ES3046661T3 - Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same - Google Patents

Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same

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ES3046661T3
ES3046661T3 ES18184847T ES18184847T ES3046661T3 ES 3046661 T3 ES3046661 T3 ES 3046661T3 ES 18184847 T ES18184847 T ES 18184847T ES 18184847 T ES18184847 T ES 18184847T ES 3046661 T3 ES3046661 T3 ES 3046661T3
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inflammatory
composition
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Sang Jae Kim
Kyung Hee Kim
Kyu-Yong Lee
Seong-Ho Koh
Hyun-Hee Park
Sung Jin Huh
Woo Jin Lee
Bum Joon Kim
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Original Assignee
GemVax and Kael Co Ltd
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Abstract

La presente invención se refiere a un péptido con actividad antiinflamatoria, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 179, presenta una homología de secuencia de aminoácidos superior al 80% con las secuencias mencionadas anteriormente, o es un fragmento de las mismas. La presente invención también se refiere a una composición antiinflamatoria que comprende los péptidos mencionados. Según la presente invención, los péptidos que tienen al menos una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 179 muestran una eficacia excepcional tanto en la supresión de la inflamación como en la profilaxis. Por lo tanto, la composición que comprende los péptidos de esta invención puede utilizarse como composiciones farmacéuticas antiinflamatorias o como composiciones cosméticas, para el tratamiento y la prevención de diversas enfermedades inflamatorias. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Péptidos antiinflamatorios y composición que comprende los mismos
[0003] CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0004] La presente invención se refiere a péptidos antiinflamatorios y composiciones que comprenden los mismos.
[0005] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0006] La inflamación es un tipo de defensa biológica como medio de proteger el cuerpo del daño de tejidos biológicos que podría producirse por estímulos físicos externos, estímulos químicos tales como exposición a diversos alérgenos, o invasión de microorganismos incluyendo bacterias, hongos y virus.
[0007] La ruta de la ciclooxigenasa (COX) o la ruta de la lipooxigenasa (LOX pueden utilizarse para la señalización de la inflamación, que produce prostaglandina, tromboxano, etc. Una vez que se libera la señal inflamatoria, uno de muchos cambios que se producen en el cuerpo es la expansión de los vasos sanguíneos para aumentar el suministro de sangre alrededor de la inflamación para concentrar células tales como los neutrófilos requeridos para la respuesta inflamatoria. Sin embargo, pueden aparecer enfermedades inflamatorias si se produce una respuesta de defensa biológica anómala excesiva. Para prevenir esto, están en desarrollo fármacos que suprimen la respuesta inflamatoria excesiva reprimiendo las enzimas utilizadas en la ruta de señalización inflamatoria (por ejemplo, COX-1, COX-2, 5-LOX, 12-LOX etc.).
[0008] De acuerdo con una respuesta temporal, la inflamación se clasifica como inflamación aguda (respuesta inmediata, respuesta no específica, de algunos días a varias semanas), inflamación crónica (respuesta retrasada, respuesta específica, algunas semanas o más), inflamación subaguda (una etapa intermedia entre la inflamación aguda y la inflamación crónica, características de los productos mixtos de mononucleares y polimorfonucleares).
[0009] Asimismo, además de los factores peptídicos, factores tales como prostaglandinas, leucotrienos, factores lipídicos que incluyen el factor activador de plaquetas (FAP), enzimas sintéticas del factor de inflamación, radicales libres tales como NO (óxido nítrico), muchos tipos de moléculas de adhesión celular, sistema inmunitario, y factores de coagulación pueden producir la inflamación.
[0010] Una vez que una célula está dañada debido a agentes causantes conocidos de la inflamación tales como factores biológicos externos (microbios, virus, parásitos), factores físicos (estímulos mecánicos, calor, radiación, electricidad), y factores químicos, se liberan histamina y quinina. La histamina y quinina liberadas darán como resultado angiectasia, un aumento de la permeabilidad de los capilares y concentración de macrófagos en el sitio de la inflamación, y esto produce un aumento en el caudal de sangre, edema, migración de inmunocitos y anticuerpos, dolor y generación de calor.
[0011] Los tratamientos usados actualmente para la inflamación son fármacos sintéticos tales como ibuprofeno, antihistamínicos, esteroides, cortisona, agentes inmunosupresores, y agonistas inmunitarios; todos los cuales alivian solo temporalmente la inflamación. Estos fármacos no curan fundamentalmente la inflamación y tienen efectos secundarios como reacciones de hipersensibilidad y deterioro del sistema inmunitario, Por lo tanto, para aliviar eficazmente la inflamación, se investiga para desarrollar una sustancia que inhiba la expresión de las proteínas inflamatorias mencionadas. Sin embargo, han surgido problemas en las sustancias antiinflamatorias que se habían desarrollado anteriormente. Diversas categorías de antiinflamatorios, incluidos los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y fármacos antiinflamatorios esteroideos (AIE); pero no solo estos fármacos tienen efectos secundarios tras su uso, tampoco curan fundamentalmente la inflamación. Por lo tanto, existe una necesidad actual de fármacos antiinflamatorio que sean factibles física y económicamente. Como ejemplo, en inflamaciones agudas o crónicas tales como artritis reumatoide crónica, no solo los fármacos antiinflamatorios no esteroideos suprimen la actividad enzimática de COX-2, son conocidos también por suprimir la actividad de COX-1, lo que produce efectos secundarios tales como trastornos gastrointestinales.
[0012] Los documentos WO 00/02581 y WO 03/038047 divulgan péptidos derivados de la telomerasa.
[0013] La presente invención se completó ya que los presentes inventores han descubierto que los péptidos derivados de telomerasa pueden tener propiedades antiinflamatorias.
[0014] Por tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar un péptido novedoso.
[0015] Otro objeto de la presente invención es proporcionar el polinucleótido que codifica el péptido novedoso. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un péptido que tenga actividad antiinflamatoria.
[0016] Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición antiinflamatoria que utilice el péptido como ingrediente activo.
[0017] Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición cosmética que utilice este péptido como un ingrediente activo.
[0018] Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que utilice este péptido como un ingrediente activo.
[0019] SUMARIO DE LA INVENCION
[0020] La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
[0021] En un primer aspecto, la presente invención proporciona un péptido con actividad antiinflamatoria, en el que el péptido se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 101, 63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 54, 55, y 56.
[0022] En una primera realización del primer aspecto de la invención o de cualquier realización del primer aspecto de la invención, el péptido procede de la telomerasa humana.
[0023] En una segunda realización del primer aspecto de la invención o de cualquier realización del primer aspecto de la invención, el péptido es para uso como medicamento.
[0024] En una tercera realización del primer aspecto de la invención o de cualquier realización del primer aspecto de la invención, el péptido es para uso en el tratamiento o profilaxis de una enfermedad inflamatoria.
[0025] En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un péptido seleccionado del grupo que consiste en: SEQ ID n O: 101,63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 54, 55, y 56.
[0026] En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una composición antiinflamatoria que comprende un péptido seleccionado del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 101, 63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 54, 55, y 56 como ingrediente activo.
[0027] En una primera realización del tercer aspecto de la invención o de cualquier realización del tercer aspecto de la invención, la composición antiinflamatoria es para uso en el tratamiento o profilaxis de una enfermedad inflamatoria, en la que la composición es una composición farmacéutica.
[0028] En una segunda realización del tercer aspecto de la invención o de cualquier realización del tercer aspecto de la invención, la composición antiinflamatoria es para uso en la mejora o prevención de la inflamación de la piel, en el que la composición es una composition cosmética.
[0029] En realizaciones del primer o tercer aspecto de la invención o de cualquier realización del primer o tercer aspecto de la invención, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en (1) enfermedad inflamatoria general o localizada (por ejemplo, alergias; enfermedad del complejo inmunitario; fiebre del heno; choque de hipersensibilidad; choque de endotoxina; caquexia, hipertermia; granulomatosis; o sarcoidosis); (2) enfermedades gastrointestinales relacionadas (por ejemplo, apendicitis; úlcera gástrica; úlcera duodenal; peritonitis; pancreatitis; colitis ulcerosa, aguda o isquémica; colangitis; colecistitis, esteatorrea, hepatitis, enfermedad de Crohn; o enfermedad de Whipple); (3) enfermedades dérmicas relacionadas (por ejemplo, psoriasis; quemaduras; quemaduras solares; dermatitis; Verrugas urticarias o habones); (4) enfermedades vasculares relacionadas (por ejemplo, angiitis; vasculitis; endocarditis; arteritis; ateroesclerosis; tromboflebitis; pericarditis; insuficiencia cardíaca congestiva; miocarditis; isquemia de miocardio; periarteritis nodosa; estenosis recurrente; enfermedad de Buerger; o fiebre reumática); (5) enfermedades respiratorias (por ejemplo, asma; epiglotitis; bronquitis; enfisema; rinitis; fibrosis quística; pneumonitis intersticial; EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva crónica); síndrome de dificultad respiratoria de adulto; coniosis; alveolitis; bronquiolitis; faringitis; pleuresía; o sinusitis); (6) enfermedades relacionadas con los huesos, articulaciones, músculos y tejido conectivo (por ejemplo, granuloma eosinófilo; artritis; atralgia; osteomielitis; dermatomiositis; fasciitis; enfermedad de Paget; gota; enfermedad periodontal; artritis reumatoide; miastenia grave; espondilitis anquilosante; o sinovitis); (7) trastornos urogenitales (por ejemplo, epididimitis; vaginitis; prostatitis; o uretritis); (8) enfermedades relacionadas con el sistema nervioso central o periférico (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer; meningitis; encefalitis; esclerosis múltiple; infarto cerebral; embolismo cerebral; síndrome de Guillain-Barre; neuritis; neuralgia; lesión de médula espinal; parálisis; o uveítis); (9) virus (por ejemplo, gripe; virus sincitial respiratorio; VIH; hepatitis B; hepatitis C; o virus del herpes), enfermedad infecciosa (por ejemplo, fiebre del Dengue; o septicemia), infección fúngica (por ejemplo, candidiasis); o bacteriana, parasítica, e infección microbiana similar (por ejemplo, bacteremia diseminada; malaria; oncocerciasis; o amebiasis); (10) enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, tiroiditis; lupus; síndrome de Goodpasture; rechazo al injerto; enfermedad del injerto contra el huésped; o diabetes); y (11) cáncer o enfermedad tumoral (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin).
[0030] En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un kit para profilaxis o tratamiento de enfermedades inflamatorias que comprende: un péptido seleccionado del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 101, 63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 43, 54, 55, 56, y 91, e instrucciones que incluyen al menos una de dosis de administración, vía de administración, frecuencia de administración, e indicación del péptido o composición. Aplicabilidad Industrial
[0031] Un péptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 179 tiene una eficacia sobresaliente para suprimir la inflamación y en medios profilácticos. Por lo tanto, la composición que comprende los péptidos se puede usar como una composición farmacéutica antiinflamatoria o como una composición cosmética, a su vez, tratar y prevenir una variedad de diferentes tipos de enfermedades inflamatorias.
[0032] Referencias
[0033] KR2012-0130996A
[0034] KR2012-0133661A
[0035] KR2011-0060940A
[0036] US2011-0150873A1
[0037] Bonaldi T et al., EMBO J, (22)5551-60, 2003
[0038] Yankner BA et al., Science (Nueva York, N.Y.) [1990, 250(4978):279-282]
[0039] Dahlgren KN et al., J. Biol. Chem. 277:32046-32053, 2002.
[0040] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0041] La FIG. 1 es una gráfica que muestra los resultados de llevar a cabo un ELISA de TNF-a con el cultivo de monocitos derivados de PBMC. Los monocitos se estimularon con LPS (10 ng/ml) durante dos horas, a continuación se hicieron reaccionar con cada péptido, FITC, FITC-TAT, PEP 1-FITC y el péptido FITC durante dos horas. (* P < 0,01. En comparación con el control negativo (FITC y FITC-TAT).;[0042] La FIG. 2 es una gráfica que muestra los resultados de llevar a cabo el análisis de la luciferasa de las líneas de células transfectantes HEK293/null y HEK293/TLR2 con luciferasa de NF-kB, reaccionando a continuación con lipoproteína (10 ng/ml) y FITC y FITC-PEP1(4<j>M), e incubando durante 18 horas. Se obtuvieron resultados de la luciferasa mediante corrección usando renilla. (* P < 0,01, en comparación con el control negativo (Sin tratar) y en comparación con la muestra tratada con lipoproteína.)
[0043] La FIG. 3 a FIG. 23 son los resultados del cribado de los efectos de inhibición de TNF-a sobre los monocitos. La FIG. 24 a la FIG. 46 son los resultados del cribado de los efectos de inhibición de TNF-a sobre la línea de células THP-1.
[0044] La FIG. 47 representa la viabilidad de los neurocitoblastos tratados con 0, 2.5, 5.0, 10, 20 y 40 j M de proteína p amiloide.
[0045] La FIG.48 representa la proliferación de los neurocitoblastos tratados con 0, 2,5, 5,0, 10, 20 y 40 j M de proteína p amiloide.
[0046] La FIG. 49 representa la viabilidad de los neurocitoblastos tratados con 0, 1, 10, 50, 100 y 200<j>M de PEP 1. La FIG. 50 representa la proliferación de los neurocitoblastos tratados con 0, 1, 10, 50, 100 y 200 j M de PEP1.
[0047] La FIG. 51 representa la viabilidad de los neurocitoblastos tratados con 1, 10, 50 y 100<j>M de PEP 1; los neurocitoblastos fueron dañados por 20<j>M de proteína beta amiloide, y a continuación se midió la viabilidad celular tras el tratamiento con diferentes concentraciones de PEP1. (Los grupos del control fueron aquellos no tratados con proteína beta amiloide y péptidos basados en telomerasa).
[0048] La FIG. 52 representa la toxicidad de los neurocitoblastos tratados con 1, 10, 50 y 100 j M de PEP 1; los neurocitoblastos fueron dañados por 20<j>M de proteína beta amiloide, y a continuación se midió la toxicidad celular tras el tratamiento con diferentes concentraciones de PEP1. (Los grupos del control fueron aquellos no tratados con proteína beta amiloide y péptidos basados en telomerasa).
[0049] La FIG. 53 representa la proliferación de los neurocitoblastos tratados con 1, 10, 50 y 100 j M de PEP 1; los neurocitoblastos fueron dañados por 20<j>M de proteína beta amiloide, y a continuación se midió la proliferación celular tras el tratamiento con diferentes concentraciones de PEP1. (Los grupos del control fueron aquellos no tratados con proteína beta amiloide y péptidos basados en telomerasa).
[0051] La FIG. 54 representa la migración de los neurocitoblastos tratados con 1, 10, 50 y 100 pM de PEP 1; los neurocitoblastos fueron dañados por 20 pM de proteína beta amiloide, y a continuación se midió la migración celular tras el tratamiento con diferentes concentraciones de PEP1. (Los grupos del control fueron aquellos no tratados con proteína beta amiloide y PEP 1).
[0053] La FIG. 55 representa la apoptosis de los neurocitoblastos tratados con 1, 10, 50 y 100 pM de PEP 1; los neurocitoblastos fueron dañados por 20 pM de proteína beta amiloide, y a continuación se midió la apoptosis celular tras el tratamiento con diferentes concentraciones de PEP1. (Los grupos del control fueron aquellos no tratados con proteína beta amiloide y péptidos basados en telomerasa).
[0055] La FIG. 56 representa el efecto inhibidor de ROS (Especies de oxigeno reactivo) de PEP1 en neurocitoblastos dañados por el péptido beta amiloide; los neurocitoblastos fueron dañados por 20 pM de proteína beta amiloide, y a continuación se midió la inhibición de ROS tras el tratamiento con diferentes concentraciones de PEP1 (1, 10, 50 y 100 M). (Los grupos del control fueron aquellos no tratados con proteína beta amiloide y PEP 1).
[0057] La FIG. 57 representa los resultados de los niveles de expresión de la proteína analizados mediante (A) electroforesis 2<d>y (B) Matriz de anticuerpos; los neurocitoblastos fueron dañados por 20 pM de proteína beta amiloide, y a continuación se midió el nivel de expresión de la proteína tras el tratamiento con diferentes concentraciones de PEP1 (1, 10 and 50 pM). (Los grupos del control fueron aquellos no tratados con proteína beta amiloide y PEP 1).
[0059] La FIG. 58 representa los resultados de transferencia western que muestran el nivel de expresión de las proteínas relacionadas con la inflamación: los neurocitoblastos fueron dañados por 20 pM de proteína beta amiloide, y a continuación se trataron con diferentes concentraciones de PEP1 (1, 10 y 50 pM).
[0061] La FIG. 59 representa el efecto inhibidor de PEP 1 sobre la agregación de la proteína beta amiloide; (A) muestra la oligomerización reducida de las proteínas beta amiloides cuando se tratan simultáneamente con 1 pM de proteína beta amiloide y PEP 1 (0,1, 1 y 10 pM). (B) muestra el caso cuando PEP-1 se trató sobre la proteína p amiloide que se indujo ya para la agregación.
[0063] La FIG. 60 representa el efecto del inhibidore de PI3K, LY294002 sobre la viabilidad celular tratada con PEP 1. El aumento de la viabilidad celular tras tratar con PEP 1 disminuyó cuando se trató con LY294002.
[0065] La FIG. 61 a la FIG. 159 son los resultados del análisis de la transferencia western de los péptidos seleccionados que muestran la acumulación de HMGB1 en la célula.
[0067] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0069] Debido a que la presente invención puede tener adaptabilidad para diversas transformaciones y ejemplos de aplicación práctica, a continuación se ofrece una descripción más detallada de la presente invención. Sin embargo, esto no significa limitar la forma de aplicación práctica.
[0071] Se sabe que un telómero es una secuencia repetitiva de material genético en los extremos de cromosomas que evita que los cromosomas se dañen o se unan a otros cromosomas. La longitud de un telómero se acorta en cada división celular, y después de un determinado número de divisiones celulares, la longitud del telómero se acorta extremadamente en la medida que la célula deja de dividirse y muere. Por otra parte, se sabe que el alargamiento de los telómeros amplía el lapso de vida de una célula. Por ejemplo, las células cancerosas excretan una enzima denominada telomerasa, que evita el acortamiento de los telómeros, dando como resultado, por tanto, la proliferación de células cancerosas. La presente invención se llevó a cabo tras el descubrimiento de péptidos derivados de telomerasa con efectos antiinflamatorios.
[0073] En una realización de la presente invención, se proporciona un péptido con actividades antiinflamatorias. El péptido se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 101,63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 54, 55, y 56.
[0074] Los péptidos descritos en la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 179 son como se indica en la siguiente tabla 1. La SEQ ID NO: 180 relaciona el orden de longitud completa de la proteína telomerasa humana. La SEQ ID NO: 1 relaciona el péptido derivado de telomerasa que consiste en una secuencia de 16 aminoácidos. Los péptidos que se mencionan en la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 179 son como se indica en la siguiente tabla 1. La SEQ ID NO: 180 relaciona el orden de longitud completa de la proteína telomerasa humana. La SEQ ID NO: 1 relaciona el péptido derivado de telomerasa que consiste en una secuencia de 16 aminoácidos. Los péptidos en la SEQ<i>D NO: 2 a la SEQ ID NO: 77 son péptidos que incluyen la SEQ ID NO: 1. Los péptidos en la SEQ ID NO: 78 a la SEQ ID NO: 179 son fragmentos de péptidos de la SEQ ID NO: 1.
[0075] En la Tabla 1 siguiente, se usó el "nombre" para distinguir entre los péptidos. Más de un péptido de los péptidos mencionados en la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 179 comprende un "péptido sintético", un péptido sintetizado de áreas seleccionadas de la telomerasa. En la presente memoria descriptiva, el término "pep" en el presente documento se refiere a un péptido que tiene una cualquiera de la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 179, o, un péptido que comprende un 80% de homología de la secuencia de aminoácidos anterior con las secuencias anteriormente mencionadas, o un fragmento peptídico de los péptidos anteriormente mencionados.
[0077] Tabla 1
[0080]
[0081]
[0082]
[0083]
[0084]
[0085]
[0086]
[0089] En una realización de la presente invención, se proporciona un polinucleótido que codifica un péptido con actividades antiinflamatorias. Un polinucleótido que codifica un péptido seleccionado del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 101, 63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 54, 55, y 56. El polinucleótido mencionado anteriormente permite la producción de los péptidos en grandes cantidades. Por ejemplo, el cultivo de vectores que incluye polinucleótidos que codifican péptidos permite la producción de péptidos en grandes cantidades.
[0091] Los péptidos aquí divulgados pueden incluir un péptido que comprenda la secuencia de aminoácidos más del 80%, más del 85%, más del 90%, más del 95%, más del 96%, más del 97%, más del 98%, o más del 99% de homología. Además, los péptidos aquí divulgados pueden incluir un péptido que comprende SEQ ID NO: 1 o sus fragmentos, y un péptido con más de 1 aminoácido transformado, más de 2 aminoácidos transformados, más de 3 aminoácidos transformados, más de 4 aminoácidos transformados, más de 5 aminoácidos transformados, más de 6 aminoácidos transformados o más de 7 aminoácidos transformados.
[0093] En la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, los términos "homología" e "identidad de secuencia" se usan de manera indistinta para indicar el grado de solapamiento de la secuencia entre dos secuencias de aminoácidos (o si es relevante: ácido nucleico).
[0095] Salvo que se indique otra cosa, la expresión "Identidad de secuencia" para los péptidos tal como se usa en el presente documento se refiere a la identidad de secuencia calculada como (nref- nd¡f)-100/nref, en la que ndif es el número total de restos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean de tal manera que un número máximo de aminoácidos son idénticos y en la que nref es el número de restos en la más corta de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia de ADN agtcagtc tendrá una identidad de secuencia del 75% con la secuencia aatcaatc (ndif=2 y nref=8).
[0097] Tal como se utiliza en el presente documento, la identidad de secuencia puede determinarse mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, mediante la búsqueda del procedimiento de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, utilizando el algoritmo C<l>U<s>TAL W de Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res 22:467380, mediante las implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group). Se puede usar también el algoritmo BLAST (Altschul et al., 1990, Mol. Biol. 215:403-10) del cual se puede obtener el software a través del National Center for Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov/). Cuando se usan cualquiera de los algoritmos anteriormente mencionados, se usan los parámetros por defecto para la longitud de la "Ventana", penalidad de brecha, etc.
[0099] Como se usa en el presente documento, los cambios en la secuencia de aminoácidos pueden pertenecer a las modificaciones de las características físicas y químicas de los péptidos. Por ejemplo, la transformación de aminoácidos puede llevarse a cabo mejorando la estabilidad térmica del péptido, alterando la especificidad del sustrato, y cambiando el pH óptimo.
[0101] Según la presente divulgación, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos una de las SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 179, un péptido que comprende un 80% de homología de la secuencia de aminoácidos anterior con las secuencias anteriormente mencionadas, o un fragmento peptídico de los péptidos anteriormente mencionados preferiblemente está hecho de 30 o menos aminoácidos..
[0103] Según la presente divulgación, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos una de las SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 179, un péptido que comprenda una secuencia de aminoácidos con una homología superior al 80% con las secuencias antes mencionadas, o un fragmento peptídico de los péptidos antes mencionados puede comprender un péptido procedente de la telomerasa, más concretamente, de la telomerasa del Homo sapiens.
[0105] El término "aminoácido" incluye en el presente documento no solo los 22 aminoácidos convencionales que se integran naturalmente en el péptido, sino también los D-isómeros y los aminoácidos transformados. Por lo tanto, en una realización específica de la presente invención, un péptido del presente documento incluye un péptido que tiene D-aminoácidos. Por otra parte, un péptido puede incluir aminoácidos no convencionales tales como aquellos que se han modificado posteriormente a la traducción. Los ejemplos de modificaciones posteriores a la traducción incluyen fosforilación, glicosilación, acilación (incluyendo acetilación, miristorilación, palmitoilación), alquilación, carboxilación, hidroxilación, glicación, biotinilación, ubiquitinilación, transformación en propiedades químicas (por ejemplo, desimidación, desamidación coneliminación de p) y transformación estructural (por ejemplo, formación de puente disulfuro). Asimismo, se incluyen cambios de aminoácidos y los cambios de los aminoácidos se producen debido a una reacción química durante el proceso de combinación con reticulantes para la formación de un conjugado peptídico.
[0107] Un péptido divulgado en el presente documento puede ser un péptido de tipo salvaje que se ha identificado y aislado a partir de fuentes naturales. Por otra parte, cuando se comparan con los fragmentos peptídicos de la SEQ ID NO: 1, los péptidos divulgados en el presente documento pueden ser mutantes artificiales que comprenden uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados y/o insertados. La alteración de aminoácidos en un polipéptido de tipo salvaje - no solo en mutantes artificiales - comprende la sustitución conservativa de aminoácidos que no altera el plegado y/o la activación de la proteína. Los ejemplos de sustituciones conservativas pertenecen al grupo que consiste en aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparaginas), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina, valina y metionina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina y treonina. Se conocen en la técnica sustituciones de aminoácidos que no alteran generalmente la actividad específica de la presente invención. Las alteraciones que se producen más comúnmente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, y las alteraciones opuestas. En la tabla 2 siguiente se muestras otros ejemplos de sustituciones conservativas.
[0108] Tabla 2.
[0111]
[0112]
[0115] La transformación sustancial de las propiedades biológicas de los péptidos se lleva a cabo seleccionando una sustitución significativamente diferente en las siguientes eficacias: (a) la eficacia en el mantenimiento de la estructura de la estructura principal del polipéptido en el área de sustitución, tal como estructuras tridimensionales en hojas o hélices, (b) la eficacia en el mantenimiento de la carga eléctrica o la hidrofobicidad de la molécula en el área diana, o (c) la eficacia del mantenimiento del volumen de la cadena secundaria. Los restos naturales se dividen en grupos por propiedades generales de la cadena secundaria como las siguientes: 1. hidrofobicidad: Norleucina, met, ala, val, leu, ile;
[0116] 2. hidrofilicidad neutra: cys, ser, thr;
[0117] 3. acidez: asp, glu;
[0118] 4. Básico: asn, gln, his, lis, arg;
[0119] 5. resto que afecta la orientación de la cadena: gly, pro; y
[0120] 6. aromaticidad: trp, tyr, phe.
[0121] Se pueden llevar a cabo sustituciones no conservativas intercambiando un miembro de las anteriores clases con el de una clase diferente. Cualquier resto de cisteína que no esté relacionado con el mantenimiento de la estructura tridimensional adecuada del péptido puede normalmente sustituirse a serina, aumentando por tanto la estabilidad oxidativa de la molécula y evitando la reticulación inadecuada. Por el contrario, se puede conseguir la mejora de la estabilidad añadiendo uno o varios enlace(s) cisteína al péptido.
[0122] Los tipos alterados de variantes de aminoácidos de péptidos son aquellos que cambió el modelo de glicosilación. El término "cambio" en el presente documento se refiere a la deleción de restos de hidratos de carbono y/o la adición de al menos un resto glicosilado que no existe en un péptido.
[0123] La glicosilación en los péptidos es típicamente una glicosilación ligada a N u O. Las glicosilaciones en péptidos está normalmente conectadas a N o conectadas a O. La expresión "conectado a N" en el presente documento se refiere a que los restos de hidratos de carbono están unidos a la cadena secundaria de los restos de asparagina. Como secuencias tripeptídicas, asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina (donde la X es cualquier aminoácido excepto prolina) son la secuencia de reconocimiento para unir el resto de hidrato de carbono enzimáticamente a la cadena secundaria de asparagina. Por lo tanto, con la presencia de una de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido, se crean sitios de glicosilación potencial. "glicosilación conectada a O" significa unir uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a hidroxil aminoácidos. Los hidroxil aminoácidos más habituales son serina o treonina, pero se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
[0125] La adición de un sitio de glicosilación a un péptido se lleva a cabo convenientemente cambiando la secuencia de aminoácidos para contener una secuencia tripeptídica mencionada anteriormente (para los sitios de glicosilación unidos a N). Estos cambios pueden realizarse mediante la adición de al menos un resto de serina o treonina a la secuencia del primer anticuerpo, o mediante sustitución con aquellos restos (para los sitios de glicosilación unidos a O).
[0127] Como se usa en el presente documento, un polinucleótido es una molécula de ácido nucleico que puede ser una molécula de<a>D<n>o ARN espontánea o artificial, tanto monocatenaria como bicatenaria. La molécula de ácido nucleico puede ser uno o más ácidos nucleicos del mismo tipo (por ejemplo, que tiene una misma secuencia de nucleótidos) o ácidos nucleicos de diferentes tipos. Las moléculas de ácido nucleico comprenden uno o más ADN, ADNc, ADN señuelo, ARN, ARNsi, miARN ARNhc, ARNst, ARNsno, ARNsn, ARNsn PNA, oligómero antisentido, plásmido y otros ácidos nucleicos modificados, pero sin limitarse a ellos.
[0128] Una proteína HMGB1 se conoce como una citoquina. Esta experimenta en primer lugar la acetilación y la traslocación al citoplasma mediante estimulación externa. A continuación; se secreta fuera de la célula, cumpliendo por tanto el papel de citoquina productora de inflamación. Puesto que, cuando se tiene una inflamación debida a dicha actividad, la proteína HMGB1 se secreta fuera de la célula, los pacientes con enfermedades inflamatorias tales como síndrome de Churg Strauss, artritis reumatoide y síndrome de Sjogren presentarán niveles séricos elevados de HMGB1. Por lo tanto, si el núcleo contiene gran cantidad de HMGB1 incluso cuando hay un estímulo que causa inflamación, es sugestivo del hecho de que el HMGB1 no se segrega fuera de la célula, lo que significa que se suprime la inflamación.
[0130] Cuando se trata una célula con un péptido que comprende cualquier secuencia de aminoácidos entre SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 179, un péptido que tenga más del 80% de homología de secuencia de aminoácidos con las secuencias antes mencionadas, o un fragmento de los péptidos antes mencionados, la cantidad de HMGB1 dentro del núcleo puede aumentar. Esto representa que los péptidos mencionados anteriormente tienen excelentes efectos preventivos o supresores de la inflamación.
[0132] También, un péptido que comprende cualquier secuencia de aminoácidos entre SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 179, un péptido que tenga una homología de secuencia de aminoácidos superior al 80% con las secuencias antes mencionadas, o un fragmento de los péptidos antes mencionados, puede tener la ventaja de que presenta una alta viabilidad debido a su baja toxicidad dentro de una célula.
[0134] En la presente invención, una "enfermedad inflamatoria" es una indicación amplia que se refiere a cualquier enfermedad que designa la inflamación como causa principal o una inflamación producida por enfermedad. Específicamente, una enfermedad inflamatoria incluye (1) una enfermedad inflamatoria general o localizada (por ejemplo, alergias; enfermedad del inmunocomplejo; fiebre del heno; choque hipersensible; choque endotóxico; caquexia, hipertermia; granulomatosis; o sarcoidosis); (2) enfermedades gastrointestinales relacionadas (por ejemplo, apendicitis; úlcera gástrica; úlcera duodenal; peritonitis; pancreatitis; colitis ulcerosa, aguda, o isquémica; colangitis; colecistitis, esteatorrea, hepatitis, enfermedad de Crohn; o enfermedad de Whipple); (3) enfermedades dérmicas relacionadas (por ejemplo, psoriasis; quemaduras; quemaduras solares; dermatitis; Verrugas urticarias o habones); (4) enfermedades vasculares relacionadas (por ejemplo, angiitis; vasculitis; endocarditis; arteritis; ateroesclerosis; tromboflebitis; pericarditis; insuficiencia cardíaca congestiva; miocarditis; isquemia de miocardio; periarteritis nodosa; estenosis recurrente; enfermedad de Buerger; o fiebre reumática); (5) enfermedades respiratorias (por ejemplo, asma; epiglotitis; bronquitis; enfisema; rinitis; fibrosis quística; pneumonitis intersticial; EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva crónica); síndrome de dificultad respiratoria de adulto; coniosis; alveolitis; bronquiolitis; faringitis; pleuresía; o sinusitis); (6) enfermedades relacionadas con los huesos, articulaciones, músculos y tejido conectivo (por ejemplo, granuloma eosinófilo; artritis; atralgia; osteomielitis; dermatomiositis; fasciitis; enfermedad de Paget; gota; enfermedad periodontal; artritis reumatoide; miastenia grave; espondilitis anquilosante; o sinovitis); (7) trastornos urogenitales (por ejemplo, epididimitis; vaginitis; prostatitis; o uretritis); (8) enfermedades relacionadas con el sistema nervioso central o periférico (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer; meningitis; encefalitis; esclerosis múltiple; infarto cerebral; embolismo cerebral; síndrome de Guillain-Barre; neuritis; neuralgia; lesión de médula espinal; parálisis; o uveítis); (9) virus (por ejemplo, gripe; virus sincitial respiratorio; VIH; hepatitis B; hepatitis C; o virus del herpes), enfermedad infecciosa (por ejemplo, fiebre del Dengue; o septicemia), infección fúngica (por ejemplo, candidiasis); o bacteriana, parasítica, e infección microbiana similar (por ejemplo, bacteremia diseminada; malaria; oncocerciasis; o amebiasis); (10) enfermedad autoinmunitaria (por ejemplo, tiroiditis; lupus; síndrome de Goodpasture; rechazo al injerto; enfermedad del injerto contra el huésped; o diabetes); y (11) cáncer o enfermedad tumoral (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin), pero sin limitarse a aquellas.
[0136] Tratar el componente inflamatorio de dichas enfermedades ha sido una meta principal de la industria farmacéutica global durante numerosas décadas, y se han desarrollado una amplia variedad de tratamientos útiles. Los ejemplos incluyen los corticoesteroides (una gama de agentes naturales, semisintéticos y sintéticos diseñada para imitar el efecto del cortisol, incluyendo prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona, fluticasona y así sucesivamente), inhibidores de la ciclooxigenasa (no selectivos o cox-1 selectivos, tales como indometacina, sulfasalazina y aspirina, y más recientemente cox-2 selectivos, tales como celecoxib), bloqueantes del leucotrieno (tales como monteleukast) y anti-TNF (tales como anticuerpos neutralizantes monoclonales modificados, incluyendo infliximab (Remicade™) y adalimumab (Humira™), proteínas de fusión del receptor TNF, tales como etanercept (Enbrel™), tales como inhibidores de la síntesis de TNF-a de molécula pequeña similares a talidomida).
[0138] En una realización de la presente invención, se proporciona una composición antiinflamatoria que comprende un péptido de la invención como un ingrediente activo. El péptido se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 101, 63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 54, 55, y 56.
[0140] En una realización de la presente invención, la composición antiinflamatoria puede contener 0.1 pg/mg a 1 mg/mg, específicamente 1 pg/mg a 0,5 mg/mg, más específicamente 10 pg/mg a 0.1 mg/mg de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de al menos una de las SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 179, o, un péptido que comprende un 80% de homología de la secuencia de aminoácidos anterior con las secuencias anteriormente mencionadas, o un fragmento peptídico de los péptidos anteriormente mencionados. cuando el péptido está incluido en el intervalo anteriormente mencionado, puede satisfacerse toda la seguridad y estabilidad de la composición y es adecuada en términos de rentabilidad.
[0142] En una realización de la presente invención, la composición puede tener aplicación con todos los animales incluyendo seres humanos, perros, pollos, cerdos, vacas, ovejas, cobayas, y monos.
[0144] En una realización de la presente invención, se proporciona la composición médica para el uso del tratamiento 0 la profilaxis de enfermedades inflamatorias con un ingrediente activo que está comprendido por un péptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 101, 63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 54, 55, y 56. En una realización de la presente invención, La composición farmacéutica puede administrarse mediante medios orales, rectales, transdérmicos, intravenosos, intramusculares, intraperitoneales, en la médula ósea, epidurales o subcutáneos.
[0146] Las formas de la administración oral pueden ser, aunque no de forma limitativa, comprimidos, píldoras, cápsulas blandas o duras, gránulos, polvos, solución, o emulsión. Las formas de administración no oral pueden ser, aunque no de forma limitativa, Inyecciones, goteros, lociones, pomadas, geles, cremas, suspensiones, emulsiones, supositorios, parches, o pulverizaciones.
[0148] En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica, si es necesario, puede contener aditivos, tales como diluyentes, excipientes, lubricantes, aglutinantes, disgregantes, tampones, dispersantes, tensioactivos, agentes colorantes, aromáticos o edulcorantes. En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica puede fabricarse mediante procedimientos convencionales de la industria en la materia.
[0150] En una realización de la presente invención, el ingrediente activo de la composición médica puede variar de acuerdo con la edad, el sexo, el peso, la patología y el estado del paciente, la ruta de administración, o el criterio a cargo del médico que prescribe el tratamiento. La dosificación basada en estos factores se determina en los niveles de los expertos en la materia, y la dosis diaria, por ejemplo, puede ser, aunque no de forma limitativa, 0,1 pg / kg / día a 1 g / kg / día, específicamente 1 |jg / kg / día a 10 mg / kg / día, más específicamente 10 pg / kg / día a 1 mg / kg / día, más específicamente 50 pg / kg / día a 100 pg / kg / día. En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica puede administrarse, aunque no de forma limitativa, de 1 a 3 veces por día.
[0152] En una realización de la presente invención, se proporciona una composición externa de la piel para la mejora o la prevención de la inflamación de la piel. La composición externa de la piel puede contener un ingrediente activo que es un péptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 101, 63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 54, 55, y 56.
[0154] En otra realización de la presente invención, se proporciona una composición cosmética para la mejora o la prevención de la inflamación de la piel. La composición cosmética puede contener un ingrediente activo que es un péptido de la invención seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 101, 63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 54, 55, y 56.
[0156] En una realización de la presente invención, la composición de aplicación externa o composición cosmética puede proporcionarse en todas las formas adecuadas de aplicaciones tópicas. Por ejemplo, se pueden proporcionar formas como soluciones, emulsiones obtenidas mediante dispersión de una fase oleosa en agua, emulsión obtenida mediante dispersión de agua en una fase oleosa, suspensión, soporte sólido, gel, polvo, pasta, espuma o aerosol. Estas formas pueden fabricarse mediante procedimientos convencionales de la industria en la materia.
[0158] En una realización de la presente invención, la composición cosmética puede incluir, dentro de niveles que no dañarán el efecto principal, otros ingredientes que pueden aumentar de forma deseable el efecto principal. En una realización de la presente invención, la composición cosmética puede incluir adicionalmente un hidratante, agentes emolientes, tensioactivos, absorbentes de UV, conservantes, fungicidas, antioxidantes, agentes de ajuste del pH, pigmentos orgánicos o inorgánicos, compuestos aromáticos, un agente de enfriamiento o antitranspirante. La relación de la formulación de los ingredientes anteriormente mencionados puede decidirse por los expertos en la materia dentro de los niveles que no dañarán el objeto y los efectos de la presente invención, y la relación de la formulación basada en el peso total de la composición cosmética puede ser de 0,01 a 5% en peso, específicamente de 0,01 a 3% en peso.
[0160] En una realización de la presente invención, se proporciona una composición alimentaria para la prevención o la supresión de la inflamación.
[0162] En una realización de la presente invención, la composición alimentaria no se limita a formas, sino que por ejemplo puede estar en forma de gránulos, polvo, líquidos, y formas sólidas. Cada forma puede estar formada con ingredientes comúnmente utilizados en la industria adecuadamente seleccionados por los expertos en la materia, además del ingrediente activo, y puede aumentar el efecto con otros ingredientes.
[0164] La decisión para la dosificación en el ingrediente activo anteriormente mencionado está comprendida en el nivel de los expertos en la materia, y la dosificación diaria, por ejemplo, puede ser de 1 |jg / kg / día a 10 mg / kg / día, más específicamente 10 jg / kg / día a 1 mg / kg / día, más específicamente de 50 jg / kg / día a 100 jg / kg / día, aunque sin limitarse a estos números y puede variar de acuerdo con la edad, el estado de salud, las complicaciones y otros diversos factores.
[0166] En una realización de la presente invención, un péptido seleccionado del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 101, 63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 54, 55, y 56 para la prevención o el tratamiento de enfermedades inflamatorias.
[0168] En una realización de la presente invención, se proporciona el péptido para su uso en un procedimiento de prevención o tratamiento de la enfermedad inflamatoria con la aplicación de los péptidos mencionados anteriormente en los pacientes.
[0170] En una realización de la presente invención, se proporciona un kit para la profilaxis o el tratamiento de enfermedades inflamatorias. El kit comprende: un péptido seleccionado del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 101, 63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 43, 54, 55, 56, y 91; e instrucciones que incluyen al menos una de dosis de administración, vía de administración, frecuencia de administración, e indicación del péptido o composición.
[0172] Se pretende que los términos utilizados en el presente documento sean usados para describir las realizaciones, no para limitar la presente invención. Los términos sin número delante no se limitan a la cantidad sino que muestran que puede haber más de un significado del término utilizado. Los términos "que incluye", "que tiene", "que consiste", y "que comprende" deben de interpretarse abiertamente (es decir, "que incluye pero que no se limita a").
[0174] Se usa la mención del intervalo numérico en vez de indicar números separados en el intervalo, salvo que se indique de forma explícita, cada número puede leerse como números separados integrados en el presente documento. Se incluyen los valores finales de todos los intervalos en el intervalo y pueden combinarse de forma independiente.
[0176] Salvo que se señale otra cosa o se contradiga claramente en el contexto, todos los procedimientos mencionados en el presente documento pueden llevarse a cabo en el orden adecuado. El uso de una cualquiera de las realizaciones y de todas las realizaciones, o el lenguaje ilustrativo (por ejemplo, que utiliza "aproximadamente ~"), salvo que se incluya en las reivindicaciones, se utiliza para describir con más claridad la presente invención, no para limitar el ámbito de la presente invención. Cualquier lenguaje en el presente documento, excepción hecha de las reivindicaciones, no debe interpretarse como una necesidad de la presente invención. A menos que defina lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención.
[0178] Las realizaciones preferidas de la presente invención son el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la presente invención. Pueden resultar evidentes a los expertos en la materia tras la lectura de las indicaciones anteriores las variaciones adicionales sobre las realizaciones preferidas. Los presentes inventores esperan que los expertos en la materia pueden utilizar las variaciones de forma adecuada y se pueda llevar a cabo la presente invención de otras maneras que las relacionadas en el presente documento. Por lo tanto, la presente invención, como permite la ley de patentes, incluye equivalentes y sus variaciones, de los puntos clave de la invención indicados en las reivindicaciones adjuntas.
[0179] El factor de necrosis tumoral (TNF), particularmente TNF-a, se conoce porque se libera de las células inflamatorias y puede producir diversas reacciones citotóxicas, reacciones inmunológicas y reacciones inflamatorias. TNF-a es conocido por estar implicado en la incidencia y la prolongación de muchas enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias y produce además una septicemia y un choque séptico graves cuando se libera en la sangre y actúa sistémicamente. Debido a que TNF-a es un factor asociado ampliamente con el sistema inmunitario de un cuerpo vivo, el desarrollo de agentes que inhiban TNF-a se lleva a cabo de forma activa. TNF-a se biosintetiza en una forma inactiva y se convierte en una forma activa escindiéndose mediante la proteasa; la enzima responsable de la activación se denomina enzima convertidora del factor de necrosis tumoral (TACE). Por lo tanto, una sustancia que inhibe este TACE puede tratar, mejorar, o evitar enfermedades, dolencias patológicas, dolencias anómalas, inconvenientes, síntomas adversos y similares adscritos a TNF-a(KR2011-0060940A).
[0180] La proteína de la caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1) existe en altas concentraciones en el timo, ganglios linfáticos, testículos, y en el hígado del feto, y con la excepción de hepatocitos y células del cerebro, existe usualmente en el interior del núcleo. Dicha proteína HMGB1 tiene 3 dominios que consisten en caja A, caja B y C-terminal..
[0181] Se notificó por Tracey et al., en 1999 que la proteína HMGB1 tiene un papel como una citoquina que induce la inflamación, y el mecanismo de inducción de la inflamación de la mencionada HMGB1 es mediante un estímulo externo que produce la acetilación de HMGB1 que a continuación se mueve desde el núcleo al citoplasma. Posteriormente, se sabe que se secreta fuera de la célula, o se secreta fuera de la célula en necrosis. Bonaldi T et al., EMBO J, (22)5551-60, 2003
[0182] La invención se describe adicionalmente mediante las figuras, los siguientes ejemplos y experimentos, que son únicamente a fines de realizaciones específicas ilustrativas de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del ámbito de la invención de ninguna manera.
[0183] Ejemplo 1
[0184] Síntesis de PEP-1 y medición de las actividades antiinflamatorias de PEP-1 (SEQ ID NO: 1) Experimento 1. Síntesis de PEP-1 (SEQ ID NO: 1)
[0185] Se sintetizó un péptido comprendido por 16 aminoácidos con la estructura química 1 como se indica a continuación que tenía la secuencia SEQ ID: 1 (PEP-1) derivada de la telomerasa humana:
[0186] <Estructura química 1>
[0187]
[0189] La SEQ ID NO: 1 (PEP-1) se sintetizó de acuerdo con el procedimiento existente de síntesis de péptidos en fase sólida. En detalle, se sintetizaron los péptidos acoplando cada aminoácido del extremo C mediante la síntesis en fase sólida de Fmoc, SPPS, utilizando ASP48S (Peptron, Inc., Daejeon ROK). Aquellos péptidos cuyo primer aminoácido del extremo C estaba unido a la resina se utilizaron de la siguiente forma:
[0190] Resina de NH2-Lys(Boc)-2-cloro-Tritilo
[0191] Resina de NH2-Ala-2-cloro-Tritilo
[0192] Resina de NH2-Arg(Pbf)-2-cloro-Tritilo
[0193] Todos los materiales de aminoácidos para sintetizar el péptido se protegieron mediante Fmoc en el extremo N y los restos de aminoácidos se protegieron mediante Trt, Boc, t-Bu (t-butiléster), Pbf (2,2,4,6,7-pentametil dihidro-benzofuran-5-sulfonil) que se puede disolver en ácido. Tal como:
[0194] Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, ácido Trt-Mercaptoacético.
[0195] HBTU[2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetametilaminio hexafluorofosfato] / HOBt [N-Hidroxibenzotriazol]/NMM [4-metilmorfolina] se usaron como reactivos de acoplamiento. En 20% de DMF, se usó piperidina para eliminar Fmoc. Para eliminar la protección del residuo o para separar el péptido sintetizado de la resina, se utilizó cóctel de escisión [TFA (ácido trifluoroacético) /TIS (triisopropilsilano) / E<d>T (etanoditiol) / H2O=92,5/2,5/2,5/2,5]. Se sintetizó el péptido utilizando la estructura principal de la fase sólida en combinación con el aminoácido de partida con la protección del aminoácido, haciendo reaccionar los aminoácidos correspondientes por separado, lavando con disolvente y desprotegiendo, y repitiendo el procedimiento. Tras cortar el péptido sintetizado de la resina, se purificó mediante HPLC y se verificó para la síntesis mediante EM, y a continuación se liofilizó.
[0196] El proceso de síntesis específico de PEP1 se describe de la siguiente forma.
[0197] 1) Acoplamiento
[0198] Se fundió el aminoácido (8 equivalentes) protegido con Resina de NH2-Lys(Boc)-2-cloro-Tritilo, y el agente de acoplamiento HBTU(8 equiv.)/HOBt (8 equiv.)/NMM(16 equiv.) y se añadió a DMF, a continuación se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas, a continuación se lavó con DMF, MeOH, y DMF en este orden.
[0199] 2) Desprotección Fmoc
[0200] Se añadió piperidina al 20% en DMF, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos 2 veces, a continuación se lavó con DMF, MeOH, y DMF en este orden.
[0201] 3) Se realizó el marco básico del péptido repitiendo las reacciones 1 y 2 repetidamente.
[0202] 4) Escisión: Se añadió el cóctel de escisión al péptido completamente sintetizado y se separó el péptido de la resina.
[0203] 5) Se añadió éter dietílico enfriado a la mezcla obtenida, y a continuación se usó centrifugación para precipitar el péptido clasificado.
[0204] 6) Tras la purificación mediante HPLC-Prep, se comprobó el peso molecular mediante CL/EM y se liofilizó para producir en forma de polvo.
[0205] Experimento 2: Medición de la actividad antiinflamatoria de PEP 1
[0206] Cultivo de líneas de células
[0207] Las células de macrófago Raw 264.7 (KCBL, 40071) del Banco de Células de Corea se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; PAA, Austria) que contenía suero de feto de bovino al 10% (FBS; Gibco Laboratories), 100 unidades/ml de estreptomicina, y penicilina (Gibco Laboratories) a 37°C con CO2 al 5%. se sembraron las células Raw 264.7 en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 106 células/ml y se incubaron durante la noche. Las células Raw 264.7 se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x106 células/mL y se incubaron durante la noche.
[0208] Al día siguiente, se sustituyó el medio con medio reciente y se añadieron 5 pg/ml de péptido (obtenido como se describe en el ejemplo del Experimento 1) a las células. Tras 30 min de incubación de las células con el péptido, se añadieron 50 pl de LPS (hasta una concentración final de 1 pg/ml) y se incubaron las células durante 24 h más. La muestra experimental con la inducción de la respuesta inflamatoria se trató con 1 pg/mL mL de lipopolisacárido (LPS; Sigma, EE.UU.) y la muestra de control se trató con solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,2). Las muestras del sobrenadante de cada condición se recogieron en tubos eppendorf y se sometieron a análisis adicional.
[0209] Experimento 2-1. Análisis del nivel de NO
[0210] Se midió el nivel de óxido nítrico (NO) en células Raw 264.7 (1 x 106 células/ml) usando el sistema del reactivo de Griess (Promega, EE.UU). Se añadieron 50 pl de medio de cultivo a una placa de 96 pocillo y se añadieron solución de reactivo I de Griess (NED) y reactivo II de Griess (Solución de sulfanilamida) en la misma cantidad. Tras 10 min de incubación de las células con los reactivos, se midió la densidad óptica a 540 nm en 30 min utilizando un lector de microplacas (Molecular Devices, EE.UU.). Se calculó la concentración de NO utilizando una curva convencional (0~100 pM) de nitrito de sodio.
[0211] Como se muestra en la Tabla 3 siguiente, la estimulación de células con LPS aumentó la expresión de NO, pero en el tratamiento simultáneo con LPS y Pep1, el nivel de expresión de NO mencionado anteriormente disminuyó. Se produjo NO durante la inflamación, y el resultado que muestra Pep1 redujo el nivel de NO al 65% del control, respaldando fuertemente el efecto antiinflamatorio de Pep1.
[0212] Tabla 3. La medición del efecto antiinflamatorio de PEP1 derivado de telomerasa humana
[0213] PEP 1
[0216]
[0217] Experimento 2-2. Análisis del efecto inhibidor de las citoquinas
[0219] Para investigar el efecto de PEP1 en la inhibición de la producción de citoquinas proinflamatorias, se pretrataron células RAW 264.7 con PEP 1 a una concentración de 5 pg/mL y se les administró LPS a una concentración de 1 pg/mL, y se incubaron durante 24 horas. Se recogieron muestras del sobrenadante que contenía el medio de cultivo celular y se analizaron los niveles de citocinas mediante kits ELISA (eBioscience, San Diego).
[0221] Se revistieron placas de 96 pocillos con 100 pl de anticuerpos de captura (diluidos en tampón de revestimiento a la concentración recomendada por el protocolo del fabricante) durante la noche a 4°C. A continuación, tras lavar las placas 5 veces, se añadieron 200 pl de diluyentes de ensayo a cada pocillo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente para el bloqueo. Tras lavar cada pocillo con tampón de ensayo cinco veces, la muestra de cultivo celular de cada muestra de proteína convencional de citoquina se diluyó y se añadieron 100 pl de cada uno a cada pocillo. Las placas que contenían las muestras se incubaron durante la noche a 4 °C. A continuación, tras lavar la placa cinco veces con el tampón de lavado, se añadieron 100 pl de anticuerpo secundario conjugado con avidina y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente.
[0223] Tras la incubación con el anticuerpo secundario, la placa se lavó cinco veces y se incubó con 100 pl de avidina-HRP (BD Bioscience) durante 30 min a temperatura ambiente. Tras lavar la placa siete veces, se añadieron 100 pl de solución de TMB (Pierce) y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. La reacción se detuvo añadiendo 50 pl de H2SO42N en cada pocillo. Se midió la densidad óptica a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Se llevó a cabo el análisis estadístico mediante el análisis de la varianza utilizando el procedimiento ANOVA del programa SPSS, y se verificó la significancia entre análisis utilizando el ensayo del intervalo múltiple de Duncan.
[0225] Experimento 2-3. Medición de la secreción de IL-6
[0227] Como se muestra en la Tabla 4 siguiente, el tratamiento con LPS solo, aumentó la secreción de la citoquina IL-6 (interleuquina-6). Sin embargo, el tratamiento conjunto con LPS y PEP-1 mostró una disminución en el nivel de secreción de la citocina proinflamatoria IL-6. Lo más importante, tras el tratamiento con PEP-1, el nivel de secreción de citoquinas proinflamatorias disminuyó en más de un 70%, lo que indica un efecto antiinflamatorio sólido de Pep1.
[0229] Tabla 4. Inhibición de la producción de la citoquina IL-6 mediante PEP-1
[0232]
[0235] Experimento 2-4. HMGB1, TNF-a, Inhibición de la expresión de COX-2
[0237] Se determinó el nivel de expresión de la proteína mediante análisis de la transferencia Western. Se hicieron crecer células en medio que contenía PEP-1, se lavaron con PBS, se trataron con tripsina-EDTA al 0,05%, y se recogieron mediante centrifugación. Las células recogidas se disolvieron en un volumen adecuado de tampón de lisis. Los desechos intracelulares se aglomeraron mediante centrifugación, y se separó una cantidad igual de proteína de cada muestra mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. La proteína separada se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Schleicherand Schuell, Keene, NH, EE.UU.), a continuación se ensayó para el anticuerpo específico de cada proteína. . La membrana se incubó con una solución de ECL (quimioluminiscencia potenciada) (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, EE.UU.), se expuso a rayos X, y se analizó el nivel de expresión de la proteína de acuerdo con el nivel de exposición que se muestra en la película de rayos X.
[0239] Se llevó a cabo el análisis de la transferencia Western para determinar el efecto inhibidor de Ppep1 sobre la expresión de la proteína citoquina. Como se muestra en la Tabla 5 siguiente, la estimulación de células con LPS aumentó la expresión de las citoquinas; HMGB1, TNF-a y COX. Sin embargo, si se trataron las células con LPS y Pep1, el nivel de expresión de las citoquinas proinflamatorias mencionadas anteriormente disminuyó. El resultado muestra que el tratamiento con Pep1 disminuyó los niveles de las citoquinas proinflamatorias en más de un 70% proporcionando una fuerte evidencia que apoya el efecto antiinflamatorio de Pep1.
[0241] Tabla 5. La medición del efecto inhibidor de Pep1 en el nivel de expresión de las citoquinas proinflamatorias.
[0244]
[0247] Experimento 3: Investigación del efecto inhibidor de Pep1 sobre el nivel de TNF-a en células HepG2
[0248] Experimento 3-1: Cultivo de células
[0250] PBMC (célula mononuclear de sangre periférica) se separó de las muestras de sangre (50 ml) recogida a partir de sujetos sanos utilizando Ficoll-PaqueTM PLUS (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, EE.UU.) Piscataway, NJ, EE.UU.). A continuación, las PBMC se enriquecieron en medio RPMI 1640 completo que contenía 20% de suero humano, seguido de la transferencia a una placa de cultivo celular de poliestireno de 100 mm recubierta con suero humano durante 30 min. Tras 2 h de incubación a 37 o c y 5% de CO2, los monocitos se desprendieron del fondo de la placa de cultivo celular utilizando PBS fría (solución salina tamponada con fosfato) (Gibco/Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), y se cultivaron 1 x 105 células en cada pocillo de la placa de 96 pocillos en medio RPMI 1640 (suplementado con penicilinaestreptomicina; 100 mg/ml, suero humano; 20%) durante la noche.
[0252] Para el análisis de la luciferasa, Se utilizaron células HEK293/null (riñón embriónico humano) y HEK293/TRL que expresaban de forma estable TLR2 (receptor 2 de tipo toll) obtenidas de la Seoul National University School of Dental Medicine. Un día antes del experimento de la luciferasa, 2,5 x 105 células se sembraron en cada pocillo de una placa de 12 pocillos y se cultivaron durante la noche en medio DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco) (suplementado con blasticidina; 10 pg/ml, suero de feto de bovino; 10%)(Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.)
[0254] Experimento 3-2: Ensayo de la citoquina
[0256] Para observar el efecto de PEP-1 sobre el nivel de TNF-a en términos del nivel de expresión de la proteína, se llevó a cabo un ELISA (ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima). 1 x 105 monocitos derivados de PBMC se cultivaron en placas de 96 pocillos durante la noche. A continuación, se trató con LPS (lipopolisacárido; 10 ng/ml, Sigma) durante 2 horas, seguido por 3 lavados con PBS. A continuación se trató con medio OPTI-MEM (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU:) durante una hora para inducir la privación de alimento, y 4 pM de FITC (Isotiocianato de floresceína), se trataron con FITC-TAT, PEP-1-FITC, y FITC-PEP-1 durante 2 horas antes de medir el nivel de TNF-a. Tras cultivar, se recogió la sopa de células y se midió la cantidad de TNF-a utilizando el kit ELISA (R&D, Minneapolis, MN, EE.UU.) como sigue:
[0258] La medición de TNF utiliza el procedimiento ELISA de tipo sándwich. Se añadieron 100 pl e anticuerpo primario contra TNF-a en cada pocillo de placas de 96 pocillos prerrevestidas, y la placa se incubó a 4°C durante la noche. Al día siguiente, la placa se lavó 3 veces con una solución de lavado de Tween20 al 05% durante 5 min cada una, y a continuación se añadieron 100 pl de cada muestra y una solución normalizada y se dejó a temperatura ambiente durante 2 h, tras lavar la placa de forma igual a la anterior, se añadieron 100 pl de anticuerpo secundario conjugado con HRP a cada pocillo y se dejó a temperatura ambiente durante 2 h. De nuevo, se lavó la placa, y se añadió avidina/biotina para medir la absorbancia. Se cuantificó el nivel de TNF-a de cada muestra utilizando la gráfica normalizada de la absorbancia de la solución patrón.
[0260] Se estimularon monocitos derivados de PBMC con endotoxina LPS (10 ng/ml) durante 2 h, se sometieron a privación de alimento durante 1 h utilizando OPTI-MEM y a continuación 4 pM de FITC, FITC-TAT, PEP 1-FITC y FITC-PEP 1 durante 2 h. Tras la incubación, se midió el nivel de TNF-a con medio de cultivo celular utilizando ELISA. Como resultado, en el caso de FITC y FITC-TAT, el nivel de TNF-a aumentó debido al LPS (6,2 y 6.7ng/ml, respectivamente), pero el nivel de TNF-a disminuyó significativamente en el caso de PEP-1-FITC y FITC-PEP-1 (0,17 y 0,25 ng/ml, respectivamente) y la diferencia fue estadísticamente significativa (P < 0,01) (FiG. 1).
[0261] Experimento 3-3: Ensayo de la luciferasa
[0263] Para investigar el papel de PEP1 en la respuesta inflamatoria, los inventores evaluaron los modelos de expresión de NF-kB mediante el análisis de la luciferasa. En primer lugar, los inventores incubaron HEK293/null y HEK293/TLR2 (Graduate School of Dentistry, Seoul National University) en una placa de 12 pocillo durante 24 horas, para que se puedan obtener 2,5 x 105 células/pocillo. Después de lavar con PBS tres veces, se sustituyó el medio con OPTI-MEM (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se incubó durante 4 horas, y a continuación se añadió una mezcla de 3 j l de lipofectamina (Invitrogen/Life Technologies), 1 |jg de luciferasa de NF-kB y 10 ng de luciferasa de renilla (Promega, Madison, WI, EE.UU.) a cada pocillo y de nuevo se incubó durante 4 horas. Se colocó lipoproteína pam3cys (10ng/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) en todos los pocillos excepto en aquellos del control negativo, y se trataron con FITC (4 jM ) y FITC-PEP 1 (4 jM ) durante 18 horas antes de que se lavaran con PBS durante tres veces. Los inventores confirmaron la activación de NF-kB mediante el luminómetro TD-20/20 (Turner designs, Sunnyvale, CA, EE.UU.) tras disolver (lisis) las células introduciendo 50 j l de tampón de lisis pasiva - proporcionado por el sistema de ensaya del indicador de la doble luciferasa (Promega) - en cada pocillo. Se confirmó la eficacia de la transfección mediante la transfección simultánea de pCMV-luciferasa de renilla (Promega), y los inventores analizaron los resultados calibrando los valores de la luciferasa.
[0265] Tras transfectar la luciferasa de NF-kB a las líneas de células HEK293/null y HEK293/TLR2, pam3cys, una lipoproteína sintética, y FITC (4 jM ), un control negativo se trataron conjuntamente, y pam3cys con FITC-PEP 1 (4 jM ) se trataron de nuevo conjuntamente para cultivarse durante 18 horas. La medición de los modelos de expresión de NF-kB mediante la intensidad de la luciferasa a través de la lisis de las células con tampón de lisis pasiva - proporcionado por el sistema de ensayo indicador de la doble luciferasa (Promega) mostró que no hubo diferencia en la lipoproteína o FITC-PEP1 tratadas o HEK293/null no tratadas. Sin embargo, cuando la lipoproteína, un agonista de TLR2, se trató con la línea de células HEK293/TLR2, aumentó la expresión de NF-kB (P<0,01) en comparación con la de sin tratar, confirmando la incidencia de respuestas inflamatorias. Asimismo, aumentó la expresión de NF-kB cuando FITC-PEP 1 se trató conjuntamente en comparación con sin tratar; y la expresión disminuyó en comparación con el control negativo en el que la lipoproteína y FITC se trataron conjuntamente (P<0,01) (FIG. 2). Por último, los inventores fueron capaces de confirmar que la respuesta inflamatoria que se puede producir por TLR 2 se redujo cuando PEP 1 se trató conjuntamente.
[0266] Ejemplo 2
[0268] Efecto inhibidor del TNF-a de la serie PEP RIA (SEQ ID NO: 2 a 179) péptidos
[0270] Basándose en los resultados del Ejemplo 1 en el que la SEQ ID NO: 1 (PEP1) tiene el efecto inhibidor de TNF-a, se llevó a cabo el experimento utilizando los péptidos de la SEQ ID NO: 2 a 179 para confirmar su efecto inhibidor de TNF-a. La síntesis de los péptidos de la SEQ ID NO: 2 a 179 utilizó el mismo procedimiento mencionado anteriormente en el Ejemplo 1 (procedimiento utilizado para la síntesis de PEP1, pero los aminoácidos añadidos fueron diferentes.
[0272] Experimento 1: cultivo de células
[0274] Se separó la capa de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) de las muestras de sangre (50 ml) recogidas en sujetos sanos utilizando la solución de separación Biocoll (Biochrom AG, Berlín, Alemania). Las PBMC recogidas se enriquecieron en medio RPMI 1640 que contenía 20% de suero humano durante 30 min, y a continuación se transfirieron a una placa de cultivo de células de poliestireno de 100 mm revestida con suero humano para la incubación durante 2 h a 37°C, en una estufa incubadora con CO2 al 5%. Los monocitos se desprendieron de la parte inferior de la placa utilizando PBS frío, y se incubaron para alcanzar el número de 1 x 105 células/pocillo en una placa de 96 pocillo con medio RPMI 1640 (suplementado con penicilinaestreptomicina; 100 mg/ml, suero humano; 20%) durante la noche.
[0276] Experimento 2: Análisis del efecto inhibidor de TNF-a
[0278] Se llevó a cabo ELISA para encontrar cómo los péptidos de la serie PEP RIA influencian el nivel de TNF-a. Los monocitos derivados de PBMC se incubaron hasta alcanzar el número de 1 x 105 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y, a continuación, se trataron con LPS (lipopolisacárido; 10 ng/ml, Sigma) durante 2 horas. A los monocitos que se lavaron tres veces con PBS, se añadió el medio de cultivo OPTI-MEM para inducir la privación de alimento de las células durante una hora, se tomaron 4 jM del péptido y se incubaron durante 2 horas. Hubo tres grupos de control negativos. El primer grupo no se trató con nada. El segundo grupo se trató con estrógeno (en este experimento, se usó estradiol como tipo de estrógeno). El tercer grupo se trató con LPS (10 ng/ml) o con LPS (10 ng/ml) así como estrógeno (20 nM). PEP1, que se confirmó que tenía actividad inhibidora de TNF-a se utilizó como control positivo para medir la actividad inhibidora de t NF-a. Tras la incubación, se midió TNF-a siguiendo el manual del kit ELISA (R&D, Minneapolis, MN, EE.UU.). Los detalles del procedimiento de cuantificación se pueden encontrar en el Experimento 2.2 del Ejemplo 1.
[0280] Utilizando el procedimiento indicado anteriormente, se cribaron los péptidos con efecto inhibidor de TNF-a. Se estimularon monocitos derivados de PBMC con LPS (10 ng/ml), que es una endotoxina, durante 2 horas y se indujeron para la privación de alimento añadiendo OPTI-MEM durante 1 hora. A continuación, se trataron 4 |jM de 179 péptidos y se incubaron durante 2h. Después de esto, se trataron 4 pM de 179 péptidos y se incubaron durante 2 h. Se midió la cantidad de TNF-a en el medio de cultivo celular utilizando ELISA y se cribaron los péptidos con efecto inhibidor de TNF-a comparando los controles negativos y positivos (FIG. 3 a FIG. 23).
[0282] Las siguientes son las secuencias peptídicas que mostraron un efecto inhibidor de TNF-a cuando se compararon con el grupo del control que se trató solo con LPS: La SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO 103, SEQ ID NO 104, SEQ ID NO 105, SEQ ID NO 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO 111, SEQ ID NO 112, SEQ ID NO 113, SEQ ID NO 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO 119, SEQ ID NO 124, SEQ ID NO 131, SEQ ID NO 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO 148, SEQ ID NO 149, SEQ ID NO 150, SEQ ID NO 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO 159, SEQ ID NO 164, SEQ ID NO 165, SEQ ID NO 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO 172, SEQ ID NO 173, SEQ ID NO 174, SEQ ID NO 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, y SEQ ID NO: 178.
[0284] Asimismo, las siguientes son las secuencias peptídicas que mostraron un efecto inhibidor de TNF-a cuando se compararon con el grupo tratado con LPS y estrógeno: La SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO 117, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO
164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174.
[0286] Experimento 3: Análisis de péptidos que alteran el nivel de TNF-a en la línea de células THP1
[0288] Se llevó a cabo el experimento usando la línea de células THP-1 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EE.UU.) que es una leucemia monocítica aguda humana.
[0290] Las células THP-1 se incubaron para alcanzar el número de 1 x 105 células por pocillo en una placa de 96 pocillo con medio RPMI 1640 durante 24 h, seguido por la adición de 100 pM de<p>M<a>(13-acetato 12-miristato de forbol) para la diferenciación en macrófagos. Tras la diferenciación de THP-1 en macrófagos mediante PMA durante un día, se trataron con LPS durante 2 h y se eliminaron mediante lavado. Seguido por la privación de alimento durante una hora y el tratamiento con PEP1.
[0292] Las células THP-1 diferenciadas mediante PMA se trataron con LPS (lipopolisacárido; 10 ng/ml, Sigma) durante 2 horas, seguido por 2 lavados con PBS. A las células, se añadió medio de cultivo OPTI-MEM para inducir la privación de alimento de las células durante una hora, y se tomó 1 pM de 179 péptidos y se incubó durante 1 hora. Tras la incubación, se midió el nivel de TNF-a utilizando el kit ELISA y se cribaron los péptidos que reducían el nivel TNF-a (Figura 24 a Figura 46).
[0294] Como resultado, la secuencia peptídica SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: NO: 179 parecieron reducir el nivel de TNF-a en comparación con el grupo del control tratado solo con LPS. Además, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 113 fueron seleccionados como péptidos que reducen el nivel de expresión de TNF-a en comparación con la del grupo tratado con LPS y estrógenos.
[0296] Ejemplo 3
[0298] Análisis de la respuesta inflamatoria inducida por la proteína p amiloide
[0300] HMGB1 experimenta en primer lugar la acetilación y la traslocación al citoplasma mediante estimulación externa. A continuación se secreta fuera de la célula, cumpliendo por tanto el papel de citoquina productora de inflamación. Puesto que, cuando se tiene una inflamación debida a dicha actividad, la proteína HMGB1 se secreta desde de la célula, y los pacientes con enfermedades inflamatorias tales como síndrome de Churg Strauss, artritis reumatoide y síndrome de Sjogren presentarán niveles séricos elevados de HMGB1. Por lo tanto, si el núcleo contiene una gran cantidad de HMGB1 incluso cuando existe un estímulo que produce la inflamación, esto sugiere el hecho de que HMGB1 no se secreta fuera de la célula, lo que significa que la inflamación se está suprimiendo.
[0301] Experimento 1: Análisis de supervivencia y proliferación de neurocitoblastos por los efectos antiinflamatorios de PEP-1
[0302] En primer lugar, se preparó PEP-1 de acuerdo con los procedimientos de fabricación descritos en el Ejemplo 1.
[0303] Experimento 1-1: Cultivo de neurocitoblastos y evaluación de la toxicidad del amiloide p
[0304] Tras retirar la corteza de la cabeza de un embrión de rata que se había gestado durante 13 días, se cultivó durante una semana con Factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) para obtener los neurocitoblastos. Para analizar los efectos de la proteína p amiloide sobre los neurocitoblastos, la proteína p amiloide preoligomerizada de las concentraciones 0 a 40 pM se trató sobre los neurocitoblastos durante 48 horas, A continuación se utilizó el ensayo CCK-8, BrdU, y TUNEL para la evaluación de la citotoxicidad (en referencia a BA Yankner et al., 1990 y KN Dahlgren et al., 2002). Los inventores utilizaron la misma concentración de la proteína p amiloide en experimentos posteriores tras confirmar que la supervivencia se redujo al 60% cuando se procesó con 20 pM de la proteína p amiloide (En referencia a la FIG. 47 y 48). Experimento 1-2: Evaluación de la toxicidad mediante tratamiento con PEP-1
[0305] Para evaluar el impacto de PEP-1 sobre los neurocitoblastos cultivados, los neurocitoblastos se cultivaron en primer lugar mediante un procedimiento bien conocido (BA Yankner et, al, 1990 y KN Dahlgren et al., 2002). A continuación, se trataron concentraciones diferentes (0, 1, 10, 50, 100, 200<j>M) de PEP-1 durante 48 horas, seguido por las evaluaciones de la viabilidad celular y la proliferación utilizando el ensayo MTT, BrdU y el ensayo TUNEL. Las concentraciones de PEP-1 de 0 a 200pM parecían estables en las neuronas ya que no inhibieron ni la supervivencia ni la proliferación de las células madre neurales Referencia a Fig. 49 y 50). Experimento 1-3: Evaluación de la toxicidad celular mediante el tratamiento simultáneo de proteína B amiloide y la telomerasa peptídica
[0306] Para determinar si PEP-1 tenía el efecto de suprimir la neurotoxicidad producida por la proteína p amiloide, 20 pM de proteína p amiloide y diversas concentraciones de PEP-1 se trataron simultáneamente durante 48 horas. La viabilidad celular y la apoptosis se midieron utilizando el ensayo MMT, el ensayo CCK-8, el ensayo LDH y el ensayo TUNEL, y el ensayo de proliferación de neurocitoblastos mediante el ensayo BrdU.
[0307] Los resultados del ensayo MMT y el ensayo CCK-8 confirmaron que 10 pM de PEP-1 comenzaron a proteger los neurocitoblastos de la neurotoxicidad por el amiloide p, y la protección más eficaz se proporcionó en 100 pM. (En referencia a la FIG. 51). Se llevó a cabo el ensayo LDH para la evaluación del grado de muerte celular como otro procedimiento, y los inventores confirmaron que el aumento de la muerte celular debido al amiloide p disminuyó mediante PEP-1 y la eficacia se inició a una concentración 1 pM (En referencia a la FIG. 52). Los inventores confirmaron también con el ensayo BrdU que la disminución de la proliferación celular debida a la proteína p amiloide se restauró cuando se procesó con PEP-1 (En referencia a la FIG. 53).
[0308] La movilidad celular es una materia vital debido a la naturaleza de los neurocitoblastos. De acuerdo con los resultados experimentales de la movilidad celular, los inventores confirmaron que la disminución de la proliferación celular debida a la proteína p amiloide se restauró cuando se procesó con PEP-1 y que esta aumentó incluso más cuando se comparó una concentración 10 pM con el control. Esto sugiere que en los ensayos clínicos futuros, el procesamiento antes del trasplante de citoblastos puede proporcionar resultados más efectivos. (En referencia a la FIG. 54).
[0309] Para confirmar el grado de daño de las células madre neuronales, se realizó el ensayo TUNEL. Se observó que la muerte de células madre neuronales aumentó significativamente en el grupo de tratamiento con 20<j>M de proteína amiloide-p, y la muerte de células madre neuronales disminuyó cuando se trató con a 100 j M de PEP 1. (En referencia a la FIG. 55)
[0310] Se investigó el mecanismo de acción del efecto protector de PEP-1 sobre la apoptosis por la proteína p amiloide. En primer lugar, se investigó si PEP-1 es capaz de minimizar el daño oxidativo producido por la proteína p amiloide. Se observó un cambio en la generación de especies de oxígeno reactivo tras el tratamiento con la proteína p amiloide y PEP-1 utilizando la tinción DCF-DA (Molecular Probes, Eugene, OR). En el grupo en el que aumentaron las especies de oxígeno reactivo debido a 20 pM de proteína p amiloide, el aumento de las especies de oxígeno reactivo disminuyó mediante el tratamiento con PEP-1 (1 pM, 10 pM, 50 pM) (En referencia a la FIG. 56).
[0311] Experimento 1-4: Análisis comparativo de los niveles de expresión de la proteína entre los grupos tratados con y sin PEP-1
[0313] Se analizó el nivel de expresión de la proteína del grupo tratado con PEP-1 y el grupo sin tratar mediante la técnica de electroforesis 2D y la técnica de la micromatriz de anticuerpos. Se prepararon 200 |jg extrayendo proteoma de los neurocitoblastos cultivados en el Experimento 1-1 del ejemplo 3. Además, El grupo que no se trató con PEP-1 se usó como grupo comparativo en la misma condición.
[0315] La electroforesis 2D se realizó utilizando geles de acrilamida al 12%. La primera electroforesis en gel se realizó a PI 4~10N, utilizando un tamaño de gel de 8,5x7cm. Tras la electroforesis, se tiño con azul de Coomassie coloidal, y a continuación se comparó la expresión utilizando el software PDQuest para analizar cada mancha.
[0316] Se identificaron diferencias de más de 1,5 veces en los niveles de expresión utilizando MALDI-TOF MS (Espectrometría de masas en tiempo de vuelo con ionización mediante desorción por láser asistida por matriz). Entre estas, se identificaron proteínas correlacionadas con la señalización relacionada con la inflamación, tales como i-NOS y HMGB-1 (en referencia a la Tabla 6). Los cambios en los niveles de expresión de proteínas aumentaron o disminuyeron en 1,5 veces mediante la proteína p amiloide, pero esto confirmó que el nivel de expresión se reguló próximo al del control negativo cuando se añadió PEP-1 (En referencia a la FIG. 57).
[0317] Se llevó a cabo la micromatriz de anticuerpos utilizando el kit de señalización celular (CSAA1, kit de señalización celular de la micromatriz de Ab PanoramaTM), se escanearon los portas de la matriz mediante el escáner GenePix Personal 4100A (Molecular Devices) y se analizaron los datos mediante GenePix Pro 5.0 (Molecular Devices).
[0319] La siguiente Tabla 6 es un análisis de los niveles de expresión de las proteínas asociadas con la inflamación mediante la técnica de la electroforesis 2D. El grupo de control representa el nivel de expresión proteica de las células que no fueron tratadas ni con proteína amiloide-p ni con PEP-1. Muestra el aumento o la disminución del múltiplo de expresión proteica basado en el nivel de expresión del grupo de control.
[0321] Los inventores confirmaron con los resultados del análisis que al igual que lo sugerido en la Tabla 6 siguiente, la expresión por exceso o la expresión por defecto de la proteína relacionada con la inflamación se controló mediante PEP-1; el nivel de expresión de la proteína estuvo próximo al del grupo del control negativo.
[0323] Tabla 6
[0326]
[0329] La ruta de señalización de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)/AKT realiza un papel crucial en el crecimiento y la supervivencia de los neurocitoblastos. La ruta PI3K se activa por factores de crecimiento y factores reguladores, y está implicada en la regulación normal del crecimiento y la supervivencia de los neurocitoblastos. Las rutas de señalización de AKT desactivan algunos factores proapoptóticos, incluyendo una molécula de señalización apoptótico bien conocida, GSK3p.
[0331] Para investigar adicionalmente los efectos antiinflamatorios de PEP-1, los inventores llevaron a cabo la transferencia Western sobre HMGB1, debido a que mostró un cambio principal en el análisis de la proteína. Como resultado, el procesamiento del PEP-1 aumentó los niveles de expresión de la proteína en las proteínas antiapoptóticas tales como Ki67, pAKT, PI3K, HSTF-1 y Bcl-2, y disminuyó los niveles de expresión de la proteína de las señales apoptóticas tales como Bax, GSK3p, Citocromo-c, caspasa-3 (En referencia a la FIG. 58).
[0333] HMGB1, una proteína estructural no de histona que se une al ADN, realiza diversos papeles en la célula; tales como estabilizar la estructura del nucleosoma y regular la expresión génica. Como una de las sustancias causantes de la inflamación que se excreta en la última fase de la respuesta inflamatoria, se excreta por los macrófagos y los monocitos cuando se estimula la inflamación, pero cuando la neurona está dañada y conduce a la necrosis celular, se excretará fuera de la célula, dando lugar a una intensa respuesta inflamatoria. El aumento de HMGB1 por el tratamiento de PEP-1 tras la disminución debida al tratamiento con el p amiloide en el citoplasma de las células nerviosas refleja el hecho de que PEP-1 inhibe la secreción de HMGB1 producida fuera de la célula por la muerte celular de la neurona; sugiriendo por tanto que PEP-1 tiene potentes efectos antiinflamatorios (En referencia a la FIG. 58).
[0335] Además, los inventores investigaron la respuesta de PEP-1 a la agregación del amiloide p. La agregación de la proteína se inhibió cuando se trató con PEP-1 (En referencia a la FIG. 59 (A)) en la inducción de la agregación del amiloide p y la proteína experimentó la degradación cuando se trató con PEP-1 en la proteína p amiloide, cuya agregación ya había sido inducida (En referencia a la FIG. 59(B)).
[0337] En el mecanismo de acción de PEP-1, los inventores han confirmado anteriormente el aumento en la señalización de la supervivencia celular y la disminución en la señalización de la apoptosis de PI3K. Para investigar si estos efectos son directos o indirectos, los inventores trataron con un inhibidor de PI3K, LY294002 (Promega). Como resultado, el aumento de la viabilidad celular tras tratar con PEP 1 disminuyó cuando se trató con LY294002. Por lo tanto, los inventores concluyen que PI3K está directamente asociado con el efecto neuroprotector de PEP 1 (En referencia a la FIG. 60).
[0339] PEP-1 inhibe la apoptosis de los neurocitoblastos mediante la proteína p amiloide. Asimismo, se confirmó la mejora de la movilidad celular de los neurocitoblastos, sugiriendo por tanto una variedad de posibilidades en la aplicación clínica. Los efectos de la inhibición de la neurotoxicidad producida por la proteína beta amiloide se verificaron por el efecto antiinflamatorio del mecanismo de acción de PEP 1, aumentaron los factores de supervivencia de los neurocitoblastos y disminuyeron los factores apoptóticos, especialmente la activación de la ruta de señalización de PI3Ky los efectos antioxidantes.
[0341] Ejemplo 4
[0343] Efectos de los péptidos de la serie PEP RIA (Secuencia No. 2 a 179) sobre la inflamación por la proteína p amiloide
[0345] Experimento 1. Cultivo de células
[0347] Células PC12 indiferenciadas (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.) se mantuvieron en crecimiento en fase logarítmica sobre poli-l-lisina (Sigma, Saint Louis, MO, EE.UU.) - placas de 100mm prerrevestidas(Corning, PA, EE.UU.) en medio RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, EE.UU.) que contenía suero de caballo inactivado térmicamente al 10%, suero de feto de bovino inactivado térmicamente al 5%, 100 unidades/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina. Se incubaron los cultivos a 37°C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5%. Se hicieron crecer los cultivos hasta una confluencia del 50% y se recogieron en una solución salina equilibrada de Hank exenta de Ca2+/Mg2+ que contenía EDTA 1 mM. Se sembraron en placas las células a una densidad de 1 x 106 células/placa de 100mm durante 24 horas. Para la diferenciación neuronal, las células PC12 se privaron de suero durante 12 h (medio RPMI1640 que contenía 100 unidades/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina sin suero de caballo o suero de feto de bovino); posteriormente, las células se mantuvieron en medio exento de suero. Después de dos días, el medio se sustituyó con medio exento de suero. En el día tres, se añadió NGF (50 ng/ml, Sigma, Saint Louis, MO, EE.UU.) al medio, y los cultivos se mantuvieron durante tres días más. Tras la diferenciación, se incubaron células nPC12 con 20 pM de amiloide p con diversas concentraciones de péptidos [0 (control), 1, 10, y 50 pM] durante 48 h.
[0349] Experimento 2. Análisis de transferencia de Western
[0351] Se analizaron los niveles de HMGB1 mediante la transferencia western. En resumen, 5 X 106 células se lavaron dos veces en PBS frío, se incubaron durante 10 min en hielo en tampón de lisis [50 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0.02% de azida sódica, 0,2% de SDS, 100 pg/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (p Ms F), 50 pl/ml de aprotinina, 1% de lgepal 630, 100 mM de NaF, 0,5% de desoxiconato sódico, 0,5 mM de ED<t>A, 0,1 mM de EGTA].1 mM EGTA]; las células no rotas y los núcleos se precipitaron por centrifugación durante 10 min a 2000 x g y los lisados se aclararon por centrifugación a 10.000 x g. Los anticuerpos utilizados fueron: anti-HMGB1 (1:1000, Señalización celular, Beverly, MA, EE.UU.) y anti-p-tubulina (1:1000, Señalización celular, Beverly, MA, EE.UU.). Las membranas se lavaron con solución salina tamponada con Tris que contenía Tween-20 al 0,05% (TBST) y a continuación se procesaron utilizando anticuerpo anti-conejo conjugado con HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE.UU.) seguido por detección ECL (Amersham Pharmacia Biotech,). Se cuantificaron las manchas con un analizador de imágenes (GE Healthcare, ImageQuant LAS 4000).
[0353] Como resultado del análisis de la transferencia western, se seleccionaron los péptidos que mostraban acumulación de HMGB1 en la célula. La FIG 60 a la FIG. 159 son los resultados de las transferencias western de los péptidos seleccionados. En estas figuras, las tubulinas se utilizan para confirmar la expresión de proteínas. Las secuencias de los péptidos seleccionados son las siguientes:
[0355] SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, y SEQ ID NO: 179.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES
1. Un péptido con actividad antiinflamatoria, en el que el péptido se selecciona entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 101,63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 54, 55, y 56.
2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido se origina a partir de la telomerasa humana.
3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, para su uso como un medicamento.
4. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una enfermedade inflamatoria.
5. Un polinucleótido que codifica un péptido seleccionado del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 101, 63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 54, 55, y 56.
6. Una composición antiinflamatoria que comprende un péptido seleccionado del grupo que consiste en: 101, 63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 54, 55, y 56 como ingrediente activo.
7. La composición antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad inflamatoria, en la que la composición es una composición farmacéutica.
8. La composición antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 6, para su uso en la mejora o prevención de la inflamación de la piel, en la que la composición es una composición cosmética.
9. El péptido para el uso de acuerdo con la reivindicación 4 o la composición antiinflamatoria para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en los que la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en (1) enfermedad inflamatoria general o localizada (por ejemplo, alergias; enfermedad inmunocompleja; fiebre del heno; choque hipersensible; choque endotoxínico; caquexia, hipertermia; granulomatosis; o sarcoidosis); (2) enfermedades gastrointestinales relacionadas (por ejemplo, apendicitis, úlcera gástrica, úlcera duodenal, peritonitis, pancreatitis, colitis ulcerosa, aguda o isquémica, colangitis, colecistitis, esteatorrea, hepatitis, enfermedad de Crohn o enfermedad de Whipple); (3) enfermedades dérmicas relacionadas (por ejemplo, psoriasis; quemaduras; quemaduras solares; dermatitis; verrugas urticariales o habones); (4) enfermedades vasculares relacionadas (por ejemplo, angiitis; vasculitis; endocarditis; arteritis; aterosclerosis; tromboflebitis; pericarditis; insuficiencia cardíaca congestiva; miocarditis; isquemia miocárdica; periarteritis nodosa; estenosis recurrente; enfermedad de Buerger; o fiebre reumática); (5) enfermedades respiratorias (por ejemplo, asma; epiglotitis; bronquitis; enfisema; rinitis; fibrosis quística; neumonitis intersticial; EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva crónica); síndrome de dificultad respiratoria del adulto; coniosis; alveolitis; bronquiolitis; faringitis; pleuresía; o sinusitis); (6) enfermedades relacionadas con los huesos, articulaciones, músculos y tejido conectivo (por ejemplo, granuloma eosinofílico; artritis; artralgia; osteomielitis; dermatomiositis; fascitis; enfermedad de Paget; gota; enfermedad periodontal; artritis reumatoide; miastenia gravis; espondilitis anquilosante; o sinovitis); (7) trastornos urogenitales (por ejemplo, epididimitis; vaginitis; prostatitis; o uretritis); (8) enfermedades relacionadas con el sistema nervioso central o periférico (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer; meningitis; encefalitis; esclerosis múltiple; infarto cerebral; embolia cerebral; síndrome de Guillain-Barré; neuritis; neuralgia; lesión de la médula espinal; parálisis; o uveítis); (9) virus (por ejemplo, gripe; virus respiratorio sincitial; VIH; hepatitis B; hepatitis C; o virus del herpes), enfermedad infecciosa (por ejemplo, fiebre del dengue; o septicemia), infección fúngica (por ejemplo, candidiasis); o infección bacteriana, parasitaria y microbiana similar (por ejemplo, bacteriemia diseminada; paludismo; oncocercosis; o amebiasis); (10) enfermedad autoinmune (por ejemplo, tiroiditis; lupus; síndrome de Goodpasture; rechazo de aloinjerto; enfermedad de injerto contra huésped; o diabetes); y (11) cáncer o enfermedad tumoral (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin).
10. Un kit para la profilaxis o el tratamiento de enfermedades inflamatorias que comprende: un péptido seleccionado entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: SEQ ID NO: 101, 63, 62, 70, 71, 72, 17, 25, 42, 43, 54, 55, 56, y 91, e instrucciones que incluyen al menos una de dosis de administración, vía de administración, frecuencia de administración, e indicación del péptido o composición.
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