ES3042252T3

ES3042252T3 - Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells

Info

Publication number: ES3042252T3
Application number: ES20189453T
Authority: ES
Inventors: Jay Neitz; Maureen Neitz; Thomas W Chalberg
Original assignee: University of Washington; Adverum Biotechnologies Inc
Current assignee: University of Washington; Adverum Biotechnologies Inc
Priority date: 2014-03-17
Filing date: 2015-03-17
Publication date: 2025-11-19
Anticipated expiration: 2035-03-17
Also published as: JP2019205465A; EP3119798A1; EP3800191A1; JP6689249B2; CN106414474A; KR102288849B1; ES2822551T3; CN106414474B; NZ724403A; JP2017510296A; US20180320145A1; AU2015231439A1; EP3119798B1; IL247756B; KR20160135754A; EP3800191B1; KR102537394B1; IL259321A; AU2022200708A1; AU2020200948B2

Abstract

La presente divulgación proporciona casetes de polinucleótidos, vectores de expresión y métodos para la expresión de un gen en células cónicas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Composiciones y métodos para mejorar la expresión génica en células cono

[0003] Declaración con respecto al Listado de Secuencias

[0004] El Listado de Secuencias asociado con esta memoria descriptiva se proporciona en formato de texto en lugar de una copia impresa y forma parte de la descripción. El nombre del archivo de texto que contiene el Listado de Secuencias es AVBI_005_02WO_ST25.txt. El archivo de texto tiene 308 KB y se creó el 17 de marzo de 2015.

[0005] Campo de la invención

[0006] Esta invención se refiere a la terapia génica de trastornos de la retina.

[0007] Antecedentes de la invención

[0008] Los trastornos de la visión del ojo a menudo se relacionan con defectos primarios conocidos en las células cono. Estas incluyen distrofias maculares como la distrofia macular de Stargardt, la distrofia de conos, la distrofia de conos y bastones, la ataxia espinocerebelosa tipo 7 y el síndrome de Bardet-Biedl-1, así como trastornos de la visión del color, incluida la acromotopsia, la monocromacia de conos azules y los defectos de protan, deutan y tritan.

[0009] Además de aquellos trastornos cuya causa conocida es intrínseca a los fotorreceptores de cono, existen trastornos de la visión de la mácula central (en los primates) que pueden tratarse atacando las células cono. Estas incluyen la degeneración macular relacionada con la edad, la telangiectasia macular, la retinitis pigmentosa, la retinopatía diabética, las oclusiones de las venas retinianas, el glaucoma, la distrofia del fondo de ojo de Sorsby, la distrofia macular viteliforme del adulto, la enfermedad de Best y la retinosquisis ligada al cromosoma X.

[0010] Un enfoque prometedor para tratar y prevenir enfermedades oftálmicas que aborda las limitaciones del tratamiento existente es la administración de agentes terapéuticos al ojo con un vector de terapia genética como un virus adenoasociado (AAV). AAV es un virus de ADN monocatenario de 4.7 kb. Los vectores recombinantes basados en AAV se asocian con una excelente seguridad clínica, ya que el AAV de tipo salvaje no es patógeno y no tiene asociación etiológica con ninguna enfermedad conocida. Además, el AAV ofrece la capacidad de administrar genes de manera altamente eficiente y de expresar transgenes de manera sostenida en numerosos tejidos, incluidos los ojos, los músculos, los pulmones y el cerebro. Además, el AAV ha demostrado ser prometedor en ensayos clínicos en humanos. Un ejemplo es la amaurosis congénita de Leber, en la que los pacientes tratados con un agente terapéutico administrado mediante una única administración subretinal de un vector rAAV han experimentado un beneficio clínico sostenido a partir de la expresión del agente terapéutico durante más de cuatro años desde la fecha inicial del tratamiento.

[0011] Aún quedan varios desafíos con respecto al diseño de casetes de polinucleótidos y vectores de expresión para uso en terapia genética para tratar enfermedades oculares en general y células cono específicamente. Un desafío importante es obtener la expresión suficiente del transgén en las células objetivo, especialmente en las células cono de la retina. Una necesidad insatisfecha de larga data en la técnica ha sido la expresión suficientemente robusta de transgenes luego de la transferencia de genes. En algunos casos, se requiere una expresión más eficiente para la eficacia de ciertos vectores, por ejemplo, vectores de ADN plasmídico. En otros casos, son deseables casetes de expresión génica más eficientes para permitir una dosis terapéutica más baja que tenga un perfil de seguridad más favorable o una vía de administración menos invasiva (por ejemplo, intravítrea vs. subretiniana). En algunos entornos, se ha logrado una expresión eficiente utilizando un promotor fuerte y ubicuo, pero a menudo es deseable tener una alta expresión del transgén utilizando un casete de expresión de ácido nucleico que solo se expresa en tipos de células objetivo.

[0012] Esfuerzos previos para expresar transgenes en células cono, por ejemplo, como se describe en la Solicitud de patente estadounidense US 2012/0172419, mostraron cierta promesa, pero a menudo los niveles de expresión eran inferiores a los óptimos o no específicos de la célula. Dado que una serie de trastornos de la visión son resultado de defectos primarios en las células cono, la expresión específica de transgenes en las células cono, con altos niveles de expresión, representaría un avance significativo en la técnica. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de métodos mejorados y casetes y vectores de ácidos nucleicos optimizados para expresar genes en células cono.

[0013] Resumen de la invención

[0014] En un aspecto de la invención, se proporciona un casete de polinucleótidos para la expresión mejorada de un transgén en células cono de una retina de mamífero, que comprende: (a) una región promotora que consiste en un promotor M-Opsina truncado que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 80 o un fragmento funcional o variante del mismo que tenga una identidad de secuencia del 85% o más con SEQ ID NO: 80; (b) una secuencia de codificación unida operativamente a la región promotora, en donde la secuencia de codificación codifica una proteína terapéutica que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 32; y (c) un sitio de poliadenilación unido operativamente a la secuencia de codificación.

[0016] La presente invención proporciona casetes de polinucleótidos y vectores de expresión (rAAV). También se describen métodos para la expresión de un gen en células cono; no forman parte de la invención, pero son útiles para comprender la invención.

[0018] Se proporcionan casetes de polinucleótidos para la expresión de un transgén en células cono de la retina de un mamífero. La expresión del transgén es una expresión mejorada. En ciertas realizaciones, la expresión de la secuencia de codificación es mayor que la expresión del transgén operativamente ligado a SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la expresión del transgén es específica del cono.

[0020] En algunas realizaciones, el casete de polinucleótidos comprende una región promotora, en donde la región promotora promueve la expresión de un gen en las células cono de la retina; y un sitio de poliadenilación. En algunas realizaciones, la expresión es específicamente en células cono. La región promotora consiste en un promotor M-Opsina truncado que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 80 o un fragmento funcional o variante del mismo que tenga una identidad de secuencia del 95% o más con SEQ ID NO: 80.

[0022] En algunas realizaciones, el casete de polinucleótidos comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una región 5' no traducida para una secuencia de codificación, denominada en este documento como una 5'UTR. En algunas de estas realizaciones, la 5'UTR comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia del 85% o más con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88 y SEQ ID NO:89. En algunas realizaciones, la secuencia 5'UTR es heteróloga a la secuencia promotora. En algunas realizaciones, la 5'UTR consiste esencialmente en una secuencia que tiene una identidad de secuencia del 85% o más con respecto a la longitud completa de SEQ ID NO:85 o SEQ ID NO:86. En algunas realizaciones, la 5'UTR no comprende un polinucleótido ATG.

[0024] En algunas realizaciones, el casete de polinucleótidos comprende un intrón. En algunas de estas realizaciones, el intrón comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia del 85% o más con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60. En ciertas realizaciones, el intrón se encuentra dentro de la secuencia de polinucleótidos que codifica un 5'UTR.

[0026] En algunas realizaciones, el casete de polinucleótidos comprende una secuencia de iniciación de la traducción. En algunas de estas realizaciones, la secuencia de iniciación de la traducción comprende una secuencia de polinucleótidos que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 72 o SEQ ID NO: 73.

[0028] En algunas realizaciones, el casete de polinucleótidos comprende una secuencia potenciadora. En algunas de estas realizaciones, la secuencia potenciadora comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 85% o más con SEQ ID NO: 52 o un fragmento funcional de la misma. En ciertas realizaciones, la secuencia potenciadora consiste esencialmente en una secuencia que tiene una identidad de secuencia del 85% o más con respecto a la longitud completa de SEQ ID NO: 51.

[0030] El casete de polinucleótidos comprende una secuencia de codificación unida operativamente al promotor. En algunas realizaciones, la secuencia de codificación es heteróloga a la región promotora y/o a la secuencia 5'UTR. La secuencia de codificación codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, 95% o 98% con SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:32, o una secuencia polimórfica de SEQ ID NO: 11 seleccionados del grupo que consiste en: (i) Thr65Ile, (ii) Ile111Val, (iii) Ser116Tyr, (iv) Leu153Met, (v) Ile171Val, (vi) Ala174Val, (vii) Ile178Val, (viii) Ser180Ala, (ix) Ile230Thr, (x) Ala233Ser, (xi) Val236Met, (xii) Ile274Val, (xiii) Phe275Leu, (xiv) Tyr277Phe, (xv) Val279Phe, (xvi) Thr285Ala, (xvii) Pro298Ala, y (xviii) Tyr309Phe. En algunas realizaciones, la secuencia entre el sitio de inicio de la transcripción y el final de la secuencia de codificación no contiene un marco de lectura abierto, aparte del marco de lectura abierto del transgén, que es de más de 500 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia entre el sitio de inicio de la transcripción y el final de la secuencia de codificación no contiene un marco de lectura abierto, aparte del marco de lectura abierto del transgén, que es de más de 273 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia entre el sitio de inicio de la transcripción y el final de la secuencia de codificación no contiene un marco de lectura abierto, aparte del marco de lectura abierto del transgén, que es de más de 250 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, se ha eliminado al menos un marco de lectura abierto de la secuencia de codificación.

[0032] En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una región promotora, en donde la región promotora promueve la expresión de un gen en las células cono de la retina; una región 5' no traducida; un intrón; una secuencia de iniciación de la traducción; una secuencia de codificación unida operativamente a la región promotora; y un sitio de poliadenilación. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una región promotora, en donde la región promotora promueve la expresión de un gen específicamente en las células cono de la retina; una región 5' no traducida; un intrón; una secuencia de iniciación de la traducción; una secuencia de codificación unida operativamente a la región promotora; y un sitio de poliadenilación.

[0034] En algunos aspectos de la invención, se proporcionan vectores de administración de genes que comprenden un casete de polinucleótidos de la presente invención. El vector de administración de genes es un virus adenoasociado recombinante, en donde el virus adenoasociado recombinante comprende una proteína de la cápside de AAV. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV es una proteína de la cápside de AAV de tipo salvaje. En otras realizaciones, la proteína de la cápside de AAV es una proteína de la cápside de AAV variante. En ciertas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV variante comprende una inserción de péptido en el bucle de GH de AAV seleccionado del grupo que consiste en LGETTRP (SEQ ID NO:96), NETITRP (SEQ ID NO:97), KAGQANN (SEQ ID NO:98), KDPKTTN (SEQ ID NO:99), KDTDTTR (SEQ ID NO:100), RAGGSVG (SEQ ID NO:101), AVDTTKF (SEQ ID NO:102), y STGKVPN (SEQ ID NO:103).

[0036] En algunos aspectos de la invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un casete de polinucleótidos de la invención y un excipiente farmacéutico. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un vector de administración de genes de la invención y un excipiente farmacéutico. Dichas composiciones farmacéuticas pueden usarse en el tratamiento o profilaxis de un trastorno de la visión del color seleccionado del grupo que consiste en acromotopsia, monocromacia de cono azul, un defecto de protan, un defecto de deutan y un defecto de tritan.

[0038] Se proporcionan métodos para expresar un transgén en células cono. Para evitar dudas, los métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal no forman parte de la invención. En algunos ejemplos, el método comprende poner en contacto una o más células cono con una cantidad efectiva de un casete de polinucleótido de la invención o un vector de administración de genes de la invención, en donde el transgén se expresa en niveles detectables en una o más células cono. En algunos ejemplos, el método esin vitro.En otros ejemplos, el método esin vivo.En algunos de estos ejemplos, el contacto comprende la inyección del casete de polinucleótido o del vector de administración de genes en el vítreo del ojo de un mamífero. En otros ejemplos similares, el método comprende la inyección del casete de polinucleótidos o del vector de administración de genes en el espacio subretinal del ojo de un mamífero. En algunos ejemplos, el método comprende además detectar la expresión del transgén en células cono, en donde la expresión se detecta en el 80% o más de las células cono. En algunos ejemplos, la expresión es específica de las células cono.

[0040] Se proporcionan métodos para el tratamiento o profilaxis de un trastorno de células cono en un mamífero que necesita tratamiento o profilaxis para un trastorno de células cono. En algunos ejemplos, el método comprende administrar al ojo del mamífero una cantidad efectiva de una composición farmacéutica de la invención, en donde la secuencia de codificación codifica un producto génico terapéutico. En algunos ejemplos, la administración comprende inyectar la composición farmacéutica en el vítreo del ojo del mamífero. En otros ejemplos similares, el método comprende inyectar la composición farmacéutica en el espacio subretinal del ojo de un mamífero.

[0042] En algunos ejemplos, el trastorno de las células cono es un trastorno de la visión del color. En ciertos ejemplos, el trastorno de la visión del color se selecciona del grupo que consiste en acromotopsia, monocromacia de cono azul, un defecto de protan, un defecto de deutan y un defecto de tritan. En algunos de estos ejemplos, el método comprende además detectar un cambio en los síntomas de la enfermedad, en donde el cambio comprende un aumento en la capacidad del mamífero para percibir un color. En algunos ejemplos, el trastorno de las células cono es una distrofia macular. En ciertos ejemplos, la distrofia macular se selecciona del grupo que consiste en distrofia macular de Stargardt, distrofia de conos, distrofia de conos y bastones, ataxia espinocerebelosa tipo 7 y síndrome de Bardet-Biedl-1. En algunos ejemplos, el trastorno de las células cono es un trastorno de la visión de la mácula central. En ciertos ejemplos, el trastorno de la visión de la mácula central se selecciona del grupo que consiste en degeneración macular relacionada con la edad, telangiectasia macular, retinitis pigmentosa, retinopatía diabética, oclusiones de la vena retiniana, glaucoma, distrofia del fondo de ojo de Sorsby, distrofia macular viteliforme del adulto, enfermedad de Best, distrofia de conos y bastones, amaurosis congénita de Leber y retinosquisis ligada al cromosoma X. En algunos de estos ejemplos, el método comprende además detectar un cambio en los síntomas de la enfermedad. En algunos de estos ejemplos, el cambio comprende una estabilización de la salud de las células cono y/o una reducción de la tasa de pérdida de agudeza visual del mamífero. En algunos de estos ejemplos, el cambio comprende una mejora en la salud de las células cono y/o una mejora en la agudeza visual del mamífero.

[0044] Breve descripción de los dibujos

[0046] Las características novedosas de la divulgación se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención se obtendrá mediante referencia a la siguiente descripción detallada que establece realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos de los cuales:

[0048] FG. 1A representa una visión general esquemática de los casetes de polinucleótidos para mejorar la expresión de un transgén en células cono.

[0049] FG. 1B representa una visión general esquemática de vectores virales que comprenden casetes de polinucleótidos para una mejor expresión de un transgén en células cono.

[0051] FG. 2 representa un intrón de ejemplo que contiene características canónicas, incluidas secuencias de consenso para el donante de empalme (A/C) A G G T Pu A G U; sitio de ramificación C T Pu A Py; región rica en Py; y aceptor N C A G G.

[0053] FG. 3A representa un ejemplo de estructura de ARNm 5'UTR (SEQ ID NO: 56), la estructura de ARNm 5'UTR de pR2.1 (Mancusoet al.).Esta 5' UTR tiene dos AUG corriente arriba y marcos de lectura abiertos (ORF), un alto nivel de apareamiento de bases y estructura de horquilla, y una secuencia Kozak más corta.

[0055] FG. 3B representa un ejemplo de ARNm 5'UTR y estructura (SEQ ID NO: 57) de un casete optimizado de la presente divulgación. La 5' UTR no comprende AUG corriente arriba ni ORF. Además, en comparación con la 5' UTR de la Fig. 3A, la 5' UTR de la Fig. 3B es más corta, con menos apareamiento de bases; y la secuencia Kozak es más larga.

[0057] FG. 4A representa un casete de polinucleótidos antes de la optimización del codón. Los marcos de lectura abiertos (ORF) de más de 250 nucleótidos de longitud se muestran en gris debajo de la secuencia.

[0059] FG. 4B representa un casete de polinucleótidos después de la optimización de codones, pero antes de la eliminación de los ORF no transgénicos. Los ORF de más de 250 nucleótidos se muestran en gris debajo del diagrama de secuencia. Nótese la introducción de un nuevo ORF en orientación inversa a partir del poliA SV40 y que se extiende 1,365 bases.

[0061] FG. 4C representa un casete de polinucleótidos después de la optimización de codones y la eliminación de los ORF. Los ORF de más de 250 nucleótidos se muestran en gris debajo del diagrama de secuencia. Nótese que la secuencia se ha optimizado de manera que los ORF recién introducidos se acorten o eliminen.

[0063] FG. 5 ilustra cómo la variante AAV2-7m8 de AAV2 administrada intravítreamente transduce las células de la retina en la fóvea central y parafóvea de primates de manera más eficiente que el AAV2 administrado intravítreamente. 5 x 1011 genomas vectoriales de AAV2.CMV.GFP (arriba a la izquierda); AAV-2.5T.CMV.GFP (arriba a la derecha) (Excoffon K. J., et al. 2009. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106:3865-3870); (abajo a la izquierda) AAV2-7.8.CMV.GFP (Dalkara D, et al. Sci Transl Med. 2013 Jun 12;5(189):189ra76); o AAV-ShH10.CMV.GFP (abajo a la derecha) (Klimczak RR et al. PLoS One. 2009 Oct 14;4(10):e7467) se inyectaron en el vítreo de un mono verde africano en un volumen de 50 uL y se observó la expresión de GFP 8 semanas después mediante imágenes de fluorescencia OCTin vivo.

[0065] FG. 6 ilustra cómo de manera robusta el casete regulador pMNTC promueve la expresión génica en los conos foveales de primates. (a-b) Se inyectó AAV2-7m8.MNTC.GFP en el vítreo central de un babuino y se observó su expresión (a) 5 semanas y (b) 8 semanas después mediante fluorescencia del fondo de ojo. (c y d) Fluorescencia de GFP natural dentro de una sección de 15 micrones de la fóvea aproximadamente 6 meses después de la inyección con AAV2-7m8.MNTC.GFP con bajo aumento (c) y alto aumento (d).

[0067] FG. 7 ilustra la expresión génica robusta y específica del cono en los conos de una retina de ratón después de la inyección intravítrea de MNTC.GFP con administración de AAV. (a-b) Ejemplos de fluorescencia de GFP 11 semanas después de que los ratones recibieran inyecciones intravítreas de 5.04 x 1010 genomas vectoriales mediante inyección intravítrea. (c-e) Las retinas se recolectaron para histología 14 semanas después de la inyección y los segmentos externos del cono se marcaron con un anticuerpo contra la opsina L/M (rojo). En (c) el canal rojo está desactivado de modo que solo es visible el GFP nativo, (d) es la misma imagen con el canal rojo activado para permitir la visualización de los segmentos externos del cono. La comparación de (c) y (d) muestra que la mayoría de los conos, si no todos, fueron transducidos por el virus. (e) Imagen de la misma retina que en c y d desde un ángulo diferente que muestra los perfiles de los fotorreceptores de cono.

[0069] FG. 8 ilustra la expresión génica dirigida por el casete regulador pMNTC en los conos de la retina del jerbo mongol. 1 x 1010 - 2 x 1010 genomas vectoriales del virus que transporta GFP bajo el control del promotor CMV, pR2.1 o MNTC se inyectaron en un volumen de 5 uL en el vítreo de un jerbo mongol y se visualizó la expresión de GFP en los puntos temporales designados mediante imágenes de fluorescencia del fondo de ojo. (a) Expresión de GFP dirigida por AAV2-7m8.CMV.GFP y AAV2-7m8.MNTC.GFP, visualizada 4 semanas después de la administración intravítrea. A los jerbos 12-10, 12-11 y 12-12 se les inyectó AAV2-7m8.CMV.GFP, mientras que a los jerbos 12-13, 12-14 y 12-15 se les inyectó AAV2-7m8.MNTC.GFP. OD,oculus dexter(ojo derecho). Os ,oculus sinister(ojo izquierdo). (b) Expresión de GFP dirigida por AAV2-7m8.pR2.1.GFP y AAV2-7m8.MNTC.GFP, 4 y 8 semanas después, detectada mediante imágenes de fluorescencia del fondo de ojo.

[0070] FIGS. 9A-9D demuestran que el casete regulador pMNTC proporciona una expresión génica más robusta en los conos foveales de primates que el promotor del cono pR2.1. 5 x 1011 genomas vectoriales de AAV2-7m8.MNTC.GFP o AAV2-7m8.pR2.1.GFP se inyectaron en un volumen de 50 uL en el vítreo de monos verdes africanos como se indica (AAV2-7m8.MNTC.GFP en los animales 271 y 472; AAV2-7m8.pR2.1.GFP en los animales 500 y 509). Las retinas se visualizaronin vivoa las (a) 2 semanas, (b) 4 semanas, (c) 8 semanas y (d) 12 semanas para GFP utilizando una cámara de fluorescencia de fondo de ojo (a, b, c, d) o autofluorescencia en Heidelberg Spectralis OCT (a, b; datos no mostrados para las semanas 8 y 12). OD,oculus dexter(ojo derecho). OS,oculus sinister(ojo izquierdo).

[0072] FIGS. 10A-10D demuestran la contribución de cada uno de los elementos pMNTC optimizados a la expresión más robusta observada. (a) Los casetes de expresión pMNTC y pR2.1. (b) Los casetes de expresión experimentales, en los que cada elemento en pMNTC se reemplaza uno por uno por el elemento correspondiente en pR2.1. (c,d) Expresión del transgén de luciferasa en las retinas de jerbos inyectados intravítreamente con cada uno de los artículos de prueba (n = 6-8 ojos por constructo) según se detectó (c) 4 semanas y (d) 8 semanas después de la inyección mediante imágenes IVIS. "7m8.CMV" sirvió como control positivo.

[0074] Definiciones

[0076] Un "vector", como se utiliza en este documento, se refiere a una macromolécula o asociación de macromoléculas que comprende o se asocia con un polinucleótido y que puede utilizarse para mediar la administración del polinucleótido a una célula. Los vectores ilustrativos incluyen, por ejemplo, plásmidos, vectores virales, liposomas y otros vehículos de administración de genes.

[0078] El término "AAV" es una abreviatura de virus adenoasociado y puede usarse para referirse al virus en sí o derivados del mismo. El término cubre todos los subtipos y tanto las formas de origen natural como las recombinantes, salvo que se requiera lo contrario. El término "AAV" incluye AAV tipo 1 (AAV-1), AAV tipo 2 (AAV-2), AAV tipo 3 (AAV-3), AAV tipo 4 (AAV-4), AAV tipo 5 (AAV-5), AAV tipo 6 (AAV-6), AAV tipo 7 (AAV-7), AAV tipo 8 (AAV-8), AAV aviar, AAV bovino, Aa V canino, AAV equino, AAV de primates, AAV no de primates y AAV ovino. "AAV de primates" se refiere a AAV que infecta a primates, "AAV no de primates" se refiere a AAV que infecta a mamíferos no primates, "AAV bovino" se refiere a AAV que infecta a mamíferos bovinos, etc.

[0079] Un "virus AAV" o "partícula viral AAV" o "partícula vector rAAV" se refiere a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside de AAV (típicamente por todas las proteínas de la cápside de un AAV de tipo salvaje) y un vector rAAV polinucleótido encapsidado. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto de un genoma de AAV de tipo salvaje, tal como un transgén que se administrará a una célula de mamífero), típicamente se la denomina "partícula de vector rAAV" o simplemente un "vector rAAV". Por lo tanto, la producción de partículas rAAV incluye necesariamente la producción de un vector rAAV, ya que dicho vector está contenido dentro de una partícula rAAV.

[0081] El término "replicación defectuosa" como se usa en este documento en relación con un vector viral AAV de la invención significa que el vector AAV no puede replicar y empaquetar independientemente su genoma. Por ejemplo, cuando una célula de un sujeto se infecta con viriones rAAV, el gen heterólogo se expresa en las células infectadas, sin embargo, debido al hecho de que las células infectadas carecen de los genes rep y cap del AAV y de los genes de función accesoria, el rAAV no puede replicarse más.

[0083] Una "variante de AAV" o "mutante de AAV", como se usa en este documento, se refiere a una partícula viral compuesta de: a) una proteína de cápside de AAV variante, donde la proteína de cápside de AAV variante comprende al menos una diferencia de aminoácidos (por ejemplo, sustitución de aminoácidos, inserción de aminoácidos, deleción de aminoácidos) con respecto a una proteína de cápside de AAV parental correspondiente, y donde la proteína de cápside variante confiere mayor infectividad de una célula retiniana en comparación con la infectividad de la célula retiniana por un virión de AAV que comprende la proteína de cápside de AAV parental correspondiente, donde la proteína de cápside de AAV no comprende una secuencia de aminoácidos presente en una proteína de cápside de AAV de origen natural; y b) un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico heterólogo.

[0085] La abreviatura "rAAV" se refiere al virus adenoasociado recombinante, también conocido como vector AAV recombinante (o "vector rAAV"). Un "vector rAAV", como se utiliza en este documento, se refiere a un vector AAV que comprende una secuencia de polinucleótidos que no es de origen AAV (es decir, un polinucleótido heterólogo a Aa V), típicamente una secuencia de interés para la transformación genética de una célula. En general, el polinucleótido heterólogo está flanqueado por al menos una, y generalmente por dos secuencias repetidas terminales invertidas (ITR) de AAV. El término vector rAAV abarca tanto las partículas del vector rAAV como los plásmidos del vector rAAV.

[0087] Tal como se utiliza en este documento, el término "gen" o "secuencia de codificación" se refiere a una secuencia de nucleótidosin vitrooin vivoque codifica un producto génico. En algunos casos, el gen consiste o consiste esencialmente en una secuencia de codificación, es decir, una secuencia que codifica el producto del gen. En otros casos, el gen comprende una secuencia adicional no de codificación. Por ejemplo, el gen puede o no incluir regiones anteriores y posteriores a la región de codificación, por ejemplo, secuencias 5' no traducidas (5' UTR) o "líderes" y secuencias 3' UTR o "finales", así como secuencias de intervención (intrones) entre segmentos de codificación individuales (exones).

[0088] Tal como se utiliza en el presente documento, un "gen terapéutico" se refiere a un gen que, cuando se expresa, confiere un efecto beneficioso a la célula o tejido en el que está presente, o a un mamífero en el que se expresa el gen. Ejemplos de efectos beneficiosos incluyen la mejora de un signo o síntoma de una condición o enfermedad, la prevención o inhibición de una condición o enfermedad o la concesión de una característica deseada. Los genes terapéuticos incluyen genes que corrigen una deficiencia genética en una célula o mamífero.

[0090] Tal como se utiliza en este documento, un transgén es un gen que se administra a una célula mediante un vector.

[0092] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "producto génico" se refiere al producto de expresión deseado de una secuencia de polinucleótidos tal como un polipéptido, un péptido, una proteína o un ARN de interferencia, incluido el ARN de interferencia corta (ARNip), el miARN o el ARN de horquilla pequeña (ARNhc).

[0093] Tal como se utilizan en este documento, los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se refieren a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, fosforilación o conjugación con un componente de marcación.

[0095] Por "que comprende" se entiende que los elementos citados son necesarios, por ejemplo, en la composición, método, kit, etc., pero pueden incluirse otros elementos para formar la, por ejemplo, composición, método, kit, etc. dentro del alcance de la reivindicación. Por ejemplo, un casete de expresión "que comprende" un gen que codifica un polipéptido terapéutico unido operativamente a un promotor es un casete de expresión que puede incluir otros elementos además del gen y el promotor, por ejemplo, una secuencia de poliadenilación, elementos potenciadores, otros genes, dominios enlazadores, etc.

[0097] Por "que consiste esencialmente en", se entiende una limitación del alcance de, por ejemplo, la composición, método, kit, etc., descritos a los materiales o pasos especificados que no afecten materialmente las características básicas y novedosas de, por ejemplo, la composición, método, kit, etc. Por ejemplo, un casete de expresión "que consiste esencialmente en" un gen que codifica un polipéptido terapéutico unido operativamente a un promotor y una secuencia de poliadenilación puede incluir secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias enlazadoras, siempre que no afecten materialmente la transcripción o la traducción del gen. Como otro ejemplo, un fragmento de polipéptido variante o mutante "que consiste esencialmente en" una secuencia citada tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia citada más o menos aproximadamente 10 residuos de aminoácidos en los límites de la secuencia basada en el polipéptido ingenuo de longitud completa del que se derivó, por ejemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuo menos que el residuo de aminoácido límite citado, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos más que el residuo de aminoácido límite citado.

[0099] Por "que consiste en" se entiende la exclusión de la composición, método o kit de cualquier elemento, paso o ingrediente no especificado en la reivindicación. Por ejemplo, un casete de expresión "que consiste en" un gen que codifica un polipéptido terapéutico unido operativamente a un promotor, y una secuencia de poliadenilación consiste únicamente en el promotor, la secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido terapéutico y la secuencia de poliadenilación. Como otro ejemplo, un polipéptido "que consiste en" una secuencia citada contiene sólo la secuencia citada.

[0101] Tal como se utiliza en este documento, los términos "identidad de secuencia", por ejemplo "% de identidad de secuencia", se refieren al grado de identidad entre dos o más polinucleótidos cuando se alinean utilizando un programa de alineamiento de secuencias de nucleótidos; o entre dos o más secuencias de polipéptidos cuando se alinean utilizando un programa de alineamiento de secuencias de aminoácidos. De manera similar, el término "idéntico" o porcentaje de "identidad" cuando se usa aquí en el contexto de dos o más secuencias de nucleótidos o aminoácidos se refiere a dos secuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos cuando se comparan y alinean para lograr la máxima correspondencia, por ejemplo, medida utilizando un algoritmo de comparación de secuencias, por ejemplo, el algoritmo Smith-Waterman, etc., o mediante inspección visual. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo Needleman y Wunsch, (1970, J. Mol. Biol. 48: 444 453) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG, utilizando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de brecha de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Como otro ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de brecha de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un conjunto de parámetros particularmente preferido (y el que se debe utilizar a menos que se especifique lo contrario) es una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de brecha de 12, una penalización de extensión de brecha de 4 y una penalización de brecha de desplazamiento de marco de 5. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (1989, Cabios, 4: 11-17) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de brecha de 12 y una penalización de brecha de 4. Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas descritas en este documento se pueden utilizar como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Estas búsquedas se pueden realizar utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al., (1990, J. Mol. Biol, 215: 403-10). Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineaciones con brechas para fines de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997, Nucleic Acids Res, 25: 3389-3402). Al utilizar los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).

[0103] El término "% de homología" se utiliza indistintamente en este documento con el término "% de identidad" y se refiere al nivel de identidad de secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos entre dos o más secuencias alineadas, cuando se alinean utilizando un programa de alineación de secuencias. Por ejemplo, como se usa en este documento, 80% de homología significa lo mismo que 80% de identidad de secuencia determinada por un algoritmo definido y, en consecuencia, un homólogo de una secuencia dada tiene más de 80% de identidad de secuencia a lo largo de la secuencia dada.

[0105] Tal como se utilizan en este documento, los términos "complemento" y "complementario" se refieren a dos secuencias de nucleótidos antiparalelas capaces de aparearse entre sí tras la formación de enlaces de hidrógeno entre los residuos de bases complementarias en las secuencias de nucleótidos antiparalelas. Por ejemplo, un ARNhc podría ser complementario, es decir, 100% complementario, o sustancialmente complementario, por ejemplo, 80% complementario, 85% complementario, 90% complementario, 95% complementario, 98% complementario, o más a una secuencia objetivo. El término "expresión", como se usa en este documento, abarca la transcripción y/o traducción de un gen endógeno, un transgén o una secuencia de codificación en una célula.

[0107] Un "vector de expresión" como se utiliza en este documento abarca un vector, por ejemplo, plásmido, minicírculo, vector viral, liposoma y similares como se discutió anteriormente o como se conoce en la técnica, que comprende un polinucleótido que codifica un producto génico de interés, y se utiliza para efectuar la expresión de un producto génico en una célula objetivo deseada. Un vector de expresión también comprende elementos de control vinculados operativamente a la región de codificación para facilitar la expresión del producto génico en el objetivo. La combinación de elementos de control, por ejemplo, promotores, potenciadores, UTR, secuencias dirigidas a miARN, etc., y un gen o genes a los que están unidos operativamente para su expresión se denomina a veces "casete de expresión". Muchos de estos elementos de control son conocidos y están disponibles en la técnica o pueden construirse fácilmente a partir de componentes que están disponibles en la técnica.

[0109] Un "promotor", como se utiliza en este documento, abarca una secuencia de ADN que dirige la unión de la ARN polimerasa y, por lo tanto, promueve la síntesis de ARN, es decir, una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. Los promotores y la expresión de proteínas o polipéptidos correspondientes pueden ser ubicuos, es decir, fuertemente activos en un amplio rango de células, tejidos y especies, o específicos del tipo de célula, específicos del tejido o específicos de la especie. Los promotores pueden ser "constitutivos", lo que significa que están continuamente activos, o "inducibles", lo que significa que el promotor puede activarse o desactivarse por la presencia o ausencia de factores bióticos o abióticos. También se incluyen en los constructos o vectores de ácidos nucleicos de la invención secuencias potenciadoras que pueden o no ser contiguas a la secuencia promotora. Las secuencias potenciadoras influyen en la expresión génica dependiente del promotor y pueden estar ubicadas en las regiones 5' o 3' del gen nativo.

[0111] Un "potenciador", tal como se utiliza en el presente documento, abarca un elemento que actúa en cis y que estimula o inhibe la transcripción de genes adyacentes. Un potenciador que inhibe la transcripción también se denomina "silenciador". Los potenciadores pueden funcionar (es decir, pueden asociarse con una secuencia de codificación) en cualquier orientación, a distancias de hasta varios pares de kilobases (kb) desde la secuencia de codificación y desde una posición corriente abajo de una región transcrita.

[0113] Una "secuencia de señal de terminación", como se utiliza en este documento, abarca cualquier elemento genético que hace que la ARN polimerasa termine la transcripción, tal como por ejemplo una secuencia de señal de poliadenilación.

[0115] Una "secuencia señal de poliadenilación", como se utiliza en este documento, abarca una región de reconocimiento necesaria para la escisión por endonucleasa de una transcripción de ARN que es seguida por la secuencia de consenso de poliadenilación AATAAA. Una secuencia señal de poliadenilación proporciona un "sitio poliA", es decir, un sitio en una transcripción de ARN al que se agregarán residuos de adenina mediante poliadenilación postranscripcional.

[0116] Tal como se utiliza en este documento, los términos "unido operativamente" u "operablemente unido" se refieren a una yuxtaposición de elementos genéticos, por ejemplo, promotor, potenciador, secuencia de señal de terminación, secuencia de poliadenilación, etc., en donde los elementos están en una relación que les permite operar de la manera esperada. Por ejemplo, un promotor está vinculado operativamente a una región de codificación si el promotor ayuda a iniciar la transcripción de la secuencia de codificación. Puede haber residuos de intervención entre el promotor y la región de codificación siempre que se mantenga esta relación funcional. Tal como se utiliza en este documento, el término "heterólogo" significa derivado de una entidad genotípicamente distinta del resto de la entidad con la que se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido introducido mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una especie diferente es un polinucleótido heterólogo. Como otro ejemplo, un promotor eliminado de su secuencia de codificación nativa y unido operativamente a una secuencia de codificación con la que no se encuentra unido de forma natural es un promotor heterólogo. Así, por ejemplo, un rAAV que incluye un ácido nucleico heterólogo que codifica un producto génico heterólogo es un rAAV que incluye un ácido nucleico que típicamente no está incluido en un AAV de tipo salvaje de origen natural, y el producto génico heterólogo codificado es un producto génico que típicamente no está codificado por un AAV de tipo salvaje de origen natural.

[0118] El término "endógeno" tal como se utiliza en este documento con referencia a una molécula de nucleótido o producto génico se refiere a una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo un gen o elemento genético, o un producto génico, por ejemplo ARN, proteína, que se encuentra de forma natural en o está asociado con un virus o célula huésped.

[0120] El término "nativo" como se utiliza en este documento se refiere a una secuencia de nucleótidos, por ejemplo un gen, o un producto génico, por ejemplo ARN, proteína, que está presente en un virus o célula de tipo salvaje. El término "variante" como se utiliza en este documento se refiere a un mutante de una secuencia de polinucleótido o polipéptido de referencia, por ejemplo, una secuencia de polinucleótido o polipéptido nativa, es decir, que tiene menos del 100% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótido o polipéptido de referencia. Dicho de otra manera, una variante comprende al menos una diferencia de aminoácidos (por ejemplo, sustitución de aminoácidos, inserción de aminoácidos, eliminación de aminoácidos) con respecto a una secuencia de polinucleótidos de referencia, por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos nativa. Por ejemplo, una variante puede ser un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de 70% o más con una secuencia de polinucleótido nativo de longitud completa, por ejemplo, una identidad de 75% u 80% o más, tal como 85%, 90% o 95% o más, por ejemplo, 98% o 99% de identidad con la secuencia de polinucleótido nativo de longitud completa. Como otro ejemplo, una variante puede ser un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de 70% o más con una secuencia de polipéptido nativo de longitud completa, por ejemplo, una identidad de 75% u 80% o más, tal como 85%, 90% o 95% o más, por ejemplo, 98% o 99% de identidad con la secuencia de polipéptido nativo de longitud completa. Las variantes también pueden incluir fragmentos variantes de una secuencia de referencia, por ejemplo, nativa, que comparte una identidad de secuencia del 70% o más con un fragmento de la secuencia de referencia, por ejemplo, nativa, por ejemplo, una identidad del 75% o del 80% o más, como del 85%, 90% o 95% o más, por ejemplo, del 98% o del 99% de identidad con la secuencia nativa.

[0122] Tal como se utilizan en este documento, los términos "actividad biológica" y "biológicamente activo" se refieren a la actividad atribuida a un elemento biológico particular en una célula. Por ejemplo, la "actividad biológica" de una "inmunoglobulina", un "anticuerpo" o un fragmento o variante del mismo se refiere a la capacidad de unirse a un determinante antigénico y facilitar así la función inmunológica. Como otro ejemplo, la actividad biológica de un polipéptido o fragmento funcional o variante del mismo se refiere a la capacidad del polipéptido o fragmento funcional o variante del mismo para llevar a cabo sus funciones nativas de, por ejemplo, unión, actividad enzimática, etc. Como un tercer ejemplo, la actividad biológica de un elemento regulador genético, por ejemplo, promotor, potenciador, secuencia kozak y similares, se refiere a la capacidad del elemento regulador o fragmento funcional o variante del mismo para regular, es decir, promover, potenciar o activar la traducción de, respectivamente, la expresión del gen al que está unido operativamente.

[0124] Los términos "administrar" o "introducir", tal como se utilizan en este documento, se refieren a la administración de un vector para la expresión de una proteína recombinante a una célula, a células y/u órganos de un sujeto, o a un sujeto. Dicha administración o introducción puede tener lugarin vivo, in vitrooex vivo.Un vector para la expresión de un producto génico puede introducirse en una célula mediante transfección, que típicamente significa la inserción de ADN heterólogo en una célula por medios físicos (por ejemplo, transfección con fosfato de calcio, electroporación, microinyección o lipofección); infección, que típicamente se refiere a la introducción por medio de un agente infeccioso, es decir, un virus; o transducción, que típicamente significa la infección estable de una célula con un virus o la transferencia de material genético de un microorganismo a otro por medio de un agente viral (por ejemplo, un bacteriófago).

[0126] "Transformación" se utiliza típicamente para referirse a bacterias que comprenden ADN heterólogo o células que expresan un oncogén y, por lo tanto, se han convertido en un modo de crecimiento continuo, como las células tumorales. Un vector utilizado para "transformar" una célula puede ser un plásmido, un virus u otro vehículo.

[0127] Típicamente, se hace referencia a una célula como "transducida", "infectada", "transfectada" o "transformada" dependiendo del medio utilizado para la administración, introducción o inserción de ADN heterólogo (es decir, el vector) en la célula. Los términos "transducido", "transfectado" y "transformado" pueden usarse indistintamente en este documento, independientemente del método de introducción del ADN heterólogo.

[0128] El término "célula huésped", tal como se utiliza en este documento, se refiere a una célula que ha sido transducida, infectada, transfectada o transformada con un vector. El vector puede ser un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán evidentes para los expertos en la técnica. Se apreciará que el término "célula huésped" se refiere a la célula original transducida, infectada, transfectada o transformada y su progenie.

[0130] Los términos "tratamiento", "tratando" y similares se utilizan en el presente documento para significar, en general, la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir total o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma, por ejemplo, reduciendo la probabilidad de que la enfermedad o el síntoma de la misma se presente en el sujeto, y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. El término "tratamiento", tal como se utiliza en este documento, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero e incluye: (a) prevenir que la enfermedad se presente en un sujeto que puede estar predispuesto a padecerla pero que aún no ha sido diagnosticado como que la tiene; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar su regresión. El agente terapéutico puede administrarse antes, durante o después de la aparición de la enfermedad o lesión. De particular interés es el tratamiento de una enfermedad en curso, en el que el tratamiento estabiliza o reduce los síntomas clínicos indeseables del paciente. Es conveniente realizar este tratamiento antes de que se produzca la pérdida completa de la función de los tejidos afectados. Lo ideal es que la terapia objeto se administre durante la etapa sintomática de la enfermedad y, en algunos casos, después de la etapa sintomática de la enfermedad.

[0132] Los términos "individuo", "huésped", "sujeto" y "paciente" se utilizan indistintamente en este documento y se refieren a un mamífero, incluidos, pero no limitados a, primates humanos y no humanos, incluidos simios y humanos; animales de deporte mamíferos (por ejemplo, caballos); animales de granja mamíferos (por ejemplo, ovejas, cabras, etc.); mascotas mamíferos (perros, gatos, etc.); y roedores (por ejemplo, ratones, ratas, etc.).

[0133] A continuación se describen las diversas composiciones de la invención y métodos para ayudar a comprender la invención. Aunque en este documento se ejemplifican composiciones y métodos particulares, se entiende que cualquiera de una serie de composiciones y métodos alternativos es aplicable y adecuado para uso. También se entenderá que una evaluación de los constructos de expresión de la invención y de los métodos para ayudar a comprender la invención puede llevarse a cabo utilizando procedimientos estándar en la técnica.

[0134] La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, biología molecular (incluidas las técnicas recombinantes), microbiología, bioquímica e inmunología, que están dentro del alcance de los expertos en la técnica. Estas técnicas se explican detalladamente en la literatura, tales como por ejemplo: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); y "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991).

[0136] A continuación se describen varios aspectos de la invención con referencia a aplicaciones de ejemplo para ilustración. Debe entenderse que se establecen numerosos detalles, relaciones y métodos específicos para proporcionar una comprensión completa de la invención. Sin embargo, una persona con conocimientos normales en la técnica pertinente reconocerá fácilmente que la invención puede practicarse sin uno o más de los detalles específicos o con otros métodos. La presente invención no está limitada por el orden ilustrado de actos o eventos, ya que algunos actos pueden ocurrir en órdenes diferentes y/o simultáneamente con otros actos o eventos. Además, no todos los actos o eventos ilustrados son necesarios para implementar una metodología de acuerdo con la presente invención.

[0138] La terminología utilizada en este documento tiene únicamente el propósito de describir realizaciones particulares. Tal como se utilizan en este documento, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" pretenden incluir también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, en la medida en que se utilicen los términos "incluyendo", "incluye", "que tiene", "tiene", "con" o variantes de los mismos en la descripción detallada y/o en las reivindicaciones, dichos términos tienen la intención de ser inclusivos de una manera similar al término "que comprende".

[0139] El término "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de un rango de error aceptable para el valor particular según lo determine una persona con conocimientos normales en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor,es decir,las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "alrededor de" puede significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar, según la práctica en la técnica. Alternativamente, "alrededor de" puede significar un rango de hasta un 20%, preferiblemente hasta un 10%, más preferiblemente hasta un 5% y más preferiblemente aún hasta un 1% de un valor dado. Alternativamente, particularmente con respecto a sistemas o procesos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro de 5 veces, y más preferiblemente dentro de 2 veces, de un valor. Cuando en la solicitud y las reivindicaciones se describen valores particulares, a menos que se indique lo contrario, se debe asumir que el término "alrededor de" significa dentro de un rango de error aceptable para el valor particular.

[0141] Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse de modo que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "solamente" y similares en relación con la citación de elementos de reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".

[0143] Las publicaciones aquí analizadas se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo aquí contenido debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder a dicha publicación en virtud de una invención anterior.

[0144] Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, lo que puede requerir confirmación independiente.

[0146] A menos que se indique lo contrario, todos los términos utilizados en este documento tienen el mismo significado que tendrían para una persona experta en la técnica y la práctica de la presente invención empleará técnicas convencionales de microbiología y tecnología de ADN recombinante, que están dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

[0148] Descripción detallada de la invención

[0150] La presente divulgación proporciona casetes de polinucleótidos y vectores de expresión para la expresión de un gen en células cono. También se proporcionan métodos para el uso de estas composiciones para promover la expresión de un gen en células cono, por ejemplo, en un individuo, por ejemplo para el tratamiento o profilaxis de un trastorno de células cono. Estos y otros objetos, ventajas y características de la invención serán evidentes para aquellas personas expertas en la técnica al leer los detalles de las composiciones y métodos que se describen más completamente a continuación.

[0152] Composiciones

[0154] En algunos aspectos de la divulgación, se proporcionan composiciones para la expresión de un transgén en células cono. Por una "célula cono", también denominada en este documento "fotorreceptor cono" o "cono", se hace referencia al subtipo de células fotorreceptoras de la retina del ojo que funcionan mejor con luz relativamente brillante. Los conos son sensibles a longitudes de onda específicas de la luz y, por lo tanto, favorecen la percepción del color. Además, los conos responden más rápido a los estímulos que los fotorreceptores de bastones, percibiendo detalles más finos y cambios más rápidos en las imágenes que los bastones y, por lo tanto, favorecen una visión de alta agudeza para actividades en las que el detalle visual es de importancia primordial, como leer y conducir. Los conos son fácilmente identificables en secciones transversales de la retina por la forma cónica de sus segmentos externos. También son fácilmente identificables por su ubicación en la retina, existiendo la mayor densidad de conos en la depresión de 1.5 mm ubicada en el centro de la mácula de la retina, llamada "fóvea central" o "fosa foveal".

[0156] La composición que permite la expresión de un transgén en las células cono es un casete de polinucleótidos. Por "casete de polinucleótidos" se entiende una secuencia de polinucleótidos que comprende dos o más secuencias de polinucleótidos, por ejemplo, elementos reguladores, secuencias de inicio de la traducción, secuencias de codificación, secuencias de terminación, etc., típicamente unidas operativamente entre sí. De igual manera, por un "casete de polinucleótidos para la expresión de un transgén en una célula cono", se entiende una combinación de dos o más secuencias de polinucleótidos, por ejemplo, promotor, potenciador, 5'UTR, secuencia de iniciación de la traducción, secuencia de codificación, secuencias de terminación, etc. que promueve la expresión del transgén en una célula cono.

[0158] Los casetes de polinucleótidos comprenden:

[0160] (a) una región promotora que consiste en un promotor M-Opsina truncado que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 80 o un fragmento funcional o variante del mismo que tiene una identidad de secuencia del 85% o más con SEQ ID NO: 80;

[0161] (b) una secuencia de codificación unida operativamente a la región promotora, en donde la secuencia de codificación codifica una proteína terapéutica que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 32; y

[0163] (c) un sitio de poliadenilación unido operativamente a la secuencia de codificación.

[0165] El casete de polinucleótidos puede comprender además: una región 5' no traducida; un intrón; y/o una secuencia de iniciación de la traducción.

[0167] Los casetes de polinucleótidos de la presente invención proporcionan una expresión potenciada de un transgén en células cono. Como lo demuestran los ejemplos de trabajo de la presente divulgación, los presentes inventores han descubierto una serie de elementos polinucleotídicos, es decir, elementos mejorados en comparación con los conocidos en la técnica, que proporcionan de forma individual y sinérgica la expresión potenciada de transgenes en células cono. Por "potenciado" se entiende que la expresión del transgén aumenta, se incrementa o se vuelve más fuerte en las células cono que llevan los casetes de polinucleótidos de la presente invención en relación con las células cono que llevan el transgén unido operativamente a elementos reguladores comparables, por ejemplo como se conoce en la técnica. Dicho de otra manera, la expresión del transgén aumenta, se incrementa o se hace más fuerte a partir de los casetes de polinucleótidos de la presente invención en relación con la expresión a partir de un casete de polinucleótidos que no comprende uno o más elementos optimizados de la presente divulgación, es decir, un control de referencia. Por ejemplo, la expresión del transgén se potencia, o aumenta o es más fuerte en células cono que comprenden un casete de polinucleótidos que comprende un promotor divulgado en este documento que en células cono que llevan el transgén unido operativamente a un promotor diferente, por ejemplo como se conoce en la técnica. Como otro ejemplo, la expresión del transgén se potencia, o incrementa, aumenta o es más fuerte en células cono que comprenden un casete de polinucleótidos que comprende una secuencia potenciadora divulgada en este documento que en células cono que llevan el transgén unido operativamente a una secuencia potenciadora diferente. Como otro ejemplo, la expresión del transgén se potencia, o incrementa, aumenta o es más fuerte en las células cono que comprenden un casete de polinucleótido que codifica una 5'UTR divulgada en este documento que en las células cono que llevan el transgén unido operativamente a una secuencia de codificación 5'UTR diferente. Como otro ejemplo, la expresión del transgén se potencia, o incrementa, aumenta o es más fuerte en células cono que comprenden un casete de polinucleótidos que comprende un intrón como se describe en este documento que en células cono que llevan el transgén unido operativamente a una secuencia intrónica diferente como se conoce en la técnica. Las secuencias de ejemplo que comprenden elementos (por ejemplo, promotores, secuencias potenciadoras, 5'UTR e intones) que pueden usarse como referencias para comparación incluyen secuencias abarcadas por el promotor nativo de L-opsina (SEQ ID NO: 1) y variantes del mismo, secuencias abarcadas por el promotor sintético pR2.1 (SEQ ID NO: 50) y variantes del mismo (por ejemplo, pR1.7, pR1.5, pR1.1) como se describe en, por ejemplo Solicitud U.S. No.

[0168] 2013/0317091, y secuencias abarcadas por el promotor IRBP/GNAT2 (Solicitud U.S. No. 2014/0275231).

[0169] Sin querer estar limitados por la teoría, se cree que una expresión potenciada de un transgén en las células se debe a una acumulación más rápida del producto génico en las células o a un producto génico más estable en las células. De este modo, la expresión potenciada de un transgén por los casetes de polinucleótidos de la invención objeto se puede observar de varias maneras. Por ejemplo, se puede observar una expresión potenciada al detectar la expresión del transgén después del contacto del casete de polinucleótidos con las células cono antes, por ejemplo, 7 días antes, 2 semanas antes, 3 semanas antes, 4 semanas antes, 8 semanas antes, 12 semanas antes o más, de lo que se detectaría la expresión si el transgén estuviera unido operativamente a elementos reguladores comparables, por ejemplo como se conoce en la técnica. Una expresión potenciada también puede observarse como un aumento en la cantidad de producto genético por célula. Por ejemplo, puede haber un aumento de 2 veces o más, por ejemplo, un aumento de 3 veces o más, un aumento de 4 veces o más, un aumento de 5 veces o más, o un aumento de 10 veces o más en la cantidad de producto génico por célula cono. La expresión potenciada también puede observarse como un aumento en el número de células cono que expresan niveles detectables del transgén transportado por el casete de polinucleótidos. Por ejemplo, puede haber un aumento de 2 veces o más, por ejemplo, un aumento de 3 veces o más, un aumento de 4 veces o más, un aumento de 5 veces o más, o un aumento de 10 veces o más en el número de células cono que expresan niveles detectables del transgén. Como otro ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede promover niveles detectables del transgén en un mayor porcentaje de células en comparación con un casete de polinucleótido convencional; por ejemplo, donde un casete convencional puede promover niveles detectables de expresión del transgén en, por ejemplo, menos del 5% de las células cono en una región determinada, el polinucleótido de la presente invención promueve niveles detectables de expresión en el 5% o más de las células cono en esa región; por ejemplo, 10% o más, 15% o más, 20% o más, 25% o más, 30% o más, 35% o más, 40% o más, o 45% o más, en algunos casos 50% o más, 55% o más; 60% o más, 65% o más, 70% o más, o 75% o más, por ejemplo, 80% o más, 85% o más, 90% o más, o 95% o más de las células cono que entran en contacto expresarán niveles detectables de producto genético. La expresión potenciada también puede observarse como una alteración en la viabilidad y/o función de las células cono, por ejemplo medida utilizando herramientas de medición tales como fotografía del fondo de ojo, OCT, óptica adaptativa, cERG, pruebas de visión del color, pruebas de agudeza visual y similares, como se conoce en la técnica y como se describe en este documento.

[0170] Los casetes de polinucleótidos de la presente invención comprenden una región promotora que consiste en un promotor M-Opsina truncado que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 80 o un fragmento funcional o variante del mismo que tenga una identidad de secuencia del 85% o más con SEQ ID NO: 80. En algunas realizaciones, el promotor promueve específicamente la expresión del gen en células cono de la retina de mamíferos; más preferiblemente en células cono de la retina de primates; más preferiblemente en células cono de la retina de Catarrhini; incluso más preferiblemente en células cono de la retina humana. Por "específicamente" se entiende que el promotor promueve predominantemente la expresión del gen en las células objetivo en comparación con otros tipos de células. Así, por ejemplo, cuando se emplea una región promotora que promueve específicamente la expresión en células cono, más del 50% de la expresión, por ejemplo, al menos cualquiera del 60%, 65%, 70% o 75% o más de la expresión, por ejemplo, al menos cualquiera del 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más de la expresión del gen después de la administración del casete de polinucleótidos objeto al ojo será en células cono.

[0172] En algunas realizaciones, la región promotora del casete de polinucleótido objeto consiste en un promotor de M-opsina truncado que tiene la secuencia divulgada en este documento (s Eq ID NO: 80), o un fragmento funcional o variante del mismo que tiene una identidad de secuencia del 90% o más, o del 95% o más con la secuencia mencionada anteriormente. En algunas realizaciones, la secuencia promotora del casete de polinucleótido objeto consiste esencialmente en SEQ ID NO:80, o una secuencia que tiene una identidad del 95% o más con la secuencia mencionada anteriormente. En algunas realizaciones, el promotor da como resultado una expresión potenciada en células cono en comparación con otros promotores conocidos en la técnica, por ejemplo, los promotores sintéticos pR2.1, pR1.7, pR1.1 e IRBP/GNAT2.

[0174] En algunas realizaciones, el casete de polinucleótidos comprende además un elemento potenciador. Los potenciadores son elementos de ácido nucleico conocidos en la técnica para potenciar la transcripción y pueden ubicarse en cualquier lugar asociado con el gen que regulan, por ejemplo, corriente arriba, corriente abajo, dentro de un intrón, etc. Cualquier elemento potenciador puede usarse en los casetes de polinucleótidos y vectores de terapia génica de la presente invención, siempre que potencie la expresión del gen cuando se use en combinación con el promotor. En una realización preferida, el elemento potenciador es específico para las células cono retiniano; más preferiblemente, es específico para las células cono retiniano de primates; más preferiblemente en las células cono retiniano de Catarrhini; incluso más preferiblemente en las células cono retiniano de humanos. Por "específicamente" se entiende que el potenciador potencia predominantemente la expresión del gen en las células objetivo en comparación con otros tipos de células. Así, por ejemplo, cuando se emplea un potenciador que potencia específicamente la expresión en células cono, más del 50% de la expresión, por ejemplo, al menos cualquiera del 60%, 65%, 70%, 75% o más de la expresión, por ejemplo, al menos el 80%, y preferiblemente el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, o más de la expresión del gen después de la administración del vector al ojo será en células cono.

[0176] Las regiones potenciadoras de ejemplo que encuentran uso en los casetes de polinucleótidos de la presente invención incluyen aquellas que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en la región potenciadora para cualquier gen específico del cono o fragmentos o variantes del mismo que retienen la actividad potenciadora. Por ejemplo, el potenciador mínimo de L/M opsina, conocido como Región de Control del Locus (LCR) (Wang et al., 1992. Neuron 9: 429-440) (SEQ ID<n>O: 52) se puede utilizar para potenciar la expresión génica en las células cono; su ausencia da como resultado una monocromaticidad de conos azules (Nathans et al., 1989; Science, 245: 831-838). Se ha demostrado que la LCR es útil en la terapia génica, por ejemplo con vectores AAV (Li et al., Vision Research 48(2008): 332-338). Además, se ha identificado un fragmento funcional que consiste esencialmente en una secuencia LCR "de núcleo" de 36 pb que es necesaria y suficiente para la expresión del promotor de opsina en las células cono (Komaromy et al. Targeting gene expression to cones with human cone opsin promoters in recombinant AAV. Gene Ther. 2008; 15(14):1049-55) (SEQ ID NO:51). En algunas realizaciones, el potenciador del casete de polinucleótidos comprende SEQ ID NO:51 o SEQ ID NO:52. En ciertas realizaciones, el potenciador del casete de polinucleótidos consiste esencialmente en SEQ ID NO:51 o SEQ ID NO:52.

[0178] Los elementos potenciadores de L/M de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 o más nucleótidos que comprenden una o más copias del potenciador de opsina mínimo de L/M y el potenciador de opsina completo de L/M, u otras porciones o variantes del mismo que conservan la actividad que mejora la expresión de genes de una manera específica del cono, encuentran uso en las presentes composiciones. Se puede utilizar cualquier método adecuado para identificar secuencias potenciadoras capaces de impulsar la expresión en células cono de primates para identificar dichos potenciadores, como lo entenderán los expertos en la técnica basándose en las enseñanzas aquí contenidas.

[0179] La longitud de las regiones promotoras y potenciadoras puede ser de cualquier longitud adecuada para el propósito previsto, y el espaciado entre las regiones promotoras y potenciadoras puede ser cualquier espaciado adecuado para promover la expresión específica del cono del producto génico. En varias realizaciones preferidas, el potenciador se ubica 0-1500; 0-1250; 0-1000; 0-750; 0-600; 0-500; 0-400; 0-300; 0-200; 0-100; 0-90; 0-80; 0-70; 0-60; 0-50; 0-40; 0-30; 0-20; o 0-10 nucleótidos corriente arriba del promotor. El promotor puede estar a cualquier distancia adecuada corriente arriba del gen codificado.

[0180] En algunas realizaciones, el casete de polinucleótidos objeto comprende una secuencia que codifica una región 5' no traducida, es decir, una secuencia de polinucleótidos que codifica una región 5' no traducida a la secuencia de codificación, también denominada la 5'UTR. En un casete de expresión, la 5'UTR se conoce en la técnica como la secuencia entre el sitio de inicio de la transcripción y la secuencia Kozak donde comienza la traducción de la proteína. Se sabe que la estructura secundaria del ARNm de la 5'UTR afecta los niveles de transcripción. Específicamente, para una expresión génica potenciada, la secuencia de la región 5'UTR en la presente invención se selecciona para minimizar o evitar las estructuras secundarias y los codones AUG (uAUG) corriente arriba que se sabe que disminuyen la eficiencia de la traducción debido a un escaneo ineficiente de los ribosomas y a falsos inicios de traducción (Kozak, 1995. PNAS 92:2662). Véase Davuluri et al., Genome Research, 2000: 10 (11); 1807-1816. Por ejemplo, la secuencia 5'UTR del gen humano HSP70 (SEQ ID NO: 58) ha sido identificada por su inusual capacidad para potenciar la traducción del ARNm, posiblemente debido a un mecanismo IRES (Rubtsova et al., 2003. P<n>A<s>278(25): 22350-22356; Vivinus et al, 2001. Eur J Biochem.

[0181] 268: 1908-1917). Se puede utilizar cualquier 5' UTR, pero lo ideal es que la secuencia de la 5' UTR tenga una estructura de ARNm secundaria mínima y secuencias AUG corriente arriba. Dicho de otra manera, en algunas realizaciones, la secuencia entre el sitio de inicio de la transcripción y el sitio de inicio de la traducción del casete de polinucleótido no contiene el polinucleótido ATG. En algunas realizaciones, la UTR 5' comprende, consiste esencialmente o consiste en SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88 o SEQ ID NO:89; o una variante de la misma, por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 85% o más con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88 y SEQ ID NO:89. En algunas realizaciones, parte o la totalidad de la secuencia 5'UTR está comprendida por una región promotora como se divulga en, por ejemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55 o SEQ ID NO:79. En otras realizaciones, la 5'UTR no está comprendida por la región promotora; véase, por ejemplo, la secuencia promotora central SEQ ID NO:84, que no codifica la secuencia 5' UTR. En algunas realizaciones, la secuencia 5'UTR es heteróloga a la secuencia promotora. En varias realizaciones preferidas, el extremo 3' de la UTR está 0-20; 0-15; 0-10; 0-9; 0-8; 0-7; 0-6; o 0-5 nucleótidos corriente arriba de la secuencia de codificación, y su extremo 5' está 0-20; 0-15; 0-10; 0-9; 0-8; 0-7; 0-6; o 0-5 nucleótidos corriente abajo de la región promotora proximal. En algunas realizaciones, el elemento 5'UTR da como resultado una expresión potenciada en las células cono en comparación con otras 5'UTR conocidas en la técnica, por ejemplo, las 5'UTR comprendidas por los promotores sintéticos pR2.1, pR1.7, pR1.1 e IRBP/GNAT2.

[0183] En algunas realizaciones, el casete de polinucleótido objeto comprende además un intrón que comprende una región donante/aceptora de empalme. En algunas realizaciones, el intrón se ubica corriente abajo de la región promotora y corriente arriba de la secuencia de iniciación de la traducción del gen, es decir, el intrón se ubica dentro de la 5'UTR. En otras realizaciones, el intrón se ubica corriente abajo de la secuencia de iniciación de la traducción del gen, es decir, el intrón se ubica dentro de la secuencia de codificación. Como es generalmente conocido en la técnica, los intrones son polinucleótidos de ADN que se transcriben en ARN y se eliminan durante el procesamiento del ARNm a través del empalme de intrones. Los casetes de polinucleótidos que contienen intrones generalmente tienen mayor expresión que aquellos sin intrones. Los intrones pueden estimular la expresión entre 2 y 500 veces (Buchman and Berg, 1988. Mol Cel Bio, 8(10): 4395). Los intrones empalmados de manera eficiente contienen un donante previo al empalme, un punto de ramificación y una región rica en Py (Senapathy et al, 1990; Meth. Enzymol. 183, 252-78; Wu and Krainer, 1999; Mol Cell Biol 19(5):3225-36). Los intrones 5' son generalmente más eficientes en comparación con los intrones en el extremo 3' (Huang and Gorman, 1990; Mol Cell Bio, 10:1805). Aunque se sabe en general que los intrones aumentan el nivel de expresión génica, el aumento específico (si lo hay) de un ADNc determinado es empírico y debe probarse; por ejemplo, el intrón quimérico en el vector pSI aumenta la expresión de CAT en 21 veces, pero la expresión de luciferasa solo en 3 veces.

[0185] Se puede utilizar cualquier intrón en los casetes de polinucleótidos objeto, siempre que comprenda una región donante/aceptora de empalme reconocida en células cono de mamíferos o de primates, de modo que el intrón pueda extraerse del producto de ARNm resultante. En una realización, el intrón comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un intrón SV40 de acuerdo con SEQ ID NO:5. En otra realización, el intrón comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el intrón quimérico de pSI (SEQ ID NO:60) o una variante del mismo. En otra realización, el intrón comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el intrón A de CMV o una variante del mismo. En otra realización más, el intrón comprende, consiste esencialmente en, o consiste en el intrón pR2.1 (SEQ ID NO: 59) o una variante del mismo, o alternativamente, el intrón de beta globina de conejo o humano (Xu et al, 2001, Gene 272:149; Xu et al.2002; J Control Rel 81:155) o una variante del mismo. En algunas de estas realizaciones, el intrón comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia del 85% o más con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60. Típicamente, el intrón es heterólogo a la región promotora y/o a la 5'UTR.

[0187] En algunas realizaciones, el intrón reside dentro de una 5'UTR. En otras palabras, la secuencia de ADN que codifica la 5'UTR está interrumpida por una secuencia de ADN intrónica. Por ejemplo, la secuencia de codificación para la 5'UTR que es SEQ ID NO:84 puede estar codificada en dos partes, por ejemplo SEQ ID NO:85 y SEQ ID NO:86, con una secuencia intrónica entre ellas. Como otro ejemplo, las secuencias de codificación para la 5'UTR que es SEQ ID NO:88 pueden estar codificadas en dos partes, por ejemplo SEQ ID NO:89 y SEQ ID NO:73, con una secuencia intrónica entre ellas. En diversas realizaciones, el extremo 3' del intrón está 0-20; 0-15; 0-10; 0-9; 0-8; 0-7; 0-6; o 0-5 nucleótidos corriente arriba del gen, y su extremo 5' está 0-20; 0-15; 0-10; 0-9; 0-8; 0-7; 0-6; o 0-5 nucleótidos corriente abajo de la región promotora proximal. En otras realizaciones, el intrón reside dentro de la secuencia de codificación del gen.

[0189] En algunas realizaciones, los casetes de polinucleótidos de la presente invención comprenden una secuencia de iniciación de la traducción, también conocida como "secuencia Kozak" o "secuencia de iniciación de la traducción Kozak". Esta es la secuencia de ácido nucleico donde se une el ribosoma y comienza la traducción. Los ejemplos incluyen ACCATGG (Kozak, 1986. Cell, 44:283-292) y (GCC)GCC(A/G)CCATGG (Kozak, 1987. Nucl Acid Res; 15(20): 8125) (SEQ ID NO:73). Se puede utilizar cualquier secuencia Kozak adecuada en el casete de polinucleótidos, preferiblemente seleccionada para aumentar la expresión de la secuencia de codificación en las células cono de la retina. En una realización, la secuencia de iniciación de la traducción comprende SEQ ID NO:72. En una realización alternativa, la secuencia de iniciación de la traducción comprende SEQ ID NO:73. En algunas realizaciones, el elemento Kozak da como resultado una expresión mejorada en células cono en comparación con otras secuencias Kozak conocidas en la técnica, por ejemplo, las secuencias Kozak comprendidas por los promotores sintéticos pR2.1, pR1.7, pR1.1 e IRBP/GNAT2.

[0190] En algunos aspectos de la presente invención, los casetes de polinucleótidos objeto son adecuados para la administración de un gen a células cono de un animal, por ejemplo, para determinar el efecto que el gen tiene sobre la viabilidad y/o función celular, para tratar un trastorno de las células cono, etc. En consecuencia, los casetes de polinucleótidos de la presente invención comprenden además un gen que se administrará como transgén a las células cono de un animalin vitrooin vivo.La secuencia de codificación del gen está unida operativamente a la región promotora del casete de polinucleótido objeto y, en los casos en los que está presente un elemento potenciador, al elemento potenciador del casete de polinucleótido objeto, de modo que el promotor y opcionalmente los elementos potenciadores promueven la expresión de la secuencia de codificación o ADNc en las células cono del sujeto.

[0192] La secuencia de codificación que se expresará en las células cono puede ser cualquier secuencia de polinucleótidos, por ejemplo un gen o ADNc que codifique una proteína terapéutica que tenga una identidad de secuencia de al menos el 85% con SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 32. La secuencia de codificación puede ser heteróloga a la secuencia promotora y/o a la secuencia 5'UTR a la que está unida operativamente, es decir, no estar asociada operativamente de forma natural con ella. Alternativamente, la secuencia de codificación puede ser endógena a la secuencia promotora y/o secuencia 5'UTR a la que está unida operativamente, es decir, está asociada en la naturaleza con ese promotor o 5'UTR. El producto del gen puede actuar intrínsecamente en la célula cono o puede actuar extrínsecamente, por ejemplo, puede secretarse. La secuencia de codificación codifica un producto genético deseado o un fragmento funcional o variante del mismo que se puede utilizar como terapia para tratar una enfermedad o trastorno de las células cono, o como un medio para potenciar la visión, incluyendo, pero sin limitar, la promoción de la visión en color tetracromática. El transgén codifica una proteína terapéutica que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con:

[0194] (a) SEQ ID NO:11 (SEQ ID NO:10) Homo sapiens opsina 1 (pigmentos de cono), sensible a ondas largas (OPN1LW), Secuencia de referencia de ARNm del NCBI: NM__020061.4; o

[0196] (b) SEQ ID NO: 32 proteína del canal dependiente de nucleótidos cíclicos del fotorreceptor de cono, subunidad beta (acromatopsia).

[0198] En algunas realizaciones, la secuencia de codificación codificada por el transgén codifica un polipéptido que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 95% de identidad de secuencia, al menos un 98% de identidad de secuencia o al menos un 99% de identidad de secuencia, con SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 32.

[0200] La proteína mencionada en (a) está involucrada en la visión del color.

[0202] La proteína citada (b) es un gen asociado a una enfermedad ocular ejemplar, como por ejemplo la acromatopsia (polipéptido "q").

[0204] En una realización de la invención, la secuencia de codificación del transgén se modifica o se "optimiza por codones" para potenciar la expresión reemplazando codones representados con poca frecuencia por codones representados con mayor frecuencia. La secuencia de codificación es la porción de la secuencia de ARNm que codifica los aminoácidos para la traducción. Durante la traducción, cada uno de los 61 codones de trinucleótidos se traduce a uno de los 20 aminoácidos, lo que conduce a una degeneración o redundancia en el código genético. Sin embargo, distintos tipos de células y distintas especies animales utilizan ARNt (cada uno con un anticodón) que codifican los mismos aminoácidos en diferentes frecuencias. Cuando una secuencia genética contiene codones que rara vez están representados por el ARNt correspondiente, la maquinaria de traducción del ribosoma puede ralentizarse, lo que impide una traducción eficiente. La expresión se puede mejorar mediante la "optimización de codones" para una especie particular, donde la secuencia de codificación se altera para codificar la misma secuencia de proteína, pero utilizando codones que están altamente representados y/o utilizados por proteínas humanas altamente expresadas (Cid-Arregui et al., 2003; J. Virol. 77: 4928). En un aspecto de la presente invención, la secuencia de codificación del transgén se modifica para reemplazar codones expresados con poca frecuencia en mamíferos o en primates con codones expresados con frecuencia en primates. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la secuencia de codificación codificada por el transgén codifica un polipéptido que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 32, por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 95% de identidad de secuencia, al menos un 98% de identidad, al menos un 99% de identidad, en donde al menos un codón de la secuencia de codificación tiene una frecuencia de ARNt más alta en humanos que el codón correspondiente en la secuencia divulgada anteriormente o en este documento.

[0206] En una realización adicional de la invención, la secuencia de codificación del transgén se modifica para potenciar la expresión mediante la terminación o eliminación de marcos de lectura abiertos (ORF) que no codifican el transgén deseado. Un marco de lectura abierto (ORF) es la secuencia de ácido nucleico que sigue a un codón de inicio y no contiene codones de parada. Los ORF pueden estar en orientación directa o inversa y pueden estar "en marco" o "fuera de marco" en comparación con el gen de interés. Estos marcos de lectura abiertos tienen el potencial de expresarse en un casete de expresión junto con el gen de interés y podrían provocar efectos adversos no deseados. En un aspecto de la presente invención, se ha modificado la secuencia de codificación del transgén para eliminar los marcos de lectura abiertos alterando aún más el uso de codones. Esto se hizo eliminando codones de inicio (ATG) e introduciendo codones de parada (TAG, TAA o TGA) en orientación inversa o en ORFs fuera de marco, mientras se preservaba la secuencia de aminoácidos y se mantenían codones altamente utilizados en el gen de interés (es decir, evitando codones con frecuencia < 20%). En la presente invención, la secuencia de codificación del transgén se puede optimizar mediante la optimización de codones y la eliminación de ORF no transgénicos o utilizando ambas técnicas. Como será evidente para una persona con conocimientos normales en la técnica, es preferible eliminar o minimizar los ORF no transgénicos después de la optimización de codones para eliminar los ORF introducidos durante la optimización de codones. En las figuras 3A a 3C se muestran ejemplos de optimización de codones y eliminación de los ORF.

[0208] El casete de polinucleótidos de la presente invención comprende además una región de poliadenilación. Como se entiende en la técnica, las transcripciones de la ARN polimerasa II se terminan mediante la escisión y la adición de una región de poliadenilación, también conocida como señal poli A, región poli A o cola poli A. La región poli A contiene múltiples monofosfatos de adenosina consecutivos, a menudo con repeticiones del motivo AAUAAA. Se han identificado varios sitios de poliadenilación eficientes, incluidos los de SV40, la hormona de crecimiento bovino, la hormona de crecimiento humana y la beta globina de conejo (Xu et al, 2001; Gene 272: 149; Xu et al., 2002; J Control Rel. 81:155). La señal poliA más eficiente para la expresión de un transgén en células cono puede depender del tipo de célula y de la especie de interés y del vector particular utilizado. En algunas realizaciones de la invención, el casete de polinucleótidos comprende la región poliA seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:90 o SEQ ID NO:91 o un fragmento funcional o variante del mismo de cualquiera de las secuencias anteriores. En ciertas realizaciones, la región poliA comprende SEQ ID NO: 90 o una variante de la misma. En algunas de estas realizaciones, la región poliA consiste esencialmente en SEQ ID NO: 90 o una variante de la misma.

[0210] Como lo apreciará el artesano normalmente experto, dos o más de los elementos polinucleotídicos antes mencionados pueden combinarse para crear los casetes polinucleotídicos de la presente invención. Así, por ejemplo, el casete de polinucleótido objeto puede comprender una región promotora que comprende una secuencia promotora mejorada en enlace operativo con una secuencia 5'UTR mejorada, por ejemplo SEQ ID NO:80 en combinación operativa con SEQ<i>D NO:84 o SEQ ID NO:85, véase, por ejemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94 o SEQ ID NO:95. Como otro ejemplo, el casete de polinucleótido objeto puede comprender una secuencia o región potenciadora mejorada en enlace operativo con una secuencia o región promotora mejorada, por ejemplo SEQ ID NO:51 o SEQ ID NO:52 en combinación operativa con SEQ ID NO:80; véase, por ejemplo, s Eq ID NO:92 o SEQ ID NO:95. Como otro ejemplo, el casete de polinucleótido objeto puede comprender una secuencia 5'UTR mejorada en enlace operativo con una secuencia de intrón mejorada, por ejemplo SEQ ID NO:84 o SEQ ID NO:86 en combinación operativa con SEQ ID NO:60; véase, por ejemplo, SEQ ID NO:94 o SEQ ID NO:95. Como otro ejemplo, el casete de polinucleótido objeto puede comprender una secuencia 5'UTR mejorada en enlace operativo con una secuencia de intrón mejorada y una secuencia Kozak mejorada, por ejemplo, SEQ ID<n>O:84 o SEQ ID NO:86 en combinación operativa con SEQ ID NO:60 y con SEQ ID NO:73; véase, por ejemplo, SEQ ID NO:95. Como otro ejemplo, el casete de polinucleótido objeto puede comprender un potenciador mejorado, un promotor mejorado, una 5'UTR mejorada, un intrón mejorado, un kozak mejorado y una región poliA mejorada en enlace operativo; véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 95. El artesano normalmente experto podrá apreciar fácilmente otras combinaciones de elementos, tanto los descritos aquí como los conocidos en la técnica.

[0212] Además, como reconocerá una persona con conocimientos normales en la técnica, los casetes de polinucleótidos pueden contener opcionalmente otros elementos que incluyen, pero no se limitan a, sitios de restricción para facilitar la clonación y elementos reguladores para un vector de expresión génica particular. Los ejemplos de secuencia reguladora incluyen ITR para vectores AAV, secuencias bacterianas para vectores plasmídicos, sitiosattPoattBpara vectores de integrasa de fagos y elementos transponibles para transposones.

[0214] Vectores de terapia génica

[0216] Como se mencionó anteriormente, en algunos aspectos de la presente invención, los casetes de polinucleótidos de la invención son adecuados para la administración de un gen a células cono de un animal, por ejemplo, para determinar el efecto que el gen tiene sobre la viabilidad y/o función celular, para tratar un trastorno de las células cono, etc. Por consiguiente, en algunos aspectos de la invención, la composición que permite la expresión de un transgén en células cono es un vector de administración de genes, donde el vector de administración de genes comprende los casetes de polinucleótidos de la presente invención.

[0218] El vector de administración de genes es un virus adenoasociado recombinante (rAAV). En las realizaciones, el casete de polinucleótido objeto está flanqueado en los extremos 5' y 3' por secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de AAV funcionales. Por "secuencias ITR de AAV funcionales" se entiende que las secuencias ITR funcionan según lo previsto para el rescate, la replicación y el empaquetamiento del virión de AAV. Por lo tanto, los ITR de AAV para uso en los vectores de administración de genes de la invención no necesitan tener una secuencia de nucleótidos de tipo salvaje, y pueden alterarse mediante la inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos, o los ITR de AAV pueden derivarse de cualquiera de varios serotipos de AAV, por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10. Los vectores AAV preferidos tienen los genes REP y CAP de tipo salvaje eliminados total o parcialmente, pero conservan secuencias ITR flanqueantes funcionales.

[0220] En dichas realizaciones, el casete de polinucleótido objeto está encapsidado dentro de una cápside de AAV, que puede derivarse de cualquier serotipo de virus adenoasociado, incluidos, sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, Aa V4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, etc. Por ejemplo, la cápside de AAV puede ser una cápside de tipo salvaje o nativa. Las cápsides de AAV de tipo salvaje de particular interés incluyen AAV2, AAV5 y AAV9. Sin embargo, al igual que con los ITR, la cápside no necesita tener una secuencia de nucleótidos de tipo salvaje, sino que puede ser alterada mediante la inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos en la secuencia VP1, VP2 o VP3, siempre que la cápside sea capaz de transducir células cono. Dicho de otra manera, la cápside de AAV puede ser una cápside de AAV variante. Las cápsides de AAV variantes de particular interés incluyen aquellas que comprenden una inserción de péptido dentro de los residuos 580-600 de AAV2 o los residuos correspondientes en otro AAV, por ejemplo, Lg ETTRP, NETITRP, KAGQANN, KDPKTTN, KDTDTTR, RAGGSVG, AVDTTKF, o STGKVPN, como se divulga en la solicitud de EE. UU. No. US 2014/0294771. En algunas realizaciones, el vector AAV es un AAV "pseudotipado" creado mediante el uso del gen de la cápside (cap) de un AAV y el gen rep y los ITR de un AAV diferente, por ejemplo, un AAV2 pseudotipado creado mediante el uso de rep de AAv2 y cap de AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, aAv6, AAV7, AAV8 o AAV9 junto con un plásmido que contiene un vector basado en AAV2. Por ejemplo, el vector AAV puede ser rAAV2/1, rAAV2/3, rAAV2/4, rAAV2/5, rAAV2/6, rAAV2/7, rAAV2/8, rAAV2/9, etc. Preferiblemente, el rAAV es defectuoso en replicación, ya que el vector AAV no puede replicarse y empaquetar independientemente su genoma. Por ejemplo, cuando las células cono se transducen con viriones rAAV, el gen se expresa en las células cono transducidas, sin embargo, debido al hecho de que las células cono transducidas carecen de los genes rep y cap de AAV y de los genes de función accesoria, el rAAV no puede replicarse.

[0222] Los vectores de terapia génica, (por ejemplo, rAAV) viriones que encapsulan los casetes de polinucleótidos de la presente invención, se pueden producir utilizando una metodología estándar. Por ejemplo, en el caso de viriones rAAV, un vector de expresión de AAV de acuerdo con la invención puede introducirse en una célula productora, seguido de la introducción de un constructo auxiliar de AAV, donde el constructo auxiliar incluye regiones de codificación de AAV capaces de expresarse en la célula productora y que complementan funciones auxiliares de AAV ausentes en el vector de AAV. A esto le sigue la introducción del virus auxiliar y/o vectores adicionales en la célula productora, en donde el virus auxiliar y/o vectores adicionales proporcionan funciones accesorias capaces de sustentar una producción eficiente del virus rAAV. Luego se cultivan las células productoras para producir rAAV. Estos pasos se llevan a cabo utilizando la metodología estándar. Los viriones de AAV con replicación defectuosa que encapsulan los vectores de AAV recombinantes de la presente invención se elaboran mediante técnicas estándar conocidas en la técnica utilizando células de empaquetamiento de AAV y tecnología de empaquetamiento. Se pueden encontrar ejemplos de estos métodos, por ejemplo, en la Patente U.S. Nos. 5,436,146; 5,753,500, 6,040,183, 6,093,570 y 6,548,286. Se describen composiciones y métodos de envasado adicionales en Wang et al. (US 2002/0168342).

[0224] Se puede utilizar cualquier método adecuado para producir partículas virales para la administración de los casetes de polinucleótidos objeto, incluidos, pero no limitados a aquellos descritos en los ejemplos que siguen. Se puede preparar cualquier concentración de partículas virales adecuada para transducir eficazmente las células cono para ponerlas en contactoin vitrooin vivo.Por ejemplo, las partículas virales pueden formularse a una concentración de 108 genomas vectoriales por ml o más, por ejemplo, 5x108 genomas vectoriales por mL; 109 genomas vectoriales por mL; 5 x 109 genomas vectoriales por mL, 1010 genomas vectoriales por mL, 5x1010 genomas vectoriales por mL; 1011 genomas vectoriales por mL; 5 x 1011 genomas vectoriales por mL; 1012 genomas vectoriales por mL; 5x1012 genomas vectoriales por mL; 1013 genomas vectoriales por mL; 1.5 x 1013 genomas vectoriales por mL; 3x1013 genomas vectoriales por mL; 5x1013 genomas vectoriales por mL; 7.5x1013 genomas vectoriales por mL; 9x1013 genomas vectoriales por mL; 1 x 1014 genomas vectoriales por mL, 5 x 1014 genomas vectoriales por mL o más, pero típicamente no más de 1 x 1015 genomas vectoriales por mL. De manera similar, se puede administrar al ojo del mamífero o al del primate cualquier número total de partículas virales adecuadas para proporcionar una transducción apropiada de las células cono de la retina para conferir el efecto deseado o tratar la enfermedad. En varios ejemplos preferidos, al menos 108; 5x108; 109; 5 x 109, 1010, 5x1010; 1011; 5 x1011; 1012; 5x1012; 10131.5 x1013; 3x1013; 5x1013; 7.5x1013; 9x1013, 1 x 1014 partículas virales, o 5 x 1014 partículas virales o más, pero típicamente no más de 1 x 1015 partículas virales se inyectan por ojo. Se puede realizar cualquier número adecuado de administraciones del vector al ojo del mamífero o del primate. En un ejemplo, los métodos comprenden una única administración; en otros ejemplos, se realizan múltiples administraciones a lo largo del tiempo según lo considere apropiado el médico tratante.

[0225] El vector viral objeto puede formularse en cualquier dosis unitaria adecuada, incluyendo, sin limitación, 1x108 genomas vectoriales o más, por ejemplo, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, o 1x1013 genomas vectoriales o más, en ciertos casos, 1x1014 genomas vectoriales, pero por lo general no más de 4x1015 genomas vectoriales. En algunos casos, la dosis unitaria es como máximo de aproximadamente 5x1015 genomas vectoriales, por ejemplo 1x1014 genomas vectoriales o menos, por ejemplo 1x1013, 1x1012, 1x1011, 1x1010, o 1x109 genomas vectoriales o menos, en ciertos casos 1x108 genomas vectoriales o menos, y típicamente no menos de 1x108 genomas vectoriales. En algunos casos la dosis unitaria es de 1x1010 hasta 1x1011 genomas vectoriales. En algunos casos la dosis unitaria es de 1x1010 hasta 3x1012 genomas vectoriales. En algunos casos la dosis unitaria es de 1x109 hasta 3x1013 genomas vectoriales. En algunos casos la dosis unitaria es de 1x108 hasta 3x1014 genomas vectoriales.

[0227] En algunos casos, la dosis unitaria de una composición farmacéutica puede medirse utilizando la multiplicidad de infección (MOI). Por MOI se entiende la relación o múltiplo de los genomas del vector o del virus respecto de las células a las que se puede administrar el ácido nucleico. En algunos casos, la MOI puede ser 1x106. En algunos casos, la MOI puede ser 1x105 -1x107. En algunos casos, la MOI puede ser 1x104 -1x108. En algunos casos, los virus recombinantes de la invención son al menos aproximadamente 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017, y 1x1018MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de esta invención son 1x108 hasta 3x1014 MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de la invención tienen como máximo aproximadamente 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017, y 1x1018MOI.

[0228] En algunos aspectos, la cantidad de composición farmacéutica comprende aproximadamente 1 x 108 hasta aproximadamente 1 x 1015 virus recombinantes, aproximadamente 1 x 109 hasta aproximadamente 1 x 1014 virus recombinantes, aproximadamente 1 x 1010 hasta aproximadamente 1 x 1013 virus recombinantes, o aproximadamente 1 x 1011 hasta aproximadamente 3 x 1012 virus recombinantes.

[0230] Al preparar las composiciones de rAAV objeto, se puede emplear cualquier célula huésped para producir viriones de rAAV, incluidas, por ejemplo, células de mamíferos (por ejemplo, células 293), células de insectos (por ejemplo, células SF9), microorganismos y levaduras. Las células huésped también pueden ser células empaquetadoras en las que los genes rep y cap de AAV se mantienen de forma estable en la célula huésped o células productoras en las que el genoma del vector de AAV se mantiene y empaqueta de forma estable. Las células productoras y de empaquetamiento de ejemplo se derivan de células SF-9, 293, A549 o HeLa. Los vectores AAV se purifican y formulan utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica.

[0232] Para los casos en los que las células cono se deben poner en contactoin vivo,los casetes de polinucleótidos objeto o los vectores de administración de genes que comprenden el casete de polinucleótidos objeto se pueden tratar como apropiados para su administración al ojo. En particular, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden un casete de polinucleótidos o un vector de administración de genes de la invención y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los casetes de polinucleótidos objeto o el vector de administración de genes se pueden combinar con vehículos, diluyentes y reactivos farmacéuticamente aceptables útiles para preparar una formulación que sea generalmente segura, no tóxica y deseable, e incluya excipientes que sean aceptables para el uso en primates. Dichos excipientes pueden ser sólidos, líquidos, semisólidos o, en el caso de una composición de aerosol, gaseosos. Ejemplos de dichos vehículos o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5%. También se pueden incorporar a las formulaciones compuestos activos complementarios. Las soluciones o suspensiones utilizadas para las formulaciones pueden incluir un diluyente estéril como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; compuestos antibacterianos como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; compuestos quelantes como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); tampones como acetatos, citratos o fosfatos; detergentes como Tween 20 para evitar la agregación; y compuestos para el ajuste de la tonicidad como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, como el ácido clorhídrico o el hidróxido de sodio.

[0233] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso interno en la presente invención incluyen además soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunos casos, la composición es estéril y debe ser fluida hasta el punto de que sea fácil inyectarla. En ciertas realizaciones, es estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conserva frente a la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El vehículo puede ser, por ejemplo, un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones internas se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

[0234] Las soluciones estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de una esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada y estéril del mismo.

[0236] En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, como etilenvinilacetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente. Las suspensiones liposomales (incluidos los liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también pueden utilizarse como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse según métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Patente U.S. No. 4,522,811.

[0238] Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosis. La forma unitaria de dosificación, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones de las formas unitarias de dosificación de la invención están dictadas por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se desea lograr, y de las limitaciones inherentes a la técnica de preparación de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.

[0239] Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, paquete o dispensador, por ejemplo una jeringa, por ejemplo una jeringa precargada, junto con instrucciones para su administración.

[0241] Las composiciones farmacéuticas de la invención abarcan cualquier sal, éster o sal de dichos ésteres farmacéuticamente aceptable, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un animal que comprende un ser humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. En consecuencia, por ejemplo, la divulgación también se dirige a profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes.

[0243] El término "profármaco" indica un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir, fármaco) dentro del cuerpo o de sus células mediante la acción de enzimas endógenas u otros productos químicos y/o condiciones.

[0245] El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención: es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto original y no le imparten efectos toxicológicos no deseados. Se conocen en la técnica diversas sales farmacéuticamente aceptables, que se describen, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th edition, Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985 (y ediciones más recientes de las mismas), en la "Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology", 3a edición, James Swarbrick (Ed.), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007, y en J. Pharm. Sci. 66: 2 (1977). Además, para una revisión sobre sales adecuadas, consulte Manual de sales farmacéuticas: Propiedades, selección y uso de Stahl y Wermuth (Wiley-VCH, 2002)).

[0247] Las sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables se forman con metales o aminas, como metales alcalinos y alcalinotérreos o aminas orgánicas. Los metales utilizados como cationes incluyen sodio, potasio, magnesio, calcio y similares. Las aminas comprenden N-N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilendiamina, N-metilglucamina y procaína (véase, por ejemplo, Berge et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharma Sci., 1977, 66, 119). Las sales de adición de base de dichos compuestos ácidos se preparan poniendo en contacto la forma de ácido libre con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal de la manera convencional. La forma de ácido libre se puede regenerar poniendo en contacto la forma de sal con un ácido y aislando el ácido libre de la manera convencional. Las formas de ácido libre difieren de sus respectivas formas de sal en ciertas propiedades físicas tales como la solubilidad en solventes polares, pero por lo demás las sales son equivalentes a sus respectivos ácidos libres para los propósitos de la presente invención.

[0249] El casete de polinucleótidos o vector de administración de genes objeto, por ejemplo, virus recombinante (viriones), se puede incorporar en composiciones farmacéuticas para su administración a pacientes mamíferos, particularmente primates y más particularmente seres humanos. El casete de polinucleótidos objeto o el vector de administración de genes, por ejemplo los viriones, se pueden formular en vehículos acuosos no tóxicos, inertes y farmacéuticamente aceptables, preferiblemente a un pH que oscila de 3 a 8, más preferiblemente de 6 a 8. Dichas composiciones estériles comprenderán el vector o virión que contiene el ácido nucleico que codifica la molécula terapéutica disuelto en un tampón acuoso que tiene un pH aceptable tras la reconstitución.

[0250] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica proporcionada en este documento comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector o virión en mezcla con un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, fosfato y aminoácidos, polímeros, polioles, azúcar, tampones, conservantes y otras proteínas. Los aminoácidos, polímeros y azúcares de ejemplo y similares son compuestos de polietoxi etanol octilfenoxi, compuestos de monoestearato de polietilenglicol, ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán, sacarosa, fructosa, dextrosa, maltosa, glucosa, manitol, dextrano, sorbitol, inositol, galactitol, xilitol, lactosa, trehalosa, albúmina sérica bovina o humana, citrato, acetato, soluciones de Ringer y Hank, cisteína, arginina, carnitina, alanina, glicina, lisina, valina, leucina, polivinilpirrolidona, polietileno y glicol. Preferiblemente, esta formulación es estable durante al menos seis meses a 4° C.

[0252] En algunas realizaciones, la composición farmacéutica proporcionada en este documento comprende un tampón, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) o fosfato de sodio/sulfato de sodio, tampón tris, tampón de glicina, agua estéril y otros tampones conocidos por el artesano normalmente experto, tales como los descritos por Good et al. (1966) Biochemistry 5:467. El pH del tampón en el que se encuentra la composición farmacéutica que comprende el gen supresor de tumores contenido en el sistema de administración del vector adenoviral, puede estar en el rango de 6.5 a 7.75, preferiblemente de 7 a 7.5, y más preferiblemente de 7.2 a 7.4.

[0254] Métodos

[0256] Como se mencionó anteriormente, los casetes de polinucleótidos y los vectores de administración de genes objeto, denominados colectivamente en este documento como las "composiciones objeto", encuentran uso en la expresión de un transgén en células cono de un animal. Por ejemplo, las composiciones objeto pueden usarse en investigación, por ejemplo para determinar el efecto que tiene el gen sobre la viabilidad y/o función de las células cono. Como otro ejemplo, las composiciones objeto se pueden usar en medicina, por ejemplo para tratar un trastorno de células cono. De este modo, se proporcionan métodos para la expresión de un gen en células cono, comprendiendo el método poner en contacto las células cono con una composición de la presente invención. En algunos ejemplos, el contacto ocurrein vitro.En algunos ejemplos, el contacto ocurrein vivo,es decir, la composición objeto se administra a un sujeto. Para evitar dudas, los métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal no forman parte de la invención.

[0258] Para los casos en los que las células cono se van a poner en contactoin vitrocon un casete de polinucleótidos de interés o un vector de administración de genes que comprende un casete de polinucleótidos de interés, las células pueden ser de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, roedor (por ejemplo, ratones, ratas, jerbos, ardillas), conejo, felino, canino, cabra, ovino, cerdo, equino, bovino, primate, humano. Las células pueden ser de líneas celulares establecidas, por ejemplo, células WERI, células 661W, o pueden ser células primarias, donde "células primarias", "líneas celulares primarias" y "cultivos primarios" se usan indistintamente en este documento para referirse a células y cultivos celulares que se han derivado de un sujeto y se han dejado crecerin vitropara un número limitado de pasajes, es decir, divisiones, del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios son cultivos que pueden haber sido sometidos a pases 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 15 veces, pero no suficientes veces como para pasar por la etapa de crisis. Típicamente, las líneas celulares primarias utilizadas en relación con la presente invención se mantienen durante menos de 10 pasesin vitro.

[0259] Si las células son células primarias, pueden recolectarse de un mamífero mediante cualquier método conveniente, por ejemplo, explanto completo, biopsia, etc. Se puede utilizar una solución adecuada para la dispersión o suspensión de las células recolectadas. Esta solución generalmente será una solución salina equilibrada, por ejemplo solución salina normal, PBS, solución salina balanceada de Hank,etc.,convenientemente suplementado con suero fetal de ternera u otros factores de origen natural, junto con un tampón aceptable a baja concentración, generalmente de 5-25 mM. Los tampones convenientes incluyen HEPES, tampones de fosfato, tampones de lactato, etc. Las células se pueden usar inmediatamente o se pueden almacenar congeladas durante largos períodos de tiempo, para luego descongelarlas y poder reutilizarlas. En tales casos, las células usualmente se congelarán en DMSO al 10%, suero al 50%, medio tamponado al 40% o alguna otra solución similar a la que se usa habitualmente en la técnica para conservar las células a dichas temperaturas de congelación, y se descongelarán de la manera comúnmente conocida en la técnica para descongelar células cultivadas congeladas.

[0261] Para promover la expresión del transgén, el casete de polinucleótidos objeto o el vector de administración de genes que comprende un casete de polinucleótidos objeto se pondrá en contacto con las células durante aproximadamente 30 minutos a 24 horas o más, por ejemplo, 1 hora, 1.5 horas, 2 horas, 2.5 horas, 3 horas, 3.5 horas 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 24 horas, etc. El casete de polinucleótidos objeto o el vector de administración de genes que comprende un casete de polinucleótidos objeto se puede proporcionar a las células objeto una o más veces, por ejemplo, una vez, dos veces, tres veces o más de tres veces, y las células se dejan incubar con los agentes durante una cierta cantidad de tiempo después de cada evento de contacto, por ejemplo, 16-24 horas, después de lo cual el medio se reemplaza con medio fresco y las células son además cultivadas. El contacto con las células puede ocurrir en cualquier medio de cultivo y bajo cualquier condición de cultivo que promueva la supervivencia de las células. Por ejemplo, las células pueden suspenderse en cualquier medio nutritivo apropiado que sea conveniente, como DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, suplementado con suero fetal de ternera o suero de cabra inactivado por calor (aproximadamente 5-10%), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol, y antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los cuales las células responden. Los factores de crecimiento, tal como se definen en este documento, son moléculas capaces de promover la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de las células, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen polipéptidos y factores no polipeptídicos.

[0263] Típicamente, se proporciona una cantidad eficaz de un casete de polinucleótido objeto o un vector de administración de genes que comprende un casete de polinucleótido objeto para producir la expresión del transgén en las células. Como se analiza en otra parte del presente documento, la cantidad efectiva puede determinarse fácilmente de forma empírica, por ejemplo, detectando la presencia o los niveles del producto génico del transgén, detectando un efecto en la viabilidad o la función de las células cono, etc. Típicamente, una cantidad efectiva de casete de polinucleótidos objeto o vector de administración de genes que comprende un casete de polinucleótidos objeto promoverá una mayor expresión del transgén en las células cono que la misma cantidad de un casete de polinucleótidos como se conoce en la técnica, por ejemplo, un casete pR2.1 (nucleótidos 1-2274 de SEQ ID NO:50), pR1.7, pR1.5, pR1.1 o IRBP/GNAT2. Típicamente, la expresión se potenciará 2 veces o más con respecto a la expresión de un casete de polinucleótido de referencia o de control, por ejemplo como se conoce en la técnica, por ejemplo 3 veces, 4 veces o 5 veces o más, en algunos casos 10 veces, 20 veces o 50 veces o más, por ejemplo 100 veces.

[0265] En algunos ejemplos, como cuando el transgén es un marcador seleccionable, la población de células puede enriquecerse con aquellas que comprenden el casete de polinucleótido objeto separando las células modificadas de la población restante. La separación puede realizarse mediante cualquier técnica de separación conveniente y apropiada para el marcador seleccionable utilizado. Por ejemplo, si el transgén es un marcador fluorescente, las células pueden separarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia, mientras que si el transgén es un marcador de superficie celular, las células pueden separarse de la población heterogénea mediante técnicas de separación por afinidad, por ejemplo, separación magnética, cromatografía de afinidad, "criba" con un reactivo de afinidad unido a una matriz sólida u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen clasificadores de células activados por fluorescencia, que pueden tener distintos grados de sofisticación, como canales de color múltiples, canales de detección de dispersión de luz de ángulo bajo y obtuso, canales de impedancia, etc. Las células pueden seleccionarse contra células muertas empleando colorantes asociados con células muertas (por ejemplo, yoduro de propidio). Se puede emplear cualquier técnica que no sea excesivamente perjudicial para la viabilidad de las células. De esta manera se logran composiciones celulares altamente enriquecidas con células que comprenden los polinucleótidos objeto. Por "altamente enriquecido" se entiende que las células genéticamente modificadas serán el 70% o más, el 75% o más, el 80% o más, el 85% o más, el 90% o más de la composición celular, por ejemplo, aproximadamente el 95% o más, o el 98% o más de la composición celular. En otras palabras, la composición puede ser una composición sustancialmente pura de células modificadas genéticamente.

[0267] Para los casos en los que las células cono se van a poner en contactoin vivocon un casete de polinucleótidos objeto o un vector de administración de genes que comprende un casete de polinucleótidos objeto, el objeto puede ser cualquier mamífero, por ejemplo, roedor (por ejemplo, ratones, ratas, jerbos), conejo, felino, canino, cabra, ovino, cerdo, equino, bovino o primate. En ciertas realizaciones, el objeto es un primate del Parvorder Catarrhini. Como se sabe en la técnica, Catarrhini es una de las dos subdivisiones de los primates superiores (la otra son los monos del Nuevo Mundo), e incluye a los monos del Viejo Mundo y a los simios, que a su vez se dividen en los simios menores o gibones y los grandes simios, que consisten en los orangutanes, gorilas, chimpancés, bonobos y humanos. En otra realización preferida, el primate es un ser humano.

[0269] La composición objeto puede administrarse a la retina del sujeto mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, la composición objeto puede administrarse intraocularmente mediante inyección intravítrea o inyección subretiniana. Los métodos generales para administrar un vector mediante inyección intravítrea o mediante inyección subretiniana pueden ilustrarse mediante los siguientes breves resúmenes. Estos ejemplos tienen como único fin ilustrar ciertas características de los métodos y de ningún modo pretenden ser limitantes.

[0270] Para la administración subretinal, el vector puede administrarse en forma de una suspensión inyectada subretinalmente bajo observación directa utilizando un microscopio quirúrgico. Por lo general, se administrará un volumen de 1 a 200 uL, por ejemplo 50 uL, 100 uL, 150 ul o 200 uL, pero usualmente no más de 200 uL, de la composición objeto mediante dichos métodos. Este procedimiento puede implicar una vitrectomía seguida de una inyección de suspensión del vector utilizando una cánula fina a través de una o más retinotomías pequeñas en el espacio subretinal. En pocas palabras, se puede suturar una cánula de infusión en su lugar para mantener un volumen normal del globo ocular mediante infusión (por ejemplo, de solución salina) durante toda la operación. Se realiza una vitrectomía utilizando una cánula de tamaño de orificio adecuado (por ejemplo, calibre 20 a 27), en donde el volumen de gel vítreo que se extrae se reemplaza por infusión de solución salina u otra solución isotónica desde la cánula de infusión. La vitrectomía se realiza ventajosamente porque (1) la extracción de su corteza (la membrana hialoidea posterior) facilita la penetración de la cánula en la retina; (2) su extracción y reemplazo con fluido (por ejemplo, solución salina) crea espacio para acomodar la inyección intraocular del vector, y (3) su extracción controlada reduce la posibilidad de desgarros de retina y desprendimiento de retina no planificado.

[0272] Para la administración intravítrea, el vector puede administrarse en forma de suspensión. Inicialmente, se aplica un anestésico tópico en la superficie del ojo seguido de una solución antiséptica tópica. Se mantiene el ojo abierto, con o sin instrumentación, y se inyecta el vector a través de la esclerótica con una aguja corta y estrecha, por ejemplo de calibre 30, en la cavidad vítrea del ojo de un sujeto bajo observación directa. Típicamente, se puede administrar al ojo un volumen de 1 a 100 uL, por ejemplo 25 uL, 50 uL o 100 uL, y usualmente no más de 100 uL, de la composición objeto mediante inyección intravítrea sin retirar el vítreo. Como alternativa, se puede realizar una vitrectomía y reemplazar todo el volumen de gel vítreo por una infusión de la composición objeto. En tales casos, se pueden administrar hasta aproximadamente 4 mL de la composición objeto, por ejemplo, al ojo humano. La administración intravítrea generalmente es bien tolerada. Al finalizar el procedimiento, a veces aparece un ligero enrojecimiento en el lugar de la inyección. Ocasionalmente se presenta dolor a la palpación, pero la mayoría de los pacientes no refieren ningún dolor. No es necesario ningún parche ni protector ocular después de este procedimiento y las actividades no están restringidas. A veces, se prescribe un colirio antibiótico durante varios días para ayudar a prevenir la infección.

[0273] Los métodos y composiciones descritos de la presente invención encuentran uso en el tratamiento de afecciones que pueden abordarse, al menos en parte, mediante terapia génica de células fotorreceptoras de conos. Por tanto, los métodos y composiciones descritos de la presente invención encuentran utilidad en el tratamiento de individuos que necesitan una terapia con células cono. Por una persona que necesita una terapia de células cono, se entiende un individuo que padece o está en riesgo de desarrollar un trastorno de las células cono. Por "trastorno de las células cono" se entiende un trastorno que afecta a las células cono de la retina, incluidos, pero no limitados a los trastornos de la visión del ojo que están asociados a un defecto en las células cono, es decir, un defecto intrínseco de los conos, por ejemplo, trastornos de la visión del color, incluida la acromatopsia, la acromatopsia incompleta, la monocromaticidad de los conos azules y los defectos de protan, deutan y tritan.

[0275] Acromatopsia. La acromatopsia, o monocromatismo de bastones, es un trastorno en el que los sujetos experimentan una falta total de percepción del color, de modo que el sujeto solo ve en blanco, negro y tonos de gris. Otros síntomas incluyen agudeza visual reducida, fotofobia, nistagmo, pequeño escotoma central y fijación excéntrica. El trastorno se detecta frecuentemente por primera vez en niños alrededor de los seis meses de edad por su actividad fotofóbica y/o su nistagmo. La agudeza visual y la estabilidad de los movimientos oculares generalmente mejoran durante los primeros 6-7 años de vida (pero permanecen cerca de 20/200). Se han asociado mutaciones en CNGB3, CN<g>A3, GNAT2, PDE6C, y PDE6HI con el trastorno.

[0277] Acromatopsia incompleta. La acromatopsia incompleta es similar a la acromatopsia pero con menor penetrancia. En la acromatopsia incompleta, los síntomas son similares a los de la acromatopsia completa excepto que están disminuidos. Las personas con acromatopsia incompleta tienen una agudeza visual reducida con o sin nistagmo o fotofobia. Además, estos individuos muestran sólo un deterioro parcial de la función de las células cono, pero conservan la función de las células bastón.

[0278] Monocromía de cono azul. El monocromatismo de cono azul (cono S) (BCM) es un síndrome de disfunción estacionaria congénita ligada al cromosoma X poco común que afecta aproximadamente a 1 de cada 100,000 individuos. Los machos afectados con BCM no tienen conos funcionales sensibles a longitudes de onda largas (L) ni a longitudes de onda medias (M) en la retina, debido a mutaciones en el locus genético de los genes L y M-opsina. La discriminación del color está gravemente afectada desde el nacimiento y la visión se deriva de los conos S y bastones fotorreceptores que quedan preservados. El BCM generalmente se presenta con agudeza visual reducida (6/24 a 6/60), nistagmo pendular, fotofobia y los pacientes a menudo tienen miopía. El electrorretinograma (ERG) máximo y específico de bastones no suele mostrar ninguna anomalía definida, mientras que el ERG de conos de 30 Hz no se puede detectar. El ERG fotópico de un solo destello se suele poder registrar, aunque pequeño y tardío, y el e Rg del cono S está bien conservado.

[0280] Deficiencia de la visión del color. La deficiencia de la visión del color (CVD), o daltonismo, es la incapacidad o la disminución de la capacidad para ver el color o percibir diferencias de color en condiciones de iluminación normales. Las personas que sufren daltonismo pueden ser identificadas como tales mediante cualquiera de varias pruebas de visión del color, por ejemplo, ERG en color (cERG), placas pseudoisocromáticas (placas de Ishihara, placas policromáticas de Hardy-Rand-Ritter), la prueba de 100 tonos Farnsworth-Munsell, el panel D-15 de Farnsworth, la prueba de la City University, la regla de Kollner, etc. Entre los ejemplos de deficiencias en la visión del color se incluyen los defectos de protan, los defectos de deutan y los defectos de tritan. Los defectos de protan incluyen protanopía (una insensibilidad a la luz roja) y protanomalía (una sensibilidad reducida a la luz roja), y están asociados con mutaciones en el gen L-Opsina (OPN1LW). Los defectos de Deutan incluyen deuteranopía (una insensibilidad a la luz verde) y deutanomalía (una sensibilidad reducida a la luz verde), y están asociados con mutaciones en el gen M-Opsina (OPN1MW). Los defectos de Tritan incluyen tritanopía (una insensibilidad a la luz azul) y tritanomalía (una sensibilidad reducida a la luz azul), y están asociados con mutaciones en el gen S-Opsina (OPN1SW).

[0282] Un individuo afectado por un trastorno de células cono o en riesgo de desarrollar un trastorno de células cono puede identificarse fácilmente utilizando técnicas para detectar los síntomas del trastorno como se conoce en la técnica, incluyendo, sin limitación, fotografía del fondo de ojo; tomografía de coherencia óptica (OCT); óptica adaptativa (AO); electrorretinografía, por ejemplo, ERG, ERG en color (cERG); pruebas de visión del color como placas pseudoisocromáticas (placas de Ishihara, placas policromáticas de Hardy-Rand-Ritter), la prueba de 100 tonos de Farnsworth-Munsell, el panel D-15 de Farnsworth, la prueba de la City university, la regla de Kollner y similares; y pruebas de agudeza visual como la prueba de letras ETDRS, la prueba de agudeza visual de Snellen, la prueba del campo visual, la prueba de sensibilidad al contraste y similares; como será conocido por el artesano normalmente experto. Adicionalmente o alternativamente, el individuo afectado por un trastorno de células cono o en riesgo de desarrollar un trastorno de células cono puede identificarse fácilmente utilizando técnicas para detectar mutaciones genéticas asociadas con el trastorno de células cono como se conoce en la técnica, incluyendo, sin limitación, PCR, análisis de secuencia de ADN, digestión de restricción, hibridación de transferencia Southern, espectrometría de masas, etc. En algunos ejemplos, el método comprende el paso de identificar al individuo que necesita una terapia de células cono. En tales casos, se puede utilizar cualquier método conveniente para determinar si el individuo tiene los síntomas de un trastorno de células cono o está en riesgo de desarrollar un trastorno de células cono, por ejemplo detectando los síntomas descritos en este documento o conocidos en la técnica, detectando una mutación en un gen como se describe en este documento o como se conoce en la técnica, etc., para identificar al individuo que necesita una terapia de células cono.

[0283] Al poner en práctica los métodos objeto, la composición objeto típicamente se administra a la retina del sujeto en una cantidad que es eficaz para dar como resultado la expresión del transgén en las células cono. En algunos ejemplos, el método comprende el paso de detectar la expresión del transgén en las células cono.

[0284] Hay varias formas de detectar la expresión de un transgén, cualquiera de las cuales puede utilizarse en los ejemplos objeto. Por ejemplo, la expresión puede detectarse directamente, es decir, midiendo la cantidad de producto génico, por ejemplo, a nivel de ARN, por ejemplo mediante RT-PCR, transferencia Northern, protección de ARNasa; o a nivel de proteína, por ejemplo, mediante transferencia Western, ELISA, inmunohistoquímica y similares. Como otro ejemplo, la expresión puede detectarse indirectamente, es decir, detectando el impacto del producto del gen en la viabilidad o función del fotorreceptor de cono en el sujeto. Por ejemplo, si el producto genético codificado por el transgén mejora la viabilidad de la célula cono, la expresión del transgén puede detectarse detectando una mejora en la viabilidad de la célula cono, por ejemplo mediante fotografía del fondo del ojo, tomografía de coherencia óptica (OCT), óptica adaptativa (AO) y similares. Si el producto génico codificado por el transgén altera la actividad de la célula cono, la expresión del transgén puede detectarse detectando un cambio en la actividad de la célula cono, por ejemplo mediante electrorretinograma (ERG) y ERG en color (cERG); óptica adaptativa funcional; pruebas de visión del color como placas pseudoisocromáticas (placas de Ishihara, placas policromáticas de Hardy-Rand-Ritter), la prueba de 100 tonos Farnsworth-Munsell, el panel D-15 de Farnsworth, la prueba de la City university, la regla de Kollner y similares; y pruebas de agudeza visual como la prueba de letras ETDRS, la prueba de agudeza visual de Snellen, la prueba del campo visual, la prueba de sensibilidad al contraste y similares, como una forma de detectar la presencia del polinucleótido administrado. En algunos casos, se puede detectar tanto una mejora en la viabilidad como una modificación en la función de las células cono.

[0285] En algunos ejemplos, el método objeto produce un beneficio terapéutico, por ejemplo, previene el desarrollo

[0286] de un trastorno, detiene la progresión de un trastorno, revierte la progresión de un trastorno, etc. En algunos

[0287] ejemplos, el método objeto comprende la etapa de detectar que se ha logrado un beneficio terapéutico. El

[0288] artesano normalmente capacitado apreciará que dichas medidas de eficacia terapéutica serán aplicables a la enfermedad particular que se está modificando y reconocerá los métodos de detección apropiados a utilizar

[0289] para medir la eficacia terapéutica. Por ejemplo, la eficacia terapéutica en el tratamiento de la degeneración

[0290] macular se puede observar como una reducción en la tasa de degeneración macular o un cese de la progresión

[0291] de la degeneración macular, efectos que se pueden observar, por ejemplo, mediante fotografía del fondo de

[0292] ojo, OCT u AO, comparando los resultados de las pruebas después de la administración de la composición

[0293] objeto con los resultados de las pruebas antes de la administración de la composición objeto. Como otro

[0294] ejemplo, la eficacia terapéutica en el tratamiento de una disfunción cónica progresiva se puede observar como

[0295] una reducción en la tasa de progresión de la disfunción cónica, como un cese en la progresión de la disfunción

[0296] cónica o como una mejora en la función cónica, efectos que se pueden observar, por ejemplo, mediante ERG

[0297] y/o cERG; pruebas de visión del color; óptica adaptativa funcional; y/o pruebas de agudeza visual, por ejemplo, comparando los resultados de las pruebas después de la administración de la composición objeto con los

[0298] resultados de las pruebas antes de la administración de la composición objeto y detectando un cambio en la

[0299] viabilidad y/o función del cono. Como tercer ejemplo, la eficacia terapéutica en el tratamiento de una deficiencia

[0300] en la visión del color se puede observar como una alteración en la percepción del color del individuo, por

[0301] ejemplo en la percepción de longitudes de onda rojas, en la percepción de longitudes de onda verdes, en la percepción de longitudes de onda azules, efectos que se pueden observar, por ejemplo, mediante pruebas de

[0302] cERG y de visión del color, por ejemplo, comparando los resultados de las pruebas después de la administración de la composición objeto con los resultados de las pruebas antes de la administración de la composición objeto y detectando un cambio en la viabilidad y/o función del cono.

[0304] Se espera que la expresión del transgén utilizando el transgén objeto sea robusta. Por consiguiente, en algunos

[0305] casos, la expresión del transgén, por ejemplo detectada midiendo los niveles del producto génico, midiendo la

[0306] eficacia terapéutica, etc., se puede observar dos meses o menos después de la administración, por ejemplo 4,

[0307] 3 o 2 semanas o menos después de la administración, por ejemplo, 1 semana después de la administración de

[0308] la composición objeto. También se espera que la expresión del transgén persista a lo largo del tiempo. En consecuencia, en algunos casos, la expresión del transgén, por ejemplo detectada midiendo los niveles del

[0309] producto génico, midiendo la eficacia terapéutica, etc., se puede observar 2 meses o más después de la administración de la composición objeto, por ejemplo, 4, 6, 8 o 10 meses o más, en algunos casos 1 año o

[0310] más, por ejemplo 2, 3, 4 o 5 años, en ciertos casos, más de 5 años.

[0312] En ciertos ejemplos, el método comprende el paso de detectar la expresión del transgén en las células cono,

[0313] en donde la expresión se potencia con respecto a la expresión de un casete de polinucleótido que no comprende uno o más elementos mejorados de la presente divulgación, es decir, un control de referencia, por

[0314] ejemplo, el promotor pR2.1 o variantes del mismo (por ejemplo, pR1.7, pR1.5, pR1.1, etc.) como se divulga en,

[0315] por ejemplo, Solicitud US No. 2013/0317091, o el promotor sintético IRBP/GNAT2 como se describe en LA

[0316] Solicitud US No. 2014/0275231. Típicamente, la expresión se potenciará 2 veces o más en relación con la

[0317] expresión de una referencia, es decir, un casete de polinucleótido de control, por ejemplo como se conoce en

[0318] la técnica, por ejemplo 3 veces, 4 veces o 5 veces o más, en algunos casos 10 veces, 20 veces o 50 veces o

[0319] más, por ejemplo 100 veces, como se evidencia por, por ejemplo, una detección más temprana, niveles más

[0320] altos de producto génico, un impacto funcional más fuerte en las células, etc.

[0322] Típicamente, si la composición del sujeto es un rAAV que comprende un casete de polinucleótidos de la

[0323] presente invención, una cantidad eficaz para lograr un cambio será de aproximadamente 1x108 genomas vectoriales o más, en algunos casos 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, o 1x1013 genomas vectoriales o más, en

[0324] ciertos casos, 1x1014 genomas vectoriales o más, y por lo general no más de 1x1015 genomas vectoriales. En

[0325] algunos casos, la cantidad de genomas vectoriales que se administran es como máximo de aproximadamente

[0326] 1x1015 genomas vectoriales, por ejemplo 1x1014 genomas vectoriales o menos, por ejemplo 1x1013, 1x1012,

[0327] 1x1011, 1x1010, o 1x109 genomas vectoriales o menos, en ciertos casos 1x108 genomas vectoriales, y típicamente no menos de 1x108 genomas vectoriales. En algunos casos, la cantidad de genomas vectoriales

[0328] que se administran es de 1x1010 hasta 1x1011 genomas vectoriales. En algunos casos, la cantidad de genomas vectoriales que se administran es de 1x1010 hasta 3x1012 genomas vectoriales. En algunos casos, la cantidad

[0329] de genomas vectoriales que se administran es de 1x109 hasta 3x1013 genomas vectoriales. En algunos casos,

[0330] la cantidad de genomas vectoriales que se administran es de 1x108 hasta 3x1014 genomas vectoriales.

[0332] En algunos casos, la cantidad de composición farmacéutica a administrar puede medirse utilizando la multiplicidad de infección (MOI). En algunos casos, MOI puede referirse a la relación o múltiplo de los genomas

[0333] del vector o del virus con respecto a las células a las que se puede administrar el ácido nucleico. En algunos

[0334] casos, la MOI puede ser 1x106. En algunos casos, la MOI puede ser 1x105 -1x107. En algunos casos, la MOI

[0335] puede ser 1x104 -1x108. En algunos casos, los virus recombinantes de la invención son al menos aproximadamente 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017, y 1x1018 MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de esta invención son

[0336] 1x108 hasta 3x1014 MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de la invención tienen como máximo aproximadamente 1x101, 1x102, 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011, 1x1012, 1x1 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017, y 1x1018 MOI.

[0338] En algunos aspectos, la cantidad de composición farmacéutica comprende aproximadamente 1 x 108 hasta aproximadamente 1 x 1015 partículas de virus recombinantes, aproximadamente 1 x 109 hasta aproximadamente 1 x 1014 partículas de virus recombinantes, aproximadamente 1 x 1010 hasta aproximadamente 1 x 1013 partículas de virus recombinantes, o aproximadamente 1 x 1011 hasta aproximadamente 3 x 1012 partículas de virus recombinantes.

[0340] Las dosis individuales típicamente no son menores que la cantidad requerida para producir un efecto medible

[0341] en el sujeto, y pueden determinarse en función de la farmacocinética y la farmacología de absorción, distribución, metabolismo y excreción ("ADME") de la composición objeto o sus subproductos, y por lo tanto en

[0342] función de la disposición de la composición dentro del sujeto. Esto incluye la consideración de la vía de administración, así como la cantidad de dosis, que se puede ajustar para aplicaciones subretinal (aplicada directamente donde se desea la acción principalmente para un efecto local), intravítrea (aplicada al vítreo para

[0343] un efecto panretinal) o parenteral (aplicada por vías sistémicas, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, etc.).

[0344] Las cantidades efectivas de dosis y/o régimen de dosis se pueden determinar fácilmente de manera empírica

[0345] a partir de ensayos preclínicos, de ensayos de seguridad, de escalada y de rango de dosis, de relaciones individuales entre médicos y pacientes, así como de ensayosin vitroein vivocomo los que se describen en

[0346] este documento y se ilustran en la sección Experimental, a continuación.

[0348] De lo anterior se desprenderá que, si bien en este documento se han descrito realizaciones específicas de la

[0349] invención con fines ilustrativos, se pueden realizar diversas modificaciones.

[0351] Ejemplos

[0353] Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de proporcionar a aquellos con conocimientos normales en la

[0354] técnica una descripción y divulgación completa de cómo hacer y utilizar la presente invención, y no pretenden

[0355] limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero

[0356] se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario,

[0357] las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica o cercana a ella.

[0359] Los métodos generales de bioquímica molecular y celular se pueden encontrar en libros de texto estándar como Clonación Molecular: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag

[0360] et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999);

[0361] Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths,

[0362] John Wiley & Sons 1998). Los reactivos, vectores de clonación y kits para manipulación genética a los que se

[0363] hace referencia en esta divulgación están disponibles en proveedores comerciales tales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y ClonTech.

[0365] Antecedentes

[0367] Se necesitan nuevas terapias para el tratamiento de muchos trastornos asociados a los fotorreceptores de

[0368] conos, incluidas las distrofias maculares como la distrofia de conos y bastones, la distrofia de conos, la distrofia

[0369] macular de Stargardt y la acromatopsia; trastornos de la visión del color como defectos de protan, deutan y

[0370] tritan; y trastornos de la visión de la mácula central como la degeneración macular relacionada con la edad, la telangiectasia macular, la retinitis pigmentosa, la retinopatía diabética, las oclusiones de la vena retiniana, el glaucoma, la distrofia del fondo de ojo de Sorsby, la distrofia macular viteliforme del adulto, la enfermedad de

[0371] Best y la retinosquisis ligada al cromosoma X. Como estos trastornos de la visión están asociados con una

[0372] pérdida de función y/o viabilidad de los fotorreceptores de los conos, se plantea la hipótesis de que estos

[0373] trastornos podrían tratarse administrando un gen terapéutico a los fotorreceptores de los conos para rescatar

[0374] la viabilidad y la función de los conos.

[0376] Para tal fin, se diseñó el casete de polinucleótidos “pMNTC” en el que se diseñaron secuencias potenciadoras, promotoras, 5'UTR, intrónicas, Kozak y de poliadenilación para la expresión específica del cono (Fig. 10a). El

[0377] casete incluía una secuencia potenciadora de LCR del locus genómico L y M-opsina y una secuencia promotora

[0378] truncada del gen M-Opsina, que comprendía aproximadamente 140 nucleótidos corriente arriba del sitio de

[0379] inicio de la transcripción. Además, el casete incluía una región 5' no traducida (5' UTR) basada en la 5'UTR de

[0380] M-opsina pero modificada para tener una estructura secundaria mínima (véase Fig. 3) y para incluir una secuencia adicional en su extremo 3' en la que se insertó un intrón. La secuencia intrónica utilizada fue un

[0381] intrón quimérico pSI que tiene el sitio donante 5' del primer intrón del gen de la p-globina humana y la ramificación y el sitio aceptor 3' del intrón que se encuentra entre el líder y el cuerpo de una región variable de

[0382] la cadena pesada del gen de inmunoglobulina (Bothwell, A.L. et al. (1981) Heavy chain variable región contribution to the NPb family of antibodies: Somatic mutation evident in a gamma 2a variable región. Cell 24, 625-37). Las secuencias de los sitios donador y aceptor, junto con el sitio del punto de ramificación, se cambiaron para que coincidieran con las secuencias de consenso para el empalme (Senapathy, P., Shapiro, M.B. and Harris, N.L. (1990) Meth. Enzymol. 183, 252-78). También se incluyó en el casete de polinucleótidos pMNTC una fuerte secuencia Kozak y una secuencia de poliadenilación SV40.

[0384] También se realizaron experimentos para identificar el mejor AAV con el cual administrar transgenes a las células cono. Se ha logrado la administración exitosa de polinucleótidos a células de la retina con fines de terapia genética utilizando vectores virales tales como AAV y lentivirus. Sin embargo, estos virus deben inyectarse subretinianamente para llegar a las células de la retina de los primates no humanos (NHP), un procedimiento que conlleva el riesgo de dañar la retina. Un enfoque menos disruptivo es la administración mediante inyección intravítrea. Sin embargo, nunca se ha demostrado una transducción eficiente de los fotorreceptores de cono después de la administración intravítrea de AAV o lentivirus: si bien existen informes de AAV con la capacidad de transducir células cono de la retina con alta eficiencia (Merigan et al. IOVS 2008,49 E-abstract 4514), informes posteriores han cuestionado la eficacia de estos vectores (Yin et al. IOVS 2011, 52(5):2775-2783).

[0386] Resultados

[0388] La evolución dirigida de AAV2 ha llevado a la identificación de la variante viral "7m8" que es capaz de transducir fotorreceptores mejor que el AAV2 de tipo salvaje (Dalkara et al. Sci Transl Med 2013). Sin embargo, la retina contiene dos tipos de fotorreceptores - bastones y conos - y no existen informes que demuestren si AAV2-7m8 puede transducir fotorreceptores de conos,per se,y más particularmente, los fotorreceptores de cono en el área altamente enriquecida en conos de la fóvea. Para probar esta posibilidad, administramos AAV2-7m8 que lleva un casete de expresión del promotor ubicuo CMV unido operativamente a GFP a la retina del mono verde africano mediante inyección intravítrea. El AAV2-7m8.CMV.GFP administrado por vía intravítrea pareció transducir células de la retina en la fóvea central (la región libre de bastones de 0.35 mm de diámetro de la retina en el centro de la fosa foveal) y la parafóvea (el borde de la depresión) de los primates de manera más eficiente que el AAV2 administrado por vía intravítrea u otras variantes de AAV que previamente se había demostrado en la técnica que transducían células de la retina. Ni el AAV2-7m8 ni los otros AAV probados parecieron ser capaces de transducir los conos de la fóvea de los primates, la región de la retina de 1.5 mm de diámetro enriquecida con conos que rodea la fóvea y forma las pendientes de la fosa (Fig. 5).

[0390] A continuación, se empaquetó un genoma que comprende pMNTC unido operativamente a GFP dentro de la cápside AAV2-7m8 y se evaluó la capacidad de esta composición vectorial para expresar el transgén GFP en células conoin vivocuando se inyecta intravítreamente. Se evaluó la expresión en varias especies con diferentes cantidades de células cono de la retina entre los fotorreceptores totales, incluidos ratones (3% de conos), ratas (1% de conos), jerbos (13% de conos) y primates no humanos (5% de conos). Contrariamente a nuestros resultados en la Fig. 5, se pudo detectar una fuerte expresión génica en toda la fóvea de primates no humanos (Fig. 6). Estos datos indican que el AAV2-7m8 administrado intravítreamente puede, de hecho, transducir los conos retinianos y que el pMNTC actúa como un casete de expresión robusto en las células de los conos. También se observó una expresión robusta del gen informador en la retina inyectada intravíricamente de la rata (datos no mostrados) y el jerbo (Fig. 8A), con niveles de expresión y ubicación anatómica correlacionándose con la abundancia y ubicación de los conos en todas las especies.

[0392] Para determinar la especificidad celular de la expresión dirigida por pMNTC, se analizaron montajes completos de retina de ratón transducida mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo específico para las L y M opsinas de los conos. La expresión de la L/M opsina, que marca únicamente los segmentos externos de los fotorreceptores de los conos, se observó en prácticamente todos los conos de la retina del ratón que expresaban GFP del vector AAV2-7m8.MNTC.GFP (Fig. 7), lo que indica que la expresión de transgenes dirigida por MNTC es altamente específica de los conos. Además, el 80% o más de los segmentos externos de los conos que fueron marcados con el anticuerpo específico de L/M opsina también expresaron el transgén GFP, lo que indica que AAV2-7m8 transduce los conos de manera muy eficiente (Fig. 7).

[0394] A continuación, se comparó la capacidad de pMNTC para promover la expresión en células cono con la de pR2.1. pR2.1 comprende el potenciador de L/M opsina humana ("LCR") y la región promotora del gen L-opsina humana. Además, pR2.1 comprende la L-Opsina 5'UTR fusionada a una secuencia 5'UTR adicional en su extremo 3', en la que se ha insertado la secuencia intrónica tardía 16s de SV40 modificada. A esto le sigue la secuencia Kozak de L-Opsina, que luego típicamente se enlaza en marco a un transgén. Al final del casete hay una cola de poliA SV40.

[0396] Las preparaciones virales de AAV2-7m8.MNTC.GFP y AAV2-7m8.pR2.1.GFP se administraron intravítreamente a las retinas de jerbos y primates no humanosin vivo, y las retinas se visualizaronin vivo2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, y 12 semanas después mediante autofluorescencia del fondo de ojo y OCT La expresión del informador GFP se detectó más pronto, con mayor fuerza y en más conos en la retina de jerbos transducidos con rAAV que portaban el casete de expresión pMNTC.GFP que en las retinas de jerbos que portaban el casete de expresión pR2.1.GFP (Fig. 8B). Asimismo, la expresión del informador GFP se detectó más pronto y en más conos en retinas de primates no humanos transducidas con rAAV que portaban el casete de expresión pMNTC.GFP en comparación con retinas de NHP transducidas con el casete de expresión pR2.1 (Fig. 9, n = 4 ojos). En los jerbos y en los NHP, se observó de manera consistente que el GFP era más fuerte en pMNTC que en pR2.1 durante toda la duración del estudio.

[0398] Para determinar la contribución de cada uno de los elementos del casete de expresión pMNTC a la mejora general de la expresión, se clonaron una serie de constructos de expresión en las que cada uno de los elementos del pMNTC se sustituyó uno por uno con el elemento correspondiente del casete de expresión pR2.1. Estos constructos fueron luego empaquetados en AAV2-7m8 y administrados mediante inyección intravítrea a la retina del jerbo. Las retinas de los jerbos se evaluaron 4 y 8 semanas despuésin vivomediante bioluminiscenciain vivo(sistema de imágenes IVIS, PerkinElmer), que proporciona una lectura cuantitativa de la expresión del informador en todo el ojo.

[0400] Como se esperaba, la expresión del informador de luciferasa bajo el control de pMNTC fue mayor que la expresión del informador de luciferasa bajo el control de pR2.1. El reemplazo de la secuencia promotora pMNTC por la secuencia promotora pR2.1 que tiene la mayor homología de secuencia con ella (SEQ ID NO:83) redujo la expresión (constructo pMNTC_pR2.1 L3'P), al igual que la inclusión de la secuencia promotora pR2.1 que se encuentra más distal al 5'UTR de pR2.1 (Se Q ID NO:82) (constructo pMNTC_pR2.1-L5'P). La expresión también se redujo mediante la introducción en el 5'UTR pMNTC de dos secuencias de inicio falso ("AUG1" y "AUG2") que se observaron en el 5'UTR pR2.1 (constructo pMNTC_2.1-AUG1/2). Curiosamente, la expresión no se redujo cuando el pMNTC 5'UTR se reemplazó con una secuencia pR2.1 5'UTR modificada en la que se habían eliminado estos falsos comienzos (SEQ ID NO:87, nucleótido 17 cambiado a C, nt 61 y 62 cambiados a CA) (pMNTC_pR2.1-5'UTR), lo que sugiere que el pR2.1 5'UTR promovería una fuerte expresión en las células cono pero por los AUG falsos en el elemento pR2.1 5'UTR. También es interesante que el intrón pR2.1 (SEQ ID NO: 59) pareció proporcionar una expresión más robusta que el intrón quimérico pSI de pMNTC, lo que sugiere que la inclusión del intrón pR2.1 en los casetes de polinucleótidos de la presente invención se puede utilizar para mejorar aún más la expresión en las células cono. Por último, la eliminación del potenciador L/M (encontrado tanto en pR2.1 como en pMNTC) también redujo la expresión. Si bien al principio la cola de poliA también parecía tener un impacto significativo en la expresión, la resecuenciación del constructo pMNTC que comprende este elemento pR2.1 reveló que la cola de poliA no estaba vinculada operativamente al transgén, lo que explica por qué solo se observaron niveles de expresión de fondo de este constructo. Por lo tanto, el LCR de L/M opsina, la inclusión del promotor central de M opsina en lugar del promotor de L opsina y la exclusión de falsos comienzos en el 5'UTR contribuyen a la mejora de la expresión génica lograda utilizando el promotor pMNTC.

[0402] En conclusión, se ha identificado una variante de AAV, la variante de AAV que comprende un péptido 7m8 en el bucle de GH, que puede utilizarse para la administración intravítrea de polinucleótidos a los conos retinianos. Asimismo, se ha identificado una serie de elementos de casete de polinucleótidos que pueden utilizarse para promover una fuerte expresión en los fotorreceptores de cono. En conjunto, estos descubrimientos representan mejoras que pueden facilitar el desarrollo de agentes terapéuticos para los trastornos asociados a los conos.

[0403] Materiales y métodos

[0405] Expresión de transgenesin vitroen células WERI-RB-1. Las células de retinoblastoma WERI-Rb-1 que expresan pigmentos fotorreceptores de cono se transfectan con un casete de polinucleótidos de la presente divulgación de acuerdo con el método descrito por Shaaban and Deeb, 1998; IOVS 39(6)885-896. Los casetes de polinucleótidos se transfectan como ADN plasmídico utilizando técnicas bien establecidas de biología molecular, tal como la clonación (Maniatis et al.) o mediante síntesis de ADNde novo.Todos los elementos reguladores se colocan en el casete y se utilizan para impulsar la proteína GFP potenciada. Luego, el ADN plasmídico se introduce en las células utilizando técnicas establecidas para la transfección no viral, por ejemplo, utilizando un reactivo de transfección basado en lípidos (Altogen Biosystems, NV) o Lipofectamina<l>T<x>(Life Technologies). Luego, las células se cultivan durante 72 horas y se mide la expresión de eGFP mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. La expresión del transgén en células transfectadas con el casete de polinucleótidos de la presente invención (es decir, constructos diseñados para la expresión del fotorreceptor de cono) se compara con las contrapartes no optimizadas (es decir, aquellas basadas en pR2.1) y se encuentra que es más fuerte a partir de casetes que llevan elementos mejorados.

[0407] La expresiónin vitrotambién se evalúa utilizando otras líneas celulares de mamíferos que expresan opsinas de cono, tales como las células 661W (Tan et al., IOVS 2004; 45(3) 764-768).

[0409] De manera similar, la expresiónin vitrose evalúa utilizando líneas de células no fotorreceptoras que han sido diseñadas para expresar proteínas específicas de los fotorreceptores de cono. Se ha descrito un sistema de este tipo con células HEK293 que han sido modificadas genéticamente para expresar CRX/Sp1 (Khani et al., IOVS 2007; 48: 3954). También se utilizan genes marcadores (eGFP, dsRed, mCherry, luciferasa) así como genes fisiológicos (opsina, genes ACHR). Los genes fisiológicos se prueban examinando los niveles de ARNm (por ejemplo, mediante RT-PCR) o los niveles de proteína (por ejemplo, mediante ELISA o transferencia Western).

[0411] Cuidado animal. Todos los experimentos se ajustaron a los principios sobre el cuidado y uso de animales adoptados por la American Physiological Society and the Society for Neuroscience, y fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

[0413] Estudios con animales pequeños. La expresión del producto genético codificado por la secuencia de codificación de los casetes de expresión se evalúain vivoen ratones, ratas y jerbos. Esto se logra mediante la inyección intravítreain vivode una preparación de rAAV que comprende el casete de expresión (Li et al., 2008; Mol Vis 48: 332-338). Téngase en cuenta que en su lugar se puede realizar la electroporación del ADN plasmídico (Matsuda/Cepko).

[0415] Estudios con ratones. Los ratones utilizados en este estudio fueron C57BL/6. Los animales fueron anestesiados con ketamina/xilazina (110 mg/kg intraperitoneal). Se insertó una aguja desechable biselada de calibre 34 cargada con el artículo de prueba en el vítreo del ojo y se inyectaron en el vítreo 5.04 x 1010 genomas vectoriales de rAAV en un volumen de 1.5 pl.

[0417] Estudios en jerbos y ratas. Jerbos de Mongolia(Meriones unguiculatus)y ratas noruegas marrones se utilizaron en este estudio. Se dilataron las pupilas con fenilefrina al 10% y tropicamida al 0.5%. Los animales fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal o intramuscular de 0.1-0.2 mL de una solución de ketamina/xilazina (70 mg/mL de ketamina y 10 mg/mL de xilazina para ratas; 25 mg/mL de ketamina y 0.3 mg/mL de xilazina para jerbos). Se insertó una aguja desechable biselada de calibre 34 cargada con el artículo de prueba en una jeringa Hamilton de 100 pL en el vítreo del ojo a través de la esclerótica en un punto temporal superior optimizado a aproximadamente 1 mm del limbo. Se inyectaron lentamente 1 x 1010 - 2 x 1010 genomas vectoriales del artículo de prueba (2 x 1010 vg de rAAV.GFP, o 1.15 x 1010 vg de rAAV.luciferasa) en un volumen de 5 uL con una bomba de microinyección en el vítreo, después de lo cual se mantuvo la punta de la aguja en el ojo inyectado en la posición inyectada durante 10 segundos para asegurar una dispensación adecuada del artículo de prueba. Luego se retiró la aguja.

[0419] Estudios en primates no humanos (NHP). Los casetes de polinucleótidos y los vectores de expresión también se prueban en animales grandes. Esto se hace utilizando A<a>V, por ejemplo utilizando las técnicas de Mancuso et al. En resumen, se crea un casete de AAV, se fabrica el AAV que encapsida el casete de expresión y se inyecta la preparación viral por vía intravítrea (hasta 170 uL en el vítreo) o subretinal (hasta 3 inyecciones de 100 uL en diferentes ubicaciones; se puede realizar una vitrectomía antes de la inyección) en primates no humanos. La expresión se evalúa mediante un informador (GFP), un ERG en color y/o pruebas de comportamiento utilizando la prueba de color de Cambridge o en animales entrenados para realizar un movimiento sacádico (movimiento ocular) cuando un objetivo ingresa al campo de visión. Los movimientos sacádicos se monitorizan utilizando un rastreador ocular. Antes del tratamiento, se entrena a los animales para que realicen una prueba de visión de color o para que hagan un movimiento sacádico cuando ven un objetivo de color. Se realiza un ERG para estimar la sensibilidad espectral de los conos presentes. Los datos del rendimiento de la prueba de visión del color y del ERG proporcionan evidencia de que el animal es dicromático (daltónico). En el caso de los animales que reciben un vector que transporta el gen GFP, la expresión se controla mediante imágenes del fondo del ojo con RetCam II o un dispositivo similar bajo luz que produce excitación de la GFP En el caso de los animales que reciben un gen de fotopigmento que difiere en sensibilidad espectral en comparación con los pigmentos endógenos del animal, se monitoriza la expresión utilizando el ERG de color multifocal para medir la sensibilidad espectral en hasta 106 ubicaciones diferentes de la retina y mediante pruebas de comportamiento.

[0421] Los babuinos fueron sedados con 10-15 mg/kg de ketamina seguido de sevoflurano. Los monos verdes africanos fueron sedados con una inyección intramuscular de una mezcla de ketamina:xilazina 5:1 (0.2 ml/kg de 100 mg/ml de ketamina y 20 mg/ml de xilazina). La midriasis se logró con fenilefrina tópica al 10%. Se colocó un espéculo ocular en el ojo para facilitar las inyecciones. Se aplicó una gota de clorhidrato de proparacaína al 0.5% y luego una solución de betadina al 5%, seguido de un enjuague con solución salina estéril. Los babuinos (Fig. 6) recibieron 60 pl de una solución de una preparación de 3.4 x 1013 vg de rAAV mediante inyección intravítrea (ITV) para producir una dosis final de 2.02 x 1012 vg por ojo. Los monos verdes africanos recibieron 50 uL de una solución de una preparación de 1 x 1013 del vector rAAV mediante inyección de ITV para obtener una dosis final de 5 x 1011 vg por ojo. Las inyecciones ITV en el vítreo central se administraron utilizando una aguja de calibre 31 de 0.375 pulgadas (Terumo) insertada inferotemporalmente al nivel de la ora serrata, ~2.5 mm posterior al limbo, bajo una magnificación quirúrgica para permitir la visualización completa de la colocación de la aguja extraocular e intraocular. La colocación central del vítreo se confirmó mediante la observación directa de la punta de la aguja en el momento de la inyección. Después de las inyecciones ITV se administró un ungüento antibiótico triple tópico.

[0423] Biomicroscopía con lámpara de hendidura. Se examinó el segmento anterior de cada ojo de mono mediante biomicroscopía con lámpara de hendidura durante la evaluación inicial y en la semana 4 (día 28), semana 8 (día 56) y semana 12 (día 84) después de la inyección para monitorizar la inflamación. No se observaron anormalidades.

[0425] Examen y fotografía del fondo del ojo. Se realizó un examen ocular y una fotografía del fondo del ojo de las retinas de ratas y jerbos utilizando un microscopio de fondo de ojo Phoenix Micron IV. Todos los animales recibieron una evaluación/fotografía inicial para confirmar la salud ocular y luego fueron fotografiados en los puntos de tiempo designados para monitorizar la expresión del transgén GFP Cualquier cambio en los nervios ópticos y la retina o aparición de lesiones macroscópicas se registró mediante una fotografía de fondo de ojo en color y la expresión de GFP se visualizó utilizando imágenes de fondo de ojo de fluorescencia con un filtro de fluoresceína.

[0427] Se realizaron examen de retina, fotografía de color y fluorescencia del fondo de ojo y OCT de autofluorescencia de NHP utilizando una cámara de retina Topcon TRC-50EX con hardware de imágenes digitales Canon 6D y software New Vision Fundus Image Analysis System y Spectralis OCT Plus. Todos los animales recibieron una imagen de referencia. La expresión de GFP también se documentó en las semanas 2, 4, 8 y 12 posteriores a la inyección intravítrea del vector.

[0429] Sistema de generación de imágenes IVIS. La expresión de luciferasa en la retina después de la administración de rAAV.luciferasa se cuantificóin vivo2, 4 y 8 semanas después de la inyección intravítrea utilizando un sistema de generación de imágenes IVIS. A los jerbos se les inyectó por vía subcutánea 150 mg/kg de luciferina (PerkinElmer) (15 mg/ml de luciferina en una dosis de 15 ml/kg). Aproximadamente 22 minutos después, los animales fueron sedados mediante inhalación de isoflurano al 4% durante 3-5 minutos. Inmediatamente después, los animales fueron colocados en la plataforma de generación imágenes en pares y se cuantificó la luminiscencia de un ojo de cada animal, seguido inmediatamente por la generación de imágenes del ojo contralateral. Se utilizó un jerbo ingenuo como estándar negativo, con niveles de luminiscencia de fondo que típicamente registraban una luminiscencia de 1 x 104 fotones/segundo. Se realizó una verificación de bioluminiscencia utilizando un ratón fantasma (ratón fantasma Perkin Elmer XPM-2 para imágenes de bioluminiscencia) antes de la generación de imágenes para garantizar la calibración del sistema de generación de imágenes.

[0431] Inmunohistoquímica. Los ratones fueron sacrificados con una dosis letal de pentobarbital sódico y los tejidos se fijaron mediante perfusión cardíaca primero con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0.13 M, pH 7.2-7.4 que contenía 2 unidades de heparina por mL, seguido de paraformaldehído al 4% (PFA) en p Bs , seguido de paraformaldehído al 4% más glutaraldehído al 1% en PBS. El glutaraldehído sirvió para mantener la retina neural unida al RPE para que los segmentos externos del cono permanecieran intactos. Cada solución se calentó a ~37 °C justo antes de la administración y se administraron ~35-40 ml de perfundido en cada etapa. Una vez detenida la perfusión, se envolvió al ratón en una toalla de papel húmeda y se dejó reposar durante 2 3 horas antes de la enucleación y disección.

[0433] Se utilizó tinta permanente para marcar la orientación del ojo, se retiró el segmento anterior y la copa ocular se fijó en PFA al 4% durante la noche a 4 °C y luego se conservó en PBS a 4 °C. Se realizaron preparaciones completas de retina aplanando la retina diseccionada entre tejidos empapados en PFA al 4% durante dos horas y luego transfiriéndola a una placa de cultivo durante 6 horas más de fijación. Posteriormente, el PFA fue reemplazado por PBS que contenía 0.03% de azida de sodio (Sigma).

[0435] El marcaje de anticuerpos se realizó en un agitador de mesa giratorio. Para bloquear el marcado no específico, los montajes completos se incubaron durante la noche a 4 °C con una solución que contenía 5% de suero de burro (Jackson ImmunoResearch, Cat #004-000-120), 1mg/ml de BSA (Jackson ImmunoResearch, Cat #001-000-161), y 0.03% de Triton X-100 en PBS (pH 7.4). El anticuerpo primario utilizado en este estudio fue anti de conejo opsina rojo-verde (L/M) diluido 1:200 (Millipore, Cat # AB5405. Las muestras se lavaron en PBS 3 veces durante 30 minutos cada vez y luego se incubaron a 4 °C durante la noche con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato 1:10,000; Invitrogen, Cat # D-21490) más anticuerpos secundarios. El anticuerpo secundario para el anticuerpo L/M-opsina fue IgG(H+L) anti-conejo de burro marcado con Alexa Fluor 488 diluido 1:200 en tampón de dilución de anticuerpos (Invitrogen, Cat # A21206). La incubación con anticuerpo secundario fue seguida por tres lavados con PBS de 30 minutos, 30 minutos de posfijación con paraformaldehído al 4% y tres lavados más con PBS de 30 minutos. Finalmente, los cortes de retina se colocaron en portaobjetos con DABCO al 2% en glicerol y se cubrieron con cubreobjetos.

[0437] Microscopía. Se adquirieron imágenes de campo amplio de monturas completas de retina de ratón utilizando una Nikon Eclipse E1000 con un objetivo 20x (al aire libre) y una cámara configurada con un zoom óptico de 1.5x. Para cada muestra, se tomaron 50 secciones ópticas con una separación de 0.5 pm y se reconstruyó la pila Z de M-opsina en ImageJ. La pila Z se orientó de modo que las longitudes de los segmentos externos estuvieran en el plano, y se midió la distancia entre el lugar donde comenzaba y terminaba la tinción de anticuerpos como una estimación de la longitud de los segmentos externos. Además, se generó una proyección 3D de la pila Z y se pudo cuantificar el número de conos con M-opsina visible en el segmento externo.

[0438] Se adquirieron cortes de imágenes confocales utilizando un Olympus FluoViewTM FV1000. Las secciones se visualizaron utilizando una lente de inmersión en aceite de 20x (40 imágenes tomadas con una separación de 0.5 |jm) y las pilas Z se reconstruyeron en ImageJ. Los niveles de exposición del canal se equilibraron dentro y entre las imágenes mediante Adobe Photoshop. Para los montajes completos de la retina, las imágenes se tomaron utilizando una lente de aire libre de 10x y los mosaicos se construyeron con el software de construcción de mosaicos nativo de Adobe Photoshop.

[0440] Experimentos que prueban la especificidad tisular de los casetes de polinucleótidos. En este caso, se inyecta un constructo que codifica GFP a través de una o más vías de administración, tales como intravítrea, subretiniana o intravenosa. Luego se sacrifica el animal y se analizan los tejidos mediante qPCR (para detectar secuencias de ADN que indican la presencia del constructo - y la expresión de GFP - para detectar áreas donde el constructo se expresa activamente. Mientras que la ausencia de secuencia de ADN indica falta de biodistribución en un tejido determinado, la presencia de una secuencia de ADN junto con la falta de expresión del transgén (nivel de ARNm o proteína) indica la presencia de un vector pero falta de expresión en ese tejido. De esta manera, se puede establecer el nivel de especificidad de los fotorreceptores de cono y utilizarlo para determinar la utilidad de esta invención en términos de restringir la expresión a células fotorreceptoras de cono objetivo sin expresión en tejidos no objetivo, tales como el nervio óptico, hígado, bazo o tejido cerebral. Se sabe que el AAV intravítreo se biodistribuye al cerebro (Provost et al.), por lo que los constructos mejorados y altamente expresados para direccionar a los fotorreceptores de cono serían útiles para limitar la expresión a las células objetivo de la retina y limitar los posibles eventos adversos asociados con la expresión de transgenes fuera del objetivo.

[0442] Lo anterior simplemente ilustra los principios de la invención. Se apreciará que los expertos en la técnica podrán idear diversas disposiciones que, aunque no se describen o se muestran explícitamente aquí, incorporan los principios de la invención. Además, todos los ejemplos y el lenguaje condicional aquí citados tienen como principal objetivo ayudar al lector a comprender los principios de la invención y los conceptos aportados por los inventores para promover la técnica. Además, todas las declaraciones aquí contenidas que citan principios, aspectos y realizaciones de la invención, así como ejemplos específicos de la misma, tienen por objeto abarcar equivalentes tanto estructurales como funcionales de la misma.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un casete de polinucleótidos para la expresión potenciada de un transgén en células cono de la retina de un mamífero, que comprende:

(a) una región promotora que consiste en un promotor M-Opsina truncado que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 80 o un fragmento funcional o variante del mismo que tiene una identidad de secuencia del 85% o más con SEQ ID NO: 80;

(b) una secuencia de codificación unida operativamente a la región promotora, en la que la secuencia de codificación codifica una proteína terapéutica que tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 32; y

(c) un sitio de poliadenilación unido operativamente a la secuencia de codificación.

2. Un casete de polinucleótidos como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la secuencia de codificación codifica una proteína terapéutica que tiene:

(a) una identidad de secuencia de al menos 90% con SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 32; (b) una identidad de secuencia de al menos 95% con SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 32; (c) una identidad de secuencia de al menos 98% con

SEQ ID NO: 32; o (d) una secuencia polimórfica de SEQ ID NO: 11 seleccionada del grupo que consiste en: (i) Thr65Ile, (ii) Ile111Val, (iii) Ser116Tyr, (iv) Leu153Met, (v) Ile171Val, (vi) Ala174Val, (vii) Ile178Val, (viii) Ser180Ala, (ix) Ile230Thr, (x) Ala233Ser, (xi) Val236Met, (xii) Ile274Val, (xiii) Phe275Leu, (xiv) Tyr277Phe, (xv) Val279Phe, (xvi) Thr285Ala, (xvii) Pro298Ala, y (xviii) Tyr309Phe.

3. Un casete de polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la región promotora consiste en:

(a) una secuencia que tiene una identidad de secuencia del 95% o más con SEQ ID NO: 80; o

(b) SEQ ID NO: 80.

4. Un casete de polinucleótidos como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende una secuencia de polinucleótidos que comprende una región 5' no traducida de la secuencia de codificación (5' UTR), en el que la 5' UTR comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia del 85% o más con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO 88, y SEQ ID NO: 89.

5. Un casete de polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 4, en el que la 5' UTR no comprende un polinucleótido a Tg .

6. Un casete de polinucleótidos como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además un intrón, en el que el intrón tiene una identidad de secuencia del 85% o más con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 59, y SEQ ID NO: 60.

7. Un casete de polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 6 cuando depende de la reivindicación 4 o reivindicación 5, en el que el intrón está ubicado dentro de la 5' UTR.

8. Un casete de polinucleótidos como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además una secuencia de iniciación de la traducción, en el que la secuencia de iniciación de la traducción comprende una secuencia de polinucleótidos que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 72 o SEQ ID NO: 73.

9. Un casete de polinucleótidos como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende además una secuencia potenciadora que tiene una identidad de secuencia del 85% o más con la SEQ ID NO: 51.

10. Un casete de polinucleótidos como se reivindica en la reivindicación 9, en el que la secuencia potenciadora tiene una identidad de secuencia del 85% o más con la SEQ ID NO: 52 o un fragmento funcional del mismo.

11. Un casete de polinucleótidos como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende la SEQ ID NO: 95 unida operativamente a una secuencia de codificación, en el que la secuencia de codificación codifica una proteína terapéutica que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 32.

12. Un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende:

a) una proteína de la cápside del AAV, y

b) un casete de polinucleótidos como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 flanqueado por secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de AAV.

13. Un rAAV como se reivindica en la reivindicación 12, en el que la proteína de la cápside de AAV es una proteína de la cápside de AAV2-7m8.

14. Una composición farmacéutica que comprende un casete de polinucleótido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o un rAAV como se reivindica en la reivindicación 12 o la reivindicación 13 y un excipiente farmacéutico.

15. Una composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 14, para uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno de la visión del color seleccionado del grupo que consiste en acromotopsia, monocromacia de cono azul, un defecto de protan, un defecto de deutan y un defecto de tritan.