ES3041762T3

ES3041762T3 - High concentration anti-amyloid beta peptide protofibril antibody formulations and methods of use thereof

Info

Publication number: ES3041762T3
Application number: ES21722538T
Authority: ES
Inventors: Nobuo Yoshida; Naomi Sakuramoto; Takahisa Sakaguchi; Hirokazu Kito; Takahiro Ozawa; Anjali Joshi; Yung Yueh Hsu; Pierre Souillac
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2021-03-19
Publication date: 2025-11-14
Anticipated expiration: 2041-03-19
Also published as: SI4121007T1; IL295383B1; IL295383A; KR20220156534A; EP4252777A9; WO2021186245A1; AU2021238951A1; CA3174778A1; FI4121007T3; EP4252777A3; LT4121007T; MX2022011101A; EP4252777A2; JP2023518066A; HRP20251087T1; DK4121007T3; MD4121007T2; EP4121007A1; HUE072937T2; CL2022002517A1

Abstract

Se proporcionan aquí formulaciones farmacéuticas acuosas que comprenden altas concentraciones de un anticuerpo anti-protofibrilla Aβ aislado o un fragmento del mismo que se une a protofibrillas Aβ humanas, como BAN2401, arginina, polisorbato 80 y un tampón farmacéuticamente aceptable. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones de anticuerpos anti-protofibrillas de péptido beta amiloide de alta concentración y métodos de uso de las mismas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud provisional de los EE. UU. N.° 62/992.746 presentada el 20 de marzo de 2020 y de la Solicitud provisional de los EE. UU. N.° 63/027.263 presentada el 19 de mayo de 2020.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo de etiología desconocida y la forma más común de demencia entre las personas mayores. En 2006, hubo 26,6 millones de casos de EA en el mundo (intervalo: 11,4-59,4 millones) (Brookmeyer, R.,e ta l., Forecasting the global burden of Alzheimer's Disease. Alzheimer Dement. 2007; 3:186-91), mientras que más de 5 millones de personas en los Estados Unidos supuestamente vivían con EA (2010 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimer Dement. 2010;6:158-94). Para el año 2050, se prevé que la prevalencia mundial de la EA aumente a 106,8 millones (intervalo: 47,2 - 221,2 millones), mientras que solo en los Estados Unidos se estima que la prevalencia sea de 11 a 16 millones. (Brookmeyer, anteriormente, y 2010 Alzheimer's disease facts and figures, anteriormente).

La enfermedad generalmente implica un deterioro global de la función cognitiva que avanza lentamente y deja a los sujetos en estadio terminal postrados en cama. Los sujetos con EA típicamente sobreviven solo de 3 a 10 años después del inicio de los síntomas, aunque se conocen extremos de 2 y 20 años. (Hebert, L.E.,et al.,Alzheimer disease in the U.S. population: prevalence estimates using the 2000 census. Arch Neurol. 2003; 60:1119-1122). La EA es la séptima causa principal de todas las muertes en los Estados Unidos y la quinta causa principal de muerte en estadounidenses mayores de 65 años, a pesar del hecho de que la mortalidad debida a la EA está muy subestimada porque los certificados de defunción rara vez atribuyen la causa de la muerte a la EA. (2010 Alzheimer's disease facts and figures, anteriormente).

Histológicamente, la enfermedad se caracteriza por placas neuríticas, que se encuentran principalmente en la corteza de asociación, el sistema límbico y los ganglios basales. El componente principal de estas placas es el péptido beta amiloide (Ap). Ap existe en diversos estados conformacionales: monómeros, oligómeros, protofibrillas y fibrillas insolubles. Se desconocen los detalles de la relación mecánica entre el inicio de la enfermedad de Alzheimer y la producción de Ap. Sin embargo, algunos anticuerpos anti Ap se encuentran actualmente en estudio clínico como posibles agentes terapéuticos para la enfermedad de Alzheimer.

Los anticuerpos anti Ap y otras proteínas pueden administrarse a sujetos por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular y otros medios. La posología y/o la forma farmacéutica de un anticuerpo pueden presentar muchos desafíos para el desarrollo de una formulación farmacéutica adecuada. Por ejemplo, a altas concentraciones de anticuerpos, la estabilidad del anticuerpo puede ser problemática debido a la formación de agregados o fragmentación entre proteínas. Generalmente, la agregación aumenta con el aumento de las concentraciones de anticuerpos. Además, las formulaciones de anticuerpos de alta concentración requieren altas concentraciones de estabilizadores y otros excipientes para lograr la estabilidad y semivida de la proteína a largo plazo. Las formulaciones de anticuerpos de alta concentración también suelen ser viscosas, lo que complica potencialmente la fabricación y la administración de la formulación farmacéutica.

En el presente documento se proporcionan formulaciones farmacéuticas que comprenden 80-300 mg/ml de un anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado o fragmento del mismo que se une a protofibrillas Ap, en donde el anticuerpo es BAN2401 (también conocido como lecanemab). Se ha encontrado que las formulaciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento son ventajosas. Por ejemplo, a pesar de las altas concentraciones del anticuerpo anti protofibrillas Ap (por ejemplo, 100 mg/ml o 200 mg/ml), la tasa de agregación proteína-proteína es inesperadamente baja y comparable a las tasas de agregación que se observan típicamente con concentraciones de anticuerpos mucho más bajas (por ejemplo, 10 mg/ml). En algunas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas desveladas actualmente presentan una tasa inicial de agregados más baja que las formulaciones que tienen concentraciones significativamente más bajas de anticuerpo anti protofibrillas Ap (por ejemplo, ~0,3 % del nivel inicial de agregados para 100 mg/ml de anticuerpo anti protofibrillas Ap frente al ~0,8 % del nivel inicial de agregados para 10 mg/ml de anticuerpo anti protofibrillas Ap). En algunas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas desveladas actualmente presentan una menor tasa de generación de partículas subvisibles que las formulaciones que tienen concentraciones significativamente más bajas del anticuerpo anti protofibrillas Ap (por ejemplo, 10,6 partículas/ml para 100 mg/ml de anticuerpo anti protofibrillas Ap frente a 12,6 partículas/ml para 10 mg/ml de anticuerpo anti protofibrillas Ap). En algunas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas desveladas actualmente presentan una tasa de agregación disminuida, un nivel de agregación inicial disminuido, una tasa de fragmentación de proteínas disminuida y/o una disminución en la formación de partículas subvisibles en comparación con formulaciones que tienen concentraciones significativamente más bajas del anticuerpo anti protofibrillas Ap. La tasa de agregación baja, el nivel de agregación inicial, la tasa de fragmentación de proteínas y/o la generación de partículas subvisibles pueden permitir una mayor estabilidad y/o una semivida más prolongada del producto. Además, los excipientes en las formulaciones farmacéuticas desveladas actualmente pueden estar presentes en cantidades más bajas que en los productos intravenosos comercializados actualmente. En algunas realizaciones, el pH y la osmolalidad de las formulaciones farmacéuticas desveladas actualmente son aceptables para la administración intravenosa después de la dilución en fluidos intravenosos.

La asignación de aminoácidos a cada dominio es, generalmente, de acuerdo con las definiciones de SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (Kabatet al., 5.a ed., Departamento de Salud y Servicios Sociales de los EE. UU., Publicación de los NIH N.° 91-3242. 1991, en adelante denominado "informe Kabat").

El anticuerpo anti protofibrillas Ap de acuerdo con la invención es BAN2401, también conocido como lecanemab. BAN2401 es una versión monoclonal de IgG1 humanizada de mAb158, que es un anticuerpo monoclonal murino generado para dirigirse a las protofibrillas y desvelado en el documento WO 2007/108756 y en Journal of Alzheimer's Disease 43: 575-588 (2015). BAN2401 es un anticuerpo anti protofibrillas Ap, que demuestra baja afinidad por monómero Ap mientras que se une con alta selectividad a especies de agregados de Ap solubles. Por ejemplo, se ha informado que BAN2401 demuestra una selectividad aproximadamente 1000 veces y de 5 a 10 veces mayor por las protofibrillas Ap solubles que por los monómeros Ap o las fibrillas insolubles en Ap, respectivamente.

BAN2401 comprende (i) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 y (ii) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Las secuencias de longitud completa de cadena pesada y cadena ligera de BAN2401 se exponen en las SEQ ID NO: 11 y 12 y se describen en el documento WO 2007/108756 y en Journal of Alzheimer's Disease 43:575-588 (2015).

Otros ejemplos no limitantes de anticuerpos para su uso como el al menos un anticuerpo anti protofibrillas Ap en la presente divulgación incluyen los desvelados en los documentos WO 2002/003911,<w>O 2005/123775, WO 2007/108756, WO 2011/001366, WO 2011/104696 y WO 2016/005466.

El documento WO 2020/023530 se refiere a métodos de tratamiento y prevención de la enfermedad de Alzheimer.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración que varía de 85 mg/ml a 275 mg/ml. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración que varía de 90 mg/ml a 250 mg/ml. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración que varía de 95 mg/ml a 225 mg/ml. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración que varía de 100 mg/ml a 200 mg/ml. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado está presente en una concentración de 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 110 mg/ml, 120 mg/ml, 130 mg/ml, 140 mg/ml, 150 mg/ml, 160 mg/ml, 170 mg/ml, 180 mg/ml, 190 mg/ml, 200 mg/ml, 210 mg/ml, 220 mg/ml, 230 mg/ml, 240 mg/ml, 250 mg/ml, 260 mg/ml, 270 mg/ml, 280 mg/ml, 290 mg/ml o 300 mg/ml. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado está presente en una concentración de 100 mg/ml. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado está presente en una concentración de 200 mg/ml. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado está presente en una concentración de 250 mg/ml. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado está presente en una concentración de 300 mg/ml. La formulación farmacéutica de la invención comprende un tampón farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el tampón es un tampón de citrato. En algunas realizaciones, el tampón es un tampón de histidina. En algunas realizaciones, el al menos un componente adicional en la formulación farmacéutica se elige entre emulsionantes. En algunas realizaciones, el al menos un componente adicional en la formulación farmacéutica se elige entre ácido cítrico (o ácido cítrico monohidrato), cloruro de sodio e histidina (y/o clorhidrato de histidina).

La concentración de arginina (y/o clorhidrato de arginina) en la formulación farmacéutica varía de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 400 mM. En algunas realizaciones, la concentración de arginina (y/o clorhidrato de arginina) en la formulación farmacéutica varía de aproximadamente 110 mM a aproximadamente 380 mM. En algunas realizaciones, la concentración de arginina (y/o clorhidrato de arginina) en la formulación farmacéutica varía de aproximadamente 120 mM a aproximadamente 360 mM. En algunas realizaciones, la concentración de arginina (y/o clorhidrato de arginina) en la formulación farmacéutica varía de aproximadamente 125 mM a aproximadamente 350 mM. En algunas realizaciones, la concentración de arginina (y/o clorhidrato de arginina) en la formulación farmacéutica es de 125 mM. En algunas realizaciones, la concentración de arginina (y/o clorhidrato de arginina) en la formulación farmacéutica es de 200 mM. En algunas realizaciones, la concentración de arginina (y/o clorhidrato de arginina) en la formulación farmacéutica es de 350 mM.

En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende histidina. En algunas realizaciones, la concentración de histidina en la formulación farmacéutica varía de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM. En algunas realizaciones, la concentración de histidina en la formulación farmacéutica varía de 10 mM a 100 mM, de 12 mM a 80 mM, de 14 mM a 60 mM, de 15 mM a 55 mM, de 15 mM a 35 mM o de 15 mM a 25 mM. En algunas realizaciones, la concentración de histidina es de 25 mM. En algunas realizaciones, la concentración de histidina es de 50 mM.

La concentración de polisorbato 80 en la formulación farmacéutica varía de aproximadamente el 0,01 al 0,1 % p/v, del 0,01 al 0,08 % p/v, del 0,02 al 0,08 % p/v, del 0,03 al 0,07 % p/v o del 0,04 al 0,06 % p/v. En algunas realizaciones, el polisorbato 80 está presente en la formulación farmacéutica en una concentración del 0,01 % p/v, 0,02 % p/v, 0,03 % p/v, 0,04 % p/v, 0,05 % p/v, 0,06 % p/v, 0,07 % p/v o del 0,08 % p/v. En algunas realizaciones, el polisorbato 80 está presente en la formulación farmacéutica en una concentración del 0,02 % p/v. En algunas realizaciones, el polisorbato 80 está presente en la formulación farmacéutica en una concentración del 0,05 % p/v.

En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende ácido cítrico monohidrato. En algunas realizaciones, la concentración de ácido cítrico monohidrato en la formulación farmacéutica varía de aproximadamente 10 mM a 100 mM. En algunas realizaciones, la concentración de ácido cítrico monohidrato en la formulación farmacéutica varía de 10 mM a 100 mM, de 10 mM a 90 mM, de 15 mM a 85 mM, de 20 mM a 80 mM, de 25 mM a 75 mM, de 30 mM a 70 mM, de 30 mM a 60 mM o de 30 mM a 50 mM. En algunas realizaciones, la concentración de ácido cítrico monohidrato en la formulación farmacéutica es de 50 mM.

La divulgación proporciona a formulación farmacéutica que tiene un pH en el intervalo de 4,5 a 5,5. En algunas realizaciones, el pH es 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1,5,2, 5,3, 5,4 o 5,5. En algunas realizaciones, el pH es 5,0. En algunas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas desveladas en el presente documento pueden estar en forma de una solución y/o cualquier otra formulación líquida adecuada que un experto en la materia considere apropiada. La vía de administración de las composiciones de la presente divulgación puede ser intravenosa o subcutánea. En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica se formula como un líquido apirógeno estéril para administración intravenosa. En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica se formula como un líquido apirógeno estéril para administración subcutánea. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es una solución salina.

En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende 100 mg/ml de BAN2401, ácido cítrico monohidrato 50 mM, arginina 110 mM. clorhidrato de arginina 240 mM y polisorbato 80 al 0,05 % (p/v), y tiene un pH de 5,0 ± 0,4. En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende 100 mg/ml o 200 mg/ml de BAN2401, 25 mM de histidina y clorhidrato de histidina, clorhidrato de arginina 200 mM y polisorbato 80 al 0,05 % (p/v), y tiene un pH de 5,0 ± 0,4.

En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende 200 mg/ml de BAN2401, histidina y clorhidrato de histidina 50 mM, clorhidrato de arginina 125 mM y polisorbato 80 al 0,02 % (p/v), y tiene un pH de 5,0 ± 0,4.

En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende 200 mg/ml de BAN2401, ácido cítrico 50 mM (y/o ácido cítrico monohidrato), arginina 125 mM (y/o clorhidrato de arginina) y polisorbato 80 al 0,02 % (p/v), y tiene un pH de 5,0 ± 0,4.

BAN2401 y los métodos que comprenden el uso de BAN2401 se desvelan en la Solicitud provisional de los EE. UU. N.262/749.614 y en la Solicitud internacional PCT N.2 PCT/US2019/043067.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa el porcentaje de agregación en formulaciones de BAN2401 a razón de 10 mg/ml, 100 mg/ml y 200 mg/ml en los puntos temporales 0, 1,2 y 3 meses a 5 °C.

La figura 2 representa el porcentaje de fragmentación en formulaciones de BAN2401 a razón de 10 mg/ml, 100 mg/ml y 200 mg/ml en los puntos temporales 0, 1,2 y 3 meses a 5 °C.

La figura 3 representa el porcentaje de monómeros en formulaciones de BAN2401 a razón de 10 mg/ml, 100 mg/ml y 200 mg/ml en los puntos temporales 0, 1,2 y 3 meses a 5 °C.

La figura 4 representa el porcentaje de agregación en formulaciones de BAN2401 a razón de 10 mg/ml, 100 mg/ml y 200 mg/ml en los puntos temporales 0, 1,2 y 3 meses a 25 °C.

La figura 5 representa el porcentaje de fragmentación en formulaciones de BAN2401 a razón de 10 mg/ml, 100 mg/ml y 200 mg/ml en los puntos temporales 0, 1,2 y 3 meses a 25 °C.

La figura 6 representa el porcentaje de monómeros en formulaciones de BAN2401 a razón de 10 mg/ml, 100 mg/ml y 200 mg/ml en los puntos temporales 0, 1,2 y 3 meses a 25 °C.

La figura 7 representa el porcentaje de agregación en formulaciones de BAN2401 a valores de pH de 4,5, 5.0, 5,5, 6,0 y 6,5 en los puntos temporales 0, 1,2 y 3 meses a 5 °C.

La figura 8 representa el porcentaje de fragmentación en formulaciones de BAN2401 a valores de pH de 4,5, 5.0, 5,5, 6,0 y 6,5 en los puntos temporales 0, 1,2 y 3 meses a 5 °C.

La figura 9 representa el porcentaje de monómeros en formulaciones de BAN2401 a valores de pH de 4,5, 5.0, 5,5, 6,0 y 6,5 en los puntos temporales 0, 1,2 y 3 meses a 5 °C.

La figura 10 representa el porcentaje de agregación en formulaciones de BAN240I a valores de pH de 4,5, 5.0, 5,5, 6,0 y 6,5 en los puntos temporales 0, 1,2 y 3 meses a 25 °C.

La figura 11 representa el porcentaje de fragmentación en formulaciones de BAN2401 a valores de pH de 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 y 6,5 en los puntos temporales 0, 1,2 y 3 meses a 25 °C.

La figura 12 representa el porcentaje de monómeros en formulaciones de BAN2401 a valores de pH de 4,5, 5.0, 5,5, 6,0 y 6,5 en los puntos temporales 0, 1,2 y 3 meses a 25 °C.

La figura 13 representa el porcentaje de agregación en formulaciones de BAN2401 a razón de 10 mg/ml, 100 mg/ml y 200 mg/ml en los puntos temporales 0, 1 y 2 meses a 25 °C.

La figura 14 representa el porcentaje de fragmentación en formulaciones de BAN2401 a razón de 10 mg/ml, 100 mg/ml y 200 mg/ml en los puntos temporales 0, 1 y 2 meses a 25 °C.

La figura 15 representa el porcentaje de monómeros en formulaciones de BAN2401 a razón de 10 mg/ml, 100 mg/ml y 200 mg/ml en los puntos temporales 0, 1 y 2 meses a 25 °C.

La figura 16 representa el porcentaje de agregación de monómeros en formulaciones de BAN2401 en función de la concentración de arginina.

La figura 17 representa un diagrama de flujo para el proceso de fabricación de una inyección de 10 mg/ml de BAN2401.

La figura 18 representa un diagrama de flujo para el proceso de fabricación de una inyección de 100 mg/ml de BAN2401.

La figura 19 representa los valores de pH de formulaciones de BAN2401 a valores de pH en los puntos temporales 0 y 12 meses a 5 °C.

La figura 20 representa los valores de pH de formulaciones de BAN2401 a valores de pH en los puntos temporales 0, 1 y 3 meses a 25 °C.

La figura 21 representa los valores de pH de formulaciones de BAN2401 a valores de pH después de un mes a 5 °C y con agitación a 25 °C.

La figura 22 representa la absorbancia a 405 nm de formulaciones de BAN2401 en los puntos temporales 0, 1,3, 6, 9 y 12 meses a 5 °C.

La figura 23 representa la absorbancia a 405 nm de formulaciones de BAN2401 en los puntos temporales 0, 1 y 3 meses a 25 °C.

La figura 24 representa la absorbancia a 405 nm de formulaciones de BAN2401 en un mes a 5 °C y con agitación a 25 °C.

La figura 25 representa el porcentaje de agregación en formulaciones de BAN2401 en los puntos temporales 0, 1,3, 6, 9 y 12 meses a 5 °C.

La figura 26 representa el porcentaje de fragmentación en formulaciones de BAN2401 en los puntos temporales 0, 1,3, 6, 9 y 12 meses a 5 °C.

La figura 27 representa el porcentaje de monómeros en formulaciones de BAN2401 en los puntos temporales 0, 1,3, 6, 9 y 12 meses a 5 °C.

La figura 28 representa el porcentaje de agregación en formulaciones de BAN2401 en los puntos temporales 0, 1 y 3 meses a 25 °C.

La figura 29 representa el porcentaje de fragmentación en formulaciones de BAN2401 en los puntos temporales 0, 1 y 3 meses a 25 °C.

La figura 30 representa el porcentaje de monómeros en formulaciones de BAN2401 en los puntos temporales 0, 1 y 3 meses a 25 °C.

La figura 31 representa el porcentaje de agregación en formulaciones de BAN2401 en un mes a 5 °C y con agitación a 25 °C.

La figura 32 representa el porcentaje de fragmentación en formulaciones de BAN2401 en un mes a 5 °C y con agitación a 25 °C.

La figura 33 representa el porcentaje de monómeros en formulaciones de BAN2401 en un mes a 5 °C y con agitación a 25 °C.

Definiciones

Las siguientes son definiciones de términos usados en la presente solicitud.

Como se usa en el presente documento, los términos en singular "un", "una", y "el/la" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Como se usa en el presente documento, la expresión "y/o" significa "uno o ambos" de los elementos así unidos, es decir, elementos que están presentes conjuntivamente en algunos casos y presentes disyuntivamente en otros casos. Por lo tanto, como ejemplo no limitante, "A y/o B", cuando se usa junto con un lenguaje abierto tal como "que comprende", puede referirse, en algunas realizaciones, a A solamente (opcionalmente incluyendo elementos distintos de B); en otras realizaciones, a B solamente (opcionalmente incluyendo elementos distintos de A); en aún otras realizaciones, tanto a A como a B (incluyendo opcionalmente otros elementos); etc.

Como se usa en el presente documento, "al menos uno/a" significa uno o más de los elementos en la lista de elementos, pero sin incluir necesariamente al menos uno de todos y cada uno de los elementos específicamente enumerados dentro de la lista de elementos y sin excluir ninguna combinación de elementos en la lista de elementos. Esta definición también permite que los elementos puedan estar presentes opcionalmente distintos de los elementos específicamente identificados dentro de la lista de elementos a los que se refiere la expresión "al menos uno/a", ya estén relacionados o no con los elementos identificados específicamente. Por lo tanto, como ejemplo no limitativo, "al menos uno de A y B" (o, de manera equivalente, "al menos uno de A o B", o, de manera equivalente, "al menos uno de A y/o B") puede referirse, en una realización, al menos a un, opcionalmente incluyendo más de un, A, sin B presente (y opcionalmente incluyendo elementos distintos de B); en otra realización, al menos a un, opcionalmente incluyendo más de un, B, sin A presente (y opcionalmente incluyendo elementos distintos de A); en aún otra realización, al menos a un, opcionalmente incluyendo más de un, A, y al menos a un, opcionalmente incluyendo más de un, B (y opcionalmente incluyendo otros elementos); etc.

Cuando se menciona un número, ya sea en solitario o como parte de un intervalo numérico, debe entenderse que el valor numérico puede variar por encima y por debajo del valor establecido en una varianza que sea razonable para el valor descrito, como se reconoce por un experto en la materia.

Como se usa en el presente documento, un "fragmento" de un anticuerpo comprende una parte del anticuerpo, por ejemplo, que comprende una región de unión a antígeno o región variable del mismo. Los ejemplos no limitantes de fragmentos incluyen fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales y moléculas de anticuerpos monocatenarios.

Como se usa en el presente documento, "fragmentación" o "formación de fragmentos" se refiere a la degradación de un anticuerpo o fragmento del mismo cuando está en una formulación o se añade a ella. Un fragmento generado por la fragmentación o la formación de fragmentos puede o no ser capaz de unirse al antígeno al que se une el anticuerpo o fragmento del mismo.

Como se usa en el presente documento, "tampón de histidina" puede comprender histidina, clorhidrato de histidina o una combinación de los mismos, en donde el clorhidrato de histidina puede ser clorhidrato de histidina monohidrato. Como se usa en el presente documento, "tampón de citrato" puede comprender ácido cítrico, sus sales o una combinación de los mismos, en donde el ácido cítrico puede ser ácido cítrico monohidrato o ácido cítrico anhidro.Realizaciones no limitantes de la divulgación:

Determinadas realizaciones de la presente divulgación se refieren a formulaciones farmacéuticas acuosas.

Concentración de anticuerpo

Para cualquiera de las formulaciones farmacéuticas acuosas descritas en el presente documento, el anticuerpo puede estar presente en las siguientes concentraciones.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración de 100 mg/ml.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración de 200 mg/ml.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración que varía de 80 mg/ml a 300 mg/ml. En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración que varía de 80 mg/ml a 240 mg/ml. En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración que varía de 100 mg/ml a 200 mg/ml.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración que varía de 80 mg/ml a 300 mg/ml, de 85 mg/ml a 275 mg/ml, de 90 mg/ml a 250 mg/ml, de 95 mg/ml a 225 mg/ml, de 100 a 200 mg/ml. En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración que varía de 90 mg/ml de 220 mg/ml, de 100 mg/ml a 210 mg/ml o de 110 mg/ml a 200 mg/ml.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración de 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 110 mg/ml, 120 mg/ml, 180 mg/ml, 190 mg/ml, 200 mg/ml, 210 mg/ml, 220 mg/ml, 230 mg/ml, 240 mg/ml, 250 mg/ml, 260 mg/ml, 270 mg/ml, 280 mg/ml, 290 mg/ml o 300 mg/ml. En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración de 100 mg/ml.

Arginina

Para cualquiera de las formulaciones farmacéuticas acuosas descritas en el presente documento, la formulación comprende arginina. La arginina es arginina, clorhidrato de arginina o una combinación de los mismos.

La concentración de arginina varía de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 400 mM.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, la concentración de arginina varía de 110 mM a 380 mM, de 120 mM a 360 mM, de 125 mM a 350 mM, de 100 mM a 200 mM, de 125 mM a 200 mM o de 150 mM a 200 mM. En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, la concentración de arginina varía de 150 mM a 250 mM, de 160 mM a 240 mM, de 170 mM a 230 mM, de 180 mM a 220 mM, de 190 mM a 210 mM de arginina, clorhidrato de arginina o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, la concentración de arginina es de 125 mM.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, la concentración de arginina es de 200 mM.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, la concentración de arginina varía de 200 mM a 400 mM, de 210 mM a 390 mM, de 220 mM a 380 mM, de 230 mM a 370 mM, de 240 mM a 360 mM, de 240 mM a 350 mM o de 250 mM a 350 mM.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, la concentración de arginina es de 350 mM.

Polisorbato 80 (PS80)

Para cualquiera de las formulaciones farmacéuticas acuosas descritas en el presente documento, la formulación comprende polisorbato 80 del 0,01 % p/v al 0,1 % p/v.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, la concentración de polisorbato 80 varía de aproximadamente el 0,01 % p/v al 0,08 % p/v, del 0,02 % p/v al 0,08 % p/v, del 0,03 % p/v al 0,07 % p/v o del 0,04 % p/v al 0,06 % p/v.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el polisorbato 80 está presente en una concentración del 0,01 % p/v, 0,02 % p/v, 0,03 % p/v, 0,04 % p/v, 0,05 % p/v, 0,06 % p/v, 0,07 % p/v o del 0,08 % p/v.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el polisorbato 80 está presente en una concentración del 0,02 % p/v.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el polisorbato 80 está presente en una concentración del 0,05 % p/v.

Tampón

Para cualquiera de las formulaciones farmacéuticas acuosas descritas en el presente documento, la formulación comprende un tampón farmacéuticamente aceptable como se indica a continuación.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el tampón farmacéuticamente aceptable es tampón de citrato.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el tampón de citrato está presente en una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, la concentración del tampón de citrato varía de 10 mM a 100 mM, de 10 mM a 90 mM, de 15 mM a 85 mM, de 20 mM a 80 mM, de 25 mM a 75 mM, de 30 mM a 70 mM, de 30 mM a 60 mM o de 30 mM a 50 mM.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el tampón de citrato está presente en una concentración de 50 mM.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el tampón farmacéuticamente aceptable es un tampón de histidina.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el tampón de histidina está presente en una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, la concentración del tampón de histidina varía de 10 mM a 100 mM, de 12 mM a 80 mM, de 14 mM a 60 mM o de 15 mM a 55 mM, de 15 mM a 35 mM o de 15 mM a 25 mM. En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el tampón de histidina está presente en una concentración de 25 mM.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el tampón de histidina está presente en una concentración de 50 mM.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el tampón de histidina comprende histidina y clorhidrato de histidina monohidrato. En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el tampón de histidina comprende histidina y clorhidrato de histidina monohidrato, en donde la histidina está en una concentración de aproximadamente 0,1 a 0,3 mg/ml, y el clorhidrato de histidina monohidrato está en una concentración de aproximadamente 4 a 6 mg/ml. En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el tampón de histidina comprende histidina y clorhidrato de histidina monohidrato, en donde la histidina está en una concentración de aproximadamente 0,26 mg/ml, y el clorhidrato de histidina monohidrato está en una concentración de aproximadamente 4,89 mg/ml. En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el tampón de histidina comprende histidina y clorhidrato de histidina monohidrato, en donde la histidina comprende 0,2-0,3 mg/ml de histidina y de 4,4 a 4,9 mg/ml de clorhidrato de histidina, opcionalmente, en donde el clorhidrato de histidina es monohidrato.

pH

Para cualquiera de las formulaciones farmacéuticas acuosas descritas en el presente documento, la formulación tiene un pH que varía de 4,5 a 5,5.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el pH es de 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1,5,2, 5,3, 5,4 o 5,5. En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, el pH es de 5,0.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, la formulación farmacéutica es adecuada para inyección intravenosa.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica, la formulación farmacéutica es adecuada para inyección subcutánea.

En algunas realizaciones de la formulación farmacéutica acuosa, la formulación farmacéutica comprende metionina. En algunas realizaciones, se desvela una formulación farmacéutica acuosa que comprende:

(a) de 80 mg/ml a 240 mg/ml de BAN2401,

(b) clorhidrato de arginina de 140 mM a 260 mM,

(c) polisorbato 80 del 0,01 % p/v al 0,1 % p/v, y

(d) tampón de histidina de 15 mM a 35 mM,

en donde la formulación farmacéutica tiene un pH que varía de 4,5 a 5,5.

En algunas realizaciones, en el presente documento se desvela una formulación farmacéutica acuosa que comprende:

(a) de 80 mg/ml a 120 mg/ml de BAN2401,

(b) arginina de 240 mM a 360 mM,

(c) polisorbato 80 del 0,03 % p/v al 0,08 % p/v, y

(d) tampón de citrato de 30 mM a 70 mM,

en donde la formulación farmacéutica tiene un pH que varía de 4,5 a 5,5, y en donde la arginina es arginina, clorhidrato de arginina o una combinación de los mismos.

(a) 100 mg/ml de BAN2401,

(b) clorhidrato de arginina 200 mM,

(c) polisorbato 80 al 0,05 % p/v, y

(d) tampón de histidina 25 mM,

en donde la formulación farmacéutica tiene un pH que varía de 4,5 a 5,5.

(a) 200 mg/ml de BAN2401,

(b) clorhidrato de arginina 200 mM,

(c) polisorbato 80 al 0,05 % p/v, y

(d) tampón de histidina 25 mM,

en donde la formulación farmacéutica tiene un pH que varía de 4,5 a 5,5.

(a) 100 mg/ml de BAN2401,

(b) arginina 350 mM,

(c) polisorbato 80 al 0,05 % p/v, y

(d) tampón de citrato 50 mM,

en donde la formulación farmacéutica tiene un pH que varía de 4,5 a 5,5, y en donde la arginina es arginina, clorhidrato de arginina o una combinación de los mismos,

(a) de 150 mg/ml a 250 mg/ml de BAN2401,

(b) clorhidrato de arginina de 100 mM a 150 mM,

(c) polisorbato 80 del 0,01 % p/v al 0,05 % p/v, y

tampón de histidina de 35 mM a 65 mM,

en donde la formulación farmacéutica tiene un pH que varía de 4,5 a 5,5.

En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica acuosa tiene un pH de 5,0.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Estudio de concentración de proteína

Se prepararon muestras con tres concentraciones de proteína (10, 100, 200 mg/ml) y se examinaron en el estudio de concentración. El material de 10 mg/ml era una sustancia farmacológica purificada (PDS, por sus siglas en inglés) de BAN2401 y los materiales de 100 y 200 mg/ml se produjeron a partir de PDS de BAN2401 usando filtros giratorios Amicon Ultra-15. Todas las muestras estaban en el mismo tampón de formulación (citrato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM, pH 5,7), excepto que cada una tenía un nivel de PS80 diferente. Los porcentajes de PS80 de las muestras de 10, 100 y 200 mg/ml fueron del 0,02 %, 0,16 % y 0,32 %, respectivamente. Todas las muestras se filtraron en 0,2 g y se dividieron en alícuotas en tubos de polipropileno (PP) estériles para la prueba de estabilidad. (Nota: El proceso de eliminación de PS80 no estaba disponible en el momento en que se realizó el estudio de concentración). La estabilidad de las muestras se evaluó a dos temperaturas (5 y 25 °C) durante 3 meses usando HPLC-SEC nativa, pH y DLS. Se realizaron ensayos de caracterización adicionales, tales como verificación de PS80, en las muestras de T = 0. Los detalles de las pruebas de muestra se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Programa de pruebas (Estudio de concentración)

Se midió el pH usando un medidor de pH con una microsonda. Antes de las mediciones, se realizó una calibración usando estándares de pH 4,0 y 7,0.

La agregación y la degradación física del BAN2401 concentrado se evaluaron realizando HPLC-SEC nativa en muestras de estabilidad almacenadas a 5 y 25 °C.

El análisis de HPLC-SEC (nativa) se realizó utilizando una columna TSK G3000 SWXL con fosfato de sodio 0,2 M, fase móvil de pH 7,0 a un caudal de 1,0 ml/min. Los volúmenes de inyección de muestra fueron 15, 1,5 o 0,8 pi, para concentraciones de proteína de 10, 100 o 200 mg/ml, respectivamente. Esto garantiza que se inyecten aproximadamente 150 pg de proteína en la columna durante todo el estudio. Los resultados de las áreas máximas relativas (%) para el monómero, el agregado y el fragmento se indican en las figuras 1-6.

A ambas temperaturas (5 y 25 °C) se observaron mayores porcentajes de agregado y tasas de agregación con mayores concentraciones de proteína. Para las muestras de 100 y 200 mg/ml, los porcentajes agregados de partida fueron casi el doble que los de la muestra de 10 mg/ml. Esto indicó que el proceso de concentración por sí solo provocó que la proteína se agregara. Se produjo una agregación adicional durante el almacenamiento a 5 y 25 °C. La tasa de agregación promedio durante 3 meses a 5 °C: fue del 0,17 % al mes para 100 mg/ml y del 0,20 % al mes para 200 mg/ml. A modo de comparación, la muestra de 10 mg/ml mostró solo una tasa de agregación del 0,07 % al mes en las mismas condiciones. En resumen, parecía que BAN2401 a razón de 100 mg/ml o más no era físicamente estable en la formulación.

La concentración de proteína se evaluó mediante UV midiendo la absorbancia a 280 y 320 mu en un espectrofotómetro Beckman DU-800. Las muestras se diluyeron 500 veces y se prepararon por duplicado. La concentración de proteína se calculó usando un coeficiente de extinción, £, de 1,32 usando la siguiente fórmula:

Concentración-" (A280-<á>320)/<e x>Dilución Factor

La concentración de proteína se midió usando un espectrofotómetro UV-Vis. Los resultados se enumeran en la Tabla 2. En general, las concentraciones permanecieron sin cambios a lo largo de los 3 meses a ambas temperaturas.

Tabla 2. Resultados de la concentración de proteína (estudio de concentración)

Ejemplo 2: Estudio de cribado de pH

La estabilidad de BAN2401 a 200 mg/ml se evaluó a cinco valores de pH diferentes. Para preparar las muestras, se concentró la PDS de BAN2401 eliminado con PS80 y se diafiltró en un tampón que contenía citrato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 4,5. El ajuste de concentración final se realizó mediante una dilución para lograr una concentración de 200 mg/ml de proteína y PS80 al 0,02 %. El material resultante se dividió en 5 alícuotas; cuatro de las alícuotas se titularon con hidróxido de sodio 10 N para producir muestras a diferentes pH (es decir, pH 5,0, 5,5, 6,0 y 6,5). Las muestras resultantes se filtraron en 0,2 pm y se subdividieron en alícuotas en tubos de polipropileno (PP) estériles para la evaluación de estabilidad.

La estabilidad de las muestras se evaluó a dos temperaturas (5 y 25 °C) usando HPLC-SEC nativa, pH y DLS durante 3 meses. Adicionalmente, se realizó un estudio de agitación en el punto temporal de I mes, donde un subconjunto de las muestras a 5 °C se agitó horizontalmente a 250 RPM durante 3 días en una incubadora a 25 °C. Los detalles de las pruebas de muestra se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Programa de pruebas (estudio de pH)

El análisis de SEC-HPLC se realizó utilizando una columna TSK G3000 SWXL con fosfato de sodio 0,2 M, fase móvil de pH 7,0 a un caudal de 1,0 ml/min. Los volúmenes de inyección de muestra fueron 15, 1,5 o 0,8 pl, para concentraciones de proteína de 10, 100 o 200 mg/ml, respectivamente. Esto garantiza que se inyecten aproximadamente 150 pg de proteína en la columna durante todo el estudio. Se indican los resultados de las áreas máximas relativas (%) para el monómero, el agregado y el fragmento.

La agregación y la degradación física del BAN2401 concentrado se evaluaron realizando HPLC-SEC nativa en muestras de estabilidad almacenadas a 5 y 25 °C. Los resultados se muestran en las figuras 7-12. BAN2401 pareció ser más estable a un pH más bajo en ambas temperaturas (5 y 25 °C). Las formulaciones con pH 4,5 y 5,0 comenzaron con porcentajes de agregados bajos y presentaron un aumento más lento de la formación de agregados, a una tasa del -0,07 % al mes a 5 °C. Además de la agregación, también se analizó la fragmentación de la proteína. Los resultados sugirieron que la fragmentación de BAN2401 fue más pronunciada en las formulaciones de BAN2401 a un pH más bajo. Basándose en estas consideraciones, las formulaciones de BAN2401 a pH 5,0 se consideraron las más estables (es decir, exhibieron menos agregación y/o degradación física de BAN2401 en relación con otras formulaciones a diferentes valores de pH).

Ejemplo 3: Estudio de cribado de excipientes

En este estudio se cribaron doce excipientes. Para preparar las muestras con BAN2401 a 200 mg/ml, se concentró BAN2401 eliminado con PS80 mediante una etapa de TFF, seguido de una etapa de diafiltración con el tampón base (citrato 50 mM, PS80 al 0,02 %, pH 6,0). El material concentrado se dividió en alícuotas en veinticuatro fracciones. Cada fracción se enriqueció con una solución madre que contenía un excipiente específico. Para la mayoría de los excipientes se examinaron dos concentraciones, excepto el cloruro de sodio y el ácido ascórbico para los que se prepararon muestras con tres y un nivel de concentración, respectivamente. En la Tabla 4 se muestra una lista de los excipientes usados y sus concentraciones.

Tabla 4. Lista de excipientes y concentraciones correspondientes

Todas las muestras, incluyendo el control (es decir, la muestra en el tampón base sin excipiente), se filtraron a 0,2 g y a continuación se cargaron en jeringas BD asépticamente usando una herramienta de taponamiento manual. Las muestras de control también se cargaron en viales de vidrio. Los viales y las jeringas BD se colocaron a 5 y 25 °C. La estabilidad de la muestra se evaluó durante 2 meses usando HPLC-SEC nativa y pH.

Las muestras del estudio de cribado de excipientes se prepararon en una condición de tampón subóptima (citrato 50 mM, PS80 al 0,02 %, pH 6,0) para amplificar los efectos positivos de los excipientes en la prevención de la formación de agregados. El perfil de estabilidad (agregación) de cada formulación durante 2 meses a 25 °C se evaluó mediante HPLC-SEC nativa.

Como se muestra en las figuras 13-15, la formulación que contenía arginina 160 mM (F14) produjo la tasa de agregación más baja entre las formulaciones. A modo de comparación, la formulación de arginina 160 mM presentó sólo el 1,4 % de agregados a 25 °C después de 2 meses mientras que el control (es decir, la formulación en el tampón base sin excipiente - F0) mostró el 2,4 % de agregados al mismo tiempo en las mismas condiciones.

Además, las formulaciones con arginina tenían los porcentajes de agregados de partida más bajos, lo que indica que la arginina era capaz de suprimir la formación de agregados durante la etapa de concentración de proteína. La fragmentación fue ligeramente mayor con la formulación de arginina (F14) en comparación con el control (F0). Sin embargo, la diferencia podría haber estado dentro de la variabilidad del ensayo.

El segundo mejor excipiente en este estudio fue la formulación con prolina 400 mM (F10), aunque su efecto en el control de la agregación no fue tan eficaz como el de la formulación de arginina (F14).

Las formulaciones con cloruro de sodio (F16-F18) no mostraron efecto sobre la estabilidad en comparación con la muestra de control. Se hizo la misma observación para las formulaciones con PS80 (F19 y F20): no se observó efecto en la estabilidad al variar el contenido de PS80. La formulación con ácido ascórbico (F15) mostró un efecto drástico al aumentar los porcentajes de agregados y fragmentos desde el inicio del estudio.

Se midió el pH de las dos formulaciones de arginina (F13 y F14) para verificar que la presencia de arginina en las formulaciones no había provocado que el pH se desviara con el tiempo. Como se muestra en la Tabla 4, no se observó cambio en el pH. También se midió la osmolalidad de las dos formulaciones. Las muestras se almacenaron a -20 °C antes de descongelarlas al mismo tiempo para las mediciones.

Tabla 5. pH y osmolalidad de las formulaciones de arginina (F13 y F14)

Ejemplo 4: Estudio de concentración de arginina

La relación entre la concentración de arginina y agregados en la formulación se estudió mediante Design Expert® 7.0. Los factores elegidos para el estudio y los niveles explorados para cada factor se muestran en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6. Factores investigados en el Ejemplo 4

Se generó una aleatorización de muestras mediante un diseño D-óptimo en Design Expert® 7.0. El conjunto de muestras obtenido contenía 25 puntos de datos que incluían 4 réplicas, como se muestra en la Tabla 7. Se preparó y se evaluó cada formulación.

Tabla 7. Formulaciones preparadas para el Ejemplo 4

La relación entre la concentración de arginina y los niveles de agregados en formulaciones de 100 mg/ml de BAN2401 a pH 5,0 que contenían polisorbato 80 al 0,02 % se estimó mediante Design Expert® 7.0. El resultado de la estimación se muestra en la figura 16.

Ejemplo 5: Estudio de PS80

Para evaluar los cambios en la calidad del producto farmacológico en condiciones de estrés, se realizaron estudios de agitación y congelación-descongelación usando un tampón de formulación (pH 5,0, arginina 350 mM, ácido cítrico 50 mM). En este experimento, se investigaron formulaciones con concentraciones variables de polisorbato 80 para confirmar el efecto del polisorbato 80 en la generación de partículas subvisibles en dichas condiciones de estrés. Las formulaciones investigadas y las condiciones de estrés aplicadas se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8. Formulaciones estudiadas para estudios de estrés por agitación y congelación-descongelación

Las muestras se prepararon de la misma manera que se describe en el Ejemplo 4. Se añadió una solución de PS80 al 10 % para alcanzar la concentración de PS80 diana en las formulaciones y el ajuste de la concentración de proteína final se realizó mediante dilución con el tampón de formulación. Las formulaciones se pasaron a través de filtros de 0,2 g y se cargaron en viales de 2 ml con un volumen de llenado de 1,3 ml. Las muestras se colocaron en un agitador orbital en orientación horizontal (vial tendido de lado) que a continuación se colocó en un refrigerador o en la mesa de laboratorio. Las muestras se agitaron a 250 rpm durante 3 días. Otras muestras se congelaron colocándolas en una cámara a -20 °C durante 2 horas, a continuación retirándolas y colocándolas a temperatura ambiente durante 2 horas para descongelarse. El ciclo de congelación-descongelación se repitió tres veces. Las muestras de los estudios de agitación y congelación-descongelación se evaluaron en cuanto a apariencia visual, niveles de agregados y fragmentos mediante SEC-HPLC, y partículas subvisibles mediante imágenes de microflujo (MFI, por sus siglas en inglés).

Los resultados de los estudios de agitación y congelación-descongelación en formulaciones de BAN2401 con niveles variables de PS80 se resumen a continuación.

Análisis de SEC-HPLC

El análisis de SEC-HPLC se realizó utilizando una columna TSK G3000 SWXL con fosfato de sodio 0,2 M, fase móvil de pH 7,0 a un caudal de 1,0 ml/min. Los volúmenes de inyección de muestra fueron 5,0 pl o 2,5 pl, para concentraciones de proteína de 50 o 100 mg/ml, respectivamente. Esto garantiza que se inyecten aproximadamente 250 pg de proteína en la columna durante todo el estudio. Se indican los resultados de las áreas máximas relativas (%) para el monómero, el agregado y el fragmento.

En el nivel de agregados en formulaciones de pH 5 almacenadas a 25 °C durante 3 meses con concentraciones variables de polisorbato 80, no hubo una diferencia significativa en los niveles de agregados cuando la concentración de PS80 se aumentó del 0 % al 0,06 %, en una formulación a pH de 5,0. Se concluye que PS80 no afecta a la formación de agregados, es decir, dímeros y trímeros, según lo medido por SEC-HPLC, durante el almacenamiento de las formulaciones de BAN2401 a 25 °C.

En el efecto de la concentración de polisorbato 80 sobre los niveles de fragmentos en formulaciones a pH 5, la concentración de polisorbato 80 no afecta a los niveles de fragmentos en BAN2401.

En la apariencia de las formulaciones después de la agitación a 250 rpm durante 3 días a temperatura ambiente, la muestra sin PS80 estaba turbia con la proteína precipitada, mientras que las otras muestras (polisorbato 80 al 0,02 %, 0,05 % y 0,1 %) eran soluciones libres de partículas visiblemente transparentes. Todas las muestras que se agitaron a 250 rpm durante 3 días a 5 °C eran transparentes y estaban libres de precipitados. Todas las muestras sometidas a ciclos de congelación/descongelación también estaban transparentes y libres de precipitado.

Los niveles de agregados y fragmentos en las formulaciones de BAN2401 sometidas a agitación y congelacióndescongelación se muestran en la Tabla 9. La condición de estrés que provocó la mayor inestabilidad fue la agitación en condiciones ambientales. En estas condiciones, la muestra sin PS80 mostró la mayor formación de especies de alto peso molecular y la mayor pérdida de monómero. Este efecto se anuló a medida que aumentaba la concentración de PS80.

Tabla 9. Resultados de los niveles de agregados y fragmentos para los estudios de agitación

y congelación-descongelación

(a) Especies de alto peso molecular; <b) Especies de bajo peso molecular; y (c) La muestra

estaba turbia

Análisis de partículas subvisibles

El análisis de partículas subvisibles se realizó usando imágenes de microflujo (microscopio de flujo DPA4100 y celda de flujo BP-4100-FC-400-UN). El volumen total de la muestra fue de 0,9 ml y los resultados se informaron para un intervalo de 2,25-100 gm, 5-100 gm, 10-100 gm y 25-100 gm.

Se redujo un aumento de partículas subvisibles (2 a 10 pm) en las muestras sin PS80 que se sometieron a concentración y congelación-descongelación. La generación de partículas subvisibles se suprimió cada vez más a medida que aumentaba la concentración de PS80 en la formulación. Este efecto se demostró en todos los intervalos de tamaño estudiados. No hubo cambios significativos en las partículas subvisibles en las formulaciones que contenían el 0,05 % y el 0,1 % de polisorbato 80. Por lo tanto, se eligió una concentración de PS80 del 0,05 % como óptima para la formulación.

Los datos sugieren que PS80 no tiene ningún efecto sobre la formación de agregados (dímeros y trímeros) y fragmentos de BAN2401 según lo medido por SEC-HPLC. Por lo tanto, la concentración de PS80 se seleccionó basándose en los resultados de los estudios de agitación y congelación-descongelación. Se eligió una concentración de PS80 del 0,05 % para evitar posibles caídas durante el envío y minimizar la formación de partículas subvisibles.

Ejemplo 6: Preparación de formulaciones intravenosas (IV) de BAN2401

A. Formulación de 10 mg/ml de BAN2401

Se fabricó una formulación de 10 mg/ml de BAN2401 para inyección intravenosa ("inyección de 10 mg/ml") mediante un proceso aséptico de cGMP convencional para la preparación de una formulación acuosa estéril. Se produjo una inyección de 10 mg/ml de BAN2401 a partir de la formulación de sustancia farmacológica de BAN2401 correspondiente a continuación sin adición de ningún excipiente ni dilución. En la Tabla 10 se muestra una formulación IV de ejemplo que contiene 10 mg/ml de BAN2401.

Tabla 10. Formulación IV de 10 mg/ml comparativa que comprende BAN2401

La solución de sustancia farmacológica de BAN2401 filtrada se cargó asépticamente en viales como se ilustra en la figura 17 (denominada en la figura 17 como "Formulación A"). La sustancia farmacológica combinada se sometió a una etapa de filtración para reducir la carga biológica a través de un filtro de 0,2 pm. La filtración estéril final se realizó a través de dos filtros de 0,2 pm en serie y se realizaron pruebas de integridad del filtro antes y después de la filtración. El producto farmacológico a granel estéril se cargó asépticamente en viales. Durante la operación de llenado, la precisión del llenado se confirmó midiendo el peso de llenado del vial. Los viales llenos se taparon y a continuación se sellaron con un sobresello de aluminio. Después de tapar a presión, el producto se almacenó a 5 ± 3 °C.

Los viales se analizaron usando el Método 1 (oscurecimiento de luz) según el estándar USP 788. Los resultados se muestran en las Tablas 11 y 12.

Tabla 11. Distribución tlel tamaño de partícula (partículas/recipiente) para viales de inyección de 10 mg/ml

Tabla 12. Distribución del tamaño de partícula (partículas/ml) para viales de inyección de 10 mg/ml

Ejemplo 7: Preparación de formulaciones intravenosas (IV) y subcutáneas (SC) de BAN2401

A. Formulaciones de 100 mg/ml de BAN2401

Se fabricó una formulación de 100 mg/ml de BAN2401 ("inyección de 100 mg/ml") mediante un proceso aséptico de cGMP convencional para la preparación de una formulación acuosa estéril. Se produjeron 100 mg/ml de BAN2401 a partir de las sustancias farmacológicas de BAN2401 correspondientes sin adición de ningún excipiente ni dilución (Tabla 13).

Tabla 13. Formulación IV de 100 mg/ml de ejemplo que comprende BAN2401,

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La solución de sustancia farmacológica de BAN2401 filtrada (inyección de 100 mg/ml) se cargó asépticamente en viales como se ilustra en la figura 18 (denominada en la figura 18 como "Formulación B"). La sustancia farmacológica se sometió a una etapa de filtración para reducir la carga biológica a través de un filtro de 0,2 pm. La filtración estéril final se realizó a través de dos filtros de 0,2 pm en serie y se realizaron pruebas de integridad del filtro antes y después de la filtración. El producto farmacológico a granel estéril se cargó asépticamente en viales. Durante la operación de llenado, la precisión del llenado se confirmó midiendo el peso de llenado del vial. Los viales llenos se taparon y a continuación se sellaron con un sobresello de aluminio. Después de tapar a presión, el producto se almacenó a 5 ± 3 °C.

Los viales se analizaron usando el Método 1 (oscurecimiento de luz) según el estándar USP 788. Los resultados se muestran en las Tablas 14 y 15.

Tabla 14. Distribución del tamaño de partícula (particulas/vial) para viales de invección de 100 mg/ml

Tabla 15. Distribución del tamaño de partícula (partículas/ml) para erales de inyección de 100 mg/ml

Se fabricó otra inyección de 100 mg/ml de BAN2401. Los siguientes materiales se pueden usar en una formulación SC de ejemplo que contiene 100 mg/ml de BAN2401, como se muestra en la Tabla 16.

Tabla 16. Otra formulación IV de 100 mg/ml de ejemplo que comprende BAN2401.

________________ ________________

B. Formulación de 200 mg/ml de BAN2401

Los siguientes materiales se pueden usar en una formulación SC de ejemplo que contiene 200 mg/ml de BAN2401, como se muestra en la Tabla 17. La estabilidad de BAN2401 en estas formulaciones (FSC1. FSC2 y FSC3) se evaluó junto con una evaluación de la estabilidad del material en tres cierres de recipientes:

i) Jeringa precargada (PFS, por sus siglas en inglés) de vidrio y tapón Becton-Dickenson Hypak Biotech

ii) PFS de plástico y tapón West Crystal Zenith

iii) Vial de vidrio de 5 ml y tapón West

Tabla 17. Formulaciones SC de 200 mg/inl de ejemplo que comprenden BAN2401

1 Concentración total como histidina

Se preparó BAN2401 a una concentración de proteína diana de 200 mg/ml mediante TFF como se resume a continuación. Se realizó una operación TFF separada para preparar material de BAN2401 en cada tampón de formulación, excepto para FSC1 a y FSC1 b. Para dos de las formulaciones, se realizó una operación TFF y el material concentrado resultante se dividió en dos semilotes. Una pequeña cantidad de material filtrado estéril en cada tampón de formulación final no se cargó en el tiempo cero, sino que se almacenó congelada a -20 °C para llenar los cierres de recipiente apropiados para la prueba con jeringa.

(a) Preparación de BAN2401

El proceso de concentración/diafiltración de proteína mediante TFF se puede subdividir en 3 etapas:

1. Concentración del material a 100-150 mg/ml

2. Diafiltración (5 veces) frente al tampón de formulación

3. Concentración a >200 mg/ml

La etapa de concentración/diafiltración se realizó usando un sistema Pall Centramate LV instalado con 0,02 m2 de área de membrana. El material de BAN2401 (extraído de la fabricación de lotes GMP antes de la adición de PS80) se cargó en el sistema TFF y se realizó una concentración de 10-15 veces (etapa 1). A continuación, el material se diafiltró frente a hasta 5 diavolúmenes del tampón de formulación (etapa 2), realizándose controles de pH y conductividad del permeado para controlar la diafiltración. Después de la diafiltración, el material se concentró aún más hasta la concentración de proteína diana de 210 a 250 mg/ml (etapa 3). Se recogió el retenido y se tomaron muestras para determinar la concentración de proteína.

En la preparación de esta formulación, no se alcanzó la concentración de proteína diana de 210 a 250 mg/ml debido a la alta presión en el sistema TFF. Por lo tanto, la concentración diana de proteína se consiguió usando unidades de filtro centrífugo Millipore (MWCO de 30.000). Para realizar esta etapa de concentración, las unidades de filtro se equilibraron con el tampón de formulación de BAN2401, seguido de la centrifugación del material BAN2401 a 3600 RPM (~3000xg) durante intervalos de 30 minutos a 20 °C, hasta que se esperaba que la concentración de proteína en el retenido fuera superior a 200 mg/ml. El retenido se recuperó de las unidades de filtro y se combinó. Después de mezclar a fondo, se tomaron muestras del retenido combinado para medir la concentración de proteína.

Después de concentrar la proteína, se tomó una muestra del grupo y se diluyó 500 veces con el tampón de formulación apropiado. La absorbancia de la muestra diluida a 280 nm y 320 nm se midió frente al blanco de tampón. El ajuste final de la concentración de proteína se realizó mediante dilución con el tampón de formulación apropiado. Por último, se añadió una solución al 10 % de PS80 al BAN2401 para lograr un PS80 al 0,02 % en la solución final, y la solución de proteína se mezcló a fondo mediante rotación de tipo noria.

El material final formulado con BAN2401 se filtró usando filtros de jeringa de 0,2 gm y posteriormente se cargó en viales o PFS. Esta etapa se realizó asépticamente en una cabina de bioseguridad. Los viales o PFS resultantes se colocaron en un congelador a -20 °C. Los viales se almacenaron invertidos y las PFS se almacenaron horizontalmente para simular las peores condiciones.

C.Experimentos de estabilidad en formulaciones SC de 200 mg/ml de ejemplo que comprenden BAN2401.

La estabilidad de la muestra se evaluó a 5 °C (3M, 6M, 9M, 12M) y a 25 °C (1M, 3M) usando un ensayo de pH (figuras 19-21), absorbancia a 405 nm (figuras 22-24) (para detectar aumentos en el amarillamiento), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (figuras 25-33), y a 5 °C posteriormente. Véase la Tabla 17 para consultar las formulaciones FSC1-FSC4 de ejemplo; obsérvese que en las Figuras 19-33, "F1a" se refiere a FSC1a, "F1b" se refiere a FSC1b, "F2" se refiere a FSC2 y "F3" se refiere a FSC3. Se realizaron ensayos de caracterización adicionales, incluida la concentración de proteína, calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés), PS80 y osmolalidad en muestras de t = 0. Se realizaron pruebas de partículas subvisibles en muestras de t = 0 y t = 6 meses. Se realizó un estudio de agitación de 3 días en muestras almacenadas durante 1 mes a 5 °C. Las muestras para el estudio de agitación se transfirieron del almacenamiento a 5 °C después de 1 mes a 25 °C con agitación durante 3 días a 250 rpm.

Los resultados de las pruebas mostraron que 200 mg/ml de BAN2401 en todas las formulaciones de FSC1a-FSC3 tenían niveles similares de agregados y fragmentos después del almacenamiento a 2-8 °C durante 12 meses. Se evaluó la estabilidad para BAN2401 a 200 mg/ml, en las tres formulaciones FSC1a-FSC3. En general, la estabilidad de BAN2401 en cada formulación ensayada pareció similar y se mantuvo en más del 98,2 % de monómero después del almacenamiento a 5 °C durante 12 meses, independientemente del cierre del recipiente ensayado. Además, después del almacenamiento a 5 °C durante 12 meses, el pH se mantuvo estable, no hubo un aumento apreciable del amarillamiento por A405.

(a) Concentración de proteína (Muestras de T=0)

La concentración de proteína se midió usando un espectrofotómetro UV-Vis. Los resultados se enumeran en la Tabla 18.

Tabla 18. Resultados de la concentración de proteína

La concentración de proteína se evaluó midiendo la absorbancia a 280 y 320 nm en un espectrofotómetro Beckman DU-800 utilizando una cubeta de cuarzo de 1 cm. Las muestras se diluyeron 500 veces y se prepararon por triplicado. La concentración de proteína se calculó usando un coeficiente de extinción, £, de 1,32 usando la siguiente fórmula:

Concentración:-- (A2S0-A320)/g x Dilución Factor

(b) Polisorbato 80 (Muestras de T=0)

El contenido de PS80 de las muestras se midió mediante la cuantificación de ácido oleico. Los resultados se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19. Resultados de polisorbato 80

La medición se realizó por cuantificación de ácido oleico, un producto de hidrólisis de PS80. Usando hidrólisis básica, PS80 libera ácido oleico a una relación molar de 1:1. A continuación, el ácido oleico se puede separar de otros productos y matrices de hidrólisis de PS80 mediante HPLC de fase inversa. El ácido oleico se controló sin derivatización usando la absorbancia a 195 nm. [J. Chromatography B, 878 (2010) 1865-1870]. Experimentalmente, las muestras se mezclaron con hidróxido de sodio para liberar ácido oleico, que posteriormente se extrajo con acetonitrilo. El extracto se diluyó con una solución de fosfato de potasio y se inyectó un volumen de muestra de 100 |ul en una columna Waters Symmetry C18. La separación se realizó mediante una elución isocrática que contenía un 80 % de fase orgánica A (acetonitrilo) y un 20 % de fase acuosa B (fosfato de potasio monobásico 20 mM, pH 2,8). La concentración de PS80 en la muestra se calculó a partir del área máxima usando una curva estándar.

(c) Osmolalidad (Muestras de T=0)

La osmolalidad de las muestras se determinó usando un osmómetro de punto de congelación. Los resultados se muestran en la Tabla 20.

Tabla 20. Resultados de osmolalidad

La osmolalidad se midió usando un osmómetro de punto de congelación Osmette III de Precision Systems. Las muestras se diluyeron 3 veces con WFI y se extrajeron volúmenes de muestra diluida de 10 |ul y se cargaron en el instrumento usando la pipeta del osmómetro. Las medidas de osmolalidad resultantes se corrigieron para la dilución de las muestras.

(d) Partículas subvisibles

El análisis de partículas subvisibles se realizó usando un instrumento FlowCarn de Fluid Technologies. Los resultados de T = O se enumeran en la Tabla 21. Parece haber un aumento en la concentración total de partículas y en el número de partículas mayores de 10 |um a lo largo del tiempo cuando el material se almacena a 5 °C. El grado de cambio de aumento fue pequeño, en el siguiente orden: FSC I a < FSC1b < FSC2 < FSC3.

Tabla 21. Resultados de partículas subvisibles

El análisis de partículas subvisibles se realizó usando una FlowCam de Fluid Imaging Technologies con un objetivo de 20x y una celda de flujo de 50 um. Antes de analizar muestras de BAN2401, la celda de flujo se lavó abundantemente con dI de H2O y se realizó una medición en dI H2O para garantizar que la celda de flujo estuviera limpia. Si el número total de panículas contadas por 0,2 ml de di H2O era §2, la celda de flujo se consideraba lista para usar. Las muestras se equilibraron a temperatura ambiente y a continuación se diluyeron 20 veces con agua desionizada. Las muestras diluidas por duplicado se analizaron usando un volumen de muestra de 0,2 ml y un caudal de muestra de 0,02 ml/min. La tasa de autoimagen fue de 14, lo que da una eficiencia del 19,6 % y un tiempo de análisis de 10 min. Las concentraciones de partículas resultantes se corrigieron para determinar la dilución de las muestras.

(e) pH

Se controló el pH de cada formulación durante todo el ensayo de estabilidad. Como se muestra en las figuras 19-21, no se observó ningún cambio aparente para las muestras en ninguna de las condiciones de almacenamiento ensayadas.

(f) HPLC-SEC

El análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento-cromatografía de exclusión por tamaño (HPLC-SEC) se realizó utilizando una columna TSK 03000 SWXL con fosfato de sodio 0,2 M, fase móvil a pH 7,0 a un caudal de 1,0 ml/min. El volumen de inyección de muestra fue de 0,8 gl para una concentración de proteína de 200 mg/ml. Esto garantiza que se inyecten aproximadamente 150 gg de proteína en la columna durante todo el estudio. Se indicaron los resultados de las áreas máximas relativas (%) para el monómero, el agregado y el fragmento, como se muestra en las figuras 25-33.

La degradación física del BAN2401 se evaluó realizando un análisis por HPLC-SEC en las muestras de estabilidad almacenadas a 5 y 25 °C. Después del almacenamiento a 5 °C durante 12 meses, el porcentaje de agregado fue similar para las 3 formulaciones, a razón de aproximadamente el 1,1 %. El fragmento porcentual generado para todas las formulaciones ensayadas estuvo en el intervalo del 0,4-0,5 %. El contenido de monómero después de 12 meses de almacenamiento a 5 °C estuvo en el intervalo del 98,4-98,6 % para todas las formulaciones y cierres de recipientes ensayados. Con las tasas actuales de degradación, es posible que BAN2401 en todas las formulaciones ensayadas pueda tener más del 97 % de monómero después de un almacenamiento de hasta 24 meses a 5 °C.

Después del almacenamiento a 25 °C hasta 3 meses, la generación de fragmentos después de 3 meses estuvo en el intervalo del 0,4-0,8 %. El contenido de monómero fue ligeramente superior al 98 % para todas las formulaciones, excepto FSC3, que tenía ligeramente menos del 98 % de monómero después de 3 meses a 25 °C.

Ejemplo 8: Selección de concentraciones de proteína, arginina y polisorbato 80

A. Preparación de las muestras

Cada formulación candidata (F1-F12) se preparó de la siguiente manera. El intermedio de proceso de la sustancia farmacológica (DS, por sus siglas en inglés) se concentró y se equilibró con los tampones de formulación correspondientes (Tabla 22) mediante unidades de filtro centrífugo. Después de la concentración y el equilibrio, se añadió PS80 disuelto en el tampón de formulación para lograr concentraciones predeterminadas y las concentraciones de proteína se ajustaron a la concentración final. Cada formulación candidata se cargó en viales con un volumen de llenado de 0,5 ml. Las formulaciones candidatas (F1-F12) se muestran en la Tabla 22. La formulación F0 se evaluó como control.

Tabla 22 Formulación (F0) y formulaciones candidatas F1-F12

a: F2 y FIO son las mismas formulaciones, preparadas para diferentes estudios,

b: En la selección de la concentración de polisorbato 80, la solución farmacológica se extrajo del

producto farmacológico y se llenó con 0,5 ml para alinear el volumen de llenado y el sistema de cierre

de recipiente.

B. Protocolo de estabilidad

Los protocolos de estabilidad se muestran en la Tabla 23, Tabla 24 y Tabla 25. Una vez retirados del almacenamiento, los viales se almacenaron a 5 °C hasta las pruebas. Las condiciones de almacenamiento fueron las siguientes:

• Condiciones a largo plazo: almacenados a 5 °C ± 3 °C en posición vertical

• Condiciones aceleradas: Almacenados a 25 °C±2 °C, 60 % de HR ± 5 % de HR en posición vertical • Condiciones de estrés (Congelación-descongelación): Congelados a -30 °C y descongelados a temperatura ambiente, en posición vertical

• Condiciones de estrés (Agitación): 5 °C, tumbados, en horizontal, a 250 rpm en un agitador alternativo con una amplitud de agitación de 50 mm

Tabla 23 Protocolo de Estabilidad (Condición acelerada y a largo plazo)

N/A: No aplicable.

Tabla 24 Protocolo de estabilidad (Condición estresada: F0-F7)

N/A: No aplicable,

Tabla 25 Protocolo de estabilidad (Condición estresada: FO, F8-F12)

N/A: No aplicable,

Dado que se sabe que la viscosidad de la solución aumenta exponencialmente en soluciones de proteína altamente concentradas, la concentración de proteína de cada formulación candidata (F1-F5) se ajustó a 200 ± 10 mg/ml con tampón de formulación que contenía PS80 al 0,05 % (p/v) para el análisis. Otras formulaciones no se diluyeron antes de la medición.

C. Resultados y análisis

(a) Selección de la concentración de arginina

Para seleccionar la concentración de arginina diana en la formulación, se evaluaron las propiedades físicas y se realizaron estudios de congelación-descongelación, estabilidad a largo plazo y acelerada para formulaciones candidatas con diferente concentración de arginina (de 150 a 350 mmol/l, F1 a F5) y se compararon con la formulación F0 (véase la Tabla 22). Las propiedades físicas y los resultados del estudio de congelación-descongelación se muestran en la Tabla 26. Los resultados del estudio de estabilidad a largo plazo y acelerada se muestran en la Tabla 27 y la Tabla 28.

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(b) Propiedades físicasComo se muestra en la Tabla 26, los valores de osmolalidad aumentaron a medida que aumentaba la concentración de arginina. F1, F2 y F3 mostraron valores de osmolalidad más bajos en comparación con F4 y F5. Por lo tanto, la concentración de arginina se limitó a 250 mmol/l o menos. Los valores de viscosidad de F1-F5 estuvieron dentro de un intervalo estrecho (7,3-8,1 mPa s (7,3-8,1 cP)) y no se correlacionaron con la concentración de arginina dentro de 150 a 350 mmol/l. Los resultados de apariencia, pH y concentración de PS80 y proteína estuvieron casi en el objetivo.

(c) Estudio de estabilidad en congelación-descongelación

No se observaron cambios significativos en ninguno de los elementos de prueba después de tres ciclos de prueba de congelación-descongelación como se muestra en la Tabla 26.

(d) Estudio de estabilidad a largo plazo

Como se muestra en la Tabla 27, no se observaron cambios significativos en ninguno de los elementos de prueba, excepto por HPLC de exclusión por tamaño (SEC) después de tres meses de almacenamiento. Las cantidades de agregado y fragmento por SEC aumentaron ligeramente en las formulaciones candidatas F1-F5. Cada tasa de aumento fue similar a la formulación F0.

(e) Estudio acelerado de estabilidad

Como se muestra en la Tabla 28, no se observaron cambios significativos en ninguno de los elementos de prueba excepto por SEC y HPLC de exclusión iónica (IEX). Aunque la cantidad de agregado por SEC aumentó en todos los candidatos (F1-F5, 200 mg/ml de BAN2401) y la tasa fue más rápida que en la formulación F0 como se esperaba, todos los candidatos se consideraron factibles considerando los resultados en condiciones a largo plazo y la estabilidad de F0 con una semivida larga. La mayor concentración de arginina dio como resultado una formación de agregados ligeramente más lenta, de acuerdo con los resultados descritos en el Ejemplo 4. La cantidad de fragmento por SEC también aumentó en todos los candidatos pero la tasa fue similar a la de la formulación F0. En cuanto a IEX, la cantidad de pico ácido aumentó en todos los candidatos pero la tasa fue similar a la de F0.

(f) Concentración de arginina

Como se muestra en la Tabla 26, F4 y F5 (a concentraciones de arginina de 300 y 350 mmol/l) no se consideraron factibles en vista de la osmolalidad. Entre los candidatos factibles F1, F2 y F3 (a concentraciones de arginina de 150, 200 y 250 mmol/l), F1 es el más cercano a la isotónica. Como se muestra en la Tabla 28, las formulaciones con concentraciones de arginina más altas mostraron una tasa de formación de agregados más baja en los estudios de estabilidad acelerada, pero la diferencia en la tasa no fue significativa en el intervalo de concentración de arginina evaluado. Tomando en consideración tanto la isotonicidad como la tasa de formación de agregados, se seleccionaron 200 mmol/l como la concentración de arginina diana basándose en la formulación F2.

(g) Selección de la concentración de proteína

Para seleccionar la concentración de proteína diana en la formulación, se evaluaron las propiedades físicas y se realizaron estudios de congelación-descongelación, estabilidad a largo plazo y acelerada para formulaciones candidatas con diferente concentración de proteína (200 a 300 mg/ml, F2, F6, F7) y la formulación F0. Las propiedades físicas y los resultados del estudio de congelación-descongelación se muestran en la Tabla 29. Los resultados de los estudios de estabilidad a largo plazo y acelerada se muestran en la Tabla 27 y la Tabla 28.

(h) Propiedades físicasComo se muestra en la Tabla 29, F2 y F6 mostraron valores de osmolalidad más bajos en comparación con F7. Los valores de viscosidad en F2, F6 y F7 fueron 7,8, 21 y 48 mPas (7,8, 21 y 48 cP), respectivamente. Una viscosidad alta superior a 20 mPa s (20 cP) provocaría dificultades en la fabricación de DS al aumentar la contrapresión de la bomba y disminuir el flujo transmembrana durante las etapas de ultrafiltración y diafiltración. Además, la solución de mayor concentración dificulta el proceso de llenado de DP al obstruir las agujas de llenado, lo que provoca una variación del peso de llenado. Dado que se informa que la viscosidad deseada no es superior a 20 mPas (20 cP)3, F2 era factible. Los resultados de apariencia, pH y concentración de PS80 y proteína estuvieron casi en el objetivo.(i) Estudio de congelación-descongelación

No se observaron cambios significativos en ninguno de los elementos ensayados después de tres ciclos de prueba de congelación-descongelación como se muestra en la Tabla 29.

(j) Estudio de estabilidad a largo plazo

Como se muestra en la Tabla 27, no se observaron cambios significativos distintos de la HPLC de exclusión por tamaño (SEC) después de tres meses de almacenamiento. La cantidad de agregado por SEC aumentó ligeramente en las formulaciones candidatas F2, F6 y F7, pero la tasa de aumento fue similar a la de F0.

(k) Estudio de estabilidad acelerada

Como se muestra en la Tabla 28, no se observaron cambios significativos distintos de la SEC y la HPLC de exclusión iónica (IEX). La cantidad de agregado por SEC aumentó en todos los candidatos (F2, F6 y F7) en tasas similares en el punto temporal de tres meses (0,7-0,8 % de aumento). Por lo tanto, todos los candidatos se consideraron factibles. La cantidad de fragmento por SEC también aumentó en todos los candidatos pero la tasa fue similar a la de F0. En cuanto a IEX, la cantidad de pico ácido por IEX aumentó en todos los candidatos pero la tasa fue similar a la de F0.

(l) Concentración de proteína

Teniendo en cuenta los resultados de osmolalidad y viscosidad que se muestran en la Tabla 29, y los resultados de estabilidad global que se muestran en la Tabla 27 y la Tabla 28, se seleccionó una concentración de proteína de 200 mg/ml.

(m) Selección de la concentración de PS80

Para seleccionar la concentración de PS80 diana en la formulación, se realizaron estudios de congelacióndescongelación y agitación para formulaciones candidatas con diferente concentración de PS80 [del 0 al 0,10 % (p/v), F8-F12] y la formulación F0. Los resultados del estudio de congelación-descongelación y agitación se muestran en la Tabla 30 y la Tabla 31, respectivamente.

(n) Estudio de congelación-descongelación

Como se muestra en la Tabla 30, no se observaron cambios significativos en ninguno de los elementos ensayados después de tres ciclos de prueba de congelación-descongelación. Los recuentos de partículas por MFI fueron relativamente altos en F8 (sin PS80).

(o) Estudio de agitación

Como se muestra en la Tabla 31, las formulaciones que contenían del 0,02 % (p/v) al 0,10 % (p/v) de PS80 (F9 a F12) eran estables después de la agitación. Se observaron cambios en F8 (sin PS80) en apariencia, concentración de proteína y cantidad de agregado por SEC después de la agitación. La apariencia cambió de líquido transparente ligeramente amarillo a líquido de color blanco opalescente. La concentración de proteína disminuyó ligeramente de 206 a 195 mg/ml. La cantidad de agregado aumentó del 1,1 % al 3,8 %. Por lo tanto, F8 (sin PS80) no se consideró factible.

(p) Concentración de PS80

Basándose en los resultados que se muestran en la Tabla 30 (estudio de congelación-descongelación) y la Tabla 31 (estudio de agitación), las formulaciones que contenían del 0,02 % (p/v) al 0,10 % (p/v) de PS80 fueron estables después de tres ciclos de congelación-descongelación y agitación hasta tres días. Por lo tanto, se seleccionó como objetivo una concentración de PS80 del 0,05 % (p/v).

(q) Conclusión

En conclusión, se seleccionó la siguiente formulación para la formulación de BAN2401 para estudios posteriores.Tabla32Formulación para estudios posteriores

Ejemplo 9: Estudio de estabilidad para formulaciones de 200 mg/ml de BAN2401 con pH diferente

Se realizó un estudio de estabilidad para ensayar la estabilidad de las formulaciones de BAN2401 a 200 mg/ml con diferentes pH. Además, se ensayó el impacto de la adición de metionina en la estabilidad del producto farmacológico (DP).

A. Preparación de las muestras

Cada formulación candidata (Tabla 33) se preparó de la siguiente manera. Las formulaciones se equilibraron con el tampón de formulación correspondiente mediante unidades de filtro centrífugo. Solo para la preparación de F20, se usó un tampón de formulación a un pH de 3,5 hasta que el pH de la solución filtrada llegó a 4,0, ya que los protones son repelidos por la proteína cargada concentrada cerca de la membrana semipermeable, lo que se conoce como efecto Donnan. Después de la concentración y el equilibrio, se añadió PS80 disuelto en el tampón de formulación para lograr la concentración predeterminada y a continuación se ajustó la concentración de proteína a la concentración final. Cada formulación candidata se cargó en viales con un volumen de llenado de 0,5 ml. La formulación F0 (véase la Tabla 33) se evaluó como control.

Tabla 33 Composición de la sustancia farmacológica y las formulaciones SC candidatos

Arg: Arginina, Met: Metionina

a: Para ajustar el pH, se combinaron arginina y clorhidrato de arginina para F0 y se añadió clorhidrato para

F13 a F22.

b: F21 es la misma formulación que F15

B. Protocolo de almacenamiento

Los protocolos de almacenamiento se muestran en la Tabla 34, Tabla 35 y Tabla 36. Una vez retirados del almacenamiento, los viales se almacenaron a 5 °C hasta que comenzaron las pruebas. Las condiciones de almacenamiento son las siguientes:

1000 lx: 25 °C ± 2 °C, 60 % de HR ± 5 % de HR, tumbados con exposición a la luz de 1000 lx Oscuridad: 25 °C ± 2 °C, 60 % de HR ± 5 % de HR, tumbados sin exposición a la luz cubriéndolos con papel de aluminio

Para confirmar el nivel de agregado después de un almacenamiento de tres meses o más, se evaluó adicionalmente la HPLC de exclusión por tamaño como muestras de almacenamiento prolongado a los nueve meses para el estudio de estabilidad a largo plazo y tres meses para la acelerada. Las últimas muestras se analizaron después de almacenarse en el frigorífico durante seis meses.

C. Resultados y análisis

Se evaluaron las propiedades físicas y se realizaron estudios a largo plazo y acelerados para formulaciones candidatas que incluían variación de pH (pH 4,0 a pH 6,0) y adición de metionina. También se realizaron estudios de congelacióndescongelación y fotoestabilidad para evaluar la eficiencia de la adición de metionina.

D. Variación de pH

Como se muestra en la Tabla 37, las Tablas 38A y 38B, la Tablas 39 y la Tabla 40, no se observaron diferencias significativas entre las formulaciones candidatas (F13, F15, F17 y F20 a F22) para ninguno de los elementos de prueba excepto por HPLC de exclusión por tamaño (SEC). La formulación F20 (es decir, una formulación con un pH inferior a 4,0) mostró una menor cantidad de agregados por SEC en el punto temporal inicial. Además, se observó una tasa ligeramente más baja de formación de agregados y una tasa más alta de formación de fragmentos en un estudio de estabilidad acelerada. Se confirmó que los resultados de las formulaciones con pH de 4,5 a 5,5 eran comparables.

E. Adición de metionina

43 Como se muestra en las Tablas 41A y 41B, y la Tabla 42 a la Tabla 46, no se observaron diferencias significativas entre las formulaciones con o sin metionina (F18 y F15). La formulación con metionina (F18) mostró una tasa de formación de agregados ligeramente más baja en un estudio de estabilidad a largo plazo extendida, un estudio de estabilidad acelerada y un estudio de fotoestabilidad. F18 también mostró una oxidación ligeramente menor del residuo de metionina (por ejemplo, en la posición 259 en las cadenas pesadas) con una exposición a la luz de 1000 lux durante un máximo de siete días. El estudio de congelación-descongelación no mostró ninguna diferencia. El efecto de 10 mmol/l de metionina como estabilizante fue limitado.

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F. ConclusiónLos atributos de calidad fueron comparables entre las formulaciones de BAN2401 con una variación de pH de pH 4,5 a pH 5,5. s a pH 4,0 mostró una menor tasa de formación de agregados y, por el contrario, una mayor tasa de formación de fragmentos durante el almacenamiento. No se observaron diferencias significativas entre las formulaciones con y sin metionina a una concentración de 10 mmol/l, basándose en las evaluaciones de calidad y los estudios de estabilidad, incluidos los estudios de estabilidad a largo plazo, acelerada, en congelación-descongelación y de fotoestabilidad. Aunque se observaron una tasa de formación de agregados ligeramente más lenta y una menor supresión en la oxidación del residuo de aminoácidos, las diferencias no fueron significativas. En conclusión, se determinó que F15 y F21, que estaban compuestas por 200 mg/ml de BAN2401, 25 mmol/l de L-histidina/clorhidrato de histidina, 200 mmol/l de L-arginina, 0,05 (p/v)% de polisorbato 80 a un pH de 5,0 ± 0,5, eran buenas sustancias farmacológicas candidatas para su desarrollo posterior.

Ejemplo 10: Investigación sobre el efecto de la concentración de arginina en la estabilidad de la formulación de BAN2401

Se evaluó el efecto de la concentración de arginina (0, 50, 100 y 200 mmol/l) sobre la estabilidad de BAN2401 a 200 mg/ml. Las muestras de cada nivel de concentración de arginina se almacenaron en condiciones aceleradas (25 °C/60 % de HR) y se analizaron a los 0, 1 y 2 meses.

A. Preparación de las muestras

Las muestras (F1-F4) se prepararon mediante intercambio de tampón del intermedio de proceso de sustancia farmacológica de BAN2401 concentrado mediante ultrafiltración. Después de la filtración aséptica, cada muestra de 0,4 ml se cargó en un vial. La información de las muestras se muestra en la Tabla 47.

Tabla 47 Información de las muestras

B. Resultados

Los resultados de este estudio de estabilidad para las muestras F1 a F4 se muestran en las Tablas 48 a 51. No hubo ninguna diferencia en el pH ni en la concentración de proteína entre las muestras y el nivel de concentración de arginina fue coherente con el objetivo para las muestras iniciales.

El % de agregados para muestras que contenían arginina (F2 a F4) fue menor que el de la muestra sin arginina (F1).

Tabla 48 Resultados de prueba de la muestra F1 (arginina 0 mmol/l objetivo)

Tabla 49 Resultados de prueba de la muestra F2 (arginina SO mmol/1 objetivo)

Tabla SO Resultados de prueba de la muestra F3 (arginina 100 mmol/1 objetivo)

Tabla 51 Resultados de prueba de la muestra F4 (arginina 200 mmol/1 objetivo)

C. Análisis y conclusión

Los resultados de este estudio indicaron que las concentraciones de arginina de 50 a 200 mmol/ previenen aumentos de agregados de proteína en la formulación de 200 mg/ml de BAN2401. La variación de la concentración de arginina entre lotes puede resultar en una variación en el % de agregado entre lotes. Además, la concentración de arginina puede afectar a la tendencia de aumento del % de agregados en el estudio de estabilidad.

La formulación que comprende tampón de histidina pareció mostrar un efecto en la reducción de la fragmentación de BAN2401 en comparación con el porcentaje de fragmentación en la muestra F1 con el porcentaje de fragmentación que se muestra en la Figura 11 en el Ejemplo 2, en el que se usaron las muestras que comprenden 200 mg/ml de BAN2401, citrato de sodio 50 mM y cloruro de sodio 100 mM.

Tabla 52. Secuencias de aminoácidos de regiones variables de mAb

Tabla 53. Secuencias de aminoácidos de regiones constantes de mAb

Tabla 54. Secuencias (le aminoácidos de CDR de mAb

Cadena pesada (SEQ ID NO: 11):

evqlvesggglvqpggsWscsasgftfssfgmhwvrqapgkgleíV'V'ayissgsstíyygdtvkgrftfsrdnaknsiflqinsslr aedtavyycateggyyygrsyytmdywgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepYtvswasgalts gvMfpaviqsí:giys]sí:vvtvpssslgiqíyícnvn.hkpsr!tkvdkn'epkscdkEhtcppcpapeilggpsvfifppkpkdtí itiisrtpevtcvwdvshedpev'kíiiwyvdgvevhnaktkpreeqyastyfvvsvH.vlhqdwlngkey'kckvsnkdpapíe ktisácakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennyktlpp'vldsdgsfflyskltvdksrwq qgnvfscsvniheaUinhytqksJslsp^k:

Cadena ligera (SEQ ID NO: 12):

dwmiqspísipvqjgapas^scrssqsivhsngatylwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtd'ftlrisrveaedv gi v ye fqg $ b vpptfgp gtkJei krívaapsvfífppsd^IksgtasYvclhíaiypfealcyqwkvdnalqsgnsqí^teqdsk dstysUstJtiskadyekhkvyacenhqglsspvá^fhrgec

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación farmacéutica acuosa que comprende:

(a) un anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado que se une a protofibrillas Ap humanas, a una concentración de 80 mg/ml a 300 mg/ml,

(b) arginina de 100 mM a 400 mM,

(c) polisorbato 80 del 0,01 % p/v al 0,1 % p/v, y

(d) un tampón farmacéuticamente aceptable,

en donde la formulación farmacéutica tiene un pH que varía de 4,5 a 5,5,

en donde el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado es lecanemab, y

en donde la arginina es arginina, clorhidrato de arginina o una combinación de los mismos.

2. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración de 100 mg/ml a 200 mg/ml.

3. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración de 100 mg/ml.

4. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado está presente en una concentración de 200 mg/ml.

5. La formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además metionina.

6. La formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el tampón farmacéuticamente aceptable es tampón de citrato o tampón de histidina.

7. La formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, que comprende tampón de citrato de 10 a 100 mM o tampón de histidina de 10 a 100 mM.

8. La formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende histidina de 125 a 350 mM.

9. La formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende arginina 200 mM, en donde la arginina es clorhidrato de arginina.

10. La formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, que comprende arginina 200 mM, en donde la arginina es clorhidrato de arginina, y tampón de histidina 25 mM.

11. La formulación farmacéutica acuosa de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

(a) de 80 mg/ml a 240 mg/ml del anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado,

(b) clorhidrato de arginina de 140 mM a 260 mM,

(c) polisorbato 80 del 0,02 % p/v al 0,08 % p/v, y

(d) tampón de histidina de 15 mM a 35 mM,

en donde la formulación farmacéutica tiene un pH que varía de 4,5 a 5,5.

12. La formulación farmacéutica acuosa de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

(a) de 80 mg/ml a 120 mg/ml del anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado,

(b) arginina de 240 mM a 360 mM,

(c) polisorbato 80 del 0,02 % p/v al 0,08 % p/v, y

(d) tampón de citrato de 30 mM a 50 mM,

en donde la formulación farmacéutica tiene un pH que varía de 4,5 a 5,5,

y en donde la arginina es arginina, clorhidrato de arginina o una combinación de los mismos.

13. La formulación farmacéutica acuosa de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

(a) 100 mg/ml o 200 mg/ml del anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado,

(b) arginina, clorhidrato de arginina, o una combinación de los mismos de 190 mM a 210 mM,

(c) polisorbato 80 del 0,04 % p/v al 0,06 % p/v, y

(d) tampón de histidina de 15 mM a 35 mM.

14. La formulación farmacéutica acuosa de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

(a) 100 mg/ml del anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado,

(b) clorhidrato de arginina 200 mM,

(c) polisorbato 80 al 0,05 % p/v, y

(d) tampón de histidina 25 mM.

15. La formulación farmacéutica acuosa de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

(a) 200 mg/ml del anticuerpo anti protofibrillas Ap aislado,

(b) clorhidrato de arginina 200 mM,

(c) polisorbato 80 al 0,05 % p/v, y

(d) tampón de histidina 25 mM.

16. La formulación farmacéutica acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde el tampón de histidina es una combinación de histidina y clorhidrato de histidina monohidrato.

17. La formulación farmacéutica acuosa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en donde la formulación farmacéutica tiene un pH de 5,0.