RS67249B1 - Formulacije antitela visoke koncentracije protiv protofibrila amiloid beta peptida i metode njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ova prijava polaže pravo na prioritet po američkoj privremenoj prijavi br.62/992,746 podnetoj 20. marta 2020. godine i američkoj privremenoj prijavi br.63/027,263 podnetoj 19. maja 2020. godine.

[0002] Alchajmerova bolest (AD) je progresivni, neurodegenerativni poremećaj nepoznate etiologije i najčešći oblik demencije kod starijih osoba. Godine 2006. bilo je 26,6 miliona slučajeva AD u svetu (raspon: 11,4-59,4 miliona) (Brookmeyer, R., et al., Forecasting the global burden of Alzheimer's Disease. Alzheimer Dement.2007; 3:186-91), dok je u Sjedinjenim Američkim Državama navodno živelo više od 5 miliona ljudi sa AD (2010 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimer Dement.2010;6:158-94). Predviđa se da će se do 2050. godine svetska prevalencija AD povećati na 106,8 miliona (raspon: (raspon: 47,2 - 221,2 miliona), dok se samo u Sjedinjenim Američkim Državama prevalencija procenjuje na 11 do 16 miliona. (Brookmeyer, supra, and 2010 Alzheimer's disease facts and figures, supra).

[0003] Bolest generalno uključuje globalno opadanje kognitivne funkcije koje sporo napreduje i ostavlja subjekte u završnoj fazi vezane za krevet. Subjekti sa AD obično preživljavaju samo 3 do 10 godina nakon početka simptoma, mada su poznati i ekstremi od 2 i 20 godina. (Hebert, L.E., etal., Alzheimer disease in the U.S. population: prevalence estimates using the 2000 census. Arch Neurol.2003; 60:1119-1122.) AD je sedmi vodeći uzrok svih smrti u Sjedinjenim Američkim Državama i peti vodeći uzrok smrti kod Amerikanaca starijih od 65 godina, uprkos činjenici da se mortalitet usled AD znatno potcenjuje jer se na umrlicama retko navodi AD kao uzrok smrti. (2010 Alzheimer's disease facts and figures, supra.)

[0004] Histološki, bolest se karakteriše neuritskim plakovima, koji se nalaze prvenstveno u asocijacionom korteksu, limbičkom sistemu i bazalnim ganglijama. Glavni sastojak ovih plakova je amiloid beta peptid (Aβ). Aβ postoji u različitim konformacionim stanjima monomerima, oligomerima, protofibrilima i nerastvorljivim fibrilima. Detalji mehanističke veze između početka Alchajmerove bolesti i proizvodnje Aβ su nepoznati. Međutim, neka anti-Aβ antitela se sada podvrgavaju kliničkom ispitivanju kao potencijalni terapijski efikasni agensi za Alchajmerovu bolest.

[0005] Anti-Aβ antitela i drugi proteini mogu se primenjivati kod subjekata putem intravenskih, subkutanih, intramuskularnih i drugih sredstava. Doziranje i/ili oblik doziranja antitela mogu predstavljati mnoge izazove za razvoj pogodne farmaceutske formulacije. Na primer, pri visokim koncentracijama antitela, stabilnost antitela može biti problematična zbog formiranja protein-protein agregata ili fragmentacije. Generalno, agregacija se povećava sa povećanjem koncentracije antitela. Štaviše, formulacije antitela visoke koncentracije zahtevaju visoke koncentracije stabilizatora i drugih pomoćnih supstanci da bi se postigla dugoročna stabilnost proteina i rok trajanja. Formulacije antitela visoke koncentracije su takođe često viskozne, što potencijalno komplikuje proizvodnju i primenu farmaceutske formulacije.

[0006] Ovde su obezbeđene farmaceutske formulacije koje obuhvataju 80-300 mg/ml izolovanog anti-Aβ protofibril antitela ili fragmenta istog koji se vezuje za Aβ protofibril, pri čemu je antitelo BAN2401 (takođe poznato kao lecanemab). Utvrđeno je da su ovde obezbeđene farmaceutske formulacije povoljne. Na primer, uprkos visokim koncentracijama anti-Aβ protofibril antitela (npr.100 mg/mL ili 200 mg/mL), stopa agregacije protein-protein je neočekivano niska i uporediva sa stopama agregacije koje se tipično vide sa mnogo nižim koncentracijama antitela (npr.10 mg/mL). U nekim otelotvorenjima, ovde obelodanjene farmaceutske formulacije pokazuju nižu početnu stopu agregata nego formulacije koje imaju značajno niže koncentracije anti-Aβ protofibril antitela (npr. ~0,3% početnog nivoa agregata za 100 mg/mL anti-Aβ protofibril antitela naspram ~0,8% početnog nivoa agregata za 10 mg/mL anti-Aβ protofibril antitela). U nekim otelotvorenjima, ovde obelodanjene farmaceutske formulacije pokazuju nižu stopu generisanja subvidljivih čestica nego formulacije koje imaju značajno niže koncentracije anti-Aβ protofibril antitela (npr.10,6 čestica/mL za 100 mg/mL anti-Aβ protofibril antitela naspram 12,6 čestica/mL za 10 mg/mL anti-Aβ protofibril antitela). U nekim otelotvorenjima, ovde obelodanjene farmaceutske formulacije pokazuju smanjenu stopu agregacije, smanjen početni nivo agregacije, smanjenu stopu fragmentacije proteina i/ili smanjenje formiranja subvidljivih čestica u poređenju sa formulacijama koje imaju značajno niže koncentracije anti-Aβ protofibril antitela. Niska stopa agregacije, početni nivo agregacije, stopa fragmentacije proteina i/ili generisanja subvidljivih čestica mogu omogućiti povećanu stabilnost i/ili duži rok trajanja proizvoda. Štaviše, pomoćne supstance u ovde obelodanjenim farmaceutskim formulacijama mogu biti prisutne u manjim količinama nego u trenutno plasiranim intravenskim proizvodima. U nekim otelotvorenjima, pH i osmolalnost ovde obelodanjenih farmaceutskih formulacija su prihvatljivi za intravensku primenu nakon razblaživanja u intravenskim tečnostima.

[0007] Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu je, generalno, u skladu sa definicijama SEKVENCE PROTEINA OD IMUNOLOŠKOG ZNAČAJA (Kabat et al., 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91- 3242.1991, u daljem tekstu „Kabatov izveštaj“).

[0008] Anti-Aβ protofibril antitelo prema pronalasku je BAN2401, takođe poznato kao lecanemab. BAN2401 je humanizovana IgG1 monoklonalna verzija mAb158, koja je mišje monoklonalno antitelo razvijeno da cilja protofibrile i obelodanjeno je u WO 2007/108756 i Journal of Alzheimer's Disease 43: 575-588 (2015). BAN2401 je anti-Aβ protofibril antitelo, pokazujući nizak afinitet za Aβ monomer dok se vezuje sa visokom selektivnošću za rastvorljive Aβ agregate. Na primer, prijavljeno je da BAN2401 pokazuje približno 1000 puta i 5 do 10 puta veću selektivnost za rastvorljive Aβ protofibrile nego za Aβ monomere ili Aβ-nerastvorljive fibrile, respektivno.

[0009] BAN2401 obuhvata (i) varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 i (ii) varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2. Sekvence pune dužine teškog lanca i lakog lanca BAN2401 su navedene u SEQ ID NO: 11 i 12 i opisane su u WO 2007/108756 i u Journal of Alzheimer's Disease 43:575-588 (2015).

[0010] Drugi neograničavajući primeri antitela za upotrebu kao najmanje jedno anti-Aβ protofibril antitelo u ovom otkriću uključuju ona obelodanjena u WO 2002/003911, WO 2005/123775, WO 2007/108756, WO 2011/001366, WO 2011/104696 i WO 2016/005466.

[0011] WO 2020/023530 se odnosi na metode lečenja i prevencije Alchajmerove bolesti.

[0012] U nekim otelotvorenjima, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji u rasponu od 85 mg/mL do 275 mg/mL. U nekim otelotvorenjima, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji u rasponu od 90 mg/mL do 250 mg/mL. U nekim otelotvorenjima, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji u rasponu od 95 mg/ml. do 225 mg/mL. U nekim otelotvorenjima, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji u rasponu od 100 mg/mL do 200 mg/mL. U nekim otelotvorenjima, izolovano antitelo je prisutno u koncentraciji od 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 200 mg/mL, 210 mg/mL, 220 mg/mL, 230 mg/mL, 240 mg/mL, 250 mg/mL, 260 mg/mL, 270 mg/mL, 280 mg/mL, 290 mg/mL, ili 300 mg/mL. U nekim otelotvorenjima, izolovano antitelo je prisutno u koncentraciji od 100 mg/mL. U nekim otelotvorenjima, izolovano antitelo je prisutno u koncentraciji od 200 mg/mL. U nekim otelotvorenjima, izolovano antitelo je prisutno u koncentraciji od 250 mg/mL. U nekim otelotvorenjima, izolovano antitelo je prisutno u koncentraciji od 300 mg/mL. Farmaceutska formulacija pronalaska obuhvata farmaceutski prihvatljiv pufer. U nekim otelotvorenjima, pufer je citratni pufer. U nekim otelotvorenjima, pufer je histidinski pufer. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna dodatna komponenta u farmaceutskoj formulaciji je izabrana iz emulgatora. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedna dodatna komponenta u farmaceutskoj formulaciji je izabrana iz limunske kiseline (ili limunske kiseline monohidrata), natrijum hlorida i histidina (i/ili histidin hidrohlorida).

[0013] Koncentracija arginina (i/ili arginin hidrohlorida) u farmaceutskoj formulaciji se kreće od oko 100 mM do oko 400 mM. U nekim otelotvorenjima, koncentracija arginina (i/ili arginin hidrohlorida) u farmaceutskoj formulaciji se kreće od oko 110 mM do oko 380 mM. U nekim otelotvorenjima, koncentracija arginina (i/ili arginin hidrohlorida) u farmaceutskoj formulaciji se kreće od oko 120 mM do oko 360 mM. U nekim otelotvorenjima, koncentracija arginina (i/ili arginin hidrohlorida) u farmaceutskoj formulaciji se kreće od oko 125 mM do oko 350 mM. U nekim otelotvorenjima, koncentracija arginina (i/ili arginin hidrohlorida) u farmaceutskoj formulaciji je 125 mM. U nekim otelotvorenjima, koncentracija arginina (i/ili arginin hidrohlorida) u farmaceutskoj formulaciji je 200 mM. U nekim otelotvorenjima, koncentracija arginina (i/ili arginin hidrohlorida) u farmaceutskoj formulaciji je 350 mM.

[0014] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija obuhvata histidin. U nekim otelotvorenjima, koncentracija histidina u farmaceutskoj formulaciji se kreće od oko 10 mM do oko 100 mM. U nekim otelotvorenjima, koncentracija histidina u farmaceutskoj formulaciji se kreće od 10 mM do 100 mM, 12 mM do 80 mM, 14 mM do 60 mM, 15 mM do 55 mM, 15 mM do 35 mM, ili 15 mM do 25 mM. U nekim otelotvorenjima, koncentracija histidina je 25 mM. U nekim otelotvorenjima, koncentracija histidina je 50 mM.

[0015] Koncentracija polisorbata 80 u farmaceutskoj formulaciji se kreće od oko 0,01 do 0.

1% w/v, 0,01 do 0,08% w/v, 0,02 do 0,08% w/v, 0,03 do 0,07% w/v ili 0,04 do 0,06% w/v. U nekim otelotvorenjima, polisorbat 80 je prisutan u farmaceutskoj formulaciji u koncentraciji od 0,01% w/v, 0,02% w/v, 0,03% w/v, 0,04% w/v, 0,05% w/v, 0,06% w/v, 0,07% w/v ili 0,08% w/v. U nekim otelotvorenjima, polisorbat 80 je prisutan u farmaceutskoj formulaciji u koncentraciji od 0,02% w/v. U nekim otelotvorenjima, polisorbat 80 je prisutan u farmaceutskoj formulaciji u koncentraciji od 0,05% w/v.

[0016] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija obuhvata monohidrat limunske kiseline. U nekim otelotvorenjima, koncentracija monohidrata limunske kiseline u farmaceutskoj formulaciji se kreće od oko 10 mM do 100 mM. U nekim otelotvorenjima, koncentracija monohidrata limunske kiseline u farmaceutskoj formulaciji se kreće od 10 mM do 100 mM, 10 mM do 90 mM, 15 mM do 85 mM, 20 mM do 80 mM, 25 mM do 75 mM, 30 mM do 70 mM, 30 mM do 60 mM, ili 30 mM do 50 mM. U nekim otelotvorenjima, koncentracija monohidrata limunske kiseline u farmaceutskoj formulaciji je 50 mM.

[0017] Otkriće pruža farmaceutsku formulaciju sa pH vrednošću u rasponu od 4,5 do 5,5. U nekim otelotvorenjima, pH je 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 ili 5,5. U nekim otelotvorenjima, pH je 5,0.

[0018] U nekim otelotvorenjima, ovde obelodanjene farmaceutske formulacije mogu biti u obliku rastvora i/ili bilo koje druge pogodne tečne formulacije koju stručnjak iz ove oblasti smatra prikladnom. Put primene kompozicija ovog otkrića može biti intravenski ili subkutani. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija je formulisana kao sterilna, nepirogena tečnost za intravensku primenu. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija je formulisana kao sterilna, nepirogena tečnost za subkutanu primenu. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je fiziološki rastvor.

[0019] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija obuhvata 100 mg/mL BAN2401, 50 mM monohidrata limunske kiseline, 110 mM arginina.240 mM arginin hidrohlorida, i 0,05% (w/v) polisorbata 80, i ima pH vrednost od 5,0 ± 0,4.

[0020] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija obuhvata 100 mg/mL ili 200 mg/mL BAN2401, 25 mM histidina i histidin hidrohlorida, 200 mM arginin hidrohlorida, i 0,05% (w/v) polisorbata 80, i ima pH vrednost od 5,0 ± 0,4.

[0021] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija obuhvata 200 mg/mL BAN2401, 50 mM histidina i histidin hidrohlorida, 125 mM arginin hidrohlorida, i 0,02% (w/v) polisorbata 80, i ima pH vrednost od 5,0 ± 0,4.

[0022] U nekim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija obuhvata 200 mg/mL BAN2401, 50 mM limunske kiseline (i/ili monohidrata limunske kiseline), 125 mM arginina (i/ili arginin hidrohlorida), i 0,02% (w/v) polisorbata 80, i ima pH vrednost od 5,0 ± 0,4.

[0023] BAN2401 i metode koje obuhvataju upotrebu BAN2401 su obelodanjene u američkoj privremenoj prijavi br.62/749,614 i PCT međunarodnoj prijavi br. PCT/US2019/043067. Kratak opis crteža

[0024]

SL. 1 prikazuje procenat agregacije u formulacijama BAN2401 na 10 mg/mL, 100 mg/mL i 200 mg/mL u vremenskim tačkama 0, 1, 2 i 3 meseca na 5 °C.

SL. 2 prikazuje procenat fragmentacije u formulacijama BAN2401 na 10 mg/mL, 100 mg/mL i 200 mg/mL u vremenskim tačkama 0, 1, 2 i 3 meseca na 5 °C.

SL. 3 prikazuje procenat monomera u formulacijama BAN2401 na 10 mg/mL, 100 mg/mL i 200 mg/mL u vremenskim tačkama 0, 1, 2 i 3 meseca na 5 °C.

SL. 4 prikazuje procenat agregacije u formulacijama BAN2401 na 10 mg/mL, 100 mg/mL i 200 mg/mL u vremenskim tačkama 0, 1, 2 i 3 meseca na 25 °C.

SL. 5 prikazuje procenat fragmentacije u formulacijama BAN2401 na 10 mg/mL, 100 mg/mL i 200 mg/mL u vremenskim tačkama 0, 1, 2 i 3 meseca na 25 °C.

SL. 6 prikazuje procenat monomera u formulacijama BAN2401 na 10 mg/mL, 100 mg/mL i 200 mg/mL u vremenskim tačkama 0, 1, 2 i 3 meseca na 25 °C.

SL. 7 prikazuje procenat agregacije u formulacijama BAN2401 pri pH vrednostima od 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 i 6,5 u vremenskim tačkama 0, 1, 2 i 3 meseca na 5 °C.

SL. 8 prikazuje procenat fragmentacije u formulacijama BAN2401 pri pH vrednostima od 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 i 6,5 u vremenskim tačkama 0, 1, 2 i 3 meseca na 5 °C.

SL. 9 prikazuje procenat monomera u formulacijama BAN2401 pri pH vrednostima od 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 i 6,5 u vremenskim tačkama 0, 1, 2 i 3 meseca na 5 °C.

SL. 10 prikazuje procenat agregacije u formulacijama BAN240I pri pH vrednostima od 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 i 6,5 u vremenskim tačkama 0, 1, 2 i 3 meseca na 25 °C.

SL. 11 prikazuje procenat fragmentacije u formulacijama BAN2401 pri pH vrednostima od 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 i 6,5 u vremenskim tačkama 0, 1, 2 i 3 meseca na 25 °C.

SL. 12 prikazuje procenat monomera u formulacijama BAN2401 pri pH vrednostima od 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 i 6,5 u vremenskim tačkama 0, 1, 2 i 3 meseca na 25 °C.

SL. 13 prikazuje procenat agregacije u formulacijama BAN2401 na 10 mg/mL, 100 mg/mL i 200 mg/mL u vremenskim tačkama 0, 1 i 2 meseca na 25 °C.

SL. 14 prikazuje procenat fragmentacije u formulacijama BAN2401 na 10 mg/mL, 100 mg/mL i 200 mg/mL u vremenskim tačkama 0, 1 i 2 meseca na 25 °C.

SL. 15 prikazuje procenat monomera u formulacijama BAN2401 na 10 mg/mL, 100 mg/mL i 200 mg/mL u vremenskim tačkama 0, 1 i 2 meseca na 25 °C.

SL. 16 prikazuje procenat agregacije monomera u formulacijama BAN2401 kao funkciju koncentracije arginina.

SL. 17 prikazuje dijagram toka za proces proizvodnje injekcije BAN2401 od 10 mg/mL.

SL. 18 prikazuje dijagram toka za proces proizvodnje injekcije BAN2401 od 100 mg/mL.

SL. 19 prikazuje pH vrednosti formulacija BAN2401 pri pH vrednostima u vremenskim tačkama 0 i 12 meseci na 5 °C.

SL. 20 prikazuje pH vrednosti formulacija BAN2401 pri pH vrednostima u vremenskim tačkama 0, 1 i 3 meseca na 25 °C.

SL. 21 prikazuje pH vrednosti formulacija BAN2401 pri pH vrednostima nakon jednog meseca na 5 °C i uz agitaciju na 25 °C.

SL. 22 prikazuje apsorbanciju na 405 nm formulacija BAN2401 u vremenskim tačkama 0, 1, 3, 6, 9 i 12 meseci na 5 °C.

SL. 23 prikazuje apsorbanciju na 405 nm formulacija BAN2401 u vremenskim tačkama 0, 1 i 3 meseca na 25 °C.

SL. 24 prikazuje apsorbanciju na 405 nm formulacija BAN2401 nakon jednog meseca na 5 °C i uz agitaciju na 25 °C.

SL. 25 prikazuje procenat agregacije u formulacijama BAN2401 u vremenskim tačkama 0, 1, 3, 6, 9 i 12 meseci na 5 °C.

SL. 26 prikazuje procenat fragmentacije u formulacijama BAN2401 u vremenskim tačkama 0, 1, 3, 6, 9 i 12 meseci na 5 °C.

SL. 27 prikazuje procenat monomera u formulacijama BAN2401 u vremenskim tačkama 0, 1, 3, 6, 9 i 12 meseci na 5 °C.

SL. 28 prikazuje procenat agregacije u formulacijama BAN2401 u vremenskim tačkama 0, 1 i 3 meseca na 25 °C.

SL. 29 prikazuje procenat fragmentacije u formulacijama BAN2401 u vremenskim tačkama 0, 1 i 3 meseca na 25 °C.

SL. 30 prikazuje procenat monomera u formulacijama BAN2401 u vremenskim tačkama 0, 1 i 3 meseca na 25 °C.

SL. 31 prikazuje procenat agregacije u formulacijama BAN2401 nakon jednog meseca na 5 °C i uz agitaciju na 25 °C.

SL. 32 prikazuje procenat fragmentacije u formulacijama BAN2401 nakon jednog meseca na 5 °C i uz agitaciju na 25 °C.

SL. 33 prikazuje procenat monomera u formulacijama BAN2401 nakon jednog meseca na 5 °C i uz agitaciju na 25 °C.

Definicije

[0025] Slede definicije termina korišćenih u ovoj prijavi.

[0026] Kako se ovde koriste, termini u jednini „jedan,“ „jedna“ i „jedno“ uključuju referencu u množini osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije.

[0027] Fraza „i/ili“, kako se ovde koristi, znači „jedan ili oba“ od povezanih elemenata, tj. elemente koji su u nekim slučajevima konjunktivno prisutni, a u drugim slučajevima disjunktivno prisutni. Stoga, kao neograničavajući primer, „A i/ili B“, kada se koristi zajedno sa otvorenim izrazima kao što je „obuhvata“, može se odnositi, u nekim otelotvorenjima, samo na A (opciono uključujući elemente osim B); u drugim otelotvorenjima, samo na B (opciono uključujući elemente osim A); u još drugim otelotvorenjima, i na A i na B (opciono uključujući druge elemente); itd.

[0028] Kako se ovde koristi, „najmanje jedan“ znači jedan ili više elemenata sa liste elemenata, ali ne nužno uključujući najmanje jedan od svakog i svih elemenata specifično navedenih u listi elemenata i ne isključujući bilo koje kombinacije elemenata u listi elemenata. Ova definicija takođe dozvoljava da elementi mogu opciono biti prisutni osim elemenata specifično identifikovanih u listi elemenata na koju se fraza „najmanje jedan“ odnosi, bilo da su povezani ili nepovezani sa tim elementima specifično identifikovanim. Stoga, kao neograničavajući primer, „najmanje jedan od A i B“ (ili, ekvivalentno, „najmanje jedan od A ili B,“ ili, ekvivalentno „najmanje jedan od A i/ili B“) može se odnositi, u jednom otelotvorenju, na najmanje jedan, opciono uključujući više od jednog, A, bez prisustva B (i opciono uključujući elemente osim B); u drugom otelotvorenju, na najmanje jedan, opciono uključujući više od jednog, B, bez prisustva A (i opciono uključujući elemente osim A); u još jednom otelotvorenju, na najmanje jedan, opciono uključujući više od jednog, A, i najmanje jedan, opciono uključujući više od jednog, B (i opciono uključujući druge elemente); itd.

[0029] Kada je naveden broj, bilo sam ili kao deo numeričkog opsega, treba razumeti da numerička vrednost može varirati iznad i ispod navedene vrednosti za varijaciju koja je razumna za opisanu vrednost, kako prepoznaje stručnjak u ovoj oblasti.

[0030] Kako se ovde koristi, „fragment“ antitela obuhvata deo antitela, na primer obuhvatajući region za vezivanje antigena ili varijabilni region istog. Neograničavajući primeri fragmenata uključuju Fab fragmente, Fab' fragmente, F(ab')2 fragmente, Fv fragmente, diabodije, linearna antitela i molekule antitela sa jednim lancem.

[0031] Kako se ovde koristi, „fragmentacija“ ili „formiranje fragmenta“ odnosi se na degradaciju antitela ili fragmenta istog kada je u formulaciji ili je dodato u formulaciju. Fragment generisan fragmentacijom ili formiranjem fragmenta može ili ne mora biti sposoban da se veže za antigen za koji se antitelo ili fragment istog vezuje.

[0032] Kako se ovde koristi, „histidinski pufer“ može obuhvatati histidin, histidin hidrohlorid, ili kombinaciju istih, pri čemu histidin hidrohlorid može biti histidin hidrohlorid monohidrat.

[0033] Kako se ovde koristi, „citratni pufer“ može obuhvatati limunsku kiselinu, njene soli, ili kombinaciju istih, pri čemu limunska kiselina može biti monohidrat limunske kiseline ili anhidrovana limunska kiselina.

Neograničavajuća otelotvorenja otkrića:

[0034] Određena otelotvorenja ovog otkrića odnose se na vodene farmaceutske formulacije.

Koncentracija antitela

[0035] Za bilo koju od ovde opisanih vodenih farmaceutskih formulacija, antitelo može biti prisutno u sledećim koncentracijama.

[0036] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji od 100 mg/ml.

[0037] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji od 200 mg/mL.

[0038] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji u rasponu od 80 mg/mL do 300 mg/mL. U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji u rasponu od 80 mg/mL do 240 mg/mL.

[0039] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji u rasponu od 100 mg/mL do 200 mg/mL.

[0040] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji u rasponu od 80 mg/mL do 300 mg/mL, 85 mg/mL do 275 mg/mL, 90 mg/mL do 250 mg/mL, 95 mg/mL do 225 mg/mL, 100 do 200 mg/mL. U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji u rasponu od 90 mg/mL do 220 mg/mL, 100 mg/mL do 210 mg/mL, ili 110 mg/mL do 200 mg/mL.

[0041] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji od 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 200 mg/mL, 210 mg/mL, 220 mg/mL, 230 mg/mL, 240 mg/mL, 250 mg/mL, 260 mg/mL, 270 mg/mL, 280 mg/mL, 290 mg/mL, ili 300 mg/mL.

[0042] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji od 100 mg/ml.

[0043] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, izolovano anti-Aβ protofibril antitelo je prisutno u koncentraciji od 200 mg/mL.

Arginin

[0044] Za bilo koju od ovde opisanih vodenih farmaceutskih formulacija, formulacija obuhvata arginin. Arginin je arginin, arginin hidrohlorid, ili kombinacija istih.

[0045] Koncentracija arginina se kreće od oko 100 mM do oko 400 mM.

[0046] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, koncentracija arginina se kreće od 110 mM do 380 mM, 120 mM do 360 mM, 125 mM do 350 mM, 100 mM do 200 mM, 125 mM do 200 mM ili 150 mM do 200 mM. U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, koncentracija arginina se kreće od 150 mM do 250 mM, 160 mM do 240 mM, 170 mM do 230 mM, 180 mM do 220 mM, 190 mM do 210 mM arginina, arginin hidrohlorida, ili kombinacije istih.

[0047] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, koncentracija arginina je 125 mM.

[0048] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, koncentracija arginina je 200 mM.

[0049] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, koncentracija arginina se kreće od 200 mM do 400 mM, 210 mM do 390 mM, 220 mM do 380 mM, 230 mM do 370 mM, 240 mM do 360 mM, 240 mM do 350 mM ili 250 mM do 350 mM.

[0050] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, koncentracija arginina je 350 mM.

Polisorbat 80 (PS80)

[0051] Za bilo koju od ovde opisanih vodenih farmaceutskih formulacija, formulacija obuhvata polisorbat 80 od 0,01% w/v do 0,1% w/v.

[0052] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, koncentracija polisorbata 80 se kreće od oko 0,01% w/v do 0,08% w/v, 0,02% w/v do 0,08% w/v, 0,03% w/v do 0,07% w/v, ili 0,04% w/v do 0,06% w/v.

[0053] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, polisorbat 80 je prisutan u koncentraciji od 0,01% w/v, 0,02% w/v, 0,03% w/v, 0,04% w/v, 0,05% w/v, 0,06% w/v, 0,07% w/v, ili 0,08% w/v.

[0054] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, polisorbat 80 je prisutan u koncentraciji od 0,02% w/v.

[0055] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, polisorbat 80 je prisutan u koncentraciji od 0,05% w/v.

Pufer

[0056] Za bilo koju od ovde opisanih vodenih farmaceutskih formulacija, formulacija obuhvata farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što sledi.

[0057] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, farmaceutski prihvatljiv pufer je citratni pufer.

[0058] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, citratni pufer je prisutan u koncentraciji od oko 10 mM do oko 100 mM.

[0059] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, koncentracija citratnog pufera se kreće od 10 mM do 100 mM, 10 mM do 90 mM, 15 mM do 85 mM, 20 mM do 80 mM, 25 mM do 75 mM, 30 mM do 70 mM, 30 mM do 60 mM, ili 30 mM do 50 mM.

[0060] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, citratni pufer je prisutan u koncentraciji od 50 mM.

[0061] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, farmaceutski prihvatljiv pufer je histidinski pufer.

[0062] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, histidinski pufer je prisutan u koncentraciji od oko 10 mM do oko 100 mM.

[0063] IU nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, koncentracija histidinskog pufera se kreće od 10 mM do 100 mM, 12 mM do 80 mM, 14 mM do 60 mM, ili 15 mM do 55 mM, 15 mM do 35 mM, ili 15 mM do 25 mM.

[0064] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, histidinski pufer je prisutan u koncentraciji od 25 mM.

[0065] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, histidinski pufer je prisutan u koncentraciji od 50 mM.

[0066] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, histidinski pufer obuhvata histidin i histidin hidrohlorid monohidrat. U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, histidinski pufer obuhvata histidin i histidin hidrohlorid monohidrat, pri čemu je histidin u koncentraciji od oko 0,1 do 0,3 mg/mL, a histidin hidrohlorid monohidrat je u koncentraciji od oko 4 do 6 mg/mL. U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, histidinski pufer obuhvata histidin i histidin hidrohlorid monohidrat, pri čemu je histidin u koncentraciji od oko 0,26 mg/mL, a histidin hidrohlorid monohidrat je u koncentraciji od oko 4,89 mg/mL. U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, histidinski pufer obuhvata histidin i histidin hidrohlorid monohidrat, pri čemu histidin obuhvata 0,2-0,3 mg/mL histidina i 4,4 do 4,9 mg/mL histidin hidrohlorida, opcionalno gde je histidin hidrohlorid monohidrat.

pH

[0067] Za bilo koju od ovde opisanih vodenih farmaceutskih formulacija, formulacija ima pH u rasponu od 4,5 do 5,5.

[0068] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, pH je 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 ili 5,5.

[0069] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, pH je 5,0.

[0070] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, farmaceutska formulacija je pogodna za intravensku injekciju.

[0071] U nekim otelotvorenjima farmaceutske formulacije, farmaceutska formulacija je pogodna za subkutanu injekciju.

[0072] U nekim otelotvorenjima vodene farmaceutske formulacije, farmaceutska formulacija obuhvata metionin.

[0073] U nekim otelotvorenjima, ovde je obelodanjena vodena farmaceutska formulacija koja obuhvata:

(a) 80 mg/mL do 240 mg/mL BAN2401,

(b) 140 mM do 260 mM arginin hidrohlorida,

(c) 0,01% w/v do 0,1% w/v polisorbata 80, i

(d) 15 mM do 35 mM histidinskog pufera,

pri čemu farmaceutska formulacija ima pH u rasponu od 4,5 do 5,5.

[0074] U nekim otelotvorenjima, ovde je obelodanjena vodena farmaceutska formulacija koja obuhvata:

(a) 80 mg/mL do 120 mg/mL BAN2401,

(b) 240 mM do 360 mM arginina,

(c) 0,03% w/v do 0,08% w/v polisorbata 80, i

(d) 30 mM do 70 mM citratnog pufera,

pri čemu farmaceutska formulacija ima pH u rasponu od 4,5 do 5,5, i pri čemu je arginin arginin, arginin hidrohlorid, ili kombinacija istih.

[0075] U nekim otelotvorenjima, ovde je obelodanjena vodena farmaceutska formulacija koja obuhvata:

(a) 100 mg/mL BAN2401,

(b) 200 mM arginin hidrohlorida,

(c) 0,05% w/v polisorbata 80, i

(d) 25 mM histidinskog pufera,

pri čemu farmaceutska formulacija ima pH u rasponu od 4,5 do 5,5.

[0076] U nekim otelotvorenjima, ovde je obelodanjena vodena farmaceutska formulacija koja obuhvata:

(a) 200 mg/mL BAN2401,

(b) 200 mM arginin hidrohlorida,

(c) 0,05% w/v polisorbata 80, i

(d) 25 mM histidinskog pufera,

pri čemu farmaceutska formulacija ima pH u rasponu od 4,5 do 5,5.

[0077] U nekim otelotvorenjima, ovde je obelodanjena vodena farmaceutska formulacija koja obuhvata:

(a) 100 mg/mL BAN2401,

(b) 350 mM arginina,

(c) 0,05% w/v polisorbata 80, i

(d) 50 mM citratnog pufera,

pri čemu farmaceutska formulacija ima pH u rasponu od 4,5 do 5,5, i pri čemu je arginin arginin, arginin hidrohlorid, ili kombinacija istih.

[0078] U nekim otelotvorenjima, ovde je obelodanjena vodena farmaceutska formulacija koja obuhvata:

(a) 150 mg/mL do 250 mg/mL BAN2401,

(b) 100 mM do 150 mM arginin hidrohlorida,

(c) 0,01% w/v do 0,05% w/v polisorbata 80, i

(d) 35 mM do 65 mM histidinskog pufera,

pri čemu farmaceutska formulacija ima pH u rasponu od 4,5 do 5,5.

[0079] U nekim otelotvorenjima, vodena farmaceutska formulacija ima pH 5,0.

PRIMERI

Primer 1: Studija koncentracije proteina

[0080] Uzorci sa tri koncentracije proteina (10, 100, 200 mg/mL) pripremljeni su i ispitani u studiji koncentracije. Materijal od 10 mg/mL bio je prečišćena supstanca leka BAN2401 (PDS), a materijali od 100 i 200 mg/mL proizvedeni su iz BAN2401 PDS korišćenjem Amicon Ultra-15 spin filtera. Svi uzorci su bili u istom puferu formulacije (25 mM natrijum citrata, 125 mM natrijum hlorida, pH 5,7), osim što je svaki imao različit nivo PS80.

Procentualni udeo PS80 u uzorcima od 10, 100, 200 mg/mL iznosio je 0,02%, 0,16% i 0,32%, respektivno. Svi uzorci su filtrirani na 0,2 µm i aliquotirani u sterilne polipropilenske (PP) epruvete za testiranje stabilnosti. (Napomena: Proces uklanjanja PS80 nije bio dostupan u vreme kada je sprovedena studija koncentracije.)

[0081] Stabilnost uzorka je procenjena na dve temperature (5 i 25 °C) tokom 3 meseca korišćenjem nativne HPLC-SEC, pH i DLS analize. Dodatni testovi karakterizacije, kao što je verifikacija PS80, obavljeni su na uzorcima sa T = 0. Detalji testiranja uzoraka prikazani su u tabeli 1.

Tabela 1. Raspored testiranja (studija koncentracije)

[0082] pH je meren pomoću pH metra sa mikrosondom. Pre merenja, izvršena je kalibracija korišćenjem standarda pH 4,0 i 7,0.

[0083] Agregacija i fizička degradacija koncentrovanog BAN2401 procenjene su obavljanjem nativne HPLC-SEC analize na uzorcima stabilnosti čuvanim na 5 i 25 °C.

[0084] HPLC-SEC (nativna) analiza je obavljena korišćenjem TSK G3000 SWXL kolone sa 0,2 M mobilnom fazom natrijum fosfata, pH 7,0, pri protoku od 1,0 mL/min. Volumeni injekcije uzorka bili su 15, 1,5, ili 0,8 µL, za koncentracije proteina od 10, 100, ili 200 mg/mL, respektivno. Ovo osigurava da se približno 150 µg proteina ubrizga na kolonu tokom studije. Rezultati relativnih površina pikova (%) za monomer, agregat i fragment prikazani su na slikama 1-6.

[0085] Na obe temperature (5 i 25 °C), veći procenti agregata i stope agregacije su primećeni sa povećanjem koncentracije proteina. Za uzorke od 100 i 200 mg/mL, početni procenti agregata bili su skoro dvostruko veći od onih za uzorak od 10 mg/mL. Ovo je ukazalo da je sam proces koncentracije uzrokovao agregaciju proteina. Dodatna agregacija se dogodila tokom skladištenja na 5 i 25 °C. Prosečna stopa agregacije tokom 3 meseca na 5 °C: iznosila je 0,17% mesečno za 100 mg/mL, i 0,20% mesečno za 200 mg/mL. Radi poređenja, uzorak od 10 mg/mL pokazao je samo 0,07% mesečne stope agregacije pod istim uslovima. Ukratko, činilo se da BAN2401 na 100 mg/mL ili više nije fizički stabilan u formulaciji.

[0086] Koncentracija proteina je procenjena UV merenjem apsorbancije na 280 i 320 µm na Beckman DU-800 spektrofotometru. Uzorci su razblaženi 500 puta i pripremljeni su u duplikatima. Koncentracija proteina je izračunata korišćenjem koeficijenta ekstinkcije, ε, od 1,32 koristeći sledeću formulu:

Koncentracija = (A280-A320)/ε x Faktor razblaživanja

[0087] Koncentracija proteina je merena korišćenjem UV-Vis spektrofotometra. Rezultati su navedeni u tabeli 2. Generalno, koncentracije su ostale nepromenjene tokom 3 meseca na obe temperature.

Tabela 2. Rezultati koncentracije proteina (studija koncentracije)

Primer 2: Studija skrininga pH vrednosti

[0088] Stabilnost BAN2401 na 200 mg/mL je procenjena na pet različitih pH vrednosti. Da bi se pripremili uzorci, PS80-uklonjeni BAN2401 PDS je koncentrovan i diafiltriran u pufer koji sadrži 50 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, pH 4,5. Konačno prilagođavanje koncentracije je obavljeno razblaživanjem kako bi se postigla koncentracija od 200 mg/mL proteina i 0,02% PS80. Dobijeni materijal je podeljen u 5 alikvota; četiri alikvota su titrirana sa 10 N natrijum hidroksidom da bi se dobili uzorci sa različitim pH vrednostima (tj. pH 5,0, 5,5, 6,0 i 6,5). Dobijeni uzorci su filtrirani na 0,2 µm i potom podeljeni u sterilne polipropilenske (PP) epruvete za evaluaciju stabilnosti.

[0089] Stabilnost uzoraka je procenjena na dve temperature (5 i 25 °C) korišćenjem nativne HPLC-SEC, pH i DLS analize tokom 3 meseca. Pored toga, studija agitacije je sprovedena u 1-mesečnoj vremenskoj tački, gde je podskup uzoraka od 5 °C agitovan horizontalno pri 250 o/min tokom 3 dana u inkubatoru na 25 °C. Detalji testiranja uzoraka prikazani su u tabeli 3.

Tabela 3. Raspored testiranja (studija pH vrednosti)

[0090] SEC-HPLC analiza je obavljena korišćenjem TSK G3000 SWXL kolone sa 0,2 M mobilnom fazom natrijum fosfata, pH 7,0, pri protoku od 1,0 mL/min. Volumeni injekcije uzorka bili su 15, 1,5, ili 0,8 µL za koncentracije proteina od 10, 100, ili 200 mg/mL, respektivno. Ovo osigurava da se približno 150 µg proteina ubrizga na kolonu tokom studije. Prijavljeni su rezultati relativnih površina pikova (%) za monomer, agregat i fragment.

[0091] Agregacija i fizička degradacija koncentrovanog BAN2401 procenjene su obavljanjem nativne HPLC-SEC analize na uzorcima stabilnosti čuvanim na 5 i 25 °C.

Rezultati su prikazani na slikama 7-12. BAN2401 se činio stabilnijim pri nižem pH na obe temperature (5 i 25 °C). Formulacije sa pH 4,5 i 5,0 počele su sa niskim procentima agregata i pokazale su sporiji porast formiranja agregata, po stopi od -0,07% mesečno na 5 °C. Pored agregacije, analizirana je i fragmentacija proteina. Rezultati su sugerisali da je fragmentacija BAN2401 bila izraženija u formulacijama BAN2401 pri nižem pH. Na osnovu ovih razmatranja, formulacije BAN2401 na pH 5,0 smatrane su najstabilnijim (tj. pokazale su manju agregaciju i/ili fizičku degradaciju BAN2401 u odnosu na druge formulacije pri različitim pH vrednostima).

Primer 3: Studija skrininga pomoćnih supstanci

[0092] Dvanaest pomoćnih supstanci je skriningovano u ovoj studiji. Da bi se pripremili uzorci sa BAN2401 na 200 mg/mL, PS80-uklonjeni BAN2401 je koncentrovan putem TFF koraka, nakon čega je usledio korak diafiltracije sa osnovnim puferom (50 mM citrata, 0,02% PS80, pH 6,0) Koncentrovani materijal je podeljen na dvadeset četiri frakcije. Svaka frakcija je tretirana osnovnim rastvorom koji sadrži specifičnu pomoćnu supstancu. Za većinu pomoćnih supstanci, ispitivane su dve koncentracije, osim natrijum hlorida i askorbinske kiseline za koje su pripremljeni uzorci sa tri i jednim nivoom koncentracije, respektivno. Lista korišćenih pomoćnih supstanci i njihovih koncentracija prikazana je u tabeli 4.

Tabela 4. Lista pomoćnih supstanci i odgovarajućih koncentracija

[0093] Svi uzorci, uključujući kontrolni (tj. uzorak u osnovnom puferu bez pomoćne supstance - F0), filtrirani su na 0,2 µm i zatim aseptično punjeni u BD špriceve pomoću ručnog alata za zatvaranje. Kontrolni uzorci su takođe punjeni u staklene ampule. Ampule i BD špricevi su postavljeni na 5 i 25 °C. Stabilnost uzorka je procenjena tokom 2 meseca korišćenjem nativne HPLC-SEC i pH analize.

[0094] Uzorci studije skrininga pomoćnih supstanci su pripremljeni u suboptimalnom puferu (50 mM citrata, 0,02% PS80, pH 6,0) kako bi se pojačali pozitivni efekti pomoćnih supstanci u sprečavanju formiranja agregata. Profil stabilnosti (agregacija) svake formulacije tokom 2 meseca na 25 °C je procenjen obavljanjem nativne HPLC-SEC analize.

[0095] Kao što je prikazano na slikama 13-15, formulacija koja sadrži 160 mM arginina (F14) je proizvela najnižu stopu agregacije među formulacijama. Kao poređenje, formulacija sa 160 mM arginina pokazala je samo 1,4% agregata na 25 °C nakon 2 meseca, dok je kontrola (tj. formulacija u osnovnom puferu bez pomoćne supstance - F0) pokazala 2,4% agregata u isto vreme pod istim uslovima.

[0096] Pored toga, formulacije sa argininom su imale najniže početne procente agregata, što ukazuje da je arginin bio sposoban da suzbije formiranje agregata tokom koraka koncentracije proteina. Fragmentacija je bila nešto viša kod formulacije sa argininom (F14) u poređenju sa kontrolom (F0). Međutim, razlika je mogla biti unutar varijabilnosti testa.

[0097] Druga najbolja pomoćna supstanca u ovoj studiji bila je formulacija sa 400 mM prolina (F10), iako njen efekat u kontrolisanju agregacije nije bio efikasan kao kod formulacije sa argininom (F14).

[0098] Formulacije sa natrijum hloridom (F16-F18) nisu pokazale nikakav efekat na stabilnost u poređenju sa kontrolnim uzorkom. Isto zapažanje je napravljeno i za formulacije sa PS80 (F19 i F20): nije primećen efekat stabilnosti variranjem sadržaja PS80. Formulacija sa askorbinskom kiselinom (F15) je pokazala dramatičan efekat na povećanje procenta agregata i fragmenta od početka studije.

[0099] pH dve formulacije sa argininom (F13 i F14) je izmeren da bi se proverilo da prisustvo arginina u formulacijama nije uzrokovalo pomeranje pH vrednosti tokom vremena. Kao što je prikazano u tabeli 4, nije primećena promena pH vrednosti. Izmerena je i osmolalnost dve formulacije. Uzorci su čuvani na -20 °C pre nego što su istovremeno otopljeni za merenja.

Tabela 5. pH i osmolalnost formulacija arginina (F13 i F14)

Primer 4: Studija koncentracije arginina

[0100] Odnos između koncentracije arginina i agregata u formulaciji je proučavan pomoću Design Expert<®>7.0. Faktori izabrani za studiju i nivoi istraženi za svaki faktor prikazani su u tabeli 6 ispod.

Tabela 6. Faktori istraženi u primeru 4

[0101] Randomizacija uzoraka je generisana pomoću D-optimalnog dizajna u Design Expert<®>7.0. Dobijeni skup uzoraka je sadržao 25 tačaka podataka, uključujući 4 replike, kao što je prikazano u tabeli 7. Svaka formulacija je pripremljena i evaluirana.

Tabela 7. Formulacije pripremljene za primer 4

[0102] Odnos između koncentracije arginina i nivoa agregata u formulacijama BAN2401 od 100 mg/mL pri pH 5,0 koje sadrže 0,02% polisorbata 80, procenjen je pomoću Design Expert<®>7.0. Rezultat procene je prikazan na slici 16.

Primer 5: Studija PS80

[0103] Da bi se procenile promene u kvalitetu proizvoda leka pod stresnim uslovima, sprovedene su studije stresa izazvanog agitacijom i zamrzavanjem-otapanjem korišćenjem pufera formulacije (pH 5,0, 350 mM arginina, 50 mM limunske kiseline). U ovom eksperimentu, istraživane su formulacije sa različitim koncentracijama polisorbata 80 kako bi se potvrdio efekat polisorbata 80 na generisanje subvidljivih čestica pod takvim stresnim uslovima. Istraživane formulacije i primenjeni stresni uslovi prikazani su u tabeli 8.

Tabela 8. Formulacije proučavane za studije stresa izazvanog agitacijom i zamrzavanjem-otapanjem

[0104] Uzorci su pripremljeni na isti način kao što je opisano u primeru 4. Dodat je 10% rastvor PS80 da bi se postigla ciljna koncentracija PS80 u formulacijama, a konačno prilagođavanje koncentracije proteina je obavljeno razblaživanjem sa puferom formulacije. Formulacije su propuštene kroz 0,2 µm filtere i punjene u 2 mL bočice sa zapreminom punjenja od 1,3 mL. Uzorci su postavljeni na orbitalni šejker u horizontalnoj orijentaciji (bočica leži sa strane) koji je zatim postavljen u frižider ili na radni sto u laboratoriji. Uzorci su mešani pri 250 o/min tokom 3 dana. Drugi uzorci su zamrznuti postavljanjem u komoru na -20°C tokom 2 sata, zatim su uklonjeni i ostavljeni na sobnoj temperaturi 2 sata da se otope. Ciklus zamrzavanja-otapanja je ponovljen tri puta. Uzorci iz studija agitacije i ciklusa zamrzavanja-otapanja su procenjeni na vizuelni izgled, nivoe agregata i fragmenta pomoću SEC-HPLC analize, i subvidljive čestice pomoću Micro Flow Imaging (MFI).

[0105] Rezultati studija agitacije i ciklusa zamrzavanja-otapanja na BAN2401 formulacijama sa različitim nivoima PS80 sumirani su u nastavku.

SEC-HPLC analiza

[0106] SEC-HPLC analiza je obavljena korišćenjem TSK G3000 SWXL kolone sa 0,2 M mobilnom fazom natrijum fosfata, pH 7,0, pri protoku od 1,0 mL/min. Volumeni injekcije uzorka bili su 5,0 µL ili 2,5 µL za koncentracije proteina od 50 ili 100 mg/mL, respektivno. Ovo osigurava da se približno 250 µg proteina ubrizga na kolonu tokom studije. Prijavljeni su rezultati relativnih površina pikova (%) za monomer, agregat i fragment.

[0107] U pogledu nivoa agregata u formulacijama pH 5, čuvanim na 25 °C tokom 3 meseca sa različitim koncentracijama polisorbata 80, nije bilo značajne razlike u nivoima agregata kada je koncentracija PS80 povećana sa 0% na 0,06%, pri pH 5,0 formulacije. Zaključeno je da PS80 ne utiče na formiranje agregata, tj. dimera i trimera, mereno SEC-HPLC analizom, tokom skladištenja formulacija BAN2401 na 25 °C.

[0108] U pogledu efekta koncentracije polisorbata 80 na nivoe fragmenta u formulacijama na pH 5, koncentracija polisorbata 80 ne utiče na nivoe fragmenta u BAN2401.

[0109] U pogledu izgleda formulacija nakon mešanja pri 250 o/min tokom 3 dana na sobnoj temperaturi, uzorak bez PS80 bio je zamagljen sa istaloženim proteinom, dok su ostali uzorci (0,02%, 0,05% i 0,1% polisorbata 80) bili vizuelno bistri rastvori bez čestica. Svi uzorci koji su mešani pri 250 o/min tokom 3 dana na 5 °C bili su čisti i bez taloga. Svi uzorci podvrgnuti ciklusima zamrzavanja/otapanja su takođe bili čisti i bez taloga.

[0110] Nivoi agregata i fragmenta u formulacijama BAN2401 podvrgnutim agitaciji i zamrzavanju-otapanju prikazani su u tabeli 9. Stresni uslov koji je izazvao najveću nestabilnost bila je agitacija pod ambijentalnim uslovima. Pod ovim uslovima, uzorak bez PS80 je pokazao najveće formiranje vrsta visoke molekularne težine i najveći gubitak monomera. Ovaj efekat je poništen kako se koncentracija PS80 povećavala.

Tabela 9. Rezultati nivoa agregata i fragmenta za studije agitacije i zamrzavanja-otapanja

<(a)>Vrste visoke molekularne težine;<(b)>Vrste niske molekularne težine; i<(c)>Uzorak je bio zamagljen

Analiza subvidljivih čestica

[0111] Analiza subvidljivih čestica je obavljena korišćenjem Micro Flow Imaging metode (protočni mikroskop DPA4100 i protočna ćelija BP-4100-FC-400-UN). Ukupna zapremina uzorka bila je 0,9 mL, a rezultati su prijavljeni za opsege od 2,25-100 µm, 5-100 µm, 10-100 µm i 25-100 µm.

[0112] Povećanje subvidljivih čestica (2 do 10 µm) je primećeno u uzorcima bez PS80 koji su podvrgnuti mešanju i zamrzavanju-otapanju. Generisanje subvidljivih čestica je sve više suzbijano kako se koncentracija PS80 u formulaciji povećavala. Ovaj efekat je primećen u svim proučavanim opsezima veličina. Nije bilo značajne promene u subvidljivim česticama u formulacijama koje sadrže 0,05% i 0,1% polisorbata 80. Stoga je koncentracija PS80 od 0,05% izabrana kao optimalna za formulaciju.

[0113] Podaci bi sugerisali da PS80 nema efekta na formiranje agregata BAN2401 (dimera i trimera) i fragmenata, mereno SEC-HPLC analizom. Stoga, koncentracija PS80 je odabrana na osnovu rezultata studija agitacije i zamrzavanja-otapanja. Koncentracija PS80 od 0,05% je izabrana da bi se sprečilo potencijalno taloženje tokom transporta i da bi se smanjilo formiranje subvidljivih čestica.

Primer 6: Priprema intravenskih (IV) formulacija BAN2401

A. Formulacija BAN2401 od 10 mg/mL

[0114] Formulacija BAN2401 od 10 mg/mL za intravensku injekciju („Injekcija od 10 mg/mL“) je proizvedena konvencionalnim cGMP aseptičnim procesom za pripremu sterilne vodene formulacije. Injekcija BAN2401 od 10 mg/mL je proizvedena iz odgovarajuće formulacije supstance leka BAN2401 ispod, bez dodavanja bilo kakvih pomoćnih supstanci i razblaživanja. Primer IV formulacije koja sadrži 10 mg/mL BAN2401 prikazan je u tabeli 10.

Tabela 10. Uporedna IV formulacija od 10 mg/mL koja obuhvata BAN2401

[0115] Filtrirani rastvor supstance leka BAN2401 je aseptično punjen u ampule kao što je ilustrovano na slici 17 (na slici 17 se naziva „Formulacija A“). Združena supstanca leka je prošla korak filtracije za smanjenje bioopterećenja kroz 0,2 µm filter. Konačna sterilna filtracija je obavljena kroz dva 0,2 µm filtera u seriji, i izvršeni su testovi integriteta filtera pre i posle filtracije. Sterilni masovni proizvod leka je aseptično punjen u ampule. Tokom operacije punjenja, tačnost punjenja je potvrđena merenjem težine punjenja ampule.

Napunjene ampule su zatvorene čepom, a zatim su zatvorene aluminijumskim zatvaračem. Nakon zatvaranja, proizvod je skladišten na 5±3 °C.

[0116] Ampule su analizirane korišćenjem Metode 1 (zasenčenje svetlosti) prema USP 788. Rezultati su prikazani u tabelama 11 i 12.

Tabela 11. Raspodela veličine čestica (čestice/posuda) za injekcije od 10

Tabela 12. Raspodela veličine čestica (čestice/mL) za injekcije od 10 mg/mL

Primer 7: Priprema intravenskih (IV) i subkutanih (SC) formulacija BAN2401 A. Formulacije BAN2401 od 100 mg/mL

B.

[0117] Formulacija BAN2401 od 100 mg/mL („Injekcija od 100 mg/mL“) je proizvedena konvencionalnim cGMP aseptičnim procesom za pripremu sterilne vodene formulacije. BAN2401 od 100 mg/mL je proizveden iz odgovarajućih supstanci leka BAN2401 bez dodavanja bilo kakvih pomoćnih supstanci i razblaživanja (tabela 13).

Tabela 13. Primer IV formulacije od 100 mg/mL koja obuhvata BAN2401

[0118] Filtrirani rastvor supstance leka BAN2401 (Injekcija od 100 mg/mL) je aseptično punjen u ampule kao što je ilustrovano na slici 18 (na slici 18 se naziva „Formulacija B“). Supstanca leka je prošla korak filtracije za smanjenje bioopterećenja kroz 0,2 µm filter. Konačna sterilna filtracija je obavljena kroz dva 0,2 µm filtera u seriji, i izvršeni su testovi integriteta filtera pre i posle filtracije. Sterilni masovni proizvod leka je aseptično punjen u ampule. Tokom operacije punjenja, tačnost punjenja je potvrđena merenjem težine punjenja ampule. Napunjene ampule su zatvorene čepom, a zatim su zatvorene aluminijumskim zatvaračem. Nakon zatvaranja, proizvod je skladišten na 5±3 °C.

[0119] Ampule su analizirane korišćenjem Metode 1 (zasenčenje svetlosti) prema USP 788. Rezultati su prikazani u tabelama 14 i 15.

Tabela 14. Raspodela veličine čestica (čestice/ampula) za ampule injekcije od 100 mg/mL

Tabela 15. Raspodela veličine čestica (čestice/mL) za injekcije od 100 mg/mL

[0120] Proizvedena je još jedna injekcija BAN2401 od 100 mg/mL. Sledeći materijali se mogu koristiti u drugoj primeru formulacije koja sadrži 100 mg/mL BAN2401, kao što je prikazano u tabeli 16.

Tabela 16. Drugi primer IV formulacije od 100 mg/mL koja obuhvata BAN2401.

[0121] B. Formulacija BAN2401 od 200 mg/mL

[0122] Sledeći materijali se mogu koristiti u primeru SC formulacije koja sadrži 200 mg/mL BAN2401, kao što je prikazano u tabeli 17. Stabilnost BAN2401 u ovim formulacijama (FSC1. FSC2 i FSC3) je procenjena u kombinaciji sa procenom stabilnosti materijala u tri zatvarača posude:

i) Becton-Dickenson Hypak Biotech stakleni špric sa predpunjenim rastvorom (PFS) i čep

ii) West Crystal Zenith plastični PFS i čep

iii) West 5 mL staklena ampula od 5 mL i čep

Tabela 17. Primeri SC formulacija od 200 mg/mL koje obuhvataju BAN2401.

<1>Ukupna koncentracija kao histidin

[0123] BAN2401 sa ciljnom koncentracijom proteina od 200 mg/mL je pripremljen putem TFF kao što je sumirano u nastavku. Odvojena TFF operacija je obavljena da bi se pripremio materijal BAN2401 u svakom puferu formulacije, osim za FSC1a i FSC1b. Za dve formulacije, obavljena je jedna TFF operacija, a dobijeni koncentrisani materijal je podeljen u dve polovične serije. Mala količina sterilno filtriranog materijala u svakom finalnom puferu formulacije nije punjena u vreme nula, već je skladištena zamrznuta na -20°C da bi se punila u odgovarajuće zatvarače posuda za testiranje špriceva.

(a) Priprema BAN2401

[0124] Proces koncentracije/diafiltracije proteina putem TFF može se podeliti u 3 faze:

1. Koncentracija materijala na 100-150 mg/mL

2. Diafiltracija (5X) naspram pufera formulacije

3. Koncentracija na >200 mg/mL

[0125] Korak koncentracije/diafiltracije je obavljen korišćenjem Pall Centramate LV sistema instaliranog sa 0,02 m<2>površine membrane. Materijal BAN2401 (uzet iz proizvodnje GMP serije pre dodavanja PS80) je unesen u TFF sistem i obavljena je koncentracija od 10-15 puta (faza 1). Materijal je zatim diafiltriran naspram do 5 diavolumena pufera formulacije (faza 2), pri čemu su obavljene pH i provodljivost propusnosti kako bi se nadgledala diafiltracija. Nakon diafiltracije, materijal je dalje koncentrisan na ciljnu koncentraciju proteina od 210 do 250 mg/mL (faza 3). Retentat je sakupljen i uzeti su uzorci za određivanje koncentracije proteina.

[0126] Prilikom pripreme ove formulacije, ciljna koncentracija proteina od 210 do 250 mg/mL nije postignuta zbog visokog pritiska u TFF sistemu. Zbog toga, ciljna koncentracija proteina je postignuta korišćenjem Millipore centrifugalnih filter jedinica (30,000 MWCO). Da bi se obavio ovaj korak koncentracije, filter jedinice su ekvilibrisane sa puferom formulacije BAN2401, nakon čega je usledila centrifugacija BAN2401 materijala pri 3600 o/min (~3000 x g) u intervalima od 30 minuta na 20 °C, dok se nije očekivalo da će koncentracija proteina u retentatu biti veća od 200 mg/mL. Retentat je povraćen iz filter jedinica i združen. Nakon temeljnog mešanja, iz združenog retentata su uzeti uzorci za merenja koncentracije proteina.

[0127] Nakon što je protein koncentrisan, uzet je uzorak iz združenog retentata i razblažen 500 puta sa odgovarajućim puferom formulacije. Apsorbanca razblaženog uzorka na 280 nm i 320 nm je izmerena u odnosu na prazan pufer. Konačno prilagođavanje koncentracije proteina je obavljeno razblaživanjem sa odgovarajućim puferom formulacije. Na kraju, 10% PS80 rastvor je dodat BAN2401 da bi se postiglo 0,02% PS80 u konačnom rastvoru, a proteinski rastvor je temeljno promešan rotacijom s kraja na kraj.

[0128] Finalno formulisani BAN2401 materijal je filtriran korišćenjem 0,2 µm filtera sa špricem, a zatim je punjen u ampule ili PFS. Ovaj korak je obavljen aseptično u kabinetu za biosigurnost. Dobijene ampule ili PFS su postavljeni u zamrzivač na -20°C. Ampule su skladištene naopako, a PFS su skladišteni horizontalno da bi se simulirali najgori mogući uslovi.

C. Eksperimenti stabilnosti na primerima 200 mg/mL SC formulacija koje obuhvataju BAN2401.

[0129] Stabilnost uzoraka je procenjena na 5°C (3M, 6M, 9M, 12M) i 25°C (1M, 3M) korišćenjem testa za pH (slike 19-21), apsorbancije na 405 nm (slike 22-24) (za detekciju povećanja žutila), hromatografiju sa isključenjem po veličini (SEC) (slike 25-33), i na 5°C nakon toga. Videti tabelu 17 za primer formulacija FSC1-FSC4; napomena: na slikama 19-33, „F1a“ se odnosi na FSC1a, „F1b“ se odnosi na FSC1b, „F2“ se odnosi na FSC2, a „F3“ se odnosi na FSC3. Dodatni testovi karakterizacije, uključujući koncentraciju proteina, diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju (DSC), PS80 i osmolalnost, obavljeni su na t=0 uzorcima. Testiranje subvidljivih čestica je obavljeno na uzorcima sa t=0 i t=6 meseci.

Studija agitacije od 3 dana je obavljena na uzorcima čuvanim 1 mesec na 5°C. Uzorci za studiju agitacije su premešteni iz skladišta na 5°C nakon 1 meseca na 25°C uz agitaciju pri 250 o/min tokom 3 dana.

[0130] Rezultati testa su pokazali da BAN2401 od 200 mg/ml u svim formulacijama FSC1a-FSC3 ima slične nivoe agregata i fragmenata nakon skladištenja na 2-8°C tokom 12 meseci. Stabilnost za BAN2401 na 200 mg/mL, u tri FSC1a-FSC3 formulacije, je procenjena.

Ukupno, stabilnost BAN2401 u svakoj testiranoj formulaciji izgledala je slična, i održala je više od 98,2% monomera nakon skladištenja na 5°C tokom 12 meseci, bez obzira na testirani zatvarač posude. Pored toga, nakon skladištenja na 5°C tokom 12 meseci, pH je ostao stabilan, i nije bilo primetnog povećanja žutila po A405.

(a) Koncentracija proteina (uzorci T=0)

[0131] Koncentracija proteina je merena korišćenjem UV-Vis spektrofotometra. Rezultati su navedeni u tabeli 18.

Tabela 18. Rezultati koncentracije proteina

[0132] Koncentracija proteina je procenjena merenjem apsorbancije na 280 i 320 nm na Beckman DU-800 spektrofotometru korišćenjem 1cm kvarcne kivete. Uzorci su razblaženi 500 puta i pripremljeni su u triplikatima. Koncentracija proteina je izračunata korišćenjem koeficijenta ekstinkcije, ε, od 1,32 koristeći sledeću formulu:

Koncentracija= (A280-A320)/ ε x faktor razblaživanja

(b) Polisorbat 80 (uzorci T=0)

[0133] Sadržaj PS80 u uzorcima je meren putem kvantifikacije oleinske kiseline. Rezultati su prikazani u tabeli 19.

Tabela 19. Rezultati polisorbata 80

[0134] Merenje je obavljeno kvantifikacijom oleinske kiseline, proizvoda hidrolize PS80. Korišćenjem bazne hidrolize, PS80 oslobađa oleinsku kiselinu u molarnom odnosu 1:1. Oleinska kiselina se zatim može odvojiti od drugih proizvoda hidrolize PS80 i matrica korišćenjem HPLC sa obrnutom fazom. Oleinska kiselina je praćena bez derivatizacije korišćenjem apsorbancije na 195 nm. [J. Chromatography B, 878 (2010) 1865-1870].

Eksperimentalno, uzorci su mešani sa natrijum hidroksidom da bi se oslobodila oleinska kiselina, koja je zatim ekstrahovana acetonitrilom. Ekstrakt je razblažen rastvorom kalijum fosfata, a zapremina uzorka od 100 µL je ubrizgana u Waters Symmetry C18 kolonu.

Separacija je obavljena korišćenjem izokratske elucije koja sadrži 80% organske faze A (acetonitril) i 20% vodene faze B (20 mM kalijum fosfat monobazični, pH 2,8).

Koncentracija PS80 u uzorku je izračunata iz površine pika korišćenjem standardne krive. (c) Osmolalnost (uzorci T=0)

[0135] Osmolalnost uzoraka je utvrđena korišćenjem osmometra tačke smrzavanja. Rezultati su prikazani u tabeli 20.

Tabela 20. Rezultati osmolalnosti

[0136] Osmolalnost je merena korišćenjem Precision Systems Osmette III osmometra tačke smrzavanja. Uzorci su razblaženi 3 puta sa WFI, a razblaženi volumeni uzorka od 10 µL su izvučeni i uneseni u instrument korišćenjem pipete osmometra. Dobijena merenja osmolalnosti su korigovana za razblaživanje uzorka.

(d) Subvidljive čestice

[0137] Analiza subvidljivih čestica je obavljena korišćenjem Fluid Technologies FlowCam instrumenta. Rezultati za T=0 navedeni su u tabeli 21. Čini se da postoji povećanje ukupne koncentracije čestica i broja čestica većih od 10 µm tokom vremena kada se materijal čuva na 5°C. Stepen povećane promene bio je mali u sledećem redosledu: FSC1a < FSC1b < FSC2 < FSC3.

Tabela 21. Rezultati subvidljivih čestica

[0138] Analiza subvidljivih čestica je obavljena korišćenjem Fluid Imaging Technologies FlowCam sa 20X objektivom i 50 µm protočnom ćelijom. Pre obrade uzoraka BAN2401, protočna ćelija je ispirana sa dI H2O i izvršeno je merenje na dI H2O kako bi se osiguralo da je protočna ćelija čista. Ako je ukupan broj prebrojanih čestica po 0,2 mL dl H2O bio ≦ 2, protočna ćelija je smatrana spremnom za upotrebu. Uzorci su ekvilibrisani na sobnu temperaturu, a zatim razblaženi 20 puta sa dejonizovanom vodom. Duplirani razblaženi uzorci su analizirani korišćenjem zapremine uzorka od 0,2 mL i protoka uzorka od 0,02 mL/min. Stopa automatskog snimanja bila je 14, dajući efikasnost od 19,6% i vreme rada od 10 min. Dobijene koncentracije čestica su korigovane za razblaživanje uzorka.

(e) pH

[0139] pH svake formulacije je praćen tokom testiranja stabilnosti. Kao što je prikazano na slikama 19-21, nije primećena očigledna promena kod uzoraka u bilo kojem od testiranih uslova skladištenja.

(f) HPLC-SEC

[0140] Analiza hromatografijom visoke performanse sa isključenjem po veličini (HPLC-SEC) izvedena je korišćenjem TSK 03000 SWXL kolone sa 0,2 M mobilnom fazom natrijum fosfata, pH 7,0, pri protoku od 1,0 mL/min. Zapremina injekcije uzorka bila je 0,8 µL za koncentraciju proteina od 200 mg/mL. Ovo osigurava da se približno 150 µg proteina ubrizga na kolonu tokom studije. Prijavljeni su rezultati relativnih površina pikova (%) za monomer, agregat i fragment, kao što je prikazano na slikama 25-33.

[0141] Fizička degradacija BAN2401 je procenjena obavljanjem HPLC-SEC analize na uzorcima stabilnosti čuvanim na 5 i 25 °C. Nakon skladištenja na 5°C tokom 12 meseci, procenat agregata bio je sličan za 3 formulacije, približno 1,1%. Procenat generisanog fragmenta za sve testirane formulacije bio je u rasponu od 0,4-0,5%. Sadržaj monomera nakon 12 meseci skladištenja na 5°C bio je u rasponu od 98,4-98,6% za sve testirane formulacije i zatvarače posuda. Pri trenutnim stopama degradacije, moguće je da BAN2401 u svim testiranim formulacijama ima više od 97% monomera nakon do 24 meseca skladištenja na 5°C.

[0142] Nakon skladištenja na 25°C do 3 meseca, generacija fragmenta nakon 3 meseca bila je u rasponu od 0,4-0,8%. Sadržaj monomera je bio nešto veći od 98% za sve formulacije, osim za FSC3, koja je imala nešto manje od 98% monomera nakon 3 meseca na 25°C.

Primer 8: Odabir koncentracija proteina, arginina i polisorbata 80

A. Priprema uzorka

[0143] Svaka kandidatna formulacija (F1-F12) je pripremljena na sledeći način. Procesni intermedijer supstance leka (DS) je koncentrisan i ekvilibrisan sa odgovarajućim puferima formulacije (tabela 22) pomoću centrifugalnih filter jedinica. Nakon koncentracije i ekvilibracije, PS80 rastvoren u puferu formulacije je dodat da bi se postigle unapred određene koncentracije, a koncentracije proteina su prilagođene na konačnu koncentraciju. Svaka kandidatna formulacija je punjena u ampule sa zapreminom punjenja od 0,5 mL. Kandidatne formulacije (F1-F12) su prikazane u tabeli 22. Formulacija F0 je procenjena kao kontrola.

Tabela 22. Formulacija (F0) i kandidatne formulacije F1–F12

a: F2 i F10 su iste formulacije, pripremljene za različite studije.

b: Prilikom odabira koncentracije polisorbata 80, rastvor leka je izvučen iz

proizvoda leka i punjen sa 0,5 mL kako bi se uskladila zapremina punjenja i

sistem zatvaranja posude.

B. Protokol stabilnosti

[0144] Protokoli stabilnosti prikazani su u tabeli 23, tabeli 24 i tabeli 25. Kada su izvađene iz skladišta, ampule su čuvane na 5 °C do testiranja. Uslovi skladištenja su bili sledeći:

• Dugoročni uslov: skladištenje na 5 °C ± 3 °C, uspravno

• Ubrzani uslov:<Skladištenje>na 25 °C ± 2 °C, 60% RH ± 5% RH, uspravno

• Stresni uslov (zamrzavanje-otapanje): Zamrznuto na -30 °C i otopljeno na sobnoj temperaturi, uspravno

• Stresni uslov (agitacija): 5 °C, polegnuto, horizontalno, pri 250 o/min na recipročnom šejkeru sa amplitudom mešanja od 50 mm

Tabela 23. Protokol stabilnosti (dugoročni i ubrzani uslov)

N/P: Nije primenljivo.

Tabela 24. Protokol stabilnosti (stresni uslov: F0-F7)

N/P: Nije primenljivo.

Tabela 25. Protokol stabilnosti (stresni uslov: F0, F8-F12)

N/P: Nije primenljivo.

[0145] Pošto je poznato da viskoznost rastvora eksponencijalno raste kod visoko koncentrovanih proteinskih rastvora, koncentracija proteina svake kandidatne formulacije (F1-F5) je prilagođena na 200 ± 10 mg/mL sa puferom formulacije koji sadrži 0,05% (w/v) PS80 za analizu. Ostale formulacije nisu bile razređene pre merenja.

C. Rezultati i diskusija

(a) Odabir koncentracije arginina

[0146] Da bi se odabrala ciljna koncentracija arginina u formulaciji, procenjena su fizička svojstva i sprovedene su studije dugoročne i ubrzane stabilnosti, kao i studije zamrzavanjaotapanja, za kandidatne formulacije sa različitom koncentracijom arginina (150 do 350 mmol/L, F1 do F5) i upoređene su sa formulacijom F0 (videti tabelu 22). Fizička svojstva i rezultati studije zamrzavanja-otapanja prikazani su u tabeli 26. Rezultati studije dugoročne i ubrzane stabilnosti prikazani su u tabeli 27 i tabeli 28.

Ċ

(b) Fizička svojstva

[0147] Kao što je prikazano u tabeli 26, vrednosti osmolalnosti su se povećale sa povećanjem koncentracije arginina. F1, F2 i F3 su pokazale niže vrednosti osmolalnosti u poređenju sa F4 i F5. Zbog toga, koncentracija arginina je ograničena na 250 mmol/L ili manje. Vrednosti viskoznosti F1-F5 su bile u uskom rasponu (7,3-8,1 cP) i nisu bile u korelaciji sa koncentracijom arginina u rasponu od 150 do 350 mmol/L. Rezultati izgleda, pH i koncentracije PS80 i proteina su skoro bili na ciljnim vrednostima.

(c) Studija stabilnosti zamrzavanja-otapanja

[0148] Nisu primećene značajne promene u svim testiranim stavkama nakon tri ciklusa testiranja zamrzavanja-otapanja, kao što je prikazano u tabeli 26.

(d) Studija dugoročne stabilnosti

[0149] Kao što je prikazano u tabeli 27, nisu primećene značajne promene u svim testiranim stavkama osim za HPLC sa isključenjem po veličini (SEC) nakon tri meseca skladištenja. Količine agregata i fragmenta po SEC su se blago povećale u kandidatnim formulacijama F1-F5. Svaka stopa povećanja bila je slična formulaciji F0.

(e) Studija ubrzane stabilnosti

[0150] Kao što je prikazano u tabeli 28, nisu primećene značajne promene u svim testiranim stavkama osim za SEC i HPLC sa izmenom jona (IEX). Iako se količina agregata po SEC povećala kod svih kandidata (F1-F5, BAN2401200 mg/mL) i stopa je bila brža nego kod formulacije F0, kao što se očekivalo, svi kandidati su smatrani izvodljivim s obzirom na rezultate u dugoročnom uslovu i stabilnost F0 sa dugim rokom trajanja. Viša koncentracija arginina je rezultirala nešto sporijim formiranjem agregata, što je u skladu sa rezultatima opisanim u primeru 4. Količina fragmenta po SEC se takođe povećala kod svih kandidata, ali je stopa bila slična onoj u F0 formulaciji. Što se tiče IEX, količina kiselog pika se povećala kod svih kandidata, ali je stopa bila slična onoj u F0.

(f) Koncentracija arginina

[0151] Kao što je prikazano u tabeli 26, F4 i F5 (pri koncentracijama arginina od 300 i 350 mmol/L) nisu smatrane izvodljivim u pogledu osmolalnosti. Među izvodljivim kandidatima F1, F2 i F3 (pri koncentracijama arginina od 150, 200 i 250 mmol/L), F1 je najbliži izotoničnom. Kao što je prikazano u tabeli 28, formulacije sa višim koncentracijama arginina su pokazale nižu stopu formiranja agregata u studijama ubrzane stabilnosti, ali razlika u stopi nije bila značajna u rasponu koncentracije arginina koji je procenjen. Uzimajući u obzir i izotoničnost i stopu formiranja agregata, 200 mmol/L je izabrano kao ciljna koncentracija arginina na osnovu F2 formulacije.

(g) Odabir koncentracije proteina

[0152] Da bi se odabrala ciljna koncentracija proteina u formulaciji, procenjena su fizička svojstva i sprovedene su studije stabilnosti zamrzavanja-otapanja, dugoročne i ubrzane stabilnosti za kandidatne formulacije sa različitom koncentracijom proteina (200 do 300 mg/mL, F2, F6, F7) i formulacijom F0. Fizička svojstva i rezultati studije stabilnosti zamrzavanja-otapanja prikazani su u tabeli 29. Rezultati studije dugoročne i ubrzane stabilnosti prikazani su u tabeli 27 i tabeli 28.

(h) Fizička svojstva

[0153] Kao što je prikazano u tabeli 29, F2 i F6 su pokazale niže vrednosti osmolalnosti u poređenju sa F7. Vrednosti viskoznosti u F2, F6 i F7 bile su 7,8, 21 i 48 cP, respektivno.

Visoka viskoznost preko 20 cP bi izazvala poteškoće u proizvodnji DS povećavanjem protiv pritiska pumpe i smanjenjem transmembranskog fluksa tokom koraka ultrafiltracije i diafiltracije. Pored toga, rastvor veće koncentracije čini proces punjenja DP težim zbog začepljenja igala za punjenje što dovodi do varijacije težine punjenja. Pošto je prijavljena željena viskoznost ne veća od 20 cP3, F2 je bio izvodljiv. Rezultati izgleda, pH i koncentracije PS80 i proteina su bili skoro na cilju.

(i) Studija zamrzavanja-otapanja

[0154] Nisu primećene značajne promene u svim testiranim stavkama nakon tri ciklusa testiranja zamrzavanja-otapanja, kao što je prikazano u tabeli 29.

(j) Studija dugoročne studija

[0155] Kao što je prikazano u tabeli 27, nisu primećene značajne promene osim HPLC sa isključenjem po veličini (SEC) nakon tri meseca skladištenja. Količina agregata po SEC se blago povećala u kandidatnim formulacijama F2, F6 i F7, ali je stopa povećanja bila slična onoj u F0.

(k) Studija ubrzane stabilnosti

[0156] Kao što je prikazano u Tabeli 28, nisu primećene značajne promene osim SEC i HPLC sa izmenom jona (IEX). Količina agregata po SEC se povećala kod svih kandidata (F2, F6 i F7) sličnim stopama u vremenskoj tački od tri meseca (povećanje od 0,7-0,8%). Stoga su svi kandidati smatrani izvodljivim. Količina fragmenta po SEC se takođe povećala kod svih kandidata, ali je stopa bila slična onoj u F0. Što se tiče IEX, količina kiselog pika po IEX se povećala kod svih kandidata, ali je stopa bila slična onoj u F0.

(I) Koncentracija proteina

[0157] Uzimajući u obzir rezultate osmolalnosti i viskoznosti prikazane u tabeli 29, i ukupne rezultate stabilnosti prikazane u tabeli 27 i tabeli 28, odabrana je koncentracija proteina od 200 mg/mL.

(m) Odabir koncentracije PS80

[0158] Da bi se odabrala ciljna koncentracija PS80 u formulaciji, sprovedene su studije zamrzavanja-otapanja i agitacije za kandidatne formulacije sa različitom koncentracijom PS80 [0 do 0,10% (w/v), F8-F12] i formulacijom F0. Rezultati studija zamrzavanja-otapanja i agitacije prikazani su u tabeli 30 i tabeli 31, respektivno.

Ċ

(n) Studija zamrzavanja-otapanja

[0159] Kao što je prikazano u tabeli 30, nisu primećene značajne promene u svim testiranim stavkama nakon tri ciklusa testiranja zamrzavanja-otapanja. Broj čestica po MFI bio je relativno visok u F8 (bez PS80).

(o) Studija agitacije

[0160] Kao što je prikazano u tabeli 31, formulacije koje sadrže 0,02% (w/v) do 0,10% (w/v) PS80 (F9 do F12) bile su stabilne nakon agitacije. Promene su primećene u F8 (bez PS80) za izgled, koncentraciju proteina i količinu agregata po SEC nakon agitacije. Izgled se promenio iz bistre, blago žute tečnosti u opalescentnu belu tečnost. Koncentracija proteina se blago smanjila sa 206 na 195 mg/mL. Količina agregata se povećala sa 1,1% na 3,8%. Stoga, F8 (bez PS80) nije smatran izvodljivim.

(p) Koncentracija PS80

[0161] Na osnovu rezultata prikazanih u tabeli 30 (studija zamrzavanja-otapanja) i tabeli 31 (studija agitacije), formulacije koje sadrže 0,02% (w/v) do 0,10% (w/v) PS80 bile su stabilne nakon tri ciklusa zamrzavanja-otapanja i agitacije do tri dana. Stoga je koncentracija PS80 od 0,05% (w/v) odabrana kao ciljna.

(q) Zaključak

[0162] U zaključku, sledeća formulacija je odabrana za BAN2401 formulaciju za naredne studije.

Tabela 32. Formulacija za naredne studije

Primer 9: Studija stabilnosti za 200 mg/mL BAN2401 formulacije sa različitim pH vrednostima

[0163] Studija stabilnosti je sprovedena da bi se testirala stabilnost BAN2401 formulacija na 200 mg/mL sa različitim pH vrednostima. Pored toga, testiran je i uticaj dodatka metionina na stabilnost proizvoda leka (DP).

A. Priprema uzorka

[0164] Svaka kandidatna formulacija (tabela 33) je pripremljena na sledeći način.

Formulacije su ekvilibrisane sa odgovarajućim puferom formulacije pomoću centrifugalnih filter jedinica. Samo za F20 pripremu, pufer formulacije sa pH od 3,5 je korišćen dok pH filtriranog rastvora nije dostigao 4,0, jer se protoni odbijaju od koncentrisanog naelektrisanog proteina blizu polupropustljive membrane, što je poznato kao Donanov efekat. Nakon koncentracije i ekvilibracije, PS80 rastvoren u puferu formulacije je dodat da bi se postigla unapred određena koncentracija, a zatim je koncentracija proteina prilagođena na konačnu koncentraciju. Svaka kandidatna formulacija je punjena u ampule sa zapreminom punjenja od 0,5 mL. Formulacija F0 (videti tabelu 33) je procenjena kao kontrola.

Tabela 33. Sastav supstance leka i kandidatnih SC formulacija

Arg: Arginin, Met: Metionin

a: Za prilagođavanje pH vrednosti, arginin i arginin hidrohlorid su kombinovani za F0, a hidrohlorid je

dodat za F13 do F22.

b: F21 je ista formulacija kao F15

C. Protokol skladištenja

D.

[0165] Protokoli skladištenja prikazani su u tabeli 34, tabeli 35 i tabeli 36. Kada su izvađene iz skladišta, ampule su čuvane na 5 °C dok testiranje nije počelo. Uslovi skladištenja su sledeći:

• Dugoročni uslov: skladišteno na 5 °C ± 3 °C uspravno

• Ubrzani uslov: Skladištenje na 25 °C ± 2 °C, 60% RH ± 5% RH, uspravno

• Stresni uslov (zamrzavanje-otapanje): Zamrznuto na -30 °C i otopljeno na sobnoj temperaturi, uspravno

1000 lx: 25 °C ± 2 °C, 60% RH ± 5% RH, polegnuto, sa izloženošću svetlosti od 1000 lx

Mračno: 25 °C ± 2 °C, 60% RH ± 5% RH, polegnuto, bez izloženosti svetlosti, pokrivanjem aluminijumskom folijom

[0166] Da bi se potvrdio nivo agregata nakon tri meseca ili dužeg skladištenja, HPLC sa isključenjem po veličini je dodatno procenjen kao uzorci sa produženog skladištenja u devetom mesecu za dugoročnu i trećem mesecu za ubrzanu studiju stabilnosti. Kasniji uzorci su testirani nakon skladištenja u frižideru šest meseci.

C. Rezultati i diskusija

[0167] Procenjena su fizička svojstva i sprovedene su dugoročne i ubrzane studije za kandidatne formulacije, uključujući varijaciju pH (od 4,0 do 6,0) i dodatak metionina. Studije zamrzavanja-otapanja i fotostabilnosti su takođe sprovedene kako bi se procenila efikasnost dodatka metionina.

D. Varijacija pH vrednosti

[0168] Kao što je prikazano u tabeli 37, tabeli 38A i 38B, tabeli 39 i tabeli 40, nisu primećene značajne razlike među kandidatnim formulacijama (F13, F15, F17 i F20 do F22) za bilo koje test stavke osim za HPLC sa isključenjem po veličini (SEC). Formulacija F20 (tj. formulacija sa nižim pH od 4,0) pokazala je manju količinu agregata po SEC u početnoj vremenskoj tački. Pored toga, nešto niža stopa formiranja agregata i viša stopa formiranja fragmenata su primećene u ubrzanoj studiji stabilnosti. Potvrđeno je da su rezultati formulacija sa pH od 4,5 do 5,5 uporedivi.

E. Dodatak metionina

[0169] Kao što je prikazano u tabelama 41A i 41B, i tabelama 42 do 46, nije primećena značajna razlika između formulacija sa ili bez metionina (F18 i F15). Formulacija sa metioninom (F18) je pokazala nešto nižu stopu formiranja agregata u dugoročnoj studiji stabilnosti, ubrzanoj studiji stabilnosti i studiji fotostabilnosti. F18 je takođe pokazao nešto nižu oksidaciju metioninskog ostatka (npr. na poziciji 259 u teškim lancima) pri izloženosti svetlosti od 1000 luksa do sedam dana. Studija zamrzavanja-otapanja nije pokazala nikakvu razliku. Efekat 10 mmol/L metionina kao stabilizatora bio je ograničen.

F. Zaključak

[0170] Atributi kvaliteta bili su uporedivi među formulacijama BAN2401 sa varijacijom pH vrednosti od 4,5 do 5,5. Formulacije sa pH 4,0 su pokazale nižu stopu formiranja agregata i, naprotiv, bržu stopu formiranja fragmenta tokom skladištenja. Nismo primetili značajnu razliku između formulacija sa i bez metionina u koncentraciji od 10 mmol/L, na osnovu evaluacije kvaliteta, studija stabilnosti, uključujući dugoročne, ubrzane, studije zamrzavanjaotapanja i fotostabilnosti. Iako su primećeni nešto sporija stopa formiranja agregata i manje supresije u oksidaciji aminokiselinskog ostatka, razlike nisu bile značajne. U zaključku, F15 i F21, koje su bile sastavljene od 200 mg/mL BAN2401, 25 mmol/L L-histidina/histidin hidrohlorida, 200 mmol/L L-arginina, 0,05% (w/v) polisorbat 80 pri pH 5,0 ± 0,5, određene su kao dobri kandidati za supstancu leka za dalji razvoj.

Primer 10: Ispitivanje efekta koncentracije arginina na stabilnost formulacije BAN2401

[0171] Efekat koncentracije arginina (0, 50, 100 i 200 mmol/L) na stabilnost BAN2401 na 200 mg/mL je procenjen. Uzorci svakog nivoa koncentracije arginina su skladišteni u ubrzanom uslovu (25 °C/60%RH) i testirani na 0, 1 i 2 meseca.

A. Priprema uzorka

[0172] Uzorci (F1-F4) su pripremljeni zamenom pufera koncentrisanog procesnog intermedijera supstance leka BAN2401 putem ultrafiltracije. Nakon aseptične filtracije, svaki uzorak od 0,4 mL je punjen u ampulu. Informacije o uzorku prikazane su u tabeli 47.

Tabela 47. Informacije o uzorku

B. Rezultati

[0173] Rezultati ove studije stabilnosti za uzorke F1 do F4 prikazani su u tabeli 48 do 51. Nije bilo razlike u pH i koncentraciji proteina između uzoraka, a nivo koncentracije arginina bio je u skladu sa ciljem za početne uzorke.

[0174] Procenat agregata za uzorke koji sadrže arginin (F2 do F4) bio je niži od onog za uzorak bez arginina (F1).

Tabela 48. Rezultati testa uzorka F1 (ciljano 0 mmol/L arginina)

Tabela 49. Rezultati testa uzorka F2 (ciljano 50 mmol/L arginina)

Tabela 50. Rezultati testa uzorka F3 (ciljano 100 mmol/L arginina)

Tabela 51. Rezultati testa uzorka F4 (ciljano 200 mmol/L arginina)

[

C. Diskusija i zaključak

[0175] Rezultati ove studije su ukazali da koncentracije arginina od 50 do 200 mmol/L sprečavaju povećanje agregata proteina u formulaciji BAN2401 od 200 mg/mL. Varijacija koncentracije arginina između serija može rezultirati varijacijom u % agregata između serija. Pored toga, koncentracija arginina može uticati na trend povećanja % agregata u studiji stabilnosti.

[0176] Formulacija koja obuhvata histidinski pufer činila se da pokazuje efekat na smanjenje fragmentacije BAN2401 u poređenju sa procentom fragmentacije u uzorku F1 sa procentom fragmentacije prikazanim na slici 11 u primeru 2, u kojem su korišćeni uzorci koji obuhvataju 200 mg/mL BAN2401, 50 mM natrijum citrata i 100 mM natrijum hlorida.

LISTA SEKVENCI

[0177]

Tabela 52. Aminokiselinske sekvence konstantnih regiona

Tabela 53. Aminokiselinske sekvence konstantnih regiona

Tabela 54. Aminokiselinske sekvence CDR mAb

Teški lanac (SEQ ID NO: 11):

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Vodena farmaceutska formulacija koja obuhvata:

(a) izolovano anti-Aβ protofibril antitelo koje se vezuje za humane Aβ protofibrile, u koncentraciji od 80 mg/mL do 300 mg/mL,

(b) 100 mM do 400 mM arginina,

(c) 0,01% w/v do 0,1% w/v polisorbata 80, i

(d) farmaceutski prihvatljiv pufer,

pri čemu farmaceutska formulacija ima pH u rasponu od 4,5 do 5,5,

pri čemu je izolovano anti-Aβ protofibril antitelo lecanemab, i

pri čemu je arginin arginin, arginin hidrohlorid, ili kombinacija istih.

2. Farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je izolovano anti-Aβ protofibril antitelo prisutno u koncentraciji od 100 mg/mL do 200 mg/mL.

3. Farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je izolovano anti-Aβ protofibril antitelo prisutno u koncentraciji od 100 mg/mL.

4. Farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je izolovano anti-Aβ protofibril antitelo prisutno u koncentraciji od 200 mg/mL.

5. Farmaceutska formulacija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-4, koja dalje obuhvata metionin.

6. Farmaceutska formulacija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-5, pri čemu je farmaceutski prihvatljiv pufer citratni pufer ili histidinski pufer.

7. Farmaceutska formulacija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-6, koja obuhvata 10 do 100 mM citratnog pufera ili 10 do 100 mM histidinskog pufera.

8. Farmaceutska formulacija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-7, koja obuhvata 125 do 350 mM arginina.

9. Farmaceutska formulacija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-8, koja obuhvata 200 mM arginina, pri čemu je arginin arginin hidrohlorid.

10. Farmaceutska formulacija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-9, koja obuhvata 200 mM arginina, pri čemu je arginin arginin hidrohlorid, i 25 mM histidinskog pufera.

11. Vodena farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1 koja obuhvata:

(a) 80 mg/mL do 240 mg/mL izolovanog anti-Aβ protofibril antitela,

(b) 140 mM do 260 mM arginin hidrohlorida,

(c) 0,02% w/v do 0,08% w/v polisorbata 80, i

(d) 15 mM do 35 mM histidinskog pufera,

pri čemu farmaceutska formulacija ima pH u rasponu od 4,5 do 5,5.

12. Vodena farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1 koja obuhvata:

(a) 80 mg/mL do 120 mg/mL izolovanog anti-Aβ protofibril antitela,

(b) 240 mM do 360 mM arginina,

(c) 0,02% w/v do 0,08% w/v polisorbata 80, i

(d) 30 mM do 50 mM citratnog pufera,

pri čemu farmaceutska formulacija ima pH u rasponu od 4,5 do 5,5,

i pri čemu je arginin arginin, arginin hidrohlorid, ili kombinacija istih.

13. Vodena farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1, koja obuhvata:

(a) 100 mg/mL ili 200 mg/mL izolovanog anti-Aβ protofibril antitela,

(b) 190 mM do 210 mM arginina, arginin hidrohlorida, ili kombinacije istih, (c) 0,04% w/v do 0,06% w/v polisorbata 80, i

(d) 15 mM do 35 mM histidinskog pufera.

14. Vodena farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1, koja obuhvata:

(a) 100 mg/mL izolovanog anti-Aβ protofibril antitela,

(b) 200 mM arginin hidrohlorida,

(c) 0,05% w/v polisorbata 80, i

(d) 25 mM histidinskog pufera.

15. Vodena farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1, koja obuhvata:

(a) 200 mg/mL izolovanog anti-Aβ protofibril antitela,

(b) 200 mM arginin hidrohlorida,

(c) 0,05% w/v polisorbata 80, i

(d) 25 mM histidinskog pufera.

16. Vodena farmaceutska formulacija prema bilo kojem od patentnih zahteva 13-15, pri čemu je histidinski pufer kombinacija histidina i histidin hidrohlorid monohidrata.

17. Vodena farmaceutska formulacija prema bilo kojem od patentnih zahteva 13-16, pri čemu farmaceutska formulacija ima pH 5,0.