ES3046715T3 - Il-5 antibody or antigen binding fragment thereof in medical application - Google Patents

Il-5 antibody or antigen binding fragment thereof in medical application

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ES3046715T3
ES3046715T3 ES18860941T ES18860941T ES3046715T3 ES 3046715 T3 ES3046715 T3 ES 3046715T3 ES 18860941 T ES18860941 T ES 18860941T ES 18860941 T ES18860941 T ES 18860941T ES 3046715 T3 ES3046715 T3 ES 3046715T3
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Yifang Wang
Qiyue Hu
Hu Ge
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Abstract

Se proporciona un anticuerpo anti-IL-5, un fragmento de unión a antígeno del mismo y una aplicación médica para el mismo. La presente invención comprende un anticuerpo derivado de ratón que contiene una región CDR del anticuerpo anti-IL-5, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo anti-IL-5 y su fragmento de unión a antígeno, así como el uso de la composición farmacéutica como fármaco. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Anticuerpo de IL-5 o fragmento de unión a antígeno del mismo en aplicación médica
[0005] Campo de la invención
[0007] La presente divulgación se refiere a anticuerpos monoclonales de anti-IL-5 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos y su uso como un agente de diagnóstico y terapéutico para enfermedades relacionadas con IL-5.
[0009] Antecedentes de la invención
[0011] La interleucina-5 (IL-5) es uno de los miembros importantes de la familia de interleucinas, también conocida como factor de transferencia de células T (TRF), factor-II de crecimiento de células B (BCGF-II), factor potenciador de IgA (IgA-EF) o factor de diferenciación de eosinófilos (EDF). Es una glicoproteína homodimérica secretada principalmente por la célula T colaboradora 2 (Th2). La IL-5 humana consiste en 134 restos de aminoácidos, incluyendo un péptido señal que consiste en 22 aminoácidos y dos sitios de glicosilación. La IL-5 humana tiene un 70% de identidad con la IL-5 murina a nivel de aminoácidos. Una IL-5 activa está en forma de oligodímero, con dos cadenas peptídicas unidas entre sí a través de enlace(s) disulfuro y en una configuración antiparalela, mientras que los monómeros de IL-5 no son biológicamente activos (Adv Immunol.
[0012] 1994; 57:145-90).
[0014] El eosinófilo (EOS) está asociado con una variedad de enfermedades inflamatorias en el pulmón, incluyendo enfermedades alérgicas asociadas con una reacción anafiláctica. Entre estas enfermedades, el asma es una enfermedad inflamatoria respiratoria crónica, que afecta aproximadamente a 300 millones de pacientes en todo el mundo, con una morbilidad del 10%. Su patogénesis está asociada con una variedad de citocinas, y la IL-5 y su receptor IL-5R desempeñan un papel importante en la patogénesis del asma. Existe un gran número de células inflamatorias que se infiltran en el tejido broncopulmonar de pacientes con asma, entre los que los eosinófilos están más significativamente aumentados. Muchos estudios han demostrado que el eosinófilo es una de las células principales que conduce a la inflamación de las vías respiratorias en el asma (Curr. Opin. Pulm. Med. 2005, 11(1), 1-6). La IL-5 desempeña un papel extremadamente importante en la diferenciación, maduración, adhesión, infiltración y apoptosis de EOS. Un gran número de estudios en animales y estudios clínicos han demostrado que la IL-5 puede activar las células progenitoras de EOS en la médula ósea e iniciar la agregación de EOS en la sangre periférica y las vías respiratorias, conduciendo a una inflamación crónica e hiperreactividad de las vías respiratorias (J. Immunol. 2014, 193(8), 4043-52). Además, la IL-5 puede prolongar la duración de supervivencia de EOS, potenciar su respuesta de desgranulación a factores estimulantes específicos (tales como IgA o IgG) y mediar la actividad quimiotáctica de eosinófilos (J. Asthma Allergy 2015, 8, 125-34). Se detectó una expresión aumentada de la IL-5 tanto en pacientes con asma como en modelos inducidos por antígeno bronquial humano (Greenfeder et al, Respiratory Research, 2: 71-79, 2001). La proteína IL-5 humana recombinante tomada por pacientes con asma dará como resultado el número aumentado de eosinófilos, la hiperreactividad bronquial y la liberación de partículas tóxicas por eosinófilos, lo que indica que IL-5 es un factor clave en la patogénesis del asma.
[0016] Actualmente, el método más eficaz para el tratamiento del asma es inhibir la expresión de algunos mediadores clave (incluyendo IL-5) en el asma mediante administración nasal u oral de esteroles para aliviar la inflamación en el pulmón. Sin embargo, el uso a largo plazo de esteroles tiene muchos efectos secundarios. Por lo tanto, es necesario encontrar nuevas dianas farmacéuticas para el tratamiento del asma. Estudios han mostrado que inhibiendo la unión de IL-5 a su receptor, los anticuerpos de IL-5 pueden reducir significativamente la acumulación de eosinófilos en el pulmón, reducir el nivel de eosinófilos en sangre, tejido y esputo, disminuir la respuesta inflamatoria mediada por eosinófilos, mejorar la función pulmonar y mostrar una buena eficacia para el tratamiento de asma eosinofílica grave y asma recurrente (Drugs 2017, 77(7), 777-784). Actualmente, solo los anticuerpos de IL-5 mepolizumab de GSK y reslizumab de Teva Pharma están disponibles comercialmente. Se describe una forma murina de mepolizumab, el anticuerpo 2B6, por ejemplo, en el documento de Patente US 5,683,892. Un anticuerpo tri-específico, Mepo-210-474, que comprende las mismas secuencias de CDR que mepolizumab se describe, por ejemplo, en el documento de Patente CN 1175263. Finalmente, se describe la aprobación regulatoria de mepolizumab, por ejemplo, en Mao, L. et al. (2016) Pract. Pharm. Clin. Remedies 19, 1306-1309. Otros anticuerpos contra la diana de IL-5 están en fase de investigación preclínica. Las patentes relacionadas son, por ejemplo, WO2009068649, WO2017033121, WO2016040007, WO2015095539, WO2012083370, WO2012158954, WO2006046689, WO9621000, WO9535375, etc.
[0018] Sin embargo, todavía existe la necesidad de la mejora en la eliminación inducida por IL-5 de eosinófilos y la mejora de la función pulmonar. Por lo tanto, es necesario continuar desarrollando anticuerpos con alta selectividad, alta afinidad y buena eficacia para proporcionar más y más preferidos regímenes de tratamiento anti-IL-5 para el asma.
[0020] Compendio de la invención
[0021] La presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno (también denominados moléculas de unión a IL-5) como se especifica en las reivindicaciones que se unen específicamente a la secuencia de aminoácidos de IL-5 o estructura tridimensional. La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier otra realización o aspecto descrito en la presente memoria es solo con fines ilustrativos.
[0023] Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
[0025] En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-5 humana, en donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena pesada como se establece en SEQ ID NO: 51 y una región variable de cadena ligera como se establece en SEQ ID NO: 47.
[0027] Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno descritos en la presente memoria pueden unirse a IL-5 con una afinidad (KD) de menos de 10-8 M, menos de 10-9 M, menos de 10-10 M, o menos de 10­ 11 M.
[0029] En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo recombinante, y preferiblemente un anticuerpo humanizado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
[0031] Las secuencias de la región FR de cadena ligera y pesada en la región variable de cadena ligera y pesada del anticuerpo humanizado pueden derivarse de la cadena ligera y pesada de la línea germinal humana, o secuencias mutadas de las mismas.
[0033] En algunas realizaciones del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, que comprende además una región constante del anticuerpo humano, en donde la región constante de cadena pesada es preferiblemente una región constante pesada del anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humano. Más preferiblemente, el anticuerpo de longitud completa comprende una región constante de cadena pesada del anticuerpo humano como se establece en SEQ ID NO: 52 y una región constante de cadena ligera humana como se establece en SEQ ID NO: 3.
[0035] En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2, anticuerpo monocatenario (scFv), región V dimerizada (diacuerpo) y región V estabilizada con disulfuro (dsFv).
[0037] La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, y uno o más vehículos, diluyentes, tampones o excipientes farmacéuticamente aceptables. La cantidad del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo contenido en la dosis unitaria de la composición farmacéutica es preferiblemente de 0,1 a 2000 mg, más preferiblemente de 1 a 1000 mg.
[0039] La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.
[0041] La presente invención también proporciona un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente. La presente invención también proporciona una célula huésped transformada con el vector recombinante descrito anteriormente, seleccionándose la célula huésped del grupo que consiste en células procariotas y células eucariotas, preferiblemente células eucariotas, más preferiblemente células de mamífero.
[0043] La presente invención también proporciona un método para producir el anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, el método comprende cultivar la célula huésped anterior en un cultivo para formar y acumular el anticuerpo monoclonal anterior o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y recuperar el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo del cultivo.
[0045] La presente invención también proporciona el anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe anteriormente en la presente memoria, o la composición farmacéutica anterior que comprende el mismo, o la molécula de ácido nucleico aislada anterior para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad o afección se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en asma, ataque maligno de asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, aspergilosis broncopulmonar alérgica, eosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por oncocercosis, angioedema intermitente, síndrome de mialgia eosinofílica, gastroenteritis eosinofílica, infección por helmintos, enfermedad de Hodgkin, pólipos nasales, síndrome de Loeffler, urticaria, bronquitis hiperplásica eosinofílica, arteritis nodular, sinusitis, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis por oncocercosis, endometriosis y bronquitis eosinofílica dependiente de esteroides.
[0047] Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de IL-5 como se especifica en las reivindicaciones tienen alta especificidad y alta afinidad por IL-5. Los anticuerpos humanizados tienen inmunogenicidad muy reducida y conservan completamente la especificidad del anticuerpo murino y muestran alta afinidad y excelentes actividadesin vitroein vivo.
[0049] Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de IL-5 como se especifica en las reivindicaciones tienen buena selectividad para reconocer específicamente IL5 y muestran buenas características dinámicas metabólicas en ratas, mostrando una vida media larga y una alta biodisponibilidad.
[0050] Las moléculas del anticuerpo humanizado de IL-5 como se especifica en las reivindicaciones tienen buena estabilidad a largo plazo, ninguna modificación química anormal obvia, ninguna agregación obvia a alta concentración, y alta pureza y estabilidad térmica. Además de reducir la proliferación de eosinófilos, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno de IL-5 tienen buenas propiedades para mejorar la función pulmonar.
[0052] Descripción de los dibujos
[0054] Figura 1: Los anticuerpos de IL-5 bloquean la unión de IL-5 al receptor de IL-5 en un experimento de FACS. El anticuerpo h1705-008 es parte de la invención, el anticuerpo h1706-009 es un anticuerpo comparativo y no forma parte de la invención, y el anticuerpo hu39D10 es un control positivo.
[0056] Figura 2: Detección de la especificidad de unión de anticuerpos de IL-5 a la citocina Th2. El anticuerpo h1705-008 es parte de la invención, el anticuerpo h1706-009 es un anticuerpo comparativo y no forma parte de la invención
[0058] Figura 3: Los anticuerpos de IL-5 potencian el valor intermitente respiratorio (Penh). G1: grupo de control normal (PBS); G2: grupo modelo (IgG); G3: grupo 10mpk del anticuerpo h1705-008;<g>4: grupo 2mpk del anticuerpo h1705-008; G5: grupo 10mpk del anticuerpo h1706-009; G6: grupo 2mpk del anticuerpo h1706-009; G7: grupo 10mpk del Hu39D10; *p<0,05, **<0,01 (en comparación con el grupo G2 mediante ANOVA/Bonferroni). El anticuerpo h1705-008 es parte de la invención, el anticuerpo h1706-009 es un anticuerpo comparativo y no forma parte de la invención, y el anticuerpo hu39D10 es un control positivo.
[0060] Figura 4A: El nivel de eosinófilos de BALF en el pulmón de ratones con asma; Figura 4B: Puntuaciones del espesor de la mucosa traqueal de ratones con asma. G1: grupo de control normal; G2: grupo modelo; G3: grupo 10mpk del anticuerpo h1705-008; G4: grupo 2mpk del anticuerpo h1705-008; G5: grupo 10mpk del anticuerpo h1706-009; G6: grupo 2mpk del anticuerpo h1706-009; G7: grupo 10mpk del Hu39D10; Figura 4C: Porcentaje de eosinófilos de BALF en el pulmón de ratones con asma. El anticuerpo h1705-008 es parte de la invención, el anticuerpo h1706-009 es un anticuerpo comparativo y no forma parte de la invención, y el anticuerpo hu39D10 es un control positivo.
[0062] La Figura 5A y la Figura 5B muestran la capacidad del mAb de IL5 para reducir el nivel de eosinófilos en BALF. Los anticuerpos h1773-007, h1779-014 y h1780-017 son anticuerpos comparativos y no forman parte de la invención, y el anticuerpo hu39D10 es un control positivo.
[0064] Descripción detallada de la invención
[0066] 1. Terminología
[0068] Para comprender más fácilmente la presente divulgación, ciertos términos técnicos y científicos se definen específicamente a continuación. A menos que se defina explícitamente lo contrario en la presente memoria, todos los demás términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación.
[0070] Los códigos de tres letras y los códigos de una letra para los aminoácidos usados en la presente divulgación son como se describen en J. Biol. Chem. 243, 3558 (1968).
[0072] Como se usa en la presente memoria, "anticuerpo" se refiere a inmunoglobulina, una estructura de cuatro cadenas peptídicas conectadas entre sí por un enlace disulfuro entre dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Diferentes regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina muestran diferentes composiciones de aminoácidos y órdenes de clasificación, por lo tanto presentan diferente antigenicidad. Por consiguiente, las inmunoglobulinas pueden dividirse en cinco tipos, o denominarse isotipos de inmunoglobulina, a saber IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, con cadena pesada p, 5, y, a y £, respectivamente. Según su composición de aminoácidos de la región bisagra y el número y localización de los enlaces disulfuro de la cadena pesada, el mismo tipo de Ig puede dividirse adicionalmente en diferentes subtipos, por ejemplo, la IgG puede dividirse en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. La cadena ligera se puede dividir en la cadena k o A, en base a diferentes regiones constantes. Cada uno de los cinco tipos de Ig puede tener la cadena k o A.
[0074] La cadena ligera del anticuerpo comprende además una región constante de cadena ligera, que comprende la cadena k, A humana o murina o una variante de las mismas. La cadena pesada del anticuerpo comprende además una región constante de cadena pesada, que comprende IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana o murina o una variante de la misma.
[0076] Aproximadamente 110 secuencias de aminoácidos adyacentes al extremo N-terminal de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo son altamente variables, conocidas como región variable (región Fv); el resto de secuencias de aminoácidos próximas al extremo C-terminal son relativamente estables, conocidas como región constante. La región variable incluye tres regiones hipervariables (HVRs) y cuatro regiones marco (FRs) relativamente conservadoras. Las tres regiones hipervariables que determinan la especificidad del anticuerpo también se conocen como las regiones determinantes de complementariedad (CDRs). Cada región variable de cadena ligera (LCVR) y cada región variable de cadena pesada (HCVR) consiste en tres regiones CDR y cuatro regiones FR, con orden secuencial desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las tres regiones CDR de la cadena ligera se refieren a LCDR1, LCDR2 y LCDR3, y las tres regiones CDR de la cadena pesada se refieren a HCDR1, HCDR2 y HCDR3. El número y posición de los restos de aminoácidos de CDR en las regiones LCVR y HCVR del anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno en la presente memoria cumplen con los criterios de numeración de Kabat conocidos (LCDR1 -3, HCDR1-3).
[0078] El término "anticuerpo" comprende un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado, y preferiblemente es un anticuerpo humanizado.
[0080] El término "anticuerpo murino", como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo monoclonal anti-IL-5 murino preparado según el conocimiento y las habilidades de la técnica. Durante la preparación, al sujeto de prueba se le puede inyectar antígeno de IL-5, y después se aísla un hibridoma que expresa el anticuerpo que posee la secuencia o las características funcionales deseadas. Preferiblemente, el anticuerpo de IL-5 murino o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende además la región constante de cadena ligera de la cadena k, A murina o una variante de la misma, o comprende además la región constante de cadena pesada de IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4 murina, o una variante de la misma.
[0082] El término "anticuerpo quimérico", como se usa en la presente memoria, es un anticuerpo resultante de la fusión de la región variable de un anticuerpo murino con la región constante de un anticuerpo humano, y el anticuerpo quimérico puede aliviar la respuesta inmunitaria inducida por el anticuerpo murino. Para establecer un anticuerpo quimérico, puede establecerse un hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal murino específico y se clona un gen de región variable a partir del hibridoma murino. Después, se puede clonar un gen de región constante deseado de un anticuerpo humano, y conectar con un gen de región variable de un murino para formar un gen quimérico que se puede insertar posteriormente en un vector de expresión. Finalmente, la molécula de anticuerpo quimérico se expresará en el sistema eucariota o procariota. Preferiblemente, la cadena ligera del anticuerpo quimérico de IL-5 comprende además una región constante de cadena ligera derivada de la cadena k, A humana o una variante de la misma. La cadena pesada del anticuerpo quimérico de IL-5 comprende además una región constante de cadena pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humanas o una variante de las mismas, preferiblemente comprende una región constante de cadena pesada derivada de IgG1, IgG2 o IgG4 humanas, o comprende una variante de la región constante de cadena pesada de IgG1, IgG2 o IgG4 humanas con mutación(s) de aminoácidos, tales como la mutación(s) YTE o retromutación(s).
[0083] El término "anticuerpo humanizado", como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo generado injertando secuencias de CDR murinas en el marco de la región variable de anticuerpos humanos, es decir, un anticuerpo producido en diferentes tipos de secuencias del marco del anticuerpo de la línea germinal humana. Dicho anticuerpo humanizado puede superar respuestas heterólogas inducidas por un gran número de componentes proteicos murinos transportados por el anticuerpo quimérico. Dichas secuencias del marco se pueden obtener de una base de datos de DNA pública que cubre secuencias génicas de anticuerpos de la línea germinal o referencias publicadas. Por ejemplo, las secuencias de DNA de la línea germinal de los genes de la región variable de cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBase" (disponible en la web www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), así como en Kabat, EA, et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Para evitar una disminución en la actividad provocada por la inmunogenicidad disminuida, las secuencias del marco en la región variable del anticuerpo humano pueden someterse a mutaciones inversas o retromutaciones mínimas para mantener la actividad. El término "anticuerpo humanizado" también comprende un anticuerpo humanizado en donde se realiza la maduración de la afinidad de CDR mediante la presentación de fagos. El marco de la región variable del anticuerpo humano puede diseñarse y seleccionarse, en donde la secuencia de la región FR en la región variable de cadena pesada del anticuerpo puede derivarse de la secuencia de la cadena pesada de la línea germinal humana y la secuencia de la cadena ligera de la línea germinal humana. Para evitar una disminución en la actividad provocada por la inmunogenicidad disminuida, la región variable del anticuerpo humano puede someterse a mutaciones inversas mínimas (retromutaciones, es decir, los restos de aminoácidos de la región FR derivados del anticuerpo humano se sustituyen con restos de aminoácidos correspondientes al anticuerpo original) para mantener la actividad.
[0085] El injerto de CDR puede dar como resultado la disminución de la afinidad del anticuerpo de IL-5 resultante o fragmento de unión a antígeno del mismo con el antígeno debido al cambio en los restos del marco en contacto con el antígeno. Dichas interacciones pueden ser el resultado de mutaciones altamente somáticas. Por lo tanto, todavía puede ser necesario transferir los aminoácidos del marco del donante al marco del anticuerpo humanizado. Los restos de aminoácidos derivados del anticuerpo de IL-5 no humano o fragmento de unión a antígeno del mismo, que están implicados en la unión a antígeno, pueden identificarse comprobando la secuencia y la estructura de la región variable del anticuerpo monoclonal murino. Los restos de aminoácidos en el marco de la CDR del donante que son diferentes de los de las líneas germinales pueden considerarse relacionados. Si no es posible determinar la línea germinal más estrechamente relacionada, la secuencia puede compararse con la secuencia común compartida entre los subtipos o con la secuencia común de las secuencias murinas que tienen un alto porcentaje de similitud. Se cree que los restos del marco raros son el resultado de una elevada mutación en células somáticas, que desempeñan un papel importante en la unión.
[0087] Como se usa en la presente memoria, "fragmento de unión a antígeno" o "fragmento funcional" se refiere a uno o más fragmento(s) de anticuerpo que retienen la capacidad de unión al antígeno (por ejemplo, IL-5). Se ha demostrado que pueden usarse fragmentos de anticuerpo de longitud completa para lograr la función de unión con un antígeno. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen (i) fragmento Fab, un fragmento monovalente compuesto por el dominio VL, VH, CL y CH1; (ii) fragmento F(ab')<2>, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un enlace disulfuro en la región bisagra; (iii) fragmento Fd, que consiste en dominios VH y CH1; (iv) fragmento Fv, que consiste en dominios VH y VL de un anticuerpo de un brazo; (v) dominio único o fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546) compuesto por el dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) separada y (vii) una combinación de dos o más CDRs separadas unidas opcionalmente por un enlazador sintético. Además, aunque el dominio VL y el dominio VH del fragmento Fv están codificados por dos genes separados, pueden unirse mediante un enlazador sintético usando métodos recombinantes, generando de ese modo una cadena proteica única de un molecular monovalente formado por el emparejamiento del dominio VL y VH (denominado Fv monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988); Science 242: 423-426 y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. USA 85:5879-5883). Este anticuerpo monocatenario también pretende estar incluido en el término "fragmento de unión a antígeno" del anticuerpo.
[0089] Dichos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas en el campo, y se seleccionan para fragmentos funcionales usando el mismo método que para un anticuerpo intacto. Las partes de unión al antígeno pueden producirse mediante tecnología de DNA recombinante o mediante alteración enzimática o química de una inmunoglobulina intacta. Los anticuerpos pueden estar en forma de diferentes isotipos, por ejemplo, anticuerpo IgG (por ejemplo, subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM.
[0091] El fragmento de unión a antígeno según la presente invención incluye Fab, F(ab')2, Fab', anticuerpo monocatenario (scFv), región V dimerizada (diacuerpo) y región V estabilizada con disulfuro (dsFv).
[0093] Fab es un fragmento de anticuerpo obtenido tratando una molécula de IgG con papaína (que escinde el resto de aminoácido en la posición 224 de la cadena H). El fragmento Fab tiene un peso molecular de aproximadamente 50000 y tiene actividad de unión a antígeno, en donde aproximadamente la mitad del lado del extremo N-terminal de la cadena H y la cadena L completa están unidas entre sí a través de un enlace disulfuro.
[0095] Un fragmento Fab puede producirse tratando un anticuerpo monoclonal con papaína. Además, el fragmento Fab puede producirse insertando el DNA que codifica el fragmento Fab del anticuerpo en un vector de expresión procariótico o un vector de expresión eucariótico e introduciendo el vector en un procariota o eucariota para expresar el Fab.
[0097] F(ab')2 es un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100000 y que tiene actividad de unión a antígeno y que comprende dos regiones Fab que están unidas en la posición bisagra, F(ab')2 se obtiene digiriendo la parte posterior de los dos enlaces disulfuro en la región bisagra de IgG con pepsina. Un fragmento F(ab')2 puede producirse por tratamiento de un anticuerpo monoclonal con pepsina. Además, el fragmento F(ab')2 puede producirse uniendo el Fab' descrito a continuación a través de un enlace tioéter o un enlace disulfuro.
[0098] Fab' es un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50000 y que tiene actividad de unión a antígeno. Fab' se obtiene escindiendo un enlace disulfuro en la región bisagra del F(ab')2 anterior. Un fragmento Fab' puede producirse mediante tratamiento de un fragmento F(ab')2 con un agente reductor, tal como ditiotreitol. Además, el fragmento Fab' puede producirse insertando el DNA que codifica el fragmento Fab' del anticuerpo en un vector de expresión procariótico o un vector de expresión eucariótico e introduciendo el vector en un procariota o eucariota para expresar el Fab'.
[0100] El término "anticuerpo monocatenario", "Fv monocatenario" o "scFv" se refiere a una molécula que comprende un dominio variable de cadena pesada (o región; VH) del anticuerpo y un dominio variable de cadena ligera (o región; VL) del anticuerpo conectados por un enlazador. Dichas moléculas scFv tienen la estructura general de NH<2>-VL-enlazador-VH-COOH o NH<2>-VH-enlazador-VL-COOH. Un enlazador adecuado en la técnica anterior consiste en una secuencia de aminoácidos GGGGS repetida o una variante de la misma, por ejemplo, usando una variante con 1-4 repeticiones (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Otros enlazadores que pueden usarse para la presente divulgación se describen por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res.56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41 -56 y Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.
[0102] Un scFv puede producirse mediante las siguientes etapas: obteniendo cDNAs que codifican VH y VL de un anticuerpo monoclonal, construyendo DNA que codifica scFv, insertando el DNA en un vector de expresión procariótico o un vector de expresión eucariótico, y después introduciendo el vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el scFv.
[0104] Un diacuerpo es un fragmento de anticuerpo en donde el scFv se dimeriza, y es un fragmento de anticuerpo que tiene actividad de unión a antígeno divalente. En la actividad de unión a antígeno divalente, dos antígenos pueden ser iguales o diferentes. Un diacuerpo puede producirse mediante las siguientes etapas, obteniendo cDNAs que codifican VH y VL de un anticuerpo monoclonal, construyendo el DNA que codifica scFv de modo que la longitud del péptido enlazador sea de 8 o menos restos de aminoácidos, insertando el DNA en un vector de expresión procariota o un vector de expresión eucariota, y después introduciendo el vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el diacuerpo.
[0106] Se obtiene un dsFv sustituyendo un resto de aminoácido en cada uno de VH y VL con un resto de cisteína, y conectando después los polipéptidos sustituidos a través de un enlace disulfuro entre los dos restos de cisteína. El resto de aminoácido que se va a sustituir con un resto de cisteína se puede seleccionar basándose en la predicción de la estructura tridimensional del anticuerpo según métodos conocidos (Protein Engineering, 7, 697 (1994)). El dsFv de la presente divulgación puede producirse mediante las siguientes etapas: obteniendo cDNAs que codifican VH y VL del anticuerpo monoclonal de la presente divulgación que reconoce específicamente IL-5 humana y se une a la secuencia de aminoácidos de la región extracelular o estructura tridimensional de la misma, construyendo DNA que codifica dsFv, insertando el DNA en un vector de expresión procariota o un vector de expresión eucariota, y después introduciendo el vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el dsFv.
[0108] Un péptido que contiene CDR está construido por una o más región(s) de CDRs de VH y VL. Los péptidos que comprenden varias CDRs pueden unirse directamente o a través de un enlazador peptídico adecuado. Un péptido que contiene CDR puede producirse mediante las etapas de: construyendo un DNA que codifica las CDRs de VH y VL de un anticuerpo monoclonal, insertando el DNA en un vector de expresión procariótico o un vector de expresión eucariótico, y después introduciendo el vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el péptido. El péptido que contiene CDR también puede producirse mediante un método de síntesis química tal como el método Fmoc o el método tBoc.
[0110] El término "marco del anticuerpo", como se usa en la presente memoria, se refiere a parte del dominio variable, VL o VH, que sirve como armazón para los bucles de unión a antígeno (CDRs) de este dominio variable. En esencia, es el dominio variable sin las CDRs.
[0112] El término "diferencia de aminoácidos" se refiere a diferencias en una o más posición(s) de aminoácidos a lo largo de la longitud de un fragmento polipeptídico entre un polipéptido y una variante del mismo, en donde la variante puede obtenerse sustituyendo, insertando o eliminando uno o más aminoácido(s) en el polipéptido.
[0113] El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente una inmunoglobulina o anticuerpo (por ejemplo, un sitio específico en la molécula de IL-5). Los epítopos incluyen normalmente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos consecutivos o no consecutivos en una conformación terciaria única. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, ed. G. E. Morris (1996).
[0115] El término "se unen específicamente a", "se unen selectivamente a", "se une selectivamente a" o "se une específicamente a" se refiere a la unión de un anticuerpo a un epítopo predeterminado en un antígeno.
[0116] Normalmente, el anticuerpo se une con una afinidad (KD) de menos de aproximadamente 10-8 M, por ejemplo, menos de aproximadamente 10-9 M, 10-10 M o 10-11 M o incluso menos.
[0118] El término "KD" se refiere a la constante de equilibrio de disociación para una interacción anticuerpo-antígeno particular. Normalmente, el anticuerpo de la presente divulgación se une a IL-5 con una constante de equilibrio de disociación (KD) de menos de aproximadamente 10-7 M, tal como menos de aproximadamente 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso menos, por ejemplo, como se determina usando técnicas de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento B<ia>C<o>RE.
[0120] Cuando se usa el término "competición" en el contexto de proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, proteínas de unión a antígeno neutralizantes o anticuerpos neutralizantes) que compiten por el mismo epítopo, significa que se produce competición entre las proteínas de unión a antígeno, que se determina mediante los siguientes ensayos: una proteína de unión a antígeno que va a ensayarse (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo) previene o inhibe (por ejemplo, reduce) la unión específica entre una proteína de unión a antígeno de referencia (por ejemplo, un ligando o anticuerpo de referencia) y un antígeno común (por ejemplo, un antígeno de IL-5 o un fragmento del mismo). Están disponibles numerosos tipos de ensayos de unión competitiva para determinar si una proteína de unión a antígeno compite con otra. Estos ensayos son, por ejemplo, radioinmunoensayo directo o indirecto (RIA) en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo competitivo de sándwich (véase, por ejemplo, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253); EIA directo de biotina-avidina en fase sólida (véase, por ejemplo, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137: 3614-3619), ensayo de marcaje directo en fase sólida, ensayo sándwich de marcaje directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de marcaje directo en fase sólida con marcador I-125 (véase, por ejemplo, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15); EIA directo de biotina-avidina en fase sólida (véase, por ejemplo, Cheung, et al., 1990, Virology 176: 546-552); y RIA de marcaje directo (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82). Normalmente, el ensayo implica el uso de un antígeno purificado (ya sea sobre una superficie sólida o sobre una superficie celular) capaz de unirse tanto a una proteína de unión a antígeno no marcada que se va a probar como a una proteína de unión a antígeno de referencia marcada. La inhibición competitiva se determina midiendo la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o a la célula en presencia de la proteína de unión al antígeno que se va a probar. Normalmente, la proteína de unión a antígeno que se va a probar está presente en exceso. Las proteínas de unión a antígeno identificadas mediante ensayo competitivo (que compiten con la proteína de unión a antígeno) incluyen: proteínas de unión a antígeno que se unen al mismo epítopo que la proteína de unión a antígeno de referencia; y proteínas de unión a antígeno que se unen a un epítopo que está suficientemente próximo al epítopo al que se une la proteína de unión a antígeno de referencia, donde los dos epítopos interfieren espacialmente entre sí para impedir la unión. En los ejemplos del presente documento se proporcionan detalles adicionales con respecto a los métodos para determinar la unión competitiva. Normalmente, cuando una proteína de unión a antígeno competitiva está presente en exceso, inhibirá (por ejemplo, reducirá) al menos 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% o 75% o incluso más de la unión específica entre la proteína de unión a antígeno de referencia y el antígeno común. En algunos casos, la unión se inhibe en al menos 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, o 97% o incluso más.
[0122] El término "molécula de ácido nucleico", como se usa en la presente memoria, se refiere a moléculas de DNA y moléculas de RNA. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es DNA bicatenario. Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia.
[0124] El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. En una realización, el vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de DNA bicatenario circular en donde pueden ligarse segmentos de DNA adicionales. En otra realización, el vector es un vector viral, en donde segmentos de DNA adicionales pueden unirse en el genoma viral. Los vectores descritos en la presente memoria son capaces de auto-replicarse en la célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero), o pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y de ese modo se replican junto con el genoma del huésped (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero).
[0126] Los métodos para producir y purificar anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, chapters 5-8 y 15. Por ejemplo, los ratones pueden inmunizarse con IL-5 humana o fragmentos de la misma, y los anticuerpos resultantes pueden re-naturalizarse, purificarse y secuenciarse después para secuencias de aminoácidos usando métodos convencionales bien conocidos en la técnica. Los fragmentos de unión a antígeno también pueden prepararse mediante métodos convencionales. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación se modifican por ingeniería genética para contener una o más región(s) FR humanas en CDRs derivadas de un anticuerpo no humano. Las secuencias de la línea germinal de FR humana pueden obtenerse alineando la base de datos de genes de la línea germinal variable de anticuerpos humanos y el software MOE de ImMunoGeneTics (IMGT) a través de su sitio web http://imgt.cines.fr, o de The Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351.
[0128] El término "célula huésped" se refiere a una célula en la que se ha introducido el vector de expresión. Las células huésped pueden incluir células microbianas (por ejemplo, bacterianas), vegetales o animales. Las bacterias que son susceptibles de transformarse incluyen miembros de Enterobacteriaceae, tales como las cepas deEscherichia co lioSalmonella;Bacillaceae tales comoBacillus subtilis; Pneumococcus; StreptococcusyHaemophilus influenzae.Los microorganismos adecuados incluyenSaccharomyces cerevisiaeyPichia pastoris.Las líneas de células huésped animales adecuadas incluyen células CHO (línea celular de ovario de hámster chino), células HEK (como ejemplos no limitantes, células HEK293E) y células NS0.
[0130] Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno modificados por ingeniería genética descritos en la presente memoria pueden prepararse y purificarse usando métodos conocidos. Por ejemplo, la secuencia de cDNA que codifica una cadena pesada y una cadena ligera puede clonarse y modificarse genéticamente en un vector de expresión GS. El vector de expresión de la inmunoglobulina recombinante puede transfectarse después de manera estable a células CHO. Como un método más recomendado bien conocido en la técnica, los sistemas de expresión de mamíferos darán como resultado la glicosilación del anticuerpo, normalmente en sitios N-terminales altamente conservados en la región Fc. Los clones estables pueden verificarse para la expresión de un anticuerpo que se une específicamente a IL-5 humana. Los clones positivos pueden expandirse en medio de cultivo sin suero en biorreactores para la producción de anticuerpos. El medio de cultivo, en el que se ha secretado un anticuerpo, puede purificarse mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, la purificación se puede realizar en una columna de Proteína A o G Sepharose FF que se ha equilibrado con un tampón ajustado. La columna se lava para eliminar los componentes de unión no específica, y después el anticuerpo unido se eluye mediante gradiente de pH y las fracciones de anticuerpo se detectan mediante SDS-PAGE, y después se recogen. Los anticuerpos pueden filtrarse y concentrarse usando técnicas comunes. Las mezclas solubles y los polímeros pueden eliminarse mediante técnicas comunes, tales como exclusión por tamaño o intercambio iónico. El producto resultante se congela después inmediatamente, por ejemplo a -70°C, o puede liofilizarse.
[0131] "Administración", "que se administra" o "tratamiento", como se aplica a un animal, ser humano, sujeto, célula, tejido, órgano o fluido biológico, se refiere a poner en contacto un producto farmacéutico, terapéutico, agente de diagnóstico exógeno o una composición con el animal, ser humano, sujeto, célula, tejido, órgano o fluido biológico. "Administración", "que se administra" o "tratamiento" se puede referir, por ejemplo, a métodos terapéuticos, farmacocinéticos, de diagnóstico, de investigación y experimentales. El tratamiento de una célula abarca poner en contacto un reactivo con la célula, así como poner en contacto un reactivo con un fluido, donde el fluido está en contacto con la célula. "Administración", "que se administra" o "tratamiento" también significa tratamientosin vitroyex vivode una célula, con un reactivo, diagnóstico, composición de unión, o con otra célula. "Tratamiento", como se aplica a un ser humano, veterinario o sujeto de investigación, se refiere a un tratamiento terapéutico, medidas profilácticas o preventivas, para aplicaciones de investigación y diagnóstico.
[0132] "Tratar" significa la administración de un agente terapéutico, tal como una composición que contiene uno cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente divulgación, interna o externamente a un paciente que tiene uno o más síntoma(s) de enfermedad para los que el agente tiene actividad terapéutica conocida. Normalmente, el agente se administra en una cantidad eficaz para aliviar uno o más síntoma(s) de la enfermedad en el paciente o población a tratar, induciendo la regresión de o inhibiendo la progresión de dicho síntoma(s) en cualquier grado clínicamente medible. La cantidad de un agente terapéutico que es eficaz para aliviar cualquier síntoma de enfermedad particular (también denominada como "cantidad terapéuticamente eficaz") puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad y el peso del paciente, y la capacidad del fármaco para provocar una respuesta deseada en el paciente. Si un síntoma de enfermedad se ha aliviado puede evaluarse mediante cualquier medición clínica usada normalmente por médicos u otros proveedores de atención médica calificados para evaluar el estado de gravedad o progresión de ese síntoma. Aunque una realización de la presente divulgación (por ejemplo, un método de tratamiento o artículo de fabricación) puede no ser eficaz para aliviar el síntoma(s) de la enfermedad objetivo en cada paciente, debe aliviar el síntoma(s) de la enfermedad objetivo en un número estadísticamente significativo de pacientes según se determina mediante cualquier prueba estadística conocida en la técnica tal como la prueba t de Student, la prueba chi cuadrado, la prueba U según Mann y Whitney, la prueba de Kruskal-Wallis (prueba H), la prueba de Jonckheere-Terpstra y la prueba de Wilcoxon.
[0134] "Modificación conservadora" o "sustitución conservadora" se refiere a sustituciones de aminoácidos en una proteína con otros aminoácidos que tienen características similares (por ejemplo, carga, tamaño de la cadena lateral, hidrofobicidad/hidrofilicidad, conformación y rigidez de la cadena principal, etc.), de manera que los cambios se pueden realizar frecuentemente sin alterar la actividad biológica de la proteína. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, la sustitución de un único aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no altera sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)). Además, las sustituciones con aminoácidos estructural o funcionalmente similares tienen menos probabilidad de alterar la actividad biológica.
[0135] "Cantidad eficaz" abarca una cantidad suficiente para mejorar o prevenir un síntoma o signo de la afección médica. Cantidad eficaz también significa una cantidad suficiente para permitir o facilitar el diagnóstico. Una cantidad eficaz para un paciente o sujeto veterinario particular puede variar dependiendo de factores tales como la afección que se está tratando, la condición de salud general del paciente, la vía y dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios. Una cantidad eficaz puede ser la dosis máxima o el protocolo de dosificación que evita efectos secundarios significativos o efectos tóxicos.
[0137] "Exógeno" se refiere a sustancias que se producen fuera de un organismo, célula o cuerpo humano, dependiendo del contexto. "Endógeno" se refiere a sustancias que se producen dentro de una célula, organismo o cuerpo humano, dependiendo del contexto.
[0139] "Homología" se refiere a la similitud de secuencia entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos secuencias polipeptídicas. Cuando una posición en ambas secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácido, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de DNA está ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones que van a compararse y después multiplicado por 100. Por ejemplo, si 6 de 10 posiciones en dos secuencias son coincidentes u homólogas cuando las secuencias están alineadas óptimamente, entonces las dos secuencias tienen un 60% de homología; si 95 de 100 posiciones en dos secuencias son coincidentes u homólogas, entonces las dos secuencias tienen un 95% de homología. Generalmente, la comparación se realiza cuando dos secuencias se alinean para dar el máximo porcentaje de homología.
[0141] Como se usa en la presente memoria, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan indistintamente y todas estas designaciones incluyen progenie. Por lo tanto, las palabras “transformantes” y “células transformadas” incluyen las células sujeto primarias y cultivos derivados de las mismas independientemente del número de pases. También debe entenderse que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en el contenido de DNA, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la seleccionada en las células originalmente transformadas. Cuando se pretenden denominaciones distintas, se entenderá claramente a partir del contexto.
[0143] Como se usa en la presente memoria, "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o técnica en la que se amplifican cantidades mínimas de una parte específica de ácido nucleico, RNA y/o DNA, como se describe en, por ejemplo, el documento de Patente U.S. Pat. No. 4,683,195. Generalmente, la información de secuencia sobre los extremos de la región de interés o más allá de la región de interés necesita estar disponible, de manera que se puedan diseñar los cebadores de oligonucleótidos; estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas de la plantilla que se va a amplificar. Los nucleótidos 5' terminales de los dos cebadores están en consistencia con los extremos del material que se va a amplificar. La PCR puede usarse para amplificar secuencias de RNA específicas, secuencias de DNA específicas del DNA genómico total, y cDNA transcrito del RNA celular total, secuencias de bacteriófagos o plásmidos, etc. Véase, en general Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol.
[0144] 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). El ensayo de PCR usado en la presente divulgación se considera que es un ejemplo, pero no el único, del método de reacción de polimerasa para la amplificación de una muestra de prueba de ácido nucleico. El método comprende el uso de secuencias de ácido nucleico conocidas como cebadores y polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar una parte específica del ácido nucleico.
[0146] "Opcional" u "opcionalmente" significa que el suceso o situación que sigue puede ocurrir, pero no necesariamente, y la divulgación incluye los casos en donde el suceso o circunstancia ocurre o no. Por ejemplo, "contiene opcionalmente 1-3 regiones variables de cadena pesada del anticuerpo" significa que la región variable de cadena pesada del anticuerpo con secuencia específica puede estar, pero no es necesario que esté presente.
[0148] "Composición farmacéutica" se refiere a una mezcla que contiene uno o más compuesto(s) o una sal o profármaco fisiológica/farmacéuticamente aceptable del mismo y otros componentes químicos, tales como vehículos y excipientes fisiológica/farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica tiene como objetivo promover la administración a un organismo, facilitando la absorción del principio activo y ejerciendo de ese modo un efecto biológico.
[0150] Además, la presente invención proporciona el anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo del mismo como se especifica en las reivindicaciones como un principio activo para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades asociadas con IL-5 seleccionadas del grupo que consiste en asma, exacerbación del asma, ataque maligno de asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, rinitis alérgica perenne, aspergilosis broncopulmonar alérgica, eosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por oncocercosis, angioedema intermitente, síndrome de mialgia eosinofílica, gastroenteritis eosinofílica, infección por helmintos, enfermedad de Hodgkin, pólipos nasales, síndrome de Loeffler, urticaria, bronquitis hiperplásica eosinofílica, arteritis nodular, sinusitis, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis por oncocercosis, endometriosis y bronquitis eosinofílica dependiente de esteroides. Preferiblemente, dicho tratamiento inhibe o reduce los eosinófilos infiltrantes en el tejido pulmonar. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden administrarse de tres veces al día a una vez cada seis meses, y pueden administrarse por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral o tópica.
[0152] Un método para detectar o determinar la cantidad de IL-5 puede ser cualquier método conocido en la técnica, incluyendo inmunodetección o inmunoensayo. La inmunodetección o inmunoensayo es un método para detectar o determinar la cantidad de un anticuerpo o un antígeno usando un antígeno o anticuerpo marcado. Los ejemplos de inmunodetección o inmunoensayo incluyen el método inmunológico de anticuerpo de marcado con sustancia radiactiva (RIA), inmunoensayo enzimático (EIA o ELISA), inmunoensayo fluorescente (FIA), inmunoensayo luminiscente, transferencia de Western, ensayos fisicoquímicos y similares. Las enfermedades anteriores asociadas con IL-5 pueden diagnosticarse detectando o determinando las células que expresan IL-5 con el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo descrito en la presente memoria.
[0154] Para detectar las células que expresan el polipéptido, se puede usar un inmunoensayo conocido, preferiblemente, se usa inmunoprecipitación, tinción celular fluorescentes, tinción inmunohistoquímica y similares. Además, se puede usar un método de tinción de anticuerpos fluorescentes con el sistema FMAT8100HTS (Applied Biosystem) y similares.
[0156] Una muestra viva usada para detectar o determinar IL-5 puede ser células tisulares, sangre, plasma, suero, fluido pancreático, orina, heces, fluido tisular o medio de cultivo.
[0158] 2. Ejemplos y Ejemplos de Prueba
[0160] Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir adicionalmente la presente divulgación. Los métodos experimentales para los cuales las condiciones específicas no están específicamente indicadas se llevan a cabo generalmente según condiciones convencionales, véase Molecular Cloning, Laboratory Manual of antibody technology, Cold Spring Harbor Laboratory; o según las condiciones recomendadas por el fabricante de materiales o productos. Los reactivos para los que no se indican específicamente las fuentes son reactivos disponibles comercialmente.
[0162] Ejemplo 1. Preparación de antígenos de IL-5 y proteínas para la detección
[0164] Diseño y expresión del antígeno de IL-5: Se insertaron en el vector phr secuencias que codifican IL-5 humana marcada con His, IL-5 de mono Rhesus, IL-5 de ratón, IL-5 de rata o el dominio extracelular del receptor IL-5Ra humana fusionado con el fragmento IgG1-Fc humano, para construir plásmidos de expresión, que después se transfectaron en HEK293. El día 6 después de la transfección, las muestras se centrifugaron a 4500 rpm durante 10 min y se recogieron los sobrenadantes celulares. El sobrenadante que contenía la proteína del receptor de IL-5 o IL-5a recombinante se purificó usando una columna de níquel, y la proteína de fusión de IL-5-Fc humana recombinante se purificó usando una columna de cromatografía de afinidad de proteína A. La proteína purificada puede usarse en los siguientes ejemplos. Las secuencias de proteínas del antígeno se muestran como sigue:
[0166] 1. Secuencia de aminoácidos de IL-5 humana con la etiqueta His (rhIL-5-his)
[0167] MRMLLHLSLLALGAAYVYAIPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQL CTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLG VMNTEWIIESHHHHHH
[0169] Nota: El texto en cursiva muestra la etiqueta His6. (SEQ ID NO: 1)
[0171] 2. Secuencia de aminoácidos de IL-5 de mono cinomólogo con la etiqueta His
[0172] MRMLLHLSLLALGAAYVYAIPTEIPASALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPVPVHKNHQL CTEEIFQGIGTLESQTVQGGTVERLFKNLSLIKKYIGGQKKKCGEERRRVNQFLDYLQEFLG VMNTEWIIESHHHHHH
[0174] Nota: El texto en cursiva muestra la etiqueta His6. (SEQ ID NO: 2)
[0176] 3. Secuencia de aminoácidos de IL-5 de ratón con la etiqueta His
[0177] ME IPMS TWKETLTQL SAHRALLT SNE TMRLPVPTHKNHQLCI GE IFQGLDILKNQTVRGGT VEMLFQNLSLIKKYIDRQKEKCGEERRRTRQFLDYLQEFLGVMSTEWfiMEGifflHffiífí
[0178] Nota: El texto en cursiva muestra la etiqueta His6. (SEQ ID NO: 3)
[0179] 4. Secuencia de aminoácidos de IL-5 de rata con la etiqueta His
[0180] ME IPMSTWKETLIQLSTHRALLTSNETMRLPVPTHKNHQLCIGEI FQGLDI LKNQTVRGGT VE ILFQNL S LIKKYIDGQKEKCGEERRKTRHFLDYLQE FLGVMS TEWAME ViTiIffIÍIÍ.JÍ
[0181] Nota: El texto en cursiva muestra la etiqueta His6. (SEQ ID NO 4)
[0182] 5. Secuencia de aminoácidos del receptor de IL-5a humana fusionado con el fragmento Fc humano DLLPDEKISLLPPVNFTIKVTGLAQVLLQWKPNPDQEQRNVNLEYQVKINAPKEDDYETRIT ESKCVTILHKGFSASYRTILQNDHSLLASSWASAELHAPPGSPGTSIVNLTCTTNTTEDNYS RLRSYQVSLHCTWLVGTDAPEDTQYFLYYRYGSWTEECQEYSKDTLGRNIACWFPRTFILSK GRDWLAVLVNGSSKHSAIRPFDQLFALHAIDQINPPLNVTAEIEGTRLSIQWEKPVSAFPIH CFDYEVKIHNTRNGYLQIEKLMTNAFISIIDDLSKYDVQVRAAVSSMCREAGLWSEWSQPIYVG'NDEUK'PL'REWIEG'PM'DEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
[0183] Nota: El texto en cursiva muestra Fc humana. (SEQ ID NO: 5)
[0184] Ejemplo 2: Construcción e identificación de líneas celulares recombinantes del receptor de IL-5a y del receptor de IL-5a/p
[0185] Para seleccionar los anticuerpos funcionales, se construyeron una línea celular CHO-S/IL-5a que expresa IL-5a y una línea celular CHO-S/IL-5a/IL-5p que expresa tanto IL-5a como IL-5p. El gen de IL-5a humana de longitud completa (Q01344) se clonó en un vector de expresión de mamífero, pTargeT. El plásmido linealizado se transfectó en células CHO-S mediante electroporación. La selección se realizó con G418 durante 2 semanas, seguido de dos rondas de diluciones limitantes. La IL-5a expresada en la superficie celular se detectó mediante FACS. Se seleccionaron líneas celulares CHO-S/IL-5a con alto nivel de expresión de IL-5a y se transfectaron en pcDNA3.1-IL-5p linealizado mediante electroporación. La selección se realizó con G418 y zeocina durante 2 semanas, seguido de dos rondas de diluciones limitantes. Se detectaron IL-5a e IL-5p expresadas en la superficie celular mediante FACS. Se seleccionaron las líneas celulares CHO-S/IL-5a/IL-5p con alta expresión de IL-5a e IL-5p.
[0186] Ejemplo 3: Preparación del anticuerpo monoclonal murino anti-IL-5 humana
[0187] Se inmunizaron dos grupos de ratones Balb/c (5 ratones/grupo) y cuatro grupos de ratones SJL (5 ratones/grupo) con proteína recombinante rhIL-5-his y adyuvante de Freund CFA (Sigma, Lot#SLBQ1109V); o con IFA (Sigma, Lot#SLBJ2845V) a dos dosificaciones de 100 g/50 g/50 g (grupo de dosis alta) y de 25 g/12,5 g/12,5 g (grupo de dosis baja), respectivamente. La respuesta inmunitaria específica a IL-5 se determinó detectando el título en suero mediante ELISA, ensayo de bloqueo de ligando-receptor y ensayo de inhibición de proliferación de TF-1. Se seleccionaron los ratones con mejor respuesta inmunitaria específica, se sacrificaron, se recogieron células de bazo y se fusionaron con células de mieloma.
[0188] La selección primaria se realizó usando un ensayo de unión ELISA frente a IL-5 humana. Las células de hibridoma se transfirieron a placas de 24 pocillos, y los sobrenadantes se volvieron a seleccionar mediante un ensayo de unión ELISA frente a IL-5 humana, de mono cinomólogo o de ratón mediante un ensayo de bloqueo basado en ELISA frente al receptor de IL-5 y mediante el ensayo de inhibición de la proliferación de TF-1. Después de dicha selección, los clones positivos obtenidos se sometieron a dos rondas de sub-clonación para obtener clones de hibridoma para la producción de anticuerpos. Los anticuerpos obtenidos se purificaron mediante cromatografía de afinidad.
[0189] Los anticuerpos purificados se sometieron a los siguientes ensayos: SEC-HPLC, detección del contenido de endotoxinas, ensayo Biacore para afinidad a diversas IL-5, ensayo de bloqueo basado en FACS frente al receptor de IL-5, y ensayo de inhibición de la proliferación de<t>F-1, ensayo de adhesión de eosinófilos, y evaluación de la eficacia en modelo de asma de ratón y modelo de neutralización de cobaya in vivo. Las líneas celulares de hibridoma monoclonal mAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 y mAb1779 se seleccionaron por sus excelentes actividades in vitro e in vivo.
[0191] Las secuencias se clonaron a partir de hibridoma positivo como sigue. Se recogieron las células de hibridoma en fase de crecimiento logarítmico, se extrajeron los RNAs con T rizol (Invitrogen, No. de Cat. 15596-018) según las instrucciones o el kit del fabricante, y se realizó la transcripción inversa con el kit PrimeScript™ Reverse Transcriptase (Takara, No. de Cat 2680A). Los cDNAs obtenidos mediante transcripción inversa se sometieron a amplificación por PCR usando Ig-Primer Set de ratón (Novagen, TB326 Rev. B 0503) y se secuenciaron los productos resultantes. Se obtuvieron las secuencias de aminoácidos correspondientes a las secuencias de DNA de las regiones variables de cadena pesada y ligera de mAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 y mAb1779 (los restos de aminoácidos de las CDRs de VH/VL se determinaron y anotaron mediante el sistema de numeración de Kabat). mAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 y mAb1779 son anticuerpos comparativos y no forman parte de la invención:
[0193] Secuencia de la región variable de cadena pesada murina de mAb1705 (SEQ ID NO: 6)
[0194] EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCTASGFTFSHYYMAWVRQAPKKGLEWVTSISYEGDITYYGD SVKGRFTISRDNAKSTLYLQMNSLRSEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGVMVTVSS
[0196] Secuencia de la región variable de cadena ligera murina de mAb1705 (SEQ ID NO 7) DIQMTQSPSSMSVSLGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKIARSPKLVIYGTSNLEVGVPSRF SGSRSGSDYSLTINTLESEDTGIYFCLQDKEFPRTFGGGTRLELK
[0198] Secuencia de la región variable de cadena pesada murina de mAb 1706 (SEQ ID NO 8)
[0199] E'VQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPKKGLEWVTSINYEGNSAYYGD SVKGRFTISRDNAKS TLYLQMDS LRSE DTATYYCATETVRESLDYWGQGVMVTVS S
[0201] Secuencia de la región variable de cadena ligera murina de mAb 1706 (SEQ ID NO 9) DIQMTQSPSSMSVSLGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKLGKSPKLMIHSASNLEVGVPSRF SGSRSGSDYSLTINTLESEDPGIYFCLQHKQFPRTFGGGTKLELK
[0203] Secuencia de la región variable de cadena pesada murina de mAb1780 (SEQ ID NO: 10) QVKLLQSGAALVKPGDSVKMSCKASDYTFTEYLIHWVKQSQGRSLEWIGYINPYSGGTVYNE KFKSKATLTVDKFSS TAYMEFRRLTFE D SAIYYCARDGGYSDPLDYWGQGVMVTVSS
[0205] Secuencia de la región variable de cadena ligera murina de mAb1780 (SEQ ID NO: 11)
[0206] DTVLTQSPALAVSPGERVSISCRASEGLTSYMHWYQQKPGQQPKLLIYKASNLASGVPARFS GSGSGTDFTLTIDPVEADDAATYFCQQNWNDPWTFGGGTKLELK
[0208] Secuencia de la región variable de cadena pesada murina de mAb1773 (SEQ ID NO: 12)
[0209] EVQLQQSLAELVRPGASVTLSCTASGFNIKNTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTKHGP KFQGKATITADTSSNTAYLQFSSLTSEDTAIYYCFRYGIYPDHWGQGTPLTVSS
[0211] Secuencia de la región variable de cadena ligera murina de mAb1773 (SEQ ID NO: 13)
[0212] QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVNYIYWYQQKPRSSPKPWIY ATATLASGVPARFS GSGSGTSFSLTISRMEAEDAATYYCQQWNSYPYTFGGGTKLEIE
[0214] Secuencia de la región variable de cadena pesada murina de mAb1779 (SEQ ID NO: 14) QVKLLQSGAALVKPGFSVKMSCKASGYTFTD YIIHWVKQSHGKSLEWIGYFNPNSGGSNYNE NFKRKATLTADKSSSTAYLEFSRVTSEDSAIYYCGRRIAWDHWYFDFWGPGTMVTVSS
[0216] Secuencia de la región variable de cadena ligera murina de mAb1779 (SEQ ID NO 15)
[0217] DIQMTQSPASLSASLGETVSIECLASEGISNDYAWYQQKSGRSPQLLVYAASRLQDGVPSRF SGSG5GTRYFFKISGMQPEDEADYFCQQGYKTPLTFGSGTKLEIK
[0219] Las secuencias de CDR de cadena ligera y pesada de cada anticuerpo se muestran en la Tabla 1. Los resultados de actividad del ensayo BIAcore se muestran en la Tabla 2. mAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 y mAb1779 son anticuerpos comparativos y no forman parte de la invención.
[0221] Tabla 1. Secuencias de CDR de cadena pesada li era de cada anticuerpo
[0223]
[0226] Tabla 2. Actividadin vitrodel anticuerpo murino de IL-5
[0229]
[0230] Los resultados muestran que los anticuerpos murinos de la presente divulgación tienen alta afinidad por el antígeno.
[0232] Ejemplo 4: Purificación de proteínas recombinantes relacionadas con IL-5, y purificación de anticuerpos de hibridoma y anticuerpos recombinantes
[0234] 4.1 Etapas para la purificación de proteínas recombinantes de IL-5-Flag-His: Las muestras se centrifugaron a alta velocidad para eliminar impurezas y se concentraron hasta un volumen apropiado. La columna de afinidad NI-NTA (QIAGEN, No. de Cat 30721) se equilibró con PBS y se lavó con 2-5 volúmenes de columna. Los sobrenadantes expresados por las células sin impurezas se cargaron en la columna, que después se enjuagó con PBS hasta que la lectura de A280 se redujo al valor inicial. Después, la columna se enjuagó con PBS para eliminar la proteína impura. La proteína de interés se eluyó con tampón de lavado (imidazol 20 mM) y después tampón de elución (imidazol 300 mM), y se recogió el pico eluido. El eluato recogido se purificó adicionalmente mediante intercambio iónico (columna Hiload 16/600 superdex 200). La columna se equilibró con aproximadamente 2 volúmenes de columna de PBS para asegurar un pH de 7,4. El tampón de elución que contenía la proteína de interés se concentró y se cargó en la columna para la purificación posterior. Las muestras se recogieron, se identificaron mediante SDS-PAGE y LC-MS, y después se dividieron en alícuotas para su uso.
[0236] 4.2. Purificación del anticuerpo expresado por hibridoma y las proteínas de fusión Fc: Las muestras de sobrenadante expresadas por células se centrifugaron a alta velocidad para eliminar impurezas, y después los sobrenadantes expresados por hibridoma se purificaron usando una columna de proteína G, los sobrenadantes que expresan proteína de fusión Fc se purificaron usando una columna de proteína A. La columna se enjuagó con PBS hasta que la lectura de A280 se redujo al valor inicial. Las proteínas de interés se eluyeron con ácido acético 100 mM, pH 3,0 y se neutralizaron con Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Las muestras eluidas se concentraron apropiadamente y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía en gel Superdex 200 (GE) equilibrada previamente con PBS. Los picos desprovistos de agregados se recogieron y se dividieron en alícuotas para su uso.
[0238] Ejemplo 5: Diseño de humanización de anticuerpos monoclonales anti-IL-5 humana
[0240] La humanización de anticuerpos monoclonales murinos anti-IL-5 humana se llevó a cabo como se describe en las bibliografías en la técnica. Brevemente, las regiones constantes de anticuerpos murinos se sustituyeron con regiones constantes humanas, las CDRs de anticuerpos murinos se injertaron en la plantilla humana que compartía la mayor homología de FR, y algunos restos de aminoácidos en la región FR, que tienen un efecto clave en el mantenimiento de la conformación del anticuerpo y que afectan a la unión del anticuerpo al antígeno, se retro-mutaron.
[0242] Mediante la alineación con la base de datos de genes de la línea germinal de la región variable de cadena pesada y ligera del anticuerpo humano IMGT, se seleccionaron como plantillas genes de la región variable de cadena pesada y ligera de la línea germinal humana, que tienen alta identidad con la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos mAb-1705, mAb-1706, mAb1780, mAb1773 y mAb1779, respectivamente. Las CDRs de estos anticuerpos murinos se injertaron por separado en las plantillas derivadas humanas correspondientes para formar una secuencia de región variable en el orden de FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Los restos de aminoácidos se determinaron y anotaron mediante el sistema de numeración de Kabat.
[0244] Selección de la región FR humana y retro-mutación de aminoácidos clave. Basándose en la estructura de CDR de VH/VL típica del anticuerpo murino obtenido, se seleccionaron secuencias homólogas de la región variable de cadena ligera (VL) y la región variable de cadena pesada (VH) de la base de datos de la línea germinal humana. Las secuencias de VL y VH de la línea germinal humana resultantes se clasificaron de alta a baja, basándose en la homología de FR, y las secuencias de la línea germinal con la mayor homología de FR se seleccionaron como plantillas principales. Las CDRs de los anticuerpos murinos se injertaron en las plantillas humanas. Y después usando software y basándose en la estructura tridimensional de los anticuerpos murinos, los restos embebidos, restos que interaccionan directamente con las regiones CDR, y restos que tienen efectos significativos sobre la conformación de VL y VH se sometieron a retro-mutaciones. Además, los restos de aminoácidos químicamente inestables se optimizaron para producir moléculas humanizadas finales.
[0246] 5.1 Selección del marco humanizado para el clon de hibridoma mAb 1705:
[0248] Se seleccionó IGHV3-23*04 como plantilla para VH de h1705, y se seleccionó IGKV1-12*01 como plantilla para VL. Las CDRs del mAb1705 murino se injertaron en la plantilla humana. Los restos embebidos y los restos que interaccionan directamente con las regiones CDR se encontraron mediante software y se sometieron a retromutación. Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos humanizados se diseñaron como se muestra en la Tabla 3.
[0250] Tabla 3. Selección de plantilla y diseño de retro-mutación para h1705
[0251]
[0253] Nota: "Injertado" significa que las CDRs de anticuerpos murinos se injertaron en la secuencia de la región FR de la línea germinal humana. Por ejemplo, A43S indica que A en la posición 43 de la secuencia injertada se retro-mutó a S, según la numeración natural de la secuencia de aminoácidos.
[0255] Tabla 4. Combina i n l r i n v ri l n li r l n i r humanizado h1705
[0258]
[0260] Nota: Esta tabla muestra las secuencias obtenidas combinando diversas variantes. Por ejemplo, h1705-007 indica que el anticuerpo murino humanizado h1705-007 comprende dos variantes, es decir, la cadena ligera h1705_VL.1A y la cadena pesada h1705_VH.1A y así sucesivamente.
[0262] Los anticuerpos h1705-003 a h1705-007 y h1707-009 a h1705-011 son anticuerpos comparativos y no forman parte de la invención.
[0264] Las secuencias específicas de las regiones variables del anticuerpo humanizado h1705 son:
[0265] h1705_VL.1 (SEQ ID NO: 46) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKAPKLLIYGTSNLEVGVPSRF SGSGSGTBFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
[0267] h1705_VL.1A (SEQ ID NO 47) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLLIYGTSNLEVGVPSRF SGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
[0269] h1705_VL.1B (SEQ ID NO 48) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIANYLSWYQQKPGKSPKLVIYGTSNLEVGVPSRF SGSRSGSBYTLTISSLQPEDFATYFCLQDKEFPRTFGGGTKVEIK
[0271] h1705_VH.1 (SEQ ID NO 49)
[0272] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSISYEGDITYYGD SVKGRFIISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQILRESFDYWGQGTLVTVSS
[0274] h1705_VH.1A (SEQ ID NO 50)
[0275] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSISYEGDITYYGD SVKGRFIISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSS
[0277] h1705_VH.1B (SEQ ID NO 51)
[0278] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSISYEGDITYYGD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCASQTLRESFDYWGQGTLVTVSS
[0280] Cada una de las regiones variables de cadena ligera anteriores se combinó con la región constante de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 53 para formar las secuencias de cadena ligera intactas finales. Cada región variable de cadena pesada se combinó con la región constante de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 52 para formar las secuencias de cadena pesada finales.
[0281] Región constante de IgG1 de cadena pesada (anticuerpo humanizado) (SEQ ID NO 52)
[0282] ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLYITREPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKIKPREEQYNSIYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0284] Nota: El texto subrayado representa la mutación diseñada M252Y, S254T o T256E.
[0286] Región constante kappa de cadena ligera (anticuerpo humanizado) (SEQ ID NO: 53)
[0287] RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0289] 5.2 Selección del marco humanizado para el clon de hibridoma mAb 1706 (ejemplo comparativo, no forma parte de la invención):
[0291] Se seleccionó IGHV3-23*04 como la plantilla para VH de h1706, y se seleccionó IGKV1-12*01 como la plantilla para VL. Las CDRs del mab1706 murino se injertaron en la plantilla humana. Los restos embebidos y los restos que interaccionan directamente con las regiones CDR se encontraron mediante software y se sometieron a retro-mutación. Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos humanizados se diseñaron como se muestra en la Tabla 5.
[0293] T l . l i n l n ill i ñ r r -m i n r h17
[0296]
[0298] Nota: "Injertado" significa que las CDRs de anticuerpos murinos se injertaron en la región FR de la línea germinal humana. Por ejemplo, A43S indica que A en la posición 43 de la secuencia injertada se retro-mutó a S, según la numeración de la secuencia natural de la secuencia de aminoácidos.
[0300] Tabla 6. Combinaci n l r i n v ri l n li r l ni r humanizado h1706
[0303]
[0306] Las secuencias específicas de las regiones variables del anticuerpo humanizado h1706 son:
[0307] h1706_VL.1 (SEQ ID NO: 54)
[0308] DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKAPKLLIYSASNLEVGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
[0310] h1706_VL.1A (SEQ ID NO 55)
[0311] DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLLIYSASNLEVGVPSRF SGSGSGTBFTLTISSLQPEDFATYYCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
[0313] h1706_VL.1B (SEQ ID NO 56)
[0314] DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDIGNYLSWYQQKPGKSPKLMIYSASNLEVGVPSRF SGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCLQHKQFPRTFGGGTKVEIK
[0315] h1706_VH.1 (SEQ ID NO 57) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSINYEGNSAYYGD SVKGRFIISRDNSKNILYLQMNSLRAEDTflVYYCAKEILRESLDYWGQGTMVTYSS
[0316] h1706_VH.1A (SEQ ID NO 58) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVSSINYEGNSAYYGD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATETLRESLDYWGQGTMVTVSS
[0317] h1706_VH.1B (SEQ ID NO 59) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYYMAWVRQAPGKGLEWVTSINYEGNSAYYGD SVKGRFIISRDNSKNILYLQMNSLRAEDTATYYCATEILRESLDYWGQGTMVTVSS
[0318] Cada una de las regiones variables de cadena ligera anteriores se combinó con la región constante de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 53 para formar las secuencias de cadena ligera intactas finales. Cada región variable de cadena pesada se combinó con la región constante de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 52 para formar las secuencias de cadena pesada finales.
[0319] 5.3 Selección del marco humanizado para el clon de hibridoma mAb1780 (ejemplo comparativo, no forma parte de la invención):
[0320] Se seleccionó IGHV1-2*02 como plantilla para VH de h1780, y se seleccionó IGKV3-11 *01 como plantilla para VL. Las CDRs del mAb1780 murino se injertaron en la plantilla humana. Los restos embebidos y los restos que interaccionan directamente con las regiones CDR se encontraron mediante software y se sometieron a retromutación. Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos humanizados se diseñaron como se muestra en la Tabla 7.
[0321] T l 7. l i n l n ill i ñ r r -m i n r h17
[0324]
[0326] Nota: "Injertado" significa que las CDRs de anticuerpos murinos se injertaron en la región FR de la línea germinal humana. Por ejemplo, E1D indica que E en la posición 1 de la secuencia injertada se retro-mutó a D, según la numeración de la secuencia natural de la secuencia de aminoácidos.
[0327] Tabla 8. Com in i n l r i n v ri l n li r l ni r h m nizado h1780
[0330]
[0332] Las secuencias específicas de las regiones variables del anticuerpo humanizado h1780 son: h1780_VL.1 (SEQ ID NO: 60) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGIPARF SGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
[0333] h1780_VL.1A (SEQ ID NO: 61)
[0334] DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGIPARF SGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
[0335] h1780_VL.1 B (SEQ ID NO: 62) DTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASEGLTSYMHWYQQKPGQAPRLLIYKASNLASGVPARF SGSGSGTBFTLTISSLEPEDFATYFCQQNWNDPWTFGGGTKVEIK
[0336] h1780_VH.1 (SEQ ID NO: 63) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYSGGTVYNE KFKSRVIMTRDTSISIAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
[0337] h1780_VH.1A (SEQ ID NO 64) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWMGYINPYSGGTVYNE KFKSRVTLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
[0338] h1780_VH.1B (SEQ ID NO 65) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVRQAPGQGLEWIGYINPYSGGTVYNE KFKSRATLTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAVYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
[0339] h1780_VH.1C (SEQ ID NO 66) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEYLIHWVKQAPGQGLEWIGYINPYSGGTVYNE KFKSRATLTVDKSISTAYMEFSRLRSDDTAYYYCARDGGYSDPLDYWGQGTMVTVSS
[0340] Cada una de las regiones variables de cadena ligera anteriores se combinó con la región constante de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 53 para formar las secuencias de cadena ligera intactas finales. Cada región variable de cadena pesada se combinó con la región constante de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 52 para formar las secuencias de cadena pesada finales.
[0341] 5.4 Selección del marco humanizado para el clon de hibridoma mAb1773 (ejemplo comparativo, no forma parte de la invención):
[0342] Se seleccionó IGHV3-73*01 como plantilla para VH de h1773, y se seleccionó IGKV1-39*01 como plantilla para VL. Las CDRs del mAb1773 murino se injertaron en la plantilla humana. Los restos embebidos y los restos que interaccionan directamente con las regiones CDR se encontraron mediante software y se sometieron a retromutación. Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos humanizados se diseñaron como se muestra en la Tabla 9. Mientras tanto, para eliminar los sitios isomerizados en las regiones CDR, N localizado en HCDR2 (RIDPANGDTK HGPKfQG ) de h1773 se sustituyó con V (es decir, N55V) para formar una región variable de cadena pesada y un anticuerpo que comprende la variante de HCDR2 (la secuencia de la HCDR2 mutada se muestra como s Eq ID NO: 82: RIDPAVGDTKHGPKFQG).
[0343] T l . l i n l n ill i ñ r r -m i n r h177
[0346]
[0348] Nota: "Injertado" significa que las CDRs de anticuerpos murinos se injertaron en la región FR de la línea germinal humana. Por ejemplo, M4L indica que M en la posición 4 de la secuencia injertada se retro-mutó a L, según la numeración de la secuencia natural de la secuencia de aminoácidos.
[0349] Tabla 10. Combinación de la re ión variable de cadena pesada li era del anticuerpo humanizado h1773
[0352]
[0353] Las secuencias específicas de las regiones variables del anticuerpo humanizado h1773 son: h1773_VL.1 (SEQ ID NO 67) DIQMTQSPSSLSASYGDRVTITCSASSSVNYIYWYQQKPGKAPKLLIYLTATLASGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNSYPYTFGGGTKVEIK
[0354] h1773_VL.1A (SEQ ID NO 68) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIYWYQQKPGKSPKPWIYLTATLASGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNSYPYTFGGGTKVEIK
[0355] h1773_VH.1 (SEQ ID NO 69) EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNTYIHWVRQASGKGLEWVGRIDPAVGDTKHGP KFQGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRYGIYPDHWGQGTLVTVSS
[0356] h1773_VH.1A (SEQ ID NO: 70) EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTISNTYIHWVRQASGKGLEWVGRIDPAVGDTKHGP KFQGRFTISADDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCFRYGIYPDHWGQGTLVTVSS
[0357] h1773_VH.1B (SEQ ID NO 71) EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTISNTYIHWVKQASGKGLEWIGRIDPAVGDTKHGP KFQGRFTISADDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCFRYGIYPDHWGQGTLVTVSS
[0358] Cada una de las regiones variables de cadena ligera anteriores se combinó con la región constante de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 53 para formar las secuencias de cadena ligera intactas finales. Cada región variable de cadena pesada se combinó con la región constante de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 52 para formar las secuencias de cadena pesada finales.
[0359] 5.5 Selección del marco humanizado para el clon de hibridoma mAb1779 (ejemplo comparativo, no forma parte de la invención):
[0360] Se seleccionó IGHV1-2*02 como plantilla para VH de h1779, y se seleccionó IGKV1-33*01 como plantilla para VL. Las CDRs de h1779 murino se injertaron en la plantilla humana. Los restos embebidos y los restos que interaccionan directamente con las regiones CDR se encontraron mediante software y se sometieron a retromutación. Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos humanizados se diseñaron como se muestra en la Tabla 11.
[0361] Tabla 11. Selección de plantilla diseño de retro-mutación para h1779
[0364]
[0366] Nota: "Injertado" significa que las CDRs de anticuerpos murinos se injertaron en la región FR de la línea germinal humana. Por ejemplo, A43S indica que A en la posición 43 de la secuencia injertada se retro-mutó a S, según la numeración de la secuencia natural de la secuencia de aminoácidos.
[0367] Las moléculas humanizadas diseñadas se combinaron con diversas moléculas como se indica en la Tabla 12. Tabla 12. Combinación de la región variable de la cadena pesada y ligera del anticuerpo humanizado h1779
[0368]
[0371] Las secuencias específicas de las regiones variables del anticuerpo humanizado h1779 son:
[0372] h1779_VL.1 (SEQ ID NO 72) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQDGVPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIñTYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK
[0374] h1779_VL.1A (SEQ ID NO 73)
[0375] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKSPKLLIYAASRLQDGVPSRF SGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK
[0377] h1779_VL.1B (SEQ ID NO 74)
[0378] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISNDVAWYQQKPGKSPKLLVYAASRLQDGVPSRF SGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGYKTPLTFGQGTKLEIK
[0380] h1779_VH.1 (SEQ ID NO 75)
[0381] EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGGSNYNE NFKRRVTMTRDISISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
[0383] h1779_VH.1A (SEQ ID NO 76)
[0384] EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWMGYFNPNSGGSNYNE NFKRRVTMTADKSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
[0386] h1779_VH.1B (SEQ ID NO 77)
[0387] EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNE NFKRRATMTADKSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
[0389] h1779_VH.1C (SEQ ID NO 78)
[0390] EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNE NFKRRATMTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
[0392] h1779_VH.1D (SEQ ID NO: 79)
[0393] EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIIHWVRQAPGQGLEWIGYFNPNSGGSNYNE NFKRRATMTADKSISTAYLEFSRLRSEDTAVYYCARRIAWDHWYFDFWGQGTMVTVSS
[0395] Cada una de las regiones variables de cadena ligera anteriores se combinó con la región constante de cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO: 53 para formar las secuencias de cadena ligera intactas finales. Cada región variable de cadena pesada se combinó con la región constante de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO: 52 para formar las secuencias de cadena pesada finales.
[0397] Mientras tanto, el anticuerpo Hu39D10 frente a IL5 descrito en el documento de Patente WO2012083370A1 se usó como control positivo en la presente divulgación, y la secuencia de cadena pesada y ligera del mismo se muestra en la S<e>Q ID NO: 80 y la SEQ ID NO: 81, respectivamente.
[0399] Secuencia de la cadena pesada de Hu39D10 (SEQ ID NO 80)
[0400] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLSLTSHSVNWIRQAPGKGLEWVGLIWSNGDTDYNSA IKSRFTISRDTSKSTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYYGYFDYWGQGTLVTVSSA5TKGPSV FPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLIVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSLGK
[0402] Secuencia de la cadena ligera de Hu39D10 (SEQ ID NO 81)
[0403] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASEGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYGANSLQTGVPSRF SGSGSATDYTLTISSLQPEDFATYYCQQSYKFPNTFGQGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQ LKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGL S S PVTKS FNRGE C
[0405] Ejemplo 6. Preparación de anticuerpos quiméricos recombinantes y anticuerpos humanizados
[0407] 1. Clonación molecular de anticuerpos quiméricos recombinantes: Las moléculas de anticuerpo positivo obtenidas mediante selección del hibridoma se secuenciaron para obtener secuencias génicas que codifican las regiones variables. Se diseñaron cebadores directos e inversos basándose en las secuencias obtenidas, y se construyó el fragmento génico VH/VK de cada anticuerpo mediante PCR usando la secuencia génica como plantilla. El fragmento génico VH/VK se sometió después a recombinación homóloga con el vector de expresión pHr (que comprende un péptido señal y el fragmento del gen (CH1-Fc/CL) de la región constante hIgG1/hkappa) para construir un plásmido de expresión de longitud completa del anticuerpo quimérico recombinante VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr para formar cinco anticuerpos quiméricos de Ch1705, Ch1706, Ch1780, Ch1773 y Ch1779. Los anticuerpos de Ch1706, Ch1780, Ch1773 y Ch1779 son ejemplos comparativos y no forman parte de la invención.
[0409] 2. Clonación molecular de anticuerpos humanizados: Se realizó optimización de codones en las secuencias de anticuerpos humanizados diseñadas para generar secuencias génicas codificantes con preferencia de codones humanos. Se diseñaron cebadores de PCR para construir el fragmento génico VH/VK de cada anticuerpo, y después el fragmento génico VH/VK se sometió a recombinación homóloga con el vector de expresión pHr (que comprende un péptido señal y el fragmento del gen (CH1-Fc/CL) de la región constante de hIgG1/hkappa) para construir el plásmido de expresión de longitud completa de anticuerpo humanizado VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr.
[0411] 3. Expresión y purificación de anticuerpos quiméricos recombinantes y anticuerpos humanizados: El plásmido que expresa la cadena ligera o pesada del anticuerpo se transfectó en células HEK293E en una relación de 1:1,2. Después de 6 días, se recogieron los sobrenadantes de expresión, se centrifugaron a alta velocidad para eliminar impurezas, y se purificaron mediante columna de proteína A. La columna se enjuagó con PBS hasta que la lectura de A280 se redujo al valor inicial. La proteína de interés se eluyó con tampón de elución ácido, pH 3,0-pH 3,5 y se neutralizó con Tris-HCl 1 M, pH 8,0-9,0. Las muestras eluidas se concentraron apropiadamente, y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía en gel Superdex 200 (GE) equilibrada previamente con PBS para eliminar los agregados. El pico de monómero se recogió y se dividió en alícuotas para su uso
[0413] El rendimiento y los efectos beneficiosos de los anticuerpos en la presente divulgación se verificaron mediante los siguientes métodos de prueba.
[0415] Evaluaciónin vitrode la actividad biológica
[0417] Ejemplo de Prueba 1: Unión de anticuerpos de IL-5 murina a IL-5 de diferentes especies mediante un ensayo BIAcore (ejemplo comparativo, no forma parte de la invención)
[0419] La afinidad entre los anticuerpos de IL-5 murina de prueba y la IL-5 humana se determinó usando un instrumento BIAcore T200 (GE). Las moléculas que se iban a analizar se capturaron por afinidad mediante el chip biosensor de proteína A, y después el antígeno (la IL5 recombinante humana, de mono y murina preparada en el Ejemplo 1) se hizo fluir a través de la superficie del chip, y las señales de reacción se detectaron en tiempo real usando un instrumento BIAcore T200 para obtener las curvas de unión y disociación. Después de que se completara la disociación de cada ciclo de experimento, el chip biosensor se lavó y se regeneró con una solución de regeneración de glicina-ácido clorhídrico (pH 1,5). Los datos se ajustaron al modelo de Langmuir (1:1) usando el software BIAevaluation versión 4.1 GE, y los valores de afinidad se obtuvieron como se muestra en la Tabla 13.
[0421] Tabla 13. Afini ni r IL- m rin r IL- if r n i m i n nsayo BIAcore
[0424]
[0427] Este ejemplo demuestra que todos los anticuerpos mAb 1705, mAb 1706, mAb 1780, mAb 1773 y mAb 1779 de la presente divulgación tienen alta afinidad por IL-5 de diferentes especies (humana, mono).
[0429] Ejemplo de prueba 2: Afinidad de anticuerpos de IL-5 humanizados por IL-5 de diferentes especies mediante ensayo BIAcore
[0431] La afinidad entre los anticuerpos de IL-5 humanizados de prueba y la IL-5 humana se determinó usando un instrumento BIAcore T200 (GE). Las moléculas que se iban a probar se capturaron por afinidad mediante el chip biosensor de Proteína A, y después el antígeno (preparado en el Ejemplo 1) se hizo fluir a través de la superficie del chip, y las señales de reacción se detectaron en tiempo real usando un instrumento BIAcore T200 para obtener las curvas de unión y disociación. Después de que se completara la disociación de cada ciclo del experimento, el chip biosensor se lavó y se regeneró con una solución de regeneración de glicina-ácido clorhídrico (pH 1,5). Los datos se ajustaron al modelo de Langmuir (1:1) usando el software BIAevaluation versión 4.1 GE, y los valores de afinidad se obtuvieron como se muestra en la Tabla 14.
[0433] Tabla 14. Afinidad d ni r IL- h m niz r IL- h m n m iante ensayo BIAcore
[0436]
[0439] Los anticuerpos h1705-003 a h1705-007 y h1707-009 a h1705-011 son anticuerpos comparativos y no forman parte de la invención
[0441] Los resultados muestran que los anticuerpos de IL-5 humanizada todavía tienen alta afinidad por IL-5 humana (en cuanto a variantes humanizadas de los otros anticuerpos murinos, sólo se proporcionaron datos ejemplares, excepto para cada variante humanizada de h1705).
[0443] Ejemplo de prueba 3: Los anticuerpos de IL-5 murina bloquean la unión entre IL-5 y el receptor de IL-5a mediante ensayo ELISA (ejemplo comparativo, no forma parte de la invención)
[0445] Para demostrar la capacidad de los anticuerpos de IL-5 para evitar que IL-5 se uniera a la región extracelular de la proteína del receptor de IL-5a expresada de forma recombinante, la placa de ELISA se revistió con IL-5 (5 pg/ml en PBS), se incubó a 37°C durante 1 hora, el líquido se desechó, después se añadió solución de bloqueo de leche desnatada al 5% diluida con PBS a 200 pl/pocillo y se bloqueó a 37°C durante 2,5 horas en una incubadora. Después de que el bloqueo terminó, la solución de bloqueo se desechó, la placa se lavó 5 veces con tampón PBST (PBS que contenía Tween-20 al 0,05%, pH 7,4), se añadieron 25 pl de IL-5Ra 10 pg/ml (en BSA al 1%) que se marcó con el kit de marcaje con biotina (Dojindo Chemical, LK03), y después se añadieron 25 pl de anticuerpo diluido en gradiente que compitió con IL-5Ra para la unión a IL-5, y se incubó a 37°C durante 1 hora. Después de la incubación, la solución de reacción en la placa se desechó, la placa se lavó 5 veces con PBST, se añadió polímero de estreptavidina-peroxidasa (Sigma, S2438-250 UG) diluido a 1:600 con solución de dilución de muestra a 50 |jl/pocillo, y se incubó a 37°C durante 1 hora. Después de lavar la placa con PBST durante 5 veces, se añadieron 50 jl/pocillo de sustrato cromogénico TMB (KPL, 52-00-03), se incubó a temperatura ambiente durante 3-10 min y se añadieron 50 jl/pocillo de H<2>SO<4>1M para detener la reacción. Los valores de absorbancia se leyeron a 450 nm con un lector de microplacas NOVOStar. Se calcularon los valores de IC50 para los anticuerpos de IL-5 para bloquear la unión entre IL-5 e IL-5Ra. Los resultados se muestran en la Tabla 15, ambos anticuerpos de la presente divulgación pueden inhibir eficazmente la unión de IL-5 a su receptor.
[0447] Tabla 15. Anticuerpos de IL-5 murin r l r l ni n n r IL- l receptor de IL-5a mediante ELISA
[0450]
[0453] Ejemplo de prueba 4: los anticuerpos de IL-5 bloquean la unión entre IL-5 y el receptor de IL-5 mediante FACS
[0454] Para identificar los anticuerpos de IL-5 resultantes que pueden bloquear el receptor de IL-5 en la superficie celular, se construyó la línea celular recombinante CHOS, que expresa altamente ambos receptores de IL-5Ra/p. Este experimento identificó que los anticuerpos de IL-5 pueden prevenir la unión de IL-5 al receptor de IL-5a/p recombinante en la superficie de la línea celular CHOS, respectivamente.
[0456] Método particular: Se cultivaron CHO-S-IL-5Ra y p con CD-CHO que contenía 100 ng/ml de G418 y 25 ng/ml de zeozina, y la concentración durante el cultivo celular no fue mayor de 3x106 células/ml. Las células IL-5Ra/p-CHOS en buenas condiciones se centrifugaron (1000 rpm, 5 min), se lavaron una vez con FBS al 10% en PBS, se contaron, la concentración celular se ajustó a 4x106 células/ml, y se añadieron 25 j l de ellas a una placa de 96 pocillos con fondo redondo. Los anticuerpos que se iban a probar se diluyeron con solución de PBS que contenía FBS al 10%, con una concentración inicial de 200 jg/ml, y se obtuvieron 8 gradientes mediante dilución 1:10. Se mezclaron uniformemente 25 j l de IL-5 100 ng/ml marcada con el kit de marcaje con biotina (Dojindo Chemical, LK03) con 50 j l de cada anticuerpo diluido, se añadieron a la placa de 96 pocillos a la que se habían añadido las células y se incubaron a 4°C durante 1 hora. Después de la incubación, se centrifugó a 4°C (400 g, 5 min), el sobrenadante se desechó, se centrifugó y se lavó con 200 j l de PBS previamente enfriado, se repitió dos veces; se añadió anticuerpo secundario de PE-avidina diluido a 1:1333 y se incubó en la oscuridad a 40°C durante 40 min, el sobrenadante se desechó después de centrifugarse a 4°C (400 g, 5 min), se añadieron 200 j l de PBS previamente enfriado, las células se disociaron, se centrifugaron y se lavaron a 4°C, se repitieron tres veces y se añadieron 100 j l de PBS. La placa se leyó en un instrumento, y los valores de IC50 para los anticuerpos de IL-5 para bloquear la unión entre IL-5 e IL-5Ra/p se calcularon basándose en los valores de la señal de fluorescencia. Los resultados se muestran en la Tabla 16 y la Figura 1.
[0458] Tabla 16. Resultados de anticuerpos de IL-5 para bloquear la unión entre IL-5 e IL-5Ra/p
[0460]
[0463] Los anticuerpos h1706-009, h1780-017, h1773-007 y h1779-014 son anticuerpos comparativos y no forman parte de la invención. hu39D10 es un control positivo.
[0465] Los resultados muestran que los anticuerpos h1705-008, h1706-009, h1780-017, h1773-007 y h1779-014 mostraron una capacidad más fuerte para bloquear la unión de IL-5 al receptor de IL-5 en la superficie celular.
[0466] Ejemplo de prueba 5: Los anticuerpos de IL-5 inhiben la proliferación inducida por IL-5 de las células TF1
[0467] La IL-5 puede inducir la proliferación de células TF-1, y los anticuerpos de IL-5 pueden prevenir que la IL-5 estimule la proliferación de células TF-1.
[0469] Específicamente, se cultivaron células TF-1 (ATCC, CRL-2003) en RPMI1640 que contenía FBS al 10% y 2 ng/ml de rhGM-CSF (Lianke Bio, No de catálogo 96-AF-300-03-20), se incubaron en una incubadora a 37°C, CO<2>al 5%, con la densidad celular no superior a 1 x 106células/ml. Para la detección de los anticuerpos, las células que estaban en fase de crecimiento logarítmico se lavaron tres veces con PBS mediante centrifugación a 800 rpm durante 5 min, y la densidad celular se ajustó a 6000 células/pocillo/90 j l con RPMI1640 (FBS: 2%, IL-5 humana recombinante, 10 ng/ml). Se añadieron 10 j l de diluciones en gradiente de anticuerpos que iban a probarse a una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 3 días. Se añadieron 30 j l del título celular y se mezclaron. Los valores de IC50 se calcularon basándose en la lectura. Los resultados se muestran en la Tabla 17 a continuación.
[0471] Tabla 17. Anticuerpos humanizados de IL-5 para inhibir la proliferación inducida por IL-5 de células TF1
[0472]
[0475] Todos los anticuerpos distintos de h1705-008 son anticuerpos comparativos y no forman parte de la invención. hu39D10 es un control positivo.
[0477] Ejemplo de prueba 6: Los anticuerpos de IL5 inhiben la adhesión de eosinófilos inducida por IL5
[0479] La IL5 puede inducir la diferenciación, maduración, migración y activación de eosinófilos, provocar inflamación respiratoria y conducir al asma. Según el principio de que la citocina IL-5 puede promover la adhesión de eosinófilos y activar eosinófilos, en este ejemplo de prueba, los efectos de anticuerpos específicos de IL-5 sobre el bloqueo de la ruta mediada por IL-5 se determinaron recogiendo y purificando eosinófilos de sangre periférica humana, y detectandoin vitrolos efectos de los anticuerpos de IL-5 sobre el bloqueo de la adhesión de eosinófilos mediada por IL5.
[0481] Específicamente, la sangre periférica humana se diluyó 5 veces con PBS que contenía EDTA 2 mM, los monocitos y granulocitos se separaron mediante Percoll™ (con un gradiente de densidad de 1,088), la capa de eritrocitos que contenía granulocitos se aspiró cuidadosamente y los eritrocitos se eliminaron con tampón Red Blood Cell Lysis. Se contaron las células restantes, se añadieron perlas magnéticas de separación recubiertas con anticuerpo CD16 humano (Miltenyi, Catálogo No. 130-045-701), se incubaron durante 30 min y se hicieron fluir a través de la columna de perlas magnéticas. El efluente de la fracción celular se recogió directamente, que estaba compuesto principalmente por eosinófilos. Los eosinófilos resultantes se contaron y se añadieron a una placa de cultivo celular de 96 pocillos recubierta previamente con anticuerpo IgG, aproximadamente 1x104 células por pocillo, añadidas con IL-5 humana (20 ng/ml) y diferentes concentraciones de moléculas de anticuerpo de IL-5 (comenzando a 10 pg/ml, diluidas 3 veces, 10 niveles de concentraciones). La placa de cultivo celular se incubó en una incubadora a 37°C, CO<2>al 5% durante 1 h, y después se añadió CTAB al 0,3% para lisar las células. Finalmente, se añadió sustrato de reacción de peroxidasa TMB para desarrollar color. Los valores de absorción de OD450 se leyeron en un lector de microplacas. El valor máximo de adsorción se leyó en el pocillo al que solamente se había añadido IL-5, y el pocillo que no contenía IL-5 ni fármaco de anticuerpo se estableció como control de fondo. El valor de inhibición de cada concentración de los fármacos de anticuerpo con respecto al valor de adsorción máximo se calculó como = (valor de adsorción máximo -[fármaco de anticuerpo])/(valor de adsorción máximo - valor de control de fondo) x 100%, y se calculó la IC50. Los resultados se muestran en la Tabla 18.
[0483] Tabla 18. Los anticuerpos de IL-5 bloquean la adhesión de eosinófilos inducida por IL-5
[0486]
[0489] Los anticuerpos h1706-009 y h 1780-017 son anticuerpos comparativos y no forman parte de la invención. hu39D10 es un control positivo.
[0491] Los resultados indican que los anticuerpos humanizados de la presente divulgación muestran una fuerte capacidad para inhibir la adhesión de eosinófilos mediada por IL5.
[0493] Ejemplo de prueba 7: Evaluación de la especificidad de anticuerpos de IL-5 humanizados a citocinas Th2
[0494] La IL-5 es una de las citocinas Th2. Para verificar que los anticuerpos de IL-5 se dirigen específicamente sólo a IL-5 sin reactividad cruzada con otras citocinas, 12 tipos de Th2 y citocinas relacionadas, incluyendo IL2 (R&D, 202-IL-010/CF), IL4(R&D 204-IL-050/CF), IL-5 (R&D, 205-IL-025/CF), IFNy (gamma), IL6(R&D 7270-IL-025/CF), IL9(R&D 209-IL-010/CF), IL10(R&D 217-IL-025/CF), IL13 (R&D, 213-ILB-025/CF), IL25(R&D 8134-IL-025/CF), IL31 (R&D, 2824-IL-010/CF) e IL3 que comparten receptor a con IL-5 (203-IL-050/CF) y GMCSF (R&D, 215-GM-010/CF), se usaron en el ensayo Fortebio.
[0495] Específicamente, los anticuerpos se capturaron usando el biosensor de proteína A (PALL Fortebio, 18-5010), se registró la señal de captura, y después se añadieron 40 nM de cada citocina y se registraron las nuevas señales de unión. Finalmente, la señal de unión para IL-5 se definió como el 100%, y se observaron las señales de unión entre anticuerpos y otras citocinas. Los resultados se muestran en la Figura 2.
[0496] Los resultados muestran que entre los 12 tipos de citoquinas relacionadas, los anticuerpos humanizados de IL-5 h1705-008 y h1706-009 (anticuerpo comparativo, no forma parte de la presente invención) simplemente se unen específicamente a IL-5, y no muestran reacción cruzada con otras citoquinas Th2.
[0497] Evaluación farmacocinética
[0498] Ejemplo de Prueba 8: Evaluación farmacocinética de anticuerpos humanizados de IL-5 en ratas
[0499] Se dividieron en 6 grupos ratas SD experimentales (proporcionadas por Sipple-BK Lab Animal Co., Ltd.), 18 machos, con 3 ratas en cada grupo. Hu39D10, h1705-008 y h1706-009 se administraron por vía intravenosa y subcutánea. A otras 9 ratas SD se les administró solamente por vía intravenosa h1773-007, h1779-014 o h1780-017. Para el grupo de administración intravenosa, se recogieron 0,2 ml de sangre completa sin introducir anticoagulación antes de la administración y 5 min, 8 h, 1d, 2d, 4d, 7d, 10d, 14d, 21d y 28d después de la administración. Las muestras de sangre se colocaron a 4°C durante 30 min, se centrifugaron a 1000 g durante 15 min, los sobrenadantes (suero) se colocaron en tubos EP y se almacenaron a -80°C. Para el grupo de administración subcutánea, se recogió sangre completa antes de la administración y 1h, 2h, 4h, 8h, 1d, 2d, 4d, 7d, 10d, 14d, 21d y 28d después de la administración. La concentración de anticuerpo en el suero se determinó mediante Elisa.
[0500] Los resultados indican que las moléculas de anticuerpo humanizado de la presente divulgación tienen una vida media larga y una alta biodisponibilidad en ratas.
[0501] Tabla 19. Evaluación farmacocinética de anticuerpos en rata
[0503]
[0505] Los anticuerpos h1706-009, h1773-007, h1779-014 y h1780-017 son anticuerpos comparativos y no forman parte de la invención. hu39D10 es un control positivo.
[0506] Evaluación biológicain vivo
[0507] Ejemplo de prueba 9: Evaluación de las eficacias de los anticuerpos de IL-5 en un modelo de asma de ratón inducido por OVA
[0508] Este ejemplo de prueba es para evaluar las eficacias de los anticuerpos de IL-5 en el modelo de asma de ratón BALB/c inducido por aerosol de ovoalbúmina (OVA) basado en la respuesta inflamatoria de las vías respiratorias y la remodelación de las vías respiratorias. Los ratones se dividieron aleatoriamente en 7 grupos según el peso corporal, 10 ratones en cada grupo: grupo de control normal (G1); grupo modelo (G2); grupos de tratamiento para el anticuerpo h1705-008 (G3 y G4 para dos dosificaciones de 10 mpk y 2 mpk, respectivamente) y h1706-009 (G5 y G6 para dos dosificaciones de 10 mpk y 2 mpk, respectivamente); y un grupo de control para el anticuerpo positivo Hu39D10 (G7, 10 mpk). El anticuerpo h1706-009 es un anticuerpo comparativo y no forma parte de la invención. El día 1 y el día 14, todos los ratones se sensibilizaron mediante inyección intraperitoneal de solución de sensibilización. En los días 28, 29 y 30, seis grupos de ratones excluyendo el Grupo 1 se expusieron a solución de exposición a aerosol de OVA durante 30 minutos. Dos horas antes de la exposición, se inyectó por vía intraperitoneal al Grupo 2 (G2) tampón fosfato, y se inyectó por vía intraperitoneal a los ratones del Grupo 3-7 (G3-G7) diferentes dosis de diferentes anticuerpos, una vez al día, durante tres días consecutivos. Se prepararon soluciones de anticuerpo frescas que iban a probarse inmediatamente antes de cada inyección y todas las inyecciones se completaron en media hora. Como control normal, 2 horas después de la inyección intraperitoneal de tampón fosfato, los ratones del Grupo 1 se expusieron a PBS en aerosol durante 30 minutos, una vez al día, durante tres días consecutivos.
[0509] El día 31, se probó la hiperreactividad de las vías respiratorias en los animales usando el sistema WBP. Todos los animales inhalaron pulverización de metacolina a concentración doblemente creciente de 1,5625, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 mg/mL para determinar el valor intermitente de exhalación mejorado a la concentración correspondiente. El día 31,1 hora después del ensayo de respuesta de las vías respiratorias con sistema WBP, se insertó una cánula traqueal con diámetro de 1,2 mm en la tráquea y se fijó, se realizó el lavado pulmonar dos veces, se usaron 0,8 ml de tampón fosfato que contenía BSA al 1% y EDTA 0,6 mM cada vez. Se registró el volumen recuperado del fluido de lavado.
[0511] El BALF se centrifugó a 300 g a 4°C durante 5 minutos y el sobrenadante se retuvo para el análisis de citocinas. Después de la centrifugación, las células se volvieron a suspender en 1,5 ml de PBS (que contenía BSA al 1% y EDTA 0,6 mM) para el recuento celular. El número total de células en BALF se contó con un hemocitómetro y un ensayo de tinción con azul de tripano. Las células se untaron, se tiñeron con solución de tinción de Wright durante un minuto y después se tiñeron con Giemsa durante 7 minutos para distinguir eosinófilos, neutrófilos, macrófagos y linfocitos. Las células se contaron con microscopio óptico.
[0513] Después del lavado, se recogieron los tejidos pulmonares, se sumergieron en una solución de formaldehído neutro al 10% y después se fijaron en una solución de formaldehído neutro al 10%. Los tejidos fijados se sometieron después a incrustación en parafina, recorte, tinción con H & E y puntuación. Los resultados de la prueba se muestran en la Figura 3 y las Figura 4A y 4B.
[0515] Los resultados muestran que las moléculas de anticuerpo h1705-008 y h1706-009 pueden mejorar significativamente la función pulmonar de una manera dependiente de la dosis, mientras que la dosis alta (10 mpk) del compuesto positivo no puede mejorar la función pulmonar (véase la Figura 3). El anticuerpo h1706-009 es un anticuerpo comparativo y no forma parte de la invención. Al mismo tiempo, los dos anticuerpos redujeron significativamente el nivel de eosinófilos y el espesor de la mucosa, y mostraron una capacidad más fuerte para reducir el número de eosinófilos en comparación con el anticuerpo positivo a la misma dosificación (10 mpk) (véanse las Figuras 4A y 4B). Repitiendo el experimento en el mismo tipo de modelo de asma de ratón, también se verificó que 1 mg/ml de h1705-008, h1706-009 y h1780-017 redujeron todos significativamente el nivel de eosinófilos en BalF, cuando se comparó con el anticuerpo positivo (véase la Figura 4C). Los anticuerpos h1706-009 y h1780-017 son anticuerpos comparativos y no forman parte de la invención.
[0516] Ejemplo de prueba 10: Evaluaciónin vivode la eficacia de los anticuerpos de IL5 en asma aguda inducida por IL5 humana exógena en un modelo de cobaya
[0518] En este ejemplo de prueba, se usaron cobayas macho para establecer el modelo de asma aguda inducida por IL5 humana, y se usó hu39D10 como anticuerpo positivo para evaluar si los cinco anticuerpos monoclonales humanizados de IL-5 de la presente divulgación tienen efectos de inhibición sobre el aumento inducido por IL5 humana de eosinófilos en el fluido de lavado broncoalveolar (BALF) en cobayas. Las cobayas se dividieron en 9 grupos, 8-10 en cada grupo: grupo de control normal, grupo modelo, grupo hu39D10 (1 mg/kg), grupo h1705-008 (1 mg/kg), grupo h1706-009 (1 mg/kg), grupo h1780-017 (1 mg/kg), grupo h1773-007 (1 mg/kg) y grupo h1779-014 (1 mg/kg). Los anticuerpos h1706-009, h1773-007, h1779-014 y h1780-017 son anticuerpos comparativos y no forman parte de la invención. El día 1, se inyectaron por vía intratraqueal a las cobayas en el grupo modelo y en los grupos de administración de fármaco 100 pl de IL5 humana (que contenía 5 pg de antígeno de IL5) para la sensibilización, y se inyectó por vía intratraqueal al grupo de control normal con PBS.
[0519] 2 horas después de la sensibilización, se administraron por vía intraperitoneal, 1 mg/kg de los anticuerpos monoclonales de IL5 anteriores (al volumen de administración de 5 ml/kg) a los grupos de administración de fármaco, se administró el anticuerpo de IgG correspondiente al grupo modelo, y se administró por vía intraperitoneal PBS al grupo de control normal. 24 horas después de la inyección intratraqueal, se anestesiaron las cobayas y se extrajo el fluido de lavado broncoalveolar. La concentración celular se ajustó a 5 A106/ml, y se dejaron caer 15 pl del mismo sobre el portaobjetos de vidrio, se secaron y se fijaron para tinción con HE, y se contaron el número total de células y el número de eosinófilos bajo un microscopio de 400x. Se calculó el porcentaje de eosinófilos. Los resultados se muestran en las Figuras 5A y 5B, lo que indica que los cinco anticuerpos humanizados de la presente divulgación pueden reducir significativamente el nivel de eosinófilos en el BALF.
[0521] Evaluación de la estabilidad
[0523] Ejemplo de prueba 11: Estabilidad de los anticuerpos anti-IL-5 humanizados
[0525] 1. Estabilidad química de los anticuerpos: La modificación de desamidación es una modificación química común en anticuerpos que puede afectar a la estabilidad a largo plazo. En particular, se debe evitar generalmente un alto grado de modificación de desamidación, oxidación o isomerización de aminoácidos parciales en las regiones CDR, o se debe reducir por mutación. Se disolvieron 100 pg de muestras tomadas en diversos puntos de tiempo en 100 pl de solución de His-HCl 0,2 M, Gua-HCl 8 M, pH 6,0, se añadieron 3 pl de DTT 0,1 g/ml, se incubaron en un baño de agua a 50°C durante 1 hora y después se ultrafiltraron dos veces con His-HCl 0,02 M pH 6,0. Se añadieron 3 pl de tripsina 0,25 mg/ml, se incubaron en un baño de agua a 37°C durante la noche para la digestión enzimática. El análisis de LC-MS se realizó con Agilent 6530 Q-TOF. Los resultados muestran que la estabilidad química de los anticuerpos humanizados de la presente divulgación fue buena, y los anticuerpos no mostraron modificación anormal después de la reacción de aceleración en el sistema de tampón 529 a 40°C durante un mes.
[0527] 2. Estudio del grado de agregación de anticuerpos en condiciones de alta concentración: La estabilidad de los anticuerpos de prueba se evaluó a altas concentraciones y diferentes sistemas tampón y diferentes condiciones de temperatura durante un mes. La estabilidad se investigó a la concentración de 50 mg/ml, en tres sistemas tampón de PB9, His y 529, a 40°C, 25°C, 4°C y -80°C con congelación y descongelación repetidas. El grado de agregación se monitorizó por SEC-HPLC. Se usó un cromatógrafo Waters e2695, con la columna de Waters Xbridge BEH 200A SEC, y la fase móvil fue PBS (el pH se ajustó a 6,8 con ácido clorhídrico diluido). Se cargaron 50 gg de proteína y se realizó una elución isocrática a un caudal de 0,5 mL/min. Se observó que ninguno de los anticuerpos de IL-5 humanizados se agregaba significativamente en condiciones de alta concentración. Después de 4 semanas de reacción de aceleración a 40°C, la pureza del monómero de anticuerpo fue mayor del 95% en los tres sistemas.
[0529] 3. Estudio sobre la pureza de los anticuerpos en condiciones de alta concentración: La estabilidad de los anticuerpos de prueba se evaluó a altas concentraciones y diferentes sistemas tampón y diferentes condiciones de temperatura durante un mes. La estabilidad se investigó a la concentración de 50 mg/ml, en el sistema His y a 40°C. La pureza se monitorizó por CE-SDS. Se tomaron 100 gg de proteína y se añadió tampón de muestra para alcanzar 95 gl. Para el análisis del modo reductor, se añadieron 5 gl de dimercaptoetanol; para el análisis del modo no reductor, se añadieron 5 gl de IAA. Se incubó en un baño de agua a 70°C durante 10 min, se centrifugó y se cargó el sobrenadante. Los datos se recogieron y analizaron con un aparato de electroforesis Beckman PA800plus. Se observó que las proteínas de anticuerpo tienen buena estabilidad de pureza en condiciones de alta concentración, y después de 28 días de reacción de aceleración a 40°C, el análisis CE-SDS mostró que el pico principal de los anticuerpos solo disminuyó en un 2%.
[0531] 4. Detección de la estabilidad térmica de diferentes anticuerpos por UNIT: Las muestras se disolvieron en el tampón PBS correspondiente, y la concentración se controló a aproximadamente 1 mg/ml. Se cargaron 9 gl. Ajuste de los parámetros: temperatura de inicio 20°C; incubación 0 s; velocidad de calentamiento 0,3°C/min; retención de la placa 5 s; temperatura de terminación 95°C. Se detectaron los valores de Tm de los anticuerpos. Los anticuerpos tienen un valor de Tm alto y muestran una buena estabilidad térmica.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a IL-5 humana, en donde el anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena pesada como se establece en SEQ ID NO: 51 y una región variable de cadena ligera como se establece en SEQ ID NO: 47.
2. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo recombinante, y preferiblemente un anticuerpo humanizado.
3. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, que comprende una región constante del anticuerpo humano, en donde preferiblemente el anticuerpo de longitud completa comprende una región constante de cadena pesada del anticuerpo humano como se establece en la SEQ ID NO: 52 y una región constante de cadena ligera humana como se establece en la SEQ ID NO: 53.
4. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2, en donde el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2, anticuerpo monocatenario (scFv), región V dimerizada (diacuerpo) y región V estabilizada con disulfuro (dsFv).
5. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y uno o más vehículos, diluyentes, tampones o excipientes farmacéuticamente aceptables.
6. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 6.
8. Una célula huésped transformada con el vector recombinante de la reivindicación 7, en donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en células procariotas y células eucariotas, preferiblemente es una célula eucariota, y más preferiblemente es una célula de mamífero.
9. Un método para producir el anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 en un medio de cultivo para formar y acumular el anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y recuperar el anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo del cultivo.
10. El anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o la composición farmacéutica de la reivindicación 5, o la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 6, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en asma, ataque maligno de asma, neumonía crónica, rinitis alérgica, aspergilosis broncopulmonar alérgica, eosinofilia, síndrome de Churg-Strauss, dermatitis atópica, dermatitis por oncocercosis, angioedema intermitente, síndrome de mialgia eosinofílica, gastroenteritis eosinofílica, infección por helmintos, enfermedad de Hodgkin, pólipos nasales, síndrome de Loeffler, urticaria, bronquitis hiperplásica eosinofílica, arteritis nodular, sinusitis, esofagitis eosinofílica, esofagitis eosinofílica alérgica, conjuntivitis alérgica, endometriosis y bronquitis eosinofílica dependiente de esteroides.
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