KR20170054310A

KR20170054310A - 텔로머라제 유래 펩티드를 포함하는 수지상세포 치료제 및 면역 치료제, 및 이를 사용하는 치료방법

Info

Publication number: KR20170054310A
Application number: KR1020160148221A
Authority: KR
Inventors: 김상재; 히로유키 아베; 장화인; 하정순
Original assignee: 주식회사 젬백스앤카엘; 김상재; 주식회사 한국줄기세포뱅크
Priority date: 2015-11-09
Filing date: 2016-11-08
Publication date: 2017-05-17
Also published as: US20170128557A1

Abstract

본 발명은 수지상세포 치료제에 관한 것으로 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드를 포함하는 펩티드들로 활성화된 수지상세포를 투여하여 표적 지향성 치료가 필요한 질병 및 이상 증상을 가진 개체를 치료하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 수지상세포 치료제 및 텔로머라제 유래 펩티드를 포함하는 면역 치료제를 병용 투여하여 표적 지향성 치료가 필요한 질병 및 이상 증상 중에 하나인 암을 포함하는 종양성 질병 치료에서 증상을 유발하는 인자들의 감소 효과를 나타내어, 표적 지향성 면역 치료가 필요한 질병에 우수한 치료방법을 제공할 수 있다.

Description

텔로머라제 유래 펩티드를 포함하는 수지상세포 치료제 및 면역 치료제, 및 이를 사용하는 치료방법 {Dendritic Cell Therapeutic Agent and Immunotherapeutic Agent Comprising a Peptide Derived from Telomerase, and Method for Treatment Using the Same}

본 발명은 면역반응을 유도하는 텔로머라제 유래 펩티드 및 이를 포함하는 펩티드들로 자극된 수지상세포를 포함하는 수지상세포 치료제 및/또는 텔로머라제 유래 펩티드를 포함하는 면역 치료제를 포함하는 면역반응 활성화 조성물, 및 상기 수지상세포 치료제 단독으로 및/또는 상기 면역 치료제를 병용투여하는 면역반응 활성화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드를 포함한 펩티드들에 의해 활성화된 수지상세포 및 이를 포함하는 조성물 단독으로, 또는 텔로머라제 유래 펩티드를 포함하는 면역 치료제와 병용하여 사용되어, 항원 특이적 면역 반응을 증가시켜 염증 또는 암을 포함한 질환들의 치료에 효과적인 펩티드에 의해 활성화된 수지상세포 치료제 및 상기 세포 치료제와 병용되는 면역 치료제에 관한 것이다.

세포 치료제는, 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 또는 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식 및 선별하거나, 여타의 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다.

세포 치료제 중 수지상세포 면역 치료제는 매우 특화된 면역 세포로서, 면역 치료제가 투여되는 대상 유래의 수지상세포에 펩티드들을 펄싱하여 활성화시킨 수지상세포로부터 조제되고, 치료제를 필요로 하는 대상의 체내에 투여된다. 투여된 수지상세포는 T 세포에 해당 펩티드들의 항원을 제시하고, 이로 인해 활성화된 T 세포 (CTL)는 해당 펩티드들을 표지하는 세포를 특이적으로 공격하기 때문에, 체내의 정상세포를 손상시키지 않고 질병을 치료할 수 있다. 미성숙 DC는 T 세포를 자극할 수는 없지만, 항원을 캡처(capturing)하는 능력이 뛰어나다. 미성숙 수지상세포 (Dendritic Cell, DC)는 항원 및 기타 자극 물질들을 캡처링하여 자극을 받고 성숙한 수지상세포로 분화된다. 항원을 제시하는 성숙한 DC는 CD80, CD83, CD86 및 MHC 클래스 I 및 클래스 II를 강하게 발현하고, 배수 림프절 (draining lymph node)의 T 세포가 풍부한 곁피질 (paracortical) 영역으로 이동하여 T 세포에 항원을 제시하고 항원 특이적인 T 세포 독성반응 (cytotoxic T lymphocytes, CTL)을 유도하고, 헬퍼 T 세포를 유도하여 항암 효과를 나타내게 된다.

그런데, 수지상세포 면역 치료제의 제조를 위해서 필요한 수지상세포는 체내로부터 직접 분리할 수 없다. 그 때문에 수지상세포는 면역 치료제가 투여되는 대상으로부터 채취한 골수 또는 혈액으로부터 단핵세포를 분리하고, 이 단핵세포를 수지상세포로 분화시킴으로써 수득된다.

종래 알려져 있는 수지상세포 면역 치료제를 제조하기 위해서 사용되는 단핵세포를 채취하는 방법으로서는, 성분채집술 (apheresis)이 알려져 있다. 성분채집술은 공여자 또는 수여자의 전혈 (whole blood)를 채혈하여 혈액이 장치를 통과하여 필요한 성분만을 모으는 것을 말한다. 성분채집술에 따르면, 성분 채혈장치를 사용해서 혈액 중의 백혈구를 분리하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 성분채집술은 장치의 운용에 비용이 드는 데다가, 장치의 조작을 위해서 고도의 기술이 요구된다. 또한, 성분채집술에서는 단핵세포뿐만 아니라, 단핵세포 이외의 성분 (백혈구, 적혈구 또는 혈소판 등)도 포함하는 혼합물을 채취한다. 그 때문에 성분채집술 후에, 적혈구나 혈소판 등의 단핵세포 이외의 성분을 제거하기 위해서 단핵세포의 분리공정을 수행하는 것이 일반적이다.

수지상세포 면역 치료제를 임상시험 등에 응용하기 위해서는 1회의 투여에 대략 1×10⁷개의 세포 수를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 세포 수를 확보하기 위해서, 통상, 동일한 대상으로부터 간격을 두고 8회 정도의 성분채집술이 수행된다. 또, 혈액 중에 존재하는 단핵세포의 비율은 적기 때문에, 수지상세포 면역 치료제를 제조할 수 있을 정도로 충분한 양의 단핵세포를 얻기 위해서 성분채집술을 사용하면, 혈액을 성분채집술 장치 내에서 순환시켜서 백혈구 성분을 충분하게 채취할 필요가 있는데, 이것은 체력적으로 또한 시간적으로 환자에게 부담이 매우 크다. 그 때문에 성분채집술 중, 환자의 용태가 급변하면, 성분채집술을 도중에 중단하고, 수지상세포 면역 치료제 요법 그 자체를 단념해야만 하는 경우가 있다. 또한, 성분채집술에서 단핵세포의 성분을 채취했을 경우에는 통상 5∼8회 분 정도의 수지상세포 면역 치료제를 제작할 수 있다고 하지만, 수득되는 수지상세포 면역 치료제의 실제 양은 환자의 혈액상태 등에 따라서 변동한다. 성분채집술의 또 다른 단점은 채취된 단핵세포를 냉동보관해야 하며, 이렇게 냉동된 세포를 투여 전에 녹여야 한다는 것이다.

성분채집술이 필요 없는 면역 치료제용 수지상세포 제조법은 특허 문헌 1에 제시되어 있는 것과 같이 환자의 말초혈액을 채취하여 단핵세포를 수집 및 배양하고, 단핵 세포에서 분화된 미성숙 수지상세포에 펩티드를 펄싱하여 활성화시킨 뒤 성숙한 수지상세포가 되면 다시 펩티드를 펄싱하여 활성화시키는 과정을 거쳐 얻어진다. 성분채집술을 사용하지 않는 수지상세포 제조법은 성분채집술을 이용할 때의 단점인 환자의 부담과 시간을 줄일 수 있다. 또한, 하나의 백신을 제조하는 데 25-30ml 정도의 말초혈액으로 충분하다는 장점이 있다. 아울러, 수지상세포를 얼리거나 녹이는 과정이 없이 신선한 백신을 얻을 수 있다.

세포 매개 면역은 감염 또는 형질전환된 (transformed) 세포 (암세포 등)를 죽이는 작용을 하는 세포인 CTL (cytotoxic T lymphocyte, 세포독성 T 림프구) 및 NK 세포 (natural killer cell, 자연살해세포)에 의해 이루어진다.

CTL은 항원특이적 (antigen-specific) 세포매개 면역을 담당하는 세포이다. 즉 특정항원을 인지해서, 그 항원이 보이는 세포를 세포사멸 (apoptosis) 방식으로 죽이는 역할을 하게 된다. 항원특이적이기 때문에 적응성 면역 (adaptive immunity)으로 분류된다. 활성화된 CTL은 퍼포린 (perforin)이나 그랜자임 (granzyme) 같은 물질을 분비하여 대상 세포를 공격 및 사멸시키는 작용을 한다.

NK 세포는 문제가 생긴 세포 (바이러스에 감염되었거나 형질전환된 암세포와 같은 세포)들을 인지하는 방식이 항원 특이적 (antigen-specific)이지 않다는 점에서 CTL과 다르다. 항원특이적이지 않기 때문에 내재적 면역 (innate immunity)으로 분류된다. NK 세포는 개체가 원래 가지고 있는 펩티드들을 비정상적으로 적게 표지하는 세포들을 공격하여 사멸시키는 작용을 한다.

세포 감염 및 변성 세포에 의해 촉발되는 염증 또는 암을 포함하는 각종 질환들은 이를 치료하기 위하여 각종 화학적 치료제 투여 및 방사선 치료 등을 통하여 광범위한 치료를 통해 대부분의 치료가 이루어진다. 이 과정에서 감염되거나 변성되지 않은 정상세포의 많은 손실 및 사멸이 나타나게 되어 많은 부작용을 일으키게 된다. 이에 정상세포는 건드리지 않으면서 감염 또는 변성 등에 의한 잘못된 세포들만 특이적으로 공격하여 제거하는 치료제의 필요성이 대두되고 있다.

본 발명에 따른 펩티드 (이하 PEP1)은 텔로머라제 (telomerase)의 촉매부분에 존재하는 16개의 중요한 아미노산으로 구성된 펩티드로 항염 및 항산화 등의 효능을 지닌 것으로 알려져 있다. PEP1을 포함한 펩티드 군으로 펄싱하여 활성화된 수지상세포를 포함하는 면역 치료용 조성물이 세포 감염 및 변성 등에 의하여 유도되는 염증 또는 암을 포함한 각종 질환에 효과가 있음이 임상 실험 등을 통하여 발견됨에 따라 PEP1을 포함한 펩티드의 펄싱으로 활성화된 수지상세포 면역 치료용 조성물이 염증 또는 암을 포함한 각종 질환의 표적지향성 면역 치료 효과를 보일 것으로 기대된다. 추가적으로, 본 발명은 PEP1 펩티드 등을 포함한 항원 펩티드로 활성화된 수지상세포 치료제와 병용하여 PEP1 펩티드를 포함하는 면역 치료제를 투여하여 면역 상승 효과를 얻을 수 있음을 개시하고 있다. 아울러, 본 발명은 PEP1 펩티드 등을 포함한 항원 펩티드로 활성화된 수지상세포 치료제 및 NK 세포 치료제와 병용하여, PEP1 펩티드를 포함하는 면역 치료제를 병용하여 상승된 면역 효과를 얻을 수 있음을 개시하고 있다.

본 발명은 텔로머라제의 역전사 효소 (reverse transcriptase of telomerase) 유래의 펩티드를 포함하는 펩티드들로 활성화된 수지상세포 치료제 및 텔로머라제 유래 펩티드를 포함하는 면역 치료제를 포함하는 염증 또는 암에 대한 면역반응을 생성하는 면역반응 활성화 조성물을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 인간 텔로머라제 역전사 효소 (human reverse transcriptase of human telomerase, hTERT) 유래의 아미노산 펩티드를 포함하는 펩티드들로 활성화된 수지상세포 단독으로 또는 텔로머라제 유래 펩티드를 포함하는 면역 치료제를 병용하여 투여하는 면역반응 활성화 조성물을 제공한다.

WO 2013-118899 A1 WO 2013-100500 A1 JP 5577472 B2

이러한 배경하에서 본 발명자들은 부작용이 거의 없으면서, 효과가 우수한 펩티드로 활성화된 수지상세포 및 이를 포함하는 수지상세포 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 효과적이면서 동시에 부작용이 없는 텔로머라제 유래 펩티드로 활성화된 수지상세포 치료제 단독으로 또는 상기 수지상세포 치료제와 병용하여 텔로머라제 유래 펩티드를 포함하는 면역 치료제를 병용 투여하는 면역반응 활성화 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 염증 또는 암을 비롯한 질환을 치료하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 일측면에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드들로 활성화된 수지상세포를 포함하는 감염되거나 또는 변성된 세포들에 대한 면역 반응을 생성하는 면역반응 활성화 조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 수지상세포는 PEP1 이외에 추가적으로 WT1, MUC-1, CA125, MAGE-A3, CEA, NY-ESO1, Survinin 및 Her2로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원 유래의 펩티드로 활성화된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 감염되거나 또는 변성된 세포들에 면역 반응 생성으로 염증 또는 암을 치료하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 암은 췌장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 간암, 신장암 중에서 선택되는 하나 이상의 암을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 수지상세포는 투여 받을 개체의 말초혈액으로부터 선별 배양된 단핵세포에서 유래된 수지상세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1 또는 그의 단편을 포함하는 면역 치료제와 병용 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 NK (natural killer) 세포 치료제와 병용 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 항암화학요법용 약제 또는 표적 항암치료제와 병용 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 방사선 치료 요법과 병용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따르면, 약학적으로 유효한 양의 상기 수지상세포를 포함하는 면역반응 활성화 조성물을 표적 지향성 치료를 필요로 하는 질병 또는 이상 증상을 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 염증 또는 암에 대한 면역 반응을 생성하는 면역반응 활성화 방법을 제공한다.

본 발명의 면역반응 활성화 방법에 있어서, 상기 조성물의 투여는 2주마다 1회씩 림프절 근처의 피내 주사를 통해 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 면역반응 활성화 방법에 있어서, 상기 조성물의 투여는 서열번호 1 또는 그의 단편을 포함하는 면역 치료제와 병용 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따르면, 상기 수지상세포를 포함하는 면역반응 활성화 조성물을 포함하는 염증 또는 암에 대한 면역반응을 생성하는 면역반응 활성화 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 서열번호 1 또는 그의 단편을 포함하는 면역 치료제를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 약학적 유효성분으로 본 발명에 따른 수지상세포를 포함하는 면역반응 활성화 조성물 및 서열번호 1의 면역 치료제를 2주 간격으로 림프절 근처의 피내 주사를 통해 투여하는 것을 지시하는 지시서를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 서열번호 1의 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열과 80%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 펩티드들로 활성화된 수지상세포를 포함하는 면역반응 활성화 조성물은 표적 지향성 치료를 필요로 하는 질병 또는 이상 증상을 가진 개체에서 질병을 유발하는 인자들의 감소 및 개체의 면역반응 증가에 효과를 보여, 종양성 질환을 포함하는 표적 지향성 치료를 필요로 하는 질병 또는 이상 증상의 치료법을 제공할 것으로 예상된다.

도 1의 A는 본 발명에 따른 미성숙 수지상세포의 PEP1 항원 포식작용을 유세포 분석기(Flow cytometry)로 분석한 결과를 나타낸 것이고, B는 본 발명에 따른 미성숙 수지상세포의 PEP1 항원 섭취능을 공초점현미경(Confocal microscopy)로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 PEP1 활성화 수지상세포의 항원 특이적 T 세포 증식 유도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 PEP1 특이적 T 세포가 분비하는 IFN-γ 분비량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4은 본 발명에 따른 수지상세포 면역 치료 요법을 시행한 환자 중 74세 위암 여성 환자 (환자 1)의 말초 혈액을 사용하여 치료 전 ELISPOT 어세이를 실시한 결과 사진 및 이를 수치화한 결과를 나타낸 표이다.
도 5는 본 발명에 따른 수지상세포 면역 치료 요법을 시행한 환자 중 74세 위암 여성 환자 (환자 1)의 말초 혈액을 사용하여 치료 후 ELISPOT 어세이를 실시한 결과 사진 및 이를 수치화한 결과를 나타낸 표이다.
도 6은 본 발명에 따른 수지상세포 면역 치료 요법을 시행한 환자 중 77세 폐암 남성 환자 (환자 2)의 말초 혈액을 사용하여 치료 전 ELISPOT 어세이를 실시한 결과 사진 및 이를 수치화한 결과를 나타낸 표이다.
도 7는 본 발명에 따른 수지상세포 면역 치료 요법을 시행한 환자 중 77세 폐암 남성 환자 (환자 2)의 말초 혈액을 사용하여 치료 후 ELISPOT 어세이를 실시한 결과 사진 및 이를 수치화한 결과를 나타낸 표이다.
도 8는 본 발명에 따른 수지상세포 면역 치료 요법을 시행한 환자 중 72세 췌장암 남성 환자 (환자 3)의 말초 혈액을 사용하여 치료 전 ELISPOT 어세이를 실시한 결과 사진 및 이를 수치화한 결과를 나타낸 표이다.
도 9는 본 발명에 따른 수지상세포 면역 치료 요법을 시행한 환자 중 72세 췌장암 남성 환자 (환자 3)의 말초 혈액을 사용하여 치료 후 ELISPOT 어세이를 실시한 결과 사진 및 이를 수치화한 결과를 나타낸 표이다.
도 10은 본 발명에 따른 수지상세포 면역 치료 요법을 시행한 환자 중 66세 유방암 여성 환자 (환자 4)의 말초 혈액을 사용하여 치료 전 ELISPOT 어세이를 실시한 결과 사진 및 이를 수치화한 결과를 나타낸 표이다.
도 11은 본 발명에 따른 수지상세포 면역 치료 요법을 시행한 환자 중 66세 유방암 여성 환자 (환자 4)의 말초 혈액을 사용하여 치료 후 ELISPOT 어세이를 실시한 결과 사진 및 이를 수치화한 결과를 나타낸 표이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1의 펩티드, 서열번호 1의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제, 구체적으로 인간 텔로머라제에서 유래한 펩티드를 포함한다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.

또한 본 발명의 일측면에 따른 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 세포 내 독성이 낮고, 생체 내 안정성이 높다는 장점을 가진다. 본 발명에서의 서열번호 1은 텔로머라제 유래 펩티드로서 하기와 같이 16개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.

서열 번호 1에 기재된 펩티드는 아래 표 1과 같다. 아래 표 1의 "이름"은 펩티드를 구별하기 위해 명명한 것이다. 본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1에 기재된 펩티드는 인간 텔로머라제의 전체 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 다른 일측면에서, 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제에 포함된 펩티드 중 해당 위치의 펩티드를 선별해 합성한 "합성 펩티드"를 포함한다. 서열번호 2는 전체 텔로머레이즈의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

본 발명의 일측면에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 (comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 포함하는 펩티드들로 활성화된 수지상세포를 유효 성분으로 포함하는 면역반응 활성화 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 펩티드로 활성화된 수지상세포를 포함하는 면역반응 활성화 조성물은 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 면역 치료제와 병용 투여될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 면역반응 활성화 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 면역반응 활성화 조성물은 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 면역반응 활성화 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 면역반응 활성화 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 면역반응 활성화 조성물과 병용 투여되는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 면역 치료제의 투여량은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1 ㎍/kg/일 내지 100 g/kg/일, 구체적으로는 10 ㎍/kg/일 내지 10 g/kg/일, 더 구체적으로는 100 ㎍/kg/일 내지 1 g/kg/일, 보다 더 구체적으로는 500 ㎍/kg/일 내지 100 mg/kg/일이 될 수 있으나, 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다 (즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).

수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며, 그것이 아님이 명시되어 있지 않는, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.

본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석되어서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다.

이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 펩티드의 합성

1. 펩티드의 합성

서열번호 1의 펩티드 (이하 "PEP1"이라 함)를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S (Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Ala-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin

펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.

커플링 시약 (Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H₂O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.

아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.

본 실시예에 사용된 펩티드에 대해 고성능 액체 크로마토그래피 결과, 모든 펩티드의 순도는 95% 이상이었다.

펩티드 PEP 1 제조에 관한 구체적인 과정을 설명하면 다음과 같다.

1) 커플링

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin에 보호된 아미노산(8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량)을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

2) Fmoc 탈보호

20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩티드 기본 골격 NH₂-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chloro-Trityl Resin)을 만들었다.

4) 절단(Cleavage): 합성이 완료된 펩티드 Resin에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩티드를 Resin에서 분리하였다.

5) 얻어진 mixture에 Cooling diethyl ether를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침전시킨다.

6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 powder로 제조하였다.

실시예 2: 항원(펩티드)로 활성화된 수지상세포의 제조

수지상세포의 제조방법은 채취한 혈액 등으로부터 단핵세포를 증식시켜 제조하는 단핵세포 제조공정과, 상기 단핵세포를 수지상세포로 분화시키는 수지상세포 분화공정으로 이루어진다. 단핵세포를 수지상세포로 분화시키는 방법으로는, 단핵세포를 IL-4 (Inteleukin-4) 등을 포함하는 배지에서 배양하여 미성숙 수지상세포로 분화시킬 수 있으며, 수득된 미성숙 수지상세포를 TNF-α (Tumor necrosis factors-α) 등을 포함하는 배지에서 배양하여 성숙 수지상세포로 분화시킬 수 있다.

1. 인간 말초혈액 유래 단핵세포 (human peripheral blood mononuclear cells, hPBMC)의 분리

건강한 지원자로부터 말초혈액 5~100cc를 헤파린(heparin)과 같은 항응고제가 포함된 진공 채혈관을 이용하여 채혈하였다. 채취된 혈액과 인산염완충용액(phosphate buffered saline, PBS)을 소정의 비율로 혼합하여 희석한 후, 희석된 시료로부터 Lymphoprep 또는 Ficoll-Plque를 이용한 밀도구배 원심분리방법을 통해 인간 말초혈액 유래 단핵세포를 분리하였다. 분리된 말초혈액 유래 단핵세포는 PBS로 2회 세척한 후 실험에 사용하였다. 한편, 냉동보관된 말초혈액 유래 단핵세포를 사용할 경우에는, 37°C 항온 수조기에서 1분 이내로 해동하여 세포배양배지로 2회 세척한 후 실험에 사용하였다.

2. CD14 양성세포(CD14+)의 분리

말초혈액 유래 단핵세포로부터 고순도의 CD14+ 세포를 고수율로 분리하기 위해서 플라스틱 부착법과 CD14+ MACS 분리법을 사용하였다. 플라스틱 부착법은 전체 단핵세포를 세포배양용기에 접종하여 1~2시간 배양한 후, 바닥에 부착한 세포만을 Tripsin-EDTA를 이용하거나 또는 물리적으로 탈착시켜 사용하였다. MACS 분리법은 CD14 column에 걸러 순수한 CD14+ 세포를 얻는 방법으로, 밀테니(Miltenyibiotic)사에서 판매하는 마이크로비드를 사용하여 제조사 매뉴얼에 따라 분리하였다.

3. 미성숙 수지상세포(immature dendritic cells, imDC)로 분화

CD14+ 세포를 0.5~2x10⁶개/㎖의 농도가 되도록 세포배양용기에 접종하였다. 보다 구체적으로, CD14+ 세포를 IL-4(interleukin-4) 500~1,500U/㎖와 GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 500~2,000U/㎖를 함유한 CellGro DC serum-free medium(CellGenix) 배양배지에 넣어 37°C, 5% CO₂ 조건 하에서 5일 동안 배양하였으며, 사이토카인의 보충을 위해 2~3일 간격으로 세포배양배지를 교체하였다.

4. 미성숙 수지상세포의 PEP1 항원(펩티드) 활성화

면역 반응을 유도하기 위해서, 미성숙 수지상세포에 PEP1 5~100㎍/㎖를 첨가하고, IL-4 500~1,500U/㎖, GM-CSF 500~2,000U/㎖, 및 KLH(Keyhole limpet hemocyanin) 10㎍/㎖을 함유한 CellGro DC serum-free medium(CellGenix)에 넣어 37°C, 5% CO₂ 조건 하에서 18~24시간 동안 항원 활성화를 유도하였다.

5. 성숙 수지상세포(mature dendritic cells, mDC)로 분화

항원 활성화 후 바로 미성숙 수지상세포의 성숙화를 유도하기 위해서, TNF-α (Tumor necrosis factors-α) 5~20ng/㎖, IL-1β(Interleukin-1β) 10~20ng/㎖, IL-6(Interleukin-6) 1,000~2,000U/㎖, 및 PGE₂(Prostaglandin E₂) 0.01~10㎍/㎖를 함유한 CellGro DC serum-free medium(CellGenix)에 넣어 37°C, 5% CO₂ 조건 하에서 1일 동안 배양하였다.

실시예 3: 수지상세포 기능 분석

실시예 3-1: 미성숙 수지상세포의 포식작용( Endocytosis ) 및 세포 섭취능 (Cellular uptake) 분석

미성숙 수지상세포는 성숙 수지상세포에 비하여 항원을 인식하여 포식하는 능력이 우세하다. 본 발명의 실시예에 따라 분화된 미성숙 수지상세포가 항원인 PEP1을 세포 내로 유입하는지를 유세포분석기(Flow cytometry)와 공초점현미경(Confocal microscopy)을 이용하여 분석하였다.

1. 미성숙 수지상세포의 포식작용 분석

미성숙 수지상세포 1x10⁶개/㎖에 PEP1-FITC(Fluorescein isothiocyanate) 50~100㎍/㎖를 처리하여 37°C에서 30분, 1시간, 2시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS로 2회 세척하고, FACSCalibur(Becton Dickinson)를 이용하여 미성숙 수지상세포의 포식작용을 분석하였다. 대조군은 수지상세포를 4°C에서 1시간 동안 배양하여 사용하였다. 도 1의 A는 대조군(검은색, 왼편 그래프)에 비해 PEP1을 처리한 미성숙 수지상세포(녹색, 오른편 그래프)가 오른쪽으로 이동(shift)됨을 보여주는 FACS 결과이다. 미성숙 수지상세포가 PEP1을 항원으로 인지하여 우수한 포식능을 가지며 항원제시세포로의 기능을 발휘하고 있음을 보여준다. 이는 면역반응의 시작이 미성숙 수지상세포의 항원 포식과 섭취된 항원이 처리과정(processing)을 통해 MHC 분자에 제시되며 수지상세포의 성숙을 통해 촉진됨을 나타낸다.

2. 미성숙 수지상세포의 섭취능 분석

미성숙 수지상세포 3x10⁵개/㎖를 챔버 웰(chamber well)에 접종하고 PEP1-FITC 50~100㎍/㎖로 30분, 1시간, 2시간 동안 활성화하였다. 활성화 후 챔버 웰을 PBS로 4회 세척하고, 2%(v/v) Paraformaldehyde로 상온에서 15분 동안 세포를 고정시켰다. DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole)로 상온에서 15분 동안 핵을 염색하고, 공초점현미경으로 미성숙 수지상세포의 섭취능을 육안 분석하였다. 도 1의 B는 미성숙 수지상세포의 PEP1 항원 섭취능을 분석한 결과로, 미성숙 수지상세포 내로 PEP1-FITC가 잘 포식되고 침투(초록색)하고 있음을 육안상으로 확인할 수 있다.

실시예 3-2: PEP1 활성화 수지상세포의 T 세포 자극력(stimulatory capacity) 분석

수지상세포는 세포독성 T세포 (Cytotoxic T lymphocytes, CTL)을 활성화시켜 표적세포를 공격하는 방식으로 질병을 치료한다. 이에, PEP1 활성화 수지상세포의 T 세포 증식반응과 사이토카인(Cytokine) 분비능을 분석하였다.

1. PEP1 활성화 수지상세포의 T 세포 증식반응(T cell proliferation response) 분석

PEP1 활성화 수지상세포가 T 세포 증식을 유도하는지 혼합 림프구 반응시험(Mixed lymphocyte reactions, MLR)으로 분석하였다. 혼합 림프구 반응(Mixed lymphocyte reactions, MLR)은 공동자극분자의 활성화를 측정하는 전형적인 방법으로 항원제시세포의 기능을 평가하는 표준화 기법으로 알려져있다. PEP1 활성화 수지상세포와 T 세포를 1:10, 1:50, 1:100의 비율로 혼합하여 96-well plate에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 후 BrdU incorporation (BrdU Cell Proliferation Assay Kit, Cell Signaling Technology)를 이용하여 제조사 매뉴얼에 따라 T 세포 증식력을 분석하였다. 구체적으로, 혼합배양이 끝난 96-well plate에 최종 농도가 1배가 되도록 BrdU 용액을 넣은 후 37°C에서 1~24시간 동안 배양하였다. 300g로 10분 동안 plate를 원심분리하여 BrdU가 함유된 배지를 제거하고, Fixing/Denaturing 용액 100㎕를 96-well plate에 넣은 후 상온에서 30분 동안 반응시켰다. BrdU 검출 항체(BrdU detection antibody) 100㎕를 96-well plate에 넣은 후 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 세척액으로 3회 세척하였다. HRP (Horseradish peroxidase)가 결합된 이차 항체 100㎕를 96-well plate에 넣은 후 상온에서 30분 동안 반응시키고, 세척액으로 3회 세척하였다. 마지막으로, 발색시약(Tetramethylbenzidine, TMB) 100㎕를 넣어 상온에서 30분 동안 반응시키고, 발색 정지시약 100㎕를 넣은 후 450nm에서 ELISA reader로 분석하였다. 수지상세포와 T 림프구를 함께 배양시에 다수의 세포덩어리군(aggregates)이 형성되고 이들 세포군은 수지상세포에 의해 자극받은 T 림프구 무리를 의미한다. 도 2는 수지상세포의 자극능을 확인하는 결과로, PEP1 활성화 수지상세포의 농도가 1:100, 1:50, 1:10으로 증가함에 따라 T 세포 증식 자극능을 보여주는 흡광도(OD)가 각각 0.42, 0.57, 0.98로 증가함을 나타내고 있다. 이는 PEP1 활성화 수지상세포가 항원제시세포로서 T 세포와의 교차반응을 수행하여 T 세포에 의한 면역반응을 유도하고 있음을 의미한다.

2. PEP1 특이적 T 세포의 사이토카인 분비능 분석

PEP1 활성화 수지상세포와 T 세포를 72시간 동안 혼합배양한 후 배양액을 수거하였다. 1,600rpm, 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 취한 후 IFN-γ ELISA (IFN gamma ELISA kit, R&D Systems)을 이용하여 제조사 매뉴얼에 따라 사이토카인 분비능을 분석하였다. 구체적으로, Polyclonal antibody IFN-γ가 부착된 96-well plate에 희석액 100㎕를 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척용액으로 4회 세척 후 HRP가 결합된 IFN-γ 이차 항체 (IFN-γ Conjugated horseradish peroxidase) 200㎕를 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척용액으로 4회 세척 후 발색시약 200㎕를 넣고 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 발색 정지시약 50㎕를 넣고 바로 450nm에서 ELISA reader로 분석하였다. 도 3은 PEP1 특이적 T 세포가 분비하는 IFN-γ 분비량을 분석한 결과로, PEP1 특이적 T 세포가 1,470.2±4.3 pg/㎖로 대조군(T 세포)의 24.2±0.8 pg/㎖에 비해 약 59.3배 더 높게 분비함을 알 수 있다.

실시예 4: 임상 단계에서, PEP1이 포함된 펩티드들로 활성화된 수지상세포 면역 치료 효과 분석

전술한 바와 같이, 수지상세포는 세포독성 T세포 (Cytotoxic T lymphocytes, CTL)을 활성화시켜 표적세포를 공격하는 방식으로 질병을 치료한다. 이에, PEP1이 포함된 펩티드들로 활성화된 수지상세포를 제조하여, 이를 개체에 투여한 후, 개체에서 각 펩티드들에 대한 T 세포들의 반응 증가 정도를 ELISPOT 어세이로 관찰하는 방법을 사용하였다.

1. 실험 대상 및 방법

실험 대상은 질병(암)을 가진 환자 4명을 대상으로 수행되었으며, 수지상세포 면역 치료 방법은 다음과 같다. 각 환자들에게서 말초혈액을 채위하여 단핵세포를 수집한 뒤 배양한다. 단핵세포 배양과정에서 분화된 미성숙 수지상세포를 PEP1이 포함된 암 항원 펩티드들로 항원 활성화한다. 수지상세포가 성숙되면 한번 더 동일한 펩티드들로 항원 활성화한다. 활성화된 성숙 수지상세포를 분리하여 각 환자들에게 투여한다.

보다 구체적으로, 치료에 사용한 수지상세포 및 NK세포(Natural killer cells)는 2주 마다 채취한 환자의 전혈 25ml에서 단핵세포를 증식시켜 제조하였고, 증식시킨 단핵세포를 수지상세포로 분화시켰다. 즉, 본 실시예에서는 환자의 말초 혈관으로부터 얻은 CD14+ 단핵세포를 IL-4 및 GM-CFS와 함께 6일 동안 배양하여 증식시키고, 스트렙토코커스 물질(Streptococcus agent)인 OK-432를 처리하여 성숙화시켰다. 아울러, 수지상세포의 제조과정 중 WT1, MUC1 및 기타 항원들로 수지상세포를 활성화하였다.

유전자 검사와, 항원 검사, 종양마커 검사를 거친 환자의 암 특성에 맞추어, 암 항원과 유사한 기능을 하는 물질 (암세포의 용해물 (lysate), 종양 특이 단백질, 종양 관련 펩티드)를 수지상세포에 배합하여 수지상세포의 암 인식 능력을 향상시키는 활성화 과정을 수행한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 암 관련 항원으로는, 이에 한정되는 것은 아니나, 본 실시예에서 사용된 암 관련 항원으로 WT1, MUC-1, CA125, MAGE-A3, CEA, NY-ESO1, Survinin, Her2 등과 아울러 텔로머라제 유래 펩티드인 PEP1을 수지상세포 활성화에 사용하였다. 활성화 방법으로는 구체적인 예에 한정되는 것은 아니나, 수지상세포를 암 항원과 함께 배양하는 것 등을 들 수 있다. 활성화는 미성숙 수지상세포 또는 성숙 수지상세포에 실시할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 환자의 말초혈액을 채취하여 단핵세포를 수집 및 배양하고, 단핵세포에서 분화된 미성숙 수지상세포에 펩티드를 처리하여 활성화시켜 성숙한 수지상세포로 분화되면, 다시 펩티드를 처리하여 활성화시키는 과정을 거친다. 활성화에 사용하는 항원의 양은 구체적으로 다음과 같이 당업계에서 일반적으로 사용되는 양을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, PEP1은 이들 항원들과 함께 1μg/ml 내지 1000μg/ml의 양으로 사용될 수 있고, WT1 20μg/ml, MUC1 20μg/ml, CEA 20μg/ml, CA125 500μg/ml, 및 HER2 20μg/ml의 양으로 사용될 수 있다. 이상과 같이 준비된 수지상세포(1x10⁷)를 14일 간격으로 6회 피내 주사하였다.

수지상세포 면역 치료가 항원으로 활성화된 펩티드들에 대한 T 세포의 반응 증가를 주는지 알아 보기 위하여 다음과 같이 실험하였다. 수지상세포 면역 치료를 시행하는 환자의 말초혈액에서 피콜법 (ficoll, 피콜을 사용한 원심분리법)을 사용하여 버피코트 (buffy coat) 층을 분리하여 단핵세포를 얻는다. 3 내지 4일 동안 배양을 거친 후 ELISPOT 어세이를 실행하였다. ELISPOT 어세이는 ImmunoSpot 키트 (Celluluar Technology Limited, USA)의 프로토콜을 따라서 진행되었다. 구체적으로, ImmunoSpot 플레이트에 웰 (well) 당 1x10⁵개 세포 농도로 T 세포를 분주하였다. 각 웰에 펩티드 자극제 (항원 펩티드)로서 Peptivator WT1, Peptivator NY-ESO1 (Miltenyi Biotec., Germany), MUC-1, MAGE-A3, Survivin 및 PEP1을 각각의 최적 농도로 첨가 후 48시간 동안 배양하였다. CTL 활성화에 관여하는 Th1 (Helper T cell 1) 반응에서 방출되는 IFN-γ 및 Th2 (Helper T cell 2) 반응에서 방출되는 IL-4를 특이적 항체 검출 시약을 이용하여 염색하였다. IFN-γ를 방출하는 세포는 붉게 염색되고, IL-4를 방출하는 세포는 파란색으로 염색된다. 염색 후 플레이트를 ImmunoSpot 분석기 (Cellular Technology Ltd., USA)를 이용하여 검사하고 각 스팟의 숫자를 분석하였다.

2. 실험 대상 별 ELISPOT 결과 및 분석

수지상세포 면역 치료의 시행 전/후 환자 별 ELISPOT 결과는 다음과 같다.

1) 74세 위암 여성 환자 (환자 1)

수지상세포 면역 치료 시행 전의 ELISPOT 결과, 아무 펩티드도 첨가하지 않은 음성 대조군 (negative control)과 비교하여 볼 때, 시각화된 것과 수치 모두에서 차이는 보이지 않았다 (도 4 참조). 수지상세포 백신을 6회 투여하고, 각종 펩티드 자극에 의한 CTL 활성을 ELISPOT으로 확인하였다. 치료 시행 후의 ELISPOT 결과, 음성 대조군에 비하여 PEP1, MUC1, WT1, Survivin 모든 군에서 스팟이 증가하였다 (도면 5 참조).

ELISPOT 결과 (수지상세포 백신 투여 전)

ELISPOT 분석 통한 스팟 수
음성 대조군		PEP1		MUC1		WT1
IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ
1	5	2	3	0	3	1	31

ELISPOT 결과 (수지상세포 백신 6회 투여 후 7일 경과)

ELISPOT 분석 통한 스팟 수
음성 대조군		PEP1		MUC1		WT1		Survivin
IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ
17	27	335	567	441	384	383	542	350	331

2) 77세 폐암 남성 환자 (환자 2)

수지상세포 면역 치료 시행 전의 ELISPOT 결과, 아무 펩티드도 첨가하지 않은 음성 대조군 (negative control)과 비교하여 볼 때, 시각화된 것과 수치 모두에서 차이는 보이지 않았다 (도면 6 참조). 수지상세포 백신을 6회 투여하고, 각종 펩티드 자극에 의한 CTL 활성을 ELISPOT으로 확인하였다. 치료 시행 후의 ELISPOT 결과, 음성 대조군에 비하여 PEP1, MUC1, WT1, NY-ESO1 모든 군에서 스팟이 증가하였다 (도면 7 참조). MHC-class-I 경로의 활성화를 의미하는 IFN-γ 분비를 나타내는 스팟 (적색)이 44일이 경과한 뒤에도 검출되었다.

ELISPOT 결과 (수지상세포 백신 투여 전)

ELISPOT 분석 통한 스팟 수
음성 대조군		PEP1		MUC1		WT1
IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ
0	1	9	0	3	2	4	1

ELISPOT 결과 (수지상세포 백신 6회 투여 후 44일 경과)

ELISPOT 분석 통한 스팟 수
음성 대조군		PEP1		MUC1		WT1		NY- ESO1
IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ
2	153	410	332.5 *	341	311.5 *	256	423.5 *	342	256.5 *

Cf) * IFN-γ의 spot수가 너무 많아서 정확한 측정이 되지 않음

3) 72세 췌장암 남성 환자 (환자 3)

수지상세포 면역 치료 시행 전의 ELISPOT 결과, 아무 펩티드도 첨가하지 않은 음성 대조군 (negative control)과 비교하여 볼 때, 시각화된 것과 수치 모두에서 차이는 보이지 않았다 (도면 8 참조). 수지상세포 백신을 6회 투여하고, 각종 펩티드 자극에 의한 CTL 활성을 ELISPOT으로 확인하였다. 치료 시행 후의 ELISPOT 결과, 음성 대조군에 비하여 PEP1, MUC1, WT1 모든 군에서 스팟이 증가하였다 (도면 9 참조). PEP1, MUC1, WT1 펩티드에 의한 MHC-class-I 경로의 활성화를 의미하는 IFN-γ의 스팟 (적색)이 검출되었고, MHC-class-II 경로의 활성화를 의미하는 IL-4 스팟 (청색)도 다수 검출되었다.

ELISPOT 결과 (수지상세포 백신 투여 전)

ELISPOT 분석 통한 스팟 수
음성 대조군		PEP1		MUC1		WT1
IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ
8	3	4	1	2	6	3	2

ELISPOT 결과 (수지상세포 백신 6회 투여 후 11일 경과)

ELISPOT 분석 통한 스팟 수
음성 대조군		PEP1		MUC1		WT1
IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ
2	14	434	632	476	374	519	454

4) 66세 유방암 여성 환자 (환자 4)

실험에 사용한 T 세포 처리수를 기존의 두 배로 적용하였다 (2x10⁵ 세포/웰). 수지상세포 면역 치료 시행 전의 ELISPOT 결과, 아무 펩티드도 첨가하지 않은 음성 대조군 (negative control)과 비교하여 볼 때, 시각화된 것과 수치 모두에서 차이는 보이지 않았다 (도면 10 참조). 수지상세포 백신을 6회 투여하고, 각종 펩티드 자극에 의한 CTL 활성을 ELISPOT으로 확인하였다. 치료 시행 후의 ELISPOT 결과, 음성 대조군에 비하여 PEP1, MUC1, WT1 모든 군에서 스팟이 증가하였다 (도면 11 참조). MHC-클래스-I 경로의 활성화를 의미하는 IFN-γ의 스팟 (적색)이 35일 후에도 검출되었으며, MHC-클래스-II 경로의 활성화를 의미하는 IL-4 스팟 (청색)도 다수 검출되었다.

ELISPOT 결과 (수지상세포 백신 투여 전)

ELISPOT 분석 통한 스팟 수
음성 대조군		PEP1		MUC1		WT1
IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ
17	13	3	22	5	15	1	13

ELISPOT 결과 (수지상세포 백신 6회 투여 후 35일 경과)

ELISPOT 분석 통한 스팟 수
음성 대조군		PEP1		MUC1		WT1
IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ	IL-4	IFN-γ
20	12	353	258	415	273	352	273

이상과 같은 4명의 환자들의 ELISPOT 어세이 결과들을 분석하면, 항원 펩티드들로 활성화하는 단계를 포함하는 수지상세포 면역 치료법에 의해 항원 펩티드에 특이적인 CTL 활성화를 나타내는 스팟이 많이 발견됨을 알 수 있다. 이는 본 발명에 따른 수지상세포 면역 치료법이 항원 특이적인 T 세포 반응을 유도하는 것임을 나타낸다.

또한, IFN-γ는 다양한 펩티드 자극에 의하여 MHC-class-1의 경로로 기능하는 CTL을 활성화시키는 Th1 세포에서 분비되는 것으로, IL-4는 MHC-class-2 경로로 기능하는 Th2 세포에서 분비되는 것으로 알려져 있다. 상기 실험을 통하여, 본 실험에 사용한 펩티드 항원들은 MHC-class-1 경로의 활성화뿐만 아니라, MHC-class-2 경로의 활성화에도 관여하는 것을 미루어 짐작할 수 있다.

실시예 4: 임상 단계에서, PEP1이 포함된 펩티드들로 활성화된 수지상세포 면역 치료 및 PEP1 투여의 병용 치료 효과 분석

표적 치료에 가장 적합한 대상인 암을 가진 개체를 대상으로 실험을 수행하였다. PEP1을 포함한 펩티드들로 활성화된 수지상세포를 사용한 수지상세포 치료제 및 NK 세포 치료제 및 PEP1을 포함하는 면역 치료제를 직접 투여하는 치료법을 병용하는 것이 암이 진행된 환자에게 심각한 부작용 없이 효과적인 치료법이 될 수 있다는 가정을 기본으로 실험을 수행하였다.

실험 대상은 총 4명으로 선정하여 각각의 환자 상태를 고려하여 실험을 진행하였으며, 이는 다음과 같다.

1) 89세 폐암 1기 여성 (환자 5)

이 환자는 2012년에 방사선 절제 치료법을 한번 받았고, 국소재발 후 2013년에 동일한 시술을 한번 더 받았다. 또한, 2013년에 1차 수지상세포 면역 치료를 받았다. 2014년 5월에 PET-CT로 폐를 조사한 결과, 몇 개의 종괴 (mass)가 발견되었고 몇 가지 종양 표지인자 (tumor marker)의 수치가 증가된 상태였다.

이후 환자는 2주에 1회씩 총 6회에 걸쳐 수지상세포 치료제와 NK 세포 치료제를 이용한 면역치료를 받았다. 치료에 사용된 수지상세포와 NK 세포는 특허번호 5577472 (The Life Science Institute Co. Ltd, Tokyo, Japan)의 방법을 준수하여, 2주마다 채취한 환자의 전혈 25ml에서 얻었다. 4종의 펩티드 (WT-1, MUC-1, PEP1 및 MAGE-A3)를 항원 펩티드로 사용하여 수지상세포를 활성화하였다. 수지상세포는 림프절 근처의 피내주사 (intradermal injection)를 통해, NK 세포는 혈관 점적 주입 (drip infusion of vein)을 통해 투여되었다.

수지상세포 면역 치료를 포함하는 면역 치료 시행 후 환자의 폐의 종괴와 종양 표지인자 변화는 표 10와 같다.

종양표지인자	정상인 범위	면역치료 전	면역치료 후	치료 후 변화
CA125 (U/ml)	0~35.1	38.7	15.8	감소
NSE (ng/ml)	0~16.3	21.1	16.7	감소

표 9와 같이 종괴 및 종양 표지인자가 눈에 띄게 감소하였으며, 면역 치료 중 부작용은 발견되지 않았다.

2) 47세 췌장암 3기 남성 (환자 6)

이 환자는 2014년에 췌장암 판정을 받고 동일 년도에 부분적인 췌장절제술 및 수술 후 처방으로서 경구 화학치료법을 받았다. 실험 대상으로 선정된 직후 CT를 통해 두 군데에서 간으로의 전이를 발견했다. 몇 가지 종양 표지인자의 수치도 증가된 상태였다.

이후 환자는 2주에 1회씩 총 6회에 걸쳐 수지상세포 (DC) 면역 치료 및 NK 세포를 이용한 병용 면역치료법을 받았다. 또한 2주마다 PEP1 펩티드를 포함하는 면역 치료제를 9회에 걸쳐 투여하였다. PEP1 펩티드를 포함하는 면역 치료제는 매회 0.56 mg 용량으로 투여하였다. 치료에 사용된 수지상세포와 NK 세포는 2주마다 채취한 환자의 전혈 25ml에서 얻었다. 수지상세포의 활성화를 위해서, 4종의 펩티드 (WT-1, MUC-1, PEP1 및 Survivin)가 항원 펩티드로서 수지상세포에 펄싱되었다. 수지상세포 (DC) 및 PEP1은 림프절 근처의 피내주사를 통해, NK 세포는 혈관 점적 주입을 통해 투여되었다. 또한 환자는 면역치료법을 받는 기간 동안 격주로 FOLFORINOX 화학치료를 받았다.

PEP1를 포함하는 펩티드들로 활성화된 수지상세포 치료제 및 PEP1를 포함하는 면역 치료제 투여를 포함하는 면역치료 시행 후 환자의 간으로의 암 전이 및 종양 표지인자 변화는 표 11와 같다.

종양표지인자	정상인 범위	면역치료 전	면역치료 후	치료 후 변화
Dupan2 (U/ml)	0~150	323	83	감소
CA19-9 (U/ml)	0~37	649	143.3	감소

표 11과 같이 암전이 및 종양 표지인자가 눈에 띄게 감소하였으며, 면역 치료 중 부작용은 발견되지 않았다.

3) 70세 폐암 3기 여성 (환자 7)

이 환자는 2011년에 폐암 판정을 받고 동일년도에 수술치료를 받았으며, 2013년에는 몇 가지 화학치료법을 받았다. 이후 실험 대상으로 선정된 직후 CT로 조사한 결과, 오른쪽 폐에서 종괴 하나가 발견되었으며, 한 가지 종양 표지인자의 수치가 증가된 상태였다.

환자는 수지상세포 면역 치료와 NK 세포를 이용한 면역치료법을 연속으로 두 번 받았다. 한 번의 면역치료법은 2주에 1회씩 총 6회 걸쳐 진행되기 때문에 이 환자는 총 12회의 면역치료법을 받았다. 또한 2주마다 PEP1 펩티드를 포함하는 면역 치료제를 11회에 걸쳐 투여하였다. PEP1 펩티드를 포함하는 면역 치료제는 매회 0.56 mg으로 투여하였다. 치료에 사용된 수지상세포와 NK세포는 2주마다 채취한 환자의 전혈 25ml에서 얻었다.

수지상세포의 활성화를 위해서, 1~6회에 걸친 첫 번째 치료에서 3종의 펩티드 (WT-1, MUC-1 및 Survivin)가 항원 펩티드로서 수지상세포에 펄싱되었다. 7~12회에 걸친 두 번째 치료에서 5종의 펩티드 (WT-1, MUC-1, NY-ESO1, PEP1 및 MAGE-A3)가 항원 펩티드로서 수지상세포에 펄싱되었다. 수지상세포 (DC)와 PEP1은 림프절 근처의 피내주사를 통해, NK 세포는 혈관 점적 주입을 통해 투여되었다. 또한 환자는 면역치료법을 받는 기간 동안 몇 가지 화학치료법을 받았다.

수지상세포 (DC) 면역 치료 및 PEP1의 투여를 포함하는 두 번의 면역치료 시행 후 CT 조사 결과 환자의 오른쪽 폐에 있는 종괴는 거의 크기에 변화가 없었다. 그러나 환자의 일부 종양 표지인자는 감소하였으며 상세한 수치는 변화는 표 12와 같다.

종양표지인자	정상인 범위	면역치료 전	면역치료 후	치료 후 변화
NSE (ng/ml)	0~16.3	18.1	14.9	감소

표 12과 같이 암전이 및 종양 표지인자가 감소하였으며, 면역 치료 중 부작용은 발견되지 않았다.

4) 77세 폐암 3기 남성 (환자 8)

이 환자는 2014년에 폐암 판정을 받고 어떤 치료법도 받지 않은 상태에서 동일년도에 대상으로 선정되었다. 대상에 선정된 직후 CT를 통해 조사한 결과 왼쪽 폐에 종괴 하나와 여러 개의 림프절 전이가 발견되었다. 종양 표지인자의 수치 역시 올라간 상태였다.

환자는 우리 병원에서 2주에 1회씩 총 6회에 걸쳐 수지상세포 (DC) 치료제 및 NK 세포 치료제를 이용한 면역치료법을 받았다. 또한 2주마다 PEP1 펩티드를 총 13회에 걸쳐 투여 받았다. PEP1 펩티드를 포함하는 면역 치료제는 매회 0.56 mg 용량으로 투여하였다. 치료에 사용된 수지상세포 (DC) 및 NK 세포는 2주마다 채취한 환자의 전혈 25ml에서 얻었다. 수지상세포의 활성화를 위해서, 6종의 펩티드 (WT-1, MUC-1, PEP1, CEA, NY-ESO1 및 MAGE-A3)가 항원 펩티드로서 수지상세포에 펄싱되었다. 수지상세포와 PEP1은 림프절 근처의 피내주사를 통해, NK 세포는 혈관 점적 주입을 통해 투여되었다. 면역치료 중 환자는 다른 병원에서 방사선 치료를 33회 받았다.

수지상세포 면역 치료 및 PEP1의 투여를 포함하는 면역치료 시행 후 면역치료 후 환자의 림프절 전이상태의 변화나 방사선 치료에 기인한 염증, 흉막강 내 흉수 량의 증가는 보이지 않았다. 그러나 환자의 종양 표지인자 중 6종의 수치가 감소하였으며 전체 종양 표지 인자의 수치 변화는 표 13와 같다.

종양표지인자	정상인 범위	면역치료 전	면역치료 후	치료 후 변화
SLX (U/ml)	0~38	41.5	28.7	감소
ICTP (ng/ml)	0~5.5	19.1	18.9	감소
CEA (ng/ml)	0~5	8.7	6.8	감소
CA15-3 (U/ml)	0~27	68	45.5	감소
CA72-4 (U/ml)	0~8	51.5	16.4	감소
CYFRA (ng/ml)	0~3.5	22.8	5	감소
CA125 (U/ml)	0~35.1	15.9	92.7	증가
CA19-9 (U/ml)	0~37	11	40.2	증가
SCC (ng/ml)	0~1.5	2.6	2.9	증가
proGRP (pg/ml)	0~81	113	124.4	증가

상기 4명의 환자들에서 나타난 결과들은 PEP1을 포함한 펩티드로 활성화된 수지상세포 면역 치료가 환자의 종양 표지 인자 감소로 나타나는 항암 효과가 있는 것을 보여준다. 또한, 수지상세포 면역 치료 및 NK 세포 치료만 받은 환자 1에 비하여, PEP1 투여를 병행한 환자 2의 경우를 보았을 때, 종양 표지 인자가 더 감소하는 것으로 나타났다. 이는 PEP1의 병용 투여가 면역 치료 효과를 더 우수하게 하는 것뿐만 아니라, 수지상세포 면역 치료에서, PEP1의 활성화에 의한 면역 상승 효과를 유추할 수 있는 결과라고 할 수 있다.

추가로 환자 3 및 환자 4는 수지상세포 면역 치료와 동시에 화학 치료 (환자 3) 및 방사선 요법 (환자 4)을 추가로 받은 환자로, 두 환자 모두 종양 표지 인자가 감소하는 것을 보였다. 이는 일반적으로 화학 치료 및 방사선 요법은 환자의 면역 반응을 현저하게 낮추는 것을 고려할 때, 본 발명에 따른 수지상세포 면역 치료가 면역 반응 감소의 환경에도 불구하고 면역 반응을 증가시켜 종양 표지인자들의 감소를 가져오는 효과를 나타내는 것을 보여준다고 할 수 있다. 또한, 환자 3 및 환자 4의 경우 PEP1을 병용 투여한 환자인데, 이는 PEP1의 병용이 면역 반응을 증가시키는 효과를 주는 것뿐만 아니라, 수지상세포 면역 치료에서, PEP1의 활성화가 주는 면역 상승 효과를 유추할 수 있는 또 다른 결과라고 할 수 있다.

상기 실시예들을 통하여 PEP1을 포함한 펩티드들로 활성화된 수지상세포를 이용한 수지상세포 면역 치료법이 면역반응을 강화시키고, 이를 통한 우수한 질병치료 효과를 나타냄을 알 수 있다. 또한 수지상세포 면역 치료법과 PEP1 투여를 병행하였을 때 수지상세포 면역 치료법만 수행한 결과보다 우수한 효과를 보이는 것 또한 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 수지상세포 면역 치료법은 효과적인 표적 지향성 질병 치료제로서 개발될 수 있으며, 이를 이용하여 암을 포함한 표적 지향성 치료가 필요한 개체에게 적절한 치료법을 제공할 수 있을 것이다. 또한, 수지상세포 면역 치료제 및 PEP1의 병용 투여시에도 뛰어난 표적 지향성 질병 치료 효과를 보일 수 있을 것으로 기대된다.

<110> KIM, sangjae Gemvax & KAEL Co.,LTD. <120> Dendritic Cell Therapeutic Agent and Immunotherapeutic Agent Comprising a Peptide Derived from Telomerase, and Method for Treatment Using the Same <130> 16p647ind <150> KR 10-2015-0156996 <151> 2015-11-09 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 1132 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125 Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140 Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175 Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190 Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205 Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220 Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255 Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270 Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285 Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His 290 295 300 Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335 Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365 Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415 Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln 420 425 430 Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445 Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe 450 455 460 Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495 Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510 Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525 Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575 Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 580 585 590 Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln 595 600 605 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655 Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685 Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700 Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln 725 730 735 Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His 740 745 750 Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp 755 760 765 Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 780 Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800 Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815 Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro 820 825 830 Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp 835 840 845 Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 865 870 875 880 Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895 Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu 900 905 910 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe 915 920 925 Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 930 935 940 Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe 945 950 955 960 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975 Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn 980 985 990 Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln 995 1000 1005 Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln 1010 1015 1020 Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055 Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp 1060 1065 1070 Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr 1075 1080 1085 Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser 1090 1095 1100 Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120 Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1125 1130

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드들로 활성화된 수지상세포를 포함하는 감염되거나 또는 변성된 세포들에 대한 면역 반응을 생성하는 면역반응 활성화 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편을 포함하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 수지상세포는 추가적으로 WT1, MUC-1, CA125, MAGE-A3, CEA, NY-ESO1, Survinin 및 Her2로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 항원 유래의 펩티드로 활성화된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 감염되거나 또는 변성된 세포들에 대한 면역 반응 생성으로 염증 또는 암을 치료하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4항에 있어서 상기 암은 췌장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 간암, 및 신장암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 암을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 수지상세포는 상기 조성물을 투여 받을 개체의 말초혈액으로부터 선별 배양된 단핵세포에서 유래된 수지상세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1 또는 그의 단편을 포함하는 면역 치료제와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 NK (natural killer) 세포 치료제와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 항암화학요법용 약제 또는 표적 항암치료제와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 방사선 치료 요법과 병용하는 것을 특징으로 하는 조성물.
약학적으로 유효한 양의 제 1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 면역반응 활성화 조성물을 표적 지향성 치료를 필요로 하는 질병 또는 이상 증상을 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응을 생성하는 면역반응 활성화 방법.
제 11항에 있어서, 상기 조성물의 투여는 2주마다 1회씩 림프절 근처의 피내 주사를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 조성물의 투여는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 면역 치료제와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 면역반응 활성화 조성물, 및 상기 조성물을 대상 개체에 투여하는 방법을 기재한 지시서를 포함하는 염증 또는 암에 대한 면역반응을 생성하는 면역반응 활성화 키트.
제 14항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 1 또는 그의 단편을 포함하는 면역 치료제를 더 포함하며, 상기 지시서는 상기 면역치료제를 2주 간격으로 림프절 근처의 피내 주사를 통해 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.