ES3046537T3 - Steroids and protein-conjugates thereof - Google Patents

Steroids and protein-conjugates thereof

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ES3046537T3
ES3046537T3 ES17801239T ES17801239T ES3046537T3 ES 3046537 T3 ES3046537 T3 ES 3046537T3 ES 17801239 T ES17801239 T ES 17801239T ES 17801239 T ES17801239 T ES 17801239T ES 3046537 T3 ES3046537 T3 ES 3046537T3
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Amy Han
William Olson
J Andrew Murphy
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Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Se describen en este documento conjugados de esteroides proteicos que son útiles, por ejemplo, para la administración específica de glucocorticoides (GC) a las células. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Esteroides y conjugados de proteínas de los mismos
[0005] Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
[0007] Esta solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la Solicitud de patente provisional U.S. No. 62/508,317 presentada el 18 de mayo de 2017, y también la Solicitud de patente provisional U.S. No. 62/419,365, presentada el 8 de noviembre de 2016.
[0009] Campo
[0011] En el presente documento se proporcionan novedosos conjugados de esteroides y proteínas, y conjugados para su uso en métodos para tratar enfermedades, trastornos y afecciones que comprenden la administración de los conjugados.
[0013] Antecedentes
[0015] Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) son anticuerpos que están unidos covalentemente a fármacos de moléculas pequeñas biológicamente activos, combinando así la especificidad de orientación de los anticuerpos con el modo de acción y la potencia de los fármacos de moléculas pequeñas. La utilidad terapéutica de los ADC se ha validado en el tratamiento del cáncer y es un importante foco de estudio en curso. ADCETRIS® (brentruximab vedotin) y KADCYLA® (ado-trastuzumab emtansina) son ADC aprobados para el tratamiento de ciertos tipos de cáncer, y al menos cuarenta ADC se encuentran actualmente en desarrollo clínico.
[0017] Los glucocorticoides (GC) son esteroides de moléculas pequeñas que se unen a los receptores de glucocorticoides (GR) y se utilizan en terapias antiinflamatorias e inmunosupresoras. Sin embargo, debido a la expresión ubicua de los receptores de glucocorticoides en muchos tipos de células, los tratamientos con glucocorticoides se ven comprometidos por toxicidades en la mayoría de los sistemas orgánicos. Por lo tanto, se necesitan tanto nuevos glucocorticoides como novedosas terapias que minimicen los efectos secundarios que surgen de la administración de glucocorticoides, en particular los que surgen de la activación de los receptores de glucocorticoides en células no objetivo. La presente divulgación proporciona soluciones a las necesidades antes mencionadas, así como otras necesidades no satisfechas en el campo al que se refiere la presente divulgación. En la presente divulgación se incluyen conjugados anticuerpo-fármaco que comprenden cargas útiles de glucocorticoides.
[0019] El documento WO 2015/153401 A1 se refiere a enlazadores basados en fosfato con estabilidad ajustable para la administración intracelular de conjugados de fármacos. Los enlazadores basados en fosfato comprenden un grupo monofosfato, difosfato, trifosfato o tetrafosfato (grupo fosfato) y un brazo enlazador que comprende un elemento de ajuste y opcionalmente un espaciador. Una carga útil está unida covalentemente al grupo fosfato en el extremo distal del brazo de enlace y el grupo funcional en el extremo proximal del brazo de enlace está unido covalentemente a un ligando objetivo específico de la célula, tal como un anticuerpo. El documento WO 2015/153401 A1 informa que estos enlazadores basados en fosfato tienen una estabilidad diferenciada y ajustable en la sangre frente a un entorno intracelular (por ejemplo, el compartimento lisosomal).
[0021] El documento WO 2011/039511 A2 se refiere a agentes terapéuticos para la administración dirigida de un agente inmunosupresor a monocitos y/o células derivadas de monocitos que comprende una fracción de unión con especificidad para monocitos y/o células derivadas de monocitos y un agente inmunosupresor. En una realización, el agente es un conjugado de glucocorticoide-anticuerpo. El documento WO 2011/039511 A2 También se refiere a métodos, usos, kits y composiciones que comprenden tales agentes.
[0023] Resumen
[0025] La invención es tal como se define en las reivindicaciones.
[0027] Los métodos de tratamiento no entran dentro del ámbito de las reivindicaciones. En lugar de ello, cualquier referencia a métodos de tratamiento puede entenderse como proporcionada para ilustrar cómo pueden usarse los compuestos, conjugados y composiciones farmacéuticas de la presente divulgación.
[0029] En esta divulgación se proporcionan compuestos y métodos útiles para el tratamiento de diversas enfermedades, trastornos o afecciones. En ciertos aspectos, los conjugados de la invención comprenden un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (A):
[0030]
[0032] o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
[0033] en donde:
[0034] R1 y R2 son, independientemente, -H, alquilo, alquil-C(O)-O-, -OH, o halo; o R1 y
[0035] R2 juntos forman
[0038]
[0040] en donde R4 es alquilo, arilo, arilalquilo o un heterocicloalquilo que contiene N,
[0041] en donde el alquilo, arilo, arilalquilo y heterocicloalquilo que contiene N están, independientemente en cada caso, opcionalmente sustituidos con -NRaRb;
[0042] R3 es-NRaRb;
[0043] R5 es, independientemente en cada caso, -OH, halo, alquilo o arilalquilo;
[0044] Ra y Rb son, independientemente en cada caso, -H, alquilo o arilo opcionalmente sustituido;
[0045] n es un número entero de 0-19; y
[0046] en donde el agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
[0047] En ciertos aspectos, los compuestos son conjugados anticuerpo-fármaco, o conjugados de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo con un fármaco, que comprenden un compuesto de Fórmula (A) y una fracción de ciclodextrina.
[0048] Breves descripciones de los dibujos
[0050] FIG. 1. muestra una secuencia para sintetizar ciertos esteroides descritos en este documento.
[0051] FIG. 2. muestra una secuencia para modificar la posición del alcohol primario de la budesonida.
[0052] FIG. 3. muestra una secuencia para modificar la posición del alcohol primario de Flumetasona.
[0053] FIG. 4. muestra una secuencia para modificar la posición del alcohol primario de la dexametasona.
[0054] FIG. 5 muestra un espectro de resonancia magnética nuclear bidimensional con efecto Overhauser (NOE) (de aquí en adelante, "2D-NOESY") para el compuesto 7-1Ren la Tabla 1.
[0055] FIG. 6 muestra un NOESY 2D para el compuesto 7-1S en la Tabla 1.
[0056] FIG. 7 muestra un espectro 2D-NOESY para 11-5R en la Tabla 1.
[0057] FIG. 8 muestra un espectro 2D-NOESY para el compuesto 11-5S en la Tabla 1.
[0058] FIG. 9 muestra un enfoque general para sintetizar ciertos Enlazador-Cargas útiles.
[0059] FIG. 10 muestra una secuencia para sintetizar DIBAC-Suc-NHS (Compuesto (V)).
[0060] FIG. 11 muestra una secuencia para sintetizar DIBAC-Suc-PEG4-ácido/NHS (Compuesto (VI)).
[0061] FIG. 12 muestra una secuencia para sintetizar BCN-PEG4-Ácido (Compuesto (VII)).
[0062] FIG. 13 muestra una secuencia para sintetizar DIBAC-Suc-PEG4-VC-pAB-PNP (Compuesto (VIII)).
[0063] FIG. 14 muestra una secuencia para sintetizar la Carga útil del Enlazador 1 (LP1).
[0064] FIG. 15 muestra una secuencia para sintetizar la Carga útil del Enlazador 2 (LP2) y Carga útil del Enlazador 3 (LP3).
[0065] FIG. 16 muestra una secuencia para sintetizar la Carga útil del Enlazador 4-11 (LP4-LP11).
[0066] FIG. 17 muestra una secuencia para sintetizar la Carga útil del Enlazador 12 (LP12).
[0067] FIG. 18 muestra una secuencia de síntesis para crear la Carga útil del Enlazador 12 (LP13) y Carga útil del Enlazador 14 (LP14).
[0068] FIG. 19 muestra un proceso sintético general para una conjugación de ADC a través de una reacción de clic [2+3] con LP4.
[0069] FIG. 20 muestra un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie de un anticuerpo anti-PRLR, un anticuerpo anti-PRLR funcionalizado con azido y un conjugado de anticuerpo-LP4 anti-PRLR como se describe en el Ejemplo 59.
[0070] FIG. 21 muestra la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de un anticuerpo anti-PRLR, un anticuerpo funcionalizado con azido y un conjugado 4DAR anti-PRLR-LP4 como se describe en el Ejemplo 59.
[0071] FIG. 22 muestra un análisis ESI-MS de un anticuerpo anti-PRLR, un anticuerpo anti-PRLR funcionalizado con azido y un conjugado de anticuerpo-LP4 anti-PRLR como se describe en el Ejemplo 59.
[0072] FIG. 23 muestra la activación selectiva de GR en células 293/PRLR/GRE-Luc (FIG. 23A) y células 293/MMTV-Luc (FIG. 23B) mediante ADC de esteroides y control de budesonida como se describe en el Ejemplo 64. FIG. 24 muestra la contribución carga útil del enlazador a la activación de GR por el ADC de esteroides y el control de budesonida según lo probado en células 293/PRLR/GRE-Luc como se describe en el Ejemplo 65. FIG. 25 muestra la activación del receptor de glucocorticoides en una línea celular HEK293/MMTV-luc/IL-2R<y>/IL7R por budesonida, 11-5 en la Tabla 1, y ncADC anti-IL2RY a las veinticuatro (24), cuarenta y ocho (48) o setenta y dos (72) horas como se describe en el ejemplo 66.
[0073] FIG. 26 muestra una secuencia para sintetizar la Carga útil del Enlazador (LP7).
[0074] FIG. 27 muestra un proceso sintético para preparar el compuesto (27b).
[0075] FIG. 28 muestra una secuencia para sintetizar Enlazador-Cargas útiles (LP15 y LP16).
[0076] FIG. 29 muestra un proceso sintético general para una conjugación de ADC a través de una reacción de clic [2+3] con ciclodextrina-Enlazador-Cargas útiles.
[0077] FIG. 30 muestra la bioactividad de los ADC esteroides con y sin enlazadores de ciclodextrina en un gráfico de unidades de luz relativas (RLU) frente a log-io [M].
[0078] FIG. 31 muestra una secuencia para sintetizar ciertos esteroides (cargas útiles 1-6) descritos en este documento.
[0079] FIG. 32 muestra una secuencia para sintetizar ciertos enlazador-esteroides (LP101 a LP116).
[0080] FIG. 33 muestra un proceso sintético general para una conjugación de ADC a través de la reacción de clic [2+3].
[0081] FIG. 34 muestra ESI-MS de Ab anti-PRLR, Ab anti-PRLR-N3y anti-PRLR-LPs.
[0082] FIG. 35 muestra ESI-MS de Ab anti-Fel d1, Ab-PEG anti-Fel d13-N3y Ab-LP anti-Fel d1.
[0083] FIG. 36 muestra la bioactividad de los ADC esteroides en células positivas al antígeno (células 293_PRLR_PBind GR/UAS-Luc, FIG. 36A) frente a células negativas al antígeno (células 293_PBind GR/UAS-Luc, FIG. 36B) en un gráfico de unidades de luz relativas (RLU) frente a Log10 [M].
[0084] FIG. 37A muestra la media entre la concentración sanguínea y el tiempo para los compuestos 4b y 6-I.
[0085] FIG. 37B muestra el nivel de TNF-a en muestras de sangre de las cargas útiles 4b y 6-I como se describe en los Ejemplos 120-121.
[0086] Descripción detallada
[0087] A. Definiciones
[0088] Tal como se utiliza en este documento, "alquilo" se refiere a una fracción radical de hidrocarburo monovalente y saturado. El alquilo está opcionalmente sustituido y puede ser lineal o ramificado. Alquilo incluye, pero no se limita a, aquellos que tienen 1-20 átomos de carbono,es decir,C1-20 alquilo; 1-12 átomos de carbono,es decir,C1-12 alquilo; 1-8 átomos de carbono,es decir,C1-8 alquilo; 1-6 átomos de carbono,es decir,C1-6 alquilo; y 1-3 átomos de carbono,es decir,C1-3 alquilo. Ejemplos de fracciones alquilo incluyen, pero no se limitan a metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, s-butilo, í-butilo, i-butilo, una fracción pentilo y una fracción hexilo. "Alquileno" es alquilo divalente.
[0090] Como se usa en este documento, "haloalquilo" se refiere a alquilo, como se definió anteriormente, en donde el alquilo incluye al menos un sustituyente seleccionado de un halógeno, por ejemplo, F, Cl, Br o I.
[0092] Como se utiliza en este documento, "alquenilo" se refiere a una fracción radical de hidrocarburo monovalente que contiene al menos dos átomos de carbono y uno o más enlaces dobles carbono-carbono no aromáticos. El alquenilo está opcionalmente sustituido y puede ser lineal, ramificado o cíclico. El alquenilo incluye, pero no se limita a, aquellos que tienen de 2 a 20 átomos de carbono,es decir,C2-20 alquenilo; 2-12 átomos de carbono,es decir,C2-12 alquenilo; 2-8 átomos de carbono,es decir,C2-8 alquenilo; 2-6 átomos de carbono,es decir,C2-6 alquenilo; y 2-4 átomos de carbono,es decir,C2-4 alquenilo. Ejemplos de fracciones alquenilo incluyen, pero no se limitan a vinilo, propenilo, butenilo y ciclohexenilo. "Alquenileno" es alquenilo divalente.
[0094] Como se utiliza en este documento, "alquinilo" se refiere a una fracción radical de hidrocarburo monovalente que contiene al menos dos átomos de carbono y uno o más enlaces triples carbono-carbono. El alquinilo está opcionalmente sustituido y puede ser lineal, ramificado o cíclico. El alquinilo incluye, pero no se limita a, aquellos que tienen de 2 a 20 átomos de carbono,es decir,C2-20 alquinilo; 2-12 átomos de carbono,es decir,C2-12 alquinilo; 2-8 átomos de carbono,es decir,C2-8 alquinilo; 2-6 átomos de carbono,es decir,C2-6 alquinilo; y 2-4 átomos de carbono,es decir,C2-4 alquinilo. Ejemplos de fracciones alquinilo incluyen, pero no se limitan a etinilo, propinilo y butinilo. "Alquinileno" es alquinilo divalente.
[0096] Como se usa en este documento, "alcoxi" se refiere a una fracción radical de hidrocarburo monovalente y saturado en donde el hidrocarburo incluye un enlace sencillo a un átomo de oxígeno y en donde el radical está localizado en el átomo de oxígeno, por ejemplo, CH3CH2-O para etoxi. Los sustituyentes alcoxi se unen al compuesto que sustituyen a través de este átomo de oxígeno del sustituyente alcoxi. El alcoxi está opcionalmente sustituido y puede ser lineal, ramificado o cíclico,es decir,cicloalcoxi. Alcoxi incluye, pero no se limita a, aquellos que tienen 1-20 átomos de carbono,es decir,C1-20 alcoxi; 1-12 átomos de carbono,es decir,C1-12 alcoxi; 1-8 átomos de carbono,es decir,C1-8 alcoxi; 1-6 átomos de carbono,es decir,C1-6 alcoxi; y 1-3 átomos de carbono,es decir,C1-3 alcoxi. Ejemplos de fracciones alcoxi incluyen, pero no se limitan a metoxi, etoxi, n-propoxi, i-propoxi, n-butoxi, s-butoxi, í-butoxi, i-butoxi, una fracción pentoxi, una fracción hexoxi, ciclopropoxi, ciclobutoxi, ciclopentoxi y ciclohexoxi.
[0098] Como se usa en este documento, "haloalcoxi" se refiere a alcoxi, como se definió anteriormente, en donde el alcoxi incluye al menos un sustituyente seleccionado de un halógeno, por ejemplo, F, Cl, Br o I.
[0100] Como se utiliza en este documento, "arilo" se refiere a una fracción monovalente que es un radical de un compuesto aromático en donde los átomos del anillo son átomos de carbono. El arilo está opcionalmente sustituido y puede ser monocíclico o policíclico. por ejemplo, bicíclico o tricíclico. Ejemplos de fracciones arilo incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen 6 a 20 átomos de carbono en el anillo,es decir,C6-20 arilo; de 6 a 15 átomos de carbono en el anillo,es decir,C6-15 arilo y de 6 a 10 átomos de carbono en el anillo,es decir,C6-10 arilo. Ejemplos de fracciones arilo incluyen, pero se limitan a, fenilo, naftilo, fluorenilo, azulenilo, antrilo, fenantrilo y pirenilo.
[0102] Como se usa en este documento, "arilalquilo" se refiere a una fracción monovalente que es un radical de un compuesto de alquilo, en donde el compuesto de alquilo está sustituido con un sustituyente aromático,es decir,el compuesto aromático incluye un enlace simple a un grupo alquilo y en donde el radical está localizado en el grupo alquilo. Un grupo arilalquilo se une a la estructura química ilustrada a través del grupo alquilo. Un arilalquilo puede representarse mediante la estructura, por ejemplo,
[0105]
[0108] en donde B es una fracción aromática, por ejemplo, fenilo. El arilalquilo está opcionalmente sustituido,es decir,el grupo arilo y/o el grupo alquilo, pueden sustituirse como se describe en este documento. Ejemplos de arilalquilo incluyen, pero no se limitan a, bencilo.
[0110] Como se usa en este documento, "ariloxi" se refiere a una fracción monovalente que es un radical de un compuesto aromático en donde los átomos del anillo son átomos de carbono y en donde el anillo está sustituido con un radical de oxígeno,es decir,el compuesto aromático incluye un enlace sencillo a un átomo de oxígeno y en donde el radical está localizado en el átomo de oxígeno, por ejemplo,
[0113]
[0116] para fenoxi. Los sustituyentes ariloxi se unen al compuesto que sustituyen a través de este átomo de oxígeno. El ariloxi está opcionalmente sustituido. El ariloxi incluye, pero no se limita a, aquellos que tienen de 6 a 20 átomos de carbono en el anillo,es decir,C6-20 ariloxi; 6 a 15 átomos de carbono en el anillo,es decir,C6-15 ariloxi, y de 6 a 10 átomos de carbono en el anillo,es decir,C6-10 ariloxi. Ejemplos de fracciones ariloxi incluyen, pero no se limitan a fenoxi, naftoxi y antroxi.
[0118] Tal como se utiliza en el presente documento, "RaRb"N-ariloxi" se refiere a una fracción monovalente que es un radical de un compuesto aromático en donde los átomos del anillo son átomos de carbono y en donde el anillo está sustituido con un sustituyente de RaRbN y un radical oxígeno,es decir,El compuesto aromático incluye un enlace sencillo a un sustituyente de RaRbN y un enlace sencillo a un átomo de oxígeno y en donde el radical está localizado en el átomo de oxígeno, por ejemplo,
[0121]
[0124] los sustituyentes de RaRbN-ariloxi se unen al compuesto que sustituyen a través de este átomo de oxígeno. RaRbN-ariloxi está opcionalmente sustituido. RaRbN-ariloxi incluye, pero no se limita a, aquellos que tienen de 6 a 20 átomos de carbono en el anillo, de 6 a 15 átomos de carbono en el anillo y de 6 a 10 átomos de carbono en el anillo. Un ejemplo de una fracción de RaRbN-ariloxi incluye, pero no se limita a, 4-(dimetil-amino)-fenoxi,
[0127]
[0130] Tal como se utiliza en este documento, "arileno" se refiere a una fracción divalente de un compuesto aromático en donde los átomos del anillo son solo átomos de carbono. El arileno está opcionalmente sustituido y puede ser monocíclico o policíclico. por ejemplo, bicíclico o tricíclico. Ejemplos de fracciones arileno incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen de 6 a 20 átomos de carbono en el anillo,es decir,C6-20 arileno; de 6 a 15 átomos de carbono en el anillo,es decir,C6-15 arileno y de 6 a 10 átomos de carbono en el anillo,es decir,C6-10 arileno.
[0132] Como se utiliza en este documento, "heteroalquilo" se refiere a un alquilo en donde uno o más átomos de carbono están reemplazados por heteroátomos. Como se utiliza en este documento, "heteroalquenilo" se refiere a un alquenilo en donde uno o más átomos de carbono están reemplazados por heteroátomos. Como se utiliza en este documento, "heteroalquinilo" se refiere a un alquinilo en donde uno o más átomos de carbono están reemplazados por heteroátomos. Los heteroátomos adecuados incluyen, pero no se limitan a átomos de nitrógeno, oxígeno y azufre. El heteroalquilo está opcionalmente sustituido. Ejemplos de fracciones heteroalquilo incluyen, pero no se limitan a aminoalquilo, sulfonilalquilo y sulfinilalquilo. Ejemplos de fracciones heteroalquilo también incluyen, pero no se limitan a, metilamino, metilsulfonilo y metilsulfinilo.
[0134] Como se utiliza en este documento, "heteroarilo" se refiere a una fracción monovalente que es un radical de un compuesto aromático en donde los átomos del anillo contienen átomos de carbono y al menos un átomo de oxígeno, azufre, nitrógeno o fósforo. Ejemplos de fracciones heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen de 5 a 20 átomos de anillo; de 5 a 15 átomos de anillo; y de 5 a 10 átomos de anillo. El heteroarilo está opcionalmente sustituido.
[0136] Como se utiliza en este documento, "heteroarileno" se refiere a un arileno en donde uno o más átomos del anillo aromático están reemplazados por un átomo de oxígeno, azufre, nitrógeno o fósforo. El heteroarileno está opcionalmente sustituido.
[0138] Como se utiliza en este documento, "heterocicloalquilo" se refiere a un cicloalquilo en donde uno o más átomos de carbono están reemplazados por heteroátomos. Los heteroátomos adecuados incluyen, pero no se limitan a átomos de nitrógeno, oxígeno y azufre. El heterocicloalquilo está opcionalmente sustituido. Ejemplos de fracciones heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, morfolinilo, piperidinilo, tetrahidropiranilo, pirrolidinilo, imidazolidinilo, oxazolidinilo, tiazolidinilo, dioxolanilo, ditiolanilo, oxanilo o tianilo.
[0140] Tal como se utiliza en el presente documento, "heterocicloalquilo que contiene N" se refiere a un cicloalquilo en donde uno o más átomos de carbono están reemplazados por heteroátomos y en donde al menos un heteroátomo es un átomo de nitrógeno. Los heteroátomos adecuados, además del nitrógeno, incluyen, pero no se limitan a átomos de oxígeno y azufre. El heterocicloalquilo que contiene N está opcionalmente sustituido. Ejemplos de fracciones heterocicloalquilo que contienen N incluyen, pero no se limitan a, morfolinilo, piperidinilo, pirrolidinilo, imidazolidinilo, oxazolidinilo o tiazolidinilo.
[0142] Como se usa en este documento, "opcionalmente sustituido", cuando se usa para describir una fracción radical, por ejemplo, alquilo opcionalmente sustituido, significa que dicha fracción está opcionalmente unida a uno o más sustituyentes. Ejemplos de dichos sustituyentes incluyen, pero no se limitan a, halo, ciano, nitro, haloalquilo, azido, epoxi, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido,
[0143] O O O
[0144] -I-OrA -J-Sra -I-nrarb -^ -R a —I-U-orA -I-Ü—NrArB
[0147]
[0150] o
[0152] A s W<II>i
[0154] II
[0156] en donde RA, RB, y RC son, independientemente en cada presencia, un átomo de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, arilalquilo, heteroalquilo, heteroarilo o heterocicloalquilo, o RA y RB, junto con los átomos a los que están unidos, forman un anillo carbocíclico saturado o insaturado, en donde el anillo está opcionalmente sustituido y en donde uno o más átomos del anillo están opcionalmente reemplazados con un heteroátomo. En ciertos ejemplos, cuando una fracción radical está opcionalmente sustituida con un heteroarilo opcionalmente sustituido, un heterocicloalquilo opcionalmente sustituido o un anillo carbocíclico saturado o insaturado opcionalmente sustituido, los sustituyentes en el heteroarilo opcionalmente sustituido, el heterocicloalquilo opcionalmente sustituido o el anillo carbocíclico saturado o insaturado opcionalmente sustituido, si están sustituidos, no están sustituidos con sustituyentes que estén además opcionalmente sustituidos con sustituyentes adicionales. En algunos ejemplos, cuando un grupo descrito en este documento está opcionalmente sustituido, el sustituyente unido al grupo no está sustituido a menos que se especifique lo contrario.
[0158] Tal como se utiliza en el presente documento, "agente de unión" se refiere a un anticuerpo o a un fragmento de unión a antígeno del mismo.
[0160] Tal como se utiliza en este documento, "enlazador" se refiere a una fracción divalente que enlaza covalentemente el agente de unión al esteroide descrito en este documento.
[0162] Como se utiliza en este documento, "condiciones de síntesis de amida" se refiere a condiciones de reacción adecuadas para facilitar la formación de una amida, por ejemplo, mediante la reacción de un ácido carboxílico, ácido carboxílico activado o haluro de acilo con una amina. En algunos ejemplos, "condiciones de síntesis de amida" se refiere a condiciones de reacción adecuadas para facilitar la formación de un enlace amida entre un ácido carboxílico y una amina. En algunos de estos ejemplos, el ácido carboxílico se convierte primero en un ácido carboxílico activado antes de que el ácido carboxílico activado reaccione con una amina para formar una amida. Las condiciones adecuadas para efectuar la formación de una amida incluyen, pero no se limitan a, aquellas que utilizan reactivos para efectuar la reacción entre un ácido carboxílico y una amina, incluyendo, pero no limitado a, diciclohexilcarbodiimida (DCC), diisopropilcarbodiimida (DIC), hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio (BOP), hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyBOP), hexafluorofosfato de (7-azabenzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfonio (PyAOP), hexafluorofosfato de bromotripirrolidinofosfonio (PyBrOP), hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU), tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU), 3-óxido hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio (HATU), 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina (EEDQ), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), hexafluorofosfato de 2-cloro-1,3-dimetilimidazolidinio (CIP), 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT) y carbonildiimidazol (CDI). En algunos ejemplos, un ácido carboxílico se convierte primero en un éster carboxílico activado antes de reaccionar con una amina para formar un enlace amida. En ciertos ejemplos, el ácido carboxílico reacciona con un reactivo. El reactivo activa el ácido carboxílico desprotonándolo y luego formando un complejo de producto con el ácido carboxílico desprotonado como resultado del ataque nucleofílico del ácido carboxílico desprotonado sobre el reactivo protonado. Para ciertos ácidos carboxílicos, este éster activado es más susceptible posteriormente al ataque nucleofílico por una amina que el ácido carboxílico antes de ser convertido. Esto da como resultado la formación de un enlace amida. Como tal, el ácido carboxílico se describe como activado. Los reactivos de ejemplo incluyen DCC y DIC.
[0163] Como se utiliza en este documento, "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad (de un compuesto) que es suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico a un paciente en el tratamiento o manejo de una enfermedad o trastorno, o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados con la enfermedad o trastorno.
[0165] Tal como se utiliza en el presente documento, "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier sal adecuada para la administración a un paciente. Las sales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las descritas en. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 1977, 66:1. Ejemplos de sales incluyen, pero no se limitan a, sales derivadas de ácidos, derivadas de bases, orgánicas, inorgánicas, de aminas y de metales alcalinos o alcalinotérreos, incluyendo, pero no limitado a, sales de calcio, sales de magnesio, sales de potasio, sales de sodio, sales de ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico y ácido salicílico, y similares.
[0167] Ciertos grupos, fracciones, sustituyentes y átomos se representan con una línea ondulada que interseca o remata un enlace o enlaces para indicar el átomo a través del cual se unen los grupos, fracciones, sustituyentes y átomos. Por ejemplo, un grupo fenilo que está sustituido con un grupo propilo se representa como:
[0170]
[0173] tiene la siguiente estructura:
[0176]
[0179] Tal como se utiliza en este documento, las ilustraciones que muestran sustituyentes unidos a un grupo cíclico (por ejemplo, aromático, heteroaromático, anillo fusionado y cicloalquilo o heterocicloalquilo saturado o insaturado) a través de un enlace entre átomos del anillo pretenden indicar, a menos que se especifique lo contrario, que el grupo cíclico puede estar sustituido con ese sustituyente en cualquier posición del anillo en el grupo cíclico o en cualquier anillo en el grupo de anillos fusionados, de acuerdo con las técnicas aquí descritas o que son conocidas en el campo al que pertenece la presente divulgación. Por ejemplo, el grupo,
[0181] (R1)q
[0184]
[0187] en donde el subíndice q es un número entero de 0-4 y en donde las posiciones del sustituyente R1 se describen de forma genérica,es decir,no está unido directamente a ningún vértice de la estructura de la línea de enlace,es decir,átomo de carbono del anillo específico, incluye los siguientes ejemplos no limitantes de grupos en los que el sustituyente R1 está unido a un átomo de carbono de anillo específico:
[0190]
[0191]
[0193] También, por ejemplo, el grupo,
[0195]
[0197] en donde el subíndice n es un número entero de 0-19 y en donde las posiciones del sustituyente R5 se describen de forma genérica,es decir,representado como no unido directamente a ningún vértice de la estructura de la línea de enlace, incluye los siguientes ejemplos no limitantes de grupos en los que el sustituyente R5 está unido a un átomo de carbono de anillo específico:
[0199]
[0200] Como se utiliza en este documento, la expresión "enlazador reactivo" o la abreviatura "RL" se refiere a un grupo monovalente que comprende un grupo reactivo y un grupo de enlace, representado como
[0203] R G -L — ^
[0205] en donde RG es el grupo reactivo y L es el grupo de enlace. El grupo de enlace es cualquier fracción divalente que puentea el grupo reactivo a una carga útil. Los enlazadores reactivos (RL), junto con las cargas útiles a las que están unidos, comprenden intermedios ("enlazador-cargas útiles") útiles como precursores sintéticos para la preparación de los conjugados de esteroides de anticuerpos descritos en este documento. El enlazador reactivo contiene un grupo reactivo ("RG"), que es un grupo funcional o fracción que reacciona con una porción reactiva de un anticuerpo, anticuerpo modificado o fragmento de unión a antígeno del mismo. La fracción resultante de la reacción del grupo reactivo con el anticuerpo, anticuerpo modificado o fragmento de unión a antígeno del mismo, junto con el grupo de enlace, comprende la porción de "enlazador del agente de unión" ("BL") del conjugado, descrito en este documento. En ciertas realizaciones, el "grupo reactivo" es un grupo o fracción funcional (por ejemplo, maleimida o éster NHS) que reacciona con un residuo de cisteína o lisina de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En ciertas realizaciones, el "grupo reactivo" es un grupo o fracción funcional que es capaz de experimentar una reacción de química clic. En algunas realizaciones de dicha reacción de química clic, el grupo reactivo es un alquino que es capaz de experimentar una reacción de 1,3 cicloadición con una azida. Dichos grupos reactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a alquinos tensados, por ejemplo, aquellos adecuados para cicloadiciones de alquino-azida promovidas por tensión (SPAAC), cicloalquinos, por ejemplo, ciclooctinos, alquinos benzanulados y alquinos capaces de experimentar reacciones de 1,3 cicloadición con azidas en ausencia de catalizadores de cobre. Los alquinos adecuados también incluyen, pero no se limitan a, DIBAC, DIBO, BARAC, DIFO, sustituidos, por ejemplo, alquinos fluorados, aza-cicloalquinos, BCN y derivados de los mismos. Las Cargas útiles del Enlazador que comprenden dichos grupos reactivos son útiles para conjugar anticuerpos que han sido funcionalizados con grupos azido. Dichos anticuerpos funcionalizados incluyen anticuerpos funcionalizados con grupos azido-polietilenglicol. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo funcionalizado se deriva haciendo reaccionar un anticuerpo que comprende al menos un residuo de glutamina, por ejemplo, cadena pesada Q295 (numeración EU), con un compuesto según la fórmula H2N-LL-N3, en donde LL es un grupo polietilenglicol divalente, en presencia de la enzima transglutaminasa.
[0207] En algunos ejemplos, el grupo reactivo es un alquino, por ejemplo,
[0210]
[0213] que puede reaccionar mediante química de clic con una azida, por ejemplo,
[0216]
[0219] Para formar un producto de química clic, por ejemplo,
[0222]
[0225] su regioisómero, o mezcla de ellos. En algunos ejemplos, el grupo reactivo es un alquino, por ejemplo,
[0228]
[0231] que puede reaccionar mediante química de clic con una azida, por ejemplo,
[0232] Para formar un producto de química clic, por ejemplo,
[0235]
[0237] En algunos ejemplos, el grupo reactivo es un alquino, por ejemplo,
[0240]
[0242] que puede reaccionar mediante química clic con una azida, por ejemplo,
[0245]
[0247] Para formar un producto de química clic, por ejemplo,
[0250]
[0252] su regioisómero, o mezcla de ellos. En algunos ejemplos, el grupo reactivo es un grupo funcional, por ejemplo,
[0255]
[0257] que reacciona con un residuo de cisteína en un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, para formar un enlace con el mismo, por ejemplo,
[0260]
[0262] en donde Ab se refiere a un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo y S se refiere al átomo de S en un residuo de cisteína a través del cual el grupo funcional se une al Ab. En algunos ejemplos, el grupo reactivo es un grupo funcional, por ejemplo,
[0265]
[0267] que reacciona con un residuo de lisina en un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, para formar un enlace con el mismo, por ejemplo,
[0270]
[0272] en donde Ab se refiere a un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo y N se refiere al átomo de N en un residuo de lisina a través del cual el grupo funcional se une al Ab.
[0273] Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "enlazador del agente de unión" o "BL" se refiere a cualquier grupo o fracción divalente que enlaza, conecta o une un agente de unión (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo) con un compuesto de carga útil establecido en este documento (por ejemplo, esteroide). En general, los enlazadores de agentes de unión adecuados para los conjugados de anticuerpos descritos en este documento son aquellos que son suficientemente estables para explotar la vida media circulante del anticuerpo y, al mismo tiempo, capaces de liberar su carga útil después de la intemalización mediada por antígeno del conjugado. Los enlazadores pueden ser escindibles o no escindibles. Los enlazadores escindibles son enlazadores que se escinden mediante el metabolismo intracelular después de la intemalización, por ejemplo, escisión mediante hidrólisis, reducción o reacción enzimática. Los enlazadores no escindibles son enlazadores que liberan una carga útil adjunta a través de la degradación lisosomal del anticuerpo después de la internalización. Los enlazadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, enlazadores lábiles a los ácidos, enlazadores lábiles a la hidrólisis, enlazadores escindibles enzimáticamente, enlazadores lábiles a la reducción, enlazadores autoinmolativos y enlazadores no escindibles. Los enlazadores adecuados también incluyen, pero no se limitan a, aquellos que son o comprenden glucurónidos, succinimidatioéteres, unidades de polietilenglicol (PEG), hidrazonas, unidades de mal-caproilo, unidades de disulfuro (por ejemplo, -SS-, -SC(R1R2) -, en donde R1 y R2 son independientemente hidrógeno o hidrocarbilo), unidades de carbamato, unidades de para-amino-bencilo (PAB), unidades de fosfato, por ejemplo, unidades de mono-, bis­ o trisfosfato y unidades peptídicas, por ejemplo, unidades peptídicas que contienen dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más aminoácidos, incluidas, pero no limitadas a, valina-citrulina y unidades. En algunas realizaciones, el enlazador del agente de unión (BL) comprende una fracción que se forma mediante la reacción del grupo reactivo (RG) de un enlazador reactivo (RL) y la porción reactiva del agente de unión, por ejemplo, anticuerpo, anticuerpo modificado o fragmento de unión a antígeno del mismo.
[0275] En algunos ejemplos, el BL comprende la siguiente fracción:
[0277]
[0279] ejemplos, el BL comprende la siguiente fracción:
[0282]
[0285] su regioisómero, o mezcla de los mismos, en donde
es el enlace con el agente de unión. En algunos ejemplos, el BL comprende la siguiente fracción:
[0288]
[0291] su regioisómero, o mezcla de los mismos, en donde
es el enlace con el agente de unión. En algunos ejemplos, el BL comprende la siguiente fracción:
[0294]
[0298] 1
[0299] su regioisómero, o mezcla de los mismos, en donde ^es el enlace con el agente de unión. En algunos ejemplos, el BL comprende la siguiente fracción:
[0300]
[0302] 1
[0303] en donde ^ es el enlace a la cisterna del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. En algunos ejemplos, el BL comprende la siguiente fracción:
[0306]
[0308] 1
[0309] en donde ^ es el enlace a la Usina del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. En estos ejemplos, el enlace con el agente de unión es directo o a través de un enlazador. En realizaciones particulares, el agente de unión se modifica con una azida para facilitar la unión a BL. A continuación se describen ejemplos. B. Esteroides
[0310] Se proporcionan aquí conjugados, tal como se definieron anteriormente, de compuestos que tienen la estructura de Fórmula (A):
[0313]
[0315] o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
[0316] en donde los grupos variables son los definidos anteriormente.
[0317] En algunas realizaciones, el conjugado de la invención comprende un compuesto de Fórmula (A), que tiene la estructura de Fórmula (A1):
[0320]
[0322] en donde R1-R3 son como se definen anteriormente y R5A y R5B son cada uno, independientemente, un halo o un átomo de hidrógeno.
[0323] En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula (A1), R5A y R5B son átomos de hidrógeno. En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula (A1), R5A y R5B son fluorados. En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula (A1), R5A es un átomo de hidrógeno y R5B es fluoro.
[0324] En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula (A1), R1 es alquileno-C(O)-O- o -OH y R2 es alquilo. En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula (A1), R1 y R2 juntos forman
[0326] a p o
[0328] en donde R4 es arilo, arilalquilo o alquilo, en donde el arilo, arilalquilo y alquilo están opcionalmente sustituidos con -NRaRb. En algunas realizaciones, R4 es -aril- NRaRb. En algunas realizaciones, R4 es -fenil- NRaRb.
[0329] En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula (A1), R1 y R2 juntos forman
[0332]
[0334] en donde R4 es
[0336]
[0338] En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula (A1), R3 es-NRaRb, Ra es H y Rb es H o alquilo.
[0339] En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula (A1), R3 es-NH2, -NHCH3 o -N(CH3)2.
[0340] En algunas realizaciones del compuesto de Fórmula (A1), R1 y R2 juntos forman
[0343]
[0345] en donde R4 es arilo, arilalquilo o alquilo, en donde el arilo, arilalquilo y alquilo están opcionalmente sustituidos con -NRaRb; R3 es-NRaRb, Ra es H, Rb es H o alquilo; y R5, independientemente en cada presencia, es flúor o un átomo de hidrógeno.
[0346] También se exponen el compuesto s de Fórmula (A4):
[0349]
[0351] en donde R3 es -NRaRb y R4 es alquilo, en donde Ra y Rb son cada uno, independientemente, un átomo de hidrógeno o alquilo. En ciertas realizaciones, R4 es C1-4 alquilo. En algunas realizaciones, R4 es propilo. En ciertas realizaciones, R3 es -NH2,
[0352] -NHCH3, o -N(CH3)2.
[0353] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado como se definió anteriormente, que comprende un compuesto que tiene la estructura de Fórmula (I):
[0356]
[0358] o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
[0359] en donde:
[0360] R1 y R2 son, independientemente, -H, alquilo, alquil-C(O)-O-, -OH, o halo; o R1 y R2 juntos forman
[0363] R4
[0365] O 'Q
[0366] en donde R4 es alquilo, arilo, arilalquilo o un heterocicloalquilo que contiene N,
[0367] en donde el alquilo, arilo, arilalquilo y heterocicloalquilo que contiene N están, independientemente en cada caso, opcionalmente sustituidos con -NRaRb;
[0368] R3 es-NRaRb;
[0369] R5 es, independientemente en cada caso, -OH, halo, alquilo o arilalquilo;
[0370] Ra y Rb son, independientemente en cada caso, H o alquilo; y
[0371] n es un número entero de 0-19.
[0372] En algunos de estos ejemplos, R1 y R2 se seleccionan, independientemente, de -H, alquilo, alquil-C(O)-O-, -OH y halo. En algunos otros ejemplos, R1 y R2 juntos forman
[0375] R4
[0376] c A o
[0378] En ciertos ejemplos, R1 es -H. En ciertos otros ejemplos, R1 es alquilo. En algunos ejemplos, R1 es alquilo-C(O)-O-. En algunos otros ejemplos, R1 es -OH. En ciertos ejemplos, R1 es halo. En algunos otros ejemplos, R1 es -F. En algunos ejemplos, R1 es -Cl. En algunos otros ejemplos, R1 es -Br. En ciertos ejemplos, R1 es -I. En ciertos otros ejemplos, R2 es -OH. En algunos ejemplos, R2 es halo. En algunos otros ejemplos, R2 es -F. En ciertos ejemplos, R2 es -Cl. En algunos otros ejemplos, R2 es -Br. En algunos ejemplos, R2 es -I.
[0379] En algunos ejemplos, en la Fórmula (I), R5 es -OH. En algunos ejemplos, R5 es halo, tal como pero no limitado a, -F, -Cl, -Br o -I. En algunos ejemplos, R5 es -F. En algunos ejemplos, R5 es -Cl. En algunos ejemplos, R5 es -Br. En algunos ejemplos, R5 es -I. En algunos ejemplos, R5 es alquilo tal como, pero no limitado a, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo o nonilo. En algunos ejemplos, R5 es bencilo.
[0380] En algunos ejemplos de Fórmula (I), R3 es-NRaRb, en donde Ra y Rb son, independientemente en cada caso, -H o alquilo.
[0381] En algunos ejemplos, en la Fórmula (I), R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, arilo, arilalquilo y un heterocicloalquilo que contiene N. En algunos de estos ejemplos, alquilo, arilo, arilalquilo o heterocicloalquilo que contiene N están opcionalmente sustituidos con -NRaRb. En algunos ejemplos, R4 es alquilo tal como, pero no limitado a, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo o nonilo. En algunos ejemplos, R4 es metilo. En algunos ejemplos, R4 es etilo. En algunos ejemplos, R4 es n-propilo. En algunos ejemplos, R4 es ipropilo. En algunos ejemplos, R4 es n-butilo. En algunos ejemplos, R4 es i-butilo. En algunos ejemplos, R4 es tbutilo. En algunos ejemplos, R4 es sec-butilo. En algunos ejemplos, R4 es pentilo. En algunos ejemplos, R4 es hexilo. En algunos ejemplos, R4 es heptilo. En algunos ejemplos, R4 es octilo o nonilo. En algunos ejemplos, R4 es arilo, tal como, pero no limitado a, fenilo o naftilo. En algunos ejemplos, R4 es fenilo. En algunos ejemplos, R4 es naftilo. En algunos ejemplos, R4 es arilalquilo, tal como, pero no limitado a, bencilo. En algunos ejemplos, R4 es heterocicloalquilo que contiene N, tal como, pero no limitado a, piperidinilo. En algunos ejemplos, R4 es 4-amino-fenilo. En algunos ejemplos, R4 es 4-aminofenilo opcionalmente sustituido con halo.
[0382] En algunos ejemplos, R4 es
[0385]
[0387] en donde Ra y Rb son, independientemente en cada caso, H o alquilo.
[0388] En algunos ejemplos, R4 es
[0391]
[0393] En algunos ejemplos, R4 es
[0396]
[0397] En algunos ejemplos, R4 es
[0400]
[0402] En algunos ejemplos, R4 es
[0405]
[0407] En algunos ejemplos, R4 es
[0410]
[0412] En algunos ejemplos, R4 es
[0415]
[0417] En algunos ejemplos, R4 es
[0420]
[0422] En algunos ejemplos, R4 es
[0425]
[0427] En algunos ejemplos, R4 es
[0430]
[0432] En algunos ejemplos, R4 es
[0435]
[0437] En algunos ejemplos, R4 es
[0440]
[0442] En algunos ejemplos, R4 es alquilo sustituido con amino tal como, pero no limitado a, metil-amino, etil-amino, propil-amino, butil-amino, pentil-amino, hexil-amino, heptil-amino, octil-amino o nonil-amino. En algunos ejemplos, R4es metil-amino. En algunos ejemplos, R4es etil-amino. En algunos ejemplos, R4es n-propil-amino. En algunos ejemplos, R4 es i-propil-amino. En algunos ejemplos, R4 es n-butil-amino. En algunos ejemplos, R4 es i-butil-amino. En algunos ejemplos, R4 es t-butil-amino. En algunos ejemplos, R4 es pentil-amino. En algunos ejemplos, R4 es hexil-amino. En algunos ejemplos, R4 es heptil-amino. En algunos ejemplos, R4 es octil-amino. En algunos ejemplos, R4 es nonil-amino.
[0443] En algunos ejemplos, R4 es
[0446]
[0447] En algunos ejemplos, R4 es
[0450]
[0453] En algunos ejemplos, R4 es
[0456]
[0459] En algunos ejemplos, R4 es
[0462]
[0465] En algunos ejemplos, en el presente documento, Ra y Rb se seleccionan, independientemente en cada caso, de H y alquilo. En algunos ejemplos, ambos Ra y Rb son H. En algunos ejemplos, ambos Ra y Rb son metilo. En algunos ejemplos, ambos Ra y Rb son etilo. En algunos ejemplos, ambos Ra y Rb son propilo. En algunos ejemplos, uno de Ra o Rb es -H y el otro es alquilo. En algunos ejemplos, uno de Ra o Rb es -H y el otro es metilo. En algunos ejemplos, uno de Ra o Rb es -H y el otro es etilo. En algunos ejemplos, uno de Ra o Rb es -H y el otro es propilo.
[0467] En algunos ejemplos, n es un número entero de 0-19. En algunos ejemplos, n es 0. En otros ejemplos, n es 1. En ciertos ejemplos, n es 2. En otros ejemplos, n es 3. En ciertos ejemplos, n es 4. En algunos ejemplos, n es 5. En otros ejemplos, n es 6. En ciertos ejemplos, n es 7. En otros ejemplos, n es 8. En ciertos ejemplos, n es 9. En algunos ejemplos, n es 10. En otros ejemplos, n es 11. En ciertos ejemplos, n es 12. En otros ejemplos, n es 13. En ciertos ejemplos, n es 14. En algunos ejemplos, n es 15. En otros ejemplos, n es 16. En ciertos ejemplos, n es 17. En otros ejemplos, n es 18. En ciertos ejemplos, n es 19.
[0469] En algunos ejemplos, se expone aquí un compuesto de Fórmula (I), en donde R1 y R2 juntos forman
[0472]
[0475] En algunos de estos ejemplos, R4 es alquilo, arilo, arilalquilo o un heterocicloalquilo que contiene N. En ciertos ejemplos, alquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo o heterocicloalquilo que contiene N están opcionalmente sustituidos con -NRaRb. En algunos de estos ejemplos, R4 es alquilo. En algunos de estos ejemplos, R4 es arilo. En algunos de estos ejemplos, R4 es arilalquilo. En algunos de estos ejemplos, R4 es heterocicloalquilo que contiene N. En algunos ejemplos, R4 es alquilo tal como, pero no limitado a, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo o nonilo. En algunos ejemplos, R4 es metilo. En algunos ejemplos, R4 es etilo. En algunos ejemplos, R4es n-propilo. En algunos ejemplos, R4es i-propilo. En algunos ejemplos, R4es n-butilo. En algunos ejemplos, R4 es i-butilo. En algunos ejemplos, R4 es t-butilo. En algunos ejemplos, R4 es sec-butilo. En algunos ejemplos, R4 es pentilo. En algunos ejemplos, R4 es hexilo. En algunos ejemplos, R4 es heptilo. En algunos ejemplos, R4 es octilo o nonilo. En algunos ejemplos, R4 es arilo, tal como, pero no limitado a, fenilo o naftilo. En algunos ejemplos, R4 es fenilo. En algunos ejemplos, R4 es naftilo. En algunos ejemplos, R4 es heteroarilo, tal como, pero no limitado a, tiofeno o fenol. En algunos ejemplos, R4 es arilalquilo, tal como, pero no limitado a, bencilo. En algunos ejemplos, R4 es heterocicloalquilo que contiene N, tal como, pero no limitado a, piperidinilo. En algunos ejemplos, R4 es 4-amino-fenilo. En algunos ejemplos, R4 es 4-aminofenilo opcionalmente sustituido con halo.
[0477] En algunos ejemplos, se expone aquí un compuesto de Fórmula (I), en donde R1 y R2 juntos forman
[0480] R4
[0482] <o v u>'<v /J>i<W>
[0483] en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, arilo, arilalquilo y un heterocicloalquilo que contiene N; y en donde alquilo, arilo, arilalquilo o heterocicloalquilo que contiene N están opcionalmente sustituidos con -NRaRb; y en donde la estereoquímica del carbono indicada por * es la configuración R.
[0485] En algunos ejemplos, se expone aquí un compuesto de Fórmula (I), en donde R1 y R2 juntos forman
[0488]
[0491] en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, arilo, arilalquilo y un heterocicloalquilo que contiene N; y en donde alquilo, arilo, arilalquilo o heterocicloalquilo que contiene N están opcionalmente sustituidos con -NRaRb; y en donde la estereoquímica del carbono indicada por * es la configuración S.
[0493] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (I), en donde el compuesto tiene la estructura de Fórmula (PIa):
[0496]
[0499] En algunos de estos ejemplos, R1 y R2 se seleccionan, independientemente, de -H, alquilo, alquil-C(O)-O-, -OH y halo. En algunos otros ejemplos, R1 y R2 juntos forman
[0502]
[0505] En ciertos ejemplos, R1 es -H. En ciertos otros ejemplos, R1 es alquilo. En algunos ejemplos, R1 es alquilo-C(O)-O-. En algunos otros ejemplos, R1 es -OH. En ciertos ejemplos, R1 es halo. En algunos otros ejemplos, R1 es -F. En algunos ejemplos, R1 es -Cl. En algunos otros ejemplos, R1 es -Br. En ciertos ejemplos, R1 es -I. En ciertos otros ejemplos, R2 es -OH. En algunos ejemplos, R2 es halo. En algunos otros ejemplos, R2 es -F. En ciertos ejemplos, R2 es -Cl. En algunos otros ejemplos, R2 es -Br. En algunos ejemplos, R2 es -I.
[0507] En algunos ejemplos de la Fórmula (PIa), R5 es -OH. En algunos ejemplos, R5 es halo, tal como pero no limitado a -F, -Cl, -Br o -I. En algunos ejemplos, R5 es -F. En algunos ejemplos, R5 es -Cl. En algunos ejemplos, R5 es -Br. En algunos ejemplos, R5 es -I. En algunos ejemplos, R5 es alquilo tal como, pero no limitado a, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo o nonilo.
[0509] En algunos ejemplos, en la Fórmula (PIa), R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, arilo, arilalquilo y un heterocicloalquilo que contiene N. En algunos de estos ejemplos, alquilo, arilo, arilalquilo o heterocicloalquilo que contiene N están opcionalmente sustituidos con -NRaRb. En algunos ejemplos, R4 es alquilo tal como, pero no limitado a, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo o nonilo. En algunos ejemplos, R4 es metilo. En algunos ejemplos, R4 es etilo. En algunos ejemplos, R4 es n-propilo. En algunos ejemplos, R4 es i-propilo. En algunos ejemplos, R4 es n-butilo. En algunos ejemplos, R4 es i-butilo. En algunos ejemplos, R4 es t-butilo. En algunos ejemplos, R4 es pentilo. En algunos ejemplos, R4 es hexilo. En algunos ejemplos, R4 es heptilo. En algunos ejemplos, R4 es octilo o nonilo. En algunos ejemplos, R4 es arilo, tal como, pero no limitado a, fenilo o naftilo. En algunos ejemplos, R4 es fenilo. En algunos ejemplos, R4 es naftilo. En algunos ejemplos, R4 es arilalquilo, tal como, pero no limitado a, bencilo. En algunos ejemplos, R4 es heterocicloalquilo que contiene N, tal como, pero no limitado a, piperidinilo. En algunos ejemplos, R4 es 4-amino-fenilo.
[0511] En algunos ejemplos, R4 es
[0514]
[0517] En algunos ejemplos, R4 es
[0518]
[0520] En algunos ejemplos, R4 es
[0523]
[0525] En algunos ejemplos, R4 es
[0528]
[0530] En algunos ejemplos, R4 es
[0533]
[0535] En algunos ejemplos, R4 es
[0538]
[0540] En algunos ejemplos, R4 es
[0543]
[0545] En algunos ejemplos, R4 es
[0548]
[0550] En algunos ejemplos, R4 es alquilo sustituido con amino tal como, pero no limitado a, metil-amino, etil-amino, propil-amino, butil-amino, pentil-amino, hexil-amino, heptil-amino, octil-amino o nonil-amino. En algunos ejemplos, R4es metil-amino. En algunos ejemplos, R4es etil-amino. En algunos ejemplos, R4es n-propil-amino. En algunos ejemplos, R4 es i-propil-amino. En algunos ejemplos, R4 es n-butil-amino. En algunos ejemplos, R4 es i-butil-amino. En algunos ejemplos, R4 es t-butil-amino. En algunos ejemplos, R4 es pentil-amino. En algunos ejemplos, R4 es hexil-amino. En algunos ejemplos, R4 es heptil-amino. En algunos ejemplos, R4 es octil-amino. En algunos ejemplos, R4 es nonil-amino.
[0551] En algunos ejemplos, R4 es
[0554]
[0556] En algunos ejemplos, R4 es
[0559]
[0561] En algunos ejemplos, R4 es
[0562]
[0565] En algunos ejemplos, en el presente documento, Ra y Rb se seleccionan, independientemente en cada caso, de -H o alquilo. En algunos ejemplos, ambos Ra y Rb son -H. En algunos ejemplos, ambos Ra y Rb son metilo. En algunos ejemplos, ambos Ra y Rb son etilo. En algunos ejemplos, ambos Ra y Rb son propilo. En algunos ejemplos, uno de Ra o Rb es -H y el otro es alquilo. En algunos ejemplos, uno de Ra o Rb es -H y el otro es metilo. En algunos ejemplos, uno de Ra o Rb es -H y el otro es etilo. En algunos ejemplos, uno de Ra o Rb es -H y el otro es propilo.
[0567] En algunos ejemplos, en la Fórmula (PIa), n es un número entero de 0-19. En algunos ejemplos, n es 0. En otros ejemplos, n es 1. En ciertos ejemplos, n es 2. En otros ejemplos, n es 3. En ciertos ejemplos, n es 4. En algunos ejemplos, n es 5. En otros ejemplos, n es 6. En ciertos ejemplos, n es 7. En otros ejemplos, n es 8. En ciertos ejemplos, n es 9. En algunos ejemplos, n es 10. En otros ejemplos, n es 11. En ciertos ejemplos, n es 12. En otros ejemplos, n es 13. En ciertos ejemplos, n es 14. En algunos ejemplos, n es 15. En otros ejemplos, n es 16. En ciertos ejemplos, n es 17. En otros ejemplos, n es 18. En ciertos ejemplos, n es 19.
[0569] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (PIa), en donde el compuesto tiene la estructura de Fórmula (PIb-1) o (PIb-2):
[0572]
[0575] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (PIa), en donde el compuesto tiene la estructura de Fórmula (PIc-1) o (PIc-2):
[0578]
[0581] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (PIa), en donde el compuesto tiene la estructura de Fórmula (PId-1) o (PId-2):
[0584]
[0587] En algunos ejemplos, n es 0. En algunos ejemplos, n es 1. En algunos ejemplos, n es 2.
[0589] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (I), en donde el compuesto tiene la estructura de Fórmula (PIe-1) o (PIe-2):
[0590]
[0592] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (PIa), (PIb-1), (PIb-2), (PIc-1), (PIc-2), (PId-1), (PId-2), (PIe-1), o (PIe-2), en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, arilo, arilalquilo y un heterocicloalquilo que contiene N. En algunos de estos ejemplos, alquilo, arilo, arilalquilo o heterocicloalquilo que contiene N están opcionalmente sustituidos con -NRaRb En algunos ejemplos, R4 es alquilo tal como, pero no limitado a, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo o nonilo. En algunos ejemplos, R4 es metilo. En algunos ejemplos, R4 es etilo. En algunos ejemplos, R4 es n-propilo. En algunos ejemplos, R4 es i-propilo. En algunos ejemplos, R4 es n-butilo. En algunos ejemplos, R4 es i-butilo. En algunos ejemplos, R4 es t-butilo. En algunos ejemplos, R4 es pentilo. En algunos ejemplos, R4 es hexilo. En algunos ejemplos, R4 es heptilo. En algunos ejemplos, R4 es octilo o nonilo. En algunos ejemplos, R4 es arilo, tal como, pero no limitado a, fenilo o naftilo. En algunos ejemplos, R4 es fenilo. En algunos ejemplos, R4 es naftilo. En algunos ejemplos, R4 es arilalquilo, tal como, pero no limitado a, bencilo. En algunos ejemplos, R4 es heterocicloalquilo que contiene N, tal como, pero no limitado a, piperidinilo. En algunos ejemplos, R4 es 4-amino-fenilo.
[0593] En algunos ejemplos, R4 es
[0596]
[0598] En algunos ejemplos, R4 es
[0601]
[0603] En algunos ejemplos, R4 es
[0606]
[0608] En algunos ejemplos, R4 es
[0611]
[0613] En algunos ejemplos, R4 es
[0616]
[0618] En algunos ejemplos, R4 es
[0621]
[0623] En algunos ejemplos, R4 es
[0626]
[0628] En algunos ejemplos, R4 es
[0629]
[0632] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (PIa), (PIb-1), (PIb-2), (PIc-1), (PIc-2), (PId-1), (PId-2), (PIe-1), o (PIe-2), en donde R4 es alquilo sustituido con amino tal como, pero no limitado a, metil-amino, etil-amino, propil-amino, butil-amino, pentil-amino, hexil-amino, heptil-amino, octil-amino o nonil-amino. En algunos ejemplos, R4 es metil-amino. En algunos ejemplos, R4 es etil-amino. En algunos ejemplos, R4 es n-propil-amino. En algunos ejemplos, R4 es ipropil-amino. En algunos ejemplos, R4 es n-butil-amino. En algunos ejemplos, R4 es i-butil-amino. En algunos ejemplos, R4es t-butil-amino. En algunos ejemplos, R4es pentil-amino. En algunos ejemplos, R4es hexil-amino. En algunos ejemplos, R4 es heptil-amino. En algunos ejemplos, R4 es octil-amino. En algunos ejemplos, R4 es nonil-amino.
[0634] En algunos ejemplos, R4 es
[0637]
[0640] En algunos ejemplos, R4 es
[0643]
[0646] En algunos ejemplos, R4 es
[0649]
[0652] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (I), en donde el compuesto tiene la estructura de Fórmula (PVI) :
[0655]
[0659] (PVI) ^
[0661] En la fórmula (PVI) R3 es -NRaRby n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15.
[0663] En algunos ejemplos, en la Fórmula (PVI), R4 se selecciona de -H, -OH, halo o alquilo. En algunos ejemplos, R4 es halo, tal como pero no limitado a -F, -Cl, -Br o -I. En algunos ejemplos, R4 es -F. En algunos ejemplos, R4 es-Cl. En algunos ejemplos, R4 es -Br. En algunos ejemplos, R4 es -I. En algunos ejemplos, R4 es alquilo tal como, pero no limitado a, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo o nonilo. El subíndice n es un número entero de 0-19. En algunos ejemplos, n es 0. En otros ejemplos, n es 1. En ciertos ejemplos, n es 2. En otros ejemplos, n es 3. En ciertos ejemplos, n es 4. En algunos ejemplos, n es 5. En otros ejemplos, n es 6. En ciertos ejemplos, n es 7. En otros ejemplos, n es 8. En ciertos ejemplos, n es 9. En algunos ejemplos, n es 10. En otros ejemplos, n es 11. En ciertos ejemplos, n es 12. En otros ejemplos, n es 13. En ciertos ejemplos, n es 14. En algunos ejemplos, n es 15.
[0665] En algunos ejemplos, R3 es -NH2. En algunos ejemplos, R3 es -NH(CH3).
[0667] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (I), en donde el compuesto tiene la estructura de Fórmula (PVII):
[0668]
[0670] En fórmula (PVII) R3 es RaRbN -y n son 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15.
[0671] En algunos ejemplos, en la Fórmula (PVII), R4 se selecciona de -H, -OH, halo o alquilo. En algunos ejemplos, R4 es halo, tal como pero no limitado a -F, -Cl, -Br o -I. En algunos ejemplos, R4 es -F. En algunos ejemplos, R4 es -Cl. En algunos ejemplos, R4 es -Br. En algunos ejemplos, R4 es -I. En algunos ejemplos, R4 es alquilo tal como, pero no limitado a, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo o nonilo. El subíndice n es un número entero de 0-19. En algunos ejemplos, n es 0. En otros ejemplos, n es 1. En ciertos ejemplos, n es 2. En otros ejemplos, n es 3. En ciertos ejemplos, n es 4. En algunos ejemplos, n es 5. En otros ejemplos, n es 6. En ciertos ejemplos, n es 7. En otros ejemplos, n es 8. En ciertos ejemplos, n es 9. En algunos ejemplos, n es 10. En otros ejemplos, n es 11. En ciertos ejemplos, n es 12. En otros ejemplos, n es 13. En ciertos ejemplos, n es 14. En algunos ejemplos, n es 15.
[0672] En algunos ejemplos, R3 es -NH2. En algunos ejemplos, R3 es -NH(CH3).
[0673] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (PVII), en donde el compuesto tiene la estructura de Fórmula (PVIIa):
[0676]
[0678] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (PVII), en donde el compuesto tiene la estructura de Fórmula (PVIIb):
[0681]
[0683] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (PVII), en donde el compuesto tiene la estructura de Fórmula (PVIIb-1) o (PVIIb-2):
[0686]
[0689] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (I), en donde el compuesto tiene la estructura de Fórmula (PVIII):
[0690]
[0692] En algunos ejemplos, de cualquiera de las Fórmulas (PI), (Pía), (PIb-1), (PIb-2), (PIc-1), (PIc-2), (PId-1), (PId-2), (PIe-1), (PIe-2), (PVI), (PVII), (PVIIa), (PVIIb), (PVIIb-1), o (PVIIb-2), en donde el halo, cuando está presente, es flúor.
[0693] En algunos ejemplos del compuesto de Fórmula (I), R1 y R2 se seleccionan, independientemente, de -H, alquilo,<alquil-C(O)-O-,>-O<h o halo. En algunos otros ejemplos, R1 y R2 juntos forman>
[0695] o^'~a
[0697] En ciertos ejemplos, R1 es -H. En ciertos otros ejemplos, R1 es alquilo. En algunos ejemplos, R1 es alquilo-C(O)-O-. En algunos otros ejemplos, R1 es -OH. En ciertos ejemplos, R1 es halo. En algunos otros ejemplos, R1 es -F. En algunos ejemplos, R1 es -Cl. En algunos otros ejemplos, R1 es -Br. En ciertos ejemplos, R1 es -I. En ciertos otros ejemplos, R2 es -OH. En algunos ejemplos, R2 es halo. En algunos otros ejemplos, R2 es -F. En ciertos ejemplos, R2 es -Cl. En algunos otros ejemplos, R2 es -Br. En algunos ejemplos, R2 es -I.
[0698] En algunos ejemplos, en la Fórmula (I), R5 se selecciona, independientemente en cada caso, de -OH, halo, alquilo o arilalquilo. En algunos ejemplos, R5 es -OH. En algunos ejemplos, R5 es halo, tal como pero no limitado a -F, -Cl, -Br o -I. En algunos ejemplos, R5 es -F. En algunos ejemplos, R5 es -Cl. En algunos ejemplos, R5 es -Br. En algunos ejemplos, R5 es -I. En algunos ejemplos, R5 es alquilo tal como, pero no limitado a, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo o nonilo. En algunos ejemplos, R5 es bencilo.
[0699] En algunos ejemplos, en la Fórmula (I), R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, arilo, arilalquilo y un heterocicloalquilo que contiene N. En algunos de estos ejemplos, alquilo, arilo, arilalquilo o heterocicloalquilo que contiene N están opcionalmente sustituidos con -NRaRb. En algunos ejemplos, R4 es alquilo tal como, pero no limitado a, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo o nonilo. En algunos ejemplos, R4 es metilo. En algunos ejemplos, R4 es etilo. En algunos ejemplos, R4 es n-propilo. En algunos ejemplos, R4 es ipropilo. En algunos ejemplos, R4 es n-butilo. En algunos ejemplos, R4 es i-butilo. En algunos ejemplos, R4 es tbutilo. En algunos ejemplos, R4 es sec-butilo. En algunos ejemplos, R4 es pentilo. En algunos ejemplos, R4 es hexilo. En algunos ejemplos, R4 es heptilo. En algunos ejemplos, R4 es octilo o nonilo. En algunos ejemplos, R4 es arilo, tal como, pero no limitado a, fenilo o naftilo. En algunos ejemplos, R4 es fenilo. En algunos ejemplos, R4 es naftilo. En algunos ejemplos, R4 es arilalquilo, tal como, pero no limitado a, bencilo. En algunos ejemplos, R4 es heterocicloalquilo que contiene N, tal como, pero no limitado a, piperidinilo. En algunos ejemplos, R4 es 4-amino-fenilo. En algunos ejemplos, R4 es 4-aminofenilo opcionalmente sustituido con halo.
[0700] En algunos ejemplos, R4 es
[0703]
[0705] En algunos ejemplos, R4 es
[0708]
[0710] En algunos ejemplos, R4 es
[0713]
[0715] En algunos ejemplos, R4 es
[0716]
[0719] En algunos ejemplos, R4 es alquilo sustituido con amino tal como, pero no limitado a, metil-amino, etil-amino, propil-amino, butil-amino, pentil-amino, hexil-amino, heptil-amino, octil-amino o nonil-amino. En algunos ejemplos, R4es metil-amino. En algunos ejemplos, R4es etil-amino. En algunos ejemplos, R4es n-propil-amino. En algunos ejemplos, R4 es i-propil-amino. En algunos ejemplos, R4 es n-butil-amino. En algunos ejemplos, R4 es i-butil-amino. En algunos ejemplos, R4 es t-butil-amino. En algunos ejemplos, R4 es sec-butilo. En algunos ejemplos, R4es pentil-amino. En algunos ejemplos, R4es hexil-amino. En algunos ejemplos, R4es heptil-amino. En algunos ejemplos, R4 es octil-amino. En algunos ejemplos, R4 es nonil-amino.
[0721] En algunos ejemplos, R4 es
[0724]
[0727] En algunos ejemplos, R4 es
[0730]
[0733] En algunos ejemplos, R4 es
[0736]
[0739] En algunos ejemplos, en el presente documento, Ra y Rb se seleccionan, independientemente en cada caso, de H o alquilo. En algunos ejemplos, ambos Ra y Rb son H. En algunos ejemplos, ambos Ra y Rb son metilo. En algunos ejemplos, ambos Ra y Rb son etilo. En algunos ejemplos, ambos Ra y Rb son propilo. En algunos ejemplos, uno de Ra o Rb es H y el otro es alquilo. En algunos ejemplos, uno de Ra o Rb es H y el otro es metilo. En algunos ejemplos, uno de Ra o Rb es H y el otro es etilo. En algunos ejemplos, uno de Ra o Rb es H y el otro es propilo.
[0741] En algunos ejemplos, en la Fórmula (I), n es un número entero de 0-19. En algunos ejemplos, n es 0. En otros ejemplos, n es 1. En ciertos ejemplos, n es 2. En otros ejemplos, n es 3. En ciertos ejemplos, n es 4. En algunos ejemplos, n es 5. En otros ejemplos, n es 6. En ciertos ejemplos, n es 7. En otros ejemplos, n es 8. En ciertos ejemplos, n es 9. En algunos ejemplos, n es 10. En otros ejemplos, n es 11. En ciertos ejemplos, n es 12. En otros ejemplos, n es 13. En ciertos ejemplos, n es 14. En algunos ejemplos, n es 15. En otros ejemplos, n es 16. En ciertos ejemplos, n es 17. En otros ejemplos, n es 18. En ciertos ejemplos, n es 19.
[0743] En algunos ejemplos, se expone aquí un compuesto de Fórmula (I), en donde R1 y R2 juntos forman
[0746]
[0749] En algunos de estos ejemplos, R4 es alquilo, arilo, arilalquilo o un heterocicloalquilo que contiene N. En ciertos ejemplos, alquilo, arilo, arilalquilo o heterocicloalquilo que contiene N están opcionalmente sustituidos con -NRaRb. En algunos de estos ejemplos, R4 es alquilo. En algunos de estos ejemplos, R4 es arilo. En algunos de estos ejemplos, R4 es arilalquilo. En algunos de estos ejemplos, R4 es heterocicloalquilo que contiene N. En algunos ejemplos, R4es alquilo tal como, pero no limitado a, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo o nonilo. En algunos ejemplos, R4 es metilo. En algunos ejemplos, R4 es etilo. En algunos ejemplos, R4 es n-propilo. En algunos ejemplos, R4 es i-propilo. En algunos ejemplos, R4 es n-butilo. En algunos ejemplos, R4 es i-butilo. En algunos ejemplos, R4 es t-butilo. En algunos ejemplos, R4 es sec-butilo. En algunos ejemplos, R4 es pentilo. En algunos ejemplos, R4 es hexilo. En algunos ejemplos, R4 es heptilo. En algunos ejemplos, R4 es octilo. En algunos ejemplos, R4 es nonilo. En algunos ejemplos, R4 es arilo, tal como, pero no limitado a, fenilo o naftilo. En algunos ejemplos, R4 es fenilo. En algunos ejemplos, R4 es naftilo. En algunos ejemplos, R4 es arilalquilo, tal como, pero no limitado a, bencilo. En algunos ejemplos, R4 es heterocicloalquilo que contiene N, tal como, pero no limitado a, piperidinilo. En algunos ejemplos, R4 es 4-amino-fenilo. En algunos ejemplos, R4 es 4-aminofenilo opcionalmente sustituido con halo.
[0751] En algunos ejemplos, se expone aquí un compuesto de Fórmula (I), en donde R1 y R2 juntos forman
[0754] FT
[0755] o "^ o
[0757] en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, arilo, arilalquilo y un heterocicloalquilo que contiene N; y en donde alquilo, arilo, arilalquilo o heterocicloalquilo que contiene N están opcionalmente sustituidos con -NRaRb; y en donde la estereoquímica del carbono indicada por * es R.
[0759] En algunos ejemplos, se expone aquí un compuesto de Fórmula (I), en donde R1 y R2 juntos forman
[0762] R“
[0763] 0 ^V 0i
[0765] en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo, arilo, arilalquilo y un heterocicloalquilo que contiene N; y en donde alquilo, arilo, arilalquilo o heterocicloalquilo que contiene N están opcionalmente sustituidos con -NRaRb; y en donde la estereoquímica del carbono indicada por * es S.
[0767] En algunos ejemplos, la carga útil aquí descrita es un derivado o análogo de budesonida o diflorasona, de acuerdo con la fórmula (A) o (I), como se define anteriormente. De acuerdo con la invención, las cargas útiles aquí descritas se conjugan con un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo basándose en los métodos descritos en este documento. De acuerdo con una realización de la invención, las cargas útiles aquí descritas se conjugan con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y también con una fracción de ciclodextrina basándose en los métodos aquí establecidos. Como se enseña aquí, se pueden utilizar cargas útiles del enlazador estables con estos métodos de conjugación para producir conjugados de anticuerpos-esteroides. En algunos ejemplos, los conjugados anticuerpo-esteroide también incluyen una fracción de ciclodextrina.
[0769] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (I), en donde R3 tiene la siguiente estructura:
[0772]
[0775] En estos ejemplos, q es un número entero de 0-5.
[0777] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (I), en donde R3 tiene una estructura que es:
[0780]
[0783] En estos ejemplos, q es un número entero de 0-5.
[0785] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (I), en donde R3 tiene una estructura que es:
[0788]
[0791] En algunos ejemplos, se expone aquí un conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (I), en donde el compuesto tiene la estructura de Fórmula 1000:
[0792]
[0794] o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. En fórmula 1000, R1 y R2 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en -H, -OH, alquilo, -OC(O)-alquilo y halo; o R1 y R2 juntos forman
[0797]
[0800] en donde R4 es como se define en la reivindicación 7. R3 es -NRaRb. R5 se selecciona, independientemente en cada caso, de un sustituyente en el grupo que consiste en -OH, halo y alquilo; n es un número entero de 0-16; y cada R5 se posiciona en cualquier átomo del anillo. Ra y Rb se seleccionan, independientemente en cada caso, del grupo que consiste en -H y alquilo; o Ra y Rb ciclizan para formar cicloheteroalquilo con tres a seis átomos en el anillo, incluido un heteroátomo, que es el N al que están unidos. Ra y Rb están, independientemente en cada caso, opcionalmente sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en -OH, -PO4H, NH2,
[0801] -C(O)OH y -C(O)CH3.
[0802] En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento conjugados que comprenden un agente de unión conjugado con un compuesto de acuerdo con la Fórmula 1000, R4 se selecciona del grupo que consiste en -alquileno-NRaRb, -X-arileno-Y-NRaRb, -X-heteroarileno-Y-NRaRb, y heterocicloalquilo que contiene N; en donde X está ausente o es -CH2--; y Y está ausente
[0803] En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento conjugados que comprenden un agente de unión conjugado con un compuesto de acuerdo con la Fórmula 1000, en donde R3 es -NRaRb; y R4 es alquilo. En ciertas realizaciones, R3 es -NH2. En ciertas realizaciones, R4 es n-propilo. En ciertas realizaciones, R3 es -NH2 y R4 es n-propilo.
[0804] En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula 1000 es de acuerdo con la Fórmula 1010, 1020, 1030 o 1040:
[0807]
[0809] o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0810] En ciertas realizaciones, el compuesto de Fórmula 1000 es de acuerdo con la Fórmula 1110, 1120, 1130 u 1140:
[0813]
[0814]
[0816] o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0817] En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento conjugados que comprenden un agente de unión conjugado con un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Fórmulas 1000-1140, en donde R3 es -NRaRb; y R4 es alquilo. En ciertas realizaciones, R3 es -NH2. En ciertas realizaciones, R4 es n-propilo. En ciertas realizaciones, R3 es -NH2 y R4 es n-propilo.
[0818] En cualquiera de las Fórmulas 1000-1140, R3 puede ser cualquier R3 específica proporcionado anteriormente. En realizaciones particulares, R3es -NH2, -N(H)CH3 o -N(CH3)2.
[0819] En cualquiera de las Fórmulas 1000-1140, R4 puede ser cualquier R4 específica proporcionado anteriormente. En realizaciones particulares, R4 se selecciona de -CH2-CH2-NH2,
[0821]
[0823] Se exponen también aquí compuestos que tienen las siguientes estructuras:
[0826]
[0827]
[0829] o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0830] C. Conjugados de esteroides de proteína
[0831] De acuerdo con la presente invención, se proporcionan en la presente memoria conjugados proteicos de los esteroides descritos anteriormente. Dichos conjugados contienen anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que están unidos covalentemente, por ejemplo, a través de enlazadores del agente de unión descritos en este documento, a los compuestos descritos en la Sección B anterior, por ejemplo, los compuestos de Fórmula (A), (A1), (A4), (I), (I1) (PIa), (PIb-1), (PIb-2), PIc-1), (PIc-2), (PId-1), (PId-2), (PIe-1), (PIe-2), (PVI), (PVII), (PVIIa), (PVIIb), (PVIIb-1), (PVIIb-2), (PVIII), y (1000)-(1140).
[0832] El enlazador del agente de unión se puede enlazar a un esteroide descrito en este documento en cualquier fracción o posición adecuada del esteroide, incluyendo por ejemplo, a través de una amida, éter, éster, carbamato o amina. Por ejemplo, el enlazador del agente de unión se puede unir a compuestos a través de R1, R3, o R4 o grupo hidroxilo representado Fórmula (A1):
[0835]
[0837] En ciertas realizaciones, los esteroides descritos en este documento se unen al enlazador del agente de unión mediante la reacción de un grupo amino o hidroxilo del esteroide con un grupo reactivo adecuado presente en el enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador del agente de unión también incluye una fracción de ciclodextrina. Por ejemplo, la fracción de ciclodextrina puede estar unida a la estructura química principal del enlazador del agente de unión.
[0838] En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento compuestos que tienen la estructura:
[0839] BA-(L-PAY)x
[0840] en donde BA es un agente de unión como se describe en este documento; L es un enlazador opcional como se describe en este documento; PAY es un compuesto esteroide como se describe en este documento; y x es un número entero de 1-30. En realizaciones particulares, cada PAY es un radical que se puede obtener mediante la eliminación de un átomo, por ejemplo un átomo de hidrógeno de un compuesto de acuerdo con una Fórmula seleccionada del grupo que consiste en Fórmulas (A), (A1), (A4), (I), (I1), (PIa), (PIb-1), (PIb-2), PIc-1), (PIc-2), (PId-1), (PId-2), (PIe-1), (PIe-2), (PVI), (PVII), (PVIIa), (PVIIb), (PVIIb-1), (PVIIb-2), (PVIII), y (1000)-(1140). A continuación se describen en detalle ejemplos de dichos compuestos.
[0841] En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento compuestos que tienen la estructura de Fórmula (III):
[0842]
[0844] en donde ya sea (a) o (b):
[0845] (a) R3 es-BL-X-, o
[0848]
[0850] R1 y R2 son cada uno, independientemente, -H, alquilo, alquil-C(O)-O-, -OH, o halo; o R1 y R2 juntos forman
[0852] R4
[0853] < A o
[0855] en donde R4 es alquilo, arilo, arilalquilo o un heterocicloalquilo que contiene N; en donde el alquilo, arilo, arilalquilo y
[0856] heterocicloalquilo que contiene N están opcionalmente sustituidos con -NRaRb;
[0857] o
[0858] (b) R3 es -NRaRb, y R1 y R2 juntos forman
[0861]
[0863] en donde R4 es - BL-,
[0866]
[0868] o -BL-Y, en donde Y es un heterociclo divalente que contiene N;
[0869] -BL- es un enlazador del agente de unión divalente;
[0870] R5 es, independientemente en cada caso, -OH, halo, alquilo o arilalquilo;
[0871] Ra y Rb son, independientemente en cada caso, -H o alquilo;
[0872] RP, independientemente en cada caso, es halo;
[0873] BA es un agente de unión unido a -BL-;
[0874] X, independientemente en cada caso, es NRa;
[0877]
[0879] es arilo o heteroarilo;
[0880] t es un entero de 0-2;
[0881] x es un número entero de 1-30; y
[0882] n es un número entero de 0-19.
[0883] En algunos ejemplos, el subíndice x es 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30. En algunos ejemplos, el subíndice x es 0. En algunos ejemplos, el subíndice x es 1. En algunos ejemplos, el subíndice x es 2. En algunos ejemplos, el subíndice x es 3. En algunos ejemplos, el subíndice x es 4. En algunos ejemplos, el subíndice x es 5. En algunos ejemplos, el subíndice x es 6. En algunos ejemplos, el subíndice x es 7. En algunos ejemplos, el subíndice x es 8. En algunos ejemplos, el subíndice x es 9. En algunos ejemplos, el subíndice x es 10. En algunos ejemplos, el subíndice x es 11. En algunos ejemplos, el subíndice x es 12. En algunos ejemplos, el subíndice x es 13. En algunos ejemplos, el subíndice x es 14. En algunos ejemplos, el subíndice x es 15. En algunos ejemplos, el subíndice x es 16. En algunos ejemplos, el subíndice x es 17. En algunos ejemplos, el subíndice x es 18. En algunos ejemplos, el subíndice x es 19. En algunos ejemplos, el subíndice x es 20. En algunos ejemplos, el subíndice x es 21. En algunos ejemplos, el subíndice x es 22. En algunos ejemplos, el subíndice x es 23. En algunos ejemplos, el subíndice x es 24. En algunos ejemplos, el subíndice x es 25. En algunos ejemplos, el subíndice x es 26. En algunos ejemplos, el subíndice x es 27. En algunos ejemplos, el subíndice x es 28. En algunos ejemplos, el subíndice x es 29. En algunos ejemplos, el subíndice x es 30.
[0884] En algunos ejemplos de Fórmula (III), R1 y R2 son, cada uno, independientemente, -H, alquilo o -OH. En algunos ejemplos de Fórmula (III), uno de R1 o R2 es -H, alquilo o -OH. En algunos ejemplos de Fórmula (III), ambos R1 y R2 son ya sea -H, alquilo o -OH.
[0885] En algunos ejemplos de Fórmula (III), R1 y R2 juntos forman
[0888]
[0890] En algunos ejemplos, R4 es -RL. En algunos ejemplos, R4 es RL-NRa-arilo. En algunos otros ejemplos, R4 es alquilo. En ciertos ejemplos, R4 es arilalquilo, En algunos ejemplos, R4 es arilo. En otros ejemplos, R4 es heterocicloalquilo que contiene N.
[0891] En algunos ejemplos de Fórmula (III), R5 es -H o halo. En algunos ejemplos de Fórmula (II), R5 es -H o fluoro. En algunos ejemplos de Fórmula (III), uno de R5 es -H o halo. En algunos ejemplos de Fórmula (III), R5 es -H o halo y n es 2. En algunos ejemplos de Fórmula (III), R5 es -F y n es 1. En algunos ejemplos de Fórmula (III), R5 es -F y n es 2.
[0892] En algunos otros ejemplos de Fórmula (III), R3 es -NRaRb. En algunos ejemplos R3 es
[0895]
[0897] En algunos ejemplos de Fórmula (III), R3 es
[0900]
[0902] o
[0905]
[0907] En algunos ejemplos de Fórmula (III), R3 es -NRaRb. En algunos ejemplos, R3 es
[0910]
[0912] En algunos ejemplos R3 es
[0913]
[0915] En algunos ejemplos, R3 es
[0917] <b>■<l-—>f<n>i+<—>
[0918] Rb
[0919] En la fórmula (III), el subíndice n es un número entero de 0-19. En algunos ejemplos, n es 0. En otros ejemplos, n es 1. En ciertos ejemplos, n es 2. En otros ejemplos, n es 3. En ciertos ejemplos, n es 4. En algunos ejemplos, n es 5. En otros ejemplos, n es 6. En ciertos ejemplos, n es 7. En otros ejemplos, n es 8. En ciertos ejemplos, n es 9. En algunos ejemplos, n es 10. En otros ejemplos, n es 11. En ciertos ejemplos, n es 12. En otros ejemplos, n es 13. En ciertos ejemplos, n es 14. En algunos ejemplos, n es 15. En otros ejemplos, n es 16. En ciertos ejemplos, n es 17. En otros ejemplos, n es 18. En ciertos ejemplos, n es 19.
[0920] En algunos ejemplos, se expone aquí un compuesto que tiene la estructura de Fórmula (IIIa):
[0923]
[0925] en donde:
[0926] BA es un agente de unión;
[0927] R5 es, independientemente en cada caso, -OH, halo o alquilo;
[0928] R3 se selecciona de-NRaRb;
[0929] BL es un enlazador del agente de unión;
[0930] Ra y Rb se seleccionan, independientemente en cada caso, de H y alquilo;
[0931] n es un número entero de 0-19; y
[0932] x es un número entero de 1 a 30.
[0933] En algunos ejemplos, se expone aquí un compuesto que tiene la estructura de Fórmula (IIIa2):
[0936]
[0938] en donde:
[0939] BA es un agente de unión;
[0940] R5 es, independientemente en cada caso, -OH, halo o alquilo;
[0941] R3 es-NRaRb;
[0942] BL es un enlazador del agente de unión;
[0943] Ra y Rb se seleccionan, independientemente en cada caso, de H o alquilo;
[0944] n es un número entero de 0 a 19; y
[0945] x es un número entero de 0 a 30.
[0946] En algunos ejemplos R3 es
[0949]
[0951] En algunos ejemplos de Fórmula (IIIa2), R3 es -NRaRb. En algunos ejemplos R3 es
[0954]
[0956] También se exponen el compuesto s de Fórmula (B4):
[0959]
[0961] en donde R4 es alquilo, en donde Ra es un átomo de hidrógeno o alquilo, BL es un enlazador del agente de unión y BA es un agente de unión. En ciertas realizaciones, R4 es C1-4 alquilo. En algunas realizaciones, R4 es propilo. En ciertas realizaciones, x es un número entero de 1-6. En ciertas realizaciones, x es 4.
[0962] También se exponen el compuesto s de Fórmula (B6A):
[0965]
[0967] en donde X es NRa, ® es arilo o heteroarilo, RP es halo, t es un entero de 0-2, Ra es un átomo de hidrógeno o alquilo, BL es un enlazador del agente de unión, BA es un agente de unión, y x es un número entero de 1-30, y R4 es alquilo. En algunas realizaciones, X es O, R4 es alquilo y x es un número entero de 1-6. En ciertas realizaciones, x es 4.
[0968] También se exponen aquí compuestos de Fórmula (B6B)
[0969]
[0972] en donde Ra es un átomo de hidrógeno o alquilo, BL es un enlazador del agente de unión, BA es un agente de unión y x es un número entero de 1-30. En algunas realizaciones, x es un número entero de 1-6. En algunas realizaciones, x es 4.
[0974] Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "enlazador del agente de unión" o "BL" se refiere a cualquier grupo o fracción divalente que enlaza, conecta o une un agente de unión (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo) con un compuesto de carga útil establecido en este documento (por ejemplo, esteroide). En general, los enlazadores del agente de unión adecuados para los conjugados de anticuerpos descritos en este documento son aquellos que son suficientemente estables para explotar la vida media circulante del anticuerpo y, al mismo tiempo, capaces de liberar su carga útil después de la internalización mediada por antígeno del conjugado. Los enlazadores pueden ser escindibles o no escindibles. Los enlazadores escindibles son enlazadores que se escinden mediante el metabolismo intracelular después de la internalización, por ejemplo, escisión mediante hidrólisis, reducción o reacción enzimática. Los enlazadores no escindibles son enlazadores que liberan una carga útil adjunta a través de la degradación lisosomal del anticuerpo después de la internalización. Los enlazadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, enlazadores lábiles a los ácidos, enlazadores lábiles a la hidrólisis, enlazadores escindibles enzimáticamente, enlazadores lábiles a la reducción, enlazadores autoinmolativos y enlazadores no escindibles. Los enlazadores adecuados también incluyen, pero no se limitan a, aquellos que son o comprenden glucurónidos, succinimidatioéteres, unidades de polietilenglicol (PEG), carbamatos, hidrazonas, unidades de mal-caproilo, unidades de disulfuro (por ejemplo, -SS-, -SS- C(R1)(R2) -, en donde R1 y R2 son independientemente hidrógeno o hidrocarbilo), unidades de para-amino-bencilo (PAB), unidades de fosfato, por ejemplo, unidades de mono-, bis- y trisfosfato, péptidos, por ejemplo, unidades peptídicas que contienen dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más unidades de aminoácidos, incluidas, entre otras, unidades de valina-citrulina, unidades de valinaalanina, unidades de valina-arginina, unidades de valina-lisina, unidades de -lisina-valina-citrulina y unidades de -lisina-valina-alanina. En algunas realizaciones, el grupo enlazador del agente de unión de los conjugados descritos en este documento se deriva de la reacción de un grupo "enlazador reactivo" de una carga útil del enlazador descrita en este documento con una porción reactiva de un anticuerpo. El grupo enlazador reactivo (RL) se refiere a un grupo monovalente que comprende un grupo reactivo y un grupo de enlace, representado como
[0977]
[0980] en donde RG es el grupo reactivo, L es el grupo de enlace y la línea ondulada representa un enlace a una carga útil. El grupo de enlace es cualquier fracción divalente que une el grupo reactivo con la carga útil. El grupo de enlace también puede ser cualquier fracción trivalente que una el grupo reactivo, la carga útil y una fracción de ciclodextrina. En algunos ejemplos, el grupo de enlace es trivalente e incluye una fracción de ciclodextrina unida a un grupo trivalente (por ejemplo, un residuo de lisina) en el grupo de enlace. Los enlazadores reactivos (RL), junto con las cargas útiles a las que están unidos, comprenden intermedios ("cargas útiles del enlazador") útiles como precursores sintéticos para la preparación de los conjugados de esteroides de anticuerpos descritos en este documento. El enlazador reactivo contiene un grupo reactivo (RG), que es un grupo funcional o fracción que reacciona con una porción reactiva de un anticuerpo, un anticuerpo modificado o un fragmento de unión a antígeno del mismo. La fracción resultante de la reacción del grupo reactivo (RG) con el anticuerpo, anticuerpo modificado o fragmento de unión a antígeno del mismo, junto con el grupo de enlace (L), comprende la porción de "enlazador del agente de unión" (BL) del conjugado, descrito en este documento. Así, en algunas realizaciones, BL tiene la siguiente estructura:
[0983]
[0986] BA
[0987] en donde ^ es la unión con el agente de unión, RGN es la fracción resultante de la reacción de un grupo reactivo de una carga útil del enlazador con una porción reactiva de un agente de unión, L es un grupo de
[0988] <enlace, y>r<5 es una unión a una carga útil.>
[0989] En ciertas realizaciones, RGN se deriva de la reacción de RG con un residuo de cisteína o lisina de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En ciertas realizaciones, RGN se deriva de una reacción química de clic. En algunas realizaciones de dicha reacción de química de clic, RGN se deriva de una reacción de 1,3 cicloadición entre un alquino y una azida. Ejemplos no limitativos de tales RGNs incluyen aquellos derivados de alquinos tensados, por ejemplo, aquellos adecuados para cicloadiciones de alquino-azida promovidas por tensión (SPAAC), cicloalquinos, por ejemplo, ciclooctinos, alquinos benzanulados y alquinos capaces de experimentar reacciones de 1,3 cicloadición con azidas en ausencia de catalizadores de cobre. RGNs adecuados también incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de DIBAC, DIBO, BARAC, sustituidos, por ejemplo, alquinos fluorados, aza-cicloalquinos, BCN y derivados de los mismos. Conjugados que contienen tales grupos r Gn pueden derivarse de anticuerpos que han sido funcionalizados con grupos azido. Dichos anticuerpos funcionalizados incluyen anticuerpos funcionalizados con grupos azido-polietilenglicol. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo funcionalizado se deriva haciendo reaccionar un anticuerpo que comprende al menos un residuo de glutamina con un compuesto de acuerdo con la fórmula H2N-LL-N3, en donde LL es un grupo polietilenglicol divalente, en presencia de la enzima transglutaminasa, por ejemplo, transglutaminasa microbiana. Los residuos de glutamina adecuados de un anticuerpo incluyen Q295, o aquellos derivados por inserción o mutación, por ejemplo, mutación N297Q.
[0990] BA de los conjugados descritos en este documento es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, los conjugados descritos en este documento se derivan de anticuerpos funcionalizados con azido. En ciertas realizaciones, BA de los conjugados descritos en este documento es:
[0993]
[0995] en donde Ab es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, n es un número entero de 1 a 10, w es el número de fracciones de carga útil del enlazador, y ^ es una unión a un único enlazadordel agente de unión (BL), por ejemplo, unión a una fracción derivada de una reacción de 1,3-cicloadición entre un alquino y una azida. En ciertas realizaciones, w es 3. En ciertas realizaciones, w es 2 o 4,es decir,el conjugado comprende 2 o 4 fracciones de carga útil del enlazador.
[0996] En algunas realizaciones, BL es una fracción divalente de Fórmula (BLA);
[0997] -RGN-(SP1)q-(A)z(NRa)s-(B)t-(CH2)u-(O)v-(SP2)w- (BLA);
[0998] en donde RGN es como se define en este documento;
[0999] A es un aminoácido o un péptido;
[1000] Ra es H o alquilo;
[1001] B es arilo, heteroarilo o heterocicloalquilo, en donde arilo, heteroarilo o heterocicloalquilo está opcionalmente sustituido con alquilo, -OH o -NRaRb;
[1002] SP1 y SP2 son, independientemente, grupos espaciadores; y q, z, s, t, u, v y w son, independientemente en cada caso, 0 o 1.
[1003] En algunas otras realizaciones, BL es una fracción trivalente de Fórmula (BLB);
[1004] -RGN-(SP1)q-(A)z(NRa)s-(B)t(CH2)u-(O)v-(SP2)w- (BLB);
[1005] en donde RGN es como se define en este documento;
[1006] A es un tripéptido, en donde al menos uno de los aminoácidos del tripéptido está unido directa o indirectamente a una fracción de ciclodextrina;
[1007] Ra es H o alquilo;
[1008] B es arilo, heteroarilo o heterocicloalquilo, en donde arilo, heteroarilo o heterocicloalquilo está opcionalmente sustituido con alquilo, -OH o -NRaRb;
[1009] SP1 y SP2 son, independientemente, grupos espaciadores; y q, z, s, t, u, v y w son, independientemente en cada caso, 0 o 1.
[1010] En algunos ejemplos, la ciclodextrina (CD) está unida directamente a un residuo de aminoácido, como un residuo de aminoácido lisina. Esto significa que la CD está a una posición de unión del enlazador covalente del aminoácido lisina. En algunos de estos ejemplos, el enlazador covalente también está unido directamente a una fracción de carga útil. Esto significa que el enlazador covalente está a una posición de unión de una carga útil tal como, pero no limitado a, una carga útil de esteroide establecida en este documento. En algunos de estos ejemplos, el enlazador covalente también está unido directamente a una fracción de CD. Esto significa que el enlazador covalente está a una posición de unión de una CD, tal como las CD que se establecen en este documento. En algunos de estos ejemplos, el enlazador covalente es un aminoácido lisina o un derivado del mismo.
[1012] En algunos ejemplos, la CD está unida indirectamente a un enlazador covalente en un grupo de enlace (por ejemplo, un B<l>). Esto significa que la CD está a más de una posición de unión del enlazador covalente. Esto también significa que la CD está unida a través de otra fracción al enlazador covalente. Por ejemplo, la CD puede estar unida a un grupo maleimida que está unido a un grupo polietilenglicol que está unido al enlazador covalente. En algunos de estos ejemplos, el enlazador covalente también está unido indirectamente a una fracción de carga útil. Esto significa que el enlazador covalente está a más de una posición de unión de una carga útil tal como, pero no limitado a, una carga útil de esteroide establecida en este documento. Esto también significa que el enlazador covalente está unido a través de otra fracción a la carga útil. Por ejemplo, el enlazador covalente puede estar unido a un dipéptido, tal como, pero no limitado a, Val-Ala o Val-Cit, que puede estar unido a para-amino benzoilo, que puede estar unido a la carga útil. En algunos de estos ejemplos, el enlazador covalente también está unido indirectamente a una fracción de ciclodextrina. Esto significa que el enlazador covalente se encuentra a más de una posición de enlace de una ciclodextrina, tal como las ciclodextrinas establecidas en este documento. Esto también significa que el enlazador covalente está unido a través de otra fracción a la ciclodextrina. Por ejemplo, el enlazador covalente puede estar unido a un grupo de polietilenglicol que puede estar unido a un grupo reactivo que puede estar unido a la ciclodextrina. En algunos de estos ejemplos, el enlazador covalente es un aminoácido lisina o un derivado del mismo.
[1014] En algunas realizaciones, BL es -RCN-(SP1)q-(A)z-. En algunas realizaciones, BL es -RGN-(SP1)q-(A)2-. En algunas realizaciones, BL es una fracción de Fórmula (BLA1)
[1017]
[1020] en donde RAA1 y RAA2 son cada una, independientemente, cadenas laterales de aminoácidos. En algunos ejemplos de Fórmula RLA1, SP1 es un grupo polietilenglicol divalente y RGN es un aducto de la reacción de 1,3-cicloadición entre un alquino y una azida.
[1022] En algunas realizaciones, BL es -RGN'(SP1)q-(A)z-. En algunas realizaciones, BL es -RGN-(SP1)q-(A)2-. En algunas realizaciones, BL es una fracción de Fórmula (BLB1)
[1025]
[1028] en donde RAA1 y RAA2 son cada una, independientemente, cadenas laterales de aminoácidos. RAA3 es una cadena lateral de aminoácidos que está unida directa o indirectamente a una fracción de ciclodextrina. En algunos ejemplos de Fórmula RLB1, SP1 es un grupo polietilenglicol divalente y RGN es un aducto de la reacción de 1,3-cicloadición entre un alquino y una azida.
[1030] En algunas realizaciones, BL tiene la siguiente estructura:
[1032] -RGN-(SP1)q-Z1-Z2-Z30-1-
[1033] en donde:
[1035] RGN, SP1, son como se definen en este documento;
[1037] q es 0 o 1;
[1039] Z1 es un grupo polietilenglicol o caproilo;
[1041] Z2 es un dipéptido o tripéptido; y
[1043] Z3 es un grupo PAB.
[1044] En ciertas realizaciones, RGN se deriva de un grupo reactivo de química clic y Z1 es un grupo polietilenglicol. En ciertas realizaciones, RGN-(SP1)q-Z1- es:
[1047]
[1049] o una mezcla de los mismos; o
[1052]
[1054] En algunas realizaciones, el dipéptido es valina-citrulina o valina-alanina.
[1055] En algunas realizaciones, el BL está unido a la carga útil a través de una amina terciaria. Por ejemplo, si el esteroide es el siguiente compuesto,
[1058]
[1060] el RL puede unirse a la amina terciaria de la siguiente manera:
[1063]
[1065] En algunos ejemplos, se establece un compuesto como el siguiente:
[1068]
[1070] en donde:
[1071] BL es un enlazador del agente de unión como se define anteriormente;
[1072] Ra y Rb son, independientemente en cada caso, -H o alquilo.
[1073] En algunos ejemplos, en este documento RGN se deriva de un grupo reactivo de química clic. En algunos ejemplos, RGN es:
[1076]
[1078] o mezcla de los mismos;
[1079] o
[1081] o una mezcla de los mismos, en donde
[1084]
[1086] es una unión a un agente de unión.
[1087] En algunos otros ejemplos, en este documento RGN se selecciona de un grupo que reacciona con un residuo de cisteína o lisina en un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos ejemplos, RGN es
[1090]
[1092] en donde
[1095]
[1097] es un enlace a la cisteína de un agente de unión, por ejemplo, anticuerpo. En algunos ejemplos, RGN es
[1100]
[1102] En algunas realizaciones, SP1 se selecciona de:
[1105]
[1107] En algunos ejemplos, SP1 es
[1110]
[1112] En algunos otros ejemplos, SP1 es
[1115]
[1116] . En otros ejemplos, SP1 es . En todavía otros
[1118]
[1120] ejemplos, SP1 es. En algunos otros ejemplos Sp1 es
[1122]
[1124] En cualquiera de los ejemplos anteriores, los subíndices a, b y c son independientemente, en cada caso, un número entero de 1 a 20.
[1125] En algunas realizaciones, RAA3 se selecciona de
[1127]
[1129] en donde CD es una fracción de ciclodextrina. En algunas realizaciones, RAA3 se selecciona de
[1131]
[1133] En cualquiera de los compuestos de Fórmula (II), (IIa), (IIb), o (IIc), SP1 se selecciona de:
[1134]
[1136] En algunos ejemplos, SP1 es
[1138]
[1140] En algunos ejemplos, SP1 es
[1141]
[1143] En algunos ejemplos, SP1 es
[1146]
[1148] En algunos ejemplos, SP1 es
[1151]
[1153] En algunos ejemplos, SP1 es
[1156]
[1158] En algunos ejemplos, SP1 es
[1161]
[1163] En algunos ejemplos, SP1 es
[1165] O
[1166] /O íy
[1167] En algunos ejemplos, SP1 es
[1170]
[1172] En algunos ejemplos, SP1 es
[1175]
[1177] En algunos ejemplos, SP1 es
[1180]
[1182] En algunos ejemplos, SP1 es
[1185]
[1187] En algunas realizaciones, BL-SP1 es:
[1188]
[1190] o mezcla de los mismos;
[1193]
[1195] o mezcla de los mismos;
[1198]
[1200] o mezcla de los mismos;
[1201] o
[1204]
[1206] En algunos de estos ejemplos, los subíndices b, c y d son independientemente, en cada caso, un número entero de 1 a 20.
[1207] En cualquiera de los compuestos de Fórmula (II), (IIa), (IIb), o (IIc), BL-SP1 se selecciona de:
[1210]
[1212] o mezcla de los mismos;
[1213]
[1215] o una mezcla de los mismos; o
[1218]
[1220] En algunas realizaciones, A es un péptido seleccionado de valina-citrulina, citrulina-valina, lisina-fenilalanina, fenilalanina-lisina, valina-asparagina, asparagina-valina, treonina-asparagina, asparagina-treonina, serinaasparagina, asparagina-serina, fenilalanina-asparagina, asparagina-fenilalanina, leucina-asparagina, asparagina-leucina, isoleucina-asparagina, asparagina-isoleucina, glicina-asparagina, asparagina-glicina, ácido glutámico-asparagina, asparagina-ácido glutámico, citrulina-asparagina, asparagina-citrulina, alaninaasparagina o asparagina-alanina.
[1221] En algunos ejemplos, A es valina-citrulina o citrulina-valina.
[1222] En algunos ejemplos, A es valina-alanina o alanina-valina.
[1223] En algunos ejemplos, A es lisina-valina-alanina o alanina-valina-lisina.
[1224] En algunos ejemplos, A es lisina-valina-citrulina o citrulina-valina-lisina.
[1225] En algunos ejemplos, A es valina.
[1226] En algunos ejemplos, A es alanina.
[1227] En algunos ejemplos, A es citrulina.
[1228] En algunos ejemplos, A es
[1231]
[1233] En algunos de estos ejemplos, RAA1 es una cadena lateral de aminoácidos, y en donde RAA2 es una cadena lateral de aminoácidos.
[1234] En algunos ejemplos, A es
[1237]
[1238] En algunos de estos ejemplos, RAA1 es una cadena lateral de aminoácidos, RAA2 es una cadena lateral de aminoácidos y RAA3 es una cadena lateral de aminoácidos que está unida directa o indirectamente a una fracción de ciclodextrina.
[1240] En algunos ejemplos, A es
[1243]
[1246] En algunos ejemplos, A es
[1249]
[1252] En algunos ejemplos, A es
[1255]
[1258] <en donde>-CD<representa un enlace directo o indirecto a una fracción de ciclodextrina.>
[1260] En algunos ejemplos, incluido cualquiera de los anteriores, CD se selecciona, independientemente en cada caso, de entre
[1263]
[1264]
[1266] En algunos ejemplos, la CD es
[1269]
[1271] En algunos ejemplos, la CD es
[1274]
[1276] En algunos ejemplos, la CD es
[1279]
[1281] En algunos ejemplos, la CD es
[1282]
[1284] En algunos ejemplos, la CD es
[1286]
[1288] En algunos ejemplos, la CD es
[1290]
[1292] En algunos ejemplos, A es
[1294]
[1296] En algunos ejemplos, Ra es H
[1297] En algunos ejemplos, Ra es alquilo
[1298] En algunos ejemplos, Ra es metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, i-butilo o pentilo.
[1299] En algunas realizaciones, B es arilo.
[1300] En algunos ejemplos, B es fenilo.
[1301] En algunos ejemplos de compuestos de Fórmula (II), (IIa), (IIb), o (Me), B es fenilo o piridinilo.
[1302] En algunos ejemplos en este documento, B es:
[1305]
[1308] En estos ejemplos, R10 es alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, arilo, alquilarilo, arilalquilo, halo, haloalquilo, haloalcoxi, heteroarilo, heterocicloalquilo, hidroxilo, ciano, nitro, - I-O a, -í-SC>2RA,
[1311]
[1313] NRaRb, o azido. En estos ejemplos, los subíndices p y m se seleccionan independientemente, en cada caso, de un número entero de 0 a 4.
[1314] En algunos ejemplos en este documento, B es:
[1317]
[1319] En estos ejemplos, p es 0, 1, 2, 3 o 4. En algunos de estos ejemplos, R1 es, independientemente en cada presencia, alquilo, alcoxi, haloalquilo o halo. En algunos ejemplos, R1 es alquilo. En algunos ejemplos, R1 es alcoxi. En algunos ejemplos, R1 es haloalquilo. En algunos ejemplos, R1 es halo.
[1320] En algunas realizaciones de la Fórmula (BLA), el -(NRa)s-(B)t-(CH2)u-(O)v-(SP2)w es:
[1323]
[1325] Se exponen en el presente documento conjugados de anticuerpos-esteroides que tienen las siguientes fórmulas:
[1328]
[1329]
[1330] en donde BA es un agente de unión y x es un número entero de 1-30. En realizaciones particulares, BA es un anticuerpo. En algunas realizaciones, x es un número entero de 1 a 4. En algunas realizaciones, x es 4. En algunas realizaciones, x es 2.
[1331] Se exponen en el presente documento conjugados de anticuerpos-esteroides de acuerdo con la Fórmula 1200:
[1334]
[1336] o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: BA es un agente de unión; cada L es un enlazador opcional; BA o L está unido covalentemente a R3 o R4; y x es un número entero de 1 a 30. Los expertos reconocerán que cuando L está presente, L está unido a R3 o R4; cuando L no está presente, BA está unido a R3 o R4. Los grupos R3 o R4 se describen en detalle a continuación. En realizaciones particulares, BA es un anticuerpo. En algunas realizaciones, x es un número entero de 1 a 4. En algunas realizaciones, x es 4. En algunas realizaciones, x es 2.
[1337] En ciertas realizaciones de la Fórmula 1200, R1 y R2 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en -H, -OH, alquilo, -OC(O)-alquilo y halo; o R1 y R2 juntos forman
[1339] R4
[1340] o'^ 'o
[1342] En ciertas realizaciones de la Fórmula 1200, R3 es -NRaRb; y R4 es preferiblemente heterocicloalquilo que contiene N.
[1343] En ciertas realizaciones de la Fórmula 1200, R3 es -NRaRb; y R4 es alquilo.
[1344] En cada realización de la Fórmula 1200, BA o L está unido a un grupo funcional en R3 o R4. Por ejemplo, si R3 o R4 comprende un grupo amino, BA o L se pueden unir al grupo amino, sustituyendo un átomo de hidrógeno. En cada realización, R5 se selecciona, independientemente en cada caso, de un sustituyente en el grupo que consiste en -OH, halo y alquilo; n es un número entero de 0-19; y cada R5 se posiciona en cualquier átomo del anillo. En cada realización, Ra y Rb se seleccionan, independientemente en cada caso, del grupo que consiste en -H y alquilo; o Ra y Rb ciclizan para formar cicloheteroalquilo con tres a seis átomos en el anillo, incluido un heteroátomo, que es el N al que están unidos. En realizaciones particulares, BA es un anticuerpo. En algunas realizaciones, x es un número entero de 1 a 4. En algunas realizaciones, x es 4. En algunas realizaciones, x es 2.
[1345] Se exponen en el presente documento conjugados de anticuerpo-esteroide de acuerdo con la Fórmula 1210, 1220, 1230 o 1240:
[1348]
[1349]
[1351] o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde R3 está unido covalentemente a L o BA. En ciertas realizaciones de la Fórmula 1210, 1220, 1230 o 1240, R1 y R2 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en -H, -OH, alquilo, -OC(O)-alquilo y halo; o R1 y R2 juntos forman
[1354] R4
[1356] O ' ^ ' O
[1358] En ciertas realizaciones, R3 es -NRaRb; y R4 es alquilo. En cada realización, BA o L está unido a un grupo amino en R3, por ejemplo, sustituyendo un átomo de hidrógeno. En cada realización, Ra y Rb se seleccionan, independientemente en cada caso, del grupo que consiste en -H y alquilo; o Ra y Rb ciclizan para formar cicloheteroalquilo con tres a seis átomos en el anillo, incluido un heteroátomo, que es el N al que están unidos. En realizaciones particulares, BA es un anticuerpo. En algunas realizaciones, x es un número entero de 1 a 4. En algunas realizaciones, x es 4. En algunas realizaciones, x es 2.
[1359] Se exponen en el presente documento conjugados de anticuerpo-esteroide de acuerdo con la Fórmula 1310, 1320, 1330 o 1340:
[1362]
[1364] o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde R4 está unido covalentemente a L o BA. En las fórmulas 1310, 1320, 1330 o 1340, R3 es -NRaRb; y R4 es heterocicloalquilo que contiene N. En cada realización, BA o L está unido a un grupo amino en R4, por ejemplo, sustituyendo un átomo de hidrógeno. En cada realización, Ra y Rb se seleccionan, independientemente en cada caso, del grupo que consiste en -H y alquilo; o Ra y Rb ciclizan para formar cicloheteroalquilo con tres a seis átomos en el anillo, incluido un heteroátomo, que es el N al que están unidos. En realizaciones particulares, BA es un anticuerpo. En algunas realizaciones, x es un número entero de 1 a 4. En algunas realizaciones, x es 4. En algunas realizaciones, x es 2.
[1365] También se exponen en el presente documento conjugados de anticuerpos-esteroides que tienen las siguientes fórmulas:
[1366]
[1369] o mezcla de los mismos;
[1371] en donde Ab es un anticuerpo y x es un número entero de 1-30. En algunas realizaciones, x es un número entero de 1 a 4. En algunas realizaciones, x es 4. En algunas realizaciones, x es 2.
[1373] Se exponen en el presente documento conjugados de anticuerpos-esteroides que tienen las siguientes fórmulas:
[1376]
[1379] o mezclas de los mismos;
[1380]
[1382] o mezclas de los mismos;
[1384]
[1385]
[1388] o mezclas de los mismos;
[1391]
[1394] o mezclas de los mismos;
[1396] En realizaciones particulares, Ab es un anticuerpo y x es un número entero de 1-30. En algunas realizaciones, x es un número entero de 1 a 4. En algunas realizaciones, x es 4. En algunas realizaciones, x es 2.
[1398] También se proporcionan aquí conjugados del agente de unión de budesonida o diflorasona.
[1400] El agente de unión es un anticuerpo. El término "anticuerpo", tal como se utiliza en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular que se une al antígeno y que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente o interactúa con un antígeno particular. El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como sus multímeros (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en este documento como HCVR o V<h>) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, C<h>1, C<h>2 y C<h>3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en este documento como LCVR o V<l>) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (C<l>1). Las regiones V<h>y V<l>pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada V<h>y V<l>se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el terminal amino hasta el carboxiterminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En algunas realizaciones, las FR del anticuerpo (o porción de unión al antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden estar modificadas de forma natural o artificial. Una secuencia de consenso de aminoácidos puede definirse basándose en un análisis lado a lado de dos o más CDR.
[1402] El término "anticuerpo", tal como se utiliza en este documento, también incluye fragmentos de unión al antígeno de moléculas de anticuerpos completas. Los términos "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo y similares, tal como se utilizan en este documento, incluyen cualquier polipéptido o glicoproteína natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado genéticamente que se una específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de un anticuerpo que se unen al antígeno pueden derivarse, por ejemplo, a partir de moléculas de anticuerpos completas utilizando cualquier técnica estándar adecuada, como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables y opcionalmente constantes del anticuerpo. Tal ADN es conocido y/o está fácilmente disponible en, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de a Dn (incluidas, por ejemplo, bibliotecas de fagos-anticuerpos), o pueden sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o mediante técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear residuos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.
[1403] Ejemplos no limitantes de fragmentos de unión al antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades mínimas de reconocimiento que consisten en residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3, o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas diseñadas, como anticuerpos específicos del dominio, anticuerpos de dominio único, anticuerpos con dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), los inmunofármacos modulares pequeños (SMIP) y los dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", tal como se utiliza en el presente documento.
[1405] Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo típicamente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente o en marco con una o más secuencias de marco. En fragmentos de unión al antígeno que tienen un dominio V<h>asociado con un dominio V<l>, los dominios V<h>y V<l>pueden estar situados unos respecto de otros en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener dímeros de V<h>-V<h>, V<h>-V<l>o V<l>-V<l>. Alternativamente, el fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio V<h>o V<l>monomérico.
[1407] En ciertas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Las configuraciones de ejemplo no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación incluyen: (i) V<h>-C<h>1; (ii) V<h>-C<h>2; (iii) V<h>-C<h>3; (iv) V<h>-C<h>1-C<h>2; (v) V<h>-C<h>1-C<h>2-C<h>3; (vi) V<h>-C<h>2-C<h>3; (vii) V<h>-C<l>; (viii) V<l>-C<h>1; (ix) V<l>-C<h>2; (x) V<l>-C<h>3; (xi) V<l>-C<h>1-C<h>2; (xii) V<l>-C<h>1-C<h>2-C<h>3; (xiii) V<l>-C<h>2-C<h>3; y (xiv) V<l>-C<l>. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluida cualquiera de las configuraciones de ejemplo enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar vinculados directamente entre sí o pueden estar vinculados por una región de bisagra o de enlace total o parcial. Una región de bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado un enlace flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una sola molécula de polipéptido. Además, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios V<h>o V<l>monoméricos (por ejemplo, por enlaces disulfuro).
[1409] Al igual que con las moléculas de anticuerpos completas, los fragmentos de unión al antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecífico). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo típicamente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno separado o a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluidos los formatos de anticuerpos biespecíficos de ejemplo divulgados en este documento, se puede adaptar para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación utilizando técnicas de rutina disponibles en la técnica.
[1411] Los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar a través de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). "Citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a la lisis de células que expresan antígeno por un anticuerpo de la presente divulgación en presencia de complemento. La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" (ADCC) se refiere a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcRs) (por ejemplo, Las células asesinas naturales (NK), los neutrófilos y los macrófagos reconocen el anticuerpo unido a una célula objetivo y, por lo tanto, provocan la lisis de dicha célula. La CDC y la ADCC se pueden medir utilizando ensayos que son bien conocidos y están disponibles en la técnica.(Véase,por ejemplo, Patentes U.S. Nos. 5,500,362 y 5,821,337, y Clynesetal.(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). La región constante de un anticuerpo es importante para la capacidad del anticuerpo de fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de las células. Por tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse sobre la base de si es deseable que el anticuerpo medie la citotoxicidad.
[1412] Los anticuerpos útiles para los compuestos descritos en este documento incluyen anticuerpos humanos. El término "anticuerpo humano", tal como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitioin vitroo por mutación somáticain vivo),por ejemplo en las CDR y en particular en la CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", tal como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas. El término "anticuerpo humano" no incluye moléculas de origen natural que normalmente existen sin modificación o intervención/manipulación humana, en un organismo vivo natural y no modificado.
[1414] Los anticuerpos pueden, en algunas realizaciones, ser anticuerpos humanos recombinantes. El término "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, como los anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped (descrito más adelante), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes (descrito más adelante), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res.
[1415] 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Estos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesisin vitro(o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, mutagénesisin vivosomática) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de la regiones Vh y Vyl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, si bien se derivan de y están relacionadas con las secuencias Vh y Vl de línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanosin vivo.
[1417] Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que están asociadas con la heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende un constructo estable de cuatro cadenas de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dímeros se mantienen unidos por un enlace disulfuro de cadena pesada entre cadenas. En una segunda forma, los dímeros no están unidos a través de enlaces disulfuro entre cadenas y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta de una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de la purificación por afinidad.
[1419] La frecuencia de aparición de la segunda forma en varios isotipos de IgG intactos se debe, pero no se limita a, diferencias estructurales asociadas con el isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una sola sustitución de aminoácidos en la región bisagra de la bisagra de la IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) a niveles típicamente observados usando una bisagra IgG1 humana. La presente divulgación abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la bisagra, región Ch2 o Ch3 que puede ser deseable, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.
[1421] Los anticuerpos útiles para los compuestos descritos en este documento pueden ser anticuerpos aislados. Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en este documento, significa un anticuerpo que ha sido identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que ha sido separado o eliminado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en donde el anticuerpo existe naturalmente o se produce naturalmente, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente divulgación. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpoin situdentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que han sido sometidos al menos a un paso de purificación o aislamiento. Según ciertas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.
[1423] Los anticuerpos útiles para los compuestos divulgados en este documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de línea germinal correspondientes de las que se derivaron los anticuerpos. Estas mutaciones se pueden determinar fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en este documento con las secuencias de la línea germinal disponibles, por ejemplo, en bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se derivan de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en este documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR se mutan a los residuos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que se derivó el anticuerpo, o a los residuos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o a una sustitución conservadora de aminoácidos de los residuos correspondientes de la línea germinal (tales cambios de secuencia se denominan en este documento colectivamente como "mutaciones de la línea germinal"). Una persona con conocimientos normales en la técnica, comenzando con las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera divulgadas en este documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más mutaciones de línea germinal individuales o combinaciones de las mismas. En ciertas realizaciones, todos los residuos del marco y/o CDR dentro de los dominios Vh y/o Vl se mutan de nuevo a los residuos que se encuentran en la secuencia de la línea germinal original de la que se derivó el anticuerpo. En otras realizaciones, solo ciertos residuos se mutan de nuevo a la secuencia de la línea germinal original, por ejemplo, sólo los residuos mutados que se encuentran dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o sólo los residuos mutados que se encuentran dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otras realizaciones, uno o más de los residuos del marco y/o CDR se mutan a los residuos correspondientes de una secuencia de línea germinal diferente(es decir,una secuencia de línea germinal que es diferente de la secuencia de línea germinal de la que se derivó originalmente el anticuerpo). Además, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, en donde ciertos residuos individuales se mutan al residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal particular, mientras que otros residuos que difieren de la secuencia de línea germinal original se mantienen o se mutan al residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos que contienen una o más mutaciones de la línea germinal se pueden analizar fácilmente para determinar una o más propiedades deseadas, como especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc.
[1425] En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento de anticuerpo (Fab, Fab' y F(ab)2, minicuerpo, diacuerpo, tricuerpo y similares) o un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos descritos en este documento se pueden humanizar utilizando los métodos descritos en Patente U.S. No. 6,596,541 y Publicación U.S. No. 2012/0096572.
[1427] Cuando el agente de unión es un anticuerpo, se une a un socio de unión al antígeno que es un polipéptido y puede ser una molécula transmembrana(porejemplo, receptor) o un factor de crecimiento que podría estar glicosilado o fosforilado.
[1429] Los objetivos adecuados a los que se une el agente de unión incluyen cualquier objetivo al que sea deseable la administración de esteroides. En algunas realizaciones, el agente de unión es un anticuerpo, un anticuerpo modificado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un objetivo seleccionado de: AXL, BAFFR, BCMA BCR-componentes de la lista, BDCA2, BDCA4, BTLA, BTNL2 BTNL3, BTNL8, BTNL9, C10orf54, CCR1, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR9, CCR10, CD11c, CD137, CD138, CD14, CD168, CD177, CD19, CD20, CD209, CD209L, CD22, CD226, CD248, CD25, CD27, CD274, CD276, CD28, CD30, CD300A, CD33, CD37, CD38, CD4, CD40, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD5, CD52, CD55, CD56, CD59, CD62E, CD68, CD69, CD70, CD74, CD79a, CD79b, CD8, CD80, CD86, CD90.2, CD96, CLEC12A, CLEC12B, CLEC7A, CLEC9A, CR1, CR3, CRTAM, CSF1R, CTLA4, CXCR1/2, CXCR4, CXCR5, DDR1, DDR2, DEC-205, DLL4, DR6, FAP, FCamR, FCMR, FcR's, Fire, GITR, HHLA2, HLA clase II, HVEM, ICOSLG, IFNLR1, IL10R1, IL10R2, IL12R, IL13RA1, IL13RA2, IL15R, IL17RA, IL17RB, IL17RC, IL17RE, IL20R1, IL20R2, IL21R, IL22R1, IL22RA, IL23R, IL27R, IL29R, IL2Rg, IL31R, IL36R, IL3RA, IL4R, IL6R, IL5R, IL7R, IL9R, Integrinas, LAG3, LIFR, MAG/Siglec-4, MMR, MSR1, NCR3LG1, NKG2D, NKp30, NKp46, PDCD1, PROKR1, PVR, PVRIG, PVRL2, PVRL3, RELT, SIGIRR, Siglec-1, Siglec-10, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, SIRPA, SLAMF7, TACI, TCR-componentes/asociados de la lista PTCRA, TCRb, CD3z, CD3, TEK, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TIGIT, TLR2, TLR4, TROY, TSLPR, TYRO, VLDLR, VSIG4, y VTCN1.
[1431] Los enlazadores del agente de unión se pueden unir al agente de unión,es decir,anticuerpo o molécula de unión al antígeno, a través de una unión a un aminoácido particular dentro del anticuerpo o molécula de unión al antígeno. Ejemplos de uniones de aminoácidos que se pueden utilizar en el contexto de este aspecto de la divulgación incluyen, por ejemplo, lisina (véase, por ejemplo, US 5,208,020; US 2010/0129314; Hollander et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19:358-361; WO 2005/089808; US 5,714,586; US 2013/0101546; y US 2012/0585592), cisteína (véase, por ejemplo, US 2007/0258987; WO 2013/055993; WO 2013/055990; WO 2013/053873; WO 2013/053872; WO 2011/130598; US 2013/0101546; y US 7,750,116), selenocísteina (véase, por ejemplo, WO 2008/122039; y Hofer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2008, 105:12451-12456), formil glicina (véase, por ejemplo, Carrico et al., Nat. Chem. Biol., 2007, 3:321-322; Agarwal et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2013, 110:46-51, y Rabuka et al., Nat. Protocols, 2012, 10:1052-1067), aminoácidos no naturales (véase, por ejemplo, WO 2013/068874, y WO 2012/166559), y aminoácidos ácidos (véase, por ejemplo, WO 2012/05982). Los enlazadores se pueden conjugar a través de glutamina mediante conjugación quimioenzimática basada en transglutaminasa (véase, por ejemplo, Dennler et al., Bioconjugate Chem. 2014, 25, 569-578). Los enlazadores también se pueden conjugar con una proteína de unión al antígeno mediante la unión a carbohidratos (US 2008/0305497, WO 2014/065661, y Ryan et al., Food & Agriculture Immunol., 2001, 13:127-130) y enlazadores de disulfuro (véase, por ejemplo, WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611, WO 2014/197854, y Shaunak et al., Nat. Chem. Biol., 2006, 2:312-313). En algunos ejemplos, el agente de unión es un anticuerpo, y el anticuerpo está unido al enlazador a través de un residuo de lisina. En algunas realizaciones, el anticuerpo está unido al enlazador a través de un residuo de cisteína.
[1433] D. Métodos de preparación de compuestos
[1435] Los conjugados descritos en este documento se pueden sintetizar mediante el acoplamiento de las cargas útiles del enlazador descritas en este documento con un agente de unión, por ejemplo, un anticuerpo en condiciones de conjugación estándar (véase, por ejemplo, Drug Deliv. 2016 Junio;23(5):1662-6; AAPS Journal, Vol. 17, No. 2, Marzo 2015; e Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 561). Las cargas útiles del enlazador son intermedios sintéticos que comprenden la carga útil de interés y la fracción de enlace que, en última instancia, actúa como la fracción (o porción de la misma) que conecta el agente de unión con la carga útil. Las cargas útiles del enlazador comprenden un grupo reactivo que reacciona con el agente de unión para formar los conjugados descritos en este documento. Cuando el agente de unión es un anticuerpo, el anticuerpo se puede acoplar a una carga útil del enlazador a través de una o más cisteínas, lisinas u otros residuos del anticuerpo. Las cargas útiles del enlazador se pueden acoplar a residuos de cisteína, por ejemplo, sometiendo el anticuerpo a un agente reductor, por ejemplo, ditiotreitol, para romper los enlaces disulfuro del anticuerpo, purificando el anticuerpo reducido, por ejemplo, mediante filtración en gel y, posteriormente, haciendo reaccionar el anticuerpo con una carga de enlace que contiene una fracción reactiva, por ejemplo, un grupo maleimido. Los disolventes adecuados incluyen, pero no se limitan a agua, DMA, DMF y DMSO. Las cargas útiles del enlazador que contienen un grupo reactivo, por ejemplo, un éster activado o un grupo haluro de ácido, se pueden acoplar a residuos de lisina. Los disolventes adecuados incluyen, pero no se limitan a agua, DMA, DMF y DMSO. Los conjugados se pueden purificar utilizando técnicas de proteínas conocidas, que incluyen, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño, diálisis y ultrafiltración/diafiltración.
[1437] Agentes de unión, por ejemplo, anticuerpos, también se pueden conjugar mediante una reacción de química clic. En algunas realizaciones de dicha reacción de química de clic, la carga útil del enlazador comprende un grupo reactivo, por ejemplo, alquino que es capaz de experimentar una reacción de 1,3 cicloadición con una azida. Dichos grupos reactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a alquinos tensados, por ejemplo, aquellos adecuados para cicloadiciones de alquino-azida promovidas por tensión (SPAAC), cicloalquinos, por ejemplo, ciclooctinos, alquinos benzanulados y alquinos capaces de experimentar reacciones de 1,3 cicloadición con azidas en ausencia de catalizadores de cobre. Los alquinos adecuados también incluyen, pero no se limitan a, DIBAC, DIBO, BARAC, DIFO, sustituidos, por ejemplo, alquinos fluorados, aza-cicloalquinos, BCN y derivados de los mismos. Las cargas útiles del enlazador que comprenden dichos grupos reactivos son útiles para conjugar anticuerpos que han sido funcionalizados con grupos azido. Dichos anticuerpos funcionalizados incluyen anticuerpos funcionalizados con grupos azido-polietilenglicol. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo funcionalizado se deriva haciendo reaccionar un anticuerpo que comprende al menos un residuo de glutamina, por ejemplo, cadena pesada Q295, con un compuesto según la fórmula H2N-LL-N3, en donde LL es un grupo polietilenglicol divalente, en presencia de la enzima transglutaminasa. Para mayor comodidad, en ciertas fórmulas de este documento, el anticuerpo Ab es un anticuerpo modificado con uno o más grupos -LL-N3 grupos enlazados covalentemente, o residuos de los mismos. Preferiblemente, cada -LL-N3 está unido covalentemente a una cadena lateral de aminoácidos de un residuo de glutamina del anticuerpo. También preferiblemente, el -LL-N3 es o puede reaccionar con un grupo reactivo RG para formar un enlazador covalente con una carga útil del enlazador. Nuevamente, por conveniencia, en ciertas fórmulas aquí incluidas, los grupos -LL-N3 se dibujan expresamente.
[1439] Se exponen aquí métodos para sintetizar los conjugados descritos en este documento que comprenden poner en contacto un agente de unión, por ejemplo, anticuerpo, con una carga útil del enlazador descrita en este documento. En ciertas realizaciones, la carga útil del enlazador incluye una fracción de ciclodextrina.
[1441] En algunas realizaciones, la carga útil del enlazador es un compuesto de Fórmula (II):
[1444]
[1445] (a) R3 es RL-X-, o
[1448]
[1450] R1 y R2 son cada uno, independientemente, -H, alquilo, alquil-C(O)-O-, -OH, o halo; o R1 y R2 juntos forman
[1451] R4
[1452] o " ^ o
[1454] en donde R4 es alquilo, arilo, arilalquilo o un heterocicloalquilo que contiene N; en donde el alquilo, arilo, arilalquilo y heterocicloalquilo que contiene N están opcionalmente sustituidos con -NRaRb; o
[1455] (b) R3 es -NRaRb, y R1 y R2 juntos forman
[1457] R4
[1459] <0 ^>><0>A^Aí
[1461] en donde R4 es -RL-,
[1463] <rl>-<x>- @ - (C<h>2)0.2- b l_ x _ (CH2)
[1465] o RL-Y, en donde Y es un heterociclo divalente que contiene N;
[1466] RL es un enlazador reactivo;
[1467] R5 es, independientemente en cada caso, -OH, halo, alquilo o arilalquilo;
[1468] Ra y Rb son, independientemente en cada caso, -H o alquilo;
[1469] RP, independientemente en cada caso, es halo;
[1470] X, independientemente en cada caso, es NRa;
[1473]
[1475] es arilo o heteroarilo; y
[1476] n es un número entero de 0-19.
[1477] Los compuestos de fórmula (II) son cargas útiles del enlazador que son útiles como intermedios sintéticos en la síntesis de los conjugados descritos en este documento. Estas cargas útiles del enlazador comprenden un grupo reactivo que puede reaccionar con un anticuerpo para formar los conjugados descritos en este documento.
[1478] En algunos ejemplos de Fórmula (II), R1 y R2 son, cada uno, independientemente, -H, alquilo o -OH. En algunos ejemplos de Fórmula (II), uno de R1 o R2 es -H, alquilo o -OH. En algunos ejemplos de Fórmula (II), ambos R1 y R2 son -H, alquilo o -OH.
[1479] En algunos ejemplos de Fórmula (II), R1 y R2 juntos forman
[1482]
[1484] En algunos ejemplos, R4 es -RL. En algunos ejemplos, R4 es RL-NRa-arilo. En algunos otros ejemplos, R4 es alquilo. En ciertos ejemplos, R4 es arilalquilo, En algunos ejemplos, R4 es arilo. En otros ejemplos, R4 es heterocicloalquilo que contiene N.
[1485] En algunos ejemplos de Fórmula (II), R5 es halo. En algunos ejemplos de Fórmula (II), R5 es fluoro. En algunos ejemplos de Fórmula (II), uno de R5 es halo. En algunos ejemplos de Fórmula (II), R5 es halo y n es 2. En algunos ejemplos de Fórmula (II), R5 es -F y n es 1. En algunos ejemplos de Fórmula (II), R5 es -F y n es 2. En algunos otros ejemplos de Fórmula (II), R3 es -NRaRb.
[1486] En algunos ejemplos de Fórmula (II), R3 es
[1489]
[1491] En algunos ejemplos de Fórmula (II), R3 es
[1494]
[1497] En algunos ejemplos de Fórmula (II), R3 es -NRaRb. En algunos ejemplos de Fórmula (II), R3 es
[1500]
[1502] En algunos ejemplos de Fórmula (II), R3 es
[1505]
[1507] En algunos ejemplos de Fórmula (II), R3 es
[1510] R -L— T NI -
[1511] R»
[1512] En fórmula (II), El subíndice n es un número entero de 0-19. En algunos ejemplos, n es 0. En otros ejemplos, n es 1. En ciertos ejemplos, n es 2. En otros ejemplos, n es 3. En ciertos ejemplos, n es 4. En algunos ejemplos, n es 5. En otros ejemplos, n es 6. En ciertos ejemplos, n es 7. En otros ejemplos, n es 8. En ciertos ejemplos, n es 9. En algunos ejemplos, n es 10. En otros ejemplos, n es 11. En ciertos ejemplos, n es 12. En otros ejemplos, n es 13. En ciertos ejemplos, n es 14. En algunos ejemplos, n es 15. En otros ejemplos, n es 16. En ciertos ejemplos, n es 17. En otros ejemplos, n es 18. En ciertos ejemplos, n es 19.
[1513] En algunos ejemplos, se expone aquí un compuesto que tiene la estructura de Fórmula (IIa):
[1516]
[1518] en donde:
[1519] R5 es, independientemente en cada caso, -OH, halo o alquilo;
[1520] R3 se selecciona de-NRaRb;
[1521] RL es un enlazador reactivo;
[1522] Ra y Rb se seleccionan, independientemente en cada caso, de H y alquilo; y
[1523] n es un número entero de 0-19.
[1524] En algunos ejemplos, se expone aquí un compuesto que tiene la estructura de Fórmula (IIa2):
[1527]
[1529] en donde:
[1530] R5 es, independientemente en cada caso, -OH, halo o alquilo;
[1531] R3 es-NRaRb;
[1532] RL es un enlazador reactivo;
[1533] Ra y Rb se seleccionan, independientemente en cada caso, de H y alquilo; y
[1534] n es un número entero de 0-19.
[1535] En algunos ejemplos R3 es
[1538]
[1540] o. En algunos ejemplos de Fórmula (IIa2), R3 es -NRaRb. En algunos ejemplos R3 es
[1543]
[1545] Como se utiliza en este documento, la expresión "enlazador reactivo" o la abreviatura "RL" se refiere a un grupo monovalente que comprende un grupo reactivo y un grupo de enlace, representado como RG-L-^, en donde RG es el grupo reactivo y L es el grupo de enlace. El grupo de enlace es cualquier fracción divalente que une el grupo reactivo a una carga útil. El grupo de enlace también incluye cualquier fracción trivalente que une el grupo reactivo, una fracción de ciclodextrina y una carga útil. Los enlazadores reactivos (RL), junto con las cargas útiles a las que están unidos, comprenden intermedios ("cargas útiles del enlazador") útiles como precursores sintéticos para la preparación de los conjugados de esteroides de anticuerpos descritos en este documento. El enlazador reactivo contiene un grupo reactivo ("RG"), que es un grupo funcional o fracción que reacciona con una porción reactiva de un anticuerpo, anticuerpo modificado o fragmento de unión a antígeno del mismo. La fracción resultante de la reacción del grupo reactivo con el anticuerpo, anticuerpo modificado o fragmento de unión a antígeno del mismo, junto con el grupo de enlace, comprende la porción de "enlazador del agente de unión" ("BL") del conjugado, descrito en este documento. En ciertas realizaciones, el "grupo reactivo" es un grupo o fracción funcional (por ejemplo, maleimida o éster NHS) que reacciona con un residuo de cisteína o lisina de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En ciertas realizaciones, el "grupo reactivo" es un grupo o fracción funcional que es capaz de experimentar una reacción de química clic. En algunas realizaciones de dicha reacción de química clic, el grupo reactivo es un alquino que es capaz de experimentar una reacción de 1,3 cicloadición con una azida. Dichos grupos reactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a alquinos tensados, por ejemplo, aquellos adecuados para cicloadiciones de alquino-azida promovidas por tensión (SPAAC), cicloalquinos, por ejemplo, ciclooctinos, alquinos benzanulados y alquinos capaces de experimentar reacciones de 1,3 cicloadición con alquinos en ausencia de catalizadores de cobre. Los alquinos adecuados también incluyen, pero no se limitan a, DIBAC, DIBO, BARAC, sustituidos, por ejemplo, alquinos fluorados, aza-cicloalquinos, BCN y derivados de los mismos. Las cargas útiles del enlazador que comprenden dichos grupos reactivos son útiles para conjugar anticuerpos que han sido funcionalizados con grupos azido. Dichos anticuerpos funcionalizados incluyen anticuerpos funcionalizados con grupos azidopolietilenglicol. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo funcionalizado se deriva haciendo reaccionar un anticuerpo que comprende al menos un residuo de glutamina, por ejemplo, cadena pesada Q295, con un compuesto según la fórmula H2N-LL-N3, en donde LL es, por ejemplo, un grupo de polietilenglicol divalente, o en donde LL es un grupo trivalente que incluye polietilenglicol y una porción de ciclodextrina, en presencia de la enzima transglutaminasa. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo funcionalizado que tiene la siguiente estructura:
[1548]
[1550] en donde Ab es un anticuerpo, R es hidrocarbilo, n es un número entero de 1 a 10, w es un número entero de 1-10. En ciertas realizaciones, R es etileno. En ciertas realizaciones, n es 3. En ciertas realizaciones, w es 2 o 4.
[1551] En algunos ejemplos, el grupo reactivo es un alquino, por ejemplo,
[1554]
[1556] que puede reaccionar mediante química de clic con una azida, por ejemplo,
[1559]
[1561] Para formar un producto de química clic, por ejemplo,
[1564]
[1566] su regioisómero, o una mezcla de ellos. En algunos ejemplos, el grupo reactivo es un alquino, por ejemplo,
[1569]
[1571] que puede reaccionar mediante química de clic con una azida, por ejemplo,
[1574]
[1576] para formar un producto de química clic, por ejemplo,
[1579]
[1581] En algunos ejemplos, el grupo reactivo es un alquino, por ejemplo,
[1584]
[1586] que puede reaccionar mediante química de clic con una azida, por ejemplo,
[1589]
[1591] para formar un producto de química clic, por ejemplo,
[1592]
[1595] su regioisómero, o una mezcla de ellos. En algunos ejemplos, el grupo reactivo es un grupo funcional, por ejemplo,
[1598]
[1600] ,que reacciona con un residuo de cisteína en un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, para forma un enlace con el mismo, por ejemplo,
[1603]
[1605] en donde Ab se refiere a un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo y S se refiere al átomo de S en un residuo de cisteína a través del cual el grupo funcional se une al Ab. En algunos ejemplos, el grupo reactivo es un grupo funcional, por ejemplo,
[1608]
[1610] que reacciona con un residuo de lisina en un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, para formar un enlace con el mismo, por ejemplo,
[1613]
[1615] en donde Ab se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y -NH- se refiere al extremo del residuo de lisina a través del cual el grupo funcional se une al Ab. En algunos ejemplos, este átomo de N en un residuo de lisina a través del cual se une el grupo funcional se indica aquí como la letra N sobre un enlace, por ejemplo,
[1618]
[1620] En algunas realizaciones, RL es una fracción monovalente de Fórmula (RLA);
[1621] RG-(SP1)q-(A)z-(NRa)-(B)t-(CH2)u-(O)v-(SP2)w-(RLA);
[1622] en donde RG es un grupo reactivo;
[1623] A es un aminoácido o un péptido;
[1624] Ra es H o alquilo;
[1625] B es arilo, heteroarilo o heterocicloalquilo, en donde arilo, heteroarilo o heterocicloalquilo está opcionalmente sustituido con alquilo, -OH o -NRaRb;
[1626] SP1 y SP2 son, independientemente, grupos espaciadores; y q, z, s, t, u, v y w son, independientemente en cada caso, 0 o 1.
[1627] En algunas realizaciones, RL es RG-(SP1)q-(A)z-. En algunas realizaciones, RL es RG-(SP1)q-(A)2-. En algunas realizaciones, RL es una fracción de Fórmula (RLA1)
[1628]
[1630] en donde RAA1 y RAA2 son cada una, independientemente, cadenas laterales de aminoácidos. En algunos ejemplos de Fórmula RLA1, SP1 es un grupo polietilenglicol divalente y RG es un grupo que comprende un alquino que es capaz de experimentar una reacción de 1,3-cicloadición con una azida.
[1631] En algunas realizaciones, RL tiene la siguiente estructura:
[1632] RG-(SP1)q-Z1-Z2-Z30-1-en donde:
[1633] RG, SP1, y q son como se definen en este documento;
[1634] Z1 es un grupo polietilenglicol o caproilo;
[1635] Z2 es un dipéptido; y
[1636] Z3 es un grupo PAB.
[1637] En algunas otras realizaciones, BL es una fracción trivalente de Fórmula (BLB);
[1638] -RCN-(SP1)q-(A)z-(NRa)s-(B)t-(CH2)u-(O)v-(SP2)w-(BLB);
[1639] en donde RGN es como se define en este documento;
[1640] A es un tripéptido, en donde al menos uno de los aminoácidos del tripéptido está unido directa o indirectamente a una fracción de ciclodextrina;
[1641] Ra es H o alquilo;
[1642] B es arilo, heteroarilo o heterocicloalquilo, en donde arilo, heteroarilo o heterocicloalquilo está opcionalmente sustituido con alquilo, -OH o -NRaRb;
[1643] SP1 y SP2 son, independientemente, grupos espaciadores; y q, z, s, t, u, v y w son, independientemente en cada caso, 0 o 1.
[1644] En algunos ejemplos, la ciclodextrina (CD) está unida directamente a un residuo de aminoácido, tal como un residuo de aminoácido lisina. Esto significa que la CD está a una posición de enlace del enlazador covalente del aminoácido lisina. En algunos de estos ejemplos, el enlazador covalente también está unido directamente a una fracción de carga útil. Esto significa que el enlazador covalente está a una posición de enlace de una carga útil tal como, pero no limitado a, una carga útil de esteroide establecida en este documento. En algunos de estos ejemplos, el enlazador covalente también está unido directamente a una fracción de CD. Esto significa que el enlazador covalente está a una posición de enlace lejos de una CD, tal como las CD que se establecen en este documento. En algunos de estos ejemplos, el enlazador covalente es un aminoácido lisina o un derivado del mismo.
[1645] En algunos ejemplos, la CD está unida indirectamente a un enlazador covalente en un grupo de enlace (por ejemplo, un BL). Esto significa que la CD está a más de una posición de enlace lejos del enlazador covalente. Esto también significa que la CD está unida a través de otra fracción al enlazador covalente. Por ejemplo, la CD puede estar unida a un grupo maleimida que está unido a un grupo polietilenglicol que está unido al enlazador covalente. En algunos de estos ejemplos, el enlazador covalente también está unido indirectamente a una fracción de carga útil. Esto significa que el enlazador covalente está a más de una posición de enlace de una carga útil tal como, pero no limitado a, una carga útil de esteroide establecida en este documento. Esto también significa que el enlazador covalente está unido a través de otra fracción a la carga útil. Por ejemplo, el enlazador covalente puede estar unido a un dipéptido, tal como, pero no limitado a, Val-Ala o Val-Cit, que puede estar unido a para-amino benzoilo, que puede estar unido a la carga útil. En algunos de estos ejemplos, el enlazador covalente también está unido indirectamente a una fracción de ciclodextrina. Esto significa que el enlazador covalente se encuentra a más de una posición de enlace de una ciclodextrina, como las ciclodextrinas descritas en este documento. Esto también significa que el enlazador covalente está unido a través de otra fracción a la ciclodextrina. Por ejemplo, el enlazador covalente puede estar unido a un grupo de polietilenglicol que puede estar unido a un grupo reactivo que puede estar unido a la ciclodextrina. En algunos de estos ejemplos, el enlazador covalente es un aminoácido lisina o un derivado del mismo.
[1646] En algunas realizaciones, BL es -RGN-(SP1)q-(A)z-. En algunas realizaciones, BL es -RGN-(SP1)q-(A)2-.En algunas realizaciones, BL es una fracción de Fórmula (BLB1)
[1649] ^RGN-(SP1r
[1652] ( B L B1)
[1653] en donde RAA1 y RAA2 son cada una, independientemente, cadenas laterales de aminoácidos. RAA3 es una cadena lateral de aminoácidos que está unida directa o indirectamente a una fracción de ciclodextrina. En algunos ejemplos de Fórmula RLB1, SP1 es un grupo polietilenglicol divalente y RGN es un aducto de la reacción de 1,3-cicloadición entre un alquino y una azida.
[1654] En algunos ejemplos, A es
[1657]
[1659] En algunos de estos ejemplos, RAA1 es una cadena lateral de aminoácidos, RAA2 es una cadena lateral de aminoácidos y RAA3 es una cadena lateral de aminoácidos que está unida directa o indirectamente a una fracción de ciclodextrina.
[1660] En algunos ejemplos, A es
[1663]
[1666] <en donde>-CD<representa un enlace directo o indirecto a una fracción de ciclodextrina.>
[1667] En algunos ejemplos, incluido cualquiera de los anteriores, CD se selecciona, independientemente en cada caso, de entre
[1670]
[1671]
[1673] En algunos ejemplos, la CD es
[1675]
[1677] En algunos ejemplos, la CD es
[1679]
[1681] En algunos ejemplos, la CD es
[1683]
[1685] En algunos ejemplos, la CD es
[1686]
[1688] En algunos ejemplos, la CD es
[1691]
[1693] En algunos ejemplos, la CD es
[1696]
[1698] En algunos ejemplos, A es
[1701]
[1703] En algunas realizaciones, el RL se une a una amina terciaria. Por ejemplo, si el esteroide es el siguiente compuesto,
[1704]
[1706] el RL puede unirse a la amina terciaria de la siguiente manera:
[1709]
[1711] En algunos ejemplos, se establece un compuesto como el siguiente:
[1714]
[1716] en donde:
[1717] RL es un enlazador reactivo como se define anteriormente;
[1718] Ra y Rb son, independientemente en cada caso, -H o alquilo.
[1719] En algunos ejemplos, RG se selecciona de un grupo reactivo de química clic.
[1720] En algunos otros ejemplos, aquí RG se selecciona de un grupo que reacciona con un residuo de cisteína o lisina en un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
[1721] En algunas realizaciones, RG es
[1724]
[1727] En algunos ejemplos, RG es
[1730]
[1732] En otros ejemplos, RG es
[1735]
[1737] En algunos otros ejemplos, RG es
[1740]
[1742] En algunos ejemplos, RG es
[1743]
[1745] En otros ejemplos, RG es
[1748]
[1750] En otros ejemplos, RG es
[1753]
[1755] En algunas realizaciones, SP1 puede seleccionarse de:
[1758]
[1760] En algunos ejemplos, SP1 es
[1763]
[1765] En algunos otros ejemplos, SP1 es
[1768]
[1770] En otros ejemplos, SP1 es
[1773]
[1775] En otros ejemplos más, SP1 es
[1778]
[1780] En algunos otros ejemplos, SP1 es
[1782] O
[1783] j- (C H 2>-J L ^
[1784] En cualquiera de los ejemplos anteriores, los subíndices a, b y c son independientemente, en cada caso, un número entero de 1 a 20.
[1785] En cualquiera de los compuestos de Fórmula (II), (IIa), (IIb), o (IIc), SP1 puede seleccionarse de:
[1788]
[1790] En algunos ejemplos, SP1 es
[1793]
[1795] En algunos ejemplos, SP1 es
[1798]
[1800] . En algunos ejemplos, SP1 es
[1803]
[1805] En algunos ejemplos, SP1 es
[1808]
[1810] En algunos ejemplos, SP1 es
[1813]
[1815] En algunos ejemplos, SP1 es
[1818]
[1820] En algunos ejemplos, SP1 es
[1821]
[1823] En algunos ejemplos, SP1 es
[1826]
[1828] En algunos ejemplos, SP1 es
[1831]
[1833] En algunos ejemplos, SP1 es
[1836]
[1838] En algunos ejemplos, SP1 es
[1841]
[1843] En algunas realizaciones, RL-SP1 puede seleccionarse del grupo que consiste en:
[1846]
[1848] En algunos de estos ejemplos, los subíndices b, c y d son independientemente, en cada caso, un número entero de 1 a 20.
[1849] En algunos ejemplos RL-SP1- es
[1852]
[1854] En algunos ejemplos RL-SP1 es
[1855]
[1857] En algunos ejemplos RL-SP1 es
[1860]
[1862] En algunos ejemplos RL-SP1 es
[1865]
[1867] En cualquiera de los compuestos de Fórmula (II), (IIa), (IIb), o (IIc), RL-SP1 se selecciona de:
[1870]
[1871]
[1874] En algunas realizaciones, A es un péptido seleccionado de valina-citrulina, citrulina-valina, lisina-fenilalanina, fenilalanina-lisina, valina-asparagina, asparagina-valina, treonina-asparagina, asparagina-treonina, serinaasparagina, asparagina-serina, fenilalanina-asparagina, asparagina-fenilalanina, leucina-asparagina, asparagina-leucina, isoleucina-asparagina, asparagina-isoleucina, glicina-asparagina, asparagina-glicina, ácido glutámico-asparagina, asparagina-ácido glutámico, citrulina-asparagina, asparagina-citrulina, alaninaasparagina o asparagina-alanina.
[1875] En algunos ejemplos, A es valina-citrulina o citrulina-valina.
[1876] En algunos ejemplos, A es valina-alanina o alanina-valina.
[1877] En algunos ejemplos, A es valina.
[1878] En algunos ejemplos, A es alanina.
[1879] En algunos ejemplos, A es citrulina.
[1880] En algunos ejemplos, A es
[1883]
[1885] En algunos de estos ejemplos, RAA1 es una cadena lateral de aminoácidos, y en donde RAA2 es una cadena lateral de aminoácidos.
[1886] En algunos ejemplos, A es
[1889]
[1891] En algunos ejemplos, A es
[1894]
[1896] En algunos ejemplos, Ra es H
[1897] En algunos ejemplos, Ra es alquilo
[1898] En algunos ejemplos, Ra es metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, i-butilo o pentilo.
[1899] En algunas realizaciones, B es arilo.
[1900] En algunos ejemplos, B es fenilo.
[1901] En algunos ejemplos de compuestos de Fórmula (II), (IIa), (IIb), o (Me), B es fenilo o piridinilo.
[1902] En algunos ejemplos en este documento, B es:
[1905]
[1908] En estos ejemplos, R10 es alquilo, alquenilo, alquinilo, aleoxi, arilo, alquilarilo, arilalquilo, halo, haloalquilo, haloalcoxi, heteroarilo, heterocicloalquilo, hidroxilo, eiano, nitro,
[1911]
[1913] NRaRb, o azido. En estos ejemplos, los subíndices p y m se seleccionan independientemente, en cada caso, de un número entero de 0 a 4. En algunos ejemplos en este documento, B es:
[1916]
[1918] En estos ejemplos, p es 0, 1, 2, 3 o 4. En algunos de estos ejemplos, R1 es, independientemente en cada presencia, alquilo, alcoxi, haloalquilo o halo. En algunos ejemplos, R1 es alquilo. En algunos ejemplos, R1 es alcoxi. En algunos ejemplos, R1 es haloalquilo. En algunos ejemplos, R1 es halo.
[1919] En algunas realizaciones de la Fórmula
es:
[1921] También se proporcionan aquí cargas útiles del enlazador de budesonida o diflorasona.
[1922] Ejemplos de cargas útiles del enlazador incluyen, pero no se limitan a:
[1925]
[1926]
[1929] y sales de los mismos.
[1931] E. Composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento
[1933] La presente divulgación incluye métodos para tratar enfermedades, afecciones o trastornos, por ejemplo, enfermedades inflamatorias y trastornos autoinmunes, o controlar sus síntomas, que comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de la presente invención. Se incluyen todas las enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con el receptor de glucocorticoides, la unión de glucocorticoides y/o la señalización del receptor de glucocorticoides. Dichos métodos comprenden administrar un conjugado de la presente invención a un paciente. Por lo tanto, en esta divulgación se incluyen métodos para tratar una enfermedad, trastorno o afección asociada con el receptor de glucocorticoides que comprenden administrar un conjugado de la presente invención a un paciente que tiene dicha enfermedad, trastorno o afección.
[1935] En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección es un estado alérgico, que incluye, pero no se limita a, asma, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, reacciones de hipersensibilidad a fármacos, rinitis alérgica perenne o estacional y enfermedad del suero; enfermedades dermatológicas, que incluyen, pero no se limitan a, dermatitis herpetiforme ampollosa, eritrodermia exfoliativa, micosis fungoide, pénfigo y eritema multiforme grave (síndrome de Stevens-Johnson); trastornos endocrinos, que incluyen, pero no se limitan a insuficiencia adrenocortical primaria o secundaria, hiperplasia suprarrenal congénita, hipercalcemia asociada con cáncer y tiroiditis no supurativa; enfermedades gastrointestinales; trastornos hematológicos, que incluyen, pero no se limitan a anemia hemolítica adquirida (autoinmune), anemia hipoplásica congénita (eritroide) (anemia de Diamond-Blackfan), púrpura trombocitopénica idiopática en adultos, aplasia pura de glóbulos rojos y trombocitopenia secundaria; triquinosis; meningitis tuberculosa con bloqueo subaracnoideo o bloqueo inminente; enfermedades neoplásicas, incluyendo pero no limitado a leucemias y linfomas; trastornos del sistema nervioso, incluyendo pero no limitado a exacerbaciones agudas de esclerosis múltiple, edema cerebral asociado con tumor cerebral primario o metastásico, craneotomía o lesión en la cabeza; enfermedades oftálmicas, incluyendo pero no limitado a oftalmía simpática, arteritis temporal, uveítis y condiciones inflamatorias oculares que no responden a corticosteroides tópicos; enfermedades renales, incluyendo pero no limitado a inducir una diuresis o remisión de proteinuria en síndrome nefrótico idiopático o aquel debido a lupus eritematoso; enfermedades respiratorias, incluyendo pero no limitado a beriliosis, tuberculosis pulmonar fulminante o diseminada cuando se usa concurrentemente con quimioterapia antituberculosa apropiada, neumonías eosinofílicas idiopáticas, sarcoidosis sintomática; y trastornos reumáticos, incluido, pero no limitado a, el uso como terapia complementaria para administración a corto plazo (para ayudar al paciente a superar un episodio agudo o una exacerbación) en artritis gotosa aguda, carditis reumática aguda, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, artritis reumatoide, incluida la artritis reumatoide juvenil, y para uso en dermatomiositis, polimiositis y lupus eritematoso sistémico.
[1937] En algunos ejemplos, se expone aquí un método para tratar una enfermedad, trastorno o afección seleccionada de una enfermedad autoinmune, una alergia, artritis, asma, un trastorno respiratorio, un trastorno sanguíneo, un cáncer, una enfermedad del colágeno, un trastorno del tejido conectivo, una enfermedad dermatológica, una enfermedad ocular, un problema endocrino, una enfermedad inmunológica, una enfermedad inflamatoria, un trastorno intestinal, una enfermedad gastrointestinal, un trastorno neurológico, una afección de trasplante de órganos, un trastorno reumatoide, un trastorno de la piel, una afección de hinchazón, una afección de cicatrización de heridas y una combinación de las mismas que comprende administrar un conjugado de la presente invención.
[1939] En algunos ejemplos, el trastorno autoinmune se selecciona de esclerosis múltiple, hepatitis autoinmune, herpes zóster, lupus eritematoso sistémico (es decir, lupus), miastenia gravis, distrofia muscular de Duchenne y sarcoidosis. En algunos ejemplos, el trastorno respiratorio se selecciona de asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, inflamación bronquial y bronquitis aguda. En algunos ejemplos, el cáncer se selecciona de leucemia, leucemia linfoblástica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL) y mieloma múltiple. En algunos ejemplos, la enfermedad del colágeno es el lupus eritematoso sistémico. En algunos ejemplos, la enfermedad ocular es queratitis. En algunos ejemplos, el problema endocrino se selecciona de enfermedad de Addison, insuficiencia suprarrenal, hiperplasia suprarrenal congénita y adrenocortical. En algunos ejemplos, la enfermedad inflamatoria se selecciona de inflamación de las articulaciones, inflamación de tendones, bursitis, epicondilitis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, neumonitis lipídica, tiroiditis, urticaria (ronchas), pericarditis, síndrome nefrótico y uveítis. En algunos ejemplos, el trastorno intestinal se selecciona de colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn y enfermedad inflamatoria intestinal. En algunos ejemplos, el trastorno reumatoide se selecciona de artritis reumatoide, polimialgia reumática, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante y lupus eritematoso sistémico. En algunos ejemplos, el trastorno de la piel se selecciona de psoriasis, eczema y hiedra venenosa. En algunos ejemplos, el trastorno neurológico es la polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica.
[1940] En algunas realizaciones, los conjugados de la presente invención se administran a un paciente para tratar un evento inflamatorio agudo, que incluye, pero no se limita a, choque, edema cerebral y enfermedad de injerto contra huésped. En algunas realizaciones, los conjugados de la presente invención se administran para tratar efectos linfolíticos, incluidos, pero no limitados a, aquellos asociados con neoplasias hematológicas, por ejemplo, leucemias, linfomas y mielomas.
[1942] En algunos ejemplos, se expone aquí un método para reducir la inflamación en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de la presente invención. En algunos ejemplos, se expone aquí un método para modular el sistema inmunológico en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de la presente invención. En algunos ejemplos, se expone aquí un método para modular los niveles de cortisol en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de la presente invención. En algunos ejemplos, se expone aquí un método para reducir la migración de linfocitos en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado de la presente invención. En algunos ejemplos, se expone aquí un método para tratar la hipercalcemia debida a cáncer, enfermedad de Méniére, migraña, cefalea en racimos, úlcera aftosa grave, laringitis, tuberculosis grave, reacción de Herxheimer a la sífilis, insuficiencia cardíaca descompensada, rinitis alérgica o pólipos nasales, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite un conjugado de la presente invención. En algunos ejemplos, los conjugados de la presente invención se pueden usar para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal, la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa. En algunos ejemplos, la enfermedad, trastorno o afección es una afección inflamatoria crónica, que incluye, pero no se limita a, asma, infecciones de la piel e infecciones oculares. En algunos ejemplos, los conjugados de la presente invención se utilizan para la inmunosupresión en pacientes sometidos a un trasplante de órganos.
[1944] En algunas realizaciones, los conjugados de la presente invención se administran a un paciente para tratar un trastorno nervioso asociado con la señalización de GR, incluidos, pero no limitados a, trastornos psiquiátricos tales como esquizofrenia, adicción a las drogas, trastorno de estrés postraumático (TEPT) y trastornos del estado de ánimo, abuso de sustancias, estrés y ansiedad. En algunas realizaciones, los conjugados de la presente invención se administran a un paciente para tratar un trastorno del sistema visual, que incluye, pero no se limita a, inflamación ocular (por ejemplo, conjuntivitis, queratitis, uveítis), edema macular y degeneración macular. En algunas realizaciones, los conjugados de la presente invención se administran a un paciente para tratar un trastorno cardiovascular. En algunas realizaciones, los conjugados de la presente invención se administran a un paciente para tratar un trastorno del metabolismo de la glucosa y/o del hígado. En algunas realizaciones, los conjugados de la presente invención se administran a un paciente para tratar un trastorno del sistema musculoesquelético. En algunas realizaciones, los conjugados de la presente invención se administran a un paciente para tratar una afección inflamatoria cutánea, como eczema y psoriasis.
[1946] Los conjugados de la presente invención proporcionan un medio para la administración dirigida de su carga útil de esteroides a células o sistemas de órganos particulares, reduciendo o previniendo así los efectos secundarios que resultan de la administración de la carga útil de esteroides libre no conjugada. Por tanto, en el presente documento se proporcionan métodos para tratar una enfermedad, trastorno o afección asociada con el receptor de glucocorticoides que comprenden administrar un conjugado de la presente invención a un paciente que tiene dicha enfermedad, trastorno o afección, en donde se reducen los efectos secundarios asociados con la administración de la carga útil de esteroides libre de dicho conjugado. Además, en el presente documento se proporcionan métodos para administrar un compuesto de Fórmula (I) a una célula que comprenden poner en contacto dicha célula con un conjugado de proteína de Fórmula (I), en donde el conjugado de proteína comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un antígeno de superficie de dicha célula.
[1948] Los conjugados de la presente invención pueden administrarse solos o junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales. El o los agentes terapéuticos adicionales se pueden administrar justo antes, simultáneamente o poco después de la administración de los compuestos descritos en este documento. La presente divulgación también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los conjugados de la presente invención en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, y métodos de tratamiento que comprenden la administración de dichas combinaciones a sujetos que las necesitan.
[1950] Los agentes terapéuticos adicionales adecuados incluyen, pero no se limitan a: un segundo glucocorticoide, un agente terapéutico autoinmune, una hormona, un producto biológico o un anticuerpo monoclonal. Los agentes terapéuticos adecuados también incluyen, pero no se limitan a, cualquier sal, ácido o derivado farmacéuticamente aceptable de un compuesto aquí establecido.
[1952] Los conjugados de la presente invención también pueden administrarse y/o coformularse en combinación con antivirales, antibióticos, analgésicos, corticosteroides, esteroides, oxígeno, antioxidantes, inhibidores de COX, cardioprotectores, quelantes de metales, IFN-gamma y/o NSAIDs.
[1954] En algunas realizaciones de los métodos descritos en este documento, se pueden administrar múltiples dosis de un conjugado de la presente invención (o una composición farmacéutica que comprende una combinación de un conjugado de la presente invención y cualquiera de los agentes terapéuticos adicionales mencionados en este documento) a un sujeto durante un período de tiempo definido. Los métodos según este aspecto de la divulgación comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de un conjugado de la presente invención. Como se utiliza en este documento, "administrar secuencialmente" significa que cada dosis del compuesto se administra al sujeto en un punto diferente en el tiempo, por ejemplo, en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente divulgación incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una dosis inicial única de un conjugado de la presente invención, seguida de una o más dosis secundarias del conjugado y, opcionalmente, seguida de una o más dosis terciarias del conjugado.
[1956] Los términos "dosis inicial", "dosis secundarias" y "dosis terciarias" se refieren a la secuencia temporal de administración de los conjugados de la presente invención. Así, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio del régimen de tratamiento (también denominada "dosis de línea base"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis inicial, secundaria y terciaria pueden contener todas la misma cantidad del conjugado de la presente invención, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En ciertas realizaciones, la cantidad del conjugado contenido en las dosis inicial, secundaria y/o terciaria varía entre sí (por ejemplo, ajustado hacia arriba o hacia abajo según sea apropiado) durante el curso del tratamiento. En ciertas realizaciones, se administran dosis de dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) al comienzo del régimen de tratamiento como "dosis de carga", seguidas de dosis posteriores que se administran con menor frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").
[1958] En ciertas realizaciones de ejemplo de la presente divulgación, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (por ejemplo, 1, 1 / , 2, 2 / , 3, 3 / , 4, 41/ 2, 5, 51/ 2, 6, 61/ 2, 7, 71/ 2, 8, 81/ 2, 9, 91/ 2, 10, 101/ 2, 11, 11 /, 12, 121/ 2, 13, 13 /, 14, 14 /, 15, 15 /, 16, 16 /, 17, 17 /, 18, 18 /, 19, 19 /, 20, 20 /, 21 ,21 /, 22, 22 /, 23, 23 /, 24, 24 /, 25, 25 /, 26, 26 /, o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", como se utiliza en este documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis del compuesto que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia sin dosis de intervención.
[1960] Los métodos según este aspecto de la divulgación pueden comprender administrar a un paciente cualquier número de dosis secundarias y/o terciarias del conjugado. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, solo se administra una única dosis secundaria al paciente. En otras realizaciones, se administran al paciente dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias. Asimismo, en ciertas realizaciones, solo se administra una única dosis terciaria al paciente. En otras realizaciones, se administran al paciente dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias. El régimen de administración puede llevarse a cabo indefinidamente durante la vida de un sujeto en particular, o hasta que dicho tratamiento ya no sea terapéuticamente necesario o ventajoso.
[1962] En realizaciones que involucran múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse con la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente 1 a 2 semanas o 1 a 2 meses después de la dosis inmediatamente anterior. De manera similar, en realizaciones que involucran múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse con la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 2 a 12 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. En ciertas realizaciones de la divulgación, la frecuencia con la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar a lo largo del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ser ajustada durante el curso del tratamiento por un médico dependiendo de las necesidades de cada paciente después del examen clínico.
[1963] La presente divulgación incluye regímenes de administración en los que se administran de 2 a 6 dosis de carga a un paciente en una primera frecuencia (por ejemplo, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, etc.), seguida de la administración de dos o más dosis de mantenimiento al paciente con menor frecuencia. Por ejemplo, de acuerdo con este aspecto de la divulgación, si las dosis de carga se administran con una frecuencia de una vez al mes, entonces las dosis de mantenimiento pueden administrarse al paciente una vez cada seis semanas, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, etc.
[1965] La presente divulgación incluye composiciones farmacéuticas de los conjugados de la presente invención, por ejemplo, composiciones que comprenden un conjugado de la presente invención, una sal o polimorfo del mismo y un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de vehículos, diluyentes y excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a: tampones para el mantenimiento del pH adecuado de la composición (por ejemplo, tampones de citrato, tampones de succinato, tampones de acetato, tampones de fosfato, tampones de lactato, tampones de oxalato y similares), proteínas transportadoras (por ejemplo, albúmina sérica humana), nanopartículas, solución salina, polioles (por ejemplo, trehalosa, sacarosa, xilitol, sorbitol y similares), surfactantes (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80, polioxolato y similares), antimicrobianos y antioxidantes.
[1967] En algunos ejemplos, se expone aquí un método para tratar una enfermedad, trastorno o afección que incluye administrar a un paciente que tiene dicho trastorno una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de la presente invención, o una composición farmacéutica del mismo.
[1969] En algunos ejemplos, se expone aquí un método para tratar una enfermedad, trastorno o afección seleccionada del grupo que consiste en una enfermedad inmunológica, enfermedad autoinmune, inflamación, asma o un trastorno inflamatorio intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa.
[1971] En algunos ejemplos, se expone aquí un método para tratar una enfermedad, trastorno o afección dirigiéndose a un antígeno, por ejemplo, antígeno que expresa la superficie celular, al cual la administración de esteroides puede lograr un beneficio terapéutico que comprende administrar los conjugados descritos en este documento. En algunas realizaciones, el antígeno es AXL, BAFFR, BCMA, BCR-componentes de la lista, BDCA2, BDCA4, BTLA, BTNL2 BTNL3, BTNL8,BTNL9, C10orf54, CCR1, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR9, CCR10, CD11c, CD137, CD138, CD14, CD168, CD177, CD19, CD20, CD209, CD209L, CD22, CD226, CD248, CD25, CD27, CD274, CD276, CD28, CD30, CD300A, CD33, CD37, CD38, CD4, CD40, CD44, CD45, CD47, CD46, CD48, CD5, CD52, CD55, CD56, CD59, CD62E, CD68, CD69, CD70, CD74, CD79a, CD79b, CD8, CD80, CD86, CD90.2, CD96, CLEC12A, CLEC12B, CLEC7A, CLEC9A, CR1, CR3, CRTAM, CSF1R, CTLA4, CXCR1/2, CXCR4, CXCR5, DDR1, DDR2, DEC-205, DLL4, DR6, FAP, FCamR, FCMR, FcR's, Fire, GITR, HHLA2, HLA clase II, HVEM, ICOSLG, IFNLR1, IL10R1, IL10R2, IL12R, IL13RA1, IL13RA2, IL15R, IL17RA, IL17RB, IL17RC, IL17RE, IL20R1, IL20R2, IL21R, IL22R1, IL22RA, IL23R, IL27R, IL29R, IL2Rg, IL31R, IL36R, IL3RA, IL4R, IL6R, IL5R, IL7R, IL9R, Integrinas, LAG3, LIFR, MAG/Siglec-4, MMR, MSR1, NCR3LG1, NKG2D, NKp30, NKp46, PDCD1, PROKR1, PVR, PVRIG, PVRL2, PVRL3, RELT, SIGIRR, Siglec-1, Siglec-10, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, SIRPA, SLAMF7, TACI, TCR- componentes/asociados de la lista, PTCRA, TCRb, CD3z, CD3, TEK, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TIGIT, TLR2, TLR4, TROY, TSLPR, TYRO, VLDLR, VSIG4, o VTCN1. En algunas realizaciones, el antígeno es IL2R-Y.
[1972] En algunos ejemplos, se expone aquí un método para tratar una enfermedad, trastorno o afección seleccionada de una enfermedad inmunológica, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad dermatológica o una enfermedad gastrointestinal.
[1974] En algunos ejemplos, la enfermedad es enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome de Cushing, insuficiencia suprarrenal o hiperplasia suprarrenal congénita.
[1976] En algunos ejemplos, la enfermedad es una inflamación, asma o un trastorno inflamatorio intestinal.
[1978] En algunos ejemplos, la enfermedad es una enfermedad autoinmune seleccionada de esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, psoriasis o eczema.
[1980] En algunos ejemplos, se expone aquí un método para reducir o mejorar los efectos secundarios de la quimioterapia, en donde el método incluye administrar a un paciente que tiene dicho trastorno una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado o composición farmacéutica de la presente invención.
[1982] En algunos ejemplos, se expone aquí un método para reducir o mejorar los efectos secundarios de la terapia inmunosupresora, en donde el método incluye administrar a un paciente que tiene dicho trastorno una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado o composición farmacéutica de la presente invención.
[1984] En algunos ejemplos, se expone aquí un método para tratar el cáncer, en donde el método incluye administrar a un paciente que tiene dicho trastorno una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado o composición farmacéutica de la presente invención. En algunos ejemplos, el cáncer se selecciona de leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL) o mieloma múltiple, entre otros.
[1986] F. Ejemplos
[1988] Las enseñanzas de esta divulgación se ilustran con los siguientes ejemplos específicos. En los siguientes ejemplos, éstos son sólo ejemplos de la presente invención en la medida en que se relacionan con la preparación y prueba de compuestos esteroides de 21-amino conjugados con anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
[1990] Los reactivos y disolventes se obtuvieron de fuentes comerciales tales como Sinopharm Chemical Reagent Co. (SCRC), Sigma-Aldrich, Alfa, u otros proveedores, a menos que se indique explícitamente lo contrario.
[1992] Los espectros de 1H RMN y otros RMN se registraron en un Bruker AVIII 400 o un Bruker AVIII 500. Los datos se procesaron con el software Nuts o MestReNova, midiendo los desplazamientos de protones en partes por millón (ppm) campo abajo desde un estándar interno de tetrametilsilano.
[1994] Las mediciones de HPLC-MS se realizaron en un sistema Agilent 1200 HPLC/6100 SQ utilizando las siguientes condiciones:
[1996] El método A para la medición por HPLC-MS incluyó, como fase móvil: A: Agua (0.01% ácido trifluoroacético TFA) y B: acetonitrilo (0.01% TFA). La fase de gradiente fue del 5% de B que se incrementó al 95% de B durante un período de tiempo de 15 minutos (min) y a una tasa de flujo de 1.0 mL/min. La columna utilizada fue una SunFire C18, 4.6x50 mm, 3.5 pm. La temperatura de la columna era de 50 °C. Los detectores incluían un convertidor analógico-digital ELSD (detector de dispersión de luz evaporativa, en adelante "ADC ELSD"), un detector de matriz de diodos DAD (214 nm y 254 nm) y un sistema de Ionización por electroaspersión-Ionización a presión atmosférica (ES-API).
[1998] El método B para mediciones de HPLC-MS incluyó, como fase móvil: A: Agua (10 mM NH4HCO3) y B: acetonitrilo. La fase de gradiente fue del 5% de B que se incrementó al 95% de B durante un período de tiempo de 15 minutos y una tasa de flujo de 1.0 mL/min. La columna utilizada fue una XBridge C18, 4.6x50 mm, 3.5 pm. La temperatura de la columna fue de 50 °C. Los detectores incluyeron un ADC ELSD, un DAD (214 nm y 254 nm) y un detector selectivo de masas (MSD ES-API).
[2000] La medición LC-MS se realizó en un sistema Agilent 1200 HPLC/6100 SQ utilizando las siguientes condiciones:
[2001] El método A para la medición LC-MS se realizó en un instrumento WATERS 2767. La columna era una Shimadzu Shim-Pack, PRC-ODS, 20x250 mm, 15 pm, dos conectadas en serie. La fase móvil fue A: Agua (0.01% TFA) y B: acetonitrilo (0.01% TFA). La fase de gradiente fue del 5% de B que se incrementó al 95% de B durante un período de tiempo de 3 minutos y a una tasa de flujo de 1.8 - 2.3 mL/min. La columna utilizada fue una SunFire C18, 4.6x50 mm, 3.5 pm. La temperatura de la columna era de 50 °C. Los detectores incluían un convertidor analógico-digital ELSD (detector de dispersión de luz evaporativa), un detector de matriz de diodos DAD (214 nm y 254 nm) y un ES-API.
[2003] El método B para la medición LC-MS se realizó en un instrumento Gilson GX-281. La columna era una Xbridge Prep C18 de 10 pm OBD, 19 x 250 mm. La fase móvil era A: Agua (10 mM NH4HCO3) y B: Acetonitrilo. La fase de gradiente fue del 5% de B que se incrementó al 95% de B durante un período de tiempo de 3 minutos y a una tasa de flujo de 1.8 - 2.3 mL/min. La columna utilizada fue una XBridge C18, 4.6x50 mm, 3.5 |jm. La temperatura de la columna fue de 50 °C. Los detectores incluyeron ADC ELSD, DAD (214 nm y 254 nm) y un detector selectivo de masas (MSD) (ES-API).
[2004] La cromatografía líquida de alta presión preparativa (Prep-HPLC) se realizó en un instrumento Gilson GX-281. Se utilizaron dos sistemas de disolventes, uno ácido y otro básico. El sistema de disolvente ácido incluía una columna Waters SunFire C18 de 10 jm (100 A, 250 x 19 mm). El disolvente A para HPLC preparativa fue TFA al 0.05 % en agua y el disolvente B fue acetonitrilo. La condición de elución fue un gradiente lineal que aumentó el disolvente B del 5% al 100% durante un período de tiempo de 20 minutos y a una tasa de flujo de 30 mL/min. El sistema de disolvente básico incluía una columna Waters Xbridge 10 jm C18 (100 Á, 250 x 19 mm). El disolvente A para HPLC preparativa fue bicarbonato de amonio 10 mM (NH4HCO3) en agua y el disolvente B fue acetonitrilo. La condición de elución fue un gradiente lineal que aumentó el disolvente B del 5% al 100% durante un período de tiempo de 20 minutos y a una tasa de flujo de 30 mL/min.
[2005] La cromatografía instantánea se realizó en un instrumento Biotage, con columna Flash Agela sílica-CS. La cromatografía instantánea en fase reversa se realizó en el instrumento Biotage, con Boston ODS o Agela C18, a menos que se indique explícitamente lo contrario.
[2006] En los ejemplos y en toda la especificación se utilizan las siguientes abreviaturas:
[2008] -(4-{2-
[2010]
[2011]
[2012]
[2013]
[2014]
[2015]
[2016]
[2017]
[2018] Métodos de preparación
[2019] Ejemplo 1
[2020] Este ejemplo demuestra un método para fabricar derivados químicos de Desonida con control estereoquímico en la posición C22. En las FIGS. 1 y 2, se identifica la posición C22 para los compuestos 7, 8 y 11 con un asterisco,es decir,* La síntesis de esteroides con control estereoquímico en la posición C22 se realizó siguiendo la ruta sintética representada en las FIGs. 1 y 2.
[2021] Desonida (1), que es un nombre genérico para (1S,2S,4R,8S,9S,11 S, 12S, 13R)-11 -hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-6,6,9,13-tetrametil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029048013,18]icosa-14,17-dien-16-ona, se hizo reaccionar con anhídrido isobutírico (compuesto 2) para producir intermedio 3 por esterificación en la posición de alcohol primario del compuesto 1. El compuesto 3 se hizo reaccionar con una serie de aldehídos (4-1; 4-2; 4-3; y 4-4, cada uno diferente con respecto al grupo R-CHO ilustrado a la derecha de estas etiquetas numéricas) por transacetalación bajo condición HCO4 de ácido fuerte para producir alcoholes 5 y ésteres 6. Como se indica en la FIG. 1, estos aldehídos se diferenciaban entre sí con respecto al grupo R indicado en la FIG. 1.
[2022] Los alcoholes 5 y éster 6 se separaron mediante cromatografía en columna.
[2023] Cada alcohol 5 o éster 6 se hizo reaccionar individualmente con dietilamina para eliminar el grupo Fmoc o con Fe/NH4Cl para reducir el nitro y proporcionar compuestos epímeros 7 y 8 que tienen ambos estereoquímica R/S en C22, respectivamente.
[2024] Como se detalla a continuación, se separaron los epímeros R y S y sus configuracionesR-y S se identificaron. Los epímeros R de, por ejemplo, compuestos 7 y 8 en la FIG. 1 fueron aislados y confirmados que eran el estereoisómero mayoritario en más del 90% mediante 1H RMN. La configuración C22 de cada epímero se determinó mediante estudios espectroscópicos 2D-NOESY.
[2025] En la Tabla 1 a continuación se presentan los esteroides elaborados utilizando los métodos descritos en este documento.
[2026] Tabla 1 - Estructura y propiedades químico-físicas de los compuestos
[2028]
[2029]
[2030]
[2031]
[2032]
[2034] En la Tabla 2 a continuación se presentan los esteroides elaborados utilizando los métodos descritos en este documento.
[2035] Tabla 2 - Estructura y propiedades químico-físicas de los compuestos
[2036]
[2037]
[2038]
[2040] En la Tabla 3 a continuación se presentan las cargas útiles del enlazador creadas utilizando los métodos descritos en este documento.
[2041] Tabla 3.Ejemplos de cargas útiles de enlazador
[2042]
[2043]
[2044]
[2045]
[2047] En la Tabla 4 a continuación se presentan las cargas útiles del enlazador creadas utilizando los métodos descritos en este documento.
[2048] Tabla 4.Ejemplos de cargas útiles de enlazador
[2049]
[2050]
[2051]
[2052]
[2055] Ejemplo 2
[2057] Este ejemplo demuestra métodos para fabricar derivados químicos de budesonida, dexametasona y flumetasona. Estos métodos se ilustran, de forma general, como se muestra en las FIGS. 2, 3 y 4.
[2059] Como se muestra en la FIG. 2, análogos mesilato de budesonida (9) o su análogo difluoro (9B) se hicieron reaccionar con alquilaminas o fenoles sustituidos (10) para producir compuestos que incluyen anilina o amina (11), tales como compuestos 11-1 a 11-23 en la FIG. 2.
[2061] Como se muestra en la FIG. 3, análogos mesilato de dexametasona (12), se hicieron reaccionar con alquilaminas o fenoles sustituidos (10) para producir compuestos que incluyen anilina o amina (14) o(15) en la FIG. 3.
[2063] Como se muestra en la FIG. 4, análogos mesilato de flumetasona (13), se hicieron reaccionar con alquilaminas o fenoles sustituidos (10) para producir compuestos que incluyen anilina o amina (16) en la FIG. 4.
[2065] Como se detalla a continuación, los epímeros estereoquímicamente puros de 11-5S y 11-5Ren la Tabla 1 se obtuvieron por separación quiral a partir de una mezcla de sus correspondientes isómeros R/S. La estereoquímica absoluta de cada compuesto se determinó mediante 2D-NOESY Los espectros 2D-NOESY mostraron que H22 y H18 se correlacionaron en 11-5R, y que no había correlación entre H22 y H18 en 11-5S. De manera similar, los centros quirales en la posición C22 se identificaron para los compuestos 7-1S, 7-1R, 7-4R, 8-1R, 11-6S, 11-6R, 11-7R, 11-8R, 11-12R, 11-13R, y 11-19R en la Tabla 1 mediante 2D-NOESY.
[2067] Ejemplo 3
[2069] Este ejemplo demuestra un método para fabricar compuestos 7-1S y 7-1Ren la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a los compuestos numerados en la FIG. 1.
[2071] 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-6-(4-nitrofenil)-16-oxo-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil 2-metilpropanoato (5-1) y
[2072] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetil-6-(4-nitrofenil)-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048,01318]icosa-14,17-dien-16-ona (6-1).
[2074] Paso 1: El compuesto 3 se sintetizó de acuerdo con los procedimientos en US2007/135398 haciendo reaccionar desonida (1) con ácido isobutírico en acetona.
[2075] Paso 2: A una solución del compuesto 3 (320 mg, 0.657 mmol) en nitropropano (20 mL) se añadió ácido perclórico acuoso (70%, 1.90 g, 1.33 mmol) gota a gota a 0 °C, seguido de la adición de 4-nitrobenzaldehído (4-1, 151 mg, 1.00 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche y luego se diluyó con acetato de etilo (80 mL). La mezcla resultante se lavó con solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (30 mL x 3) y luego con salmuera (30 mL x 2). Luego la solución resultante se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. Luego, el residuo se purificó mediante cromatografía instantánea eluyendo con acetato de etilo al 0-35 % en éter de petróleo para obtener el compuesto. (5-1) como un sólido amarillo (120 mg, rendimiento 32%), que era una mezcla de epímeros 5R/5S en una relación 3/1 basada en 1H RMN y eluyendo adicionalmente con acetato de etilo al 60-70 % en éter de petróleo para obtener el compuesto (6-1) como un sólido amarillo (150 mg, rendimiento 36%), que era una mezcla de 6r /6S epímeros en una relación 5/1 basada en 1H RMN (R/S no determinado).
[2077] Compuesto (5-1): ESI m/z: 580 (M H)+. 1H RMN (CDCh, 400 MHz, epímeros A y B con relación = 3)ó8.27 y 8.25 (d,J =8.8 Hz, 2H), 7.62 y 7.55 (d,J =8.8 Hz, 2H), 7.28-7.21 (m, 1H), 6.33-6.23 (m, 1H), 6.03 y 6.05 (s, 1H), 5.62 y 6.16 (s, 1H), 5.12 y 5.43 (d,J =5.4 Hz, 1H), 4.97 y 4.77 (d,J =17.6 Hz, 1H), 4.88 y 4.33 (d,J =17.6 Hz, 1H), 4.52 (br s, 1H), 2.80-2.50 (m, 2H), 2.44-2.29 (m, 1H), 2.29-2.05 (m, 3H), 2.01-1.84 (m, 2H), 1.80­ 1.67 (m, 2H), 1.51 y 1.59 (br s, 1H), 1.46 y 1.48 (s, 3H), 1.29-1.07 (m, 7H), 1.03 y 1.05 (s, 3H) ppm.
[2079] Compuesto 6-1: ESI m/z: 510 (M H)+. 1H RMN (DMSOd6, 400 MHz, epímeros A y B con relación = 5)ó8.26 y 8.24 (d,J =8.8 Hz, 2H), 7.77 y 7.57 (d,J =8.8 Hz, 2H), 7.32 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 6.17 y 6.18 (dd,J =10.0 Hz, 1.8 Hz, 1H), 5.93 y 5.95 (s, 1H), 5.63 y 6.28 (s, 1H), 5.14 y 5.03 (t,J =6.0 Hz, 1H), 4.99 y 5.35 (d,J =6.3 Hz, 1H), 4.82 (d,J= 3.2 Hz, 1H), 4.64-4.13 (m, 3H), 2.64-2.51 (m, 1H), 2.37-2.24 (m, 1H), 2.20-1.99 (m, 2H), 1.94-1.57 (m, 5H), 1.40 (s, 3H), 1.14-0.98 (m, 2H), 0.88 (s, 3H) ppm.
[2081] Paso 3: Elaborar (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-6-(4-Aminofenil)-11-hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-16-ona (7-1R) en la Tabla 1) y (1S,2S,4R,6S,8S,9S,12S,12S,13R)-6-(4-Aminofenil)-11-hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0. 029.041.01311]icosa-14,17-dien-16-ona (7-1S) en la Tabla 1).
[2083] Se añadieron simultáneamente polvo de hierro (56.0 mg, 1.00 mmol) y cloruro de amonio (53.5 mg, 1.00 mmol) a una solución del compuesto 5-1 (51.0 mg, 0.100 mmol) en una solución combinada de etanol (3 mL) y agua (0.5 mL). La suspensión se agitó a 80°C durante una hora y se filtró a través de Celite para eliminar el sólido. El filtrado se concentró al vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto 7-1R (30 mg, rendimiento 63%) como un sólido blanco y compuesto 7-1S (8 mg, rendimiento 17%) como un sólido blanco.
[2085] Se utilizó la espectroscopia 2D-NOESY para determinar las configuraciones estereoquímicas de los centros quirales del compuesto 7-1Ry compuesto 7-1S. Los espectros 2D-NOESY confirmaron que existe una correlación entre H22 y H21 en el compuesto 7-1R, lo que indica que tiene un centro quiral de configuración R. No se observó correlación entre H22 y H21 en el compuesto 7-1S, indicando que tiene un centro quiral de configuración S. El estudio de RMN también mostró que el desplazamiento de H22 en el compuesto 7-1R(5.33 ppm) fue mucho mayor que la del compuesto 7-1S (6.01 ppm), lo que indica H22 del compuesto 7-1Rse vio más obstaculizado. Los espectros 2D-NOESY del compuesto 7-1-22R y compuesto 7-1-22S se muestran en las FIGS. 5 y 6.
[2087] Compuesto 7-1R en la Tabla 1: ESI m/z: 480 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 400 MHz)ó7.46 (d,J= 10.1 Hz, 1H), 7.17 (d,J =8.4 Hz, 2H), 6.67 (d,J =8.4 Hz, 2H), 6.27 (dd,J= 10.1, 1.8 Hz, 1H), 6.04 (s, 1H), 5.33 (s, 1H), 5.00 (d,J= 5.4 Hz, 1H), 4.61 (d,J= 19.4 Hz, 1H), 4.50-4.39 (m, 1H), 4.31 (d,J =19.4 Hz, 1H), 2.78-2.61 (m, 1H), 2.47-2.35 (m, 1H), 2.35-2.22 (m, 1H), 2.22-2.10 (m, 1H), 2.04-1.94 (m, 1H), 1.91-1.66 (m, 4H), 1.51 (s, 3H), 1.25-1.11 (m, 1H), 1.07 (dd,J= 11.2 Hz, 3.5 Hz, 1H), 0.99 (s, 3H) ppm.
[2089] Compuesto 7-1S en la Tabla 1: ESI m/z: 480 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 400 MHz)ó7.47 (d,J =10.1 Hz, 1H), 7.02 (d,J =8.4 Hz, 2H), 6.65 (d,J =8.5 Hz, 2H), 6.27 (dd,J= 10.1, 1.8 Hz, 1H), 6.03 (s, 1H), 6.01 (s, 1H), 5.36 (d,J= 6.2 Hz, 1H), 4.46-4.31 (m, 2H), 4.12 (d,J= 19.2 Hz, 1H), 2.75-2.61 (m, 1H), 2.47-2.35 (m, 1H), 2.27­ 2.11 (m, 2H), 2.08-1.97 (m, 1H), 1.96-1.73 (m, 4H), 1.51 (s, 3H), 1.33-1.17 (m, 2H), 1.17-1.09 (m, 1H), 1.01 (s, 3H) ppm.
[2091] Ejemplo 4
[2093] Este ejemplo demuestra un método para fabricar compuestos. (8-1 R/S) y compuesto (8-1R) en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 1.
[2095] 2-[(1 S,2S,4R,8S,9S,11 S,12S,13R)-6-(4-Aminofenil)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.0480318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil 2-metilpropanoato (8-1R).
[2097] Se añadieron simultáneamente polvo de hierro (56.0 mg, 1.00 mmol) y cloruro de amonio (53.5 mg, 1.00 mmol) a una solución del compuesto (6-1) (58.0 mg, 0.100 mmol) en una solución combinada de etanol (3 mL) y agua (1 mL). La suspensión resultante se agitó a 80°C durante una hora y se filtró a través de Celite para eliminar el sólido. El filtrado se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto (8-1R)y su enantiómero(es decir,estereoquímica S en C22) (26 mg, rendimiento 45%) como un sólido blanco. La relación del epímero R al epímero S es 4:1 por HPLC y 1H RMN. ESI m/z: 550 (M+H)+.
[2099] El epímero se aisló adicionalmente y se determinó la configuración mediante 2D RMN.
[2101] Compuesto (8-1R): ESI m/z: 550 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 500 MHz)57.46 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 7.19 (d,J =8.5 Hz, 2H), 6.69 (d,J =8.4 Hz, 2H), 6.27 (dd,J =10.0 Hz, 2.0 Hz, 1H), 6.05 (s, 1H), 5.44 (s, 1H), 5.07 (d,J =17.5 Hz, 1H), 4.96 (d,J =5.5 Hz, 1H), 4.88 (d,J= 17.5 Hz, 1H), 4.48-4.44 (m, 1H), 2.73-2.64 (m, 2H), 2.42­ 2.39 (m, 1H), 2.32-2.24 (m, 1H), 2.19-2.15 (m, 1H), 2.03-1.99 (m, 1H), 1.95-1.92 (m, 1H), 1.90-1.83 (m, 2H), 1.76-1.69 (m, 1H), 1.52 (s, 3H), 1.27-1.12 (m, 7H), 1.09-1.05 (m, 1H), 1.02 (s, 3H) ppm.
[2103] Ejemplo 5
[2105] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos (7-2R/S) en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 1.
[2107] Paso 1: 1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetil-6-[(4-nitrofenil)metil]-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.04801318]icosa-14,17-dien-16-ona (5-2).
[2109] A una solución del compuesto (3) (226 mg, 0.464 mmol) en nitropropano (10 mL) se añadió ácido perclórico acuoso (70 %, 985 mg, 6.90 mmol) gota a gota a 0 °C, seguido de la adición de 2-(4-nitrofenil)acetaldehído. (4­ 2, 115 mg, 0.696 mmol) según la síntesis en Synthesis, 2011, 18, 2935-2940. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche y luego se diluyó con acetato de etilo (60 mL). La mezcla se lavó con solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (50 mL x 3), luego con salmuera (50 mL x 3), y luego se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea eluyendo con 0-35% de acetato de etilo en éter de petróleo para obtener el compuesto. (6-2) como un sólido marrón (95 mg, rendimiento 34%, incluido epímeros 22R/S en una relación >10/1 por 1H RMN) y eluyendo además con acetato de etilo al 60-70 % en éter de petróleo para obtener el compuesto (5-2) (145 mg, rendimiento 60%) como un sólido marrón.
[2111] Compuesto (5-2): ESI m/z: 524 (M H)+. 1H RMN (CDCh, 400 MHz)58.09 (d,J =8.7 Hz, 2H), 7.39 (d,J =8.7 Hz, 2H), 7.17 (d,J =10.1 Hz, 1H), 6.31 (dd,J =10.1 Hz, 1.8 Hz, 1H), 6.02 (s, 1H), 4.92 (d,J =5.3 Hz, 1H), 4.86 (t,J =3.6 Hz, 1H), 4.52-4.39 (m, 2H), 4.28-4.17 (m, 1H), 3.08 (d,J =3.5 Hz, 2H), 2.96 (t,J =4.9 Hz, 1H), 2.53­ 2.40 (m, 1H), 2.32-2.19 (m, 1H), 2.04-1.95 (m, 1H), 1.95-1.82 (m, 2H), 1.60-1.46 (m, 3H), 1.38 (s, 3H), 1.34 (br s, 1H), 0.91-0.77 (m, 4H), 0.76-0.62 (m, 2H) ppm.
[2113] Paso 2: (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-6-[(4-Aminofenil)metil]-11-hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-16-ona (7-2R/S)
[2115] Se añadieron simultáneamente polvo de hierro (78.0 mg, 1.40 mmol) y cloruro de amonio (75.0 mg, 1.40 mmol) a una solución del compuesto (5-2) (75.0 mg, 0.143 mmol) en una solución combinada de etanol (4 mL) y agua (0.5 mL). La suspensión se agitó a 80°C durante 1.5 horas y se filtró a través de Celite para eliminar el sólido. El filtrado se concentró al vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto (7-2R/S) (26 mg, rendimiento 37%) como un sólido blanco. ESI m/z: 494 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 400 MHz) 57.44 (d,J =10.1 Hz, 1H), 6.93 (d,J =8.3 Hz, 2H), 6.48 (d,J =8.3 Hz, 2H), 6.30 (dd,J= 10.1 Hz, 1.9 Hz, 1H), 6.07 (s, 1H), 4.85-4.77 (m, 2H), 4.51 (d,J= 19.4 Hz, 1H), 4.35-4.29 (m, 1H), 4.24 (d,J =19.4 Hz, 1H), 2.87-2.72 (m, 2H), 2.62-2.47 (m, 1H), 2.38-2.28 (m, 1H), 2.08-1.93 (m, 1H), 1.90-1.78 (m, 2H), 1.67-1.58 (m, 1H), 1.53-1.37 (m, 5H), 0.91-0.77 (m, 5H), 0.74 (dd,J =11.2 Hz, 3.4 Hz, 1H) ppm.
[2117] Ejemplo 6
[2119] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos (8-2R/S) en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 1.
[2121] Paso 1: 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-6-[(4-nitrofenil)metil]-16-oxo-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048,01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil 2-metilpropanoato (6-2)
[2123] La síntesis de compuestos 6-2 se describió en el Ejemplo 5, arriba. Compuesto 6-2: ESI m/z: 594 (M H)+. 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 58.15 (d,J =8.7 Hz, 0.1H) y 8.09 (d,J=8.7 Hz, 1.9H), 7.40 (d,J =8.6 Hz, 2H), 7.20 (d,J =10.1 Hz, 1H), 6.31 (dd,J =10.1 Hz, 1.8 Hz, 1H), 6.02 (s, 1H), 4.94 (t,J =3.6 Hz, 1H), 4.87 (d,J =5.1 Hz, 1H), 4.81 (d,J= 17.6 Hz, 1H), 4.71 (d,J =17.6 Hz, 1H), 4.46 (s, 1H), 3.09 (d,J =3.5 Hz, 2H), 2.73-2.61 (m, 1H), 2.53-2.41 (m, 1H), 2.31-2.21 (m, 1H), 2.07-1.96 (m, 1H), 1.94-1.84 (m, 2H), 1.84-1.76 (m, 1H), 1.63­ 1.43 (m, 3H), 1.39 (s, 3H), 1.22 (t,J =7.0 Hz, 6H), 0.92-0.82 (m, 4H), 0.76-0.61 (m, 2H) ppm.
[2125] Paso 2: 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-6-[(4-Aminofenil)metil]-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil 2-metilpropanoato (8-2R/S)
[2126] A una solución del compuesto 6-2 (65.0 mg, 0.109 mmol) en una solución combinada de etanol (5 mL) y agua (1 mL) se añadieron simultáneamente polvo de hierro (61.0 mg, 1.09 mmol) y cloruro de amonio (58.4 mg, 1.09 mmol). La suspensión se agitó a 80 °C durante una hora y se filtró a través de Celite para eliminar el sólido. El filtrado se concentró al vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto (8-2R/S) (30 mg, rendimiento 49%) como un sólido blanco. ESI m/z: 564 (M H)+. 1H RMN (CDCh, 400 MHz) 57.25 (d,J= 10.2 Hz, 1H), 6.95 (d,J =8.3 Hz, 2H), 6.44 (d,J =8.3 Hz, 2H), 6.31 (dd,J= 10.1, 1.8 Hz, 1H), 6.05 (s, 1H), 4.92-4.84 (m, 2H), 4.80 (d,J =5.2 Hz, 1H), 4.73 (d,J= 17.7 Hz, 1H), 4.41 (s, 1H), 3.48 (br s, 1H), 2.85 (d,J =2.7 Hz, 2H), 2.75-2.62 (m, 1H), 2.56-2.41 (m, 1H), 2.31-2.19 (m, 1H), 2.05-1.91 (m, 2H), 1.88-1.80 (m, 1H), 1.77-1.70 (m, 1H), 1.55-1.41 (m, 3H), 1.39 (s, 3H), 1.29-1.18 (m, 8H), 0.91-0.74 (m, 5H) ppm.
[2128] Ejemplo 7
[2130] Este ejemplo demuestra un método para fabricar el compuesto (8-3R/S) de la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 1.
[2132] Paso 1: 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-6-(2-{[(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}etil)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil 2-metilpropanoato (6-3)
[2133] A una solución del compuesto 3 (240 mg, 0.493 mmol) en nitropropano (5 mL) se añadió ácido perclórico acuoso (70 %, 214 mg, 1.49 mmol) gota a gota a 0 °C, seguido de la adición de Fmoc-3-amino-1-propanal. (4-3, 236 mg, 0.799 mmol) según la síntesis en J. Am. Chem. Soc., 2006, 128 (12), 4023-4034. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche y luego se diluyó con acetato de etilo (80 mL). La mezcla se lavó con solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (50 mL x 3), luego agua (50 mL x 2), luego salmuera (50 mL) y luego se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante TLC preparativa (sílica gel, metanol/cloruro de metileno, v/v = 1/25) para obtener el compuesto. (6-3) (200 mg, rendimiento 56%, epímeros 6R/6S) como un sólido blanquecino. ESI m/z: 724 (M H)+. 1H RMN (CDch, 400 MHz) 57.76 (d,J =7.6 Hz, 2H), 7.56 (d,J =7.2 Hz, 2H), 7.40 (d,J= 7.2 Hz, 1H), 7.32-7.20 (m, 3H), 6.28-6.25 (m, 2H), 6.00 (s, 1H), 5.28-5.04 (m, 2H), 4.87-4.76 (m, 1H), 4.46-4.35 (m, 3H), 4.18 (t,J =6.8 Hz, 1H), 3.49 (s, 1H), 3.39-3.24 (m, 2H), 2.77-2.49 (m, 2H), 2.37-2.26 (m, 1H), 2.23-1.96 (m, 3H), 1.96-1.47 (m, 6H), 1.45-1.41 (m, 3H), 1.28-1.06 (m, 10H), 1.02-0.94 (m, 3H) ppm.
[2135] Paso 2: 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-6-(2-Aminoetil)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil 2-metilpropanoato (8-3R/S)
[2137] Una solución del compuesto (6-3) (40.0 mg, 55.3 pmol) en dietilamina (1 mL) y cloruro de metileno (1 mL) se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Los volátiles se eliminaron al vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (método B) seguido de TLC preparativa (cromatografía en capa fina) (sílica gel, cloruro de metileno/metanol, v/v = 75/10) para obtener el compuesto. (8-3R/S) (3 mg, rendimiento 11%) como un sólido blanquecino. ESI m/z: 502 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 400 MHz) 57.36 (d,J =10.1 Hz, 1H), 6.16 (dd,J =10.1 Hz, 1.8 Hz, 1H), 5.91 (s, 1H), 5.23 (t,J =4.4 Hz, 1H), 5.08-4.90 (m, 1H), 4.75-4.65 (m, 1H), 4.38-4.28 (m, 1H), 2.83-2.50 (m, 2H), 2.33-2.23 (m, 1H), 2.13-2.00 (m, 2H), 1.90-1.46 (m, 6H), 1.39 (s, 3H), 1.24-1.12 (m, 2H), 1.23-0.78 (m, 11H) ppm.
[2139] Ejemplo 8
[2141] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos 7-4R en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 1.
[2143] (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetil-6-(piperidin-4-il)-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.002,9.04,801318]icosa-14,17-dien-16-ona (7-4R).
[2145] A una solución de desonida (1, 0.10 g, 0.25 mmol) en nitropropano (5 mL) se le añadió ácido perclórico acuoso (70 %, 0.11 g, 0.75 mmol) gota a gota a 0 °C, seguido de la adición de 1-Boc-4-piperidinacarboxaldehído (4-4, 64 mg, 0.30 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante la noche, la suspensión se concentró al vacío. El residuo se basificó mediante la adición de solución de amoniaco en metanol (7 M, 10 mL). La mezcla resultante se concentró al vacío y el producto crudo se purificó por HPLC preparativa dos veces (método B) para obtener el compuesto 7-4R (15 mg, rendimiento 13%) como un sólido blanco. ESI m/z: 472 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 500 MHz) 57.47 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 6.27 (dd,J =10.0 Hz, 2.0 Hz, 1H), 6.03 (s, 1H), 4.90 (d,J= 4.0 Hz, 1H), 4.50 (d,J =19.0 Hz, 1H), 4.46-4.43 (m, 1H), 4.41 (d,J= 4.0 Hz, 1H), 4.29 (d,J =19.0 Hz, 1H), 3.13-3.09 (m, 2H), 2.71-2.60 (m, 3H), 2.42-2.38 (m, 1H), 2.27-2.13 (m, 2H), 1.99-1.96 (m, 1H), 1.85-1.64 (m, 7H), 1.52 (s, 3H), 1.51-1.38 (m, 2H), 1.14-0.99 (m, 2H), 0.96 (s, 3H) ppm. La configuración R estereoquímica del compuesto 7-4Rfue determinado por 2D RMN.
[2147] Ejemplo 9
[2149] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos (11-1R/S) en la Tabla 1. El método se ilustra, de forma general, como se muestra en la FIG. 2.
[2150] Paso 1: 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-H¡drox¡-9,13-d¡met¡l-16-oxo-6-prop¡l-5,7-dioxapentac¡clo[10.8.
[2151] 002,9.04,1.01111]¡cosa-14,17-d¡en-8-¡l]-2-oxoet¡l metanosulfonato (9)
[2153] Proced¡m¡ento general A para la síntesis de mesilatos a partir de su alcohol: A una solución del alcohol (1.0 equiv.) en DCM (10 mL por gramo del material de partida) se añadieron trietilamina o 4-d¡met¡lam¡nop¡r¡d¡na (2 equiv.) y cloruro de metanosulfonilo (1.2 equiv.). Después de agitar a 0 °C durante media hora o hasta que el material de partida se consumió según TLC, se añadió a la mezcla de reacción sílica gel (mallas100-200) y se concentró al vacío. El residuo con sílica gel se purificó por cromatografía en columna de sílica gel (0-50% de acetato de etilo en éter de petróleo) para dar el producto mesilato. Alternativamente, la mezcla se lavó con clorhidrato agua ac. (1 N) y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. El producto crudo se purificó mediante cromatografía instantánea (0-2% MeOH en DCM) para obtener el producto mesilato correspondiente.
[2155] Método alternativo para elaborar el compuesto 9: A una solución de budesonida (0.28 mg, 0.65 mmol) en piridina (5 mL), se le añadió 4-d¡met¡lam¡nop¡r¡d¡na (0.16 g, 1.3 mmol) y, a continuación, cloruro de metanosulfonilo (0.11 g, 0.97 mmol) gota a gota a 0 °C. Tras agitar a temperatura ambiente durante 2 horas, la mezcla resultante se vertió en acetato de etilo (100 mL). La mezcla se lavó con clorhidrato ac. diluido (1N) y luego salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. El producto crudo se purificó mediante cromatografía instantánea (0-1 % de metanol en cloruro de metileno) para obtener el compuesto (9) (0.26 g, rendimiento 85%) como un sólido blanco. ESI m/z: 509 (M H)+. 1H r Mn (CDCh, 400 MHz) (cuyos epímeros) 5 7.25 y 7.22 (d,J =2.0 Hz, 1H), 6.30-6.27 (m, 1H), 6.03-6.02 (m, 1H), 5.17-5.11 (m, 1.5H), 5.06-4.96 (m, 1.5 H), 4.87-4.86 (m, 0.5 H), 4.59 (d,J =4.5 Hz, 0.5 H), 4.52-4.50 (m, 1 H), 3.24 (s, 3H), 2.60-2.53 (m, 1H), 2.36­ 2.33 (m, 1H), 2.24-2.00 (m, 3H), 1.86-1.62 (m, 4H), 1.53-1.33 (m, 8H), 1.21-1.09 (m, 2 H), 1.02-0.96 (m, 3H), 0.94-0.91 (m, 3H) ppm.
[2157] Paso 2: (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-8-(2-Am¡noacet¡l)-11-h¡drox¡-9,13-d¡met¡l-6-prop¡l-5,7-dioxapentac¡clo [10. 8.0.029.04,1.01318]¡cosa-14,17-d¡en-16-ona (11-1R/SJ
[2159] A una solución de amoniaco en MeOH (7 M, 15 mL) a temperatura ambiente se añadió el compuesto 9 (0.10 g, 0.20 mmol). La solución se selló y se agitó a 40°C durante la noche. Los volátiles se eliminaron al vacío y el producto crudo se purificó por HPL<c>preparativa (método B) para obtener el compuesto (11-1R/S) (8.0 mg, rendimiento del 9%) como un sólido blanquecino. ESI m/z: 429.9 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 400<m>H<z>)57.46 (d,J =10.0 Hz, 1H), 6.26 (d,J =10.0 Hz, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.22-5.15 (m, 1.5 H), 4.88 (m, 0.6H), 4.58 (m, 0.5H), 4.42 (m, 1H), 3.96-3.81 (m, 0.7H), 3.50-3.41 (m, 0.7H), 2.70-2.63 (m, 1H), 2.40-2.37 (m, 1H), 2.22-1.94 (m, 3H), 1.87-1.25 (m, 11H), 1.17-0.80 (8H) ppm. H<p>L<c>Anal.: > 95%, Tiempo de retención: 7.63 min (método B).
[2160] Ejemplo 10
[2162] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos 11-2R/S en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2164] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidrox¡-9,13-d¡met¡l-8-[2-(met¡lam¡no)acet¡l]-6-propil-5,7-d¡oxapentac¡clo[10.8.0.02,9.04,1.01318]¡cosa-14,17-d¡en-16-ona (11-2R/S)
[2166] Una solución del compuesto 9 (51 mg, 0.10 mmol) en metilamina (solución 2 M en THF, 0.5 mL) en un tubo sellado se agitó a 20-25 °C durante 4 horas y luego se agitó a 40 °C durante la noche. Los volátiles se eliminaron al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (método A) y luego mediante HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto (11-2R/S) (15 mg, rendimiento del 33 %) como un sólido blanco. ESI m/z: 444.3 (M H)+. 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 57.26-7.23 (d,J= 10.8 Hz, 1H), 6.30-6.26 (m, 1H), 6.03-6.02 (m, 1H), 5.20-5.16 (m, 1H), 4.90-4.89 (d,J =4.8 Hz, 0.5 H), 4.69-4.66 (t,J= 4.8 Hz, 0.5H), 4.49-4.51 (m, 1H), 3.50-3.29 (m, 2H), 2.61-2.52 (m, 1H), 2.37-2.32 (m, 1H), 2.17-2.16 (d,J =3.6 Hz, 3H), 2.14-2.08 (m, 3H), 1.86­ 1.74 (m, 3H), 1.59-1.48 (m, 2H), 1.45 (s, 3H), 1.42-0.89 (m, 12H) ppm.
[2168] Ejemplo 11
[2170] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos 11-3R/S en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2172] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-8-[2-(D¡met¡lam¡no)acet¡l]-11-h¡drox¡-9,13-dimet¡l-6-prop¡l-5,7-d¡oxapentac¡do[10.8.0.02,9.04,8013,18]¡cosa-14,17-d¡en-16-ona (11-3R/S)
[2174] A una solución del compuesto 9 (51 mg, 0.10 mmol) en THF (3 mL) se añadió gota a gota una solución de dimetilamina en THF (2 M, 0.75 mL, 1.5 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a 50°C durante la noche. La mezcla de reacción se concentró y el producto crudo se purificó mediante HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto. 11-3R/S (15 mg, rendimiento del 33 %) como un sólido blanco. ESI m/z: 458.2 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 400 MHz) 57.46 (d, J= 10.4 Hz, 1H), 6.26 (d,J =10.0 Hz, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.21 (t,J =4.8 Hz, 0.6H), 5.17 (d,J =7.2 Hz, 0.6H), 4.58 (d,J= 4.4 Hz, 0.4H), 4.44-4.41 (m, 1H), 3.80-3.57 (m, 1H), 3.26 (d, J= 18.8 Hz, 0.7H), 3.08-2.91 (m, 0.7H), 2.70-2.61 (m, 1H), 2.49-2.33 (m, 7H), 2.26-2.11 (m, 2H), 2.02-1.95 (m, 1H), 1.85-1.55 (m, 5H), 1.49 (s, 3H), 1.49-1.30 (m, 3H), 1.09-1.00 (m, 2H), 0.98-0.90 (m, 6H) ppm. HPLC Anal.: > 95%, Tiempo de retención: 8.34 min (método B).
[2176] Ejemplo 12
[2178] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos 11-5R/S en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2180] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-8-[2-(4-Aminofenoxi)acetil]-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8. 002,9.04,801318]icosa-14,17-dien-16-ona(11-5R/S)
[2182] Procedimiento general B para fabricar éter fenólico sustituido a partir de su precursor mesilato: Al acetonitrilo o acetona calientes (60-65 °C) se agregaron precursor de mesilato (1 equiv.), fenol sustituido (2,0-2,5 equiv.) y carbonato de potasio o carbonato de cesio (2,0-3,0 equiv.). La suspensión resultante se sometió a reflujo durante 2-3 horas y la reacción se monitorizó mediante LCMS y/o TLC. Después de enfriar la reacción a temperatura ambiente, los volátiles se eliminaron al vacío y al residuo se añadió agua. La mezcla acuosa se extrajo con acetato de etilo. La solución orgánica combinada se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El producto crudo se utilizó para el siguiente paso directamente o se purificó mediante cromatografía instantánea o HPLC preparativa.
[2184] Paso 1: U Una mezcla del compuesto 9 (0.13 g, 0.26 mmol), 4-nitrofenol (10-5, 72 mg, 0.52 mmol) y carbonato de potasio (72 mg, 0.52 mmol) en acetona (10 mL) se sometió a reflujo (60 °C) durante la noche. Después de la filtración para eliminar los sólidos, el filtrado se concentró al vacío. El producto crudo se purificó por cromatografía instantánea (0-1% de metanol en cloruro de metileno) para producir un intermedio nitro (0.11 g, rendimiento 77%) como un aceite marrón. ESI m/z: 552 (M H)+. 1H RMN (CDCh, 500 MHz) (con epímeros)58.23- 8.15 (m, 2.4H), 7.26-7.23 (m, 1H), 6.97-6.91 (m, 2.4H), 6.31-6.28 (m, 1H), 6.05-6.04 (m, 1H), 5.22-5.18 (m, 1.4H), 5.10-5.07 (m, 0.6H), 4.93 (d,J =5.0 Hz, 0.6H), 4.83-4.77 (m, 1H), 4.67 (d,J =5.0 Hz, 0.6H), 4.56­ 4.53 (m, 1H), 2.62-2.55 (m, 1H), 2.38-2.5 (m, 1H), 2.24-2.07 (m, 3H), 1.88-1.56 (m, 5H), 1.46-1.40 (m, 6H), 1.20-1.13 (m, 2H), 1.05-0.99 (m, 3H), 0.97-0.94 (m, 3H) ppm.
[2186] Paso 2: Se agregaron simultáneamente polvo de hierro (0.10 g, 1.9 mmol) y cloruro de amonio (0.10 g, 1.9 mmol) a una solución del intermedio nitro (0.10 g, 0.19 mmol) en una solución combinada de etanol (20 mL) y agua (2 mL). La suspensión se agitó a 80°C durante 2 horas y se filtró a través de Celite para eliminar las sales inorgánicas. El filtrado se concentró al vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto (11-5R/S) (50 mg, rendimiento 50%) como un sólido blanco. ESI m/z: 522 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 500 MHz) (con epímeros) 57.47 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 6.78-6.70 (m, 4H), 6.29-6.26 (m, 1H), 6.04 (br s, 1H), 5.25 (t,J =5.0 Hz, 0.4H), 5.20 (d,J =7.0 Hz, 0.4H), 5.06 (d,J= 18.0 Hz, 0.4H), 4.98 (d,J=18.0 Hz, 0.6H), 4.90-4.87 (m, 0.6 H), 4.75-4.66 (m, 1.6H), 4.46-4.44 (m, 1H), 2.71-2.64 (m, 1H), 2.42-2.38 (m, 1H), 2.28-2.18 (m, 2H), 2.06-2.00 (m, 1H), 1.87-1.83 (m, 1H), 1.76-1.73 (m, 1H), 1.69-1.61 (m, 3H), 1.55-1.38 (m, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.20-1.02 (m, 3H), 0.98-0.92 (m, 5H) ppm.
[2188] Una mezcla de dos epímeros del compuesto 11-5R y compuesto 11-5S de la Tabla 1 (0.30 g, 0.58 mmol) se aislaron mediante HPLC quiral (Instrumento: Gilson-281, Columna: OZ-H 20*250 mm, 10 um (Dacel), utilizando fase móvil: hexano (0.1 % DEA)/etanol (0.1 % DEA) = 70/30 a una tasa de flujo de 60 ml/min, detectado a 214 nm. La solución resultante se concentró para obtener el compuesto 11-5S (30 mg, rendimiento del 10 %) y compuesto 11-5R (50 mg, rendimiento del 17 %) como sólidos blancos, por separado. Las estructuras de los compuestos 11-5S y el compuesto 11-5R se determinaron mediante 2D-NOESY
[2189] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-8-[2-(4-Aminofenoxi)acetil]-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-16-ona (11-5S); Primer pico en HPLC; ESI m/z: 522 (M H)+. Tiempo de retención en HPLC (método A): 7.54 min; SFC quiral (CC4): Tiempo de retención 4.71 min, 99.5d.e.%; 1H RMN (400 MHz, CDCh) 57.21 (d,J =10.1 Hz, 1H), 6.77 (d,J =8.8 Hz, 2H), 6.63 (d,J =8.8 Hz, 2H), 6.24 (dd,J =10.1, 1.6 Hz, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.20 (d,J =6.8 Hz, 1H), 5.18 (t,J =4.8 Hz, 1H), 4.99 (d,J= -17.9 Hz, 1H), 4.61 (d,J =-17.9 Hz, 1H), 4.43 (s, 1H), 3.46 (s, 2H), 2.57 (td,J =13.2, 4.4 Hz, 1H), 2.34 (dd,J =13.4, 3.2 Hz, 1H), 2.16-2.01 (m, 4H), 1.85-1.68 (m, 3H), 1.59-1.49 (m, 3H), 1.44 (s, 3H), 1.44-1.26 (m, 2H), 1.18-1.09 (2H), 1.00 (s, 3H), 0.91 (t,J =7.3 Hz, 3H) ppm. 13C RMN (100 MHz, CDCla) 5204.0, 186.7, 170.0, 156.3, 151.4, 141.0, 127.9, 122.6, 116.5, 116.4, 108.4, 98.6, 83.2, 72.6, 69.8, 55.3, 53.0, 47.2, 44.2, 41.5, 37.3, 34.1, 33.0, 32.0, 31.1, 21.2, 17.9, 17.7, 14.1 ppm.
[2191] (1 S,2S,4R,8S,9S,11 S, 12S, 13R)-8-[2-(4-Aminofenoxi)acetil]-11 -hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-16-ona (11-5R): Segundo pico en HPLC; ESI m/z: 522 (M H)+; Tiempo de retención en HPLC (método A): 7.58 min; SFC quiral (CC4): Tiempo de retención 3.80 min, 98.1d.e.%; 1H RMN (400 MHz, CDCh) 57.23 (d,J= 10.1 Hz, 1H), 6.79 (dd,J =8.8 Hz, 2H), 6.65 (d,J =8.8 Hz, 2H), 6.27 (dd,J =10.1, 1.7 Hz, 1H), 6.04 (s, 1H), 4.94 (d,J= 4.4 Hz, 1H), 4.89 (d,J= -18.0 Hz, 1H), 4.65 (d,J= -18.0 Hz, 1H), 4.61 (t,J= 4.4 Hz, 1H), 4.48 (d,J= 2.1 Hz, 1H), 3.51 (s, 2H), 2.58 (td,J =13.3, 4.9 Hz, 1H), 2.35 (dd,J= 13.4, 2.8 Hz, 1H), 2.23-1.99 (m, 4H), 1.79-1.61 (m, 6H), 1.46-1.38 (m, 2H), 1.44 (s, 3H), 1.23- 1.09 (m, 2H), 0.95 (s, 3H), 0.93 (t,J= 7.3 Hz, 3H) ppm. 13C RMN (101 MHz, CDCh) 5204.9, 186.6, 170.0, 156.2, 151.2, 141.0, 127.9, 122.5, 116.3, 116.3, 104.5, 97.6, 81.9, 72.6, 69.9, 55.1,49.8, 45.7, 44.0, 41.1, 35.0, 34.0, 33.3, 31.9, 30.3, 21.1, 17.5, 17.1, 14.0 ppm.
[2193] Ejemplo 13
[2195] Este ejemplo demuestra un método para fabricar los compuestos 11-5S y (11-5R) de la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2197] El compuesto9Rfue preparado a partir de (R)-budesonida y el compuesto 9S se preparó a partir de (S)-Budesonida, respectivamente, de acuerdo con el Procedimiento general A en el Ejemplo 9. Utilizando el mismo método descrito en el Ejemplo 12, el compuesto (11-5S) se obtuvo a partir de la reacción del compuesto (9S) con el compuesto (10-12), y el compuesto (11-5R) se obtuvo a partir de la reacción del compuesto (9R) con el compuesto (10-9), respectivamente. Un procedimiento representativo es como sigue: A una solución del compuesto (9R) o compuesto (9S (100 mg) en acetona (10 mL) se añadió simultáneamente el compuesto 10­ 9 (2eq.) y Cs2CO3 (2eq.). La mezcla se sometió a reflujo durante 2 horas y el crudo se elaboró eliminando la acetona al vació, extrayendo el crudo con acetato de etilo, lavando las sales inorgánicas con agua y purificando el producto resultante mediante cromatografía (0-50% de acetato de etilo en éter de petróleo) para proporcionar el compuesto 11-5R o compuesto 11-5S (rendimiento del 25-60%) como un sólido de color amarillo pálido. ESI m/z: 522 (M H)+. HPLC Anal.: 98%. Los espectros 2D-NOESY del compuesto 11-5R y del compuesto 11-5S se muestran en las FIGs. 7 y 8.
[2199] Ejemplo 14
[2201] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos 11-6S y 11-6R de la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2203] (1S,2S,4R,6S,8S,9S,11S,12S,13R)-8-[2-(4-Amino-3-fluorofenoxi)acetil]-11-hidroxil-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-16-ona (11-6S) y (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-8-[2-(4-Amino-3-fluorofenoxi)acetil]-1 1-hidroxil-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-16-ona (11-6R).
[2205] Una mezcla racémica de los compuestos 11-6R/S se prepararon de acuerdo con el método establecido en el Ejemplo 12. Los productos racémicos se separaron mediante SFC quiral (ver detalles en la Sección 2.3) para obtener el compuesto 11-6S (segundo pico) y compuesto 11-6R (primer pico) como sólidos de color blanquecino.
[2207] El compuesto 11-6S (30 mg, rendimiento del 7.9%). ESI m/z: 540.2 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde)57.32 (d,J= 10.1 Hz, 1H), 6.71-6.62 (m, 2H), 6.49 (dd,J= 8.5, 2.0 Hz, 1H), 6.19-6.16 (m, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.21 (t,J =4.8 Hz, 1H), 5.10 (d,J =7.3 Hz, 1H), 5.02 (d,J= 18.1 Hz, 1H), 4.69 (dd,J =58.9, 28.6 Hz, 4H), 4.31 (s, 1H), 2.56-2.51 (m, 1H), 2.29 (d,J =10.6 Hz, 1H), 2.06-1.97 (m, 3H), 1.89 (s, 2H), 1.79-1.72 (m, 1H), 1.30 (m, 10H), 0.88-0.85 (m, 6H) ppm. Tiempo de retención: 2.94 min, 98% in SFC quiral (AD). HPLC Anal.: > 96.94%, Tiempo de retención: 7.94 min (método B).
[2209] Compuesto 11-6R (28 mg, 7.4% de rendimiento). ESI m/z: 540.3 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde)57.32 (d,J= 10.1 Hz, 1H), 6.72-6.68 (m, 2H), 6.52 (dd,J= 8.6, 2.1 Hz, 1H), 6.18 (d,J= 10.1 Hz, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.01 (d,J= 18.3 Hz, 1H), 4.77 (dd,J= 12.9, 3.3 Hz, 2H), 4.71 (s, 2H), 4.65 (t,J =4.3 Hz, 1H), 4.32 (s, 1H), 3.17 (d,J =5.2 Hz, 1H), 2.57-2.51 (m, 1H), 2.30 (d,J= 10.5 Hz, 1H), 2.10 (d,J =7.2 Hz, 1H), 2.01-1.99 (m, 1H), 1.84 (s, 2H), 1.62-1.52 (m, 5H), 1.39-1.33 (m, 5H), 1.23 (s, 1H), 1.02-0.95 (m, 2H), 0.87 (t,J=7.4 Hz, 3H), 0.83 (s, 3H) ppm. Tiempo de retención: 2.25 min, 100% in SFC quiral (AD). HPLC Anal.: > 98.50%, Tiempo de retención: 8.01 min (método B).
[2211] Ejemplo 15
[2213] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos 11-7R en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2215] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-8-[2-(4-Amino-3-fluorofenoxi)acetil]-11-hidroxil-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.041.01318]icosa-14,17-dien-16-ona (11-7S y 11-7R)
[2217] Una mezcla racémica de esteroides 11-7-22R/S se prepararon de acuerdo con el método establecido en el Ejemplo 12. Los productos racémicos se separaron mediante SFC quiral (ver detalles en la Sección 2.3) para obtener el compuesto 11-7S (segundo pico) y compuesto 11-7R (primer pico).
[2219] El compuesto 11-7R: ESI m/z: 540.2 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, CDCla)57.25 (d,J= 10.1 Hz, 1H), 6.87 (dt,J =15.5, 7.7 Hz, 1H), 6.47 (dd,J =12.8, 2.4 Hz, 1H), 6.37 (d,J =8.7 Hz, 1H), 6.29 (dd,J =9.9, 4.4 Hz, 1H), 6.04 (s, 1H), 5.22-4.49 (m, 5H), 3.61 (s, 2H), 2.58 (td,J =13.5, 4.9 Hz, 1H), 2.36 (d,J =10.3 Hz, 1H), 2.19-2.03 (m, 3H), 1.87-1.72 (m, 2H), 1.67-1.55 (m, 3H), 1.51-1.33 (m, 7H), 1.21-1.11 (m, 2H), 1.00-0.90 (m, 6H). HPLC Anal.: > 62.24%, 36.49%, Tiempo de retención: 7.78, 7.86 min (método B).
[2220] Ejemplo 16
[2221] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos 11-8R en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2222] (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxil-9,13-dimeti1-8-{2-[4-(metilamino)fenoxi]acetil}-6-propil-5,7-dioxapentaciclo-[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-16-ona (11-8R)
[2223] Se preparó el esteroide 11-8 de acuerdo con el método establecido en el Ejemplo 13.
[2224] El compuesto (11-8R) se obtuvo como un sólido blanco (14 mg, rendimiento del 54%). ESI m/z: 525.3 (M H)+.
[2225] 1H RMN (500 MHz, MeODd4) 57.47 (d,J= 10.1 Hz, 1H), 6.83-6.80 (m, 2H), 6.65-6.62 (m, 2H), 6.28 (dd,J =10.1, 1.9 Hz, 1H), 6.04 (s, 1H), 4.99 (d,J =18.2 Hz, 1H), 4.90 (d,J =4.8 Hz, 1H), 4.74 (d,J =18.1 Hz, 1H), 4.66 (t,J =4.5 Hz, 1H), 4.46 (d,J =3.0 Hz, 1H), 2.75 (s, 3H), 2.67 (td,J =13.6, 5.2 Hz, 1H), 2.40 (dd,J =13.5, 2.7 Hz, 1H), 2.30-2.22 (m, 1H), 2.16-2.12 (m, 1H), 2.02 (dd,J= 13.7, 3.3 Hz, 1H), 1.85 (dd,J= 13.7, 2.6 Hz, 1H), 1.76 (d,J= 6.9 Hz, 1H), 1.67-1.63 (m, 4H), 1.51 (s, 3H), 1.48-1.44 (m, 2H), 1.17-1.08 (m, 1H), 1.05 (dd,J =11.2, 3.5 Hz, 1H), 0.98-0.94 (m, 6H) ppm. HpLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 7.56 min (método A).Ejemplo 17
[2226] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos (11-10R/S), en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2227] (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-8-[2-(4-Fluorofenoxi)acetil]-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-16-ona (11-10R/S).
[2228] Los esteroides 11-10R/S se prepararon de acuerdo con el método establecido en el Ejemplo 13.
[2229] El compuesto 11-10R/S se obtuvo como un sólido blanco (14 mg, rendimiento del 54%). ESI m/z: 525.2 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, MeODd4) 57.47 (d,J =10.1 Hz, 1H), 7.02 (t,J =8.7 Hz, 2H), 6.94-6.90 (m, 2H), 6.27 (dd,J= 10.1, 1.8 Hz, 1H), 6.03 (s, 1H), 5.06 (d,J =18.1 Hz, 1H), 4.90-4.88 (m, 1H), 4.82 (d,J =18.1 Hz, 1H), 4.69 (t,J =4.4 Hz, 1H), 4.46 (d,J= 2.8 Hz, 1H), 2.71-2.63 (m, 1H), 2.42-2.38 (m, 1H), 2.30-2.11 (m, 2H), 2.05­ 2.01 (m, 1H), 1.89-1.84 (m, 1H), 1.77-1.63 (m, 5H), 1.51-1.41 (m, 5H), 1.18-1.02 (m, 2H), 0.97-0.93 (m, 6H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 9.94 min (método A).
[2230] Ejemplo 18
[2231] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos 11-11R/Sen la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2232] N-(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi} fenil)acetamida (11-11R/S)
[2233] Los esteroides 11-11R/Sse prepararon de acuerdo con el método establecido en el Ejemplo 13.
[2234] Los compuestos 11-11R/Sse obtuvieron como un sólido blanco (25 mg, rendimiento del 46%). ESI m/z: 564.3 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODd4) 57.49-7.45 (m, 3H), 6.89 (d,J =9.0 Hz, 2H), 6.28 (d,J =10.2 Hz, 1H), 6.04 (s, 1H), 5.09 (d,J =18.1 Hz, 1H), 4.91-4.89 (m, 1H), 4.83 (d,J= 18.1 Hz, 1H), 4.70 (t,J =4.3 Hz, 1H), 4.47 (d,J =3 Hz, 1H), 2.72-2.65 (m, 1H), 2.43-2.39 (m, 1H), 2.30-2.22 (m, 1H), 2.18-2.12 (n, 4H), 2.06-2.03 (m, 1H), 1.90-1.86 (m, 1H), 1.77-1.65 (m, 5H), 1.48 (m, 5H), 1.18-1.09 (m, 1H), 1.07-1.04 (m, 1H), 0.99-0.95 (m, 6h ) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 7.33 min (método B).
[2235] Ejemplo 19
[2236] Este ejemplo demuestra un método para fabricar compuestos 11-12R/S en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2237] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-[2-(4-Aminofenoxi)acetil]-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,1.013,11]icosa-14,17-dien-16-ona (11-12R/S)
[2238] Paso 1: El compuesto (9B) fue preparado de acuerdo con el Procedimiento general A en el Ejemplo 9. A una solución de (6S,9R)2F-budesonida (80 mg, 0.17 mmol) en DCM (1 mL) se añadió gota a gota trietilamina (34 mg, 0.34 mmol) y cloruro de metanosulfonilo (30 mg, 0.26 mmol) a 0 °C. La mezcla se agitó a esta temperatura durante media hora hasta que se consumió la (6S,9R)2F-budesonida, lo cual se monitorizó mediante TLC. Luego, la mezcla de reacción se diluyó con DCM (100 ml) y se inactivó con cloruro de amoniosat. ac.(30 mL). La solución orgánica se lavó con cloruro de amoniosat. ac.y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía instantánea (0-2% MeOH en DCM) para dar el producto mesilato correspondiente (9B).
[2239] Paso 2: El compuesto 9B se disolvió en acetona (0.5 mL). A la solución se le añadió 4-aminofenol (10-9, 37 mg, 0.34 mmol) y carbonato de cesio (0.11 g, 0.34 mmol). La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 1.5 horas o hasta que (9B) fue consumido totalmente según TLC y LCMS. Luego la mezcla se diluyó con acetato de etilo y se filtró. El filtrado se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (método B) para dar los compuestos 11-12R/S (6.0 mg, 6.3 % de rendimiento a partir de (6S,9R)2F-budesonida) como un sólido blanco. ESI m/z: 558 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODd4) 57.34 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 6.78-6.71 (m, 4H), 6.37-6.33 (m, 2H), 5.63-5.49 (m, 1H), 5.10-4.99 (m, 1H), 4.77-4.63 (m, 2H), 4.33 (d,J= 9.1 Hz, 1H), 2.74­ 2.57 (m, 1H), 2.39-2.13 (m, 3H), 1.98-1.31 (m, 12H), 1.03-0.93 (m, 6H) ppm. HPLC Anal.: pureza 97.4%, Tiempo de retención: 7.55 min (método B).
[2241] (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-[2-(4-Aminofenoxi)acetil]-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.041.01318]icosa-14,17-dien-16-ona (11-12R)
[2243] El compuesto9BRse preparó de acuerdo con el Procedimiento general A en el Ejemplo 9. Una reacción de compuesto 9BR (0.90 g, 1.7 mmol) con 4-aminofenol (0.20 g, 1.8 mmol) y carbonato de cesio (1.1 g, 3.4 mmol) en acetonitrilo (20 mL) proporcionó (11-12R) (0.20 g, rendimiento del 54%) como un aceite amarillo después de la purificación por cromatografía en columna de sílica gel (50-80% de acetato de etilo en éter de petróleo). ESI m/z: 558 (M/+H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 57.26 (d,J =10.5 Hz, 1H), 6.64 (d,J =5.0 Hz, 2H), 6.50 (d,J =5.0 Hz, 2H), 6.30 (dd,J =10 Hz, 2 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 5.72-5.65 (m, 0.5H), 5.62-5.55 (m, 0.5H), 5.52­ 5.48 (m, 1H), 5.0 (s, 0.5H), 4.95 (s, 0.5H), 4.80-4.78 (m, 1H), 4.75-4.65 (m, 1H), 4.24-4.16 (m, 1H), 2.70-2.52 (m, 1H), 2.30-2.21 (m, 1H), 2.11-2.00 (m, 2H), 1.77 (d,J=13.0Hz, 1H), 1.61-1.54 (m, 4H), 1.49 (s, 3H), 1.36 (q,J =7.5 Hz, 3H), 1.23 (s, 1H), 0.87 (d,J= 7.5 Hz, 3H), 0.83 (s, 3H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 8.44 min (método B).
[2245] Ejemplo 20
[2247] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos 11-13R en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2249] (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-[2-(3-Aminofenoxi)acetil]-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.04801311]icosa-14,17-dien-16-ona (11-13R).
[2251] El esteroide 11-13R se preparó de acuerdo con el método establecido en el Ejemplo 19.
[2253] El compuesto (11-13R) se obtuvo como un sólido naranja claro (9.0 mg, rendimiento del 44 %) después de la purificación por HPLC preparativa (método A). ESI m/z: 558 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODd4) 57.35 (dd,J =10.1, 1.3 Hz, 1H), 7.29 (t,J =8.1 Hz, 1H), 6.76-6.70 (m, 3H), 6.40-6.29 (m, 2H), 5.66-5.48 (m, 1H), 5.14 (d,J =18.1 Hz, 1H), 4.93-4.91 (m, 1H), 4.90-4.87 (m, 1H), 4.77 (t,J =4.3 Hz, 1H), 4.35 (d,J= 9.3 Hz, 1H), 2.76­ 2.62 (m, 1H), 2.41-2.18 (m, 3H), 1.83-1.56 (m, 9H), 1.50 (dt,J =15.4, 7.6 Hz, 2H), 0.99-0.96 (m, 6H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 7.77 min (método A).
[2255] Ejemplo 21
[2257] Este ejemplo demuestra un método para fabricar los compuestos 11-14R/S en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2259] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-[2-(4-Amino-3-fluorofenoxi)acetil]-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.048.01318] icosa-14,17-dien-16-ona (11-14R/S).
[2261] A una solución de (9B) (0.20 g, 0.37 mmol) en DMSO (3 mL) se añadieron 4-amino-3-fluorofenol (10-14, 0.25 g, 2.0 mmol) e hidróxido de potasio (0.11 g, 2.0 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó a 60 °C durante una hora bajo protección de nitrógeno hasta que se completó la reacción, lo que se monitorizó mediante TLC y LCMS. Después de enfriar a temperatura ambiente y filtrar a través de una membrana, la solución de reacción se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método A) para obtener el compuesto 11-14R/S (40 mg, rendimiento del 19 %) como un sólido blanquecino. ESI m/z: 576 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODd4) 57.40-7.31 (m, 1H), 7.20 (td,J=9.1, 1.9 Hz, 1H), 6.91-6.84 (m, 1H), 6.80-6.76 (m, 1H), 6.40-6.30 (m, 2H), 5.57 (ddd,J =48.6, 9.7, 6.8 Hz, 1H), 5.15 (d,J =18.1 Hz, 1H), 4.90-4.79 (m, 2H), 4.75 (t,J =4.3 Hz, 1H), 4.41-4.28 (m, 1H), 2.78-2.57 (m, 1H), 2.40-2.12 (m, 3H), 1.98-1.39 (m, 11H), 1.07-0.92 (m, 6<h>) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 8.10 min (método A).
[2263] Ejemplo 22
[2265] Este ejemplo demuestra un método para fabricar compuestos. 11-15R/S en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2267] N-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi} fenil)metil] carbamato de terc-butilo (N-Boc-11-15R/S).
[2268] Paso 1: A una solución de 4-(aminometil)fenol (1.2 g, 10 mmol) en metanol (70 mL) y agua (5 mL) se añadió B0C2O (2.4 g, 11 mmol) gota a gota mediante jeringa a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante una hora hasta que se consumió totalmente el 4-(aminometil)fenol, lo que se monitorizó mediante LCMS y TLC. Los volátiles se eliminaron al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo (150 mL). La solución se lavó con ácido cítricosat. ac.(50 mL x 2) y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para dar A/-Boc-4-aminometilfenol (2.1 g, rendimiento del 94%) como aceite marrón. ESI m/z: 246 (M Na)+. 1H RMN (500 MHz, CDCla) 57.12 (d,J =7.8 Hz, 2H), 6.82-6.71 (m, 2H), 4.84 (s, 1H), 4.23 (d,J= 5.3 Hz, 2H), 1.46 (s, 9H) ppm.
[2270] Paso 2: El compuesto (N-Boc-11-15R/S) se preparó de acuerdo con el método establecido en el Ejemplo 19.
[2271] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-{2-[4-(Aminometil)fenoxi]acetil}-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318] icosa-14,17-dien-16-ona (11-15R/S)
[2273] A una solución de (N-Boc-11-15R/S) (30 mg, 45 pmol) en DCM (2 mL) y se añadió TFA (0.4 mL) gota a gota mediante una jeringa a 0 °C. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante una hora hasta la eliminación total de Boc, lo cual se monitorizó mediante LCMS. Los volátiles se eliminaron al vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (método A) para dar el compuesto (11-15R/S) (15 mg, rendimiento del 49 %) como un sólido blanco. ESI m/z: 572 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODdd) 57.45-7.32 (m, 3H), 7.01-6.96 (m, 2H), 6.41-6.30 (m, 2H), 5.57 (ddd,J =18.2, 10.4, 7.3 Hz, 1H), 5.21 (dd,J =19.7 Hz, 1H), 4.93-4.91 (m, 1H), 4.85 (d,J =18.0 Hz, 1H), 4.77 (t,J= 4.3 Hz, 1H), 4.37-4.32 (m, 1H), 4.07 (s, 2H), 2.75-2.58 (m, 1H), 2.40-2.15 (m, 3H), 1.86-1.40 (m, 11<h>), 1.08-0.92 (m, 6H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 7.47 min (método A).
[2275] Ejemplo 23
[2277] Este ejemplo demuestra un método para fabricar los compuestos 11-16R/S en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2279] (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-8-[2-(4-hidroxifenoxi)acetil]-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-16-ona (11-16<r>/S)
[2281] Los compuestos 11-16R/S se prepararon de acuerdo con el método establecido en el Ejemplo 12.
[2283] Los compuestos 11-16R/S (20 mg, 38 % de rendimiento) se obtuvieron como un sólido de color bronce después de la purificación por HPlC preparativa (método A). e S i m/z: 523.2 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODdd)57.47 (d,J =10.1 Hz, 1H), 6.82-6.77 (m, 2H), 6.75-6.70 (m, 2H), 6.28 (dd,J =10.1, 1.8 Hz, 1H), 6.04 (s, 1H), 5.00 (d,J =18.1 Hz, 1H), 4.91-4.89 (m, 1H), 4.75(d, J= 18.1 Hz, 1H), 4.67 (t,J= 4.5 Hz, 1H), 4.46 (d,J= 3.1 Hz, 1H), 2.68 (td,J =13.6, 5.8 Hz, 1H), 2.40 (dd,J= 13.5, 2.8 Hz, 1H), 2.31-2.21 (m, 1H), 2.17-2.13 (m, 1H), 2.02 (dd,J =13.7, 3.3 Hz, 1H), 1.86 (dd,J= 13.7, 2.6 Hz, 1H), 1.80-1.58 (m, 5H), 1.53-1.40 (m, 5H), 1.18-0.93 (m, 8H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 8.92 min (método A).
[2285] Ejemplo 24
[2287] Este ejemplo demuestra un método para fabricar los compuestos 11-17R/S en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2289] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-{2-[(6-Aminopiridin-2-il)oxi]acetil}-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318] icosa-14,17-dien-16-ona (11-17R/S)
[2291] Los compuestos 11-17R/S se prepararon de acuerdo con el método establecido en el Ejemplo 19.
[2293] Los compuestos 11-17R/S) (50 mg, rendimiento del 24%) se obtuvieron como un sólido blanco después de la purificación por cromatografía instantánea (10-50% de acetato de etilo en éter de petróleo). ESI: 559 (M H)+.
[2294] 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 57.35-7.31 (m, 2H), 6.31 (d,J =11.5 Hz, 1H), 6.13 (s, 1H), 6.03 (d,J =8.0 Hz, 1H), 5.98 (d,J =7.5 Hz, 1H), 5.84-5.82 (m, 1H), 5.68-5.56 (m, 3H), 5.25-4.72 (m, 4H), 4.29 (br s, 1H), 2.66-2.57 (m, 1H), 2.28-2.05 (m, 4H), 1.63-1.58 (m, 4H), 1.50-1.30 (m, 6H), 0.95-0.87 (m, 6H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 8.65 min (método A).
[2296] Ejemplo 25
[2298] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos 11-19 en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2300] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-Azidoacetil)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318íicosa-14,17-dien-16-ona (11-19)
[2302] Paso 1: Una suspensión del compuesto 9B (1.0 g, 1.8 mmol), azida de sodio (1.2 g, 18 mmol) en acetona (15 mL) se agitó a 50 °C durante la noche, cuando la reacción se completó según LCMS. Después de enfriar, la mezcla de reacción se vertió en agua fría (80 mL). La mezcla acuosa se extrajo con acetato de etilo (50 mL x 3). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera (30 ml), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para obtener el precursor azido de compuesto crudo de (11-19R/S) (0.90 g, > 99 % de rendimiento) como un sólido amarillo, que se utilizó para el siguiente paso sin purificación adicional. ESI m/z: 492 (M H)+.
[2303] (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-Aminoacetil)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-16-ona; sal de ácido trifluoroacético (11-19R/S)
[2304] Paso 2: A una solución del precursor de los compuestos11-19R/S(0.85 g, 1.7 mmol) en THF (20 mL) se añadió clorhidrato ac. (1 N, 10 mL). La mezcla se agitó a 28-32 °C hasta que se volvió transparente, a lo que luego se agregó trifenilfosfina (0.68 g, 2.6 mmol) a esta temperatura. La solución transparente de color amarillo resultante se agitó a 28-32 °C durante 18 horas, cuando la reacción se completó según TLC y LCMS. La mezcla se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía instantánea en fase reversa (0-50% de acetonitrilo en TFA ac. (0.05%)) para dar los compuestos 11-19R/S (0.56 g, rendimiento del 57 %, sal TFA) como un sólido blanquecino. ESI m/z: 466 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, MeODd4) 57.33 (d,J =9.9 Hz, 1H), 6.40-6.29 (m, 2H), 5.69-5.45 (m, 1H), 4.93-4.92 (m, 1H), 4.71 (t,J =4.3 Hz, 1H), 4.35-4.27 (m, 2H), 3.90-3.84 (m, 1H), 2.81-2.54 (m, 1H), 2.42-2.06 (m, 3H), 1.82-1.32 (m, 11H), 1.09-0.87 (m, 6H) ppm. 19F RMN (376 MHz, MeODd4)5-77.01, -166.24, -166.92, -188.81, -188.83 ppm. HPlC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 6.86 min (método A).
[2306] (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-Aminoacetil)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-16-ona; sal de ácido trifluoroacético (11-19R)
[2308] Paso 1: Utilizando el mismo procedimiento descrito anteriormente, el precursor azido de(11-19R)(0.12 g, rendimiento del 87 %) se obtuvo a partir del compuesto (9BR) como un sólido blanco después de la purificación por cromatografía instantánea (0-50% de acetato de etilo en éter de petróleo). ESI m/z: 492 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, CDCla) 57.10 (dd,J =10.2, 1.3 Hz, 1H), 6.44 (s, 1H), 6.38 (dd,J= 10.2, 1.8 Hz, 1H), 5.48-5.31 (m, 1H), 4.92 (d,J =5.4 Hz, 1H), 4.62 (t,J= 4.4 Hz, 1H), 4.43 (dd,J =5.6, 2.7 Hz, 1H), 4.22 (d,J =18.7 Hz, 1H), 3.94 (d,J =18.7 Hz, 1H), 2.56-2.39 (m, 2H), 2.32-2.18 (m, 2H), 1.85-1.71 (m, 3H), 1.67-1.54 (m, 7H), 1.46-1.37 (m, 2H), 0.97-0.90 (m, 6H) ppm.
[2310] Paso 2: Utilizando el mismo procedimiento descrito anteriormente, el compuesto 11-19R (30 mg, rendimiento del 66 %) se obtuvo como un sólido blanco después de la purificación por HPLC preparativa (método A). ESI m/z: 466 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODd4) 57.34 (d,J =10.0 Hz, 1H), 6.40-6.30 (m, 2H), 5.65-5.46 (m, 1H), 4.94-4.91 (m, 1H), 4.72 (t,J =4.3 Hz, 1H), 4.34-4.28 (m, 2H), 3.88 (d,J= 18.8 Hz, 1H), 2.78-2.60 (m, 1H), 2.39- 2.34 (m, 1H), 2.33-2.18 (m, 2H), 1.77-1.54 (m, 9H), 1.53-1.40 (m, 2H), 0.99-0.95 (m, 6H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 6.85 min (método A).
[2312] Ejemplo 26
[2314] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos 11-20R/S en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2316] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluoro-11-hidroxi-8-(2-{[(4-metoxifenil)metil](metil)amino}acetil)-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-16-ona; ácido trifluoroacético (11-20R/S)
[2318] A una solución del compuesto 9B (0.54 g, 1.0 mmol) en acetonitrilo (10 mL) se añadieron W-PMB-metilamina (0.30 g, 2.0 mmol) y carbonato de potasio (0.28 g, 2.0 mmol) a temperatura ambiente sucesivamente. La mezcla de reacción se agitó a 70 °C durante la noche. Después de enfriar, la mezcla se diluyó con DCM y se filtró. El filtrado se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (10-90% de acetato de etilo en éter de petróleo) para obtener el compuesto crudo (11-20R/S) (0.20 g, rendimiento del 33 %) como un sólido blanco. El producto crudo (30 mg) se purificó adicionalmente mediante HPLC preparativa (método A) para obtener el compuesto puro (11-20R/S) como un sólido blanco (12 mg, rendimiento del 13%). ESI m/z: 600 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODd4) 57.50-7.43 (m, 2H), 7.34 (d,J =10.1 Hz, 1H), 7.07 (d,J =8.5 Hz, 2H), 6.39- 6.30 (m, 2H), 5.56 (ddd,J= 48.5, 10.7, 6.5 Hz, 1H), 5.24-5.21 (m, 1H), 4.94-4.92 (m, 1H), 4.64-4.53 (m, 1H), 4.38-4.16 (m, 4H), 3.86 (s, 3H), 2.92-2.91 (m, 3H), 2.76-2.56 (m, 1H), 2.39-2.31 (m, 1H), 2.28-2.09 (m, 2H), 1.97 (td,J =13.2, 7.8 Hz, 1H), 1.78-1.23 (m, 10H), 1.08-0.88 (m, 6H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 7.81 min (método A).
[2320] Ejemplo 27
[2322] Este ejemplo demuestra un método para fabricar los compuestos. 11-21R/Sen la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 2.
[2324] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-8-[2-(metilamino)acetil]-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-16-ona; ácido trifluoroacético (11-21 R/S)
[2325] A los compuestos 11-20R/S (30 mg, 0.053 mmol) en un vial con tapa de rosca de 4 mL se agregaron 1-cloroetilcarbonodoridato (1 gota) y cloroformo (0.4 mL). La mezcla se agitó a 70 °C durante 2 horas hasta que el material de partida se consumió por TLC. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió a la mezcla metanol (1.5 mL). La mezcla se agitó a 70 °C durante 1 h hasta que se completó la reacción, lo que se monitorizó mediante TLC y LCMS. Los volátiles se eliminaron al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (método A) para obtener los compuestos 11-21R/S (8.0 mg, rendimiento del 28%) como un sólido blanco. ESI m/z: 480 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, MeODd4) 57.34 (d,J =10.1 Hz, 1H), 6.41-6.26 (m, 2H), 5.56 (ddd,J =48.7, 10.0, 6.8 Hz, 1H), 5.28 (t,J= 4.9 Hz, 1H), 5.23 (d,J =7.4 Hz, 1H), 4.47-4.41 (m, 1H), 4.34-4.30 (m, 1H), 4.07-4.00 (m, 1H), 2.82-2.54 (m, 4H), 2.43-2.09 (m, 3H), 1.96 (td,J =13.6, 7.9 Hz, 1H), 1.81-1.34 (m, 10H), 1.10-0.85 (m, 6H) ppm. 19F RMN (376 MHz, MeODd4) 5 -76.96, -166.28, -166.95, -188.80, -188.83 ppm. HPLC Anal.: 99%, Tiempo de retención: 6.97 min (método A).
[2327] Ejemplo 28
[2329] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos 14-2 en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 3.
[2331] (1R,2S,85,108,118,13S,14R,15S,17S)-1,8-difluoro-17-hidroxi-2,13,15-trimetil-14-[2-(metilamino)acetil]-5-oxotetraciclo[8.7.0.027.01115]heptadeca-3,6-dien-14-il propanoato (14-2)
[2333] La síntesis de mesilato de flumetasona (12) se informó en Bioorg. Med. Chem. Lett., 2015, 25, 2837-2843.
[2334] Una solución de 12 (82 mg crudo) en metilamina (solución 2 M en THF, 1.5 mL, 3.000 mmol) en un tubo sellado se agitó a temperatura ambiente durante la noche y luego se calentó a 60 °C durante 3 horas hasta que se completó la reacción. La solución se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC prep. (0-80% de acetonitrilo en agua con 10 mM de NH4HCO3) para obtener el compuesto 14-2 (8 mg, rendimiento 11 % para dos pasos) como un sólido blanco. ESI m/z: 480.2 (M+H). 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) 87.27-7.25 (d, J=10.4 Hz, 1H), 6.30-6.27 (dd, J=10.4, 2.0 Hz, 1 H), 6.10 (s, 1H), 5.73-5.56 (m, 1H), 5.43-5.32 (m, 2H), 4.62-4.42 (m, 1H), 4.25-4.18 (m, 1H), 4.15 (brs, 1H), 2.87 (s, 2H), 2.70 (s, 1H), 2.60-2.56 (m, 1H), 2.36-1.90 (m, 7H), 1.49­ 1.35 (m, 5H), 1.10-0.91 (m, 10H).
[2336] Ejemplo 29
[2338] Este ejemplo demuestra un método para elaborar los compuestos 15-5 de la Tala 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 3.
[2340] (1R,2S,8S,10S,11S,13R,14R,15S,17S)-14-[2-(4-Aminofenoxi)acetil]-1,8-difluoro-14,17-dihidroxi-2,13,15-trimetiltetraciclo[8.7.0.027.01115]heptadeca-3,6-dien-5-ona (15-5)
[2342] Paso 1: Una mezcla del compuesto (12) (0.16 g, 0.33 mmol), 4-nitrofenol (10-5, 92 mg, 0.67 mmol) y carbonato de potasio (92 mg, 0.67 mmol) en acetona (15 mL) se sometió a reflujo (60 °C) durante 18 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, los volátiles se eliminaron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía instantánea (0-1% de acetato de etilo en éter de petróleo) para producir un intermedio nitro (0.14 g, rendimiento 79%) como un sólido blanco. ESI m/z: 532 (M H)+. 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 58.20 (d,J =9.0 Hz, 2H), 7.10 (d,J =10.5 Hz, 1H), 6.94 (d,J =9.0 Hz, 2H), 6.43 (brs, 1H), 6.39-6.37 (m, 1H), 5.45-5.32 (m, 1H), 5.26 (d,J =18.0 Hz, 1H), 4.85 (d,J =18.0 Hz, 1H), 4.43-4.40 (m, 1H), 3.21-3.16 (m, 1H), 2.60 (s, 1H), 2.52-2.40 (m, 2H), 2.30-2.20 (m, 2H), 2.06-1.99 (m, 1H), 1.86-1.68 (m, 3H), 1.53-1.48 (m, 2H), 1.09 (s, 3H), 0.99 (d,J =7.0 Hz, 3H) ppm.
[2344] Paso 2: A una solución del intermedio nitro (0.13 g, 0.25 mmol) en una solución combinada de etanol (20 mL) y agua (2 mL) se añadió polvo de hierro (0.14 g, 2.5 mmol) y luego cloruro de amonio (0.14 g, 2.5 mmol). Después de agitar a 80 °C durante 2 horas, la suspensión se enfrió a temperatura ambiente y se filtró a través de Celite para eliminar las sales inorgánicas. El filtrado se concentró al vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (método B) para producir el compuesto 15-5 (90 mg, rendimiento 70 %) como un sólido blanco. ESI m/z: 502 (M H)+. 1H RMN (DMSOde, 500 MHz) 57.27 (d,J =10.0 Hz, 1H), 6.59 (d,J =8.5 Hz, 2H), 6.49 (d,J= 8.5 Hz, 2H), 6.31-6.28 (m, 1H), 6.11 (s, 1H), 5.77-5.57 (m, 1H), 5.42-5.39 (m, 1H), 5.22 (s, 1H), 5.07 (d,J= 18.5 Hz, 1H), 4.63 (s, 1 H), 4.59 (d,J =18.5 Hz, 1H), 4.29-4.10 (m, 1H), 2.99-2.91 (m, 1H), 2.55-2.43 (m, 3H), 2.25-2.19 (m, 3H), 1.71-1.64 (m, 1H), 1.56-1.43 (m, 5H), 1.15-1.10 (m, 1H), 0.88 (s, 3H), 0.83 (d,J= 6.0 Hz, 3H) ppm.
[2346] Ejemplo 30
[2348] Este ejemplo demuestra un método para elaborar el compuesto 16-5 en la Tabla 1. Este ejemplo se refiere a la numeración de compuestos en la FIG. 4.
[2350] (1R,2S,10S,11S,t3R,14R,15S,17S)-14-[2-(4-Aminofenoxi)acetil]-1-fluoro-14,17-dihidroxi-2,13,15-trimetiltetraciclo[8.7.0.027.01115]heptadeca-3,6-dien-5-ona (16-5)
[2351] La síntesis de mesilato de dexametasona (13) se informó enJ. Pharmacol.,172, 1360 (2015).
[2353] Una mezcla de mesilato de dexametasona (13, 94 mg, 0.20 mmol), 4-nitrofenol (10-5, 42 mg, 0.30 mmol) y carbonato de potasio (55 mg, 0.40 mmol) en acetona (10 mL) se sometió a reflujo (60 °C) durante 3 horas y luego se concentró. El producto crudo se concentró al vacío, y luego se purificó directamente por cromatografía instantánea (0-50% de acetato de etilo en éter de petróleo) para producir un intermedio nitro (0.10 g, rendimiento 97%) como un sólido blanco. ESI m/z: 514 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 400 MHz) 88.23 (d,J =9.0 Hz, 2H), 7.43 (d,J= 10.5 Hz, 1H), 7.04 (d,J =9.0 Hz, 2H), 6.31 (dd,J =10.0 Hz, 2.0 Hz, 1H), 6.11 (br s, 1H), 5.41 (d,J= 18.0 Hz, 1H), 4.96 (d,J =18.0 Hz, 1H), 4.34-4.30 (m, 1H), 3.13-3.06 (m, 1H), 2.79-2.72 (m, 1H), 2.57-2.41 (m, 3H), 2.32-2.26 (m, 1H), 1.94-1.90 (m, 1H), 1.82-1.75 (m, 1H), 1.62 (s, 3H), 1.62-1.53 (m, 2H), 1.28-1.23 (m, 1H), 1.07 (s, 3H), 0.92 (d,J= 7.0 Hz, 3 H) ppm.
[2355] A una solución del intermedio nitro(es decir,NO2-análogo en la FIG. 4, 60 mg, 0.12 mmol) en una solución combinada de etanol (3 mL) y agua (0.5 mL) se le añadió polvo de hierro (67 mg, 1.2 mmol) y luego cloruro de amonio (64 mg, 1.2 mmol). Después de agitar a 80 °C durante 1.5 horas, la suspensión se enfrió a temperatura ambiente y se filtró a través de Celite para eliminar las sales inorgánicas. El filtrado se concentró al vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto 16-5 (20 mg, rendimiento 35%) como un sólido blanco. ESI m/z: 484 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 500 MHz) 57.42 (d,J =10.5 Hz, 1H), 6.78­ 6.74 (m, 2H), 6.73-6.70 (m, 2H), 6.31 (dd,J =10.0 Hz, 2.0 Hz, 1H), 6.10 (br s, 1H), 5.08 (d,J =18.0 Hz, 1H), 4.71 (d,J =18.0 Hz, 1H), 4.30-4.27 (m, 1H), 3.14-3.09 (m, 1H), 2.78-2.71 (m, 1H), 2.54-2.37 (m, 3H), 2.30-2.24 (m, 1H), 1.94-1.89 (m, 1H), 1.81-1.74 (m, 1H), 1.62 (s, 3H), 1.59-1.52 (m, 2H), 1.26-1.21 (m, 1H), 1.06 (s, 3H), 0.91 (d,J= 7.5 Hz, 3H) ppm.
[2357] Ejemplo 31
[2359] Este ejemplo demuestra métodos para separar estereoisómeros de ciertos compuestos descritos en este documento.
[2361] Se utilizó la tecnología SFC (cromatografía de fluidos supercríticos) para la purificación de compuestos moleculares pequeños, que son térmicamente lábiles, incluidos los compuestos quirales. La SFC utilizó dióxido de carbono como fluido supercrítico como fase móvil y un adsorbente sólido unido a polímero orgánico como fase estacionaria. Con base en los diferentes coeficientes de partición de los epímeros en las dos fases, los epímeros mixtos podrían separarse ajustando la densidad de la fase móvil. Las condiciones del instrumento y de la columna se describen a continuación: Instrumento: SFC-80 (Thar, Waters), Columna: AD 20*250 mm, 5 um (Decial), temperatura de la columna: 35°C, Fase móvil: CO2/EtOH(1%Metanol Amoniaco)= 65/35, Tasa de flujo: 80 g/min, Contrapresión: 100 bar, Longitud de onda de detección: 214 nm, Tiempo de ciclo: 4.5 min, Solución de muestra: 130 mg disueltos en 30 ml de metanol, Volumen de inyección: 1.5 ml). Utilizando una columna AD-H quiral, se separaron 20 gramos de 22R/S-budesonida para obtener 8.9 gramos de R-budesonida y 8.9 gramos de S-budesonida con un rendimiento de recuperación total del 89%. De manera similar, dos epímeros del compuesto 11-5R/S También fueron separados por la SFC. Las condiciones de separación detalladas se describen a continuación en la Tabla 5.
[2363] Tabla 5: Condiciones de separación quiral de la budesonida y el compuesto (11-5) en la Tabla 1.
[2366]
[2367]
[2370] Las estructuras de 22R/S-budesonida se determinaron estereoespecíficamente mediante 2D-NOESY. En comparación con los datos de RMN de protones informados de 22R/S-budesonida, el primer compuesto de la SFC quiral, se determinó que era el R-epímero, mientras que se determinó que el segundo era el S epímero. La configuración en C22 influye en las resonancias magnéticas de los protones vecinos. Un doblete con J ^<ph>-ispH = 5.0 Hz y Ji6pH-i5aH = 2.5 Hz se observaron en el S-espectro, que resultó de una repulsión estérica del sustituyente 22-propilo que desprotegió el protón C16 en el S-epímero. Este efecto no se observa en elR-epímero. El protón C22 en el epímero S también se movió hacia abajo en comparación con el del R- epímero, lo que indica una desprotección del protón C22 en el S-epímero debido a una repulsión estérica entre el sustituyente 17p-cetol y la cadena 22p-propilo en el S-epímero. De manera similar, el protón C22 en el R-epímero estaba protegido por el efecto de anisotropía del grupo carbonilo C20 en el 22R-epímero. Los desplazamientos químicos detallados se describen a continuación en la Tabla 6.
[2371]
[2372] Ejemplo 32
[2374] Este ejemplo demuestra métodos para crear enlazadores y cargas útiles de enlazadores, en general.
[2376] En la FIG. 9 se muestran tres enfoques genéricos para crear cargas útiles de enlazador. En la FIG. 9, R' es una amina esteroide o anilina; R" es una fracción que contiene alquino, tal como un fragmento A o B, o una fracción maleimida, tal como C; R1 es un residuo de aminoácido; P es un grupo protector, como Fmoc o Boc; n es un número entero de 0-11; m es un número entero de 2-4; p es un número entero de 0-5. El enfoque I forma una amida (23) a partir de una reacción de acoplamiento entre el esteroide amina o anilina (21, Q = NH o NR) y un dipéptido (22) seguido de N-desprotección. La amina (23) luego se acopló con un ácido o su éster activo (24), tal como V-5, V-7, V en la FIG. 10, VI-8 y VI en la FIG. 11, y VII en la FIG. 12, para generar las cargas útiles del enlazador (25). El enfoque II forma una amida (28) a partir de una reacción de acoplamiento entre un ácido o su éster activo (26) y VC-pAB (27) seguido de N-desprotección. El compuesto 28 luego se convirtió en su derivado PNP que reaccionó además con 21 para generar el carbamato de carga útil del enlazador (29). El enfoque III forma un carbamato (30) del dipéptido N-protegido-pAB-PNP (19) y el esteroide amina o anilina (21), seguido de N-desprotección; la fracción amina en 30 Luego se acopló con un ácido o su éster activo (26) para generar 29.
[2378] Ejemplo 33
[2380] Este ejemplo demuestra métodos para crear el enlazador DIBAC-Suc-NHS (V). El siguiente ejemplo se refiere a la FIG. 10.
[2382] Véasemétodos en J. Org. Chem., 2010, 75, 627-636.
[2384] Paso 1: W-[Triciclo[9.4.0.03,8]pentadeca-1(11),3,5,7,9,12,14-heptaen-2-iliden]hidroxilamina V-2): Una mezcla de dibenzosuberenona (V-1) (21 g, 0.10 mol) y clorhidrato de hidroxilamina (9.3 g, 0.14 mol) en una solución combinada de etanol absoluto (100 mL) y piridina (200 mL) se agitó y se sometió a reflujo durante 15 horas. La TLC mostró que el material de partida se había consumido (TLC: 5% de metanol en cloruro de metileno). Después de enfriar por debajo de 25 °C, la mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno (500 mL) y la solución resultante se lavó con HCl acuoso (ac.) (1N, 3 x 200 mL) y luego salmuera (200 mL). La solución orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para producir V-2 crudo (22 g, 98 % de rendimiento crudo) como un sólido marrón claro. ESI m/z: 222.1 (M H)+.
[2386] Paso 2: 2-Azatriciclo[10.4.0.04'9]hexadeca-1(16),4(9),5,7,10,12,14-hepteno (V-3): A una solución de la oxima (V-2) (5.5 g, 25 mmol) en cloruro de metileno seco (en este documento también diclorometano o DCM) (150 mL) a -5 °C se añadió DIBAL-H (1 M en tolueno, 250 mL) gota a gota, manteniendo la temperatura por debajo de -5 °C. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche y posteriormente se inactivó con una solución de fluoruro de sodio sólido (38 g, 0.90 mol) en agua (12 mL) a 0 °C. La suspensión se agitó a 0 °C durante 30 minutos más y se filtró a través de Celite. La Celite se lavó completamente con cloruro de metileno y la solución orgánica combinada se concentró al vacío para producir V-3 (4.6 g, rendimiento del 89%) como un sólido amarillo. ESI m/z: 222.1 (M H)+.
[2388] Paso 3: ácido 4-[2-Azatriciclo[10.4.0.049]hexadeca-1(16),4(9),5,7,10,12,14-heptaen-2-il]-4-oxobutanoico (V-5): A una solución de (V-3) (5.0 g, 24 mmol) en cloruro de metileno (50 mL) se añadieron DIPEA (3.1 g, 24 mmol) y luego anhídrido succínico (V-4, 2.9 g, 29 mmol). Luego la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, se inactivó con bisulfato de sodio ac. (1N, 100 mL), y se extrajo con cloruro de metileno (3 x 100 mL). La solución orgánica combinada se lavó con agua (100 mL) y luego con salmuera (100 mL), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para producir (V-5) (7.7 g, rendimiento del 95 %) como un sólido blanco, que se utilizó sin purificación adicional. ESI m/z: 308.2 (M H)+.
[2390] Paso 4: ácido 4-{10.11-dibromo-2-azatriciclo[10.4.0.049]hexadeca-1(16),4(9),5,7,12,14-hexaen-2-il}-4-oxobutanoico (V-6): Una solución de (V-5) (15 g, 49 mmol) en cloruro de metileno (200 mL) se purgó con nitrógeno y se enfrió a 0 °C. A la solución se le añadió bromo líquido (23 g, 0.14 mol) gota a gota a 0 °C mediante una jeringa. La reacción se agitó a esta temperatura durante 2 horas y la TLC mostró que la reacción se había completado (TLC: 10% de metanol en cloruro de metileno). La mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno (50 mL) y se dejó calentar a temperatura ambiente. La solución orgánica se lavó con sulfito de sodio ac. saturado (sat.) (3 x 50 mL), agua (50 mL) y luego salmuera (50 mL), se seca sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para producir (V-6) (13 g, 99 % de rendimiento crudo) como un sólido blanquecino. ESI m/z: 467.9 (M H)+. 1H RMN (CDCla, 400 MHz): 57.71 (d,J= 6.8 Hz, 1H), 7.25-7.01 (m, 6H), 6.94-6.88 (m, 1H), 5.90 (d,J =9.6 Hz, 1H), 5.84-5.79 (m, 1H), 5.25-5.25 (m, 1H), 4.24-4.10 (m, 1H), 2.87-2.80 (m, 1H), 2.68-2.47 (m, 3H) ppm.
[2392] Paso 5: ácido 4-{2-Azatriciclo[10.4.0.04,9]hexadeca-1(16),4(9),5,7,12,14-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanoico (V-7): Una solución de (V-6) (5.0 g, 11 mmol) en THF anhidro (50 mL) se enfrió a -40 °C con un baño de hielo seco/acetonitrilo y a la solución se le añadió una solución de ferc-butanolato de potasio en tetrahidrofurano (1N, 37 mL, 37 mmol) gota a gota bajo atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó a esta temperatura durante media hora después de la adición. La TLC mostró que la reacción se completó (TLC: 10% de metanol en cloruro de metileno). Se dejó que la mezcla de reacción se calentara a temperatura ambiente y se inactivó con bisulfato de sodio ac. (1N) a pH 1. La mezcla se extrajo con cloruro de metileno (3 x 50 mL). La solución orgánica combinada se lavó con agua (50 mL) y luego con salmuera (50 mL), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para producir el compuesto (V-7) (2.7 g, rendimiento del 95 %) como un sólido de color blanquecino. ESI m/z: 306.1 (M H)+. 1H RMN (DMSOda, 500 MHz): 511.98 (s, 1H), 7.67-7.29 (m, 8H), 5.02 (d,J= 13.5 Hz, 1H), 3.61 (d,J= 14.5 Hz, 1H), 2.61-2.56 (m, 1H), 2.32-2.27 (m, 1H), 2.21-2.16 (m, 1H), 1.80­ 1.76 (m, 1H) ppm.
[2394] Paso 6: ácido 4-{2-Azatriciclo[10.4.0.049]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanoico (V): A una solución de ácido (V-7) (50 mg, 0.16 mmol) en cloruro de metileno (10 mL) se añadieron posteriormente W-hidroxisuccinimida (HOSu, 28 mg, 0.24 mmol) y clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-W-etilcarbodiimida (EDCI, 47 mg, 0.24 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante la noche, la mezcla se lavó con agua y luego con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para producir el intermedio V, que se utilizó directamente para el siguiente paso. ESI m/z: 403.0 (M H)+.
[2396] Ejemplo 34
[2398] Este ejemplo demuestra métodos para crear el enlazador DIBAC-Suc-PEG4-ácido/NHS (VI). El siguiente ejemplo se refiere a la FIG. 11.
[2400] Paso 1: 1-hidroxi-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de terc-butilo (VI-3): A una solución de tetraetilenglicol (VI-1, 58 g, 0.30 mol) en THF seco (200 mL) se añadió sodio (0.12 g) y la mezcla se agitó hasta que se consumió el sodio. A la solución resultante se le añadió luego acrilato de ferc-butilo (VI-2, 13 g, 0.10 mol) en THF seco (50 mL) gota a gota y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se inactivó primero con ácido acético (0.1 mL) y luego con agua (0.5 mL), y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante media hora y posteriormente se extrajo con acetato de etilo (3 x 200 mL). La solución orgánica combinada se lavó con agua (30 mL) y luego con salmuera (3 x 100 mL), se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró para obtener el producto (VI-3, 26 g, rendimiento del 81%) como aceite incoloro. ESI m/z: 340 (M 18)+.
[2402] Paso 2: 1-(metanosulfoniloxi)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de ferc-butilo (VI-4): A una solución de (VI-3) (26 g, 81 mmol), trietilamina (12 mL, 89 mmol) en cloruro de metileno (150 mL) en un baño de agua con hielo se añadió gota a gota una solución de cloruro de metanosulfonilo (10 g, 89 mmol) en DCM (50 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 14 horas y luego se concentró al vacío. El residuo se mezcló con agua (30 mL) y luego se extrajo con acetato de etilo (3 x 200 mL). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera (3 x 100 mL), se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró al vacío para obtener el producto deseado (VI-4) (31 g, rendimiento del 95%) como un aceite de color amarillo claro. ESI m/z: 418 (M 18)+.
[2404] Paso 3: 1-azido-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de terc-butilo (VI-5, A una solución de (VI-4) (27 g, 67 mmol) en DMF (70 mL) se añadió azida de sodio (6.6 g, 0.10 mol), que luego se agitó a 80 °C durante 4-16 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con acetato de etilo (3 x 150 mL). La solución combinada se lavó con agua (30 mL) y luego con salmuera (3 x 100 mL), se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró al vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (éter de petróleo/acetato de etilo (con 1% a 2% de metanol) = 4/1) para obtener (VI-5) (18 g, rendimiento del 67%) como aceite incoloro. e S i m/z: 365 (M 18)+.
[2406] Paso 4: 1-amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de ferc-Butilo (VI-6): A una solución de (VI-5) (1.5 g, 4.3 mmol) en acetato de etilo (20 mL) se añadió Pd/C húmedo (10 %, 0.15 g) bajo nitrógeno. Luego, la mezcla se lavó con hidrógeno y se agitó a temperatura ambiente bajo un globo de hidrógeno durante la noche. Luego la mezcla se filtró a través de Celite. La Celita se lavó con acetato de etilo (10 mL). El filtrado combinado se concentró al vacío para producir (VI-6) crudo (1.4 g) como un aceite amarillo claro, que se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional. ESI m/z: 322 (M H)+.
[2408] Paso 5: Ácido 1-amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oico (VI-7): A una solución de (VI-6), obtenido anteriormente (1.4 g) en cloruro de metileno (10 mL) se añadió TFA(5 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una hora. Los volátiles se eliminaron al vacío para producir un producto crudo (VI-7) como su sal TFA (1.6 g) como aceite amarillo, que se utilizó para el siguiente paso sin purificación adicional. ESI m/z: 266 (M H)+.
[2410] Paso 6: ácido 1-(4-{2-Azatriciclo[10.4.0.04'9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexano-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oico (VI-8): Una mezcla de ácido 4-{2-Azatriciclo[1 0.4.0.049]hexadeca-l(12),4(9),5, 7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanoico (V en la FIG. 11, 1.0 g, 2.5 mmol) y (VI-7) (0.91 g, 2.5 mmol) en DMF (10 mL) se añadió trietilamina (0.50 g, 5.0 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se purificó directamente mediante cromatografía instantánea en fase reversa (0-100% de acetonitrilo en agua (NH4HCO310 mM)) para obtener el (VI-8) (1.0 g, 74 % de rendimiento en 3 pasos a partir de VI-5) en forma de aceite marrón. ESI m/z: 553.3 (M H)+. 1H RMN (MeODdd, 400 MHz): 57.65 (d,J= 7.2 Hz, 1H), 7.64-7.58 (m, 1H), 7.49-7.42 (m, 3H), 7.40-7.30 (m, 2H), 7.287.22 (m, 1H), 5.12 (d,J =13.6 Hz, 1H), 3.75-3.68 (m, 3H), 3.63-3.50 (m, 12H), 3.50-3.39 (m, 2H), 3.25 (t,J=5.6 Hz, 2H), 2.76-2.66 (m, 1H), 2.52 (t,J= 6.0 Hz, 2H), 2.41-2.30 (m, 1H), 2.21-2.14 (m, 1H), 2.03-1.93 (m, 1H) ppm.
[2412] Paso 7: 2,5-Dioxopirrolidin-1-il 1-(4-{2-azatriciclo[10.4.0.04'9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexano-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato (VI): A una solución de (VI-8) (40 mg, 72 |jmol) en cloruro de metileno (10 mL) se añadió posteriormente HOSu (1-hidroxipirrolidin-2,5-diona, 12 mg, 0.11 mmol) y EDCI (21 mg, 0.11 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche y luego se diluyó con cloruro de metileno (50 mL). La solución orgánica se lavó con agua (50 mL) y luego con salmuera (50 mL), se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró al vacío para generar el intermedio (VI), que se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional. ESI m/z: 650 (M H)+. 1H RMN (CDCh, 400 MHz):57.70 (m, 1H), 7.66 (m, 1H), 7.55-7.47 (m, 3H), 7.38-7.24 (m, 4H), 6.33 (br s, 1H), 5.13 (d,J =13.6 Hz, 1H), 3.83-3.78 (m, 1H), 3.66-3.60 (m, 13H), 3.47-3.35 (m, 2H), 2.99-2.82 (m, 6H), 2.51-2.43 (m, 2H), 2.20-1.89 (m, 4H) ppm.
[2414] Ejemplo 35
[2416] Este ejemplo demuestra métodos para producir ácido 1-((1R,8S,9s)-Biciclo[6.1.0]non-4-in-9-il)-3-oxo-2,7,10,13,16-pentaoxa-4-azanonadecan-19-oico (BCN-PEG4-Ácido, VII). El siguiente Ejemplo se refiere a la FIG. 12.
[2418] A una solución de intermedio VII-1 (0.10 g, 0.33 mmol) en tetrahidrofurano (THF) (5 mL) se añadieron posteriormente diisopropiletilamina (0.17 g, 1.3 mmol), intermedio (VI-7) (89 mg, 0.33 mmol) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 43 mg, 0.33 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después de filtrar para eliminar el sólido insoluble y concentrar al vacío, la mezcla de reacción se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) para producir BCN-PEG.4-ácido (VII) (25 mg, rendimiento del 17%) como aceite incoloro. 1H RMN (CDCh, 400 MHz): 55.07 (br s, 1H), 4.14 (d,J= 7.6 Hz, 2H), 3.77 (t,J= 6.4 Hz, 2H), 3.70-3.55 (m, 14H), 3.40-3.31 (m, 2H), 2.58 (t,J= 6.0 Hz, 2H), 2.30-2.19 (m, 6H), 1.61-1.52 (m, 2H), 1.43-1.32 (m, 1H), 1.0-0.92 (m, 2H) ppm.
[2420] Ejemplo 36
[2422] Este ejemplo demuestra métodos para producir {{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-azatriciclo[10.4.0.049]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metil 4-nitrofenil carbonato (DIBAC-Suc-PEG4-VC-pAB-PNP, VIII). El siguiente Ejemplo se refiere a la FIG. 13.
[2424] 1 -(4-{2-azatriciclo[10.4.0.04_9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexano-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-{[4-(hidroximetil)fenil]carbamoil}butil]carbamoil}-2-metilpropil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (VIII-3)
[2426] Paso 1: A una solución del compuesto (VIII-1) (300 mg, 0.54 mmol) y el compuesto (VIII-2A 205 mg, 0.54 mmol) en DMF (10 ml) se le añadieron HATU (309 mg, 0.81 mmol) y luego DIEA (140 mg, 1.08 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de filtrar para eliminar el sólido insoluble y concentrar al vacío, La mezcla de reacción se purificó directamente mediante instantáneo inverso (NH4HCO3 como tampón) y se obtuvo un sólido blanco (VIII-3) (300 mg, 60%). ESI m/z: 617(M+1).
[2428] {{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-azatriciclo[10.4.0.04-9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexano-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metil 4-nitrofenil carbonato (VIII)
[2430] Paso 2: A una solución de (VIII-3) (150 mg, 0.16 mmol) y (VIII-4) (150 mg, 0.49 mmol) en DMF (10 mL) se añadió DIEA (63 mg, 0.49 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de filtrar para eliminar el sólido insoluble y concentrar al vacío, La mezcla de reacción se purificó directamente mediante cromatografía instantánea inversa (NH4HCO3 como tampón), y se obtuvo (VIII) como un sólido amarillo (50 mg, 28%). ESI m/z: 1079 (M+1).
[2432] Ejemplo 37
[2434] Este ejemplo demuestra métodos para crear la Carga útil del Enlazador (LP1). El siguiente ejemplo se refiere a la FIG. 14.
[2436] N-[(1S)-1-({4-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetil-16-oxo-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0029.048.01318]icosa-14,17-dien-6-il]fenil}carbamoil)etil]carbamato de terc-butilo (31)
[2437] Paso 1: Una mezcla de Boc-Ala-OH (0.20 g, 0.42 mmol), DIPEA (0.12 g, 0.84 mmol) y HATU (0.24 g, 0.63 mmol) en DMF (5 mL) se agitó a 23 °C durante 30 minutos. A la solución se le añadió luego el compuesto 7-1R(87 mg, 0.46 mmol). Después de agitar a 23 °C durante otras 2 horas, la mezcla se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto. 31 (0.11 g, rendimiento del 40 %) como un sólido blanco. ESI m/z: 651 (M H)+.
[2439] (2S)-2-Amino-N-{4-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetil-16-oxo-5,7-dioxapentaciclo[10.8.002,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-6-il]fenil}propanamida (32)
[2441] Paso 2: A una solución del compuesto 31 (0.10 g, 0.15 mmol) en cloruro de metileno (3 mL) se añadió TFA (0.3 mL) gota a gota. La mezcla se agitó a 23 °C durante una hora y los volátiles se eliminaron al vacío para producir (32) crudo (83 mg) como aceite, que se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional. ESI m/z: 551 (M H)+.
[2443] N-[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetil-16-oxo-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0029.048.01318]icosa-14,17-dien-6-il]fenil}carbamoil)etil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamato de terc-butilo (33)
[2445] Paso 3: Una mezcla de (32) (83 mg, 0.15 mmol), trietilamina (31 mg, 0.31 mmol) y Boc-Val-NHS (58 mg, 0.19 mmol) en DMF (5 mL) se agitó a 23 °C durante 4 horas y la mezcla de reacción se purificó directamente por HPLC preparativa (método B) para obtener (33) (52 mg, rendimiento del 20 % en 2 pasos) como un sólido blanco. ESI m/z: 750 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 5 10.00 (s, 1H), 8.07 (d,J=7.0 Hz, 1H), 7.58 (d,J=8.5 Hz, 2H), 7.40 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 7.31 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 6.72 (d,J= 9.0 Hz, 1H), 6.16 (dd,J= 1.5, 10.0 Hz, 1H), 5.91 (s, 1H), 5.38 (s, 1H), 5.08 (t,J= 6.5Hz, 1H), 4.92 (d,J =5.1 Hz, 1H), 4.78 (d,J=3.0 Hz, 1H), 4.55-4.46 (m, 1H), 4.42 (t,J=7.0Hz, 1H), 4.29 (s, 1H), 4.21-4.14 (m, 1H), 3.82 (t,J =8.5 Hz, 1H), 2.65-2.52 (m, 1H), 2.37-2.25 (m, 1H), 2.18-2.06 (m, 1H), 2.04-1.88 (m, 2H), 1.85-1.57 (m, 5H), 1.40 (s, 3H), 1.37 (s, 9H), 1.29 (d,J= 7.0 Hz, 3H), 1.15-0.98 (m, 2H), 0.96-0.76 (m, 9H) ppm.
[2447] (2S)-2-Amino-N-[(1S)-1-({4-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetil-16-oxo-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0029.048.01318]icosa-14,17-dien-6-il]fenil}carbamoil)etil]-3-metilbutanamida (34g)
[2448] Paso 4: A una solución del compuesto 33 (50 mg, 67 pmol) en cloruro de metileno (3 mL) se añadió TFA (0.3 mL) gota a gota, que luego se agitó a 23 °C durante una hora. Los volátiles se eliminaron al vacío para producir el compuesto 34g crudo (42 mg) como aceite, que se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional. ESI m/z: 650 (M H)+.
[2450] 1-(4-{2-Azatriciclo[10.4.049]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexano-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetil-16-o-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0029.048.01318]icosa-14,17-dien-6-il]fenil}carbamoil)etil]carbamoil}-2-metilpropil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (LP1)
[2452] Paso 5: Una solución de DIBAC-suc-PEG4-OH (VI-8, 41 mg, 74 pmol), DIPEA (24 mg, 0.19 mmol) y HATU (47 mg, 0.12 mmol) en DMF (5 mL) se agitó a 23 °C durante 30 minutos y luego se añadió (34g) (40 mg, 62 pmol). Después de agitarse a 23 °C durante otras 2 horas, la mezcla de reacción se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) para obtener LP1 (33 mg, rendimiento del 44 % en 2 pasos) como un sólido blanco. ESI m/z: 1185 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 59.97 (s, 1H), 8.18 (d,J= 6.5 Hz, 1H), 7.87 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 7.75 (t,J =5.5 Hz, 1H), 7.67 (d,J= 6.5 Hz, 1H), 7.63-7.56 (m, 3H), 7.53-7.41 (m, 3H), 7.42 7.27 (m, 6H), 6.19-6.14 (m, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.38 (s, 1H), 5.08 (t,J= 6.5 Hz, 1H), 5.03 (d,J= 14.0 Hz, 1H), 4.92 (d,J =5.1 Hz, 1H), 4.78 (d,J= 3.0 Hz, 1H), 4.55-4.46 (m, 1H), 4.42 (t,J= 7.0 Hz, 1H), 4.29 (s, 1H), 4.21­ 4.14 (m, 2H), 3.63-3.55 (m, 3H), 3.50-3.40 (m, 12H), 3.32-3.26 (m, 2H), 3.10-3.05 (m, 2H), 2.65-2.52 (m, 2H), 2.48-2.48 (m, 2H), 2.40-2.25 (m, 3H), 2.18-2.06 (m, 1H), 2.04-1.88 (m, 3H), 1.85-1.57 (m, 5H), 1.40 (s, 3H), 1.28 (d,J=7.0 Hz, 3H), 1.15-0.98 (m, 2H), 0.96-0.84 (m, 6H), 0.84-0.80 (d,J= 7.0 Hz, 3H) ppm.
[2454] Ejemplo 38
[2456] El ejemplo demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador (LP2). El siguiente ejemplo se refiere a la FIG 15.
[2458] N-[(1 S)-1 -{[(1 S)-4-(carbamoilamino)-1 -[(4-{2-[(1 R,2S,8S,10S,11 S,13R,14R,15S,17S)-1,8-difluoro-14,17-dihidroxi-2,13,15-trimetil-5-oxotetraciclo[8.7.0.02701115]heptadeca-3,6-dien-14-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamato de terc-butilo (34e)
[2460] Procedimiento general C: A una solución de Boc-Val-Ala-OH o Boc-Val-Cit-OH (1.0 equiv.) en un disolvente orgánico (tal como DCM o DMF) se le añadió una base (tal como DIPEA) (2.0 equiv.) y HATU (1.2 equiv.) a 20­ 25 °C. La mezcla se agitó a 20-25 °C durante 30 minutos, seguido de la adición de anilina (1.1 equiv.). La mezcla se agitó durante 16 horas más hasta que el péptido se consumió según LCMS. A continuación, a la mezcla de reacción se añadió TFA (0.05 mL por cada 10 mg de péptido). La mezcla se agitó a 20-25 °C durante otra hora. Los volátiles se eliminaron a presión reducida y el residuo se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B).
[2461] Paso 1: A una solución de Boc-VC (VC es Val-Cit) (67 mg, 0.18 mmol) en DMF (3 mL) se añadieron HATU (68 mg, 0.18 mmol) y NMM (30 mg, 0.30 mmol), y la solución resultante se agitó a 23 °C durante 10 minutos. A la mezcla de reacción se añadió luego el compuesto 15-5 (75 mg, 0.15 mmol). Después de agitar a 23 °C durante la noche, la mezcla de reacción se vertió en acetato de etilo (80 mL), se lavó con salmuera y luego se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La solución orgánica combinada se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (0-10 % de metanol en cloruro de metileno) para obtener (34e) (0.12 g, rendimiento 89%) como un sólido blanco. ESI m/z: 858 (M H)+. 1H RMN (MeODdd, 500 MHz) 57.54-7.47 (m, 2H), 7.36 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 6.90-6.87 (m, 2H), 6.34 (dd,J =10.0, 1.5 Hz, 1H), 6.31 (s, 1H), 5.63-5.50 (m, 1H), 5.20 (d,J= 18.0 Hz, 1H), 4.80 (d,J= 18.0 Hz, 1H), 4.54-4.47 (m, 1H), 4.32-4.30 (m, 1H), 3.92-3.81 (m, 1H), 3.23-3.11 (m, 3H), 2.65-2.52 (m, 1H), 2.43-2.32 (m, 3H), 2.11-1.99 (m, 1H), 1.79-1.58 (m, 9H), 1.46-1.24 (m, 11H), 1.06 (s, 3H), 1.00-0.92 (m, 9H) ppm.
[2463] Biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetilW-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-[(4-{2-[(1R,2S,8S,10S,11S,13R,14R,15S,17S)-1,8-difluoro-14,17-dihidroxi-2,13,15-trimetil-5-oxotetraciclo[8.7.0.02,7011,15]heptadeca-3,6-dien-14-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}-3,6,9,12-tetraoxatetradecan-1-il)carbamato (LP2)
[2465] Paso 2: A una solución del compuesto intermedio 34e (25 mg, 29 jmol) en cloruro de metileno (2 mL) se añadió TFA (1 mL) y la mezcla resultante se agitó a 23 °C durante una hora. Los volátiles se eliminaron al vacío para obtener un residuo (25 mg, ESI m/z: 758.3 (M H)+) como residuo de aceite marrón.
[2467] A una solución de BCN-PEG4-ácido (VII en la FIG. 12, 18 mg, 41 jmol) en DMF (2 mL), se le añadieron HATU (15 mg, 41 jm o l) y NMM (6.9 mg, 41 jm ol) y la solución resultante se agitó a 23 °C durante media hora. A la solución de reacción se añadió luego una solución del residuo de aceite marrón obtenido anteriormente en DMF (1 mL). Después de agitar a 23 °C durante la noche, la mezcla se elaboró y se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) para obtener LP2 (15 mg, rendimiento del 37 %) como un sólido blanco. ESI m/z: 1181.4 (M H)+. 1H RMN (DMSOd6, 400 MHz) (rotámero) 59.82 y 9.37 (s, 1H), 8.39 (d,J= 8.0 Hz, 0.4H), 8.09 (d,J= 7.2 Hz, 0.6H), 8.00 (d,J= 8.0 Hz, 0.4H), 7.88 (d,J= 8.8 Hz, 0.6H), 7.55 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.49 (d,J =8.8 Hz, 1H), 7.27 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 7.10 (br s, 1H), 6.80 (m, 2H), 6.29 (dd,J= 10.0, 1.0 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 5.99-5.94 (m, 1H), 5.72-5.56 (m, 1H), 5.43-5.41 (m, 3H), 5.31 (s, 1H), 5.22 (d,J= 18.0 Hz, 1H), 4.71 (d,J= 18.0 Hz, 1H), 4.37-4.31 (m, 1H), 4.24-4.14 (m, 2H), 4.04 (s, 1H), 4.02 (s, 1H), 3.62-3.56 (m, 2H), 3.50-3.45 (m, 12H), 3.40-3.37 (m, 2H), 3.13-3.08 (m, 2H), 3.00-2.92 (m, 3H), 2.54-2.33 (m, 2H), 2.25-2.08 (m, 8H), 2.09-1.90 (m, 1H), 1.78-1.23 (m, 15H), 1.14-1.09 (m, 1H), 0.89-0.82 (m, 14H) ppm.
[2469] Ejemplo 39
[2471] El ejemplo demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador (LP3). El siguiente ejemplo se refiere a la FIG. 15.
[2473] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-Amino-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino) pentanamido]fenil} metilW-(4-{2-[(1R,2S,8S,10S,11S,13R,14R,15S,17S)-1,8-difluoro-14,17-dihidroxi-2,13,15-trimetil-5-oxotetraciclo[8.7.0.02,701115]heptadeca-3,6-dien-14-il]-2-oxoetoxi} fenil) carbamato (34f)
[2475] Procedimiento general D: Paso 1: A una solución de carga útil de anilina (1.0 equiv.) en DMF se añadieron Fmoc-vcPAB-PNP (1.1 equiv.), HOBt (1.5 equiv.) y DIPEA (2.0 equiv.) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente (18-30 °C) hasta que se consumió el material de partida según LCMS. Paso 2: A la mezcla de reacción se añadió piperidina (0.03 mL por cada 10 mg de carga útil) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente (18-30 °C) durante una hora hasta que se eliminó el Fmoc monitorizado por LCMS. Después de filtrar a través de la membrana, la solución de reacción se purificó directamente mediante cromatografía instantánea en fase reversa o HPLC preparativa para generar el carbonato de vcPAB.
[2477] Cuando se utilizó N-Boc-vcPAB-PNP para reemplazar Fmoc-vcPAB-PNP en la reacción del Paso 1, el carbonato de N-Boc vcPAB se obtuvo del Paso 1. Después de la purificación, el carbonato de N-Boc vcPAB se redisolvió en DCM y se trató con TFA (concentración de TFA < 25 %) a 0 °C hasta que se eliminó el Boc monitorizado por LCMS. La mezcla de reacción se concentró para eliminar los volátiles y el residuo resultante se purificó mediante cromatografía o HPLC preparativa para generar el carbonato vcPAB.
[2479] A una solución de Fmoc-vcPAB-PNP (73 mg, 96 jmol) en DMF (1 mL) se le añadió el compuesto 15-5 (40 mg, 80 |jmol), DMAP (20 mg, 0.16 mmol), HOBt (23 mg, 0.16 mmol) y DIPEA (55 mg, 0.40 mmol) sucesivamente a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante media hora hasta que (15-5) se consumió totalmente según LCMS. (ESI: 565.3 (M H)+). A la mezcla resultante se añadió luego piperidina (34 mg, 0.40 mmol) a temperatura ambiente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos más, lo cual se monitorizó mediante LCMS, la mezcla resultante se purificó directamente mediante cromatografía instantánea en fase reversa (0-30 % de acetonitrilo en agua) a (34f) (50 mg, rendimiento 69%) como un sólido amarillo pálido. ESI: 907 (M H)+
[2481] Biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetilN-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-{[4-({[(4-{2-[(1R,2S,8S,10S,11S,13R,14R,15S,17S)-1,8-difluoro-14,17-dihidroxi-2,13,15-trimetil-5 oxotetraciclo[8.7.0.02,701115]heptadeca-3,6-dien-14-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil] oxi}metil)fenil]carbamoil}butil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}-3,6,9,12-tetraoxatetradecan-1-il)carbamato (LP3)
[2483] Paso 3: A una solución de BCN-PEG4-ácido (60 mg, 67 |jmol) en DMF (3.6 mL) se añadieron HATU (27 mg, 70 jm ol) y DIPEA (20 mg, 0.15 mmol) sucesivamente a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante media hora, seguido de la adición del compuesto (34f) (50 mg, 60 jm ol) en porciones. Luego, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas hasta que el compuesto 34f fue consumido totalmente según LCMS. Luego, la mezcla de reacción se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto LP3 (36 mg, rendimiento 54%) como un sólido blanco. ESI: 1330 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOde) 510.02 (s, 1H), 9.56 (s, 1H), 8.14 (d,J= 7.2 Hz, 1H), 7.89 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.62 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 7.35 (d,J= 8.4 Hz, 4H), 7.27 (d,J=10.4 Hz, 1H), 7.11 (t,J= 4.4 Hz, 1H), 6.78 (d,J= 8.8 Hz, 2H), 6.33-6.26 (m, 1H), 6.10 (s, 1H), 5.98 (t,J= 5.4 Hz, 1H), 5.75­ 5.52 (m, 1H), 5.42 (s, 3H), 5.30 (s, 1H), 5.20 (d,J=18.4 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 4.70 (d,J= 18.4 Hz, 1H), 4.43­ 4.35 (m, 1H), 4.26-4.15 (m, 2H), 4.02 (d,J= 7.6 Hz, 2H), 3.64-3.55 (m, 2H), 3.49 (s, 11H), 3.38 (t,J= 6.0 Hz, 2H), 3.11 (dd,J =11.8, 5.9 Hz, 2H), 3.05-2.88 (m, 3H), 2.44-2.31 (m, 2H), 2.28-2.08 (m, 9H), 2.02-1.90 (m, 1H), 1.76-1.10 (m, 16H), 0.91-0.77 (m, 14H) ppm. H<p>LC pureza: >99%, Tiempo de retención: 7.03 min.
[2485] Ejemplo 40
[2487] El ejemplo demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador (LP4). El siguiente ejemplo se refiere a la FIG. 16.
[2489] (2S)-2-Amino-N-[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]-3-metilbutanamida (34a)
[2491] Procedimiento general E: A una solución de Fmoc-Val-Ala-OH (1.2 equiv.) en DMF (0.2 mL por 10 mg de péptido) se añadieron DIPEA (3.0 equiv.) y HATU (1.4 equiv.) a 20-25 °C. La mezcla se agitó a 20-25 °C durante 5 minutos, seguido de la adición de anilina (1.0 equiv.). La mezcla se agitó durante 2 horas más hasta que el péptido se consumió totalmente, según LCMS. A continuación a la mezcla de reacción se añadió piperidina (5.0 equiv.). La mezcla se agitó a 20-25 °C durante 2 horas. Después de filtrar a través de membrana, la solución de reacción se purificó directamente mediante cromatografía instantánea en fase reversa (0-100% de acetonitrilo en bicarbonato de amonio ac. (10 mM)) o HPLC preparativa (método B). El compuesto (34a) se obtuvo siguiendo este procedimiento general.
[2493] Alternativamente el compuesto (34a) se obtuvo de acuerdo con el Procedimiento General C. A una solución de Boc-Val-Ala-OH (0.29 g, 1.0 mmol) en cloruro de metileno (5 mL) se añadieron DIPEA (0.26 g, 2.0 mmol) y HATU (0.46 g, 1.2 mmol), y la mezcla se agitó a 23 °C durante 30 minutos y a la mezcla de reacción se le añadió luego el compuesto (11-5) (0.57 g, 1.1 mmol). Después de agitar a 23 °C durante 16 horas adicionales, a la mezcla de reacción se añadió TFA (1.5 mL) y la mezcla resultante se agitó a 23 °C durante otra hora. Los volátiles se eliminaron a presión reducida y el residuo se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) para obtener 34a (0.17 g, rendimiento del 25 % en 2 pasos) como un sólido blanco.<e>S<i>m/z: 692 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 510.00 (s, 1H), 8.47 (d,J= 6.5 Hz, 1H), 7.57-7.47 (m, 2H), 7.33 (d,J= 10 Hz, 1H), 6.87-6.82 (m, 2H), 6.18 (d,J= 10 Hz, 1H), 5.93 (s, 3H), 5.25-5.11 (m, 1H), 5.09 (d,J= 6.5 Hz, 1H), 4.92-4.65 (m, 3H), 4.55-4.40 (m, 1H), 4.40-4.30 (m, 1H), 2.32-2.22 (m, 1H), 2.18-1.80 (m, 5H), 1.65-1.45 (m, 5H), 1.45-1.25 (m, 9H), 1.25-0.98 (m, 2H), 0.96-0.76 (m, 13H) ppm.
[2495] Biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetilW-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,1S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}-3,6,9,12-tetraoxatetradecan-1-il)carbamato (LP4)
[2497] Procedimiento general F: A una solución de un BCN-PEG4-ácido o su NHS-éster en DMF se añadieron HATU (1 eq.) y DIPEA (2.5 eq.). La mezcla se agitó a 25 °C durante 30 minutos, seguido de la adición de una solución de una amina. Después de agitar a 25 °C durante 2 horas monitorizadas por LC-MS, los materiales de partida se consumieron y la mezcla se purificó directamente por HPLC preparativa para obtener la amida deseada.
[2498] A una solución de BCN-PEG4-ácido (IX, 70 mg, 0.16 mmol) en DMF (8 mL) se añadieron HATU (66 mg, 0.17 mmol) y DIPEA (56 mg, 0.43 mmol) sucesivamente. La mezcla se agitó a 25 °C durante 30 minutos seguido de la adición de una solución de 34a (0.10 g, 0.15 mmol). Después de agitar a 25 °C durante 2 horas, la mezcla se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) para obtener LP4 (25 mg, rendimiento del 16 %) como un sólido blanco. ESI m/z =1116 (M H)+.
[2500] Uso de compuestos quirales 11-5R como material de partida, el quiral (R)-LP4 se obtuvo como un sólido blanco (24 mg, rendimiento del 31 %) de acuerdo con el Procedimiento general F. ESI m/z: 1115 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) (rotámeros) 59.78 (s, 0.5H), 9.69 (s, 0.5H), 8.40 (d,J= 7.5 Hz, 0.5H), 8.15 (d,J= 7.0 Hz, 0.5H), 8.01 (d,J= 8.0 Hz, 0.5H), 7.89 (d,J= 9.0 Hz, 0.5H), 7.57 (d,J= 9.0 Hz, 1H), 7.51 (d,J= 9.0 Hz, 1H), 7.32 (d,J =10.1 Hz, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.85 (d,J =9.1 Hz, 2H), 6.18 (d,J = 11.4 Hz,1H), 5.93 (s, 1H), 5.10 (d,J= 18.5 Hz, 1H), 4.86-4.67 (m, 4H), 4.45-4.36 (m, 1H), 4.33 (s, 1H), 4.20 (t,J= 7.5 Hz, 0.5H), 4.10 (t,J = 7.8 Hz, 0.5H), 4.03 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 3.59 (d,J= 6.6 Hz, 2H), 3.49-3.45 (m, 11H), 3.39 (s, 2H), 3.30 (s, 2H), 3.11 (dd,J= 11.4, 5.9 Hz, 2H), 2.47-2.43 (m, 1H), 2.38-2.12 (m, 8H), 2.03-1.83 (s, 5H), 1.62-1.51 (m, 6H), 1.42-1.24 (m, 10H), 1.02-0.94 (m, 2H), 0.90-0.82 (m, 14H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 9.49 min (método A).
[2502] Ejemplo 41
[2504] El ejemplo demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador (LP5). El siguiente ejemplo se refiere a la FIG.16.
[2506] (2S)-2-[(2S)-2-Amino-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)-N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,801318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)pentanamida (34c)
[2508] El compuesto 34c se obtuvo después de la Procedimiento General C. Una mezcla de Boc-vc (0.26 g, 0.50 mmol), DIPEA (0.19 g, 0.60 mmol) y HATU (0.23 g, 0.60 mmol) en DMF (10 mL) se agitó a 23 °C durante 30 minutos y luego a la mezcla se le añadió 11-5 (0.28 g, 0.55 mmol). Después de agitar a 23 °C durante 16 horas, la mezcla de reacción se purificó directamente mediante cromatografía instantánea en fase reversa (0-50 % de acetonitrilo en agua) para producir un crudo (ESI m/z 878 (M H)+), que se disolvió en cloruro de metileno (8 mL) y se trató con TFA (3 mL). La mezcla resultante se agitó a 23 °C durante una hora. Los volátiles se eliminaron a presión reducida y el residuo se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto 34c (0.12 g, rendimiento del 31 % en 2 pasos) como un sólido blanco. ESI m/z: 778 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 59.97 (d,J= 12.0 Hz, 1H), 8.10 (m, 1H), 7.51 (d,J= 6.5 Hz, 2H), 7.32 (dd,J= 10.1,2.5 Hz, 1H), 6.83 (dd,J= 15.9, 9.0 Hz, 2H), 6.17 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 5.97 (t,J= 5.0 Hz ,1H), 5.93 (s, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.22 (t,J= 4.8 Hz, 1H), 5.12 (d,J= 6.0 Hz, 1H), 5.09 (d,J= 6.5 Hz, 1H), 4.83-4.67 (m, 3H), 4.47-4.37 (m, 1H), 4.35 - 4.29 (m, 1H), 3.05 -2.90 (m, 3H), 2.57-2.51(m, 1H), 2.30 (d,J= 12.0 Hz, 1H), 2.13­ 1.74 (m, 7H), 1.70- 1.46 (m, 7H), 1.45-1.29 (m, 7H), 1.17-0.93 (m, 2H), 0.91-0.82 (m, 9H), 0.77 (dd,J=6.7, 2.7 Hz, 3H) ppm.
[2510] Biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetilN-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,1S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}-3,6,9,12-tetraoxatetradecan-1-il)carbamato (LP5)
[2512] Se obtuvo LP5 después de la Procedimiento general F. Una solución de BCN-PEG4-ácido (IX en la FIG. 15, 0.28 g) en cloruro de metileno (6 mL) se añadió a una mezcla de HATU (59 mg, 0.15 mmol) y DIPEA (50 mg, 0.39 mmol) en DMF (5 mL). La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 30 minutos y se le añadió el compuesto 34c (0.10 g, 0.13 mmol) en una porción. La mezcla resultante se agitó a 25 °C durante la noche y se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) para obtener LP5 (35 mg, rendimiento del 23 %) como un sólido de color amarillo pálido. ESI m/z =1202 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, MeODdd) 57.61-7.43 (m, 3H), 6.87 (t,J= 8.6 Hz, 2H), 6.26 (d,J =10.0 Hz, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.29-5.02 (m, 2H), 4.84-4.65 (m, 2H), 4.51-4.44 (s, 2H), 4.22-4.05 (m, 3H), 3.80-3.68 (m, 2H), 3.67-3.45 (m, 14H), 3.22-3.08 (m, 2H), 2.72-2.50 (m, 3H), 2.45-2.33 (m, 1H), 2.30-2.02 (m, 10H), 1.99-1.82 (m, 2H), 1.81-1.32 (m, 17H), 1.26-0.85 (m, 17H) ppm.
[2514] Ejemplo 42
[2516] El ejemplo demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador (LP6). El siguiente ejemplo se refiere a la FIG. 16.
[2518] {4-[(2S)-2-[(2S)-2--Amino-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metil N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.048.01318]icosa-14, 17-dien-8-il]-2-oxoetoxi} fenil)carbamato (34d)
[2520] El compuesto 34d fue preparado de acuerdo con el Procedimiento general D.
[2522] Paso 1: A una solución del compuesto (11-5) de la Tabla 1 (66 mg, 0.10 mmol) en DMF (3.5 mL) se añadieron sucesivamente Boc-vcPAB-PNP (64 mg, 0.12 mmol), HOBt (14 mg, 0.10 mmol) y DIPEA (13.0 mg, 0.10 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 13 °C durante la noche y se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) para obtener el intermedio Boc-34d (61 mg, rendimiento 58%) como un sólido blanco. ESI m/z: 1027.3 (M H)+. 1H RMN (MeODdd, 400 MHz) 57.60 (d,J=8.4 Hz, 2H), 7.46 (d,J =10.4 Hz, 1H), 7.38-7.33 (m, 4H), 6.87-6.83 (m, 2H), 6.26 (dt,J =10.0, 2.0 Hz, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.26-5.03 (m, 4.2H), 4.82-4.67 (m, 1.8H), 4.54-4.51 (m, 1H), 4.48-4.43 (m, 1H), 3.91 (d,J= 6.4 Hz, 1H), 3.31-3.18 (m, 1H), 3.14-3.08 (m, 1H), 2.70-2.63 (m, 1H), 2.40-2.37 (m, 1H), 2.26-2.00 (m, 4H), 1.94-1.72 (m, 4H), 1.68-1.35 (m, 20H), 1.22-0.92 (m, 14H) ppm.
[2523] Paso 2: A una solución de Boc-34d (59 mg, 58 |jmol) en DCM (2 mL) y MeOH (1 mL), se añadió HCl gota a gota en dioxano (4 N, 1.5 mL) a 0 °C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente (14 °C) durante 4 horas. Los volátiles se eliminaron al vacío para producir 34d (60 mg, crudo) como aceite marrón, que se utilizó directamente para el siguiente paso. ESI m/z: 927 (M H)+.
[2525] Biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetilW-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-{[4-({[(4-{2-[(1 S,2S,4R,8S,9S,11 S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]oxi}metil)fenil]carbamoil}butil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}-3,6,9,12-tetraoxatetradecan-1-il)carbamato (LP6)
[2527] Se obtuvo LP6 como un sólido blanco (24 mg, 31% de rendimiento) después del Procedimiento general F. ESI m/z: 1350.5 (M H)+. 1H RMN (DMSOde, 400 MHz) 510.02 (s, 1H), 9.58 (s, 1H), 8.13 (d,J =7.6 Hz, 1H), 7.88 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.61 (d,J =8.4 Hz, 2H), 7.36-7.30 (m, 5H), 7.11 (t,J=4.8 Hz, 1H), 6.84-6.78 (m, 2H), 6.19­ 6.16 (m, 1H), 5.98 (t,J=5.2 Hz, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.23-5.06 (m, 4H), 4.80-4.67 (m, 3H), 4.39-4.31 (m, 2H), 4.23 (t,J=7.2 Hz, 1H), 4.02 (d,J=8.0 Hz, 2H), 3.64-3.55 (m, 2H), 3.49 (m, 12H), 3.42-3.27 (m, 3H), 3.13- 2.89 (m, 4H), 2.41-2.12 (m, 9H), 2.03-1.95 (m, 2H), 1.91-1.82 (m, 2H), 1.75-1.68 (m, 1H), 1.61-1.20 (m, 16H), 1.15-0.95 (m, 2H), 0.92-0.81 (m, 15H) ppm. HPLC Anal.: 69%+31%=100%, Tiempo de retención: 8.86 min y 8.92 min (método B).
[2529] Ejemplo 43
[2531] El ejemplo demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador LP7. El siguiente ejemplo se refiere a la FIG. 16.
[2533] (Biciclo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetil A/-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R, 6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9.13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo [10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}-3,6,9,12-tetraoxatetradecan-1-il)carbamato (LP7)
[2535] Se obtuvo LP7 (24 mg, 31 % de rendimiento en 3 pasos desde 34a) como un sólido blanco de acuerdo con el Procedimiento general F. ESI m/z: 1115 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) (rotámeros) 59.78 (s, 0.5H), 9.69 (s, 0.5H), 8.40 (d,J= 7.5 Hz, 0.5H), 8.15 (d,J= 7.0 Hz, 0.5H), 8.01 (d,J= 8.0 Hz, 0.5H), 7.89 (d,J= 9.0 Hz, 0.5H), 7.57 (d,J= 9.0 Hz, 1H), 7.51 (d,J= 9.0 Hz, 1H), 7.32 (d,J= 10.1 Hz, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.85 (d,J= 9.1 Hz, 2H), 6.18 (d,J= 11.4 Hz, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.10 (d,J= 18.5 Hz, 1H), 4.86-4.67 (m, 4H), 4.45-4.36 (m, 1H), 4.33 (s, 1H), 4.20 (t,J =7.5 Hz, 0.5H), 4.10 (t,J= 7.8 Hz, 0.5H), 4.03 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 3.59 (d,J= 6.6 Hz, 2H), 3.49-3.45 (m, 11H), 3.39 (s, 2H), 3.30 (s, 2H), 3.11 (dd,J= 11.4, 5.9 Hz, 2H), 2.47-2.43 (m, 1H), 2.38­ 2.12 (m, 8H), 2.03-1.83 (s, 5H), 1.62-1.51 (m, 6H), 1.42-1.24 (m, 10H), 1.02-0.94 (m, 2H), 0.90-0.82 (m, 14H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 9.47 min (método A).
[2537] Ejemplo 44
[2539] El ejemplo también demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador (LP7). El siguiente ejemplo se refiere a la FIG. 26. Se utilizaron las siguientes condiciones de reacción:
[2541]
[2544] A una solución de ácido (VI-8) (1,0-2,5 equiv.) en DMF (o DCM/DMF) se añadieron DIPEA (1,5-10 equiv.) y HATU (2,5-4,0 equiv.) a temperatura ambiente sucesivamente. La mezcla resultante se agitó a esta temperatura durante 0,5-1 hora antes de añadir la amina (26b) (1.0 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 a 16 horas hasta que la amina se consumió totalmente, según se monitorizó mediante LCMS. La mezcla de reacción se filtró a través de una membrana y el filtrado se concentró y luego se separó por HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto de ejemplo LP7 (rendimiento del 20-69%) como un sólido blanco.
[2546] 1-(4-{2-azatriciclo[10.4.0.049]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-W-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]carbamoil}-2-metilpropil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (LP7)
[2547]
[2549] ESI m/z: 1227.6 (
[2550] 1H RMN (500 MHz, DMSOde) (rotámeros)59.79 (s, 0.5H), 9.70 (s, 0.5H), 8.41 (d,J= 7.5 Hz, 0.5H), 8.17 (d,J= 7.0 Hz, 0.5H), 8.02 (d,J= 8.0 Hz, 0.5H), 7.89 (d,J= 8.6 Hz, 0.5H), 7.77 (t,J= 4.8 Hz, 1H), 7.68 (d,J =7.3 Hz, 1H), 7.62 (d,J= 7.3 Hz, 1H), 7.58 (d,J= 9.0 Hz, 1H), 7.53-7.43 (m, 4H), 7.40-7.28 (m, 4H), 6.88-6.82 (m, 2H), 6.18 (d,J= 9.1 Hz, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.10 (d,J =18.4 Hz, 1H), 5.03 (d,J= 14.0 Hz, 1H), 4.83-4.67 (m, 4H), 4.45-4.29 (m, 2H), 4.23-4.17 (m, 0.5H), 4.11 (t,J= 7.7 Hz, 0.5H), 3.64-3.40 (m, 15H), 3.31-3.26 (m, 2H), 3.13-3.03 (m, 2H), 2.65-2.52 (m, 2H), 2.47-1.26 (m, 24H), 1.06-0.93 (m, 2H), 0.90-0.80 (m, 12H) ppm.
[2551] HPLC Anal.: 99%, Tiempo de retención: 8.55 min (método B).
[2552] Solubilidad: <0.1 mg/mL de agua; 0.06 mg/mL de DMSO al 20 % en agua; 0.07 mg/mL de DMSO al 30 % en agua.
[2553] Ejemplo 45
[2554] Este ejemplo demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador (LP15). El siguiente ejemplo se refiere a lasFig S.27-28. Obsérvese que en la FIG. 27, el compuesto 11b es idéntico al compuesto 11-5 en la FIG. 2. Paso 1: Elaboración del compuesto (13b), con referencia a la FIG. 27.
[2555] A una solución de ácido Fmoc-Val-Ala-OH (12b) en DMF, se añadieron HATU (1,0-2,8 equiv.) y TEA (2,0-5,0 equiv.) a 25 °C. Tras agitar la mezcla a 25 °C durante 30 minutos, se añadió una solución de amina (11b,es decir,carga útil, 1.0 equiv.) en DMF (1 mL) se añadió mediante jeringa. La mezcla resultante se agitó a 25 °C durante 2-24 horas hasta que la amina se consumió casi por completo según LCMS. Luego se añadió a la mezcla piperidina o dietilamina (exceso) y la mezcla se agitó a 25 °C durante 1-16 horas hasta que se eliminó totalmente el Fmoc, según se monitorizó mediante LCMS. La mezcla de reacción se filtró a través de una membrana y el filtrado se concentró y se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) o cromatografía instantánea en fase reversa para dar el compuesto 13b (rendimiento del 23-64%) como un sólido blanco. En concreto, se utilizaron las siguientes condiciones:
[2557]
[2560] Paso 2: Elaboración del compuesto (17a), con referencia a la FIG. 27.
[2561] A una solución del compuesto 13b En DMF se añadieron HATU (1,0-2,8 equiv.) y DIPEA o TEA (2,0-5,0 equiv.) a 25 °C. Tras agitar la mezcla a 25 °C durante 30 minutos, se añadió una solución de Fmoc-Lys-(PEG)4-COT (13c, 1.0 equiv.) en DMF (1 mL) mediante jeringa. La mezcla resultante se agitó a 25 °C durante 2-24 horas hasta que la amina (13b) se consumió mayoritariamente según LCMS. Luego se añadió a la mezcla piperidina o dietilamina (exceso) y la mezcla se agitó a 25 °C durante 1-16 horas hasta que se eliminó totalmente el Fmoc, según se monitorizó mediante LCMS. La mezcla de reacción se filtró a través de una membrana y el filtrado se concentró y se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) o cromatografía instantánea en fase reversa para dar el compuesto (17a) (rendimiento del 23-64%) como un sólido blanco.
[2562] Paso 3: Elaboración del compuesto (27b), con referencia a la FIG. 27.
[2563] A una solución de alquino (17a) (1.0 equiv.) en DMF o DMSO se añadió a-ciclodextrina-azida (16a)(V e rSynth. Commun., 2002, 32(21), 3367-3372; J. Am. Chem. Soc., 2012, 134(46), 19108-19117; J. Med. Chem., 1997,40(17), 2755-2761; J. Am. Chem. Soc., 1993, 115(12), 5035-5040) (1.5-3.0 equiv.). Luego, la mezcla resultante se agitó a 20-30 °C durante 16 horas a 3 días hasta que el compuesto 16a se consumió en su mayor parte y se detectó la masa intermedia deseada, según se monitorizó mediante LCMS. Después de la filtración, la mezcla resultante se purificó directamente mediante HPLC preparativa (o se usó directamente) para dar el compuesto. 27b (rendimiento del 25-58%) como un sólido blanco (con regioisómeros de triazol). En concreto, se utilizaron las siguientes condiciones:
[2565]
[2568] Paso 4: Elaboración del compuesto (LP15), con referencia a la FIG. 28.
[2570] Se utilizaron las siguientes condiciones de reacción:
[2572]
[2575] A una solución de ácido (VI-8) (1,0-2,5 equiv.) en DMF (o DCM/DMF) se añadieron DIPEA (1,5-10 equiv.) y HATU (2,5-4,0 equiv.) a temperatura ambiente sucesivamente. La mezcla resultante se agitó a esta temperatura durante 0,5-1 hora antes de añadir la amina (27b) (1.0 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2-16 horas hasta que la amina (27b) se consumió en su totalidad, según lo monitorizado por LCMS. La mezcla de reacción se filtró a través de una membrana, el filtrado se concentró y luego se separó por HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto de ejemplo (rendimiento del 20-69 %) como un sólido blanco.
[2577] 1-(4-{2-Azatric¡clo[10.4.0.04’9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-¡n-2-¡l}-4-oxobutanam¡do)-W-[(1R)-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecahidroxi-10,15,20,25,30-pentakis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-dodecaoxaheptaciclo[26.2.2.23,6.2811.213,16.21821.22326]dotetracontan-5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-cicloocta[d][1,2,3]triazol-4-il)oxi]acetamido}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}pentil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (LP15)
[2580]
[2583] ESI m/z: 1259.1 (M/2 H)+.
[2584] 1H RMN (500 MHz, DMSOde) (rotámeros)59.84 (s, 1H), 8.34 (s, 0.5H), 8.15 (d,J =7.3 Hz, 1H), 8.04 (d,J =6.6 Hz, 1H), 7.90-7.84 (m, 1H), 7.81-7.74 (m, 1.5H), 7.72-7.56 (m, 4H), 7.56-7.27 (m, 11H), 6.89-6.79 (m, 2H), 6.17 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.64-5.44 (m, 12H), 5.24-5.00 (m, 5H), 4.86-4.51 (m, 16H), 4.40-4.16 (m, 5H), 4.05-3.96 (m, 1H), 3.86-3.73 (m, 10H), 3.67-2.88 (m, 35H), 2.80-2.69 (m, 1H), 2.62-2.55 (m, 1H), 2.41­ 2.20 (m, 6H), 2.10-1.71 (m, 10H), 1.66-1.07 (m, 26H), 1.05-0.79 (m, 17H) ppm.
[2586] HPLC Anal.: 97%, Tiempo de retención: 6.62 y 6.67 min (método B). Los tiempos de retención corresponden a dos regioisómeros de triazol.
[2588] Ejemplo 46
[2590] Este ejemplo demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador (LP16). El siguiente ejemplo se refiere a las FIGS. 27-28. El método para fabricar LP16 fue el mismo que el método para fabricar LP15, en el Ejemplo 45 del presente documento, excepto que se utilizó una carga útil diferente, como se muestra en las FIG<s>.27­ 28. Se utilizaron las siguientes condiciones de reacción:
[2593]
[2596] A una solución de ácido VI-8 (1,0-2,5 equiv.) en DMF (o DCM/DMF) se añadieron DIPEA (1,5-10 equiv.) y HATU (2,5-4,0 equiv.) a temperatura ambiente sucesivamente. La mezcla resultante se agitó a esta temperatura durante 0,5-1 hora antes de añadir la amina (27b) (1.0 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2-16 horas hasta que la amina (27b) se consumió en su totalidad, según lo monitorizado por LCMS. La mezcla de reacción se filtró a través de una membrana y el filtrado se concentró y luego se separó por HPLC preparativa (método B) para dar el compuesto de ejemplo (rendimiento del 20-69 %) como un sólido blanco.
[2598] 1-(4-{2-Azatric¡clo[10.4.0.04’9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-¡n-2-¡l}-4-oxobutanam¡do)-W-[(1R)-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecahidroxi-10,15,20,25,30-pentakis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-dodecaoxaheptaciclo[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.22326]dotetracontan-5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-cicloocta[d][1,2,3]triazol-4-il)oxi]acetamido}-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}pentil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (LP16)
[2600]
[2603] 1H RMN (500 MHz, DMSOde) (con regioisómero de triazol)59.77-9.42 (m, 1H), 8.27-8.20 (m, 0.5H), 8.17-8.01 (m, 2H), 7.86-7.74 (m, 2.5H), 7.70-7.60 (m, 4H), 7.57-7.43 (m, 7H), 7.39-7.28 (m, 6H), 6.88-6.81 (m, 2H), 6.21­ 6.14 (m, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.61-5.42 (m, 10H), 5.16-4.97 (m, 4H), 4.89-4.48 (m, 17H), 4.40-4.28 (m, 4H), 4.16 4.10 (m, 1H), 4.04-3.94 (m, 1H), 3.83-3.74 (m, 7H), 3.65-3.56 (m, 9H), 3.48-3.21 (m, 23H), 3.15-3.06 (m, 4H), 2.97-2.89 (m, 1H), 2.81-2.69 (m, 1H), 2.61-2.53 (m, 2H), 2.40-2.20 (m, 6H), 2.14-2.06 (m, 2H), 2.03-1.95 (m, 4H), 1.91-1.70 (m, 5H), 1.64-1.52 (m, 9H), 1.49-1.25 (m, 14H), 1.13-0.81 (m, 19H) ppm.
[2605] HPLC Anal.: 98%, Tiempo de retención: 6.61 (59%) y 6.73 (39%) min (método B). Los tiempos de retención corresponden a dos regioisómeros de triazol.
[2607] Solubilidad: 0.1 mg/mL de DMSO al 10% en agua.
[2609] Ejemplo 47
[2611] El ejemplo demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador (LP8). El siguiente ejemplo se refiere a la FIG. 16.
[2613] (2S)-2-[(2S)-2-Amino-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)-W-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapenta ciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)pentanamida (34h)
[2615] El compuesto (34h) como un sólido blanco se preparó de acuerdo con el Procedimiento general C después de la purificación por HPLC preparativa (método B). ESI m/z: 778 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 59.97 (d,J= 12.0 Hz, 1H), 8.10 (m, 1H), 7.51 (d,J= 6.5 Hz, 2H), 7.32 (dd,J =10.1, 2.5 Hz, 1H), 6.83 (dd,J= 15.9, 9.0 Hz, 2H), 6.17 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 5.97 (t,J= 5.0 Hz ,1H), 5.93 (s, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.22 (t,J= 4.8 Hz, 1H), 5.12 (d,J= 6.0 Hz, 1H), 5.09 (d,J= 6.5 Hz, 1H), 4.83-4.67 (m, 3H), 4.47-4.37 (m, 1H), 4.35-4.29 (m, 1H), 3.05-2.90 (m, 3H), 2.57-2.51(m, 1H), 2.30 (d,J= 12.0 Hz, 1H), 2.13-1.74 (m, 7H), 1.70- 1.46 (m, 7H), 1.45-1.29 (m, 7H), 1.17-0.93 (m, 2H), 0.91-0.82 (m, 9H), 0.77 (dd,J= 6.7, 2.7 Hz, 3H) ppm.
[2617] 1-(4-{2-Azatriciclo[10.4.049]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]carbamoil}-2-metilpropil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (LP8)
[2619] El compuesto LP8 (25 mg, 20% de rendimiento) se obtuvo como un sólido blanco de acuerdo con el Procedimiento general F. ESI m/z: 1263 (M/+H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOde) 5 9.79 (s, 0.7H), 9.69 (s, 0.3H),8.41 (d,J= 8.0 Hz, 0.3H), 8.16 (d,J= 8.0 Hz, 0.7H), 8.01 (d,J= 7.6 Hz, 0.3H), 7.89 (d,J= 7.6 Hz, 0.7H), 7.77 (t,J= 5.2 Hz, 1H), 7.70-7.66 (m, 1H), 7.64-7.60 (m, 1H), 7.60-7.54 (m, 1H), 7.54-7.44 (m, 4H), 7.40-7.24 (m, 4H), 6.90-6.82 (m, 2H), 6.30 (dd,J=10 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 5.72-5.55 (m, 1H), 5.52-5.48 (m, 1H), 5.16-5.08 (m, 1H), 5.06-5.00 (m, 1H), 4.88-4.80 (m, 1H), 4.80-4.76 (m, 1H), 4.74 (t,J=4.0 Hz, 1H), 4.42-4.33 (m, 1H), 4.26-4.06 (m, 2H), 3.64-3.54 (m, 3H), 3.50-3.40 (m, 12H), 3.12-3.02 (m, 2H), 2.70-2.55 (m, 2H), 2.40­ 2.20 (m, 4H), 2.12-1.90 (m, 4H), 1.86-1.70 (m, 2H), 1.64-1.54 (m, 4H), 1.49 (s, 4H), 1.46-1.34 (m, 3H), 1.29 (d,J= 6.8 Hz, 3h ), 0.90-0.80 (m, 13H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 8.26 min (método B).
[2620] Ejemplo 48
[2622] El ejemplo demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador (LP9). El siguiente ejemplo se refiere a la FIG. 16.
[2624] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-Azatriciclo[10.4.0.049]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13, 15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3-metil butanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil} metil W-(4-{2-[(1 S,2S,4R,8S,9S,11 S, 12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11 -hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapenta ciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamato (LP9)
[2626] El compuesto (34i) como un sólido blanco se preparó de acuerdo con el Procedimiento general D.
[2628] El compuesto LP9 (20 mg, rendimiento del 22%) se obtuvo de acuerdo con el Procedimiento general F. ESI m/z: 1499 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOde) 510.02 (s, 1H), 9.59 (s, 1H),8.14 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 7.88 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.80-7.75 (m, 1H), 7.70-7.66 (m, 1H), 7.65-7.60 (m, 3H), 7.53-7.45 (m, 3H), 7.40-7.28 (m, 7H), 6.84 (d,J=9.2 Hz, 2H), 6.30 (dd,J= 10.4 Hz,J =1.6 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 6.10-6.0 (m, 1H), 5.72-5.55 (m,1H), 5.52 (s, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.16-5.05 (m, 4H), 4.88-4.70 (m, 3H), 4.43-4.33 (m, 1H), 4.25-4.20 (m, 2H), 3.65-3.55 (m, 3H), 3.50-3.40 (m, 12H), 3.30-3.25 (m, 2H), 3.12-2.90 (m, 4H), 2.70-2.55 (m, 2H), 2.48-2.43 (m, 1H), 2.40­ 2.35 (m, 1H), 2.30-2.20 (m, 2H), 2.15-1.95 (m, 4H), 1.86-1.75 (m, 2H), 1.64-1.54 (m, 5H), 1.49 (s, 4H), 1.46­ 1.34 (m, 4H), 1.23 (s, 2h ), 0.90-0.80 (m, 12H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 7.83 min (método B).
[2630] Ejemplo 49
[2632] El ejemplo demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador (LP10). El siguiente ejemplo se refiere a la FIG. 16.
[2633] (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-Am¡noacet¡l)-12,19-d¡fluoro-11-h¡drox¡-9,13-d¡met¡l-6-prop¡l-5,7-d¡oxapentac¡clo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]¡cosa-14,17-d¡en-16-ona (34j)
[2635] El compuesto 34j (80 mg, 64% de rend¡m¡ento) se obtuvo a part¡r del compuesto 11-19 de acuerdo con el Proced¡m¡ento general D. ESI m/z: 871 (M H)+.
[2637] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-Azatr¡c¡clo[10.4.0.04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13, 15-hexaen-10-¡n-2-¡l}-4-oxobutanam¡do)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-am¡do]-3-met¡l butanam¡do]-5-(carbamo¡lam¡no)pentanam¡do]fen¡l}met¡l A/-(4-{2-[(1 S,2S,4R,8S,9S,11 S, 12R,13S,19S)-12,19-d¡fluoro-11 -h¡drox¡-9,13-d¡met¡l-16-oxo-6-prop¡l-5,7-d¡oxapenta c¡clo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]¡cosa-14,17-d¡en-8-¡l]-2-oxoetox¡}fen¡l)carbamato (LP10)
[2639] S¡gu¡endo el Proced¡m¡ento general F, el compuesto (LP10) (20 mg, rend¡m¡ento del 22%) se obtuvo a part¡r de la reacc¡ón de 34j (43 mg, 50 pmol) con DIBAC-suc-PEG4-NHS éster (VI), después de la pur¡f¡cac¡ón por HPLC preparat¡va (método B). ESI m/z: 1406 (M+H)+. 1H RMN (DMSOd6, 500 MHz) 59.99 (s, 1H), 8.11 (d,J= 7.5 Hz, 1H), 7.88 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 7.80-7.75 (m, 1H), 7.70-7.66 (m, 1H), 7.65-7.60 (m, 3H), 7.53-7.33 (m, 6H), 7.33­ 7.28 (m, 3H), 6.30 (dd,J= 10.0 Hz y 1.5 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 6.10-6.00 (m, 1H), 5.72-5.55 (m, 2H), 5.41 (s, 2H), 5.05-5.01 (m, 1H), 4.97 (s, 2H), 4.80-4.72 (m, 1H), 4.60-4.58 (m, 1H), 4.43-4.33 (m, 1H), 4.25-4.10 (m, 3H), 3.88-3.80 (m, 1H), 3.65-3.55 (m, 3H), 3.50-3.40 (m, 12H), 3.30-3.25 (m, 2H), 3.12-2.90 (m, 4H), 2.70-2.55 (m, 2H), 2.48-2.35 (m, 2H), 2.30-2.20 (m, 2H), 2.15-1.95 (m, 4H), 1.86-1.65 (m, 3H), 1.64-1.54 (m, 5H), 1.49 (s, 4<h>), 1.46-1.34 (m, 5H), 0.90-0.80 (m, 12H) ppm. HPLC Anal.: 100%, T¡empo de retenc¡ón: 7.40 m¡n (método B).
[2641] Ejemplo 50
[2643] El ejemplo demuestra un método para crear la Carga út¡l del Enlazador LP11. El s¡gu¡ente ejemplo se ref¡ere a la FIG. 16.
[2645] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-Azatr¡c¡clo[10.4.0.049]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-¡n-2-¡l}-4-oxobutanam¡do)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-am¡do]-3-met¡lbutanam¡do]-5-(carbamo¡lam¡no)pentanam¡do]fen¡l}met¡l N-[(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-d¡fluoro-11-h¡drox¡-9,13-d¡met¡l-16-oxo-6-prop¡l-5,7-d¡oxapentac¡do[10.8.0.029.048.01318]¡cosa-14,17-d¡en-8-¡l]-2-oxoetox¡}fen¡l)met¡l]carbamato (LP11)
[2647] El compuesto 34k (80 mg, 64% de rend¡m¡ento) se obtuvo de (11-15) de acuerdo con el Proced¡m¡ento general D.
[2649] S¡gu¡endo el Proced¡m¡ento general F, el compuesto (LP11) (18 mg, 31% de rend¡m¡ento) como un sól¡do blanco se obtuvo a part¡r de la reacc¡ón del compuesto (34k) y DIBAC-suc-PEG4-NHS éster (VI). ESI m/z: 756.5 (M/2 H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 510.02 (s, 1H), 8.14 (d,J =8.0 Hz, 1H), 7.88 (d,J= 8.0 Hz, 1H), 7.76(t,J= 5.5 Hz, 1H), 7.72(t,J= 5.5 Hz, 1H), 7.70-7.66 (m, 1H), 7.65-7.60 (m, 3H), 7.53-7.45 (m, 3H), 7.40-7.31 (m, 2H), 7.31-7.25 (m, 4H), 7.20-7.15 (m, 2H), 6.86-6.80 (m, 2H), 6.30 (dd,J= 10.4Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 6.10-6.00 (m, 1H), 5.72-5.55 (m, 1H), 5.52 (s, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.16-5.10 (m, 1H), 5.06-5.00 (m, 1H), 5.00-4.93 (m, 2H), 4.90-4.76 (m, 2H), 4.75 (t,J =4.0 Hz, 1H), 4.43-4.33 (m, 1H), 4.25-4.20 (m, 2H), 4.12 (d,J= 6.0 Hz, 2H), 3.65-3.55 (m, 3H), 3.50-3.40 (m, 12H), 3.30-3.25 (m, 2H), 3.12-2.90 (m, 4H), 2.70-2.55 (m, 2H), 2.48-2.43 (m, 1H), 2.40-2.35 (m, 1H), 2.30-2.20 (m, 2H), 2.15-1.95 (m, 4H), 1.86-1.70 (m, 3H), 1.64-1.54 (m, 5H), 1.49 (s, 4<h>), 1.46-1.34 (m, 4<h>), 0.90-0.80 (m, 12H) ppm. HPLC Anal.: 99%, T¡empo de retenc¡ón: 7.89 m¡n (método B).
[2651] Ejemplo 51
[2653] El ejemplo demuestra un método para crear la Carga út¡l del Enlazador LP12. El s¡gu¡ente ejemplo se ref¡ere a la FIG. 17.
[2655] [(2R,3R,4S,5R,6S)-3,4,5-Tr¡s(acet¡lox¡)-6-[4-form¡l-3-(prop-2-¡n-1-¡lox¡)fenox¡]oxan-2-¡l]met¡l acetato (45)
[2656] Paso 1: La síntes¡s de [(2R,3R,4S,5R,6S)-3,4,5-Tr¡s(acet¡lox¡)-6-(4-form¡l-3-h¡drox¡fenox¡)oxan-2-¡l]met¡l acetato (43) se ¡nformó en Carbohydrate Research, 1986, 146, 241-249. A una soluc¡ón del compuesto ¡ntermed¡o 43 (2.8 g, 6.0 mmol) en acetona (40 mL) se añad¡ó s¡multáneamente carbonato de potas¡o (1.7 g, 12 mmol) y 3-bromoprop-1-¡no (44, 3.5 g, 30 mmol) y la mezcla resultante se somet¡ó a reflujo durante la noche. Luego se concentró la mezcla al vacío y el res¡duo se pur¡f¡có por cromatografía ¡nstantánea (0-33% de acetato de et¡lo en éter de petróleo) para obtener el compuesto 45 (1.9 g, rend¡m¡ento 63%) como un sól¡do marrón. ESI m/z: 507 (M H)+. 1H RMN (MeODdd, 500 MHz) 510.26 (s, 1H), 7.78 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 6.87 (d,J= 2.0 Hz, 1H), 6.77 (dd,J= 8.5, 2.0 Hz, 1H), 5.51 (d,J= 8.0 Hz, 1H), 5.41 (t,J= 9.5 Hz, 1H), 4.93 (t,J= 2.5 Hz, 2H), 5.23­ 5.19 (m, 1H), 5.14 (t,J= 9.5 Hz, 1H), 4.34-4.30 (m, 1H), 4.22-4.15 (m, 2H), 3.11 (t,J =2.0 Hz, 1H), 2.05-1.99 (m, 12H) ppm. [(2R,3R,4S,5R,6S)-3,4,5-Tr¡s(acet¡lox¡)-6-[4-(h¡drox¡met¡l)-3-(prop-2-¡n-1-¡lox¡)fenox¡]oxan-2-¡l]met¡l acetato (46)
[2657] Paso 2: A una solución del compuesto 45 (0.83 g, 1.6 mmol) en isopropanol (50 mL) se añadió borohidruro de sodio (31 mg, 0.82 mmol). La mezcla se agitó a 23°C durante 2 horas y luego se concentró al vacío. El residuo se diluyó con acetato de etilo y se lavó con salmuera. La solución orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para obtener el compuesto 46 (0.70 g, rendimiento 84%) como aceite marrón. ESI m/z: 526.1 (M H2O)+. 1H RMN (MeODd4, 500 MHz) 57.32 (d,J= 8.0 Hz, 1H), 6.78 (d,J= 2.0 Hz, 1H), 6.67 (dd,J= 8.0, 2.0 Hz, 1H), 5.40 (t,J= 9.0 Hz, 1H), 5.33 (dd,J= 7.5 Hz, 1H), 5.20-5.11 (m, 2H), 4.78 (t,J= 2.5 Hz, 2H), 4.59 (s, 2H), 4.32 (d,J= 12.5, 5.0 Hz, 1H), 4.21 (dd,J= 12.5, 2.5 Hz, 1H), 4.12-4.08 (m, 1H), 3.02 (t,J= 2.0 Hz, 1H), 2.07-2.0
[2659] [(2R,3R,4S,5R,6S)-3,4,5-Tris(acetiloxi)-6-(4-{[(4-nitrofenoxicarbonil) oxi]metil}-3-(prop-2-in-1-iloxi)fenoxi)oxan-2-il]metil acetato (48)
[2661] Paso 3: A una solución del compuesto 46 (0.40 g, 0.79 mmol) en cloruro de metileno (30 mL) se añadió carbonocloridato de 4-nitrofenilo (47, 0.24 g, 1.2 mmol), 4-dimetilaminopiridina (0.19 g, 1.6 mmol) y diisopropiletilamina (0.20 g, 1.6 mmol). La mezcla se agitó a 23 °C durante la noche y se diluyó con cloruro de metileno (50 mL). La solución orgánica se lavó con solución acuosa saturada de cloruro de amonio (50 mL) y luego con salmuera (50 mL), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (0-33 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para obtener el compuesto 48 (0.30 g, rendimiento 57%) como un sólido blanquecino. ESI m/z: 691.0 (M H2O)+. 1H RMN (CDCh, 500 MHz)58.27 (d,J= 9.0 Hz, 2H), 7.38 (d,J= 9.0 Hz, 2H), 7.35 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 6.75 (d,J= 2.5 Hz, 1H), 6.64 (dd,J= 9.0, 2.5 Hz, 1H), 5.33-5.26 (m, 4H), 5.21-5.17 (m, 1H), 4.76 (t,J= 2.0 Hz, 2H), 4.28 (dd,J =12.5, 5.0 Hz, 1H), 4.20 (dd,J=12.5, 2.5 Hz, 1H), 3.89-3.88 (m, 1H), 2.56 (t,J =7.0 Hz, 1H), 2.08-2.04 (m, 12H) ppm.
[2663] [(2R,3R,4S,5R,6S)-3,4,5-Tris(acetiloxi)-6-[4-({[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.002,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]oxi}metil)-3-(prop-2-in-1-iloxi)fenoxi]oxan-2-il]metil acetato (49)
[2665] Paso 4: A una solución del compuesto 48 (0.15 g, 0.22 mmol) en DMF (5 mL) se añadieron 11-5 (0.14 g, 0.26 mmol), HOBt (59 mg, 0.44 mmol) y diisopropiletilamina (57 mg, 0.44 mmol) sucesivamente. La mezcla se agitó a 23 °C durante la noche y luego se purificó mediante HPLC preparativa (método B) para obtener el compuesto.
[2666] 49 (0.14 g, rendimiento del 62 %) como un sólido blanco. ESI m/z: 1056.3 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 400 MHz) 87.46 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 7.35-7.26 (m, 3H), 6.87-6.80 (m, 3H), 6.67 (dd, J = 8.0, 2.4 Hz, 1H), 6.26 (dt, J = 10.0, 2.4 Hz, 1H), 6.03 (br s, 1H), 5.42-5.34 (m, 2.5H), 5.26-5.03 (m, 5.5H), 4.88-4.64 (m, 4H), 4.46-4.43 (m, 1H), 4.34-4.30 (m, 1H), 4.21-4.18 (m, 1H), 4.12-4.08 (m, 1H), 3.03 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 2.71-2.62 (m, 1H), 2.41-2.38 (m, 1H), 2.28-2.15 (m, 2H), 2.06-2.04 (m, 12H), 1.90-1.39 (m, 12H), 1.20-0.89 (m, 8H) ppm.
[2668] [2-(Prop-2-in-1-iloxi)-4-{[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroxi-6-(hidroximetil)oxan-2-il]oxi}fenil]metil N-(4-{2-[(1S,2S,4S,8R,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-4,9,13-trimetil-16-oxo-6-propil-7-oxapentaciclo[10.8.
[2669] 002,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamato (LP12)
[2671] Paso 5: A una solución del compuesto 49 (35 mg, 33 pmol) en metanol (3 mL) se añadió otra solución de LiOH en H2O (14 mg, 0.33 mmol) en agua (1 mL). La mezcla se agitó a 23 °C durante 1.5 horas y se inactivó con HOAc (20 mg). La mezcla se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa (método B) para obtener la carga útil del enlazador. LP12 (26 mg, rendimiento del 88 %) como un sólido blanco. ESI m/z: 888 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 400 MHz) 87.46 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 7.35-7.30 (m, 3H), 6.91 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.87-6.83 (m, 2H), 6.74 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 6.27 (dt, J = 10.0, 2.0 Hz, 1H), 6.03 (s, 1H), 5.25 (t, J = 4.8 Hz, 0.5H), 5.19 (d, J = 7.2 Hz, 0.5H), 5.13-5.03 (m, 3H), 4.94-4.91 (m, 1H), 4.82-4.75 (m, 3H), 4.71­ 4.67 (m, 1H), 4.46-4.43 (m, 1H), 3.91 (dd, J = 12.0, 2.0 Hz, 1H), 3.70 (dd, J = 12.0, 5.2 Hz, 1H), 3.48-3.36 (m, 4H), 2.99 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 2.71-2.62 (m, 1H), 2.40-2.37 (m, 1H), 2.26-2.12 (m, 2H), 2.07-2.00 (m, 1H), 1.88­ 1.61 (m, 5H), 1.56-1.35 (m, 6H), 1.20-0.92 (m, 8H) ppm.
[2673] Ejemplo 52
[2675] El ejemplo demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador LP13. El siguiente ejemplo se refiere a la FIG. 18.
[2677] 2-[(1S,2S,4S,8S,9S,11S,12S,13R)-11 -hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil N-(2-{[({4-[(2S)-5-(carbamoilamino)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-il)hexanamido]-3-metilbutanamido]pentanamido]fenil}metoxi)carbonil] (metil)amino}etil)-N-metilcarbamato (LP13)
[2679] A una solución de carbonato de budesonida-DME (20 mg, 0.037 mmol) en DMF (1 ml) se añadió posteriormente MC-VC-PAB-PNP (22 mg, 0.03 mmol), DIPEA (12 mg, 0.09 mmol) y HoBt (6 mg, 0.05 mmol). Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas, luego se realizó una HPLC preparativa para obtener dos epímeros: Epímero 1: 3.3 mg (rendimiento 10%) y Epímero 2: 4.1 mg (rendimiento 12%).
[2681] Epímero 1: ESI m/z: 1143.4 (M+1). 1H RMN (400 MHz, MeOD) 87.63-7.62 (m, 2H), 7.50-7.49 (m, 1H), 7.37­ 7.35 (m, 2H), 6.81 (s, 1H), 6.29-6.27 (m, 1H), 6.03 (brs, 1H), 5.37-5.08 (m, 5H), 4.83-4.79 (m, 3H), 4.53-4.46 (m, 2H), 4.18-4.15 (m, 1H), 3.69-3.37 (m, 6H), 3.25-3.13 (m, 3H), 3.12-2.96 (m
2.90-2.86 (m, 2H), 2.68­ 2.64 (m, 1H), 2.41-2.40 (m, 1H), 2.31-2.28 (m,
2H), 2.26-1.95 (m, 7H), 1.93-1.77 (m, 11H), 1.51 (s, 3H), 1.42­ 1.30 (m, 10H), 1.25-0.89 (m, 15H)
[2682] Epímero 2: ESI m/z: 1143.4 (M+1). 1H RMN (400 MHz, MeOD) 87.62-7.34 (m, 5H), 6.81 (brs, 1H), 6.29-6.23
[2683] (m, 1H), 6.05-6.00 (m, 1H), 5.27-5.17 (m, 4H), 4.92-4.79 (m, 2H), 3.75-3.37 (m, 7H), 3.03-2.86 (m, 5H), 2.72­ 2.63 (m, 1H), 2.41-2.28 (m, 3H), 2.23-2.04 (m, 7H), 1.91-1.32 (m, 31H), 1.19-0.90 (m, 14H).
[2684] Ejemplo 53
[2685] El ejemplo demuestra un método para crear la Carga útil del Enlazador LP14. El siguiente ejemplo se refiere a la FIG. 18.
[2686] W-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]carbamoil}-2-metilpropil]-1-{2-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-il)fenil]acetamido}-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (LP14)
[2687] El compuesto 34h-2 (0.18 g, rendimiento del 74 % en 2 pasos) se obtuvo de acuerdo con el Procedimiento general F. ESI m/z: 728 (M H)+.
[2688] El compuesto LP14 (20 mg, 14 % de rendimiento en 3 pasos desde 34h) se obtuvo como un sólido blanco. ESI:
[2689] 1189 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 59.81-9.67 (m, 1H), 8.43-8.13 (m, 2H), 8.03-7.84 (m, 1H), 7.61­ 7.47 (m, 2H), 7.35 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 7.29-7.21 (m, 3H), 7.17 (s, 2H), 6.88-6.81 (m, 2H), 6.33-6.28 (dd,J =10.1, 1.8 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 5.71-5.56 (m, 1H), 5.51 (s, 1H), 5.12 (d,J= 18.5 Hz, 1H), 4.84 (d,J= 18.5 Hz, 1H), 4.79-4.76 (m, 1H), 4.74 (t,J= 4.3 Hz, 2H), 4.38-4.33 (m, 1H), 4.25-4.17 (m, 2H), 3.63-3.55 (m, 2H), 3.52­ 3.44 (m, 14H), 3.42 (t,J= 5.8 Hz, 2H), 3.21 (q,J= 5.7 Hz, 1H), 2.69-2.55 (m, 1H), 2.47-2.41 (m, 1H), 2.41-2.34
[2690] (m, 1H), 2.29-2.23 (m, 1H), 2.14-2.02 (m, 2H), 1.99-1.90 (m, 1H), 1.82 (d,J=13.0 Hz, 1H), 1.65-1.53 (m, 4H),
[2691] 1.49 (s, 3H), 1.47-1.41 (m, 1H), 1.40-1.33 (m, 2H), 1.29 (d,J =7.1 Hz, 3H), 0.90-0.80 (m, 12H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 8.45 min (método A).
[2692] Tabla 7 A continuación se resumen algunas propiedades físicas de LP1-LP16.
[2693] Tabla 7: Propiedades físicas de ciertas cargas útiles del enlazador
[2695]
[2696]
[2699] Ejemplo 54
[2701] Este ejemplo demuestra un método para la conjugación específica del sitio, generalmente, de una carga útil a un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo. Este ejemplo se refiere a la FIG. 19.
[2703] En un ejemplo, se produjeron conjugados específicos del sitio a través de la conjugación de dos pasos con transglutaminasa microbiana (MTG EC 2.3.2.13, Zedira, Darmstadt, Alemania) (en adelante "basada en MTG") de un anticuerpo mutado N297Q o N297D. En el primer paso, el anticuerpo mutado se funcionalizó con azido-PEG.3-amina a través de una reacción enzimática basada en MTG. Véase, por ejemplo, la Solicitud de patente internacional PCT No. PCT/US17/19537, presentada el 24 de febrero de 2017, titulado OPTIMIZED TRANSGLUTAMINASE SITE-SPECIFIC ANTIBODY CONJUGATION. En el segundo paso, se unió una carga útil del enlazador funcionalizada con alquino al anticuerpo funcionalizado con azido mediante una reacción de 1,3 cicloadición-dipolar [2+3] (véase, por ejemplo, FIG. 19, que representa una carga útil del enlazador funcionalizada con DIBAc conjugada con un anticuerpo funcionalizado con azido derivado a través de la ciclización [2+3]). Este proceso proporcionó conjugados estequiométricos y específicos del sitio con un rendimiento aislado de aproximadamente el 50-80%.
[2705] Ejemplo 55
[2707] Este ejemplo demuestra procedimientos específicos para la conjugación específica del sitio de una carga útil del enlazador de alquino con un anticuerpo.
[2709] Este ejemplo se refiere a los compuestos representados en la FIG. 29.
[2711] En este ejemplo, los conjugados específicos del sitio se produjeron en dos pasos. El primer paso es la unión enzimática basada en la transglutaminasa microbiana (MTG) de una molécula pequeña, como la azida-PEG.3-amina (supra), al anticuerpo que tiene una etiqueta Q (referencias para la etiqueta Q) (en adelante conjugación "basada en MTG"). El segundo paso empleó la unión de una carga útil del enlazador al anticuerpo funcionalizado con azido a través de una cicloadición [2+3], por ejemplo, la 1,3 cicloadición-dipolar entre las azidas y las ciclooctinas (también conocida como química de clic sin cobre). Véase, Baskin, J. M.; Prescher, J. A.; Laughlin, S. T.; Agard, N. J.; Chang, P. V.; Miller, I. A.; Lo, A.; Codelli, J. A.; Bertozzi, C. R. PNAS 2007, 104 (43), 16793-7. Se muestra en la FIG. 28 un ejemplo de una carga útil del enlazador que tiene una fracción DIBAC conjugada con un anticuerpo funcionalizado con azido a través de una cicloadición [2+3]. Este proceso proporcionó conjugados estequiométricos y específicos del sitio con un rendimiento aislado de aproximadamente el 50-80%.
[2713] Conjugación de ADC mediante reacción de clic [2+3].
[2715] Paso 1: Preparación de un anticuerpo funcionalizado con azido.
[2717] El anticuerpo humano aglicosilado IgG (IgG1, IgG4, etc.) o un isotipo IgG1 humano con mutación N297Q, en PBS (pH 6,5-8,0) se mezcló con >200 equivalentes molares de azido-dPEG3-amina (MW= 218.26 g/mol). La solución resultante se mezcló con MTG (EC 2.3.2.13 de Zedira, Darmstadt, Alemania, o Modernist Pantry [L# 210115A] - ACTIVA TI contiene maltodextrina de Ajinomoto, Japón) (25 U/mL; 5 U MTG por mg de anticuerpo), lo que dio como resultado una concentración final del anticuerpo de 0,5-5 mg/mL, y luego la solución se incubó a 37 °C durante 4-24 h mientras se agitaba suavemente. La reacción se monitorizó mediante ESI-MS. Una vez finalizada la reacción, el exceso de amina y MTG se eliminaron mediante cromatografía en columna SEC o de proteína A, para generar el anticuerpo funcionalizado con azido. Este producto se caracterizó mediante SDS-PAGE y ESI-MS. El azido-dPEG3-amina añadida a dos sitios del anticuerpo, lo que da como resultado un aumento de 204 Da para el conjugado de anticuerpo 2DAR-PEG3-azida.
[2719] En un experimento específico, el anticuerpo de etiqueta Q N-terminal (24 mg) en 7 mL de tampón PBS sin potasio (pH 7.3) se incubó con > 200 equivalentes molares de azido-PEG.3-amina (PM 218.26) en presencia de MTG (0.350 mL, 35 U, mTGase, Zedira, Darmstadt, Alemania). La reacción se incubó a 37 °C durante la noche mientras se mezclaba suavemente. Se eliminaron el exceso de azido-PEG3-amina y la mTGasa mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, Superdex 200 PG, GE Healthcare).
[2721] Paso 2: Preparación de conjugados específicos del sitio de un fármaco con un anticuerpo mediante reacciones de química clic.
[2723] Los conjugados de anticuerpos específicos del sitio con una IgG humana (IgG1, IgG4, etc.) en la Tabla 10 se prepararon mediante una reacción de clic [2+3] entre anticuerpos funcionalizados con azido y una carga útil del enlazador que contenía alquino. A continuación se detalla el procedimiento de conjugación. Un conjugado de anticuerpo específico del sitio con carga útil del enlazador (LP) se preparó incubando mAb-PEG3-N3 (1-3 mg/mL) en un medio acuoso (por ejemplo, PBS, PBS que contiene 5% de glicerol, HBS) con >6 equivalentes molares de un LP disuelto en un disolvente orgánico adecuado, como DMSO, DMF o DMA (es decir, la mezcla de reacción contiene 5-20 % de disolvente orgánico, v/v) a 24 °C hasta 37 °C durante más de 6 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante ESI-MS y la ausencia de mAb-PEG3-N3 indicó la finalización de la conjugación. La cantidad excedente de la LP y el disolvente orgánico se eliminaron mediante SEC a través de elución con PBS, o mediante cromatografía en columna de proteína A mediante elución con tampón ácido seguido de neutralización con Tris (pH 8.0).
[2725] En un ejemplo específico, el anticuerpo funcionalizado con azido (1 mg) en 0.800 mL de PBSg (PBS, 5 % de glicerol, pH 7.4) se trató con seis equivalentes molares de DIBAC-PEG4-D-Lys (COT-rc-CD)-VC-PABC-carga útil (concentración 10 mg/mL en DMSO) durante 6-12 horas a temperatura ambiente y el exceso de carga útil del enlazador (LP) se eliminó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, Superdex 200 HR, GE Healthcare).
[2727] El producto final se concentró mediante ultracentrifugación y se caracterizó por UV, SEC, SDS-PAGE y ESI-MS.
[2729] Ejemplo 56
[2731] Este ejemplo demuestra un método para elaborar un conjugado de anticuerpo y fármaco funcionalizado con azido.
[2733] El anticuerpo aglicosilado con un isotipo IgG1 humano en BupH™ (pH 7,6-7,8) se mezcló con >200 equivalentes molares de azido-dPEG3-amina (MW. 218.26 g/mol). La solución resultante se mezcló con transglutaminasa (25 U/mL; 5 U MTG por mg de anticuerpo, Zedira, Darmstadt, Alemania), dando como resultado una concentración final del anticuerpo de 0,5-3 mg/mL, y luego la solución se incubó a 37 °C durante 4-24 horas mientras se agitaba suavemente. La reacción se monitorizó mediante SDS-PAGE o ESI-MS. Una vez finalizado, el exceso de amina y MTG se eliminaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (ver FIG. 21) para generar el anticuerpo funcionalizado con azido. Este producto fue analizado en SDS-PAGE (ver FIG. 20) y ESI-MS (ver FIG. 22). El azido-dPEG3-amina añadida a dos sitios - Q295 y Q297 - del anticuerpo, da como resultado un aumento de 804 Da para el conjugado de anticuerpo aglicosilado 4DAR-PEG3-azida. Los sitios de conjugación fueron identificados y confirmados en EEQEnlazadorYQEnlazadorSTYR para el anticuerpo funcionalizado con azido 4DAR a través del mapeo de secuencias de péptidos de cadenas pesadas digeridas con tripsina.
[2735] Ejemplo 57
[2737] Este ejemplo demuestra un método para realizar conjugaciones de sitio específico de un fármaco con un anticuerpo utilizando reacciones de química de clic.
[2739] Los conjugados de fármacos de anticuerpos aglicosilados específicos del sitio con una IgG1 humana que contiene una mutación N297Q en la Tabla 8 que se describe a continuación se prepararon mediante una reacción de clic [2+3] entre anticuerpos funcionalizados con azido con una carga útil del enlazador que contiene alquino. Como se muestra en la Tabla 8, Anti Her2-PEG3-N3 se conjugó con compuestos LP1, LP2, LP3, LP4, LP5, LP6, LP7, LP8, LP9, LP10, y LP11. Como se muestra en la Tabla 8, Anti PRLR-PEG3-N3 se conjugó a LP1, LP2, LP3, LP4, LP5, LP6, LP7, LP8, LP9, LP10, LP11, LP15 y LP16. Como se muestra en la Tabla 8, Anti-IL2Rg-PEG3-N3 se conjugó a LP4 y LP7. Como se muestra en la Tabla 8, Anti-Fel d 1-PEG3-N3 se conjugó a LP4.
[2740] Para la conjugación, se utilizó un anticuerpo IgG1 humano aglicosilado funcionalizado con azido (mAb-PEG3-N3) y el conjugado de enlazador-carga útil (LP) se preparó incubando mAb-PEG3-N3 (1-3 mg/mL) en un medio acuoso (por ejemplo, PBS, PBS que contiene 5% de glicerol, HBS) con >6 equivalentes molares de una LP disuelta en un disolvente orgánico adecuado, como DMSO, DMF o DMA (la mezcla de reacción contiene 10 -20 % de disolvente orgánico, v/v) a 24 °C a 37 °C durante más de 6 horas. El progreso de la reacción se monitorizó mediante ESI-MS. La reacción se monitorizó mediante ESI-MS y la ausencia de mAb-PEG3-N3 indicó la finalización de la conjugación. La cantidad excedente de la LP y el disolvente orgánico se eliminaron mediante SEC eluyendo con PBS. Los conjugados purificados se analizaron mediante SEC, SDS-PAGE y ESI-MS. En la Tabla 8 se muestra una lista de conjugados de anticuerpos esteroides no tóxicos (ncADC) de las LP correspondientes, sus pesos moleculares y valores ESI-DAR. En la Tabla 8, Ab se refiere a un anticuerpo, Ab-N3 se refiere al anticuerpo funcionalizado con azida, y ncADC se refiere a un conjugado de anticuerpo y fármaco no citotóxico.
[2742] Tabla 8
[2744]
[2745]
[2748] Ejemplo 58
[2750] Este ejemplo demuestra un método para realizar una conjugación no específica del sitio de un fármaco con un anticuerpo utilizando una reacción de tiol-maleimida.
[2752] La conjugación a través de cisteínas de anticuerpos se realizó en dos pasos utilizando los métodos descritos similares a los descritos en Mol Pharm. 1 de junio de 2015;12(6):1863-71.
[2754] Un anticuerpo monoclonal (mAb, 10 mg/ml en 50 mM HEPES, 150 mM NaCl) a pH 7.5 se redujo con 1 mM de ditiotreitol (0.006 mg por mg de anticuerpo) o TCEP (2.5 equivalentes molares al anticuerpo) a 37 °C durante 30 minutos. Después de la filtración en gel (G-25, pH 4.5 acetato de sodio), compuesto LP13 en DMSO (10 mg/mL) se añadió al anticuerpo reducido y la mezcla se ajustó a pH 7.0 con HEPES 1 M (pH 7.4). Se dejó reaccionar durante 3-14 horas. El conjugado resultante se purificó mediante SEC. Los valores de DAR (UV) se determinaron utilizando las absorbancias medidas del ncADC y los coeficientes de extinción del anticuerpo y LP13.
[2756] Ejemplo 59
[2758] Este ejemplo demuestra métodos para caracterizar conjugados de anticuerpos y fármacos anticuerpos no citotóxicos (ncADC).
[2760] El anticuerpo y el ncADC se caracterizaron mediante SDS-PAGE, SEC y MS (ESI). El conjugado anti-PRLR-LP4 en la Tabla 8 generado a partir del anticuerpo anti-PRLR a través de su anticuerpo funcionalizado con azido (anti-PRLR-PEG3-N3) se caracterizó mediante SDS-PAGE realizada en condiciones no reductoras y reductoras (FIG. 20), SEC. (FIG. 21) y ESI-MS (FIG. 22) y demostró la finalización de la formación del ncADC.
[2761] Se utilizó SDS-PAGE para analizar la integridad y pureza de los ADC.
[2763] En un método, las condiciones de ejecución de SDS-PAGE incluyeron muestras no reducidas y reducidas (2-4 |jg) junto con BenchMark Pre-Stained Protein Ladder (Invitrogen, cat# 10748-010; L# 1671922.) que se cargaron por carril en gel Novex 4 - 20% Tris-glicina (1.0 mm x 10 pocillos) y se ejecutaron a 180 V, 300 mA, durante 80 minutos. Se preparó una muestra analítica utilizando tampón SDS Novex Tris-Glicina (2X) (Invitrogen, Cat# LC2676) y la muestra reductora se preparó con tampón de muestra SDS (2X) que contenía 10 % de 2-mercaptoetanol.
[2765] En la figura 20 se muestran los pesos moleculares de los anticuerpos y ncADC en SDS-PAGE realizada en condiciones no reductoras y reductoras. Los desplazamientos de masa no fueron obvios en condiciones no reductoras debido a porcentajes relativamente pequeños de cambios de masa. Sin embargo, las masas de las cadenas pesadas aumentaron desde los anticuerpos desnudos hasta los anticuerpos funcionalizados con azido y, además, hasta el conjugado ncADC. No se detectó ningún material reticulado.
[2767] Como se muestra en la FIG. 20, los carriles SDS-PAGE incluyeron las siguientes especies según las siguientes etiquetas de carril en la Tabla 9.
[2769] Tabla 9
[2772]
[2775] Los ADC se analizaron para determinar su pureza mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).
[2776] Para determinar la pureza de los conjugados anticuerpo-fármaco, se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño. Los experimentos analíticos SEC se realizaron utilizando un instrumento Waters 600, en una columna HR Superdex 200 (1.0 x 30 cm), a una tasa de flujo de 0.80 mL/min utilizando PBS pH 7,4, y se monitorizaron a A280 nm utilizando un PDA Waters 2998. Una muestra analítica estuvo compuesta por 200 pL de PBS (pH 7.4) con 30-100 pL de muestra de prueba. Las purificaciones SEC preparativas se realizaron utilizando un instrumento AKTA de GE Healthcare, en una columna Superdex 200 p G (2.6 x 60 cm), a una tasa de flujo de 2 mL/min eluyendo con PBSg a pH 7.4 y monitorizadas a A280 nm. Los resultados de la SEC en la FIG. 21 indicaron un tiempo de retención típico para el mAb monomérico y sus conjugados y no hubo agregación ni degradación detectable.
[2778] El anticuerpo y el ADC se analizaron mediante análisis de masa intacta por LC-ESI-MS.
[2780] Se realizó la medición de la masa intacta de las muestras de ncADC mediante LC-ESI-MS para determinar el perfil de distribución de la carga útil del fármaco y calcular el DAR promedio de las formas de ADC intactas. Cada muestra de prueba (20-50 ng, 5 uL) se cargó en una columna Acquity UPLC Protein BEH C4 (10K psi (68.95 MPa), 300 A, 1.7 pm, 75pm * 100 mm; Cat No. 186003810). Después de 3 minutos de desalinización, se eluyó la proteína y se adquirieron los espectros de masas mediante un espectrómetro de masas Waters Synapt G2-Si (Waters).
[2782] Como se muestra en la FIG. 22, los espectros de masas deconvolucionados exhibieron un pico predominante para el anticuerpo anti-PRLR aglicosilado con un peso molecular de 144579.0 Da, y un pico predominante para su anticuerpo anti-PRLR funcionalizado con azido con un peso molecular de 145373.0 Da, lo que indica un aumento de 794.0 Da en comparación con su anticuerpo parental aglicosilado (correspondiente a conjugación de 4 amino-PEG3-azida a cada anticuerpo aglicosilado). Además, el pico predominante del conjugado anti-PRLR-LP4 tuvo un peso molecular de 149836.0 Da, lo que indica un aumento de 4463 Da en comparación con su anticuerpo parental aglicosilado (que corresponde a 4 conjugaciones de LP4 con cada anticuerpo aglicosilado). Como se resume en la Tabla 8, la mayoría de los ADC específicos del sitio en este documento tienen 4DAR.
[2783] Para los conjugados de anticuerpos y fármacos no específicos del sitio, los valores de DAR se determinaron según el análisis de masas ESI Q-TOF. Los espectros de masas ESI Q-TOF se deconvolucionaron a espectros de masas de carga cero utilizando un algoritmo de máxima entropía (MassLynx). Los espectros de masas resultantes demostraron la distribución de cada anticuerpo conjugado con el fármaco. El porcentaje del área de un pico representa la distribución relativa de la especie particular de anticuerpo cargado con el fármaco. El DAR promedio se calculó utilizando la información del porcentaje del área de pico y los números de carga del fármaco en el anticuerpo.
[2785] Ejemplo 60
[2787] Este ejemplo demuestra, utilizando el ensayo de unión competitiva LanthaScreen TR-FRET GR, que los esteroides de carga útil aquí expuestos se unen al receptor de glucocorticoides (GR).
[2789] Para evaluar la capacidad de los nuevos esteroides para unirse al receptor de glucocorticoides (GR), se realizó un ensayo de unión libre de células utilizando un kit de ensayo de unión competitiva LanthaScreen TR-FRET GR (Life Technologies, Cat# A15901). El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La budesonida es un esteroide GR comercial y se utilizó como control de referencia en el ensayo de unión y otros ensayos basados en células descritos más adelante en el documento. En resumen, se preparó una dilución en serie triple de budesonida y los compuestos derivados que se indican a continuación en DMSO al 100 % comenzando con 100 nM (100X del final). Las diluciones seriadas se diluyeron además 50 veces en el tampón de receptor nuclear F con 5 mM de DTT y 0.1 mM de péptido estabilizador, y se transfirieron a una placa de ensayo de 384 pocillos. A continuación, se agregaron secuencialmente Fluormone GS1 Green, GR-LBD (GST) y el anticuerpo Tb anti-GST a una placa de ensayo de 384 pocillos. Luego la placa se incubó a temperatura ambiente durante 2.5 horas mientras se protegía de la luz. La placa se analizó en un lector de placas Envision Multilabel (PerkinElmer) con excitación establecida a 340 nm y filtros de emisión a 520 nm y 486 nm. La relación FRET se calculó como 520 nm/486 nm. Los valores de IC50 se determinaron utilizando una ecuación logística de cuatro parámetros sobre una curva de respuesta de 12 puntos (GraphPad Prism).
[2791] Como se muestra en la Tabla 10, la budesonida compitió en la unión de Fluormone GS1 Green en el ensayo GR con un valor de IC50 entre 10 a 100 nM. Los análogos N de budesonida compitieron de manera similar en la unión con valores de IC50 que van desde menos de 10 nM a más de 100 nM. Los nuevos esteroides probados en este estudio demostraron ser comparables o mejores (valores IC50 menores) en este ensayo y un desplazamiento similar para el ligando GR en comparación con la budesonida. Los isómeros 22R en general son más potentes que los isómeros 22S o al menos idénticos los isómeros 22S.
[2793] Tabla 10: Unión libre de células y actividad funcional basada en células
[2795]
[2796]
[2799] Ejemplo 61
[2801] Este ejemplo demuestra que el PRLR-ncADC se internaliza en las células HEK293/PRLR.
[2803] Se evaluó la intemalización de un anticuerpo anti-PRLR y un anticuerpo de control de isotipo en células HEK293 diseñadas para expresar PRLR humano de longitud completa (aminoácidos 1 a 622 del número de acceso NP_000940.1 con una mutación K2E; HEK293/PRLR). Las células parentales HEK293 también se evaluaron como control negativo. Las células se sembraron a una concentración de 20,000 células/pocillo en medio completo y se incubaron durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, los pocillos se lavaron con PBS y se colocaron en hielo. Se agregaron diluciones seriadas de anticuerpos de 0.1 a 100 nM a los pocillos apropiados en FBS al 2 % en PBS y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS y luego se incubaron en hielo durante 30 minutos con anti-hIgG de cabra de fragmento Fab conjugado con Alexa 488 (Jackson Immunoresearch, Cat # 109-547-003). Las células se lavaron dos veces con PBS y luego se fijaron en formaldehído al 3.7 % en PBS (condición de control de 4 °C) o se incubaron a 37 °C durante 3 horas para permitir la internalización. Después de la incubación de 3 horas, las células se fijaron en formaldehído al 3.7 % en PBS durante 15 minutos, se lavaron con PBS y se tomaron imágenes en un Molecular Devices ImagExpress MicroXL.
[2805] El anti-PRLR-ncADC y el anticuerpo PRLR parental se internalizaron en las células HEK293/PRLR, mientras que el control de isotipo ncADC y el anticuerpo parental de control de isotipo no se internalizaron ya que no se unen a una proteína que se encuentra en las líneas celulares analizadas. No se observó internalización en células parentales HEK293 en ninguna de las muestras analizadas.
[2807] Ejemplo 62
[2809] Los bioensayos descritos en este documento se utilizaron para evaluar la eficacia de los esteroides libres y los anti-PRLR-ncADC. En un ejemplo, el bioensayo evaluó la actividad de los esteroides, después de la internalización de un ADC de esteroide anti-PRLR-GC específico del sitio en las células, para unirse a pBIND-GR y la posterior activación del informador de luciferasa. Para este ensayo, se diseñó una línea celular 293 para expresar PRLR humano de longitud completa. Luego, dicha línea celular estable se transfectó además con un receptor quimérico que consiste en un dominio de unión del ligando GR fusionado al dominio de unión del ADN Gal4 de levadura (pBind-GR, Promega Cat# E1581) y una secuencia activadora ascendente de Gal4 (9xGal4UAS-Luc2P) que impulsa la expresión del gen de la luciferasa. Este formato de ensayo ofrece alta sensibilidad y baja reactividad cruzada con otros receptores nucleares. Dado que los dos vectores juntos se utilizan para monitorizar la unión del ligando GR y la transactivación, la línea celular estable resultante se denomina en este documento como 293/PRLR/GRE-Luc para simplificar (ver Improved Dual-Luciferase Repórter Assays for Nuclear Receptors, Current Chem Genomics, 2010; 4: 43-49; Aileen Paguio, Pete Stecha, Keith V Wood, y Frank Fan).
[2811] En un segundo ejemplo, un bioensayo evaluó tanto la eficacia de los esteroides libres como cualquier actividad no específica de los anti-PRLR-ncADC. Para este ensayo, se transfectó una línea celular 293 con el vector pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro] (Cat# E1360, Promega). La línea celular resultante se denomina en este documento 293/MMTV-Luc.
[2813] Ejemplo 63
[2815] Se utilizó un ensayo basado en células informadoras de luciferasa coactivadora del receptor de glucocorticoides (GR) para analizar la activación de GR por budesonida y los esteroides descritos en este documento en función del tiempo.
[2817] Se estudió la actividad de los esteroides en las células 293/PRLR/GRE-Luc a las 72 horas de incubación. Para este ensayo, se sembraron 20,000 células en placas de 96 pocillos en un medio que contenía DMEM suplementado con 10 % de FBS y penicilina/estreptomicina (medio completo) y se cultivaron durante la noche a 37 °C en 5 % de CO2. Para las curvas de respuesta a la dosis del fármaco libre o ncADC, se añadieron reactivos diluidos en serie de 100 nM a 5.1 pM a las células y se incubaron durante 72 horas a 37 °C. La actividad de la luciferasa se determinó mediante la adición del reactivo One-Glo™ (Promega, Cat#E6130) y las unidades de luz relativas (RLU) se midieron en un luminómetro Victor (Perkin Elmer). Los valores de EC50 se determinaron a partir de una ecuación logística de cuatro parámetros sobre una curva de respuesta de 10 puntos utilizando GraphPad Prism. La administración de esteroides provocará una activación del informador Luc en las células 293/PRLR/GRE-Luc.
[2819] Como se muestra en la Tabla 11, en el punto temporal de 72 horas, células 293/PRLR/GRE-Luc activadas por budenosida con un valor de IC50 entre 10 a 100nM. Los análogos N de células 293/PRLR/GRE-Luc activadas por budesonida con una multiplicidad de activación similar y valores de IC50 que varían desde menos de 10 nM a más de 100 nM.
[2821] Ejemplo 64
[2823] Activación selectiva de GR por ADC en líneas celulares específicas
[2825] La actividad de los esteroides y los ncADC de esteroides, después de la internalización en la línea celular 293/PRLR/GRE-Luc así como en células 293/MMTV-Luc, que no expresan PRLR como se describe en el Ejemplo 61, y células 293/PRLR, que no expresan el informador de luciferasa descrito en el Ejemplo 62, se estudiaron en concentraciones de 100 nM a 5.1 pM utilizando los procedimientos de ensayo descritos en el Ejemplo 63 a las 72 horas de incubación.
[2827] Se estudiaron el conjugado PRLR-LP4 (en la Tabla 8) y su conjugado de control de isotipo, así como las cargas útiles libres y los anticuerpos no conjugados en dos tipos de líneas celulares. El conjugado PRLR-LP4 (Anti PRLR-LP4 (en la Tabla 8) demostró la activación selectiva de la línea celular 293/PRLR/GRE-Luc (FIG. 23A) y no hay activación de GR (FIG. 23B) en células 293/MMTV-Luc, que no expresan PRLR.
[2829] Como se muestra en la FIG. 23A, en células 293/PRLR/GRE-Luc, el anticuerpo anti-PRLR conjugado específicamente en el sitio con LP4 (Anti PRLR-LP4 en la Tabla 8) indujo una activación completa de GRE-Luc con un valor de EC50 < 10 nM. El anticuerpo de control de isotipo conjugado con LP4 (Anti Her2-LP4 en la Tabla 8) no indujo una activación significativa de GRE-Luc. El anticuerpo de control de isotipo no conjugado no indujo una activación significativa de GRE-Luc. La carga útil libre 11-5 en la Tabla 1 (carga útil de LP4) indujo una activación completa de GRE-Luc con una EC50 <10 nM. El control de referencia, Budesonida, indujo una activación completa de GRE-Luc con una EC50 <10 nM. Como se muestra en la FIG. 23B, en células 293/MMTV-Luc, solo la carga útil libre 11-5 en la Tabla 1 (carga útil de LP4) y el control de referencia, Budesonida, activación inducida de GRE-Luc: 11-5 en la Tabla 1 (carga útil de LP4) indujo una activación completa de GRE-Luc con un valor de EC50 entre 10 a 100 nM, y Budesonida indujo una activación completa de GRE-Luc con un valor de EC50 entre 10 a 100 nM.
[2831] Ejemplos aquí presentados demuestran que el anti PRLR-LP4 en la Tabla 8 activa específicamente las células 293/Pr LR/Gr E-Luc que expresan tanto el PRLR objetivo como el informador de luciferasa GRE inducido por esteroides, pero no tiene efecto en la línea celular 293-MMTV-Luc sensible a esteroides o en la línea celular 293-PRLR que expresa el objetivo.
[2833] Ejemplo 65
[2835] En este ejemplo se examinó la contribución del enlazador y la carga útil a la activación de GR de ncADC.
[2836] Se estudió la actividad de los esteroides libres y sus ncADC correspondientes después de la intemalización en la línea celular 293/PRLR/GRE-Luc en concentraciones de 100 nM a 5.1 pM utilizando los procedimientos de ensayo descritos en el Ejemplo 63 a las 72 horas de incubación.
[2838] Como se muestra en la Tabla 11 y también se muestra en la FIG. 24, en células 293/PRLR/GRE-Luc, el anticuerpo anti-PRLR conjugado específicamente en el sitio con LP4 (Anti PRLR-LP4 en la Tabla 8) indujo una activación completa de GRE-Luc con una EC50 < 10 nM a las 72 horas. El anticuerpo de control de isotipo conjugado con LP4 (Anti Her2-LP4 en la Tabla 8) no indujo una activación significativa de GRE-Luc. La carga útil libre, 11-5 en la Tabla 1 (carga útil de LP4), indujo una activación completa de GRE-Luc con una EC50 <10 nM.
[2840] El anticuerpo anti-PRLR conjugado específicamente en el sitio con LP2 (Anti PRLR-LP2 en la Tabla 8) indujo una activación completa de GRE-Luc con una EC50 <10 nM. El anticuerpo de control de isotipo conjugado con LP2 (Anti Her2-LP2 en la Tabla 8) no indujo una activación significativa de GRE-Luc. La carga útil libre 16-5 en la Tabla 1 (carga útil de LP2) indujo una activación completa de GRE-Luc con una EC50 <10 nM. Finalmente, el anticuerpo anti-PRLR conjugado específicamente en el sitio con LP1 (Anti PRLR-LP1 en la Tabla 8) indujo una activación completa de GRE-Luc con una EC50 entre 10-100 nM. El anticuerpo de control de isotipo conjugado con LP1 (Anti Her2-LP1 en la Tabla 8) no indujo una activación significativa de GRE-Luc. La carga útil libre 7-1R en la Tabla 1 (carga útil de LP1) indujo una activación completa de GRE-Luc con una EC50 entre 10-100 nM.
[2842] Este ejemplo demuestra que con el mismo anticuerpo y enlazador, la potencia de la carga útil 11-5 en la Tabla 1 (carga útil de LP4) es mayor que la carga útil 16-5 en la Tabla 1 (carga útil de LP2) que es mayor que 7-1R en la Tabla 1 (carga útil de LP1). El anti PRLR-LP4 en la Tabla 8 tuvo una mayor potencia que el anti PRLR-LP2 en la Tabla 8, que tuvo una mayor potencia que el anti PRLR-LP1 en la Tabla 8.
[2844] Tabla 11: Contribución de la carga útil del enlazador en la activación de GR del esteroide ncADC, como se probó en células 293/PRLR/GRE-Luc
[2847]
[2849] Ejemplo 66
[2851] Bioensayo IL2Ry-ncADC con células HEK293/MMTV -luc/IL2Ry/IL 7R.
[2853] La cadena y del receptor de citoquina común, también conocida como IL2Ry y CD132, es un receptor de citoquina tipo I que es común a las vías de señalización de la interleucina-2 (IL-2), IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21 y desempeña un papel importante en la formación y regulación de los sistemas inmunes (Rochman et al. 2009). IL2Ry se expresa principalmente en las células inmunes y, por lo tanto, puede ser un objetivo útil para administrar fármacos inmunosupresores como esteroides a través de un conjugado fármaco-anticuerpo no citotóxico (ncADC) y suprimir la actividad de las células inmunes al tiempo que se evitan los efectos secundarios fuera del objetivo asociados con la administración sistémica de esteroides.
[2855] El ensayo basado en células descrito en este documento se utilizó para detectar la activación transcripcional del receptor de glucocorticoides (GR) por ncADC con la región de repetición terminal larga del virus del tumor mamario murino (MMTV LTR) que se ha utilizado para estudiar la activación de GR (Deroo et al. 2001). La línea celular HEK293 se generó por primera vez para expresar de forma estable un informador de luciferasa pGL4.36[/uc2P/MMTV/Hygro] (Promega, # E136A), denominado en este documento HEK293/M1VITV-luc, y mantenido en DMEM que contiene 10 % de FBS, NEAA, penicilina/estreptomicina/L-glutamina y 100 pg/mL de higromicina (medio completo). Luego, la línea celular estable parental HEK293/MMTV-luc se transfectó con un plásmido que codifica IL2Ry humano de longitud completa (que expresa los aminoácidos 1-369 del número de acceso NP_000197.1) y se transdujo con un plásmido que codifica IL7Ra de longitud completa (que expresa los aminoácidos 1-459 del número de acceso NP_002176.2) y se clasificó para una alta expresión de IL2R<y>e IL7Ra mediante citometría de flujo. La línea celular resultante, denominada en este documento HEK293/MMTV-I<uc>/IL-2R<y>/IL7R, se mantuvo en un medio completo suplementado con 1 pg/mL de puromicina y 500 pg/mL de sulfato G418.
[2857] Para el bioensayo, se sembraron células HEK293/MMTV-luc o HEK293/MMTV-Iuc/IL2Ry/IL7R en placas de ensayo de 96 pocilios a 10,000 células/pocillo en medio completo y se incubaron a 37 °C en 5 % de CO2 durante la noche. A la mañana siguiente, para probar la activación de<g>R, budesonida, el compuesto 11-5 en la Tabla 1 (carga útil LP4) y el compuesto 16-5 en la Tabla 1 (carga útil LP2), el conjugado anti-IL2Rg-LP4 (en la Tabla 8), el anticuerpo de control (control de isotipo en la Tabla 8) y los anticuerpos desnudos se diluyeron en serie a 1:3 de 200 nM-1 pM a 0.002-0,01 nM y se agregaron a las células. Las concentraciones se ajustaron de acuerdo con la relación fármaco-anticuerpo para los ncADC y otras técnicas conocidas por los expertos en la técnica. También se incluyó como control un pocilio sin ningún artículo de prueba.
[2859] La actividad de la luciferasa se midió después de 6, 24, 48 y 72 horas de incubación a 37 °C al 5 % de CO2 en un instrumento Victor X (Perkin Elmer). Los resultados se analizaron utilizando regresión no lineal (logística de 4 parámetros) con el software Prism 6 (GraphPad) para obtener valores de EC50. La multiplicidad de activación se calculó determinando la relación entre la actividad de la luciferasa de cada muestra y la observada sin ningún artículo de prueba añadido.
[2861] Como se muestra en la Tabla 12, después de 6, 24 y 48 horas de incubación, la budesonida demostró la mayor activación de GR con activaciones completas; 16-5 en la Tabla 1 (carga útil LP2) y 11-5 en la Tabla 1 (carga útil LP4) mostraron activación parcial. En tiempos de incubación más largos de 72 horas, 16-5 en la Tabla 1 (carga útil LP2) y 11-5 en la Tabla 1 (carga útil LP4) mostraron un nivel similar de activación de GR a Budesonida con activaciones completas. Estos resultados demuestran que la budesonida, 16-5 (carga útil LP2), y 11-5 (carga útil LP4) en la Tabla 1 activa GR con EC50s entre 10-100 nM.
[2863] Tabla 12: Activación del receptor de glucocorticoides en células HEK293/MMTV-Iuc/IL-2Ry/IL7R por budesonida, 11-5 en la Tabla 1 o 16-5 en la Tabla 1 a las 6, 24, 48 o 72 horas
[2865]
[2868] Budesonida, la carga útil del enlazador LP4 (carga útil 11-5) y la carga útil del enlazador LP7 (carga útil R-11-5), mAbs-ncADC anti-IL2Ry y anti-IL2RY con LP4 y LP7 (denominados anti-IL2RY-LP4 y anti-IL2Ry-LP7), así como un mAb-LP7 de control y el mAb anti-IL2RY no conjugado se agregó a células HEK293/MMTVLuc/IL2Ry/IL7R y se incubaron durante 24 horas (A), durante 48 horas (B), durante 72 horas (C) o células HEK293/MMTV-Luc durante 72 horas (D) con una concentración máxima de 200 nM (RLU, unidad de luz relativa) en la FIG 25 y la Tabla 13.
[2870] Como se muestra en la Tabla 13.1 y la Figura 25, después de 24 horas de incubación, la budesonida mostró la multiplicidad de activación máxima más alta en las células HEK293/MMTV-L<uc>/IL2R<y>/IL7R, y 11-5 yR-11-5mostraron niveles de activación relativamente más bajos en comparación con la budesonida (FIG 25<a>). Con tiempos de incubación más largos de 48 y 72 horas, 11-5 y R-11-5 mostraron un nivel de activación similar a la budesonida (FIG 25B y FIG 25C).
[2872] Los anti-IL2Ry-LP4 y anti-IL2Ry-LP7 mostraron poca o ninguna activación en las células HEK293/MMTV-L<uc>/IL2R<y>/IL7R después de 24 horas de incubación (FIG. 25A), pero mostraron mayores niveles de activación con un período de incubación más largo de 48 horas y 72 horas (FIGS. 25B y 25C). Los anti-IL2Ry-ncADC, anti-IL2Ry-LP4 y anti-IL2Ry-LP7, no demostraron ninguna activación en las células HEK293/MMTV-Luc (FIG.
[2873] 25D) lo que indica que la administración de esteroides por ncADC depende de la unión al antígeno IL2Ry en la superficie celular y la internalización posterior. Por el contrario, el anticuerpo anti-IL2RY no conjugado y los anticuerpos de control de isotipo no conjugados y conjugados no mostraron ninguna activación significativa en ninguna condición. Budesonida, 11-5 y R-11-5 mostraron activación en HEK293/MMTV-Luc a las 72 horas de incubación, lo que indica la activación de GR por los fármacos libres (FIG 25D).
[2875] Tabla 13.1: Activación del receptor de glucocorticoides en HEK293/MMTV-Luc/IL-2Ry/IL7R por cargas útiles de esteroides y ADC anti-IL2Ry-esteroide y ADC de control
[2878]
[2881] Ejemplo 67
[2883] Este Ejemplo muestra la bioactividad de los ADC citotóxicos con y sin enlazadores de ciclodextrina (FIG 30).
[2884] Para evaluar la comparabilidad de los ADC con y sin CD que contienen cargas citotóxicas, se realizó un ensayo de citotoxicidad utilizando células SKBR3. Las células SKBR3 se han utilizado comúnmente para evaluar la actividad del ADC anti-Her2. Se ha utilizado un ADC anti-PRLR como ADC mAb de control en el ensayo de citotoxicidad SKBR3. Para el ensayo, la citotoxicidadin vitrode los ADC anti-PRLR se evaluó utilizando el kit de ensayo CellTiter-Glo (Promega, Cat# G7573), en donde la cantidad de ATP presente se utiliza para determinar la cantidad de células viables en el cultivo. Para el ensayo, las células SKBR3 se sembraron a 6000 células/pocillo en placas blancas Nunclon de 96 pocillos en medio de crecimiento completo y se cultivaron durante la noche a 37 °C en 5 % de CO2. Para las curvas de viabilidad celular, se agregaron a las células ADC diluidas en serie 1:4 o carga útil libre en concentraciones que comenzaron en 100 nM, incluido un control sin tratamiento, y luego se incubaron durante 5 días. Después de la incubación de 5 días, las células se incubaron a temperatura ambiente con 100 pL de reactivos CellTiter-Glo durante 5 minutos. Las unidades de luminiscencia relativa (RLU) se determinaron en un lector de placas Victor (PerkinElmer). Los valores de IC50 se determinaron a partir de una ecuación logística de cuatro parámetros sobre una curva de respuesta de 10 puntos (GraphPad Prism). Todas las curvas y valores de EC50 se corrigieron para los equivalentes de carga útil. Todas las IC50 se expresan en concentración nM y el porcentaje de células muertas (% de muerte) se informa para la concentración más alta probada.
[2885] La bioactividad de los ADC esteroides con y sin enlaces de ciclodextrina se muestra en la FIG. 30.
[2887] Para probar la comparabilidad de los ADC con y sin CD que contienen cargas de esteroides, se estudió su actividad en las células 293/PRLR/GRE-Luc a las 72 horas de incubación. Para este ensayo, se sembraron 20,000 células en placas de 96 pocillos en un medio que contenía DMEM suplementado con 10 % de FBS y penicilina/estreptomicina (medio completo) y se cultivaron durante la noche a 37 °C en 5 % de CO2. Para las curvas de respuesta a la dosis del fármaco libre o del ADC, se añadieron reactivos diluidos en serie de 100 nM a 5.1 pM a las células y se incubaron durante 72 horas a 37 °C. La actividad de la luciferasa se determinó mediante la adición del reactivo One-Glo™ (Promega, Cat#E6130) y las unidades de luz relativas (RLU) se midieron en un luminómetro Victor (Perkin Elmer). Los valores de EC50 se determinaron a partir de una ecuación logística de cuatro parámetros sobre una curva de respuesta de 10 puntos utilizando GraphPad Prism. La administración de esteroides provocará una activación del informador Luc en las células 293/PRLR/GRE-Luc. La activación completa en este ensayo se define entre el 90 y el 100% de la activación máxima medida con la carga útil libre. La activación parcial en este ensayo se define como una activación que está entre el 10% y el 90% de la activación máxima medida con la carga útil libre. La activación mínima en este ensayo se define como menos del 10% de la activación máxima medida con la carga útil libre.
[2889] Como se muestra en la Tabla 13.2 y la FIG. 30, los ADC anti-PRLR Ab que contienen CD (Anti-PRLR Ab-Ex46) tienen una eficacia y potencia similares en la activación del informador GRE-Luc en células 293/PRLR/GRE-Luc que los ADC anti-PRLR Ab que no contienen CD (Anti-PRLR Ab-Ex44). En este ensayo, los ADC de control de isotipo, independientemente de si contienen CD o no, así como el anticuerpo no conjugado, no demostraron ningún efecto significativo en este ensayo.
[2892] TABLA 13.2: ACTIVACIÓN DE GR DE ADCS ESTEROIDES CON O SIN ENLAZADORES DE
[2893] CICLODEXTRINA EN CÉLULAS 293/PRLR/GRE-LUC
[2895]
[2899] TABLA 14. PROPIEDADES FISICAS Y QUIMICAS DE LOS ESTEROIDES-ENLAZADORES
[2902]
[2903]
[2905] TABLA 15. PROPIEDADES FÍSICAS DE LOS ESTEROIDES DE ENLAZADORES
[2906]
[2909] TABLA 16. LISTA DE CONJUGADOS DE ESTEROIDES Y ANTICUERPOS ESPECÍFICOS DE SITIO
[2912]
[2915] Ejemplo 68
[2917] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y FIG. 31.
[2919] Esteroides comerciales, incluido el acetónido de fluocinolona (1a), dexametasona (1c), flumetasona (1d), triamcinolona (1e) y metilprednisolona (1f), y acetónido de triamcinolona (1g) donde se utilizan como materiales de partida. El compuesto 1b se obtuvo de 1a por intercambio de cetal con butiraldehído en presencia de ácido perclórico, y sus dos isómeros quirales se obtuvieron a partir de la separación SFC quiral. Adoptando el mismo enfoque, el compuesto 1h se obtuvo de 1g. Los compuestos 1b-f y 1h se convirtieron en los derivados de mesilato correspondientes (2b-f, 2h), seguido de la sustitución del grupo mesilato por una fracción azida para formar compuestos 3b-f y 3h que se redujeron aún más a las aminas (4b-f, 4h). La fracción mesilato en el compuesto 2b también fue reemplazado por una anilina para proporcionar 5lz, reemplazado por una alquilamina para proporcionar 5-II, y se sustituyen por fenoles para proporcionar 6-I a 6-III. El compuesto 6-VI se obtuvo a partir de la sustitución del mesilato de budesonida por un 4-amino-fenol, y 6-VII se obtuvo a partir de la sustitución del mesilato en 2f con 4-amino-fenol.
[2920] Ejemplo 69
[2921] Síntesis del compuesto 1b, R-1b, S-1b y 1h.
[2922] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[2923] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluoro-11-hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetN-6-propN-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,801318]icosa-14,17-dien-16-ona (1b)
[2926]
[2928] A una mezcla de acetónido de fluocinolona (1a, 0.90 g, 2.0 mmol) y sílica gel (18 g) en heptanos (90 mL) se añadió butiraldehído (0.27 mL, 3.0 mmol) a 10 °C y la suspensión se agitó a 10-20 °C durante 10 minutos. A la mezcla se le añadió ácido perclórico (70 %, 0.68 mL, 8.3 mmol) gota a gota a 0 °C. A continuación, la mezcla de reacción se agitó a 10-20 °C durante la noche. La mayor parte de los compuestos 1a se consumió según TLC y LCMS. La mezcla de reacción se diluyó con éter de petróleo y se inactivó con carbonato de sodiosat. ac.La suspensión se filtró y el sólido se lavó con DCM/metanol (v/v = 1). El filtrado combinado se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea (0-100 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para dar el compuesto 1b (0.15 g, rendimiento del 16 %) como un sólido blanco. ESI m/z: 467.1 (M H)+. El compuesto 1b se purificó además mediante HPLC preparativa (método B) para obtener el compuestoR-1b(40 mg, rendimiento del 39%) y S-1b (10 mg, rendimiento del 9%) como sólidos blancos. ESI m/z: 467 (M H)+.
[2929] (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluoro-11-hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-16-ona (R-1b)
[2930] Ciertos métodos y/o intermedios en EP0262108A1 fueron empleados:
[2931] El compuesto R-1b es
[2934]
[2936] 1H RMN (400 MHz, MeODd4)57.34 (dd,J= 10.1, 1.3 Hz, 1H), 6.37-6.32 (m, 2H), 5.65-5.48 (m, 1H), 4.63 (t,J =4.3 Hz, 1H), 4.55 (d,J =19.4 Hz, 1H), 4.33-4.28 (m, 2H), 2.74-2.59 (m, 1H), 2.38-2.32 (m, 1H), 2.26-2.16 (m, 2H), 1.70-1.41 (m, 12H), 0.97-0.93 (m, 6H) ppm. HPLC Anal.: >99.9%, Tiempo de retención: 8.05 min (método A).
[2937] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S)-12-Fluoro-11-hidroxi-8-(2-hidroxiacetil)-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-16-ona (1h)
[2940]
[2942] Siguiendo el procedimiento para elaborar el compuesto 1b, el compuesto 1g (1.3 g, 3.0 mmol) se convirtió en el compuesto 1h (1.1 g, rendimiento del 85%) como un sólido blanco. ESI m/z: 449 (M 1)+.
[2943] Ejemplo 70
[2944] Procedimiento general A para la síntesis de mesilatos (Ms) 2 en la FIG 31:
[2945] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[2946] A una solución del compuesto 1 (1c, 1d, 1e, 1f, o 1h, 1 eq.) en piridina (10 mL por gramo de 1) se añadieron 4-dimetilaminopiridina (2 eq.) y cloruro de metanosulfonilo (1.5 eq.) gota a gota a 0 °C. Tras agitar a temperatura ambiente durante 2 horas y monitorizar la reacción mediante LCMS hasta que el compuesto 1 (1c, 1d, 1e, 1f, o 1h, 1 eq.) se consumió totalmente, la mezcla resultante se vertió en acetato de etilo (100 mL). La mezcla se lavó con clorhidrato acuoso diluido (1N) a pH=7 y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. El producto crudo se purificó mediante cromatografía instantánea (0-2% MeOH en DCM) para dar el compuesto 2 (2c, 2d, 2e, 2f, o 2h, 1 eq.).
[2947] Ejemplo 71
[2948] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[2949] 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,904,8013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil metanosulfonato (2b)
[2950] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y FIG. 31.
[2953]
[2955] A una solución del compuesto 1b (0.28 g, 0.65 mmol)) en DCM (3 mL) se añadió trietilamina (0.13 g, 1.3 mmol) y cloruro de metanosulfonilo (89 mg, 0.78 mmol). Después de agitar a 0 °C durante media hora hasta obtener el compuesto 1b se consumió según TLC, se concentró la mezcla de reacción al vacío. El residuo en sílica gel se purificó mediante cromatografía en columna de sílica gel (0-50 % de acetato de etilo en éter de petróleo) para dar el compuesto 2b (0.26 g, >99% de rendimiento) como un sólido blanco. ESI m/z: 545 (M H)+.Ejemplo 72
[2956] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[2957] 2-[(1 R,2S,10S,11 S,13R,14R,15S,17S)-1-Fluoro-14,17-dihidroxi-2,13,15-trimetil-5-oxotetraciclo[8.7.0.02,7.011,15]heptadeca-3,6-dien-14-il]-2-oxoetil metanosulfonato (2c)
[2958] Ciertos métodos y/o intermedios en WO2015/71657 A1 fueron empleados:
[2961]
[2963] Siguiendo el procedimiento general A, se obtuvo el compuesto 2c (0.32 g, rendimiento del 50 %) como un sólido blanco a partir de dexametasona (1c, 0.53 g, 1.4 mmol). ESI m/z: 471 (M H)+. 1H RMN (MeODd4, 500 MHz) 8 7.42 (d,J =10.0 Hz, 1H), 6.31 (dd,J =10.0, 2.0 Hz, 1H), 6.10 (s, 1H), 5.27 (d,J =18.0 Hz, 1H), 5.04 (d,J =18.0 Hz, 1H), 4.30-4.27 (m, 1H), 3.21 (s, 3H), 3.10-3.05 (m, 1H), 2.78-2.71 (m, 1H), 2.55-2.40 (m, 1H), 2.36­ 2.32 (m, 1H), 2.27-2.21 (m, 1H), 1.93-1.88 (m, 1H), 1.82-1.74 (m, 1H), 1.61 (s, 3H), 1.58-1.51 (m, 2H), 1.25­ 1.20 (m, 1H), 1.06 (s, 3H), 0.89 (d,J =7.5 Hz, 3H) ppm.
[2964] Ejemplo 73
[2965] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[2966] 2-[(1 R,2S,8S,10S,11 S,13R,14R,15S,17S)-1,8-Difluoro-14,17-dihidroxi-2,13,15-trimetil-5-oxotetraciclo[8.7.0.02,7.011,15]heptadeca-3,6-dien-14-il]-2-oxoetil metanosulfonato (2d)
[2969]
[2971] Ciertos métodos y/o intermedios en Bioorg. Med. Chem. Lett., 2015, 25, 2837-2843 fueron empleados: Siguiendo el procedimiento general A, el compuesto 2d (0.17 g, rendimiento del 71 %) se obtuvo como un sólido blanco a partir de flumetasona (1d, 0.20 g, 0.49 mmol). ESI m/z: 489 (M H)+.
[2972] Ejemplo 74
[2973] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[2974] 2-((8S,9R,10S,11 S,13S,14S,16R,17S)-9-Fluoro-11,16,17-trihidroxi-10,13-dimetil-3-oxo-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-3H-ciclopenta[a]phenanthren-17-il)-2-oxoetil metanosulfonato (2e)
[2977]
[2979] Siguiendo el procedimiento general A, el compuesto 2e (0.38 g, rendimiento del 81 %) se obtuvo como un sólido blanco a partir de triamcinolona (1e, 0.39 g, 1.0 mmol). ESI m/z: 473 (M H)+.
[2980] Ejemplo 75
[2981] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[2982] 2-((6S,8S,9S,10R,11S,13S,14S,17R)-11,17-Dihidroxi-6,10,13-trimetil-3-oxo-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-3H-ciclopenta[a]phenanthren-17-il)-2-oxoetil metanosulfonato (2f)
[2985]
[2987] Siguiendo el procedimiento general A, compuesto 2f (0.16 g, rendimiento del 35 %) se obtuvo como un sólido blanco a partir de metilprednisolona (1f, 0.38 g, 1.0 mmol). ESI m/z: 453 (M H)+.
[2988] Ejemplo 76
[2989] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[2990] 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S)-12-Fluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil metanosulfonato (2h)
[2993]
[2995] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y FIG. 31.
[2996] Siguiendo el procedimiento general A, el compuesto 2h (0.45 g, rendimiento del 85 %) se obtuvo como un sólido blanco a partir de metilprednisolona (1 h, 0.39 g, 1.0 mmol). ESI m/z: 528 (M H)+.
[2997] Ejemplo 77
[2998] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[2999] Síntesis de la carga útil esteroide 4b.
[3000] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-Azidoacetil)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.048.01318íicosa-14,17-dien-16-ona (3b)
[3001]
[3004] Una suspensión del compuesto 2b (1.0 g, 1.8 mmol) y azida sódica (1.2 g, 18 mmol) en acetona (15 mL) se agitó a 50 °C durante la noche, momento en donde la reacción se completó según el análisis LCMS. Después de enfriar la suspensión, la mezcla de reacción se vertió en agua fría (80 mL). La mezcla acuosa se extrajo con acetato de etilo (50 mL x 3). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera (30 mL), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío para producir el compuesto crudo 3b (0.90 g, > 99 % de rendimiento) como un sólido amarillo, que se utilizó para el siguiente paso sin purificación adicional. ESI m/z: 492 (M H)+.
[3005] (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-Aminoacetil)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-16-ona; sal de ácido trifluoroacético (4b)
[3008]
[3011] A un matraz de fondo redondo de 100 mL se le añadió el compuesto 3b (0.85 g, 1.7 mmol), seguido de la adición de THF (20 mL) y clorhidrato ac. (1 N, 10 mL). La mezcla se agitó a 28-32 °C hasta que se volvió transparente, a lo que luego se agregó trifenilfosfina (0.68 g, 2.6 mmol) a esta temperatura. La solución transparente de color amarillo resultante se agitó a 28-32 °C durante 18 horas, cuando la reacción se completó según TLC y LCMS. La mezcla se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía instantánea en fase reversa (0-50% de acetonitrilo en TFA ac. (0.05%)) para dar el compuesto del título 4b (0.56 g, rendimiento del 57 %, sal de TFA) como un sólido blanquecino. ESI m/z: 466 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, MeODd4) 87.33 (d,J= 9.9 Hz, 1H), 6.40-6.29 (m, 2H), 5.69-5.45 (m, 1H), 4.93-4.92 (m, 1H), 4.71 (t,J= 4.3 Hz, 1H), 4.35-4.27 (m, 2H), 3.90-3.84 (m, 1H), 2.81-2.54 (m, 1H), 2.42-2.06 (m, 3H), 1.82-1.32 (m, 11H), 1.09-0.87 (m, 6H) ppm. 19F RMN (376 MHz, MeODdd) 5-77.01, -166.24, -166.92, -188.81, -188.83 ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 6.86 min (método A).
[3013] Ejemplo 78
[3015] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[3017] (1R,2S,10S,11S,13R,14R,15S,17S)-14-(2-Aminoacetil)-1-fluoro-14,17-dihidroxi-2,13,15-trimetiltetraciclo [8.7.0.02701115]heptadeca-3,6-dien-5-ona trifluoroacetato (4c)
[3020]
[3023] Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 77 para elaborar el compuesto 4b, excepto que se sustituyó el compuesto 2c por el compuesto 2d, se obtuvo el compuesto 4c como sal TFA (0.50 g, rendimiento del 53 % en 2 pasos) como un sólido blanco. ESI m/z: 392 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOde) 88.22 (s, 3H), 7.35 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 6.19 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 5.98 (s, 1H), 5.60 (d,J =4.0 Hz, 1H), 5.38 (s, 1H), 4.30-4.10 (m, 2H), 3.62 (d,J =18.8 Hz, 1H), 2.98-2.83 (m, 1H), 2.65-2.50 (m ,1H), 2.50-2.22 (m, 2H), 2.20-2.01 (m, 2H), 1.80-1.72 (m, 1H), 1.72-1.58 (m, 1H), 1.46 (s, 3H), 1.46-1.25 (m, 2H), 1.13-1.01 (m, 1H), 0.89 (s, 3H), 0.78 (d,J =6.8 Hz, 3H) ppm. 19F RMN (376 MHz, DMSOde) 5-73.79, -164.32 ppm. HPLC Anal.: > 99%, Tiempo de retención: 6.34 min (método A).
[3025] Ejemplo 79
[3027] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[3029] (1R,2S,8S,10S,11S,13R,14R,15S,17S)-14-(2-Aminoacetil)-1,8-difluoro-14,17-dihidroxi-2,13,15-trimetiltetracycle [8.7.0.02701115]heptadeca-3,6-dien-5-ona trifluoroacetato (4d)
[3030]
[3032] Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 77 para preparar el compuesto 4b, excepto que se sustituyó el compuesto 2d por el compuesto 2b, se obtuvo el compuesto 4d como sal TFA (0.18 g, rendimiento del 21 % en 2 pasos) como un sólido blanco. ESI m/z: 410 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOde) 58.17 (s, 3H), 7.36 (d,J= 10.3 Hz, 1H), 6.29 (dd,J= 10.2, 1.7 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 5.74-5.54 (m, 2H), 5.42 (s, 1H), 4.28-4.10 (m, 2H), 3.70-3.59 (m, 1H), 3.02-2.89 (m, 1H), 2.58-2.40 (m, 1H), 2.31-2.12 (m, 3H), 2.08 (s, 1H), 1.77-1.64 (m, 1H), 1.51-1.44 (m, 4H), 1.16-1.06 (m, 1H), 0.91 (s, 3H), 0.82 (d,J =7.2 Hz, 3H).ppm. 19F RMN (376 MHz, DMSOde)5-73.65, -163.75, -186.04 ppm. HPLC Anal.: > 99%, Tiempo de retención: 6.36 min (método A).
[3033] Ejemplo 80
[3034] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[3035] (8S,9R,10S,11 S,13S,14S,16R,17S)-17-(2-Aminoacetil)-9-fluoro-11,16,17-trihidroxi-10,13-dimetil-7,8,11,12,13,15,16,17-octahydro-6H-ciclopenta[a]phenanthren-3(9H,10H,14H)-ona trifluoroacetato (4e)
[3038]
[3040] Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 77 para preparar el compuesto 4b, excepto que se sustituyó el compuesto 2e por el compuesto 2b, se obtuvo el compuesto 4e como sal TFA (28 mg, rendimiento del 21 % en 2 pasos) como un sólido blanco. ESI m/z: 394 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 58.04 (s, 3H), 7.33 (d,J =10 Hz, 1H), 6.24 (dd,J =10 Hz, 1.0 Hz, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.53 (d,J =5.5 Hz, 1H), 5.50-5.45 (m, 1H), 5.04 (s, 1H), 4.76-4.70 (m, 1H), 4.20-4.12 (m, 2H), 3.68 (d,J =20 Hz, 1H), 2.66-2.57 (m, 1H), 2.40-2.20 (m, 3H), 2.20­ 2.10 (m, 1H), 1.90-1.70 (m, 2H), 1.50-1.20 (m, 6H), 0.89 (s, 3H)ppm. HPLC Anal.: > 99%, Tiempo de retención: 5.79 min (método A).
[3041] Ejemplo 81
[3042] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y FIG. 31.
[3043] (6S,8S,9S,10R,11 S,13S,14S,17R)-17-(2-Aminoacetil)-11,17-dihidroxi-6,10,13-trimetil-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-3H-ciclopenta[a]phenanthren-3-ona (4f)
[3046]
[3048] Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 77 para preparar el compuesto 4b, excepto que se reemplazó 2b por 2f y se agitó a 60 °C, no a 28-32 °C, en el 2o paso, se obtuvo el compuesto 4f (10 mg, rendimiento del 14 % en 2 pasos) como un sólido amarillo después de la purificación por HPLC preparativa (método B). ESI m/z: 466 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, MeODdd) 88.50 (s, 1H), 7.50 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 6.27 (dd,J= 1.6 Hz, 10.0 Hz, 1H), 6.02 (s, 1H), 4.43-4.42 (m, 1H), 4.32-4.27 (m, 1H), 3.80-3.76 (m, 1H), 2.79-2.73 (m, 2H), 2.29-2.15 (m, 3H), 1.83-1.50 (m, 7H), 1.10-0.80 (m, 8H) ppm.
[3049] Ejemplo 82
[3050] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[3051] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S)-8-(2-Aminoacetil)-12-fluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.0.48.01318]icosa-14,17-dien-16-ona (4h) con isómeros22R/S(relación 2:1)
[3052]
[3054] Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 77 para preparar el compuesto 4b, excepto que se sustituyó el compuesto 2h (0.26 g, 0.5 mmol) por el compuesto 2b, se obtuvo el compuesto 4h (5 mg, rendimiento del 6 % en 2 pasos) como un sólido amarillo después de la purificación por HPLC preparativa (método A) dos veces. ESI m/z: 448 (M H)+. 1H RMN (500MHz, DMSOde) 88.04 (s, 3H), 7.95-7.70 (m, 1H), 7.32 (d,J= 10 Hz, 1H), 6.24 (d,J= 9.0 Hz, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.65-5.55 (m, 1H), 5.18 (t,J =4 Hz, 0.24H), 5.12 (d,J =5 Hz, 0.24H), 4.77 (d,J= 5.0 Hz, 0.76H), 4.66 (t,J= 4 Hz, 0.76H), 4.25-4.10 (m, 2H), 3.80-3.70 (m, 1H), 2.65-2.55 (m, 1H), 2.36-2.30 (m, 1H), 2.05-1.95 (m, 2H), 1.85-1.75 (m, 1H), 1.70-1.55 (m, 4H), 1.48 (s, 3H), 1.40-1.30 (m, 3H), 1.25-1.20 (m, 1H), 0.90-0.80 (m, 6H) ppm. 19F RMN (376 MHz, DMSOde) 5-73.51 (3F), -164.50 (0.3F), -165.27 (0.7F) ppm.
[3055] Ejemplo 83
[3056] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[3057] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-{2-[(4-Aminofenil)amino]acetil}-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.04,8.01318]icosa-14,17-dien-16-ona trifluoroacetato (5-I)
[3060]
[3062] Al compuesto 2b (0.10 g, 0.18 mmol) en DMF (2 mL) en un tubo con tapa de rosca se agregaron 4-hidroxianilina (0.10 mg, 0.92 mmol), trietilamina (0.20 g, 2.0 mmol) y yoduro de sodio (0.10 g, 0.67 mmol). La mezcla se agitó a 70 °C durante 5 horas, lo cual se monitorizó mediante LCMS. La mezcla de reacción se purificó directamente dos veces mediante HPLC preparativa (método A) para dar el compuesto 5-I (10 mg, rendimiento del 8%) como un sólido blanco. ESI m/z: 557 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 59.59 (brs, 3H), 7.50-5.96 (m, 8H), 5.76­ 3.81 (m, 7H), 2.73-2.55 (m, 1H), 2.28 (s, 1H), 2.20-1.99 (m, 2H), 1.86-1.79 (m, 1H), 1.70-1.27 (m, 10H), 0.93­ 0.76 (m, 6H) ppm. 19F RMN (376 MHz, DMSOde) 5-73.90, -164.22, -165.02, -186.37 ppm. HPLC Anal.: > 99%, Tiempo de retención: 7.55 min (método A).
[3063] Ejemplo 84
[3064] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[3065] Procedimiento general B para elaborar el compuesto 6 sustituyendo el compuesto 2 con fenol:
[3066] Al acetonitrilo o acetona caliente (60-65 °C) se le añadieron el compuesto 2 (1 eq.), el fenol correspondiente (2,0-2,5 eq.) y carbonato de potasio o carbonato de cesio (2,0-3,0 eq.). La suspensión resultante se sometió a reflujo durante 2-3 horas y se monitorizó mediante LCMS y TLC. Después de enfriar a temperatura ambiente, los volátiles se eliminaron al vacío y al residuo se le añadió agua. La mezcla acuosa se extrajo con acetato de etilo. La solución orgánica combinada se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró al vacío. El producto crudo se utilizó para el siguiente paso directamente o se purificó por cromatografía instantánea o HPLC preparativa para dar éster arílico puro 6.
[3067] Ejemplo 85
[3068] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[3069] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-[2-(4-Aminofenoxi)acetil]-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-16-ona (6-I)
[3070]
[3072] Siguiendo el procedimiento general B en una reacción de 2b (calculado como 0.17 mmol) con 4-aminofenol (37 mg, 0.34 mmol) y carbonato de cesio (0.11 g, 0.34 mmol) en acetona (0.5 mL), el compuesto del título 6-I (6.0 mg, 6.3 % de rendimiento de 1b) se obtuvo como un sólido blanco después de la purificación por HPLC preparativa (método B). ESI m/z: 298 (M/2 H)+, 558 (M H)+ (10%). 1H RMN (500 MHz, MeODdd) 87.34 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 6.78-6.71 (m, 4H), 6.37-6.33 (m, 2H), 5.63-5.49 (m, 1H), 5.10-4.99 (m, 1H), 4.77-4.63 (m, 2H), 4.33 (d,J= 9.1 Hz, 1H), 2.74-2.57 (m, 1H), 2.39-2.13 (m, 3H), 1.98-1.31 (m, 12H), 1.03-0.93 (m, 6H) ppm. HPLC Anal.: pureza 97.4%, Tiempo de retención: 7.55 min (método B).
[3073] Ejemplo 86
[3074] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[3075] (1S,2S,4R,6S,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-[2-(4-Aminofenoxi)acetil]-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-16-ona (S-6-I)
[3078]
[3080] Siguiendo el procedimiento general B excepto reemplazando 2b con S-2b, el compuesto S-6-I (19 mg, 19 % de rendimiento en 2 pasos desde S-2b) se obtuvo como un sólido blanco. ESI m/z: 558 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOde) 57.26 (dd,J= 10.2, 1.0 Hz, 1H), 6.65-6.55 (m, 2H), 6.51-6.44 (m, 2H), 6.30 (dd,J= 10.2, 1.9 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 5.74-5.46 (m, 2H), 5.23 (t,J= 4.9 Hz, 1H), 5.14 (d,J= 7.2 Hz, 1H), 4.99 (d,J= 18.2 Hz, 1H), 4.74-4.55 (m, 3H), 4.26-4.12 (m, 1H), 2.65-2.53 (m, 1H), 2.29-2.19 (m, 1H), 2.13-1.94 (m, 2H), 1.86-1.22 (m, 11H), 0.92-0.78 (m, 6H) ppm. 19F RMN (376 MHz, DMSOde) 8 -164.26, -186.38 ppm. HPLC Anal.: > 99%, Tiempo de retención: 7.34 min (método B).
[3081] Ejemplo 87
[3082] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[3083] Se emplearon ciertos métodos en Org. Biomol. Chem., 2014, 12, 7551-7560 .
[3084] Paso uno: 4-Amino(2H4)fenol:
[3087]
[3089] En un tubo de microondas de 20 mL se cargó 4-hidroxianilina (0.97 g, 8.9 mmol), óxido de deuterio (D2O, 10 mL) y cloruro de deuterio conc. (DCl, 125 uL) para dar una suspensión. El tubo se llenó con atmósfera de nitrógeno, se selló y se irradió con microondas (CEM Discover SP) a 180 °C durante 2.5 horas, lo cual fue monitorizado por LCMS. Luego la mezcla se enfrió a temperatura ambiente (28-32 °C) y se mantuvo a esta temperatura durante 18 horas. Los volátiles se eliminaron al vacío para dar un residuo marrón, que se suspendió en óxido de deuterio (10 mL) en un tubo de microondas de 20 mL. El tubo se llenó con nitrógeno, se selló y se irradió con microondas a 180 °C durante 5.5 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente (28­ 32 °C), la mezcla se mantuvo a esta temperatura durante 16 horas. Los volátiles se eliminaron al vacío y el residuo se purificó por cromatografía instantánea (10-60% de acetato de etilo en éter de petróleo) para obtener 4-Amino(2H4)fenol (0.50 g, rendimiento del 50%) como un sólido marrón. 1H RMN (500 MHz, DMSOde)58.31 (s, 1H), 4.36 (s, 2H) ppm.
[3090] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-{2-[4-Amino(2,3,5,6-2H4)fenoxi]acetil}-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,801318]icosa-14,17-dien-16-ona (6-I D)
[3093]
[3095] Paso dos: A una mezcla de 4-Amino(2H4)fenol (0.10 g, 0.88 mmol) en DMSO (3 mL) se añadió hidróxido de potasio (45 mg, 0.80 mmol). Después de agitar a 28-32 °C durante 2 minutos y luego agitar a 60 °C, a la mezcla se le añadió el compuesto 2b (0.20 g, 0.40 mmol) en una porción y se agitó bajo protección de nitrógeno a 60 °C durante una hora. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método A) y luego mediante HPLC preparativa (método B) para proporcionar 6-II (10 mg, rendimiento del 4.4 %) como un sólido blanquecino. ESI m/z: 562 (M H)+. 1H RM<n>(400 MHz, DMSOde)57.27 (d,J =10.1 Hz, 1H), 6.30 (dd,J =10.1, 1.7 Hz, 1H), 6.12 (s, 1H), 5.74-5.45 (m, 2H), 5.03-4.93 (m, 1H), 4.82­ 4.58 (m, 4H), 4.27-4.14 (m, 1H), 3.33 (s, 1H), 2.70-2.53 (m, 1H), 2.31-2.20 (m, 1H), 2.14-1.93 (m, 2H), 1.86­ 1.70 (m, 1H), 1.67-1.24 (m, 10H), 0.92-0.73 (m, 6H) ppm. 19F RMN (376 MHz, DMSOde) 5 -164.24, -165.05, -186.35 ppm. HPLC Anal.; 98.41%, Tiempo de retención: 7.34 min (método B)
[3096] El compuesto 6-ID es útil, por ejemplo, para métodos analíticos.
[3097] Ejemplo 88
[3098] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[3099] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-[2-(4-Amino-3-metoxifenoxi)acetil]-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-16-ona trifluoroacetato (6-II)
[3102]
[3104] Siguiendo el procedimiento general B, mediante la reacción de compuestos 2b (0.50 g, 0.92 mmol) con 4-amino-3-metoxifenol (0.32 g, 2.3 mmol) y carbonato de cesio (0.60 g, 1.8 mmol) en acetonitrilo (20 mL), el compuesto 6-II (0.25 g, rendimiento del 47 %) se obtuvo como un sólido blanco. ESI m/z: 588 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOde) 59.00 (s, 2H), 7.33-7.23 (m, 1H), 7.16-7.08 (m, 1H), 6.77-6.68 (m, 1H), 6.52-6.41 (m, 1H), 6.35-6.27 (m, 1H), 6.12 (s, 1H), 5.74-5.51 (m, 2H), 5.31-5.11 (m, 2H), 4.98-4.68 (m, 3H), 4.28-4.15 (m, 1H), 3.90-3.83 (m, 3H), 2.74-2.55 (m, 1H), 2.35-2.21 (m, 1H), 2.17-1.97 (m, 2H), 1.88-1.75 (m, 1H), 1.67-1.28 (m, 10H), 0.93-0.78 (m, 6H) ppm. HPLC Anal.: > 99%, Tiempo de retención: 7.68 y 7.72 min (método A).
[3105] Ejemplo 89
[3106] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[3107] Elaboración del compuesto 6-III
[3108] (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-[2-(4-Amino-3-fluorofenoxiacetil]-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-16-ona (6-III)
[3109]
[3112] A una botella de fondo redondo se le añadieron el compuesto 2e (0.20 g, 0.37 mmol), 4-amino-3-fluorofenol (0.25 g, 2.0 mmol), hidróxido de potasio (0.11 g, 2.0 mmol) y DMSO (3 mL) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó a 60 °C durante una hora bajo protección de nitrógeno hasta que se completó la reacción, lo que se monitorizó mediante TLC y LCMS. Después de enfriar a temperatura ambiente y filtrar a través de una membrana, la solución de reacción se purificó directamente por HPLC preparativa (método A) para dar el compuesto del título 6-III (40 mg, rendimiento del 19 %) como un sólido blanquecino. ESI m/z: 576 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODdd) 57.40-7.31 (m, 1H), 7.20 (td,J= 9.1, 1.9 Hz, 1H), 6.91-6.84 (m, 1H), 6.80-6.76 (m, 1H), 6.40-6.30 (m, 2H), 5.57 (ddd,J= 48.6, 9.7, 6.8 Hz, 1H), 5.15 (d,J= 18.1 Hz, 1H), 4.90-4.79 (m, 2H), 4.75 (t,J= 4.3 Hz, 1H), 4.41-4.28 (m, 1H), 2.78-2.57 (m, 1H), 2.40-2.12 (m, 3H), 1.98-1.39 (m, 11H), 1.07-0.92 (m, 6<h>) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 8.10 min (método A).
[3114] Ejemplo 90
[3116] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 2 y la FIG. 31.
[3118] (6S,8S,9S,10R,11 S,13S,14S,17R)-17-(2-(4-Aminofenoxi)acetil)-11,17-dihidroxi-6,10,13-trimetil-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-3H-ciclopenta[a]phenanthren-3-ona (6-VI)
[3121]
[3124] A una solución del compuesto 2f (60 mg, 0.13 mmol) en DMF (3 mL) se añadieron carbonato de cesio (86 mg, 0.26 mmol) y W-Boc-4-aminofenol (28 mg, 0.13 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, lo que se monitorizó mediante LCMS. La mezcla se diluyó con acetato de etilo (10 mL). La solución orgánica se lavó con agua (10 mL), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. El residuo blanco (50 mg, ESI m/z: 566 (M H)+) se disolvió en DCM (5 mL) y a la solución se añadió TFA(0.5 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas hasta que el Boc se eliminó totalmente según LCMS. Los volátiles se eliminaron al vacío. Y el residuo se purificó mediante cromatografía instantánea en fase reversa (0-25% de acetonitrilo en agua) para dar 6-VI (10 mg, rendimiento del 7.5 %) como un sólido blanco. ESI m/z: 466 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOde) 87.32 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 6.61-6.58 (m, 2H), 6.51-6.47 (m, 2H), 6.19 (dd,J =10.0, 1.6 Hz, 1H), 5.82 (t,J= 1.6 Hz, 1H), 5.39 (s, 1H), 5.04-5.01 (m, 3H), 4.66 (d,J= 3.2 Hz, 1H), 4.58 (d,J= 18.0 Hz, 1H), 4.30 (d,J= 2.4 Hz, 1H), 2.67-2.50 (m, 2H), 2.13-2.01 (m, 2H), 1.93-1.89 (m, 1H), 1.67-1.61 (m, 3H), 1.45-1.30 (m, 5H), 1.01 (d,J= 3.2 Hz, 3H), 0.95-0.71 (m, 5H) ppm.
[3126] Ejemplo 91
[3128] Este ejemplo demuestra los procedimientos sintéticos generales para hacer intermedios de las cargas útiles del enlazador en la Tabla 4.
[3130] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 4 y las FIGS. 31 y 33.
[3132] La síntesis de Carga útiles del Enlazador (LP1-LP16) comenzó haciendo carbonatos L4 de las reacciones de aminas (4) o anilinas (6) con Val-Cit-PAB-PNP protegido (L2a o L2b) seguido de N-desprotección, o de la generación de las amidas L4 entre anilinas (6) con Val-Cit-OH o Fmoc-Val-Ala-OH protegidos con Boc o Fmoc (L3a-c) seguido de N-desprotección. Los compuestos L4 Luego se acoplaron directamente con L9 o L10 para generar los esteroides enlazadores finales LP1, LP2, LP3, LP13, LP14, LP15 y LP16. Los compuestos L4 también se acoplaron con Fmoc-D-Lys-COT L5 seguido de de-Fmoc para producir L6, que fueron sometidos a [3+2] cicloadiciones con azido-ciclodextrina (7a) o azido sulfonatos (7b o 7c) para generar L8. Finalmente, las reacciones de acoplamiento de L8 con ácido PEG4 o NHS éster (L9 o L10) se utilizaron para producir la carga útil del enlazador LP5, LP8, LP10, y LP12.
[3134] Procedimiento general C para la síntesis del intermedio L4:
[3136] A una solución de carga útil 4 o 6 (1.0 eq.) y Boc-vcPAB-PNP (1.1 eq.) en DMF (1 mL por 10 mg de carga útil) se agregaron HOBt (1.0 eq.) y DIPEA (2.0 eq.) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente (18-30 °C) durante la noche hasta que se consumió la carga útil, lo cual se monitorizó mediante LCMS. Después de filtrar a través de una membrana, la solución de reacción se purificó directamente mediante HPLC preparativa para obtener Boc-L4 (rendimiento del 52%) como un sólido blanco, que se disolvió en DCM (0.6 mL por mg de Boc-L4). A esta solución se le añadió gota a gota TFA (0.2 mL por mg de Boc-L4) a 0 °C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente (18-30 °C) durante una hora hasta la eliminación del Boc, lo cual se monitorizó mediante LCMS. Los volátiles se eliminaron al vacío dar compuesto L4, que se utilizó para el siguiente paso sin purificación adicional.
[3137] Procedimiento general D para la síntesis del intermedio L4:
[3138] A una solución de carga útil 4 o 6 (1.0 eq.) en DMF (0.3 mL por 10 mg de carga útil) se agregaron Fmoc-vcPAB-PNP (1.1 eq.), HOBt (1.5 eq.) y DIPEA (2.0 eq.) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente (18-30 °C) durante 3 horas hasta que la carga útil se consumió totalmente, lo cual se monitorizó mediante LCMS. A la mezcla de reacción se añadió piperidina (0.03 mL por cada 10 mg de carga útil) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente (18-30 °C) durante una hora hasta que se eliminó el Fmoc, lo cual se monitorizó mediante LCMS. Después de filtrar a través de membrana, la solución de reacción se purificó directamente mediante cromatografía instantánea en fase reversa o HPLC preparativa para dar el compuesto L4.
[3139] Procedimiento general E para la síntesis del intermedio L4:
[3140] A una solución de Boc-Val-Ala-OH o Boc-Val-Cit-OH (1.0 eq.) en DCM (0.2 mL por 10 mg de péptido) se añadieron DIPEA (2.0 eq.) y HATU (1.2 eq.) a 20-25 °C. La mezcla se agitó a 20-25 °C durante 30 minutos, seguido de la adición de anilina (1.1 eq.) y se mantuvo en agitación durante 16 horas hasta la completa absorción del péptido, lo cual se monitorizó mediante LCMS. A continuación, a la mezcla de reacción se añadió TFA (0.05 mL por cada 10 mg de péptido). La mezcla se agitó a 20-25 °C durante otra hora. Los volátiles se eliminaron a presión reducida y el residuo se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) para dar el compuesto L4.
[3141] Procedimiento general F para la síntesis del intermedio L4:
[3142] A una solución de Fmoc-Val-Ala-OH (1.2 eq.) en DMF (0.2 mL por 10 mg de péptido) se añadieron DIPEA (3.0 eq.) y HATU (1.4 eq.) a 20-25 °C. La mezcla se agitó a 20-25 °C durante 5 minutos, seguido de la adición de anilina (1.0 eq.) y la mezcla resultante se agitó durante 2 horas hasta que el péptido se consumió por completo, lo cual se monitorizó mediante LCMS. A continuación se añadió piperidina (5.0 eq.) a la mezcla de reacción. La mezcla se agitó a 20-25 °C durante 2 horas. Después de filtrar a través de la membrana, la solución de reacción se purificó directamente mediante cromatografía instantánea en fase reversa (0-100% de acetonitrilo en bicarbonato de amonio ac. (10 mM)) o HPLC preparativa (método B) para dar el compuesto L4.
[3143] Ejemplo 92
[3144] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 4 y la FIG. 33.
[3145] Elaboración del compuesto L4a, VA-R-6-VI
[3146] (2S)-2-Amino-N-[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]-3-metilbutanamida
[3149]
[3151] Siguiendo el Procedimiento General E (rendimiento del 65%) o F (rendimiento del 53%) de R-6-VI, el compuesto L4a se obtuvo como un sólido blanco. ESI m/z: 692 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 59.95 (d,J =8.2 Hz, 1H), 8.19-8.09 (m, 1H), 7.54-7.47 (m, 2H), 7.33 (d,J= 10.1 Hz, 1H), 6.85 (d,J= 9.0 Hz, 2H), 6.22-6.13 (m, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.14-5.04 (m, 1H), 4.86-4.77 (m, 2H), 4.75 (d,J= 4.2 Hz, 1H), 4.70 (t,J= 4.3 Hz, 1H), 4.48­ 4.38 (m, 1H), 4.34 (s, 1H), 3.01 (t,J= 5.0 Hz, 1H), 2.58-2.52 (m, 1H), 2.33-2.25 (m, 1H), 2.13-2.06 (m, 1H), 2.03-2.00 (m, 1H), 1.95-1.89 (m, 1H), 1.88-1.84 (m, 2H), 1.63-1.53 (m, 5H), 1.45-1.33 (m, 6H), 1.32-1.26 (m, 3H), 1.06-0.93 (m, 2H), 0.92-0.82 (m, 10H), 0.80-0.75 (m, 3H) ppm.
[3152] Ejemplo 93
[3153] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 4 y la FIG. 33.
[3154] Elaboración del compuesto L4b, vcPAB-4b
[3155] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-Amino-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metil N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,801318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil}carbamato
[3158]
[3160] Siguiendo el Procedimiento General D del compuesto 4b, (93 mg, 0.20 mmol), el compuesto vcPAB-4b (0.13 g, rendimiento del 73 %) se obtuvo después de la purificación por cromatografía instantánea en fase reversa (50-80 % de acetonitrilo en bicarbonato de amonio ac. (10 mM)) como un sólido blanco. ESI m/z: 871 (M H)+.
[3161] Ejemplo 94
[3162] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 4 y la FIG. 33.
[3163] Elaboración del compuesto L4c, VA-6-I
[3164] (2S)-2-Amino-N-[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]-3-metilbutanamida
[3167]
[3169] Siguiendo el Procedimiento General E del compuesto 6-I, (0.50 g, 0.90 mmol) con Boc-Val-Ala-OH, el compuesto crudo L4c (0.69 g, rendimiento del 72 % en 2 pasos) se obtuvo sin purificación como un aceite amarillo, que se utilizó directamente para el siguiente paso. ESI m/z: 728 (M H)+.
[3170] Ejemplo 95
[3171] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 4 y la FIG. 33.
[3172] Elaboración del compuesto L4d, VC-PAB-6-I
[3173] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-Amino-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metil N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamato
[3176]
[3178] Siguiendo el Procedimiento General E del compuesto 6-I, (87 mg, 0.15 mmol), el compuesto L4d (80 mg, rendimiento del 64 %) se obtuvo como un sólido blanco después de la purificación por HPLC preparativa (método B). ESI m/z: 963 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 510.22 (s, 1H), 9.57 (s, 1H), 8.69 (d,J= 7.5 Hz, 1H), 8.08 (s, 3H), 7.61 (d,J= 6.8 Hz, 2H), 7.36 (d,J= 6.8 Hz, 3H),7.27 (d,J =8.0 Hz, 1H), 7.22-7.0 (m, 1H), 6.84 (d,J =7.2 Hz, 2H), 6.30 (dd,J =8.0 Hz,J= 1.6 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 6.10-6.0 (m, 1H), 5.72-5.55 (m, 1H), 5.52 (s, 1H), 5.48 (s, 1H), 5.16-5.05 (m, 3H), 4.88-4.80 (m, 1H), 4.80-4.76 (m, 1H), 4.75-4.70 (m, 1H), 4.55 4.48 (m, 1H), 4.25-4.20 (m, 1H), 3.70-3.60 (m, 1H), 3.12-2.90 (m, 2H), 2.70-2.55 (m, 1H), 2.40-2.20 (m, 1H), 2.15-2.0 (m, 3H), 1.86-1.75 (m, 1H), 1.75-1.65 (m, 1H), 1.64-1.54 (m, 5H), 1.49 (s, 4H), 1.46-1.34 (m, 4H), 0.97­ 0.91 (m,5H), 0.90-0.85 (m, 4H), 0.85-0.80 (m, 3H) ppm.
[3179] Ejemplo 96
[3180] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 4 y FIG. 33.
[3181] Elaboración del compuesto L4e, VA-6-II
[3182] (2S)-2-Am¡no-W-[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-d¡fluoro-11-h¡drox¡-9,13-d¡metil-16-oxo-6-prop¡l-5,7-d¡oxapentac¡clo[10.8.0.02,9.04,801318]¡cosa-14,17-d¡en-8-¡l]-2-oxoetox¡}-2-metox¡fen¡l)carbamo¡l]et¡l]-3-met¡lbutanam¡da
[3185]
[3187] Siguiendo el procedimiento general F del compuesto 6-111, (0.10 g, 0.17 mmol), se obtuvo el compuesto crudo L4e (0.12 g, rendimiento del 82 % en 2 pasos) que se utilizó para el siguiente paso sin purificación adicional. ESI m/z: 758 (M H)+.
[3188] Ejemplo 97
[3189] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 4 y la FIG. 33.
[3190] Elaboración del compuesto L4f, VA-6-III
[3191] (2S)-2-Amino-N-[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-d¡fluoro-11-h¡drox¡-9,13-d¡met¡l-16-oxo-6-prop¡l-5,7-d¡oxapentac¡clo[10.8.0.02,9.04,8.01318]¡cosa-14,17-d¡en-8-¡l]-2-oxoetox¡}-2-fluorofenil)carbamoil]etil]-3-metilbutanamida
[3194]
[3196] Siguiendo el procedimiento general F del compuesto L4f, (95 mg, 0.17 mmol), se obtuvo el compuesto del título L4f crudo (0.10 g, rendimiento del 66 % en 2 pasos) que se utilizó para el siguiente paso sin purificación adicional. ESI m/z: 746 (M H)+.
[3197] Ejemplo 98
[3198] Este ejemplo se refiere a los compuestos de la Tabla 4 y la FIG. 33.
[3199] Síntesis de intermedios de cargas útiles del enlazador L6
[3200] Procedimiento general: A una solución del compuesto L5 (1.2 eq.) en DMF (0.2 mL por 10 mg de L5) se añadieron HATU (1.4 eq.) y DIPEA (3 eq.) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de la adición del compuesto L4 (1.0 eq.). Luego, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas hasta que el compuesto L4 fue consumido en su totalidad, lo cual fue monitorizado mediante LCMS. Después de filtrar a través de membrana, la solución de reacción se purificó directamente mediante HPLC preparativa para dar el ciclooctino L6.
[3201] Ejemplo 99
[3202] Procedimiento general H para la elaboración de intermedios 8
[3203] A una solución de L6 en DMF (0.5 mL por 10 mg de L6) se añadieron el compuesto azido (L7a (CD-N3), L7b (N3-PEG4-sulfonato) o L7c (N3-dualsulfonato), 1.5 eq.vs.L6) y DIPEA (0.1 mL por 10 mg de L6) a temperatura ambiente. Después de agitar a 30 °C durante 24 horas, se consumió la mayoría de los materiales de partida, lo que se monitorizó mediante LCMS. La mezcla de reacción se purificó directamente mediante HPLC preparativa para dar el compuesto L8 como un sólido blanco.
[3205] Ejemplo 100
[3207] Elaboración del compuesto L8a, aCDCCK-vcPAB-4b
[3209] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-Amino-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecahidroxi-10,15,20,25,30-pentakis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-dodecaoxaheptaciclo[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.22326]dotetracontan-5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-cicloocta[d][1,2,3]triazol-4-il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metil W-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil}carbamato (L8a)
[3212]
[3215] Siguiendo el procedimiento general H para elaborar el compuesto L6a (0.12 g, 0.10 mmol) con L7a, se obtuvo el compuesto L8a (0.11 g, rendimiento del 51%) como un sólido blanco. ESI m/z: 1081 (M/2 H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOde) 5 10.05 (s, 1H), 8.30-7.80 (m, 3H), 7.80-7.55 (m, 2H), 7.50-7.40 (m, 1H), 7.40-7.25 (m, 3H), 6.30 (d,J= 12.5 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 6.0 (s, 1H), 5.80-5.35 (m, 16H), 5.25-5.05 (m, 1H), 4.97 (s, 2H), 4.90-4.50 (m, 13H), 4.50-4.00 (m, 5H), 3.95-3.55 (m, 22H), 3.30-3.20 (m, 8H), 3.20-3.00 (m, 4H), 3.00-2.85 (m, 5H), 2.25-2.20 (m, 2H), 2.10-1.95 (m, 4H), 1.80-1.00 (m, 30H), 1.00-0.90 (m, 4H),0.90-0.80 (m, 14H) ppm.
[3216] Ejemplo 101
[3218] Elaboración del compuesto L8d, aCDCCK-VA-2168
[3220] (2R)-2-Amino-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.048.013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]carbamoil}-2-metilpropil]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecahidroxi-10,15,20,25,30-pentakis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-dodecaoxaheptaciclo [26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.22326]dotetracontan-5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-cicloocta[d][1,2,3]triazol-4-il)oxi]acetamido}hexanamida (L8d)
[3221]
[3223] Siguiendo el procedimiento general H de L6b (60 mg, 59 |jmol) con L7a, se obtuvo el compuesto L8d (40 mg, rendimiento del 34%) como un sólido blanco. ESI m/z: 1009.5 (M/2 H)+.
[3224] Ejemplo 102
[3225] Elaboración del compuesto L8f, aCDCCK-vcPAB-6-I
[3226] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-Amino-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecahidroxi-10,15,20,25,30-pentakis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-dodecaoxaheptaciclo[26.2.2.23628,11.213,156 *218 *20, 1 *.223,26]dotetracontan-5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-cicloocta[d][1,2,3]triazol-4-il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metil N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,904801318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamato
[3229]
[3231] Siguiendo el procedimiento general H de L6c (0.10 g, 80 jm ol) con L7a, se obtuvo el compuesto L8f (0.11 g, rendimiento del 58%) como un sólido blanco. ESI m/z: 751 (M/3 H)+.
[3232] Ejemplo 103
[3233] Elaboración de las cargas útiles del enlazador LP101 a LP116
[3234] Elaboración del compuesto LP1: L6a (COT-dLys-vcPAB-4b)
[3235] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-Amino-6-[2-(ciclooct-2-in-1-iloxi)acetamido]hexanamido]-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metil W-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9-128-12,2,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil}carbamato
[3236]
[3238] Siguiendo el Procedimiento General G para elaborar el compuesto L4b (0.20 g, 0.23 mmol), el compuesto L6a (0.12 g, rendimiento del 45 %) se obtuvo como un sólido blanco después de la HPLC preparativa (método B). ESI m/z: 1385 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, MeODdo) 87.65-7.55 (m, 2H), 7.40-7.26 (m, 3H), 6.39-6.27 (m, 2H), 5.65-5.45 (m, 1H), 5.13-5.01 (m, 2H), 4.71-4.50 (m, 2H), 4.40-4.14 (m, 4H), 4.11-3.82 (m, 3H), 3.46-3.39 (m, 1H), 3.29-3.09 (m, 4H), 2.76-2.54 (m, 1H), 2.41-2.10 (m, 7H), 2.09-1.99 (m, 1H), 1.96-1.80 (m, 5H), 1.78­ 1.21 (m, 23H), 1.06-0.82 (m, 12H) ppm.
[3239] Ejemplo 104
[3240] Elaboración del compuesto LP102: L6b (COT-dLys-VA-6-I)
[3241] (2R)-2-Amino-6-[2-(ciclooct-2-in-1-iloxi)acetamido]-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]carbamoil}-2-metilpropil]hexanamida
[3244]
[3246] Siguiendo el procedimiento general G para elaborar L4c (0.28 g, 0.38 mmol), el compuesto L6b (0.21 g, rendimiento del 46 %) se obtuvo como un sólido blanco después de la HPLC preparativa (método B). ESI m/z: 1021.5 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, MeODd4) 87.33-7.60 (m, 3H), 6.87-6.91 (m ,2H), 6.32-6.37 (m, 2H), 5.47­ 5.65 (m, 1H), 5.07-5.30 (m, 1H), 4.72-4.86 (m, 3H), 4.34-4.51 (m, 3H), 3.83-4.20 (m, 3H), 3.33-3.49 (m, 1H), 3.14-3.27 (m, 3H), 2.59-2.75 (m, 1H), 1.31-2.39 (m, 33 H), 0.93-1.05 (m, 12H) ppm.
[3247] Ejemplo 105
[3248] Elaboración del compuesto LP103: L6c (COT-dLys-vcPAB-6-I)
[3249] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-Amino-6-[2-(ciclooct-2-in-1-iloxi)acetamido]hexanamido]-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metil W-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamato
[3252]
[3254] Siguiendo el procedimiento general G para elaborar el compuesto L4d (0.14 g, 0.15 mmol), el compuesto L6c (0.10 g, rendimiento del 57 %) se obtuvo como un sólido blanco después de la HPLC preparativa (método B). ESI m/z: 1255.5 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, MeODcw) 57.61 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.32-7.39 (m, 4H), 6.84-6.88 (m, 2H), 6.31-6.36 (m, 2H), 5.43-5.63 (m, 1H), 5.05-5.16 (m, 3H), 4.71-4.83 (m ,1H), 4.50-4.54 (m,1H), 4.18­ 4.33 (m 3H), 3.00-2.85 (m, 2H), 3.40-3.51 (m, 1H), 3.00-3.29 (m, 6H), 1.31-2.35 (m, 34 H), 1.29 (t,J=7.2 Hz, 2H), 0.93-1.02 (m ,12H) ppm.
[3256] Ejemplo 106
[3258] Procedimiento general I para LP104 a LP116:
[3260] A una solución de PEG4-ácido L9 (1,2-1,3 eq.) en DMF (1 mL por 10 mg de L9) se agregaron HATU (1.3 eq.) y DIPEA (5.0 eq.) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente (19 °C) durante media hora, seguido de la adición de una solución del compuesto L4 o L8 (1.0 eq.) en DMF (0.6 mg por 10 mg de L4 o L8). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas hasta que el compuesto L4 o L8 se consumió, lo cual fue monitorizado mediante LCMS. Después de filtrar a través de membrana, el filtrado se purificó directamente mediante HPLC preparativa para dar el compuesto L1. (L9a: BCN-PEG4-ácido, L9b: DIBAC-PEG4-ácido, L9c: MAL-PEG4-ácido)
[3262] Procedimiento general J para LP104 a LP116
[3264] A una solución del compuesto L4 o L8 (1.0 eq.) en DMF (1 mL por 50 mg) se añadieron el compuesto DIBAC-PEG4-NHS L10b (1,1-1,2 eq.) y DIPEA (5.0 eq.) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, lo que se monitorizó mediante LCMS. La mezcla de reacción se purificó directamente mediante HPLC preparativa (método B) para dar el compuesto L1.
[3266] Ejemplo 107
[3268] Elaboración del compuesto LP104: L11a (DIBAC-PEG4-aCDCCK-vcPAB-4b
[3270] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-Azatriciclo[10.4.0.049]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecahidroxi-10,15,20,25,30-pentakis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-dodecaoxaheptaciclo[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.22326]dotetracontan-5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-cicloocta[d][1,2,3]triazol-4-il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metil W-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil}carbamato
[3273]
[3276] Siguiendo el procedimiento general I a partir del compuesto L8a (0.10 g, 46 pmol) con L9b, el compuesto L1a (26 mg, rendimiento del 22%) se obtuvo como un sólido blanco. ESI m/z: 1349 (M/2 H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 59.71 (s, 1H), 8.30-8.00 (m, 3H), 8.00-7.74 (m, 2H), 7.70-7.58 (m, 5H), 7.52-7.20 (m, 12H), 6.35-6.20 (m, 2H), 6.15-5.85 (m, 3H), 5.80-5.35 (m, 18H), 5.25-4.90 (m, 6H), 4.90-4.50 (m, 14H), 4.40-4.25 (m, 4H), 4.25­ 4.10 (m, 3H), 4.10-3.95 (m, 2H), 3.95-3.55 (m, 22H), 3.55-3.40 (m, 22H), 3.20-3.00 (m, 6H), 3.00-2.85 (m, 3H), 2.65-2.55 (m, 1H), 2.25-2.20 (m, 4H), 2.10-1.95 (m, 6H), 1.80-1.70 (m, 5H), 1.70-1.50 (m, 10H), 1.50-1.45 (m, 9H), 0.90-0.80 (m, 14H) ppm. HPLC Anal.: > 99%, Tiempo de retención: 6.23 min (método B).
[3278] Ejemplo 108
[3280] Elaboración del compuesto LP105: L11b (BCN-PEG4-aCDCCK-vcPAB-4b
[3281] (1R,8S,9S)-Biddo[6.1.0]non-4-in-9-ilmetil N-(14-{[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaddo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil}carbamoil)oxi]metil}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecahidroxi-10,15,20,25,30-pentakis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-dodecaoxaheptaddo[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.22326]dotetracontan-5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ddoocta[d][1,2,3]triazol-4-il)oxi]acetamido}pentil]carbamoil}-3,6,9,12-tetraoxatetradecan-1-il)carbamato
[3284]
[3287] Siguiendo el Procedimiento General I a partir del compuesto L8a (22 mg, 10 |jmol) con BCN-PEG4-ácido L9a, el compuesto L1b (10 mg, rendimiento del 38%) se obtuvo como un sólido blanco. ESI m/z: 1293 (M/2 H)+.
[3288] 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 59.68 (s, 1H), 8.14-7.08 (m, 11H), 6.30 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 5.99 (s, 1H), 5.67-5.31 (m, 15H), 5.21-3.33 (m, 61H), 3.13-2.60 (m, 22H), 2.30-1.96 (m, 46H), 0.95-0.80 (m, 17H) ppm. HPLC Anal.: Tiempo de retención: 7.31 min (48%) y 7.41 (52%) (método B).
[3290] Ejemplo 109
[3292] Elaboración del compuesto LP108: L11e (DIBAC-PEG4-aCDCCK-VA-6-I
[3294] 1- (4-{2-Azatnddo[10.4.0.04’9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-¡l}-4-oxobutanam¡do)-W-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(18S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentacido[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]carbamoil}-2- metilpropil]carbamoil}-5-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecahidroxi-10,15,20,25,30-pentakis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-dodecaoxaheptacido[26.2.2.23,6.28,11.213,16.218,21.22326]dotetracontan-5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-cidoocta[d][1,2,3]triazol-4-il)oxi]acetamido}pentil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida
[3297]
[3298] Siguiendo el Procedimiento General J del compuesto L8d (19 mg, 9.4 |jmol) con DIBAC-PEG4-NHS L10b, el compuesto L1e (7.0 mg, rendimiento del 29%) se obtuvo como un sólido blanco. ESI m/z: 1276.8 (M/2 H)+.
[3299] 1H RMN (400 MHz, DMSOde) 59.80-9.47 (m, 1H), 8.23-7.91 (m, 3H), 7.83-7.11 (m, 13H), 6.87-6.66 (m, 2H), 6.32-6.11 (m, 2H), 5.85-5.23 (m, 14H), 5.14-5.01 (m, 3H), 4.86-3.99 (m, 19H), 3.85-3.40 (m, 38H), 3.27-2.87 (m, 13H), 2.76-2.55 (m, 3H), 2.33-2.20 (m, 4H), 2.12-1.91 (m, 6H), 1.83-1.72 (m, 4H), 1.59-0.98 (m, 31H), 0.89­ 0.84 (m, 12H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 7.76 min (método B).
[3301] Ejemplo 110
[3303] Elaboración del compuesto LP110: L11g (DIBAC-PEG4-aCDCCK-vcPAB-6-I
[3305] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-Azatriciclo[10.4.0.049]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecahidroxi-10,15,20,25,30-pentakis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29-dodecaoxaheptac¡clo[26.2.2.23’6.28’11.213’16.218’21.223’26]dotetracontan-5-¡l]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-cicloocta[d][1,2,3]triazol-4-il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metil W-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamato
[3308]
[3311] Siguiendo el Procedimiento General I a partir del compuesto L8d (0.10 g, 44 jmol) con DIBAC-PEG4-ácido L9b, el compuesto L1g (29 mg, rendimiento del 24%) se obtuvo como un sólido blanco. ESI m/z: 1394 (M/2 H)+.
[3312] 1H RMN (500 MHz, DMSOdd) 59.67 (s, 1H), 9.56 (s, 1H), 8.20-8.05 (m, 2H), 7.85-7.70 (m, 2H), 7.70-7.60 (m, 4H), 7.50-7.25 (m, 12H), 6.90-6.80 (m, 2H), 6.30 (d,J =12.5 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 6.0 (s, 1H), 5.80-5.35 (m, 16H), 5.25-5.00 (m, 6H), 4.90-4.65 (m, 10H), 4.65-4.45 (m, 4H), 4.40-4.00 (m, 6H), 3.95-3.55 (m, 22H), 3.50­ 3.30 (m, 22H), 3.20-2.85 (m, 12H), 2.65-2.55 (m, 2H), 2.45-2.35 (m, 2H), 2.35-2.20 (m, 3H), 2.15-1.95 (m,5H), 1.90-1.70 (m, 4H), 1.70-1.50 (m, 10H),1.50-1.00 (m, 18H), 0.90-0.80 (m, 12H) ppm. HPLC Anal.: Tiempo de retención: 7.93 (82%) y 8.02 (18%) min (método B).
[3314] Ejemplo 111
[3316] Elaboración del compuesto LP112: (DIBAC-PEG4-aCDCCK-vcPAB-4b
[3318] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-Azatriciclo[10.4.0.049]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metil W-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetil}carbamato
[3319]
[3322] Siguiendo el Procedimiento General J del compuesto L4b (43 mg, 50 |jmol) con DIBAC-suc-PEG4-ácido (L9b), el compuesto del título L12 (16 mg, rendimiento del 23 %) se obtuvo después de la purificación por HPLC preparativa (método B) como un sólido blanco. ESI m/z: 1406 (M+H)+. 1H RMN (DMSOd6, 500 MHz) 89.99 (s, 1H), 8.11 (d,J =7.5 Hz, 1H), 7.88 (d,J =8.5 Hz, 1H), 7.80-7.75 (m, 1H), 7.70-7.66 (m, 1H), 7.65-7.60 (m, 3H), 7.53-7.33 (m, 6H), 7.33-7.28 (m, 3H), 6.30 (dd,J= 10.0 Hz y 1.5 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 6.10-6.00 (m, 1H), 5.72­ 5.55 (m, 2H), 5.41 (s, 2H), 5.05-5.01 (m, 1H), 4.97 (s, 2H), 4.80-4.72 (m, 1H), 4.60-4.58 (m, 1H), 4.43-4.33 (m, 1H), 4.25-4.10 (m, 3H), 3.88-3.80 (m, 1H), 3.65-3.55 (m, 3H), 3.50-3.40 (m, 12H), 3.30-3.25 (m, 2H), 3.12-2.90 (m, 4H), 2.70-2.55 (m, 2H), 2.48-2.35 (m, 2H), 2.30-2.20 (m, 2H), 2.15-1.95 (m, 4H), 1.86-1.65 (m, 3H), 1.64­ 1.54 (m, 5H), 1.49 (s, 4H), 1.46-1.34 (m, 5H), 0.90-0.80 (m, 12H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 7.40 min (método B).
[3324] Ejemplo 112
[3326] Elaboración del compuesto LP113: MAL-PEG4-VA-R-11-5
[3328] 1-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-il)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamoil]etil]carbamoil}-2-metilpropil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida
[3331]
[3334] Siguiendo el procedimiento general J del compuesto L4a (20 mg, 25 jm ol) con MAL-PEG4-NHS L10c, el compuesto Lp113 (7 mg, rendimiento del 27%) se obtuvo como un sólido blanco. ESI m/z: 1119 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOde) 89.89-9.60 (m, 1H), 8.51-6.73 (m, 10H), 6.18 (dd,J =10.1, 1.7 Hz, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.17-4.05 (m, 9H), 4.02-3.52 (m, 13H), 2.71-2.54 (m, 1H), 2.46-2.20 (m, 5H), 2.15-1.77 (m, 5H), 1.63-1.53 (m, 5H), 1.47-1.20 (m, 9H), 1.10-0.94 (m, 2H), 0.95-0.65 (m, 12H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 7.46 min (método B).
[3336] Ejemplo 113
[3338] Elaboración del compuesto LP114: L11j (DIBAC-PEG4-VA-6-II
[3340] 1 -(4-{2-Azatriciclo[10.4.0.049]hexadeca-1(16),4(9),5,7,12,14-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.029.048.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}-2-metoxifenil)carbamoil]etil]carbamoil}-2-metilpropil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida
[3343]
[3344] Siguiendo el Procedimiento General I de L4e (40 mg, 47 |jmol) con DIBAC-suc-PEG4-ácido L9b, el compuesto L1j (25 mg, rendimiento del 41 %) se obtuvo como un sólido blanco. ESI m/z: 1293 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOde) 58.98-8.86 (m, 1H), 8.37-8.30 (m, 1H), 7.94-7.88 (m, 1H), 7.87-7.72 (m, 2H), 7.70-7.57 (m, 2H), 7.52-7.42 (m, 3H), 7.41-7.22 (m, 4H), 6.65-6.59 (m, 1H), 6.44-6.34 (m, 1H), 6.33-6.27 (m, 1H), 6.12 (s, 1H), 5.77-5.49 (m, 2H), 5.18-5.11 (m, 1H), 5.07-4.98 (m, 1H), 4.91-4.70 (m, 3H), 4.54-4.43 (m, 1H), 4.29-4.16 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.65-3.53 (m, 3H), 3.51-3.38 (m, 12H), 3.30-3.22 (m, 2H), 3.13-3.03 (m, 2H), 2.72-2.54 (m, 2H), 2.47-2.18 (m, 4H), 2.13-1.91 (m, 4H), 1.85-1.72 (m, 2H), 1.64-1.55 (m, 3H), 1.52-1.33 (m, 6H), 1.31-1.23 (m, 3H), 0.99-0.77 (m, 13H) ppm. H<p>LC Anal.: 99%, Tiempo de retención: 9.18 y 9.22 min (método B).
[3346] Ejemplo 114
[3348] Elaboración del compuesto LP115: L11k-(DIBAC-PEG4-VA-6-NI
[3350] 1-(4-{2-Azatriciclo[10.4.0.049]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-W-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}-2-fluorofenil)carbamoil]etil]carbamoil}-2-metilpropil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida
[3353]
[3356] Siguiendo el Procedimiento General I de L4f (82 mg, 0.11 mmol) con DIBAC-suc-PEG4-ácido L9b, el compuesto L1k (50 mg, rendimiento del 35 %) se obtuvo como un sólido blanco. ESI m/z: 1280 (M H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOde) 89.54 (s, 1H), 8.41-8.15 (m, 1H), 8.01-7.17 (m, 12H), 6.90 (d,J= 10.8 Hz, 1H), 6.73 (s, 1H), 6.31 (d,J= 9.9 Hz, 1H), 6.12 (s, 1H), 5.77-5.46 (m, 2H), 5.28-4.65 (m, 5H), 4.58-4.42 (m, 1H), 4.29-4.11 (m, 2H), 3.71-3.43 (m, 15H), 3.29 (s, 2H), 3.08 (s, 2H), 2.71-2.54 (m, 2H), 2.47-2.17 (m, 4H), 2.16-1.88 (m, 4H), 1.88-1.69 (m, 2H), 1.69-1.19 (m, 13H), 0.95-0.80 (m, 12H) ppm. 19F RMN (376 MHz, DMSO) 5 -121.11 y -121.92, -165.13 y -165.14, -186.38 y-186.40 ppm. H<p>LC Anal.: >99%, Tiempo de retención: 8.32 min (método B).
[3358] Ejemplo 115
[3360] Elaboración del compuesto LP116: L11k-(DIBAC-PEG4-VC-PAB-4b)
[3362] {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-Azatriciclo[10.4.0.04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metil W-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluoro-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10.8.0.02,9.04,8.01318]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}fenil)carbamato
[3365]
[3368] Siguiendo el Procedimiento General I a partir del compuesto L4k (58 mg, 60 jm ol) con DIBAC-suc-PEG4-ácido L9b, el compuesto del título L1v (20 mg, rendimiento del 22%) se obtuvo como un sólido blanco. ESI m/z: 1499 (M H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOde) 810.02 (s, 1H), 9.59 (s, 1H),8.14 (d,J= 7.6Hz, 1H), 7.88 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.80-7.75 (m, 1H), 7.70-7.66 (m, 1H), 7.65-7.60 (m, 3H), 7.53-7.45 (m, 3H), 7.40-7.28 (m, 7H), 6.84 (d,J =9.2 Hz, 2H), 6.30 (dd,J= 10.4 Hz,J =1.6 Hz, 1H), 6.11 (s, 1H), 6.10-6.0 (m, 1H), 5.72-5.55 (m,1H), 5.52 (s, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.16-5.05 (m, 4H), 4.88-4.70 (m, 3H), 4.43-4.33 (m, 1H), 4.25-4.20 (m, 2H), 3.65-3.55 (m, 3H), 3.50-3.40 (m, 12H), 3.30-3.25 (m, 2H), 3.12-2.90 (m, 4H), 2.70-2.55 (m, 2H), 2.48-2.43 (m, 1H), 2.40-2.35 (m, 1H), 2.30-2.20 (m, 2H), 2.15-1.95 (m, 4H), 1.86-1.75 (m, 2H), 1.64-1.54 (m, 5H), 1.49 (s, 4H), 1.46-1.34 (m, 4<h>), 1.23 (s, 2H), 0.90-0.80 (m, 12H) ppm. HPLC Anal.: 100%, Tiempo de retención: 7.83 min (método B).
[3369] Ejemplo 116
[3370] Conjugación de ADC
[3372] Las conjugaciones de anticuerpos esteroides se describieron en la FIG. 33. En un ejemplo, se produjeron conjugados específicos del sitio a través de la conjugación de dos pasos con transglutaminasa microbiana (MTG EC 2.3.2.13, Zedira, Darmstadt, Alemania) (en adelante "basada en MTG") de un anticuerpo mutado N297Q o N297D. En el primer paso, el anticuerpo mutado N297Q se funcionalizó con azdio-PEG.3-amina a través de una reacción enzimática basada en MTG. Véase, por ejemplo, Solicitud de patente internacional PCT No. PCT/US17/19537 presentada el 24 de febrero de 2017. En el segundo paso, se unió una carga útil del enlazador funcionalizada con alquino al anticuerpo funcionalizado con azido mediante una reacción de 1,3 cicloadición-dipolar [2+3] (la FIG. 33 representa una carga útil del enlazador funcionalizada con DIBAC (LP112) conjugado con un anticuerpo funcionalizado con azido derivado mediante ciclización [2+3]). Este proceso proporcionó conjugados estequiométricos y específicos del sitio con un rendimiento aislado de aproximadamente el 50-80%.
[3374] Conjugados esteroides-anticuerpo preparados en la FIG. 33
[3376] Este ejemplo demuestra un método para la conjugación específica del sitio, generalmente, de una carga útil a un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo. Este ejemplo se refiere a la FIG. 33.
[3378] El siguiente ejemplo demuestra un método para elaborar un conjugado de anticuerpo y fármaco funcionalizado con azido listado en la Tabla 16.
[3380] Anticuerpo aglicosilado con un isotipo IgG1 humano en BupH™ (anticuerpo pH 7.6 con isotipo IgG1 humano en BupHonalized 3-amina (MW 218.26 g/mol). La solución resultante se mezcló con transglutaminasa (25 U/mL; 5 U MTG por mg de anticuerpo), dando como resultado una concentración final del anticuerpo de 0,5-3 mg/mL, y luego la solución se incubó a 37 °C durante 4-24 horas mientras se agitaba suavemente. La reacción se monitorizó mediante SDS-PAGE o ESI-MS. Una vez finalizado, el exceso de amina y MTG se eliminaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para generar el anticuerpo funcionalizado con azido. Este producto fue analizado en SDS-PAGE y ESI-MS. El azido-dPEG3-amina añadida a dos sitios - Q295 y Q297 - del anticuerpo, lo que da como resultado un aumento de 804 Da para el conjugado de anticuerpo aglicosilado 4DAR-PEG3-azida. Los sitios de conjugación fueron identificados y confirmados en EEQEnlazadorYQEnlazadorSTYR para el anticuerpo funcionalizado CON azido 4DAR a través del mapeo de secuencias de péptidos de cadenas pesadas digeridas con tripsina.
[3382] El siguiente ejemplo demuestra un método para elaborar conjugaciones específicas del sitio de un fármaco con un anticuerpo utilizando reacciones de química de clic.
[3384] Los conjugados de fármacos de anticuerpos aglicosilados específicos del sitio con una IgG1 humana que contiene una mutación N297Q en la Tabla 16 que se describe a continuación se prepararon mediante una reacción de clic [2+3] entre anticuerpos funcionalizados con azido con una carga útil del enlazador que contiene alquino. Como se muestra en la Tabla 16, anti PRLR Ab-PEG3-N3 se conjugó a LP112, LP104, y LP116; y anti Fel D1 Ab-PEG3-N3 se conjugó a LP112, y LP116.
[3386] A continuación se detalla el procedimiento de conjugación. Un conjugado de anticuerpo específico del sitio con carga útil del enlazador (LP) se preparó mediante incubación mAb-PEG3-N3 (1-3 mg/mL) en un medio acuoso (por ejemplo, PBS, PBS que contiene 5% de glicerol, HBS) con >6 equivalentes molares de una LP se disolvieron en un disolvente orgánico adecuado, tal como DMSO, DMF o DMA (es decir, la mezcla de reacción contiene entre un 5 % y un 20 % de disolvente orgánico, v/v) a una temperatura de 24 °C a 37 °C durante más de 6 h. El progreso de la reacción se monitorizó mediante ESI-MS y la ausencia de mAb-PEG3-N3 indicó la finalización de la conjugación. La cantidad excedente de la LP y el disolvente orgánico se eliminaron mediante SEC mediante elución con PBS, o mediante cromatografía en columna de proteína A mediante elución con tampón ácido seguido de neutralización con Tris (pH 8.0). Los conjugados purificados se analizaron mediante SEC, SDS-PAGE y ESI-MS. En la Tabla 16 se muestra una lista de los conjugados de anticuerpos esteroides de las LP correspondientes, sus pesos moleculares y valores ESI-DAR.
[3388] En un ejemplo específico, el anticuerpo funcionalizado con azido (1 mg) en 0.800 mL de PBSg (PBS, 5 % de glicerol, pH 7.4) se trató con seis equivalentes molares de DIBAC-PEG4-D-Lys (COT-tx-CD)-VC-PABC-carga útil (concentración 10 mg/mL en DMSO) durante 6-12 horas a temperatura ambiente y el exceso de carga útil del enlazador (LP) se eliminó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, Superdex 200 HR, GE Healthcare). El producto final se concentró mediante ultracentrifugación y se caracterizó por UV, SEC, SDS-PAGE y ESI-MS.
[3390] Ejemplo 117
[3392] Caracterización del ADC por LC-ESI-MS
[3394] Se realizó la medición de la masa intacta para las muestras de ADC mediante LC-ESI-MS para determinar el perfil de distribución de la carga útil del fármaco y calcular el DAR promedio. Cada muestra de prueba (20-50 ng, 5 uL) se cargó en una columna Acquity UPLC Protein BEH C4 (10K psi (68.95 MPa), 300 A, 1.7 |jm, 75|jm x 100 mm; Cat No. 186003810). Después de 3 minutos de desalinización, se eluyó la proteína y se adquirieron los espectros de masas mediante un espectrómetro de masas Waters Synapt G2-Si.
[3396] Como se muestra en la siguiente FIG. 34, los espectros de masas deconvolucionados exhibieron un pico predominante para el anticuerpo anti-PRLR aglicosilado con un peso molecular de 144602 Da, y un pico predominante para el anticuerpo anti-PRLR funcionalizado con azido con un peso molecular de 145385 Da, lo que indica un aumento de 783 Da en comparación con su anticuerpo parental aglicosilado (es decir, correspondiente a conjugaciones de 4 amino-PEG3-azida a cada anticuerpo aglicosilado). Además, el pico predominante para el conjugado anti-PRLR-LP12 tenía un peso molecular de 151015 Da, lo que indica un aumento de 5630 Da en comparación con su anticuerpo funcionalizado con azido (es decir, correspondiente a 4 conjugaciones de LP (MW = 1405.6 Da) con cada anticuerpo aglicosilado). De manera similar, otros ADC anti-PRLR específicos del sitio tenían 3.9 - 4DAR.
[3398] Como se muestra en la siguiente FIG. 35, los espectros de masas deconvolucionados exhibieron un pico predominante para el anticuerpo anti-Fel D1 aglicosilado con un peso molecular de 145441 Da, y un pico predominante para el anticuerpo anti-Fel d1 funcionalizado con azido con un peso molecular de 146235 Da, lo que indica un aumento de 794 Da en comparación con su anticuerpo parental aglicosilado (es decir, correspondiente a 4 conjugaciones de amino-PEG3-azida a cada anticuerpo aglicosilado). Además, el pico predominante para el conjugado anti-Fel d1-LP12 tenía un peso molecular de 151871.0 Da, lo que indica un aumento de 5635 Da en comparación con su anticuerpo funcionalizado con azido (es decir, correspondiente a 4 conjugaciones de LP (MW = 1405.6 Da) con cada anticuerpo aglicosilado). De manera similar, otros anti-Fel d1-ADc específicos del sitio tenían 3.9 - 4DAR.
[3400] En la Tabla 16 se muestra una lista de conjugados de anticuerpos esteroides no citotóxicos (ncADC) de los anticuerpos correspondientes LP, sus pesos moleculares de los anticuerpos desnudos, los anticuerpos funcionalizados con azido, los LP y los ADC esteroides, así como los valores de ESI-DAR. En la tabla, Ab se refiere a un anticuerpo, Ab-N3 se refiere a un anticuerpo funcionalizado con azido y ncADC se refiere a un conjugado de anticuerpo esteroide no citotóxico.
[3402] Ejemplo 118
[3404] Ensayo enzimáticoin vitro
[3406] Escisión de la carga útil del enlazador en el ensayo de catepsina B
[3408] Las cargas útiles del enlazador se probaron en un ensayo de catepsina B. Después de 4 horas de incubación en catepsina B (CapB) con y sin inhibidor de CapB (VA074), se evaluaron tanto las cargas útiles del enlazador como la carga útil libre mediante LC-MS/MS. Los resultados indicaron que las cargas útiles del enlazador hidrofílico (LP104) podría ser escindido por CapB y liberar más carga útil (4b) en comparación con cargas útiles del enlazador no hidrofílicas (LP12).
[3410] El procedimiento del ensayo CapB es el siguiente: La solución madre de carga útil del enlazador (10 mM en DMSO) se añadió al tampón de incubación (100 mM de NaOAc, 10 mM de ditiotreitol, pH 5) para obtener una solución de sustrato de 50 jM . Se agregaron 4 jL de catepsina B de hígado humano 0.47 jg / jL (Athens Research & Technology, Athens, GA) en 50 mM de NaOAc, 1 mM de EDTA, pH 5 a 196 jL de solución de sustrato 50 jM . La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 4 horas. Luego se agregaron 5 jL de ácido acético y 150 jL de acetonitrilo (que contiene osalmid como estándar interno) a 50 jL de alícuotas de la mezcla de reacción. Después del vórtex, las muestras enfriadas se congelaron en un congelador profundo a -70 °C, seguido de descongelación y centrifugación a 14,000 rpm. Luego se diluyeron alícuotas de 50 jL de los sobrenadantes resultantes con el mismo volumen de agua y se analizaron mediante LC-ESI-MS/MS para determinar la carga útil liberada.
[3413] TABLA 17. RESULTADOS DE LA ESCISIÓN DE LA CATEPSINA B
[3415]
[3416]
[3417]
[3420] El experimento de ensayo CapB incluyó el siguiente procedimiento.
[3421] 1. Precalentar el tampón de ensayo: 0.1 M de NaOAc/0.01 M de DTT (pH 5.0)
[3422] 2. Soluciones de adición para compuestos de prueba: Soluciones de adición de 25 pM para compuestos de prueba:
[3423] Añadir 2 pL de solución madre de 5 mM a 398 pL de tampón de NaOAc 0.1 M/DTT 0.01 M (pH 5.0).
[3424] 3. Preparar 0.47 pg/pL de catepsina B en 50 mM de NaOAc/1 mM de EDTA (pH 5.0). Poner en hielo.
[3425] 4. Sin muestras de CA074: Añadir 4 pL de catepsina B 0.47 pg/pL a 196 pL de soluciones de adición de 25 pM (del paso 2), incubar los tubos a 37 °C.
[3426] 5. Con muestras de CA074: Añadir 4 pL de 0.47 pg/pL de catepsina B con 4 pL de inhibidor 10 mM (CA074) en 196 pL de soluciones de adición 25 pM (del paso 2), incubar los tubos a 37 °C.
[3427] 6. Después de 4 horas, se tomaron alícuotas de 5 pL (con CA074 y sin CA074) para la prueba de actividad enzimática (paso 15-17). Mientras tanto, se tomaron alícuotas de 50 pL en el punto temporal (4 h), agregando 5 pL de ácido acético y luego agregar 150 pL de ACN (IS) para detener la reacción.
[3428] 7. Luego de inactivar, agite la placa y centrifugue a 14000 rpm.
[3429] 8. Transferir 50 pL del sobrenadante de cada pocillo a una placa de muestra de 96 pocillos que contenga 50 pL de agua ultrapura (Millipore, ZMQS50F01) para análisis<l>C/MS.
[3430] El experimento de ensayo CapB incluyó los compuestos de referencia y el siguiente procedimiento.
[3431] 9. Precalentar el tampón de ensayo: Fosfato de Na/K 100 mM, pH 6,0, con 1.33 mM de EDTA y 2 mM de DTT.
[3432] 10. Preparar 0.024 pg/pL de catepsina B: Añadir 1 pL de solución madre de catepsina B de 0.47 pg/pL a 19 pL de tampón de ensayo (del paso 11).
[3433] 11. Añadir 2 pL de 0.024 pg/pL de catepsina B (del paso 12) a una placa opaca de 96 pocilios.
[3434] 12. Añadir 96 pL de tampón de ensayo a cada muestra.
[3435] 13. Añadir 2 pL del sustrato 10 mM Z-RR-MNA (concentración final 200 pM).
[3436] Para el control negativo (con inhibidor), añadir 2 pL de inhibidor 10 mM (CA074).
[3437] 14. Leer inmediatamente las muestras en modo cinético a excitación de 340 nm/emisión de 425 nm (leer la placa cada 30 segundos durante 3 min).
[3438] Estabilidad de la catepsina B en muestras de incubación:
[3439] 15. Tomar 5 pL de muestras de incubación en 93 pL de tampón de ensayo (del paso 11) y luego añadir 2 pL de sustrato 10 mM (Z-RR-MNA).
[3440] 16. Incubar las muestras a 37 °C durante 2 min.
[3441] 17. Leer las muestras a una excitación de 340 nm / emisión de 425 nm.
[3442] Ejemplo 119
[3443] Actividadin vitrobasada en células y libre de células
[3444] Unión libre de células al receptor de glucocorticoides (GR) en el ensayo de unión competitiva LanthaScreen TR-FRET GR
[3445] Para evaluar la capacidad de los nuevos esteroides para unirse al receptor de glucocorticoides (GR), se realizó un ensayo de unión libre de células utilizando un kit de ensayo de unión competitiva LanthaScreen TR-FRET GR (Life Technologies, Cat# A15901). El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La budesonida es un esteroide GR comercial y se utilizó como control de referencia en el ensayo de unión y otros ensayos basados en células descritos más adelante en el documento. En resumen, se preparó una dilución en serie triple de budesonida y los compuestos derivados que se indican a continuación en DMSO al 100 % comenzando con 100 nM (100X del final). Las diluciones seriadas se diluyeron aún más 50 veces en el tampón de receptor nuclear F con 5 mM de DTT y 0.1 mM de péptido estabilizador, y se transfirieron a una placa de ensayo de 384 pocillos. A continuación, se agregaron secuencialmente Fluormone GS1 Green, GR-LBD (GST) y el anticuerpo Tb anti-GST a la placa de ensayo de 384 pocillos. La placa se analizó en un lector de placas Envision Multilabel (PerkinElmer) con excitación establecida a 340 nm y filtros de emisión a 520 nm y 486 nm. La relación FRET se calculó como 520 nm / 486 nm. Los valores de IC50 se determinaron utilizando una ecuación logística de cuatro parámetros sobre una curva de respuesta de 12 puntos (GraphPad Prism). Como se muestra en la Tabla 18, la budesonida compitió en la unión de Fluormone GS1 Green en el ensayo GR con un valor de IC50 entre 10 a 100 nM. Los análogos N de budesonida compitieron de manera similar en la unión con los valores de IC50 que van desde menos de 10 nM a más de 100 nM. Los nuevos esteroides probados en este estudio demostraron ser comparables o mejores (valores IC50 menores) en este ensayo y un desplazamiento similar para el ligando GR en comparación con la budesonida.
[3447] TABLA 18: UNIÓN LIBRE DE CÉLULAS Y ACTIVIDAD FUNCIONAL BASADA EN CÉLULAS
[3449]
[3450]
[3453] En la Tabla 18: ++ < 10 nM; 10 nM < + < 50 nM; 50 nM < ; NT = no probado; NA = sin activación. Activación completa: >75 % de multiplicidad de activación inducida por Budesonida. Activación parcial: (20 %, 75 %) de multiplicidad de activación inducida por Budesonida. Sin activación: <20 % de multiplicidad de activación inducida por Budesonida. El ensayo libre de células se utiliza para evaluar la unión directa de compuestos al LBD de GR recombinante, independientemente de su permeabilidad. El ensayo basado en células se utiliza para medir cómo los compuestos activan la transcripción intracelular mediada por GR tras atravesar la membrana plasmática; por lo tanto, la permeabilidad de la membrana del compuesto es un prerrequisito para la actividad.
[3455] Ejemplo 120
[3457] Ensayo basado en células informadoras de luciferasa coactivadora del receptor de glucocorticoides (GR)
[3458] Ensayo de activación de glucocorticoides
[3460] La actividad de las cargas útiles de esteroides y los ncADC de esteroides anti-PRLR se estudiaron utilizando un ensayo basado en células informadoras de luciferasa utilizando la línea celular 293/PRLR/GRE-luc descrita en el Ejemplo 62, así como una línea celular 293 negativa al antígeno que contiene un receptor quimérico que consiste en un dominio de unión al ligando GR fusionado al dominio de unión al ADN CAL4 de levadura (pBind-GR, catálogo de Promega No. E1581) y una secuencia activadora corriente arriba Gal4 (9XGal4 UAS-Luc) que impulsa la expresión de luciferasa. La línea celular resultante se denomina 293/GRE-Luc.
[3462] El bioensayo se llevó a cabo utilizando estas dos líneas celulares, tesgin anti-PRLR-LP112, dexametasona, budesonida, compuesto 4b, control Ab-LP112, así como también Ab anti-PRLR solo, utilizando una configuración de ensayo como se describe en el Ejemplo 63.
[3464] Como se muestra en la FIG. 36A y la Tabla a continuación, después de 72 horas de incubación, anti-PRLR-LP112 mostró la multiplicidad más alta en la línea celular 293/PRLR/GRE-luc mientras que la carga útil de LP112 (4b) mostró un mejor valor de IC50 que la budesonida y la dexametasona. El control Ab-LP112 y el mAb anti-PRLR no conjugado no demostraron actividad en esta línea celular.
[3466] Como se muestra en la FIG. 36B y la Tabla a continuación, después de 72 horas de incubación, anti-PRLR-LP112 no mostró activación en la línea celular 293/PRLR/GRE-luc que no expresa PRLR, lo que indica que la administración de esteroides por parte de anti-PRLR-ncADC depende del antígeno. La carga útil LP112 (4b) volvió a mostrar un mejor valor de IC50 que la budesonida y la dexametasona. El control Ab-LP112 y el anticuerpo anti-PRLR no conjugado no demostraron ninguna actividad en esta línea celular.
[3468] La siguiente Tabla se refiere a las FIGS. 36A y 36B.
[3471]
[3472] Ejemplo 121
[3473] Este ejemplo describe un modelo de ratón de liberación de citoquinas inducida por LPS.
[3474] El objetivo de este estudio es evaluar los compuestos de prueba, 4b y 6-I, sobre la inhibición de la liberación de citoquinas inducida por LPS en ratones. Los compuestos de prueba se administraron 48 horas, 24 horas y 2 horas antes del desafío con LPS, los niveles de citoquinas en muestras de sangre, incluidos TNF-a e IL6, se midieron en los puntos de tiempo 2 horas y 4 horas después del desafío con LPS.
[3475] Materiales y reactivos
[3476] El lipopolisacárido (LPS) derivado de E. coli K12 se adquirió de Invivogen (San Diego, California, EE. UU., cat. # Tlrl-eklps) y la dexametasona se adquirió de ADAMAS (Emeryville, CA, E<e>. UU., cat.# 50-02-2). El kit ELISA de TNF-a de ratón fue de ebioscience (ThermoFisher Scientific, Cat#88-7324). El kit ELISA de IL6 de ratón fue de ebioscience (ThermoFisher Scientific, Cat#88-7064).
[3477] Métodos experimentales
[3478] Cría de animales:
[3479] En este estudio se utilizaron un total de 18 ratones C57BL/6j ingenuos. Los animales eran machos, con un peso corporal de 18-20 g al inicio del estudio. Los animales fueron adquiridos en el Shanghai Laboratory Animal Center, CAS (SLAC), y alojados en el vivero de animales de ChemPartner en un entorno SPF. Después de su llegada, los animales fueron revisados para determinar su estado de salud, incluyendo pelaje, extremidades, orificios y signos anormales en la postura o los movimientos, y se aclimataron al entorno durante más de 7 días.
[3480] Los animales fueron alojados, 3 ratones por jaula, en jaulas de policarbonato IVC tipo caja de zapatos en un ambiente SPF; los controles ambientales de la sala de animales se configuraron para mantener una temperatura de 20-26 °C, una humedad de 40-70 % y un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Se proporcionó alimento estándar (SLAC-M01, del Shanghai Laboratories Animal Center) y agua purificada (filtrada, calidad de agua municipal)ad libitumdurante todo el período de estudio.
[3481] Procedimientos experimentales
[3482] Agrupamiento: Los animales fueron asignados aleatoriamente en 6 grupos (A-F) antes de iniciar el estudio. Cada grupo incluía 3 ratones. El grupo A sirvió como control ingenuo; el grupo B recibió dexametasona y sirvió como control positivo; el grupo C fue tratado con 4b y el grupo D-F fue tratado con 6-I.
[3483] Procedimiento experimental
[3484] Todos los ratones recibieron LPS disuelto en PBS en una dosis de 0.5 mpk mediante inyección ip. Los ratones del grupo A recibieron PBS, los ratones del grupo B recibieron Dex (5mpk) y los ratones del grupo C recibieron 4b (5mpk) por inyección ip, 2 horas antes del desafío con LPS; los ratones de los grupos D, E y F recibieron una dosis de 5mpk por inyección ip, 2 horas, 24 horas y 48 horas antes del desafío con LPS, respectivamente. Se recogieron muestras de sangre a las 2 y 4 horas después del desafío con LPS, en tubos que contenían heparina. Se centrifugaron muestras de sangre y se recolectaron muestras de plasma y se almacenaron a -80 °C antes del análisis.
[3485] Los niveles de TNFa en plasma se midieron con kits ELISA siguiendo los procedimientos estándar recomendados por el fabricante.
[3486] Los resultados de PK se proporcionan en la FIG. 37A y Tabla 20
[3488] TABLA 20. PARÁMETROS PK RESUMIDOS DE 4B Y 6-I
[3491]
[3492]
[3495] Resultados de PD
[3497] El desafío con LPS indujo la liberación de TNF-a en este modelo farmacodinámico observado en el momento del muestreo de 2 horas. Los resultados fueron consistentes con la cinética informada de liberación de citoquinas en el modelo de desafío con LPS en ratones, los niveles de TNF-a disminuyeron en el punto del tiempo de 4 horas. Por lo tanto, no se podrá medir el efecto de los compuestos de prueba y, en congruencia con esto, no se observaron diferencias significativas entre los grupos en el punto del tiempo de las 4 horas.
[3498] Se recogieron muestras de sangre a las 2 horas y 4 horas después del desafío con LPS; se midieron los niveles de TNF-a en plasma. Los datos se expresaron como media ± EEM, *p < 0.05, **p < 0.01 frente al Grupo A, por Oneway
[3500] Se muestra en la FIG. 37A, en el punto temporal de 2 horas, 4b en una dosis de 5mpk inhibió significativamente la producción de TNF-a; 6-I demostró una inhibición dependiente del tiempo y se inhibió una producción significativa de TNF-a cuando se administró 2 horas antes del desafío con LPS. DEX fue capaz de inhibir significativamente TNF-a en el momento del muestreo de 2 horas.
[3502] Se recogieron muestras de sangre a las 2 horas y 4 horas después del desafío con LPS; se midieron los niveles de TNF-a en plasma. Los datos se expresaron como media ± EEM, *p < 0.05, **p < 0.01 frente al Grupo A, mediante análisis ANOVA unidireccional.
[3504] El análisis ANOVA se proporciona en la FIG. 37B y Tabla 21
[3506] TABLA 21. DATOS SIN PROCESAR DE TNF-a
[3508]
[3511] Ejemplo 122
[3513] Células dendríticas de ratón
[3515] Para determinar el efecto del compuesto 4b sobre respuestas inmunitarias inflamatorias inducidas por LPSex vivo,las células dendríticas CD11c+ (DC) se aislaron de los bazos de ratones C57Bl/6 de tipo salvaje (Jackon Labs, Protocolo #426.0). Las DC esplénicas se aislaron usando una digestión con colagenasa D (400 U/mL de colagenasa D (Roche Cat #11088858001), 20 pg/mL de DNasa I (Roche Cat #10104159001), 2 % de FCS en RPMI-1640 tamponado con HEPES) y se incubaron a 37 °C durante 25 minutos. Después de la incubación, el tejido esplénico se lavó con RPMI-1640 y se filtró a través de un filtro de 70 pm, luego se realizó la lisis de glóbulos rojos utilizando tampón de lisis ACK (Gibco Cat #A1049201) durante 1 minuto. Posteriormente, la suspensión celular se lavó dos veces utilizando RPMI-1640. Las DC clásicas se aislaron de la suspensión de células mononucleares utilizando microperlas magnéticas CD11c (Milteny Biotec Cat #130108338). En resumen, la suspensión celular se lavó dos veces con tampón de ejecución autoMACS (Milteny Biotec Cat#130091221) antes de una incubación de 30 minutos a 4 °C con Microperlas CD11c+, según los protocolos establecidos por Milteny Biotec. Las células CD11c+ se aislaron por selección positiva, se lavaron, se suspendieron en RPMI completo [RPMI-1640 (ThermoFisher Scientific, Cat #15140122) que contenía 10 % de FBS (ThermoFisher Scientific, Cat #10082147) y 1 % de penicilina-estreptomicina (ThermoFisher Scientific, Cat #11875093)] y se contaron antes del cultivo a 2x105 células por pocillo. Se agregó control completo-RPMI, RMPI completo tratado con compuesto 4b (a 10 nM y 100 nM) o RMPI completo tratado con dexametasona (Sigma, Cat#D4902-25MG) (a 10 nM y 100 nM) a las células en una placa de cultivo de 96 pocillos. Las células tratadas con DC/Control, Compuesto 4b o Dexametasona se incubaron durante 24 horas a 37 °C antes de la estimulación con 10 ng/mL de LPS durante 24 horas.
[3517] Células dendríticas humanas:
[3519] Para determinar el efecto del compuesto 4b sobre respuestas inmunitarias inflamatorias inducidas por LPSex vivoen células inmunitarias innatas humanas, Los monocitos CD14+ (Lonza Cat #2W-400C) se aislaron y cultivaron en presencia de RPMI completo [RPMI-1640 (ThermoFisher Scientific, Cat #15140122) que contenía 10 % de FBS (ThermoFisher Scientific, Cat #10082147) y 1 % de penicilina-estreptomicina (ThermoFisher Scientific, Cat #11875093)] suplementado con IL4 humana (50 ng/mL) (Milteny Biotec, Cat #130-093-922) y GM-CSF humano (100 ng/mL) (Milteny Biotec, Cat #130093866) durante 7 días. El RPMI completo con I<l>4 y GM-CSF se cambió cada tres días. Se desarrollaron dos condiciones de cultivo específicas: Condición 1: Incubación de monocitos CD14+ con RPMI completo de control , RMPI completo tratado con compuesto 4b (a 10 nM y 100 nM) o RMPI completo tratado con Dexametasona (Sigma) (a 10 nM y 100 nM) durante todo el cultivo de 7 días o Condición 2: Incubación de monocitos CD14+ con RPMI completo de control durante 5 días antes de la incubación con RPMI completo de control, RMPI completo tratado con Compuesto 4b (a 10 nM y 100 nM) o RMPI completo tratado con Dexametasona (Sigma, Cat#D4902-25MG) (a 10 nM y 100 nM) hasta el día 7. El día 7 los distintos grupos experimentales fueron estimulados con 10 ng/mL de LPS durante 24 horas.
[3520] Medición de citoquinas en los sobrenadantes 24 horas después del desafío ex vivo con LPS:
[3522] Los sobrenadantes se recogieron en placas de cultivo de tejidos de fondo redondo de 96 pocillos 24 horas después del desafío con LPS y se almacenaron a -20 °C hasta su posterior análisis. Las concentraciones de citoquinas en los sobrenadantes se midieron utilizando un kit de inmunoensayo multiplex Pro-inflamatorio Panel 1 (ratón) (MesoScale Discovery, Cat #K15048D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante o un kit de inmunoensayo multiplex Pro-inflamatorio Panel 1 (humano) (MesoScale Discovery, Cat #K15049D). En resumen, se agregaron 50 pL/pocillo de calibradores y muestras (diluidos en Diluyente 1:2) a las placas prerecubiertas con anticuerpos de captura y se incubaron a temperatura ambiente mientras se agitaban a 700 rpm durante 2 horas. Luego, las placas se lavaron 3 veces con 1xPBS que contenía 0.05 % (p/v) de Tween-20, seguido de la adición de 25 pL de solución de anticuerpos de detección diluida en Diluyente 45. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente mientras se agitaba, las placas se lavaron 3 veces y se agregaron 150 pL de tampón de lectura 2x a cada pocillo. La electroquimioluminiscencia se leyó inmediatamente en un instrumento MSD Spector®. El análisis de datos se realizó utilizando el software GraphPad Prism™. La significancia estadística dentro de los grupos se determinó mediante Anova de una vía con prueba posterior de comparación múltiple de Turkey y se calculó el error estándar de la media (SEM±).
[3524] Resumen de resultados y conclusiones:
[3526] Como se muestra en la Tabla 22, el desafío con LPSex vivoindujo una producción robusta de IL12p70, IL1p, IL6, KC-GRO y TNF-a por DCs de CD11c+ esplénico. De lo contrario, la administraciónin vitrode dexametasona y compuesto 4b en dosis crecientes durante 24 horas disminuyó significativamente las respuestas de citoquinas inducidas por LPS en DCs de CD11c+.
[3527]
[3528] Como se muestra en la Tabla 23, el desafío con LPSex vivoindujo una expresión robusta de IL12p70, IL1 p, IL6 y TNF-a por DC derivadas de monocitos humanos. Por el contrario, los monocitos cultivados durante todo el período de acondicionamiento de 7 días (Condición 1) con el Compuesto 4b y Dexametasona (Sigma) dieron como resultado una producción de citoquinas proinflamatorias significativamente reducida. Además, el acondicionamiento de las DC derivadas de monocitos maduros con el compuesto 4b y dexametasona (Sigma) también disminuyó significativamente la producción de IL12p70, IL6 y TNF-a en comparación con la estimulación con LPS de las DC de control.
[3530] Tabla 23: El compuesto 4b y la dexametasona (Sigma) inhiben la producción de citoquinas inducida por LPS en DC derivadas de monocitos humanos.
[3532]

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES
1. Un compuesto conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de fórmula (A),
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
R1 y R2 son, independientemente, -H, alquilo, alquil-C(O)-O-, -OH, o halo; o
R1 y R2 juntos forman
R4
t 0 i l ^ v ^»w0jjv
en donde R4 es alquilo, arilo, arilalquilo o un heterocicloalquilo que contiene N,
en donde el alquilo, arilo, arilalquilo y heterocicloalquilo que contiene N están, independientemente en cada caso, opcionalmente sustituidos con NRaRb;
R3 es -NRaRb;
R5 es, independientemente en cada caso, -OH, halo, alquilo o arilalquilo;
Ra y Rb son, independientemente en cada caso, -H, alquilo o arilo opcionalmente sustituido;
n es un número entero de 0-19; y
en donde el agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
2. El compuesto conjugado de la reivindicación 1, en donde el compuesto de Fórmula (A) tiene la estructura de Fórmula (A1):
en donde R1-R3 son como se definen anteriormente y R5A y R5B son cada uno, independientemente, un halo o un átomo de hidrógeno.
3. El compuesto conjugado de la reivindicación 2, en donde R1 y R2 juntos forman
R4
c A o
en donde R4 es arilo, arilalquilo o alquilo, en donde el arilo, arilalquilo y alquilo están opcionalmente sustituidos con -NRaRb.
4. El compuesto conjugado de la reivindicación 1 de acuerdo con la Fórmula (A4):
en donde R3 es -NRaRb y R4 es alquilo, en donde Ra y Rb son cada uno, independientemente, un átomo de hidrógeno o alquilo.
5. El compuesto conjugado de la reivindicación 4, en donde R4 es C1-4 alquilo.
6. El compuesto conjugado de la reivindicación 5, en donde R3 es -NH2, -NHCH3, o -N(CH3)2.
7. Un compuesto conjugado que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de fórmula 1000, en donde el agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo;
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
R1 y R2 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en -H, -OH, alquilo, -OC(O)-alquilo y halo; o
R1 y R2 juntos forman
ya sea (a) o (b):
(a) R3 es -NRaRb y R4 se selecciona del grupo que consiste en -alquileno-NRaRb, -X-arileno-Y-NRaRb, y heterocicloalquilo que contiene N; en donde X está ausente, o -CH2-; en donde Y está ausente;
o
(b) R3 es -NRaRb; y
R4 es alquilo;
R3 se selecciona, independientemente en cada caso, de un sustituyente en el grupo que consiste en -OH, halo y alquilo; n es un número entero de 0-16; y cada R5 está posicionado en cualquier átomo del anillo;
Ra y Rb se seleccionan, independientemente en cada caso, del grupo que consiste en -H y alquilo; o Ra y Rb ciclizan para formar cicloheteroalquilo con tres a seis átomos en el anillo, incluido un heteroátomo, que es el N al que están unidos, y Ra y Rb están, independientemente en cada caso, opcionalmente sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en -OH, -PO4H, NH2, -C(O)OH y - C(O)CH3.8
8. El compuesto conjugado de la reivindicación 7 de acuerdo con la Fórmula 1010, 1020, 1030, o 1040:
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
9. El compuesto conjugado de la reivindicación 8 en donde R1 es -OH; R2 es -H, -CH3 o -OH; y R3 es -NH2.
10. El compuesto conjugado de la reivindicación 7 de acuerdo con la Fórmula 1110, 1120, 1130, u 1140:
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
11. El compuesto conjugado de la reivindicación 10 en donde R4 es n-propilo.
12. El compuesto conjugado de la reivindicación 11 según la fórmula 1120.
13. El compuesto conjugado de la reivindicación 10 en donde R4 es H2NCH2CH2- o
14. El compuesto conjugado de la reivindicación 10 en donde R4 es alquilo.
15. El compuesto conjugado de la reivindicación 10 en donde R3 es -NH2, -N(H)CH3, o -N(CH3)2.
16. El compuesto conjugado de la reivindicación 15 en donde R4 es n-propilo.
17. El compuesto conjugado de la reivindicación 7, en donde el compuesto es:
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
18. El compuesto conjugado de la reivindicación 17, en donde el compuesto es:
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
19. El compuesto conjugado de la reivindicación 18, en donde el compuesto es:
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
20. El compuesto conjugado de la reivindicación 1 o 17, en donde el compuesto es:
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
21. El compuesto conjugado de la reivindicación 1 en donde el compuesto es:
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
22. Un compuesto conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-21 que comprende un agente de unión conjugado con un compuesto de Fórmula (A) y una ciclodextrina (CD), en donde el agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
23. El compuesto conjugado de la reivindicación 22, en donde CD se selecciona del grupo que consiste en
en donde 7" indica el enlace a través del cual la CD se enlaza al compuesto conjugado.
24. El compuesto conjugado de la reivindicación 1, de acuerdo con la Fórmula 1200:
1200
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
R1 y R2 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en -H, -OH, alquilo, -OC(O)-alquilo y halo; o
R1 y R2 juntos forman
ya sea (a) o (b):
(a) R3 es -NRaRb; y
R4 se selecciona del grupo que consiste en -alquileno-NRaRb,
-X-arileno-Y-NRaRb, y heterocicloalquilo que contiene N; en donde X está ausente, o -CH2-;
en donde Y está ausente;
o
(b) R3 es -NRaRb; y
R4 es alquilo;
R3 se selecciona, independientemente en cada caso, de un sustituyente en el grupo que consiste en -OH, halo y alquilo; n es un número entero de 0-16; y cada R5 está posicionado en cualquier átomo del anillo;
Ra y Rb se seleccionan, independientemente en cada caso, del grupo que consiste en -H y alquilo;
BA es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo;
cada L es un enlazador opcional;
BA o L está unido covalentemente a R3 o R4; y
x es un número entero de 1 a 30.
25. El compuesto conjugado de la reivindicación 24 de acuerdo con la Fórmula 1210, 1220, 1230, o 1240:
1210 1220
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde R3 está unido covalentemente a L o BA.
26. El compuesto conjugado de la reivindicación 24 de acuerdo con la Fórmula 1310, 1320, 1330, o 1340:
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde R4 está unido covalentemente a L o BA.
27. El compuesto conjugado de la reivindicación 1 seleccionado del grupo que consiste en:
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo;
en donde cada L es un enlazador opcional;
cada BA es un agente de unión; y
cada x es un número entero de 1 a 30.
28. El compuesto conjugado de la reivindicación 27 que es
en donde x es un número entero de 1 a 6.
29. El compuesto conjugado de la reivindicaciones 28 en donde x es 2 o 4.
30. El compuesto conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-29, en donde
BA es un anticuerpo funcionalizado derivado de la reacción de un anticuerpo que comprende al menos un residuo de glutamina con un compuesto de acuerdo con la fórmula H2N-LL-N3, en donde LL es un grupo polietilenglicol divalente en presencia de la enzima transglutaminasa.
31. El compuesto conjugado de la reivindicación 30, en donde el residuo de glutamina es Q295 y/o N297Q.
32. El compuesto conjugado de la reivindicación 1 seleccionado del grupo que consiste en:
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