ES3042057T3 - Composition and methods of using umbilical cord lining stem cells - Google Patents

Composition and methods of using umbilical cord lining stem cells

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ES3042057T3 ES16885394T ES16885394T ES3042057T3 ES 3042057 T3 ES3042057 T3 ES 3042057T3 ES 16885394 T ES16885394 T ES 16885394T ES 16885394 T ES16885394 T ES 16885394T ES 3042057 T3 ES3042057 T3 ES 3042057T3
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Abstract

La presente invención proporciona métodos para utilizar células madre del revestimiento del cordón umbilical (ULSC) para producir factores terapéuticos, incluyendo factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas y componentes de la matriz extracelular. Las ULSC son células madre mesenquimales aisladas del revestimiento del cordón umbilical. Pueden propagarse y expandirse eficientemente in vitro. Bajo condiciones específicas, las ULSC producen factores terapéuticos útiles que pueden emplearse para tratar lesiones y afecciones degenerativas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Composición y métodos de uso de células madre del revestimiento del cordón umbilical
[0005] CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0007] La invención se refiere a las células madre del cordón umbilical (UCSC) y sus usos terapéuticos. Las UCSC están reemplazando a las células madre derivadas de la médula ósea (BMSC) como el estándar de atención para muchas enfermedades de la sangre debido a que las ULSC tienen mayor potencia y son más fáciles de aislar. La presente invención se refiere a las UCSC derivadas del revestimiento del cordón umbilical (ULSC) y su uso en la producción de glicosaminoglicanos (GAG) valiosos.
[0009] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0011] En nuestro cuerpo hay una constante pérdida y reemplazo de células en el proceso fisiológico conocido como homeostasis. La homeostasis garantiza que cuando perdemos células por el desgaste cotidiano, éstas son sustituidas por células recién nacidas derivadas de células madre. Algunos tejidos tienen células madre que producen células nuevas a gran velocidad, como la piel, mientras que otros, como el cerebro, tienen células madre que se dividen lentamente y sólo son capaces de un reemplazo celular limitado. A medida que envejecemos, las tasas de reemplazo en todos nuestros tejidos disminuyen porque hay menos células madre supervivientes. Con menos reemplazo celular, los órganos acaban por repararse inadecuadamente y fallan.
[0013] En la década de 1950 se descubrió que las células madre hematopoyéticas (HSC) extraídas de la médula ósea adulta podían usarse para tratar la leucemia después de radioterapia o quimioterapia (Mayani 2003, Copelan 2006). Las HSC trasplantadas buscan la médula ósea y producen sangre nueva que incluye células tanto mieloides como linfoides. Hoy en día, el trasplante de HSC derivadas de hueso es eficaz para el tratamiento de leucemias, anemia aplásica grave, linfomas, mieloma múltiple y trastornos por inmunodeficiencia, entre otros. Actualmente se realizan más de 50.000 trasplantes al año en todo el mundo (Von Ah et al. 2015). Los bancos de sangre de médula ósea y la compatibilidad de antígenos leucocitarios humanos (HLA) permiten a los pacientes recurrir a un mayor grupo de donantes, aumentando de este modo aún más la eficacia de la terapia de trasplante de HSC.
[0015] La médula ósea adulta contiene otro tipo importante de células madre conocidas como células madre mesenquimales (MSC). Aunque se aislaron por primera vez de la médula ósea, las MSC representan sólo una pequeña fracción del total de células de la médula ósea. Afortunadamente, las MSC son más frecuentes en otros tejidos, incluyendo la grasa, los dientes y el cordón umbilical. Las MSC son multipotentes y dan lugar a una amplia variedad de tipos celulares, pero principalmente forman células óseas y del tejido conectivo (Gonzalez et al. 2015, Pittenger et al. 1999). Las MSC son útiles en el tratamiento de lesiones articulares y del tejido conectivo, donde la reparación a menudo es limitada debido a la falta de riego sanguíneo. Cuando las MSC se trasplantan a articulaciones y otros tejidos conectivos, reclutan vasos sanguíneos en las proximidades, mejorando de este modo la reparación.
[0017] Ahora se aprecia que las MSC también mejoran la reparación de lesiones reduciendo significativamente la inflamación (Gonzalez et al. 2015). Las MSC reducen la inflamación de varias maneras. Las MSC evitan provocar una respuesta inmunitaria al no expresar ni proteínas de histocompatibilidad mayor (MHC) de clase I ni de clase II (De Miguel et al. 2012). Las MSC también expresan proteínas que reducen la inflamación, incluyendo la interleucina (IL) 4, la IL-6, la IL-10, la prostaglandina E2 (PGE2), el HLA-G y el factor de crecimiento transformante (TGF)p1 (De Miguel et al. 2012, González et al. 2015, Aggarwal 2005). La presencia de estos y otros factores secretados por las MSC induce a las células cercanas a producir también factores antiinflamatorios y a reducir la expresión de factores proinflamatorios como IL-6, y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) (Gonzalez 2015 et al.).
[0019] Una fuente cada vez más prevalente tanto de HSC como de MSC es el cordón umbilical humano. Las células madre derivadas del cordón umbilical (UCSC) son una alternativa atractiva a las BMSC porque son más potentes, tienen un mayor potencial de proliferación y diferenciación debido a su origen fetal. Además, las UCSC son más rentables de extraer que las BMSC. El cordón umbilical de un bebé a término tiene una longitud de 500 milímetros de media y un diámetro de aproximadamente 20 milímetros. El tejido más externo del cordón se conoce como epitelio amniótico. Forma un tubo que contiene fibras de colágeno, células fibroblásticas y gelatina de Wharton (una sustancia gelatinosa compuesta principalmente por mucopolisacáridos y matriz extracelular), así como dos arterias, una vena y un conducto alantoideo. Tanto las HSC como las MSC pueden extraerse de estas estructuras que se han encontrado en la sangre del cordón umbilical, la vena, las arterias, el epitelio amniótico, el endotelio y la gelatina de Wharton (Subramanian et al. 2013).
[0021] La presente invención se refiere a MSC derivadas del revestimiento del cordón umbilical que se aíslan de los epitelios amnióticos incluyendo, entre otras, las ULSC aisladas por el método descrito en la Patente de Estados Unidos 8.778.679.
[0023] TÉCNICA RELACIONADA
[0024] US 8778679- Células madre del revestimiento del cordón umbilical y métodos y material para aislarlas y cultivarlas.
[0025] US20120142102 Al- Aislamiento de células madre mesenquimales humanas derivadas de sangre de cordón umbilical
[0026] US20120021509 A1- Método de aislamiento de células madre pluripotentes derivadas de sangre de cordón umbilical que expresan znf281.
[0027] EP 2079829 A2- Diferenciación de células madre de matriz de cordón umbilical en células de linaje de hepatocitos.
[0028] US 20080292597 A1- Composición de células madre de cordón umbilical y método para el tratamiento de enfermedades neurológicas.
[0029] US 9017657 B2- Grupo de células de los islotes producido a partir de células madre mesenquimales de cordón umbilical humano. La invención también proporciona un método para usar un medio acondicionado de células madre para cultivar células animales.
[0030] US 20130157365 A1-Buensuceso- Células madre pluripotentes inducidas a partir de células derivadas de tejido de cordón umbilical humano
[0031] WO 2014013255 A1- Producción de eritroides - Esta invención proporciona un método y medios adecuados para inducir y apoyar la diferenciación de células madre en células eritroides.
[0032] WO 2009137629 A2- Métodos para producir células eritroides enucleadas derivadas de células madre pluripotentes.
[0033] US 6217888 B1- Métodos de regulación de la apariencia de la piel con compuesto de vitamina B3.
[0034] REFERENCIAS CITADAS
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[0063] SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0064] La presente invención proporciona métodos de uso de las ULSC.
[0065] Ejemplos no limitativos de aplicaciones de las ULSC de acuerdo con los métodos descritos en la presente incluyen la producción de glicosaminoglicanos (GAG).
[0066] En una realización particular, Realización 1, la invención proporciona un método de uso de células madre del revestimiento de cordón umbilical (ULSC) para producir glicosaminoglicanos, el método comprendiendo:
[0067] a. Propagar las ULSC en un medio de crecimiento o medio de acondicionamiento;
[0068] b. Filtrar y concentrar el medio de crecimiento o el medio de acondicionamiento del paso a.;
[0069] c. Tratar el medio de crecimiento o el medio de acondicionamiento filtrado y concentrado del paso b. con proteasas y nucleasas para eliminar proteínas y ácidos nucleicos;
[0070] d. Tratar el medio de crecimiento o el medio de acondicionamiento tratado del paso c. con un detergente y un alcohol para eliminar los lípidos;
[0071] e. Recoger los glicosaminoglicanos del medios de crecimiento o del medio de acondicionamiento tratado del paso d.
[0073] En otra realización, Realización 2, la invención puede proporcionar un método de acuerdo con la Realización 1 en donde los glicosaminoglicanos se seleccionan entre uno o más de ácido hialurónico y sulfato de condroitina.
[0075] En otra realización, Realización 3, la invención puede proporcionar un método de acuerdo con la Realización 2 en donde el ácido hialurónico tiene un peso molecular de por lo menos 2500 kD.
[0077] En una realización final, Realización 4, la invención puede proporcionar un método de cualquiera de las Realizaciones 1 a 3 que comprende el paso adicional de purificar glicosaminoglicanos.
[0079] La presente invención logra sus objetos mediante métodos de propagación de ULSC que producen acumulaciones de glicosaminoglicanos (GAG) en medios acondicionados y dentro de la capa celular que puede ser recogidas para usos terapéuticos. Las maneras en las que la invención logra sus objetos y otros objetos que son inherentes a la invención se harán más evidentes cuando se haga referencia a los dibujos acompañantes.
[0081] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0082] FIGURA 1. Contiene histogramas de citoquinas y quimiocinas en medios acondicionados de ULSC y BMSC analizados mediante un sistema de inmunoensayo multiplexado cuantitativo (MAPs).
[0084] FIGURA 2. Contiene histogramas de la liberación del factor de crecimiento en medios acondicionados de ULSC y BMSC analizados mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
[0086] FIGURA 3. Contiene un análisis de electroforesis de carbohidratos asistida porfluoróforos (FACE) que demuestra el tamaño y la cantidad de ácido hialurónico (HA) y sulfato de condroitina (CS) en medios acondicionados de ULSC y BMSC.
[0088] FIGURA 4. contiene una imagen de un análisis del tamaño del hialuronano mediante electroforesis en gel de agarosa.
[0090] FIGURA 5. contiene una imagen de un análisis del tamaño de digestión de la hialuronidasa mediante electroforesis en gel de agarosa.
[0092] FIGURA 6. contiene un histograma que representa los niveles de HA y CS tanto en las muestras de medios acondicionados como en las células que produjeron dichos medios.
[0094] FIGURA 7. contiene una tabla de datos y una curva de absorbancia del colágeno en el medio acondicionado de ULSC analizado por dilución y análisis de absorbancia.
[0096] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0098] Se describen con detalle varias realizaciones de la invención y pueden ilustrarse mediante los ejemplos proporcionados. Como se usa en la descripción de la presente y a lo largo de las reivindicaciones siguientes, el significado de "un", "uno" y "el" incluye la referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, como se usa en la descripción de la presente, el significado de "en" incluye "en" y "sobre" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
[0100] A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, se entenderá que la palabra "comprender", o variaciones como "comprende" o "que comprende" implica la inclusión de un número entero o grupo de números enteros expuestos pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.
[0102] Los términos usados en esta memoria descriptiva tienen generalmente su significado ordinario en la técnica, en el contexto de la invención y en el contexto específico en el que se usa cada término. A continuación, o en otras partes de la memoria descriptiva, se analizan ciertos términos que se usan para describir la invención para proporcionar orientación adicional al profesional en la descripción de las composiciones y métodos de la invención y cómo elaboraros y usarlos. Por conveniencia, algunos términos pueden resaltarse, por ejemplo, usando cursivas y/o comillas. El uso del resaltado no influye en el alcance y significado de un término; el alcance y significado de un término es el mismo, en el mismo contexto, esté resaltado o no. Se apreciará que una misma cosa puede decirse de más de una manera. En consecuencia, el uso de un lenguaje alternativo y de sinónimos no excluye el uso de otros sinónimos. El uso de ejemplos en cualquier parte de esta memoria descriptiva, incluyendo ejemplos de cualquiertérmino analizado en la presente, es sólo ilustrativo, y no limita de ninguna manera el alcance de la invención siempre y cuando los datos sean procesados, muestreados, convertidos, o similares de acuerdo con la invención sin tener en cuenta ninguna teoría o esquema de acción en particular.
[0104] Además, siempre que se indique el nombre de un factor de crecimiento, citoquina, quimiocina o componente de la matriz extracelular específicos, se supone que incluye todos los homólogos, miembros de la familia y variantes de corte y empalme de ese factor que también puedan estar presentes.
[0106] En todos los ejemplos siguientes, de los cuales el Ejemplo 3 representa una realización preferida no limitativa de la invención y los Ejemplos 1, 2 y 4 no son de acuerdo con la invención sino que se presentan únicamente a efectos ilustrativos, se propagan líneas celulares de ULSC puras obtenidas de acuerdo con métodos del estado de la técnica (US 8778679) y líneas BMSC basándose en el siguiente protocolo. Los recipientes de cultivo se siembran con células a una densidad de 1x103 células por cm2 en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con bajo contenido en glucosa y un 15% de suero bovino fetal (FBS), en lo sucesivo denominado en la presente medio de expansión. Cada 3 días se sustituye el medio de expansión por medio de expansión recién preparado y estéril. Las ULSC se dejan crecer en una incubadora de CO<2>a 37°C hasta que alcanzan una confluencia del 80-90%. Una vez confluentes, el medio se sustituye por un medio de acondicionamiento estéril compuesto por un 98% de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI), un 2% de FBS, 1 mililitro (ml) de penicilina y estreptomicina 100x, 1 ml de aminoácidos no esenciales (NEAA) 100x, 1 ml de medio Eagle modificado (MEM) 100x, 1 ml de suplemento de insulina, transferrina y selenio (ITS) y 1 ml de suplemento de glutamina 100x. Los medios acondicionados se recogen a intervalos regulares en un recipiente estéril de tereftalato de polietileno (PET) que se almacena a -20°C y se sustituye por medios acondicionadores estériles recién preparados. El proceso de recogida de medios acondicionados por este método puede continuarse indefinidamente.
[0108] Cuando proceda en los ejemplos, los medios acondicionados pueden purificarse y concentrarse de acuerdo con el siguiente protocolo. Los medios acondicionados recogidos se descongelan a 4°C. Los lotes recogidos se agrupan y a continuación se filtran con un filtro de 0,22 micras (um). Los medios acondicionados filtrados se añaden al vaso de centrifugación del filtro de muestras, que a su vez se añade al vaso de recogida del filtrado, y la combinación se coloca en una centrifugadora equilibrada. La centrifugadora se hace girar hasta 3500xg hasta que se obtiene la concentración deseada, típicamente entre 50-90 minutos. A continuación los medios concentrados pueden transferirse desde el vaso de recogida de filtrado para su posterior aplicación según se desee.
[0110] EJEMPLO 1: ENSAYO DE CITOQUINAS Y QUIMIOCINAS
[0112] Se analizaron los medios de las ULSC, dos conjuntos del pase 3 y dos conjuntos del pase 6, tanto en medios de expansión como acondicionados y cuatro cultivos idénticos de BMSC para detectar la presencia de proteínas de citoquinas y quimioquinas mediante análisis de inmunoensayo multiplexado cuantitativo (MAPs). Las citoquinas y quimiocinas analizadas fueron: GM-CSF, INF-y, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-18, MIP-1 p Mc P-1, TNF-a. El análisis MAPs se basa en un sándwich de captura en el que los anticuerpos de captura se unen a microesferas codificadas fluorescentemente. Después de la captura del antígeno de una muestra biológica, como un medio de cultivo celular, el antígeno se detecta y se cuantifica usando anticuerpos de detección específicos acoplados a una sonda fluorescente. Los resultados obtenidos de este análisis se dieron como peso por volumen de cada analito. A continuación, los resultados se normalizaron por número de células del pocillo correspondiente.
[0114] Los resultados de la FIG. 1 demuestran que las ULSC expresan y secretan considerablemente más GM-CSF, IL-4, IL-7, IL-8, MIP-1p, MCP-1 y TNF-a que las BMSC. Las ULSC expresan todos los factores producidos por las BMSC y por lo menos siete factores más que no se encuentran en niveles significativos en las BMSC, Estos resultados son indicativos pero no exhaustivos de las citoquinas y quimioquinas que pueden estar presentes en los medios acondicionados y tejidos de cultivo celular de las ULSC. Otras citoquinas que pueden estar presentes incluyen las de las cuatro familias de citoquinas: la familia de los cuatro haces de hélices a (la subfamilia IL-2, la subfamilia del interferón, la subfamilia IL-10), la familia IL-1 (principalmente IL-1 e IL-18), la familia IL-17 y la familia de los nudos de cisteína (superfamilia del factor de crecimiento transformante beta que incluye TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3). Otras quimiocinas que pueden estar presentes son las de las cuatro clases que incluyen las quimiocinas C (XCL1 y XCL2), las quimiocinas CC (CCL1-CCL28), las quimiocinas CXC (CXCL1-CXCL17), las quimiocinas CX3C (CX3CL1).
[0115] EJEMPLO 2: ENSAYO DEL FACTOR DE CRECIMIENTO HUMANO
[0117] Se analizó la presencia de las proteínas de VEGF y SCF en los medios condicionados obtenidos de las ULSC y las BMSC mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Se recogieron medios acondicionados de un total de 12 cultivos, dos conjuntos de ULSC y dos conjuntos de BMSC a los 3, 6 y 9 días. Los controles probados incluyeron medios con un 2% de FBS, medios con un 0% de FBS, medios con un 0% más vitamina B3, ULSC en medio condro y ULSC en una placa transwell con un sedimento de condrocitos. El medio acondicionado concentrado de cada muestra se añadió a cada pocillo de la tira de prueba ELISA y se incubó durante una hora con agitación suave. La tira ELISA se lavó con tampón de ensayo para detener la reacción y se midió la densidad óptica de cada pocilio de la tira ELISA con un lector de microplacas a 450 nm.
[0119] Los resultados de la FIG. 2 demuestran que el SCF se expresa y secreta a un nivel considerablemente más alto en ambos conjuntos de ULSC en todos los puntos temporales en comparación con ambos conjuntos de BMSC. Los resultados también muestran que tanto las ULSC como las BMSC expresan niveles significativos de VEGF pero que después de 9 días las BMSC secretan menos VEGF que las ULSC. Estos ejemplos no limitativos son indicativos pero no exhaustivos de los factores de crecimiento que pueden estar presentes en los medios acondicionados y el tejido de cultivo celular de las ULSC. Otros factores de crecimiento que pueden estar presentes incluyen las proteínas de la familia del VEGF, las proteínas de la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF), las proteínas de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), las proteínas de la familia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), las proteínas de la familia de la angiopoyetina y las proteínas de la familia del factor neurotrófico derivado del cerebro.
[0121] EJEMPLO 3: ENSAYOS CON ÁCIDO HIALURÓNICO Y SULFATO DE CONDROITINA
[0123] Se recogió el medio tanto de las ULSC como de las BMSC diariamente o cada tercer día de los cultivos celulares propagados en medio de crecimiento o en medio de acondicionamiento. También se analizaron las capas celulares de cada pocillo. El medio filtrado y concentrado se trató con proteasas y nucleasas para eliminar proteínas y ácidos nucleicos, y después se trató con detergente y alcohol para eliminar lípidos, dejando una mezcla enriquecida con carbohidratos complejos que incluían glicosaminoglicanos (GAG). A continuación, la mezcla de GAG se trató con una enzima hialuronidasa que escinde los GAG en sus partes constituyentes. A continuación, se separaron los fragmentos de ácido hialurónico mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) o electroforesis en gel de agarosa.
[0125] E la FIG. 3, los GAG escindidos se trataron con ion mercúrico y, a continuación, se marcaron mediante aminación reductora dando una señal fluorescente idéntica para cada grupo reductor libre. A continuación, los productos marcados con fluoro se separaron mediante PAGE y se escanearon con una cámara CCD, analizándose después con un software de análisis cuantitativo de imágenes. Los resultados aquí mostrados demuestran la presencia de niveles significativos de HA y CS en los medios acondicionados tanto de las ULSC como de las BMS<c>. Estos ejemplos no limitativos son indicativos pero no exhaustivos de los constituyentes de la matriz extracelular que pueden estar presentes en los medios acondicionados y en el tejido de cultivo celular de las ULSC. Otros constituyentes de la matriz extracelular que pueden estar presentes incluyen: heparán sulfato, queratán sulfato, fibras de elastina, fibronectinas y lamininas.
[0127] En las FIG. 4 y FIG. 5, los GAG escindidos se separaron en un gel de agarosa y se tiñeron para su visualización antes de la imagenología. Los resultados de las FIG. 4 y FIG. 5 demuestran que una fracción considerable de la HA presente en los medios de los cultivos de ULSC y BMSC es de alto peso molecular, hasta por lo menos de 2500 kD. Cuando se digirieron adicionalmente con hialuronidasa (FIG.5), la HA se acumula en fragmentos de bajo peso molecular en la parte inferior del gel.
[0129] La FIG. 6 muestra una cuantificación de las cantidades de HA y CS presentes en las células y medios acondicionados de ULSC y BMSC. Las células ULSC tienen mayores cantidades de HA y CS en comparación con las BMSC, y las ULSC de los medios acondicionados produjeron más CS que las BMSC, mientras que los niveles de HA fueron similares.
[0131] EJEMPLO 4: ENSAYO DE COLÁGENO
[0133] Los estándares de colágeno se preparan en diluciones de 30, 3-1, 3-2, 3-3 y 3-4 a partir de 3 mg/ ml de stock en solución salina tamponada con fosfato. Se usan diez microlitros de medio acondicionado de ULSC para hacer muestras de colágeno por triplicado. La muestra A es medio de cultivo celular suplementado con un 2% de suero bovino fetal y un 1% de ITS acondicionado durante 2 días por ULSC confluentes. La muestra B es la muestra A concentrada 10 veces por filtro de centrifugación. La muestra C es la muestra B filtrada a través de papel Whatman de 3MM. Las muestras de prueba se depositan en un pocillo de un grupo de 96 pocillos y se secan al aire. La muestra A se prueba como diluciones 30, y 3-1; las muestras B y C se prueban como diluciones 30, 3-1, 3-2, y 3-3. Se añadieron cien microlitros de líquido de Bouin a cada pocillo y se incubaron a 37°C, durante 1 hora, en un recinto humidificado. El líquido de Bouin se eliminó por aspiración y el pocillo se lavó cinco veces, cada vez con 200 pl de agua desionizada, y se secó al aire. Se añadieron setenta y cinco microlitros de solución de preparación Sirius Red a cada pocillo, y también a un conjunto de 3 pocillos vacíos, que sirvieron como controles de fondo, y se incubaron a 37°C, durante 1 hora, en un recinto humidificado. La solución de colorante se eliminó por aspiración y el pocillo se lavó cinco veces, cada vez con 400 pl de agua desionizada, y se secó al aire. Se añadieron cien microlitros de NaOH 0,1 N a cada pocillo y se agitaron durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Se determinó la absorbancia a 540 nm (A 540) usando un lector de placas de microtitulación. Se trazaron las cantidades estándar de colágeno frente a los valores medios de A-540 para producir una curva estándar con la ecuación de mejor ajuste de dos variables. Se seleccionó un valor medio de A-540 de cada muestra de medio acondicionado para sustituir la variable de abscisas para proporcionar el valor de ordenadas, que se corrigió para el factor de dilución y el volumen de material usado para las pruebas (10 |jl) para proporcionar la concentración estimada de colágeno en el medio acondicionado original.
[0134] Los resultados de la FIG. 7 demuestran que el colágeno humano está presente a aproximadamente .28 miligramos/mililitro de medio acondicionado de ULSC y puede concentrarse fácilmente a 1 mg/ml.

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES
1. Un método de uso de células madre de revestimiento del cordón umbilical (ULSC) para producir glicosaminoglicanos, el método comprendiendo:
a. Propagar las ULSC en un medio de crecimiento o medio de acondicionamiento;
b. Filtrar y concentrar el medio de crecimiento o el medio de acondicionamiento del paso a.;
c. Tratar el medio de crecimiento o el medio de acondicionamiento filtrado y concentrado del paso b. con proteasas y nucleasas para eliminar proteínas y ácidos nucleicos;
d. Tratar el medio de crecimiento o el medio de acondicionamiento tratado del paso c. con un detergente y un alcohol para eliminar los lípidos;
e. Recoger los glicosaminoglicanos del medio de crecimiento o del medio de acondicionamiento tratado del paso d.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde los glicosaminoglicanos se seleccionan entre uno o más de ácido hialurónico y sulfato de condroitina.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el ácido hialurónico tiene un peso molecular de por lo menos 2500 kD.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende el paso adicional de purificar los glicosaminoglicanos.
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