ES3042567T3 - Sirna and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the nrarp gene - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a moléculas de ARNip y su uso en métodos y composiciones farmacéuticas para inhibir la expresión del gen NRARP. La invención también se refiere al uso de dichas moléculas de ARNip en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno relacionado con la neovascularización, caracterizado por una mayor expresión y/o actividad del gen NRARP. Dicha afección ocular se selecciona del grupo que comprende la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la retinopatía isquémica, el edema macular diabético (EMD), la retinopatía diabética proliferativa (RDP), la isquemia retiniana diabética (IRD), el edema retiniano diabético (ERD) y la retinopatía de la prematuridad (ROP), así como combinaciones de las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] ARNip y su uso en métodos y composiciones para inhibir la expresión del gen de NRARP

[0005] Campo de la invención

[0007] La presente invención se refiere al campo de productos de ARNip para su uso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades retinianas relacionadas con la neovascularización, y más particularmente para su uso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades retinianas relacionadas con la neovascularización relacionadas con altos niveles de expresión y/o actividad del gen de NRARP.

[0009] Antecedentes de la invención

[0011] Una retina sana es necesaria para una buena visión. Los trastornos de la retina pueden provocar pérdida parcial o total de la visión. Muchas enfermedades retinianas comparten síntomas y tratamientos comunes, pero cada una tiene características únicas. El objetivo de los tratamientos para la enfermedad retiniana es detener o ralentizar la progresión de la enfermedad y preservar o restaurar la pérdida de visión.

[0013] La neurorretina es un complejo tejido neurológico compuesto por una red de ocho capas celulares interconectadas encargadas de transformar la luz visual en información electromecánica se envía a, y se interpreta por, el cerebro a través del nervio óptico. La disposición de las células neuronales dentro de la retina requiere que la luz se desplace a través de la mayoría de las capas celulares para llegar a los fotorreceptores ubicados en la parte posterior de la retina; después los fotorreceptores transmiten información a las neuronas de la retina para el procesamiento local de la información visual y la transmisión a la corteza visual. Hay dos tipos de fotorreceptores, bastones y conos. Ambos tipos de fotorreceptores están presentes en toda la retina, pero los bastones dominan la periferia, mientras que los conos son más densos en el centro de la retina. El centro de la retina, también conocido como mácula, es una región especializada de la retina con conos densamente empaquetados y alta concentración de pigmentos donde la visión es más aguda. Una de las principales características de la retina es su transparencia. La transparencia permite que la luz llegue a la capa más externa de la retina, donde se encuentran los fotorreceptores. Este requisito de transparencia implica que la vasculatura necesaria para nutrir y apoyar la retina está extremadamente especializada. El suministro de sangre a la retina es proporcionado por dos fuentes principales: la vasculatura retiniana y la coroides. La coroides es un tejido pigmentado altamente vascularizado que se encuentra entre la retina y la esclerótica. La coroides proporciona nutrientes, metabolitos e intercambio gaseoso a la retina por difusión a través de coriocapilares. El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa de células pigmentadas situada entre la neurorretina y la coroides. Las células de RPE protegen, apoyan y alimentan la retina sensible a la luz. El entorno particular de la neurorretina es mantenido por la barrera hematoretiniana (BRB), también denominada barrera sangre-retina. La BRB está constituida por la barrera hematoretiniana interna y la barrera hemato-retiniana externa. La barrera hemato-retiniana interna está formada por las uniones estrechas entre las células endoteliales capilares de la vasculatura retiniana. La barrera hemato-retiniana externa está constituida por las uniones estrechas de las células de RPE. Las uniones estrechas entre las células de RPE son esenciales para controlar el transporte de compuestos solubles y líquidos a través de la BRB, así como para evitar la entrada de sustancias tóxicas en la retina.

[0015] Los vasos sanguíneos se forman en la retina por dos procesos principales: vascularización o angiogénesis. La vascularización se produce como resultado de la diferenciación de células precursoras, que ya están presentes en el tejido, para dar las células endoteliales que contribuyen a la formación de vasos sanguíneos. La angiogénesis difiere en que los nuevos vasos sanguíneos se generan al brotar de la vasculatura preexistente. La angiogénesis requiere la proliferación, migración y diferenciación de células endoteliales; así como la maduración de los vasos recién formados. El número de células endoteliales es normalmente estable en un organismo adulto; la estabilidad en el endotelio está controlada por un equilibrio en la concentración de factores angiogénicos y antiangiogénicos. Las alteraciones en el equilibrio de factores conducen a la inducción o supresión de la angiogénesis. La vascularización y la angiogénesis son procesos naturales que tienen lugar durante el desarrollo y otros eventos como la cicatrización; pero estos procesos también tienen un papel en la patogénesis de ciertas enfermedades. La neovascularización patológica suele implicar una combinación de vascularización y angiogénesis. Hay dos tipos de neovascularización que se producen en la retina y ambos pueden provocar pérdida de visión: la neovascularización retiniana (RNV) en la que nuevos vasos brotan de los capilares retinianos e invaden las capas vítrea y neural de la retina, y la neovascularización coroidea (CNV) en la que nuevos vasos brotan de la vasculatura coroidea e invaden el espacio subretiniano. Aunque la RNV y la CNV se originan en diferentes redes vasculares e invaden diferentes capas de la retina, los mecanismos moleculares compartidos promueven la progresión de ambas. La RNV y la CNV son las causas más comunes de pérdida visual grave en los países desarrollados y se necesitan nuevos tratamientos.

[0017] El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), uno de los mediadores más importantes de la angiogénesis, se regula por incremento durante la RNV y la CNV. Durante la última década, los científicos han desarrollado varios nuevos fármacos "anti-VEGF". Ayudan a bloquear los vasos sanguíneos anómalos, ralentizan su fuga y ayudan a reducir la pérdida de visión. El tratamiento con fármacos anti-VEGF se realiza mediante inyecciones intravítreas.

[0018] La inyección intravítrea (IVT) es el método más común para administrar medicamentos a la parte posterior del ojo, que se usa por todos los medicamentos aprobados actualmente para el tratamiento de la enfermedad retiniana con excepción de la verteporfina. La verteporfina se administra mediante inyección intravenosa seguida por tratamiento con láser, pero su uso ha disminuido significativamente debido a la comercialización de los modernos tratamientos anti-VEGF. Las razones detrás del uso prolongado de la inyección IVT son la eficiencia en la administración de fármacos, el nivel de familiaridad con los médicos de la retina y la capacidad del médico para controlar el cumplimiento del tratamiento (Rowe-Rendleman et al 2014). Sin embargo, este método presenta su propio conjunto de desventajas muy específicas que incluyen molestias para el paciente, riesgo de endoftalmitis, formación de cataratas y desprendimiento de retina, así como un alto costo asociado debido a la administración en el consultorio. Otros métodos de administración incluyen inyección periocular, inyección supracoroidea, inyección subtenoniana y también gotas oftálmicas. Sin embargo, existe un cierto escepticismo sobre si se puede lograr una eficacia suficiente para tratar las afecciones de la retina con gotas oftálmicas, ya que el principio activo debe administrarse desde la córnea hasta su sitio de acción en la retina. Existen importantes barreras y rutas de eliminación que dificultan la administración de medicamentos a la parte posterior del ojo. En primer lugar, solo el 1-7 % del fármaco administrado se absorbe por el ojo; la mayor parte del fármaco administrado como gotas oftálmicas se drena fuera del ojo o se absorbe a través del conducto nasolagrimal a la circulación sistémica. Además, los fármacos se eliminan rápidamente del humor vítreo. Existen dos vías de aclaramiento desde la cavidad posterior, la anterior y la posterior. La primera implica el aclaramiento a la cámara anterior por el flujo de humor acuoso (AH) y posteriormente por el flujo de salida de AH a través del ángulo de la cámara anterior. La segunda implica la eliminación a través de la barrera hemato-retiniana. Por lo tanto, los fármacos que pueden penetrar fácilmente a través de la barrera hemato-retiniana tendrán una semivida muy corta en el humor vítreo.

[0019] Una alternativa a los fármacos anti-VEGF para el tratamiento de enfermedades retinianas relacionadas con la neovascularización son los fármacos basados en interferencia de ARN (iARN).

[0021] La iARN es un mecanismo regulador postranscripcional que se produce de manera natural presente en la mayoría de las células eucariotas que usa moléculas pequeñas de ARN bicatenario (ARNbc) para dirigir el silenciamiento génico dependiente de la homología. Su descubrimiento por Fire y Mello en el gusanoC. elegans{Fire et al 1998} fue galardonado con el Premio Nobel en 2006. Poco después de su primera descripción, también se demostró que se producía iARN en células de mamífero por medio de ARN de interferencia pequeños bicatenarios (ARNip) de 21 nucleótidos de longitud {Elbashir et al 2001}.

[0023] Se cree que el proceso de interferencia de ARN es un mecanismo de defensa celular conservado evolutivamente usado para prevenir la expresión de genes extraños y se comparte habitualmente por diversos filos y flora, donde se denomina silenciamiento génico postranscripcional. Desde el descubrimiento del mecanismo de iARN ha habido una gran cantidad de investigación para descubrir nuevos compuestos que pueden alterar selectivamente la expresión génica como nueva forma de tratar la enfermedad humana abordando objetivos que de otro modo "no podrían tratarse con fármacos" con enfoques farmacéuticos tradicionales que implican moléculas o proteínas pequeñas.

[0025] De acuerdo con el conocimiento actual, el mecanismo de iARN se inicia cuando los ARN bicatenarios largos se procesan por una proteína de tipo ARNasa III conocida como Dicer. La proteína Dicer contiene normalmente un dominio de ARN helicasa N-terminal, un dominio de unión a ARN denominado Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ), dos dominios de ARNasa III y un dominio de unión a ARN bicatenario (dsRBD) {Collins et al 2005} y su actividad conduce al procesamiento de los ARN bicatenarios largos para dar ARNip bicatenarios de 21-24 nucleótidos con proyecciones en 3' de 2 bases y un grupo fosfato en 5' e hidroxilo en 3'. Los dúplex de ARNip resultantes se incorporan luego en el complejo efector conocido como complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), donde la cadena antisentido o guía del ARNip guía al RISC para reconocer y escindir secuencias de ARNm diana {Elbashir et al 2001} tras el desenrollamiento dependiente de trifosfato de adenosina (ATP) de la molécula de ARNip bicatenario a través de una actividad de ARN helicasa {Nykanen et al 2001}. La actividad catalítica de RISC, que conduce a la degradación de ARNm, está mediada por la endonucleasa argonauta 2 (AGO2) {Liu et al 2004; Song et al 2004}. AGO2 pertenece a la familia de proteínas argonautas altamente conservadas. Las proteínas argonautas son proteínas altamente básicas de ~100 KDa que contienen dos dominios comunes, a saber, los dominios PIWI y PAZ {Cerutti et al 2000}. El dominio PIWI es crucial para la interacción con Dicer y contiene la actividad nucleasa responsable de la escisión de los ARNm. AGO2 usa una cadena del dúplex de ARNip como guía para encontrar ARN mensajeros que contienen secuencias complementarias y escinde la estructura principal de fosfodiéster entre las bases 10 y 11 con respecto al extremo 5' de la cadena guía {Elbashir et al 2001}. Una etapa importante durante la activación de RISC es la escisión de la cadena sentido o pasajera por AGO2, eliminando esta cadena del complejo {Rand et al 2005}. Los estudios de cristalografía que analizan la interacción entre la cadena guía de ARNip y el dominio PIWI revelan que solo los nucleótidos 2 a 8 constituyen una "secuencia semilla" que dirige el reconocimiento de ARNm diana por RISC, y que un emparejamiento erróneo de un solo nucleótido en esta secuencia puede afectar drásticamente a la capacidad de silenciamiento de la molécula {Ma et al 2005; Doench et al 2004; Lewis et al 2003}. Una vez que el ARNm se ha escindido, debido a la presencia de extremos de ARN no protegidos en los fragmentos, el ARNm se escinde y degrada adicionalmente por nucleasas intracelulares y ya no se traducirá en proteínas {Orban et al 2005} mientras que RISC se reciclará para rondas posteriores {Hutvagner et al 2002}. Esto constituye un proceso catalítico que conduce a la reducción selectiva de moléculas de ARNm específicas y las proteínas correspondientes. Es posible explotar este mecanismo nativo para el silenciamiento génico con el fin de regular cualquier gen(es) de elección suministrando directamente efectores de ARNip en las células o tejidos, donde activarán RISC y producirán un silenciamiento potente y específico del ARNm diana. La iARN se ha aplicado en la investigación biomédica, como el tratamiento del VIH, la hepatitis viral, enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares, enfermedad metabólica, trastornos neurodegenerativos y cáncer {Angaji SA et al 2010}.

[0027] Se han publicado muchos estudios que describen las características ideales que debe tener un ARNip para lograr la máxima eficacia, con respecto a la longitud, la estructura, la composición química y la secuencia. Los parámetros iniciales para el diseño de ARNip se expusieron por T uschl y colaboradores en el documento WO02/44321, aunque se han publicado muchos estudios, algoritmos y/o mejoras posteriores desde entonces. Los enfoques de selección de ARNip se han vuelto más sofisticados a medida que han surgido detalles mecanicistas, además, un análisis adicional de datos existentes y nuevos puede proporcionar información adicional sobre un mayor refinamiento de estos enfoques {Walton SP et al 2010}.

[0029] Alternativamente, varios estudios recientes notificaron el diseño y análisis de nuevas estructuras desencadenantes de iARN distintas de la estructura clásica de ARNip 19+2 y que no se ajustan a las características clave del ARNip clásico en cuanto a proyección, longitud o simetría, discutiendo la flexibilidad de la maquinaria de iARN en células de mamífero {Chang CI et al 2011}.

[0031] Además, se ha realizado un gran esfuerzo para mejorar la estabilidad del ARNip, ya que se percibe como uno de los principales obstáculos para la terapia basada en ARNip, dada la naturaleza ubicua de las ARNasas en los líquidos biológicos. Otro problema inherente de las moléculas de ARNip es su inmunogenicidad, por lo que se ha encontrado que los ARNip inducen la activación inespecífica del sistema inmunitario innato. La desactivación anulación de genes no previstos (ARNm) es un efecto secundario bien conocido del silenciamiento génico mediado por ARNip. Se produce como resultado de la complementariedad parcial entre el ARNip y ARNm distintos de la diana prevista y provoca efectos inespecíficos (OTE) de genes que tienen complementariedad de secuencia con cualquiera de las cadenas de ARNip. Una de las principales estrategias seguidas para la mejora de la estabilidad y la reducción de OTE ha sido el uso de nucleótidos modificados tales como 2-O-metil-nucleótidos, 2'-aminonucleótidos o nucleótidos que contienen puentes de metileno en 2'-O o 4'-C. Además, se ha descrito la modificación de la estructura principal de ribonucleótido que conecta nucleótidos adyacentes, principalmente mediante la introducción de nucleótidos modificados con fosforotioato. Parece que la estabilidad mejorada y/o la reducción de la inmunogenicidad a menudo son inversamente proporcionales a la eficacia {Parrish, 2000}, y solo un cierto número, posiciones y/o combinaciones de nucleótidos modificados pueden dar como resultado un compuesto silenciador estable y no inmunogénico. Como este es un obstáculo importante para los tratamientos basados en ARNip, se han publicado diferentes estudios que describen ciertos patrones de modificación que muestran buenos resultados, ejemplos de los cuales incluyen los documentos EP1527176, WO2008/050329, WO2008/104978 o WO2009/044392, aunque se pueden encontrar muchos más en la bibliografía {Sanghvi YS. 2011; Deleavey et al 2012}.

[0033] El ojo es un compartimento tisular relativamente aislado, lo que proporciona ventajas para el uso de fármacos basados en ARNip para tratar enfermedades retinianas relacionadas con la neovascularización. Se ha demostrado la viabilidad del uso de ARNip para el tratamiento de CNV usando ARNip administrados por inyección intravítrea dirigida contra VEGF o receptor 1 de VEGF (VEGFR1) {Campochiaro PA. 2006}. La administración de ARNip mediante instilación tópica al segmento posterior es realmente difícil, debido a la distancia relativamente grande que tienen que atravesar los ARNip a través del cuerpo vítreo antes de llegar a la retina {Guzman-Aranguez A. et al 2013}. Además, el tratamiento farmacéutico de las enfermedades retinianas que afectan al segmento posterior del ojo también se ve dificultado por las barreras oculares sanguíneas restrictivas, como la barrera acuosa sanguínea (BAB) y la BRB, que separan el ojo de la circulación sistémica. Además, la estructura compartimentada del ojo limita el paso de los ARNip desde la cámara anterior hasta el segmento posterior del ojo {Duvvuri S et al 2003}. Finalmente, una vez que los ARNip entran satisfactoriamente en la parte posterior del ojo, los mecanismos de eliminación eficaces actúan para eliminar rápidamente las moléculas administradas {Del Amo EM et al 2008}. Por lo tanto, la inyección directa en la cavidad vítrea se ha convertido en el medio más eficaz para administrar terapias basadas en ARNip en el segmento posterior del ojo {Edelhauser HF et al 2010}. La inyección intravítrea de ARNip logra altas concentraciones de ARNip que están localmente disponibles para los tejidos retinianos al tiempo que limita la exposición sistémica. Sin embargo, la concentración de ARNip se agota rápidamente a partir del segmento posterior debido a la degradación por endonucleasas vítreas y/o mediante permeación a través de la BRB y por difusión a través del vítreo a la cámara anterior. Por lo tanto, se requieren múltiples inyecciones intravítreas para mantener concentraciones óptimas de ARNip dentro del segmento posterior del ojo. La principal desventaja de este modo de administración es que las múltiples inyecciones intravítreas están asociadas con presión intraocular elevada, hemorragia vítrea o retiniana, desprendimiento de retina, desgarros retinianos, endoftalmitis, cataratas, cuerpos flotantes y visión borrosa transitoria {Edelhauser HF et al 2010}. Por lo tanto, si bien las inyecciones intravítreas garantizan la administración de una alta concentración de ARNip a la retina, este método de administración también conlleva su propio conjunto de riesgos particulares. En consecuencia, la administración tópica de ARNip podría reducir los riesgos y conllevar un método de administración más respetuoso para el paciente.

[0034] Se ha demostrado que los ARNip desnudos alcanzan ciertas regiones después de las aplicaciones tópicas, pero el acceso a regiones más profundas como la capa más interna de la retina y la captación celular eficaz requieren el desarrollo de estrategias que garanticen que una concentración suficiente del compuesto alcanza el citoplasma de las células ubicadas en la zona objetivo y provoca una respuesta fisiológica o terapéutica deseada. Los enfoques físicos para administrar ARNip a través de la barrera del estrato córneo incluyen microagujas (Chong, Gonzalez-Gonzalez et al., 2013), inyección intradérmica (Leachman, Hickerson et al., 2010), electroporación (Nakai, Kishida et al., 2007), iontoforesis (Kigasawa, Kajimoto et al., 2010) entre otros. Las modificaciones de la molécula y/o formulación también pueden permitir que la molécula penetre en la región requerida y mejorar la captación celular.

[0035] Se ha descrito la administración tópica de agentes terapéuticos basados en ARNip para el tratamiento de enfermedades retinianas; por ejemplo, el documento US20130123330 da a conocer el tratamiento de retinopatía diabética y otras enfermedades de neovascularización ocular administrando al menos un dúplex de ARNip que se une a moléculas de ARNm que codifican para VEGF o VEGFR2, o un cóctel que combina dúplex de ARNip que se dirigen a genes tanto de VEGF como de VEGFR2. Esta solicitud de patente describió que los dúplex de ARNip pueden administrarse al ojo por vía tópica, subconjuntiva o intravítrea. Sin embargo, la memoria descriptiva solo incluye ejemplos de compuestos administrados por vía intravítrea o subconjuntiva. El documento WO2010048352 (Quark Pharmaceuticals) da a conocer el uso de compuestos de ARNip modificados químicamente para el tratamiento de enfermedades, trastornos y lesiones oculares asociados con la degeneración o muerte de células ganglionares de la retina, incluyendo retinitis pigmentosa (RP), retinopatía diabética (DR), edema macular diabético (DME) y degeneración macular relacionada con la edad (AMD).

[0036] Aunque se ha demostrado la administración tópica al tejido retiniano para compuestos de ARNip que regulan por disminución la expresión de genes diana asociados con la pérdida de estas células, tales como los genes de CASP2, RTP801, TIGASEII y p53, solo se ha demostrado que los compuestos de ARNip dirigidos a caspasa 2 proporcionan un efecto neuroprotector ocular al aumentar la supervivencia de las células ganglionares retinianas. La selección de genes diana desempeña un papel clave en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades retinianas relacionadas con la neovascularización con productos terapéuticos basados en ARNip. La proteína de repetición de anquirina regulada por Notch (NRARP) se induce por Notch en puntos de ramificación recién formados, donde modula de manera diferente la actividad de señalización de Notch y Wnt para equilibrar la proliferación del tallo y la estabilidad de los vasos. La regulación por disminución mediada por ARNip de NRARP en HUVEC se correlaciona con un aumento de Notch, que en las células del tallo se traduce en regresión de los vasos, mientras que el aumento de Notch conduce a la formación de nuevas células de la punta {Phng LK, Potente M, et al. 2009}. Por lo tanto, es probable que NRARP desempeñe un papel importante en la regulación de los procesos de angiogénesis y/o neovascularización en los tejidos retinianos.

[0037] Los productos terapéuticos basados en ARNip pueden ralentizar y prevenir la progresión de RNV y CNV en enfermedades retinianas, pero los beneficios terapéuticos pueden verse reducidos por la administración ineficaz de ARNip y la duración limitada de la biodisponibilidad de ARNip, lo que requiere pautas de tratamiento prolongadas de inyecciones intravítreas repetidas. Por lo tanto, se deben diseñar productos terapéuticos basados en ARNip mejorados y no invasivos dirigidos a genes diana nuevos e inventivos para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades retinianas relacionadas con la neovascularización.

[0038] Lobov et al 2011 (Blood, vol. 117, págs. 6728-6737) describe el papel de la ruta de D114 / Notch en la angiogénesis en la retina y señala además que la eliminación genética de NRARP da como resultado un fenotipo de ganancia de función Notch opuesto que conduce a una vaso-obliteración exagerada.

[0039] Phng LK, Potente M, et al. 2009; y Guzman-Aranguez A. et al 2013; ambos mencionados anteriormente, también son relevantes para la comprensión de la presente invención.

[0040] Sumario de la invención

[0041] Según la presente invención, se proporciona una molécula de ARNip para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad retiniana relacionada con la neovascularización caracterizada por un aumento de la expresión y/o la actividad de NRARP mediante administración tópica a la superficie corneal del ojo, según la reivindicación independiente 1. Aspectos adicionales de la invención se mencionan en las reivindicaciones dependientes. La presente divulgación proporciona productos mejorados para reducir la expresión de NRARP y, por consiguiente, las enfermedades retinianas relacionadas con la neovascularización. Una de las ventajas de tratar las enfermedades retinianas relacionadas con la neovascularización con productos de ARNip frente a agentes terapéuticos antiangiogénicos tradicionales es que los tratamientos basados en ARNip tendrán un efecto más duradero. Esta característica se debe al hecho de que los ARNip bloquean la síntesis de la proteína diana. Cuando se suspende el tratamiento, la célula tendrá que sintetizar nuevas proteínas diana desde cero; mientras que los tratamientos tradicionales dejarán la proteína diana intacta, lista para volver a estar activa una vez que el inhibidor ya no esté presente. Otra ventaja puede ser aumentar la potencia usando una combinación de diferentes ARNip para tratar la afección; esto puede lograrse combinando ARNip dirigidos a NRARP con otros moduladores de NRARP y/u otros mediadores moleculares de neovascularización, tales como VEGF o VEGFR2. El mecanismo de acción de los ARNip implica que una vez que la molécula activa alcanza el citoplasma, la misma molécula puede usarse para mediar en la degradación de muchas moléculas de ARNm, este no es el caso con anticuerpos, que requieren una estequiometría 1:1. Por lo tanto, se prevé que se necesitarán dosis más bajas de los compuestos para lograr la misma eficacia clínica, reduciendo así posiblemente los efectos secundarios.

[0043] Descripción de los dibujos

[0045] Figura 1: muestra los fragmentos cortos de la secuencia del gen diana de NRARP elegidos como secuencias diana para los ARNip de la presente divulgación.

[0047] Figura 2: muestra las secuencias de oligonucleótidos para las moléculas de ARNip de la presente invención dirigidas a NRARP abarcadas por la presente divulgación. Las SEQ ID NO proporcionadas en la figura se refieren a la cadena sentido (5' -> 3'); normalmente, los ARNip se administrarán como ARNbc, por lo que los ARNip incluirán tanto la cadena sentido como su cadena antisentido complementaria. De SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 18 son ARNip dirigidos a de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9 respectivamente. Generalmente, un ARNip incluirá la cadena sentido y antisentido, y también puede incluir proyecciones de dinucleótidos en 3'(por ejemplo, dTdT). Sin embargo, esto no es esencial.

[0049] Figura 3: ARNip modificados dirigidos a NRARP. De SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 40 se refieren a la cadena sentido modificada (5' -> 3') y la cadena antisentido modificada (5' -> 3') del ARNip de SEQ ID NO: 10, que se dirige a la secuencia SEQ ID NO: 1 del gen de NRARP. Leyenda: cadena sentido (S), cadena antisentido (AS), minúscula (ribonucleótidos 2'OMe), * (PS o enlace fosfotioato),minúscula(4'-tioribosa o 4'S), pU o 5pU (5-propiniluracilo en 3'), MAYÚSCULA (ribonucleótidos 2'F),minúscula(5'-metiluridina o 5mU), dT (desoxitimina o 2'H-timina).

[0051] Figura 4: niveles de expresión génica de NRARPin vitrodespués de la transfección de uno de los siguientes ARNip dirigidos a NRARP: SEQ ID NO: 10 (SYL136001), SEQ ID NO: 11 (SYL136005), SEQ ID NO: 12 (SYL136003) y SEQ ID NO: 13 (SYL136004) en células HeLa humanas.

[0053] Figura 5: viabilidad celularin vitrodespués de la transfección de uno de los siguientes ARNip dirigidos a NRARP: SEQ ID NO: 10 (SYL136001), SEQ ID NO: 11 (SYL136005), SEQ ID NO: 12 (SYL136003) y SEQ ID NO: 13 (SYL136004) en células HeLa humanas.

[0055] Figura 6: niveles de expresión génica de NRARPin vitrodespués de la transfección de ARNip de SEQ ID NO: 10 dirigido a NRARP y sus homólogos modificados: SEQ ID<n>O: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID N<o>: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39 en células HeLa humanas.

[0056] Figura 7: niveles de expresión génica de NRARPin vitrodespués de la transfección de ARNip de SEQ ID NO: 10 dirigido a NRARP y sus homólogos modificados: SEQ ID n O: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID No : 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39 en células BEAS-2B humanas.

[0058] Figura 8: niveles de expresión génica de NRARPin vitrodespués de la transfección de SEQ ID NO: 10 y sus homólogos modificados: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39 en células C2C12 murinas.

[0060] Figura 9: niveles de expresión génica de NRARPin vitrodespués de la transfección de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 37 en células ARL6 de rata.

[0062] Figura 10: viabilidad celularin vitrodespués de la transfección de SEQ ID NO: 10 y sus homólogos modificados: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39 en células HeLa humanas.

[0064] Figura 11: viabilidad celularin vitrodespués de la transfección de SEQ ID NO: 10 y sus homólogos modificados: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39 en células BEAS-2B humanas.

[0066] Figura 12: viabilidad celularin vitrodespués de la transfección de SEQ ID NO: 10 y sus homólogos modificados: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39 en células C2C12 murinas.

[0068] Figura 13. viabilidad celularin vitrodespués de la transfección de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 37 en células ARL6 de rata.

[0069] Figura 14: niveles de ARNm de NRARP en la retina después de la inducción de CNV por láser. Los datos representan medias ± e.e.m. de tres animales (seis ojos) por punto de tiempo.

[0070] Figura 15: niveles de ARNm de NRARP en coroides/RPE después de la inducción de CNV por láser. Los datos representan medias ± e.e.m. de al menos dos animales (cuatro ojos) por punto de tiempo.

[0071] Figura 16: gráfico de barras de las mediciones de lesiones a las tres semanas después del tratamiento con láser, ya sea con vehículo o con SEQ ID NO: 37 (5 mg/ml) administrada por vía tópica, o con inyección intravítrea de compuesto anti-VEGF (5 |jg/ojo). Las áreas de las lesiones se determinaron mediante angiografía con fluoresceína que se cuantificaron (en píxeles2) usando un software de análisis de imágenes computarizado, excluyendo el área de avascularización en el centro de la lesión. Los datos representan medias ± e.e.m. de seis animales (doce ojos) por punto de tiempo.

[0072] Figura 17: Variables estudiadas para evaluar las estructuras: 1.- Número de uniones maestras; 2.- Número de segmentos maestros; 3.- Longitud total de segmentos maestros; 4.- Número de mallas; 5.- Área total de mallas. Figura 18: cambio en los diferentes parámetros estudiados en respuesta al medio completo. Se representan los siguientes parámetros: número de uniones maestras; número de segmentos maestros; longitud total de segmentos maestros; número de mallas; área total de mallas. Se obtuvieron resultados a partir de células sembradas en placas de cultivo cubiertas con matrigel usando: medio EBM sin suplementos como control negativo (basal), o medio completo con suplementos y FCS al 10 % (control positivo).

[0073] Figura 19: análisis de los diferentes parámetros estudiados en respuesta a la SEQ ID NO: 37 o ARNip de KDR. Figura 20: imágenes de las estructuras formadas en respuesta a las diferentes condiciones.

[0074] Figura 21: A. Proliferación de células HUVEC en respuesta a diferentes concentraciones de VEGF. B. Inhibición de la proliferación inducida por VEGF por bevabizumab.

[0075] Figura 22: efecto de ARNip anti-KDR o ARNip de SEQ ID NO: 37 sobre la proliferación inducida por medio completo (FCS al 10 % y VEGF 100 ng/ml) en células HUVEC.

[0076] Figura 23: migración de células HUVEC en respuesta a dosis crecientes de VEGF.

[0077] Figura 24: efecto de ARNip anti-KDR o ARNip de SEQ ID NO: 37 sobre la migración de células HUVEC inducida por medio sin suplementos y medio completo (FCS al 10 % VEGF 100 ng/ml).

[0078] Figura 25: imágenes de células en el compartimento superior (migrando) en respuesta a las diferentes condiciones. Figura 26: A. Cuantificación de la cicatrización de heridas en condiciones basales y en respuesta a VEGF 10 ng/ml. B. Imágenes de la lesión en el momento en el tiempo 0 y 24 h después de la inducción.

[0079] Figura 27: cuantificación de la cicatrización de heridas en condiciones basales y en respuesta al medio completo (FCS al 10 % y VEGF 100 ng/ml).

[0080] Figura 28: imágenes que muestran las heridas en el tiempo 0 y 16 h después de la inducción en las diferentes condiciones sometidas a ensayo.

[0081] Figura 29: niveles de ARNm de NRARP en células HUVEC.

[0082] Descripción detallada de la invención

[0083] Tal como se describe en el presente documento, la presente divulgación se refiere a proporcionar una molécula de ARNip para su uso como medicamento, en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad retiniana caracterizada por un aumento de la expresión y/o la actividad de NRARP, en la que dicha molécula se dirige específicamente a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9 y reduce la expresión del gen de NRARP cuando se introduce en una célula. Preferiblemente, la secuencia diana comprende o consiste en la SEQ ID NO: 1. Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía en esta descripción han de interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en esos métodos.

[0084] Un gen se "selecciona como diana" por un ARNip según la presente divulgación cuando, por ejemplo, la molécula de ARNip disminuye o inhibe selectivamente la expresión del gen. La expresión “disminuir o inhibir selectivamente” tal como se usa en el presente documento abarca ARNip que afectan a la expresión de un gen, en este caso NRARP. De manera alternativa, un ARNip se dirige a un gen cuando (una cadena de) el ARNip se híbrida en condiciones rigurosas con el transcrito génico, es decir, su ARNm. La hibridación "en condiciones rigurosas" significa la hibridación con la región de ARNm diana en condiciones convencionales, por ejemplo, alta temperatura y/o bajo contenido en sal que tiende a desfavorecer la hibridación. Un protocolo adecuado (que implica 0,1xSSC, 68 °C durante 2 horas) se describe en Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, en las páginas 387-389.

[0086] Las secuencias de ácidos nucleicos citadas en el presente documento se escriben en una dirección de 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. El término "ácido nucleico" se refiere a ADN o ARN o una forma modificada del mismo que comprende las bases de purina o pirimidina presentes en ADN (adenina "A", citosina "C", guanina "G", timina "T") o en el ARN (adenina "A", citosina "C", guanina "G", uracilo "U"). Los ARN de interferencia proporcionados en el presente documento pueden comprender bases "T", por ejemplo, en los extremos 3', a pesar de que las bases "T" no se producen de forma natural en el ARN. En algunos casos, estas bases pueden aparecer como "dT" para diferenciar desoxirribonucleótidos presentes en una cadena de ribonucleótidos.

[0088] La secuencia diana tal como se definió anteriormente se describe como una secuencia de ADN diana tal como se usa para la definición de variantes de transcrito en bases de datos usadas con el fin de diseñar ARNip, mientras que los compuestos específicos que se usarán serán secuencias de ARN definidas como tales.

[0090] Un experto en el campo puede acceder a cualquier secuencia de genes diana a través de bases de datos públicas. Por ejemplo, el número de registro de GenBank correspondiente al ARNm de NRARP humano es NP_001004354.1 y NM_001004354.2 (ID de gen: 441478). Además, ENSEMBL (MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute) tiene el siguiente número de registro de NRARP humano: ENSG00000198435. Toda esta información se encuentra en la base de datos Ensembl de libre acceso.

[0092] Dicha región diana preferida identificada por la presente invención comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ iD NO: 9.

[0094] En una realización preferida, dicha región diana preferida comprende o consiste en SEQ ID NO: 1.

[0096] Estas secuencias presentan un 100 % de homología entre las siguientes especies:Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Canis lupus familiaris, y Sus scrofa domestica.

[0098] En el campo de la iARN, cuando los estudiosin vitrodemuestran que un ARNip humano no puede inducir la inactivación del gen del modelo animal, se sintetiza un compuesto sustituto (análogo activo en animales) con el fin de analizar la eficacia del ARNip en el modelo animal relevante. Este sustituto está diseñado contra la misma región que el ARNip humano, por lo tanto, los dos ARNip tienen la misma secuencia excepto por unos pocos nucleótidos, dependiendo de la homología entre el gen diana humano y el animal. Este enfoque se ha usado ampliamente para el desarrollo de otros oligonucleótidos, específicamente para estudios de toxicología y eficacia {Kornbrust D et al 2013}.

[0100] En una realización más preferida, dicha región diana preferida comprende o consiste en la SEQ ID NO: 1 (5'-CACCAGGACATCGTGCTCT -3').

[0102] Por consiguiente, un ARNip según los aspectos de la presente divulgación comprenderá preferentemente una molécula de ARN bicatenario, cuya cadena antisentido comprenderá una secuencia de ARN sustancialmente complementaria a al menos una secuencia que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9, y cuya cadena sentido comprenderá una secuencia de ARN complementaria a la cadena antisentido, en la que ambas cadenas se hibridan mediante emparejamiento de bases convencional entre nucleótidos. Más preferiblemente, un ARNip según aspectos de la presente divulgación comprenderá preferiblemente una molécula de ARN bicatenario, cuya cadena antisentido comprenderá una secuencia de ARN sustancialmente complementaria a de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9, e incluso más preferiblemente la cadena antisentido comprende o consiste en una secuencia de ARN sustancialmente complementaria a SEQ ID NO: 1.

[0104] Dentro del significado de la presente divulgación, "sustancialmente complementario" a una secuencia de ARNm diana, también puede entenderse como "sustancialmente idéntico" a dicha secuencia diana. "Identidad" tal como se conoce por un experto habitual en la técnica, es el grado de relación de secuencia entre secuencias de nucleótidos tal como se determina haciendo coincidir el orden y la identidad de nucleótidos entre secuencias. En una realización, la cadena antisentido de un ARNip que tiene el 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de complementariedad con la secuencia de ARNm diana se considera sustancialmente complementaria y puede usarse en la presente divulgación. El porcentaje de complementariedad describe el porcentaje de nucleótidos contiguos en una primera molécula de ácido nucleico que puede formar pares de bases en el sentido de Watson-Crick con un conjunto de nucleótidos contiguos en una segunda molécula de ácido nucleico. En una realización preferida, la cadena de ARNip antisentido tiene un 100 % de complementariedad con respecto a la secuencia de ARNm diana, y la cadena sentido tiene un 100% de complementariedad con respecto a la cadena antisentido sobre la porción bicatenaria del ARNip. El ARNip también puede incluir proyecciones no emparejadas, por ejemplo, proyecciones de dinucleótidos en 3', preferentemente dTdT.

[0106] La afección ocular retiniana identificada por la presente divulgación es una enfermedad o trastorno relacionado con la neovascularización. Más preferiblemente, dicha afección ocular se selecciona de degeneración macular relacionada con la edad (AMD), retinopatía isquémica, edema macular diabético (DME), retinopatía diabética proliferativa (PDR), isquemia de retina diabética (DRI), edema retiniano diabético (DRE), neovascularización miope y retinopatía del prematuro (ROP) y combinaciones de los mismos.

[0108] Como se conoce a partir del estado de la técnica, se han propuesto muchas estructuras diferentes para lograr la interferencia de ARN. Generalmente, estas moléculas bicatenarias tienen desde aproximadamente 19 hasta aproximadamente 25 nucleótidos de longitud e incluyen estructuras de extremos romos, así como aquellas con proyecciones. Se ha descrito que las proyecciones son ventajosas y pueden estar presentes en los extremos 5' o en los extremos 3' de cualquiera de las cadenas, ya que reducen el reconocimiento por ARNasas e imitan el sustrato natural de Dicer. Algunos autores recomiendan incluir proyecciones en ambos extremos 3' de las moléculas, mientras que otros consideran que una proyección es suficiente. Otros han descrito el uso de estructuras de extremos romos con patrones de modificación específicos (documentos EP1527176, WO2005062937, WO2008104978, EP2322617, EP2348133, US20130130377 y muchos otros).

[0110] Las proyecciones pueden comprender entre 1 y 5 nucleótidos; normalmente, las proyecciones están formadas por dinucleótidos. Las moléculas clásicas usadas en el campo comprenden una molécula bicatenaria de 19 nucleótidos que comprende además proyecciones de dinucleótidos en 3' que comprenden preferentemente desoxinucleótidos tal como se enseña en estudios iniciales de Tuschl (documento WO0244321). Se dice que estas proyecciones mejoran aún más la resistencia a la degradación por nucleasa (ARNasa).

[0112] Más tarde, Kim et al 2005 describen que los productos de 21 meros (que contienen proyecciones de dinucleótidos) son necesarios para cargar en RISC. Además, Bramsen et al. 2009 describen la introducción de posibles modificaciones desestabilizadoras en las proyecciones para aumentar aún más la eficiencia del silenciamiento.

[0113] Como tal, una realización preferida de los diversos aspectos de la presente divulgación se refiere a moléculas de ARNip que se dirigen a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9 que comprenden al menos una proyección, preferentemente una proyección en 3' en la cadena sentido y/o antisentido. Más preferiblemente, dichas moléculas de ARNip se dirigen a SEQ ID NO: 1. Cuando la divulgación se refiere a una molécula de ARNip que se dirige a al menos una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9, el ARNip incluirá una cadena antisentido de longitud equivalente y complementaria a la diana, y una cadena sentido de longitud equivalente y complementaria a la cadena antisentido. Las cadenas antisentido y sentido pueden incluir además bases adicionales que no son complementarias a la otra cadena o la diana, y/o que no están emparejadas en la porción bicatenaria del ARNip. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 es una secuencia de 19 nucleótidos; el ARNip puede incluir una región bicatenaria de 19 pb sobre esta porción de identidad de secuencia, y proyecciones de dinucleótidos adicionales.

[0115] Una realización preferida de los diversos aspectos de la presente descripción se refiere a moléculas de ARNip que se dirigen a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9, en donde cada cadena de las moléculas de ARNip bicatenario tiene una longitud de aproximadamente 18 a aproximadamente 28 o más (por ejemplo, aproximadamente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 o más) nucleótidos.

[0117] Otra realización preferida de los diversos aspectos de la presente divulgación se refiere a moléculas de ARNip de 18-28 nucleótidos de longitud o más y que comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 18. Más preferentemente, las moléculas de ARNip bicatenario tienen al menos 19 nucleótidos de longitud y se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 18.

[0118] Otra realización alternativa de los diversos aspectos de la presente divulgación proporciona moléculas con extremos romos.

[0120] Además, una realización preferida de la presente descripción se refiere a un ARNip que comprende o consiste en una estructura bicatenaria de 19 nucleótidos que se dirige a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9. Más preferentemente, el ARNip comprende o consiste en una estructura bicatenaria de 19 nucleótidos que se dirige a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9, e incluso más preferentemente se dirige a SEQ ID NO: 1.

[0122] Una realización particular de la presente divulgación se refiere a un ARNip de extremos romos bicatenario de 19 nucleótidos dirigido contra al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9. Más preferentemente, el ARNip se dirige contra al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en Se Q ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9, e incluso más preferentemente el ARNip se dirige contra SEQ ID NO: 1. En una realización particular adicional, este compuesto comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 18. En una realización preferida adicional, la cadena antisentido de este ARNip tiene al menos el 80 %, preferiblemente al menos el 90 %, de complementariedad con respecto a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9.

[0124] En una realización preferida, este compuesto comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 18.

[0126] En otra realización preferida, este compuesto comprende o consiste en una cadena sentido que comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 18, y una cadena antisentido que es complementaria a la cadena sentido.

[0128] En una realización más preferida, este compuesto comprende o consiste en SEQ ID NO: 10 (cadena sentido 5'-CACCAGGACAUCGUGCUCU -3' y cadena antisentido 5'- AGAGCACGAUGUCCUGGUG -3'), correspondiente al presente compuesto de referencia denominado SYL136001.

[0130] Además, tal como se describe en la sección denominada antecedentes de la invención, una cuestión importante con las moléculas de ARNip es su inestabilidad en líquidos biológicos debido a la naturaleza ubicua de las ARNasas. En consecuencia, se ha descrito el uso de muchas modificaciones químicas diferentes a los nucleótidos con el fin de mejorar la estabilidad del compuesto.

[0132] Otro problema inherente de las moléculas de ARNip es su inmunogenicidad, por lo que se ha descubierto que los ARNip inducen la activación inespecífica del sistema inmunitario innato, incluyendo la regulación por incremento de determinadas citocinas, por ejemplo, interferón de tipo I y/o tipo II, así como la producción de IL-12, IL-6 y/o TNF-alfa. Se cree que el origen de estos efectos es la activación de receptores de tipo Toll tales como TLR7, TLR8 y/o TLR3 por ARNip.

[0134] También se ha descrito que ambos efectos, el reconocimiento por ARNasas y la inmunogenicidad, son dependientes de la secuencia.

[0136] Algunas de las modificaciones químicas que mejoran la estabilidad del compuesto al disminuir la susceptibilidad a las ARNasas también pueden reducir la inducción del reconocimiento inmunitario y, en consecuencia, reducir la respuesta inmunitaria posterior. Sin embargo, la inserción de nucleótidos modificados químicamente en un ARNip también puede dar como resultado una disminución de la eficacia de silenciamiento tal como se describió en la sección anterior y, por lo tanto, debe abordarse con precaución.

[0138] En consecuencia, en una realización preferida de los diversos aspectos de la presente divulgación, el ARNip comprende además al menos un nucleótido con una modificación química.

[0140] Las modificaciones químicas preferidas que mejoran la estabilidad y reducen los efectos inmunogénicos incluyen 2'-O-metil-nucleótidos, 2'-fluoro-nucleótidos, 2'-amino-nucleótidos, 2'-desoxi-nucleótidos o nucleótidos que contienen puentes de metileno en 2'-O o 4'-C. Otras modificaciones químicas preferidas para la protección frente a exonucleasa incluyen el patrón de modificación ExoEndoLight (EEL): modificación de todas las pirimidinas en la cadena sentido para dar residuos 2'-O-metilo y modificación de todas las pirimidinas en un motivo 5'-UA-3' o 5' -CA-3' en la cadena antisentido para dar residuos 2'-O-metilo. Además, la posición 1 de la cadena sentido también puede cambiarse a 2'-O-metilo para evitar la fosforilación en 5' de la cadena sentido y, por lo tanto, aumentar la especificidad de cadena del ARNip. Además, la cadena sentido también puede incluir una modificación de 2'-O-metilo en la posición 14, porque los residuos de 2'-O-Me en esta posición inactivan la cadena sentido y, por lo tanto, aumentan la especificidad de cadena de los ARNip. Además, otras modificaciones químicas preferidas para la protección frente a nucleasas incluyen el patrón de modificación de metil-fluoro (MEF): modificaciones alternas de 2'-fluoro y 2'-O-metilo comenzando (extremo 5') con un 2'-F en la cadena sentido y comenzando con 2'-O-Me en la cadena antisentido. Además, la posición 1 de la cadena sentido también puede cambiarse a 2'-O-Me y la posición 1 de la cadena antisentido a 2'-F (ya que los residuos 2'F son compatibles con la fosforilación en 5' mientras que los residuos 2'O-Me son voluminosos y generalmente perjudican la fosforilación). Este patrón de modificación no solo estabiliza la molécula, sino que también deshabilita la capacidad del RISC para usar la cadena sentido, promoviendo así la especificidad de la cadena. Además, la modificación de la estructura principal de ribonucleótidos puede realizarse uniendo los nucleótidos usando enlaces fosforotioato en lugar de enlaces fosfodiéster. Una modificación química preferida adicional dentro del significado de la presente invención se refiere a: 4'-tioribosa, 5-propiniluracilo, 3',5'-metiluridina o la sustitución de uracil-ribonucleótidos por desoxitimidina (desoxirribonucleótidos). En otra realización preferida de la presente divulgación, el al menos un nucleótido químicamente modificado y/o la al menos una modificación química en la estructura principal de ribonucleótido está en la cadena sentido, en la cadena antisentido o en ambas cadenas del ARNip.

[0142] Por consiguiente, en una realización, el ARNip comprende o consiste en al menos una secuencia con una cadena sentido y/o una cadena antisentido seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 66.

[0143] En una realización preferida, el ARNip comprende o consiste en una cadena sentido que comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 65, y una cadena antisentido que es complementaria a la cadena sentido que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 66, respectivamente.

[0145] Las moléculas de ARNip tal como se describieron anteriormente pueden administrarse al interior celular en su estructura nativa usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cuando se estudia el silenciamiento génicoin vitro,estos compuestos se administran usando reactivos de transfección convencionales. Para lograr efectosin vivo,estos compuestos también se pueden administrar desnudos o usando agentes potenciadores de la administración tales como, por ejemplo, liposomas, conjugación con un resto específico, etc., aunque se conocen muchas alternativas diferentes en la técnica, y se usan de manera diferente dependiendo del sitio diana deseado dentro del cuerpo.

[0147] Alternativamente, las moléculas de ARNip de los diversos aspectos de la divulgación pueden expresarse dentro de células a partir de promotores eucariotas. Los vectores recombinantes capaces de expresar las moléculas de ARNip pueden administrarse y persistir en células diana. Alternativamente, pueden usarse vectores que proporcionan la expresión transitoria de moléculas de ácido nucleico. Dichos vectores pueden administrarse repetidamente según sea necesario. Una vez expresada, la molécula de ARNip interactúa con el ARNm diana y genera una respuesta de interferencia de ARN. Las moléculas de ARNip producidas de esta manera a menudo se denominan ARNhc (ARN de horquilla corta), ya que sus cadenas sentido y antisentido están unidas por un pequeño bucle de nucleótidos.

[0149] Un aspecto adicional de la divulgación se refiere al uso de ARNip dirigido a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9 en la preparación de un medicamento para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad retiniana caracterizada por un aumento de la expresión y/o la actividad de NRARP. Más preferiblemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 1. El método comprende inhibir la expresión de NRARP en un paciente. El término inhibición se usa para indicar una reducción o regulación por disminución de la expresión o actividad. La enfermedad retiniana es una enfermedad o trastorno relacionado con la neovascularización. En una realización, la afección ocular se selecciona del grupo que comprende degeneración macular relacionada con la edad (AMD), retinopatía isquémica, edema macular diabético (DME), retinopatía diabética proliferativa (PDR), isquemia retiniana diabética (DRI), edema retiniano diabético (DRE), neovascularización coroidea miope (también denominada comúnmente neovascularización subretiniana, mancha de Fuchs o mancha retiniana de Forster-Fuchs, y degeneración disciforme en miopía patológica) y retinopatía del prematuro (ROP) y combinaciones de los mismos.

[0151] En el presente documento también se da a conocer un método de tratamiento de una enfermedad retiniana caracterizada por el aumento de la expresión y/o la actividad de NRARP. El método comprende inhibir la expresión de NRARP en un paciente. El método puede comprender administrar ARNip dirigido a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9. Más preferiblemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 1.

[0153] Se espera que el tratamiento terapéutico con ARNip dirigidos contra ARNm de NRARP sea beneficioso con respecto a agentes terapéuticos antiangiogénicos tradicionales debido a su especificidad, estabilidad, potencia, mecanismo de acción natural y naturaleza química uniforme con otros agentes de ARNip dirigidos a las mismas o diferentes dianas génicas, ya que difieren solo en la secuencia de nucleótidos. Los tratamientos basados en ARNip bloquean la síntesis de la proteína diana, lo que provocará una reducción sostenida de la expresión génica de NRARP y un efecto más duradero que puede evitar las consecuencias de una inyección intravítrea. Esto es especialmente importante en casos tales como enfermedad o trastorno relacionado con la neovascularización, que comprende, pero no se limita a, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), retinopatía isquémica, edema macular diabético (DME), retinopatía diabética proliferativa (PDR), isquemia retiniana diabética (DRI), edema retiniano diabético (DRE), neovascularización miope y retinopatía del prematuro (ROP), ya que a menudo son afecciones crónicas que requieren numerosas inyecciones intravítreas durante su tratamiento. Las inyecciones intraoculares repetitivas aumentan el riesgo de efectos secundarios perjudiciales que incluyen, entre otros, aumento de la presión en el ojo, inflamación, sangrado, infección, daño a la retina o a los nervios o estructuras circundantes, pérdida de visión, pero también efectos secundarios de los medicamentos que se usan durante el procedimiento, como los derivados del uso de antibióticos o medicamentos para dilatar las pupilas. Además, los ARNip pueden modificarse por ingeniería para silenciar la expresión de alelos de genes mutantes que difieren de los alelos de tipo natural en tan solo un único nucleótido. Por lo tanto, los tratamientos basados en ARNip pueden modular ventajosamente la expresión de genes que tienen mutaciones puntuales para ralentizar o incluso prevenir la enfermedad, inactivando los alelos mutantes de la enfermedad selectivamente mientras se permite la expresión continua de la proteína de tipo natural.

[0154] Teniendo en cuenta la preparación de dicho medicamento, el ARNip de los diversos aspectos de la presente divulgación puede formularse como una composición farmacéutica. Las composiciones y formulaciones de dichos ARNip se formulan para administración tópica en la superficie corneal del ojo. La aplicación a la superficie corneal puede estar, por ejemplo, en forma de gotas oftálmicas, un gel, loción, crema o insertos oculares. Otras formas de administración al ojo pueden incluir la inyección en el ojo.

[0156] Una realización preferida adicional de los diversos aspectos de la presente divulgación se refiere a un ARNip que se dirige específicamente a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a s Eq ID NO: 9 como se describe en los párrafos anteriores, para su uso como un medicamento para el tratamiento de una enfermedad retiniana caracterizada por un aumento de la expresión y/o la actividad de NRARP. Más preferiblemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 1. Tal como se describió anteriormente, puede ser un ARNip que comprende o que consiste en una estructura bicatenaria de 19 nucleótidos que se dirige a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9. Este ARNip puede tener extremos romos. Preferentemente, el ARNip comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 18. Otro ARNip para su uso según la invención comprende o consiste en al menos una secuencia con una cadena sentido y/o una cadena antisentido seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 66.

[0158] Dentro del contexto de la presente divulgación, para "dirigirse específicamente" a una secuencia, el ARNip de la divulgación comprende preferentemente al menos la misma secuencia semilla. Por lo tanto, cualquier secuencia según la descripción que se dirija específicamente a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9 es preferiblemente idéntica en las posiciones 2-8 de la cadena antisentido. Más preferiblemente, dicha secuencia seleccionada a la que se dirige específicamente es SEQ ID NO: 1.

[0160] Una molécula de ARNip puede comprender un vehículo de administración, que incluye liposomas, para la administración a un sujeto. Portadores y diluyentes y sus sales pueden estar presentes en formulaciones farmacéuticamente aceptables. Las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse a las células mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, encapsulación en liposomas, iontoforesis, o incorporación en otros vehículos, tales como polímeros biodegradables, hidrogeles, ciclodextrinas poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) y microesferas de PLCA, nanocápsulas biodegradables, y microesferas bioadhesivas, o mediante vectores proteicos. Los componentes de administración intracelular también pueden ser componentes virales que incluyen, pero no se limitan a, un péptido viral fusogénico para alterar los endosomas, lo que permite que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal, proteínas virales para mantener la expresión (por ejemplo, integrasa, elementos de LTR, proteínas rep, proteínas oriP y EBNA-1) o componentes virales que interaccionan con las proteínas de la superficie celular). Los componentes de administración intracelular viral adecuados incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, virus del herpes simple, adenovirus y preferiblemente virus adenoasociados (AAV). En una realización, la molécula de ARNip se administra a través de un portador de ARNip específico de célula que combina componentes de un virus y liposomas. En otra realización, las moléculas de ácido nucleico de la divulgación también pueden formularse o complejarse con polietilenimina y derivados de la misma, tales como derivados de polietilenimina-polietilenglicol-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-GAL) o polietilenimina-polietilenglicol-tri-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-triGAL). Las composiciones preferidas de la divulgación son disoluciones acuosas, específicamente soluciones salinas tales como solución salina tamponada con fosfato (PBS) con un intervalo de pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4, preferiblemente con un pH de 7,2 0,5.

[0162] Una molécula de ARNip de la divulgación puede complejarse con agentes de alteración de la membrana y/o un lípido catiónico o molécula de lípido auxiliar.

[0164] Los sistemas de administración que pueden usarse con la divulgación incluyen, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas, emulsiones múltiples, microemulsiones, liposomas, ungüentos, disoluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, bases y polvos de hidrocarburos, y pueden contener excipientes tales como solubilizantes, potenciadores de la permeación (por ejemplo, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos y aminoácidos), y polímeros hidrófilos (por ejemplo, policarbofilo y polivinilpirrolidona). En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable es un liposoma o un potenciador transdérmico.

[0166] Una formulación farmacéutica de la divulgación está en una forma adecuada para administración tópica a la superficie corneal del ojo.

[0168] En la técnica se conocen otros factores, e incluyen consideraciones tales como toxicidad y formas que evitan que la composición o formulación ejerza su efecto.

[0170] La presente divulgación también incluye composiciones preparadas para almacenamiento o administración que incluyen una cantidad farmacéuticamente eficaz de los compuestos deseados en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En la técnica farmacéutica se conocen bien portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico. Por ejemplo, pueden proporcionarse conservantes, estabilizantes, colorantes y agentes aromatizantes. Estos incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Además, pueden usarse antioxidantes y agentes de suspensión.

[0172] Una dosis farmacéuticamente eficaz es aquella dosis necesaria para prevenir, inhibir la aparición o tratar (aliviar un síntoma en cierta medida, preferentemente todos los síntomas) un estado patológico. La dosis farmacéuticamente eficaz depende generalmente del tipo de enfermedad, la composición usada, la vía de administración, el tipo de mamífero que se trata, las características físicas del mamífero específico en consideración, la medicación concurrente y otros factores que reconocerán los expertos en las técnicas médicas.

[0173] Una cantidad terapéuticamente eficaz también puede referirse a la cantidad de un ARNip suficiente para retrasar o minimizar la aparición de una enfermedad retiniana asociada con la neovascularización de la coroides o la retina. Una cantidad terapéuticamente eficaz también puede referirse a la cantidad del agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o control de un trastorno ocular asociado con la neovascularización de la coroides o la retina. Además, una cantidad terapéuticamente eficaz con respecto a un ARNip de la divulgación significa la cantidad de agente terapéutico solo, o en combinación con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o control de un trastorno de la retina asociado con neovascularización preferentemente de la coroides o la retina. Usado en relación con una cantidad de un ARNip de la invención, el término puede abarcar una cantidad que mejora la terapia global, reduce o evita efectos no deseados, o mejora la eficacia terapéutica de o sinergiza con otro agente terapéutico.

[0175] Un beneficio terapéutico en el tratamiento o control de un trastorno ocular relacionado con la neovascularización es la disminución sostenida de la neovascularización. Dado que el ARNip disminuirá los niveles de NRARP dentro de la célula, una vez que se detiene el tratamiento, la célula debe volver a sintetizar nuevas proteínas. Como tal, las terapias basadas en tratamientos con ARNip tendrán un efecto más sostenido que los que podrían esperarse usando moléculas pequeñas diseñadas para inhibir NRARP o bloquear la función de los receptores de VEGF u otra proteína asociada con la neovascularización. Esto se considera una mejora significativa de la eficacia terapéutica.

[0177] Un beneficio adicional del uso de ARNip es la probabilidad mínima de efectos secundarios o toxicidad derivada de su presencia en la circulación sistémica, a menudo asociada con varios tratamientos basados en gotas oftálmicas. Esto se debe al hecho de que,, cuando el compuesto entra en el torrente sanguíneo, se degradará rápidamente por las ARNasas presentes en la sangre.

[0179] Por otro lado, el hecho de que la molécula de ARNip se pueda comercializar en viales de dosis única significa que se puede evitar la adición de conservantes antimicrobianos a la formulación. Estos conservantes pueden producir intolerancia en algunos pacientes, haciendo necesario interrumpir el tratamiento.

[0181] La vía de administración es tópica, mediante instilación directamente al ojo, preferentemente usando gotas oftálmicas. Teniendo en cuenta que la gran mayoría de los fármacos actualmente aprobados para el tratamiento de enfermedades retinianas se administran por inyección intravítrea, también se espera que mejore la calidad de vida de los pacientes, ya que las gotas oftálmicas provocan una molestia menor y tienen menos efectos secundarios que las inyecciones intravítreas.

[0183] La dosificación y el programa de administración precisos que se emplearán en la formulación también dependerán de la vía de administración. Un experto en la técnica entenderá que la dosificación y el programa de administración precisos que se emplearán también dependen de la gravedad del trastorno, y deben decidirse de acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. También se entiende que el nivel de dosis específico para cualquier sujeto particular depende de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, vía de administración y tasa de excreción, combinación de fármacos y la gravedad de la enfermedad particular sometida a terapia.

[0185] Las formulaciones o ARNip descritos en el presente documento pueden administrarse en formulaciones de dosificación unitaria que contienen portadores, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales.

[0187] Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en una mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidropropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido de origen natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tales como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilensorbitano. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, o uno o más agentes colorantes. Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo los principios activos en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.

[0189] Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el principio activo en mezcla con un agente dispersante o humectante, agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes o agentes de suspensión adecuados se muestran a modo de ejemplo por los ya mencionados anteriormente. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes colorantes.

[0191] Las composiciones farmacéuticas también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral o mezclas de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas de origen natural, por ejemplo, goma arábiga o goma tragacanto, fosfátidos de origen natural, por ejemplo, soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol, anhídridos, por ejemplo, monooleato de sorbitano, y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitano. Dichas formulaciones también pueden contener un emoliente, un conservante y un agente colorante. Las composiciones farmacéuticas o ARNip descritos en el presente documento pueden estar en forma de una suspensión acuosa u oleaginosa estéril.

[0193] Esta suspensión puede formularse según la técnica conocida usando los agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión que se han mencionado anteriormente.

[0195] Una preparación estéril también puede ser una disolución o suspensión estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran agua, disolución de Ringer y disolución isotónica de cloruro de sodio. Además, se emplean convencionalmente aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo insípido incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de disoluciones.

[0197] En realizaciones preferidas, las composiciones de la divulgación se formulan en una disolución, preferentemente una solución salina tamponada tal como PBS, o un gel para administración tópica al ojo, tal como, por ejemplo, en forma de gotas oftálmicas. En tales realizaciones, las formulaciones pueden ser emulsiones catiónicas y/o contener biopolímeros que incluyen, pero no se limitan a, poli(lactida-co-glicolida), carbopol, ácido hialurónico y poli(ácido acrílico).

[0199] Las moléculas de ácido nucleico de la divulgación pueden administrarse por vía parenteral en un medio estéril. El fármaco, dependiendo del vehículo y la concentración usados, puede suspenderse o disolverse en el vehículo. Ventajosamente, los adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y agentes tamponantes pueden disolverse en el vehículo.

[0201] Como tal, una realización preferida adicional de la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica en la que dicha composición comprende al menos un ARNip dirigido a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9, como se ha descrito en los párrafos anteriores. Más preferiblemente, dicha secuencia es SEQ ID NO: 1.

[0203] Las moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación también pueden administrarse a un sujeto en combinación con otros compuestos terapéuticos para aumentar el efecto terapéutico global. El uso de múltiples compuestos para tratar una indicación puede aumentar los efectos beneficiosos al tiempo que reduce la presencia de efectos secundarios.

[0205] Se incluyen las siguientes definiciones para facilitar la comprensión de la divulgación.

[0207] Por "tratar", los solicitantes quieren decir abordar desde el punto de vista médico. El término incluye administrar el compuesto de la divulgación para aliviar los síntomas de una enfermedad retiniana, tales como la disminución de la agudeza visual que acompaña a la degeneración macular, así como para abordar los cambios fisiológicos asociados con la enfermedad, tal como el crecimiento anómalo de vasos sanguíneos que acompaña a esa afección.

[0209] El término “enfermedad retiniana” significa cualquier enfermedad en la que la retina se ve afectada debido a etiologías múltiples y variantes.

[0211] El término “vascularización” se refiere al proceso de formación de redes microvasculares funcionales con perfusión de glóbulos rojos.

[0212] El término "angiogénesis" se refiere a la protrusión y excrecencia de brotes capilares y brotes de vasos sanguíneos preexistentes.

[0214] El término “neovascularización retiniana (RNV)” se refiere al brote de nuevos vasos en la retina.

[0216] El término “neovascularización coroidea (CNV)” se refiere al brote de nuevos vasos de la vasculatura coroidea.

[0217] El término “enfermedad o trastorno relacionado con la neovascularización” se refiere a cualquier enfermedad o trastorno que genere los nuevos vasos patológicos mencionados anteriormente. Para tal enfermedad o trastorno, se puede mencionar, entre otros, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), retinopatía isquémica, edema macular diabético (DME), retinopatía diabética proliferativa (PDR), isquemia diabética de la retina (DRI), edema diabético de la retina (DRE), neovascularización miope, oclusión de la vena central de la retina (CRVO) y retinopatía del prematuro (ROP), pero sin limitarse a los mismos. Otras enfermedades o trastornos oculares relacionados con la neovascularización incluyen, por ejemplo, neovascularización del iris (Rubeosis iridis) y neovascularización corneal (CN). La neovascularización del iris se asocia a menudo con diabetes, retinoblastoma, oclusión de la vena central de la retina, síndrome isquémico ocular o desprendimiento crónico de retina. La neovascularización corneal a menudo está provocada por el uso de lentes de contacto, aunque también se asocia con la inflamación como resultado de un traumatismo o lesión, y por blefaritis, uveítis o queratitis, úlceras corneales, glaucoma y otras enfermedades de la superficie ocular como la rosácea o el lupus.

[0219] La degeneración macular, también conocida como degeneración macular relacionada con la edad (AMD), es la causa más común de pérdida de visión en los Estados Unidos en personas de 50 años o más, y su prevalencia aumenta con la edad. La causa subyacente de la AMD parece ser la acumulación de material residual producido por el proceso de renovación de la parte externa de los fotorreceptores de la retina en el epitelio pigmentario retiniano (RPE). La acumulación de este material no degradado, conocido como drusas en el RPE, conduce a la producción de mediadores inflamatorios que provocan la degeneración de los fotorreceptores en la retina central o mácula (Bird AC, 2010). El centro de la mácula, llamado fóvea, media la visión de alta agudeza; por lo tanto, su degeneración provoca una grave pérdida de la visión. En los primeros estadios de la enfermedad, las acumulaciones de drusas son pequeñas y a menudo se observan junto con hipo o hiperpigmentación del RPE. A medida que la enfermedad progresa, tanto el tamaño como la cantidad de drusas aumentan. La AMD se clasifica como húmeda (neovascular) o seca (no neovascular). La forma seca de la enfermedad es la más común. Se produce cuando la retina central se ha distorsionado, pigmentado o, más comúnmente, adelgazado, un proceso asociado con atrofia del epitelio pigmentario de la retina y la pérdida de fotorreceptores maculares. El resultado es la atrofia geográfica central. La forma húmeda de la enfermedad es más grave que la forma seca y conduce a una grave pérdida de la visión. La forma húmeda generalmente se asocia con el envejecimiento, pero otras enfermedades que pueden provocar degeneración macular húmeda incluyen miopía grave y algunas infecciones intraoculares como histoplasmosis, que puede exacerbarse en individuos con SIDA. La forma húmeda se caracteriza por vasos sanguíneos anómalos que crecen a través del epitelio pigmentario de la retina, dando como resultado hemorragia, exudación, cicatrización o desprendimiento de retina.

[0221] La retinopatía isquémica es un componente común de la patogénesis tanto de la CNV como de la RNV. La isquemia provoca hipoxia celular, que activa las rutas de señalización celular para regular por incremento la expresión de estimuladores angiogénicos, como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). VEGF es una glicoproteína secretada con una potente actividad pro-angiogénica. VEGF se une a los receptores de VEGF (VEGFR) en las células endoteliales para estimular la proliferación y migración celular. Numerosos estudios han demostrado que VEGF está regulado por incremento durante la patogénesis de CNV y RNV, y que VEGF es un mediador clave de la patogénesis de CNV y RNV.

[0223] La retinopatía diabética (DR) sigue siendo la principal causa de ceguera entre las personas en edad de trabajar en los países desarrollados. Mientras que la retinopatía diabética proliferativa (PDR) es la lesión más común que amenaza la vista en la diabetes tipo 1, el edema macular diabético (DME) es la causa principal de la mala agudeza visual en la diabetes tipo 2. Debido a la alta prevalencia de diabetes tipo 2, el d Me es la principal causa de discapacidad visual en pacientes diabéticos. En un gran estudio poblacional, la incidencia de DME a lo largo de un periodo de 10 años fue del 20 % en pacientes con diabetes tipo 1, mientras que esta tasa fue de casi el 40 % en pacientes con diabetes tipo 2. Además, DME está casi invariablemente presente cuando se detecta PDR en pacientes diabéticos tipo 2. La neovascularización debido a hipoxia grave es el sello distintivo de PDR, mientras que la fuga vascular debido a la descomposición de la BRB es el principal evento implicado en la patogénesis de DME.

[0225] La retinopatía del prematuro (ROP) se produce en bebés prematuros que están expuestos a hiperoxia relativa antes de completarse la fase angiogénica del desarrollo de la retina. Esto es problemático, ya que la fase angiogénica del desarrollo de la retina normalmente se ve impulsada por la hipoxia en el útero. Por tanto, el desarrollo retiniano angiogénico normal se altera en la ROP, provocando vaso-obliteración y la formación de una retina en gran parte avascular. En ausencia de un suministro de sangre adecuado, la retina avascular es isquémica, lo que promueve un RNV destructivo y puede conducir a desprendimiento de retina y la formación de tejido cicatricial, lo que da como resultado una pérdida permanente de la visión.

[0227] El término “paciente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a animales, incluyendo mamíferos, preferentemente seres humanos.

[0229] La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitativos.

[0231] Ejemplos

[0233] 1. Análisis in vitro

[0235] 1.1. Niveles de expresión génica de NRARP después de la transfección de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.

[0237] Se transfectaron células HeLa humanas con 100 nM de uno de los ARNbc de extremos romos de 19 pb que consisten en una cadena sentido que consiste en una de las siguientes secuencias SEQ ID NO: 10 (SYL136001), SEQ ID NO: 11 (SYL136005), SEQ ID NO: 12 (SYL136003), y SEQ ID NO: 13 (SYL136004), junto con la cadena antisentido complementaria, con Lipofectamine 2000 como agente de transfección. La referencia de SYL después de cada SEQ ID NO, se refiere a una referencia para el compuesto de ARNbc. Cabe señalar que a lo largo de estos ejemplos (a menos que el contexto aclare lo contrario), cuando se hace referencia a la administración o transfección de una SEQ ID NO particular, esto indica que se administró o transfectó ARNbc de 19 pb que consiste en una cadena sentido que consiste en la SEQ ID NO y la cadena antisentido complementaria tal como se indica en las figuras 2 y 3. Todas las transfecciones se realizaron siguiendo las instrucciones convencionales del fabricante. En el mismo experimento se usó una secuencia de ARNip aleatorizada como control de la especificidad de la interferencia. Se recolectaron sedimentos celulares y se procesaron para evaluar posibles variaciones en los niveles de ARNm como consecuencia del mecanismo de acción del ARNip. Los niveles de ARN se cuantificaron mediante PCR en tiempo real usando un método de cuantificación relativa, el método de umbral comparativo 2-mct. {Livak y Schmittgen, 2001}. Todos los experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real se realizaron por triplicado y se repitieron en tres experimentos independientes. Se calcularon la media y el EEM y se representan en las figuras. Como se muestra en la figura 4, los niveles de ARNm de NRARP disminuyeron significativamente (50-60 %) en células HeLa humanas en respuesta a la transfección de SEQ ID NO: 10, S<e>Q ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 en los tres puntos de tiempo estudiados. Como se esperaba, la secuencia de ARNip aleatorizada no moduló los niveles de expresión de NRARP en ninguno de los puntos de tiempo estudiados.

[0239] 1.2 Viabilidad celular de líneas celulares humanas después de la transfección con ARNip.

[0241] Con el fin de analizar la viabilidad celular después de la transfección de los ARNip de la presente divulgación, se estudió la toxicidadin vitrodespués de la transfección de 100 nM de una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, con Lipofectamine 2000 como agente de transfección en células HeLa humanas. Todas las transfecciones se realizaron siguiendo las instrucciones convencionales del fabricante. En el mismo experimento se usó una secuencia de ARNip aleatorizada como control de la especificidad de la interferencia. Se recogieron sedimentos celulares a las 24, 48 y 72 horas después de la transfección y se procesaron para evaluar posibles variaciones en la viabilidad celular. La viabilidad celular se midió usando el ensayo de proliferación celular no radiactivo acuoso CellTiter 96® de Promega. Este método se basa en la capacidad de las células vivas para reducir el tetrazolio MTS para dar formazán. La cantidad de formazán se cuantifica midiendo la absorbancia a 490 nm. Se calcularon la media y el EEM y se representan gráficamente en la figura 5. La figura 5 muestra que no hubo cambios en la viabilidad celular en respuesta a la transfección de cualquiera de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13. En resumen, se encontró que los ARNip de la presente divulgación no son tóxicos y se toleran bien.

[0243] 1.3 Niveles de expresión de NRARP después de la transfección de ARNip no modificado y modificado químicamente en diferentes líneas celulares.

[0245] Con el fin de mejorar la estabilidad de los ARNip de la presente divulgación y para garantizar que no haya activación inmunogénica, se introdujeron diferentes modificaciones químicas optimizadas para ARNip en la secuencia canónica de SEQ ID NO: 10 (SYL136001); de este modo se obtuvieron las siguientes nuevas entidades modificadas químicamente: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39. Las nuevas secuencias modificadas químicamente se transfectaron individualmente en células humanas, murinas y de rata para analizar su capacidad de reducir los niveles de ARNm de NRARP. Las modificaciones químicas se detallan en la figura 3. Se seleccionaron células HeLa humanas, BEAS-2B humanas y C2C12 murinas porque estas células expresan niveles significativos de NRARP y se consideran buenos modelos para estudiar el efecto de los ARNip sobre la expresión de NRARP. Las células se transfectaron individualmente con 100 nM de una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39, con Lipofectamine (células HeLa), Mirus Transit-X2 (BEAS-2B), Dharmarfect 3 (C2C12) y siPORT NeoFX (ARL6) como agentes de transfección. La expresión génica se analizó en tres puntos de tiempo (24, 48 y 72 horas) después de la transfección. Todas las transfecciones se realizaron siguiendo las instrucciones convencionales del fabricante. En el mismo experimento se usó una secuencia de ARNip aleatorizada como control de la especificidad de la interferencia. Los niveles de ARN se cuantificaron mediante PCR en tiempo real usando un método de cuantificación relativa, el método de umbral comparativo 2-ññ CT {Livak y Schmittgen, 2001}. Todos los experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real se realizaron por triplicado y se repitieron en tres experimentos independientes. Se calcularon la media y el EEM y se representan gráficamente en los gráficos mostrados en las figuras 6-9. La figura 6 muestra los resultados obtenidos en células HeLa. En esta línea celular, la SEQ ID NO: 10 (SYL136001) redujo los niveles de ARNm de NRARP en un 60 % 24 horas después de la transfección y en un 50 % 48 y 72 horas después de la transfección. La SEQ ID NO: 19 modificada químicamente redujo los niveles de ARNm de NRARP en un 60 % 24 horas después de la transfección y en un 40 % 48 horas después de la transfección; 72 horas después de la transfección, los niveles basales se recuperaron por completo. La S<e>Q ID NO: 23 redujo los niveles de ARNm de NRARP en un 40 % 24-48 horas después de la transfección y en un 10 % 72 horas después de la transfección. La SEQ ID NO: 25 redujo los niveles de ARNm de NRARP en un 50-60 % 24-48 horas después de la transfección y en un 20 % 72 horas después de la transfección. La SEQ ID NO: 27 redujo los niveles de ARNm de NRARP en un 30 % 24-48 horas después de la transfección y los niveles basales se recuperaron 72 horas después de la transfección. La SEQ ID NO: 29 redujo muy eficazmente los niveles de ARNm de NRARP. Se observó una reducción de aproximadamente el 80 % 24-48 horas después de la transfección en respuesta a esta secuencia; después de eso los niveles de ARNm aumentaron, pero aún estaban un 40 % por debajo de los niveles basales 72 h después de la transfección. La SEQ ID NO: 31 redujo efectivamente los niveles de NRARP, se observó una reducción del 60 % frente a los niveles basales en los tres puntos de tiempo estudiados. La SEQ ID NO: 35 redujo los niveles de ARNm de NRARP en un 60 % 24-48 horas después de la transfección; se encontró una recuperación pronunciada de los niveles de ARNm 72 horas después de la transfección, por lo que los niveles de ARNm de NRARP estaban un 10 % por debajo de los niveles basales. La SEQ ID NO: 37 fue el compuesto que provocó la mayor reducción en los niveles de ARNm de NRARP. Se observaron reducciones del 90 %, 80 % y 70 % 24, 48 y 72 horas después de la transfección de este compuesto. La SEQ ID NO: 39 redujo los niveles de ARNm de NRARP en un 70% 24 horas después de la transfección y en un 50 % 48 horas después de la transfección, después de eso los niveles de ARNm aumentaron bruscamente, pero los niveles basales no se recuperaron completamente 72 horas después de la transfección. La figura 7 muestra los resultados obtenidos en células BEAS-2B humanas. En esta línea celular, SEQ ID NO: 10 (SYL136001) y SEQ ID NO: 19 redujeron los niveles de NRARP en un 70 % 24 horas después de la transfección, después de eso los niveles de ARNm aumentaron lentamente pero los niveles basales no se recuperaron completamente dentro del marco de tiempo del estudio con los niveles de ARNm de NRARP aún un 50 % por debajo de los niveles basales 48 horas después de la transfección y un 40 % - 50 % 72 horas después de la transfección. La SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 27 redujeron ligeramente los niveles de ARNm de NrARP en células BEAS-2B humanas, las reducciones fueron de alrededor del 20-30 % en los tres puntos de tiempo estudiados; los niveles basales no se recuperaron completamente 72 horas después de la transfección. La s Eq ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 39 redujeron gradualmente y de forma dependiente del tiempo los niveles de ARNm de NRARP alcanzando una reducción máxima del 50 % - 60 % 72 horas después de la transfección. La SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 35 redujeron eficazmente los niveles de ARNm de NRARP; los niveles de ARNm estuvieron aproximadamente un 60-70 % por debajo de los niveles basales en respuesta a cualquiera de los compuestos en los tres puntos de tiempo estudiados. La SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 37 fueron los productos más eficaces para reducir los niveles de ARNm de NRARP en esta línea celular, provocando una reducción brusca y sostenida de aproximadamente el 80 % y el 90 % respectivamente en los tres puntos de tiempo estudiados. Como se esperaba, la secuencia de ARNip aleatorizada no redujo los niveles de expresión de NRARP en ninguno de los puntos de tiempo estudiados. La figura 8 muestra los resultados obtenidos en células C2C12 murinas. La SEQ ID NO: 10 (SYL136001) redujo los niveles de NRARP en un 60 % 24 horas después de la transfección, después de eso los niveles de ARNm aumentaron lentamente, pero los niveles basales no se recuperaron completamente 72 horas después de la transfección; punto de tiempo en el que los niveles de ARNm de NARP aún estaban un 40 % por debajo de los niveles basales. La SEQ ID NO: 19 redujo los niveles de ARNm de NRARP en aproximadamente un 30 % 24 horas después de la transfección, se encontró una reducción drástica del 80 % 48 horas después de la transfección, después de eso los niveles aumentaron pero 72 horas después de la transfección los niveles de ARNm de NARP todavía estaban un 40 % por debajo de los niveles basales. La SEQ ID NO: 23, la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 27 redujeron ligeramente los niveles de ARNm de NRARP, la reducción observada en respuesta a la transfección de cada una de estas secuencias fue de aproximadamente el 20-40 % en los tres puntos de tiempo estudiados. La SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 39 redujeron eficazmente los niveles de ARNm de NRARP 24 y 48 horas después de la transfección, los niveles en estos puntos de tiempo estuvieron un 50 % y 60 % por debajo de los niveles basales, respectivamente. La respuesta a ambas secuencias 72 horas después de la transfección fue un aumento con respecto a los puntos de tiempo anteriores, aunque los niveles basales aún no se recuperaron en este punto de tiempo. La SEQ ID NO: 31 redujo los niveles de ARNm de NRARP en aproximadamente un 40 % 24 horas después de la transfección, se encontró una gran reducción del 70 % 48 horas después de la transfección, después de eso los niveles aumentaron pero 72 horas después de la transfección los niveles de ARNm de NRARP todavía estaban un 40 % por debajo de los niveles basales. La SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 37 fueron los compuestos que provocaron la mayor reducción en los niveles de ARNm de NRARP en esta línea celular, reduciendo la SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 37 los niveles de ARNm de NRARP un 60 % 24 horas después de la transfección y aproximadamente un 80 % 48 después de la transfección. Se produjo una recuperación parcial de los niveles basales 72 horas después de la transfección. De nuevo, como se esperaba, la secuencia de ARNip aleatorizada no redujo los niveles de ARNm de NRARP en ninguno de los puntos de tiempo estudiados en células C2C12. La figura 9 muestra los resultados obtenidos en células ARL6 de rata. La SEQ ID NO: 10 (SYL136001) redujo los niveles de ARNm de NRARP en un 50 % 24-48 horas después de la transfección y en un 60 % 72 horas después de la transfección. La SEQ ID NO: 37 redujo los niveles de NRARP en un 50 % 24 horas después de la transfección, en un 60% 48 horas después de la transfección y en un 70 % 72 horas después de la transfección.

[0246] 1.4 Viabilidad celular de líneas celulares humanas después de la transfección con ARNip no modificados y ARNip modificados químicamente en diferentes líneas celulares.

[0247] Con el fin de analizar la viabilidad celular después de la transfección de los ARNip de la presente divulgación, se realizaron estudios de toxicidadin vitrodespués de la transfección de 100 nM de una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 10 (SYL13600), SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39 en células HeLa y BEAS-2B humanas y en células C2C12 murinas con Lipofectamine 2000, Mirus Transit-X2, Dharmafect 3 como agentes de transfección, respectivamente. Todas las transfecciones se realizaron siguiendo las instrucciones convencionales del fabricante. En los mismos experimentos se usó una secuencia de ARNip aleatorizada como control de la especificidad de la interferencia. Se recogieron sedimentos celulares a las 24, 48 y 72 horas después de la transfección y se procesaron para evaluar posibles variaciones en la viabilidad celular como consecuencia de la transfección de ARNip. La viabilidad celular se midió usando el ensayo de proliferación celular no radiactivo acuoso CellTiter 96® de Promega. Este método se basa en la capacidad de las células vivas para reducir el compuesto de tetrazolio MTS para dar formazán, que se mide mediante absorbancia a 490 nm. Se calcularon la media y el EEM para cada experimento y se representan gráficamente en las figuras 10-12. Las figuras 10, 11 y 12 muestran que no hubo cambios en la viabilidad celular en respuesta a la transfección de cualquiera de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 10 (SYL13600), SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID n O: 35, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 39 en cualquiera de las líneas celulares usadas. Además, también se evaluaron los niveles de viabilidad celular en células ARL6 de rata en respuesta a la transfección a una de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 10 (SYL136001) y SEQ ID NO: 37 usando siPORT NeoFX como agente de transfección. La figura 13 muestra que no hubo cambios significativos en la viabilidad celular en las células ARL6 en respuesta a ninguna de las secuencias sometidas a prueba. Por lo tanto, puede concluirse que todos los ARNip de la presente divulgación no son tóxicos y se toleran bien.

[0248] 1.5 Eficacia de los ARNip sobre la angiogénesis en un modelo in vitro de células HUVEC.

[0249] Con el fin de estudiar el efecto de los ARNip de la presente divulgación sobre la angiogénesis, se realizaron experimentos con células HUVEC y análisis de la expresión de NRARP en estas células.

[0250] En particular, el objetivo de este conjunto de estudios fue estudiar el efecto antiangiogénico del ARNip de NRARP modificado SEQ ID NO: 37 (un ARNbc de extremos romos de 19 pb modificado químicamente que tiene una cadena sentido que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 37 y una cadena antisentido complementaria que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 38) en un modelo in vitro de células HUVEC.

[0251] 1.5.1 Introducción.

[0252] La angiogénesis es la formación de nuevas venas a partir de venas preexistentes. Este proceso, esencial durante el desarrollo y varios otros procesos fisiológicos, puede desregularse en el ojo, lo que conduce a diferentes tipos de enfermedades retinianas, como la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) y la retinopatía diabética (DR). Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) son células primarias que se han conservado después de 1-3 pases desde el material de origen inicial. Estas células pueden inducirse para formar estructuras tubulares en respuesta a agentes angiogénicos tales como VEGF.

[0253] 1.5.2 Materiales.

[0254] Transcriptasa inversa Multiscribe 50 U/ml (Applied Biosystems P/N 4311235).

[0255] Inhibidor de ARNasa 20 U/|jl (Applied Biosystems P/N N8080119).

[0256] Mezcla maestra universal TaqMan 2X.

[0257] Qiagen" RNeasy ®Microkit 74004.

[0258] Sonda de Nrarp humana: Ensayo de expresión génica Taqman Hs01104102_s1.

[0259] Control endógeno de GAPDH: Ensayo de expresión génica Taqman Hs00266705_g1.

[0260] Sonda de Nrarp de rata: Ensayo de expresión génica Taqman Rn 03810258_s1. Control endógeno de 18S: Ensayo de expresión génica Taqman Hs99999901_s1.

[0261] 1.5.3 Métodos.

[0262] i) Células

[0263] Se obtuvieron células HUVEC (ref.: CC-2519 / número de lote: 000191772) de Lonza. Todos los experimentos se realizaron con el mismo lote de células en el pase 6-9 y con cultivos a una densidad celular del 75-85 %. Se realizaron transfecciones usando siPORT NeoFX™ siguiendo un procedimiento convencional. Para la electroporación, se siguió el procedimiento publicado en "Hernandez JL et al. 2004. Angiogenesis. 7:235-241", en resumen, se sometieron 1xl06 células a electroporación aplicando un pulso de 20 ms a 1200 |<j>F usando el manipulador celular® 600 (BTX). Cada electroporación se realizó usando 2 jg de material genético.

[0264] Para los estudios de eficacia, se transfectaron las células usando el protocolo de electroporación y se dejaron recuperar durante un periodo de 24 h; posteriormente, las células se colocaron en placas de 96 pocillos a una densidad de 30.000 células/pocillo y se analizaron los parámetros mencionados anteriormente 6 h después de la siembra en placas. Después del análisis de la estructura, las células, el medio y el matrigel se transfirieron a un tubo libre de ARNasa y se añadieron 600 jL de tampón RLT+ p-mercaptoetanol.

[0265] ii) Análisis de la expresión del gen diana

[0266] (1) Aislamiento de ARN y retrotranscripción

[0267] Se aisló ARN total de cultivos celulares usando el kit de extracción de ARN RNeasy (Invitrogen, CA, EE. UU.). Se sometieron 4 jg de ARN total a retrotranscripción usando el kit de archivo de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante.

[0268] (2) qPCR

[0269] Se realizó qPCR usando el sistema de detección Stepone plus (Applied Biosystems). Se amplificaron 50 nanogramos de cada muestra en una mezcla maestra universal TaqMan 2X en las siguientes condiciones: 95 °C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min.

[0270] 1.5.4 Resultados.

[0271] Dado el resultado satisfactorio de la electroporación para introducir el ARNip en células HUVEC, este método se usó para estudios posteriores en los que se evaluó el papel del ARNip de NRARP modificado SEQ ID NO: 37 en la formación de estructuras capilares en ensayos de matrigel, migración, cicatrización de heridas y proliferación.i) Formación de estructuras capilares.

[0272] (1) Configuración del ensayo.

[0273] Se sembraron 15.000 células/pocillo, sometidas a privación a lo largo de un periodo de 4 h, en una placa de 96 pocillos cubierta con matrigel. Se usó medio basal de células endoteliales (EBM) sin suplementos como control negativo (sin formación de estructuras), mientras que se usó medio completo con suplementos (hEGF, hidrocortisona, extracto de cerebro bovino, gentamicina, heparina) y FCS al 10 % como control positivo induciendo un número máximo de estructuras tubulares. Se realizaron ensayos por triplicado en 3-6 experimentos independientes. Los cultivos se analizaron 24 h después de la siembra en placas.

[0274] Además, se ha establecido un nuevo método de análisis de las estructuras. Este método se basa en la cuantificación de 5 variables, usando el software Angiogenesis Analyzer desarrollado por Gilles Carpentier para NIH ImageJ. Este software ofrece una visión global del proceso angiogénico. Las variables estudiadas se muestran en la figura 17.

[0275] La figura 18 muestra el cambio en las variables estudiadas en respuesta al medio completo (suplementos FCS al 10 %). Como se muestra en la figura, el medio completo aumenta significativamente el número de estructuras formadas sin alterar el área total de las estructuras.

[0276] (2) Eficacia de ARNip SEQ ID NO: 37.

[0277] Las células se transfectaron mediante electroporación y se dejaron recuperar en medio completo durante un periodo de 24 h y se privaron de suero durante dos horas adicionales; posteriormente, las células se sembraron en placas a una densidad celular de 30.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos cubierta con matrigel para permitir la formación de estructuras. Las estructuras formadas se analizaron 6 h y 24 h después de la siembra. Se analizaron las siguientes condiciones para someter a prueba la eficacia de SEQ ID NO: 37:

[0278] - Células no transfectadas

[0279] - Células sometidas a electroporación simulada

[0280] - Células transfectadas con ARNip anti-KDR 1 |jM (Life Technologies, ref.: 145034)

[0281] - Células transfectadas con ARNip 1 j M SEQ ID NO: 37.

[0282] Todas las condiciones se analizaron en medio sin suplementos y con medio con FCS al 10 % y VEGF 100 ng/ml. Se realizó un primer ensayo con células que se habían sometido a privación en medio libre de suero durante 2 h antes de sembrar las células en el matrigel. Este procedimiento desestabilizó ligeramente las estructuras y, por lo tanto, se repitió sin la etapa de privación. Los resultados de este último estudio se muestran en las figuras 19 y 20. En resumen, la electroporación afecta gravemente a la función celular; por lo tanto, se realizaron comparaciones entre la condición de electroporación simulada y las condiciones experimentales. En ausencia de suplementos, tanto el ARNip-KDR como el ARNip-NRARP SEQ ID NO: 37 redujeron la formación de estructuras angiogénicas; el efecto del ARNip-KDR fue mayor que el del ARNip SEQ ID NO: 37. El efecto inhibidor de ambos ARNip sobre la formación de estructuras angiogénicas fue más claro en presencia de medio completo con suplementos en el punto de tiempo de 6 h; esto puede deberse al hecho de que privar a las células de suero y suplementos puede reducir la viabilidad celular. El análisis realizado 24 h después de sembrar las células en el matrigel no fue concluyente porque las estructuras ya habían comenzado a desmontarse.

[0283] ii) Efecto sobre la proliferación.

[0284] (1) Ensayo de configuración.

[0285] Las células sometidas a privación durante 24 h se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3000 células/pocillo y se cultivaron en las diferentes condiciones. Cinco días después se evaluó la proliferación por medio del ensayo de MTT. Las condiciones usadas fueron las siguientes: FCS al 2 % y diferentes concentraciones de VEGF (20-30-50 ng/ml). Se requiere FCS al 2% para que las células mantengan una tasa de proliferación basal y eviten que el cultivo entre en detención celular. La figura 21A muestra una inducción de 3 veces en la proliferación celular en respuesta a VEGF, independientemente de la concentración sometida a prueba. Con el fin de analizar el efecto inhibidor de un agente anti-VEGF, se cultivaron células en presencia de VEG<f>30 ng/ml y concentraciones decrecientes (diluciones 1:2 comenzando a 12 nM) de bevabizumab (Avastin) con el fin de determinar la CI50. Tal como se muestra en la figura 21B, se encontró que la CI50 de bevacizumab era de 0,85 nM.

[0286] (2) Eficacia de ARNip SEQ ID NO: 37.

[0287] Se sometieron células a electroporación y se sembraron en placas a una densidad de 5000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos recubierta con gelatina al 1 %; posteriormente, se dejó que las células se recuperaran durante un periodo de 24 h. Después de la recuperación, las células se cultivaron en medio basal suplementado con FCS al 10 % y VEGF 100 ng/ml. Tres días después de la siembra en placa, se analizó la proliferación de células mediante MTT. Las condiciones sometidas a prueba fueron las siguientes:

[0288] - Células no transfectadas

[0289] - Células sometidas a electroporación simulada

[0290] - Células transfectadas con ARNip anti-KDR 1 j M (Life Technologies, ref.: 145034)

[0291] - Células transfectadas con ARNip 1 j M SEQ ID NO: 37.

[0292] Los resultados, mostrados en la figura 22, indican que tanto el ARNip anti-KDR como el ARNip SEQ ID NO: 37 reducen la tasa de proliferación inducida por VEGF en aproximadamente un 40 % en comparación con las células sometidas a electroporación simulada.

[0293] iii) Efecto sobre la migración.

[0294] (1) Ensayo de configuración.

[0295] Estos estudios se realizaron en placas del sistema 24-transwell con filtros de membrana opacos de 8 jm(Transwell HTS FluroBlok™ Multiwell Insert Systemde Becton Dickinson). Ambas superficies de la membrana se cubrieron con colágeno tipo I a una concentración de 15 jg/m l durante 2 h a 37 °C para facilitar la absorción celular. Las células se sembraron en placa a una densidad de 50.000 células/pocillo y se privaron de suero durante un periodo de 4 h y posteriormente se añadió el estímulo de migración. 24 h después de añadir el estímulo en la parte inferior del dispositivo transwell, se analizó el número de células que habían migrado al compartimento superior después de la tinción con calceína-AM.

[0296] Se usó el número de células migratorias en medio completo (FCS al 10 % y suplementos) como control positivo de la migración celular y se comparó esta respuesta con la producida al aumentar la concentración de VEGF (1­ 10-100 ng/ml).

[0297] Como se muestra en la figura 23, VEGF induce un aumento dependiente de la dosis del número de células que migran al compartimento superior. El aumento máximo en la respuesta a VEGF se observó en respuesta a la mayor concentración de VEGF (100 ng/ml) y la magnitud de la respuesta fue de alrededor de 5-6 veces con respecto a las condiciones basales.

[0298] (2) Eficacia de ARNip SEQ ID NO: 37.

[0299] Se sometieron células a electroporación y se dejaron recuperar durante un periodo de 24 h; posteriormente, las células se sembraron en placas a una densidad de 10.000 células/pocillo en placas 96-transwell con filtros de membrana opacos de 8 |jm recubiertos con colágeno 15 |jg/ml. Todas las condiciones sometidas a prueba se analizaron en presencia de medio basal y medio completo (suplementado con FCS al 10 % y VEGF 100 ng/ml). Las condiciones sometidas a prueba fueron las siguientes y la migración se analizó 24 h después de la siembra en placas y la tinción de las células con calceína-AM:

[0300] - Células no transfectadas

[0301] - Células sometidas a electroporación simulada

[0302] - Células transfectadas con ARNip anti-KDR 1 jM (Life Technologies, ref.: 145034)

[0303] - Células transfectadas con ARNip 1 jM SEQ ID NO: 37.

[0304] Los resultados obtenidos indican que la electroporación tuvo un efecto perjudicial sobre la capacidad de migración de las células; por lo tanto, las células tratadas se compararon con la condición de electroporación simulada para descartar el efecto de la electroporación. Las células en el medio basal no migraron, pero la presencia de FCS al 10 % y VEGF 100 ng/ml hizo que las células migraran al pocillo opuesto en el sistema Transwell. El efecto de FCS al 10 % y VEGF 100 ng/ml se bloqueó parcialmente (30%) mediante la electroporación de ARNip SEQ ID NO: 37 o ARNip anti-KDR (figuras 24 y 25).

[0305] iv) Estudios de cicatrización de heridas.

[0306] (1) Ensayo de configuración.

[0307] Las células se sembraron en placa a una densidad de 50.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas con gelatina al 1 % y se cultivaron en medio basal durante 24 h. Posteriormente, se realizó una lesión raspando una zona estrecha del cultivo y se añadió VEGF 10 ng/ml al cultivo. Se midieron las zonas inmediatamente después y 24 h después de realizar la lesión y se compararon por medio del software NIH Imaged. Se cuantificó el porcentaje de área cicatrizada de la siguiente manera:

[0308] Cicatrización de heridas (%) = Área final/área inicial x 100

[0309] Como muestra la figura 26, VEGF 10 ng/ml indujo un aumento de 2,5 veces en la tasa de cicatrización de heridas en comparación con la afección no tratada.

[0310] (2) Eficacia de ARNip SEQ ID NO: 37.

[0311] Se sometieron células a electroporación y se dejaron recuperar durante un periodo de 24 h, posteriormente las células se sembraron en placas a una densidad de 70.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas con gelatina al 1 %. 24 h después de la siembra en placas, se indujeron lesiones raspando una zona estrecha de células y los cultivos se analizaron 16 h después de la inducción de las lesiones. El análisis se realizó tiñendo las células con calceína-AM 10 jM y analizando las zonas raspadas y el porcentaje de área que estaba cubierta por las células nuevamente. Todas las condiciones sometidas a prueba se analizaron en presencia de medio basal y medio completo (suplementado con FCS al 10 % y VEGF 100 ng/ml). Las condiciones sometidas a prueba fueron las siguientes y la migración se analizó 24 h después de la siembra en placas:

[0312] - Células no transfectadas

[0313] - Células sometidas a electroporación simulada

[0314] - Células transfectadas con ARNip anti-KDR 1 |<j>M (Life Technologies, ref.: 145034)

[0315] - Células transfectadas con ARNip 1 j M SEQ ID NO: 37.

[0316] Al igual que en experimentos anteriores, los resultados muestran un efecto perjudicial de la electroporación sobre la cicatrización de heridas, por esa razón todas las condiciones se compararon con las células sometidas a electroporación simulada. Como se muestra en las figuras 27 y 28, el ARNip SEQ ID NO: 37 redujo de manera muy eficaz la tasa de cicatrización de heridas en el medio basal. El efecto del ARNip SEQ ID NO: 37 fue incluso mayor que el del ARNip anti-KDR de control positivo. Sin embargo, este efecto sobre la cicatrización de heridas se enmascara cuando las células se cultivan en medio completo, muy probablemente debido al potente efecto de FCS sobre la migración celular.

[0317] v) Niveles de ARNm de NRARP en células de los experimentos mencionados anteriormente.

[0318] Se recogieron células HUVEC de los estudios mencionados anteriormente y se extrajo el ARN total para analizar mediante qPCR los niveles del gen diana de NRARP. La figura 29 muestra la reducción en los niveles de ARNm de NRARP en respuesta a la electroporación de ARNip SEQ ID NO: 37.

[0319] Tomando en conjunto los resultados presentados en el presente estudio, puede concluirse que el ARNip SEQ ID NO: 37 muestra un efecto antiantigénico en células HUVEC como se muestra por una reducción en la proliferación, migración y formación de estructuras capilares.

[0320] 2. Análisis in vivo

[0321] 2.1 Expresión de NRARP en retina y coroides en un modelo de rata de neovascularización coroidea inducida por láser

[0322] 2.1.1 Objetivo

[0323] El objetivo del presente estudio fue evaluar la expresión de NRARP en diferentes puntos de tiempo en la retina y la coroides de ratas marrones noruegas en las que se había inducido CNV por láser. El análisis de la expresión de este gen diana sirvió para un doble propósito i) para evaluar si NRARP se regula por incremento en respuesta a CNV con el fin de estudiar si la diana es un candidato a silenciarse con el objetivo de desarrollar un nuevo compuesto para el tratamiento de enfermedades retinianas relacionadas con la neovascularización, ii) para estudiar la expresión temporal de NRARP para determinar el mejor momento para tratar a los animales con el fin de silenciar el gen diana.

[0324] 2.1.2 Introducción

[0325] La CNV es una lesión inespecífica común a varias enfermedades coriorretinianas. Estas lesiones se caracterizan por una secuencia de eventos que implican una ruptura o alteración de la membrana de Brunch, inducción de inflamación y angiogénesis con invasión de células endoteliales coriocapilares, pericitos y células inflamatorias en el espacio subretiniano y/o epitelio pigmentario subretiniano {Grossniklaus HE et al 2010}. La penetración de los coriocapilares en el espacio subretiniano es una característica común de varias enfermedades retinianas. Algunos ejemplos de estas enfermedades incluyen AMD, PDR o DRE.

[0326] La CNV puede inducirse en modelos animales induciendo una lesión en la membrana de Brunch; esta lesión inicia los eventos moleculares que conducen a una CNV completa caracterizada por un aumento de factores angiogénicos y mediadores inflamatorios.

[0327] Se usó el modelo de CNV inducido por láser en ratas marrones noruegas validado en EyeCRO para analizar la expresión de dianas seleccionadas en diferentes puntos de tiempo después de la inducción de las lesiones. Para este propósito, se indujeron tres lesiones en cada ojo de 18 animales que posteriormente se sacrificaron y se recogieron los ojos y se enviaron a Sylentis para su análisis adicional. La diana analizada fue NRARP. NRARP es una glicoproteína relacionada con la activación de células endoteliales vasculares. El gen se sobreexpresa en una amplia gama de cánceres y su sobreexpresión se correlaciona con la metástasis y la tasa de supervivencia corta. Además, los niveles de expresión de este gen en el cáncer de mama humano se correlacionan con la formación de vasos sanguíneos y se ha encontrado que la proteína codificada por este gen tiene un papel en la migración de células endoteliales y la generación de vasculatura independiente de VEGF {Faibish MR et al. 2011}.

[0328] 2.1.3 Métodos

[0329] i) Animales

[0330] Tabla 1. Animales

[0331]

[0333] ii) Grupos experimentales

[0334] Tabla 2 - Grupos experimentales

[0336]

[0338] iii) Criterios de exclusión

[0339] Cualquier ojo en el que la hemorragia sea evidente en >2 de cada 3 lesiones con láser inmediatamente después de la aplicación de láser.

[0340] Todas las muestras de tejido se colocaron en tubos criogénicos identificados adecuadamente y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Los tubos criogénicos se identificaron con la condición experimental y se enviaron en hielo seco a Sylentis.

[0341] iv) Análisis de la expresión del gen diana

[0342] (1) Aislamiento de ARN y retrotranscripción

[0343] Se aisló ARN total de retina y coroides usando el kit de extracción de ARN RNeasy (Invitrogen, CA, EE. UU.). Se sometieron 4 |jg de ARN total a retrotranscripción usando el kit de archivo de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante.

[0344] (2) qPCR

[0345] Se realizó qPCR usando el sistema de detección Stepone plus (Applied Biosystems). Se amplificaron 500 nanogramos de cada muestra en una mezcla maestra universal TaqMan 2X en las siguientes condiciones: 95 °C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min. Todas las amplificaciones de qPCR se realizaron por triplicado y se repitieron en al menos dos experimentos independientes, siempre incluyendo controles de transcripción inversa y controles sin plantilla.

[0346] 2.1.4 Resultados - Expresión de NRARP

[0347] La expresión de NRARP se analizó en la retina y en el RPE/coroides en diferentes puntos de tiempo después de la inducción de CNV por láser. Los resultados obtenidos muestran una ligera disminución en los niveles de ARNm de NRARP en la retina 24 h después de la inducción de lesiones con láser. 72 h después de la inducción de lesiones, los niveles de ARNm de NRARP aumentan ligeramente (1,5 veces con respecto al tiempo =0). Al final del estudio (t= 504 h) los niveles de NRARP fueron equivalentes a los observados antes de la inducción de lesiones (figura 14)

[0348] Los niveles de ARNm de NRARP se regularon drásticamente por incremento en la coroides/RPE 6 h después de la inducción de CNV (~2,7 veces) y lentamente comenzaron a disminuir a partir de entonces. Los niveles basales no se recuperaron dentro del marco de tiempo del estudio (figura 15).

[0349] 2.1.5 Conclusiones

[0350] Tomando en conjunto los resultados de este estudio, se puede concluir que NRARP es una diana eficaz contra la cual se puede desarrollar un tratamiento para controlar la neovascularización en la retina. El patrón de expresión tanto en retina como en coroides indica que puede ser un buen candidato para silenciar dada la inducción significativa de su expresión en el modelo usado en este estudio y su papel en la angiogénesis.

[0351] 2.2 Evaluación de ARNip dirigido a NRARP sobre la reducción del tamaño de lesión y la fuga en un modelo de rata de neovascularización coroidea inducida por láser.

[0352] 2.2.1 Objetivo

[0353] Determinar los efectos antiangiogénicos/disruptores vasculares de un agente de prueba (ARNip SEQ ID NO: 37) después de la administración tópica en un modelo de rata de neovascularización coroidea inducida por láser (CNV por láser).

[0354] 2.2.2 Resumen del estudio

[0355] Se realizó un estudio de 26 días con ratas marrones noruegas hembras para determinar los efectos antiangiogénicos/disruptores vasculares de la instilación tópica de SEQ ID NO: 37 en un modelo inducido por láser de neovascularización coroidea.

[0356] Un total de 18 ratas se dividieron en 3 grupos de 6 ratas por grupo. En los días 1-26, los grupos 1 y 3 recibieron instilación tópica una vez al día de vehículo (grupo 1) o SEQ ID NO: 37 5 mg/ml (grupo 3). El día 7, el grupo 3 recibió una inyección intravítrea bilateral de compuesto anti-VEGF 5 |jg/ojo (control positivo).

[0357] El día 3, se realizaron tratamientos con láser usando un láser térmico de 520 nm para generar un total de tres lesiones por ojo.

[0358] El día 26 (3 semanas después del tratamiento con láser), se realizó una angiografía con fluoresceína y se determinó el área del tamaño de la lesión usando el software de análisis de imágenes (ImageJ). Las ratas que recibieron Ac anti-VEGF 5 jg/ojo, o instilación tópica de SEQ ID NO: 37 5 mg/ml, mostraron una reducción significativa en el tamaño de la lesión en comparación con su grupo de control de vehículo respectivo.

[0359] 2.2.3 Materiales y métodos

[0360] 2.2.3.1 Neovascularización coroidea inducida por láser (CNV) en ratas, días 1-26: Instilación tópica de vehículo o agente de prueba, QD (ramas 1, 2)

[0361] Día 5: tratamiento por láser bilateral para producir 3 lesiones por ojo

[0362] Día 7: inyección intravítrea bilateral de control positivo (rama 3)

[0363] Día 26: angiografía con fluoresceína in vivo

[0364] Día 26: enucleación de los ojos y recogida individual de retina y RPE/coroides, ramas del estudio

[0365] 2.2.3.2 Ramas del estudio

[0366] TABLA 3. Asignación de ramas

[0369]

[0370]

[0372] 2.2.3.3 Animales

[0373] Cepa: Marrón noruega

[0374] Sexo: Hembra

[0375] Intervalo de edad: 6-8 semanas de edad

[0376] Intervalo de peso: 120-150 g

[0377] Proveedor: Charles River Laboratories

[0378] Número de animales del estudio: 18

[0379] 2.2.3.4 Requisitos de alojamiento

[0380] Todos los animales se alojaron en grupos de 3 en jaulas grandes mantenidas en estantes ventilados en condiciones convencionales de cuidado de animales.

[0381] 2.2.3.5 Preparación y almacenamiento de formulaciones

[0382] Se usaron materiales de la USP (Farmacopea de los Estados Unidos) y recipientes estériles para todas las formulaciones, usando las siguientes alícuotas del material de prueba:

[0383] Vehículo tópico: 26 alícuotas/130 |jl cada una 2 adicionales.

[0384] ARNip SEQ ID NO: 375 mg/ml: 26 alícuotas/130 j l cada una 2 adicionales.

[0385] Todas las formulaciones se almacenaron a 4 ± 3 °C.

[0386] 2.2.3.6 Anestesia

[0387] Se mezclaron ketamina y xilazina usando una jeringa U-100 usando 20 unidades de ketamina (100 mg/ml) y 100 unidades de xilazina (20 mg/ml). La mezcla de anestesia se aplicó mediante inyección intraperitoneal (i.p.) a 1 jl/g (peso corporal).

[0388] 2.2.3.7 Aplicación de láser para producir lesiones de CNV

[0389] Los ojos de los animales se dilataron con disolución de Cyclogyl al 1 % y se protegieron de la luz. Después de la dilatación observable, los animales se sedaron con ketamina/xilazina. El fondo de ojo de los animales sedados se observó y se registró usando un oftalmoscopio para animales pequeños Micron III (Phoenix Research). Los tratamientos con láser se realizaron usando un láser térmico conectado a través del accesorio láser personalizado Micron III. Se realizó un total de 3 lesiones por ojo usando una longitud de onda de 520 nm. Las imágenes de fondo de ojo resultantes se registraron y evaluaron para confirmar que el láser había producido satisfactoriamente una burbuja a través de la membrana de Bruch.

[0390] 2.2.3.8 Administración intravítrea

[0391] Los animales se anestesiaron con ketamina/xilazina y las pupilas se dilataron con la administración tópica de Cyclogyl y/o tropicamida. Después de la sedación y la dilatación, se inyectó un volumen total de 5 j l por ojo en el vítreo en la pars plana usando una jeringa Hamilton y una aguja de calibre 33.

[0392] 2.2.3.9 Exclusiones

[0393] Cualquier ojo que muestre signos de hemorragia después de la aplicación del láser o la inyección intravítrea se excluyó del análisis.

[0394] 2.2.3.10 Angiografía con fluoresceína

[0395] Los animales se anestesiaron con ketamina/xilazina y luego recibieron una inyección i.p. de fluoresceína sódica al 10 % a 1 |jl/gramo de peso corporal. Las imágenes del fondo de ojo se capturaron como archivos TIFF de 8 bits usando el dispositivo Micron III y filtros de excitador/barrera para una longitud de onda objetivo de 488 nm. También se capturaron fotografías de fondo de ojo a color convencionales para cada ojo.

[0397] 2.2.3.11 Obtención de imágenes y cuantificación de lesiones

[0399] Todas las imágenes TIFF se cuantificaron usando un software de análisis de imágenes computarizado (ImageJ, NIH, EE.UU.). Las lesiones se trazaron individualmente a mano alzada para cuantificar el área en píxeles y las fotografías del fondo de ojo a color se usaron como referencia para la ubicación de la lesión. Las áreas de avascularización en el centro de las lesiones se excluyeron de los cálculos de área. Si había hemorragia o dos lesiones se superponían, estas lesiones se excluyeron del análisis.

[0401] 2.2.3.12 Recogida de tejidos

[0403] Los animales se anestesiaron con ketamina/xilazina (80/10 mg/kg) y luego se sacrificaron mediante administración .p. de Euthasol (pentobarbital) a 200 mg/kg. Después del sacrificio, se enuclearon los ojos y se fijaron ndividualmente en paraformaldehído al 4 %. Después de la fijación, todos los ojos se almacenaron en tubos ndividuales de polipropileno con tapón de rosca de 2 ml.

[0405] 2.2.3.13 Análisis estadísticos

[0407] Los análisis estadísticos se realizaron con el software Graphpad Prism (versión 4.0) usando una prueba de la t de Mann-Whitney bilateral. Solo los cambios con un valor de p < 0,05 se consideran estadísticamente significativos.

[0409] 2.2.4 Resultados

[0411] Se evaluó el efecto de la administración de instilación tópica de SEQ ID NO: 37 en un modelo de rata de CNV inducida por láser. A las 3 semanas después del tratamiento con láser, se realizó una angiografía con fluoresceína para cuantificar el tamaño (área en píxeles) de la lesión de CNV en los ojos de rata.

[0413] La aplicación tópica de SEQ ID NO: 375 mg/ml redujo el tamaño de la lesión en ojos de rata con respecto a la instilación de vehículo solo. La diferencia en el tamaño de lesión promedio con respecto al grupo de vehículo fue significativa (figura 16; *,p<0,05,prueba de la t para datos independientes con prueba posterior de Mann-Whitney bilateral).

[0415] La inyección intravítrea bilateral del control positivo, compuesto anti-VEGF, redujo significativamente el tamaño de la lesión con respecto al control (figura 16; **,p <0,01, prueba de la t para datos independientes con prueba posterior de Mann-Whitney bilateral).

[0417] 2.2.5 Conclusiones

[0419] En un modelo de rata de neovascularización coroidea, la instilación tópica de SEQ ID NO: 37 5 mg/ml reduce significativamente el tamaño de lesión con respecto a la instilación tópica del vehículo solo.

[0421] Bibliografía

[0423] • Angaji S.A, Hedayati S.S, Poor R.H, et al. "Application of RNA interference in treating human diseases" J Genet.

[0424] 2010. vol. 89. 4. 527-37.

[0426] • Bird AC. "Therapeutic targets in age-related macular disease". J Clin Invest., septiembre de 2010; 120(9):3033-41.

[0428] • Bramsen J.B., Laursen M.B., Nielsen A. F., et al. "A large-scale chemical modification screen identifies design rules to generate siRNAs with high activity, high stability and low toxicity" Nucleic Acids Res 2009, vol. 37, número: 9, páginas: 2867-81.

[0430] • Campochiaro PA. "Potential applications for RNAi to probe pathogenesis and develop new treatments for ocular disorders". Gene Ther., marzo de 2006; 13(6):559-62.

[0432] • Cerutti, L., N. Mian, et al. "Domains in gene silencing and cell differentiation proteins: the novel PAZ domain and redefinition of the Piwi domain." Trends Biochem Sci. 200025(10): 481-2.

[0434] • Collins, R. E. and X. Cheng. "Structural domains in RNAi." FEBS Lett 2005579(26): 5841-9.

[0435] • Chang C.I, Kim H.A, Dua P, et al. "Structural Diversity Repertoire of Gene Silencing Small Interfering RNAs" Nucleic Acid Ther. 2011. Vol. 21. 3. 125-31.

[0436] • Chong RH, Gonzalez-Gonzalez E, et al. "Gene silencing following siRNA delivery to skin via coated steel microneedles: In vitro and in vivo proof-of-concept". J Control Release 2013, 166:211-9.

[0437] • Del Amo EM and Urtti A. "Current and future ophthalmic drug delivery systems. A shift to the posterior segment". Drug Discov Today 2008, 13:135-143.

[0438] • Deleavey G.F and Damha M.J. "Designing chemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing". Chem Biol. 2012, vol. 19.8. 937-54.

[0439] • Duvvuri S, Majumdar S, Mitra AK. "Drug delivery to the retina: challenges and opportunities". Expert Opin Biol Ther 2003, 3:45-56.

[0440] • Edelhauser HF, Rowe-Rendleman CL, Robinson MR, Dawson DG, et al. "Ophthalmic drug delivery systems for the treatment of retinal diseases: basic research to clinical applications". Invest Ophthalmol Vis Sci 2010, 51:5403-5420.

[0441] • Elbashir, S. M., W. Lendeckel, et al. "RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs." Genes Dev.

[0442] 2001 15(2): 188-200.

[0443] • Faibish M, Francescone R, Bentley B, et al. "A YKL-40-Neutralizing Antibody Blocks Tumor Angiogenesis and Progression: A Potential Therapeutic Agent in Cancers". Mol Cancer Ther 2011;10:742-751.

[0444] • Fire A, Xu S, et al. "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans." Nature. 1998391(6669): 806-11.

[0445] • Grossniklaus HE, Kang SJ, et al. "Animal models of choroidal and retinal neovascularization" Prog Retin Eye Res 201029(6): 500-19.

[0446] • Guzman-Aranguez A, Loma P and Pintor J. "Small-interfering RNAs (siRNAs) as a promising tool for ocular therapy". British Journal of Pharmacology. 2013. 170730-747.

[0447] • Hutvagner G, and Zamore PD. "A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex." Science. 2002.

[0448] 297(5589): 2056-60.

[0449] • Kigasawa K, Kajimoto K, et al. "Noninvasive delivery of siRNA into the epidermis by iontophoresis using an atopic dermatitis-like model rat". Int J Pharm 2010, 383:157-60.

[0450] • Kim DH, Behlke MA, Rose SD, et al. "Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy" Na t Biotechnol 2005. Vol. 23, número: 2, páginas: 222-6.

[0451] • Kornbrust D, Cavagnaro J, Levin A, et al. "Oligo safety working group exaggerated pharmacology subcommittee consensus document" Nucleic Acid Ther 2013, vol. 23, 1, pág.: 21-8.

[0452] • Leachman SA, Hickerson RP, et al. "First-in-human mutation-targeted siRNA phase Ib trial of an inherited skin disorder". Mol Ther 2010, 18:442-6.

[0453] • Lewis BP, Shih I, et al. "Prediction of mammalian micro RNA targets." Cell. 2003 115:787-798.

[0454] • Liu J, Carmell MA, et al. "Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi." Science. 2004305(5689): 1437­ 41.

[0455] • Livak KJ and Schmittgen TD. "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method" Methods. 2001; vol: 25, número: 4, páginas: 402-8.

[0456] • Ma JB, Yuan YR, et al. "Structural basis for 5'-end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi. • Maniatis T, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, en las págias 387-389. •

[0457] • Nakai N, Kishida T, et al. "Therapeutic RNA interference of malignant melanoma by electrotransfer of small interfering RNA targeting Mitf". Gene Ther 2007, 14:357-65.

[0458] • Nykanen A, Haley B, et al. "ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway." Cell 2001 107(3): 309-21.

[0459] • Orban TI and Izaurralde E. "Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome." Rna. 2005 11(4): 459-69.

[0460] • Phng LK, Potente M, et al. "Nrarp coordinates endothelial Notch and Wnt signaling to control vessel density in angiogenesis." Dev Cell 2009 16(1): 70-82.

[0461] • Rand TA, Petersen S, et al. "Argonaute2 cleaves the antiguide strand of siRNA during RISC activation." Cell.

[0462] 2005 123(4): 621-9.

[0463] • Rowe-Rendleman CL, Durazo SA, et al. "Drug and gene delivery to the back of the eye: from bench to bedside." Investigative ophthalmology & visual science. 201455(4): 2714-30.

[0464] • Sanghvi YS. "A status update of modified oligonucleotides for chemotherapeutics applications" Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2011, vol. 4. 4 11-22.

[0465] • Song JJ, Smith SK, et al. "Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity." Science.

[0466] 2004305 (5689): 1434-7.

[0467] • Walton SP, Wu M, Gredell JA and Chan C. "Designing highly active siRNAs for therapeutic applications" FEBS J. 2010. Vol. 277. 23. 4806-13.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

i. Molécula de ARNip para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad retiniana relacionada con la neovascularización caracterizada por un aumento de la expresión y/o la actividad de NRARP mediante administración tópica a la superficie corneal del ojo, en la que dicha molécula se dirige específicamente a al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9.

2. Molécula de ARNip para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad retiniana relacionada con la neovascularización caracterizada por un aumento de la expresión y/o la actividad de NRARP según la reivindicación 1, en la que dicha enfermedad retiniana se selecciona de degeneración macular relacionada con la edad (AMD), retinopatía isquémica, edema macular diabético (DME), retinopatía diabética proliferativa (PDR), isquemia retiniana diabética (DRI), edema retiniano diabético (DRE), neovascularización miope y retinopatía del prematuro (ROP) y combinaciones de las mismas.

3. Molécula de ARNip para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad retiniana relacionada con la neovascularización caracterizada por un aumento de la expresión y/o la actividad de NRARP según cualquier reivindicación anterior, en la que dicho ARNip comprende una región bicatenaria de 19 nucleótidos, opcionalmente en la que dicho ARNip tiene extremos romos.

4. Molécula de ARNip para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad retiniana relacionada con la neovascularización caracterizada por un aumento de la expresión y/o la actividad de NRARP según cualquier reivindicación anterior, en la que dicho ARNip comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 18, y preferentemente en la que dicho ARNip comprende o consiste en una cadena sentido que comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 18, y una cadena antisentido que es complementaria a la cadena sentido.

5. Molécula de ARNip para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad retiniana relacionada con la neovascularización caracterizada por un aumento de la expresión y/o la actividad de NRARP según cualquier reivindicación anterior, en la que al menos un nucleótido comprende una modificación química, preferentemente en la que dicha modificación química de un nucleótido se selecciona de: modificación 2'-O-metilo, modificación 2'-fluoro, introducción de nucleótidos modificados con fosforotioato, sustitución de uracilo por 5-propiniluracilo, sustitución de uracilo por 5-metiluridina, sustitución de nucleótidos de uracil-ribosa por 4'-tioribosa y sustitución de nucleótidos de uracil-ribosa por nucleótidos de desoxitimidina y combinaciones de las mismas.

6. Molécula de ARNip para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad retiniana relacionada con la neovascularización caracterizada por un aumento de la expresión y/o la actividad de NRARP según la reivindicación 5, en la que dicha modificación química está en la cadena sentido, la cadena antisentido o en ambas.

7. Molécula de ARNip para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad retiniana relacionada con la neovascularización caracterizada por un aumento de la expresión y/o la actividad de NRARP según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en la que dicho ARNip comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19 - SEQ ID NO: 66; preferentemente, en la que dicho ARNip comprende o consiste en una cadena sentido que comprende o consiste en al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, s Eq ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 65, y una cadena antisentido que es complementaria a la cadena sentido que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 66.