ITTO20111183A1 - Mezzo condizionato ottenuto da cellule staminali mesenchimali placentari e suo uso nel trattamento terapeutico della preeclampsia - Google Patents
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Description
“Mezzo condizionato ottenuto da cellule staminali mesenchimali placentari e suo uso nel trattamento terapeutico della preeclampsiaâ€
DESCRIZIONE
La preeclampsia (PE) à ̈ una grave sindrome gravidica che colpisce circa il 5-10% delle gestanti, rappresentando una delle principali cause di mortalità e morbidità materno-fetale al mondo. La preeclampsia à ̈ un disordine multisistemico che si manifesta durante il terzo trimestre di gravidanza con una sintomatologia caratterizzata da ipertensione materna in donne precedentemente normotese, proteinuria maggiore di 0,3 grammi nell’arco della giornata ed edema generalizzato. Accanto alla compromissione dello stato di salute della gestante, la sindrome preeclamptica presenta notevoli fattori di rischio anche per il feto accompagnandosi generalmente a difetti di
accrescimento nell’utero (iposviluppo fetale intrauterino).
Nonostante nell’ultimo decennio la preeclampsia sia stata oggetto di intenso studio da parte della comunità clinico-scientifica, ad oggi l’eziopatogenesi di questa patologia rimane ancora poco chiara e l’unico trattamento efficace à ̈ in genere un tempestivo, e spesso prematuro, espletamento del parto. Anche nei casi di sopravvivenza del nascituro al parto pre-termine, tale intervento comporta comunque numerosi rischi, tra i quali la frequente insorgenza di malattie polmonari e retinopatie, eventi di paralisi cerebrale e ritardo mentale, patologie cardiovascolari e metaboliche, che possono peraltro manifestarsi anche in età adulta. Inoltre, nonostante la preeclampsia si risolva con il parto e la rimozione della placenta, essa può determinare gravi complicanze a lungo termine anche per la gestante. Tra queste, à ̈ stato riscontrato un significativo incremento di casi di ipertensione cronica, diabete mellito, patologia renale cronica e malattie cardiovascolari.
Sulla base di quanto precedentemente illustrato, Ã ̈ dunque evidente come questa grave
sindrome gravidica abbia importanti ricadute non soltanto a livello clinico ma anche socioeconomico. Rimane pertanto la necessità di mettere a disposizione terapie farmacologiche adeguatamente efficaci che consentano di agire sul vasto spettro di fattori eziopatogenetici tipici della preeclampsia, permettendo in tal modo di prolungare la durata della gravidanza e di evitare danni gravi e potenzialmente irreversibili sia alla madre che al nascituro.
Sebbene la PE si manifesti improvvisamente durante il terzo trimestre di gestazione, essa origina verosimilmente durante il primo trimestre, periodo durante il quale ha inizio il delicato processo di differenziamento e invasione del trofoblasto. Studi isto-morfologici hanno infatti evidenziato come le gravidanze preeclamptiche siano caratterizzate da un alterato processo di placentazione con un difettivo rimodellamento delle arterie spirali materne dovuto alla scarsa invasione della decidua da parte del trofoblasto. Queste alterazioni comportano una riduzione protratta della perfusione utero-placentare, con conseguente induzione di danno ischemico e liberazione di sostanze tossiche responsabili di
una esacerbata risposta infiammatoria maternoplacentare e danno endoteliale generalizzato. Un ruolo chiave nell’instaurazione e propagazione delle risposte infiammatorie à ̈ svolto dal fattore TNF-alfa (“Tumor necrosis factor alpha†), per il quale à ̈ stato osservato un significativo incremento dei livelli di espressione nelle placente e nel siero di pazienti colpite da preeclampsia rispetto a gestanti con gravidanze con decorso fisiologico. E’ noto inoltre che il TNF-alfa à ̈ co-responsabile della ridotta invasività del trofoblasto tipica di questa sindrome gravidica.
La placenta à ̈ un organo complesso formato da tessuti diversi tra i quali il mesenchima, che costituisce la componente cellulare più numerosa. Studi recenti hanno dimostrato la presenza a livello del mesenchima placentare e delle membrane amniotiche di una particolare popolazione cellulare con fenotipo mesenchimale-staminale (Huang YC, Yang ZM, Chen XH, Tan MY, Wang J, Li XQ, et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human placental decidua basalis and resistance to hypoxia and serum deprivation. Stem Cell Rev.
2009;5(3):247-55). Queste cellule, denominate cellule staminali mesenchimali placentari (PDMSC),
sono caratterizzate da un elevatissimo potenziale proliferativo, differenziativo e di autorinnovamento (“self-renewal†), nonché dalla capacità di esplicare un'azione immunosoppressiva ed anti-infiammatoria. A tali caratteristiche si accompagna inoltre il ruolo che le PDMSC svolgono nei meccanismi di regolazione dei processi di riparazione e proliferazione cellulare a carico delle cellule circostanti. RÃ1⁄4ster B. e colleghi hanno osservato che le MSC possiedono la capacità di migrare spontaneamente verso organi e tessuti danneggiati per prendere parte al processo riparativo (RÃ1⁄4ster B, Göttig S, Ludwig RJ, Bistrian R, MÃ1⁄4ller S, Seifried E, et al. Mesenchymal stem cells display coordinated rolling and adhesion behavior on endothelial cells. Blood.
2006;108(12):3938-44).
Sulla base delle singolari proprietà di plasticità funzionale e potenziale differenziativo sopra descritte nonché della facilità di accesso e utilizzo della placenta in quanto tale, le cellule staminali mesenchimali placentari sono diventate oggetto di studio principalmente nel campo della medicina rigenerativa. Ad ulteriore supporto dell’impiego clinico in questo campo, à ̈ l’assenza
di immunogenicità che caratterizza queste popolazioni mesenchimali staminali, dovuta essenzialmente alla mancanza di espressione di HLA di tipo II e di molecole co-stimolatorie (CD80, CD86, CD40) necessarie per la stimolazione diretta dei linfociti T, nonché alla resistenza alla lisi da parte dei linfociti T citotossici. Le particolari caratteristiche immunologiche di queste cellule suggeriscono un loro ruolo determinante nel mantenimento della tolleranza materno-fetale.
Come verrà illustrato più in dettaglio nella parte sperimentale che segue, i presenti inventori hanno osservato che il mezzo condizionato (“conditioned medium†, CM) prodotto dalla coltura di cellule staminali mesenchimali placentari in un mezzo di coltura liquido esplica un sorprendente effetto anti-infiammatorio su espianti villari da placenta prelevati da gestanti affette da preeclampsia. In particolare, à ̈ stato rilevato che il trattamento degli espianti placentari patologici con il mezzo condizionato da coltura di PDMSC prelevate dalla placenta di gestanti non affette da preeclampsia, induce una significativa e sorprendente riduzione dell’espressione a livello
genico della potente citochina pro-infiammatoria TNF-alfa.
Ciò consente pertanto di utilizzare in maniera efficace il mezzo condizionato ottenibile dalla coltura di cellule staminali mesenchimali placentari in un mezzo di coltura liquido per il trattamento terapeutico della preeclampsia.
Allo scopo di identificare le proteine secrete dalle cellule PDMSC e che con maggiore probabilità contribuiscono di concerto agli effetti benefici del CM precedentemente descritti, gli inventori hanno sottoposto il mezzo suddetto ad analisi proteomica mediante impiego di un array commerciale di anticorpi atti a riconoscere specificamente e simultaneamente una pluralità di citochine, chemochine e fattori di crescita. I risultati dello studio proteomico hanno consentito di rivelare la presenza di numerosi fattori indicati nel seguito, tra i quali sono essenziali l’interleuchina-6 (IL-6), l’interleuchina-10 (IL-10) e la proteina chemotattica monocitaria 1 (MCP-1).
Quindi, forma oggetto dell’invenzione un mezzo condizionato ottenibile coltivando una cellula staminale mesenchimale placentare prelevata dalla placenta di gestanti non affette da preeclampsia in
un terreno di coltura liquido, e comprendente almeno i fattori IL-6, IL-10 e MCP-1. Tale mezzo condizionato à ̈ particolarmente adatto per l’uso nel trattamento terapeutico della preeclampsia. Formano altresì oggetto dell’invenzione un procedimento per produrre il mezzo condizionato, una cellula staminale mesenchimale placentare, preferibilmente di origine coriale o amniotica, per l’uso nel trattamento terapeutico della preeclampsia, l’uso del mezzo condizionato o della cellula staminale mesenchimale come sopra definita per la preparazione di un medicamento per il trattamento terapeutico della preeclampsia, il tutto come definito nelle annesse rivendicazioni, che formano parte integrante della presente descrizione.
Nell’ambito della presente descrizione il termine “cellula staminale mesenchimale placentare†indica una cellula staminale mesenchimale derivata dalla placenta di una gestante non affetta da preeclampsia. L’efficacia terapeutica di tali cellule appare alquanto sorprendente, considerato che il mezzo condizionato ottenuto coltivando cellule mesenchimali staminali di placente preeclamptiche non esercita su espianti placentari patologici alcun effetto anti-infiammatorio, come
invece descritto in relazione al medesimo tipo cellulare isolato da placente da gravidanze fisiologiche.
Le cellule staminali mesenchimali di origine placentare possono appartenere a popolazioni diverse, sulla base del tessuto placentare di origine. La placenta umana à ̈ infatti un organo unico nella sua struttura, che comprende sia tessuti di origine fetale, quali il corion (corion frondoso e corion liscio)e l’amnion, che tessuti di origine materna, quale la decidua.
In una forma di realizzazione preferita, il mezzo condizionato dell’invenzione à ̈ ottenibile dalla coltura di una cellula staminale mesenchimale placentare di origine coriale. Preferibilmente, la cellula mesenchimale staminale coriale presenta le caratteristiche antigeniche di superficie illustrate nella tabella sottostante, che sono state rilevate mediante analisi per citofluorimetria.
Marcatore Analisi citofluorimetrica HLA I
CD105 (Endoglina)
CD166 (ALCAM)
CD90 (Thy-1)
9
CD73 (5’-nucleotidasi)
CD34 -HLA-DR -CD133 (Prominin-1) -CD20 -CD326 (EpCAM) -CD31 (PECAM-1) -CD45 (PTPRC) -CD14 -In alternativa, per la preparazione del terreno condizionato può essere utilizzata una cellula mesenchimale staminale derivata dall’amnion, la quale presenta le caratteristiche antigeniche di superficie illustrate nella suddetta tabella.
Il mezzo condizionato dell’invenzione comprende almeno i fattori IL-6, IL-10 e MCP-1, note citochine di secrezione cellulare capaci di esercitare una sensibile azione anti-infiammatoria.
In particolare, il meccanismo antiinfiammatorio dell’interleuchina-6 coinvolge sia l’inibizione della produzione di TNF-alfa che l’induzione allo stesso tempo del rilascio di interleuchina-10, fattore che opera a sua volta inibendo la sintesi di citochine. L’effetto anti-
infiammatorio della citochina MCP-1 risulta invece mediato da una potente azione inibitoria nei confronti delle popolazioni cellulari linfocitarie.
Accanto alle citochine sopra-descritte, l’analisi del mezzo condizionato da cellule PDMSC condotta mediante impiego del kit RayBio® Human Cytokine Antibody Array 5 ha rivelato la presenza di ulteriori modulatori funzionali secreti dalle cellule staminali mesenchimali placentari, identificando in tal modo un distinto profilo di espressione proteica.
Pertanto, in un’ulteriore forma di realizzazione il mezzo condizionato dell’invenzione comprende le proteine di seguito elencate: ENA-78, GCSF, GRO, GRO-alfa, IL-6, IL-7, IL-8, MCP-1, MCP-2, MCSF, MDC, ANGIOGENIN, ONCOSTATIN m, VEGF, BDNF, BLC, CKb 8-1, EOTAXIN 2, EOTAXIN 3, FLT-3 LIGAND, FRACTALKINE, GCP-2, GDNF, HGF, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, IP-10, LIF, LIGHT, MCP-4, MIF, MIP-3alpha, NAP-2, NT-3, OSTEOPONTIN , OSTOPROTEGERIN, TGF-beta 2, TIMP-1 e TIMP-2.
In aggiunta, l’analisi delle citochine che à ̈ stata eseguita non ha rilevato nel mezzo condizionato dell’invenzione le seguenti proteine, in quanto assenti o presenti in concentrazioni
minime e/o inferiori al limite di rilevabilità del sistema array utilizzato: GM-CSF, I-309, IL-1°, IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 p40p70, IL-13, IL-15, IFN-gamma, MCP-3, MIG, MIP-1, RANTES, SCF, SDF-1, TARC, TGF-beta 1, TNF-alfa, TNF-beta, EGF, IGF-I, THROMBOPOIETIN, PDGF-bb, LEPTIN, EOTAXIN, FGF 4, FGF 6, FGF 7, FGF 9, IGFBP-3, IGFBP-4, IL-16, NT-4, PARC, PIGF, TGF-beta 3.
In una forma di attuazione preferita, il mezzo condizionato à ̈ usato per il trattamento terapeutico della preeclampsia.
Pertanto un altro oggetto dell’invenzione à ̈ il mezzo condizionato della presente invenzione per il trattamento terapeutico della preeclampsia.
In virtù della caratteristica mancanza di immunogenicità presentata dalle cellule PDMSC, il mezzo condizionato dell’invenzione può comprendere una frazione cellulare che consiste delle cellule mesenchimali staminali placentari da cui à ̈ stato ottenuto. Alternativamente, il mezzo condizionato può essere privo di elementi cellulari.
In alternativa al mezzo condizionato, Ã ̈ possibile usare cellule staminali mesenchimali placentari da placenta di gestante non affetta da preeclampsia, preferibilmente di origine coriale o,
in alternativa, derivate dall’amnion, per il trattamento terapeutico della preeclampsia.
Come precedentemente sottolineato, la definizione placentare indica la derivazione da placente provenienti da gestanti portatrici di gravidanze con decorso fisiologico.
Pertanto, un ulteriore oggetto dell’invenzione à ̈ una cellula staminale mesenchimale placentare da placenta di gestante non affetta da preeclampsia, preferibilmente di origine coriale o, in alternativa, derivata dall’amnion, per l’uso nel trattamento terapeutico della preeclampsia.
Nell’ambito della presente invenzione rientra anche un procedimento per ottenere il mezzo condizionato precedentemente descritto, che comprende le fasi di:
(i) coltivare una cellula staminale mesenchimale placentare da placenta di gestante non affetta da preeclampsia in un mezzo di coltura basale liquido privo di siero per almeno 3 ore;
(ii) separare la frazione cellulare dal mezzo di coltura liquido.
Nel contesto della presente descrizione il termine “basale†si intende riferito ad un mezzo di coltura che contiene sali inorganici, aminoacidi e
vitamine normalmente necessari per supportare la crescita di cellule di mammifero che non abbiano particolari esigenze nutrizionali. A titolo esemplificativo e non limitativo, si citano i seguenti mezzi di coltura in forma liquida che differiscono tra loro essenzialmente per il contenuto di sali ed aminoacidi: il Basal Medium Eagles (BME), il Minimum Essential Medium (MEM), il Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), il Nutrient Mixture F-10 (HAM's F-10) e il Nutrient Mixture F-12 (HAM's F-12). La selezione del mezzo di coltura più adeguato rientra nelle capacità del tecnico medio del settore.
Secondo il procedimento dell’invenzione, il mezzo di coltura non à ̈ addizionato con siero onde evitare che i fattori di crescita contenuti nel siero possano interferire ed alterare gli effetti prodotti dagli specifici fattori secreti dalle cellule PDMSC.
Prima di prelevare il mezzo condizionato, le cellule staminali mesenchimali placentari sono lasciate in coltura per un tempo sufficiente a consentire la loro adesione al substrato di coltura, la loro moltiplicazione e la secrezione dei componenti che caratterizzano il suddetto mezzo
e che lo rendono vantaggiosamente efficace per il trattamento terapeutico della preeclampsia. In una forma di realizzazione preferita le cellule staminali mesenchimali placentari sono coltivate per almeno 3 ore, preferibilmente per almeno 12, almeno 24 ore, almeno 48 ore, almeno 72 ore o anche più.
Allo scopo di operare la separazione della frazione cellulare dal mezzo condizionato da cellule PDMSC, possono essere impiegati metodi diversi. Ad esempio, il mezzo condizionato dell’invenzione può essere sottoposto a filtrazione utilizzando complessi filtranti di adeguata porosità che consentano di trattenere gli elementi cellulari ed i loro residui in sospensione. Alternativamente, la separazione del mezzo condizionato dalle cellule PDMSC da cui à ̈ stato ottenuto può essere conseguita mediante centrifugazione e conseguente sedimentazione delle cellule stesse. Pertanto, in una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, la fase di separazione del mezzo condizionato dell’invenzione dalla componente cellulare viene eseguita mediante filtrazione o centrifugazione o la combinazione di entrambe. La scelta delle procedure di separazione
rientra ampiamente nelle conoscenze e nelle capacità del tecnico medio del settore.
Al fine di esercitare un efficace effetto terapeutico, il mezzo condizionato dell’invenzione o la cellula staminale dell’invenzione sono somministrati alle gestanti affette da questa sindrome. Pertanto, un ulteriore oggetto dell’invenzione à ̈ l’uso di un mezzo condizionato come definito o di una cellula staminale come definiti nelle annesse rivendicazioni, per la preparazione di un medicamento per il trattamento terapeutico della preeclampsia.
Preferibilmente, il medicamento à ̈ in una forma farmaceutica idonea alla somministrazione per via sistemica, più preferibilmente per iniezione, allo scopo di garantire la sua diffusione in circolo. Naturalmente nell’ambito della presente invenzione rientra l’impiego di sistemi iniettivi di qualsiasi tipologia, la cui selezione rientra nelle capacità del tecnico medio del settore
Gli esempi che seguono sono forniti a scopo illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione come definita nelle annesse rivendicazioni.
ESEMPIO 1: Isolamento di Cellule Staminali
Mesenchimali da Placenta (PDMSCs)
Le cellule mesenchimali staminali placentari (Placenta-derived Mesenchymal Stem Cells - PDMSCs) sono state isolate da placente ottenute da gestanti sane e normotese, con decorso fisiologico della gravidanza. La raccolta delle placente e il successivo campionamento di tessuto placentare à ̈ stato eseguito dopo il parto previo ottenimento del consenso informato ed in accordo con le linee guida del comitato etico interaziendale O.I.R.M. Sant’Anna – Ospedale Mauriziano di Torino. Sono state escluse gravidanze affette da malformazioni congenite, anomalie cromosomiche (strutturali o numeriche), patologie infettive, cardiovascolari e metaboliche (diabete mellito).
Dalla placenta sono state separate meccanicamente le membrane (amnion e corion liscio) e la placenta.
Dal piatto basale placentare (porzione della placenta formata dai villi coriali placentari e a contatto con la parete uterina) sono state prelevate biopsie di tessuto a tutto spessore previa rimozione meccanica della decidua basale (costituita da cellule endometriali materne modificate dall’interazione con il
sinciziotrofoblasto).
Le biopsie di sono state successivamente sottoposte a ripetuti lavaggi a temperatura ambiente con HBSS (Hank’s Buffered Salt Solution, in soluzione acquosa) sterile (Gibco, Invitrogen by Life Technologies), sino alla completa rimozione del sangue in eccesso.
Le biopsie sono state quindi omogenizzate meccanicamente e sottoposte a digestione enzimatica con 100 U/ml di Collagenasi I (Gibco, Invitrogen by Life Technologies) e 5 Î1⁄4g/ml di Desossiribonucleasi I (DNAsi I, Invitrogen by Life Technologies) in DMEM LG (Dulbecco’s Modified Minimum Essential Medium Low Glucose senza L-glutamina e senza Fetal Bovine Serum-FBS) a 37°C per 3 ore in bagnetto termostatato con agitatore.
La sospensione cellulare così ottenuta à ̈ stata sottoposta a centrifugazione per 5 secondi a 540g alla temperatura di 4°C al fine di rimuovere il particolato non digerito. Il surnatante à ̈ stato raccolto e filtrato attraverso filtri Cells strainer con pori di 70 micron di diametro. Dopo la filtrazione, la soluzione à ̈ stata centrifugata a 540g per 5 minuti alla temperatura di 4°C al fine di ottenere la sedimentazione delle cellule. Il
surnatante à ̈ stato quindi scartato e le cellule sono state risospese in HBSS sterile (30 ml per ogni 30 grammi di tessuto originario).
Sotto la soluzione così ottenuta à ̈ stato stratificato un volume di Ficoll Paque Premium 1.073 (GE Healthcare Europe) nella proporzione di 1:3 rispetto al volume di partenza. Il preparato à ̈ stato centrifugato a 540 g per 20 minuti a 20°C e l’anello di cellule mononucleate posizionato nella fase centrale del gradiente à ̈ stato raccolto, risospeso in HBSS (50ml per ogni 30 grammi di tessuto originario) e centrifugato a 540g per 10 minuti a 20°C al fine di rimuovere i residui di Ficoll.
Dopo la centrifugazione, il surnatante à ̈ stato scartato e le cellule risospese in DMEM LG addizionato con 10% di FBS (Gibco, Invitrogen by Life Technologies) e Gentamicina 0.1%. Le cellule sono state infine piastrate in fiasche da coltura cellulare e incubate a 37°C in presenza del 5% di CO2.
Le cellule sono state mantenute in coltura a 37°C ed in presenza del 5% di CO2. Al raggiungimento del 90% di confluenza, le cellule in coltura sono state dissociate mediante trattamento
con tripsina TrypLE Express (tripsina di origine vegetale senza derivati animali certificata GMP, Invitrogen by Life Technologies, al fine di promuoverne l’espansione.
Per l’isolamento delle cellule staminali mesenchimali dell’amnion, le membrane sono state sottoposte a ripetuti lavaggi a temperatura ambiente con HBSS (Hank’s Buffered Salt Solution, in soluzione acquosa) sterile e l’amnion e il corion sono stati ulteriormente separati meccanicamente e l’amnion à ̈ stato sottoposto a protocollo di digestione enzimatica, separazione e coltura come sopra descritto per le cellule mesenchimali staminali derivate dal piatto basale placentare (porzione coriale).
ESEMPIO 2: Caratterizzazione delle cellule PDMSC Le cellule staminali mesenchimali isolate dalle placente fisiologiche (piatto basale-porzione coriale) a termine come descritto nell ́Esempio 1, sono state caratterizzate mediante citofluorimetria analizzando i principali marcatori antigenici di superficie tipici di questo tipo cellulare.
La presenza o l’assenza di tali antigeni à ̈ stata valutata utilizzando anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromi (Myltenyi, Bologna,
Italia). Attraverso la misurazione della fluorescenza à ̈ stato possibile verificare che tutte le linee cellulari di PDMSC sono positive per l’espressione dei marcatori di superficie CD105, CD166, CD90 e CD73 e negative per l’espressione di HLAII, CD34, CD133, CD20, CD326, CD31, CD45 e CD14, mostrando così un appropriato fenotipo mesenchimale ed escludendo la presenza di possibili contaminazioni da parte di cellule trofoblastiche/epiteliali e di progenitori ematopoietici. Inoltre, l’analisi del fenotipo cellulare à ̈ stata anche condotta mediante esperimenti di RT-PCR dai quali à ̈ emerso che tutte le PDMSC esprimono anche i geni tipici delle cellule staminali embrionali, Oct4 (Octamer-binding transcription factor 4) e NANOG (Homeobox protein NANOG).
Al fine di valutare le caratteristiche di staminalità delle suddette cellule, al terzo passaggio di coltura le PDMSCs sono state esaminate per il loro potenziale differenziativo in tre diversi lineage: osteoblasti, adipociti e condroblasti. Il differenziamento à ̈ stato ottenuto mediante l’utilizzo di specifici medium di induzione. Per la differenziazione osteogenica, le
colture cellulari sono state incubate in α-MEM addizionato con 20% di FCS, 100 U/ml penicillina, 100 Î1⁄4g/ml streptomicina, 2 mM L-glutammina, 20 mM β-glicerolo fosfato, 100 nM desametasone e 250 Î1⁄4M ascorbato 2-fosfato. Per la differenziazione adipogenica, le colture cellulari sono state incubate con α-MEM addizionato con 20% FCS, 100 U/ml penicillina, 100 Î1⁄4g/ml streptomicina, 12 mM L-glutammina, 5 Î1⁄4g/ml insulina, 50 Î1⁄4M indometacina, 1x10-6 M desametasone e 0,5 Î1⁄4M 3-isobutil-1-metilxantina. Per la differenziazione condrogenica, le colture sono state incubate in Chondrocyte Basal Medium addizionato con R3-IGF-1 1mL, bFGF 2.5 ML, transferring 0.5 mL, insulina bovin 1 M, FBS 25 mL e gentamicina/amfotericina-B 0.5mL. Il mezzo à ̈ stato cambiato due volte a settimana per tre settimane. L’avvenuta differenziazione cellulare à ̈ stata valutata utilizzando opportune colorazioni. La differenziazione osteoblastica à ̈ stata valutata con la colorazione Alizarin Red S. L’Alizarina determina la formazione di lacche calciche insolubili ed intensamente colorate, permettendo di mettere in evidenzia la matrice ossea. La differenziazione condrogenica à ̈ stata valutata mediante colorazione Alcian Blue che forma ponti
salini tra i polianioni dei mucopolisaccaridi acidi e permette di colorare di blu i glicosaminoglicani. La differenziazione adipogenica à ̈ stata evidenziata con colorazione Oil Red O che mette in evidenza i lipidi solubilizzati dal solvente presente nella soluzione colorante ed i depositi di grasso risultano di colore rosso.
ESEMPIO 3: Produzione del mezzo condizionato Allo scopo di ottenere il mezzo condizionato dell ́invenzione, le cellule PDMSC sono state piastrate tra il terzo e il quinto passaggio di coltura, al raggiungimento dell’adeguato grado di purezza dimostrato dall’assenza di contaminanti trofoblastiche e/o emopoietiche derivanti dal tessuto placentare originario. Più specificamente, le cellule sono state piastrate ad una confluenza di 1x10<5>cellule per millilitro in DMEM LG senza Siero Fetale Bovino (FBS), alla temperatura di 37°C ed in presenza di 5% di CO2. Le cellule PDMSC sono state mantenute in coltura per un tempo che variabile da almeno 3 ore ad una settimana o più. I mezzi condizionati di coltura sono stati quindi raccolti a tempi prestabiliti, e sottoposti successivamente a centrifugazione e/o filtrazione, al fine di rimuovere i detriti cellulari
contaminanti. Ove necessario, i mezzi condizionati così ottenuti possono essere conservati mediante congelamento a -80°C.
ESEMPIO 4: Analisi del mezzo condizionato mediante Array di Citochine
Allo scopo di investigare il profilo delle citochine secrete dalle cellule PDMSC e presenti nel mezzo condizionato dell’invenzione, à ̈ stato impiegato il kit commerciale RayBio® Human Cytokine Antibody Array 5, secondo le indicazioni del produttore, che consente l’analisi simultanea di 80 diverse citochine nel medesimo campione. In particolare, la procedura si basa sull’impiego di una membrana array su cui sono state immobilizzate molecole anticorpali atte a riconoscere specificamente e catturare le citochine eventualmente presenti nel campione in esame. Nel contesto del presente esperimento, i segnali generati sulla membrana array in corrispondenza dei siti di formazione degli immunocomplessi sono stati quantificati mediante analisi densitometrica, utilizzando il software ImageQuant. I livelli di espressione delle citochine così identificate non sono stati determinati in misura assoluta, bensì normalizzati come valore percentuale rispetto ad un
gruppo di controlli standard inclusi nel kit, assegnando ai controlli positivi il valore 100% e ai controlli negativi il valore 0%. I risultati dell’esperimento sopra descritto sono riportati nella tabella che segue:
Proteina % rispetto al campione standard ENA-78 17,4%
GCSF 3,8%
GRO 74,4%
GRO-alfa 13%
IL-6 119,4%
IL-7 19,4%
IL-8 97,5%
MCP-1 53,2%
MCP-2 1,0%
MCSF 4,4%
MDC 5,0%
ANGIOGENIN 11,5%
ONCOSTATIN m 7,6%
VEGF 13,3%
BDNF 2,3%
BLC 3,3%
CKb 8-1 6,0%
EOTAXIN 2 4,2%
EOTAXIN 3 2,1%
FLT-3 LIGAND 1,4%
FRACTALKINE 6,1%
GCP-2 6,2%
GDNF 5,1%
HGF 8,6%
IGFBP-1 4,0%
IGFBP-2 10,3%
IGFBP-4 3,1%
IP-10 1,7%
LIF 1,0%
LIGHT 2,0%
MCP-4 20,8%
MIF 4,6%
MIP-3alfa 3,3%
NAP-2 8,6%
NT-3 11,4%
OSTEOPONTIN 25,3%
OSTOPROTEGERIN 12,0%
TGF-beta 2 1,68%
TIMP-1 23,4%
TIMP-2 48,4%
Inoltre, l’analisi delle citochine che à ̈ stata eseguita non ha rilevato nel mezzo condizionato dell’invenzione le seguenti proteine, in quanto assenti o presenti in concentrazioni inferiori al
limite di rilevabilità del sistema array utilizzato: GM-CSF, I-309, IL-1°, IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 p40p70, IL-13, IL-15, IFN-gamma, MCP-3, MIG, MIP-1, RANTES, SCF, SDF-1, TARC, TGF-beta 1, TNF-alfa, TNF-beta, EGF, IGF-I, THROMBOPOIETIN, PDGF-bb, LEPTIN, EOTAXIN, FGF 4, FGF 6, FGF 7, FGF 9, IGFBP-3, IGFBP-4, IL-16, NT-4, PARC, PIGF, TGF-beta 3.
ESEMPIO 5: Valutazione dell’efficacia terapeutica del mezzo condizionato ottenuto da coltura di cellule PDMSC
Allo scopo di valutare l’efficacia terapeutica del mezzo condizionato dell’invenzione, sono stati condotti studi su un modello in vitro rappresentato da espianti villari prelevati da placente ottenute da pazienti con gravidanze affette da preeclampsia e restrizione di crescita fetale. In particolare, à ̈ stato verificato se il trattamento dei suddetti espianti con il mezzo condizionato dell’invenzione inducesse una riduzione dei livelli di espressione del fattore TNF-alfa quale indicazione di una significativa azione anti-infiammatoria. Come precedentemente illustrato, diverse evidenze clinico-sperimentali hanno infatti dimostrato che questa potente citochina pro-infiammatoria à ̈ sovra-
espressa sia nelle placente che nel siero di gestanti affette da preeclampsia.
Le colture di 24 espianti villari prelevati da placente preeclamptiche sono state sottoposte a trattamento per 48 ore con il mezzo condizionato ottenuto coltivando per 48 ore cellule PDMSC isolate da placente di gravidanze con decorso fisiologico, come precedentemente descritto nell’Esempio 3.
La raccolta delle placente e il successivo campionamento di tessuto placentare à ̈ stato eseguito dopo il parto previo ottenimento del consenso informato ed in accordo con le linee guida del comitato etico interaziendale O.I.R.M. Sant’Anna – Ospedale Mauriziano di Torino. La diagnosi di preeclampsia à ̈ stata condotta secondo i seguenti criteri: insorgenza di ipertensione indotta dalla gravidanza (pressione sistolica ≥ 140 mmHg o pressione diastolica ≥ 90mmHg) e proteinuria (≥ 300 mg/24 ore) dopo le venti settimane di età gestazionale in donne precedentemente normotese. In totale, ventiquattro espianti costituiti da una porzione di albero villare con morfologia e struttura conservata e di pari peso, sono stati sezionati dal piatto basale placentare e mantenuti
in 500 Î1⁄4l di terreno HAM F12 senza FBS per 12 ore alla temperatura di 37°C ed in presenza di 5% di CO2al fine di riequilibrare le loro condizioni a seguito dello stress post-partum. Trascorse 12 ore, il terreno à ̈ stato sostituito con 500 Î1⁄4l di mezzo condizionato (in 12 espianti) o alternativamente con 500 Î1⁄4l di terreno DMEM LG senza siero (in 12 espianti di controllo). Le colture sono state incubate nelle medesime condizioni per ulteriori 48 ore. Al termine dell’esperimento, i dodici espianti trattati ed i dodici espianti di controllo sono stati collezionati e processati per l’isolamento dell’mRNA utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen Life Techonologies), seguendo il protocollo della casa produttrice. Una volta isolato, il messaggero à ̈ stato purificato mediante trattamento con DNAasi (Sigma-Aldrich) al fine di rimuovere eventuali contaminazioni da DNA genomico. La quantità dell’RNA estratto à ̈ stata determinata tramite lettura spettrofotometrica alla lunghezza d’onda di 260 nm, mentre la purezza à ̈ stata stimata tramite i rapporti d’assorbanza A260/A280 a 1,8-2.
Il cDNA (DNA complementare) utile per la successiva analisi dei livelli di espressione del
TNF-alfa à ̈ stato sintetizzato a partire da 5 Î1⁄4g di RNA totale precedentemente estratto, mediante RT-PCR utilizzando un approccio random hexamers con il kit RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis (Fermentas Life Science) secondo il protocollo consigliato dalla ditta.
L ́analisi delle variazioni di espressione genica del TNF-alfa a seguito del trattamento delle colture villari con il mezzo condizionato dell’invenzione à ̈ stata condotta mediante Real Time PCR utilizzando primers e probes TaqMan (Applied Biosystem). Al fine di operare una quantificazione relativa, i segnali della Real Time PCR sono stati comparati tra i due gruppi di campioni in esame dopo la normalizzazione con i segnali ottenuti per la subunità ribosomiale 18S, utilizzata come referenza interna.
I risultati dell’analisi di espressione genica differenziale, rappresentati dall ́istogramma di Figura 1, dimostrano chiaramente che il trattamento con il mezzo condizionato (CM) dell ́invenzione ha portato ad una riduzione statisticamente significativa dei livelli di espressione genica del TNF-alfa negli espianti villari preeclamptici trattati rispetto ai controlli (C) (p=0.015).
Claims (15)
- RIVENDICAZIONI 1. Mezzo condizionato ottenibile mediante coltura di una cellula staminale mesenchimale placentare da placenta di gestante non affetta da preeclampsia in un mezzo di coltura liquido, il mezzo condizionato comprendendo almeno l’interleuchina-6 (IL-6), l’interleuchina-10 (IL-10) e la proteina chemotattica monocitaria 1 (MCP-1).
- 2. Mezzo condizionato secondo la rivendicazione 1, in cui la cellula staminale placentare à ̈ di origine coriale o amniotica.
- 3. Mezzo condizionato secondo la rivendicazione 1 o 2, che à ̈ esente da cellule.
- 4. Mezzo condizionato secondo la rivendicazione 3, che à ̈ ottenibile mediante un procedimento comprendente le fasi di: (i) coltivare una cellula staminale mesenchimale placentare in un mezzo di coltura basale liquido privo di siero e L-glutammina per almeno 3 ore; (ii) separare la frazione cellulare dal mezzo di coltura liquido.
- 5. Mezzo condizionato secondo la rivendicazione 4, in cui il tempo di coltura à ̈ di almeno 6 ore o almeno 12 ore o almeno 48 ore o almeno 72 ore.
- 6. Mezzo condizionato secondo la rivendicazione 5, in cui la frazione cellulare à ̈ separata dal mezzo di coltura liquido mediante filtrazione e/o centrifugazione.
- 7. Mezzo condizionato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, per l’impiego nel trattamento terapeutico della preeclampsia.
- 8. Procedimento per la preparazione di un mezzo condizionato, comprendente le fasi di: (i) coltivare una cellula staminale mesenchimale placentare da placenta di gestante non affetta da preeclampsia in un mezzo di coltura basale liquido privo di siero per almeno 6 ore; (ii) separare la frazione cellulare dal mezzo di coltura liquido.
- 9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui il tempo di coltura à ̈ di almeno 6 ore o almeno 12 ore o almeno 48 ore o almeno 72 ore.
- 10. Procedimento secondo la rivendicazione 9, in cui la frazione cellulare à ̈ separata dal mezzo di coltura liquido mediante filtrazione e/o centrifugazione.
- 11. Cellula staminale mesenchimale placentare da placenta di gestante non affetta da preeclampsia per l’impiego nel trattamento terapeutico della preeclampsia.
- 12. Cellula staminale mesenchimale placentare secondo la rivendicazione 11, che à ̈ di origine coriale o amniotica.
- 13. Uso di un mezzo condizionato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7 o di una cellula staminale mesenchimale placentare secondo la rivendicazione 11 o 12, per la preparazione di un medicamento per il trattamento terapeutico della preeclampsia.
- 14. Uso secondo la rivendicazione 13, in cui il medicamento à ̈ una forma farmaceutica idonea alla somministrazione per via sistemica.
- 15. Uso secondo la rivendicazione 14, in cui la somministrazione à ̈ per iniezione.
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