KR20200059239A - Ｉｌ－５ 항체, 이의 항원 결합 단편 및 이의 의학적 적용 - Google Patents

Ｉｌ－５ 항체, 이의 항원 결합 단편 및 이의 의학적 적용 Download PDF

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Abstract

IL-5 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이의 의학적 용도가 제공된다. 본 발명은 IL-5 항체 CDR 영역을 함유하는 마우스 유래 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 상기 IL-5 항체 및 상기 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물, 그리고 약학 조성물의 약물로서의 용도를 포함한다.

Description

ＩＬ－５ 항체, 이의 항원 결합 단편 및 이의 의학적 적용
본 개시는 IL-5 항체 및 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 또한, 본 개시는 IL-5 항체의 CDR 영역을 포함하는 키메라 항체, 인간화 항체에 관한 것이고, 또한 본 개시는 IL-5 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물, 및 IL-5 관련 질환을 위한 진단제 및 치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다.
인터루킨-5(interleukin-5, IL-5)는 T 세포 대체인자(T cell replacing factor, TRF), B 세포 성장 인자-II(B cell growth factor-II, BCGF-II), IgA 강화 인자(IgA-enhancing factor, IgA-EF), 또는 호산구 분화 인자(eosinophil differentiation factor, EDF)라고도 알려져 있는, 인터루킨 패밀리의 중요한 구성원 중 하나이다. 이는 주로 보조 T 세포 2(helper T cell 2, Th2)에 의해 분비되는 동종이량체 당단백질이다. 인간 IL-5는 22개의 아미노산으로 구성된 신호 펩티드와 두 개의 글리코실화 부위를 포함하는, 134개의 아미노산 잔기로 구성된다. 인간 IL-5는 아미노산 수준에서 쥣과의 IL-5와 70%의 동일성(identity)을 갖는다. 활성 IL-5는 올리고이량체의 형태로, 두 개의 펩티드 사슬이 이황화 결합(들)을 통해 서로 연결되어 있으며 역평행한 배열(antiparallel configuration)로 있지만, IL-5의 단량체는 생물학적으로 활성이 아니다(Adv Immunol. 1994; 57:145-90).
호산구(eosinophil, EOS)는 아나필락시스 반응과 관련된 알레르기 질환을 포함하는, 폐에서의 다양한 염증성 질환과 관련이 있다. 이러한 질환 가운데, 천식(asthma)은 전 세계적으로 대략 3억 명의 환자에게 영향을 미치며, 10%의 이환율(morbidity)을 나타내는 만성 호흡 염증성 질환이다. 이의 발병기전은 다양한 사이토카인과 관련이 있으며, IL-5 및 이의 수용체 IL-5R은 천식의 발병기전에서 중요한 역할을 한다. 천식 환자의 기관지 폐의 조직에 침윤하는 염증성 세포가 다량 존재하며, 그 중에서 호산구가 가장 현저하게 증가된다. 여러 연구에서 호산구가 천식에서 기도 염증을 초래하는 주요 세포 중 하나임을 밝혀냈다(Curr Opin Pulm Med. 2005 Jan; 11(1): 1-6). IL-5는 EOS의 분화, 성숙, 부착, 침윤 및 아폽토시스에서 매우 중요한 역할을 한다. 다수의 동물 연구 및 임상 연구는 IL-5가 골수에서 EOS 전구세포를 활성화시킬 수 있고, 말초 혈액과 기도에서 EOS의 응집을 개시할 수 있어, 만성 염증 및 기도 과민반응성을 초래함을 밝혀냈다(J Immunol. 2014 Oct 15; 193(8):4043-52). 또한, IL-5는 EOS의 생존기간을 연장할 수 있고, 특정 자극 인자(예컨대, IgA 또는 IgG)에 대한 이의 탈과립 반응을 증가시킬 수 있고, 호산구의 화학주성 활성을 매개할 수 있다(J Asthma Allergy. 2015 Nov 3; 8: 125-34). IL-5의 증가된 발현은 천식 환자 및 인간 기관지 항원 유도성 모델 둘 다에서 검출되었다(Greenfeder et al, Respiratory Research, 2: 71-79, 2001). 천식 환자에 의해 복용된 재조합 인간 IL-5 단백질은 호산구 수의 증가, 기관지 과민반응성, 및 호산구에 의한 유독성 입자의 방출을 가져올 것이며, 이는 IL-5가 천식의 발병기전에서 핵심 인자임을 나타낸다.
현재, 천식에 대한 가장 효과적인 치료 방법은 폐의 염증을 완화하기 위하여 스테롤의 비강 또는 경구 투여를 통해 일부 핵심 매개체(IL-5를 포함)의 발현을 억제하는 것이다. 그러나 스테롤의 장기 사용에는 여러 부작용이 있다. 따라서, 천식 치료를 위한 새로운 약학적 대상을 발견할 필요가 있다. 연구 결과, IL-5 항체는 IL-5의 이의 수용체에 대한 결합을 억제함으로써, 폐에서 호산구의 축적을 현저하게 감소시키고, 혈액, 조직 및 가래에서 호산구의 수준을 감소시키며, 호산구 매개성 염증 반응을 감소시키고, 폐 기능을 개선할 수 있으며, 중증의 호산구 천식 및 재발성 천식의 치료에 양호한 효능을 나타낼 수 있음이 밝혀졌다(Drugs. 2017 May; 77(7): 777-784). 현재, IL-5 항체 GSK의 메폴리주맙(mepolizumab)과 Teva Pharma의 레슬리주맙(reslizumab)만이 상업적으로 이용 가능하다. IL-5 표적에 대한 다른 항체는 전임상 연구 단계에 있다. 관련 특허는 예를 들어, WO2017033121, WO2016040007, WO2015095539, WO2012083370, WO2012158954, WO2006046689, WO9621000, WO9535375 등이다. 그러나 호산구의 IL-5 유도성 제거의 개선 및 폐 기능의 개선의 필요성은 여전하다. 따라서, 천식에 대한 더 많은, 그리고 바람직한 항-IL-5 치료 요법을 제공하기 위하여 높은 선택성, 높은 친화도 및 양호한 효능을 갖는 항체를 계속 개발할 필요가 있다.
본 개시는 IL-5의 아미노산 서열 또는 3차원 구조에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편(IL-5 결합 분자라고도 지칭됨)을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 인간 IL-5에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기에서 단일클론 항체는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기에서
(i) 중쇄 가변 영역은 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 16 내지 18에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역과 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 19 내지 21에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역과 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체를 포함하거나; 또는
(ii) 중쇄 가변 영역은 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 22 내지 24에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역과 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 25 내지 27의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 25 내지 27에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역과 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체를 포함하거나; 또는
(iii) 중쇄 가변 영역은 서열번호 28 내지 30의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 28 내지 30에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역과 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 31 내지 33의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 31 내지 33에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역과 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체를 포함하거나; 또는
(iv) 중쇄 가변 영역은 서열번호 34 내지 36의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 34 내지 36에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역과 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 37 내지 39의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 37 내지 39에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역과 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체를 포함하거나; 또는
(v) 중쇄 가변 영역은 서열번호 40 내지 42의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 40 내지 42에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역과 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 43 내지 45의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 43 내지 45에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역과 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체를 포함하거나; 또는
(vi) 중쇄 가변 영역은 서열번호 34 내지 36의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 34, 82 및 36에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역과 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 37 내지 39의 아미노산 서열에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 37 내지 39에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역과 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편 CDR(3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함함)의 변이체는 친화도 성숙 방법(affinity maturation method)에 의해 수득된 것이다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편은 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 또는 10-11 M 미만의 친화도(KD)로 IL-5에 결합한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 IL-5에 특이적으로 결합하며, 단일클론 항체는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기에서
(vii) 중쇄 가변 영역은 서열번호 16 내지 18에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 19 내지 21에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역을 포함하거나; 또는
(viii) 중쇄 가변 영역은 서열번호 22 내지 24에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 25 내지 27에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역을 포함하거나; 또는
(ix) 중쇄 가변 영역은 서열번호 28 내지 30에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 31 내지 33에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역을 포함하거나; 또는
(x) 중쇄 가변 영역은 서열번호 34 내지 36에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 37 내지 39에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역을 포함하거나; 또는
(xi) 중쇄 가변 영역은 서열번호 40 내지 42에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 43 내지 45에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역을 포함하거나; 또는
(xii) 중쇄 가변 영역은 서열번호 34, 82 및 36에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 37 내지 39에 기재된 바와 같은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 재조합 항체이다.
일부 구현예에서, 단일클론 항체는 쥣과 항체, 키메라 항체, 인간화 항체의 재조합 항체, 또는 이의 항원-결합 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 인간화 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 경쇄 및 중쇄 FR 영역 서열은 각각 인간 생식세포(germline) 경쇄 및 중쇄, 또는 이의 돌연변이된 서열로부터 유래된다.
단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 인간화 항체는 서열번호 49, 57, 63, 69 또는 75의 중쇄 가변 영역, 또는 이의 변이체를 포함하고; 변이체는 서열번호 49, 57, 63, 69 또는 75에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역에 1 내지 10개의 아미노산 돌연변이를 갖는다.
단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 변이체는 서열번호 49, 57, 63, 69 또는 75에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역의 FR 영역에 1 내지 10개의 아미노산 역돌연변이(back mutation)를 가지고; 바람직하게는, 역돌연변이는 서열번호 49의 중쇄 가변 영역의 S49T, V93T 및 K98S, 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 역돌연변이는 서열번호 57의 중쇄 가변 영역의 S49T, V93T 및 K98T, 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 역돌연변이는 서열번호 63의 중쇄 가변 영역의 R38K, M48I, R67K, V68A, M70L, R72V, T74K 및 L83F, 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 역돌연변이는 서열번호 69의 중쇄 가변 영역의 F29I, R38K, V48I, R72A, T97F 및 N55V, 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 역돌연변이는 서열번호 75의 중쇄 가변 영역의 R38K, M48I, R67K, V68A, R72A, T74K, M81L, L83F 및 D89E, 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 인간화 항체는 서열번호 50 또는 51의 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 58 또는 59의 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 64, 65 및 66 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 70 또는 71의 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 76 내지 79 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 인간화 항체는 서열번호 46, 54, 60, 67 또는 72의 경쇄 가변 영역, 또는 이의 변이체를 포함하고; 변이체는 서열번호 46, 54, 60, 67 또는 72에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역에 1 내지 10개의 아미노산 변화를 갖는다.
단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 변이체는 서열번호 46, 54, 60, 67 또는 72에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역의 FR 영역에 1 내지 10개의 아미노산 역돌연변이를 가지고; 바람직하게는, 역돌연변이는 서열번호 46의 경쇄 가변 영역의 A43S, L47V, G66R, T69S, F71Y 및 Y87F 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나; 또는 역돌연변이는 서열번호 54의 경쇄 가변 영역의 A43S, L47M, F71Y 및 Y87F 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나; 또는 역돌연변이는 서열번호 60의 경쇄 가변 영역의 E1D, I2T, I57V, V84T 및 Y86F 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나; 또는 역돌연변이는 서열번호 67의 경쇄 가변 영역의 M4L, A42S, L45P 및 L46W 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나; 또는 역돌연변이는 서열번호 72의 경쇄 가변 영역의 A43S, I48V 및 F71Y 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 인간화 항체는 서열번호 47 또는 48의 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는 서열번호 55 또는 56의 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는 서열번호 61 또는 62의 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는 서열번호 68의 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는 서열번호 73 또는 74의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 인간화 항체는
서열번호 49 내지 51 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 46 내지 48 중 어느 하나로부터 선택되는 경쇄 가변 영역; 또는
서열번호 57 내지 59 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 54 내지 56 중 어느 하나로부터 선택되는 경쇄 가변 영역; 또는
서열번호 63 내지 66 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 60 내지 62 중 어느 하나로부터 선택되는 경쇄 가변 영역; 또는
서열번호 69 내지 71 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 67 또는 68 중 어느 하나로부터 선택되는 경쇄 가변 영역; 또는
서열번호 75 내지 79 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 72 내지 74 중 어느 하나로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 일부 구현예에서, 항체는 전장 항체이고, 인간 불변 영역을 더 포함하며, 여기에서 중쇄 불변 영역은 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 항체의 중쇄 불변 영역이다. 더욱 바람직하게는, 전장 항체는 서열번호 52에 기재된 바와 같은 인간 항체 중쇄 불변 영역 및 서열번호 53에 기재된 바와 같은 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab') 2, 단일 사슬 항체(scFv), 이량체화된 V 영역(다이어바디), 이황화 안정화 V 영역(dsFv), 및 CDR 포함 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또한, 본 개시는 위에 기술된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 인간 IL-5에 대한 결합을 두고 경쟁하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
또한, 본 개시는 치료학적 유효량의 본 개시에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 완충제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물의 단위 용량에 함유되는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양은 바람직하게는 0.1 내지 2000 mg, 더욱 바람직하게는 1 내지 1000 mg이다.
또한, 본 개시는 본 개시에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 개시는 위에 기술된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 개시는 본 개시에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하며, 숙주 세포는 원핵생물 세포 및 진핵생물 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 진핵생물 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포이다.
또한, 본 개시는 본 개시에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법을 제공하며, 방법은 배양물에서 위의 숙주 세포를 배양하여 위의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 형성하고 축적하는 단계, 및 배양물로부터 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함한다.
또한, 본 개시는 인간 IL-5의 검출 또는 결정 방법을 제공하며, 방법은 위의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용하는 단계를 포함한다.
또한, 본 개시는 인간 IL-5의 검출 또는 결정을 위한 작용제(agent)를 제공하며, 이는 위의 어느 하나에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
또한, 본 개시는 인간 IL-5와 관련된 질환에 대한 진단제를 제공하며, 진단제는 위의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
또한, 본 개시는 인간 IL-5와 관련된 질환의 진단 방법을 제공하며, 방법은 위의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용하여 인간 IL-5 또는 IL-5 양성 세포를 검출 또는 결정하는 단계를 포함한다.
또한, 본 개시는 인간 IL-5와 관련된 질환에 대한 진단제의 제조를 위한 위의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.
또한, 본 개시는 위의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하거나, 또는 위의 약학 조성물을 포함하거나, 또는 위의 핵산 분자를 포함하는, 인간 IL-5와 관련된 질환의 치료를 위한 약제(medicament)를 제공한다.
또한, 본 개시는 인간 IL-5와 관련된 질환의 치료 방법을 제공하며, 방법은 대상체에게 약학적 유효량의 위의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 이를 포함하는 약학 조성물, 또는 위의 핵산 분자를 투여하여 인간 IL-5와 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 단계를 포함한다.
또한, 본 개시는 인간 IL-5와 관련된 질환의 치료제 제조를 위한 위의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 이를 포함하는 약학 조성물, 또는 위의 핵산 분자의 용도를 제공한다.
위의 질환 또는 상태는 바람직하게는 천식(asthma), 천식의 악성 발작(malignant attack), 만성 폐렴(chronic pneumonia), 알레르기 비염(allergic rhinitis), 알레르기 기관지폐 아스페르길루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis), 호산구증가증(eosinophilia), 처그 스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 회선사상충증 피부염(onchocerciasis dermatitis), 간헐적 혈관부종(intermittent angioedema), 호산구성 근육통증 증후군(eosinophilic myalgia syndrome), 호산구성 위장관염(eosinophilic gastroenteritis), 연충 감염(helminth infection), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비용종(nasal polyps), 레플러 증후군(Loeffler's syndrome), 두드러기(urticaria), 호산구 과다형성 기관지염(eosinophil hyperplastic bronchitis), 결절 동맥염(nodular arteritis), 동염(sinusitis), 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis), 알레르기 호산구성 식도염(allergic eosinophilic esophagitis), 알레르기 결막염(allergic conjunctivitis), 회선사상충증 피부염(onchocerciasis dermatitis), 자궁내막증(endometriosis) 및 스테로이드 의존성 호산구성 기관지염(steroid dependent eosinophilic bronchitis)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 개시의 IL-5 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편은 IL-5와 높은 특이성 및 높은 친화도를 갖는다. 인간화 항체는 크게 감소된 면역원성을 가지며, 쥣과 항체로부터의 특이성을 완전히 보유하며, 시험관 내 및 생체 내에서 높은 친화도 및 우수한 활성을 나타낸다.
본 개시의 IL-5 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편은 단지 IL5를 특이적으로 인식하기 위한 양호한 선택성을 갖는다.
본 개시의 IL-5 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편은 랫트에서 양호한 대사역학적(metabolic dynamic) 특성을 가지며, 긴 반감기와 높은 생체이용률을 나타낸다.
본 개시의 IL-5 인간화 항체 분자는 양호한 장기적 안정성을 가지며, 높은 농도, 높은 순도 및 열 안정성에서 명백한 비정상적인 화학적 변형, 명백한 응집을 나타내지 않는다.
호산구의 증식을 감소시키는 것 이외에도, 본 개시의 IL-5 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편은 폐 기능을 개선하는 데 있어서 양호한 특성을 갖는다.
1. 용어
본 개시를 더욱 쉽게 이해하기 위하여, 특정 기술 및 과학 용어를 아래에서 구체적으로 정의한다. 본원에서 달리 명시적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 다른 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본 개시에서 사용된 아미노산에 대한 3문자 코드 및 1문자 코드는 J. biol. chem, 243, p3558 (1968)에 기술된 바와 같다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체(antibody)"는 두 개의 동일한 중쇄 및 동일한 두 개의 경쇄 사이의 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 네 개 펩티드 사슬 구조인 면역글로불린을 지칭한다. 상이한 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 상이한 아미노산 조성 및 순위 배열(rank order)를 나타내며, 따라서 상이한 항원성을 나타낸다. 따라서, 면역글로불린은 다섯 개의 유형으로 나뉘어질 수 있거나 또는 면역글로불린 아이소타입, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 지칭될 수 있으며, 각각 중쇄 μ, δ, γ, α 및 ε을 함유한다. 이의 힌지 영역의 아미노산 조성 및 중쇄 이황화 결합의 수와 위치에 따라, 동일 유형의 Ig는 상이한 아형으로 더 나뉘어질 수 있다. 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 나눌 수 있다. 경쇄는 상이한 불변 영역을 기초로 하여 κ 또는 λ 사슬로 나뉘어질 수 있다. Ig의 다섯 개 유형 각각은 κ 또는 λ 사슬을 가질 수 있다.
본 개시에서, 본 개시에서 언급된 항체 경쇄는 경쇄 불변 영역을 더 포함하고, 이는 인간 또는 쥣과 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체를 포함한다.
본 개시에서, 본 개시에서 언급된 항체 중쇄는 중쇄 불변 영역을 더 포함하고, 이는 인간 또는 쥣과 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체를 포함한다.
항체 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 인접한 약 110개 아미노산 서열은 매우 가변적이며, 가변 영역(Fv 영역)으로 알려져 있으며; C 말단에 가까운 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정하며, 불변 영역으로 알려져 있다. 가변 영역은 세 개의 초가변 영역(HVR) 및 네 개의 상대적으로 보존적인 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 항체의 특이성을 결정하는 세 개의 초가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로도 알려져 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 각각의 중쇄 가변 영역(HCVR)은 세 개의 CDR 영역 및 네 개의 FR 영역으로 구성되며, 순차적인 순서는 아미노 말단에서 카복시 말단으로 다음의 순서이다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 경쇄의 세 개의 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 지칭하고, 중쇄의 세 개의 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 지칭한다. 본원에서 항체 또는 항원 결합 단편의 LCVR 및 HCVR 영역의 CDR 아미노산 잔기의 수 및 위치는 공지된 Kabat 넘버링 기준을 따른다(LCDR1~3, HCDR1~3).
본 개시의 항체는 쥣과 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체를 포함하며, 바람직하게는 인간화 항체이다.
본 개시의 용어 "쥣과 항체(murine antibody)"는 당해 분야의 지식 및 기술에 따라 제조된 항-인간 IL-5 단일클론 항체를 지칭한다. 제조하는 동안, 시험 대상체에 IL-5 항원이 주사될 수 있으며, 그 후 원하는 서열 또는 기능적 특징을 보유하는 항체를 발현하는 하이브리도마가 단리된다. 본 개시의 바람직한 구현예에서, 쥣과 IL-5 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 쥣과 κ, λ 사슬의 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 더 포함하거나, 또는 쥣과 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 더 포함한다.
용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 쥣과 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합하여 형성된 항체이며, 키메라 항체는 쥣과의 항체-유도성 면역 반응을 완화시킬 수 있다. 키메라 항체를 확립하기 위하여, 특정 쥣과 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마가 확립될 수 있으며, 가변 영역 유전자는 쥣과 하이브리도마로부터 클로닝된다. 그 후, 인간 항체의 원하는 불변 영역 유전자가 클로닝될 수 있고, 쥣과의 가변 영역 유전자와 연결되어 이후에 발현 벡터 내로 삽입될 수 있는 키메라 유전자를 형성할 수 있다. 마지막으로, 키메라 항체 분자는 진핵생물 또는 원핵생물 시스템에서 발현될 것이다. 본 개시의 바람직한 구현예에서, IL-5 키메라 항체의 경쇄는 인간 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체로부터 유래되는 경쇄 불변 영역을 더 포함한다. IL-5 키메라 항체의 중쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체로부터 유래되는 중쇄 불변 영역을 더 포함하고, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래되는 중쇄 불변 영역을 포함하거나, 또는 YTE 돌연변이 또는 역돌연변이와 같은 아미노산 돌연변이를 갖는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄 불변 영역 변이체를 포함한다.
용어 "인간화 항체(humanized antibody)"는 인간 항체 가변 영역 프레임워크 내로 쥣과 CDR 서열을 이식하여 생성된 항체, 즉 상이한 유형의 인간 생식세포 항체 프레임워크 서열에서 생성된 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 키메라 항체에 의해 전달되는 대다수의 쥣과 단백질 성분에 의해 유도되는 이종성 반응을 극복할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열은 생식세포 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식세포 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식세포 서열 데이터베이스(웹 www.mrccpe.com.ac.uk/vbase에서 이용 가능함) 및 문헌[Kabat, EA, et. al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.]에서 찾아볼 수 있다. 감소된 면역원성으로 인한 활성의 감소를 피하기 위하여, 인간 항체의 가변 영역의 프레임워크 서열은 활성을 유지하기 위하여 최소한의 복귀돌연변이(reverse mutation) 또는 역돌연변이(back mutation)를 거치게 될 수 있다. 또한, 본 개시의 인간화 항체는 CDR 친화도 성숙이 파지 디스플레이에 의해 수행되는 인간화 항체를 포함한다. 본 개시의 바람직한 구현예에서, IL-5 인간화 항체의 CDR 서열은 서열번호 16 내지 21, 22 내지 27, 28 내지 33, 34 내지 39 및 40 내지 45로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 항체 중쇄 가변 영역의 FR 영역 서열이 인간 생식세포 중쇄 서열 및 인간 생식세포 경쇄 서열로부터 유래되는 인간 항체 가변 영역 프레임워크가 설계되고, 선택된다. 감소된 면역원성으로 인한 활성의 감소를 피하기 위하여, 인간 항체 가변 영역은 활성을 유지하기 위하여 최소한의 복귀돌연변이(역돌연변이, 즉 인간 항체로부터 유래되는 FR 영역 아미노산 잔기가 본래의 항체에 상응하는 아미노산 잔기로 교체됨)를 거치게 될 수 있다.
CDR의 이식(graft)은 항원과 접촉된 프레임워크 잔기의 변화로 인해, 생성된 IL-5 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 항원에 대한 친화도의 감소를 초래할 수 있다. 이러한 상호 작용은 높은 체세포 돌연변이의 결과일 수 있다. 따라서, 여전히 공여자(donor) 프레임워크 아미노산을 인간화 항체 프레임워크로 옮길 필요성이 있을 수 있다. 항원 결합에 관여하는 비인간 IL-5 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 유래되는 아미노산 잔기는 쥣과 단일클론 항체 가변 영역의 서열 및 구조를 체크함으로써 확인될 수 있다. 생식세포의 것과는 상이한 공여자 CDR 프레임워크의 아미노산 잔기는 관련된 것으로 간주될 수 있다. 가장 밀접하게 관련된 생식세포를 결정할 수 없는 경우, 서열은 아형 중에서 공유되는 공통 서열 또는 높은 유사성 백분율을 갖는 쥣과 서열의 공통 서열과 비교될 수 있다. 희귀한 프레임워크 잔기는 체세포에서의 높은 돌연변이의 결과인 것으로 생각되며, 이는 결합에서 중요한 역할을 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항원-결합 단편(antigen-binding fragment)" 또는 "기능적 단편(functional fragment)"은 항원(예컨대, IL-5)에 대한 결합 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 전장 항체의 단편이 항원과의 결합 기능을 달성하는 데 사용될 수 있음이 밝혀진 바 있다. 용어 "항원 결합 단편"에서 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결되는 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 하나의 암(arm)의 항체의 VH 및 VL 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 단일 도메인 또는 dAb 단편(Ward et al. (1989) Nature341:544-546); 및 (vi) 개별적인 상보성 결정 영역(CDR) 및 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 연결되는 두 개 이상의 개별적인 CDR의 조합을 포함한다. 또한, Fv 단편의 VL 도메인과 VH 도메인이 두 개의 개별적인 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 합성 링커에 의해 연결될 수 있어, VL 및 VH 도메인을 쌍을 이루게 하여 형성된 1가 분자의 단일 단백질 사슬을 생성할 수 있다(단일 사슬 Fv(scFv)라 지칭됨; 예를 들어, Bird et al. (1988); Science 242: 423-426 및 Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA85:5879-5883 참조). 이 단일 사슬 항체는 용어 항체의 "항원 결합 단편"에도 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편은 당해 분야에 공지된 통상적인 기술을 이용하여 수득되며, 온전한 항체에 대한 것과 동일한 방법을 사용하여 기능적 단편에 대해 스크리닝된다. 항원 결합 부분은 재조합 DNA 기술 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 파괴에 의해 생산될 수 있다. 항체는 상이한 아이소타입, 예를 들어 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체의 형태로 존재할 수 있다.
본 개시의 항원-결합 단편은 Fab, F(ab’)2, Fab’, 단일 사슬 항체(scFv), 이량체화된 V 영역(다이어바디), 이황화 안정화된 V 영역(dsFv) 및 CDR 함유 펩티드를 포함한다.
Fab는 IgG 항체 분자를 파파인(H 사슬의 224번 위치의 아미노산 잔기를 절단함)으로 처리하여 얻어지는 항체 단편이다. Fab 단편은 약 50,000의 분자량을 갖고, 항원 결합 활성을 가지며, 여기에서 H 사슬의 N 말단측의 약 절반 및 전체 L 사슬이 이황화 결합을 통해 서로 결합된다.
본 개시의 Fab는 인간 IL-5를 특이적으로 인식하고, 세포 외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 본 발명의 단일클론 항체를 파파인으로 처리하여 생산될 수 있다. 또한, Fab는 항체의 Fab를 암호화하는 DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 Fab를 발현시킴으로써 생산될 수 있다.
F(ab')2는 분자량이 약 100,000이고 항원 결합 활성을 가지며 힌지 위치에 결합된 2개의 Fab 영역을 포함하는 항체 단편으로, F(ab')2는 IgG의 힌지 영역의 두 개의 이황화 결합의 하류 부분을 펩신으로 분해하여 수득된다.
본 개시의 F(ab')2는 인간 IL-5를 특이적으로 인식하고 세포 외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 본 개시의 단일클론 항체를 펩신으로 처리하여 생산될 수 있다. 또한, F(ab')2는 티오에테르 결합 또는 이황화 결합을 통해 아래에 기술된 Fab'를 결합시켜 생산될 수 있다.
Fab'는 분자량이 약 50,000이고 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. Fab'는 위의 F(ab')2의 힌지 영역에서 이황화 결합을 절단하여 수득된다. 본 개시의 Fab'는 IL-5를 특이적으로 인식하고 세포 외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 본 발명의 F(ab')2를 환원제, 예컨대 디티오트레이톨로 처리하여 생산될 수 있다.
또한, Fab'는 항체의 Fab' 단편을 암호화하는 DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 Fab'를 발현시킴으로써 생산될 수 있다.
용어 "단일 사슬 항체(single chain antibody)", "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 링커로 연결된 항체 중쇄 가변 도메인(또는 영역; VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인(또는 영역; VL)을 포함하는 분자를 지칭한다. 이러한 scFv 분자는 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH의 일반적인 구조를 갖는다. 선행 기술의 적합한 링커는 예를 들어, 1 내지 4 반복부를 갖는 변이체를 사용하여, 반복된 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체로 구성된다(Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). 본 개시에 사용될 수 있는 다른 링커는 문헌[Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al.(2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 및 Roovers et al. (2001), Cancer Immunol]에 기술되어 있다.
본 개시의 scFv는 다음 단계에 의해 생산될 수 있다: 인간 IL-5를 특이적으로 인식하고 세포 외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 본 개시의 단일클론 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계, scFv를 암호화하는 DNA를 구축하는 단계, DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하는 단계, 및 이후 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 scFv를 발현시키는 단계.
다이어바디는 scFv가 이량체화된 항체 단편으로, 2가의 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다. 2가의 항원 결합 활성에서, 두 개의 항원은 동일하거나 상이할 수 있다.
본 개시의 다이어바디는 다음 단계에 의해 생산될 수 있다: 인간 IL-5를 특이적으로 인식하고 세포 외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 본 개시의 단일클론 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계, 링커 펩티드의 길이가 8개 이하의 아미노산 잔기가 되도록 scFv를 암호화하는 DNA를 구축하는 단계, DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하는 단계, 및 이후 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 다이어바디를 발현시키는 단계.
dsFv는 VH와 VL 각각의 하나의 아미노산을 시스테인 잔기로 치환한 다음, 치환된 폴리펩티드를 두 개의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 통해 연결하여 수득된다. 시스테인 잔기로 치환되는 아미노산 잔기는 공지된 방법에 따라 항체의 3차원 구조 예측에 기초하여 선택될 수 있다(Protein Engineering, 7, 697 (1994)).
본 개시의 dsFv는 다음 단계에 의해 생산될 수 있다: 인간 IL-5를 특이적으로 인식하고 세포 외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 본 개시의 단일클론 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계, dsFv를 암호화하는 DNA를 구축하는 단계, DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하는 단계, 및 이후 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 dsFv를 발현시키는 단계.
CDR 함유 펩티드는 VH 및 VL의 CDR의 하나 이상의 영역에 의해 구축된다. 여러 CDR을 포함하는 펩티드는 직접 또는 적합한 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다.
본 개시의 CDR 함유 펩티드는 다음 단계에 의해 생산될 수 있다: 인간 IL-5를 특이적으로 인식하고 세포 외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 본 개시의 단일클론 항체의 VH 및 VL의 CDR을 암호화하는 DNA를 구축하는 단계, DNA를 원핵생물 발현 벡터 또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하는 단계, 및 이후 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하여 펩티드를 발현시키는 단계. 또한, CDR 함유 펩티드는 Fmoc 방법 또는 tBoc 방법과 같은 화학 합성 방법에 의해서도 생산될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항체 프레임워크(antibody frameework)"는 가변 도메인의 일부인 VL 또는 VH 둘 중 하나를 지칭하며, 이는 이 가변 도메인의 항원 결합 루프(CDR)에 대한 스캐폴드로서 작용한다. 본질적으로, 이는 CDR이 없는 가변 도메인이다.
용어 "아미노산 차이(amino acid difference)"는 폴리펩티드 및 이의 변이체 사이의 폴리펩티드 단편의 길이에 따른 하나 이상의 아미노산의 위치의 차이를 지칭하며, 변이체는 폴리펩티드 상의 하나 이상의 아미노산을 치환, 삽입 또는 결실시켜 수득될 수 있다.
용어 "에피토프(epitope)" 또는 "항원 결정기(antigenic determinant)"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부위(예를 들어, IL-5 분자의 특정 부위)를 지칭한다. 에피토프는 전형적으로 특유의 3차 입체 형태에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속적 또는 비연속적 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, ed. G. E. Morris (1996)] 참조.
용어 "특이적으로 결합하는" 또는 "선택적으로 결합하는"은 항원상의 소정의(predetermined) 에피토프에 대한 항체의 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 약 10-8 M 미만, 예를 들어 약 10-9 M 미만, 10-10 M 또는 10-11 M 또는 이하의 친화도(KD)로 결합한다.
용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호 작용에 대한 해리 평형 상수(dissociation equilibrium constant)를 지칭한다. 전형적으로, 본 개시의 항체는 예를 들어, 비아코어(BIACORE) 기기에서 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR)을 이용하여 결정된 바와 같이, 약 10-7 M 미만, 예컨대 약 10-8 M 미만, 10-9 M 또는 10-10 M 이하의 해리 평형 상수(KD)로 IL-5에 결합한다.
용어 "경쟁(competition)"이 동일한 에피토프를 두고 경쟁하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 중화 항원 결합 단백질 또는 중화 항체)의 맥락에서 사용될 때, 이는 항원 결합 단백질 사이에 경쟁이 일어남을 의미하며, 이는 다음의 분석법에 의해 결정된다: 시험될 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 면역학적 기능 단편)이 참조 항원 결합 단백질(예를 들어, 리간드 또는 참조 항체) 및 공통 항원(예를 들어, IL-5 항원 또는 이의 단편) 사이의 특이적인 결합을 방지 또는 억제(예를 들어, 감소)한다. 항원 결합 단백질이 또 다른 것과 경쟁하는지 여부를 결정하기 위하여 여러 유형의 경쟁적 결합 분석법을 이용할 수 있다. 이러한 분석법에는 예를 들어, 고체상 직접 또는 간접 방사성면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석법(enzyme immunoassay, EIA), 샌드위치 경쟁 분석법(예를 들어, 문헌[Stahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 문헌[Kirkland et al, 1986, J. Immunol. 137: 3614-3619] 참조), 고체상 직접 표지화 분석법, 고체상 직접 표지화 샌드위치 분석법(예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 이용한 고체상 직접 표지화 RIA(예를 들어, 문헌[Morel et al, 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 문헌[Cheung, et al, 1990, Virology 176: 546-552] 참조); 및 직접 표지화 RIA(Moldenhauer et al, 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82)가 있다. 전형적으로, 분석법은 시험될 표지되지 않은 항원 결합 단백질 및 표지된 참조 항원 결합 단백질 둘 다에 결합할 수 있는 (고체 표면 또는 세포 표면상의) 정제된 항원의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험될 항원 결합 단백질의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정함으로써 결정된다. 보통은, 시험될 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁적 분석법에 의해 확인되는(항원 결합 단백질과 경쟁하는) 항원 결합 단백질은 다음을 포함한다: 참조 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질; 및 참조 항원 결합 단백질이 결합하는 에피토프와 충분히 가까운 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질로서, 두 개의 에피토프가 서로 공간적으로 간섭하여 결합을 방해하는 항원 결합 단백질. 경쟁적 결합을 결정하는 방법과 관련한 추가의 세부적인 사항은 본원의 실시예에 제공된다. 전형적으로, 경쟁하는 항원 결합 단백질이 과량으로 존재할 때, 이는 참조 항원 결합 단백질과 공통 항원 사이의 특이적인 결합의 적어도 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75% 또는 75% 이상을 억제(예를 들어, 감소)할 것이다. 일부 경우에, 결합은 적어도 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 95 내지 97%, 또는 97% 이상 억제된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "핵산 분자(nucleic acid molecule)"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 지칭한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 위치될 때 "작동 가능하게 연결된다(operably linked)". 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 코딩 서열에 서열에 작동 가능하게 연결된다.
용어 "벡터(vector)"는 연결된 또 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일 구현예에서, 벡터는 "플라스미드(plasmid)"이며, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 연결될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기에서 추가의 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈 내로 연결될 수 있다. 본원에 기술된 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있거나(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 또는 에피솜 포유동물 벡터), 또는 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있으며, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다(예를 들어, 비 에피솜 포유동물 벡터).
항체 및 항원-결합 단편의 제조 및 정제 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, chapters 5-8 and 15]에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, 마우스는 인간 IL-5 또는 이의 단편으로 면역화될 수 있고, 그 후 생성된 항체는 당해 분야에 잘 알려져 있는 종래의 방법을 이용하여 복원되고, 정제되고, 아미노산 서열에 대해 서열분석될 수 있다. 또한, 항원-결합 단편은 종래의 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편은 비인간 항체로부터 유래되는 CDR에 하나 이상의 인간 FR 영역을 함유하도록 조작된다. 인간 FR 생식세포 서열은 인간 항체 가변 생식세포 유전자 데이터베이스 및 ImMunoGeneTics(IMGT)의 웹사이트 http://imgt.cines.fr 또는 문헌[The Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351]을 통해 MOE 소프트웨어를 정렬시켜 얻을 수 있다.
용어 "숙주 세포(host cell)"는 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 미생물(예를 들어, 박테리아), 식물 또는 동물 세포를 포함할 수 있다. 형질전환되기 쉬운 박테리아는 장내세균과(enterobacteriaceae)의 구성원, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella) 균주; 간균과(Bacillaceae), 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 폐렴구균(Pneumococcus); 연쇄구균(Streptococcus) 및 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)를 포함한다. 적합한 미생물은 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다. 적합한 동물 숙주 세포주는 CHO(Chinese hamster ovary cell line, 중국 햄스터 난소 세포주), HEK 세포(비제한적인 예로서, HEK293E 세포) 및 NS0 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 개시의 조작된 항체 또는 항원 결합 단편은 공지된 방법을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열이 클로닝되어 GS 발현 벡터 내로 조작될 수 있다. 그런 다음, 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 CHO 세포에 안정하게 형질감염될 수 있다. 당해 분야에 잘 알려진 더욱 권장되는 방법으로서, 포유동물 발현 시스템은 전형적으로 Fc 영역의 고도로 보존된 N 말단 부위에서 항체의 글리코실화를 초래할 것이다. 인간 IL-5에 특이적으로 결합하는 항체의 발현에 대해 안정적인 클론이 확인될 수 있다. 양성 클론은 항체 생산을 위하여 생물 반응기에서 무혈청 배양 배지에서 확장될 수 있다. 항체가 분비된 배양 배지는 종래의 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 조정 완충액으로 평형화시킨 단백질 A 또는 G 세파로스 FF 컬럼 상에서 정제가 수행될 수 있다. 컬럼을 세척하여 비특이적 결합 성분을 제거한 다음, 결합된 항체를 pH 구배에 의해 용리시키고, 항체 분획을 SDS-PAGE로 검출한 다음, 수집한다. 일반 기술을 이용하여 항체를 여과하고 농축할 수 있다. 가용성 혼합물 및 다량체는 크기 배제 또는 이온 교환과 같은 일반 기술에 의해 제거될 수 있다. 그 후, 생성된 생성물은 즉시 예를 들어 -70℃에서 냉동시키거나, 동결건조시킬 수 있다.
동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때 "투여(administration)", "투여하는(administering)" 또는 "치료(treatment)"는 외인성 약제, 치료제, 진단제 또는 조성물을 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체와 접촉시키는 것을 지칭한다. "투여", "투여하는" 또는 "치료"는 예를 들어, 치료적, 약물동태학적, 진단적, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 처리(treatment)는 시약을 세포와 접촉시키는 것뿐만 아니라, 유체가 세포와 접촉하고 있는 경우 시약을 유체와 접촉시키는 것도 포함한다. "투여", "투여하는" 또는 "치료"는 또한 시약, 진단제, 결합 조성물과, 또는 또 다른 세포와 함께, 세포를 시험관 내(in vivo) 및 생체 외(ex vivo) 처리하는 것을 의미한다. "치료"는, 인간, 수의학, 또는 연구 대상에 적용되는 바와 같이, 연구 및 진단적 응용에 대한 치료적 처치, 예방적 또는 방지적 조치를 지칭한다.
"치료하다(treat)"는 작용제(agent)가 공지된 치료적 활성을 갖는 하나 이상의 질환 증상을 갖는 환자에게 체내로 또는 체외로의 치료제, 예컨대 본 개시의 임의의 항체 또는 이의 단편을 함유하는 조성물의 투여를 의미한다. 전형적으로, 작용제는 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도로 이러한 증상의 퇴행(regression)을 유도하거나 이러한 증상의 진행을 억제함으로써, 치료될 환자 또는 집단에서 하나 이상의 질환 증상을 완화시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 임의의 특정 질환 증상을 완화시키기에 효과적인 치료제의 양("치료학적 유효량"으로도 지칭됨)은 인자, 예컨대 환자의 질환 상태, 연령 및 체중, 그리고 약물이 환자에서 원하는 반응을 이끌어내는 능력에 따라 다를 수 있다. 질환 증상이 완화되었는지는 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의료진 또는 다른 숙련된 보건의료 제공자가 전형적으로 사용하는 임의의 임상적 측정법에 의해 평가될 수 있다. 본 개시의 구현예(예를 들어, 치료 방법 또는 제조 물품)가 모든 환자에서 대상 질병 증상을 완화시키는 데 효과적이지 않을 수 있지만, 스튜던트 t 검정, 카이 제곱 검정, 맨-휘트니에 따른 U 검정, 크루스칼 왈리스 검정(H 검정), 존키어-테르프스트라 검정 및 윌콕슨 검정과 같은 당해 분야에 공지된 임의의 통계적 검정에 의해 결정되는 바와 같이, 통계적으로 유의미한 수의 환자에서 대상 질병 증상을 완화시켜야 한다.
"보존적 변형(conservative modification)" 또는 "보존적 치환(consesrvative substitution)"은 유사한 특징(예를 들어, 전하, 곁사슬 크기, 소수성/친수성, 백본 구조 및 강직도 등)을 갖는 다른 아미노산으로 단백질의 아미노산을 치환하는 것을 지칭하며, 그 결과 단백질의 생물학적 활성을 바꾸지 않고 변경이 빈번하게 이루어질 수 있다. 당업자는 일반적으로 폴리펩티드의 비필수 영역에서의 단일 아미노산 치환은 실질적으로 생물학적 활성을 바꾸지 않음을 인식하고 있다(예를 들어, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed) 참조). 또한, 구조적으로나 기능적으로 유사한 아미노산으로의 치환은 생물학적 활성을 파괴할 가능성이 낮다.
"유효량(effective amount)"은 의학적 상태의 증상 또는 징후를 완화시키거나 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 유효량은 또한 진단을 가능하게 하거나 용이하게 하기에 충분한 양을 의미한다. 특정 환자 또는 수의 대상체에 대한 유효량은 인자, 예컨대 치료될 상태, 환자의 전반적인 건강 상태, 투여 경로 및 용량 및 부작용의 중증도에 따라 다를 수 있다. 유효량은 현저한 부작용 또는 독성 효과를 피하는 최대한의 용량 또는 투여 프로토콜일 수 있다.
"외인성(exogenous)"은 문맥에 따라 유기체, 세포, 또는 인체 외부에서 생산되는 물질을 지칭한다. "내인성(endogenous)"은 문맥에 따라 세포, 유기체, 또는 인체 내부에서 생산되는 물질을 지칭한다.
"상동성(homology)"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이 또는 두 개의 폴리펩티드 서열 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 두 개의 비교되는 서열 둘 다에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어 두 개의 DNA 분자 각각에서의 위치가 아데닌에 의해 점유될 때, 이 분자는 그 위치에서 상동이다. 두 서열 사이의 상동성의 퍼센트(%)는 두 서열에 의해 공유되는 일치하거나 상동인 위치의 수를 비교될 위치의 수로 나눈 다음, 100을 곱한 값의 함수이다. 예를 들어, 서열이 최적으로 정렬될 때 두 서열에서 10개의 위치 중 6개가 일치하거나 상동인 경우, 두 서열은 60%의 상동성을 가지고; 두 서열에서 100개의 위치 중 95개가 일치하거나 상동인 경우, 두 서열은 95% 상동성을 갖는다. 일반적으로, 두 서열이 최대 상동성(%)을 제공하도록 정렬될 때 비교가 이루어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 표현 "세포(cell)", "세포주(cell line)" 및 "세포 배양물(cell culture)"은 상호 교환적으로 사용되며, 이러한 모든 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체(transformant)" 및 "형질전환된 세포(transformed cell)"는 일차 대상 세포 및 이로부터 유래되는 배양물을 계대 수와 상관 없이 포함한다. 또한, 모든 자손은 고의적 또는 비고의적 돌연변이로 인하여 DNA 내용물에서 정확하게 동일하지 않을 수 있음을 이해하여야 한다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝되는 바와 같은 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 구별되는 명칭이 의도되는 경우, 문맥으로부터 명백히 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)" 또는 "PCR"은 핵산, RNA 및/또는 DNA의 극미량의 특정 부분이 예를 들어, 미국 특허 제4,683,195호에 기술된 바와 같이 증폭되는 절차 또는 기법을 지칭한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 설계될 수 있도록, 관심 영역의 말단에 대한 서열 정보 또는 관심 영역을 이외에 대한 서열 정보를 이용할 수 있어야 하며; 이들 프라이머는 증폭될 주형의 반대 가닥과 서열이 동일하거나 유사할 것이다. 두 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭될 물질의 말단과 일치한다. PCR은 특정 RNA 서열, 전체 게놈 DNA로부터의 특정 DNA 서열, 및 전체 세포 RNA로부터 전사된 cDNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 문헌[Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263]; [Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.)] 참조. 본 개시에 사용되는 PCR 시험은 핵산 시료를 증폭시키기 위한 하나의, 그러나 유일하지는 않은, 중합효소 반응 방법의 예로 간주된다. 이 방법은 핵산의 특정 부분을 증폭시키거나 생성하기 위하여 프라이머 및 핵산 중합효소로서 공지된 핵산 서열을 사용하는 것을 포함한다.
"선택적(optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"는 뒤따르는 사건 또는 상황이 발생할 수 있지만, 반드시 그러하지는 않음을 의미하며, 설명은 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, "선택적으로 1 내지 3개의 항체 중쇄 가변 영역을 함유한다"는 특정 서열의 항체 중쇄 가변 영역이 존재할 수 있으나, 반드시 존재할 필요는 없음을 의미한다.
"약학 조성물(pharmaceutical composition)"은 본 개시에 따른 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적/약학적으로 허용 가능한 염 또는 전구약물 및 다른 화학적 성분, 예컨대 생리학적/약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제를 함유하는 혼합물을 지칭한다. 약학 조성물은 유기체에 대한 투여를 촉진하고, 활성 성분의 흡수를 용이하게 하여 생물학적 효과를 발휘하는 것을 목표로 한다.
나아가, 본 개시는 IL-5와 관련된 질환의 치료를 위한 작용제를 포함하며, 작용제는 활성 성분으로서 본 개시의 단일클론 항체 또는 이의 항체 단편을 포함한다.
IL-5와 관련된 질환은 이들이 IL-5와 관련이 있는 한 제한이 없다. 예를 들어, 본 개시의 분자에 의해 유도되는 치료적 반응은 인간 IL-5에 대하여 결합하고 그 결과로서 호산구 유도성 자극을 억압 또는 억제함으로써 발생될 수 있다. 따라서, 치료적 용도에 적합한 제제 및 제형으로 존재할 때, 본 개시의 분자는 알레르기 및/또는 아토피성 반응 또는 호산구 관련 반응, 예를 들어 천식, 천식 악화, 천식의 악성 발작, 만성 폐렴, 알레르기 비염, 연중 알레르기 비염, 알레르기 기관지폐 아스페르길루스증, 호산구증가증, 처그 스트라우스 증후군, 아토피 피부염, 회선사상충증 피부염, 간헐적 혈관부종, 호산구성 근육통증 증후군, 호산구성 위장관염, 연충 감염, 호지킨병, 비용종, 레플러 증후군, 두드러기, 호산구 과다형성 기관지염, 결절 동맥염, 동염, 호산구성 식도염, 알레르기 호산구성 식도염, 알레르기 결막염, 회선사상충증 피부염, 자궁내막증 및 스테로이드 의존성 호산구성 기관지염 등(그러나 이에 한정되지 않음)을 앓고 있는 개체에게 매우 유용하다. 바람직한 구현예에서, 이러한 치료는 폐 조직에서 침윤하는 호산구를 억제 또는 감소시킨다. 항체 또는 이의 단편은 1일 3회부터 6개월마다 1회까지 투여될 수 있고, 정맥 내, 피하, 근육 내, 비경구, 또는 국소 투여될 수 있다.
나아가, 본 개시는 IL-5의 면역검출 또는 면역분석 방법, IL-5의 면역검출 또는 면역분석법을 위한 시약, IL-5를 발현하는 세포의 면역검출 또는 면역분석법, 및 IL-5와 관련된 질환의 진단을 위한 진단제에 관한 것으로, 이는 활성 성분으로서 인간 IL-5를 특이적으로 인식하고 세포 외 영역의 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 본 개시의 단일클론 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
본 개시에서, IL-5의 양을 검출 또는 결정하는 방법은 당해 분야에 공지된 임의의 방법일 수 있다. 예를 들어, 이는 면역검출 또는 면역분석법을 포함한다.
면역검출 또는 면역분석법은 표지된 항원 또는 항체를 이용함으로써 항체 또는 항원의 양을 검출 또는 결정하는 방법이다. 면역검출 또는 면역분석법의 예는 방사성 물질 표지화 면역학적 항체 방법(RIA), 효소 면역분석법(EIA 또는 ELISA), 형광 면역분석법(FIA), 발광 면역분석법, 웨스턴 블롯팅, 물리화학적 분석법 등을 포함한다.
위의 IL-5와 관련된 질환은 본 개시의 단일클론 항체 또는 항체 단편을 이용하여 IL-5를 발현하는 세포를 검출 또는 결정하여 진단할 수 있다.
폴리펩티드를 발현하는 세포를 검출하기 위하여, 공지된 면역분석법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 면역침전법, 형광 세포 염색법, 면역조직화학적 염색법 등이 사용된다. 나아가, FMAT8100HTS 시스템(Applied Biosystem)을 이용한 형광 항체 염색 방법 등을 사용할 수 있다.
본 개시에서, IL-5를 검출 또는 결정하기 위하여 사용되는 살아있는 샘플은 그것이 IL-5를 발현하는 세포를 함유할 가능성이 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 조직 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 췌장액, 소변, 대변, 조직액 또는 배양 배지를 사용할 수 있다.
본 개시의 단일클론 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 진단제는 원하는 진단 방법에 따라, 항원-항체 반응의 수행을 위한 작용제 또는 반응의 검출을 위한 작용제를 더 포함할 수 있다. 항원-항체 반응의 수행을 위한 작용제는 예컨대, 완충제 및 염을 포함한다. 반응 검출을 위한 작용제는 면역검출 또는 면역분석 방법에서 일반적으로 사용되는 시약, 예를 들어 예컨대 단일클론 항체, 이의 항체 단편 또는 이를 포함하는 접합체를 인식하는 표지화된 2차 항체, 및 표지에 상응하는 기질을 포함한다.
도 1: IL-5 항체는 FACS 실험에서 IL-5 수용체에 대한 IL-5의 결합을 차단한다.
도 2: Th2 사이토카인에 대한 IL-5 항체의 결합 특이성의 검출.
도 3: IL-5 항체는 호흡 간헐적 수치(respiratory intermittent value, Penh)를 증진시킨다. G1: 정상 대조군(PBS); G2: 모델군(IgG); G3: h1705-008 항체 10 mpk 군; G4: h1705-008 항체 2 mpk 군; G5: h1706-009 항체 10 mpk 군; G6: h1706-009 항체 2 mpk 군; G7: Hu39D10 10 mpk 군; *p<0.05, **<0.01 (ANOVA/본페로니에 의해 G2 군과 비교함).
도 4a: 천식 마우스의 폐에서의 BALF 호산구의 수준. 도 4b: 천식 마우스의 기관 점막의 두께 점수. G1: 정상 대조군; G2: 모델군; G3: h1705-008 항체 10 mpk 군; G4: h1705-008 항체 2 mpk 군; G5: h1706-009 항체 10 mpk 군; G6: h1706-009 항체 2 mpk 군; G7: Hu39D10 10 mpk 군. 도 4c: 천식 마우스의 폐에서의 BALF 호산구의 백분율.
도 5a 및 도 5b는 BALF에서 호산구의 수준을 감소시키는 IL5 mAb의 능력을 보여준다.
실시예 및 시험예
다음 실시예는 본 개시를 더 설명하기 위하여 제공되는 것이나, 본 개시의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 특정 조건이 구체적으로 명시되지 않은 실험 방법은 통상의 조건(문헌[Molecular Cloning, Laboratory Manual of antibody technology, Cold Spring Harbor Laboratory] 참조)에 따라, 또는 물질 또는 제품의 제조사가 권고하는 조건에 따라 일반적으로 수행한다. 출처를 구체적으로 나타내지 않은 시약은 상업적으로 이용 가능한 시약이다.
실시예 1. IL-5 항원 및 검출용 단백질의 제조
IL-5 항원의 설계 및 발현
His 태그된 인간 IL-5, 레서스 원숭이 IL-5, 마우스 IL-5, 랫트 IL-5, 또는 인간 IgG1-Fc 단편에 융합된 인간 IL-5Rα 수용체 세포 외 도메인을 암호화하는 서열을 phr 벡터에 삽입하여 발현 플라스미드를 구축한 다음, 이를 HEK293에 형질감염시켰다. 형질감염 후 6일째에, 10분 동안 4500 rpm에서 샘플을 원심분리하고, 세포 상청액을 수집하였다. 재조합 IL-5 또는 IL-5α 수용체 단백질을 함유하는 상청액을 니켈 컬럼을 이용하여 정제하고, 재조합 인간 IL-5-Fc 융합 단백질을 단백질 A 친화도 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질은 다음 실시예에서 사용될 수 있다. 항원의 단백질 서열은 다음과 같이 표시된다:
1. his 태그된 인간 IL-5 아미노산 서열(rhIL-5-his)
Figure pct00001
서열번호 1
비고: 이탤릭체는 His6 태그를 나타낸다.
2. his 태그된 시노몰구스 원숭이 IL-5 아미노산 서열
Figure pct00002
서열번호 2
비고: 이탤릭체는 His6 태그를 나타낸다.
3. his 태그된 마우스 IL-5 아미노산 서열
Figure pct00003
서열번호 3
비고: 이탤릭체는 His6 태그를 나타낸다.
4. his 태그된 랫트 IL-5 아미노산 서열
Figure pct00004
서열번호 4
비고: 이탤릭체는 His6 태그를 나타낸다.
5. 인간 Fc 단편에 융합된 인간 IL-5α 수용체의 아미노산 서열
Figure pct00005
서열번호 5
비고: 이탤릭체는 인간 Fc 태그를 나타낸다.
실시예 2: 재조합 IL-5α 수용체 및 IL-5α/β 수용체 세포주의 구축 및 확인
기능적 항체를 스크리닝하기 위하여, 본 개시는 IL-5α를 발현하는 CHO-S/IL-5α 세포주 및 IL-5α 및 IL-5β 둘 다를 발현하는 CHO-S/IL-5α/IL-5β 세포주를 구축한다.
구체적으로, 전장 인간 IL-5α 유전자(Q01344)를 포유동물 세포 발현 벡터인 pTargeT에 클로닝하고, 선형화된 플라스미드를 전기천공법을 통해 CHO-S 세포로 형질감염시켰다. 2주 동안 G418 하에서 스크리닝을 수행한 다음, 2라운드의 한계 희석(limiting dilution)을 수행하였다. 세포 표면에 발현된 IL-5α 유전자를 FACS로 검출하고, 높은 발현 수준의 IL-5α를 나타내는 CHO-S/IL-5α 세포주를 선택하고, 선형화된 pcDNA3.1-IL-5β로 전기천공법을 통해 형질감염시켰다. 2주 동안 G418 및 제오신으로 스크리닝을 수행한 다음, 2라운드의 한계 희석을 수행하였다. 세포 표면에 발현된 IL-5α 및 IL-5β 유전자를 FACS로 검출하고, 높은 발현 수준의 IL-5α 및 IL-5β를 나타내는 CHO-S/IL-5α/IL-5β 세포주를 선택하였다.
실시예 3: 항-인간 IL-5 쥣과 단일클론 항체의 제조
2개 군의 Balb/c 마우스(5마리/군)와 4개 군의 SJL 마우스(5마리/군)를 각각 100 g/50 g/50 g(고용량 군) 및 25 g/12.5 g/12.5 g(저용량 군)의 두가지 투여량의 재조합 단백질 rhIL-5-his 및 프로인트 보강제 CFA(Sigma, Lot#SLBQ1109V); 또는 IFA(Sigma, Lot#SLBJ2845V)로 면역화시켰다. ELISA, 리간드-수용체 차단 분석법 및 TF-1 증식 억제 분석법에 의해 혈청 역가를 검출하여 IL-5에 대한 특이적인 면역 반응을 결정하였다. 더 나은 특이적인 면역 반응을 나타내는 마우스를 선택하여 희생시키고, 비장 세포를 수집하여 골수종 세포와 융합시켰다.
인간 IL-5에 대한 ELISA 결합 분석법을 이용하여 1차 스크리닝을 수행하였다. 하이브리도마 세포를 24웰 플레이트로 옮기고, IL-5 수용체에 대한 ELISA 기반의 차단 분석법 및 TF-1 증식 억제 분석법에 의해, 인간, 시노몰구스, 또는 마우스 IL-5에 대한 ELISA 결합 분석법에 의해 상청액을 재스크리닝하였다. 이러한 스크리닝 후, 수득된 양성 클론을 대상으로 2라운드의 서브클로닝을 수행하여 항체 생산을 위한 하이브리도마 클론을 수득하였다. 수득된 항체를 친화도 크로마토그래피로 정제하였다.
정제된 항체를 대상으로 다음 시험을 수행하였다: SEC-HPLC, 엔도톡신 함량 검출, 다양한 IL-5에 대한 친화도에 대한 비아코어 분석법, FACS 기반의 IL-5 수용체에 대한 차단 분석법, 및 TF-1 증식 억제 분석법, 호산구의 부착 시험, 및 마우스 천식 모델 및 생체 내 기니피그 중화 모델에서의 효능 평가. 단일클론 하이브리도마 세포주 mAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 및 mAb1779를 대상으로 시험관 내 및 생체 내에서의 이들의 우수한 활성에 대해 선택하였다.
서열을 다음과 같이 양성 하이브리도마로부터 클로닝하였다. 대수 성장기의 하이브리도마 세포를 수집하고, 제조사의 설명서 또는 키트에 따라 트리졸(Trizol, Invitrogen, 카탈로그 번호 15596-018)을 이용하여 RNA를 추출하고, PrimeScriptTM 역전사효소 키트(Takara, 카탈로그 번호 2680A)를 이용하여 역전사를 수행하였다. 역전사에 의해 수득된 cDNA를 마우스 Ig-프라이머 세트(Novagen, TB326 Rev. B 0503)를 이용하여 PCR 증폭시키고, 그에 따른 생성물을 서열분석하였다. mAb1705, mAb1706, mAb1780, mAb1773 및 mAb1779 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 DNA 서열에 상응하는 아미노산 서열을 수득하였다(VH/VL CDR의 아미노산 잔기를 결정하고, Kabat 넘버링 시스템에 의해 주석을 달았다):
mAb1705 쥣과 중쇄 가변 영역 서열
Figure pct00006
서열번호 6
mAb1705 쥣과 경쇄 가변 영역 서열
Figure pct00007
서열번호 7
mAb1706 쥣과 중쇄 가변 영역 서열
Figure pct00008
서열번호 8
mAb1706 쥣과 경쇄 가변 영역 서열
Figure pct00009
서열번호 9
mAb1780 쥣과 중쇄 가변 영역 서열
Figure pct00010
서열번호 10
mAb1780 쥣과 경쇄 가변 영역 서열
Figure pct00011
서열번호 11
mAb1773 쥣과 중쇄 가변 영역 서열
Figure pct00012
서열번호 12
mAb1773 쥣과 경쇄 가변 영역 서열
Figure pct00013
서열번호 13
mAb1779 쥣과 중쇄 가변 영역 서열
Figure pct00014
서열번호 14
mAb1779 쥣과 경쇄 가변 영역 서열
Figure pct00015
서열번호 15
각 항체의 경쇄 및 중쇄 CDR 서열을 표 1에 나타내었다.
[표 1]
각 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열
Figure pct00016
비아코어 분석의 활성 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
뮤린 항체의 시험관 내 활성
Figure pct00017
결과는 본 개시의 쥣과 항체가 항원에 대해 높은 친화도를 가짐을 보여준다.
실시예 4: IL-5 관련 재조합 단백질의 정제 및 하이브리도마 항체 및 재조합 항체의 정제
4.1 IL-5-Flag-His 재조합 단백질의 정제를 위한 단계:
샘플을 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거하고, 적절한 부피로 농축시켰다. NI-NTA 친화도 컬럼(QIAGEN, 카탈로그 번호 30721)을 PBS로 평형화시키고, 2 내지 5의 컬럼 부피로 세척하였다. 불순물이 없는 세포 발현 상청액을 컬럼에 로딩한 후, A280 판독값이 기준선으로 떨어질 때까지 컬럼을 PBS로 헹구었다. 그 후, 컬럼을 PBS로 헹구어 불순한 단백질을 제거하였다. 관심 단백질을 세척 완충액(이미다졸 20 mM) 및 이어서 용리 완충액(이미다졸 300 mM)으로 용리시키고, 용리된 피크를 수집하였다.
수집된 용리액을 이온 교환(Hiload 16/600 수퍼덱스 200 컬럼)에 의해 추가 정제하였다. 7.4의 pH를 보장하기 위하여 약 2의 컬럼 부피의 PBS로 컬럼을 평형화시켰다. 관심 단백질을 함유하는 용리 완충액을 농축하고, 컬럼에 로딩하여 후속 정제를 수행하였다. 샘플을 수집하고, SDS-PAGE 및 LC-MS에 의해 확인한 다음, 사용을 위하여 분취하였다.
4.2. 하이브리도마 발현 항체 및 Fc 융합 단백질의 정제
세포가 발현된 상청액 샘플을 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거한 다음, 단백질 G 컬럼을 이용하여 하이브리도마가 발현된 상청액을 정제하고, 단백질 A 컬럼을 이용하여 Fc 융합 단백질이 발현된 상청액을 정제하였다. A280 판독값이 기준선으로 떨어질 때까지 컬럼을 PBS로 헹구었다. 관심 단백질을 100 mM 아세트산(pH 3.0)으로 용리시키고, 1 M 트리스-HCl(pH 8.0)로 중화시켰다. 용리된 샘플을 적절히 농축하고, PBS로 사전평형화시킨 겔 크로마토그래피 수퍼덱스 200(GE)에 의해 추가 정제하였다. 응집체가 제거된 피크를 수집하고, 사용을 위하여 분취하였다.
실시예 5: 항-인간 IL-5 단일클론 항체의 인간화 설계
쥣과 항-인간 IL-5 단일클론 항체의 인간화는 당해 분야의 문헌에 개시된 바와 같이 수행하였다. 간략하게는, 쥣과 항체의 불변 영역을 인간 불변 영역으로 교체하고, 쥣과 항체의 CDR을 가장 높은 FR 상동성을 공유하는 인간 주형에 이식하고, 항체 입체형태를 유지하고 항원에 대한 항체의 결합에 영향을 미치는 데 주요한 효과를 나타내는 FR 영역의 일부 아미노산 잔기에 역돌연변이를 유발하였다.
IMGT 인간 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 생식세포 유전자 데이터베이스에 대해 정렬시킴으로써, mAb-1705, mAb-1706, mAb1780, mAb1773 및 mAb1779 항체의 아미노산 서열에 대해 높은 동일성을 갖는 인간 생식세포 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 각각 주형으로 선택하였다. 이들 쥣과 항체의 CDR을 상응하는 인간 유래 주형에 개별적으로 이식하여 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 가변 영역 서열을 형성하였다. 아미노산 잔기를 결정하고, Kabat 넘버링 시스템에 의해 주석을 달았다.
인간 FR 영역의 선택 및 주요 아미노산의 역돌연변이
수득된 쥣과 항체의 전형적인 VH/VL CDR 구조에 기초하여, 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH)의 상동성 서열을 인간 생식세포 데이터베이스로부터 선택하였다. 그에 따른 인간 생식세포 VL 및 VH 서열을 FR 상동성에 기반하여 높음에서 낮음으로 순위를 매기고, 가장 높은 FR 상동성을 갖는 생식세포 서열을 주형으로 선택하였다. 쥣과 항체의 CDR을 인간 주형에 이식하였다. 그 후, 소프트웨어를 사용하고 쥣과 항체의 3차원 구조에 기초하여, 내부에 매립된 잔기, CDR 영역과 직접 상호 작용하는 잔기, 및 VL 및 VH의 입체형태에 상당한 영향을 미치는 잔기에 역돌연변이를 유발하였다. 또한, 화학적으로 불안정한 아미노산 잔기를 최적화하여 최종 인간화 분자를 수득하였다.
5.1 하이브리도마 클론 mAb1705에 대한 인간화 프레임워크의 선택
h1705 VH의 주형으로 IGHV3-23*04를 선택하고, VL의 주형으로 IGKV1-12*01을 선택하였다. 쥣과 mAb1705의 CDR을 인간 주형에 이식하였다. 내부에 매립된 잔기 및 CDR 영역과 직접 상호 작용하는 잔기를 소프트웨어에 의해 발견하였고, 역돌연변이시켰다. 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 표 3에 나타낸 바와 같이 설계하였다.
[표 3]
h1705에 대한 주형 선택 및 역돌연변이의 설계
Figure pct00018
비고: "이식"은 쥣과 항체 CDR이 인간 생식세포 FR 영역 서열 내로 이식되었음을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 서열의 천연 서열 넘버링에 따라, A43S는 이식된 서열의 43번 위치의 A가 S로 역돌연변이되었음을 나타낸다.
[표 4]
h1705 인간화 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합
Figure pct00019
비고: 이 표는 다양한 변이체를 조합하여 얻어진 서열을 보여준다. 예를 들어, h1705-007은 인간화 쥣과 항체 h1705-007이 두 개의 변이체, 즉 경쇄 h1705_VL.1A 및 중쇄 h1705_VH.1A를 포함하는 것 등을 나타낸다.
인간화 항체 h1705의 가변 영역의 특정 서열은 다음과 같다:
> h1705_VL.1 (서열번호 46)
Figure pct00020
> h1705_VL.1A (서열번호 47)
Figure pct00021
> h1705_VL.1B (서열번호 48)
Figure pct00022
> h1705_VH.1 (서열번호 49)
Figure pct00023
> h1705_VH.1A (서열번호 50)
Figure pct00024
> h1705_VH.1B (서열번호 51)
Figure pct00025
위의 경쇄 가변 영역 각각을 서열번호 53에 기재된 바와 같은 경쇄 불변 영역과 조합하여 최종적인 온전한 경쇄 서열을 형성하였다. 각각의 중쇄 가변 영역을 서열번호 52에 기재된 바와 같은 중쇄 불변 영역과 조합하여 최종적인 중쇄 서열을 형성하였다.
인간화 항체 불변 영역 서열
> 중쇄 IgG1 불변 영역:
Figure pct00026
서열번호 52
비고: 밑줄친 문자는 설계된 M252Y, S254T 또는 T256E 돌연변이를 나타낸다.
>경쇄 카파 불변 영역:
Figure pct00027
서열번호 53
5.2 하이브리도마 클론 mAb1706에 대한 인간화 프레임워크의 선택
h1706 VH의 주형으로 IGHV3-23*04를 선택하고, VL의 주형으로 IGKV1-12*01을 선택하였다. 쥣과 mab1706의 CDR을 인간 주형에 이식하였다. 내부에 매립된 잔기 및 CDR 영역과 직접 상호 작용하는 잔기를 소프트웨어에 의해 발견하였고, 역돌연변이시켰다. 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 표 5에 나타낸 바와 같이 설계하였다.
[표 5]
h1706에 대한 주형 선택 및 역돌연변이의 설계
Figure pct00028
비고: "이식"은 쥣과 항체 CDR이 인간 생식세포 FR 영역 내로 이식되었음을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 서열의 천연 서열 넘버링에 따라, A43S는 이식된 서열의 43번 위치의 A가 S로 역돌연변이되었음을 나타낸다.
[표 6]
h1706 인간화 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합
Figure pct00029
인간화 항체 h1706의 가변 영역의 특정 서열은 다음과 같다:
> h1706_VL.1 (서열번호 54)
Figure pct00030
> h1706_VL.1A (서열번호 55)
Figure pct00031
> h1706_VL.1B (서열번호 56)
Figure pct00032
> h1706_VH.1 (서열번호 57)
Figure pct00033
> h1706_VH.1A (서열번호 58)
Figure pct00034
> h1706_VH.1B (서열번호 59)
Figure pct00035
위의 경쇄 가변 영역 각각을 서열번호 53에 기재된 바와 같은 경쇄 불변 영역과 조합하여 최종적인 온전한 경쇄 서열을 형성하였다. 각각의 중쇄 가변 영역을 서열번호 52에 기재된 바와 같은 중쇄 불변 영역과 조합하여 최종적인 중쇄 서열을 형성하였다.
5.3 하이브리도마 클론 mAb1780에 대한 인간화 프레임워크의 선택
h1780 VH의 주형으로 IGHV1-2*02를 선택하고, VL의 주형으로 IGKV3-11*01을 선택하였다. 쥣과 mAb1780의 CDR을 인간 주형에 이식하였다. 내부에 매립된 잔기 및 CDR 영역과 직접 상호 작용하는 잔기를 소프트웨어에 의해 발견하였고, 역돌연변이시켰다. 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 표 7에 나타낸 바와 같이 설계하였다.
[표 7]
h1780에 대한 주형 선택 및 역돌연변이의 설계
Figure pct00036
비고: "이식"은 쥣과 항체 CDR이 인간 생식세포 FR 영역 내로 이식되었음을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 서열의 천연 서열 넘버링에 따라, E1D는 이식된 서열의 1번 위치의 E가 D로 역돌연변이되었음을 나타낸다.
[표 8]
h1780 인간화 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합
Figure pct00037
인간화 항체 h1780의 가변 영역의 특정 서열은 다음과 같다:
> h1780_VL.1 (서열번호 60)
Figure pct00038
> h1780_VL.1A (서열번호 61)
Figure pct00039
> h1780_VL.1B (서열번호 62)
Figure pct00040
> h1780_VH.1 (서열번호 63)
Figure pct00041
> h1780_VH.1A (서열번호 64)
Figure pct00042
> h1780_VH.1B (서열번호 65)
Figure pct00043
> h1780_VH.1C (서열번호 66)
Figure pct00044
위의 경쇄 가변 영역 각각을 서열번호 53에 기재된 바와 같은 경쇄 불변 영역과 조합하여 최종적인 온전한 경쇄 서열을 형성하였다. 각각의 중쇄 가변 영역을 서열번호 52에 기재된 바와 같은 중쇄 불변 영역과 조합하여 최종적인 중쇄 서열을 형성하였다.
5.4 하이브리도마 클론 mAb1773에 대한 인간화 프레임워크의 선택
h1773 VH의 주형으로 IGHV3-73*01를 선택하고, VL의 주형으로 IGKV1-39*01을 선택하였다. 쥣과 mAb1773의 CDR을 인간 주형에 이식하였다. 내부에 매립된 잔기 및 CDR 영역과 직접 상호 작용하는 잔기를 소프트웨어에 의해 발견하였고, 역돌연변이시켰다. 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 표 9에 나타낸 바와 같이 설계하였다. 한편, CDR 영역의 이성질화된 부위를 제거하기 위하여, h1773의 HCDR2(RIDPANGDTK HGPKFQG)에 위치한 N을 V로 교체하여(즉, N55V) HCDR2 변이체(돌연변이된 HCDR2의 서열은 서열번호 82: RIDPAVGDTKHGPKFQG로 표시됨)를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 항체를 형성하였다.
[표 9]
h1773에 대한 주형 선택 및 역돌연변이의 설계
Figure pct00045
비고: "이식"은 쥣과 항체 CDR이 인간 생식세포 FR 영역 내로 이식되었음을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 서열의 천연 서열 넘버링에 따라 M4L는 이식된 서열의 4번 위치의 M이 L로 역돌연변이되었음을 나타낸다.
[표 10]
h1773 인간화 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합
Figure pct00046
인간화 항체 h1773의 가변 영역의 특정 서열은 다음과 같다:
> h1773_VL.1 (서열번호 67)
Figure pct00047
> h1773_VL.1A (서열번호 68)
Figure pct00048
> h1773_VH.1 (서열번호 69)
Figure pct00049
> h1773_VH.1A (서열번호 70)
Figure pct00050
> h1773_VH.1B (서열번호 71)
Figure pct00051
위의 경쇄 가변 영역 각각을 서열번호 53에 기재된 바와 같은 경쇄 불변 영역과 조합하여 최종적인 온전한 경쇄 서열을 형성하였다. 각각의 중쇄 가변 영역을 서열번호 52에 기재된 바와 같은 중쇄 불변 영역과 조합하여 최종적인 중쇄 서열을 형성하였다.
5.5 하이브리도마 클론 mAb1779에 대한 인간화 프레임워크의 선택
h1779 VH의 주형으로 IGHV1-2*02를 선택하고, VL의 주형으로 IGKV1-33*01을 선택하였다. 쥣과 h1779의 CDR을 인간 주형에 이식하였다. 내부에 매립된 잔기 및 CDR 영역과 직접 상호 작용하는 잔기를 소프트웨어에 의해 발견하였고, 역돌연변이시켰다. 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 표 11에 나타낸 바와 같이 설계하였다.
[표 11]
h1779에 대한 주형 선택 및 역돌연변이의 설계
Figure pct00052
비고: "이식"은 쥣과 항체 CDR이 인간 생식세포 FR 영역 내로 이식되었음을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 서열의 천연 서열 넘버링에 따라, A43S는 이식된 서열의 43번 위치의 A가 S로 역돌연변이되었음을 나타낸다.
설계된 인간화 분자를 표 12에 나타낸 바와 같이 다양한 분자에 조합하였다.
[표 12]
h1779 인간화 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합
Figure pct00053
인간화 항체 h1779의 가변 영역의 특정 서열은 다음과 같다:
> h1779_VL.1 (서열번호 72)
Figure pct00054
> h1779_VL.1A (서열번호 73)
Figure pct00055
> h1779_VL.1B (서열번호 74)
Figure pct00056
> h1779_VH.1 (서열번호 75)
Figure pct00057
> h1779_VH.1A (서열번호 76)
Figure pct00058
>h1779_VH.1B (서열번호 77)
Figure pct00059
>h1779_VH.1C (서열번호 78)
Figure pct00060
>h1779_VH.1D (서열번호 79)
Figure pct00061
위의 경쇄 가변 영역 각각을 서열번호 53에 기재된 바와 같은 경쇄 불변 영역과 조합하여 최종적인 온전한 경쇄 서열을 형성하였다. 각각의 중쇄 가변 영역을 서열번호 52에 기재된 바와 같은 중쇄 불변 영역과 조합하여 최종적인 중쇄 서열을 형성하였다.
한편, WO2012083370A1에 개시된 IL5에 대한 항체 Hu39D10을 본 개시에서 양성 대조군으로 사용하고, 이의 중쇄 및 경쇄 서열을 각각 서열번호 80 및 서열번호 81로 나타내었다.
Hu39D10의 중쇄 서열
Figure pct00062
서열번호 80
Hu39D10의 경쇄 서열
Figure pct00063
서열번호 81
실시예 6. 재조합 키메라 항체 및 인간화 항체의 제조
1. 재조합 키메라 항체의 분자 클로닝
하이브리도마 스크리닝에 의해 수득된 양성 항체 분자를 서열분석하여 가변 영역을 암호화하는 유전자 서열을 수득하였다. 설계된 서열을 기초로 하여 정방향 및 역방향 프라이머를 설계하고, 유전자 서열을 주형으로 사용하여 PCR을 통해 각 항체의 VH/VK 유전자 단편을 구축하였다. 그 후, VH/VK 유전자 단편을 대상으로 발현 벡터 pHr(신호 펩티드 및 hIgG1/h카파 불변 영역 유전자 (CH1-Fc/CL) 단편을 포함함)을 이용한 상동 재조합을 수행하여 재조합 키메라 항체 전장 발현 플라스미드 VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr를 구축하여 Ch1705, Ch1706, Ch1780, Ch1773 및 Ch1779의 다섯 개의 키메라 항체를 형성하였다.
2. 인간화 항체의 분자 클로닝
설계된 인간화 항체 서열에 대해 코돈 최적화를 수행하여 인간 코돈 선호도를 갖는 암호화 유전자 서열을 생성하였다. PCR 프라이머를 설계하여 각 항체의 VH/VK 유전자 단편을 구축한 다음, VH/VK 유전자 단편을 대상으로 발현 벡터 pHr(신호 펩티드 및 hIgG1/h카파 불변 영역 유전자 (CH1-Fc/CL) 단편을 포함함)을 이용한 상동 재조합을 수행하여 인간화 항체 전장 발현 플라스미드 VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr를 구축하였다.
3. 재조합 키메라 항체 및 인간화 항체의 발현 및 정제
항체 경쇄 또는 중쇄를 발현하는 플라스미드를 1:1.2의 비율로 HEK293E 세포를 형질감염시켰다. 6일 후, 발현 상청액을 수집하고, 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거하고, 단백질 A 컬럼으로 정제하였다. A280 판독값이 기준선으로 떨어질 때까지 컬럼을 PBS로 헹구었다. 관심 단백질을 산성 용리 완충액(pH 3.0~pH 3.5)으로 용리시키고, 1 M 트리스-HCl(pH 8.0~9.0)로 중화시켰다. 용리된 샘플을 적절히 농축하고, PBS로 사전평형화시킨 겔 크로마토그래피 수퍼덱스 200(GE)에 의해 추가 정제하여 응집체를 제거하였다. 단량체 피크를 수집하고, 사용을 위하여 분취하였다.
본 개시의 항체의 성능 및 유리한 효과를 다음 시험 방법에 의해 확인하였다.
생물학적 활성의 시험관 내 평가
시험예 1: 비아코어 분석법에 의한 상이한 종의 IL-5에 대한 쥣과 IL-5 항체의 결합
시험 쥣과 IL-5 항체와 인간 IL-5 사이의 친화도를 비아코어(Biacore) T200(GE) 기기를 사용하여 결정하였다.
시험할 분자를 단백질 A 바이오센서 칩으로 친화도 포획한 후, 항원(실시예 1에서 제조한 재조합 인간, 원숭이 및 쥣과 IL5)을 칩 표면을 통해 흘리고, 비아코어 T200 기기를 사용하여 반응 신호를 실시간으로 검출하여 결합 및 해리 곡선을 얻었다. 실험의 각 사이클의 해리가 완료된 후, 바이오센서 칩을 세척하고, 글리신-염산 재생 용액(pH 1.5)으로 재생시켰다. BIAevaluation 버전 4.1 GE 소프트웨어를 이용하여 데이터를 랭뮤어 모델에 (1:1)로 적합화하였고, 표 13에 나타낸 바와 같은 친화도 값을 얻었다.
[표 13]
비아코어 분석법에 의한 상이한 종의 IL-5에 대한 뮤린 IL-5 항체의 친화도 결과
Figure pct00064
이 시험예는 본 개시의 항체 mAb 1705, mAb 1706, mAb 1780, mAb 1773 및 mAb 1779 전부가 상이한 종(인간, 원숭이)의 IL-5에 대해 높은 친화도를 가짐을 증명한다.
시험예 2: 비아코어 분석법에 의한 상이한 종의 IL-5에 대한 인간화 IL-5 항체의 친화도
시험 인간화 IL-5 항체와 인간 IL-5 사이의 친화도를 비아코어(Biacore) T200(GE) 기기를 사용하여 결정하였다.
시험할 분자를 단백질 A 바이오센서 칩으로 친화도 포획한 후, (실시예 1에서 제조한) 항원을 칩 표면을 통해 흘리고, 비아코어 T200 기기를 사용하여 반응 신호를 실시간으로 검출하여 결합 및 해리 곡선을 얻었다. 실험의 각 사이클의 해리가 완료된 후, 바이오센서 칩을 세척하고, 글리신-염산 재생 용액(pH 1.5)으로 재생시켰다. BIAevaluation 버전 4.1 GE 소프트웨어를 이용하여 데이터를 랭뮤어 모델에 (1:1)로 적합화하였고, 표 14에 나타낸 바와 같은 친화도 값을 얻었다.
[표 14]
비아코어 분석법에 의한 인간 IL-5에 대한 인간화 IL-5 항체의 친화도 결과
Figure pct00065
이 결과는 인간화 IL-5 항체가 여전히 인간 IL-5에 대해 높은 친화도를 가짐을 보여준다(다른 쥣과 항체의 인간화 변이체의 경우, h1705의 각각의 인간화 변이체를 제외하고는 예시적인 데이터만 제공하였음).
시험예 3: ELISA 분석법에 의하면 쥣과 IL-5 항체는 IL-5와 IL-5α 수용체 사이의 결합을 차단한다
IL-5가 재조합적으로 발현된 IL-5α 수용체 단백질의 세포 외 영역에 결합하는 것을 방지하는 IL-5 항체의 능력을 입증하기 위하여, ELISA 플레이트를 IL-5(PBS 중 5 μg/ml)로 코팅하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하고, 액체를 버린 다음, PBS로 희석된 5% 탈지유 차단 용액을 200 μl/웰로 첨가하고, 인큐베이터에서 37℃에서 2.5시간 동안 차단하였다. 차단이 완료된 후, 차단 용액을 버리고, 플레이트를 PBST 완충액(0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS, pH 7.4)으로 5회 세척하고, 25 μl의 10 μg/ml IL-5Rα(1% BSA 중)(비오틴 표지화 키트(Dojindo Chemical, LK03)로 표지됨)를 첨가한 다음, IL-5에 대한 결합을 두고 IL-5Rα와 경쟁하는 25 μl의 구배 희석된 항체를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트 내의 반응 용액을 버리고, 플레이트를 PBST로 5회 세척하고, 샘플 희석 용액으로 1:600으로 희석된 스트렙타비딘-퍼옥시다아제 폴리머(Sigma, S2438-250UG)를 50 μl/웰로 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척한 후, 50 μl/웰의 TMB 발색 기질(chromogenic substrate)(KPL, 52-00-03)을 첨가하고, 실온에서 3 내지 10분 동안 항온처리하고, 50 μl/웰의 1 M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. NOVOStar 마이크로플레이트 판독기로 450 nm에서 흡광도 값을 판독하였다. IL-5와 IL-5Rα 사이의 결합을 차단하는 IL-5 항체에 대한 IC50 값을 계산하였다. 결과를 표 15에 나타내었으며, 본 개시의 두 항체 모두 IL-5의 이의 수용체에 대한 결합을 효과적으로 억제할 수 있다.
[표 15]
ELISA 분석법에 의한 IL-5와 IL-5α 수용체 사이의 결합을 차단하는 뮤린 IL-5 항체의 결과
Figure pct00066
시험예 4: FACS에 의하면 IL-5 항체는 IL-5와 IL-5 수용체 사이의 결합을 차단한다
세포 표면에서 IL-5 수용체를 차단할 수 있는 생성된 IL-5 항체를 확인하기 위하여, IL-5Rα/β의 두 수용체를 고도로 발현하는 재조합 세포주 CHOS를 구축하였다. 이 실험은 IL-5가 CHOS 세포주의 표면에서 재조합 IL-5α/β 수용체에 결합하는 것을 IL-5 항체가 방지할 수 있음을 확인시켜 주었다.
자세한 방법: CHO-S-IL-5Rα 및 β를 100 ng/ml G418 및 25 ng/ml 제오신을 함유하는 CD-CHO와 함께 배양하였고, 세포 배양 중의 농도는 3 × 106개 세포/ml 이하였다. 양호한 상태의 IL-5Rα/β-CHOS 세포를 원심분리(1000 rpm, 5분)하고, PBS 중 10% FBS로 1회 세척하고, 계수하고, 세포 농도를 4 × 106개 세포/ml로 조정하고, 25 μl를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 시험할 항체를 10% FBS를 함유하는 PBS 용액으로 희석하였으며, 초기 농도는 200 μg/ml이었고, 1:10 희석에 의해 8가지의 구배를 얻었다. 비오틴 표지화 키트(Dojindo Chemical, LK03)로 표지된 25μl의 100 ng/ml IL-5를 50 μl의 각각의 희석된 항체와 균일하게 혼합하고, 세포가 첨가된 96-웰 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 4℃에서 원심분리(400 g, 5분)하고, 상청액을 버리고, 원심분리하고, 200 μl의 사전 냉각된 PBS로 세척하였고, 2회 반복하였다; 1:1333으로 희석된 PE-아비딘 이차 항체를 첨가하고, 40℃에서 40분 동안 암소에서 항온처리하고, 4℃에서 원심분리(400 g, 5분)한 후 상청액을 버리고, 200 μl의 사전 냉각된 PBS를 첨가하고, 세포를 해리시키고, 원심분리하고, 4℃에서 세척하고, 3회 반복하고, 100 μl의 PBS를 첨가하였다. 플레이트를 기기에서 판독하고, IL-5와 IL-5Rα/β 사이의 결합을 차단하는 IL-5 항체에 대한 IC50 값을 형광 신호 값에 기초하여 계산하였다. 결과를 표 16 및 도 1에 나타내었다.
[표 16]
IL-5와 IL-5Rα/β 사이의 결합을 차단하는 IL-5 항체의 결과
Figure pct00067
결과는 항체 h1705-008, h1706-009, h1780-017, h1773-007 및 h1779-014가 세포 표면의 IL-5 수용체에 대한 IL-5의 결합을 차단하는 더 강한 능력을 나타내었음을 보여준다.
시험예 5: IL-5 항체는 TF1 세포의 IL-5 유도성 증식을 억제한다
IL-5는 TF-1 세포의 증식을 유도할 수 있고, IL-5 항체는 IL-5가 TF-1 세포의 증식을 자극하는 것을 방지할 수 있다.
구체적으로, TF-1 세포(ATCC, CRL-2003)를 10%의 FBS 및 2 ng/mL의 rhGM-CSF(Lianke Bio, 카탈로그 번호 96-AF-300-03-20)를 함유하는 RPMI1640에서 배양하고, 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에서 항온처리하였고, 세포 밀도는 1 × 106개 세포/ml 이하였다. 항체의 검출을 위하여, 대수 성장기에 있는 세포를 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 PBS로 3회 세척하고, 세포 밀도를 RPMI1640(FBS: 2%, 재조합 인간 IL-5: 10 ng/ml)으로 6000개 세포/웰/90 μl로 조정하였다. 시험할 항체 10 μl의 구배 희석액을 96-웰 플레이트에 첨가하고, 3일 동안 배양하였다. 30μl의 세포 역가를 첨가하고 혼합하였다. 판독을 기초로 IC50 값을 계산하였다. 결과를 아래 표 17에 나타내었다.
[표 17]
TF1 세포의 IL-5 유도성 증식을 억제하는 IL-5 인간화 항체의 결과
Figure pct00068
시험예 6: IL5 항체는 IL5 유도성 호산구 부착을 억제한다
IL5는 호산구의 분화, 성숙, 이동 및 활성화를 유도하여, 호흡기 염증을 유발하며, 천식을 초래할 수 있다. IL-5 사이토카인이 호산구 부착을 촉진하고 호산구를 활성화시킬 수 있다는 원리에 따라, 이 시험예에서는, 인간 말초 혈액으로부터 호산구를 수집 및 정제하고, IL5 매개성 호산구 부착을 차단하는 데 있어서 IL-5 항체의 시험관 내에서의 영향을 검출하여 IL-5 매개성 경로를 차단하는 데 있어서 IL-5 특이적 항체의 영향을 결정하였다.
구체적으로, 인간 말초 혈액을 2 mM의 EDTA를 함유하는 PBS로 5배 희석하고, 단핵구 및 과립구를 PercollTM로 (1.088의 밀도 구배를 이용함) 분리하고, 과립구를 함유하는 적혈구 층을 조심스럽게 흡인하고, 적혈구를 적혈구 용해 완충액으로 제거하였다. 남은 세포를 계수하고, 인간 CD16 항체로 코팅된 분리 자기 비즈(Miltenyi, 카탈로그 번호 130-045-701)를 첨가하고, 30분 동안 항온처리한 후, 자기 비드 컬럼을 통해 흘렸다. 세포 분획의 유출물(effluent)을 직접 수집하였으며, 이는 주로 호산구로 구성되어 있었다. 그에 따른 호산구를 계수하고, IgG 항체로 사전 코팅된 96-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 약 1 × 104개 세포를 첨가하고, 인간 IL-5 (20 ng/ml) 및 상이한 농도의 IL-5 항체 분자(10 μg/ml에서 시작, 3배 희석, 10가지의 농도 수준)를 첨가하였다. 세포 배양 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이터에서 항온처리한 다음, 0.3% CTAB를 첨가하여 세포를 용해시켰다. 마지막으로, 퍼옥시다아제 반응 기질 TMB를 첨가하여 발색시켰다. OD450 흡광도 값을 마이크로플레이트 판독기 하에서 판독하였다. IL-5만 첨가된 웰에서 최대 흡착 값을 판독하고, IL-5 및 항체 약물을 함유하지 않은 웰을 백그라운드 대조군으로 설정하였다. 최대 흡착 값에 대한 각각의 농도의 항체 약물의 억제 값은 = (최대 흡착 값 - [항체 약물])/(최대 흡착 값 - 백그라운드 대조 값) × 100%로 계산하였으며, IC50을 계산하였다. 결과를 표 18에 나타내었다:
[표 18]
IL-5 항체는 IL-5 유도성 호산구 부착을 차단한다
Figure pct00069
결과는 본 개시의 인간화 항체가 IL5 매개성 호산구 부착을 억제하는 강한 능력을 보여줌을 나타낸다.
시험예 7: Th2 사이토카인에 대한 인간화 IL-5 항체의 특이성 평가
IL-5는 Th2 사이토카인 중 하나이다. IL-5 항체가 다른 사이토카인과의 교차 반응 없이 IL-5만을 특이적으로 표적화함을 확인하기 위하여, IL2(R&D, 202-IL-010/CF), IL4(R&D, 204-IL-050/CF), IL-5(R&D, 205-IL-025/CF), IFN감마, IL6(R&D, 7270-IL-025/CF), IL9(R&D, 209-IL-010/CF), IL10(R&D, 217-IL-025/CF), IL13(R&D,213-ILB-025/CF), IL25(R&D, 8134-IL-025/CF), IL31(R&D, 2824-IL-010/CF) 및 IL-5와 α 수용체를 공유하는 IL3(203-IL-050/CF) 및 GMCSF (R&D, 215-GM-010/CF)를 포함하는, 12가지 유형의 Th2 및 관련 사이토카인을 Fortebio 분석법에서 사용하였다.
구체적으로, 단백질 A 바이오센서(PALL Fortebio, 18-5010)를 사용하여 항체를 포획하고, 포획 신호를 기록한 다음, 40 nM의 각각의 사이토카인을 첨가하고, 새로운 결합 신호를 기록하였다. 마지막으로, IL-5에 대한 결합 신호를 100%로 정의하고, 항체와 다른 사이토카인 사이의 결합 신호를 관찰하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.
결과는 12가지 유형의 관련 사이토카인 중에서, 인간화 IL-5 항체 h1705-008 및 h1706-009만이 IL-5에 특이적으로 결합하고, 다른 Th2 사이토카인과 교차 반응을 보이지 않음을 보여준다.
약동학적 평가
시험예 8: 랫트에서 인간화 IL-5 항체의 약동학적 평가
18마리의 수컷, 실험용 SD 랫트(Sipple-BK Lab Animal Co., Ltd. 제공)를 6개 군으로 나누어, 각 군에 3마리의 랫트를 배정하였다. Hu39D10, h1705-008 및 h1706-009를 정맥 내 및 피하 투여하였다. 또 다른 9마리의 SD 랫트는 h1773-007, h1779-014 또는 h1780-017을 정맥 내로만 투여하였다. 정맥 내 투여군의 경우, 투여 전 및 투여 후 5분, 8시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 10일, 14일, 21일 및 28일에 항응고제를 넣지 않고 0.2 ml의 전혈을 수집하였다. 혈액 샘플을 4℃에서 30분 동안 두었다가 1000 g에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액(혈청)을 EP 튜브에 넣고 -80℃에서 보관하였다. 피하 투여군의 경우, 투여 전 및 투여 후 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 10일, 14일, 21일 및 28일에 전혈을 수집하였다. 혈청 중의 항체 농도를 Elisa에 의해 결정하였다.
결과는 본 개시의 인간화 항체 분자가 랫트에서 긴 반감기 및 높은 생체이용률을 가짐을 나타낸다.
[표 19]
랫트에서 항체의 약동학적 평가
Figure pct00070
생체 내 생물학적 평가
시험예 9: OVA 유도성 마우스 천식 모델에서 IL-5 항체의 효능 평가
이 시험예는 기도 염증 반응 및 기도 재형성(remodeling)에 기초하여 오브알부민(OVA) 에어로졸 유도성 BALB/c 마우스 천식 모델에서 IL-5 항체의 효능을 평가하기 위한 것이다.
마우스를 체중에 따라 7개의 군으로 무작위로 나누었고, 각 군은 10마리의 마우스로 구성하였다: 정상 대조군(G1); 모델군(G2); 항체 h1705-008(각각 10 mpk 및 2 mpk의 2가지 투여량에 대한 G3 및 G4) 및 h1706-009(각각 10 mpk 및 2 mpk의 2가지 투여량에 대한 G5 및 G6)에 대한 치료군; 및 양성 항체 Hu39D10에 대한 대조군(G7, 10 mpk). 1일 및 14일째에, 모든 마우스를 감작 용액(sensitizing solution)의 복강 내 주사에 의해 감작시켰다. 28일, 29일 및 30일째에, 군 1을 제외한 6개의 마우스 군에 30분 동안 OVA 에어로졸 유발검사(challenging) 용액을 투여하였다. 유발검사 2시간 전에, 군 2(G2)에 인산염 완충액을 복강 내 주사하고, 군 3 내지 7(G3-G7) 마우스에 3일 연속하여 1일 1회 상이한 농도의 상이한 항체를 복강 내 주사하였다. 시험할 새로운 항체 용액을 각각의 주사 직전에 제조하였고, 모든 주사를 30분 내에 완료하였다. 정상 대조군으로, 인산염 완충액의 복강 내 주사 2시간 후, 군 1의 마우스에 3일 연속하여 1일 1회 30분 동안 에어로졸 PBS를 투여하였다.
31일째에, WBP 시스템을 사용하여 기도 과민반응성에 대해 동물을 시험하였다. 모든 동물에 1.5625, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 mg/mL의 2배씩 증가하는 농도의 메타콜린 스프레이를 흡입시켜, 상응하는 농도에서 증가된 호기 간헐치를 결정하였다.
31일째에, WBP 시스템을 이용한 기도 반응 시험 1시간 후, 직경 1.2 mm의 기관 삽입관을 기관에 삽입하여 고정하고, 폐 세척을 2회 수행하고, 1%의 BSA 및 0.6 mM의 EDTA를 함유하는 0.8 ml의 인산염 완충액을 매번 사용하였다. 회수된 세척액의 부피를 기록하였다.
BALF를 4℃에서 5분 동안 300 g에서 원심분리하고, 상청액을 유지하여 사이토카인 분석을 수행하였다. 원심분리 후, 세포 계수를 위하여 세포를 1.5 ml의 PBS(1%의 BSA 및 0.6 mM의 EDTA 함유)에 재현탁시켰다. BALF의 총 세포 수를 혈구계산기 및 트리판 블루 염색 분석법으로 계수하였다. 세포를 도말하고, 1분 동안 Wright 염색 용액으로 염색한 후, 호산구, 호중구, 대식세포 및 림프구를 구별하기 위하여 7분 동안 김자(Giemsa)로 염색하였다. 세포를 광학 현미경으로 계수하였다.
세척 후, 폐 조직을 수집하고, 10% 중성 포름알데히드 용액에 침지시킨 후 10% 중성 포름알데히드 용액에 고정시켰다. 이어서, 고정된 조직을 대상으로 파라핀 포매, 트리밍, H & E 염색 및 스코어링을 수행하였다. 시험 결과를 도 3 및 도 4a와 도 4b에 나타내었다.
결과는 본 개시의 항체 분자 h1705-008 및 h1706-009가 용량 의존적인 방식으로 폐 기능을 유의미하게 개선할 수 있지만, 고용량(10 mpk)의 양성 화합물은 폐 기능을 개선할 수 없음을 보여준다(도 3 참조). 동시에, 두 항체는 호산구의 수준과 점막의 두께를 현저히 감소시켰으며, 동일한 투여량(10 mpk)에서 양성 항체에 비해 호산구의 양을 감소시키는 더 강한 능력을 나타내었다(도 4a 및 도 4b 참조). 동일한 유형의 마우스 천식 모델에서 실험을 반복함으로써, 양성 항체와 비교하였을 때 1 mg/ml의 h1705-008, h1706-009 및 h1780-017 모두가 BalF에서 호산구의 수준을 유의미하게 감소시켰다는 점도 확인하였다(도 4c 참조).
시험예 10: 기니피그 모델의 외인성 인간 IL5 유도성 급성 천식에서 IL5 항체의 생체 내 효능 평가
이 시험예에서, 수컷 기니피그를 사용하여 인간 IL5 유도성 급성 천식 모델을 확립하였고, hu39D10을 양성 항체로 사용하여 본 개시의 5가지 인간화 IL-5 단일클론 항체가 기니피그의 기관지폐포 세척액(BALF)에서 호산구의 인간 IL5 유도성 증가에 대한 억제 효과를 갖는지를 평가하였다. 기니피그를 각 군에 8 내지 10마리씩 9개 군으로 나누었다: 정상 대조군, 모델군, hu39D10 (1mg/kg) 군, h1705-008 (1mg/kg) 군, h1706-009 (1mg/kg) 군, h1780-017 (1 mg/kg) 군, h1773-007 (1 mg/kg) 군 및 h1779-014 (1 mg/kg) 군. 1일째에, 모델군 및 약물 투여군의 기니피그에 초회감작을 위하여 100 μl의 인간 IL5(5 μg의 IL5 항원 함유)를 기관 내 주사하였고, 정상 대조군에 PBS를 기관 내 주사하였다. 초회감작 2시간 후, 위의 IL5 단일클론 항체 1 mg/kg(5 ml/kg의 투여 부피)을 약물 투여군에 복강 내 투여하고, 상응하는 IgG 항체를 모델군에 투여하고, PBS를 정상 대조군에 복강 내 투여하였다. 기관 내 주사 24시간 후, 기니피그를 마취시키고, 기관지폐포 세척액을 추출하였다. 세포 농도를 5^106/ml로 조정하고, 15 μl를 유리 슬라이드 상에 적가하고, 건조시켜 HE 염색을 위하여 고정시키고, 세포의 총 수 및 호산구의 수를 400배 현미경으로 계수하였다. 호산구의 백분율을 계산하였다. 결과를 도 5a와 5b에 나타내었으며, 본 개시의 5가지 인간화 항체 모두가 BALF에서 호산구의 수준을 유의미하게 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
안정성 평가
시험예 11: 인간화 항-IL-5 항체의 안정성
1. 항체의 화학적 안정성
탈아미드화 변형(deamidation modification)은 장기적인 안정성에 영향을 미칠 수 있는, 항체의 일반적인 화학적 변형이다. 특히, CDR 영역의 부분 아미노산의 높은 정도의 탈아미드화, 산화 또는 이성질체화 변형은 일반적으로 회피되거나, 또는 돌연변이에 의해 감소된다. 다양한 시점(time point)에서 취한 100 μg의 샘플을 0.2 M His-HCl, 8 M Gua-HCl(pH 6.0)의 용액 100 μl에 용해시키고, 0.1 g/mL DTT 3 μl를 첨가하고, 1시간 동안 50℃의 수조에서 항온처리한 다음, 0.02 M의 His-HCl(pH 6.0)로 2회 한외여과하였다. 3 μl의 0.25 mg/mL의 트립신을 첨가하고, 효소 분해를 위하여 37℃에서 밤새 수조에서 항온처리하였다. LC-MS 분석을 Agilent 6530 Q-TOF로 수행하였다. 결과는 본 개시의 인간화 항체의 화학적 안정성이 양호하며, 항체는 529 완충제 시스템에서 40℃에서 1개월 동안 가속화 반응 후에 비정상적인 변형을 나타내지 않았음을 보여준다.
2. 고농도 조건하에서의 항체 응집 정도에 관한 연구
시험 항체의 안정성을 고농도 및 상이한 완충제 시스템 및 상이한 온도 조건에서 1개월 동안 평가하였다. 40℃, 25℃, 4℃ 및 -80℃에서 PB9, His 및 529의 세 가지 완충제 시스템에서, 50 mg/ml의 농도에서 동결 및 해동을 반복하여 안정성을 조사하였다. SEC-HPLC에 의해 응집 정도를 모니터링하였다. Waters Xbridge BEH 200A SEC 컬럼과 함께 Waters e2695 크로마토그래피를 사용하였으며, 이동상은 PBS였다(pH는 묽은 염산으로 6.8로 조정하였음). 50 μg의 단백질을 로딩하고, 0.5 mL/분의 유속으로 등용매 용리를 수행하였다. 인간화 IL-5 항체 중 어느 것도 고농도 조건하에서 현저하게 응집되지 않는 것으로 관찰되었다. 40℃에서 4주의 가속화 반응 후, 항체 단량체의 순도는 세 시스템 모두에서 95%보다 더 높았다.
3. 고농도 조건하에서의 항체의 순도에 관한 연구
시험 항체의 안정성을 고농도 및 상이한 완충제 시스템 및 상이한 온도 조건에서 1개월 동안 평가하였다. His 시스템 및 40℃에서, 50 mg/ml의 농도에서 안정성을 조사하였다. 순도는 CE-SDS에 의해 모니터링하였다. 100 μg의 단백질을 취하고, 샘플 완충제를 첨가하여 95 μl에 이르게 하였다. 환원 모드 분석을 위하여 5 μl의 디메르캅토에탄올을 첨가하였고, 비 환원 모드 분석을 위하여, 5 μl의 IAA를 첨가하였다. 10분 동안 70℃의 수조에서 항온처리하고, 원심분리하고, 상청액을 로딩하였다. Beckman PA800plus 전기영동 장치로 데이터를 수집하고 분석하였다. 항체 단백질은 고농도 조건에서 양호한 순도 안정성을 갖는 것으로 관찰되었고, 40℃에서 28일의 가속화 반응 후, CE-SDS 분석은 항체의 주요 피크가 단지 2% 감소되었음을 보여주었다.
4. UNIT에 의한 상이한 항체의 열 안정성 검출
샘플을 상응하는 완충액(PBS 완충액)에 용해시키고, 샘플의 농도를 약 1 mg/ml로 조절하였다. 9 μl를 로딩하였다. 파라미터 설정: 시작 온도 20℃; 항온처리 0초; 가열 속도 0.3℃/분; 플레이트 유지 5초; 종료 온도 95℃. 항체의 Tm 값을 검출하였다. 항체는 높은 Tm 값을 가지며 양호한 열 안정성을 나타낸다.
위에 기술된 발명을 첨부된 도면 및 실시예의 도움으로 상세하게 설명하였다. 그러나 설명 및 실시예는 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시 내용은 그 전문이 명백히 참조로 포함된다.
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Artificial Sequence <220> <223> h1780_VH.1B <400> 65 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Phe Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 66 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1780_VH.1C <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Leu Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Phe Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Asp Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 67 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1773_VL.1 <400> 67 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ala Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 68 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1773_VL.1A <400> 68 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ala Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 69 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1773_VH.1 <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Val Gly Asp Thr Lys His Gly Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Tyr Gly Ile Tyr Pro Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1773_VH.1A <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Val Gly Asp Thr Lys His Gly Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Phe Arg Tyr Gly Ile Tyr Pro Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1773_VH.1B <400> 71 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Val Gly Asp Thr Lys His Gly Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Phe Arg Tyr Gly Ile Tyr Pro Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 72 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1779_VL.1 <400> 72 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 73 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1779_VL.1A <400> 73 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 74 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1779_VL.1B <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 75 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1779_VH.1 <400> 75 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1779_VH.1A <400> 76 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 77 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1779_VH.1B <400> 77 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Ala Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 78 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1779_VH.1C <400> 78 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Ala Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Phe Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 79 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1779_VH.1D <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Arg Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Phe Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ile Ala Trp Asp His Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 80 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain sequence of Hu39D10 <400> 80 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr Ser Asn 20 25 30 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Leu Ile Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Ile Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Glu Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 81 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain sequence of Hu39D10 <400> 81 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Lys Phe Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 82 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> h1773 antibody body heavy chain HCDR2 variant <400> 82 Arg Ile Asp Pro Ala Val Gly Asp Thr Lys His Gly Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly

Claims (21)

  1. 인간 IL-5에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    단일클론 항체는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기에서
    (i) 중쇄 가변 영역은 서열번호 16 내지 18의 아미노산 서열에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 16 내지 18에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역과 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 19 내지 21에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역과 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체를 포함하거나; 또는
    (ii) 중쇄 가변 영역은 서열번호 22 내지 24의 아미노산 서열에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 22 내지 24에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역과 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 25 내지 27의 아미노산 서열에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 25 내지 27에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역과 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체를 포함하거나; 또는
    (iii) 중쇄 가변 영역은 서열번호 28 내지 30의 아미노산 서열에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 28 내지 30에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역과 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 31 내지 33의 아미노산 서열에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 31 내지 33에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역과 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체를 포함하거나; 또는
    (iv) 중쇄 가변 영역은 서열번호 34 내지 36의 아미노산 서열에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 34 내지 36에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역과 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 37 내지 39의 아미노산 서열에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 37 내지 39에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역과 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체를 포함하거나; 또는
    (v) 중쇄 가변 영역은 서열번호 40 내지 42의 아미노산 서열에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 40 내지 42에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역과 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 43 내지 45의 아미노산 서열에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 43 내지 45에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역과 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체를 포함하거나; 또는
    (vi) 중쇄 가변 영역은 서열번호 34 내지 36의 아미노산 서열에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 34, 82 및 36에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 영역과 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 HCDR 변이체를 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 37 내지 39의 아미노산 서열에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역, 또는 각각 서열번호 37 내지 39에 기재된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 영역과 3, 2 또는 1개의 아미노산의 차이가 있는 LCDR 변이체를 포함하는 것인, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    단일클론 항체는 바람직하게는 쥣과 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 재조합 항체인 것인, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제2항에 있어서,
    인간화 항체는 서열번호 49, 57, 63, 69 또는 75의 중쇄 가변 영역, 또는 이의 변이체를 포함하고; 변이체는 서열번호 49, 57, 63, 69 또는 75에 기재된 중쇄 가변 영역에 1 내지 10개의 아미노산 돌연변이를 갖는 것인, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제3항에 있어서,
    변이체는 서열번호 49, 57, 63, 69 또는 75에 기재된 중쇄 가변 영역의 FR 영역에 1 내지 10개의 아미노산 역돌연변이를 가지고; 바람직하게는, 역돌연변이는 서열번호 49의 중쇄 가변 영역에서 S49T, V93T 및 K98S, 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 역돌연변이는 서열번호 57의 중쇄 가변 영역에서 S49T, V93T 및 K98T, 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 역돌연변이는 서열번호 63의 중쇄 가변 영역의 R38K, M48I, R67K, V68A, M70L, R72V, T74K 및 L83F, 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 역돌연변이는 서열번호 69의 중쇄 가변 영역의 F29I, R38K, V48I, R72A, T97F, 및 CDR의 N55V, 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 역돌연변이는 서열번호 75의 중쇄 가변 영역의 R38K, M48I, R67K, V68A, R72A, T74K, M81L, L83F 및 D89E, 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제4항에 있어서,
    인간화 항체는 서열번호 50 또는 51의 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 58 또는 59의 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 64, 65 및 66 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 70 또는 71의 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 서열번호 76 내지 79 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제2항에 있어서,
    인간화 항체는 서열번호 46, 54, 60, 67 또는 72의 경쇄 가변 영역, 또는 이의 변이체를 포함하고; 변이체는 서열번호 46, 54, 60, 67 또는 72에 기재된 경쇄 가변 영역에 1 내지 10개의 아미노산 변화를 갖는 것인, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제6항에 있어서,
    변이체는 서열번호 46, 54, 60, 67 또는 72에 기재된 경쇄 가변 영역의 FR 영역에 1 내지 10개의 아미노산 역돌연변이를 가지고; 바람직하게는, 역돌연변이는 서열번호 46의 경쇄 가변 영역에서 A43S, L47V, G66R, T69S, F71Y 및 Y87F 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나; 또는 역돌연변이는 서열번호 54의 경쇄 가변 영역에서 A43S, L47M, F71Y 및 Y87F 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나; 또는 역돌연변이는 서열번호 60의 경쇄 가변 영역에서 E1D, I2T, I57V, V84T 및 Y86F 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나; 또는 역돌연변이는 서열번호 67의 경쇄 가변 영역에서 M4L, A42S, L45P 및 L46W 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나; 또는 역돌연변이는 서열번호 72의 경쇄 가변 영역에서 A43S, I48V 및 F71Y 또는 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제7항에 있어서,
    인간화 항체는 서열번호 47 또는 48의 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는 서열번호 55 또는 56의 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는 서열번호 61 또는 62의 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는 서열번호 68의 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는 서열번호 73 또는 74의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화 항체는
    서열번호 49 내지 51 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 46 내지 48 중 어느 하나로부터 선택되는 경쇄 가변 영역; 또는
    서열번호 57 내지 59 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 54 내지 56 중 어느 하나로부터 선택되는 경쇄 가변 영역; 또는
    서열번호 63 내지 66 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 60 내지 62 중 어느 하나로부터 선택되는 경쇄 가변 영역; 또는
    서열번호 69 내지 71 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 67 또는 68 중 어느 하나로부터 선택되는 경쇄 가변 영역; 또는
    서열번호 75 내지 79 중 어느 하나로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 72 내지 74 중 어느 하나로부터 선택되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체는 전장 항체이고, 인간 항체 불변 영역을 더 포함하며, 바람직하게는 전장 항체는 서열번호 52에 기재된 인간 항체 중쇄 불변 영역 및 서열번호 53에 기재된 인간 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab') 2, 단일 사슬 항체(scFv), 이량체화된 V 영역(다이어바디), 이황화 안정화된 V 영역(dsFv), 및 CDR 포함 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 인간 IL-5에 대한 결합을 두고 경쟁하는 것을 특징으로 하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 완충제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  15. 제14항의 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  16. 제15항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포로서,
    상기 숙주 세포는 원핵생물 세포 및 진핵생물 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 진핵생물 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포인, 숙주 세포.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법으로서, 상기 방법은
    배양물에서 제16항의 숙주 세포를 배양하여, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 형성 및 축적하는 단계, 및
    배양물로부터 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  18. 인간 IL-5를 검출 또는 결정하는 방법으로서,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 인간 IL-5를 검출 또는 결정하기 위한 작용제로서,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 작용제.
  20. 인간 IL-5와 관련된 질환을 치료하는 방법으로서,
    상기 방법은 인간 IL-5와 관련된 질환을 치료하기 위하여, 대상체에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제13항에 따른 약학 조성물, 또는 제14항의 분리된 핵산 분자의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며,
    질환은 바람직하게는 천식(asthma), 천식의 악성 발작(malignant attack), 만성 폐렴(chronic pneumonia), 알레르기 비염(allergic rhinitis), 알레르기 기관지폐 아스페르길루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis), 호산구증가증(eosinophilia), 처그 스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 회선사상충증 피부염(onchocerciasis dermatitis), 간헐적 혈관부종(intermittent angioedema), 호산구성 근육통증 증후군(eosinophilic myalgia syndrome), 호산구성 위장관염(eosinophilic gastroenteritis), 연충 감염(helminth infection), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비용종(nasal polyps), 레플러 증후군(Loeffler's syndrome), 두드러기(urticaria), 호산구 과다형성 기관지염(eosinophil hyperplastic bronchitis), 결절 동맥염(nodular arteritis), 동염(sinusitis), 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis), 알레르기 호산구성 식도염(allergic eosinophilic esophagitis), 알레르기 결막염(allergic conjunctivitis), 회선사상충증 피부염(onchocerciasis dermatitis), 자궁내막증(endometriosis) 및 스테로이드 의존성 호산구성 기관지염(steroid dependent eosinophilic bronchitis)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  21. 질환 또는 상태의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제13항의 약학 조성물, 또는 제14항의 분리된 핵산 분자, 또는 이들의 조합의 용도로서,
    질환 또는 상태는 인간 IL-5와 관련된 질환이고, 질환 또는 상태는 바람직하게는 천식, 천식의 악성 발작, 만성 폐렴, 알레르기 비염, 알레르기 기관지폐 아스페르길루스증, 호산구증가증, 처그 스트라우스 증후군, 아토피 피부염, 회선사상충증 피부염, 간헐적 혈관부종, 호산구성 근육통증 증후군, 호산구성 위장관염, 연충 감염, 호지킨병, 비용종, 레플러 증후군, 두드러기, 호산구 과다형성 기관지염, 결절 동맥염, 동염, 호산구성 식도염, 알레르기 호산구성 식도염, 알레르기 결막염, 회선사상충증 피부염, 자궁내막증 및 스테로이드 의존성 호산구성 기관지염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 용도.
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