ES2346457T3

ES2346457T3 - Composiciones de un factor de crecimiento derivado de plaquetas y metodos para usarlas.

Info

Publication number: ES2346457T3
Application number: ES05803356T
Authority: ES
Inventors: Samuel E. Lynch
Original assignee: Biomimetic Therapeutics LLC
Current assignee: Biomimetic Therapeutics LLC
Priority date: 2004-10-14
Filing date: 2005-10-12
Publication date: 2010-10-15
Anticipated expiration: 2025-10-12
Also published as: CN101198343A; EP3170505A1; CA2583823A1; JP2009195739A; ATE476985T1; MX2007004459A; US20060084602A1; IL182480A0; EP1812076A4; EP2223698A1; AU2005295919B2; US20070259814A1; KR20130058762A; US20220072204A1; US9545377B2; CA2583823C; EP2223698B1; EP2308500A1; US7473678B2; US20160310639A1

Abstract

Un material para implante, que comprende un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él un líquido que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, en que el fosfato de calcio comprende beta-fosfato de tricalcio y el fosfato de calcio comprende unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros.

Description

Composiciones de un factor de crecimiento derivado de plaquetas y métodos para usarlas.

Campo del invento

Este invento se refiere a la curación de huesos y tejidos conjuntivos.

Antecedentes del invento

Los factores de crecimiento son unas proteínas que se fijan a receptores sobre una superficie de célula, con el resultado principal de activar la proliferación y/o la diferenciación celulares. Muchos factores de crecimiento son bastante versátiles, estimulando la división celular en numerosos tipos de células diferentes; mientras que otros son específicos para un tipo particular de células. Ejemplos de factores de crecimiento incluyen un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento similares a insulina (IGF-I y II), un factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta), un factor de crecimiento epidérmico (EGF), y un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Un PDGF es una proteína catiónica, estable frente al calor, que se halla en una diversidad del tipos de células, incluyendo los gránulos de plaquetas circulantes, células de músculos lisos vasculares, células endoteliales, macrófagos y queratinocitos, y es sabido que estimula la síntesis in vitro de proteínas y la producción de colágeno por fibroblastos. También es conocido que actúa como un agente mitógeno y quimiotáctico in vitro para fibroblastos, células de músculos lisos, osteoblastos y células gliales.

Se ha mostrado que un PDGF-BB humano recombinante (= rhPDGF-BB) estimula la curación de heridas y la regeneración de huesos tanto en animales como en seres humanos. Ha sido aprobado tanto en los Estados Unidos de América como en Europa para el uso humano en aplicaciones por vía tópica con el fin de acelerar la curación de llagas de pies diabéticos crónicos. Se ha mostrado también que un hPDGF-BB recombinante es efectivo, o bien a solas o en combinación con otros factores de crecimiento, para mejorar la regeneración periodontal, es decir el crecimiento renovado de hueso, cemento y ligamento alrededor de los dientes (véase, p.ej., la patente de los EE. UU. nº 5.124.316).

El documento de solicitud de patente de los EE.UU. US 2002/0082694 describe composiciones de esponjas osteogénicas mineralizadas en alto grado y sus usos. Las composiciones incluyen un soporte o vehículo poroso resorbible con rapidez, un factor de armazón mineral resorbido más lentamente y un factor osteogénico, preferiblemente una proteína morfogenética ósea.

El documento US 6.180.606 describe unas composiciones que tienen un potencial osteogénico acrecentado, métodos para producirlas y usos de las mismas. Las composiciones comprenden una matriz porosa o semi-porosa, un factor osteogénico y un agente tal como factores de crecimiento, factores nutrientes, fármacos, compuestos que contienen calcio, productos sanguíneos, proteínas de gran peso molecular, o sus combinaciones.

Sumario del invento

Los autores del invento hemos demostrado ahora que una baja dosis de un rhPDGF (\sim0,1 a 1,0 mg/ml) favorece la reparación de hueso, periodonto, ligamento y cartílago. Una baja cantidad del rhPDGF puede ser adsorbida junto al \beta-TCP, que puede ser implantado en el sitio de la reparación, de manera tal que el rhPDGF es liberado in vivo. Se ha mostrado que la adición del rhPDGF al \beta-TCP acrecienta la fijación y la proliferación de osteoblastos a células, en comparación con el \beta-TCP sin tratar.

El invento se refiere por lo tanto a un material para implante, que comprende un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él un líquido que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada dentro de un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, en que el fosfato de calcio comprende beta-fosfato de tricalcio y el fosfato de calcio comprende partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros.

En un primer aspecto, el invento presenta un método para favorecer el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero, p.ej., un ser humano, por administración de un material para implante que contiene un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración de menos que aproximadamente 1,0 mg/ml, de tal manera que el material para implante favorece el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago. En una forma de realización, el PDGF es administrado en una cantidad de menos que o igual a 0,3 mg/ml. En otra forma de realización, el PDGF es administrado en una cantidad situada en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 mg/ml. En varias formas de realización, el PDGF es administrado en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 0,75 mg/ml, entre aproximadamente 0,25 y aproximadamente 0,6 mg/ml, y entre aproximadamente 0,25 y aproximadamente 0,5 mg/ml. En una forma de realización, el PDGF es administrado en una cantidad de aproximadamente 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml o 1,0 mg/ml, preferiblemente de 0,3 mg/ml. En otra forma de realización, el PDGF es purificado ya sea parcialmente o de manera sustancial. En todavía una forma de realización adicional, el PDGF es aislado o purificado a partir de otros contaminantes. En una forma de realización adicional, el PDGF es liberado desde el material para implante después de una administración a una velocidad media de 0,3 mg/día. En otra forma de realización, el PDGF es liberado desde el material para implante después de una administración a una velocidad media de 300 \mug/día. En todavía otras formas de realización adicionales, el PDGF es liberado desde el material para implante con una velocidad media de menos que 100 \mug/día, de menos que 50 \mug/día, de menos que 10 \mug/día, o de menos que 1 \mug/día. Preferiblemente, el PDGF es suministrado a lo largo de unos pocos días, p.ej., 1, 2, 5, 10, 15, 20 ó 25 días, o hasta 28 días o más.

Un segundo aspecto del invento presenta un método para favorecer el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero, p.ej., un ser humano, por administración de un material para implante que contiene una cantidad de un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) de menos que aproximadamente 1,0 mg/ml, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, de manera que el material para implante favorece el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago, y permitir que el hueso, periodonto, ligamento o cartílago crezca. Preferiblemente, la cantidad de PDGF es igual a o menor que aproximadamente 0,3 mg/ml. En una forma de realización, el PDGF es administrado en un intervalo de aproximadamente 0,1 a 1,0 mg/ml. En otras formas de realización, la cantidad del PDGF es de aproximadamente 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml o 1,0 mg/ml, preferiblemente de 0,3 mg/ml. En otra forma de realización, el PDGF es purificado de una manera ya sea parcial o sustancial. En todavía una forma de realización adicional, el PDGF es aislado o purificado a partir de otros contaminantes. Antes de administrar el material para implante al mamífero, el método puede incluir adicionalmente la etapa de producir un colgajo quirúrgico de piel para dejar expuesto el hueso, periodonto, ligamento o cartílago, y a continuación de la operación de administración, volver a colocar o reemplazar el colgajo. En todavía otra forma de realización, después de haber producido el colgajo quirúrgico, pero antes de administrar el material para implante al hueso, periodonto, ligamento o cartílago, el método puede incluir adicionalmente la etapa de alisar el hueso o periodonto para eliminar materia orgánica desde el hueso o periodonto. En todavía otra forma de realización, el método favorece el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago dañado o enfermo. En todavía otra forma de realización, el método favorece el crecimiento de hueso en los sitios en los que se requiere una nueva formación de hueso como resultado de intervenciones quirúrgicas, tales como, p.ej., extracción de dientes, aumento de los bordes, injerto estético y levantamiento de senos.

Un tercer aspecto del invento presenta un material para implante destinado a favorecer el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero, p.ej., un ser humano. El material para implante incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable (p.ej., un agente aglutinante biocompatible, un agente sustitutivo de hueso, un líquido o un gel) y un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), que está presente en una concentración de menos que aproximadamente 1,0 mg/ml. Preferiblemente el PDGF está presente en el material para implante en una concentración igual a o menor que aproximadamente 0,3 mg/ml. En una forma de realización, el PDGF es administrado en un intervalo de aproximadamente 0,1 a 1,0 mg/ml. En otras formas de realización, la cantidad del PDGF es de aproximadamente 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml o 1,0 mg/ml, preferiblemente de 0,3 mg/ml. En una forma de realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable del material para implante incluye un armazón o una matriz que se compone de un agente aglutinante biocompatible (p.ej., una carboximetil-celulosa) o un agente sustitutivo de hueso (\beta-TCP), que es capaz de absorber una solución que incluye el PDGF (una solución que contiene el PDGF en una concentración situada en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml). En otra forma de realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable es capaz de absorber una cantidad de la solución de PDGF que es igual a por lo menos aproximadamente un 25% de su propio peso. En otras formas de realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable es capaz de absorber una cantidad de la solución de PDGF que es igual a por lo menos aproximadamente 50%, 75%, 100%, 200%, 250% o 300% de su propio peso. En una forma de realización, el PDGF es absorbido por el vehículo farmacéuticamente aceptable del material para implante por empapamiento del vehículo farmacéuticamente aceptable en una solución que contiene el PDGF. Preferiblemente, el PDGF está presente en la solución en una concentración de menos que aproximadamente 1,0 mg/ml. En otra forma de realización, el PDGF está presente en la solución en una concentración igual a o menor que aproximadamente 0,3 mg/ml. En otra forma de realización, el PDGF está presente en la solución en una concentración situada en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 1,0 mg/ml. En todavía otras formas de realización, el PDGF está presente en la solución en una cantidad de aproximadamente 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml o 1,0 mg/ml, preferiblemente de 0,3 mg/ml. En otra forma de realización, el PDGF es purificado de una manera ya sea parcial o sustancial. En todavía una forma de realización adicional, el PDGF es aislado o purificado a partir de otros contaminantes.

Un cuarto aspecto del invento presenta un método para preparar un material para implante destinado a favorecer el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero, p.ej., un ser humano. El método incluye la operación de combinar un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), parcialmente purificado o purificado por completo, en una cantidad de menos que aproximadamente 1,0 mg/ml, con una sustancia de vehículo farmacéuticamente aceptable. De manera preferible, el PDGF es combinado con una sustancia de vehículo farmacéuticamente aceptable en una concentración igual a o menor que aproximadamente 0,3 mg/ml. En una forma de realización, el PDGF es combinado con una sustancia de vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad situada en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 1,0 mg/ml. En otras formas de realización, el PDGF es mezclado en la cantidad de 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml o 1,0 mg/ml. En otra forma de realización, el PDGF es mezclado en la cantidad de 0,3 mg/ml. En todavía otra forma de realización, el PDGF es absorbido por el material de vehículo farmacéuticamente aceptable para producir el material para implante.

Un quinto aspecto del invento presenta un vial que contiene un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración comprendida en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml en un líquido farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización de este aspecto del invento, el líquido es un tampón de acetato de sodio estéril. En todavía otra forma de realización, el vial contiene el PDGF en una concentración de aproximadamente 0,3 mg/ml. En todavía otra forma de realización preferida, el PDGF es un PDGF-BB. En todavía otras formas de realización, el PDGF es estable en el tampón de acetato de sodio durante por lo menos aproximadamente 12 meses, de manera preferible durante por lo menos aproximadamente 18 meses, de manera más preferible durante por lo menos aproximadamente 24 meses, y de una manera sumamente preferible durante por lo menos aproximadamente 36 meses, cuando se almacena a una temperatura situada en el intervalo de aproximadamente 2ºC a 80ºC.

Un sexto aspecto del invento presenta un material para implante que incluye un fosfato de calcio poroso que tiene adsorbido en él un líquido que contiene un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml. En varias formas de realización, la concentración del PDGF es de aproximadamente 0,3 mg/ml, el fosfato de calcio se selecciona entre fosfato de tricalcio, y el PDGF es proporcionado en un líquido estéril, por ejemplo, un tampón de acetato de sodio.

Un séptimo aspecto del invento presenta un método para preparar un material para implante por saturación de un material de fosfato de calcio en un líquido estéril que incluye un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml. En varias formas de realización, la concentración del PDGF es de aproximadamente 0,3 mg/ml, y el fosfato de calcio se selecciona de fosfato de tricalcio.

En una forma de realización de todos los aspectos del invento, un PDGF incluye homo- y heterodímeros de PDGF, por ejemplo PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC y PDGF-DD, y combinaciones y derivados de los mismos.

En una forma de realización de todos los aspectos del invento, la sustancia de vehículo farmacéuticamente aceptable del material para implante es, o incluye adicionalmente, uno o más de los siguientes materiales: un agente aglutinante biocompatible (p.ej., un polímero natural o sintético), un agente sustitutivo de hueso, un líquido y un gel. En otra forma de realización preferida, el material para implante incluye un PDGF presente en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable, que es adsorbido por un vehículo sólido farmacéuticamente aceptable.

En otra forma de realización de todos los aspectos del invento, el material para implante se prepara por combinación de un PDGF aislado, parcialmente purificado, sustancialmente purificado, o purificado por completo, en una cantidad situada en el intervalo de 0,1 a 1,0 mg/ml, de manera más preferible de 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml o 1,0 mg/ml, de manera sumamente preferible de 0,3 mg/ml, o incluso de menos que 0,1 mg/ml, con una sustancia de vehículo farmacéuticamente aceptable, p.ej., un agente aglutinante biocompatible, tal como un polímero natural o sintético (p.ej., un colágeno, un poli(ácido glicólico) y un poli(ácido láctico)), un agente sustitutivo de hueso (p.ej., un fosfato de calcio) (p.ej., un fosfato de tricalcio o hidroxiapatito), sulfato de calcio, o un hueso desmineralizado (p.ej., un hueso cortical o esponjoso liofilizado y desmineralizado), o un gel o líquido comercialmente disponible (es decir, un gel o líquido viscoso o inerte).

En varias formas de realización, la sustancia de vehículo del material para implante es, o incluye adicionalmente, uno o más aglutinantes biocompatibles. Un aglutinante biocompatible es un agente que produce o favorece la cohesión entre las sustancias combinadas. Unos ejemplos no limitativos de apropiados agentes aglutinantes biocompatibles incluyen unos polímeros seleccionados entre polisacáridos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, proteínas, polipéptidos, poli(\alpha-hidroxi ácidos), poli(lactonas), poli(aminoácidos), poli(anhídridos), poli(ortoésteres), poli(anhídrido-co-imidas), poli(ortocarbonatos), poli(\alpha-hidroxi alcanoatos), poli(dioxanonas), poli(fosfoésteres), un poli(ácido láctico), una poli(L-lactida) (PLLA), una poli(D,L-lactida) (PDLLA), una poli(glicolida) (PGA), una poli(lactida-co-glicolida) (PLGA), una poli(L-lactida-co-D,L-lactida), una poli(D,L-lactida-co-carbonato de trimetileno), un poli(ácido glicólico), un poli(hidroxibutirato) (PHB), una poli-(\varepsilon-caprolactona), una poli(\delta-valerolactona), una poli(\gamma-butirolactona), una poli(caprolactona), un poli(ácido acrílico), un ácido policarboxilico, un poli(hidrocloruro de alilamina), un poli(dialil-dimetil-amonio), una poli(etilenimina), un poli(fumarato de propileno), un poli(alcohol vinílico), una polivinil-pirrolidona, un polietileno, un poli(metacrilato de metilo), fibras de carbono, un poli(etilenglicol), un poli(óxido de etileno), un poli(alcohol vinílico), poli(vinil-pirrolidona), poli(etil-oxazolina), copolímeros de bloques de poli(óxido de etileno)-co-poli(óxido de propileno), una poli(tereftalato de etileno)-poliamida, y copolímeros y mezclas de los mismos. Agentes aglutinantes adicionales incluyen ácido algínico, goma arábiga, goma guar, goma de xantano, gelatina, quitina, quitosano, acetato de quitosano, lactato de quitosano, sulfato de condroitina, N,O-carboximetil quitosano, un dextrano (p.ej., \alpha-ciclodextrina, \beta-ciclodextrina, \gamma-ciclodextrina, o un dextrano sulfato de sodio), cola de fibrina, glicerol, ácido hialurónico, hialuronato de sodio, una celulosa (p.ej., una metil-celulosa, carboximetil-celulosa, hidroxipropil-metil-celulosa o hidroxietil-celulosa), una glucosamina, un proteoglicano, un almidón (p.ej., un hidroxietil almidón o un almidón soluble), ácido láctico, un Pluronic, glicerofosfato de sodio, un colágeno, un glicógeno, una queratina, una seda, y derivados y mezclas de estos productos.

El agente aglutinante biocompatible es preferiblemente hialuronato de sodio o sus derivados. De manera adicionalmente preferida, el agente aglutinante biocompatible es ácido hialurónico. En una forma de realización adicionalmente preferida, el agente aglutinante biocompatible se selecciona entre una metil-celulosa, carboximetil-celulosa, hidroxipropil-metil-celulosa o hidroxietil-celulosa, en particular una carboximetil-celulosa.

En algunas formas de realización, el agente aglutinante biocompatible es soluble en agua. Un agente aglutinante soluble en agua se disuelve desde el material para implante poco después de su implantación in vivo, introduciendo de esta manera una macroporosidad en el material para implante. Esta macroporosidad aumenta la osteoconductividad del material para implante, aumentando el acceso y, consiguientemente, la actividad de remodelación de los osteoclastos y osteoblastos en el sitio del implante.

El agente aglutinante biocompatible puede ser añadido al material para implante en cantidades variables y en una diversidad de etapas durante la preparación de la composición. Los que poseen experiencia en la especialidad serán capaces de determinar la cantidad del agente aglutinante y el método de inclusión que se requieren para una aplicación dada.

En una forma de realización, la sustancia de vehículo es, o incluye, un líquido seleccionado entre agua, un tampón y un medio de cultivo de células. El líquido se puede usar en cualquier intervalo de valores del pH, pero con la mayor frecuencia se usará en el intervalo de pH 5,0 a pH 8,0. En una forma de realización, el pH será compatible con la estabilidad y la eficacia prolongadas del PDGF presente en el material para implante, o con la estabilidad y eficacia prolongadas de otro deseado agente biológicamente compatible. En la mayor parte de las formas de realización, el pH del líquido estará situado en el intervalo de pH 5,5 a pH 7,4. Unos tampones apropiados incluyen, pero no se limitan a, carbonatos, fosfatos (p.ej., una solución salina tamponada con fosfato) y tampones orgánicos tales como Tris, HEPES y MOPS. Con la mayor frecuencia, el tampón será seleccionado por su biocompatibilidad con los tejidos anfitriones y por su compatibilidad con el agente biológicamente activo. Para la mayor parte de las aplicaciones, en que se incluyen ácidos nucleicos, péptidos o antibióticos en el material para implante, será suficiente una simple solución salina tamponada con fosfato.

En otra forma de realización de todos los aspectos del invento, la sustancia de vehículo del material para implante es, o incluye adicionalmente, uno o más agentes sustitutivos de hueso. Un agente sustitutivo de hueso es uno que se puede usar para reemplazar permanente o provisionalmente a un hueso. Después de una implantación, el agente sustitutivo de hueso puede ser retenido por el cuerpo o puede ser resorbido por el cuerpo y reemplazado por hueso. Un agente sustitutivo de hueso incluye un fosfato de calcio, a saber fosfato de tricalcio, concretamente \beta-TCP.

En una forma de realización, la sustancia de vehículo es biorresorbible. En otra forma de realización, el agente sustitutivo de hueso es proporcionado como una matriz de partículas con un tamaño de micrómetros o inferior a los micrómetros, p.ej., partículas con un tamaño de nanómetros. Las partículas pueden tener un tamaño situado en el intervalo de aproximadamente 100 \mum a aproximadamente 5.000 \mum, de manera más preferible en el intervalo de aproximadamente 200 \mum a aproximadamente 3.000 \mum, y de manera sumamente preferible en el intervalo de aproximadamente 250 \mum a aproximadamente 2.000 \mum, o las partículas pueden tener un tamaño situado en el intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1.000 nm, de manera preferible de menos que aproximadamente 500 nm, y de manera más preferible de menos que aproximadamente 250 nm. En otra forma de realización, el agente sustitutivo de hueso tiene una composición porosa. La porosidad de la composición es una característica deseable, puesto que facilita la migración e infiltración de células dentro de la composición, de manera tal que las células pueden segregar una matriz ósea extracelular. También proporciona acceso para la vascularización. La porosidad proporciona también una alta área de superficie para una resorción y una liberación acrecentadas de sustancias activas, así como una interacción aumentada entre las células y la matriz. Preferiblemente, la composición tiene una porosidad mayor que 40%, de manera más preferible mayor que 65%, y de manera sumamente preferible mayor que 90%. La composición se puede proporcionar en una forma apropiada para la implantación (p.ej., una esfera, un cilindro o un bloque) o puede ser dimensionada y conformada antes del uso. El agente sustitutivo de hueso es un fosfato de calcio, a saber \beta-TCP.

Preferiblemente, el agente sustitutivo de hueso es \beta-fosfato de tricalcio (\beta-TCP). El \beta-TCP comprende preferiblemente una matriz de partículas con unos tamaños de micrómetros o inferiores a los micrómetros, que, en particular, tienen un tamaño de menos que aproximadamente 5.000 \mum. De manera preferible, las partículas de \beta-TCP tienen un tamaño situado en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 5.000 \mum, de manera más preferible de aproximadamente 100 a aproximadamente 3.000 \mum, de manera sumamente preferible de aproximadamente 250 a aproximadamente 2.000 \mum. Las partículas de \beta-TCP son de manera preferible porosas, en particular porosas en más de un 40%, de manera más preferible porosas en más de un 75% y de manera sumamente preferible porosas en más de un 90%. El \beta-TCP puede ser proporcionado en una forma apropiada para implantación, en particular la una esfera, un cilindro o un bloque.

Preferiblemente, el agente sustitutivo de hueso puede ser proporcionado también como una pasta o una masilla moldeable y capaz de fluir. Preferiblemente, el agente sustitutivo de hueso es una pasta de fosfato de calcio que se endurece por sí sola para formar un fosfato de calcio endurecido antes o después de la implantación in vivo. Un componente de fosfato de calcio puede ser cualquier material de fosfato de calcio biocompatible conocido en la especialidad. El material de fosfato de calcio puede ser producido por uno cualquiera de una diversidad de métodos y usando cualesquiera componentes de partida apropiados. Por ejemplo, el material de fosfato de calcio puede incluir un fosfato de calcio apatítico amorfo. El material de fosfato de calcio puede ser producido por una reacción entre un ácido y una base en estado sólido de los reaccionantes de fosfato de calcio cristalino, para formar materiales sólidos de hidroxiapatito cristalino. Otros métodos de producir materiales de fosfato de calcio son conocidos en la especialidad, algunos de los cuales se describen seguidamente.

Un material de fosfato de calcio puede ser un fosfato de calcio apatítico (PCA) pobremente cristalino o un hidroxiapatito (HA). Un material de PCA se describe en los documentos de solicitudes de patente de los EE.UU U.S. n^{os} 5.650.176; 5.783.217; 6.027.742; 6.214.368; 6.287.341; 6.331.312; y 6.541.037. Un HA se describe, por ejemplo, en los documentos de reanudación de patente de los EE.UU n^{os} Re. 33.221 y Re. 33.161. Estos documentos de patente enseñan la preparación de unas composiciones para la remineralización a base de un fosfato de calcio y de un material de vehículo de hidroxiapatito finamente cristalino, no cerámico, resorbible gradualmente, que está basado en la misma composición de fosfato de calcio. Un sistema similar de fosfato de calcio, que se compone de un fosfato de tetracalcio (TTCP) y un fosfato de monocalcio (MCP) o de su forma de monohidrato (MCPM), se describe en los documentos de patente de los EE.UU n^{os}. 5.053.212 y 5.129.905. Este material de fosfato de calcio es producido por una reacción de un ácido y una base en estado sólido de unos reaccionantes de fosfato de calcio cristalino para formar materiales sólidos de hidroxiapatito cristalinos.

Unos materiales de HA cristalinos (corrientemente citados como dahllita) se pueden preparar de manera tal que sean capaces de fluir, moldeables y capaces de endurecerse in situ (véase la patente de los EE.UU. nº 5.962.028). Estos materiales de HA (corrientemente citados como hidroxiapatito carbonatado) se pueden formar combinando los reaccionantes con un líquido no acuoso para proporcionar una mezcla sustancialmente uniforme, conformar la mezcla como sea apropiado, y permitir que la mezcla se endurezca en la presencia de agua (p.ej., antes o después de la implantación). Durante el endurecimiento, la mezcla cristaliza para dar un material sólido y una estructura apatítica sólida esencialmente monolítica.

Los reaccionantes consistirán generalmente en una fuente de fosfato, p.ej., ácido fosfórico o sales fosfatos, sustancialmente exentas de agua, una fuente de un metal alcalino-térreo, particularmente calcio, núcleos opcionalmente cristalinos, particularmente cristales de hidroxiapatito o de fosfato de calcio, carbonato de calcio, y un lubricante fisiológicamente aceptable, tal como cualquiera de los líquidos no acuosos que aquí se describen. Los ingredientes secos se pueden preparar previamente en forma de una mezcla y combinar subsiguientemente con los ingredientes líquidos no acuosos en unas condiciones en las que se produce una mezcladura sustancialmente uniforme.

El material de fosfato de calcio está caracterizado por su resorbibilidad biológica, su biocompatibilidad y su mínima cristalinidad. Su carácter cristalino es sustancialmente igual que el de un hueso natural. Preferiblemente, el material de fosfato de calcio se endurece en menos que cinco horas, y se endurece sustancialmente en alrededor de una a cinco horas, en condiciones fisiológicas. Preferiblemente, el material se endurece sustancialmente en el transcurso de aproximadamente 10-30 minutos. La velocidad de endurecimiento en condiciones fisiológicas se puede hacer variar de acuerdo con las necesidades terapéuticas, modificando unos pocos parámetros simples, tal como se describe en la patente de los EE. UU. nº 6.027.742.

En una forma de realización, el resultante material de fosfato de calcio biorresorbible será "deficiente en calcio", con una relación molar de calcio a fosfato de menos que aproximadamente 1,6, en comparación con el valor estequiométrico ideal de aproximadamente 1,67 para un hidroxiapatito.

Los deseables fosfatos de calcio son capaces de endurecerse en un entorno húmedo, en o alrededor de la temperatura corporal en menos que 5 horas, y de manera preferible en el transcurso de 10-30 minutos. Unos materiales deseados son aquellos que, cuando se implantan en forma de un gránulo de 1-5 g, son resorbidos en por lo menos un 80% en el transcurso de un año. Preferiblemente, el material será previamente resorbido.

En varias formas de realización de todos los aspectos del invento, el material para implante puede incluir adicionalmente uno o más agentes biológicamente activos. Los agentes biológicamente activos, que pueden ser incorporados en los materiales para implante del invento, incluyen, sin ninguna limitación, moléculas orgánicas, materiales inorgánicos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos (p.ej., genes, fragmentos, de genes, secuencias reguladoras de genes y moléculas antisentido), nucleoproteínas, polisacáridos, glicoproteínas y lipoproteínas. Unas clases de compuestos biológicamente activos que pueden ser incorporados en los materiales para implante del invento, incluyen, sin ninguna limitación, agentes anticancerosos, antibióticos, analgésicos, agentes antiinflamatorios, inmunosupresores, inhibidores de enzimas, antihistaminas, agentes anticonvulsivos, hormonas, agentes relajantes musculares, agentes antiespasmódicos, agentes oftálmicos, prostaglandinas, agentes antidepresivos, sustancias antipsicóticas, factores tróficos, proteínas osteoinductivas, factores de crecimiento y vacunas.

Los agentes anticancerosos incluyen agentes alquilantes, agentes con platino, antimetabolitos, agentes inhibidores de topoisomerasas, antibióticos antitumorales, agentes antimitóticos, agentes inhibidores de aromatasas, agentes inhibidores de timidilato sintasas, agentes antagonistas de ADN, agentes inhibidores de farnesiltransferasas, agentes inhibidores de las bombas, inhibidores de histona acetiltransferasas, agentes inhibidores de metaloproteinasas, agentes inhibidores de ribonucleósido reductasas, agentes agonistas/antagonistas de TNF alfa, agentes antagonistas de receptores de la endotelina A, agentes agonistas de receptores de ácido retinoico, agentes inmunomoduladores, agentes hormonales y antihormonales, agentes fotodinámicos, y agentes inhibidores de tirosina cinasas.

Se puede usar cualquiera de los agentes biológicamente activos que se enumeran en la Tabla 1.

TABLA 1

1

2

3

4

5

6

Los antibióticos incluyen aminoglicósidos (p.ej., gentamicina, tobramicina, netilmicina, estreptomicina, amikacina, neomicina), bacitracina, corbapenemos (p.ej., imipenemo/cislastatina), cefalosporinas, colistina, metenamina, monobactamas (p.ej., azatreonam), penicilinas (p.ej., penicilina G, penicilina V, meticilina, natcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, piperacilina, mezlocilina, azlocilina), polimixina B, quinolonas y vancomicina; y agentes bacteriostáticos tales como cloranfenicol, clindanyan, macrólidos (p.ej., eritromicina, azitromicina, claritromicina), lincomyan, nitrofurantoína, sulfonamidas, tetraciclinas (p.ej., tetraciclina, doxiciclina, minociclina, demeclocilina), y trimetoprima. También se incuyen metronidazol, fluoroquinolonas y ritampina.

Los agentes inhibidores de enzimas son unas sustancias que inhiben una reacción enzimática. Ejemplos de agentes inhibidores de enzimas incluyen cloruro de edrofonio, N-metil-fisostigmina, bromuro de neostigmina, sulfato de fisostigmina, tacrina, 1-hidroxi maleato de tacrina, yodotubercidina, p-bromotetramisol, hidrocloruro de 10-(alfa-dietilaminopropionil)-fenotiazina, cloruro de calmidazolio, hemicolinio-3,3,5-dinitrocatecol, inhibidor I de diacilglicerol cinasa, inhibidor II de diacilglicerol cinasa, 3-fenil-propargilamina, acetato de N^{6}-monometil-L-arginina, carbidopa, 3-hidroxi-bencil-hidrazina, hidralazina, clorogilina, deprenilo, hidroxilamina, fosfato de iproniazida, 6-MeO-tetrahidro-9H-pirido-indol, nialamida, pargilina, quinacrina, semicarbazida, tranilcipromina, hidrocloruro de 2,2-difenil-valerato de N,N-dietilaminoetilo, 3-isobutil-1-metil-xantina, papaverina, indometacind, hidrocloruro de 2-ciclooctil-2-hidroxietilamina, 2,3-dicloro-a-metilbencilamina (DCMB), hidrocloruro de 8,9-dicloro-2,3,4,5-tetrahidro-1H-2-benzazepina, p-amino-glutetimida, tartrato de p-amino-glutetimida, 3-yodo-tirosina, alfa-metil-tirosina, acetazolamida, diclorofenamida, 6-hidroxi-2-benzotiazol-sulfonamida, y alopurinol.

Las antihistaminas incluyen pirilamina, clorofeniramina y tetrahidrazolina, entre otras.

Los agentes antiinflamatorios incluyen corticoesteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (p.ej., aspirina, fenilbutazona, indometacina, sulindac, tolmetina, ibuprofeno, piroxicam y fenamatos), acetaminofeno, fenacetina, sales de oro, cloroquina, D-penicilamina, metotrexato de colquicina, alopurinol, probenecida y sulfinpirazona.

Los agentes relajantes musculares incluyen mefenesina, metocarbomal, hidrocloruro de ciclobenzaprina, hidrocloruro de trihexifenidilo, levodopa/carbidopa, y biperiden.

Los antiespasmódicos incluyen atropina, escopolamina, oxifenonio y papaverina.

Los analgésicos incluyen aspirina, fenilbutazona, indometacina, sulindac, tolmetic, ibuprofeno, piroxicam, fenamatos, acetaminofeno, fenacetina, sulfato de morfina, sulfato de codeína, meperidina, nalorfina, opioides (p.ej., sulfato de codeína, citrato de fentanilo, bitartrato de hidrocodona, loperamida, sulfato de morfina, noscapina, norcodeina, normorfina, tebaína, nor-binaltorfimina, buprenorfina, cloronaltrexamina, funaltrexamina, nalbufina, nalorfina, naloxona, naloxonazina, naltrexona y naltrindol), procaína, lidocaína, tetracaína y dibucaína.

Los agentes oftálmicos incluyen fluoresceína sódica, rosa de Bengala, metacolina, adrenalina, cocaína, atropina, alfa-quimotripsina, hialuronidasa, betaxalol, pilocarpina, timolol, sales de timolol, y sus combinaciones.

Las prostaglandinas están reconocidas en la especialidad y son una clase de ácidos hidroxi grasos de cadena larga relacionados químicamente entre sí, que se presentan en la naturaleza, los cuales tienen una diversidad de efectos biológicos.

Los agentes antidepresivos son unas sustancias capaces de prevenir o aliviar una depresión. Ejemplos de agentes antidepresivos incluyen imipramina, amitriptilina, nortriptilina, protriptilina, desipramina, amoxapina, doxepina, maprotilina, tranilcipromina, fenelzina e isocarboxazida.

Los factores de crecimiento son unos factores cuya presencia continuada mejora la viabilidad o longevidad de una célula. Los factores tróficos incluyen, sin ninguna limitación, la proteína activadora de neutrófilos, la proteína quimioatrayente de monocitos, la proteína inflamatoria de macrófagos, el factor de plaquetas, la proteína básica de plaquetas, y la actividad estimuladora del crecimiento de melanomas; un factor de crecimiento epidérmico, un factor de crecimiento transformante (alfa), un factor de crecimiento de fibroblastos, un factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas, un factor de crecimiento similar a insulina (IGF, p.ej., IGF-I o IGF-II), un factor neurotrófico del crecimiento derivado de la glía, un factor neurotrófico ciliar, un factor de crecimiento nervioso, un factor de crecimiento de hueso/inductor de cartílagos (alfa y beta), proteínas morfogéneticas óseas (BMPs), interleucinas (p.ej., inhibidores de interleucinas o receptores de interleucinas, incluyendo desde la interleucina 1 hasta la interleucina 10), interferones (p.ej., interferones alfa, beta y gamma), factores hematopoyéticos, incluyendo eritropoyetina, el factor estimulador de colonias de granulocitos, el factor estimulador de colonias de macrófagos y el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos, factores de necrosis de tumores, factores de crecimiento transformantes (beta), incluyendo beta-1, beta-2, beta-3, factores de crecimiento transformantes (alfa), inhibina y activina; proteínas morfogenéticas óseas tales como OP-1, BMP-2 y BMP-7.

Las hormonas incluyen estrógenos (p.ej., estradiol, estrona, estriol, dietilestibestrol, quinestrol, clorotrianiseno, etinil estradiol, mestranol), antiestrógenos (p.ej., clomifeno, tamoxifeno), progestinas (p.ej., medroxiprogesterona, noretindrona, hidroxiprogesterona, norgestrel), antiprogestinas (mifepristona), andrógenos (p.ej., cipionato de testosterone, fluoximesterona, danazol, testolactona), antiandrógenos (p.ej., acetato de ciproterona, flutamida), hormonas de la tiroides (p.ej., triyodotironina, tiroxina, propiltiouracilo, metimazol y yodixode), y hormonas de la pituitaria (p.ej., corticotropina, sumutotropina, oxitocina y vasopresina). Las hormonas se emplean corrientemente en una terapia por reemplazo de hormonas y/o para finalidades del control de los partos. Las hormonas esteroides tales como la prednisona, se usan también como agentes inmunosupresores y antiinflamatorios.

El agente biológicamente activo se selecciona deseablemente también entre la familia de proteínas conocida como la superfamilia de proteínas de los factores de crecimiento transformantes beta (TGF-\beta), que incluye las activinas, inhibinas y proteínas morfogéneticas óseas (BMPs). En una forma de realización, el agente activo incluye por lo menos una proteína seleccionada entre la subclase de proteínas conocidas generalmente como BMPs, de las que se ha descrito que tienen actividad osteogénica, y otras actividades del tipo de crecimiento y diferenciaciones. Estas BMPs incluyen las proteínas del tipo de BMP BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 y BMP-7, descritas por ejemplo en las patentes de los EE.UU. nº^{s} 5.108.922; 5.013.649; 5.116.738; 5.106.748; 5.187.076; y 5.141.905; BMP-8, descrita en la publicación de patente PCT WO91/18098; y BMP-9, descrita en la publicación de patente PCT WO93/00432, BMP-10, descrita en la solicitud de patente PCT WO94/26893; BMP-11, descrita en la solicitud de patente PCT WO94/26892, o BMP-12 o BMP-13, descrita en la solicitud de patente PCT WO 95/16035; BMP-14; BMP-15, descritas en la patente de los EE.UU. nº 5.635.372; o BMP-16, descrita en la patente de los EE.UU. nº 5.965.403. Otras proteínas del tipo TGF-\beta que pueden ser útiles como el agente activo en las composiciones de fosfato de calcio del invento incluyen Vgr-2. Jones y colaboradores, Mol. Endocrinol. 6:1961 (1992), y cualquiera de los factores de crecimiento y diferenciación (GDF's), incluyendo los que se describen en las solicitudes de patentes PCT WO94/15965; WO94/15949; WO95/01801; WO95/01802; WO94/21681; WO94/15966; WO95/10539; WO96/01845; WO96/02559 y otras. También pueden ser útiles en el invento el BIP, descrito en el documento WO94/01557; el HP00269, descrito en la publicación de patente japonesa: JP 7-250688; y el MP52, descrito en la solicitud de patente PCT WO93/16099. Un subconjunto de BMP's, que pueden usarse en el invent,o incluyen BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12, BMP-13, BMP-14 y MP52. El agente activo es de manera sumamente preferible la BMP-2, cuya secuencia se describe en la patente de los EE.UU nº 5.013.649. Se pueden usar otros agentes osteogénicos conocidos en la especialidad, tales como teriparatida (Forteo(®), Chrysalin®, prostaglandina E2, la proteína LIM, osteogenina o una matriz ósea desmineralizada (DBM), entre otros.

El agente biológicamente activo se puede sintetizar por vía química, producir por vía recombinante o purificar a partir de una fuente en la que se halla naturalmente el agente biológicamente activo. El agente activo, si es una TGF-\beta, tal como una BMP u otra proteína dimérica, puede ser homodimérica, o puede ser heterodimérica con otras BMP's (p.ej., un heterodímero que se compone de un monómero de cada de BMP-2 y BMP-6) o con otros miembros de la superfamilia de TGF-\beta, tales como activinas, inhibinas y de TGF-\beta1 (p.ej., un heterodímero que se compone de un monómero de cada de una BMP y un miembro relacionado de la superfamilia de TGF-\beta). Ejemplos de dichas proteínas heterodiméricas se describen por ejemplo en la solicitud de patente PCT publicada WO 93/09229.

Adicionales agentes biológicamente activos incluyen las proteínas de Hedgehog, Frazzled, Chordin, Noggin, Cerberus, y Follistatina. Estas familias de proteínas se describen en términos generales en la cita de Sasai y colaboradores, Cell 79:779-790 (1994) (Chordin); la publicación de patente PCT WO94/05800 (Noggin); y la cita de Fukui y colaboradores, Devel. Biol. 159:131 (1993) (Follistatina). Las proteínas de Hedgehog se describen en los documentos WO96/16668; WO96/17924; y WO95/18856. La familia de proteínas de Frazzled es una familia de proteínas recientemente descubierta con una alta homología con el dominio de fijación extracelular de la familia de proteínas de receptores conocida como de Frizzled. La familia de genes y proteínas de Frizzled se describe en la cita de Wang y colaboradores, J Biol. Chem. 271:4468-4476 (1996). El agente activo puede incluir también otros receptores solubles, tales como los receptores solubles truncados que se describen en la publicación de patente PCT WO95/07982. A partir de la enseñanza del documento WO95/07982, un experto en la especialidad reconocerá que se pueden preparar receptores solubles truncados para otras numerosas proteínas de receptores. Las publicaciones anteriores se incorporan por su referencia a la presente.

La cantidad de la proteína biológicamente activa, p.ej., de una proteína osteogénica, que es efectiva para estimular una actividad deseada, p.ej., una actividad osteogénica aumentada de células progenitoras o de otro tipo, presentes o que se infiltran, dependerá del tamaño y de la naturaleza del defecto que se esté tratando, así como del vehículo que se esté empleando. Generalmente, la cantidad de proteína que se ha de suministrar está en un intervalo de desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg; de manera preferible de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg; de manera sumamente preferible de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 mg.

Protocolos y regímenes clásicos para el suministro de los agentes arriba enumerados son conocidos en la especialidad. Los agentes biológicamente activos se introducen en el material para implante en unas cantidades que permiten el suministro de una dosificación apropiada del agente al sitio del implante. En la mayor parte de los casos las dosificaciones se determinan usando pautas conocidas para los profesionales practicantes y aplicables al agente particular en cuestión. Es probable que la cantidad ilustrativa de agente biológicamente activo que se ha de incluir en el material para implante del invento, dependa de unas variables tales como el tipo y la extensión de la condición, el estado de salud global del paciente particular, la formulación del agente activo, y la biorresorbibilidad del vehículo de suministro que se use Se pueden usar unas pruebas clínicas clásicas para optimizar la dosis y la frecuencia de dosificación para cualquier agente biológicamente activo particular.

En una forma de realización de todos los aspectos del invento, la composición puede contener adicionalmente una médula ósea autóloga o extractos de plaquetas autólogas.

En otra forma de realización de todos los anteriores aspectos, los PDGF y/o otros factores de crecimiento se pueden obtener a partir de fuentes naturales, (p.ej., plaquetas), o de manera más preferible, se pueden producir por una tecnología de ADN recombinante. Cuando se obtienen a partir de fuentes naturales, los PDGF y/u otros factores de crecimiento se pueden obtener a partir de un fluido biológico. Un fluido biológico incluye cualquier fluido tratado o no tratado (incluyendo una suspensión) que esté asociado con organismos vivos, particularmente sangre, incluyendo sangre entera, sangre caliente o fría y sangre almacenada o fresca (recientemente obtenida); sangre tratada tal como sangre diluida con por lo menos una solución fisiológica, incluyendo, sin limitarse a, soluciones salinas, nutrientes y/o anticoagulantes; componentes sanguíneos tales como un concentrado de plaquetas (PC), plaquetas aferesadas, plasma rico en plaquetas (PRP), plasma pobre en plaquetas (PPP), plasma exento de plaquetas, plasma, suero, plasma congelado fresco (FFP), componentes obtenidos a partir de plasma, glóbulos rojos empaquetados (PRC), un revestimiento leucocitario anteado conocido como buffy coat (BC); productos sanguíneos derivados de sangre o de un componente sanguíneo o derivados de una médula ósea, glóbulos rojos separados de un plasma y vueltos a suspender en un fluido biológico; y plaquetas separadas de un plasma y vueltas a suspender en un fluido biológico. El fluido biológico puede haber sido tratado para eliminar algunos de los leucocitos, antes de ser tratado de acuerdo con el invento. Tal como se utiliza en el presente contexto, un producto sanguíneo o un fluido biológico se refiere a los componentes arriba descritos, y a productos sanguíneos o fluidos biológicos similares obtenidos por otros medios y con propiedades similares. En una forma de realización, el PDGF se obtiene a partir de un plasma rico en plaquetas (PRP). La preparación de un PRP se describe,
p.ej., en las patentes de los EE.UU n^{os}. 6.649.072, 6.641.552, 6.613.566, 6.592.507, 6.558.307, 6.398.972 y 5.599.558.

En una forma de realización de todos los aspectos del invento, el material para implante suministra un PDGF en el sitio del implante por un periodo de tiempo mayor que por lo menos 1 día. En varias formas de realización, el material para implante suministra un PDGF en el sitio del implante durante por lo menos 7, 14, 21 ó 28 días. Preferiblemente, el material para implante suministra un PDGF en el sitio del implante durante un período de tiempo comprendido entre aproximadamente 1 día y 7, 14, 21 ó 28 días. En otra forma de realización, el material para implante suministra un PDGF en el sitio del implante durante un período de tiempo mayor que aproximadamente 1 día, pero de menos que aproximadamente 14 días.

Por el concepto de "biorresorbible" se entiende la capacidad del material para implante para ser resorbido o remodelado in vivo. El proceso de resorción implica una degradación y una eliminación del material para implante original por medio de la acción de fluidos corporales, enzimas o células. Los materiales resorbidos pueden ser usados por el anfitrión en la formación de nuevo tejido, o pueden ser reutilizados de otro modo por el anfitrión, o pueden ser excretados.

Por el concepto de "factor de diferenciación" se entiende un polipéptido que incluye una cadena de por lo menos 6 aminoácidos, que estimula la diferenciación de una o más células dianas para formar células con un potencial de formación de un cartílago o hueso.

Por el concepto de "partícula con un tamaño de nanómetros" se entiende una partícula con un tamaño inferior al micrómetro, generalmente definida como una partícula situada por debajo de 1.000 nanómetros. Una partícula con un tamaño de nanómetros es un material sólido en forma de partículas que está un estado intermedio entre sustancias moleculares y macrométricas. Un nanómetro es definido como la billonésima parte de un metro (10^{-9} m). Un material con tamaño de nanómetros es conocido como el polvo, la fibra, la película o el bloque que tiene un tamaño a la escala de nanómetros.

Por el concepto de "periodonto" se entienden los tejidos que rodean y soportan a los dientes. El periodonto soporta, protege y proporciona nutrición a los dientes. El periodonto se compone de hueso, cemento, proceso alveolar de las maxilas y las mandíbulas, ligamento periodontal y encía. El cemento es una delgada capa calcificada de tejido que cubre completamente a la dentina de la raíz del diente. El cemento se forma durante el desarrollo de la raíz y a lo largo de la vida del diente y funciona como una zona de fijación para las fibras del ligamento periodontal. El proceso alveolar es la parte ósea de las maxilas y las mandíbulas, en la que los dientes están empotrados y en la que están soportadas las raíces de los dientes. El manguito alveolar es la cavidad situada dentro del proceso alveolar, en la que la raíz del diente es sostenida por el ligamento periodontal. El hueso que divide a un manguito con respecto de otro es denominado septo interdental. Cuando están presentes dientes con raíces múltiples, el hueso es denominado el septo interradicular. El proceso alveolar incluye la placa cortical, la cresta alveolar, el hueso trabecular, y el hueso alveolar propiamente dicho.

Por el concepto de "promoción del crecimiento" se entienden una curación de un hueso, periodonto, ligamento o cartílago, y una regeneración de tales tejidos y estructuras. Preferiblemente, el hueso, periodonto, ligamento o cartílago está dañado o herido y requiere una regeneración o curación.

Por el concepto de "promover el crecimiento del periodonto" se entiende una regeneración o curación de los tejidos soportantes de un diente, incluyendo el hueso alveolar, el cemento y el ligamento periodontal interpuesto, que han sido dañados por una enfermedad o un trauma.

Por el concepto de "purificado" se entiende un factor de crecimiento o diferenciación, p.ej., un PDGF, que, antes de mezclarlo con una sustancia de soporte o vehículo está concentrado al 95% o más en peso, es decir el factor está sustancialmente exento de otras proteínas, otros lípidos y otros hidratos de carbono con los que él está asociado por naturaleza. El concepto de "sustancialmente purificado" se refiere a una menor pureza de un factor, que tiene, por ejemplo, solamente un 5%-95% en peso del factor, preferiblemente un 65-95%. Una formulación de proteína purificada proporcionará generalmente una única banda mayor sobre un gel de poli(acrilamida). Con suma preferencia, el factor purificado, que se usa en los materiales para implante del invento, es puro según se juzga por un análisis de las secuencias de aminoácidos en el extremo terminal de amino. El concepto de "parcialmente purificado" se refiere a un PDGF que es proporcionado en el contexto de un PRP, PPP, FFP, o cualquier otro producto sanguíneo que requiera una recogida y una separación, por ejemplo por centrifugación, para ser producido.

Por vía de ejemplo, una solución que tiene \sim1,0 mg/ml de un PDGF, cuando tiene una pureza de \sim50%, constituye \sim2,0 mg/ml de la proteína total.

Los materiales para implante de este invento ayudan a la regeneración del periodonto, por lo menos en parte, promoviendo el crecimiento de tejido conjuntivo, hueso o cemento. Los materiales para implante se pueden preparar de manera tal que ellos promuevan directamente el crecimiento y la diferenciación de células que producen tejido conjuntivo, hueso y cemento. Alternativamente, los materiales para implante se pueden preparar de manera tal que ellos actúen indirectamente, p.ej., atrayendo a las células que son necesarias para promover el crecimiento de tejido conjuntivo, hueso y cemento. Una regeneración usando una composición de este invento es un tratamiento más efectivo de enfermedades periodontales o heridas óseas que el que se consigue usando antibióticos sistémicos o un desbridamiento quirúrgico a solas.

El PDGF, los factores de crecimiento polipeptídicos y los factores de diferenciación se pueden obtener a partir de tejidos o células de origen humano, p.ej., plaquetas, mediante una síntesis de péptidos en fase sólida o por una tecnología de ADN recombinante. Por lo tanto, por el concepto de "factor de crecimiento polipeptídico" o "factor de diferenciación" los autores del invento entendemos unos materiales derivados de tejidos o células, recombinantes o sintetizados. Si el factor es un dímero, p.ej., de PDGF, el factor recombinante puede ser un heterodímero recombinante, producido introduciendo en células procarióticas o eucarióticas cultivadas unas secuencias de ADN que codifican ambas subunidades del factor, y que entonces permiten que las subunidades traducidas sean procesadas por las células para formar un heterodímero (p.ej., un PDGF-AB). Alternativamente un ADN que codifica solamente una de las subunidades (p.ej., una cadena B o cadena A de un PDGF) se puede introducir en unas células, que entonces son cultivadas para producir el factor homodimérico (p.ej., los homodímeros PDGF-BB o PDGF-AA). Un PDGF destinado a su uso en los métodos del invento incluye homo- y heterodímeros de PDGF, por ejemplo, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC y PDGF-DD, y sus combinaciones y derivados.

La concentración de un PDGF o de otros factores de crecimiento del invento se puede determinar usando, p.ej., un inmunoensayo ligado a enzimas, tal como se describe, p.ej., en las patentes de los EE.UU n^{os}. 6.221.625, 5.747.273 y 5.290.708, o cualquier otro ensayo conocido en la especialidad para determinar la concentración de proteínas. Cuando se proporciona en el presente contexto, la concentración molar de un PDGF es determinada basándose en el peso molecular de un dímero de PDGF (p.ej., PDGF-BB; PM= aproximadamente 25 kDa).

Los métodos y los materiales para implante del invento se pueden usar para curar heridas óseas de mamíferos, p.ej., fracturas, sitios recipientes de implantes y sitios con una enfermedad periodontal. Los materiales para implante favorecen el crecimiento y la reparación de tejido conjuntivo y acrecientan la formación de hueso en comparación con una curación natural es decir (sin que se añadan agentes exógenos) o una curación suplementada por la adición de antibióticos sistémicos. A diferencia de una curación natural, de una terapia quirúrgica convencional o de antibióticos, los materiales para implante del invento incitan una formación acrecentada de hueso, tejido conjuntivo (p.ej., cartílago y ligamento) y cemento cuando se aplican a tejidos dañados o enfermos o a sitios afectados por una enfermedad periodontal. La restauración de estos tejidos conduce a un pronóstico mejorado para las zonas afectadas. La capacidad de estos factores para estimular la formación de hueso nuevo también los hace aplicables para tratar defectos óseos causados por otros tipos de infecciones o traumas quirúrgicos o accidentales.

Otras características y ventajas del invento resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción de las formas de realización del mismo, y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1G son unas fotomicrografías que muestran el efecto sobre la formación de hueso a las 8 semanas después del tratamiento. La Fig. 1A es una fotomicrografía que muestra el efecto de solamente una operación quirúrgica sobre la formación de hueso. La Fig. 1B es una fotomicrografía que muestra el efecto del \beta-TCP a solas sobre la formación de hueso. La Fig. 1C es una fotomicrografía que muestra el efecto de \beta-TCP + 0,3 mg/ml de un PDGF sobre la formación de hueso. La Fig. 1D es una fotomicrografía que muestra el efecto de \beta-TCP + 1,0 mg/ml de un PDGF sobre la formación de hueso. La Fig. 1E es una fotomicrografía que muestra el efecto de un aloinjerto de hueso secado por congelación (liofilizado) y desmineralizado (con el acrónimo DFDBA de demineralized freeze dried bone allograft) a solas sobre la formación de hueso. La Fig. 1F es una fotomicrografía que muestra el efecto de aloinjerto de hueso liofilizado y desmineralizado (DFDBA) + 0,3 mg/ml de un PDGF sobre la formación de hueso. La Fig. 1G es una fotomicrografía que muestra el efecto de un aloinjerto de hueso liofilizado y desmineralizado (DFDBA) + 1,0 mg/ml sobre la formación de hueso.

Las Fig. 2A-2C son unas fotomicrografías que muestran el efecto sobre la formación de hueso a las 16 semanas a continuación del tratamiento. La Fig. 2A es una fotomicrografía que muestra el efecto del \beta-TCP a solas sobre la formación de hueso. La Fig. 2B es una fotomicrografía que muestra el efecto de \beta-TCP + 0,3 mg/ml de un PDGF sobre la formación de hueso. La Fig. 2C es una fotomicrografía que muestra el efecto de \beta-TCP + 1,0 mg/ml de un PDGF sobre la formación de hueso.

Descripción detallada

Los autores del invento describimos ahora varias formas de realización del invento. Se presentan seguidamente dos ejemplos que demuestran el uso de un PDGF como un agente de curación de hueso y periodonto.

Ejemplos Ejemplo I Preparación de un PDGF

Se tratan unas heridas óseas, p.ej., a continuación de una enfermedad o un trauma periodontal, y se regenera el periodonto, incluyendo el hueso, el cemento y el tejido conjuntivo, de acuerdo con el invento, combinando un PDGF parcialmente purificado o purificado por completo con una cualquiera de las sustancias de soporte o vehículo farmacéuticamente aceptables que se han descrito más arriba. Un PDGF purificado se puede obtener a partir de una fuente recombinante o a partir de plaquetas humanas. Un PDGF recombinante comercialmente disponible se puede obtener a partir de R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN), BD Biosciences (San José, CA) y Chemicon, International (Temecula, CA). Un PDGF parcialmente purificado y purificado por completo se puede preparar también de la siguiente manera:

De quinientas a 1.000 unidades de sedimentos de plaquetas humanas lavadas se suspenden en NaCl 1 M (2 ml por unidad de plaquetas) y se calientan a 100ºC durante 15 minutos. El material sobrenadante se separa luego por centrifugación y el precipitado se extrae dos veces con el NaCl 1 M.

Los extractos se combinan y dializan frente a un tampón de NaCl 0,08 M/fosfato de sodio 0,01 M (de pH 7,4) y se mezclan durante una noche a 4ºC con CM-Sephadex C-50 equilibrado con el tampón. La mezcla se vierte luego dentro de una columna (de 5 x 100 cm), se lava extensamente con un tampón de NaCl 0,08 M/fosfato de sodio 0,01 M (de pH 7,4), y se eluye con NaCl 1 M mientras que se están recogiendo fracciones de 10 ml.

Las fracciones activas se agrupan y dializan frente a un tampón de NaCl 0,3 M/fosfato de sodio 0,01 M (de pH 7,4), se centrifugan y se hacen pasar a 4ºC a través de una columna de 2,5 x 25 cm de Sepharose azul (de Pharmacia) equilibrada con tampón de NaCl 0,3 M/fosfato de sodio 0,01 M (de pH 7,4). La columna se lava luego con el tampón y un PDGF parcialmente purificado se eluye luego con una solución 1:1 de NaCl 1 M y etilen glicol.

Las fracciones de PDGF parcialmente purificado se diluyen (a 1:1) con NaCl 1 M, se dializan frente a ácido acético 1 M, y se liofilizan. Las muestras liofilizadas se disuelven en un tampón de NaCl 0,8 M/fosfato de sodio 0,01 M (de pH 7,4) y se hacen pasar a través de una columna de 1,2 x 40 cm de CM-Sephadex C-50 equilibrada con el tampón. El PDGF se eluye luego con un gradiente de soluciones de NaCl (de 0,08 a 1 M).

Las fracciones activas se combinan, se dializan frente a ácido acético 1 M, se liofilizan y se disuelven en un pequeño volumen de ácido acético 1 M. Unas porciones de 0,5 ml se aplican a una columna de 1,2 x 100 cm de Biogel P-150 (con un tamaño de mallas de 100 a 200 mesh), equilibrada con ácido acético 1 M. El PDGF es luego eluido con ácido acético 1 M, mientras que se están recogiendo fracciones de 2 ml.

Cada fracción activa que contiene de 100 a 200 mg de la proteína se liofiliza, se disuelve en 100 ml de ácido trifluoroacético al 0,4% y se somete a una cromatografía de líquido de alto rendimiento de fase inversa (HPLC) sobre una columna de fenil Bondapak (de Waters). La elución con un gradiente lineal de soluciones de acetonitrilo (al 0 hasta 60%) proporciona un PDGF puro.

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Un PDGF producido por tecnología de ADN recombinante se puede preparar de la siguiente manera

Un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) que se deriva de plaquetas humanas, contiene dos secuencias de polipéptidos (polipéptidos PDGF-B y PDGF-A; Antoniades, H.N. y Hunkapiller, M., Science 220:963-965, 1983). El PDGF-B es codificado por un gen que está localizado en el cromosoma 7 (Betsholtz, C. y colaboradores, Nature 320:695-699), y el PDGF-A es codificado por el oncogén sis (Doolittle, R. y colaboradores, Science 221:275-277, 1983) localizado en el cromosoma 22 (Dalla-Favera, R., Science 218:686-688, 1982). El gen sis codifica la proteína transformante del Virus de Sarcoma de Simio (SSV, acrónimo de Simian Sarcoma Virus) que está estrechamente relacionada con el polipéptido PDGF-2. El gen c-sis celular humano codifica también la cadena del PDGF-A (Rao, C. D. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2392-2396, 1986). Puesto que las dos cadenas polipeptídicas de un PDGF son codificadas por dos diferentes genes localizados en cromosomas separados, existe la posibilidad de que un PDGF humano consista en un heterodímero de PDGF-B y PDGF-A, enlazado por disulfuro, o en una mezcla de los dos homodímeros (homodímero PDGF-BB y homodímero PDGF-AA), o una mezcla del heterodímero y de los dos homodímeros.

Se mostró que unas células de mamífero en un cultivo infectado con el Virus de Sarcoma de Simio, que contiene el gen que codifica la cadena de PDGF-A, sintetizan el polipéptido PDGF-A y lo transforman en un homodímero enlazado por puentes de disulfuro (Robbins y colaboradores, Nature 305:605-608, 1983). Además, el homodímero de PDGF-A reacciona con antisueros incitados contra un PDGF humano. Además, las propiedades funcionales del homodímero de PDGF-A segregado son similares a las de un PDGF derivado de plaquetas, por el hecho de que él estimula la síntesis de ADN en fibroblastos cultivados, induce una fosforilación en el residuo de tirosina de una proteína de membrana celular de 185 kD, y es capaz de competir con el (^{125}I)-PDGF humano para fijarse a específicos receptores de PDGF de superficie celular (Owen, A. y colaboradores, Science 225:54-56, 1984). Se mostraron unas propiedades similares para el producto génico de sis/PDGF-A derivado de células humanas normales cultivadas (por ejemplo, células endoteliales arteriales humanas), o procedente de células malignas humanas que expresan el gen de sis/PDGF-2 (Antoniades, H. y colaboradores, Cancer Cells 3:145-151, 1985).

El homodímero PDGF-B recombinante se obtiene por la introducción de clones de ADNc del gen de c-sis/PDGF-B dentro de células de ratón usando un vector de expresión. El clon de c-sis/PDGF-B usado para la expresión se obtuvo a partir de células endoteliales humanas cultivadas normales (Collins, T., y colaboradores, Nature 216:748-750, 1985).

Uso de un PDGF

Un PDGF a solas o en combinación con otros factores de crecimiento es útil para favorecer la curación de hueso, el crecimiento de hueso y la regeneración o curación de las estructuras soportantes de dientes lesionados y dañados por un trauma o una enfermedad. Es útil también para favorecer la curación de un sitio de extracción de un diente, para el aumento del borde mandibular o en sitios para implante de dientes. La curación de hueso sería también acrecentada en sitios con una fractura de hueso o en zonas infectadas, p.ej., por osteomielitis, o en sitios con tumores. El PDGF es útil también para favorecer el crecimiento y la curación de ligamento, p.ej., ligamento periodontal, y de cemento.

En uso, el PDGF u otro factor de crecimiento o diferenciación es aplicado directamente a la zona que necesita una curación o regeneración. Generalmente, es aplicado en un soporte o vehículo resorbible o no resorbible en forma de un líquido o un sólido, y el sitio es luego cubierto con un vendaje o un tejido cercano. Una cantidad suficiente para promover el crecimiento de hueso está generalmente entre 500 ng y 5 mg para un área de 1 cm^{2}, pero el límite superior es realmente de 1 mg para un área de 1 cm^{2}, siendo de 0,3 mg/ml una cantidad preferida del PDGF aplicado.

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Ejemplo II Regeneración periodontal con armazones osteoconductivos tratados con rhPDGF-BB

La efectividad del PDGF para favorecer el crecimiento de un periodonto y un hueso es demostrado por el siguiente estudio.

Estudio in vivo de un perro

El perro beagle (sabueso) es el modelo de animal más ampliamente usado para ensayar materiales y procedimientos putativos de regeneración periodontal (Wikesjo y colaboradores, J. Clin. Periodontol. 15:73-78, 1988; Wikesjo y colaboradores J. Clin. Periodontol. 16:116-119, 1999; Cho y colaboradores J. Periodontol. 66:522-530, 1995; Giannobile y colaboradores, J Periodontol. 69:129-137, 1998; y Clergeau y colaboradores, J Periodontol. 67:140-149, 1996). La acumulación de placa y cálculos pueden inducir una inflamación de las encías (gingival), que puede conducir a una pérdida marginal de hueso y se puede comparar la etiología de una periodontitis en perros y seres humanos. En una enfermedad que se presenta por naturaleza, sin embargo, hay una falta de uniformidad entre los defectos. Adicionalmente, puesto que se ha prestado más atención a la salud oral en colonias de criadores caninos, ha resultado impracticable obtener unos animales con una enfermedad periodontal natural. Por lo tanto, el modelo de furcación de Clase III horizontal inducida quirúrgicamente ha resultado ser uno de los modelos más corrientemente usados para investigar la curación y la regeneración periodontal.

Unos perros beagle con defectos de furcación de Clase III horizontal fueron tratados usando unas composiciones de PDGF del invento. Quince perros beagle adultos contribuyeron con 60 defectos tratados. Cuarenta y dos defectos fueron sometidos a biopsia a los dos meses después del tratamiento y quince defectos fueron sometidos a biopsia a los cuatro meses después del tratamiento.

Preparación de un defecto

Se utilizó el modelo de defecto periodontal de "tamaño crítico" tal como ha sido descrito por numerosos investigadores (véase, p.ej., Wikesjo, 1988 y 1999, supra; Giannobile, supra, Cho, supra, y Park y colaboradores., J. Periodontol. 66:462-477, 1995). Se usaron ambos cuadrantes mandibulares en 16 perros beagle machos (con una edad de 2-3 años) sin problemas de salud general y oral. Un mes antes de la adición dosificada, los animales fueron sedados con una inyección subcutánea de atropina (0,02 mg/kg) y de acepromazina (0,2 mg/kg) aproximadamente 30 minutos antes de ser anestesiados con una inyección IV (intravenosa) de pentobarbital sódico (25 mg/kg). A continuación de una infiltración local de la zona quirúrgica con lidocaína HCl más epinefrina 1:100.000, unos colgajos mucoperiosteos de pleno espesor fueron reflejados y los premolares primero y tercero (P1 y P3) fueron extraídos. Adicionalmente, se reseccionó la porción mesial de la corona del 1^{er} molar.

Se retiró luego el hueso alveolar alrededor de la circunferencia entera de los P2 y P4, incluyendo las zonas de furcación usando cinceles y buriles de carburo y diamante enfriados con agua. Se crearon unos defectos óseos horizontales, de manera tal que había una distancia de 5 mm desde el fornix de la furcación hasta la cresta del hueso. Los defectos tenían una anchura de aproximadamente 1 cm, dependiendo de la anchura del diente. Las raíces de todos los dientes experimentales se alisaron con curetas e instrumentos ultrasónicos, y se instrumentaron con un buril de diamante aguzado para eliminar cemento. Después de que se hubieron creado unos defectos óseos normalizados, los colgajos gingivales fueron suturados para conseguir un cierre primario. Los animales fueron alimentados con una dieta blanda y recibieron enjuagues diarios con clorhexidina por toda la duración del estudio.

Aplicación de un material de injerto

Los defectos periodontales de los P2 y P4 en cada cuadrante mandibular de los 15 animales fueron distribuidos aleatoriamente antes del tratamiento, usando unos sobres cerrados. Aproximadamente a las cuatro semanas después de la preparación de los defectos, los animales fueron vueltos a anestesiar tal como arriba se describe y unos colgajos de pleno espesor fueron reflejados en ambos cuadrantes mandibulares. Una entalla fue colocada en las superficies de las raíces de los huesos junto a la cresta ósea residual utilizando un buril circular 1/2, para que sirviese como un futuro punto de referencia histológica. Los sitios fueron irrigados con una solución salina estéril y las raíces fueron tratadas con ácido cítrico, tal como se ha descrito con anterioridad, para la finalidad de efectuar la descontaminación y eliminación de la capa untuosa (véase, p.ej., Cho, supra, y Park, supra). Durante este periodo, una cantidad de \beta-TCP o de DFDBA, suficiente para rellenar el defecto periodontal, fue saturada con una solución de rhPDGF-BB (0,3 ó 1,0 mg/ml) y la mezcla de injerto y de rhPDGF-BB se dejó asentar en el puesto quirúrgico estéril durante aproximadamente diez minutos. El injerto saturado con rhPDGF-BB fue luego empaquetado dentro del defecto con una suave presión hasta conseguir el nivel ideal de regeneración ósea.

Después de una implantación del material de injerto, los colgajos mucoperiosteos fueron suturados aproximadamente al nivel de la unión entre cemento y esmalte (CEJ, acrónimo de cementoenamel junction) utilizando suturas de poli(tetrafluoroetileno) expandido (ePTFE) a 4,0 interrumpidas e interpróximas. A continuación de una suturación de los colgajos, un gel de gluconato de clorhexidina fue colocado suavemente alrededor de los dientes y de las encías.

Grupos de tratamiento y testigos

Los defectos recibieron o bien:

1. \beta-TCP

2. \beta-TCP más rhPDGF-BB (0,3 mg/ml de rhPDGF-BB)

3. \beta-TCP más rhPDGF-BB (1,0 mg/ml de rhPDGF-BB)

4. DFDBA de perro

5. DFDBA de perro más rhPDGF-BB (0,3 mg/ml de rhPDGF-BB)

6. DFDBA de perro más rhPDGF-BB (1,0 mg/ml de rhPDGF-BB)

7. Una operación quirúrgica simulada (se trató por desbridamiento de colgajos abiertos solamente, ningún injerto).

Seis defectos por cada grupo de tratamiento fueron sometidos a biopsia a los dos meses (42 sitios en total). Además, cinco defectos en los grupos en tratamiento 1, 2 y 3 fueron sometidos a biopsia a las cuatro meses, (15 sitios en total).

TABLA 2 Diseño experimental

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Correspondientemente, a las 8 semanas hay 7 grupos divididos entre 42 sitios en 11 perros. A las 16 semanas, hay 3 grupos divididos entre 15 sitios en 4 perros (un perro recibió dos operaciones quirúrgicas de tratamiento escalonadas con ocho semanas de distancia y contribuyó de esta manera con dos sitios para cada uno de los momentos cronológicos de 8 y 16 semanas).

Tratamiento posterior a una operación quirúrgica

Los sitios sometidos a operación quirúrgica fueron protegidos alimentando a los perros con una dieta blanda durante las primeras 4 semanas después de la operación. Para asegurar una curación óptima, se proporcionó un tratamiento antibiótico sistémico con penicilina G benzatina durante las primeras dos semanas y un control de la placa se mantuvo por irrigación diaria con gluconato de clorhexidina al 2% a lo largo de todo el experimento. Las suturas fueron retiradas después de 3 semanas.

Recogida de los datos Exposición razonada para puntos de recogida de datos

Se escogió el momento cronológico de ocho semanas, puesto que éste es el momento cronológico más corriente que se ha informado para este modelo en la bibliografía y por lo tanto existen datos históricos sustanciales. Por ejemplo, Wikesjo y colaboradores, supra, y Giannobile y colaboradores, supra, también escogieron 8 semanas para comprobar los efectos regeneradores de BMP-2 y OP-1, respectivamente en el mismo modelo. Adicionalmente, Park y colaboradores, supra, evaluaron el efecto o se aplicó rhPDGF-BB directamente a la superficie acondicionada de una raíz con y sin membranas GTR en el modelo de perro beagle a las 8 semanas. Estos estudios sugieren en gran manera que el período de 8 semanas debería ser óptimo para ilustrar unos potenciales efectos significativos entre las diversas modalidades de tratamiento.

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El momento cronológico de dieciséis semanas fue escogido para averiguar los efectos a largo plazo de un tratamiento con un factor de crecimiento. Unos estudios anteriores (Park y colaboradores, supra) sugieren que por este período de tiempo hay una curación espontánea sustancial de los defectos óseos. No obstante, es posible comprobar si un tratamiento con rhPDGF-BB conduce a una respuesta tisular desusada o anormal, tal como una remodelación alterada del hueso, una génesis de un tumor o una resorción de raíces.

Biopsias y comprobaciones del tratamiento

En el momento de una biopsia, los animales fueron perfundidos con paraformaldehído al 4% y sacrificados. Las mandíbulas fueron luego retiradas y colocadas en un material fijativo. Se tomaron unas radiografías periapicales y los sitios tratados se cortaron en forma de bloques individuales usando una sierra de diamante. Los bloques (cegados) codificados se envolvieron en gasa, se sumergieron en una solución de formaldehído al 4%, se trataron y se
analizaron.

Durante el tratamiento, las biopsias fueron deshidratadas en etanol e infiltradas y embebidas en metacrilato de metilo. Unas secciones no descalcificadas con un espesor de aproximadamente 300 \mum se obtuvieron utilizando una sierra de diamante de baja velocidad provista de un agente refrigerante. Las secciones fueron pegadas con cola sobre un vidrio acrílico opalescente, rectificadas hasta llegar a un espesor final de aproximadamente 80 \mum y teñidas con azul de toluidina y fucsina básica. Unas secciones en serie escalonadas se obtuvieron en un plano mesiodistal.

Unos análisis histomorfométricos se realización en los portaobjetos enmascarados. Se comprobaron los siguientes parámetros:

1. Longitud del Aparato Completo de Nueva Fijación (CNAA acrónimo de Complete New Attachment Apparatus): La regeneración periodontal medida como la distancia entre el nivel coronal del hueso antiguo y el nivel coronal del hueso nuevo, incluyendo solamente el hueso nuevo que está adyacente al cemento nuevo con un ligamento periodontal funcionalmente orientado entre el hueso nuevo y el cemento nuevo.

2. Relleno de Hueso Nuevo (NB acrónimo de New Bone): medido como el área de sección transversal del hueso nuevo formado dentro de la furcación.

3. Relleno de tejido conjuntivo (CT, acrónimo de Connective Tissue): medido como el área dentro de la furcación ocupada por un tejido conjuntivo gingival.

4. Espacio Vacío (VO de Void). El área de la recesión donde hay una ausencia de tejido.

Resultados A. Observaciones clínicas

Desde el punto de vista clínico, todos los sitios se curaron bien. Había una impresión de que los sitios tratados con rhPDGF-BB se curaban con mayor rapidez, tal como se indicaba por la presencia de encías firmes, de color rosa, dentro del período de una semana después de la operación quirúrgica. No hubo sucesos desfavorables experimentados en ningún grupo de tratamiento, tal como se comprobó por inspección visual de los sitios tratados. Se mostró que había una recesión gingival aumentada en los grupos que recibieron \beta-TCP o DFDBA solamente.

B. Observaciones radiográficas

Desde el punto de vista radiográfico, había una evidencia de una formación aumentada de hueso a los dos meses según se juzgaba por una opacidad radiológica aumentada en los Grupos 2, 3 (\beta-TCP + rhPDGF-BB 0,3 y 1,0 mg/ml, respectivamente) y 6 (DFDBA + rhPDGF-BB 1,0 mg/ml) en comparación con los otros Grupos (Figuras 1A-G). A los cuatro meses, había una evidencia de una formación aumentada de hueso en todos los Grupos en comparación con el momento cronológico de dos meses. No había ninguna evidencia radiográfica de ninguna remodelación anormal de hueso, resorción de las raíces, ni de anquilosis en ninguno de los grupos.

TABLA 3 Resultados radiográficos. Orden de rango

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C. Análisis histomorfométricos

La comprobación histomorfométrica de las longitudes de cemento nuevo, de hueso nuevo y de ligamento periodontal (CNAA) nuevo, así como el relleno de hueso nuevo, el relleno de tejido conjuntivo y el espacio vacío se evaluaron y se expresan en forma de porcentajes. En el caso de un CNAA, los valores para cada grupo de ensayo representan las mediciones del CNAA (longitud en mm)/longitud total disponible de CNAA (en mm) x 100%. El relleno de hueso, el relleno de tejido conjuntivo y el espacio vacío se evaluaron y se expresan en forma de porcentajes del área del defecto de furcación total.

Un análisis de una vía de la varianza (ANOVA) se usó para ensayar las diferencias globales entre los grupos de tratamiento, y se hicieron comparaciones por pares usando el ensayo t de Student. Se encontraron unas diferencias significativas entre grupos después de los análisis de los portaobjetos codificados. La Tabla 4 muestra los resultados obtenidos a los dos meses.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

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Los valores de la regeneración periodontal porcentual media (CNAA) en los grupos con una operación quirúrgica sin injertos y con una operación quirúrgica más \beta-TCP a solas fueron de 27% y 37%, respectivamente, En contraste con ello, los grupos con \beta-TCP que contenían rhPDGF-BB exhibieron una regeneración periodontal significativamente mayor (p<0,05) que los grupos con una operación quirúrgica sin injertos o con DFDBA a solas (59% y 46% respectivamente para las concentraciones de 0,3 y 1,0 mg/ml frente a 27% para la operación quirúrgica a solas y de 13% para el DFDBA a solas). Finalmente, el grupo con \beta-TCP, que contenía 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB, demostró una regeneración periodontal significativamente mayor (p<0,05) que la misma concentración de rhPDGF-BB combinada con un aloinjerto (59% frente a 21%).

El relleno de hueso era significativamente mayor (p<0,05) en los grupos con \beta-TCP + 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB (84,0%) y los grupos con \beta-TCP + 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB (74,2%) que en los grupos con \beta-TCP a solas (28,0%), con operación quirúrgica a solas (34%) o con tratamiento con DFDBA a solas (6%). Había también a un relleno de hueso significativamente mayor (p<0,05) para el grupo con \beta-TCP + 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB en comparación con el grupo con DFDBA + 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB (84% y 20% respectivamente).

El grupo de análisis que examinan los datos de 8 semanas procedentes de los grupos con DFDBA y el grupo con operación quirúrgica a solas (Grupos 4, 5, 6, y 7) no demostró unas diferencias estadísticamente significativas entre los grupos con DFDBA y con operación quirúrgica a solas para la regeneración periodontal (CNAA). Había una tendencia hacia una mayor regeneración para los sitios tratados con el DFDBA acrecentado con 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB frente a los grupos con DFDBA a solas. Había un relleno de hueso significativamente mayor (p<0,05) para los sitios tratados con DFDBA + 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB que los grupos con DFDBA a solas (46 y 6% respectivamente). Había una tendencia hacia un mayor relleno de hueso para los sitios tratados con DFDBA que contenía 0,3 mg/ml de rhPDGF- BB en comparación con los grupos con DFDBA a solas o con operación quirúrgica a solas. Sin embargo, los sitios tratados con DFDBA demostraron menos relleno de hueso dentro del defecto que el grupo con operación quirúrgica a solas (6 y 34%, respectivamente), estando la mayor parte del defecto desprovista de cualquier relleno o de un relleno que consistiese en tejido conjuntivo gingival (blando).

A los cuatro meses después del tratamiento, permanecían unas diferencias significativas en la regeneración periodontal. El \beta-TCP a solas, como resultado de una anquilosis extensa, dio como resultado una regeneración de 36%, mientras que los sitios tratados con \beta-TCP que contenía rhPDGF-BB tenían una regeneración media de 58% y 49% en las concentraciones de 0,3 y 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB. Estaba presente un relleno de hueso sustancial en la totalidad de los tres grupos de tratamiento. El \beta-TCP a solas dio como resultado un 70% de relleno de hueso, el \beta-TCP más 0,3 mg/ml de rhPDGF proporcionó un 100% de relleno mientras que el grupo con 1,0 mg/ml de rhPDGF tenía un 75% de relleno.

D. Evaluación histológica

Una evaluación histológica se realizó para todas las biopsias excepto una, en la cual la evaluación no fue posible debido a unas dificultades encontradas durante el tratamiento.

Unas fotomicrografías representativas se muestran en las Figuras 1A-G y 2A-C. La Figura 1A muestra los resultados obtenidos a partir de un sitio tratado con operación quirúrgica a solas (sin injertos). Esta muestra demuestra una regeneración periodontal limitada (hueso nuevo (NB), cemento nuevo (NC) y ligamento periodontal (PDL)) como se evidenciaba en el área de las entallas y que se extendía coronalmente sólo en una corta distancia. El área de la furcación es ocupada principalmente por un tejido conjuntivo (CT) blando denso con una mínima formación de hueso (NB).

Para los sitios tratados con \beta-TCP a solas (Figura 1B) hay una regeneración periodontal, similar a la observada para la muestra con operación quirúrgica a solas, que se extiende coronalmente desde la base de las entallas por una corta distancia. Como se observó en las muestras con operación quirúrgica a solas, había muy poca formación de hueso nuevo, estando ocupada el área mayor de la furcación por un tejido conjuntivo blando.

En contraste con esto, la Figura 1C ilustra los resultados obtenidos para unos sitios tratados con \beta-TCP + 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB. Se muestra una regeneración periodontal significativa extendiéndose el hueso nuevo, el cemento nuevo y el ligamento periodontal a lo largo de toda la superficie de la furcación. Adicionalmente, el área de la furcación es rellenada con hueso nuevo que se extiende por toda la altura de la furcación hasta el fornix.

Unos resultados representativos de los sitios tratados con \beta-TCP + 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB se muestran en la Figura 1D. Mientras que hay una regeneración periodontal significativa en la furcación, ésta no se extiende a lo largo de toda la superficie de la furcación. Hay presente una formación de hueso nuevo junto con tejido conjuntivo blando, que se observa en la porción coronal del defecto junto con un pequeño espacio que está vacío (VO) de cualquier tejido en el fornix de la furcación.

Las Figuras 2A, 2B, y 2C ilustran los resultados obtenidos para el grupo con tratamiento con un aloinjerto. Unos resultados representativos para el grupo con DFDBA a solas (Figura 2A) muestra una muy mala regeneración periodontal, que está limitada al área de las entallas que se extienden solo ligeramente en una dirección coronal. La formación de hueso nuevo está limitada y se compone de pequeñas cantidades de formación de hueso a lo largo de la superficie del material de injerto de DFDBA residual (islas que se tiñen de rojo oscuro juntamente con islas de color rosa más claro). Adicionalmente, el hueso nuevo está rodeado por un extenso tejido conjuntivo blando que se extiende coronalmente para rellenar un área significativa dentro de la furcación. Finalmente, un gran espacio vacío se extiende desde la extensión coronal del tejido conjuntivo blando hasta el fornix de la furcación.

Los resultados histológicos para los grupos con DFDBA + 0,3 y 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB se muestran en las Figuras 2B y 2C, respectivamente. Ambos grupos demuestran una mayor regeneración periodontal en comparación con el grupo con DFDBA a solas con un aparato completo de nueva fijación (hueso nuevo, cemento nuevo y filamento periodontal) que se extiende coronalmente (flechas) por una corta distancia desde la base de las entallas dentro de las raíces. Había también un mayor relleno de hueso dentro del área de la furcación, aunque había un relleno significativo de la furcación con tejido conjuntivo blando.

Conclusiones

Basándose en los resultados del estudio, un tratamiento de un defecto periodontal usando rhPDGF-BB o bien con 0,3 mg/ml o con 1,0 mg/ml en combinación con un material de vehículo apropiado, que es el \beta-TCP, da como resultado una mayor regeneración periodontal que los actuales productos o procedimientos, tales como injertos con \beta-TCP o aloinjerto de hueso a solas, o bien una operación quirúrgica sin injertos.

El tratamiento con las concentraciones de 0,3 mg/ml y 1,0 mg/ml de rliPDGF dio como resultado una regeneración periodontal. La concentración de 0,3 mg/ml de rhPDGF demostró una mayor regeneración periodontal y un mayor porcentaje de relleno de hueso en comparación con la concentración de 1,0 mg/ml de rhPDGF cuando se había mezclado con \beta-TCP.

El \beta-TCP era más efectivo que un aloinjerto cuando se había mezclado con rhPDGF-BB en cualquier concentración. El hueso nuevo se maduró (remodeló) normalmente en el transcurso del tiempo (0, 8 y 16 semanas) en todos los grupos. No hubo aumento en la anquilosis ni en la resorción ósea en los grupos con rhPDGF. De hecho, los sitios que recibían el rhPDGF-BB tendían a tener menos anquilosis que los sitios testigos. Este hallazgo puede resultar del hecho de que el rhPDGF-BB es mitogénico y quimiotáctico para células de ligamentos periodontales.

Materiales y métodos Materiales utilizados: artículos de ensayo y testigos

El \beta-TCP utilizado tenía un tamaño de partículas (0,25 mm-1,0 mm) que fue optimizado para el uso periodontal. Basándose en los estudios que usaban un modelo canino, el \beta-TCP administrado es resorbido en \sim80% en el transcurso de tres meses y es reemplazado por hueso autólogo durante el proceso de curación.

El DFDBA fue suministrado por la Fundación de Trasplantes Musculoesqueletales (MTF acrónimo de Musculoskeletal Transplant Foundation). El material era un aloinjerto de perro, producido a partir de los huesos de un perro que había sido sacrificado después de la compleción de otro estudio que ensayaba un proceso quirúrgico, que se estimaba que no tenía ningún efecto sobre los tejidos del esqueleto.

Un hPDGF-BB recombinante fue suministrado por BioMimetic Pharmaceuticals y fue producido por Chiron, Inc, que es el único suministrador de rhPDGF-BB aprobado por la FDA (acrónimo de Food and Drug Administration = Administración de Alimentos y Drogas) para el uso humano. Este rhPDGF-BB fue aprobado por la FDA como un producto para la curación de heridas, bajo el nombre registrado Regranex®.

Unas jeringas con una capacidad de un ml, que contenían 0,5 ml de rhPDGF-BB estéril en dos concentraciones, preparadas en conformidad con las normas de la FDA para materiales humanos y de acuerdo con los actuales "Buenos Procesos de Fabricación" (cGMP, acrónimo de current Good Manufacturing Processes). Las concentraciones ensayadas contenían 0,3 mg/ml y 1,0 mg/ml.

El \beta-TCP fue proporcionado en unos viales que contenían 0,5 cm^{3} de partículas estériles.

El DFDBA fue proporcionado en unas jeringas con una capacidad de 2,0 ml, que contenían 1.0 cm^{3} del aloinjerto de hueso de perro, liofilizado, desmineralizado y estéril.

Preparación de los materiales

En el momento del proceso quirúrgico, los injertos implantados finales fueron preparados mezclando la solución de rhPDGF-BB con los materiales de matriz. Dicho brevemente, una cantidad de TCP o de un aloinjerto, que era suficiente para rellenar por completo el defecto de hueso, fue colocada dentro de un plato estéril. Se añadió luego la solución de rhPDGF-BB en cantidad suficiente para saturar por completo a la matriz, los materiales se mezclaron y se dejaron asentar sobre la bandeja quirúrgica durante aproximadamente 10 minutos a la temperatura ambiente, antes de ser colocados dentro del defecto de hueso.

Un periodo de tiempo de incubación de 10 minutos con el material \beta-TCP es suficiente para obtener una adsorción máxima de un factor de crecimiento (véase el Apéndice A). Ésta es también una cantidad de tiempo apropiada que tienen los cirujanos en un ajuste clínico antes de la colocación del producto dentro del defecto periodontal. Similarmente, en un mercado comercial, el rhPDGF-BB y el material de matriz se pueden suministrar en recipientes por separado dentro de un estuche, y en que los materiales se pueden mezclar directamente antes de la colocación. Este concepto de estuche simplificaría en gran manera las consideraciones de duración de vida útil, del producto y de estabilidad.

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Ejemplo III Uso de PDGF para el tratamiento de defectos de hueso periodontal en seres humanos

Un PDGF-BB humano recombinante (rhPDGF-BB) fue ensayado en cuanto a su efecto sobre la regeneración de hueso periodontal en individuos humanos. A dos grupos de ensayo se le administró el rhPDGF-BB en una cantidad o bien de 0,3 mg/ml (Grupo I) o de 1,0 mg/ml (Grupo II). El rhPDGF-BB fue preparado en un tampón de acetato de sodio y administrado en un vehículo de beta-fosfato de tricalcio (\beta-TCP). El grupo testigo, Grupo III, recibió administrado el \beta-TCP en un tampón de acetato de sodio solamente.

El objetivo de un estudio clínico fue el de evaluar la seguridad y la efectividad de un material de injerto que comprendía el \beta-TCP y el rhPDGF-BB en una cantidad o bien de 0,3 mg/ml o de 1,0 mg/ml en la gestión de uno (1) a tres (3) defectos periodontales intra-óseos de pared y comprobar su capacidad de regeneración en un hueso y en un tejido blando.

Diseño del estudio y duración del tratamiento

El estudio era una prueba clínica de centros múltiples diseñada paralelamente, aleatoria, prospectiva, controlada y doble ciega, en individuos que requerían una intervención quirúrgica para tratar un defecto de hueso adyacente a la dentición natural. Los individuos fueron distribuidos aleatoriamente en proporciones iguales para dar como resultado tres (3) grupos de tratamiento cada uno de aproximadamente 60 individuos (180 en total). La duración del estudio fue de
seis (6) meses a continuación de la implantación del dispositivo sometido a estudio. El estudio enroló a 180 individuos.

Diagnóstico y criterios de entrada principales

Unos individuos masculinos y femeninos, que tenían una edad de 25-75 años, con una enfermedad periodontal avanzada en por lo menos un sitio que requería un tratamiento quirúrgico para corregir un defecto de hueso, fueron admitidos en el estudio. Otros criterios de inclusión incluían: 1) una profundidad de la bolsa de sondeo que medía 7 mm o más en la visita en la línea de base; 2) después de un desbridamiento quirúrgico, un defecto de hueso (BD) vertical de 4 mm o mayor, con por lo menos 1 pared ósea; 3) suficiente cantidad de tejido queratinizado para permitir un cubrimiento completo con tejido del defecto; y 4) una base radiográfica del defecto coronalmente en por lo menos en 3 mm hasta el ápice del diente. Unos individuos que fumaban hasta 1 paquete por día y que tenían unos dientes con una implicación de furcación de las Clases I y II, fueron admitidos específicamente.

Dosis y modo de administración

Todos los estuches de tratamiento contenían 0,25 g de \beta-TCP (un testigo activo) o bien 0,5 ml de una solución tamponadora de acetato de sodio a solas (Grupo III), o 0,3 mg/ml de rhPDGF-BB (Grupo I), o 1,0 mg/ml de rhPDGF-BB (Grupo II).

Después de un desbridamiento y un alisamiento de la raíz realizados a fondo, la solución de ensayo se mezcló con el \beta-TCP en un recipiente estéril, de manera tal que el \beta-TCP se saturó completamente. Las superficies de la raíz fueron acondicionadas usando o bien tetraciclina, o EDTA o ácido cítrico. El injerto hidratado fue empaquetado luego dentro del defecto de hueso y los colgajos de tejido fueron sujetos con suturas interdentales para conseguir un cubrimiento completo del sitio quirúrgico.

Medición de la actividad

La medición de la efectividad primaria incluía el cambio en el nivel de fijación clínica (CAL acrónimo de clinical attachment level) entre la línea de base y seis meses después de la operación quirúrgica (Grupo I frente al Grupo III). Las mediciones de la efectividad secundaria constaban de los siguientes sucesos: 1) crecimiento de hueso lineal (LBG acrónimo de linear bone growth) y % de relleno de hueso (% BF de bone fill) desde la línea de base hasta seis meses después de la operación quirúrgica basándose en las comprobaciones radiográficas (Grupo I y Grupo II frente al Grupo III); 2) cambio en el CAL entre la línea de base y seis meses después de la operación quirúrgica (Grupo II frente al Grupo III); 3) reducción de la profundidad de la bolsa de sondeo (PDR acrónimo de probing pocket depth reduction) entre la línea de base y seis meses después de la operación quirúrgica (Grupo I y Grupo II frente al grupo Grupo III); 4) recesión gingival (GR acrónimo de gingival recession) entre la línea de base y seis meses después de la operación quirúrgica (Grupo I y Grupo II frente al Grupo III); 5) curación de la herida (WH, acrónimo de wound healing) del sitio quirúrgico durante las primeras tres semanas después de la operación quirúrgica (Grupo I y Grupo II frente al Grupo III); 6) área bajo la curva para el cambio en CAL entre la línea de base y tres (3) y seis (6) meses (Grupo I y Grupo II frente al Grupo III); 7) el límite inferior de confianza al 95% (LCB, acrónimo de lower confidence bound) para el valor de % de BF a los seis (6) meses después de la operación quirúrgica (Grupos I, II, y III frente a un aloinjerto de hueso liofilizado y desmineralizado (DFDBA acrónimo de demineralized freeze-dried bone allograft) (como se publica en la bibliografía; Parashis y colaboradores, J. Periodontal. 69:751-758, 1998); 8) el LCB al 95% para un crecimiento de hueso lineal a los seis (6) meses después de la operación quirúrgica (Grupos I, II, y III frente a un aloinjerto de hueso liofilizado y desmineralizado (DFDBA) como se publica en la bibliografía; Persson y colaboradores J. Clin. Periodontal. 27:104-108, 2000); 9) el LCB al 95% para el cambio en el CAL entre la línea de base y seis (6) meses (Grupos I, II, y II frente a EMDOGAIN® - PMA P930021, 1996); y 10) el LCB al 95% para el cambio en CAL entre la línea de base y seis (6) meses (Grupos I, II y III frente a PEPGEN P-15® - PMA P990033,
1999).

Métodos estadísticos

Los datos de seguridad y efectividad fueron examinados y recopilados por un estudio estadístico descriptivo. Unas mediciones categóricas fueron presentadas visualmente como cómputos y porcentajes, y unas variables continuas fueron presentadas visualmente como medias, medianas, desviaciones típicas e intervalos. Unas comparaciones estadísticas entre los grupos de tratamiento con el producto de ensayo (Grupos I y II) y el testigo (Grupo III) se hicieron usando unos ensayos de Chi-Square [Chi al cuadrado] y Fisher's Exact (exacto de Fisher) para variables categóricas y unos ensayos t o análisis por métodos de varianza (ANOVA) para variables continuas. Unas comparaciones entre grupos de tratamiento para variables ordinales se hicieron usando los métodos de Cochran-Mantel-Haenszel. Una p \leq 0,05 (de un lado) se consideró que era estadísticamente significativa para CAL, LBG y % de BF.

Los datos de seguridad fueron comprobados por la frecuencia y gravedad de sucesos desfavorables que se evaluaron desde puntos de vista clínicos y radiográficos. No había diferencias significativas entre los tres grupos de tratamiento en la línea de base. Tampoco se observaba ninguna diferencia significativa estadísticamente en la incidencia de sucesos desfavorables (AEs, acrónimo de adverse events; todas las causas) entre los tres grupos de tratamiento. El análisis de la seguridad no identifica ningún riesgo aumentado para el individuo debido a una implantación del material de injerto.

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Sumario de los resultados de efectividad

Los resultados de los análisis estadísticos revelaron unos beneficios significativos, tanto clínica como estadísticamente, para los dos grupos de tratamiento (Grupos I y II), en comparación con el testigo activo de \beta-TCP a solas (Grupo III) y unos testigos históricos que incluían un DFDBA, EMDOGAIN® y PEPGEN P-15®.

A los tres meses después de la operación quirúrgica, se observó una ganancia estadísticamente significativa en el CAL desde la línea de base en favor del Grupo I frente al Grupo III (p = 0,041), indicando que hay unos beneficios significativamente tempranos del PDGF sobre la ganancia en el CAL. A los seis meses después de la operación quirúrgica, esta tendencia continuaba favoreciendo al Grupo I con respecto al Grupo III, aunque esta diferencia no era estadísticamente significativa (p = 0,200). El análisis del área bajo la curva (AUC acrónimo de area under the curve), que representa el efecto acumulado (es decir, la velocidad) para la ganancia en el CAL entre la línea de base y seis meses, se aproximó a la significancia estadística, que favorece al Grupo I en comparación con el Grupo III (p = 0,054). Además los análisis del límite inferior de confianza al 95% (LCB) para todos los grupos de tratamiento justificaron la efectividad de los Grupos I y II en comparación con las ganancias en el CAL observadas a los seis (6) meses para EMDOGAIN® y PEPGEN P-15®.

Además de los beneficios clínicos observados en el CAL, unos análisis gráficos que incluían el crecimiento de hueso lineal (LBG) y el porcentaje de relleno de hueso (% de BF) revelaron una mejora estadísticamente significativa en la ganancia de hueso para los Grupos I y II frente al Grupo III. El % de BF fue definido como el porcentaje de defecto de hueso original rellenado con hueso nuevo, como se midió por radiografía. El LBG mostró una mejoría significativa en el Grupo I (de 2,5 mm) cuando se comparó con el del Grupo III (0,9 mm, p<0,001). El LBG era también significativo para el Grupo II (1,5 mm) cuando se comparó con el del Grupo III (p = 0,021).

El porcentaje de relleno de hueso (% de BF) fue aumentado significativamente a los seis meses después de la operación quirúrgica en el Grupo I (56%) y el Grupo II (34%) cuando se compararon con el Grupo III (18%), para unos valores de p < 0,001 y p = 0,019, respectivamente. El límite inferior del intervalo de confianza al 95% a los seis meses después de la operación quirúrgica tanto para el crecimiento lineal de hueso como para el % de relleno de hueso, justificaron la efectividad de los Grupos I y II en comparación con los resultados radiográficos publicados para el DFDBA, que es el material usado más ampliamente para procesos de injerto periodontal.

A los tres meses, había significativamente menos recesión gingival (GR, acrónimo de Gingival Recession)
(p=0,041) para el Grupo I en comparación con el Grupo III, lo que es compatible con el efecto beneficioso observado con el CAL. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en PDR y GR a los seis meses. Los análisis descriptivos del número de sitios que exhibían una curación completa de las heridas (WH) a las tres semanas revelaron unas mejorías en el Grupo I (72%) frente al Grupo II (60%) y Grupo III (55%), indicando una tendencia hacia una curación mejorada.

Para comprobar el efecto beneficioso acumulado para los sucesos y resultados clínicos y radiográficos, se realizó un análisis compuesto de efectividad para determinar el porcentaje de pacientes con un resultado satisfactorio, como se define por un CAL > 2,7 mm y un LBG > 1,1 mm a los seis (6) meses. Los puntos de referencia de éxito en CAL y LBG se establecieron por los niveles medios conseguidos para estos parámetros por los injertos implantados, como se identifica en la anterior sección de "Mediciones de la efectividad". Los resultados mostraron que un 61,7% de los pacientes del Grupo I y un 37,9% de los pacientes del Grupo II alcanzaban o superaban el punto de referencia compuesto, en comparación con un 30,4% de los pacientes del Grupo III, dando como resultado un beneficio estadísticamente significativo del Grupo I frente al Grupo III (p < 0,001). El % de BF reveló unos beneficios similares para el Grupo I (70,0%) frente al Grupo (44,6%) para un valor de p de 0,003.

En resumen, el Grupo I consiguió unos resultados estadísticamente beneficiosos para el CAL y el GR a los tres (3) meses así como para el LBG y el % de BF a los seis (6) meses, en comparación con el grupo testigo activo con \beta-TCP a solas (Grupo III). La significancia clínica de estos resultados es confirmada adicionalmente por una comparación con testigos históricos. Se saca la conclusión de que se había mostrado que un material de injerto que contenía PDGF conseguía una efectividad clínica y radiográfica a los seis meses para el tratamiento de defectos óseos periodontales.

TABLA 5 Sumario de la efectividad de injertos con PDF

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Se mostró que un material de injerto (es decir, \beta-TCP) que contenía un PDGF en 0,3 mg/ml y en 1,0 mg/ml era seguro y efectivo en la restauración de hueso alveolar y en la fijación clínica alrededor de unos dientes que presentaban una periodontitis desde moderada hasta avanzada en una prueba clínica aleatoria amplia, que implicaba a 180 individuos estudiados durante hasta 6 meses. Estas conclusiones se basan en mediciones radiográficas y clínicas validadas, como se recopilan seguidamente.

De un modo compatible con los datos de biocompatibilidad del material para injerto que contenía PDGF, arriba debatido, y el uso seguro históricamente de cada componente individual (es decir \beta-TCP o PDGF a solas), el estudio no reveló ninguna evidencia de efectos desfavorables ya sean locales o sistémicos. No hubo resultados desfavorables atribuibles al material de injerto, que se encontró que es seguro.

Conclusiones

Se encontró que la implantación del \beta-TCP que contenía un PDGF o bien con 0,3 mg/ml o con 1,0 mg/ml era un tratamiento efectivo para la restauración del nivel de fijación de tejido blando y de hueso, tal como se muestra por un CAL mejorado significativamente a los 3 meses en comparación con el testigo activo. Nuestros hallazgos son también compatibles con el análisis de la AUC, que mostró una mejoría en la ganancia en el CAL entre la línea de base y los seis meses. Se encontró también que la implantación del \beta-TCP que contenía un PDGF o bien con 0,3 mg/ml o con 1,0 mg/ml, es un efectivo tratamiento, basándose en unos valores del LBG y del % de BF significativamente mejorados en comparación con el testigo activo. Unos resultados clínicos significativamente mejorados, tal como se muestra por el análisis compuesto de las mediciones de unos tejidos tanto duros como blandos, en comparación con el testigo activo con \beta-TCP a solas, demuestran también la efectividad del protocolo de tratamiento que arriba se ha descrito. Finalmente, se encontró que los resultados de la administración del \beta-TCP que contenía un PDGF o bien con 0,3 mg/ml o con 1,0 mg/ml superaban los puntos de referencia establecidos de efectividad, desde un punto de vista tanto clínico como radiográfico.

Los resultados de esta prueba, juntamente con unos datos extensos y confirmatorios procedentes de estudios in vitro, en animales y en seres humanos, demuestran que un material de injerto que contiene PDGF estimula la regeneración de unos tejidos blandos y duros en defectos periodontales, aunque los efectos eran más significativos cuando se administró un PDGF en el intervalo de 0,1 a 1,0 mg/ml (p.ej., 0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml ó 1,0 mg/ml) en el material de injerto. Además, un PDGF administrado en el material de injerto en la cantidad de 0,3 mg/ml, regeneraba efectivamente al tejido blando y al hueso.

Otras formas de realización están dentro de las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Un material para implante, que comprende un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él un líquido que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, en que el fosfato de calcio comprende beta-fosfato de tricalcio y el fosfato de calcio comprende unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros.

2. El material para implante de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él un líquido que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, en que el fosfato de calcio tiene una porosidad mayor que 40% y el fosfato de calcio comprende unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros.

3. El material para implante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende además un colágeno, un poli(ácido glicólico) o un poli(ácido láctico).

4. El material para implante de acuerdo con la reivindicación 2, que se compone de un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él un líquido que se compone de un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml en un tampón, en que el fosfato de calcio tiene una porosidad mayor que 40% y el fosfato de calcio se compone de unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros.

5. El material para implante de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en un fosfato de calcio poroso, que tiene incorporado en él un líquido que se compone de un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml en un tampón, en que el fosfato de calcio se compone de unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros.

6. El material para implante de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, que se compone de un colágeno, un poli(ácido glicólico) o un poli(ácido láctico) y de un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él un líquido que se compone de un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml en un tampón, en que el fosfato de calcio tiene una porosidad mayor que 40% y el fosfato de calcio se compone de unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros.

7. El material para implante de acuerdo con la reivindicación 1 ó 3, que se compone de un colágeno, un poli(ácido glicólico) o un poli(ácido láctico) y de un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él un líquido que se compone de un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml en un tampón, en que el material para implante es poroso y el fosfato de calcio se compone de unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros.

8. El material para implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en que el PDGF es un PDGF humano recombinante.

9. El material para implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en que el líquido comprende un PDGF en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 0,75 mg/ml, de manera preferible en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,25 mg/ml a aproximadamente 0,5 mg/ml, y, en particular, en una concentración de aproximadamente 0,3 mg/ml.

10. El material para implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en que el fosfato de calcio es beta-fosfato de tricalcio.

11. El material para implante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en que el fosfato de calcio comprende unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros, en particular, en un intervalo de aproximadamente 200 micrómetros a aproximadamente 3.000 micrómetros, y de manera preferible en un intervalo de aproximadamente 250 micrómetros a aproximadamente 2.000 micrómetros.

12. El material para implante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en que el material para implante es resorbible de manera tal que por lo menos un 80% del fosfato de calcio es resorbido en el transcurso de un año desde que había sido implantado como un gránulo de 1-5 g.

13. El material para implante de la reivindicación 1, 5 ó 7, en que este material para implante comprende unas partículas porosas de fosfato de calcio que tienen una porosidad mayor que 40%.

14. El material para implante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en que el PDGF es un PDGF-BD y el fosfato de calcio es beta-fosfato de tricalcio.

15. El material para implante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en que el líquido incorporado está absorbido en el fosfato de calcio.

16. El material para implante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 u 8-15, que comprende además un agente biológicamente activo, en que el agente biológicamente activo es un anticuerpo, un antibiótico, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína, un agente anticanceroso, un factor de crecimiento, un agente anti-inflamatorio, o una vacuna, y en que la proteína es preferiblemente una proteína osteogénica y, en particular, un factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-I), un factor de crecimiento similar a insulina II (IGF-II), un factor de crecimiento transformante-\beta1 (TGF-\beta1), un factor de crecimiento transformante-\beta2 (TGF-\beta2), un factor de crecimiento transformante-\alpha (TGF-\alpha), una proteína morfogenética ósea (BMP), o bien osteogenina.

17. El material para implante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 y 7, en que la porosidad del material para implante después de su implantación in vivo es una macroporosidad.

18. El material para implante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17 en que el PDGF es un PDGF-BB.

19. El material para implante de acuerdo con la reivindicación 1, que se compone de un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él un líquido que se compone de un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, en que el material para implante es poroso, en que el fosfato de calcio se compone de unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros, y en que el fosfato de calcio es beta-fosfato de tricalcio.

20. Uso de un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él un líquido que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, en que el fosfato de calcio comprende beta-fosfato de tricalcio y el fosfato de calcio tiene una porosidad mayor que 40% y el fosfato de calcio comprende unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros, para la producción de un material para implante destinado a favorecer el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero.

21. Uso de un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él un líquido que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, en que el fosfato de calcio comprende beta-fosfato de tricalcio y el fosfato de calcio comprende unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros, para la producción de un material para implante destinado a favorecer el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero.

22. Uso de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21, en que el material para implante comprende además un colágeno, un poli(ácido glicólico) o un poli(ácido láctico).

23. Uso de acuerdo con la reivindicación 20 de un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él un líquido que se compone de un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml en un tampón, en que el fosfato de calcio tiene una porosidad mayor que 40% y el fosfato de calcio se compone de unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros, para la producción de un material para implante destinado a favorecer el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero.

24. Uso de acuerdo con la reivindicación 21 de un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él un líquido que se compone de un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml en un tampón, en que el fosfato de calcio se compone de unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros, para la producción de un material para implante destinado a favorecer el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero.

25. Uso de acuerdo con la reivindicación 20 de un colágeno, un poli(ácido glicólico) o un poli(ácido láctico) y de un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él un líquido que se compone de un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, en un tampón, en que el fosfato de calcio tiene una porosidad mayor de 40% y el fosfato de calcio se compone de unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros, para la producción de un material para implante destinado a favorecer el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero.

26. Uso de acuerdo con la reivindicación 21, de un colágeno, un poli(ácido glicólico) o un poli(ácido láctico) y de un fosfato de calcio que tiene incorporado en él un líquido que se compone de un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml en un tampón, en que el material para implante es poroso y el fosfato de calcio se compone de unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros, para la producción de un material para implante destinado a favorecer el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero.

27. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 20-26, en que el PDGF es un PDGF recombinante humano.

28. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 20-27, en que el líquido comprende un PDGF en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 0,75 mg/ml, de manera preferible en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,25 mg/ml a aproximadamente 0,5 mg/ml y, en particular, en una concentración de aproximadamente 0,3 mg/ml.

29. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 20-28, en que el fosfato de calcio es beta-fosfato de tricalcio.

30. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 20-29, en que el fosfato de calcio comprende unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros, en particular, en un intervalo de aproximadamente 200 micrómetros a aproximadamente 3.000 micrómetros, y de manera preferible en un intervalo de aproximadamente 250 micrómetros a aproximadamente 2.000 micrómetros.

31. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 20-30, en que el material para implante es resorbible de manera tal que por lo menos un 80% del fosfato de calcio es resorbido en el transcurso de un año desde haber sido implantado como un gránulo de 1-5 g.

32. El uso de la reivindicación 21, 24 ó 26, en que dicha porosidad comprende partículas porosas de fosfato de calcio que tienen una porosidad mayor que 40%.

33. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 20-32, en que el PDGF es un PDGF-BB y el fosfato de calcio es fosfato de tricalcio.

34. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 20-33, en que el líquido incorporado está absorbido en el fosfato de calcio.

35. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 20-22 ó 27-34 que comprende además un agente biológicamente activo, en que el agente biológicamente activo es un anticuerpo, un antibiótico, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína, un agente anticanceroso, un factor de crecimiento, un agente antiinflamatorio o una vacuna, en que dicha proteína es preferiblemente una proteína osteogénica y, en particular, un factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-I), un factor de crecimiento similar a insulina II (IGF-II), un factor de crecimiento transformante-\beta1 (TGF-\beta1), un factor de crecimiento transformante-\beta2 (TGF-\beta2), un factor de crecimiento transformante-\alpha (TGF-\alpha), una proteína morfogenética ósea (BMP), o bien osteogenina.

36. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 21, 24 y 26, en que la porosidad del material para implante después de su implantación in vivo es una macroporosidad.

37. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 20-36, en que el PDGF es un PDGF-BB.

38. Uso de acuerdo con la reivindicación 21 de un fosfato de calcio que tiene incorporado en él un líquido que se compone de un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, en que el fosfato de calcio se compone de unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros, y en que el fosfato de calcio se compone de beta-fosfato de tricalcio, para la producción de un material para implante destinado a favorecer el crecimiento de hueso, periodonto, ligamento o cartílago en un mamífero.

39. Un método de preparar un material para implante de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende saturar un material de fosfato de calcio poroso o un hueso desmineralizado en un líquido estéril que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en una concentración situada en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, en que el fosfato de calcio comprende beta-fosfato de tricalcio y el fosfato de calcio poroso comprende unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros.

40. El método de la reivindicación 39, en que el material para implante preparado se compone del material de fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él el líquido estéril que se compone de un PDGF en una concentración situada en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml en un tampón, en que el fosfato de calcio poroso se compone de unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros.

41. El método de la reivindicación 39 ó 40, en que la concentración de PDGF es de aproximadamente 0,3 mg/ml.

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42. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 39-41, en que dicho fosfato de calcio se selecciona entre fosfato de tricalcio, hidroxiapatito, hidroxiapatito pobremente cristalino, fosfato de calcio amorfo, metafosfato de calcio, fosfato de dicalcio dihidrato, fosfato de heptacalcio, pirofosfato de calcio dihidrato, pirofosfato de calcio y fosfato de octacalcio.

43. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 39-42, en que el fosfato de calcio es beta-fosfato de tricalcio.

44. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en que el material para implante preparado comprende un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él el líquido estéril que comprende un PDGF en una concentración en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml en un tampón, en que el fosfato de calcio poroso comprende unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros, y en que el fosfato de calcio comprende beta-fosfato de tricalcio.

45. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en que el material para implante preparado se compone de un fosfato de calcio poroso que tiene incorporado en él el líquido estéril que compone de un PDGF en una concentración situada en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml en un tampón, en que el fosfato de calcio poroso se compone de unas partículas con un tamaño situado en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 5.000 micrómetros, y en que el fosfato de calcio se compone de beta-fosfato de tricalcio.