ES3041577T3 - Compositions comrising an opioid growth factor receptor (ogfr) antagonist for use in promoting bone formation and in the treatment of cancer. - Google Patents

Compositions comrising an opioid growth factor receptor (ogfr) antagonist for use in promoting bone formation and in the treatment of cancer.

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ES3041577T3 ES21170355T ES21170355T ES3041577T3 ES 3041577 T3 ES3041577 T3 ES 3041577T3 ES 21170355 T ES21170355 T ES 21170355T ES 21170355 T ES21170355 T ES 21170355T ES 3041577 T3 ES3041577 T3 ES 3041577T3
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Abstract

Esta divulgación se refiere a métodos para promover la formación ósea o reducir la destrucción ósea. También se refiere a métodos para promover el reclutamiento de células madre mesenquimales (MSC) en el sitio de una lesión o intervención quirúrgica en el hueso para promover la curación. Además, se refiere a métodos para reducir o prevenir la formación de minerales o el crecimiento óseo, o para reducir la masa ósea. Los métodos divulgados aquí son útiles para tratar afecciones como la osteorradionecrosis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones que comprenden un antagonista del receptor del factor de crecimiento opioide (OGFR) para<su uso>en la estimulación de la formación ósea y en el tratamiento del cáncer
La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos N.s 62/005.359, presentada el 30 de mayo de 2014.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un antagonista del receptor del factor de crecimiento opioide (Opioid Growth Factor Receptor, OGFR) para estimular la formación ósea o reducir la destrucción ósea en un lugar de lesión o de intervención quirúrgica, en donde el antagonista del OGFR se administra localmente en el lugar de la lesión o de la intervención quirúrgica.
Técnica anterior
La formación y la degradación óseas están estrechamente reguladas por la señalización del factor de crecimiento entre los osteoblastos, responsables de la formación ósea, y los osteoclastos, responsables de la reabsorción ósea. El acoplamiento de la formación ósea por los osteoblastos con la degradación por los osteoclastos se ha convertido recientemente en un tema de intenso estudio; con la ampliación de la lista de factores de crecimiento identificados como factores de acoplamiento. El acoplamiento de la formación ósea con la reabsorción ósea requiere el reclutamiento de osteoblastos y osteoclastos en paralelo con el reclutamiento de sus respectivas células progenitoras. Los osteoblastos derivan de células madre mesenquimatosas (CMM), mientras que los osteoclastos derivan de monocitos que forman parte del linaje mieloide; sin embargo, sigue sin saberse cómo migran las CMM o los monocitos desde su nicho en la médula ósea hasta los lugares de formación de hueso nuevo. La comprensión actual de la regulación espacial y temporal de la osteogénesis propone que las CMM migran desde su nicho en la médula ósea hasta la superficie endosteal; donde las CMM se diferencian en osteoblastos que producen hueso nuevo. En paralelo, los monocitos también migran desde su nicho en la médula ósea a la superficie endosteal; donde posteriormente se diferencian en osteoclastos que reabsorben el hueso. Entre los factores de crecimiento que regulan la formación ósea se encuentran los ligandos de TGFp-, BMP- y de Wnt canónicos. La formación de osteoclastos a partir de precursores de monocitos y la reabsorción ósea se regulan mediante la expresión de MSCF, OPG y ligando de RANK. En paralelo, la actividad de los osteoclastos también está regulada por la expresión de los ligandos de TGFp-, BMP- y Wnt no canónicos. Sin embargo, muchos factores de crecimiento del desarrollo que intervienen en la formación de patrones tisulares, incluidos los ligandos de TGFp-, BMP- y Wnt, estimulan la formación y reabsorción óseas. El mantenimiento de un hueso sano requiere una remodelación constante, en la que el hueso se fabrica y destruye continuamente.
La introducción de un implante en el hueso da lugar a una cascada bioquímica que impulsa la respuesta proinflamatoria que está parcialmente mediada por la actividad de los macrófagos, que derivan del linaje mieloide y pueden contribuir a la degradación del hueso o de un material de implante. En la actualidad, los implantes y los materiales de los implantes se eligen para minimizar la respuesta de los macrófagos y, al mismo tiempo, ser osteoconductores óptimos y estimular la máxima integración hueso-implante. Como alternativa, la introducción de autoinjerto con un implante o el uso de injerto de tejido óseo desvitalizado (autoinjerto) se ha empleado junto con las propiedades materiales de un implante como medio para aumentar la osteointegración; sin embargo, estos abordajes han sido a menudo problemáticos. Idealmente, los materiales podrían diseñarse para que se autoorganizaran y autoensamblaran.
La generación de hueso como abordaje terapéutico adyuvante empleado durante procedimientos traumatológicos ortopédicos o durante procedimientos rutinarios de fusión vertebral representa un reto continuo en la cirugía ortopédica. Específicamente, estas terapias adyuvantes generadoras de hueso pretenden aumentar el crecimiento de hueso sano en el lugar de la intervención quirúrgica, al tiempo que reducen el tiempo de cicatrización del hueso. En las últimas décadas se ha intentado utilizar diversos factores de crecimiento con potencial osteogénico, incluida la proteína morfogénica ósea (Bone Morphogenic Protein, BMP). Por desgracia, las terapias basadas en BMP destinadas a generar hueso también conllevan un riesgo de tumorigénesis en los pacientes, en particular los que puedan estar sometidos a radioterapia o posean un tumor incipiente no detectado. Además, las terapias basadas en BMP no pueden utilizarse en pacientes con tumor activo, lo cual es especialmente desafortunado, ya que estos pacientes se beneficiarían significativamente de terapias que aumenten la formación ósea durante la intervención quirúrgica.
El deterioro de la cicatrización de fracturas sigue representando un reto importante en la cirugía ortopédica y la curación ósea. Se han notificado tasas de no consolidación de fracturas de hasta el 5-20 %. La morbilidad y el coste asociados al tratamiento de los pacientes que desarrollan no-uniones pueden ser considerables. Aproximadamente el 10 % de los 6,2 millones de fracturas que se producen cada año tienen dificultades para cicatrizar. Existen varias opciones para ayudar a acelerar la cicatrización ósea, con una eficacia no demostrada. El injerto óseo de la cresta ilíaca sigue considerándose el patrón oro, pero presenta importantes problemas relacionados con la comorbilidad del lugar de extracción. Las terapias basadas en factores de crecimiento que incluyen el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de fibroblastos (Fibroblast Growth Factor, FGF) y hormona paratiroidea (Parathyroid Hormone, PTH) han demostrado un éxito inicial en estudios de cultivo celular; sin embargo, su eficacia sigue sin demostrarse en la aplicación clínica. Una opción adicional, tal como la proteína mortogénioa ósea 2 (BMP2) y la BMP7, ha demostrado tener éxito en la aceleración de la curación de fracturas diafisarias. Sin embargo, existen riesgos asociados al uso de BMP que incluyen el aumento de la infección, mayor riesgo de crecimiento tumoral y mayor riesgo de osteólisis local. Muchos de los riesgos asociados a los tratamientos que incluyen BMP también impiden el uso de BMP en pacientes con otras patologías.
La capacidad terapéutica de aumentar la formación ósea, como adyuvante durante la cirugía ortopédica, sin aumentar el potencial de crecimiento tumoral es actualmente una limitación de las biologías disponibles en el mercado, en el tratamiento de problemas ortopédicos complejos, tales como la fusión de la columna vertebral, la curación de fracturas y el tratamiento de fracturas no consolidadas.
En el campo de la traumatología ortopédica, especialmente en fracturas abiertas con grandes defectos y no consolidadas; las principales opciones de tratamiento son los injertos óseos autógenos o alogénicos. Sin embargo, el injerto óseo autógeno, utilizado como patrón oro para lograr la formación de hueso, tiene riesgos de infección y dolor en la zona donante. Otros sustitutos de injerto óseo alogénico han mostrado una cicatrización deficiente cuando se utilizan de forma aislada. Las mismas limitaciones existen para las cirugías de columna vertebral cuando se utilizan estas opciones de injerto para lograr fusiones.
El hueso cortical y esponjoso derivado de fuentes de cadáveres sirve para rellenar el espacio y es principalmente osteoconductor sin un potencial osteoinductor significativo. Por lo tanto, sustancias biológicas tales como PDGF, VEGF y BMP se utilizan para aumentar las tasas de cicatrización o fusión de la columna vertebral, y su aplicación aumenta el coste del tratamiento. Sin embargo, estas terapias biológicas estimulan la proliferación durante el desarrollo en una serie de fenotipos celulares, que presenta un riesgo tumoral inherente e inaceptable.
La matriz ósea desmineralizada y los sustitutos de fosfato cálcico no han demostrado una gran eficacia en la cicatrización ósea acelerada y, además, tienen un coste significativo asociado debido a los costes de producción.
La BMP2 recombinante (rhBMP2) es un implante desarrollado comercialmente por Medtronic conocido como INFUSE que se distribuye en tamaños pequeño (4,2 mg de BMP2 con 2x esponjas de colágeno para un implante de 15 mg/ cm3), mediano (8,4 mg de BMP2 con 4x esponjas de colágeno para un implante de 15 mg/ cm3), grande (12 mg de BMP2 con 6x esponjas de colágeno para un implante de 15 mg/ cm3 ) y grande-II (12 mg de BMP2 con 1x esponja de colágeno para un implante de 15 mg/ cm3). Todos los tamaños del implante INFUSE están aprobados para aplicaciones de columna vertebral y maxilofaciales, mientras que sólo el implante grande-II está aprobado para fracturas. El implante INFUSE se administra reconstituyendo la BMP2 en polvo con solución salina estéril y añadiendo a continuación la solución salina de BMP2 a la esponja de colágeno; tras lo cual el implante se suministra localmente durante la intervención quirúrgica.
La BMP7 recombinante (rhBMP7 u OP1) es un implante desarrollado comercialmente por Stryker y ahora propiedad de Olympus conocido como OP1. Los implantes OP1 se distribuyen como OP1-masilla (vial de 20 ml que contiene cartílago bovino en polvo y 3,3 mg de BMP7) o implante OP1 (1 g de cartílago bovino en polvo y 3,3 mg de BMP7). OP1-masilla está aprobado para cirugías de fusión de la columna vertebral, mientras que el implante OP1 está aprobado para el tratamiento de fracturas y cirugía de fracturas no consolidadas. OP1 -masilla o el implante OP1 se administra, reconstituyendo primero la BMP7 en polvo con solución salina estéril y añadiendo después la solución salina de BMP7 al implante de colágeno; tras lo cual el implante se suministra localmente durante la intervención quirúrgica.
El receptor del factor de crecimiento opioide (OGFR o receptor Z-opioide) es un receptor opioide perinuclear no canónico que no comparte homología estructural con los receptores opioides p, k y ó canónicos (OPRM, OPRK y OPRD, respectivamente) y se une a los ligandos opioides nativos con menos eficacia que los receptores opioides canónicos. El factor de crecimiento opioide (OGF o met-5 encefalina; met5) es el ligando nativo del OGFR. Met5 deriva de la prohormona pro-encefalina (PENK) y, en menor medida, de la pro-opiomelanocortina (POMC), que primero son reducidas por la prohormona convertasa (PCSK1 y PCSK2) y después por la carboxipeptidasa E o D (CPE o CPD; encefalina convertasa) para formar cinco copias de met5-encefalina. T rabajos anteriores identificaron la expresión de met5 en osteoblastos y osteoprogenitores (Rosenet a l,Proc Natl Acad Sci 88(9):3705-9, 1991; Rosenet al.,J Bone Miner Res. 13(10):1515-20, 1998; Elhassanet al.,J Bone y Miner Res., 13(1): 88-95, 1998; Chenget al.,Mol Biol Cell.
20(1):319-27, 2009). Adicionalmente, Kuiset al.identificaron met5 en monocitos de la sangre periférica y el bazo (Kuiset al.,J Clin Invest. 88(3):817-24, 1991). No obstante, estos investigadores no lograron identificar la importancia funcional de la señalización de OGFR en linajes mesenquimatosos o mieloides. Elhassanet al.(J Bone y Miner Res, 13(1): 88-95, 1998) divulgan la presencia de met5 en tejidos óseos y articulares. Sin embargo, no existe ninguna relación demostrable entre met5 y la formación ósea. El documento WO 97/39767 A1 divulga métodos para inducir la formación de hueso utilizando la proteína leptina. El documento US 2012/100114 A1 divulga células madre mesenquimatosas, pretratadas con 2-cloro-5-nitro-N-fenil-benzamida para mostrar características osteogénicas y vehículos para la regeneración, reparación y reconstrucción tisular. Petrizzi, L.et al.(BMC Musculoskeletal Disorders, 2007, Vol. 8, página 43) divulgan un estudio preliminar sobre el efecto de la naloxona parenteral en asociación facultativa con gluconato de calcio sobre la cicatrización ósea en un sistema modelo de "perforación" ovina. El documento US 2007/197673 A1 divulga composiciones y métodos en el tratamiento de trastornos metabólicos óseos utilizando antagonistas periféricos de Ios receptores opioides, Kim D.H.et al,(Nature Review Genetios, 2007, VoI. 8, pág. 173-184) divulga estrategias para silenciar enfermedades humanas mediante ARN de interferencia. El documento WO 2006/044334 A2 divulga la estimulación del crecimiento óseo, periodontio, ligamento o cartílago de un mamífero aplicando sobre el hueso, periodontio, ligamento o cartílago una composición que comprende factor de crecimiento derivado de plaquetas. El documento US 2011/165218 divulga el uso de Heparán Sulfato 2 (HS-2) en el crecimiento y la regeneración ósea terapéuticos. Roseet al,(J. Pharmacy and Pharmacology, 2004, Vol. 56, pág. 415-427) divulga sistemas de administración de factores de crecimiento óseo. Zagonet al,(Brain Research Reviews, Vol. 38, 2002, pág. 351 -376) es una revisión sobre la biología del receptor del factor de crecimiento opioide (OGFr).
Sumario de la divulgación
La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. En el presente documento se ha identificado que la inhibición de la señalización del factor de crecimiento opioide, estimula la formación de hueso y/o reduce la destrucción de hueso. Sin desear quedar ligados a teoría particular alguna, se cree que la inhibición de la señalización del factor de crecimiento opioide a través del receptor del factor de crecimiento opioide (OGFR) es eficaz para estimular la formación ósea y/o reducir la destrucción ósea. Se ha demostrado en el presente documento que la inhibición de la señalización del factor de crecimiento opioide estimula la formación de hueso en un animal mediante la administración local de un inhibidor de la vía de señalización del factor de crecimiento opioide (OGFR) directamente en el lugar donde se desea la formación de hueso. También se ha demostrado que la administración de un inhibidor de la vía de señalización del factor de crecimiento opioide directamente en el lugar donde se desea la formación ósea es necesaria para estimular la diferenciación de las CMM para que se conviertan en osteoblastos y evitar la diferenciación de los monocitos en osteoclastos, que conduce al aumento de la mineralización y el aumento de la formación de hueso en un sitio de lesión ósea o cirugía.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a medios para estimular la formación ósea o reducir la destrucción ósea tal como se describe en las reivindicaciones adjuntas, administrando a un animal que lo necesite, una cantidad de un antagonista del receptor del factor de crecimiento opioide como se describe en las reivindicaciones directamente en un lugar donde se desea la formación de hueso.
En un aspecto, el antagonista del OGFR empleado en la presente invención bloquea la unión del factor de crecimiento opioide al OGFR.
En algunas realizaciones, el antagonista del OGFR que bloquea la unión del factor de crecimiento opioide (met5) al OGFR es naloxona o un derivado funcional de la misma, naltrexona o un derivado funcional de la misma o una combinación de las mismas como se especifica en las reivindicaciones y más adelante en el presente documento.
En estas realizaciones, los antagonistas del OGFR derivan de oximorfona y se unen al OGFR, que incluyen: naloxona, naltrexona, nalorfina, naloxonazina, levalorfano, nalmefeno, ciprodima, ciclorfano, ciclazocina, oxilorfano, LY113878, MR2266, diprenorfina, WIN 44.441-3, naltindol o norbinaltorfimina.
También se divulgan antagonistas del OGFR derivados de trans-3,4-dimetil-4-fenilpiperidina y que se unen al OGFR, que incluyen: LY99335, LY25506, LY117413 o LY255582.
También se divulgan antagonistas del OGFR que son derivados de los péptidos met5-encefalina o leu-encefalina, se unen al OGFR e incluyen como mínimo las siguientes secuencias de aminoácidos como medio para dirigirse al OGFR: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met (SEQ ID NO: 1) para los derivados de met5-encefalina o Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (SEQ ID NO: 2) para los derivados de leu-encefalina.
También se han divulgado antagonistas del OGFR que son derivados del péptido antagonista ICI174864 (N,N-dialil-Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-OH, SEQ ID NO: 3; Aib=ácido aminoisobutírico) o análogo de la somatostatina CTP (D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH<2>, SEQ ID NO: 4).
Otro antagonista del OGFR divulgado en el presente documento es una molécula que interrumpe la secuencia de localización nuclear que se encuentra en el OGFR: 251 QSALDYFMFAVRCRHQRRQLVHFAWEHFRPRCKFVWGPQDKLRRFKPSSL (SEQ ID NO: 5).
El antagonista del OGFR empleado en la presente invención es un ARN de horquilla pequeña (hp) o un ARN de interferencia pequeño (ip) dirigido contra el gen OGFR y eficaz para interrumpir la expresión génica de OGFR.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona medios para estimular el reclutamiento de células madre mesenquimatosas (CMM) a un lugar local de lesión o intervención quirúrgica en el hueso para estimular la curación mientras se inhibe la degradación ósea impulsada por osteoclastos (o reabsorción). Esto se basa en la administración de una cantidad de un antagonista del OGFR para estimular la formación ósea e inhibir al mismo tiempo la degradación ósea, tal como se describe en las reivindicaciones. La lesión puede ser, por ejemplo, fractura ósea o una intervención quirúrgica. En algunas realizaciones, el antagonista del OGFR se administra localmente en el lugar de la lesión o el lugar de la intervención quirúrgica.
Descripción de los dibujos
Figuras 1A-1I: (A)La adición de naloxona entre 1 pM y 1 mM con medios de osteoinduoción aumentó sustancialmente la acumulación mineral (tinción roja) en cultivos de CMM inducidos a convertirse en osteoblastos. La adición de naltrexona entre 1 pm y 1 mm con medios de osteoinducción también aumentó la mineralización, pero en menor medida que la naloxona.(B)La expresión génica del receptor opioide delta (OPRD) disminuyó sustancialmente en osteoblastos (* = p<0,001) y osteoclastos (* = p<0,0084) mientras que la expresión génica del receptor del factor de crecimiento opioide (OGFR) (C) aumentó significativamente en osteoblastos (* = p<0,02) y osteoclastos (* = p<0,0001).
(D)El ligando del OGFR, met5-encefalina (met5), deriva de una proteína precursora mayor conocida como proencefalina (PENK). La adición de met55 pM o 50 pM no tuvo ningún efecto sobre la formación de minerales en cultivo.
(E)Cabe destacar que la adición de met5 5 pM (PENK) a los medios de osteoinducción no tuvo ningún efecto sobre la acumulación de minerales, mientras que met5 50 pm disminuyó ligeramente la acumulación de minerales. Sin embargo, cuando se añadió naloxona 1 mM con met55 pM o 50 pM y medios de osteoinducción, el tratamiento con naloxona fue capaz de anular los efectos antiosteogénicos de met5.(F)La adición de medios de osteoinducción dio lugar a la formación de minerales en relación con los cultivos de control. BMP2 aumentó la formación de minerales en relación con los controles, mientras que un tratamiento único (1 dosis) con naloxona (1 mM) y dos tratamientos (2 dosis) con naloxona aumentaron la formación de minerales (tinción roja). El tratamiento con naloxona en cada cambio de medio (dosis continua) suprimió la formación de minerales.(G)La adición de naloxona a los cultivos de CMM disminuyó el número de células a las 72 y 120 horas (* = p<0,017).(H)La adición de naloxona a los cultivos de monocitos también redujo significativamente el número de células (* = p<0,0001).(I)Los monocitos cultivados para convertirse en osteoclastos no se vieron afectados por el tratamiento con met5 en relación con los cultivos de osteoclastos de control (la tinción TRAP es púrpura). La adición de naloxona 1 pM o naltrexona 1 pM no redujo significativamente el número de osteoclastos, mientras que la adición de naloxona 1 mM o naltrexona 1 mM redujo sustancialmente el número de osteoclastos.
Figuras 2A-2E: (A)Las CMM transfectadas con ARNhp de OGFR expresaron significativamente menos expresión génica de OGFR (* = p<0,0085), lo que se corroboró(B)en la disminución de OGFR en lisados de proteínas nucleares y citoplasmáticas. (C) Además, en las CMM deficientes en OGFR, la expresión del gen SMAD1 fue significativamente mayor que en las CMM de control y en los cultivos de control transfectados con GFP (* = p<0,0008).(D)La expresión del gen ID1 también aumentó en las CMM deficientes en OGFR en relación con las CMM de control y los cultivos de control transfectados con GFP (* = p<0,0217).(E)La proteína específica de osteoblastos osteocalcina (OCN) también aumentó significativamente en las CMM deficientes en OGFR inducidas a convertirse en osteoblastos en relación con los cultivos de control y el control transfectado con GFP (* = p<0,0215).
Figuras 3A-3G: (A)La adición de tratamiento con naloxona 1 mM aumentó la masa ósea (Bv/Tv) 1,53 veces (* = p<0,001) en los defectos unicorticales en relación con los defectos de control tratados con PBS o met5.(B)Imágenes de pCT de los defectos de los grupos tratados con control, naloxona o met5. (C) La masa ósea elevada (Bv/Tv) fue paralela a un aumento de 1,2 veces en el número trabecular (TbN) (* = p<0,047).(D)La administración quirúrgica de un defecto unicortical en el grupo de control quirúrgico (Control Sx) aumentó el Bv/Tv (volumen óseo corregido por volumen total) en relación con el grupo de control no quirúrgico, que corresponde a la masa ósea que se ha acumulado dentro del defecto (* = p<0,034). Los defectos tratados con un implante de colágeno bovino y PBS o met5 no fueron diferentes de los controles quirúrgicos. Sin embargo, tanto en el grupo de tratamiento con PBS (* = p<0,0021) como en el de met5 (* = p<0,0009) aumentaron significativamente en relación con el grupo de control no quirúrgico. Los defectos tratados con BMP2, naltrexona o naloxona aumentaron todos ellos en relación con los controles no quirúrgicos (* = p<0,0001). Los grupos de tratamiento con BMP2, naltrexona y naloxona aumentaron significativamente en comparación con el grupo de control quirúrgico (X = p<0,0005), el grupo de tratamiento con PBS (# = p<0,0124) y el grupo de tratamiento con met5 (+ = p<0,011). El Bv/Tv del grupo de tratamiento con BMP2 no fue diferente al del grupo de tratamiento con naltrexona, mientras que el Bv/Tv del grupo de tratamiento con naloxona aumentó significativamente (0 = p<0,035).(E)El grosor trabecular (TbTh) aumentó en el grupo de control quirúrgico (Control Sx), el grupo de tratamiento con met5, el grupo de tratamiento con BMP2, el grupo de tratamiento con naltrexona y el grupo de tratamiento con naloxona (* = p<0,04). Sólo el TbTh en el grupo de tratamiento con naloxona fue mayor que en el grupo de tratamiento con BMP2 o en el grupo de tratamiento con naltrexona (** = p<0,0002).(F)El implante de colágeno aumentó la formación ósea en la columna lumbar en relación con los controles de cirugía SIMULADA. Sin embargo, el implante de BMP2 colágeno o de naloxona colágeno aumentaron la formación ósea en comparación con los implantes de colágeno solos.(G)Imágenes de pCT de la masa de fusión ósea lumbar para el implante de colágeno y el implante de naloxona colágeno.
Figuras 4A-4D: (A)Se observó expresión del gen OGFR en osteoblastos (* = p<0,018), células tumorales óseas del sarcoma de Ewing RDES (* = p<0,0014), células tumorales óseas del sarcoma de Ewing Hs822t (* = p<0,0001), células tumorales óseas del sarcoma de Ewing Hs863t (* = p<0,039) y células tumorales de osteosarcoma SaOS2 (* = p<0,05).
(B)Setenta y dos horas después de la adición de naloxona 1 mM o naltrexona 1 mM, el número de células de osteosarcoma SaOS2 disminuyó significativamente en relación con los cultivos de control (* = p<0,0001). El ligando de OGFR, met5, no tuvo ningún efecto sobre el número de células. (C) El sarcoma de Ewing Hs822t de la línea de células tumorales óseas es adherente en cultivo. Setenta y dos horas después de la adición de una dosis 1 mM de naltrexona, el número de células tumorales de sarcoma de Ewing óseo Hs822t disminuyó en relación con los cultivos de control (* = p<0,0025). La naloxona no tuvo ningún efecto sobre el número de células tumorales Hs822t, Por el contrario, la adición de met5 50 mM produjo un aumento significativo del número de células tumorales Hs822t (X = p<0,03).(D)Las células tumorales óseas del sarcoma de Ewing RDES son poco adherentes en cultivo. Setenta y dos horas después de la adición de dosis de naloxona 1 mM o de naltrexona 1 mM, el número de células tumorales óseas de sarcoma de Ewing RDES disminuyó significativamente en relación con los cultivos de control (* = p<0,0005). La adición de met5 no tuvo ningún efecto sobre el número de células tumorales RDES.
Descripción detallada
En el presente documento se ha demostrado que la naloxona o la naltrexona aumentan la formación ósea al tiempo que disminuyen el número de osteoclastos. El aumento de la formación ósea está respaldado por la formación mineral observada en cultivo y la formación ósea medida mediante micro-CT tras un defecto unicortical inducido quirúrgicamente con o sin un vehículo de colágeno bovino o tras la fusión de las apófisis vertebrales posterolaterales utilizando un vehículo de colágeno bovino. El modelo quirúrgico dio lugar a una lesión que contenía abundante albúmina; que puede secuestrar la naloxona y la naltrexona, favoreciendo así una mayor disponibilidad de estos antagonistas del OGFR.
En un aspecto, la invención proporciona medios para estimular la formación ósea y/o reducir la degradación ósea incluyendo la administración de un antagonista de OGFR como se describe en las reivindicaciones a un lugar local de lesión o intervención quirúrgica en hueso.
Como se usa en el presente documento, una "intervención quirúrgica" incluye un procedimiento quirúrgico para reparar una fractura, un procedimiento quirúrgico utilizado para fusionar huesos vertebrales (por ejemplo, fusión de la columna vertebral) o un procedimiento quirúrgico que incluye, por ejemplo, integración de un implante durante una artroplastia total de articulación, tornillos óseos utilizados durante la reparación de fracturas, tornillos óseos utilizados para anclar tendones o ligamentos o cualquier dispositivo ortopédico diseñado para estabilizar mecánicamente la zona quirúrgica ortopédica.
Antagonista del OGFR
Por "antagonista del OGFR" se entiende cualquier molécula que inhiba, suprima o provoque el cese de al menos una actividad biológica mediada por el OGFR.
Generalmente, un antagonista del OGFR es un antagonista de unión al OGFR, concretamente, una molécula que interfiere, bloquea o impide de otro modo la interacción o unión del ligando de met5 (OGF) al OGFR. Un antagonista de unión al OGFR puede funcionar de dos maneras: En primer lugar, el antagonista del OGFR puede competir con el ligando de met5 para unirse al OGFR en la superficie de la membrana nuclear, interfiriendo así, bloqueando o impidiendo de otro modo la unión del ligando de met5 al OGFR, sin desencadenar la señalización aguas abajo que de otro modo sería inducida por la unión del ligando de met5 al OGFR. Como alternativa, un antagonista de la unión al OGFR puede unirse o secuestrar PENK o el ligando de met5 con suficiente afinidad y especificidad para interferir sustancialmente con el ligando de met5 al OGFR, bloquearlo o impedir su unión al mismo, inhibiendo así, suprimiendo o provocando el cese de al menos una actividad biológica mediada por el OGFR. En términos generales, los antagonistas de unión al OGFR pueden ser moléculas grandes (por ejemplo, anticuerpos) o moléculas pequeñas (por ejemplo, compuestos de un peso molecular inferior a 15 kD, 12 kD, 10 kD o incluso 8 kD) y puede ser un polipéptido, ácido nucleico o un compuesto sintético de molécula pequeña. Los antagonistas de unión al OGFR pueden identificarse con cualquier ensayoin vitrofácilmente seleccionado por un experto en la materia. Por ejemplo, los antagonistas del OGFR pueden identificarse utilizando los métodos descritos en la patente de Estados Unidos n.2 5.882.944, la patente de Estados Unidos n.° 6.007.986 o la patente de Estados Unidos n.° 6.270.979.
En una realización, el antagonista de unión al OGFR comprende además naloxona o un derivado funcional de la misma, naltrexona o un derivado funcional de la misma o una combinación de las mismas, como se describe en las reivindicaciones.
Como se usa en el presente documento, un "derivado funcional" se refiere a un derivado o análogo que es estructural y funcionalmente análogo a la molécula de origen (por ejemplo, mantiene la función de la naltrexona o la naloxona como antagonista del OGFR). Los análogos de la naloxona y la naltrexona pueden sintetizarse utilizando procedimientos sintéticos estándar como los descritos en March J., Advanced Organic Chemistry, 3a ed. (1985). Algunos ejemplos de derivados funcionales de naltrexona y naloxona son las formas salinas, por ejemplo, hidrocloruro de naloxona dihidrato o hidrocloruro de naltrexona. Ejemplos adicionales de derivados funcionales de naltrexona y naloxona adecuados para su uso en los presentes métodos incluyen los análogos de naltrexona y naloxona divulgados en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.22007/0197673 A1, la patente de Estados Unidos N.2 6.713.488, por ejemplo.
En otra realización, un antagonista de unión al OGFR deriva de oximorfona y se une al OGFR, que incluye naloxona, naltrexona, nalorfina, naloxonazina, levalorfano, nalmefeno, ciprodima, ciclorfano, ciclazocina, oxilorfano, LY113878, MR2266, diprenorfina, WIN 44.441-3, naltindol o norbinaltorfimina.
También se divulga un antagonista de unión al OGFR derivado de la trans-3,4-dimetil-4-fenilpiperidina y que se une al OGFR, que incluye LY99335, LY25506, LY117413 o LY255582.
Además, se divulga un antagonista de unión a OGFR que es derivado de los péptidos met5-encefalina o leu-encefalina, se une al OGFR e incluye como mínimo las siguientes secuencias de aminoácidos como medio para dirigirse al OGFR: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met (S<e>Q ID NO: 1) para los derivados de met5-encefalina o Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (SEQ ID NO: 2) para los derivados de leu-encefalina.
Además, se divulga un antagonista de unión a OGFR que es derivado del péptido antagonista ICI174864 (N,N-dialil-Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-OH, SEQ ID NO: 3; Aib=ácido aminoisobutírico) o análogo de la somatostatina CTP (D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NFÍ<2>, SEQ ID NO: 4).
En el presente documento se divulga además un antagonista del OGFR que, en lugar de ser un antagonista de unión al OGFR, es una molécula que interrumpe la secuencia de localización nuclear encontrado en el OGFR: 251 QSALDYFMFAVRCRHQRRQLVHFAWEHFRPRCKFVWGPQDKLRRFKPSSL (SEQ ID NO: 5).
El antagonista del OGFR empleado en la presente invención es un ARN de horquilla pequeña (hp) o un ARN de interferencia pequeño (ip) dirigido contra el gen OGFR y eficaz para interrumpir la expresión génica de OGFR.
Los antagonistas del OGFR descritos en el presente documento pueden administrarse individualmente o en combinación. Las combinaciones adecuadas incluyen, por ejemplo, naloxona y naltrexona; naloxona y/o naltrexona, en combinación con otro antagonista de unión al OGFR u otro antagonista del OGFR.
Combinación de antagonistas del OGFR con otros agentes activos
Un antagonista del OGFR descrito en el presente documento puede administrarse en combinación con uno o más agentes activos que estimulan la formación o el crecimiento óseo a través de la señalización SMAD, que puede ser sinérgico con un antagonista del OGFR. Ejemplos de tales agentes activos incluyen, pero sin limitación, una molécula BMP (por ejemplo, BMP-2, BMP-4, BMP6 y b Mp -7), que pueden regular la señalización SMAD1/5/8. Una molécula de TGFp que puede expandir el conjunto de CMM que luego puede ser regulado por un antagonista de OGFR. Los inhibidores del TGFp, que incluyen LY2109761, que reducen la señalización del TGFp disminuyen la señalización del inhibidor SMAD (SMAD6 y SMAD7) y luego antagonizan la señalización de BMP y reducen la formación ósea. Por ejemplo, un implante de colágeno puede ser infundido con una molécula BMP deseable, una molécula de TGFp o una molécula inhibidora de TGFp y un antagonista de OGFR para su uso en los presentes métodos.
Un antagonista del OGFR descrito en el presente documento puede administrarse en combinación con uno o más agentes activos que estimulan la formación o el crecimiento óseo. Ejemplos de tales agentes activos incluyen, pero sin limitaciones, uno o más factores de crecimiento, tales como EGF, VEGF, PDGF, IGF, FGF, TGFa y citocinas; células tales como células madre mesenquimatosas, condrocitos y células de médula ósea. Por ejemplo, un implante de colágeno puede infundirse tanto con un factor de crecimiento deseable como una molécula de VEGF, como con un antagonista de OGFR para su uso en los presentes métodos. Un antagonista del OGFR también puede administrarse en combinación con un agente quimioterapéutico en el tratamiento de un paciente con cáncer para estimular la formación o el crecimiento óseo en dicho paciente.
Sistemas de distribución/administración
Un antagonista de OGFR descrito en el presente documento puede administrarse con o sin un vehículo localmente para acelerar la reparación de fracturas o estimular la fusión del hueso vertebral. En algunas realizaciones, un antagonista del OGFR se combina con un vehículo o se encapsula en él para su administración.
Los vehículos adecuados pueden ser en esferas, microesferas o nanopartículas y pueden estar hechos de polímeros biocompatibles naturales y/o sintéticos. Algunos ejemplos de polímeros biocompatibles adecuados incluyen ácido hialurónico, colágeno, fosfato tricálcico, condroitina sulfato, polibutirato, polilactida, poliglicólido y copolímeros de lactida/glicólido y mezclas o copolímeros de los mismos. Los vehículos adecuados también incluyen sistemas no poliméricos, tales como ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, aminoácidos, lípidos tales como esteroles, sistema de liberación de hidrogel; sistema silásticos; sistema a base de péptidos; implantes y similares.
En una realización, el vehículo es un vehículo higroscópico a base de colágeno (por ejemplo, una esponja de colágeno, un armazón de colágeno, un colágeno en polvo o un hidrogel de gelatina a base de colágeno).
En otra realización, el vehículo es un vehículo hidrófilo a base de hidrogel (por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico), que permite que un antagonista del OGFR (por ejemplo, naloxona o naltrexona o un derivado funcional de las mismas) infundido en el mismo se libere durante un periodo de tiempo.
En aún otra realización, el vehículo es albúmina, un derivado o fragmento de albúmina que mantiene el sitio de unión a naloxona/morfina situado en la interfaz entre Ios dominios IA y IIA, y/o mantiene el sitio de unión a la naloxona alrededor de triptófano (Trp)-214, que se une a un antagonista del OGFR tal como naloxona o naltrexona o un derivado funcional de las mismas y permite una liberación lenta del antagonista del OGFR.
En aún otra realización, metilcelulosa, y un gel de inserción, por ejemplo, que se une a un antagonista del OGFR tal como naloxona o naltrexona o un derivado funcional de las mismas y permite una liberación lenta del antagonista del OGFR.
En una realización adicional, el vehículo es un implante de colágeno bovino. Un antagonista de OGFR, por ejemplo, naloxona o naltrexona o un derivado funcional de las mismas, puede combinarse con un implante de colágeno bovino, de forma similar a INFUSE (BMP2) u OP1 -masilla u OP1 -implante, que se suministra con una esponja de colágeno bovino, colágeno bovino en polvo o construcción de gelatina a base de colágeno. La administración de naloxona, naltrexona o un derivado funcional de las mismas puede conseguirse mediante, por ejemplo, reconstitución de naloxona o naltrexona en polvo o un derivado funcional de las mismas con solución salina estéril y la adición posterior de la solución salina-antagonista del OGFR al implante de colágeno; después de lo cual el implante puede administrarse localmente en el lugar de la intervención quirúrgica.
En aún otra realización, el vehículo es un implante quirúrgico o un sistema de administración de implantes quirúrgicos seleccionado entre, por ejemplo, jaulas, tornillos, barras, placas, jaulas extensibles, anclajes (anclajes metálicos, sintéticos o biodegradables).
En una realización adicional, el vehículo se compone de fosfato tricálcico beta en forma de virutas o polvos, cemento (polimetilmetacrilato o "PMMA") o un armazón de matriz ósea desmineralizada en forma de, por ejemplo, masilla, pasta, bloques o formulaciones inyectables.
En otra realización, el vehículo es un vehículo compuesto por esferas de PGA (ácido poliglicólico)-PLGA (ácido poliláctico glicólico), que puede encapsular un antagonista del OGFR para proporcionar liberación inmediata, retardada o sostenida.
En otra realización, el vehículo es un aloinjerto tal como aloinjerto corticoesponjoso, virutas corticales y aloinjerto estructural.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona medios para estimular el reclutamiento de células madre mesenquimatosas (CMM) a un lugar local de lesión o intervención quirúrgica en el hueso para estimular la curación mientras se inhibe la degradación ósea impulsada por osteoclastos (o reabsorción). Esto se basa en la administración de una cantidad de un antagonista del OGFR descrito en el presente documento (por ejemplo, naloxona o naltrexona o un derivado funcional de las mismas) para estimular la formación ósea a la vez que se inhibe la degradación ósea.
Aún en otro aspecto, la presente divulgación proporciona medios para tratar la osteonecrosis o la osteorradionecrosis basados en la administración de otro antagonista del OGFR descrito en el presente documento (por ejemplo, naloxona 0 naltrexona o un derivado funcional de las mismas).
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un intervalo de dosis adecuado, mediante el cual se administra naloxona (400 ng/ml (1 pM) a 400 pg/ml (1 mM)) y/o naltrexona (378 ng/ ml (1 pM) a 378 pg/ml (1 mM)) a dosis que oscilan entre 1 pM y 1 mM y son eficaces para aumentar la formación ósea y/o disminuir la degradación ósea mediante la disminución de la formación de osteoclastos. Las cantidades de dosis específicas de naloxona pueden ser, por ejemplo, 400 ng/ml, 800 ng/ml, 1 pg/ml, 10 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 400 pg/ml o una cantidad comprendida entre cualquiera de las dosis enumeradas siempre que estas dosis oscilen entre 1 pM y 1 mM. Estas dosis pueden administrarse en una sola administración o en administraciones. La cantidad total precisa de naloxona eficaz dependerá de la extensión de la lesión o de la aplicación quirúrgica y del vehículo que se vaya a utilizar. Por ejemplo, se recomendarían 400 pg/ ml de solución salina-naloxona o cualquier dosis equivalente, que equivalga a 400 pg/ cm3 de solución salina-naloxona, para cada implante de colágeno con dimensiones 2 cm x 2 cm x 0,25 cm o 1 cm3 de naloxona (por ejemplo, colágeno infundido con una solución salina-naloxona-1 mM) o un derivado funcional de la misma, que puede administrarse en una lesión o en una zona quirúrgica local y que produce una formación ósea sustancial y la inhibición del número de osteoclastos en la zona quirúrgica. Las cantidades de dosis específicas de naltrexona pueden ser, por ejemplo, 378 ng/ml, 756 ng/ml, 1 pg/ml, 10 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 378 pg/ml o una cantidad comprendida entre cualquiera de las dosis enumeradas. La cantidad total precisa de naltrexona eficaz dependerá de la extensión de la lesión o de la aplicación quirúrgica y del vehículo que se vaya a utilizar. Por ejemplo, 378 pg/ml de solución salina-naltrexona o cualquier dosis equivalente, que equivale a 378 pg/cm3 de solución salinanaltrexona, serían necesarios para cada implante de colágeno con dimensiones de 2 cm x 2 cm x 0,25 cm o 1 cm3 de naltrexona (por ejemplo, colágeno infundido con 1 mM de una solución salina-naltrexona) o un derivado funcional de la misma, que puede administrarse en una lesión o en una zona quirúrgica local y que produce una formación ósea sustancial y la inhibición del número de osteoclastos en la zona quirúrgica.
La presente invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos, que no debe interpretarse como limitantes de ninguna manera.
Ejemplo 1: Los antagonistas opioides regulan la formación y reabsorción ósea.
Métodos:Se recogió médula ósea humana de pacientes adultos sometidos, con su consentimiento, a una artroplastia total de cadera primaria proximal programada o a una artroplastia total de rodilla primaria distal programada (n=6), media de edad 65 años) como parte de un estudio aprobado por el CEI. Las CMM humanas se obtuvieron a partir de la fracción adherente de células derivadas de cada aspirado de médula ósea completo recogido, mientras que la población de monocitos se recogió de la fracción no adherente de la médula ósea. La fracción de monocitos se enriqueció mediante subcultivo con 100 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos recombinante (MCSF); Wyeth). En experimentos paralelos descritos a continuación, se recogieron los fémures de ratones macho de 3 semanas (n=10) y 16 semanas (n=20) de edad y, a continuación, se extrajo la médula ósea del fémur según se indica a continuación: se introdujo una aguja de calibre 21 en el canal intramedular femoral tras la extracción de los extremos proximal y distal del fémur. A continuación, se pasó cuidadosamente el medio a través del extremo proximal del fémur, lo que obligó a la médula ósea a salir del hueso. Por último, el sedimento de médula ósea se disoció mecánicamente con una aguja de calibre 18 y, a continuación, se pasó por un filtro de malla de 70 gm. Estos aspirados de médula ósea completa se utilizaron para generar osteoclastos. Las células se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con un 10 % de suero de ternera fetal (v/v) y un 1 % de penicilina-estreptomicinaglutamina (PSG; Cellgro, Mediatech). Los ligandos de netrina humana recombinante (NTN1 y NTN4) se diluyeron en PBS (R&D Systems). El comité IACUC responsable aprobó todos los estudios con animales descritos en este trabajo.
Análisis de la expresión génica:CMM, se analizaron los osteoblastos y los adipocitos derivados de médula ósea humana para detectar cambios en la expresión génica. En paralelo, también se analizaron los osteoclastos derivados de monocitos humanos para detectar cambios en la expresión génica mieloide. Los datos genéticos se obtuvieron a partir de dos muestras generadas de forma independiente y recogidas de al menos tres pacientes. El ARNm se purificó utilizando columnas RNeasy Plus Mini (Qiagen) y el ADNc se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad). La expresión génica se analizó mediante PCR cuantitativa (qPCR) utilizando 100 ng de ADNc mezclados con Fast Plus EvaGreen Master Mix (Biotium). En cada experimento, GAPDH sirvió de control, los controles negativos no contenían ningún molde y se generó una curva estándar utilizando diluciones en serie de una secuencia sintetizada químicamente para GAPDH (0, 1, 10 y 100 femtogramos; Integrated DNA Technologies). La expresión génica se evaluó mediante el método de Pfaffl, en el que la eficiencia de cada cebador (E) y la concentración de producto génico de partida (N<0>) se calculan a partir de la región lineal de la curva umbral de cruce de fluorescencia utilizando el software LinRegPCR (v2013.0). Los experimentos se consideraron válidos cuando el gen de control GAPDH se situó dentro de la curva estándar y se calculó que las eficiencias de los cebadores (E) eran E>=1,8. La presencia de un único producto génico se confirmó mediante un análisis de curva de fusión y el tamaño del producto se confirmó mediante electroforesis en gel del producto génico.
Expresión de proteínas mediante análisis Western Blot:CMM humanas, osteoblastos y osteoclastos se lisaron con tampón RIPA frío (Pierce Thermo Scientific) que contenía yodoacetamida 2 mM, clorhidrato de benzamidina 2 mM, etilmaleimida 0,1 mM, 1 % de PMSF y el cóctel inhibidor de proteasas Halt (Pierce Thermo Scientific). Se analizaron lisados de proteínas de al menos dos réplicas generadas a partir de tres muestras de pacientes. La proteína total se analizó utilizando el kit BCA Protein Assay Kit (Thermo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras se cargaron (20 gg/pocillo) en un gel Mini-Protean Tris-Tricina Precast al 10-20 % (Bio-Rad) con el Page Ruler Prestained NIR Protein Ladder (Bio-Rad) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad). El OGFR se identificó en membranas bloqueadas usando leche desgrasada al 5 % con un anticuerpo primario del OGFR (Santa Cruz Biotechnologies). Actina (1:500) y ó-tubulina sirvieron como controles de carga. Los anticuerpos se detectaron utilizando un anticuerpo secundario conjugado con un micropolímero conjugado con HRP (kit ImmPress, Vector Labs) junto con el sustrato Clarity Western ECL (Bio-Rad). Se utilizaron lisados de proteínas de cerebro de ratón (mB) como controles de expresión positiva.
Osteogénesis:El potencial osteogénico de las CMM se evaluó induciendo químicamente la formación de minerales. Las CMM de al menos tres pacientes humanos se sembraron a razón de 5x103 células por pocilio y se dejaron confluir y entretejer antes de añadir el medio de osteoinducción. El medio de inducción consistió en DMEM con 20 % de FCS (v/v) y 1 % de PSG suplementado con 25 gg/ mi de ascórbico-2-fosfato (Sigma), dexametasona 100 nM (Sigma) y el siguiente régimen de dosificación de p-glicerofosfato (BGP; Sigma): 1x cambio de medio con BGP 5 mM, 1x cambio de medio con BGP 10 mM y 1x cambio de medio con BGP 20 mM. Ligando Met5 (0, [5 gM] 2,87 o 28,7 gg [50 gM]; Sigma), naloxona (0, 400 fg, 400 pg, 400 ng, 400 gg; Sigma) o naltrexona (0, 378 fg, 378 pg, 378 ng, 378 gg; Sigma) como se indica a continuación: 1) 1x, con la primera adición de medio de osteoinducción, 2) 2x, con la primera y la segunda adición de medio de osteoinducción y 3) con cada cambio de medios posterior a la inducción. Los pocillos de control positivo se trataron con 25 ng del ligando BMP2/BMP7 humano recombinante (R&D Systems) con la primera adición de medio de inducción. Tras la aparición de nódulos minerales, las células se fijaron con EtOH helado al 70 % (Sigma) y después se tiñeron con rojo de alizarina-S 40-mM (pH 4,2, Sigma). Los experimentos de osteogénesis se repitieron al menos dos veces para cada paciente.
Ensayo del número de células:Tras la adición de naloxona 1 mM o naltrexona 1 Mm, el número de células viables se determinó con el ensayo MTT. Después de 72 horas y de 120 horas, se añadió MTT (5 mg/ml (p/v), Sigma) a cada pocilio, se incubaron durante 2 horas, tras lo cual las células se lisaron con 500 gl de DMSO (Sigma). El MTT se midió a 570 nm y Ios efectos de la terapia sobre la proliferación celular se determinaron normalizando Ios pocilios tratados en relación con Ios valores medios de Ios pocilios no tratados: El factor de cambio en el número de células = 100*[densidad óptica de las células tratadas/densidad óptica media del control].
Tinción TRAP y evaluación del número de osteoclastos:Los osteoclastos se obtuvieron a partir de una población enriquecida de monocitos humanos o de aspirados de médula ósea de ratón no enriquecidos. Se analizaron tres muestras de médula ósea de pacientes humanos en paralelo con muestras recogidas de médula ósea de ratones de 3 semanas (n=10). La fracción de monocitos se estimuló para que se convirtieran en osteoclastos cultivando 1<x>106 células con 25 ng/ mi de MCSF y 25 ng/ mi de ligando RANK recombinante humano o de ratón (R&D Systems) en presencia del ligando met5 ([5 gM] 2,87 o [50-gM] 28,7 gg; Sigma), naloxona (400 ng o 400 gg; Sigma) o naltrexona (378 ng<o>378 gg; Sigma). L<os>osteoclastos se tiñeron con fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP; Sigma Leukocyte Acid Phosphatase Kit 387-A) y se contaron cuando las células se tiñeron con positividad para TRAP y tenían al menos tres núcleos. Las estimaciones del número de osteoclastos se obtuvieron mediante el muestreo de Cavalieri y una modificación de la técnica del fraccionador.
Reducción del ARNhp del receptor OGF:La actividad del receptor OGF se inhibió transfectando las CMM con un lentivirus de ARNhp de neogenina disponible en el mercado o con un lentivirus GFP como control (Santa Cruz Biotechnologies). A continuación, se indujo a las CMM a convertirse en osteoblastos y, posteriormente, se analizaron I<os>genes diana de BMP (ID1, ID2, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD5, SMAD6, SMAD7, SMAD8/9 y osteocalcina (OCN)).
Modelo de defecto unicortical:A ratones macho C57BL/6 de 3 semanas de edad (n=5 por grupo de tratamiento) se les inyectó met5, naloxona<o>naltrexona tras la creación de un defecto unicortical. Resumiendo, se practicó una pequeña incisión (de aproximadamente 3 mm) justo debajo de la articulación de la rodilla, situada en la cara medial de la tibia, justo debajo de la tuberosidad tibial, en la cresta tibial. En Ios animales jóvenes, la placa fisiaria es claramente visible y la broca se colocó aproximadamente 1 mm por debajo de este punto. La broca produce un defecto unicortical con unas dimensiones de 300 gm de diámetro x 1 mm de profundidad. Se utilizó una jeringa Hamilton Neuros RN de 10 gl con una aguja de punta roma de calibre 33 para inyectar 2 gl de met5 (28,7 gg), naloxona (400 gg) o naltrexona (378 gg) resuspendidas en solución salina directamente en el defecto unicortical a una velocidad no superior a aproximadamente 0,1 gl por segundo. Las tibias de la extremidad izquierda sirvieron como controles quirúrgicos contralaterales, en la que I<os>animales recibieron un defecto unicortical y se inyectaron 2 gl de solución salina. Se sacrificó a Ios ratones 5 días después de la cirugía, se recogieron las extremidades posteriores y se fijaron las tibias para inmunofluorescencia, tinción TRAP y crecimiento óseo asociado a OTC.
Implantación de un implante de colágeno con antagonistas opioides en un modelo de defecto unicortical:En este estudio se utilizaron ratones macho C57BL/6 de 5 semanas de edad (n=5 por grupo de tratamiento para un total de 25 animales). Los grupos de tratamiento consistieron en Ios siguientes: 1) PBS esponja de colágeno; 2) met5 esponja de colágeno; 3) BMP2 esponja de colágeno; 4) naltrexona esponja de colágeno; 5) naloxona esponja de colágeno. Los defectos unicorticales se administraron quirúrgicamente a través de una pequeña incisión (de aproximadamente 3 mm) realizada justo debajo de la articulación de la rodilla, situada en la cara medial de la tibia, justo debajo de la tuberosidad tibial, en la cresta tibial. En ratones macho de 5 semanas de edad, la placa fisiaria es claramente visible y la broca se colocó aproximadamente 1 mm por debajo de este punto. La broca produce un defecto unicortical con unas dimensiones de 300 gm de diámetro x 1 mm de profundidad. Se prepararon implantes de esponja de colágeno bovino (Duraform) (aproximadamente 1 mm x 1 mm) y después se empaparon en PBS, 50 gM (28,7 gg en 10 gl), met-5 encefalina (met5), 25 ng de BMP2, naltrexona 1 mM (378 gg en 10 gl)<o>naloxona 1 mM (400 gg en 10 gl) (n=5 para cada grupo, 25 animales en total). Se administró un defecto unicortical a otro grupo de ratones (n=5; controles quirúrgicos del defecto cortical) que no recibieron un implante de esponja de colágeno. En paralelo, otro grupo de animales sirvió de controles no quirúrgicos. Se sacrificó a I<os>ratones 7 días después de la cirugía, se recogieron las extremidades posteriores y se prepararon las tibias para el análisis por micro-CT (gCT).
Fusión vertebral posterolateral de las vértebras L5-L6:20 ratas Sprague-Dawley esqueléticamente maduras de 1 mes de edad fueron sometidas a una fusión vertebral posterolateral lumbar bilateral en las vértebras L5-L6. Los grupos de tratamiento consistirán en Ios siguientes: 1) cirugía simulada de control; 2) implante de esponja de colágeno; 3) BMP2 implante de esponja de colágeno; 4) naloxona implante de esponja de colágeno. En condiciones estériles, se practicó una incisión de 2 cm de longitud en la línea media posterior, centrada en las vértebras L5-L6. Se utilizó un enfoque de división muscular, lateral a las articulaciones facetarias, para exponer las apófisis transversas de una vértebra determinada. Se utilizó una fresa de alta velocidad de 1 mm para descorticar las apófisis transversas de las vértebras L5-L6. Se prepararon I<os>implantes y se implantaron entre las apófisis transversas bilateralmente en el lecho muscular paraespinal. Se prepararán implantes de esponja de colágeno bovino (aproximadamente 1 cm x 1 cm) y se empaparán en PBS, 25 ng de BMP2, naloxona 1 mM (400 gg en 10 gl). Se sacrificó a Ios animales a Ios 2 meses (n=5 ratas por punto temporal por grupo de tratamiento para un total de n=20 ratas), se extrajeron las columnas dorsales y se prepararon para el análisis de micro-CT (gCT).
Análisis por MicroCT de defectos unicorticales:Se adquirieron imágenes de alta resolución de la tibia con un sistema de imágenes gCT (gCT40; Scanco Medical). Las tibias se escanearon a 45 keV con un tamaño de vóxel isotrópico de 12 gm. Se seleccionó una región de análisis a partir de secciones axiales para incluir todo el defecto unioortioal delimitado por la pared cortical endosteal. El volumen óseo corregido (volumen óseo/volumen total; Bv/Tv), el número trabecular (TbN) y el grosor trabeoular (TbTh) se calcularon utilizando el software Scanco.
Análisis estadísticos:Para analizar los datos se utilizó el programa estadístico Prism (Graphpad). Se calcularon las medias y las desviaciones estándar. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional utilizando la corrección post-hoc de Holm-Sidak para comparaciones múltiples con significación establecida en p<0,05.
Resultados:
La naloxona y la naltrexona aumentaron la diferenciación de las CMM en osteoblastos y la formación de mineral, al tiempo que disminuyeron el número de osteoclastos:La adición de naloxona entre 1 pM y 1 mM con medio de osteoinducción aumentó sustancialmente la acumulación DE mineral (tinción roja) en cultivos de CMM inducidos a convertirse en osteoblastos (Figura 1A). La adición de naltrexona entre 1 pm y 1 mm con medios de osteoinducción también aumentó la mineralización, pero en menor medida que la naloxona (Figura 1A). La expresión génica del receptor opioide delta (OPRD) fue mayor en las CMM y disminuyó significativamente en osteoblastos (p<0,0074) y osteoclastos (p<0,0084) (Figura 1B). La expresión génica de OGFR aumentó en osteoblastos (p<0,011) y osteoclastos (p<0,0001) en relación con los cultivos de CMM (Figura 1C). La expresión génica de Met5 (PENK) no fue diferente entre las CMM y los osteoblastos; sin embargo, la expresión del gen PENK disminuyó significativamente en los osteoclastos (p<0,0018) (Figura 1D). La adición de met5 5 pM (PENK) al medio de osteoinducción no tuvo ningún efecto sobre la acumulación de minerales, mientras que met550 pm disminuyó ligeramente la acumulación de minerales (Figura 1E). Sin embargo, cuando se añadió naloxona 1 mM con met5 5 pM o 50 pM y medios de osteoinducción, el tratamiento con naloxona fue capaz de anular los efectos antiosteogénicos de met5 (Figura 1E). El receptor p-opioide, el receptor K-opioide, el precursor de met5 POMC y la expresión del gen de la enzima CPA1 nunca se observaron. Se observó expresión génica de PCSK1, PCSK2, CPD y CPE en CMM, osteoblastos y osteoclastos, pero no eran significativamente diferentes entre sí. La adición de una sola, dosis "pulso" de naloxona (1 mM) o una dosis "pulso" doble de naloxona (1 mM) 72 horas después de la primera dosis "pulso" produjo un aumento sustancial de la acumulación de minerales, mientras que la dosis continua de naloxona (por ejemplo, con cada cambio de medio) se redujo ligeramente (Figura 1F). Adicionalmente, se descubrió que la adición de naloxona 1 mM suprimió, pero no detuvo, la proliferación de CMM a las 72 horas (p<0,0177) y a las 120 horas (p<0,0001) (Figura 1G). La naloxona disminuyó de forma similar la proliferación en cultivos de monocitos (p<0,0001) (Figura 1H). Los monocitos cultivados para convertirse en osteoclastos no se vieron afectados por el tratamiento con met5 en relación con los cultivos de osteoclastos de control (la tinción TRAP es púrpura (Figura 11). La adición de naloxona 1 pM o naltrexona 1 pM no redujo significativamente el número de osteoclastos, mientras que la adición de naloxona 1 mM o naltrexona 1 mM redujo sustancialmente el número de osteoclastos (Figura 11).
La pérdida de expresión de OGFR conduce a un aumento de la expresión de reguladores transcripcionales osteogénicos en paralelo con un aumento de la expresión de osteocalcina.Las CMM transfectadas con ARNhp de OGFR mostraron una expresión génica de OGFR significativamente reducida (p<0,0085) (Figura 2A), lo que se corroboró en la disminución de OGFR en lisados de proteínas nucleares y citoplasmáticas (Figura 2B). Adicionalmente, en CMM deficientes en OGFR, la expresión del gen SMAD1 fue significativamente mayor que en las CMM de control y en los cultivos de control transfectados con GFP (p<0,0008) (Figura 2C). La expresión del gen ID1 también aumentó en las CMM deficientes en OGFR en relación con las CMM de control y los cultivos de control transfectados con GFP (p<0,0217) (Figura 2D). La proteína específica de osteoblastos osteocalcina (OCN) también aumentó significativamente en las CMM deficientes en OGFR inducidas a convertirse en osteoblastos en relación con los cultivos de control y el control transfectado con GFP (p<0,0215) (Figura 2E).
El tratamiento con naloxona o naltrexona aumentó la formación ósea en el defecto quirúrgico en un modelo animal.Se administraron quirúrgicamente defectos unicorticales a tibias de ratón que luego se trataron con naloxona (1 mM) o met5 (50 pM). La naloxona aumentó la cicatrización ósea, mientras que met5 no tuvo ningún efecto (Figura 3A y 3B). El tratamiento con naloxona aumentó la masa ósea (Bv/Tv) 1,53 veces (p<0,001) (Figura 3A). La elevada masa ósea que se midió se vio impulsada por un aumento de 1,2 veces en el número trabecular (TbN) (p<0,047) (Figura 3C). Siete días después de la administración quirúrgica, la cicatrización de la fractura de un defecto unicortical medida por Bv/Tv, aumentó un 25,6 % en el grupo de control quirúrgico (control Sx) en relación con los controles no quirúrgicos (p<0,034) (Figura 3D). Los defectos tratados con PBS o met5 en combinación con un implante de colágeno no fueron significativamente diferentes del grupo de control quirúrgico, con respecto a la cicatrización de fracturas. Sin embargo, el tratamiento con PBS o met5 junto con el implante de colágeno dio como resultado aproximadamente un 37 % más que el grupo de control no quirúrgico, coherente con la diferencia observada entre los grupos de control quirúrgico y de control no quirúrgico (p<0,003) (Figura 3D). El tratamiento del defecto con BMP2 y el implante de colágeno produjo un aumento de Bv/Tv del 32,4 % en relación con el grupo tratado con PBS y del 55,6 % en relación con el grupo de control quirúrgico (p<0,0124 y p<0,005, respectivamente) (Figura 3D). No hubo diferencias significativas entre el grupo tratado con BMP2 y el grupo tratado con naltrexona. Los defectos tratados con naltrexona y un implante de colágeno aumentaron el Bv/Tv un 39,2 % en relación con el grupo de tratamiento con PBS y un 63,5 % en relación con el grupo de control quirúrgico (p<0,0043 y p<0,0001, respectivamente) (Figura 3D). Por último, los defectos tratados con naloxona y el implante de colágeno presentaron un aumento de Bv/Tv del 56,5 % en relación con los defectos tratados con PBS y del 83,8 % en relación con el grupo de control quirúrgico (p<0,0001) (Figura 3D). Además, el tratamiento con naloxona aumentó el Bv/Tv en el defecto un 18,2 % en relación con el grupo de tratamiento con BMP2 (p<0,035) (Figura 3D). El grosor trabeoular es un parámetro estructural que se relaciona con Bv/Tv, que está relacionado con la masa ósea dentro del campo de interés. El grosor trabecular aumentó significativamente dentro del defecto en los grupos de control quirúrgico (<p><0,032), met5 (<p><0,039), BMP2 (<p><0,025), naltrexona (<p><0,025) y naloxona (<p><0,001) en relación con el grupo de control no quirúrgico (Figura 3E). El tratamiento del defecto con naloxona aumentó el grosor trabecular aproximadamente un 37 % en relación con todos los demás grupos de tratamiento (p<0,001) (Figura 3E). Además, el aumento de Bv/Tv observado con el tratamiento de los defectos con naloxona parece estar impulsado principalmente a través del aumento del grosor trabecular, mientras que el tratamiento con BMP2 o naltrexona aumentó B<v>/T<v>a través tanto del número trabecular como del grosor trabecular. La adición del implante de colágeno infundido con naloxona a la columna lumbar posterolateral produjo un aumento sustancial de Bv/Tv en relación con las columnas vertebrales implantadas con colágeno o el grupo de cirugía simulada de control (Figuras 3F y 3G).
Ejemplo 2: Los antagonistas del OGFR no estimulan la proliferación de los tumores de sarcoma a pesar de la expresión del gen OGFR en las células de sarcoma.
Métodos:Se recogió médula ósea humana de pacientes adultos sometidos, con su consentimiento, a una artroplastia total de cadera primaria proximal programada o a una artroplastia total de rodilla primaria distal programada (n=6, media de edad 65 años) como parte de un estudio aprobado por el CEI. Las CMM humanas se obtuvieron a partir de la fracción adherente de aspirados de médula ósea entera. Las células tumorales de sarcoma de Ewing (RDES, H<s>822 y Hs863) y las células tumorales de osteosarcoma SaOS2 se obtuvieron de la ATCC. Las células se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con un 10 % de suero de ternera fetal (v/v) y un 1 % de penicilinaestreptomicina-glutamina (PSG; Cellgro, Mediatech).
Análisis de la expresión génica:CMM, se analizaron los osteoblastos y los adipocitos derivados de médula ósea humana para detectar cambios en la expresión génica. En paralelo, también se analizaron los osteoclastos derivados de monocitos humanos para detectar cambios en la expresión génica mieloide. Los datos genéticos se obtuvieron a partir de dos muestras generadas de forma independiente y recogidas de al menos tres pacientes. El ARNm se purificó utilizando columnas RNeasy Plus Mini (Qiagen) y el ADNc se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad). La expresión génica se analizó mediante PCR cuantitativa (qPCR) utilizando 100 ng de ADNc mezclados con Fast Plus EvaGreen Master Mix (Biotium). En cada experimento, GAPDH sirvió de control, los controles negativos no contenían ningún molde y se generó una curva estándar utilizando diluciones en serie de una secuencia sintetizada químicamente para GAPDH (0, 1, 10 y 100 femtogramos; Integrated DNA Technologies). La expresión génica se evaluó mediante el método de Pfaffl, en el que la eficiencia de cada cebador (E) y la concentración de producto génico de partida (N<ü>) se calculan a partir de la región lineal de la curva umbral de cruce de fluorescencia utilizando el software LinRegPCR (v2013.0). Los experimentos se consideraron válidos cuando el gen de control GAPDH se situó dentro de la curva estándar y se calculó que las eficiencias de los cebadores (E) eran E>=1,8. La presencia de un único producto génico se confirmó mediante un análisis de curva de fusión y el tamaño del producto se confirmó mediante electroforesis en gel del producto génico.
Ensayo del número de células:Tras la adición de naloxona 1 mM o naltrexona 1 mM, el número de células viables se determinó con el ensayo MTT. Después de 72 horas y de 120 horas, se añadió MTT (5 mg/ml (p/v), Sigma) a cada pocilio, se incubaron durante 2 horas, tras lo cual las células se lisaron con 500 pl de DMSO (Sigma). El MTT se midió a 570 nm y los efectos de la terapia sobre la proliferación celular se determinaron normalizando los pocilios tratados en relación con los valores medios de los pocilios no tratados: El factor de cambio en el número de células = 100*[densidad óptica de las células tratadas/densidad óptica media del control].
Análisis estadísticos:Para analizar los datos se utilizó el programa estadístico Prism (Graphpad). Se calcularon las medias y las desviaciones estándar. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional o bidireccional utilizando la corrección post-hoc de Holm-Sidak para comparaciones múltiples con significación establecida en p<0,05.
Resultados:
Los tumores de osteosarcoma y sarcoma de Ewing expresan el OGFR y la naloxona y la naltrexona inhiben la proliferación tumoral.La expresión génica de OGFR se observó en osteoblastos (p<0,018), células tumorales óseas de sarcoma de Ewing RDES (p<0,0014), células tumorales óseas de sarcoma de Ewing Hs822t (p<0,0001), células tumorales óseas de sarcoma de Ewing Hs863t (<p><0,039) y células tumorales de osteosarcoma SaOS2 (<p><0,05) (Figura 4A). Setenta y dos horas después de la adición de 1 mM de naloxona o 1 mM de naltrexona, el número de células de osteosarcoma SaOS2 disminuyó significativamente en relación con los cultivos de control (p<0,0001). El ligando de OGFR, met5, no tuvo ningún efecto sobre el número de células (Figura 4B). La línea celular Hs822t de sarcoma de Ewing de tumor óseo es adherente en cultivo. Setenta y dos horas después de la adición de una dosis 1 mM de naltrexona, el número de células tumorales óseas de sarcoma de Ewing Hs822t disminuyó en relación con los cultivos de control (p<0,0025). La naloxona no tuvo ningún efecto sobre el número de células tumorales Hs822t. Por el contrario, la adición de met5 50 pM dio lugar a un aumento significativo del número de células tumorales Hs822t (p<0,03) (Figura 4C). Las células tumorales óseas de sarcoma de Ewing RDES son poco adherentes en cultivo. Setenta y dos horas después de la adición de dosis de naloxona 1 mM o de naltrexona 1 mM, el número de células tumorales óseas de sarcoma de Ewing RDES disminuyó significativamente en relación con los cultivos de control (p<0,0005). La adición de met5 no tuvo ningún efecto sobre el número de células tumorales RDES (Figura 4D).Resumen de los resultados de los ejemplos 1 y 2:
La naloxona y la naltrexona aumentan la formación de hueso y reducen la reabsorción (destrucción) ósea mediante una reducción del número de osteoclastos.
Los implantes de colágeno infundidos con naloxona o naltrexona aumentaron la formación ósea en un defecto unicortical o en huesos vertebrales lumbares fusionados.
A pesar de la presencia del OGFR, la naloxona o la naltrexona no aumentaron la proliferación de células tumorales de sarcoma.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un antagonista del receptor del factor de crecimiento opioide (OGFR) para<su uso>en un método para estimular la formación ósea o reducir la destrucción ósea en un lugar de lesión o de intervención quirúrgica, en donde el antagonista del OGFR comprende un ARNip o ARNhp que inhibe la expresión del OGFR,
y, además, en donde el antagonista del OGFR se administra localmente en el lugar de la lesión o el lugar de la intervención quirúrgica.
2. Un antagonista del receptor del factor de crecimiento opioide (OGFR) para su uso en un método para estimular el reclutamiento de células madre mesenquimatosas (CMM) a un lugar local de lesión o de intervención quirúrgica en el hueso para estimular la cicatrización, en donde el antagonista del OGFR comprende un ARNip o ARNhp que inhibe la expresión del OGFR,
y, además, en donde el antagonista del OGFR se administra localmente en el lugar de la lesión o el lugar de la intervención quirúrgica.
3. El antagonista del OGFR para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el antagonista del OGFR se administra con un vehículo.
4. El antagonista del OGFR para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho vehículo es un vehículo a base de colágeno en forma de esponja de colágeno, un colágeno en polvo o un hidrogel de gelatina a base de colágeno.
5. El antagonista del OGFR para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el vehículo es un vehículo a base de albúmina.
6. El antagonista del OGFR para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el vehículo es un vehículo a base de hidrogel hidrófilo.
7. El antagonista del OGFR para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el vehículo es un implante quirúrgico o un sistema de administración de implantes quirúrgicos.
8. El antagonista del OGFR para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el vehículo está compuesto por beta-fosfato tricálcico, cemento o matriz ósea desmineralizada.
9. El antagonista del OGFR para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el vehículo está compuesto por esferas de PGA/PLGA.
10. El antagonista del OGFR para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la lesión comprende fractura ósea.
11. El antagonista del OGFR para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha intervención quirúrgica se selecciona entre una reparación quirúrgica de una fractura, un procedimiento quirúrgico para crear hueso en la fusión de la columna vertebral y un procedimiento quirúrgico para estimular la integración de implantes o dispositivos ortopédicos con el hueso adyacente.
12. El antagonista del OGFR para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el antagonista del OGFR comprende además naloxona, naltrexona, un derivado funcional de las mismas o una combinación de las mismas.
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