RS67288B1 - Sirna i njena upotreba u postupcima i kompozicijama za inhibiranje ekspresije nrarp gena - Google Patents

Sirna i njena upotreba u postupcima i kompozicijama za inhibiranje ekspresije nrarp gena

Info

Publication number
RS67288B1
RS67288B1 RS20250916A RSP20250916A RS67288B1 RS 67288 B1 RS67288 B1 RS 67288B1 RS 20250916 A RS20250916 A RS 20250916A RS P20250916 A RSP20250916 A RS P20250916A RS 67288 B1 RS67288 B1 RS 67288B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
sirna
nrarp
cells
retinal
Prior art date
Application number
RS20250916A
Other languages
English (en)
Inventor
Ana Isabel Jimenez
Covadonga Pañeda
Tamara Martinez
Original Assignee
Sylentis Sau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sylentis Sau filed Critical Sylentis Sau
Publication of RS67288B1 publication Critical patent/RS67288B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3235—Chemical structure of the sugar modified ring structure having the O of the ribose replaced by another atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

[0001] Opis
[0003] OBLAST PRONALASKA
[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast siRNA proizvoda za upotrebu u lečenju i/ili sprečavanju bolesti mrežnjače koje su povezane sa neovaskularizacijom, i konkretnije za upotrebu u lečenju i/ili sprečavanju bolesti mrežnjače koje su povezane sa neovaskularizacijom koja je povezana sa visokim nivoima ekspresije i/ili aktivnosti NRARP gena.
[0007] POZADINA PRONALASKA
[0009] Zdrava mrežnjača je neophodna za dobar vid. Poremećaji mrežnjače mogu uzrokovati delimičan ili potpuni gubitak vida. Mnoge bolesti mrežnjače imaju zajedničke simptome i lečenja, ali svaka ima jedinstvene karakteristike. Cilj lečenja bolesti mrežnjače je zaustavljanje ili usporavanje progresije bolesti i očuvanje ili obnavljanje gubitka vida.
[0010] [0003] Neuromrežnjača (neuroretina) je kompleksno neurološko tkivo sačinjeno od mreže osam međusobno povezanih slojeva ćelija koji su odgovorni za transformaciju vizuelne svetlosti u elektromehaničke informacije koje se šalju mozgu preko optičkog nerva i koje mozak interpretira. Raspored neuralnih ćelija unutar mrežnjače zahteva da svetlost prođe kroz većinu slojeva ćelija i stigne do fotoreceptora koji su locirani u posteriornom delu mrežnjače; fotoreceptori zatim prenose informacije neuronima mrežnjače radi lokalne obrade vizuelnih informacija i prenosa do vizuelnog korteksa. Postoje dva tipa fotoreceptora, štapolike i kupolike ćelije. Oba tipa fotoreceptora su prisutna svuda po mrežnjači, ali štapolike ćelije dominiraju na periferiji, dok su kupolike ćelije najgušće u centru mrežnjače. Centar mrežnjače, takođe poznat kao makula, specijalizovani je region mrežnjače sa gusto zbijenim kupolikim ćelijama i visokom koncentracijom pigmenata gde je vid najoštriji. Jedna od glavnih karakteristika mrežnjače je njena transparentnost. Transparentnost omogućava svetlosti da dopre do najudaljenijeg sloja mrežnjače gde su locirani fotoreceptori. Ovaj zahtev za transparentnošću podrazumeva da je vaskulatura potrebna za ishranu i podršku mrežnjače izuzetno specijalizovana. Snabdevanje mrežnjače krvlju obezbeđuju dva glavna izvora: vaskulatura mrežnjače i sudovnjača. Sudovnjača je veoma vaskularizovano, pigmentisano tkivo koje se nalazi između mrežnjače i beonjače. Sudovnjača obezbeđuje hranljive materije, metabolite i razmenu gasova mrežnjači difuzijom kroz kapilare sudovnjače. Pigmentni epitel mrežnjače (RPE) je monosloj pigmentisanih ćelija koji se nalazi između neuroretine i sudovnjače. RPE ćelije štite, podržavaju, i ishranjuju mrežnjaču osetljivu na svetlost. Posebno okruženje neuroretine održava krvno-retinalna barijera (BRB), koja se naziva i hematoretinalna barijera. BRB se sastoji od unutrašnje krvno-retinalne barijere i spoljašnje krvno-retinalne barijere. Unutrašnja krvno-retinalna barijera je formirana čvrstim spojevima između endotelnih ćelija kapilara vaskulature mrežnjače. Spoljašnju krvno-retinalnu barijeru čine čvrsti spojevi RPE ćelija. Čvrsti spojevi između RPE ćelija su neophodni za kontrolu transporta tečnih i rastvorljivih jedinjenja kroz BRB, kao i za sprečavanje ulaska toksičnih supstanci u mrežnjaču.
[0011] Krvni sudovi se formiraju u mrežnjači putem dva glavna procesa: vaskularizacije ili angiogeneze. Vaskularizacija se dešava kao rezultat diferencijacije prekursorskih ćelija, koje su već prisutne u tkivu, u endotelne ćelije koje doprinose formiranju krvnih sudova. Angiogeneza se razlikuje po tome što novi krvni sudovi nastaju grananjem iz već postojeće vaskulature. Angiogeneza zahteva proliferaciju, migraciju i diferencijaciju endotelnih ćelija; kao i maturaciju novoformiranih krvnih sudova. Broj endotelnih ćelija je normalno stabilan u odraslom organizmu; stabilnost u endotelu se kontroliše ravnotežom u koncentraciji angiogenih i antiangiogenih faktora. Izmene u ravnoteži faktora dovode do indukcije ili supresije angiogeneze. Vaskularizacija i angiogeneza su prirodni procesi koji se odvijaju tokom razvića i drugih događaja kao što je zarastanje; ali ovi procesi takođe imaju ulogu u patogenezi određenih bolesti. Patološka neovaskularizacija uobičajeno podrazumeva kombinaciju vaskularizacije i angiogeneze. Postoje dva tipa neovaskularizacije koji se javljaju u mrežnjači i oba mogu uzrokovati gubitak vida: neovaskularizacija mrežnjače (RNV) kod koje se novi krvni sudovi granaju iz kapilara mrežnjače i vrše invaziju u staklasto telo i neuralne slojeve mrežnjače, i neovaskularizacija sudovnjače (CNV) kod koje se novi krvni sudovi granaju iz vaskulature sudovnjače i vrše invaziju u subretinalni prostor. Iako RNV i CNV potiču iz različitih vaskularnih mreža i vrše invaziju u različite slojeve mrežnjače, zajednički molekulski mehanizmi podstiču progresiju oba. RNV i CNV su najčešći uzroci teškog gubitka vida u razvijenim zemljama i nova lečenja su potrebna.
[0012] [0005] Faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF), jedan od najvažnijih medijatora angiogeneze, pojačano se eksprimira tokom RNV i CNV. Tokom poslednje decenije, naučnici su razvili nekoliko novih „anti-VEGF“ lekova. Oni pomažu u blokiranju abnormalnih krvnih sudova, usporavaju curenje iz njih, i pomažu u smanjenju gubitka vida. Lečenje anti-VEGF lekovima izvodi se intravitrealnim injekcijama.
[0013] Intravitrealna (IVT) injekcija je najčešći postupak za isporučivanje lekova u zadnji deo oka, koji upotrebljavaju svi trenutno odobreni lekovi za lečenje bolesti mrežnjače, sa izuzetkom verteporfina. Verteporfin se primenjuje intravenskom injekcijom nakon čega sledi laserski tretman, ali je njegova upotreba značajno smanjena usled marketinga modernih anti-VEGF lečenja. Razlozi za širu upotrebu IVT injekcije su efikasnost isporučivanja lekova, nivo upoznatosti lekara za mrežnjaču i sposobnost lekara da kontroliše pridržavanje lečenju (Rowe-Rendleman et al 2014). Međutim, ovaj postupak ima skup svojih veoma specifičnih nedostataka koji uključuju nelagodnost pacijenta, rizik od endoftalmitisa, stvaranja katarakte i odvajanja mrežnjače, kao i visoke pridružene troškove usled toga što se primenjuje u ordinaciji. Drugi postupci primene uključuju periokularnu injekciju, suprahoroidalnu injekciju, subtenonsku injekciju i takođe i kapi za oči. Međutim, postoji izvesna skeptičnost u pogledu toga da li se može postići dovoljna efikasnost u lečenju stanja mrežnjače kapima za oči, pošto aktivni sastojak mora biti isporučen od rožnjače do mesta delovanja u mrežnjači. Postoje značajne barijere i putevi eliminacije koji ometaju isporuku lekova u zadnji deo oka. Prvo, oko apsorbuje samo 1‑7% primenjenog leka; većina leka primenjenog kao kapi za oči se drenira iz oka ili apsorbuje putem nazolakrimalnog kanala u sistemsku cirkulaciju. Pored toga, lekovi se brzo uklanjaju iz staklastog tela. Postoje dva puta eliminacije iz posteriorne šupljine, anteriorni i posteriorni. Prvi podrazumeva eliminaciju u anteriornu komoru putem toka očne vodice (AH), a zatim odliva AH kroz ugao anteriorne komore. Drugi podrazumeva eliminaciju kroz krvno-retinalnu barijeru. Stoga, lekovi koji mogu lako da prodru kroz krvnoretinalnu barijeru imali bi veoma kratak poluživot u staklastom telu.
[0014] Alternativa anti-VEGF lekovima za lečenje bolesti mrežnjače koji su povezani sa neovaskularizacijom su lekovi zasnovani na RNK interferenciji (RNAi).
[0015] RNAi je posttranskripcioni regulatorni mehanizam koji se javlja u prirodi koji je prisutan u većini eukariotskih ćelija koji upotrebljava male dvolančane molekule RNK (dsRNA) za usmeravanje homologno zavisnog utišavanja gena. Njeno otkriće od strane Fajera (Fire) i Mela (Mello) kod crva C. elegans {Fire et al 1998} nagrađeno je Nobelovom nagradom 2006. godine. Ubrzo posle prvog opisa, pokazano je da se RNAi takođe javlja u ćelijama sisara pomoću dvolančanih malih interferirajućih RNK (siRNA) dužine 21 nukleotida {Elbashir et al 2001}.
[0016] [0009] Smatra se da je proces RNK interferencije evolutivno konzerviran ćelijski odbrambeni mehanizam koji se upotrebljava za sprečavanje ekspresije stranih gena i uobičajeno ga dele različiti filumi i flore, gde se naziva posttranskripciono utišavanje gena. Od otkrića mehanizma RNAi došlo je do eksplozije istraživanja kako bi se otkrila nova jedinjenja koja mogu selektivno da izmene ekspresiju gena kao novi način lečenja humanih bolesti obraćanjem pažnje na ciljeve koji su inače „nelečivi“ tradicionalnim farmaceutskim pristupima koji uključuju male molekule ili proteine.
[0017] [0010] U skladu sa trenutnim znanjem, mehanizam RNAi se inicira kada duge dvolančane RNK obrađuje RNazi III-sličan protein poznat kao Dicer. Protein Dicer tipično sadrži N-terminusni domen RNK helikaze, RNK-vezujući takozvani Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ) domen, dva domena RNaze III i dvolančani RNK-vezujući domen (dsRBD) {Collins et al 2005} i njegova aktivnost dovodi do obrade dugih dvolančanih RNK u dvolančane siRNA dužine 21‑24 nukleotida sa 3' prepustom od 2 baze i 5' fosfatnom i 3' hidroksilnom grupom. Rezultujući siRNA dupleksi se zatim inkorporišu u efektorski kompleks poznat kao RNK-indukovani kompleks za utišavanje (RISC), gde antisens ili vodeći lanac siRNA vodi RISC da prepozna i iseca ciljne sekvence iRNK {Elbashir et al 2001} nakon adenozin-trifosfat (ATP)-zavisnog odmotavanja dvolančanog molekula siRNA putem aktivnosti RNK helikaze {Nykanen et al 2001}. Katalitička aktivnost RISC, koja dovodi do degradacije iRNK, posredovana je endonukleazom Argonaute 2 (AGO2) {Liu et al 2004; Song et al 2004}. AGO2 pripada visoko konzerviranoj Argonaute porodici proteina. Argonaute proteini su visoko bazni proteini od ~100 KDa koji sadrže dva zajednička domena, poimenično PIWI i PAZ domene {Cerutti et al 2000}. PIWI domen je ključan za interakciju sa Dicer i sadrži nukleaznu aktivnost koja je odgovorna za isecanje iRNK. AGO2 upotrebljava jedan lanac siRNA dupleksa kao vodič za pronalaženje informacionih RNK koje sadrže komplementarne sekvence i iseca fosfodiestersku okosnicu između baza 10 i 11 u odnosu na 5' kraj vodećeg lanca {Elbashir et al 2001}. Važan korak tokom aktivacije RISC je isecanje sens ili putničkog lanca pomoću AGO2, uklanjajući ovaj lanac iz kompleksa {Rand et al 2005}. Kristalografske studije koje analiziraju interakciju između vodećeg lanca siRNA i PIWI domena otkrivaju da samo nukleotidi 2 do 8 čine „seed sekvencu“ koja usmerava prepoznavanje ciljne iRNK od strane RISC, i da neusklađenost jednog nukleotida u ovoj sekvenci može drastično uticati na sposobnost utišavanja molekula {Ma et al 2005; Doench et al 2004; Lewis et al 2003}. Kada se iRNK iseče, usled prisustva nezaštićenih krajeva RNK u fragmentima, iRNK se dalje iseca i razgrađuje unutarćelijskim nukleazama i više se neće translatirati u proteine {Orban et al 2005}, dok će se RISC reciklirati za naredne krugove {Hutvagner et al 2002}. Ovo čini katalitički proces koji dovodi do selektivne redukcije specifičnih molekula iRNK i odgovarajućih proteina. Moguće je iskoristiti ovaj nativni mehanizam za utišavanje gena sa ciljem regulisanja bilo kog gena po izboru direktnom isporukom efektora siRNA u ćelije ili tkiva, gde će aktivirati RISC i proizvesti snažno i specifično utišavanje ciljane iRNK. RNAi je primenjena u biomedicinskim istraživanjima kao što je lečenje HIV, virusnog hepatitisa, kardiovaskularnih i cerebrovaskularnih bolesti, metaboličkih bolesti, neurodegenerativnih poremećaja i kancera {Angaji SA et al 2010}.
[0018] Objavljeno je mnogo studija koje opisuju idealna svojstva koje bi siRNA trebalo da ima kako bi postigla maksimalnu efikasnost, u pogledu dužine, strukture, hemijske kompozicije, i sekvence. Inicijalne parametre za dizajn siRNA postavili su Tušl (Tuschl) i saradnici u WO02/44321, iako je od tada objavljeno mnogo naknadnih studija, algoritama i/ili poboljšanja. Pristupi selekciji siRNA postali su sofisticiraniji kako su se pojavili mehanistički detalji, pored toga dodatna analiza postojećih i novih podataka može obezbediti dodatne uvide u dodatno usavršavanje ovih pristupa {Walton SP et al 2010}.
[0019] Alternativno, nekoliko nedavnih studija objavilo je dizajn i analizu novih struktura koje pokreću RNAi koje se razlikuju od klasične 19+2 siRNA strukture i koje se ne uklapaju u ključna svojstva klasične siRNA u smislu prepusta, dužine, ili simetrije, razmatrajući fleksibilnost RNAi mašinerije u ćelijama sisara {Chang CI et al 2011}.
[0020] [0013] Takođe, mnogo truda je uloženo u poboljšanje stabilnosti siRNA pošto se ona doživljava kao jedna od glavnih prepreka za terapiju zasnovanu na siRNA, s obzirom na sveprisutnu prirodu RNaza u biološkim tečnostima. Sledeći inherentni problem molekula siRNA je njihova imunogenost, pri čemu je pronađeno da siRNA indukuju nespecifičnu aktivaciju urođenog imunskog sistema. Nokdaun nepredviđenih gena (iRNK) je dobro poznati sporedni efekat siRNA-posredovanog utišavanja gena. Uzrokovan je delimičnom komplementarnošću između siRNA i iRNK drugih nego predviđeni cilj i uzrokuje nespecifične (off-target) efekte (OTE) na gene koji imaju komplementarnost sekvence sa bilo kojim lancem siRNA. Jedna od glavnih strategija koje se primenjuju za poboljšanje stabilnosti i redukovanje OTE bila je upotreba modifikovanih nukleotida kao što su 2’-O-metil nukleotidi, 2’-amino nukleotidi, ili nukleotidi koji sadrže 2’-O ili 4’-C metilenske mostove. Takođe, opisana je modifikacija ribonukleotidne okosnice koja povezuje susedne nukleotide, uglavnom introdukovanjem fosforotioatnih modifikovanih nukleotida. Čini se da su poboljšana stabilnost i/ili redukovanje imunogenosti često obrnuto proporcionalni efikasnosti {Parrish, 2000}, i da samo određeni broj, pozicije i/ili kombinacije modifikovanih nukleotida mogu rezultovati stabilnim i neimunogenim jedinjenjem za utišavanje. Pošto je ovo važna prepreka za siRNA-zasnovana lečenja, objavljene su različite studije koje opisuju određene obrasce modifikacije koji pokazuju dobre rezultate, primeri takvih uključuju EP1527176, WO2008/050329, WO2008/104978 ili WO2009/044392, iako se u literaturi mogu naći još mnogi {Sanghvi YS.2011; Deleavey et al 2012}.
[0021] Oko je relativno izolovan odeljak tkiva, što obezbeđuje prednosti za korišćenje siRNA-zasnovanih lekova za lečenje bolesti mrežnjače koje su povezane sa neovaskularizacijom. Izvodljivost upotrebe siRNA za lečenje CNV demonstrirana je upotrebom siRNA primenjenih intravitrealnom injekcijom usmerenom prema VEGF ili VEGF receptoru 1 (VEGFR1) {Campochiaro PA. 2006}. Isporuka siRNA topikalnom instilacijom u posteriorni segment je zaista izazovna, zbog relativno velike udaljenosti koju siRNA moraju da pređu kroz staklasto telo pre nego što stignu do mrežnjače {Guzman-Aranguez A. et al 2013}. Pored toga, farmaceutsko lečenje bolesti mrežnjače koje pogađaju posteriorni segment oka je takođe izazovno usled restriktivnih krvno-okularnih barijera kao što su krvno-vodena barijera (BAB) i BRB, koje odvajaju oko od sistemske cirkulacije. Štaviše, kompartmentalizovana struktura oka ograničava prolaz siRNA iz anteriorne komore u posteriorni segment oka {Duvvuri S et al 2003}. Konačno, kada siRNA uspešno uđu u zadnji deo oka, efikasni mehanizmi eliminacije deluju kako bi se brzo uklonili isporučeni molekuli {Del Amo EM et al 2008}. Stoga, direktna injekcija u staklasto telo postala je najefikasniji način za isporuku siRNA-zasnovanih terapeutika u posteriorni segment oka {Edelhauser HF et al 2010}. Intravitrealna injekcija siRNA postiže visoke koncentracije siRNA koje su lokalno dostupne tkivima mrežnjače, a istovremeno ograničava sistemsku izloženost. Međutim, koncentracija siRNA se brzo smanjuje iz posteriornog segmenta usled degradacije endonukleazama staklastog tela i/ili putem permeacije kroz BRB i difuzijom kroz staklasto telo do anteriorne komore. Stoga, potrebne su višestruke intravitrealne injekcije kako bi se održale optimalne koncentracije siRNA unutar posteriornog segmenta oka. Glavni nedostatak ovog načina primene je to što su višestruke intravitrealne injekcije povezane sa povišenim intraokularnim pritiskom, krvarenjem u staklastom telu ili mrežnjači, odvajanjem mrežnjače, pucanjem mrežnjače, endoftalmitisom, kataraktom, „mušicama“ i prolaznim zamućenim vidom {Edelhauser HF et al 2010}. Prema tome, iako intravitrealne injekcije osiguravaju isporuku visoke koncentracije siRNA mrežnjači, ovaj postupak primene takođe nosi sa sobom posebne rizike. Shodno tome, topikalna primena siRNA mogla bi smanjiti rizike i podrazumevati postupak primene koji je pogodniji za pacijenta.
[0022] [0015] Pokazano je da gole siRNA dospevaju u određene regione nakon topikalne primene, ali pristup dubljim regionima kao što je najdublji sloj mrežnjače i efikasno ćelijsko preuzimanje zahtevaju razvoj strategija koje osiguravaju dovoljnu koncentraciju jedinjenja koje dospeva do citoplazme ćelija koje su locirane u ciljnom području i izaziva željeni fiziološki ili terapijski odgovor. Fizički pristupi za isporuku siRNA preko stratum corneum barijere uključuju mikroigle (Chong, Gonzalez-Gonzalez et al., 2013), intradermalne injekcije (Leachman, Hickerson et al., 2010), elektroporaciju (Nakai, Kishida et al., 2007), jontoforezu (Kigasawa, Kajimoto et al., 2010) između ostalog. Modifikacije molekula i/ili formulacije takođe mogu omogućiti molekulu da prodre u potreban region i poboljša ćelijsko preuzimanje.
[0023] Topikalna primena siRNA-zasnovanih terapeutika za lečenje bolesti mrežnjače je već opisana; na primer, US20130123330 objavljuje lečenje dijabetičke retinopatije i drugih bolesti okularne neovaskularizacije primenom najmanje jednog siRNA dupleksa koji se vezuje za molekule iRNK koji kodiraju VEGF ili VEGFR2, ili koktela koji kombinuje siRNA duplekse koji ciljno deluju na oba gena, VEGF i VEGFR2. Ova patentna prijava opisuje da se siRNA dupleksi mogu primenjivati u oko topikalno, subkonjunktivno, ili intravitrealno. Međutim, specifikacija uključuje samo primere jedinjenja koja se primenjuju intravitrealno ili subkonjunktivno. WO2010048352 (Quark Pharmaceuticals) objavljuje upotrebu hemijski modifikovanih siRNA jedinjenja za lečenje okularnih bolesti, poremećaja i povreda koje su povezane sa degeneracijom ili smrću ganglijskih ćelija mrežnjače, uključujući retinitis pigmentosa (RP), dijabetičku retinopatiju (DR), dijabetički makularni edem (DME) i makularnu degeneraciju koja je povezana sa starenjem (AMD).
[0024] Iako je topikalna isporuka u tkivo mrežnjače demonstrirana za siRNA jedinjenja koja smanjuju ekspresiju ciljnih gena koji su povezani sa gubitkom ovih ćelija, kao što su CASP2, RTP801, TIGASEII i p53 geni, samo za siRNA jedinjenja koja ciljno deluju na kaspazu 2 je dokazano da obezbeđuju okularni neuroprotektivni efekat povećavajući preživljavanje ganglijskih ćelija mrežnjače.
[0025] Selekcija ciljnih gena igra ključnu ulogu u lečenju i/ili sprečavanju bolesti mrežnjače koje su povezane sa neovaskularizacijom sa siRNA-zasnovanim terapeuticima. Notchregulisani protein sa ankirinskim ponovcima (NRARP) indukuje se pomoću Notch na novoformiranim tačkama grananja, gde različito modulira Notch i Wnt signalnu aktivnost kako bi uravnotežio proliferaciju stabla i stabilnost krvnih sudova. siRNA posredovana smanjena ekspresija NRARP u HUVEC ćelijama korelira sa povećanjem Notch, što se u ćelijama stabla translatira u regresiju krvnih sudova, dok povećani Notch dovodi do formiranja novih ćelija vrha {Phng LK, Potente M, et al.2009}. Prema tome, verovatno je da NRARP igra važnu ulogu u regulaciji procesa angiogeneze i/ili neovaskularizacije u tkivima mrežnjače.
[0026] siRNA-zasnovani terapeutici mogu usporiti i sprečiti progresiju RNV i CNV kod bolesti mrežnjače, ali terapijske koristi mogu biti umanjene neefikasnom isporukom siRNA i ograničenim trajanjem bioraspoloživosti siRNA, što zahteva produžene režime lečenja ponovljenim intravitrealnim injekcijama. Stoga, poboljšani i neinvazivni siRNA-zasnovani terapeutici koja ciljno deluju na nove i inovativne ciljne gene moraju biti dizajnirani za lečenje i/ili sprečavanje bolesti mrežnjače koje su povezane sa neovaskularizacijom.
[0027] Lobov et al 2011 (Blood, vol.117, str.6728‑6737) opisuje ulogu D114 / Notch puta u angiogenezi u mrežnjači, i dodatno napominje da genetička delecija NRARP rezultuje suprotnim Notch fenotipom dobitka funkcije, što dovodi do preterane vazo-obliteracije.
[0028] Phng LK, Potente M, et al. 2009; i Guzman-Aranguez A. et al. 2013; na koje se već pozivalo, takođe su relevantni za razumevanje predmetnog pronalaska.
[0030] SAŽETAK PRONALASKA
[0032] U skladu sa predmetnim pronalaskom, obezbeđen je molekul siRNA za upotrebu u lečenju i/ili sprečavanju bolesti mrežnjače koja je povezana sa neovaskularizacijom koju karakteriše povećana ekspresija i/ili aktivnost NRARP topikalnom primenom na površinu rožnjače oka, u skladu sa nezavisnim patentnim zahtevom 1. Dodatni aspekti pronalaska navedeni su u zavisnim patentnim zahtevima.
[0033] [0023] Predmetna objava obezbeđuje poboljšane proizvode za redukovanje ekspresije NRARP i shodno tome bolesti mrežnjače koje su povezane sa neovaskularizacijom. Jedna od prednosti lečenja bolesti mrežnjače koje su povezane sa neovaskularizacijom pomoću siRNA proizvoda nasuprot tradicionalnih antiangiogenih terapijskih agenasa jeste da će lečenja koja su zasnovana na siRNA imati dugotrajniji efekat. Ovo svojstvo je posledica činjenice da siRNA blokiraju sintezu ciljnog proteina. Kada se lečenje obustavi, ćelija će morati da sintetiše nove ciljne proteine od nule; dok bi tradicionalno lečenje ostavilo ciljni protein intaktnim, koji je spreman da ponovo bude aktivan kada inhibitor više nije prisutan. Sledeća prednost bi mogla biti povećanje potentnosti upotrebom kombinacije različitih siRNA za lečenje stanja; ovo bi se moglo postići kombinovanjem siRNA koje ciljno deluju na NRARP sa drugim modulatorima NRARP i/ili drugim molekulskim medijatorima neovaskularizacije, kao što su VEGF ili VEGFR2. Mehanizam delovanja siRNA podrazumeva da kada aktivni molekul dospe do citoplazme, isti molekul može biti upotrebljen za posredovanje u degradaciji mnogih molekula iRNK, što nije slučaj sa antitelima, koja zahtevaju 1:1 stehiometriju. Prema tome, očekuje se da će biti potrebne niže doze jedinjenja kako bi se postigla ista klinička efikasnost, čime bi se potencijalno smanjili sporedni efekti.
[0035] OPIS CRTEŽA
[0037]
[0039] Slika 1: pokazuje kratke fragmente ciljne sekvence gena NRARP odabrane kao ciljne sekvence za siRNA iz predmetne objave.
[0041] Slika 2: pokazuje oligonukleotidne sekvence za molekule siRNA iz predmetnog pronalaska koje ciljno deluju na NRARP obuhvaćene predmetnom objavom. SEQ ID NO koje su date na Slici označavaju sens (5ʼ -> 3ʼ) lanac; tipično siRNA će biti primenjena kao dsRNA, tako da će siRNA uključivati i sens lanac i njegov komplementarni antisens lanac. SEQ ID NO. 10 do SEQ ID NO. 18 su siRNA koje ciljno deluju na SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO. 9 respektivno. Generalno, siRNA će uključivati sens i antisens lanac, a može takođe uključivati 3ʼ dinukleotidne prepuste (na primer, dTdT). Međutim, ovo nije neophodno.
[0043] Slika 3: modifikovane siRNA koje ciljno deluju na NRARP. SEQ ID NO 19 do SEQ ID NO 40 označavaju modifikovani sens (5’ -> 3’) lanac i modifikovani antisens lanac (5’ -> 3’) siRNA SEQ ID NO 10, koja cilja sekvencu SEQ ID NO 1 NRARP gena. Legenda: sens lanac (S), antisens lanac (AS), mala slova (2’OMe ribonukleotidi), * (PS ili fosfotioatna veza), mala slova (4’tioriboza ili 4’S), pU ili 5pU (5-propiniluracil 3’), VELIKA SLOVA (2’F ribonukleotidi), mala slova (5’-metiluridin ili 5mU), dT (dezoksitimin ili 2’H timin).
[0045] Slika 4: nivoi ekspresije NRARP gena in vitro posle transfekcije jedne od sledećih siRNA koje ciljno deluju na NRARP: SEQ ID NO. 10 (SYL136001), SEQ ID NO. 11 (SYL136005), SEQ ID NO.12 (SYL136003) i SEQ ID NO.13 (SYL136004) u humane HeLa ćelije.
[0048] 1
[0049] Slika 5: vijabilnost ćelija in vitro posle transfekcije jedne od sledećih siRNA koje ciljno deluju na NRARP: SEQ ID NO.10 (SYL136001), SEQ ID NO. 11 (SYL136005), SEQ ID NO.12 (SYL136003) i SEQ ID NO.13 (SYL136004) u humane HeLa ćelije.
[0051] Slika 6: nivoi ekspresije NRARP gena in vitro posle transfekcije siRNA SEQ ID NO.
[0052] 10 koja ciljno deluje na NRARP i njenih modifikovanih pandana: SEQ ID NO.19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO.35, SEQ ID NO.37 i SEQ ID NO.39 u humane HeLa ćelije.
[0054] Slika 7: nivoi ekspresije NRARP gena in vitro posle transfekcije siRNA SEQ ID NO.
[0055] 10 koja ciljno deluje na NRARP i njenih modifikovanih pandana: SEQ ID NO.19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO.35, SEQ ID NO.37 i SEQ ID NO.39 u humane BEAS‑2B ćelije.
[0057] Slika 8: nivoi ekspresije NRARP gena in vitro posle transfekcije SEQ ID NO. 10 i njenih modifikovanih pandana: SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.23, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 i SEQ ID NO.39 u murinske C2C12 ćelije.
[0059] Slika 9: nivoi ekspresije NRARP gena in vitro posle transfekcije SEQ ID NO. 10 ili SEQ ID NO.37 u pacovske ARL6 ćelije.
[0061] Slika 10: vijabilnost ćelija in vitro posle transfekcije SEQ ID NO. 10 i njenih modifikovanih pandana: SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO.35, SEQ ID NO. 37 i SEQ ID NO. 39 u humane HeLa ćelije.
[0063] Slika 11: vijabilnost ćelija in vitro posle transfekcije SEQ ID NO. 10 i njenih modifikovanih pandana: SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO.35, SEQ ID NO. 37 i SEQ ID NO. 39 u humane BEAS‑2B ćelije.
[0065] Slika 12: vijabilnost ćelija in vitro posle transfekcije SEQ ID NO. 10 i i njenih modifikovanih pandana: SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO.35, SEQ ID NO. 37 i SEQ ID NO. 39 u murinske C2C12 ćelije.
[0067] Slika 13: vijabilnost ćelija in vitro posle transfekcije bilo SEQ ID NO. 10 ili SEQ ID NO. 37 u pacovske ARL6 ćelije.
[0069] Slika 14: Nivoi iRNK NRARP u mrežnjači nakon indukcije CNV pomoću lasera. Podaci predstavljaju srednje vrednosti ± s.e.m za tri životinje (šest očiju) po vremenskoj tački.
[0071] Slika 15: Nivoi iRNK NRARP u sudovnjači/RPE nakon indukcije CNV pomoću lasera. Podaci predstavljaju srednje vrednosti ± s.e.m za najmanje dve životinje (četiri oka) po vremenskoj tački.
[0073] Slika 16: Histogram merenja lezija tri nedelje nakon laserskog tretmana, bilo sa topikalno primenjenim vehikulumom ili SEQ ID NO. 37 (5 mg/ml) ili intravitrealnom injekcijom anti-VEGF (5 µg/oku). Površine lezija su određene fluoresceinskom angiografijom koje su kvantifikovane (u pikselima<2>) upotrebom kompjuterizovanog softvera za analizu slike, isključujući površinu avaskularizacije u centru lezije. Podaci predstavljaju srednje vrednosti ± s.e.m za šest životinja (dvanaest očiju) po vremenskoj tački.
[0075] Slika 17: Varijable koje su proučavane za procenu struktura: 1. Broj glavnih spojeva; 2. Broj glavnih segmenata; 3. Ukupna dužina glavnog segmenta; 4. Broj mreža; 5. Ukupna površina mreže.
[0077] Slika 18: Promena različitih parametara koji su proučavani kao odgovor na kompletni medijum. Predstavljeni su sledeći parametri: broj glavnih spojeva; broj glavnih segmenata; ukupna dužina glavnih segmenata; broj mreža; ukupna površina mreža. Rezultati su dobijeni iz ćelija koje su zasejane u posude za kultivaciju obložene matrigelom upotrebom: EBM medijuma bez suplemenata kao negativne kontrole (bazalni uslovi), ili kompletnog medijuma sa suplementima i 10% FCS (pozitivna kontrola).
[0078] Slika 19: Analiza različitih parametara koji su proučavani kao odgovor na SEQ ID NO.
[0079] 37 ili KDR siRNA.
[0081] Slika 20: Slike struktura koje su formirane kao odgovor na različite uslove.
[0083] Slika 21: A. Proliferacija HUVEC ćelija kao odgovor na različite koncentracije VEGF. B. Inhibicija VEGF indukovane proliferacije pomoću bevacizumaba.
[0085] Slika 22: Efekat anti-KDR siRNA ili siRNA SEQ ID NO. 37 na proliferaciju indukovanu kompletnim medijumom (10% FCS i 100 ng/ml VEGF) u HUVEC ćelijama.
[0087] Slika 23: Migracija HUVEC ćelija kao odgovor na povećanje doza VEGF.
[0089] Slika 24: Efekat anti-KDR siRNA ili siRNA SEQ ID NO. 37 na migraciju HUVEC ćelija indukovanu medijumom bez suplemenata i kompletnim medijumom (10% FCS 100 ng/ml VEGF).
[0091] Slika 25: Slike ćelija u gornjem odeljku (migrirajuće) kao odgovor na različite uslove.
[0093] Slika 26: A. kvantifikacija zarastanja rana u bazalnim uslovima i kao odgovor na 10 ng/ml VEGF. B. Slike lezije u vremenu 0 i 24 h posle indukcije.
[0095] Slika 27: Kvantifikacija zarastanja rana u bazalnim uslovima i kao odgovor na kompletni medijum (10% FCS i 100 ng/ml VEGF).
[0097] Slika 28: Slike koje pokazuju rane u vremenu 0 i 16 h posle indukcije u različitim testiranim uslovima.
[0099] Slika 29: Nivoi iRNK NRARP u HUVEC ćelijama.
[0102] 1
[0103] DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0105] Kao što je ovde opisano, predmetna objava se odnosi na obezbeđivanje molekula siRNA za upotrebu kao medikamenta, u lečenju i/ili sprečavanju bolesti mrežnjače koju karakteriše povećana ekspresija i/ili aktivnost NRARP, pri čemu navedeni molekul specifično cilja sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od ili sadrži: SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO. 9 i redukuje ekspresiju NRARP gena kada se introdukuje u ćeliju. Poželjno ciljna sekvenca sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO. 1. Pozivanja na postupke lečenja terapijom ili operacijom u ovom opisu treba tumačiti kao pozivanja na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i medikamente iz predmetnog pronalaska za upotrebu u tim postupcima.
[0106] Gen je „ciljan“ od strane siRNA u skladu sa predmetnom objavom kada, na primer, molekul siRNA selektivno smanjuje ili inhibira ekspresiju gena. Fraza „selektivno smanjiti ili inhibirati“, kao što se ovde upotrebljava, obuhvata siRNA koje utiču na ekspresiju jednog gena, u ovom slučaju NRARP. Alternativno, siRNA cilja gen kada se (jedan lanac) siRNA hibridizuje pod strogim uslovima sa genskim transkriptom, tj. njegovom iRNK. Hibridizacija „pod strogim uslovima“ znači vezivanje za region ciljne iRNK pod standardnim uslovima, npr. visoka temperatura i/ili nizak sadržaj soli koji imaju tendenciju da ne favorizuju hibridizaciju. Pogodan protokol (koji uključuje 0,1×SSC, 68 °C tokom 2 sata) opisan je u Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, na stranicama 387‑389.
[0107] Sekvence nukleinske kiseline koje su ovde navedene napisane su u 5ʼ ka 3ʼ smeru osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Termin „nukleinska kiselina“ označava bilo DNK ili RNK ili njihov modifikovani oblik koji sadrži purinske ili pirimidinske baze prisutne u DNK (adenin „A“, citozin „C“, guanin „G“, timin „T“) ili u RNK (adenin „A“, citozin „C“, guanin „G“, uracil „U“). Interferirajuće RNK koje su ovde obezbeđene mogu sadržati „T“ baze, na primer na 3ʼ krajevima, iako se „T“ baze prirodno ne javljaju u RNK. U nekim slučajevima ove baze mogu se pojaviti kao „dT“ kako bi se razlikovali dezoksiribonukleotidi prisutni u lancu ribonukleotida.
[0108] Ciljna sekvenca kao što je prethodno definisano opisana je kao ciljna sekvenca DNK kao što se upotrebljava za definisanje varijanti transkripta u bazama podataka koje se upotrebljavaju za dizajniranje siRNA, dok će specifična jedinjenja koja će se upotrebljavati biti sekvence RNK definisane kao takve.
[0109] [0029] Osoba sa iskustvom u oblasti može pristupiti bilo kojoj ciljnoj sekvenci gena preko javnih baza podataka. Na primer, GenBank pristupni broj koji odgovara humanoj iRNK NRARP je NP_001004354.1 i NM_001004354.2 (ID gena: 441478). Štaviše, ENSEMBL (MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute) ima sledeći pristupni broj humanog NRARP: ENSG00000198435. Sve ove informacije se nalaze u Ensembl bazi podataka sa slobodnim pristupom.
[0110] Navedeni poželjni ciljni region koji je identifikovan predmetnim pronalaskom sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence koja je odabrana od SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO.
[0111] 9.
[0112] U poželjnom primeru izvođenja, navedeni poželjni ciljni region sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO.1.
[0113] Ove sekvence predstavljaju 100% homologije između sledećih vrsta: Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Canis lupus familiaris, i Sus scrofa domestica.
[0114] U oblasti RNAi, kada in vitro studije pokažu da humana siRNA nije u stanju da indukuje nokdaun gena životinjskog modela, sintetiše se surogatno jedinjenje (životinjskiaktivan analog) kako bi se analizirala efikasnost siRNA u relevantnom životinjskom modelu. Ovaj surogat se dizajnira prema istom regionu kao i humana siRNA, tako da dve siRNA imaju istu sekvencu osim nekoliko nukleotida, u zavisnosti od homologije između humanog i životinjskog ciljnog gena. Ovaj pristup se široko upotrebljava za razvoj drugih oligonukleotida, specifično za toksikološke studije i studije efikasnosti {Kornbrust D et al 2013}.
[0115] U poželjnijem primeru izvođenja, navedeni poželjni ciljni region sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO.1 (5’‑CACCAGGACATCGTGCTCT‑3’).
[0116] Shodno tome, siRNA koja je u skladu sa aspektima predmetne objave poželjno će sadržati dvolančani molekul RNK, čiji će antisens lanac sadržati sekvencu RNK suštinski komplementarnu najmanje jednoj sekvenci koja se sastoji od SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO.
[0117] 9, i čiji će sens lanac sadržati sekvencu RNK komplementarnu antisens lancu, pri čemu se oba lanca hibridizuju standardnim sparivanjem baza između nukleotida. Poželjnije, siRNA koja je u skladu sa aspektima predmetne objave poželjno će sadržati dvolančani molekul RNK, čiji će antisens lanac sadržati sekvencu RNK suštinski komplementarnu SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO. 9, a još poželjnije antisens lanac sadrži ili se sastoji od sekvence RNK suštinski komplementarne SEQ ID NO.1.
[0118] Unutar značenja predmetne objave, „suštinski komplementaran“ ciljnoj sekvenci iRNK, može se takođe razumeti kao „suštinski identičan“ navedenoj ciljnoj sekvenci. „Identičnost“, kao što je poznato onome sa prosečnim iskustvom u struci, je stepen srodnosti sekvenci između nukleotidnih sekvenci kao što je određeno podudaranjem redosleda i identičnosti nukleotida između sekvenci. U jednom primeru izvođenja, antisens lanac siRNA koji ima 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili
[0121] 1
[0122] 99% komplementarnosti sa ciljnom sekvencom iRNK smatra se suštinski komplementarnim i može se upotrebljavati u predmetnoj objavi. Procenat komplementarnosti opisuje procenat susednih nukleotida u prvom molekulu nukleinske kiseline koji mogu da se bazno spare u Votson-Krikovom (Watson-Crick) smislu sa skupom susednih nukleotida u drugom molekulu nukleinske kiseline. U poželjnom primeru izvođenja, antisens lanac siRNA je 100% komplementaran ciljnoj sekvenci iRNK, a sens lanac je 100% komplementaran antisens lancu preko dvolančanog dela siRNA. siRNA može takođe uključivati nesparene prepuste, na primer, 3ʼ dinukleotidne prepuste, poželjno dTdT.
[0123] Stanje mrežnjače oka identifikovano predmetnom objavom je bolest ili poremećaj koji je povezan sa neovaskularizacijom. Poželjnije, navedeno stanje oka odabrano je od: makularne degeneracije koja je povezana sa starenjem (AMD), ishemijske retinopatije, dijabetičkog makularnog edema (DME), proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR), dijabetičke ishemije mrežnjače (DRI), dijabetičkog edema mrežnjače (DRE), miopijske neovaskularizacije, i retinopatije prevremeno rođenih (ROP) i njihovih kombinacija.
[0124] Kao što je poznato iz stanja tehnike, predloženo je mnogo različitih struktura za postizanje RNK interferencije. Generalno ovi dvolančani molekuli su dužine od oko 19 do oko 25 nukleotida, i uključuju strukture sa tupim krajevima, kao i one sa prepustima. Prepusti su opisani kao povoljni i mogu biti prisutni na 5ʼ krajevima ili na 3ʼ krajevima bilo kog lanca, pošto redukuju prepoznavanje od strane RNaza i imitiraju prirodni supstrat za Dicer. Neki autori preporučuju uključivanje prepusta na oba 3ʼ kraja molekula, dok drugi smatraju da je jedan prepust dovoljan. Drugi su opisali upotrebu struktura sa tupim krajevima sa specifičnim obrascima modifikacije (EP1527176, WO2005062937, WO2008104978, EP2322617, EP2348133, US20130130377, i mnogi drugi).
[0125] Prepusti mogu biti sačinjeni od između 1 i 5 nukleotida; tipično su prepusti napravljeni od dinukleotida. Klasični molekuli koji se upotrebljavaju u ovoj oblasti sadrže dvolančani molekul od 19 nukleotida koji dodatno sadrži 3ʼ dinukleotidne prepuste, poželjno koji sadrže dezoksinukleotide, kao što je podučavano u inicijalnim studijama Tušla (WO0244321). Za ove prepuste se kaže da dodatno poboljšavaju otpornost na degradaciju nukleazama (RNaze).
[0126] Kasnije, Kim et al 2005 opisuju da su 21-mer proizvodi (koji sadrže dinukleotidne prepuste) neophodni za vezivanje za RISC. Dodatno, Bramsen et al 2009 opisuju introdukovanje mogućih destabilizujućih modifikacija prepusta kako bi se dodatno povećala efikasnost utišavanja.
[0127] Kao takav, poželjni primer izvođenja različitih aspekata predmetne objave označava molekule siRNA koji ciljno deluju na najmanje jednu sekvencu koja je odabrana iz grupe koja
[0130] 1
[0131] se sastoji od SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO. 9, koji sadrže najmanje jedan prepust, poželjno 3ʼ prepust u sens i/ili antisens lancu. Poželjnije, navedeni molekuli siRNA ciljaju SEQ ID NO. 1. Kada se objava odnosi na molekul siRNA koji ciljno deluje na najmanje jednu sekvencu koja je odabrana od SEQ ID NO.1 do SEQ ID NO.9, siRNA će uključivati antisens lanac ekvivalentne dužine i komplementarnosti cilju, i sens lanac ekvivalentne dužine i komplementarnosti antisens lancu. Antisens i sens lanci mogu dodatno uključivati dodatne baze koje nisu komplementarne drugom lancu ili cilju, i/ili koje nisu sparene u dvolančanom delu siRNA. Na primer, SEQ ID NO 1 je sekvenca od 19 nukleotida; siRNA može uključivati dvolančani region od 19 bp preko ovog dela identičnosti sekvence, i dodatne dinukleotidne prepuste.
[0132] Poželjni primer izvođenja različitih aspekata predmetne objave označava molekule siRNA koji ciljno deluju na najmanje jednu sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO. 9, pri čemu je svaki lanac dvolančanih molekula siRNA dugačak oko 18 do oko 28 ili više (npr. oko 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28 ili više) nukleotida.
[0133] Sledeći poželjni primer izvođenja različitih aspekata predmetne objave označava molekule siRNA dužine 18-28 nukleotida ili više, koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 10 do SEQ ID NO. 18. Poželjnije, dvolančani molekuli siRNA su dugački najmanje 19 nukleotida i odabrani su iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO.10 do SEQ ID NO.18.
[0134] Sledeći alternativni primer izvođenja različitih aspekata predmetne objave obezbeđuje molekule sa tupim krajevima.
[0135] Dodatno, poželjni primer izvođenja predmetne objave odnosi se na siRNA koja sadrži ili se sastoji od dvolančane strukture od 19 nukleotida koja ciljno deluje na najmanje jednu sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO. 9. Poželjnije, siRNA sadrži ili se sastoji od dvolančane strukture od 19 nukleotida koja ciljno deluje na najmanje jednu sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO.1 do SEQ ID NO.9, a još poželjnije koja ciljno deluje na SEQ ID NO.1.
[0136] Poseban primer izvođenja predmetne objave odnosi se na dvolančanu siRNA od 19 nukleotida sa tupim krajevima koja je usmerena prema najmanje jednoj sekvenci koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO. 9. Poželjnije, siRNA je usmerena prema najmanje jednoj sekvenci koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO. 9, a još poželjnije siRNA je usmerena prema SEQ ID NO. 1. U dodatnom posebnom primeru izvođenja, ovo jedinjenje sadrži ili se sastoji od najmanje jedne
[0139] 1
[0140] sekvence koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 10 do SEQ ID NO. 18. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, antisens lanac ove siRNA je najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, komplementaran najmanje jednoj sekvenci koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO.1 do SEQ ID NO.9.
[0141] U poželjnom primeru izvođenja, ovo jedinjenje sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO.10 do SEQ ID NO.18.
[0142] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, ovo jedinjenje sadrži ili se sastoji od sens lanca koji sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 10 do SEQ ID NO. 18, i antisens lanca koji je komplementaran sens lancu.
[0143] U poželjnijem primeru izvođenja, ovo jedinjenje sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO.
[0144] 10 (5’‑CACCAGGACAUCGUGCUCU‑3’ sens lanac i 5’‑AGAGCACGAUGUCCUGGUG‑3’ antisens lanac), što odgovara našem referentnom jedinjenju pod nazivom SYL136001.
[0145] Štaviše, kao što je opisano u odeljku pod nazivom „Pozadina pronalaska“, važan problem sa molekulima siRNA je njihova nestabilnost u biološkim tečnostima usled sveprisutne prirode RNaza. Shodno tome, opisana je upotreba mnogih različitih hemijskih modifikacija nukleotida sa ciljem poboljšanja stabilnosti jedinjenja.
[0146] Sledeći inherentni problem molekula siRNA je njihova imunogenost, pri čemu je pronađeno da siRNA indukuju nespecifičnu aktivaciju urođenog imunskog sistema, uključujući povećanje ekspresije određenih citokina, npr. interferona tipa I i/ili tipa II, kao i proizvodnje IL-12, IL-6 i/ili TNF-alfa. Smatra se da je poreklo ovih efekata aktivacija Tollsličnih receptora kao što su TLR7, TLR8 i/ili TLR3 od strane siRNA.
[0147] Oba ova efekta, prepoznavanje od strane RNaza i imunogenost, takođe su opisana kao zavisna od sekvence.
[0148] Neke od hemijskih modifikacija koje poboljšavaju stabilnost jedinjenja smanjenjem podložnosti na RNaze takođe su u stanju da redukuju indukciju imunskog prepoznavanja i shodno tome redukuju naknadni imunski odgovor. Međutim, insercija hemijski modifikovanih nukleotida u siRNA takođe može rezultovati smanjenjem efikasnosti utišavanja kao što je opisano u prethodnom odeljku, i dakle mora joj se pristupiti sa oprezom.
[0149] Shodno tome, u poželjnom primeru izvođenja različitih aspekata predmetne objave, siRNA dodatno sadrži najmanje jedan nukleotid sa hemijskom modifikacijom.
[0150] Poželjne hemijske modifikacije koje poboljšavaju stabilnost i redukuju imunogene efekte uključuju 2’-O-metil nukleotide, 2’-fluoro nukleotide, 2’-amino nukleotide, 2’-dezoksi
[0153] 1
[0154] nukleotide, ili nukleotide koji sadrže 2’-O ili 4’-C metilenske mostove. Druge poželjne hemijske modifikacije za zaštitu od egzonukleaze uključuju ExoEndoLight obrazac modifikacije (EEL): modifikacija svih pirimidina u sens lancu u 2’-O-metil ostatke, i modifikacija svih pirimidina u 5’-UA‑3’ ili 5’-CA‑3’ motivu u antisens lancu u 2’-O-metil ostatke. Pored toga, pozicija 1 sens lanca takođe se može promeniti u 2’-O-metil kako bi se sprečila 5’-fosforilacija sens lanca i time povećala specifičnost lanca siRNA. Pored toga, sens lanac može takođe uključivati 2’-O-metil modifikaciju na poziciji 14, pošto 2’-O-Me ostaci na ovoj poziciji inaktiviraju sens lanac i prema tome povećavaju specifičnost lanca siRNA. Pored toga, druge poželjne hemijske modifikacije za zaštitu od nukleaza uključuju metilfluoro obrazac modifikacije (MEF): naizmenične 2’-fluoro i 2’-O-metil modifikacije počevši (5’-kraj) sa 2’-F na sens lancu i počevši sa 2’-O-Me na antisens lancu. Pored toga, pozicija 1 sens lanca takođe se može promeniti u 2’-O-Me i pozicija 1 antisens lanca u 2’-F (pošto su 2’F ostaci kompatibilni sa 5’-fosforilacijom, dok su 2’O-Me ostaci glomazni i generalno slabe fosforilaciju). Ovaj obrazac modifikacije ne samo da stabilizuje molekul, već i onemogućava sposobnost RISC da upotrebljava sens lanac stoga promovišući specifičnost lanca. Takođe, modifikacija ribonukleotidne okosnice može se izvesti vezivanjem nukleotida upotrebom fosforotioatnih veza umesto fosfodiestarskih veza. Dodatna poželjna hemijska modifikacija unutar značenja predmetnog pronalaska odnosi se na: 4'-tioribozu, 5-propiniluracil 3', 5'-metiluridin ili supstituciju uracil ribonukleotida dezoksitimidinom (dezoksiribonukleotidi). U sledećem poželjnom primeru izvođenja predmetne objave, najmanje jedan hemijski modifikovani nukleotid i/ili najmanje jedna hemijska modifikacija u ribonukleotidnoj okosnici je na sens lancu, na antisens lancu ili na oba lanca siRNA.
[0155] U skladu sa tim, u jednom primeru izvođenja, siRNA sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence sa sens lancem i/ili antisens lancem koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO.19 do SEQ ID NO.66.
[0156] U poželjnom primeru izvođenja, siRNA sadrži ili se sastoji od sens lanca koji sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO.21, SEQ ID NO.23, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.31, SEQ ID NO.33, SEQ ID NO.35, SEQ ID NO.37, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO.43, SEQ ID NO.45, SEQ ID NO.47, SEQ ID NO.49, SEQ ID NO.51, SEQ ID NO.53, SEQ ID NO.55, SEQ ID NO.57, SEQ ID NO.59, SEQ ID NO.61, SEQ ID NO. 63 i SEQ ID NO.65, i antisens lanca koji je komplementaran sens lancu koji je odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO.
[0157] 26, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 36,
[0160] 1
[0161] SEQ ID NO.38, SEQ ID NO.40, SEQ ID NO.42, SEQ ID NO.44, SEQ ID NO.46, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO.50, SEQ ID NO.52, SEQ ID NO.54, SEQ ID NO.56, SEQ ID NO.58, SEQ ID NO.60, SEQ ID NO.62, SEQ ID NO.64 i SEQ ID NO.66, respektivno.
[0162] Molekuli siRNA kao što je prethodno opisano mogu se isporučiti u unutrašnjost ćelije u svojoj nativnoj strukturi upotrebom postupaka koji su poznati u struci. Na primer, kada se proučava utišavanje gena in vitro, ova jedinjenja se primenjuju upotrebom standardnih reagenasa za transfekciju. Kako bi se postigli efekti in vivo, ova jedinjenja se takođe mogu primenjivati gola ili upotrebom agenasa za poboljšanje isporuke, kao što su na primer lipozomi, konjugacija sa specifičnom funkcionalnom grupom, itd. iako su u struci poznate mnoge različite alternative, koje se upotrebljavaju različito u zavisnosti od željenog ciljnog mesta unutar tela.
[0163] Alternativno, molekuli siRNA iz različitih aspekata objave mogu se eksprimirati unutar ćelija iz eukariotskih promotora. Rekombinantni vektori sposobni da eksprimiraju molekule siRNA mogu se isporučiti i perzistirati u ciljnim ćelijama. Alternativno, mogu se upotrebljavati vektori koji obezbeđuju prolaznu ekspresiju molekula nukleinskih kiselina. Takvi vektori se mogu primenjivati više puta po potrebi. Jednom eksprimiran, molekul siRNA interaguje sa ciljnom iRNK i generiše RNK interferirajući odgovor. Molekuli siRNA koji su proizvedeni na ovaj način se često nazivaju shRNA (RNK sa kratkom ukosnicom), pošto su njeni sens i antisens lanci spojeni malom petljom nukleotida.
[0164] Dodatni aspekt objave odnosi se na upotrebu siRNA koja ciljno deluje na najmanje jednu sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO.9 u pripremi medikamenta za upotrebu u postupku lečenja bolesti mrežnjače koju karakteriše povećana ekspresija i/ili aktivnost NRARP. Poželjnije, navedena sekvenca je SEQ ID NO. 1. Postupak sadrži inhibiranje ekspresije NRARP kod pacijenta. Termin inhibicija se upotrebljava da ukaže na smanjenje ili umanjenje ekspresije ili aktivnosti. Bolest mrežnjače je bolest ili poremećaj koji je povezan sa neovaskularizacijom. U jednom primeru izvođenja, stanje oka je odabrano iz grupe koja sadrži makularnu degeneraciju koja je povezana sa starenjem (AMD), ishemijsku retinopatiju, dijabetički makularni edem (DME), proliferativnu dijabetičku retinopatiju (PDR), dijabetičku ishemiju mrežnjače (DRI), dijabetički edem mrežnjače (DRE), miopijsku neovaskularizaciju sudovnjače (takođe se često označava kao subretinalna neovaskularizacija, Fuksova (Fuchs’) mrlja ili Forster-Fuksova mrlja mrežnjače, i diskformna degeneracija kod patološke miopije) i retinopatiju prevremeno rođenih (ROP) i njihove kombinacije.
[0167] 2
[0168] Ovde je takođe objavljen postupak lečenja bolesti mrežnjače koju karakteriše povećana ekspresija i/ili aktivnost NRARP. Postupak sadrži inhibiranje ekspresije NRARP kod pacijenta. Postupak može sadržati primenu siRNA koja ciljno deluje na najmanje jednu sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO. 9. Poželjnije, navedena sekvenca je SEQ ID NO.1.
[0169] Očekuje se da će terapijsko lečenje sa siRNA usmerenim prema iRNK NRARP biti korisnije u odnosu na tradicionalne antiangiogene terapijske agense usled svoje specifičnosti, stabilnosti, potentnosti, prirodnog mehanizma delovanja, i uniformne hemijske prirode sa drugim siRNA agensima koji ciljno deluju na iste ili različite genske ciljeve, pošto se razlikuju samo u nukleotidnoj sekvenci. Lečenja koja su zasnovana na siRNA blokiraju sintezu ciljnog proteina što će izazvati održivu redukciju ekspresije NRARP gena i dugotrajniji efekat koji može izbeći posledice intravitrealne injekcije. Ovo je naročito važno u slučajevima kao što su bolest ili poremećaj koji je povezan sa neovaskularizacijom, koji sadrže ali nisu ograničeni na makularnu degeneraciju koja je povezana sa starenjem (AMD), ishemijsku retinopatiju, dijabetički makularni edem (DME), proliferativnu dijabetičku retinopatiju (PDR), dijabetičku ishemiju mrežnjače (DRI), dijabetički edem mrežnjače (DRE), miopijsku neovaskularizaciju i retinopatiju prevremeno rođenih (ROP), pošto su to često hronična stanja koja zahtevaju brojne intravitrealne injekcije tokom lečenja. Ponavljajuće intraokularne injekcije povećavaju rizik od štetnih sporednih efekata koji uključuju, između ostalog, povećan pritisak u oku, inflamaciju, krvarenje, infekciju, oštećenje mrežnjače ili okolnih nerava ili struktura, gubitak vida, ali i sporedne efekte lekova koji se upotrebljavaju tokom procedure, kao što su oni koji nastaju upotrebom antibiotika ili lekova za širenje zenica. Pored toga, siRNA se mogu projektovati tako da utišaju ekspresiju mutantnih alela gena koji se razlikuju od alela divljeg tipa za samo jedan nukleotid. Stoga, lečenja zasnovana na siRNA mogu povoljno modulirati ekspresiju gena koji imaju tačkaste mutacije kako bi usporila ili čak sprečila bolest, selektivnim inaktiviranjem mutantnih alela bolesti, dok istovremeno omogućavaju kontinuiranu ekspresiju proteina divljeg tipa.
[0170] Imajući u vidu pripremu takvog medikamenta, siRNA iz različitih aspekata predmetne objave može se formulisati kao farmaceutska kompozicija. Kompozicije i formulacije navedenih siRNA formulisane su za topikalnu primenu na površinu rožnjače oka. Primena na površinu rožnjače može, na primer, biti u obliku kapi za oči, gela, losiona, kreme ili očnih uložaka. Drugi oblici primene u oko mogu uključivati injekciju u oko.
[0171] [0064] Dodatni poželjni primer izvođenja različitih aspekata predmetne objave odnosi se na siRNA koja specifično ciljno deluje na najmanje jednu sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO. 9, kao što je opisano u prethodnim paragrafima, za upotrebu kao medikament za lečenje bolesti mrežnjače koju karakteriše povećana ekspresija i/ili aktivnost NRARP. Poželjnije, navedena sekvenca je SEQ ID NO. 1. Kao što je prethodno opisano, to može biti siRNA koja sadrži ili se sastoji od dvolančane strukture od 19 nukleotida koja ciljno deluje na najmanje jednu sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO. 9. Ova siRNA može biti sa tupim krajevima. Poželjno, siRNA sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 10 do SEQ ID NO. 18. Druga siRNA za upotrebu u skladu sa pronalaskom sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence sa sens lancem i/ili antisens lancem koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO.19 do SEQ ID NO.
[0172] 66.
[0173] Unutar konteksta predmetne objave, kako bi se „specifično ciljala“ sekvenca, siRNA iz objave poželjno sadrži najmanje istu seed sekvencu. Stoga, bilo koja sekvenca u skladu sa objavom koja specifično cilja najmanje jednu sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO. 9 poželjno je identična u pozicijama 2-8 antisens lanca. Poželjnije, navedena odabrana sekvenca koja se specifično cilja je SEQ ID NO.1.
[0174] Molekul siRNA može da sadrži vehikulum za isporuku, uključujući lipozome, za primenu subjektu. Nosači i razblaživači i njihove soli mogu biti prisutni u farmaceutski prihvatljivim formulacijama. Molekuli nukleinskih kiselina mogu se primenjivati u ćelije različitim postupcima koji su poznati onima sa iskustvom u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, enkapsulaciju u lipozome, jontoforezom, ili inkorporacijom u druge vehikulume, kao što su biorazgradivi polimeri, hidrogelovi, ciklodekstrini poli(mlečne-koglikolne) kiseline (PLGA) i PLCA mikrosfere, biorazgradive nanokapsule, i bioadhezivne mikrosfere, ili proteinskim vektorima. Komponente unutarćelijske isporuke mogu biti i virusne komponente koje uključuju, ali nisu ograničene na, fuzogeni virusni peptid za narušavanje endozoma, omogućavajući nukleinskoj kiselini da izbegne lizozomsku degradaciju, virusne proteine za održavanje ekspresije (npr. integraza, LTR elementi, rep proteini, oriP i EBNA‑1 proteini) ili virusne komponente koje interaguju sa proteinima na površini ćelije. Pogodne virusne komponente za unutarćelijsku isporuku uključuju, ali nisu ograničene na, retroviruse, herpes simpleks viruse, adenoviruse i poželjno adeno-asocirane viruse (AAV). U jednom primeru izvođenja, molekul siRNA se isporučuje preko ćelijski specifičnog nosača siRNA koji kombinuje komponente virusa i lipozoma. U sledećem primeru izvođenja, molekuli nukleinske kiseline iz objave mogu se takođe formulisati ili kompleksirati sa polietileniminom i njegovim derivatima, kao što su derivati polietileniminpolietilenglikol-N-acetilgalaktozamina (PEI-PEG-GAL) ili polietilenimin-polietilenglikol-tri-N-acetilgalaktozamina (PEI-PEG-triGAL). Poželjne kompozicije iz objave su vodeni rastvori, specifično fiziološki rastvori kao što je fosfatom puferisani fiziološki rastvor (PBS) sa pH opsegom od oko 7,0 do oko 7,4, poželjno sa pH od 7,2 0,5.
[0175] Molekul siRNA iz objave može biti kompleksiran sa agensima koji narušavaju membranu i/ili katjonskim lipidom ili molekulom pomoćničkog lipida.
[0176] Sistemi za isporuku koji se mogu upotrebljavati sa objavom uključuju, na primer, vodene i nevodene gelove, kreme, višestruke emulzije, mikroemulzije, lipozome, masti, vodene i nevodene rastvore, losione, aerosole, ugljovodonične baze i prahove, i mogu sadržati ekscipijense kao što su solubilizatori, pojačivači permeacije (npr. masne kiseline, estri masnih kiselina, masni alkoholi i aminokiseline), i hidrofilni polimeri (npr. polikarbofil i polivinilpirolidon). U jednom primeru izvođenja, farmaceutski prihvatljiv nosač je lipozom ili transdermalni pojačivač.
[0177] Farmaceutska formulacija iz objave je u obliku koji je pogodan za topikalnu primenu na površinu rožnjače oka.
[0178] Drugi faktori su poznati u struci, i uključuju razmatranja kao što su toksičnost i oblike koji sprečavaju da kompozicija ili formulacija ispolji svoj efekat.
[0179] Predmetna objava takođe uključuje kompozicije koje su pripremljene za skladištenje ili primenu koje uključuju farmaceutski efikasnu količinu željenih jedinjenja u farmaceutski prihvatljivom nosaču ili razblaživaču. Prihvatljivi nosači ili razblaživači za terapijsku upotrebu su dobro poznati u farmaceutskoj struci. Na primer, mogu se obezbediti konzervansi, stabilizatori, boje i agensi za poboljšanje ukusa. Oni uključuju natrijum benzoat, sorbinsku kiselinu i estre p-hidroksibenzoeve kiseline. Pored toga, mogu se upotrebljavati antioksidansi i agensi za suspendovanje.
[0180] Farmaceutski efikasna doza je ona doza koja je potrebna za sprečavanje, inhibiranje pojave, ili lečenje (ublažavanje simptoma do neke mere, poželjno svih simptoma) bolesnog stanja. Farmaceutski efikasna doza generalno zavisi od tipa bolesti, kompozicije koja se upotrebljava, puta primene, tipa sisara koji se leči, fizičkih karakteristika određenog sisara koji se razmatra, istovremene medikacije, i drugih faktora koje će oni sa iskustvom u medicinskoj struci prepoznati.
[0181] Terapijski efikasna količina može takođe označavati količinu siRNA koja je dovoljna da odloži ili minimalizuje početak bolesti mrežnjače koja je povezana sa neovaskularizacijom sudovnjače ili mrežnjače. Terapijski efikasna količina može takođe označavati količinu terapijskog agensa koja obezbeđuje terapijsku korist u lečenju ili upravljanju poremećajem
[0184] 2
[0185] oka koji je povezan sa neovaskularizacijom sudovnjače ili mrežnjače. Dodatno, terapijski efikasna količina u odnosu na siRNA iz objave znači tu količinu terapijskog agensa samog, ili u kombinaciji sa drugim terapijama, koja obezbeđuje terapijsku korist u lečenju ili upravljanju poremećajem mrežnjače koji je povezan sa neovaskularizacijom, poželjno sudovnjače ili mrežnjače. Upotrebljen u vezi sa količinom siRNA iz pronalaska, termin može obuhvatiti količinu koja poboljšava ukupnu terapiju, redukuje ili izbegava neželjene efekte, ili poboljšava terapijsku efikasnost ili sinergizira sa drugim terapijskim agensom.
[0186] Terapijska korist u lečenju ili upravljanju poremećajem oka koji je povezan sa neovaskularizacijom jeste održivo smanjenje neovaskularizacije. S obzirom na to da će siRNA smanjiti nivoe NRARP unutar ćelije, kada se lečenje prekine, ćelija mora da resintetiše nove proteine. Kao takve, terapije zasnovane na siRNA lečenjima imaće održiviji efekat od onog koji bi se mogao očekivati upotrebom malih molekula dizajniranih za inhibiranje NRARP ili blokiranje funkcije VEGF receptora ili drugog proteina koji je povezan sa neovaskularizacijom. Ovo se smatra značajnim poboljšanjem terapijske efikasnosti.
[0187] Dodatna prednost upotrebe siRNA je minimalna verovatnoća sporednih efekata ili toksičnosti koje proizilaze iz njenog prisustva u sistemskoj cirkulaciji, koji su često povezani sa nekoliko lečenja zasnovanih na kapima za oči. To je usled činjenice da kada jedinjenje uđe u krvotok, brzo će biti degradovano pomoću RNaza koje su prisutne u krvi.
[0188] S druge strane, činjenica da se molekul siRNA može prodavati u bočicama sa jednom dozom znači da se može izbeći dodavanje antimikrobnih konzervanasa u formulaciju. Ovi konzervansi mogu proizvesti netoleranciju kod nekih pacijenata, što čini neophodnim da se lečenje prekine.
[0189] Put primene je topikalni, instilacijom direktno u oko, poželjno upotrebom kapi za oči. Uzimajući u obzir da se velika većina trenutno odobrenih lekova za lečenje bolesti mrežnjače isporučuje intravitrealnom injekcijom, očekuje se da će se poboljšati i kvalitet života pacijenata, pošto kapi za oči uzrokuju manju nelagodnost i imaju manje sporednih efekata od intravitrealnih injekcija.
[0190] [0078] Precizna doza i raspored primene koji će se koristiti u formulaciji takođe će zavisiti od puta primene. Osoba sa iskustvom će razumeti da precizna doza i raspored primene koji će se koristiti takođe zavise od ozbiljnosti poremećaja, i treba ih odrediti u skladu sa procenom postupajućeg lekara i okolnostima svakog pacijenta. Takođe se razume da specifičan nivo doze za bilo kog određenog subjekta zavisi od različitih faktora, uključujući aktivnost specifičnog jedinjenja koje se koristi, starost, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol, ishranu, vreme primene, put primene, i stopu ekskrecije, kombinaciju lekova i ozbiljnost određene bolesti koja se podvrgava terapiji.
[0191] Formulacije ili siRNA koje su ovde opisane mogu se primenjivati u formulacijama jediničnih doza koje sadrže konvencionalne netoksične farmaceutski prihvatljive nosače, adjuvanse i/ili vehikulume.
[0192] Vodene suspenzije sadrže aktivne materijale u smeši sa ekscipijensima koji su pogodni za proizvodnju vodenih suspenzija. Takvi ekscipijensi su agensi za suspendovanje, na primer natrijum karboksimetilceluloza, metilceluloza, hidropropil-metilceluloza, natrijum alginat, polivinilpirolidon, tragakant guma i guma akacija; agensi za disperziju ili vlaženje mogu biti fosfatid koji se javlja u prirodi, na primer lecitin, ili proizvodi kondenzacije alkilen oksida sa masnim kiselinama, na primer polioksietilen stearat, ili proizvodi kondenzacije etilen oksida sa alifatičnim alkoholima dugog lanca, na primer heptadekaetilenoksicetanol, ili proizvodi kondenzacije etilen oksida sa parcijalnim estrima poreklom iz masnih kiselina i heksitola kao što je polioksietilen sorbitol monooleat, ili proizvodi kondenzacije etilen oksida sa parcijalnim estrima poreklom iz masnih kiselina i heksitol anhidrida, na primer polietilen sorbitan monooleat. Vodene suspenzije takođe mogu sadržati jedan ili više konzervanasa, na primer etil, ili n-propil p-hidroksibenzoat, ili jedno ili više sredstava za bojenje. Uljane suspenzije mogu se formulisati suspendovanjem aktivnih sastojaka u biljnom ulju, na primer ulju kikirikija, maslinovom ulju, susamovom ulju ili kokosovom ulju, ili u mineralnom ulju kao što je tečni parafin. Uljane suspenzije mogu sadržati agens za zgušnjavanje, na primer pčelinji vosak, čvrsti parafin ili cetil alkohol. Ove kompozicije se mogu konzervirati dodatkom antioksidansa kao što je askorbinska kiselina.
[0193] Disperzibilni prahovi i granule koji su pogodni za pripremu vodene suspenzije dodavanjem vode obezbeđuju aktivni sastojak u smeši sa agensom za dispergovanje ili vlaženje, agensom za suspendovanje i jednim ili više konzervanasa. Pogodni agensi za dispergovanje ili vlaženje ili agensi za suspendovanje mogu biti oni koji su već prethodno pomenuti. Mogu biti prisutni i dodatni ekscipijensi, na primer agensi za bojenje.
[0194] Farmaceutske kompozicije takođe mogu biti u obliku ulje-u-vodi emulzija. Uljana faza može biti biljno ulje ili mineralno ulje ili njihove smeše. Pogodni emulgatori mogu biti gume koje se javljaju u prirodi, na primer guma akacija ili tragakant guma, fosfatidi koji se javljaju u prirodi, na primer soja, lecitin, i estri ili parcijalni estri poreklom iz masnih kiselina i heksitola, anhidridi, na primer sorbitan monooleat, i proizvodi kondenzacije navedenih parcijalnih estara sa etilen oksidom, na primer polioksietilen sorbitan monooleat. Takve formulacije mogu takođe sadržati demulcent, konzervans i agens za bojenje. Farmaceutske
[0197] 2
[0198] kompozicije ili siRNA koje su ovde opisane mogu biti u obliku sterilne vodene ili uljane suspenzije.
[0199] Ova suspenzija se može formulisati u skladu sa onim što je poznato u struci upotrebom onih pogodnih agenasa za dispergovanje ili vlaženje i agenasa za suspendovanje koji su prethodno pomenuti.
[0200] Sterilni preparat može biti i sterilni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču, na primer kao rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim vehikulumima i rastvaračima koji se mogu koristiti su voda, Ringerov (Ringer’s) rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, sterilna, fiksna ulja se konvencionalno koriste kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U tu svrhu, može se koristiti bilo koje blago fiksno ulje, uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Pored toga, masne kiseline kao što je oleinska kiselina nalaze upotrebu u pripremi rastvora.
[0201] U poželjnim primerima izvođenja, kompozicije iz objave formulišu se u rastvoru, poželjno puferisanom fiziološkom rastvoru kao što je PBS, ili gelu za topikalnu primenu u oko, kao što je, na primer, u obliku kapi za oči. U takvim primerima izvođenja, formulacije mogu biti katjonske emulzije i/ili sadržati biopolimere, uključujući, ali ne ograničavajući se na, poli(laktid-ko-glikolid), karbopol, hijaluronsku kiselinu i poliakrilnu kiselinu.
[0202] Molekuli nukleinskih kiselina iz objave mogu se primenjivati parenteralno u sterilnom medijumu. Lek, u zavisnosti od upotrebljenog vehikuluma i koncentracije, može biti suspendovan ili rastvoren u vehikulumu. Pogodno je što se adjuvansi kao što su lokalni anestetici, konzervansi i puferi mogu rastvoriti u vehikulumu.
[0203] Kao takav, dodatni poželjni primer izvođenja iz predmetne objave odnosi se na farmaceutsku kompoziciju pri čemu navedena kompozicija sadrži najmanje jednu siRNA koja ciljno deluje na najmanje jednu sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 1 do SEQ ID NO. 9, kao što je opisano u prethodnim paragrafima. Poželjnije, navedena sekvenca je SEQ ID NO. 1.
[0204] Molekuli nukleinskih kiselina iz predmetne objave mogu se takođe primenjivati subjektu u kombinaciji sa drugim terapijskim jedinjenjima kako bi se povećao ukupni terapijski efekat. Upotreba više jedinjenja za lečenje indikacije može povećati korisne efekte, a istovremeno redukovati prisustvo sporednih efekata.
[0205] Sledeće definicije su uključene kako bi se olakšalo razumevanje objave.
[0206] Pod „lečiti“ podnosioci prijave misle na medicinsko lečenje. Termin uključuje primenu jedinjenja iz objave radi ublažavanja simptoma bolesti mrežnjače, kao što je smanjenje oštrine vida koje prati makularnu degeneraciju, kao i radi obraćanja pažnje na
[0209] 2
[0210] fiziološke promene koje su povezane sa bolešću, kao što je abnormalni rast krvnih sudova koji prati to stanje.
[0211] Termin „bolest mrežnjače“ znači bilo koju bolest kod koje je mrežnjača pogođena usled višestrukih i različitih etiologija.
[0212] Termin „vaskularizacija“ označava proces formiranja funkcionalnih mikrovaskularnih mreža sa perfuzijom crvenih krvnih zrnaca.
[0213] Termin „angiogeneza“ označava izbočinu i izrastanje kapilarnih pupoljaka i ogranaka iz već postojećih krvnih sudova.
[0214] Termin „neovaskularizacija mrežnjače (RNV)“ označava grananje novih krvnih sudova u mrežnjači.
[0215] Termin „neovaskularizacija sudovnjače (CNV)“ označava grananje novih krvnih sudova iz vaskulature sudovnjače.
[0216] Termin „bolest ili poremećaj koji je povezan sa neovaskularizacijom“ odnosi se na bilo koju bolest ili poremećaj koji generiše prethodno pomenute patološke nove krvne sudove. Za takvu bolest ili poremećaj, mogu se pomenuti ali nisu ograničeni na njih, makularna degeneracija koja je povezana sa starenjem (AMD), ishemijska retinopatija, dijabetički makularni edem (DME), proliferativna dijabetička retinopatija (PDR), dijabetička ishemija mrežnjače (DRI), dijabetički edem mrežnjače (DRE), miopijska neovaskularizacija, okluzija centralne vene mrežnjače (CRVO) i retinopatije prevremeno rođenih (ROP), između ostalih. Druge očne bolesti ili poremećaji koji su povezani sa neovaskularizacijom uključuju, na primer, neovaskularizaciju irisa (Rubeosis iridis) i neovaskularizaciju rožnjače (CN). Neovaskularizacija irisa je često povezana sa dijabetesom, retinoblastomom, okluzijom centralne vene mrežnjače, očnim ishemijskim sindromom ili hroničnim odvajanjem mrežnjače. Neovaskularizacija rožnjače je često uzrokovana nošenjem kontaktnih sočiva, mada je takođe povezana sa inflamacijom kao rezultatom traume ili povrede, kao i sa blefaritisom, uveitisom, ili keratitisom, čirevima rožnjače, glaukomom i drugim bolestima očne površine kao što su rozacea ili lupus.
[0217] Makularna degeneracija, takođe se označava kao makularna degeneracija koja je povezana sa starenjem (AMD), najčešći je uzrok gubitka vida u Sjedinjenim Državama kod osoba starijih od 50 godina, a njena prevalencija se povećava sa godinama. Čini se da je osnovni uzrok AMD akumulacija rezidualnog materijala koji je proizveden procesom obnove spoljašnjeg dela fotoreceptora mrežnjače u pigmentnom epitelu mrežnjače (RPE). Akumulacija ovog nedegradovanog materijala, poznatog kao druze, u RPE, dovodi do proizvodnje inflamatornih medijatora koji uzrokuju degeneraciju fotoreceptora u centralnoj
[0220] 2
[0221] mrežnjači, ili makuli (Bird AC, 2010). Centar makule, nazvan fovea, posreduje u visokoj oštrini vida; dakle njena degeneracija uzrokuje težak gubitak vida. U ranim fazama bolesti, akumulacije druza su male i često se uočavaju zajedno sa hipo- ili hiperpigmentacijom RPE. Kako bolest napreduje, povećavaju se i veličina i količina druza. AMD se klasifikuje kao vlažna (neovaskularna) ili suva (ne-neovaskularna). Suvi oblik bolesti je najčešći. Javlja se kada centralna mrežnjača postane iskrivljena, pigmentisana, ili najčešće istanjena, proces koji je povezan sa atrofijom pigmentnog epitela mrežnjače i gubitkom makularnih fotoreceptora. Rezultat je centralna geografska atrofija. Vlažni oblik bolesti je teži od suvog oblika i dovodi do teškog gubitka vida. Vlažni oblik je uobičajeno povezan sa starenjem, ali druge bolesti koje mogu uzrokovati vlažnu makularnu degeneraciju uključuju tešku miopiju i neke intraokularne infekcije kao što je histoplazmoza, koja se može pogoršati kod osoba sa AIDS. Vlažni oblik se karakteriše abnormalnim krvnim sudovima koji rastu kroz pigmentni epitel mrežnjače, što rezultuje krvarenjem, eksudacijom, ožiljcima, ili odvajanjem mrežnjače.
[0222] Ishemijska retinopatija je uobičajena komponenta patogeneze i CNV i RNV. Ishemija uzrokuje ćelijsku hipoksiju, koja aktivira ćelijske signalne puteve kako bi se povećala ekspresija angiogenih stimulatora, kao što je faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF). VEGF je sekretovani glikoprotein sa potentnom proangiogenom aktivnošću. VEGF se vezuje za VEGF receptore (VEGFR) na endotelnim ćelijama kako bi stimulisao proliferaciju i migraciju ćelija. Brojne studije su pokazale da je VEGF pojačano eksprimiran tokom patogeneze CNV i RNV, i da je VEGF ključni medijator patogeneze CNV i RNV.
[0223] Dijabetička retinopatija (DR) ostaje vodeći uzrok slepila u razvijenim zemljama među pojedincima koji su u radno aktivnom dobu. Dok je proliferativna dijabetička retinopatija (PDR) najčešća lezija koja ugrožava vid kod dijabetesa tipa 1, dijabetički makularni edem (DME) je primarni uzrok loše oštrine vida kod dijabetesa tipa 2. Zbog visoke prevalencije dijabetesa tipa 2, DME je glavni uzrok oštećenja vida kod pacijenata sa dijabetesom. U velikoj populacionoj studiji, incidenca DME tokom perioda od 10 godina bila je 20% kod pacijenata sa dijabetesom tipa 1, dok je ova stopa bila skoro 40% kod pacijenata sa dijabetesom tipa 2. Pored toga, DME je gotovo uvek prisutan kada se PDR detektuje kod pacijenata sa dijabetesom tipa 2. Neovaskularizacija usled teške hipoksije je obeležje PDR, dok je vaskularno curenje usled raspada BRB glavni događaj uključen u patogenezu DME.
[0224] Retinopatija prevremeno rođenih (ROP) se javlja kod prevremeno rođene dece koja su izložena relativnoj hiperoksiji pre nego što se završi angiogena faza razvića mrežnjače. Ovo je problematično, pošto je angiogena faza razvića mrežnjače normalno vođena hipoksijom u materici. Stoga je normalno angiogeno razviće mrežnjače poremećeno kod ROP, što uzrokuje
[0227] 2
[0228] vazo-obliteraciju i formiranje uglavnom avaskularne mrežnjače. U odsustvu adekvatnog snabdevanja krvlju, avaskularna mrežnjača je ishemijska, što podstiče destruktivnu RNV, i može dovesti do odvajanja mrežnjače i formiranja ožiljačnog tkiva, što rezultuje trajnim gubitkom vida.
[0229] Termin „pacijent“, kao što se ovde upotrebljava, označava životinje, uključujući sisare, poželjno ljude.
[0230] Pronalazak je dodatno opisan u sledećim neograničavajućim primerima.
[0232] PRIMERI
[0234] 1. In vitro analiza
[0236] 1.1. Nivoi ekspresije gena NRARP posle transfekcije SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO.12 i SEQ ID NO. 13.
[0238] Humane HeLa ćelije su transfektovane sa 100 nM jedne dsRNA od 19 bp sa tupim krajevima koja se sastoji od sens lanca koji se sastoji od jedne od sledećih sekvenci SEQ ID NO. 10 (SYL136001), SEQ ID NO. 11 (SYL136005), SEQ ID NO. 12 (SYL136003), i SEQ ID NO. 13 (SYL136004), zajedno sa komplementarnim antisens lancem, sa Lipofectamine 2000 kao agensom za transfektovanje. SYL referenca posle svakog SEQ ID NO. označava referencu za dsRNA jedinjenje. Treba napomenuti da u svim ovim primerima (osim ukoliko kontekst ne ukazuje drugačije), tamo gde se poziva na primenu ili transfekciju određene SEQ ID NO, to ukazuje da je primenjena ili transfektovana dsRNA od 19 bp koja se sastoji od sens lanca koji se sastoji od SEQ ID NO, i komplementarnog antisens lanca kao što je naznačeno na Slikama 2 i 3. Sve transfekcije su izvedene prateći standardna uputstva proizvođača. U istom eksperimentu upotrebljena je skremblovana sekvenca siRNA kao kontrola specifičnosti interferencije. Ćelijski peleti su sakupljeni i obrađeni kako bi se procenile moguće varijacije nivoa iRNK kao posledica mehanizma delovanja siRNA. Nivoi RNK su kvantifikovani pomoću PCR u realnom vremenu upotrebom postupka relativne kvantifikacije, postupka uporednog praga 2<-ΔΔCT>{Livak and Schmittgen, 2001}. Svi eksperimenti kvantitativne PCR u realnom vremenu izvedeni su u triplikatu i ponovljeni u tri nezavisna eksperimenta. Srednja vrednost i SEM su izračunate i predstavljene su na slikama. Kao što Slika 4 pokazuje, nivoi iRNK NRARP značajno su smanjeni (50‑60%) u humanim HeLa ćelijama kao odgovor na transfekciju SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, i SEQ ID NO. 13 u tri
[0241] 2
[0242] proučavane vremenske tačke. Kao što se i očekivalo, skremblovana sekvenca siRNA nije modulirala nivoe ekspresije NRARP ni u jednoj od proučavanih vremenskih tačaka.
[0244] 1.2 Ćelijska vijabilnost humanih ćelijskih linija posle transfekcije sa siRNA.
[0246] Kako bi se analizirala ćelijska vijabilnost posle transfekcije siRNA iz predmetne objave, proučavana je in vitro toksičnost posle transfekcije 100 nM jedne od sledećih sekvenci: SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, i SEQ ID NO. 13, sa Lipofectamine 2000 kao agensom za transfektovanje u humane HeLa ćelije. Sve transfekcije su izvedene prateći standardna uputstva proizvođača. U istom eksperimentu, upotrebljena je skremblovana sekvenca siRNA kao kontrola specifičnosti interferencije. Ćelijski peleti su sakupljeni na 24, 48, i 72 sata posle transfekcije i obrađeni kako bi se procenile moguće varijacije vijabilnosti ćelija. Vijabilnost ćelija je izmerena upotrebom CellTiter 96<®>Aqueous Non-Radiactive Cell Proliferation Assay od Promega. Ovaj postupak se zasniva na kapacitetu živih ćelija da redukuju MTS tetrazolijum u formazan. Količina formazana je kvantifikovana merenjem apsorbance na 490 nm. Srednja vrednost i SEM su izračunate i prikazane u grafičkom formatu na Slici 5. Slika 5 pokazuje da nije bilo promena vijabilnosti ćelija kao odgovor na transfekciju bilo koje od sledećih sekvenci: SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, i SEQ ID NO. 13. Ukratko, pronađeno je da su siRNA iz predmetne objave netoksične i da se dobro tolerišu.
[0248] 1.3 Nivoi ekspresije NRARP posle transfekcije nemodifikovane i hemijski modifikovane siRNA u različite ćelijske linije.
[0250] Kako bi se poboljšala stabilnost siRNA iz predmetne objave i kako bi se osiguralo da ne dođe do imunogene aktivacije, različite siRNA-optimizovane hemijske modifikacije introdukovane su u kanonsku SEQ ID NO. 10 sekvencu (SYL136001); stoga su dobijeni sledeći novi hemijski modifikovani entiteti: SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO.
[0251] 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 i SEQ ID NO. 39. Nove hemijski modifikovane sekvence su pojedinačno transfektovane u humane, murinske i pacovske ćelije kako bi se analizirala njihova sposobnost redukovanja nivoa iRNK NRARP. Hemijske modifikacije su detaljno prikazane na Slici 3. Humane HeLa, humane BEAS‑2B i murinske C2C12 ćelije su odabrane zato što ove ćelije eksprimiraju značajne nivoe NRARP i smatraju se dobrim modelima za proučavanje efekta siRNA na ekspresiju NRARP. Ćelije su pojedinačno transfektovane sa 100 nM jedne od sledećih sekvenci: SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO.
[0252] 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 i SEQ ID NO. 39, sa Lipofectamine (HeLa ćelije), Mirus Transit-X2 (BEAS‑2B), Dharmarfect 3 (C2C12) i siPORT NeoFX (ARL6) kao agensima za transfektovanje. Ekspresija gena je analizirana u tri vremenske tačke (24, 48 i 72 sata) nakon transfekcije. Sve transfekcije su izvedene prateći standardna uputstva proizvođača. U istom eksperimentu, upotrebljena je skremblovana sekvenca siRNA kao kontrola specifičnosti interferencije. Nivoi RNK su kvantifikovani pomoću PCR u realnom vremenu upotrebom postupka relativne kvantifikacije, postupka uporednog praga 2<-ΔΔCT>{Livak and Schmittgen, 2001}. Svi eksperimenti kvantitativne PCR u realnom vremenu izvedeni su u triplikatu i ponovljeni u tri nezavisna eksperimenta. Srednja vrednost i SEM su izračunate i prikazane u grafičkom formatu na grafikonima koji su pokazani na Slikama 6‑9. Slika 6 pokazuje rezultate koji su dobijeni u HeLa ćelijama. U ovoj ćelijskoj liniji SEQ ID NO. 10 (SYL136001) redukovala je nivoe iRNK NRARP za 60% 24 sata posle transfekcije i 50% 48 i 72 sata posle transfekcije. Hemijski modifikovana SEQ ID NO. 19 redukovala je nivoe iRNK NRARP za 60% 24 sata posle transfekcije i 40% 48 sati posle transfekcije; 72 sata posle transfekcije bazalni nivoi su potpuno povraćeni. SEQ ID NO. 23 redukovala je nivoe iRNK NRARP za 40% 24‑48 sati posle transfekcije i 10% 72 sata posle transfekcije. SEQ ID NO.25 redukovala je nivoe iRNK NRARP za 50‑60% 24‑48 sati posle transfekcije i 20% 72 sata posle transfekcije. SEQ ID NO. 27 redukovala je nivoe iRNK NRARP za 30% 24‑48 sati posle transfekcije, a bazalni nivoi su povraćeni 72 sata posle transfekcije. SEQ ID NO. 29 je veoma efikasno redukovala nivoe iRNK NRARP. Redukcija od približno 80% uočena je 24‑48 sati posle transfekcije kao odgovor na ovu sekvencu; nakon toga su se nivoi iRNK povećali, ali su i dalje bili 40% ispod bazalnih nivoa 72 sata posle transfekcije. SEQ ID NO. 31 je efikasno redukovala nivoe NRARP, redukcija od 60% u odnosu na bazalne nivoe uočena je u tri proučavane vremenske tačke. SEQ ID NO. 35 redukovala je nivoe iRNK NRARP za 60% 24‑48 sati posle transfekcije; nagli povrat nivoa iRNK pronađen je 72 sata posle transfekcije, stoga su nivoi iRNK NRARP bili 10% ispod bazalnih nivoa. SEQ ID NO.
[0253] 37 je bilo jedinjenje koje je uzrokovalo najveću redukciju nivoa iRNK NRARP. Redukcije od 90%, 80% i 70% uočene su 24, 48 i 72 sata posle transfekcije ovog jedinjenja. SEQ ID NO.
[0254] 39 redukovala je nivoe iRNK NRARP za 70% 24 sata posle transfekcije i 50% 48 sati posle transfekcije, nakon čega su se nivoi iRNK naglo povećali, ali bazalni nivoi nisu potpuno povraćeni 72 sata posle transfekcije. Slika 7 pokazuje rezultate koji su dobijeni u humanim BEAS‑2B ćelijama. U ovoj ćelijskoj liniji, SEQ ID NO. 10 (SYL136001) i SEQ ID NO. 19
[0257] 1
[0258] redukovale su nivoe NRARP za 70% 24 sata posle transfekcije, nakon čega su se nivoi iRNK polako povećavali ali bazalni nivoi nisu potpuno povraćeni unutar vremenskog okvira studije, pri čemu su nivoi iRNK NRARP i dalje bili 50% ispod bazalnih nivoa 48 sati posle transfekcije i 40%‑50% 72 sata posle transfekcije. SEQ ID NO.23 i SEQ ID NO.27 blago su redukovale nivoe iRNK NRARP u humanim BEAS‑2B ćelijama, redukcije su bile oko 20‑30% u tri proučavane vremenske tačke; bazalni nivoi nisu potpuno povraćeni 72 sata posle transfekcije. SEQ ID NO. 25 i SEQ ID NO.39 postepeno i vremenski zavisno su redukovale nivoe iRNK NRARP, dostižući maksimalnu redukciju od 50%‑60% 72 sata posle transfekcije. SEQ ID NO. 31 i SEQ ID NO.35 efikasno su redukovale nivoe iRNK NRARP; nivoi iRNK bili su približno 60‑70% ispod bazalnih nivoa kao odgovor na bilo koje od jedinjenja u tri proučavane vremenske tačke. SEQ ID NO. 29 i SEQ ID NO. 37 bile su najefikasniji proizvodi koji su redukovali nivoe iRNK NRARP u ovoj ćelijskoj liniji, uzrokujući naglu i održivu redukciju od približno 80% i 90% respektivno u tri proučavane vremenske tačke. Kao što se i očekivalo, skremblovana sekvenca siRNA nije redukovala nivoe ekspresije NRARP ni u jednoj od proučavanih vremenskih tačaka. Slika 8 pokazuje rezultate koji su dobijeni u murinskim C2C12 ćelijama. SEQ ID NO. 10 (SYL136001) je redukovala nivoe NRARP za 60% 24 sata posle transfekcije, nakon čega su se nivoi iRNK polako povećavali, ali bazalni nivoi nisu potpuno povraćeni 72 sata posle transfekcije; vremenska tačka na kojoj su nivoi iRNK NRARP i dalje bili 40% ispod bazalnih nivoa. SEQ ID NO. 19 je redukovala nivoe iRNK NRARP za približno 30% 24 sata posle transfekcije, dramatična redukcija od 80% pronađena je 48 sati posle transfekcije, nakon čega su se nivoi povećali, ali 72 sata posle transfekcije nivoi iRNK NRARP su i dalje bili 40% ispod bazalnih nivoa. SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25 i SEQ ID NO. 27 blago su redukovale nivoe iRNK NRARP, redukcija koja je uočena kao odgovor na transfekciju svake od ovih sekvenci bila je približno 20‑40% u tri proučavane vremenske tačke. SEQ ID NO. 29 i SEQ ID NO. 39 efikasno su redukovale nivoe iRNK NRARP 24 i 48 sati posle transfekcije, nivoi u ovim vremenskim tačkama bili su 50% i 60% ispod bazalnih nivoa, respektivno. Odgovor na obe sekvence 72 sata posle transfekcije bio je povećanje u odnosu na prethodne vremenske tačke, iako bazalni nivoi još uvek nisu povraćeni u ovoj vremenskoj tački. SEQ ID NO. 31 je redukovala nivoe iRNK NRARP za približno 40% 24 sata posle transfekcije, značajna redukcija od 70% pronađena je 48 sati posle transfekcije, nakon čega su se nivoi povećali, ali 72 sata posle transfekcije nivoi iRNK NRARP su i dalje bili 40% ispod bazalnih nivoa. SEQ ID NO. 35 i SEQ ID NO. 37 su bila jedinjenja koja su uzrokovala najveću redukciju nivoa iRNK NRARP u ovoj ćelijskoj liniji, pri čemu su SEQ ID NO. 35 i SEQ ID NO. 37
[0261] 2
[0262] redukovale nivoe iRNK NRARP za 60% 24 sata posle transfekcije i približno 80% 48 sati posle transfekcije. Delimični povrat bazalnih nivoa dogodio se 72 sata posle transfekcije. Ponovo, kao što se i očekivalo, skremblovana sekvenca siRNA nije redukovala nivoe iRNK NRARP ni u jednoj od proučavanih vremenskih tačaka u C2C12 ćelijama. Slika 9 pokazuje rezultate koji su dobijeni u ARL6 pacovskim ćelijama. SEQ ID NO. 10 (SYL136001) je redukovala nivoe iRNK NRARP za 50% 24‑48 sati posle transfekcije i 60% 72 sata posle transfekcije. SEQ ID NO. 37 je redukovala nivoe NRARP za 50% 24 sata posle transfekcije, 60% 48 sati posle transfekcije i 70% 72 sata posle transfekcije.
[0264] 1.4 Ćelijska vijabilnost humanih ćelijskih linija posle transfekcije sa nemodifikovanim siRNA i hemijski modifikovanim siRNA u različite ćelijske linije.
[0266] Kako bi se analizirala ćelijska vijabilnost posle transfekcije siRNA iz predmetne objave, izvedene su in vitro studije toksičnosti posle transfekcije 100 nM jedne od sledećih sekvenci: SEQ ID NO. 10 (SYL13600), SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 i SEQ ID NO. 39 u humane HeLa i BEAS‑2B ćelije i u murinske C2C12 ćelije sa Lipofectamine 2000, Mirus Transit-X2, Dharmafect 3 kao agensima za transfektovanje, respektivno. Sve transfekcije su izvedene prateći standardna uputstva proizvođača. U istim eksperimentima, upotrebljena je skremblovana sekvenca siRNA kao kontrola specifičnosti interferencije. Ćelijski peleti su sakupljeni na 24, 48, i 72 sata posle transfekcije i obrađeni kako bi se procenile moguće varijacije vijabilnosti ćelija kao posledica transfekcije siRNA. Vijabilnost ćelija je izmerena upotrebom CellTiter 96<®>Aqueous Non-Radiactive Cell Proliferation Assay od Promega. Ovaj postupak se zasniva na kapacitetu živih ćelija da redukuju MTS tetrazolijumsko jedinjenje u formazan, što se meri apsorbancom na 490 nm. Srednja vrednost i SEM su izračunate za svaki eksperiment i prikazane u grafičkom formatu na Slikama 10‑12. Slike 10, 11 i 12 pokazuju da nije bilo promena vijabilnosti ćelija kao odgovor na transfekciju bilo koje od sledećih sekvenci: SEQ ID NO. 10 (SYL13600), SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO.
[0267] 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 i SEQ ID NO.39 u bilo kojoj od upotrebljenih ćelijskih linija. Štaviše, nivoi vijabilnosti ćelija takođe su procenjeni u ARL6 pacovskim ćelijama kao odgovor na transfekciju jedne od sledećih sekvenci: SEQ ID NO. 10 (SYL136001) i SEQ ID NO. 37 upotrebom siPORT NeoFX kao agensa za transfektovanje. Slika 13 pokazuje da nije bilo značajnih promena vijabilnosti ćelija u ARL6 ćelijama kao odgovor na bilo koju od testiranih sekvenci. Prema tome možemo zaključiti da su sve siRNA iz predmetne objave netoksične i da se dobro tolerišu.
[0269] 1.5 Efikasnost siRNA na angiogenezu u in vitro modelu HUVEC ćelija.
[0271] Kako bi se proučio efekat siRNA iz predmetne objave na angiogenezu, izvedeni su eksperimenti sa HUVEC ćelijama i analizirana je ekspresija NRARP u ovim ćelijama.
[0272] Posebno, cilj ovog skupa studija bio je proučavanje antiangiogenog efekta modifikovane NRARP siRNA SEQ ID NO. 37 (dsRNK od 19 bp sa tupim krajevima, hemijski modifikovana, koja ima sens lanac koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO. 37 i komplementarni antisens lanac koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO.38) u in vitro modelu HUVEC ćelija.
[0274] 1.5.1 Uvod.
[0276] Angiogeneza je formiranje novih vena iz već postojećih. Ovaj proces, neophodan tokom razvića, i nekoliko drugih fizioloških procesa može biti poremećeno u oku što dovodi do različitih tipova bolesti mrežnjače, kao što su makularna degeneracija koja je povezana sa starenjem (AMD) i dijabetička retinopatija (DR). Endotelne ćelije humane pupčane vene (HUVEC) su primarne ćelije koje su sačuvane posle 1‑3 pasaža iz inicijalnog izvornog materijala. Ove ćelije mogu biti indukovane tako da formiraju tubularne strukture kao odgovor na angiogene agense kao što je VEGF.
[0278] 1.5.2 Materijali.
[0280] MultiScribe™ reverzna transkriptaza 50 U/ml (Applied Biosystems P/N 4311235).
[0281] Inhibitor RNaze 20 U/µl (Applied Biosystems P/N N8080119).
[0282] TaqMan 2X Universal Master Mix.
[0283] Qiagen" RNeasy<®>Microkit 74004.
[0284] Humana Nrarp proba: Taqman Gene Expression Assay Hs01104102_s1.
[0285] GAPDH endogena kontrola: Taqman Gene Expression Assay Hs00266705_g1.
[0286] Pacovska Nrarp proba: Taqman Gene Expression Assay Rn 03810258_s1 18S Endogena kontrola: Taqman Gene Expression Assay Hs99999901_s1.
[0289] 4
[0290] 1.5.3 Postupci.
[0292] i) Ćelije
[0294] HUVEC ćelije (Ref: CC‑2519 / Broj serije: 000191772) dobijene su od Lonza. Svi eksperimenti su izvedeni sa istom serijom ćelija u pasažu 6‑9 i sa kulturama pri gustini ćelija od 75‑85%. Transfekcije su izvedene upotrebom siPORT NeoFX™ prateći standardnu proceduru. Za elektroporaciju je praćena procedura koja je objavljena u "Hernandez JL et al.
[0295] 2004. Angiogenesis. 7:235‑241", ukratko, 1x10<6>ćelija je elektroporisano primenom impulsa od 20 ms na 1200 µF upotrebom Cell manipulator<®>600 (BTX). Svaka elektroporacija je izvedena upotrebom 2 µg genetičkog materijala.
[0296] Za studije efikasnosti, ćelije su transfektovane upotrebom protokola elektroporacije i ostavljene da se oporave tokom perioda od 24 h; nakon toga su ćelije zasejane na ploče sa 96 bunarića pri gustini od 30.000 ćelija/bunariću, a prethodno pomenuti parametri su analizirani 6 h posle zasejavanja. Nakon analize strukture ćelija, medijum i matrigel su prebačeni u tubu bez RNaze i dodato je 600 µl pufera RLT+ β-merkaptoetanol.
[0298] ii) Analiza ekspresije ciljnog gena
[0300] (1) Izolacija RNK i retrotranskripcija
[0302] Ukupna RNK je izolovana iz ćelijskih kultura upotrebom RNeasy RNA extraction kit (Invitrogen, CA, SAD). 4 µg ukupne RNK je retrotranskribovano upotrebom High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, SAD) u skladu sa uputstvima proizvođača.
[0304] (2) qPCR
[0306] qPCR je izvedena upotrebom Stepone plus detection system (Applied Biosystems). Amplifikovano je 50 nanograma svakog uzorka u TaqMan 2X Universal Master Mix pod sledećim uslovima: 95 °C tokom 10 min, nakon čega je usledilo 40 ciklusa od 95 °C tokom 15 s i 60 °C tokom 1 min.
[0307] 1.5.4 Rezultati.
[0309] S obzirom na uspešan ishod elektroporacije za introdukovanje siRNA u HUVEC ćelije ovaj postupak je upotrebljen za naredne studije u kojima je procenjena uloga modifikovane NRARP siRNA SEQ ID NO. 37 u testovima formiranja kapilarnih struktura na matrigelu, migracije, zarastanja rana i proliferacije.
[0311] i) Formiranje kapilarnih struktura.
[0313] (1) Postavka testa.
[0315] 15.000 ćelija/bunariću, lišenih tokom perioda od 4 h, zasejano je na ploču sa 96 bunarića obloženu matrigelom. Bazalni medijum endotelnih ćelija (EBM) bez suplemenata upotrebljen je kao negativna kontrola (bez formiranja struktura), dok je kompletni medijum sa suplementima (hEGF, hidrokortizon, ekstrakt goveđeg mozga, gentamicin, heparin) i 10% FCS upotrebljen kao pozitivna kontrola indukujući maksimalan broj tubularnih struktura. Testovi su izvedeni u triplikatu u 3‑6 nezavisnih eksperimenata. Kulture su analizirane 24 h posle zasejavanja.
[0316] Pored toga, uspostavljen je nov postupak za analizu struktura. Ovaj postupak se zasniva na kvantifikaciji 5 varijabli, upotrebom Angiogenesis Analyzer softvera koji je razvio Žil Karpentije (Gilles Carpentier) za NIH ImageJ. Ovaj softver daje globalni pregled angiogenog procesa. Proučavane varijable su pokazane na slici 17.
[0317] Slika 18 pokazuje promenu varijabli koje se proučavaju kao odgovor na kompletni medijum (suplementi 10% FCS). Kao što je pokazano na slici kompletni medijum značajno povećava broj formiranih struktura bez menjanja ukupne površine struktura.
[0319] (2) Efikasnost siRNA SEQ ID NO.37.
[0321] Ćelije su transfektovane elektroporacijom i omogućeno je da se oporave u kompletnom medijumu tokom perioda od 24 h, a zatim su lišene seruma tokom dva dodatna sata; nakon toga su ćelije zasejane pri gustini ćelija od 30.000 ćelija/bunariću na ploču sa 96 bunarića obloženu matrigelom kako bi se omogućilo formiranje struktura. Formirane strukture su analizirane 6 h i 24 h posle zasejavanja. Sledeći uslovi su testirani kako bi se testirala efikasnost SEQ ID NO.37:
[0322] - Netransfektovane ćelije
[0323] - Lažno elektroporisane ćelije
[0324] - Ćelije transfektovane sa 1 µM siRNA anti-KDR (Life Technologies, Ref: 145034) - Ćelije transfektovane sa 1 µM siRNA SEQ ID NO: 37.
[0326] Svi uslovi su testirani u medijumu bez suplemenata i sa medijumom sa 10% FCS i 100 ng/ml VEGF.
[0327] Prvi test je izveden sa ćelijama koje su bile lišene u medijumu bez seruma tokom 2 h pre zasejavanja ćelija na matrigel. Ova procedura je blago destabilizovala strukture i stoga je ponovljena bez koraka lišavanja. Rezultati ove druge studije pokazani su na Slikama 19 i 20.
[0328] Ukratko, elektroporacija ozbiljno utiče na funkciju ćelija; stoga su napravljena poređenja između uslova lažne elektroporacije i eksperimentalnih uslova. U odsustvu suplemenata, i siRNA-KDR i siRNA-NRARP SEQ ID NO. 37 redukovale su formiranje angiogenih struktura; efekat siRNA-KDR bio je veći od efekta siRNA SEQ ID NO. 37. Inhibitorni efekat obe siRNA na formiranje angiogenih struktura bio je jasniji u prisustvu kompletnog medijuma sa suplementima na 6 h vremenskoj tački; ovo može biti usled činjenice da lišavanje ćelija seruma i suplemenata može redukovati vijabilnost ćelija. Analiza koja je izvedena 24 h posle zasejavanja ćelija na matrigel nije bila ubedljiva jer su strukture već počele da se deasembliraju.
[0330] ii) Efekat na proliferaciju.
[0332] (1) Postavka testa.
[0334] 24 h-lišene ćelije su zasejane na ploče sa 96 bunarića pri gustini od 3000 ćelija/bunariću i kultivisane pod različitim uslovima. Pet dana kasnije proliferacija je procenjena pomoću MTT testa. Upotrebljeni uslovi su bili kao što sledi: 2% FCS i različite koncentracije VEGF (20‑30‑50 ng/ml). 2% FCS je potrebno kako bi ćelije održale bazalnu stopu proliferacije i kako bi se izbeglo da kultura uđe u ćelijski zastoj. Slika 21A pokazuje trostruku indukciju ćelijske proliferacije kao odgovor na VEGF, bez obzira na testiranu koncentraciju. Kako bi se analizirao inhibitorni efekat anti-VEGF agensa, ćelije su kultivisane u prisustvu 30 ng/ml VEGF i opadajućih koncentracija (razblaženja 1:2 počevši od 12 nM) bevacizumaba (Avastin) kako bi se odredila IC50. Kao što je pokazano na slici 21B, pronađeno je da je IC50 bevacizumaba 0,85 nM.
[0335] (2) Efikasnost siRNA SEQ ID NO.37.
[0337] Ćelije su elektroporisane i zasejane pri gustini od 5000 ćelija/bunariću na ploču sa 96 bunarića obloženu sa 1% želatinom; nakon toga, ćelijama je omogućeno da se oporave tokom 24 h. Posle oporavka, ćelije su kultivisane u bazalnom medijumu suplementovanom sa 10% FCS i 100 ng/ml VEGF. Tri dana posle zasejavanja, proliferacija ćelija je analizirana pomoću MTT testa. Testirani uslovi bili su kao što sledi:
[0339] - Netransfektovane ćelije
[0340] - Lažno elektroporisane ćelije
[0341] - Ćelije transfektovane sa 1 µM siRNA anti-KDR (Life Technologies, Ref: 145034) - Ćelije transfektovane sa 1 µM siRNA SEQ ID NO: 37.
[0343] Rezultati, koji su pokazani na slici 22, ukazuju da i siRNA anti-KDR i siRNA SEQ ID NO. 37 redukuju stopu proliferacije koja je indukovana pomoću VEGF za približno 40% u poređenju sa lažno elektroporisanim ćelijama.
[0345] iii) Efekat na migraciju.
[0347] (1) Postavka testa.
[0349] Ove studije su izvedene na pločama sa 24 transbunarić sistema sa neprozirnim membranskim filterima od 8 µm (Transwell HTS FluroBlok™ Multiwell Insert System od Becton Dickinson). Obe površine membrane su prekrivene sa kolagenom tipa I u koncentraciji od 15 µg/ml tokom 2 h na 37 °C kako bi se olakšala ćelijska apsorpcija. Ćelije su zasejane pri gustini od 50.000 ćelija/bunariću i lišene su seruma tokom perioda od 4 h i zatim je dodat stimulus migracije.24 h posle dodavanja stimulusa na donji deo transbunarića analiziran je broj ćelija koje su migrirale u gornji odeljak nakon bojenja sa kalcein-AM.
[0350] Broj migrirajućih ćelija u kompletnom medijumu (10% FCS i suplementi) upotrebljen je kao pozitivna kontrola migracije ćelija i ovaj odgovor je upoređen sa onim koji je dobijen povećanjem koncentracije VEGF (1‑10‑100 ng/ml).
[0351] [0134] Kao što je pokazano na slici 23, VEGF indukuje dozno zavisno povećanje broja ćelija koje migriraju u gornji odeljak. Maksimalno povećanje odgovora na VEGF uočeno je kao odgovor na najveću koncentraciju VEGF (100 ng/ml) a magnituda odgovora je bila oko 5-6 puta veća u odnosu na bazalne uslove.
[0353] (2) Efikasnost siRNA SEQ ID NO.37.
[0355] Ćelije su elektroporisane i omogućeno je da se oporave tokom perioda od 24 h; nakon toga ćelije su zasejane pri gustini od 10.000 ćelija/bunariću na ploče sa 96 transbunarića sa neprozirnim membranskim filterima od 8 µm obloženim sa 15 µg/ml kolagena. Svi testirani uslovi su analizirani u prisustvu bazalnog medijuma i kompletnog medijuma (suplementovanog sa 10% FCS i 100 ng/ml VEGF). Testirani uslovi su bili kao što sledi i migracija je analizirana 24 h posle zasejavanja i bojenja ćelija sa kalcein-AM:
[0357] - Netransfektovane ćelije
[0358] - Lažno elektroporisane ćelije
[0359] - Ćelije transfektovane sa 1 µM siRNA anti-KDR (Life Technologies, Ref: 145034) - Ćelije transfektovane sa 1 µM siRNA SEQ ID NO.37.
[0361] Dobijeni rezultati ukazuju da je elektroporacija imala štetan uticaj na migracioni kapacitet ćelija; stoga su tretirane ćelije upoređene sa uslovima lažne elektroporacije kako bi se odbacio efekat elektroporacije. Ćelije u bazalnom medijumu nisu migrirale ali je prisustvo 10% FCS i 100 ng/ml VEGF uzrokovalo migraciju ćelija u suprotni bunarić u transbunarić sistemu. Efekat 10% FCS i 100 ng/ml VEGF je delimično blokiran (30%) elektroporacijom bilo siRNA SEQ ID NO.37 ili anti-KDR siRNA (Slike 24 i 25).
[0363] iv) Studije zarastanja rana.
[0365] (1) Postavka testa.
[0367] Ćelije su zasejane pri gustini od 50.000 ćelija/bunariću u ploče sa 96 bunariću obložene sa 1% želatinom i kultivisane u bazalnom medijumu tokom 24 h. Nakon toga, lezija je izvedena struganjem uske površine kulture i dodato je 10 ng/ml VEGF u kulturu. Površine neposredno posle i 24 h posle izvođenja lezije su izmerene i upoređene pomoću NIH Imaged softvera. Procenat zaceljene površine je kvantifikovan kao što sledi:
[0368] Kao što slika 26 pokazuje, 10 ng/ml VEGF indukovalo je povećanje stope zarastanja rana od 2,5 puta u poređenju sa netretiranim uslovom.
[0370] (2) Efikasnost siRNA SEQ ID NO.37.
[0372] Ćelije su elektroporisane i omogućeno je da se oporave tokom perioda od 24 h, nakon čega su ćelije zasejane pri gustini od 70.000 ćelija/bunariću u ploče sa 96 bunarića obložene sa 1% želatinom. 24 h posle zasejavanja, lezije su indukovane struganjem uske površine ćelija, i kulture su analizirane 16 h posle indukcije lezija. Analiza je izvedena bojenjem ćelija sa 10 µM kalcein-AM i ponovnom analizom struganih površina i procenta površine koja je bila pokrivena ćelijama. Svi testirani uslovi su analizirani u prisustvu bazalnog medijuma i kompletnog medijuma (suplementovanog sa 10% FCS i 100 ng/ml VEGF). Testirani uslovi su bili kao što sledi i migracija je analizirana 24 h posle zasejavanja:
[0374] - Netransfektovane ćelije
[0375] - Lažno elektroporisane ćelije
[0376] - Ćelije transfektovane sa 1 µM siRNA anti-KDR (Life Technologies, Ref: 145034)
[0377] - Ćelije transfektovane sa 1 µM siRNA SEQ ID NO: 37.
[0379] Kao i u prethodnim eksperimentima, rezultati pokazuju štetan efekat elektroporacije na zarastanje rana, iz tog razloga svi uslovi su upoređeni sa lažno elektroporisanim ćelijama. Kao što je pokazano na slikama 27 i 28, siRNA SEQ ID NO. 37 je veoma efikasno redukovala stopu zarastanja rana u bazalnom medijumu. Efekat siRNA SEQ ID NO. 37 bio je čak i veći od efekta pozitivne kontrole anti-KDR siRNA. Međutim, ovaj efekat na zarastanje rana je maskiran kada se ćelije kultivišu u kompletnom medijumu, najverovatnije usled potentnog efekta FCS na migraciju ćelija.
[0381] v) Nivoi iRNK NRARP u ćelijama iz prethodno pomenutih eksperimenata.
[0384] 4
[0385] HUVEC ćelije iz prethodno pomenutih studija su sakupljene i ekstrahovana je ukupna RNK kako bi se pomoću qPCR analizirali nivoi NRARP ciljnog gena. Slika 29 pokazuje redukciju nivoa iRNK NRARP kao odgovor na elektroporaciju siRNA SEQ ID NO.37.
[0386] Uzimajući u obzir rezultate koji su predstavljeni u predmetnoj studiji možemo zaključiti da siRNA SEQ ID NO. 37 pokazuje antiangiogeni efekat u HUVEC ćelijama kao što je pokazano redukcijom proliferacije, migracije i formiranja kapilarnih struktura.
[0388] 2. In vivo analiza
[0390] 2.1 Ekspresija NRARP u mrežnjači i sudovnjači kod pacovskog modela neovaskularizacije sudovnjače indukovane LASEROM
[0392] 2.1.1 Cilj
[0394] Cilj predmetne studije bio je da se proceni ekspresija NRARP u različitim vremenskim tačkama u mrežnjači i sudovnjači norveških smeđih pacova kod kojih je CNV indukovana LASEROM. Analiza ekspresije ovog ciljnog gena služila je dvostrukoj svrsi: i) da se proceni da li je povećana ekspresija NRARP kao odgovor na CNV, kako bi se proučilo da li je ciljni gen kandidat za utišavanje sa ciljem razvoja novog jedinjenja za lečenje bolesti mrežnjače koje su povezane sa neovaskularizacijom, ii) da se prouči privremena ekspresija NRARP kako bi se odredilo najbolje vreme za lečenje životinja kako bi se ciljni gen utišao.
[0396] 2.1.2 Uvod
[0398] CNV je nespecifična lezija uobičajena za nekoliko horioretinalnih bolesti. Ove lezije karakteriše niz događaja koji podrazumevaju rupturu ili poremećaj Bruhove (Bruch’s) membrane, indukciju inflamacije i angiogenezu sa invazijom horiokapilarnih endotelnih ćelija, pericita i inflamatornih ćelija u subretinalni prostor i/ili subretinalni pigmentni epitel {Grossniklaus HE et al 2010}. Prodor horiokapilara u subretinalni prostor je zajedničko obeležje nekoliko bolesti mrežnjače. Neki primeri ovih bolesti uključuju AMD, PDR ili DRE.
[0399] CNV se može indukovati kod životinjskih modela indukovanjem lezije u Bruhovoj membrani; ova lezija pokreće molekulske događaje koji dovode do potpuno razvijene CNV koju karakterišu povećani angiogeni faktori i inflamatorni medijatori.
[0400] Upotrebljavali smo laserski indukovani model CNV kod smeđih norveških pacova validiran u EyeCRO kako bismo analizirali ekspresiju odabranih ciljeva u različitim vremenskim tačkama posle indukcije lezija. U tu svrhu su indukovane tri lezije u svakom oku 18 životinja koje su potom žrtvovane i oči su sakupljene i poslate u Sylentis na dodatnu analizu. Analizirani cilj bio je NRARP. NRARP je glikoprotein koji je povezan sa aktivacijom vaskularnih endotelnih ćelija. Gen se prekomerno eksprimira u čitavom nizu kancera i njegova prekomerna ekspresija koreliše sa metastazama i kratkom stopom preživljavanja. Štaviše, nivoi ekspresije ovog gena u humanom kanceru dojke korelišu sa formiranjem krvnih sudova i pronađeno je da protein koji je kodiran ovim genom ima ulogu u migraciji endotelnih ćelija i generisanju vaskulature nezavisno od VEGF {Faibish MR et al.
[0401] 2011}.
[0403] 2.1.3 Postupci
[0405] i) Životinje
[0407]
[0409] Tabela 1: Životinje
[0411]
[0412]
[0415] ii) Eksperimentalne grupe
[0417]
[0419] Tabela 2. Eksperimentalne grupe
[0421]
[0424] iii) Kriterijumi za isključivanje
[0426] Sve oči gde je krvarenje očigledno u ≥2 od 3 laserske lezije odmah nakon primene lasera.
[0427] Svi uzorci tkiva su stavljeni u kriotube koje su odgovarajuće identifikovane, i odmah zamrznute u tečnom azotu. Kriotube su identifikovane sa eksperimentalnim uslovima i poslate na suvom ledu u Sylentis.
[0429] iv) Analiza ekspresije ciljnog gena
[0431] (1) Izolacija RNK i retrotranskripcija
[0434] 4
[0435] Ukupna RNK je izolovana iz mrežnjače i sudovnjače upotrebom RNeasy RNA extraction kit (Invitrogen, CA, SAD). 4 µg ukupne RNK je retrotranskribovano upotrebom High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, SAD) u skladu sa uputstvima proizvođača.
[0437] (2) qPCR
[0439] qPCR je izvedena upotrebom Stepone plus detection system (Applied Biosystems).
[0440] 500 nanograma svakog uzorka je amplifikovano u TaqMan 2X Universal Master Mix pod sledećim uslovima: 95 °C tokom 10 min, nakon čega je usledilo 40 ciklusa od 95 °C tokom 15 s i 60 °C tokom 1 min. Sve qPCR amplifikacije su izvedene u triplikatu i ponovljene u najmanje dva nezavisna eksperimenta, uvek uključujući kontrole reverzne transkripcije i kontrole bez templata.
[0442] 2.1.4 Rezultati - Ekspresija NRARP
[0444] Ekspresija NRARP je analizirana u mrežnjači i u RPE/sudovnjači u različitim vremenskim tačkama nakon indukcije CNV pomoću lasera. Dobijeni rezultati pokazuju blago smanjenje nivoa iRNK NRARP u mrežnjači 24 h posle indukcije laserskih lezija. 72 h posle indukcije lezija, nivoi iRNK NRARP se blago povećavaju (1,5 puta tokom vremena = 0). Na kraju studije (t = 504 h) nivoi NRARP bili su ekvivalentni onima koji su uočeni pre indukcije lezija (Slika 14).
[0445] Nivoi iRNK NRARP su drastično povećani u sudovnjači/RPE 6 h posle indukcije CNV (~2,7 puta) i nakon toga su polako počeli da se smanjuju. Bazalni nivoi nisu povraćeni unutar vremenskog okvira studije (Slika 15).
[0447] 2.1.5 Zaključci
[0449] Uzimajući u obzir rezultate ove studije, može se zaključiti da je NRARP efikasan cilj prema kome se može razviti lečenje za kontrolu neovaskularizacije u mrežnjači. Obrazac ekspresije i u mrežnjači i u sudovnjači ukazuje na to da bi mogao biti dobar kandidat za utišavanje, s obzirom na značajnu indukciju njegove ekspresije u modelu koji je upotrebljen u ovoj studiji i njegovu ulogu u angiogenezi.
[0450] 2.2 Evaluacija siRNA koja ciljno deluje na NRARP na redukciju veličine lezije i curenje u pacovskom modelu laserski indukovane neovaskularizacije sudovnjače.
[0452] 2.2.1 Cilj
[0454] Da se odrede antiangiogeni/vaskularni remetilački efekti jednog test agensa (siRNA SEQ ID NO. 37) posle topikalne primene na pacovskom modelu laserski indukovane neovaskularizacije sudovnjače (laserska CNV).
[0456] 2.2.2 Sažetak studije
[0458] Studija u trajanju od 26 dana sprovedena je sa ženkama smeđeg norveškog pacova kako bi se odredili antiangiogeni/vaskularni remetilački efekti topikalne instilacije SEQ ID NO: 37 u laserski indukovanom modelu neovaskularizacije sudovnjače.
[0459] Ukupno 18 pacova je podeljeno u 3 grupe od 6 pacova po grupi. Na Dane 1-26, Grupe 1 i 3 su primale topikalnu instilaciju vehikuluma jednom dnevno (Grupa 1), ili 5 mg/ml SEQ ID NO: 37 (Grupa 3). Na Dan 7, Grupa 3 je primila bilateralnu intravitrealnu injekciju od 5 µg/oku anti-VEGF (pozitivna kontrola).
[0460] Na Dan 3, laserski tretmani su izvedeni upotrebom termalnog lasera od 520 nm kako bi se generisale ukupno tri lezije po oku.
[0461] Na Dan 26 (3 nedelje nakon laserskog tretmana), izvedena je fluoresceinska angiografija i veličina površine lezije određena je upotrebom softvera za analizu slika (ImageJ). Pacovi koji su primali bilo 5 µg/oku anti-VEGF antitela, ili topikalnu instilaciju 5 mg/ml SEQ ID NO: 37, pokazali su značajnu redukciju veličine lezije u poređenju sa njihovom odgovarajućom kontrolnom grupom sa vehikulumom.
[0463] 2.2.3 Materijali i postupci
[0465] 2.2.3.1 Laserski indukovana neovaskularizacija sudovnjače (CNV) kod pacova Dani 1-26: Topikalna instilacija vehikuluma ili test agensa, QD (Grupe 1, 2)
[0467]
[0469] Dan 5: Bilateralni laserski tretman za stvaranje 3 lezije po oku
[0472] 4
[0473] Dan 7: Bilateralna intravitrealna injekcija pozitivne kontrole (Grupa 3)
[0474] Dan 26: In vivo fluoresceinska angiografija
[0475] Dan 26: Enukleacija očiju i pojedinačno sakupljanje mrežnjače i RPE/sudovnjače. Grupe studije
[0477] 2.2.3.2 Grupe studije
[0479]
[0481] TABELA 3. Raspodela po grupama
[0483]
[0486] 2.2.3.3 Životinje
[0488]
[0490] Soj: Smeđi norveški
[0491] Pol: Ženski
[0492] Starosni opseg: 6‑8 nedelja starosti
[0493] Težinski opseg: 120‑150 g
[0494] Dobavljač: Charles River Laboratories
[0497] 4
[0498] Broj životinja za studiju: 18
[0500] 2.2.3.4 Zahtevi za smeštaj
[0502] Sve životinje su bile smeštene u grupama od po 3 u velikim kavezima, na ventiliranim policama, pod standardnim uslovima nege životinja.
[0504] 2.2.3.5 Priprema i čuvanje formulacije
[0506] Za sve formulacije korišćeni su USP (S.A.D. farmakopeja) materijali i sterilne posude, upotrebom sledećih alikvota test materijala:
[0507] Topikalni vehikulum- 26 alikvota/130 μl svaki 2 dodatno.
[0508] siRNA SEQ ID NO.37 5 mg/ml- 26 alikvota/130 μl svaki 2 dodatno.
[0509] Sve formulacije su čuvane na 4 ± 3 °C.
[0511] 2.2.3.6 Anestezija
[0513] Ketamin i ksilazin su pomešani upotrebom U-100 šprica koristeći 20 jedinica ketamina (100 mg/ml) i 100 jedinica ksilazina (20 mg/ml). Smeša za anesteziju je primenjena putem intraperitonealne (IP) injekcije u količini od 1 µl/g (telesne težine).
[0515] 2.2.3.7 Primena lasera za stvaranje CNV lezija
[0517] Oči životinja su proširene sa 1% rastvorom ciklogila i zaštićene od svetlosti. Nakon uočljive dilatacije, životinje su sedirane sa ketaminom/ksilazinom. Fundus sediranih životinja je posmatran i zabeležen pomoću funduskopa za male životinje Micron III (Phoenix Research). Laserski tretmani su izvedeni upotrebom termalnog lasera povezanog preko prilagođenog laserskog dodatka Micron III. Ukupno 3 lezije su postavljene po oku upotrebom talasne dužine od 520 nm. Rezultujući snimci fundusa su zabeleženi i procenjeni kako bi se potvrdilo da je laser uspešno stvorio mehur kroz Bruhovu membranu.
[0519] 2.2.3.8 Intravitrealna primena
[0522] 4
[0523] Životinje su anestezirane sa ketaminom/ksilazinom, a zenice su proširene sa topikalnom primenom ciklogila i/ili tropikamida. Nakon sedacije i dilatacije, ukupna zapremina od 5 µl po oku je injektirana u staklasto telo kroz pars plana upotrebom Hamilton šprica i igle kalibra 33.
[0525] 2.2.3.9 Isključenja
[0527] Sve oči koje su pokazivale znake krvarenja nakon primene lasera ili intravitrealne injekcije isključene su iz analize.
[0529] 2.2.3.10 Fluoresceinska angiografija
[0531] Životinje su anestezirane sa ketaminom/ksilazinom i zatim su primile IP injekciju 10% fluorescein natrijuma u količini od 1 µl/gramu telesne težine. Snimci fundusa su snimljeni kao 8-bitni TIFF fajlovi upotrebom Micron III i pobuđujućih/barijernih filtera za ciljnu talasnu dužinu od 488 nm. Takođe su snimljene standardne fotografije fundusa u boji za svako oko.
[0533] 2.2.3.11 Snimanje i kvantifikacija lezija
[0535] Svi TIFF snimci su kvantifikovani upotrebom kompjuterizovanog softvera za analizu slika (ImageJ, NIH, SAD). Lezije su pojedinačno opcrtane slobodnom rukom kako bi se kvantifikovala površina u pikselima i fotografije fundusa u boji su upotrebljene kao referenca za lokaciju lezija. Površine avaskularizacije u centru lezija su isključene iz proračuna površine. Ukoliko je došlo do krvarenja ili preklapanja dve lezije, ove lezije su isključene iz analize.
[0537] 2.2.3.12 Sakupljanje tkiva
[0539] Životinje su anestezirane sa ketaminom/ksilazinom (80/10 mg/kg) i zatim eutanazirane IP primenom Eutasola (pentobarbitala) u količini od 200 mg/kg. Nakon eutanazije, oči su enukleisane i pojedinačno fiksirane u 4% paraformaldehidu. Nakon fiksacije, sve oči su čuvane u pojedinačnim polipropilenskim tubama od 2 ml sa poklopcem na zavrtanje.
[0541] 2.2.3.13 Statističke analize
[0544] 4
[0545] Statističke analize su izvedene sa Graphpad Prism softverom (verzija 4.0) upotrebom dvostranog Man-Vitni (Mann-Whitney) t-testa. Samo promene sa p-vrednošću <0,05 smatraju se statistički značajnim.
[0547] 2.2.4 Rezultati
[0549] Efekat primene topikalnom instilacijom SEQ ID NO: 37 procenjen je na pacovskom modelu laserski indukovane CNV. 3 nedelje nakon laserskog tretmana, izvedena je fluoresceinska angiografija kako bi se kvantifikovala veličina (površina u pikselima) CNV lezije u očima pacova.
[0550] Topikalna primena 5 mg/ml SEQ ID NO: 37 redukovala je veličinu lezija u očima pacova u odnosu na instilaciju samo vehikulumom. Razlika prosečne veličine lezije u odnosu na grupu koja je primala vehikulum bila je značajna (Slika 16; *, p ≤ 0,05, neupareni t-test sa dvostranim Man-Vitni post-testom).
[0551] Bilateralna intravitrealna injekcija pozitivne kontrole, anti-VEGF, značajno je redukovala veličinu lezije u odnosu na kontrolu (Slika 16; **, p ≤ 0,01, neupareni t-test sa dvostranim Man-Vitni post-testom).
[0553] 2.2.5 Zaključci
[0555] U pacovskom modelu neovaskularizacije sudovnjače, topikalna instilacija 5 mg/ml SEQ ID NO. 37 značajno redukuje veličinu lezije u odnosu na topikalnu instilaciju samo vehikuluma.
[0557] REFERENCE
[0559]
[0561] • Angaji S.A, Hedayati S.S, Poor R.H, et al. "Application of RNA interference in treating human diseases" J Genet.2010. Vol.89. 4. 527-37.
[0562] • Bird AC. "Therapeutic targets in age-related macular disease". J Clin Invest. 2010 Sep;120(9):3033-41.
[0565] 4
[0566] Bramsen J.B., Laursen M.B., Nielsen A. F., et al. "A large-scale chemical modification screen identifies design rules to generate siRNAs with high activity, high stability and low toxicity" Nucleic Acids Res 2009 sves. 37 izdanje: 9 stranice: 2867-81.
[0567] Campochiaro PA. "Potential applications for RNAi to probe pathogenesis and develop new treatments for ocular disorders". Gene Ther. 2006 Mar;13(6):559-62.
[0568] Cerutti, L., N. Mian, et al. "Domains in gene silencing and cell differentiation proteins: the novel PAZ domain and redefinition of the Piwi domain." Trends Biochem Sci.2000 25(10): 481-2.
[0569] Collins, R. E. and X. Cheng. "Structural domains in RNAi." FEBS Lett 2005 579(26): 5841-9.
[0570] Chang C.I, Kim H.A, Dua P, et al. "Structural Diversity Repertoire of Gene Silencing Small Interfering RNAs" Nucleic Acid Ther.2011. sves. 21. 3. 125-31.
[0571] Chong RH, Gonzalez-Gonzalez E, et al. "Gene silencing following siRNA delivery to skin via coated steel microneedles: In vitro and in vivo proof-of-concept". J Control Release 2013, 166:211-9.
[0572] Del Amo EM and Urtti A. "Current and future ophthalmic drug delivery systems. A shift to the posterior segment". Drug Discov Today 2008, 13:135-143.
[0573] Deleavey G.F and Damha M.J. "Designing chemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing". Chem Biol.2012 sves.19.8. 937-54.
[0574] Duvvuri S, Majumdar S, Mitra AK. "Drug delivery to the retina: challenges and opportunities". Expert Opin Biol Ther 2003, 3:45-56.
[0575] Edelhauser HF, Rowe-Rendleman CL, Robinson MR, Dawson DG, et al. "Ophthalmic drug delivery systems for the treatment of retinal diseases: basic research to clinical applications". Invest Ophthalmol Vis Sci 2010, 51:5403-5420.
[0576] Elbashir, S. M., W. Lendeckel, et al. "RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs." Genes Dev.2001 15(2): 188-200.
[0577] Faibish M, Francescone R, Bentley B, et al. "A YKL-40-Neutralizing Antibody Blocks Tumor Angiogenesis and Progression: A Potential Therapeutic Agent in Cancers". Mol Cancer Ther 2011;10:742-751.
[0578] Fire A, Xu S, et al. "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans." Nature.1998 391(6669): 806-11.
[0579] Grossniklaus HE, Kang SJ, et al. "Animal models of choroidal and retinal neovascularization" Prog Retin Eye Res 201029(6): 500-19.
[0580] Guzman-Aranguez A, Loma P and Pintor J. "Small-interfering RNAs (siRNAs) as a promising tool for ocular therapy". British Journal of Pharmacology. 2013. 170 730-747.
[0581] Hutvagner G, and Zamore PD. "A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex." Science. 2002. 297(5589): 2056-60.
[0582] Kigasawa K, Kajimoto K, et al. "Noninvasive delivery of siRNA into the epidermis by iontophoresis using an atopic dermatitis-like model rat". Int J Pharm 2010, 383:157-60. Kim DH, Behlke MA, Rose SD, et al. "Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy" Nat Biotechnol 2005. sves. 23 izdanje: 2 stranice: 222-6. Kornbrust D, Cavagnaro J, Levin A, et al. "Oligo safety working group exaggerated pharmacology subcommittee consensus document" Nucleic Acid Ther 2013 sves. 23, 1, str: 21-8.
[0583] Leachman SA, Hickerson RP, et al. "First-in-human mutation-targeted siRNA phase Ib trial of an inherited skin disorder". Mol Ther 2010, 18:442-6.
[0584] Lewis BP, Shih I, et al. "Prediction of mammalian micro RNA targets." Cell. 2003 115:787-798.
[0585] Liu J, Carmell MA, et al. "Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi." Science. 2004 305(5689): 1437-41.
[0586] Livak KJ and Schmittgen TD. "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method" Methods. 2001; sves: 25, izdanje: 4, stranice: 402-8.
[0587] Ma JB, Yuan YR, et al. "Structural basis for 5’-end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi.
[0588] Maniatis T, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, na stranicama 387-389.
[0589] Nakai N, Kishida T, et al. "Therapeutic RNA interference of malignant melanoma by electrotransfer of small interfering RNA targeting Mitf". Gene Ther 2007, 14:357-65. Nykanen A, Haley B, et al. "ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway." Cell 2001107(3): 309-21.
[0590] Orban TI and Izaurralde E. "Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome." Rna.2005 11(4): 459-69.
[0591] Phng LK, Potente M, et al. "Nrarp coordinates endothelial Notch and Wnt signaling to control vessel density in angiogenesis." Dev Cell 200916(1): 70-82.
[0594] 1
[0595] Rand TA, Petersen S, et al. "Argonaute2 cleaves the antiguide strand of siRNA during RISC activation." Cell.2005 123(4): 621-9.
[0596] Rowe-Rendleman CL, Durazo SA, et al. "Drug and gene delivery to the back of the eye: from bench to bedside." Investigative ophthalmology & visual science. 2014 55(4): 2714-30.
[0597] Sanghvi YS. "A status update of modified oligonucleotides for chemotherapeutics applications" Curr Protoc Nucleic Acid Chem.2011 sves. 4. 4 1 1-22.
[0598] Song JJ, Smith SK, et al. "Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity." Science. 2004 305 (5689): 1434-7.
[0599] Walton SP, Wu M, Gredell JA and Chan C. "Designing highly active siRNAs for therapeutic applications" FEBS J._2010. sves.277. 23. 4806-13.
[0602] 2

Claims (7)

1. Patentni zahtevi
1. Molekul siRNA za upotrebu u lečenju i/ili sprečavanju bolesti mrežnjače povezane sa neovaskularizacijom koja je naznačena povećanom ekspresijom i/ili aktivnošću NRARP topikalnom primenom na površinu rožnjače oka, pri čemu navedeni molekul specifično cilja najmanje jednu sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO.1 do SEQ ID NO.9.
2. Molekul siRNA za upotrebu u lečenju i/ili sprečavanju bolesti mrežnjače povezane sa neovaskularizacijom koja je naznačena povećanom ekspresijom i/ili aktivnošću NRARP u skladu sa patentnim zahtevom 1, pri čemu je navedena bolest mrežnjače odabrana od makularne degeneracije koja je povezana sa starenjem (AMD), ishemijske retinopatije, dijabetičkog makularnog edema (DME), proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR), dijabetičke ishemije mrežnjače (DRI), dijabetičkog edema mrežnjače (DRE), miopijske neovaskularizacije i retinopatije prevremeno rođenih (ROP) i njihovih kombinacija.
3. Molekul siRNA za upotrebu u lečenju i/ili sprečavanju bolesti mrežnjače povezane sa neovaskularizacijom koja je naznačena povećanom ekspresijom i/ili aktivnošću NRARP u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu navedena siRNA sadrži dvolančani region od 19 nukleotida, opciono pri čemu je navedena siRNA sa tupim krajevima.
4. Molekul siRNA za upotrebu u lečenju i/ili sprečavanju bolesti mrežnjače povezane sa neovaskularizacijom koja je naznačena povećanom ekspresijom i/ili aktivnošću NRARP u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu navedena siRNA sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 10 do SEQ ID NO. 18, i poželjno pri čemu navedena siRNA sadrži ili se sastoji od sens lanca koji sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 10 do SEQ ID NO. 18, i antisens lanca koji je komplementaran sens lancu.
5. Molekul siRNA za upotrebu u lečenju i/ili sprečavanju bolesti mrežnjače povezane sa neovaskularizacijom koja je naznačena povećanom ekspresijom i/ili aktivnošću NRARP u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu najmanje
jedan nukleotid sadrži hemijsku modifikaciju, poželjno pri čemu je navedena hemijska modifikacija nukleotida odabrana od: 2’-O-metil modifikacije, 2’-fluoro modifikacije, introdukovanja fosforotioatnih modifikovanih nukleotida, supstitucije uracila sa 5-propiniluracilom, supstitucije uracila sa 5’-metiluridinom, supstitucije uracil riboznih nukleotida sa 4’-tioribozom i supstitucije uracil riboznih nukleotida sa dezoksitimidinskim nukleotidima i njihovih kombinacija.
6. Molekul siRNA za upotrebu u lečenju i/ili sprečavanju bolesti mrežnjače povezane sa neovaskularizacijom koja je naznačena povećanom ekspresijom i/ili aktivnošću NRARP u skladu sa patentnim zahtevom 5, pri čemu je navedena hemijska modifikacija na sens lancu, antisens lancu ili na oba.
7. Molekul siRNA za upotrebu u lečenju i/ili sprečavanju bolesti mrežnjače povezane sa neovaskularizacijom koja je naznačena povećanom ekspresijom i/ili aktivnošću NRARP u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 5 ili 6, pri čemu navedena siRNA sadrži najmanje jednu sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 19 - SEQ ID NO. 66; poželjno pri čemu navedena siRNA sadrži ili se sastoji od sens lanca koji sadrži ili se sastoji od najmanje jedne sekvence koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO.23, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO.59, SEQ ID NO.61, SEQ ID NO.63 i SEQ ID NO.65, i antisens lanca koji je komplementaran sens lancu koji je odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO.
28, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO.
38, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO.
48, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO.
58, SEQ ID NO.60, SEQ ID NO.62, SEQ ID NO.64 i SEQ ID NO.66.
4
RS20250916A 2015-09-08 2016-09-07 Sirna i njena upotreba u postupcima i kompozicijama za inhibiranje ekspresije nrarp gena RS67288B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15382440 2015-09-08
EP16766270.9A EP3347470B1 (en) 2015-09-08 2016-09-07 Sirna and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the nrarp gene
PCT/EP2016/071122 WO2017042238A1 (en) 2015-09-08 2016-09-07 Sirna and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the nrarp gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67288B1 true RS67288B1 (sr) 2025-11-28

Family

ID=54199152

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250916A RS67288B1 (sr) 2015-09-08 2016-09-07 Sirna i njena upotreba u postupcima i kompozicijama za inhibiranje ekspresije nrarp gena

Country Status (24)

Country Link
US (1) US10752896B2 (sr)
EP (2) EP3347470B1 (sr)
JP (3) JP6946297B2 (sr)
KR (2) KR102708889B1 (sr)
CN (2) CN114632090B (sr)
AU (1) AU2016319072B2 (sr)
CO (1) CO2018003596A2 (sr)
DK (1) DK3347470T3 (sr)
ES (1) ES3042567T3 (sr)
FI (1) FI3347470T3 (sr)
HR (1) HRP20251155T1 (sr)
HU (1) HUE073212T2 (sr)
IL (2) IL257524B2 (sr)
LT (1) LT3347470T (sr)
MA (1) MA44908A (sr)
MX (2) MX2018002857A (sr)
MY (1) MY185638A (sr)
PL (1) PL3347470T3 (sr)
PT (1) PT3347470T (sr)
RS (1) RS67288B1 (sr)
RU (1) RU2738971C2 (sr)
SG (1) SG10202002084UA (sr)
SI (1) SI3347470T1 (sr)
WO (1) WO2017042238A1 (sr)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017104270A1 (ja) 2015-12-15 2017-06-22 日立オートモティブシステムズ株式会社 車両用制御装置
EP4560019A1 (en) 2023-11-22 2025-05-28 Sylentis S.A.U. Sirna and compositions for prophylactic and therapeutic treatment of ocular retinal conditions
EP4560020A1 (en) 2023-11-22 2025-05-28 Sylentis S.A.U. Sirna and compositions for prophylactic and therapeutic treatment of ocular retinal conditions
CN120137968B (zh) * 2025-02-13 2025-12-09 上海市第一人民医院 Rna、药物组合物、缀合物及应用

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US20040259247A1 (en) 2000-12-01 2004-12-23 Thomas Tuschl Rna interference mediating small rna molecules
US20060040262A1 (en) * 2002-12-27 2006-02-23 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
US20050202428A1 (en) * 2002-02-13 2005-09-15 Axordia Limited Pluripotential stem cells
AU2003260370B2 (en) 2002-08-05 2008-05-22 Silence Therapeutics Gmbh Further novel forms of interfering RNA molecules
EP2305812A3 (en) * 2002-11-14 2012-06-06 Dharmacon, Inc. Fuctional and hyperfunctional sirna
WO2005062937A2 (en) 2003-12-22 2005-07-14 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended sirna
GB0521716D0 (en) 2005-10-25 2005-11-30 Genomica Sau Modulation of 11beta-hydroxysteriod dehydrogenase 1 expression for the treatment of ocular diseases
GB0608838D0 (en) 2006-05-04 2006-06-14 Novartis Ag Organic compounds
JP2010507387A (ja) 2006-10-25 2010-03-11 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド 新規のｓｉＲＮＡおよびその使用方法
US20100292301A1 (en) 2007-02-28 2010-11-18 Elena Feinstein Novel sirna structures
AU2008306455C1 (en) 2007-10-03 2014-04-17 Quark Pharmaceuticals, Inc. Novel siRNA structures
ES2563984T3 (es) 2008-10-22 2016-03-17 Quark Pharmaceuticals, Inc. Métodos para el tratamiento de trastornos oculares
WO2010058426A2 (en) * 2008-11-21 2010-05-27 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Inhibition of vegf-a secretion, angiogenesis and/or neoangiogenesis by sina mediated knockdown of vegf-c and rhoa
MX2012001716A (es) * 2009-08-14 2012-04-02 Genentech Inc Marcadores biologicos para monitorizar la respuesta del paciente a los antagonistas vegf.
KR101237036B1 (ko) 2009-11-04 2013-02-25 성균관대학교산학협력단 안티센스 가닥에 의한 오프-타겟 효과를 최소화한 신규한 ｓｉＲＮＡ 구조 및 그 용도
EP2390327A1 (en) * 2010-05-27 2011-11-30 Sylentis S.A. siRNA and their use in methods and compositions for the treatment and/or prevention of eye conditions
WO2012140234A1 (en) * 2011-04-13 2012-10-18 Vib Vzw Modulation of mirna in diseases with aberrant angiogenesis
US20130123330A1 (en) 2011-07-15 2013-05-16 Patrick Y. Lu Dual Targeted siRNA Therapeutics for Treatment of Diabetic Retinopathy and Other Ocular Neovascularization Diseases
KR101535341B1 (ko) * 2012-07-02 2015-07-13 한화케미칼 주식회사 Dll4에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도
KR20140085790A (ko) * 2012-12-27 2014-07-08 한화케미칼 주식회사 Ｎｏｔｃｈ 신호전달을 효과적으로 저해하는 ｄｌｌ４에 특이적인 신규한 인간 단일클론항체
EP2865757A1 (en) * 2013-10-22 2015-04-29 Sylentis, S.A.U. siRNA and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the PDK1 gene.
EP2865756A1 (en) * 2013-10-22 2015-04-29 Sylentis, S.A.U. siRNA and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the FLAP gene.
EP2865758A1 (en) * 2013-10-22 2015-04-29 Sylentis, S.A.U. siRNA and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the ORAI1 gene
CN105624159B (zh) * 2016-02-22 2019-02-05 中国人民解放军第二军医大学 一种针对人EDIL3基因的siRNA及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP6946297B2 (ja) 2021-10-06
US20180340177A1 (en) 2018-11-29
HRP20251155T1 (hr) 2025-12-05
CO2018003596A2 (es) 2018-08-31
US10752896B2 (en) 2020-08-25
IL257524B2 (en) 2024-01-01
PT3347470T (pt) 2025-09-25
WO2017042238A1 (en) 2017-03-16
JP2018526031A (ja) 2018-09-13
HUE073212T2 (hu) 2026-01-28
KR20180039760A (ko) 2018-04-18
RU2018112453A3 (sr) 2020-05-18
ES3042567T3 (en) 2025-11-21
DK3347470T3 (da) 2025-09-29
MY185638A (en) 2021-05-27
AU2016319072A1 (en) 2018-03-15
CN114632090B (zh) 2023-09-29
MA44908A (fr) 2018-07-18
IL295206B2 (en) 2024-02-01
CN108026530A (zh) 2018-05-11
KR102741279B1 (ko) 2024-12-11
MX2022000554A (es) 2022-02-10
PL3347470T3 (pl) 2025-11-24
IL257524B1 (en) 2023-09-01
FI3347470T3 (fi) 2025-10-08
RU2738971C2 (ru) 2020-12-21
EP4599889A3 (en) 2026-04-29
IL295206B1 (en) 2023-10-01
IL257524A (en) 2018-04-30
EP4599889A2 (en) 2025-08-13
RU2018112453A (ru) 2019-10-10
EP3347470B1 (en) 2025-07-09
MX2018002857A (es) 2018-09-12
KR20240000615A (ko) 2024-01-02
IL295206A (en) 2022-10-01
HK1257658A1 (en) 2019-10-25
JP2022000035A (ja) 2022-01-04
CA2997648A1 (en) 2017-03-16
CN114632090A (zh) 2022-06-17
LT3347470T (lt) 2025-12-10
JP7394815B2 (ja) 2023-12-08
KR102708889B1 (ko) 2024-09-25
JP2023144029A (ja) 2023-10-06
AU2016319072B2 (en) 2022-03-17
CN108026530B (zh) 2022-03-04
SG10202002084UA (en) 2020-05-28
EP3347470A1 (en) 2018-07-18
SI3347470T1 (sl) 2025-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7394815B2 (ja) ＮＲＡＲＰ遺伝子の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡ、並びにそのための方法及び組成物におけるそれらの使用
Guzman‐Aranguez et al. Small‐interfering RNA s (siRNA s) as a promising tool for ocular therapy
JP5592892B2 (ja) 眼障害の治療方法
KR101553753B1 (ko) Ｒｈｏａ에 대한 이중 가닥 ｒｎａ 및 그의 용도
Hirano et al. Suppression of ICAM-1 in retinal and choroidal endothelial cells by plasmid small-interfering RNAs in vivo
RS57620B1 (sr) Sirnk i njena primena u metodama i kompozicijama za lečenje i/ili prevenciju očnih stanja
WO2017042239A1 (en) siRNA and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the CHI3L1 gene
CN103221540A (zh) 病毒基因组中的高度保守区序列作为设计治疗性sliRNA模板的应用
CA2997648C (en) Sirna and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the nrarp gene
HK40128503A (en) Sirna and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the nrarp gene
HK1257658B (en) Sirna and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the nrarp gene
Pañeda et al. Recent advances in ocular nucleic acid-based therapies: the silent era
CN102727513B (zh) 靶向于组织因子基因的小核酸及其用途
EP4560020A1 (en) Sirna and compositions for prophylactic and therapeutic treatment of ocular retinal conditions
BR112018004578B1 (pt) Sirna e a sua utilização em métodos e composições para a inibição da expressão do gene nrarp
EP4560019A1 (en) Sirna and compositions for prophylactic and therapeutic treatment of ocular retinal conditions
Wang et al. Gene therapy using SiRNA for treatment of ocular neovascularization