memoria para almacenar un conjunto de datos de elementos de datos clasificados.

En otro aspecto, el dispositivo para proporcionar datos de entrada comprende un detector para detectar la característica del elemento de datos, por ejemplo, tales como un espectrómetro de masas o un lector de chips genéticos.

El sistema puede comprender adicionalmente un sistema de gestión de bases de datos. Las peticiones o consultas de los usuarios pueden formatearse en un lenguaje apropiado que comprenda el sistema de gestión de la base de datos, que procesa la consulta para extraer la información pertinente de la base de datos de conjuntos de entrenamiento.

El sistema puede conectarse a una red a la que estén conectados un servidor de red y uno o más clientes. La red puede ser una red de área local (LAN) o una red de área amplia (WAN), como se conoce en la técnica. Preferentemente, el servidor incluye el hardware necesario para ejecutar productos de programas informáticos (por ejemplo, software) para acceder a los datos de la base de datos y procesar las solicitudes de los usuarios.

El sistema puede incluir un sistema operativo (por ejemplo, UNIX o Linux) para ejecutar instrucciones de un sistema de gestión de bases de datos. En un aspecto, el sistema operativo puede funcionar en una red de comunicaciones global, tal como Internet, y utilizar un servidor de red de comunicaciones global para conectarse a dicha red.

El sistema puede incluir uno o más dispositivos que comprenden una interfaz gráfica de visualización que comprende elementos de interfaz tales como botones, menús desplegables, barras de desplazamiento, campos para introducir texto, y similares, como se encuentran habitualmente en las interfaces gráficas de usuario conocidas en la técnica. Las solicitudes introducidas en una interfaz de usuario pueden transmitirse a un programa de aplicación del sistema para que formatee la búsqueda de información relevante en uno o más de los bancos de datos del sistema. Las peticiones o consultas introducidas por un usuario pueden construirse en cualquier lenguaje de base de datos adecuado.

La interfaz gráfica de usuario puede ser generada por un código de interfaz gráfica de usuario como parte del sistema operativo y puede usarse para introducir datos y/o mostrar los datos introducidos. El resultado de los datos procesados puede visualizarse en la interfaz, impresa en una impresora en comunicación con el sistema, guardarse en un dispositivo de memoria, y/o transmitirse a través de la red o puede proporcionarse en forma de soporte legible por ordenador.

El sistema puede estar en comunicación con un dispositivo de entrada para proporcionar datos relativos a elementos de datos al sistema (por ejemplo, valores de expresión). En un aspecto, el dispositivo de entrada puede incluir un sistema de perfiles de expresión génica que incluye, por ejemplo, un espectrómetro de masas, lector de chips o matrices genéticas, y similares.

Los métodos y aparatos para analizar la información de biomarcadores de predicción del riesgo de acontecimientos CV según diversas realizaciones pueden implementarse de cualquier manera adecuada, por ejemplo, usando un programa informático que funciona en un sistema informático. Puede usarse un sistema informático convencional que comprende un procesador y una memoria de acceso aleatorio, tal como un servidor de aplicaciones accesible en remoto, servidores de red, ordenador personal o estación de trabajo. Los componentes adicionales del sistema informático pueden incluir dispositivos de memoria o sistemas de almacenamiento de información, tal como un sistema de almacenamiento masivo y una interfaz de usuario, por ejemplo, un monitor convencional, teclado y dispositivo de seguimiento. El sistema informático puede ser un sistema autónomo o formar parte de una red de ordenadores que incluya un servidor y uno o más bases de datos.

El sistema de análisis de biomarcadores de predicción del riesgo de acontecimientos CV puede proporcionar funciones y operaciones para completar el análisis de datos, tal como la recogida de datos, procesamiento, análisis, notificación y/o diagnóstico. Por ejemplo, en una realización, el sistema informático puede ejecutar el programa informático que puede recibir, almacenar, buscar, analizar y comunicar información relativa a los biomarcadores de predicción del riesgo de acontecimientos CV. El programa informático puede comprender múltiples módulos que realicen diversas funciones u operaciones, tal como un módulo de procesamiento para procesar los datos brutos y generar datos suplementarios y un módulo de análisis para analizar los datos brutos y los datos suplementarios a fin de generar un estado de predicción y/o diagnóstico de riesgo de acontecimiento CV o un cálculo de riesgo. El cálculo del estado de riesgo de un acontecimiento CV puede comprender opcionalmente generar o recopilar cualquier otra información, incluyendo adicionalmente información biomédica, sobre el estado del individuo en relación con la enfermedad, afección o acontecimiento, identificar si es conveniente realizar más pruebas o evaluar de otro modo el estado de salud de la persona.

Algunas realizaciones descritas en el presente documento pueden implementarse de modo que incluyan un producto de programa informático. Un producto de programa informático puede incluir un medio legible por ordenador que tiene código de programa legible por ordenador incorporado en el medio para hacer que un programa de aplicación se ejecute en un ordenador con una base de datos.

Como se usan en el presente documento, un "producto de programa informático" se refiere a un conjunto organizado de instrucciones en forma de enunciados en lenguaje natural o de programación que están contenidos en un soporte físico de cualquier naturaleza (por ejemplo, escritos, electrónicos, magnéticos, ópticos o de otro tipo) y que pueden usarse con un ordenador u otro sistema automatizado de tratamiento de datos. Tales afirmaciones del lenguaje de programación, cuando son ejecutadas por un ordenador o un sistema de tratamiento de datos, hacen que el ordenador o el sistema de tratamiento de datos actúe de acuerdo con el contenido particular de las afirmaciones. Los productos de programas informáticos incluyen, sin limitación: programas en código fuente y objeto y/o bibliotecas de pruebas o datos incluidos en un medio legible por ordenador. Adicionalmente, el producto de programa informático que permite a un sistema informático o a un dispositivo de equipo de proceso de datos actuar de maneras preseleccionadas puede proporcionarse de varias formas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, código fuente original, código ensamblado, código objeto, lenguaje de máquina, versiones cifradas o comprimidas de lo anterior y todos y cada uno de sus equivalentes.

En un aspecto, se proporciona un producto de programa informático para la evaluación del riesgo o probabilidad de un acontecimiento CV. El producto de programa informático incluye un medio legible por ordenador que incorpora código de programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema informático, comprendiendo el código del programa: código que recupera datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden niveles de biomarcadores que corresponden cada uno a uno de los biomarcadores de la Tabla 1 o la Tabla 2; y código que ejecuta un método de clasificación que indica un estado de riesgo de acontecimiento CV del individuo en función de los valores del biomarcador.

En otro aspecto más, se proporciona un producto de programa informático para indicar una probabilidad o riesgo de un acontecimiento CV. El producto de programa informático incluye un medio legible por ordenador que incorpora código de programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema informático, comprendiendo el código del programa: código que recupera datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden un valor de biomarcador correspondiente a al menos un biomarcador de la muestra biológica seleccionado entre los biomarcadores proporcionados en la Tabla 1 o 2; y código que ejecuta un método de clasificación que indica un estado de riesgo de acontecimiento CV del individuo en función del valor del biomarcador.

Aunque se han descrito diversas realizaciones en forma de métodos o aparatos, debe entenderse que las realizaciones pueden implementarse mediante código acoplado a un ordenador, por ejemplo, código residente en un ordenador o accesible por el ordenador. Por ejemplo, los programas informáticos y las bases de datos podrían utilizarse para aplicar muchos de los métodos considerados anteriormente. Por lo tanto, además de las realizaciones llevadas a cabo por el hardware, también se observa que estas realizaciones pueden lograrse mediante el uso de un artículo de fabricación comprendido en un medio utilizable por ordenador que tiene un código de programa legible por ordenador incorporado en el mismo, que provoca la habilitación de las funciones divulgadas en esta descripción. Por lo tanto, se desea que las realizaciones también se consideren protegidas por esta patente en sus medios de código de programa. Adicionalmente, las realizaciones se pueden incorporar como código almacenado en una memoria legible por ordenador de prácticamente cualquier tipo, incluido, sin limitación, RAM, ROM, medios magnéticos, medios ópticos o medios magneto-ópticos. Incluso de forma más general, las realizaciones podrían implementarse en software, o en hardware, o en cualquier combinación de los mismos, incluidos, aunque no de forma limitativa, software que se ejecuta en un procesador de propósito general, microcódigo, conjuntos lógicos programables (PLA) o circuitos integrados de aplicación específica (ASIC).

También se prevé que las realizaciones puedan llevarse a cabo como señales informáticas incorporadas en una onda portadora, así como señales (por ejemplo, eléctricas y ópticas) propagadas a través de un medio de transmisión. Por lo tanto, los distintos tipos de información considerados anteriormente podrían formatearse en una estructura, tal como una estructura de datos, y transmitida como una señal eléctrica a través de un medio de transmisión o almacenada en un medio legible por ordenador.

También se observa que muchas de las estructuras, materiales, y los actos citados en el presente documento pueden citarse como medios para realizar una función o etapa para realizar una función. Por lo tanto, debe entenderse que dicha lengua está titulada para abarcar todas las estructuras de este tipo, materiales o actos divulgados dentro de esta memoria descriptiva y sus equivalentes.

La utilización de los biomarcadores divulgados en el presente documento y los diversos métodos para determinar los valores de los biomarcadores se describen en detalle anteriormente con respecto a la evaluación del riesgo de un acontecimiento CV. Sin embargo, la aplicación del proceso, el uso de biomarcadores identificados, y los métodos para determinar los valores de los biomarcadores son totalmente aplicables a otros tipos específicos de afecciones cardiovasculares, a cualquier otra enfermedad o afección médica, o a la identificación de individuos que puedan o no beneficiarse de un tratamiento médico auxiliar.

Otros métodos

En algunas realizaciones, los biomarcadores y métodos descritos en el presente documento se utilizan para determinar una prima de seguro médico o una decisión de cobertura y/o una prima de seguro de vida o una decisión de cobertura. En algunas realizaciones, los resultados de los métodos descritos en el presente documento se utilizan para determinar una prima de seguro médico y/o una prima de seguro de vida. En algunos de dichos casos, una organización que proporciona seguros médicos o seguros de vida solicita u obtiene de otro modo información relativa al riesgo o la probabilidad de que un sujeto sufra un acontecimiento CV y utiliza esa información para determinar una prima de seguro médico o de seguro de vida adecuada para el sujeto. En algunas realizaciones, la prueba es solicitada y pagada por la organización que proporciona el seguro médico o el seguro de vida. En algunas realizaciones, la prueba la utiliza el posible adquirente de una consulta o sistema sanitario o empresa para predecir futuras obligaciones o costes en caso de que la adquisición siga adelante.

En algunas realizaciones, los biomarcadores y métodos descritos en el presente documento se utilizan para predecir y/o gestionar la utilización de recursos médicos. En algunas de dichas realizaciones, los métodos no se llevan a cabo con el fin de tal predicción, pero la información obtenida del método se usa en tal predicción y/o gestión de la utilización de los recursos médicos. Por ejemplo, un centro de pruebas u hospital puede reunir información de los presentes métodos para muchos sujetos con el fin de predecir y/o gestionar la utilización de recursos médicos en un centro en particular o en una zona geográfica concreta.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente a título ilustrativo y no están previstos para limitar el ámbito de aplicación de la solicitud tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Las técnicas rutinarias de biología molecular descritas en los siguientes ejemplos pueden llevarse a cabo como se describe en los manuales de laboratorio estándar, tales como Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001).

Ejemplo 1: Ejemplos de detección de biomarcadores mediante aptámeros

Se describe un ejemplo de método de detección de una o más proteínas biomarcadoras en una muestra, por ejemplo, en Kraemeret al.,PLoS One 6(10): e26332, y se describe a continuación. Se describen tres métodos diferentes de cuantificación: hibridación basada en micromatrices, un método Luminex basado en esferas y qPCR.

Reactivos

HEPES, NaCl, KCl, EDTA, EGTA, MgCb y Tween-20 pueden adquirirse, por ejemplo, en Fisher Biosciences. La sal sódica de sulfato de dextrano (DxSO4), de peso molecular nominal 8.000, pueden adquirirse, por ejemplo, en AIC y se dializa contra agua desionizada durante al menos 20 horas con un intercambio. La<a>D<n>polimerasa<k>O<d>EX puede adquirirse, por ejemplo, en VWR. El cloruro de tetrametilamonio y CAPSO pueden adquirirse, por ejemplo, en Sigma-Aldrich y estreptavidina-ficoeritrina (SAPE) puede adquirirse, por ejemplo, en Moss Inc. El clorhidrato de 4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilfluoruro (AEBSF) puede adquirirse, por ejemplo, en Gold Biotechnology. Las placas de 96 pocillos recubiertas de estreptavidina pueden adquirirse, por ejemplo, en Thermo Scientific (Pierce Streptavidin Coated Plates HBC, transparentes, de 96 pocillos, número de producto 15500 o 15501). La NHS-PEO4-biotina puede adquirirse, por ejemplo, en Thermo Scientific (EZ-Link NHS-PEO4-Biotin, número de producto 21329), disuelta en DMSO anhidro y puede almacenarse congelada en alícuotas de un solo uso. IL-8, MIP-4, lipocalina-2, RANTES, MMP-7 y MMP-9 pueden adquirirse, por ejemplo, en R&D Systems. Resistina y MCP-1 pueden adquirirse, por ejemplo, en PeproTech y tPA puede adquirirse, por ejemplo, en<v>W<r>.

Ácidos nucleicos

Pueden adquirirse oligodesoxinucleótidos convencionales (incluidos los sustituidos por amina y biotina), por ejemplo, en Integrated DNA Technologies (IDT). Z-Block es un oligodesoxinucleótido monocatenario de secuencia 5'- (AC-BnBn)7-AC-3', donde Bn indica un resto de desoxiuridina sustituido por bencilo. Z-Block puede sintetizarse utilizando la química convencional de la fosforamidita. Los reactivos de captura de aptámeros también pueden sintetizarse mediante química de fosforamidita convencional, y pueden purificarse, por ejemplo, en una columna PRP-3 de 21,5*75 mm, funcionando a 80 °C en un sistema Waters Autopurification 2767 (o en un sistema semiautomatizado de la serie Waters 600), utilizando, por ejemplo, un calentador Timberline TL-600 o TL-150 y un gradiente de bicarbonato de trietilamonio (TEAB)/ACN para eluir el producto. La detección se realiza a 260 nm y se recogen fracciones a través del pico principal antes de agrupar las mejores fracciones.

Tampones

El tampón SB18 está compuesto por HEPES 40 mM, NaCl 101 mM, KCl 5 mM, MgCl25 mM y 0,05 % (v/v) de Tween 20 ajustado a pH 7,5 con NaOH. El tampón SB17 es SB18 complementado con EDTA trisódico 1 mM. El tampón PB1 está compuesto por HEPES 10 mM, NaCl 101 mM, KCl 5 mM, MgCl2 5 mM, EDTA trisódico 1 mM y 0,05 % (v/v) de Tween -20 ajustado a pH 7,5 con NaOH. El tampón de elución CAPSO consiste en CAPSO 100 mM a pH 10,0 y NaCl 1 M. El tampón de neutralización contiene HEPES 500 mM, HCl 500 mM y 0,05 % (v/v) de Tween-20. El tampón de hibridación Agilent es una formulación patentada que se suministra como parte de un kit (Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit). El tampón de lavado 1 Agilent es una formulación propia (Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1, Agilent). El tampón de lavado 2 Agilent es una formulación propia (Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2, Agilent). La solución de hibridación TMAC consiste en cloruro de tetrametilamonio 4,5 M, EDTA trisódico 6 mM, Tris-HCl 75 mM (pH 8,0) y 0,15 % (v/v) de Sarkosyl. El tampón KOD (10 veces concentrado) consiste en Tris-HCl 1200 mM, MgSO4 15 mM, KCl 100 mM, (NH4)2SO460 mM, 1 % v/v de Triton-X 100 y 1 mg/ml de BSA.

Preparación de muestras

El suero (almacenado a -80 °C en alícuotas de 100 pl) se descongela en un baño de agua a 25 °C durante 10 minutos, a continuación, se almacena en hielo antes de la dilución de la muestra. Las muestras se mezclan mediante un vórtex suave durante 8 segundos. Se prepara una solución de muestra de suero al 6% por dilución en 0,94* SB17 suplementada con MgCl20,6 mM, e Gt A trisódico 1 mM, AEBSF 0,8 mM y Z-Block 2 pM. Una porción de la solución madre de suero al 6 % se diluye 10 veces en SB17 para crear una solución madre de suero al 0,6 %. Se usan reservas del 6 % y del 0,6 %, en algunas realizaciones, para detectar analitos de alta y baja abundancia, respectivamente.

Reactivo de captura (aptámero) y preparación de la placa de estreptavidina

Los aptámeros se agrupan en 2 mezclas en función de la abundancia relativa de sus analitos afines (o biomarcadores). Las concentraciones madre son de 4 nM para cada aptámero, y la concentración final de cada aptámero es de 0,5 nM. Las mezclas madre de aptámeros se diluyen 4 veces en tampón SB17, se calientan a 95 °C durante 5 minutos y se enfrían a 37 °C durante un periodo de 15 minutos antes de usar. Este ciclo de desnaturalización-renaturalización está previsto para normalizar las distribuciones de conformadores de aptámeros y garantizar así una actividad reproducible de los aptámeros a pesar de las historias variables. Las placas de estreptavidina se lavan dos veces con 150 pl de tampón PB1 antes de usarlas.

Incubación y captura de placas

Las mezclas de aptámeros 2* enfriadas por calor (55 pl) se combinan con un volumen igual de diluciones de suero al 6 % o al 0,6 %, lo que produce mezclas que contienen un 3 % y un 0,3 % de suero. Las placas se sellan con una estera de sellado de silicona (Axymat Silicone sealing mat, VWR) y se incuban durante 1,5 h a 37 °C. A continuación, las mezclas se transfieren a los pocillos de una placa lavada de 96 pocillos con estreptavidina y se incuban en un termomezclador Eppendorf a 37 °C, con agitación a 800 rpm, durante dos horas.

Ensayo manual

A menos que se especifique de otro modo, el líquido se elimina por vertido, seguido de dos golpecitos sobre capas de papel. Los volúmenes de lavado son de 150 pl y todas las incubaciones con agitación se realizan en un termomezclador Eppendorf a 25 °C, 800 rpm. Las mezclas se eliminan mediante pipeteo y las placas se lavan dos veces durante 1 minuto con tampón PB 1 suplementado con sulfato de dextrano 1 mM y biotina 500 pM, a continuación, 4 veces durante 15 segundos con el tampón PB 1. Se añade una solución recién preparada de NHS-PEO4-biotina 1 mM en tampón PB1 (150 pl/pocillo) y se incuban las placas durante 5 minutos con agitación. Se retira la solución de NHS-biotina y las placas se lavan 3 veces con tampón PB 1 suplementado con glicina 20 mM y 3 veces con tampón PB 1. A continuación, se añaden 85 pl de tampón PB 1 suplementado con DxSO4 1 mM a cada pocillo y se irradian las placas bajo una lámpara UV BlackRay (longitud de onda nominal de 365 nm) a una distancia de 5 cm durante 20 minutos con agitación. Las muestras se transfieren a una placa fresca, lavada recubierta de estreptavidina o un pocillo no utilizado de la placa lavada de estreptavidina existente, combinando mezclas de dilución de muestra alta y baja en un único pocillo. Las muestras se incuban a temperatura ambiente con agitación durante 10 minutos. Se retira el material no adsorbido y se lavan las placas 8 veces durante 15 segundos cada una con tampón PB 1 suplementado con glicerol al 30 %. A continuación, las placas se lavan una vez con tampón PB 1. Los aptámeros se eluyen durante 5 minutos a temperatura ambiente con 100 pl de tampón de elución CAPSO. Se transfieren 90 pl del eluido a una placa HybAid de 96 pocillos y se añaden 10 pl de tampón de neutralización.

Ensayo semiautomatizado

Las placas de estreptavidina con mezclas de equilibrio adsorbidas se colocan en la cubierta de un lavador de placas BioTek EL406, que está programado para realizar las siguientes etapas: el material no adsorbido se elimina por aspiración, y los pocillos se lavan 4 veces con 300 pl de tampón PB1 suplementado con sulfato de dextrano 1 mM y biotina 500 pM. A continuación, los pocillos se lavan 3 veces con 300 pl de tampón PB1. Se añaden 150 pl de una solución recién preparada (a partir de una reserva de 100 mM en DMSO) de 1 mM de NHS-PEO4-biotina en tampón PB1. Las placas se incuban durante 5 minutos con agitación. Se aspira el líquido y se lavan los pocillos 8 veces con 300 pl de tampón PB1 suplementado con glicina 10 mM. Se añaden 100 pl de tampón PB1 suplementado con sulfato de dextrano 1 mM. Después de estas etapas automatizadas, las placas se retiran del lavador de placas y se colocan en un termoagitador montado bajo una fuente de luz UV (BlackRay, longitud de onda nominal 365 nm) a una distancia de 5 cm durante 20 minutos. El termoagitador se ajusta a 800 rpm y 25 °C. Tras 20 minutos de irradiación, las muestras se transfieren manualmente a una placa de estreptavidina recién preparada lavada (o a un pocillo no utilizado de la placa lavada existente). Las mezclas de reacción de alta abundancia (3 % de suero+3 % de mezcla de aptámeros) y de baja abundancia (0,3 % de suero+0,3 % de mezcla de aptámeros) se combinan en un único pocillo en este punto. Esta placa "Catch-2" se coloca en la cubierta del lavador de placas BioTek EL406, que está programado para realizar las siguientes etapas: la placa se incuba durante 10 minutos con agitación. Se aspira el líquido y se lavan los pocillos 21 veces con 300 pl de tampón PB1 suplementado con glicerol al 30 %. Los pocillos se lavan 5 veces con 300 pl de tampón PB1 y se aspira el último lavado. Se añaden 100 pl de tampón de elución CAPSO y se eluyen los aptámeros durante 5 minutos con agitación. Siguiendo estas etapas automatizadas, a continuación, se retira la placa de la cubierta del lavador de placas y se transfieren manualmente alícuotas de 90 pl de las muestras a los pocillos de una placa HybAid de 96 pocillos que contiene 10 pl de tampón de neutralización.

Hibridación en micromatrices Agilent 8*15k personalizadas

Se transfieren 24 pl de la fracción eluida neutralizada a una nueva placa de 96 pocillos y a cada pocillo se añaden 6 pl de 10* Agilent Block (Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit, Large Volume, Agilent 5188-5380), que contiene un conjunto de controles de hibridación compuesto por 10 aptámeros Cy3. Se añaden 30 pl de tampón de hibridación Agilent 2* a cada muestra y se mezclan. Se pipetean manualmente 40 pl de la solución de hibridación resultante en cada "pocillo" del portaobjetos con junta de hibridación (Hybridization Gasket Slide, formato de 8 micromatrices por portaobjetos, Agilent). Los portaobjetos de micromatrices Agilent personalizadas, con 10 sondas por matriz complementarias a la región aleatoria de 40 nucleótidos de cada aptámero con un enlazador 20* dT, se colocan en los portaobjetos de la junta siguiendo el protocolo del fabricante. El conjunto (Hybridization Chamber Kit - SureHybenabled, Agilent) se sujeta y se incuba durante 19 horas a 60 °C mientras se rota a 20 rpm.

Lavado posterior a la hibridación

Se colocan aproximadamente 400 ml de tampón de lavado 1 Agilent en cada una de las dos placas de tinción de vidrio separadas. Los portaobjetos (no más de dos a la vez) se desmontan y separan mientras se sumergen en el tampón de lavado 1, a continuación se transfieren a una gradilla de portaobjetos en una segunda cubeta de tinción que también contenga tampón de lavado 1. Los portaobjetos se incuban durante 5 minutos adicionales en tampón de lavado 1 con agitación. Los portaobjetos se transfieren al tampón de lavado 2 preequilibrado a 37 °C y se incuban durante 5 minutos con agitación. Los portaobjetos se transfieren a una cuarta cubeta de tinción que contiene acetonitrilo y se incuban durante 5 minutos con agitación.

Imágenes en micromatrices

Los portaobjetos de micromatrices se visualizan con un sistema de escáner de micromatrices Agilent G2565CA, utilizando el canal Cy3 a una resolución de 5 pm con un ajuste de PMT del 100 % y la opción XRD activada a 0,05. Las imágenes TIFF resultantes se procesan utilizando el software de extracción de características Agilent versión 10.5.1.1 con el protocolo GE1_105_Dec08.

Diseño de sonda Luminex

Las sondas inmovilizadas en esferas tienen 40 desoxinucleótidos complementarios al extremo 3' de la región aleatoria de 40 nucleótidos del aptámero diana. La región complementaria del aptámero está acoplada a las microesferas Luminex mediante un enlazador de hexaetilenglicol (HEG) con un aminoterminal 5'. Los desoxioligonucleótidos de detección biotinilados comprenden 17-21 desoxinucleótidos complementarios a la región 5' del cebador de los aptámeros diana. Las moléculas de biotina se añaden a los extremos 3' de los oligos de detección.

Acoplamiento de sondas a microesferas Luminex

Las sondas se acoplan a las microesferas Luminex Microplex siguiendo prácticamente las instrucciones del fabricante, pero con las siguientes modificaciones: las cantidades de oligonucleótidos aminoterminales son de 0,08 nMol por 2,5*106 microesferas, y la segunda adición de EDC es de 5 pl a 10 mg/ml. Las reacciones de acoplamiento se realizan en un Eppendorf Termoagitador a 25 °C y 600 rpm.

Hibridación con microesferas

Las soluciones madre de microesferas (alrededor de 40000 microesferas/pl) se agitan en vórtex y se someten a sonicación en un limpiador ultrasónico Health Sonics (Modelo: T1,9C) durante 60 segundos para suspender las microesferas. Las microesferas en suspensión se diluyen hasta 2000 microesferas por reacción en soluciones de hibridación TMAC 1,5* y se mezclan mediante vórtex y sonicación. Se transfieren 33 pl por reacción de la mezcla de esferas a una placa HybAid de 96 pocillos. Se añaden a cada reacción 7 pl de oligonucleótido de detección biotinilado 15 nM en tampón TE 1* y se mezclan. Se añaden 10 pl de muestra de ensayo neutralizada y se sella la placa con una caperuza de silicona. La placa se incuba primero a 96 °C durante 5 minutos y luego se incuba a 50 °C sin agitación durante toda la noche en un horno de hibridación convencional. Una placa filtrante (Dura pore, Millipore número de pieza MSBVN1250, tamaño de poro de 1,2 pm) se humedece previamente con 75 pl de solución de hibridación 1* TMAC suplementada con 0,5 % (p/v) de BSA. Todo el volumen de muestra de la reacción de hibridación se transfiere a la placa de filtro. La placa de hibridación se enjuaga con 75 pl de solución de hibridación TMAC 1* que contiene 0,5 % de BSA y el material restante se transfiere a la placa de filtro. Las muestras se filtran a vacío lento, con 150 pl de tampón evacuados durante aproximadamente 8 segundos. La placa de filtro se lava una vez con 75 pl de solución de hibridación 1* TMAC que contiene 0,5 % de BSA y las microesferas de la placa de filtro se resuspenden en 75 pl de solución de hibridación 1* TMAC que contiene 0,5 % de BSA. La placa de filtro se protege de la luz y se incuba en un Termomezclador Eppendorf R durante 5 minutos a 1000 rpm. A continuación, se lava la placa filtrante una vez con 75 pl de solución de hibridación TMAC 1* con 0,5 % de BSA. A cada reacción se añaden 75 pl de 10 pg/ml de ficoeritrina estreptavidina (SAPE-100, MOSS, Inc.) en solución de hibridación 1* TMAC y se incuban en el Termomezclador Eppendorf R a 25 °C a 1000 rpm durante 60 minutos. La placa de filtro se lava dos veces con 75 pl de solución de hibridación 1* TMAC que contiene 0,5 % de BSA y las microesferas de la placa de filtro se resuspenden en 75 pl de solución de hibridación 1* TMAC que contiene 0,5 % de BSA. A continuación, la placa de filtro se incuba protegida de la luz en un Termomezclador Eppendorf R durante 5 minutos, 1000 rpm. A continuación, se lava la placa filtrante una vez con 75 pl de solución de hibridación TMAC 1* con 0,5 % de BSA. Las microesferas se resuspenden en 75 pl de solución de hibridación TMAC 1* suplementada con 0,5 % de BSA, y se analizan en un instrumento Luminex 100 que ejecuta el software XPonent 3.0. Se cuentan al menos 100 microesferas por tipo de esfera, con una calibración alta del PMT y un ajuste del discriminador de dobletes de 7500 a 18000.

Lectura QPCR

Las curvas estándar para qPCR se preparan en agua en un intervalo de 108 a 102 copias con diluciones 10 veces mayores y un control sin molde. Las muestras de ensayo neutralizadas se diluyen 40 veces en diH2O. La mezcla maestra qPCR se prepara a una concentración final de 2* (tampón 2* KOD, mezcla de dNTP 400 pM, mezcla de cebadores directo e inverso 400 nM, 2* Verde SYBR I y 0,5 U de KOD EX). Se añaden 10 pl de la mezcla maestra 2* qPCR a 10 pl de muestra de ensayo diluida. La qPCR se realiza en un BioRad MyIQ iCycler con 2 minutos a 96 °C seguidos de 40 ciclos de 96 °C durante 5 segundos y 72 °C durante 30 segundos.

Ejemplo 2. Modelo de ICFEr y predicción de acontecimientos cardiovasculares

Para predecir el riesgo o la probabilidad de que una persona con ICFEr tenga un acontecimiento CV dentro de un año, se desarrolló un modelo que contenía un panel de 16 proteínas biomarcadoras. El acontecimiento CV se definió como muerte. El análisis de entrenamiento se desarrolló utilizando el conjunto de datos del Penn Heart Failure Study (PHFS) de Bristol Myers Squibb (BMS). El PHFS incluye 1.345 pacientes y 360 acontecimientos. El estudio Henry Ford Heart Failure (HFHF) incluye 620 pacientes y 222 acontecimientos. El estudio Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) incluye 44 pacientes y 25 acontecimientos. Los datos de la visita 5 de ARIC y el conjunto de datos de Henry Ford se usaron para verificar el perfeccionamiento.

La Tabla 3A muestra la estratificación de los conjuntos de datos para el desarrollo del modelo de ICFEr (entrenamiento y verificación) y la validación.

TABLA 3A

El modelo ICFEr es un modelo de supervivencia de tiempo de fallo acelerado (AFT, por sus siglas en inglés) con una distribución de Weibull. Este modelo tiene 17 aptámeros como sus características. En total, los 17 aptámeros se unen a 16 proteínas biomarcadoras diferentes, que se enumeran en la Tabla 1. El resultado de este modelo es la probabilidad de supervivencia en el momento especificado, que es (1-p(muerte por todas las causas en el punto temporal)). Por lo tanto, el resultado es un número entre 0 y 1, siendo 0 la menor probabilidad de supervivencia (mayor riesgo) y 1 la mayor probabilidad de supervivencia (menor riesgo). La lista de características se refinó utilizando varias iteraciones de modelos de supervivencia Lasso AFT repetidos, y el modelo final se entrenó utilizando métodos de regresión AFT no penalizados.

Resultados generales

Cada modelo ajustado es un modelo de regresión del tiempo de fallo acelerado con distribución Weibull, utilizando un ajuste de una combinación lineal de los respectivos valores de los reactivos. El índice de concordancia (índice C) se calculó comparando la concordancia de las probabilidades de riesgo a 1 año predichas desde cada modelo respectivo con el tiempo hasta la muerte o la censura en los datos de entrenamiento.

Los valores del índice C y del área bajo la curva ROC (AUC) para usar el modelo en la predicción de la muerte dentro del plazo especificado figuran en la Tabla 3B a continuación.

Tabla 3B

Desarrollo de modelos

La Tabla 4A muestra el número de individuos que experimentan la muerte a los 6 meses, 1 año, en cualquier momento del estudio y en ningún momento del estudio, desglosados por entrenamiento/verificación/validación y por conjunto de datos.

TABLA 4A

continuación

Los datos demográficos de la parte de la cohorte de desarrollo de PHFS utilizada en el conjunto de datos de formación, el conjunto de datos de la visita ARIC 5 y el conjunto de datos Henry Ford utilizados en la verificación y el conjunto de datos PHFS y Henry Ford (HFHF) utilizado en la validación se muestran en la Tabla 4B-4D a continuación.

Tabla 4B: Cohorte de desarrollo de PHFS para los conjuntos de datos de entrenamiento, verificación y validación

continuación

Para garantizar la calidad de los datos, se realizaron etapas de preprocesamiento antes de analizar los datos. Las etapas de preprocesamiento incluían el control de calidad (CC) de los datos y los preanálisis.

El control de calidad de los datos de CC en la PHFS mostró que 29 muestras no superaron la comprobación de filas, lo que significa que al menos uno de los factores de escala de hibridación o tres medianas estaban fuera del intervalo de 0,4 a 2,5, indicando cuestiones técnicas (por ejemplo, atascos) con esa muestra en particular que no se solucionarían volviendo a analizar la muestra. Adicionalmente, había 12 muestras atípicas con al menos un 5 % de mediciones a más de 6 DMA de la señal mediana. Estas 41 muestras en total (1,1 %) se eliminaron de los análisis posteriores. Por último, todos los analitos que no superaron la prueba de especificidad de confirmación de diana se eliminaron del conjunto de datos.

El control de calidad de los datos de Henry Ford mostró que 24 muestras no superaron la comprobación de filas y fueron eliminadas. Es decir, el 3,7% de los 644 pacientes con HFFEr de ese conjunto. No había muestras atípicas en este conjunto de datos.

El control de calidad de los datos de la Visita 5 ARIC no mostró fallos en la comprobación de filas ni valores atípicos, por lo que no se eliminó ninguna muestra.

Los análisis previos no mostraron evidencias de relaciones sólidas entre cualquiera de las variables clínicas exploradas (edad, sexo, etnia, estado diabético, IMC, estado de la ICFEp/ICFEr, estado del acontecimiento y TFGe) y los factores de escala de normalización en cualquiera de los conjuntos de datos.

Tras el control de calidad de los datos y los análisis previos, el desarrollo del modelo se llevó a cabo en dos etapas, 1) prueba de concepto (POC) y 2) perfeccionamiento.

En la etapa POC sólo se utilizaron los datos de entrenamiento. Los modelos preliminares explorados fueron Cox con regularización de red elástica, y AFT con regularización de red elástica utilizando distribuciones Weibull y log-logística, todos ellos utilizando 10 repeticiones de validación cruzada de 5 veces. Para el análisis de POC, se incluyeron el sexo y la edad en el desarrollo de los modelos iniciales de ICFEr sólo para el criterio de valoración compuesto.

Los modelos desarrollados en el perfeccionamiento usaron los conjuntos de datos PFHS, visita 5 ARIC y Henry Ford. Los datos de PHFS se dividieron 80/20 entrenamiento/validación, como en POC. Todos los datos ARIC (44 muestras) se usaron sólo para verificación. Los datos de Henry Ford se dividieron 20/80 verificación/validación.

El modelo final es un modelo AFT con una distribución Weibull, y tiene 17 características, que son 17 aptámeros. Se eligió este tipo de modelo por su rendimiento en POC.

La lista de características se elaboró mediante varias rondas repetidas de Lasso, con lambda = 100 y alfa= 0,125, utilizando modelos de red elástica AFT con tres repeticiones de validación cruzada quíntuple. El modelo se inició con las 100 características univariantes de mayor rango del análisis POC. Después de cada ronda de ajuste del modelo, se determinó manualmente un umbral para el tamaño de los coeficientes y se eliminaron de la lista las características con los coeficientes más pequeños (en valor absoluto). Esto se repitió hasta que las métricas del modelo resultante (índice C y AUC al año (365 días)) empezaron a descender en el conjunto de verificación. La lista final de 17 aptámeros se utilizó a continuación para ajustar un modelo de supervivencia AFT estándar sin parámetros de penalización. Resultados POC

Se cumplieron los criterios iniciales de rendimiento del modelo ICFEr con la muerte por todas las causas como criterio de valoración, proporcionando pruebas suficientes para pasar esta prueba al perfeccionamiento del modelo. Ni el modelo de todos los pacientes ni el modelo ICFEr para el criterio de valoración compuesto superaron los criterios de rendimiento iniciales y no se recomendó su perfeccionamiento.

Los resultados de la POC mostraron una serie de analitos significativos a diferentes niveles de p-valor ajustado a la tasa de falsos descubrimientos (FDR) para el modelo de Cox.

Esos números y porcentajes pueden observarse en la Tabla 5 para el pronóstico de Insuficiencia Cardíaca de muerte por todas las causas - prueba de fracción de eyección reducida.

Tabla 5

El modelo que obtuvo los mejores resultados fue un modelo de Cox con parámetros de penalización de regresión neta elástica, que alcanzó un índice C de 0,751. El mejor modelo log-logístico AFT alcanzó un índice C de 0,71. Ambos superan el umbral de viabilidad de Índice C > 0,67. Por la mayor interpretabilidad del modelo AFT, este era el método de utilización preferido para el perfeccionamiento. El AUC a un año para este modelo fue de 0,782.

Añadir la edad y el sexo al modelo en POC no mejoró el rendimiento del modelo y no se incluyeron en ninguno de los modelos en Perfeccionamiento.

Resultados del perfeccionamiento

El modelo final desarrollado en el perfeccionamiento para la población de ICFEr es un modelo de supervivencia AFT de 17 aptámeros que utiliza una distribución de Weibull. El modelo final no incluye parámetros de regularización (alfa y lambda).

Un modelo con 31 características logró métricas ligeramente mejores en los datos de entrenamiento y verificación, pero no fue tan estable durante el endurecimiento del modelo, por lo que fue rechazado.

El modelo se entrenó con el 80 % de los datos de la PHFS que se usaron para la POC. Las métricas de verificación se calcularon en todos los pacientes de la visita 5 ARIC con ICFEr y en el 20 % de los pacientes del Henry Ford con ICFEr. El resto de los datos (20 % de PHFS y 80 % de Henry Ford) se retuvieron para su validación. Los resultados del índice C y del AUC para usar el modelo para predecir la muerte o para predecir la variable de valoración compuesta al año se muestran en la Tabla 3B anterior.

La figura 1 muestra la probabilidad de Kaplan-Meier observada del conjunto de datos de entrenamiento, con los individuos divididos en cuartiles según la probabilidad de acontecimiento prevista a los 365 días. Las líneas están bien separadas a 180 y 365 días, como cabría esperar de un modelo de buen rendimiento.

Validación

La validación del modelo se evaluó con el 20 % de los datos del PHFS y el 80 % de los datos del Henry Ford que no se utilizaron en el desarrollo del modelo. Las predicciones son la probabilidad de supervivencia a un año. Se requieren valores mínimos de 0,7 para el índice C y el AUC a fin de superar la validación.

El AUC a 1 año (365 días) y a los 6 meses (180 días), así como el Índice C, se muestran en la Tabla 6 para los conjuntos de entrenamiento, verificación y validación. Todas las métricas de validación son superiores a las requeridas para pasar la validación. (Índice C > 0,7 y AUC > 0,7 al año y a los seis meses). Hay un ligero descenso en las tres métricas de los datos de entrenamiento a los de validación, como era de esperar.

TABLA 6

La figura 2A muestra la probabilidad de Kaplan-Meier observada del conjunto de datos de validación, con los individuos divididos en cuartiles según la probabilidad de acontecimiento prevista a los 365 días. Las líneas están bien separadas a 180 y 365 días, como cabría esperar de un modelo que funciona bien. Adicionalmente, las líneas no se cruzan después de ~45 días, que es otro indicador de que un modelo se comporta como se espera. La figura 2B muestra la probabilidad de supervivencia observada en los datos de validación cuando se estratifica por cuartiles de riesgo predicho, con intervalos de confianza del 95 % para las distintas curvas de Kaplan-Meier. El punto de corte de la probabilidad de supervivencia para cada cuartil es Q4: p < 0,813, Q3: p < 0,9; Q2 <0,942 y Q1 es > 0,942.

Los datos de las pruebas de interferencia se evaluaron para detectar posibles interferencias utilizando el modelo final. La albúmina a 1000 y 2000 mg/dl, hemoglobina a 500 y 1000 mg/dl, colesterol y valsartán no superaron la primera etapa de las pruebas de interferencia a los 365 días y a los 180 días, pero ninguno tenía un efecto mensurable sobre el índice C del modelo. Los valores de UFR fuera de intervalo se imputaron mediante winsorización durante el desarrollo del modelo. En general, los resultados de las herramientas de endurecimiento del modelo, incluyendo pruebas de interferencias y simulación de ruido de ensayo, en los datos de validación fueron satisfactorios, cumpliendo los objetivos de las métricas índice C y AUC tanto a los 365 días como a los 180 días.

Ejemplo 3: Análisis del modelo de panel de biomarcadores de ICFEr

Se analizaron paneles de biomarcadores modelo que comprendían varias combinaciones de los biomarcadores enumerados en la Tabla 1 para determinar el índice C de todas las causas de muerte dentro de un año de cada panel. Las Tablas 7 y 8 a continuación muestran los resultados del modelo cuando se midieron varias combinaciones que comprenden de 1 a 8 proteínas biomarcadoras.

Los resultados de la Tabla 7 muestran que los paneles que comprenden al menos dos de CCL 14, RNASE6, REG3A y SVEP1 o al menos dos de CCL14, RNASE6, REG3A y ADAMTSL2 se comportaron adecuadamente, con un índice C superior a 0,700.

Los resultados de la Tabla 8 también muestran que muchos paneles que comprenden ADAMTSL2, CCL14, REG3A, RNASE6oSVEP1 y comprendiendo al menos uno de GDF15, THBS2, SVEP1, RNASE1, TAGLN, RSPO4 y WFDC2 se comportaron adecuadamente, con un índice C superior a 0,700. En los paneles que comprenden SVEP1 dos veces, SVEP1 se midió utilizando dos aptámeros diferentes que se unen a SVEP1.

Tabla 7: R n imi n n l m r n n r ín x r l n indicados

continuación

T l : R n imi n n l m r n n r ín x r l n in i

(continuación)

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Ejemplo 4. Modelo de ICFEp y predicción de acontecimientos cardiovasculares

Para predecir el riesgo o la probabilidad de que una persona con ICFEp tenga un acontecimiento CV dentro de un año, se desarrolló un modelo que contenía un panel de 14 proteínas biomarcadoras. El acontecimiento CV se definió como muerte. El análisis de entrenamiento se desarrolló utilizando el conjunto de datos del estudio BMS Penn Heart Failure Study (PHFS). El PHFS incluye 1.345 pacientes y 360 acontecimientos. Para la verificación se usó una parte del conjunto de datos Henry Ford de la Universidad de Arizona (AZHF) y el conjunto de datos de la visita 5 ARIC. Los conjuntos de datos de validación son remanentes de los conjuntos de datos de PHFS, AZHF y ARIC.

La Tabla 9A muestra la estratificación de los conjuntos de datos para el entrenamiento, verificación y validación del modelo ICFEp.

TABLA 9A

El modelo ICFEp es un modelo de supervivencia de tiempo de fallo acelerado (AFT, por sus siglas en inglés) con una distribución de Weibull. Este modelo tiene 14 aptámeros como sus características. Los 14 aptámeros se unen a 14 proteínas biomarcadoras diferentes, que se enumeran en la Tabla 2. El resultado de este modelo es la probabilidad de supervivencia a un año, y las métricas tradicionales se evalúan tradicionalmente como la probabilidad inversa (es decir, probabilidad del acontecimiento). La lista de características se refinó mediante asociación univariable en conjuntos de datos de entrenamiento y verificación, una red elástica con validación cruzada para los modelos de selección de características y eliminación de los analitos con alto CV. El modelo final se entrenó utilizando métodos de regresión AFT no penalizados. Las métricas del modelo se muestran en la Tabla 9B a continuación. Los resultados de la Tabla 9B muestran que el modelo supera los criterios de rendimiento para la predicción del riesgo a 1 año en los conjuntos de datos de entrenamiento, verificación y validación.

Tabla 9B

Desarrollo de modelos

Los datos demográficos de la parte de la cohorte de desarrollo de PHFS utilizada en el conjunto de datos de formación se muestran en la Tabla 10 a continuación. Los datos demográficos de las partes de la cohorte AZHF y de la cohorte de la visita 5 ARIC utilizadas en los conjuntos de datos de verificación se muestran en las Tablas 11A y 11B, respectivamente. Los datos demográficos de las partes de las cohortes de PHFS, AZHF, visita 5 ARIC utilizadas en los conjuntos de datos de validación se muestran en la Tabla 12, respectivamente.

Tabla 10: Cohorte de desarrollo del PHFS

Tabla 11A: Cohorte de verificación de AZHF

Tabla 11B: Cohorte de verificación de la visita 5 ARIC

Tabla 12: Cohorte de validación combinada

Para garantizar la calidad de los datos, se realizaron etapas de preprocesamiento antes de analizar los datos. Las etapas de preprocesamiento incluían el control de calidad (CC) de los datos y los preanálisis.

El control de calidad de los datos mostró que 29 muestras del conjunto de datos combinado original no superaron la comprobación de filas, lo que significa que al menos uno de los factores de escala de hibridación o tres medianas estaban fuera del intervalo de 0,4 a 2,5, indicando cuestiones técnicas (por ejemplo, atascos) con esa muestra en particular que no se solucionarían volviendo a analizar la muestra. Adicionalmente, había 12 muestras atípicas con al menos un 5 % de mediciones a más de 6 DMA de la señal mediana. Estas 41 muestras en total (1,1 %) se eliminaron de los análisis posteriores. Por último, todos los analitos que no superaron la prueba de especificidad de confirmación de diana se eliminaron del conjunto de datos.

Los análisis previos no mostraron evidencias de relaciones sólidas entre cualquiera de las variables clínicas exploradas (edad, sexo, etnia, estado diabético, IMC, estado de la ICFEp/ICFEr, estado de acontecimientos y TFGe) y los factores de escala de normalización.

Tras el control de calidad de los datos y los análisis previos, el desarrollo del modelo se llevó a cabo en dos etapas, 1) prueba de concepto (POC) y 2) perfeccionamiento.

En la etapa POC sólo se utilizaron los datos de entrenamiento. Los modelos preliminares explorados fueron Cox con regularización de red elástica, y AFT con regularización de red elástica utilizando distribuciones Weibull y log-logística, todos ellos utilizando 10 repeticiones de validación cruzada de 5 veces.

Los criterios de rendimiento iniciales del modelo se cumplieron tanto para el criterio de valoración compuesto como para el de muerte por todas las causas. Adicionalmente, el modelo ICFEp entrenado en la muerte por todas las causas funcionó casi tan bien como el entrenado en el criterio de valoración compuesto en la predicción del criterio de valoración compuesto. La ICFEp perseguida en el perfeccionamiento se entrenó en la muerte por todas las causas para que se alineara con el perfeccionamiento del modelo ICFEr (véase el Ejemplo 2).

Los modelos desarrollados en el perfeccionamiento usaron los conjuntos de datos de PFHS, AZHF y visita 5 ARIC. Los datos de PHFS se dividieron 80/20 entrenamiento/validación, como en POC. AZHF se dividió 20/80 verificación/validación, para conservar un conjunto considerable de datos de validación de candidatos. Los datos de ARIC se dividieron a 50/50.

El modelo final es un modelo AFT de Weibull y tiene 14 características. Se eligió este tipo de modelo por su rendimiento en POC, coherencia con el modelo ICFEr, y capacidad para proporcionar probabilidades de riesgo estimadas.

Resultados POC

Los resultados de la POC mostraron una serie de analitos significativos a diferentes niveles de FDR para la asociación univariable de Cox con el criterio de valoración. Dichas cifras y porcentajes se muestran en la Tabla 13 a continuación para el pronóstico de ICFEp de la POC de muerte por todas las causas.

Tabla 13

El modelo que obtuvo mejores resultados fue un modelo AFT Weibull, que alcanzó un Índice C de 0,698, y un AUC de 0,81 a los 90 días y un a Uc de 0,685 a los 365 días. Ambos modelos pasaron al perfeccionamiento.

Aunque no era uno de los modelos predefinidos, también se completó la evaluación de pacientes con ICFEp entrenados en la muerte por todas las causas y evaluados en un criterio de valoración de muerte por todas las causas. El mejor modelo fue una distribución AFT de Weibull, que alcanzó un índice C de 0,718. Dado que este modelo superó el criterio POC para un índice C superior a 0,67, también pasó al perfeccionamiento.

Resultados del perfeccionamiento

El modelo final desarrollado en el perfeccionamiento para la población de ICFEp es un modelo de supervivencia AFT de 14 aptámeros que utiliza una distribución de Weibull. El modelo final no incluye parámetros de regularización (alfa y lambda). El modelo se entrenó con el 80 % de los datos de la PHFS que se usaron para la POC. Las métricas de verificación se calcularon en el 20 % de los pacientes del AZHF con ICFEp, y en el 50 % de los pacientes de la visita 5 ARIC con ICFEp. El resto de los datos se retuvieron para su validación.

El modelo se construyó utilizando una lista reducida de características univariantes superpuestas de los conjuntos de datos de derivación y verificación de AZHF, refinados además mediante la selección de características LASSO. El mejor modelo tenía un alfa de 0,2, la lambda mínima (0,1) y se observó que el mejor modelo resultante con 15 características tenía una diferencia de índice C de sólo el 1 % entre el entrenamiento y la verificación, con ambos conjuntos por encima de 0,80. Se volvió a evaluar un modelo refinado y se eliminó una característica con un CV elevado para obtener un modelo resultante de 14 características. El modelo final se evaluó para predecir un criterio de valoración de muerte por todas las causas, utilizando el índice C y el AUC a 1 año. También se evaluó la concordancia y el AUC en la predicción de un criterio de valoración compuesto de hospitalización o muerte. Los resultados de los conjuntos de datos de entrenamiento y verificación se muestran en la Tabla 14. Los intervalos de confianza (IC) del 95 % se muestran entre paréntesis.

Tabla 14

Validación

La validación del modelo se evaluó con el 20 % de los datos del PHFS y el 80 % de los datos del AZHF que no se utilizaron en el desarrollo del modelo. Un conjunto de datos de validación secundario es el 50 % de la visita 5 ARIV. Las predicciones son la probabilidad de supervivencia a un año. Se requieren valores mínimos de 0,7 para el índice C y el AUC a fin de superar la validación.

Los resultados de validación se muestran en la Tabla 15 siguiente, junto con los resultados de entrenamiento y verificación para su comparación. El AUC a 1 año (365 días) y a 6 meses (180 días), así como el Índice C, se muestran en la Tabla 15 para los conjuntos de entrenamiento, verificación y validación. Todas las métricas de validación son superiores a las requeridas para superar la validación (Índice C > 0,7 y AUC > 0,7 al año y a los seis meses).

TABLA 15

Además de las métricas de discriminación (índice C y AUC), el ajuste del modelo predictivo sobre la tasa de acontecimientos observada se observó en los conjuntos de datos de entrenamiento y validación. Usar el modelo AFT ajustado, se predijo la probabilidad de supervivencia para cada muestra respectiva en cada punto temporal discreto de 0 a 365 días.

Las Figuras 3 y 4 muestran la probabilidad de Kaplan-Meier observada de los conjuntos de datos de validación y entrenamiento, respectivamente, cuando se estratifican por cuartiles de riesgo previsto a los 365 días. Las líneas están separadas a 180 y 365 días, como cabría esperar de un modelo de buen rendimiento. Adicionalmente, las líneas no se cruzan después de ~45 días, que es otro indicador de que un modelo se comporta como se espera.

Los datos de las pruebas de interferencia se evaluaron para detectar posibles interferencias utilizando el modelo final. Sólo albúmina, hemoglobina y valsartán no superaron la primera etapa de las pruebas de interferencia a los 365 días y a los 180 días, pero ninguno de ellos afectó de forma demostrable a las métricas de rendimiento de salida del modelo durante 180 o 365 días. El modelo final tiene 14 características y predice el riesgo de mortalidad a los 365 días o a los 180 días en pacientes con ICFEp. El resultado del modelo es una probabilidad de riesgo de 0 a 1. Cumple o supera los criterios de validación de índice C y AUC en los respectivos puntos temporales del conjunto de datos de validación.

Ejemplo 5: Análisis del modelo de panel de biomarcadores de ICFEp

Se analizaron paneles de biomarcadores modelo que comprendían varias combinaciones de los biomarcadores enumerados en la Tabla 2 para determinar el índice C de todas las causas de muerte dentro de un año de cada panel. Las Tablas 16A y 16B a continuación muestran los resultados del modelo cuando se midieron varias combinaciones que comprenden de 1 a 8 proteínas biomarcadoras. Los resultados de la Tabla 16A muestran que los paneles que comprenden al menos GDF15 y RET o CHRDL1 funcionaron adecuadamente, con un índice C superior a 0,700. Adicionalmente, los paneles que comprenden al menos de dos a trece de GDF15, WFDC2, CLEC3B, GHR, MUC16, NPPB, IGFBP2, CCN5, TNNT2, HSPB6, SLPI, MMP12, RET y CHRDL1 funcionaron adecuadamente. Los resultados de la Tabla 16A y 16B muestran que los paneles que comprenden al menos tres de GDF15, WFDC2, CLEC3B, GHR, MUC16, NPPB, IGFBP2, CCN5, TNNT2, HSPB6, SLPI, MMP12, RET y CHRDL1 funcionaron adecuadamente, con un índice C superior a 0,700.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un método para cribar en un sujeto el riesgo de un acontecimiento cardiovascular (CV) o para predecir la probabilidad de que un sujeto tenga un acontecimiento CV, en donde el sujeto sufre insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada, que comprende formar un panel de biomarcadores que tiene N proteínas biomarcadoras y detectar el nivel de cada una de las N proteínas biomarcadoras en una muestra que ha sido tomada del sujeto, en donde N es al menos 3, en donde al menos dos de las N proteínas biomarcadoras son RET y CRDL1, y al menos una de las N proteínas biomarcadoras es MIC-1 y, opcionalmente, las N proteínas biomarcadoras se seleccionan entre tetranectina, pro-BNP N-terminal, TNNT2, CA125, SLPI, HE4, MMP-12, HSPB6, WISP-2, GHR e IGFBP-2, en donde la muestra es una muestra de suero y en donde el acontecimiento CV es un ictus, un accidente isquémico transitorio (AIT), un infarto de miocardio (IM), muerte y/u hospitalización por insuficiencia cardíaca.

2. El método de la reivindicación 1, en donde una de las N proteínas biomarcadoras es HE4; o

en donde una de las N proteínas biomarcadoras es tetranectina; o en donde una de las N proteínas biomarcadoras es GHR; o en donde una de las N proteínas biomarcadoras es CA125; o en donde una de las N proteínas biomarcadoras es pro-BNP N-terminal; o donde una de las N proteínas biomarcadoras es IGFBP-2; o donde una de las N proteínas biomarcadoras es WISP-2; o donde una de las N proteínas biomarcadoras es TNNT2; o donde una de las N proteínas biomarcadoras es HSPB6; o en donde una de las N proteínas biomarcadoras es SLPI; o donde una de las N proteínas biomarcadoras es MMP-12.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde todas las N proteínas biomarcadoras se seleccionan entre RET, CRDL1, tetranectina, pro-BNP N-terminal, TNNT2, CA125, MIC-1, SLPI, HE4, MMP-12, HSPB6, WISP-2, GHR y IGFBP-2.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el riesgo o la probabilidad de que el sujeto sufra un acontecimiento CV en un plazo de 1 año desde la fecha en que se tomó la muestra del sujeto se cribó o se predijo; o en donde el riesgo o la probabilidad de que el sujeto sufra un acontecimiento CV en un plazo de 180 días desde la fecha en que se tomó la muestra del sujeto se cribó o se predijo; o en donde el riesgo o la probabilidad de que el sujeto sufra un acontecimiento CV dentro de 90 días desde la fecha en que se tomó la muestra del sujeto se cribó o se predijo.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el riesgo o la probabilidad de que el sujeto sufra un acontecimiento CV en el plazo de 1 año, 180 días o 90 días desde la fecha en que se tomó la muestra del sujeto es alto si los niveles de cada una de al menos 2 de las N proteínas biomarcadoras son anormales en relación con un nivel de control de la proteína biomarcadora respectiva, opcionalmente en donde el riesgo o la probabilidad de que el sujeto sufra un acontecimiento CV en el plazo de 1 año, 180 días o 90 días desde la fecha en que se tomó la muestra del sujeto es alto si los niveles de cada una de las N proteínas biomarcadoras son anormales en relación con un nivel de control de la proteína biomarcadora respectiva.

6. El método de las reivindicaciones 4 o 5, en donde el riesgo o la probabilidad de que el sujeto sufra un acontecimiento CV en el plazo de 1 año, 180 días o 90 días desde la fecha en que se tomó la muestra del sujeto se calcula como una probabilidad de supervivencia a 1 año, 180 días o 90 días a partir de la fecha en que se tomó la muestra del sujeto.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el método comprende poner en contacto las proteínas biomarcadoras de la muestra procedente del sujeto con un conjunto de N reactivos de captura de biomarcadores, en donde cada reactivo de captura del conjunto de reactivos de captura se une específicamente a una proteína biomarcadora detectada.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde N es 3 o N es 4 o N es 5 o N es 6 o N es 7 o N es 8 o N es 9 o N es 10 o N es 11 o N es 12 o N es 13 o N es 14.

9. El método de la reivindicación 7, en donde cada uno de los N reactivos de captura de biomarcadores es un anticuerpo o un aptámero.

10. El método de la reivindicación 9, en donde cada reactivo de captura de biomarcadores es un aptámero, opcionalmente en donde al menos un aptámero es un aptámero de velocidad de disociación lenta,

en donde cada aptámero de velocidad de disociación lenta se une a su proteína diana con una velocidad de disociación (ty2) de • 30 minutos, • 60 minutos, • 90 minutos, • 120 minutos, • 150 minutos, • 180 minutos, • 210 minutos o • 240 minutos y/o

en donde al menos un aptámero de velocidad de disociación lenta comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos 10 nucleótidos con modificaciones.