ES3047057T3

ES3047057T3 - Gene for resistance to a pathogen of the genus heterodera

Info

Publication number: ES3047057T3
Application number: ES18171637T
Authority: ES
Inventors: Ottó Törjek; Dietrich Borchardt; Wolfgang Mechelke; Werner Beyer; Britta Schulz; Jens Christoph Lein
Original assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Current assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Priority date: 2018-05-09
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2025-12-03
Anticipated expiration: 2038-05-09
Also published as: FI3567111T3; PL3567111T3; EP3567111B1; DK3567111T3; PT3567111T; EP3567111A1; RS67302B1; HRP20251258T1; LT3567111T

Abstract

La molécula de ácido nucleico mediadora de resistencia de Heterodera, según la invención, permite una reproducción más eficiente contra la infestación por el nematodo del quiste de la remolacha o el desarrollo de nuevas líneas resistentes. En particular, la propiedad de la molécula de ácido nucleico identificada induce un efecto de resistencia dominante en la planta diana. La molécula de ácido nucleico mediadora de resistencia de Heterodera, y las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente, ofrecen aplicaciones adicionales, como el uso del alelo del gen resistente en enfoques cisgenéticos o transgenéticos, con el objetivo de desarrollar nuevos cultivares resistentes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Gen de resistencia a un patógeno del género Heterodera

[0005] Campo de la invención

[0007] La presente solicitud se refiere a una molécula de ácido nucleico que, cuando está presente en una planta, es capaz de conferir resistencia a un patógeno del género Heterodera - en particular, al nematodo del quiste de la remolachaHeterodera schachtii,y, en particular, en una planta de la especieBeta vulgaris- así como al polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. En particular, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente solicitud se caracteriza porque el efecto de resistencia hacia patógenos del género Heterodera que confiere la presencia de la molécula de ácido nucleico es dominante. Además, la presente solicitud se refiere a una planta, célula de planta, órgano de planta, tejido de planta, parte de planta o semilla o descendiente de una planta resistente a Heterodera, que comprende la molécula de ácido nucleico o porciones de la misma como un gen endógeno, como un gen editado o como un transgén. Además, la presente solicitud también divulga métodos para aumentar la resistencia hacia un patógeno del género Heterodera, en una planta, en particular en una planta de la especieBeta vulgaris,así como métodos para producir o identificar y posiblemente seleccionar una planta resistente a Heterodera. La presente solicitud también divulga métodos para monitorear una infestación por el patógenoHeterodera schachtii,así como sondas de oligonucleótidos y cebadores para la hibridación con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

[0009] Antecedentes de la invención

[0011] Se ha informado que, en remolachas azucareras cultivadas con fines comerciales, más de dos docenas de especies diferentes de nematodos causan daños económicos (Hafez, Sugar Beet nematodes in Idaho and Eastern Oregon (1997), University of Idaho, College of Agriculture). La plaga de nematodos más grave de la remolacha es el nematodo del quiste de la remolacha(Heterodera schachtii)(Cooke, Agricultural Zoology Reviews 2 (1987), 132-183) que tiene la mayor importancia económica en la mayoría de las zonas de cultivo de remolacha alemanas y europeas. Se detectó por primera vez en 1859 en Alemania y, de acuerdo con una estimación actual, 10-25 % de las zonas de producción de remolacha azucarera en todo el mundo podrían estar infestadas con esta plaga, causando pérdidas de rendimiento de hasta el 80 % (Hafez 1997), donde la pérdida de rendimiento depende de la cantidad de nematodos en el suelo, el tiempo de siembra e infestación de la remolacha azucarera, así como de las condiciones climáticas.

[0013] El nematodo del quiste de la remolacha es un nematodo patógeno de las plantas y puede causar pérdidas considerables de rendimiento no sólo en la remolacha azucarera, sino también en otras remolachas como la remolacha roja, la remolacha forrajera y la acelga, así como en otras plantas de la familia Amaranthaceae, como la espinaca, y Brassicacea, como la colza, las coles, las coles chinas, las coliflores, las coles de Bruselas, el brócoli, el nabo, el rábano y el colinabo, al dañar gravemente los sistemas radiculares, especialmente durante el verano. Este nematodo también infecta muchas malezas comunes como el nabo silvestre, la bolsa de pastor, la gallina gorda y la verdolaga.

[0015] En los campos de remolacha azucarera, la infestación por nematodos del quiste de la remolacha aparece inicialmente como áreas circulares a ovaladas de plantas atrofiadas. Los nematodos se alimentan de las raíces de las plantas, reduciendo la capacidad de las plantas para absorber nutrientes y agua. Por lo tanto, los síntomas sobre el suelo parecen ser deficiencia de nutrientes o sequía, reducción de la población, crecimiento deficiente, retraso del crecimiento, amarillamiento y marchitamiento, donde los síntomas varían de acuerdo con la etapa de crecimiento en el momento de la infección. Cuando las plántulas se infectan, los síntomas incluyen retraso en el crecimiento y reducción del crecimiento de las hojas, y las hojas externas más viejas se vuelven amarillas y se marchitan durante el período caluroso del día. Un cultivo infestado contiene plantas más pequeñas, de menor valor y calidad y competirá mal con las malezas.

[0017] La propagación de la enfermedad es continua y cada vez resulta más difícil para los productores controlar la plaga. Sin embargo, es fundamental controlar la plaga, ya que las altas poblaciones de nematodos del suelo pueden hacer que la producción de remolacha azucarera resulte antieconómica. Existen diferentes métodos para combatir la enfermedad, pero ninguna de las prácticas que se aplican actualmente es satisfactoria. Un control químico deHeterodera schachtiia través de nematicidas no sólo supone costes para el agricultor y contamina el medio ambiente, sino que además ya no está permitido en muchos países, mientras que la descontaminación del suelo no es aplicable en campos de mayor tamaño. Además, la rotación de cultivos en donde las remolachas azucareras se cultivan sólo cada cuatro años o incluso con menor frecuencia para reducir la población de nematodos no siempre es practicable ni lo suficientemente eficaz. Otra práctica de gestión común incluye el cultivo de cultivos resistentes a los nematodos, como el rábano de aceite o la mostaza. Estas plantas atraen la plaga, pero inhiben su desarrollo y reproducción, lo que reduce la población de la plaga. También es posible cultivar variedades de remolacha azucarera resistentes o tolerantes. Hasta ahora, el método más eficaz para disminuir la población de nematodos en el suelo ha sido el cultivo de variedades de remolacha azucarera resistentes.

[0018] Mientras tanto, se ofrecen en el mercado variedades de cultivo de remolacha azucarera resistentes y tolerantes a los nematodos que albergan, por ejemplo, un importante gen de resistencia contraHeterodera schachtiide Beta procumbens (Heijbroek et al., Euphytica 38 (1988), 121-131; Lange et al., Actas del Congreso 53 del IIRB, Bruselas (1990), 89-102). En el segmento deBeta procumbens,translocado es decir el segmento del cromosoma 1 deB. procumbensintegrado al final del cromosoma 9 deB. vulgaris,se identificó un gen Hs1pro-1 mediante clonación posicional como factor causal (Cai et al., Science 275 (1997), 832-834). Sin embargo, al integrar el segmento del cromosoma 1 deBeta procumbensen el genoma deBeta vulgarisno sólo se busca la resistencia deseada aHeterodera schachtiiintroducida en la planta, sino, más bien, a menudo también características no deseadas, como, por ejemplo, un rendimiento reducido, debido a la herencia de genes adicionales que están vinculados con la característica positiva de resistencia aHeterodera.Este fenómeno también se conoce con el término "arrastre de conexión". Por lo tanto, el uso de este gen en el mejoramiento tiene limitaciones debido a una pérdida significativa de rendimiento debido al arrastre de conexión y además debido a la inestabilidad de la translocación.

[0020] Se encontró otra fuente de resistencia a los nematodos en la acelga marina silvestreB. vulgarissubespeciemarítimaen material recogido en Francia (Hijner, Meded. Inst. rat. Suikerprod. 21 (1951), 1-13). Sin embargo, hasta ahora no están del todo claros los antecedentes genéticos y funcionales de la resistencia a Heterodera ni la identidad de los genes de resistencia.

[0022] Sin embargo, como se mencionó anteriormente, una desventaja de las variedades de cultivo que tienen las resistencias descritas consiste en que el desarrollo de la variedad cultivada es muy laborioso y complicado debido a la herencia complicada, y en que dichas variedades de cultivo tienen un rendimiento marcadamente más pobre en relación con las variedades de cultivo normales, en ausencia de una infestación. Entre otras cosas, esto puede estar relacionado con la interacción epigenética de algunos genes de resistencia con genes que son responsables de la producción de azúcar, lo que conduce a una menor aptitud de las plantas en ausencia del patógeno.

[0024] El uso de nuevas técnicas de fitomejoramiento basadas en la edición genética, por ejemplo, mediante nucleasas TALE o sistemas CRISPR, y de enfoques transgénicos, es imposible en la práctica ya que no se han identificado ni caracterizado los genes que intervienen en el desarrollo de la resistencia.

[0026] Para un fitomejoramiento sostenible contra el nematodo del quiste de la remolacha, es decir para contrarrestar el peligro de las variantes de Heterodera que superan la resistencia, es necesario identificar continuamente nuevos genes de resistencia e integrarlos en los acervos genéticos de las plantas cultivadas, como la remolacha azucarera. En particular, el objetivo consistía en proporcionar genes de resistencia adecuados que, cuando están presentes en la planta, por sí solos ya producen un efecto de resistencia dominante muy grande contraHeterodera schachtii.De acuerdo con la invención, este objetivo se consigue mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

[0028] Descripción de la invención

[0030] La invención se define por las características de las reivindicaciones independientes.

[0032] La presente solicitud se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de conferir resistencia a un patógeno del género Heterodera - en particular al nematodo del quiste de la remolachaHeterodera schachtii-en una planta, y, en particular, enBeta vulgarissubespecievulgaris.La molécula de ácido nucleico, cuando está presente en la planta, produce un efecto de resistencia dominante contraHeterodera schachtii.

[0034] Además, la presente solicitud se refiere a una planta, célula de planta, órgano de planta, tejido de planta, parte de planta, semilla, material de semilla o descendiente de una planta resistente a Heterodera, que comprende de forma endógena o transgénica la molécula de ácido nucleico o porciones de la misma. De acuerdo con la presente solicitud, quedan exentas aquellas plantas y sus componentes que hayan sido obtenidos exclusivamente mediante un procedimiento esencialmente biológico.

[0036] Métodos para aumentar la resistencia a Heterodera en una planta, en particular en una planta de la especieBeta vulgaris,así como métodos para producir o identificar y posiblemente seleccionar una planta resistente a Heterodera, también se divulgan en la presente solicitud. La presente solicitud también se refiere a métodos para monitorear una infestación del patógenoHeterodera schachtii,así como oligonucleótidos como sondas y cebadores para la hibridación con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

[0038] La presente invención se refiere a

[0040] [1] una molécula de ácido nuclei

[0041] planta de Beta vulgaris en donde se expresa la molécula de ácido nucleico caracterizada porque la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en:

[0043] (a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs. 1, 4 y 7;

[0044] (b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia codificante seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs. 2, 5 y 8;

[0045] (c) una secuencia de nucleótidos que se híbrida con una secuencia complementaria de una secuencia de nucleótidos de acuerdo con (a), (b), (f) o (g) en condiciones rigurosas;

[0046] (d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (a) o (b);

[0047] (e) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs. 3, 6 y 9;

[0048] (f) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 94 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs. 3, 6 y 9;

[0049] (g) una secuencia de nucleótidos que es una variante de una secuencia de ADN de cualquiera de (a) a (f) debido a la degeneración del código genético, en donde las condiciones rigurosas se definen como hibridación en 4 x SSC a 65 °C y lavado repetido posterior en 0.1 x SSC a 65 °C durante aproximadamente 1 hora en total. La presente solicitud divulga

[0050] [2] una molécula de ácido nucleico de acuerdo con [1], caracterizada porque la molécula de ácido nucleico confiere una resistencia hacia un patógeno del género Heterodera que es dominante en una planta,

[0051] [3] una molécula de ácido nucleico de acuerdo con [1] o [2], caracterizada porque la molécula de ácido nucleico se origina a partir deBeta vulgarissubespeciemarítima.

[0052] [4] La presente invención se refiere a un polipéptido que está codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con [1].

[0053] [5] La presente invención se refiere a un vector o casete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con [1]. La molécula de ácido nucleico es preferiblemente heteróloga al vector o casete de expresión o la molécula de ácido nucleico está preferiblemente unida a un elemento regulador heterólogo, preferiblemente un promotor o terminador.

[0054] [6] La presente invención se refiere a una célula que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con [1] como un transgén, o el vector o casete de expresión de acuerdo con [5].

[0055] [7] La presente solicitud divulga

[0056] una planta o una porción de la misma, caracterizada porque la planta o su porción contiene la molécula de ácido nucleico de acuerdo con uno de [1] a [3] de forma endógena o transgénica, o el vector o casete de expresión de acuerdo con [5], en donde preferiblemente la planta que contiene endógenamente la molécula de ácido nucleico es una planta del género Beta, en particular de la especieBeta vulgaris,- perono Beta vulgarissubespeciemarítima.Preferiblemente dicha planta es una planta que tiene resistencia hacia un patógeno del género Heterodera,

[0057] [8] una planta de acuerdo con [7], caracterizada porque la planta es una planta híbrida,

[0058] [9] una planta de acuerdo con [7] u [8], caracterizada porque la molécula de ácido nucleico está presente de forma heterocigótica u homocigótica en el genoma de la planta.

[0059] [10] La presente solicitud divulga semillas o descendientes de la planta de acuerdo con uno de [7] a [9], en donde la semilla o el descendiente comprende transgénica o endógenamente la molécula de ácido nucleico de acuerdo con uno de [1] a [3], o el vector o casete de expresión de acuerdo con [5].

[0060] [11] La presente invención se refiere a una semilla de una planta de Beta vulgaris, caracterizada porque la planta no esB. vulgarissubespeciemarítima,en donde la semilla comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con [1], en donde la semilla ha sido derivada de una planta producida por el método de acuerdo con [13] a [15] o en donde la semilla no es una semilla de una planta obtenida exclusivamente por medio de un proceso esencialmente biológico, opcionalmente en donde la semilla ha sido tratada técnicamente, con lo cual el tratamiento técnico se selecciona del grupo que consiste en:

[0061] (a) Pulido

[0062] (b) Recubrimiento preferentemente en granulado

[0063] (c) Incrustación

[0064] (d) Coloración.

[0065] [12] La presente invención se refiere a un método para aumentar la resistencia a un nematodo del género Heterodera en una planta de Beta vulgaris, que comprende las siguientes etapas:

[0066] (i) la integración de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con [1] mediante reparación dirigida por homología -preferiblemente, apoyada por una nucleasa dirigida al sitio- en el genoma de al menos una célula de una planta, y regeneración opcional de una planta a partir de la célula de planta; o

[0067] (ii) aumento de la expresión de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con [1] en la planta mediante modificación del promotor nativo o mediante fusión de la molécula de ácido nucleico con un promotor heterólogo que exhibe una mayor actividad en comparación con el promotor nativo; o

[0068] (iii) transformación de una célula de planta con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con [1], o el vector o el casete de expresión de acuerdo con [5], y regeneración de la planta transgénica a partir de la célula de planta transformada.

[0069] [13] La presente invención se refiere a un método para producir una planta de Beta vulgaris con resistencia a un nematodo del género Heterodera, que incluye las siguientes etapas:

[0070] (a) la transformación de una célula de planta con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con [1], o el vector o el casete de expresión de acuerdo con [5]; y

[0071] (b) la regeneración de la planta transgénica a partir de la célula de planta transformada; o

[0072] (i) introducción de una nucleasa dirigida al sitio y una matriz de reparación en una célula de una planta, en donde la nucleasa dirigida al sitio es capaz de generar al menos una rotura de cadena sencilla o al menos una rotura de cadena doble del ADN en el genoma de la célula, preferiblemente, secuencia arriba y/o secuencia abajo de una región objetivo y la matriz de reparación comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con [1];

[0073] (ii) el cultivo de la célula a partir de (i) en condiciones que permitan una reparación dirigida por homología o una recombinación homóloga, en donde la molécula de ácido nucleico se integra desde la matriz de reparación al genoma de la planta; y

[0074] (iii) regeneración de una planta a partir de la célula modificada en (ii).

[0075] [14] La presente invención se refiere a un método de acuerdo con [13], caracterizado porque la región objetivo a) se encuentra entre un marcador de acuerdo con la SEQ ID NO: 10 y un marcador de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, o

[0076] b) está flanqueada por un marcador de acuerdo con la SEQ ID NO: 10 y un marcador de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, o

[0077] c) comprende un intervalo cromosómico entre un marcador de acuerdo con la SEQ ID NO: 10 y un marcador de acuerdo con la SEQ ID NO: 11.

[0078] [15] La presente invención se refiere a un método de acuerdo con [13] o [14], caracterizado porque al menos una rotura de cadena sencilla o al menos una rotura de cadena doble se produce en una posición que está como máximo 10,000 pares de bases secuencia arriba y/o secuencia abajo de la región objetivo.

[0079] [16] La presente solicitud divulga una planta o porción de la misma, obtenida u obtenible mediante un método de acuerdo con uno de [13] a [15].

[0080] [17] La presente invención se refiere a un método para identificar, y opcionalmente proporcionar o seleccionar, una planta de Beta vulgaris resistente a un nematodo del género Heterodera, caracterizado porque el método incluye al menos la etapa (i) o (ii):

[0081] (i) detección de la presencia y/o expresión de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con [1], o la presencia del polipéptido de acuerdo con [4], en la planta de Beta vulgaris o una porción de la planta de Beta vulgaris; y/o (ii) detección de al menos una región que se encuentra entre el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 10 y el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 11, está flanqueada por el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 10 y el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 11, o comprende un intervalo cromosómico entre el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 10 y el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 11, segregándose conjuntamente con la secuencia de nucleótidos de la(s) molécula(s) de ácido nucleico de acuerdo con [1]; y

[0082] (iii) selección opcional de la planta de Beta vulgaris que tiene resistencia a un nematodo del género Heterodera en donde el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 10 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 56940072 pb del cromosoma 5 referenciado al genotipo EL10 de Beta vulgaris, en donde dicho nucleótido es G o T, y el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 11 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 57809807 pb del cromosoma 5 referenciado al genotipo EL10 de Beta vulgaris, en donde dicho nucleótido es G o T

[0083] [18] La presente solicitud divulga un método para la identificación de una molécula de ácido nucleico que, cuando está presente en la planta, es capaz de conferir resistencia a un patógeno del género Heterodera en una planta, preferiblemente en una planta de la especieBeta vulgaris,caracterizado porque el método incluye las siguientes etapas:

[0084] (i) comparación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de acuerdo con [4] con secuencias de aminoácidos de una base de datos de secuencias, o identificación de variantes alélicas que codifican el polipéptido de acuerdo con [4] en genotipos de la planta;

[0085] (ii) identificación de la secuencia de aminoácidos, o una variante alélica, que codifica una secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos es al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 92 %, al menos 94 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de acuerdo con [4];

[0086] (iii) introducción de una molécula de ácido nucleico, o la variante alélica, que codifica la secuencia de aminoácidos identificada en una planta, preferiblemente en una planta de la especieBeta vulgaris,y la expresión de la molécula de ácido nucleico en la planta; y

[0087] (iv) detección de la resistencia hacia un patógeno del género Heterodera.

[0088] [19] La presente solicitud divulga un método para el cultivo de plantas, preferiblemente de plantas de la especieBeta vulgaris,que incluye

[0089] (i) el suministro de plantas de acuerdo con uno de los puntos [7] a [9], la producción de plantas con la ayuda de un método de acuerdo con uno de los puntos [13] a [16], o la identificación y selección de plantas con la ayuda de un método de acuerdo con [17], y

[0090] (ii) el cultivo de las plantas de (i) o de sus descendientes,

[0091] en donde el método contrarresta una infestación de las plantas cultivadas con un patógeno del género Heterodera.

[0092] [20] La presente solicitud divulga un oligonucleótido de al menos 15, 16, 17, 18, 19 o 20 - preferiblemente, al menos 21, 22, 23, 24 o 25, particularmente preferiblemente, al menos 30, 35, 40, 45 o 50, y, particularmente preferiblemente, al menos 100, 200, 300 o 500 - nucleótidos de longitud, cuyo oligonucleótido se hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos como se define en uno de [1] a [3].

[0093] [21] La presente solicitud divulga un par de oligonucleótidos -preferiblemente, oligonucleótidos de acuerdo con [20] o un kit que contiene estos oligonucleótidos- en donde los oligonucleótidos son adecuados para la hibridación como cebador directo y cebador inverso a una región en el genoma deBeta vulgarisque se segrega conjuntamente enBeta vulgariscon la resistencia a un patógeno del género Heterodera conferida por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con uno de [1] a [3], preferiblemente en donde la región en el genoma deBeta vulgarisestá ubicado entre el marcador s5e3001s02 y el marcador s5e4668xxx, está flanqueado por el marcador s5e3001s02 y el marcador s5e4668xxx, o comprende un intervalo cromosómico entre el marcador s5e3001s02 y el marcador s5e4668xxx.

[0094] [22] La presente invención se refiere al uso de un cebador oligonucleotídico de al menos 20 nucleótidos de longitud, oligonucleótido que hibrida específicamente como sonda con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en

[0095] (i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ ID NO 1,4 y 7;

[0096] (ii) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia codificante seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ ID NO 2, 5 y 8;

[0097] (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ ID NO 3, 6 y 9,

[0098] para la amplificación de una región específica de la molécula de ácido nucleico de [1] en una reacción en cadena de la polimerasa.

[0099] [23] La presente solicitud divulga un método, una planta o una porción de planta o un par de oligonucleótidos de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en donde

[0101] s5e3001s02 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), preferiblemente en la posición 56940072 pb del cromosoma 5 referenciado al genotipo EL10 de Beta vulgaris, en donde dicho nucleótido es G o T, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 10, más preferiblemente dicho nucleótido es T; y/o

[0103] s5e4668xxx es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), preferiblemente en la posición 57809807 pb del cromosoma 5 referenciado al genotipo EL10 de Beta vulgaris, en donde dicho nucleótido es G o T, preferiblemente un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) como se establece en la SEQ ID NO: 11, más preferiblemente dicho nucleótido es T

[0105] [24] La presente solicitud divulga la planta de acuerdo con [7] en donde la planta o una semilla precipitada de dicha planta tiene un genoma que permite el desarrollo de un cuerpo de remolacha que tiene una masa fresca mínima de 200 g, 250 g, 300 g, 350 g, 400 g, 450 g o 500 g y una masa máxima de 100 g, 1100 g, 1200 g, 1300 g, 1400 g, 1500 g, 1600 g, 1700 g, 1800 g, 1900 g o 2000 g.

[0107] [25] La presente solicitud divulga la planta de acuerdo con [7] o [24], una planta de remolacha azucarera o una semilla precipitada de dicha planta, en donde el genoma de la planta de remolacha azucarera permite el desarrollo de un cuerpo de remolacha que tiene una concentración de sacarosa en la masa fresca del cuerpo de remolacha de al menos 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o incluso 20 % (porcentaje en masa).

[0109] En primer lugar, se explican en detalle a continuación algunos de los términos utilizados en esta solicitud:

[0110] El géneroHeteroderaabarca varias especies, por ejemplo, la especieHeterodera amygdali, Heterodera arenaria, Heterodera aucklandica, Heterodera avenae, Heterodera bergeniae, Heterodera bifenestra, Heterodera cacti, Heterodera cajani, Heterodera canadensis, Heterodera cardiolata, Heterodera carotae, Heterodera cicero, Heterodera cruciferae, Heterodera delvii, Heterodera elachista, Heterodera filipjevi, Heterodera gambiensis, Heterodera glycines, Heterodera goettingiana, Heterodera hordecalis, Heterodera humuli, Heterodera latipons, Heterodera longicaudata, Heterodera medicaginis, Heterodera oryzae, Heterodera oryzicola, Heterodera rosii, Heterodera rostochiensis, Heterodera sacchari, Heterodera schachtii, Heterodera tabacum, Heterodera trifolii, Heterodera ustinoviyHeterodera zeae.

[0112] Junto con la especificación de una longitud de una secuencia de nucleótidos, el término "aproximadamente" significa una desviación de /- 200 pares de bases, preferiblemente de /- 100 pares de bases y, particularmente preferiblemente, de /- 50 pares de bases.

[0114] Una "planta del género Beta" pertenece a la familia del amaranto (Amaranthaceae). Entre estas plantas se encuentran las de la especieBeta macrocarpa, Beta vulgaris, Beta lomatogona, Beta macrorhiza, Beta corolliflora, Beta trigyna,yBeta nana.Una planta de la especieBeta vulgarises, en particular, una planta de la subespecieBeta vulgarissubespecievulgaris.Por ejemplo, entre estas se encuentran:Beta vulgarissubespecievulgarisvariedadaltissima(remolacha azucarera en sentido estricto),Beta vulgarissubespecievulgarisvariedadvulgaris(acelga)Beta vulgarissubespecievulgarisvariedadconditiva(remolacha común/remolacha roja),Beta vulgarissubespecievulgarisvariedadcrassa/ alba(remolacha forrajera). Se observa que el ácido nucleico de acuerdo con la invención no se encuentra de forma natural en la remolacha azucarera, la acelga, la remolacha común o la remolacha forrajera, sino que puede introducirse en éstas mediante la acción humana.

[0116] Un "fragmento funcional" de una secuencia de nucleótidos significa un segmento de una secuencia de nucleótidos que tiene una funcionalidad idéntica o comparable a la de la secuencia de nucleótidos completa de la que se origina el fragmento funcional. Como tal, el fragmento funcional puede poseer una secuencia de nucleótidos que sea idéntica u homóloga a la secuencia de nucleótidos total en una longitud de al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. Esto también abarca explícitamente el intervalo de 90 - 100 %. Además, un "fragmento funcional" de una secuencia de nucleótidos también puede significar un segmento de una secuencia de nucleótidos que modifica la funcionalidad de toda la secuencia de nucleótidos, por ejemplo, en el curso del silenciamiento genético postranscripcional o transcripcional. Como tal, el fragmento funcional de una secuencia de nucleótidos puede comprender al menos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 - preferiblemente, al menos 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120 o 140, y, particularmente preferiblemente, al menos 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 o 1,000 - nucleótidos sucesivos de la secuencia de nucleótidos total. Esto también abarca explícitamente el intervalo de 21 a 50 nucleótidos.

[0118] Una "parte funcional" de una proteína significa un segmento de una proteína, o una sección de la secuencia de aminoácidos, que codifica la proteína, en donde el segmento puede ejercer una funcionalidad idéntica o comparable a la de la proteína entera en una célula de planta. En una longitud de al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, una parte funcional de una proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica o, teniendo en cuenta los intercambios de aminoácidos conservadores y semiconservadores, similar a la proteína de la que se origina la parte funcional.

[0119] El término "heterólogo" significa que el polinucleótido introducido se origina de una célula o un organismo con un trasfondo genético diferente, de la misma especie o de una especie diferente, o es homólogo de la célula huésped procariota o eucariota, pero luego se encuentra en un entorno genético diferente y, por lo tanto, difiere de un polinucleótido correspondiente que posiblemente esté presente de forma natural. Puede estar presente un polinucleótido heterólogo además de un gen endógeno correspondiente.

[0121] En el sentido de la invención, se entiende por "homólogo" una proteína del mismo origen filogenético; lo que se entiende por un "análogo" es una proteína que ejerce la misma función, pero tiene un origen filogenético diferente; lo que se entiende por un "ortólogo" es una proteína de una especie diferente que ejerce la misma función; y lo que se entiende por un "parálogo" es una proteína que ha aparecido dentro de una especie debido a una duplicación, en donde esta copia o bien conserva la misma función proteica, altera su plantilla de expresión, pero no la función, cambia su función proteica, o bien reparte la función del gen original entre ambas copias.

[0123] Lo que se debe entender por "hibridar" o "hibridación" es un proceso en el cual una molécula de ácido nucleico monocatenario se une a una cadena de ácido nucleico que es complementaria en la mayor medida posible, es decir, forma pares de bases con esta. Los métodos estándar para la hibridación se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Lo que se entiende preferentemente por esto es que al menos el 60 % - más preferentemente al menos el 65 %, 70 %, 75 %, 80 % u 85 % y, de manera particularmente preferida, el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % - de las bases de la molécula de ácido nucleico forman un apareamiento de bases con la cadena de ácido nucleico que es complementaria en la mayor medida posible. La posibilidad de tal hibridación depende de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. El término "rigurosidad" se relaciona con las condiciones de hibridación. Hay alta rigurosidad cuando el emparejamiento de bases se hace más difícil; hay baja rigurosidad si el emparejamiento de bases se hace más fácil. Por ejemplo, la rigurosidad de las condiciones de hibridación depende de la concentración de sal o la fuerza iónica y la temperatura. En general, la rigurosidad se puede aumentar incrementando la temperatura y/o disminuyendo el contenido de sal. Lo que se debe entender por "condiciones de hibridación rigurosas" son aquellas condiciones en las cuales la hibridación se produce predominantemente sólo entre moléculas de ácidos nucleicos homólogas. El término "condiciones de hibridación" se refiere no sólo a las condiciones que prevalecen en la adición real de los ácidos nucleicos, sino también a las condiciones que prevalecen en las siguientes etapas de lavado. Por ejemplo, las condiciones de hibridación rigurosas son condiciones en las cuales, predominantemente, solo se hibridan aquellas moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 70 % - preferiblemente, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % - de identidad de secuencia. Las condiciones de hibridación rigurosas son, por ejemplo: hibridación en 4 x SSC a 65 °C y posterior lavado repetido en 0.1 x SSC a 65 °C durante aproximadamente 1 hora en total. La hibridación se produce preferiblemente en condiciones rigurosas.

[0125] En relación con un ácido nucleico en forma de ADN de doble cadena, secuencia de nucleótidos "complementaria" significa que la segunda cadena de ADN complementaria a la primera cadena de ADN tiene los nucleótidos que corresponden a las bases de la primera cadena, de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases. Una secuencia complementaria es, preferiblemente, completamente complementaria a la contrasecuencia y, por lo tanto, preferiblemente tiene la misma longitud.

[0127] Lo que se entiende por una “molécula de ácido nucleico aislada” es una molécula de ácido nucleico extraída de su entorno natural u original. El término también abarca una molécula de ácido nucleico producida sintéticamente. Se entiende por “polipéptido aislado” un polipéptido extraído de su entorno natural u original. El término también abarca un polipéptido producido sintéticamente.

[0129] Un "marcador molecular" es un ácido nucleico que es polimórfico en una población de plantas y se utiliza como punto de referencia u orientación. Un marcador para la detección de un evento de recombinación debe ser adecuado para monitorear diferencias o polimorfismos dentro de una población de plantas. De este modo, un marcador de este tipo es capaz de detectar y diferenciar entre distintos estados alélicos (alelos). El término "marcador molecular" también se refiere a secuencias de nucleótidos que son complementarias o al menos en gran medida complementarias u homólogas a las secuencias genómicas - por ejemplo, ácidos nucleicos que se utilizan como sondas o cebadores. Estas diferencias a nivel de ADN se pueden encontrar como marcadores y son, por ejemplo, diferencias en la secuencia de polinucleótidos, por ejemplo, de SSR (repeticiones de secuencias simples), de RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción), de FLP (polimorfismos de longitud de fragmentos) o de SNP (polimorfismos de un solo nucleótido). Los marcadores pueden derivarse de ácidos nucleicos genómicos o expresados, por ejemplo, ARN empalmado, ADNc o de EST, y también pueden estar relacionados con ácidos nucleicos que se utilizan como sondas o pares de cebadores y, como tales, son adecuados para amplificar un fragmento de secuencia utilizando métodos basados en<p>C<r>. Los marcadores que describen polimorfismos genéticos (entre partes de una población) pueden detectarse utilizando métodos bien establecidos de la técnica anterior (An Introduction to Genetic Analysis, 7.a edición, Griffiths, Miller, Suzuki, et al., 2000). Por ejemplo, entre estas se encuentran la secuenciación de ADN, la amplificación específica de secuencia basada en PCR, la verificación de RFLP, la verificación de polimorfismos de polinucleótidos mediante hibridación específica de alelo (ASH), la detección de secuencias variables amplificadas del genoma de la planta, la detección de un 3SR (replicación de secuencia autosostenida), detección de SSR, de SNP, de RFLP o de AFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados). Además, los métodos de detección de EST (etiquetas de secuencia expresada) y marcadores SSR derivados de secuencias EST y RAPD (ADN polimórfico amplificado aleatoriamente) también son conocidos. Dependiendo del contexto, el término "marcador" en la descripción también puede significar una posición cromosómica específica en el genoma de una especie donde se puede encontrar un marcador específico (SNP, por ejemplo).

[0131] Los marcadores también incluyen oligonucleótidos sintéticos que pueden estar conectados con una o más moléculas de detección, en donde las moléculas de detección pueden usarse para una reacción de detección o la generación de una señal dentro del alcance de un método de verificación. Los oligonucleótidos sintéticos también incluyen cebadores marcados. Los cebadores marcados son compuestos artificiales, no existen en la naturaleza y no se pueden aislar de la naturaleza. La producción de dichos compuestos se explica con más detalle a continuación.

[0133] Un "promotor" es una secuencia de ADN reguladora no traducida, normalmente secuencia arriba de una región codificante, que contiene el punto de unión de la ARN polimerasa e inicia la transcripción del ADN. Un promotor contiene además otros elementos que actúan como gen regulador de la expresión genética (por ejemplo, elementos reguladores en cis). Un "promotor central o mínimo" es un promotor que tiene los elementos básicos necesarios para la iniciación de la transcripción (por ejemplo, caja TATA y/o iniciador).

[0135] Un "patógeno" significa un organismo que, en interacciones con una planta, provoca síntomas de enfermedad en uno o más órganos de la planta. Tal como se utiliza en el presente documento, patógeno significa un nematodo, en particular un nematodo del género Heterodera.

[0137] Lo que se entiende por "infección patógena" es el momento más temprano en donde un patógeno interactúa con un tejido de planta huésped. En este sentido, se entiende por “infestación” la ocurrencia de contacto entre el patógeno y el huésped. En el caso deHeterodera schachtii,los quistes se activan en el suelo, los juveniles eclosionarán cuando se complete el desarrollo a juveniles de segunda etapa e infestarán las raíces de las plantas hospedantes. Los nematodos penetran en la zona de alargamiento detrás de la punta de la raíz e inician la transformación de las células de la raíz en sincitios (estructuras de alimentación especializadas). Los sincitios aumentan simultáneamente con el desarrollo del nematodo hasta convertirse en adultos y pueden provocar un deterioro del funcionamiento de las raíces, lo que limita el rendimiento del cultivo y produce pérdidas de rendimiento. Sin plantas hospedantes,Heterodera schachtiipuede sobrevivir dentro de quistes en el suelo durante años.

[0139] Por "órganos" de plantas se entiende, por ejemplo, hojas, brotes, tallos, raíces, hipocótilos, yemas vegetativas, meristemos, embriones, anteras, óvulos, semillas o frutos. Las "partes de la planta" incluyen, pero no se limitan a, el brote o el tallo, las hojas, las flores, la inflorescencia, las raíces, los frutos y las semillas, así como el polen. El término "partes de la planta" también significa una asociación de múltiples órganos, por ejemplo, una flor o una semilla, o una parte de un órgano, por ejemplo, una sección transversal del brote de la planta. Los "tejidos" de plantas son, por ejemplo, el tejido calloso, el tejido de almacenamiento, el tejido meristemático, el tejido foliar, el tejido de los brotes, el tejido radicular, el tejido tumoral de planta o el tejido reproductivo, así como el cambium, el parénquima, el tejido vascular, el esclerénquima y la epidermis. Sin embargo, el tejido no se limita a esta lista. Por ejemplo, se deben entender por "células" de plantas, por ejemplo, células aisladas que tienen una pared celular o agregados de las mismas, o bien protoplastos.

[0141] En conjunción con la presente invención, el término "secuencia reguladora" se refiere a una secuencia de nucleótidos que influye en la especificidad y/o la fuerza de expresión, por ejemplo, ya que la secuencia reguladora confiere una especificidad tisular definida. Dicha secuencia reguladora puede estar ubicada secuencia arriba del punto de inicio de la transcripción de un promotor mínimo, pero también secuencia abajo del mismo, por ejemplo,en una secuencia líder transcrita, pero no traducida, o dentro de un intrón. El término "secuencia reguladora" también puede abarcar un promotor completo o un elemento en cis que sea adecuado para ser utilizado dentro de un promotor.

[0143] El término "resistencia" debe entenderse en sentido amplio y cubre el espectro de protección que va desde un retraso hasta un bloqueo completo del desarrollo de la enfermedad. Un ejemplo de un patógeno importante esHeterodera schachtii.Una célula de planta resistente de la invención o una planta resistente de la invención preferiblemente logra una resistencia aHeterodera schachtiique se define como la capacidad de una planta para limitar la multiplicación de nematodos. Por ejemplo, se puede medir un aumento en la resistencia tomando muestras de suelo y determinando la cantidad de nematodos y/o determinando la cantidad de quistes formados en las raíces de las plantas.

[0144] "Planta transgénica" se refiere a una planta en cuyo genoma está integrado al menos un polinucleótido. Puede tratarse de un polinucleótido heterólogo o de un polinucleótido exógeno. El polinucleótido está, preferiblemente, integrado de forma estable, lo que significa que el polinucleótido integrado se conserva de forma estable en la planta, se expresa y también puede transmitirse de forma estable a los descendientes. La introducción estable de un polinucleótido en el genoma de una planta también incluye la integración en el genoma de una planta de la generación parental precedente, de modo que el polinucleótido puede transmitirse de forma estable en el futuro. El término "heterólogo" significa que el polinucleótido introducido se origina de una célula o un organismo con un trasfondo genético diferente, en donde la célula o el organismo puede pertenecer a la misma especie o a una especie diferente, o es homólogo a la célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo, pero luego se encuentra en un entorno genético diferente y, por lo tanto, difiere de un polinucleótido correspondiente que posiblemente esté presente de forma natural. Puede estar presente un polinucleótido heterólogo además de un gen endógeno correspondiente.

[0146] Tal como se utiliza en el presente documento, planta significa cualquier planta dicotiledónea o monocotiledónea, en particular una planta de la familia Amaranthaceae, tal comoBeta vulgarisyEspinada olerácea,y Brassicacea, tal comoBrassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Raphanus sativus, Brassica juncacea, Brassica nigra, Eruca vesicaria subespecie sativa.

[0148] Los diseños y realizaciones se describen a modo de ejemplo con referencia a las secuencias y figuras pendientes.

[0150] Fig. 1 Ilustración del mapeo y ensamblaje de la secuencia dentro de la región objetivo en el cromosoma 5 (eje x: distancia física en miles de pares de bases (1k = 1000 pb)):

[0152] Parte superior = ensamblaje de nueve genes anotados (#1 - #9); la dirección de las puntas de flecha simboliza la dirección 5'-3' de cada gen putativo.

[0154] Parte media = las ilustraciones de diferentes introgresiones genéticas de accesos de eventos de recombinación deB. vulgarissubespeciemarítima(BM) se indican de acuerdo con su localización.

[0156] Parte inferior = mapeo físico de los genes candidatos LRR1, LRR2 y LRR3 de acuerdo con las SEQ ID Nos 1, 4 y 7.

[0158] Descripción detallada de la invención

[0160] La presente solicitud se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de conferir resistencia a un patógeno del género Heterodera cuando está presente en una planta, en particular - en una planta de la especieBeta vulgaris,más preferiblemente enBeta vulgarissubespecievulgaris.En particular, la molécula de ácido nucleico confiere resistencia hacia un patógeno del género Heterodera en una planta en donde se expresa el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico. De acuerdo con la divulgación, el patógeno esHeterodera schachtii,que es uno de los nematodos patógenos más importantes de la remolacha azucarera y puede causar pérdidas de rendimiento de hasta el 80 %.Heterodera schachtiipuede provocar pérdidas considerables de rendimiento no sólo en la remolacha azucarera, sino también en otras remolachas como la remolacha roja y plateada, el ruibarbo y la espinaca, así como en cultivos de hortalizas del género Brassica, como coles, coles chinas, coliflores, coles de Bruselas, brócoli, nabos, rábanos y colinabos, al dañar gravemente el sistema radicular.

[0162] La presente solicitud se basa en el mapeo genético fino, la identificación, el aislamiento y la caracterización de un gen y de un lugar génico, respectivamente, que se originan del donanteBeta vulgarissubespeciemarítima,cuya presencia en una planta - en particular, enBeta vulgarissubespecievulgaris- se correlaciona con o es causante de la resistencia de la planta en cuestión a la infección con Heterodera. El material inicial fue una población deBeta vulgarissubespeciemarítimarecogida en Francia (Hijner 1951).

[0164] Mediante mapeo fino intensivo y clonación basada en mapas se ha identificado y secuenciado un lugar de resistencia permitiendo hacer comparaciones de secuencia entre el genotipo resistente y el de referencia sensible (Fig. 1). Se demostró que la región objetivo tiene un alto grado de complejidad ya que el lugar de resistencia contiene grandes duplicaciones de secuencia y, en particular, en los genotipos sensibles varios retrotransposones están incrustados en la región objetivo. Se encontró que el lugar de resistencia contenía siete genes anotados, incluidos tres genes LRR repetidos en tándem que se identificaron como genes candidatos que confieren resistencia a Heterodera (LRR1, LRR2 y LRR3), donde los tres genes LRR muestran similitud de secuencia.

[0166] Por lo tanto, la presente solicitud se refiere a una molécula de ácido nucleico y a un polipéptido codificado por dicha molécula de ácido nucleico, respectivamente, que confieren preferentemente una resistencia frente a un patógeno del género Heterodera, en particular frente aHeterodera schachtii.La molécula de ácido nucleico de la presente invención confiere - en particular, en una planta del género Beta - una resistencia a este patógeno. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede ser una molécula de ácido nucleico aislada. Se trata preferentemente de ADN y, de forma especialmente preferente, de ADNc (ADN codificante). La planta es preferiblemente una planta de la especieBeta vulgaris- de manera especialmente preferente, una planta de la subespecieBeta vulgarissubespecievulgaris;entre ellas se encuentran, por ejemplo, las variedades de cultivo de remolacha azucarera, remolacha común, remolacha forrajera, acelga y acelga suiza.

[0168] En una realización de la presente invención, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención comprende una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de ADN establecida en una cualquiera de las SEQ ID Nos: 1, 4 y 7 y/o la secuencia codificante de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID Nos: 2, 5 y 8. Además, la presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una de las SEQ ID Nos: 3, 6 y 9.

[0170] Como se mencionó anteriormente, el gen identificado de acuerdo con la invención es un gen/proteína de resistencia del tipo NBS-LRR, que se caracteriza por motivos estructurales específicos. La estructura general de dichas proteínas de resistencia en las plantas ya ha sido bien estudiada (Martin et al., Annual Review Plant Biology 54 (2003), 23-61). Sin embargo, el principio de la realización estructural -en particular, de lo que se conoce como el dominio LRR, que se aplica como un dominio de detección potencial para la mayoría de los efectores patógenos desconocidos- es impredecible y el trasfondo funcional de los genes de resistencia, es decir, la estructura genética, por lo general, es en gran parte desconocida. Por consiguiente, la identificación de un gen o proteína que confiere resistencia a Heterodera basándose únicamente en el motivo estructural conocido es, en consecuencia, imposible. Además, la región de secuencia ha resultado tener un alto grado de complejidad ya que el lugar de resistencia contiene una gran duplicación de secuencia y en genotipos sensibles varios retrotransposones están incrustados en la región diana, lo que hace especialmente difícil el desarrollo de marcadores de diagnóstico, así como el ensamblaje de datos de secuencia.

[0172] Además, se pueden introducir sustituciones, eliminaciones, inserciones, adiciones y/o cualquier otro cambio en la secuencia de ADN de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención que, solos o en combinaciones, de hecho, cambien la secuencia de nucleótidos, en donde la secuencia de nucleótidos modificada puede, sin embargo, realizar la misma función que la secuencia inicial. El presente caso abarca una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que es un alelo o derivado de la secuencia de ácido nucleico no modificada de la presente invención y que cuando está presente en la planta confiere resistencia hacia un patógeno del género Heterodera, en particular aHeterodera schachtii.Además, el presente caso trata de la codificación de una secuencia de aminoácidos que confiere resistencia a un patógeno del género Heterodera, en particular aHeterodera schachtii.En una realización adicional, la invención incluye por tanto una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que representa un derivado del polipéptido que está codificado por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención, o que incluye la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la invención. Una secuencia de aminoácidos derivada que tiene al menos una sustitución, eliminación, inserción o adición de uno o más aminoácidos, en donde se conserva la funcionalidad del polipéptido/proteína codificado, representa un derivado del polipéptido. Sustituciones, eliminaciones, inserciones, adiciones y/o cualquier otro cambio, ya sea solo o en combinación, que de hecho cambien la secuencia de nucleótidos, pero realicen la misma función que la secuencia inicial, pueden introducirse en la secuencia de nucleótidos utilizando métodos convencionales que se conocen en la técnica anterior, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, TILLING, mutagénesis mediada por PCR, mutagénesis inducida químicamente, edición del genoma, etc.

[0174] La sustitución de un aminoácido por un aminoácido diferente que tenga propiedades químicas/físicas iguales o equivalentes o similares se denomina "sustitución conservadora" o "sustitución semiconservadora". Ejemplos de propiedades físicas/químicas de un aminoácido son, por ejemplo, la hidrofobicidad o la carga. El experto en la materia sabe qué sustitución de aminoácido representa una sustitución conservadora o semiconservadora. Además, la experiencia general permite al experto en la materia reconocer, identificar y detectar qué eliminaciones y adiciones de aminoácidos son inocuas para la funcionalidad de la proteína de resistencia y en qué posiciones son posibles. El experto en la materia es consciente de que, en el caso de la presente proteína NBS-LRR, para las modificaciones de la secuencia de aminoácidos (sustituciones, eliminaciones, inserciones o adiciones de uno o más aminoácidos), debe conservarse la funcionalidad, en particular, de los dominios conservados, y que por tanto sólo son posibles modificaciones precedentes limitadas en estos dominios.

[0175] La divulgación por lo tanto incluye un fragmento funcional de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención. El término "fragmento" incluye entonces genes con una secuencia de nucleótidos suficientemente similar a la secuencia de nucleótidos antes mencionada. El término "suficientemente similar" significa que una primera secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos tiene un número suficiente o mínimo de nucleótidos o grupos de aminoácidos idénticos o equivalentes en relación con una segunda secuencia de nucleótidos o una segunda secuencia de aminoácidos.

[0177] Respecto a la secuencia de aminoácidos, después de una modificación por ejemplo a través de uno de los métodos antes mencionados, ésta también tiene un dominio estructural común y/o posee una actividad funcional común. Las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos que tienen una identidad de al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o al menos 100 % con la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos de acuerdo con la invención se definen en este documento como suficientemente similares. Esto también abarca explícitamente el intervalo del 90 % al 100 %. Para los fragmentos funcionales, se establece una similitud suficiente si la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos generalmente tiene la misma propiedad que la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente de la presente invención. Las secuencias de nucleótidos que codifican un derivado o codifican una secuencia de aminoácidos derivada se generan ya sea directa o indirectamente (por ejemplo, a través de etapas de amplificación o replicación) a partir de una secuencia de nucleótidos inicial que corresponde a la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención en toda su longitud, o al menos en parte.

[0179] Por consiguiente, la presente invención incluye una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar, en condiciones rigurosas, con una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención o a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la invención y en donde dicha secuencia de nucleótidos, preferiblemente cuando está presente y/o expresada en una planta, es capaz de conferir resistencia hacia un nematodo del género Heterodera.

[0181] Además, es comúnmente conocido que el código genético es redundante, por lo que exhibe una multiplicidad de combinaciones de codones de tres pares de bases que especifican un aminoácido. Así, la presente invención incluye una secuencia de ADN variante debido a la degeneración del código genético, que sin embargo todavía preferiblemente cuando está presente y/o expresada en una planta es capaz de conferir resistencia hacia un patógeno del género Heterodera.

[0183] De acuerdo con la presente divulgación, la o las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, ya sea solas o en combinación, confieren resistencia hacia un patógeno del género Heterodera, preferiblemente cuando están presentes y/o expresadas en una planta, más preferiblemente en donde la resistencia hacia un patógeno del género Heterodera es una resistencia aHeterodera schachtiiy/o la planta es una planta de la subespecieBeta vulgarissubespecievulgaris.

[0185] La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o el lugar de resistencia de la presente invención se caracterizan porque, preferiblemente cuando están presentes en una planta y/o tras su expresión en una planta, confieren un efecto de resistencia dominante contra un patógeno del género Heterodera -preferiblemente, contraHeterodera schachtii- o codifica polipéptidos que son capaces de conferir un efecto de resistencia dominante contra un patógeno del género Heterodera - preferiblemente, contraHeterodera schachtii.

[0187] De acuerdo con la presente invención, una molécula de ácido nucleico confiere resistencia frente a un patógeno del género Heterodera, en particular aHeterodera schachtii,preferiblemente cuando esté presente y/o se exprese en una planta, preferiblemente en una planta de la subespecieBeta vulgarissubespecievulgaris,en donde las al menos dos o tres moléculas de ácido nucleico se seleccionan del grupo que consiste en:

[0189] (a) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la presente invención que comprende la secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID No. 1, la secuencia de ADNc expuesta en la SEQ ID No. 2, que se hibrida con una secuencia complementaria de una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID No. 1 o 2, que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No. 3 y/o que es uno de los alelos, derivados o variantes mencionados anteriormente de la secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos;

[0191] (b) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la presente invención que comprende la secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID No. 4, la secuencia de ADNc expuesta en la SEQ ID No. 5, que hibrida con una secuencia complementaria de una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID No. 4 o 5, que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No. 6 y/o que es uno de los alelos, derivados o variantes mencionados anteriormente de la secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos;

[0193] (c) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la presente invención que comprende la secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID No. 7, la secuencia de ADNc expuesta en la SEQ ID No. 8, que hibrida con una secuencia complementaria de una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID No. 7 u 8, que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No. 9 y/o que es uno de los alelos, derivados o variantes mencionados anteriormente de la secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos.

[0195] Como se divulga, una combinación de dos moléculas de ácido nucleico descritas en (a) y (b) confiere resistencia a Heterodera, en particular aHeterodera schachtiicuando esté presente en una planta, preferiblemente en una planta de la especieBeta vulgaris.

[0197] Como se divulga, una combinación de las dos moléculas de ácido nucleico descritas en (a) y (c) confiere resistencia a Heterodera, en particular aHeterodera schachtiicuando esté presente en una planta, preferiblemente en una planta de la especieBeta vulgaris.

[0198] Como se divulga, una combinación de las dos moléculas de ácido nucleico descritas en (b) y (c) confiere resistencia a Heterodera, en particular aHeterodera schachtiicuando esté presente en una planta, preferiblemente en una planta de la especieBeta vulgaris.

[0200] La combinación puede ser una o más moléculas de ácido nucleico. Sin embargo, la combinación también se puede incluir en un kit. Si la combinación está incluida en un kit, los ácidos nucleicos (a) (b) y/o (c) de la combinación como se describió anteriormente pueden ser todos parte de una molécula de ácido nucleico o pueden ser parte de moléculas de ácido nucleico distintas.

[0202] En este contexto, también se divulgan los polipéptidos/proteínas codificados por la combinación tal como se define anteriormente. La combinación de proteínas puede estar comprendida en un kit que también es parte de la invención.

[0204] Además, se divulga una planta que comprende una combinación de moléculas de ácido nucleico como se describió anteriormente. La combinación puede ser parte de la planta de forma transgénica o endógena. Además, una o dos de las secuencias pueden ser parte de la planta como transgenes, mientras que las otras una o dos secuencias son parte de las plantas como endógenos.

[0206] En otra realización, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención se caracteriza porque, preferiblemente cuando está presente en una planta o tras su expresión en una planta, ya por sí sola confiere un efecto de resistencia dominante contra un patógeno del género Heterodera - preferiblemente contraHeterodera schachtii-o que codifica un polipéptido capaz de conferir un efecto de resistencia dominante contra un patógeno del género Heterodera.

[0208] Como se divulga, la molécula de ácido nucleico descrita en (b) en el contexto de la combinación de moléculas de ácido nucleico inventivas confieren resistencia hacia un patógeno del género Heterodera, en particular aHeterodera schachtii,preferiblemente cuando esté presente y/o se exprese en una planta, en particular en una planta de la subespecieBeta vulgarissubespecievulgaris.

[0210] Como se divulga, la molécula de ácido nucleico descrita en (c) en el contexto de la combinación de moléculas de ácido nucleico inventivas confiere resistencia hacia un patógeno del género Heterodera, en particular aHeterodera schachtii,preferiblemente cuando esté presente y/o se exprese en una planta, en particular en una planta de la especieBeta vulgaris.

[0212] Como se divulga, las moléculas de ácido nucleico descritas en (a) en el contexto de la combinación de moléculas de ácido nucleico inventivas confieren resistencia hacia un patógeno del género Heterodera, en particular aHeterodera schachtiicuando esté presente y/o se exprese en una planta, en particular en una planta de la subespecieBeta vulgarissubespecievulgaris.

[0214] Como ya se ha descrito anteriormente, hasta ahora, las plantas deBeta vulgarissubespecievulgarisresistentes a Heterodera no se podrían generar sin introducir también características a menudo no deseadas, como por ejemplo un rendimiento reducido, debido a la herencia de genes adicionales vinculados con la característica positiva de la resistencia a Heterodera. Una desventaja de las variedades de cultivo que tienen las resistencias descritas consiste en que el desarrollo de la variedad cultivada es muy laborioso y complicado debido a la herencia complicada, y en que dichas variedades de cultivo tienen un rendimiento marcadamente más pobre en relación con las variedades de cultivo normales, en ausencia de una infestación. Entre otras cosas, esto puede estar relacionado con la interacción epigenética de algunos genes de resistencia con genes que son responsables de la producción de azúcar, lo que conduce a una menor aptitud de las plantas en ausencia del patógeno.

[0216] Además, para el fitomejoramiento sostenible contra el nematodo del quiste de la remolacha, es decir para contrarrestar el peligro de variantes deHeterodera schachtiique superan la resistencia, es necesario identificar continuamente nuevos genes de resistencia e integrarlos en los acervos genéticos de plantas cultivadas como la remolacha azucarera.

[0218] En este contexto, los inventores aislaron e identificaron por primera vez un nuevo gen de resistencia a Heterodera que puede utilizarse para un cultivo notablemente simplificado. Gracias a la incorporación dirigida y facilitada de este gen en líneas de élite, ahora es posible desarrollar muy rápidamente variedades de muy alto rendimiento con una alta resistencia a Heterodera y proporcionar un gen de resistencia adicional que podría usarse para combatir las variantes de Heterodera que han superado la resistencia tradicional. Los posibles accesos para la introgresión de una o más de las secuencias que confieren resistencia de acuerdo con la invención se pueden adquirir, por ejemplo, mediante la selección de poblaciones deB. vulgaris subespecie marítima.La selección puede basarse en la identificación de una planta que comprende una o más secuencias que confieren resistencia de acuerdo con la invención. La identificación puede tener lugar como se describe en otra parte del presente documento. Preferiblemente, la selección o la identificación incluye el uso de marcadores moleculares diagnósticos para el lugar de resistencia. Además, las plantas que contienen las secuencias que confieren resistencia se pueden adquirir a través de CPO Wageningen, Postbus 18, 6700 AA Wageningen/NL, por ejemplo, a partir del acceso a BMH.

[0219] Como se divulga, se proporciona por primera vez una planta deBeta vulgarissubespecievulgariscomo una planta de remolacha azucarera, la acelga, la remolacha roja o la remolacha forrajera, que tiene resistencia contra un patógeno del género Heterodera, en particular contraHeterodera schachtii.Las plantas enumeradas son todas plantas cultivadas, cultivos o plantas que son adecuadas para el cultivo agrícola y que tienen resistencia. En particular, estos cultivos contienen un órgano de almacenamiento subterráneo que puede utilizarse como alimento, materia prima o fuente industrial de azúcares u otros compuestos químicos y que comprende la resistencia. El órgano de almacenamiento puede ser, por ejemplo, el cuerpo de remolacha de la remolacha azucarera que contiene sacarosa, el cuerpo de remolacha consumible de la remolacha roja o el cuerpo de remolacha comestible de la remolacha forrajera. Los órganos de almacenamiento subterráneos pueden representar más del 50 % y, en el caso de la remolacha azucarera, incluso más del 70 % de la biomasa total de la planta adulta. Además, también se divulgan semillas o material de siembra de estas plantas. Las semillas o el material de siembra pueden tratarse técnicamente como se describe más adelante.

[0221] La presente divulgación incluye un ácido nucleico que codifica la proteína de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID Nos. 3, 6 y 9, en donde, en una realización específica, se excluye el ácido nucleico de origen natural de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID Nos. 1, 4 y 7.

[0223] Además, la presente divulgación se refiere a una molécula de ADN recombinante y/o heteróloga que comprende las secuencias de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Esta molécula de ADN, además, tiene preferentemente una secuencia reguladora. Por lo tanto, puede estar vinculada operativamente con esta secuencia reguladora o estar bajo la influencia de esta secuencia reguladora. Esta secuencia reguladora es preferiblemente una secuencia promotora y/u otras secuencias de elementos de control de transcripción o traducción - por ejemplo, elementos cis. La secuencia reguladora, que controla la expresión de un gen que incluye la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, es preferiblemente una secuencia que es capaz de conferir o modular la expresión, como resultado de una infección patógena. Este promotor es preferiblemente capaz de controlar la expresión de la secuencia de ADN específicamente en las raíces de la planta. La secuencia reguladora puede ser heteróloga a la secuencia de expresión. Este enfoque tiene la ventaja de que el experto en la materia puede ajustar mejor la tasa de expresión de la secuencia que se va a expresar, el tejido en donde se produce la expresión y el punto en el tiempo en donde se produce la expresión, de modo que selecciona la secuencia reguladora que mejor se adapta al caso de uso respectivo. La secuencia de ADN heteróloga incluye preferiblemente una secuencia de nucleótidos que codifica un componente de la defensa contra patógenos de las plantas (ejemplo: genes de resistencia (genes R) o genes que codifican enzimas implicadas en la transferencia de señales, como quinasas o fosfatasas, y para la proteína G, o que codifican un efector patógeno (lo que se conoce como genes de avirulencia)(avr))).La secuencia de ADN heteróloga puede ser una de las secuencias de ADN de acuerdo con la invención. La secuencia de ADN heteróloga también puede codificar adicionalmente otros componentes de la defensa contra patógenos de las plantas. Por lo tanto, la secuencia de ADN heteróloga puede diseñarse de tal manera que se cree un ARNm policistrónico después de su transcripción.

[0225] La presente solicitud se refiere además a un polipéptido que puede ser codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y un fragmento funcional y/o inmunológicamente activo del mismo, así como a un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido o a su fragmento. El polipéptido tiene de manera particularmente preferible una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID Nos. 3, 6 o 9. La producción recombinante de proteínas, polipéptidos y fragmentos es familiar para el experto en la materia (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, o Wingfield, PT, 2008, Production of Recombinant Proteins, Current Protocols in Protein Science, 52: 5.0:5.0.1-5.0.4). Los anticuerpos policlonales o monoclonales contra la proteína de acuerdo con la invención pueden ser producidos por el experto en la materia de acuerdo con métodos conocidos (E. Harlow et al., editor, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)). La producción de anticuerpos monoclonales, así como de fragmentos Fab y F(ab')<2>que también son útiles en los métodos de detección de proteínas pueden realizarse mediante diversos métodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 98-118, Nueva York: Academic Press (1983)). Los anticuerpos pueden luego usarse para la selección de bibliotecas de expresión de ADNc con el fin de identificar genes idénticos homólogos o heterólogos por medio de selección inmunológica (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, o Ausubel et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology". John Wiley & Sons), o puede utilizarse para análisis de transferencia Western. En particular, la presente divulgación se refiere a anticuerpos que detectan selectivamente un polipéptido codificado por el alelo que confiere resistencia a Heterodera de acuerdo con la invención, y esencialmente no detectan el polipéptido codificado por el alelo sensible correspondiente, es decir, que detectan menos, por un factor de 2 - preferiblemente, un factor de 5, y, más preferiblemente, un factor de 10 o más - del polipéptido codificado por el alelo correspondientemente sensible que el polipéptido codificado por el alelo que confiere resistencia a Heterodera de acuerdo con la invención.

[0227] Como se divulga, el anticuerpo se caracteriza porque es un polipéptido sintético que no existe en la naturaleza.

[0228] Además, los anticuerpos tal como se divulgan pueden unirse con un colorante fluorescente para poder usarse en un método inmunohistoquímico, por ejemplo, y evocar una coloración de anticuerpo. El colorante fluorescente puede ser fluorocromo. Los anticuerpos también pueden estar presentes unidos a otras moléculas de señalización. Entre ellas se encuentran, por ejemplo, la biotina, los radioisótopos, las enzimas reporteras como la fosfatasa alcalina o los oligonucleótidos.

[0230] Un objetivo adicional de la invención son vectores o casetes de expresión que incluyen la molécula de ácido nucleico o la molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención - posiblemente bajo el control de elementos reguladores y, en particular, bajo el control de elementos reguladores funcionales en plantas, así como marcadores de selección negativos y/o positivos. De este modo, la estructura principal del vector es heteróloga a la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, lo que significa que dicho vector no existe en la naturaleza y no puede aislarse de la naturaleza. El vector es un plásmido, un cósmido, un fago o un vector de expresión, un vector de transformación, un vector lanzadera o un vector de clonación; puede ser bicatenario o monocatenario, lineal o circular; o puede transformar un organismo procariota o eucariota ya sea mediante integración en su genoma o extracromosómicamente. La molécula de ácido nucleico o molécula de ADN de acuerdo con la invención en un vector de expresión o casete de expresión está, preferiblemente, unida operativamente con una o más secuencias reguladoras que permiten la transcripción y, opcionalmente, la expresión en una célula procariota o eucariota; (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001). Estas secuencias reguladoras son preferiblemente promotores o terminadores - en particular, un punto de inicio de la transcripción, una ubicación de unión del ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, una ubicación de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en el presente documento bajo el control de un promotor y/o un terminador adecuado. Los promotores adecuados pueden ser promotores constitutivos (ejemplo: Promotor 35S del "virus del mosaico de la coliflor" (Odell et al., Nature 313 (1985), 810 812); aquellos promotores que son inducibles patógenamente son especialmente adecuados (ejemplo: Promotor PR1 del perejil (Rushton et al., EM<b>O J. 15 (1996), 5,690-5,700)). Los promotores inducibles patogénicamente particularmente adecuados son promotores sintéticos o quiméricos que no existen en la naturaleza, están compuestos de múltiples elementos, y contienen un promotor mínimo y tienen al menos un elemento regulador en cis secuencia arriba del promotor mínimo, cuyo al menos un elemento regulador en cis sirve como lugar de unión para factores de transcripción especiales. Los promotores quiméricos se diseñan de acuerdo con los requisitos deseados y se inducen o reprimen a través de diferentes factores. Se encuentran ejemplos de tales promotores en los documentos WO 00/29592, WO 2007/147395, y WO 2013/091612. Por ejemplo, un terminador adecuado es el terminador nos (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 561-573).

[0231] Los promotores y terminadores adecuados también pueden ser el promotor nativo y el terminador nativo. Los vectores o casetes de expresión contienen además genes indicadores/reporteros convencionales o genes de resistencia para la detección de la transferencia del vector o molécula de ADN/molécula de ácido nucleico deseado, y para la selección de los individuos que los contienen, ya que una detección directa a través de la expresión del gen es en la mayoría de los casos bastante difícil. Dado que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención codifica por sí misma un polipéptido que confiere resistencia al nematodo del quiste de la remolacha, no es esencial para la expresión en células de plantas proporcionar un gen de resistencia adicional; sin embargo, se recomienda para permitir una selección rápida.

[0233] Ejemplos de genes indicadores/reporteros son, por ejemplo, el gen de la luciferasa y el gen que codifica la proteína verde fluorescente (GFP). Estos, además, también permiten realizar pruebas de la actividad y/o regulación de un promotor del gen. Ejemplos de genes de resistencia - especialmente, para transformaciones de plantas - son el gen de la neomicina fosfotransferasa, el gen de la higromicina fosfotransferasa o el gen que codifica la fosfinotricina acetiltransferasa. Los marcadores de selección positivos adicionales pueden ser enzimas que proporcionan a la planta transformada una ventaja de selección sobre la planta no transformada - en particular, una ventaja nutricional, por ejemplo, la manosa-6-fosfato isomerasa o la xilosa isomerasa. Sin embargo, esto no excluye el material de genes indicadores/reporteros o genes de resistencia adicionales conocidos por el experto en la materia. En una realización preferida, el vector es un vector de planta. Además, el casete de expresión puede estar presente como integrado en un genoma de planta.

[0235] En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a células que incluyen los vectores, moléculas de ADN recombinante y/o moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Una célula en el sentido de la invención puede ser una célula procariota (por ejemplo, bacteriana) o eucariota (por ejemplo, una célula de planta o una célula de levadura). La célula es preferiblemente una agrobacteria comoAgrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes,una célula deEscherichia coli,o una célula de planta; la célula de planta es particularmente preferiblemente una célula de una planta del géneroBeta,la especieBeta vulgaris,o la subespecieBeta vulgarissubespecievulgaris.La célula también puede estar presente como cultivo. La invención comprende también, en consecuencia, un cultivo celular que contiene dichas células. El cultivo celular es preferiblemente un cultivo puro o un aislado que no contenga células de otro tipo.

[0237] El experto en la materia conoce tanto numerosos métodos, como la conjugación o la electroporación, con los que puede introducir la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, la molécula de ADN recombinante y/o el vector o el casete de expresión de la presente invención en una agrobacteria, y métodos tales como diversos métodos de transformación (transformación biolística, transformación mediada por agrobacteria) con los que puede introducir la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, la molécula de ADN y/o el vector de la presente invención en una célula de planta (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.

[0238] Además, la presente divulgación se refiere preferiblemente a una planta resistente a Heterodera -preferiblemente, una planta de la especieBeta vulgarissubespecievulgariso una porción del mismo - que contiene la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención que confiere resistencia a Heterodera. La planta resistente a Heterodera puede contener la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención como un transgén o como un endógeno. De acuerdo con la divulgación, por primera vez, se han identificado plantas de las subespeciesBeta vulgarissubespecievulgarisque contienen las moléculas de ácido nucleico descritas. La divulgación también incluye plantas de la subespecieBeta vulgarissubespecievulgarisque contienen la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención como un endógeno.

[0240] Una porción puede ser por lo tanto una célula, un tejido, un órgano o una combinación de múltiples células, tejidos u órganos. Una combinación de varios órganos es, por ejemplo, una flor o una semilla. Una planta resistente a Heterodera de la presente invención preferiblemente muestra una resistencia mejorada a Heterodera, - en particular,Heterodera schachtii- que una planta correspondiente que no contiene la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención (planta de control). La planta de control idealmente tiene el genotipo idéntico a la planta de la presente invención, y ha sido cultivada en condiciones idénticas, pero no contiene la molécula de ácido nucleico que confiere resistencia. El nivel de la resistencia, por ejemplo, a un patógeno del género Heterodera, en particularHeterodera schachtii,puede establecerse cualitativamente en plantas del género Beta determinando puntuaciones de calificación (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1). Una mayor resistencia se manifiesta en una mejora de la resistencia en al menos una puntuación de calificación, en al menos dos puntuaciones de calificación y, preferiblemente, en al menos tres o más puntuaciones de calificación.

[0242] Una célula de planta o una planta o una porción de la misma que contiene la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención - en particular, una planta del género Beta - muestra preferiblemente una mayor resistencia a un patógeno del género Heterodera - en particular, aHeterodera schachtii- que una célula de planta o planta correspondiente o una porción de la misma que no contiene la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, o puede contener una variante alélica sensible de la molécula de ácido nucleico. El nivel de resistencia hacia un patógeno del género Heterodera, por ejemplo, haciaHeterodera schachtii,puede establecerse cualitativamente en plantas del género Beta mediante la determinación de puntuaciones de calificación. Una mayor resistencia se manifiesta en una mejora de la resistencia en al menos una puntuación de calificación, en al menos dos puntuaciones de calificación y, preferiblemente, en al menos tres o más puntuaciones de calificación.

[0244] En el caso de una célula de planta transgénica, o de una planta o porción de la misma, ésta comprende la molécula de ácido nucleico o la molécula de ADN de acuerdo con la invención como transgén o el vector o el casete de expresión de la presente invención. Una célula de planta transgénica de este tipo o una planta o porción de la misma es, por ejemplo, una que se transforma - preferiblemente, de manera estable - con la molécula de ácido nucleico, la molécula de ADN de acuerdo con la invención, o con el vector o el casete de expresión de la presente invención. La molécula de ácido nucleico está unida operativamente a una o más secuencias reguladoras que permiten la transcripción y, opcionalmente, la expresión en la célula de planta. La estructura total constituida por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y la o las secuencias reguladoras representan entonces el transgén. Tales secuencias reguladoras son, por ejemplo, un promotor o un terminador. El experto en la materia conoce numerosos promotores y terminadores funcionales que son aplicables en plantas.

[0246] La divulgación también incluye una vacuola de la célula de acuerdo con la invención y las sustancias de contenido (como sacarosa) almacenadas en ella.

[0248] Además, la presente solicitud también se refiere al extracto celular de una célula - preferiblemente de una célula de planta, particularmente preferiblemente de una célula deBeta vulgarisy, de forma especialmente preferida, de una célula de uno de los siguientes cultivos: remolacha azucarera, acelga o remolacha forrajera. Ninguna planta puede regenerarse a partir del extracto de células. Se divulga en el presente documento un genoma de planta que contiene el ácido nucleico de acuerdo con la invención. Ninguna planta puede regenerarse a partir del genoma de planta como tal.

[0250] De este modo se puede aumentar la concentración de azúcar o sacarosa del extracto celular en relación con una célula que no es una célula de acuerdo con la invención, pero que pertenece a la misma especie o cultivo. Esto se aplica, en particular, en caso de infección por un patógeno del género Heterodera.

[0252] También se divulga en este documento el uso del extracto de células para la producción de azúcar (sacarosa) o para la producción de jugo (crudo) - preferiblemente jugo de remolacha forrajera (crudo).

[0254] También se divulga igualmente en la presente memoria el azúcar - en particular la sacarosa - contenida en las células de acuerdo con la invención y sus vacuolas.

[0255] Un aspecto adicional de la presente divulgación es un material de semilla que comprende semillas que contienen la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede estar presente de forma transgénica o endógena. El material de semilla y las semillas podrán ser tratadas técnicamente. Por lo tanto, la divulgación también comprende materiales de semilla tratadas técnicamente y semillas tratadas técnicamente. Las diversas clases de material de semilla recubierto químicamente, se explican detalladamente a continuación por lo que el término material de semilla también incluye semillas: el material de semilla tratado técnicamente puede presentarse en forma pulida. De este modo se elimina la capa más externa de la semilla, de modo que la semilla adquiere una forma más redondeada. Esto es útil durante la siembra, una forma uniforme óptima conduce a una distribución uniforme de los granos del material de semilla. El material de semilla tratado técnicamente abarca además material de semilla apilada. De este modo, el material de semilla se coloca sobre una masa de apilamiento que protege el material de semilla contenida allí y da lugar a una masa mayor, de modo que el material de semilla apilada muestra una mayor capacidad de resistencia con respecto a la deriva del viento y, por lo tanto, es menos susceptible de ser arrastrado por el viento y, al mismo tiempo, se permite un posicionamiento más preciso durante la siembra. Como se ha divulgado, todos los granos de material de semilla apilada de un lote o unidad designada para la venta pueden tener esencialmente la misma forma y la misma masa. Son posibles desviaciones del 5 % en diámetro y masa. Sin embargo, es preferible que las desviaciones no superen el 1 %. Como uno de los componentes principales, la masa apilada puede contener por ejemplo un compuesto mineral como arcilla y/o turba, por ejemplo. Se citan posibles componentes adicionales en el documento US 4,067,141. Además, la masa de apilamiento puede contener agentes químicos adicionales que influyen positivamente en el cultivo en la práctica. En este caso estas pueden ser sustancias que se cuentan entre los agentes fertilizantes. Además, estos pueden ser fungicidas, insecticidas y/o antialimentadores. Los fungicidas pueden ser tiram y/o himexazol y/u otros fungicidas. El insecticida puede ser una sustancia del grupo de los neonicotinoides. La sustancia del grupo de los neonicotinoides es preferiblemente imidacloprid (Código ATC: QP53AX17) y/o clotianidina (número CAS 210880-92-5). Además, el insecticida también puede ser ciflutrina (número CAS 68359-37-5) o betaciflutrina.

[0257] El material de semilla apilada es un tipo específico de material de semilla recubierto. En este contexto, el material de semilla tratado técnicamente incluye también el material de semilla recubierto. Sin embargo, la divulgación no se limita a el material de semilla apilada, sino más bien puede aplicarse con cualquier forma de material de semilla recubierto. La divulgación también se refiere a el material de semilla recubierto, que incluye material de semilla apilada, pero no se limita a esta. Por lo tanto, también se incluyen recubrimiento seco, recubrimiento húmedo y recubrimiento en suspensión. El recubrimiento puede contener también al menos un colorante, de modo que el material de semilla recubierto puede diferenciarse rápidamente del material de semilla sin tratar y, además, se garantiza una buena visibilidad en el entorno después de la siembra. El recubrimiento también puede contener aquellos agroquímicos que se describen en el contexto de la masa de apilamiento. La divulgación incluye así un material de semilla recubierto en donde el recubrimiento contiene al menos un antialimentador tal como un insecticida y/o al menos un fungicida. Opcionalmente se puede aplicar el llamado recubrimiento electrónico (recubrimiento mediante aplicación de energía eléctrica). Sin embargo, el recubrimiento electrónico no es un recubrimiento en el sentido estricto de la palabra.

[0259] Una forma adicional de material de semilla tratado técnicamente es el material de semilla incrustado. En este contexto también se habla de lo que se denomina recubrimiento, así como de material de semilla tratado con un recubrimiento. La diferencia con el materia de semillas apilado es que los granos de semillas conservan su forma original, por lo que este método resulta especialmente económico. El método se describe en el documento EP 0334258 A1, por ejemplo. Una forma adicional de material de semilla tratado técnicamente es el material de semilla germinado o cebado. El material de semilla germinado se trata previamente mediante una germinación previa, mientras que el material de semilla cebado ha sido pretratado mediante un cebado ("germinación"). El material de semilla pregerminado y cebado tiene la ventaja de un tiempo de emergencia más corto. El momento de la emergencia después de la siembra está, al mismo tiempo, más fuertemente sincronizado. Esto permite un mejor procesamiento agrotécnico durante el cultivo y, especialmente, durante la cosecha y, además, aumenta la cantidad del rendimiento. En la pregerminación, el material de semilla germina hasta que la radícula sale de la cáscara del material de semilla, y luego el proceso se detiene. En el cebado, el proceso se detiene antes de que la radícula salga de la cáscara del material de semilla. En comparación con el material de semilla pregerminado, el material de semilla que ha sido sometido a un proceso de cebado es insensible al estrés de un nuevo secado y, después de dicho nuevo secado, tienen una vida útil de almacenamiento más larga en comparación con el material de semilla pregerminado, para lo que generalmente no se aconseja un nuevo secado. En este contexto, se consideran también como material de semilla tratado previamente desde el punto de vista técnico el material de semilla cebado y nuevamente secado. El proceso de pregerminación se explica en el documento US 4,905,411 A. En el documento EP 0686340 A1 se explican diversas realizaciones del cebado. Además de esto, también es posible preparar y cebar simultáneamente el material de semilla en un solo proceso. Este método se describe en el documento EP 2002702 B1. La presente invención abarca el material de semilla cebado que es además apilado.

[0261] El material de semilla tratado técnicamente puede adicionalmente estar provisto de una o más de las resistencias a herbicidas explicadas anteriormente. Esto permite un cultivo agrotécnico aún mejor, ya que el material de semilla tratado técnicamente puede ser desplegado en un campo que ya ha sido tratado previamente con herbicida y que, por tanto, está libre de malezas.

[0263] Además de esto, la divulgación también abarca una mezcla que contiene el material de semilla o las semillas de acuerdo con la invención, y una masa de recubrimiento como se definió anteriormente. La masa de recubrimiento se materializa preferentemente en forma de masa de apilamiento, tal como se ha definido anteriormente.

[0265] A la hora de almacenar el material de semilla, es preferible elegir condiciones de almacenamiento que no afecten negativamente a la estabilidad o la vida en almacenamiento del material de semilla. En este caso, las fluctuaciones de humedad pueden tener un efecto desfavorable. También se divulga un método para almacenar el material de semilla en un recipiente que es al mismo tiempo repelente al agua y transpirable. Un contenedor de este tipo puede diseñarse como una caja de cartón. Dicho cartón puede poseer opcionalmente una barrera de vapor interior. Si el cartón está diseñado como cartón dúplex, su estabilidad aumenta. Un material de semilla de acuerdo con la divulgación que incluye dicho contenedor y dicha caja de cartón, o un material de semilla tratado técnicamente, también es parte de la divulgación. También forma parte de la divulgación contener material de semilla o material de semilla tratado técnicamente en dicho cartón.

[0267] También se divulga una planta híbrida o una planta doblemente haploide. Las plantas híbridas y las plantas doblemente haploides no existen en la naturaleza y no pueden aislarse de ella. Como se divulga, la molécula de ácido nucleico está presente en forma heterocigótica u homocigótica. En el caso de una planta híbrida, la molécula de ácido nucleico también puede estar presente en forma homocigótica. La divulgación también abarca semillas híbridas y semillas doblemente haploides que contienen un ácido nucleico de acuerdo con la invención o un polipéptido de acuerdo con la invención.

[0269] La presente divulgación comprende una planta - preferiblemente, de la especieBeta vulgaris- que se caracteriza porque se incrementa aún más la resistencia frente a un patógeno del género Heterodera en esta planta. Por ejemplo, esto puede lograrse mediante el "apilamiento de genes", es decir, la resistencia aumenta utilizando este efecto de dosis. Para ello, las plantas de acuerdo con la invención que contienen el alelo que confiere resistencia de Heterodera se transforman en exceso con este alelo de resistencia para aumentar la cantidad de transcripción del gen en la planta. Un enfoque alternativo incluye la edición genética/mutagénesis dirigida al sitio o la modificación mediada por TILLING del promotor nativo del alelo que confiere resistencia, con el fin de aumentar su tasa de expresión, o la modificación del alelo del gen LRR que confiere resistencia en sí, con el fin de aumentar su actividad o estabilidad. Un método de este tipo para aumentar la actividad mediante la modificación de un gen de resistencia se describe en el documento WO 2006/128444 A2, por ejemplo, y puede realizarse mediante las técnicas conocidas por el experto en la materia. Un enfoque adicional puede incluir la fusión de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención con un promotor heterólogo que exhibe una mayor actividad en comparación con el promotor nativo - en particular, tras la infección por Heterodera.

[0271] Como se divulga, la planta adicionalmente, de manera transgénica o endógenamente, puede comprender una segunda molécula de ácido nucleico en una posición diferente en el genoma, que codifica un polipéptido que es capaz de conferir una resistencia a Heterodera en la planta en donde se expresa el polipéptido. Por ejemplo, uno o más de los genes de resistencia o lugares de resistencia que se describen en la técnica anterior pueden -en la medida en que no estén ya presentes en el genotipo inicial- introducirse en la planta presente mediante cruce, transformación, reparación dirigida por homología o recombinación homóloga en la planta. Entre ellos se encuentran, por ejemplo, el gen Hs1pro-1 deB. procumbens(Cai et al., Science 275 (1997), 832-834).

[0272] El aumento de la resistencia puede tener lugar mediante la integración de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención en el genoma de al menos una célula de una planta de la especieBeta vulgaris,así como la posible regeneración de una planta a partir de la célula de la planta. La integración puede tener lugar tanto mediante cruce sexual, por ejemplo, con uno delBeta vulgarissubespeciemarítimamencionado anteriormente y selección posterior, o mediante reparación dirigida por homología o recombinación homóloga. Los dos últimos métodos citados están preferiblemente respaldados por nucleasas dirigidas al sitio que pueden seleccionarse entre, pero no están limitadas a, las siguientes: Nucleasa CRISPR, que incluye nucleasas Cas9, CasX, CasY o Cpf1, nucleasa TALE, nucleasa de dedo de zinc, meganucleasa, nucleasa Argonauta, endonucleasa de restricción, incluida FokI o una variante de la misma, recombinasa o dos endonucleasas de mellado específicas del sitio.

[0274] Un enfoque alternativo incluye el aumento de la expresión de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención en la planta. Esto puede tener lugar a través de la modificación del promotor nativo, en donde la modificación tiene lugar preferiblemente por medio de edición genética o mutagénesis dirigida al sitio que está mediada por nucleasas dirigidas al sitio y, opcionalmente, modelos de reparación. Ya se han citado ejemplos de tales nucleasas. El aumento de la expresión de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención también puede tener lugar mediante la fusión de la molécula de ácido nucleico con un promotor heterólogo que muestra una mayor actividad en comparación con el promotor nativo - en particular después de la infección por Heterodera. La fusión también puede tener lugar mediante modelos de reparación y nucleasas dirigidas al sitio, pero también mediante inserción directa después de la rotura de la doble cadena.

[0276] Como ya se ha mencionado anteriormente, un método para aumentar la resistencia de Heterodera, también puede resultar en el aumento de la actividad y/o estabilidad del polipéptido de acuerdo con la invención, a través de la modificación de la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Un método de este tipo para aumentar la actividad mediante la modificación de un gen de resistencia se describe en el documento WO 2006/128444 A2, por ejemplo, y puede realizarse mediante las técnicas conocidas por el experto en la materia. Este enfoque se explica en detalle más adelante.

[0278] Tal como se utiliza en el presente documento, una "nucleasa dirigida al sitio" (SDN) es una enzima capaz de inducir una ruptura de<a>D<n>de doble cadena en una secuencia de nucleótidos particular, llamada el "sitio de reconocimiento". La SDN se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en meganucleasa, nucleasa efectora TAL, nucleasa de dedo de zinc, sistemas CRISPR como CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, CRISPR/CasX o CRISPR/CasY Las endonucleasas de escisión rara son SDN que tienen un sitio de reconocimiento de preferiblemente alrededor de 14 a 70 nucleótidos consecutivos y, por lo tanto, tienen una frecuencia de escisión muy baja, incluso en genomas más grandes, como la mayoría de los genomas de plantas. Las endonucleasas de migración celular, también llamadas meganucleasas, constituyen una familia de estas endonucleasas de escisión rara. Pueden estar codificadas por intrones, genes independientes o secuencias intermedias, y presentan sorprendentes propiedades estructurales y funcionales que las distinguen de las enzimas de restricción más clásicas, generalmente de los sistemas de restricción-modificación bacteriana Tipo II. Sus sitios de reconocimiento tienen una asimetría general que contrasta con la simetría díada característica de la mayoría de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción. Se ha demostrado que varias endonucleasas de migración celular codificadas por intrones o inteínas promueven la migración celular de sus respectivos elementos genéticos en sitios alélicos sin intrones o sin inteínas. Al realizar una ruptura de doble cadena específica del sitio en los alelos sin intrones o sin inteínas, estas nucleasas crean extremos recombinogénicos, que participan en un proceso de conversión genética que duplica la secuencia codificante y conduce a la inserción de un intrón o una secuencia intermedia a nivel del ADN. En la Tabla I se proporciona una lista de otras meganucleasas de escisión raras y sus respectivos sitios de reconocimiento del documento WO 03/004659 (páginas 17 a 20) (incorporado en el presente documento por referencia).

[0280] Además, existen métodos disponibles para diseñar endonucleasas de escisión rara personalizadas que reconocen básicamente cualquier secuencia de nucleótidos diana elegida. En resumen, las enzimas de restricción quiméricas se pueden preparar utilizando híbridos entre un dominio de dedo de zinc diseñado para reconocer una secuencia de nucleótidos específica y el dominio de escisión de ADN no específico de una enzima de restricción natural, como Fokl. Tales métodos se han descrito, por ejemplo, en los documentos WO 03/080809, WO 94/18313 o WO 95/09233 y en Isalan et al., 2001, Nature Biotechnology 19, 656-660; Liu et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530).

[0282] Otro ejemplo de endonucleasas diseñadas a medida incluye las llamadas nucleasas TALE (TALEN), que se basan en efectores similares a activadores de la transcripción (TALE) del género bacteriano Xanthomonas fusionados al dominio catalítico de una nucleasa (por ejemplo, FokI o una variante del mismo). La especificidad de unión al ADN de estos TALE está definida por residuos dobles variables de repetición (RVD) de unidades repetidas de 34/35 aminoácidos dispuestas en tándem, de modo que un RVD reconoce específicamente un nucleótido en el ADN objetivo. Las unidades repetidas se pueden ensamblar para reconocer básicamente cualquier secuencia objetivo y fusionarse a un dominio catalítico de una nucleasa para crear endonucleasas específicas de secuencia (véase, por ejemplo, Boch et al., 2009, Science 326: páginas 1509-1512; Moscou y Bogdanove, 2009, Science 326:página 1501; y los documentos WO 2010/079430, WO 2011/072246, w O 2011/154393, WO 2011/146121, WO 2012/001527, WO 2012/093833, WO 2012/104729, WO 2012/138927, WO 2012/138939). El documento WO2012/138927 describe además TALEN monoméricos (compactos) y TALEN con varios dominios catalíticos y combinaciones de los mismos.

[0284] Recientemente, se ha descrito un nuevo tipo de sistema de endonucleasa personalizable: el llamado sistema CRISPR/Cas. Un sistema CRISPR en su entorno natural describe un complejo molecular que comprende al menos un ARN no codificante pequeño e individual en combinación con una nucleasa Cas u otra nucleasa CRISPR como una nucleasa Cpfl (Zetsche et al., "Cpf1 Is a Single RNA-Guides Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System", Cell, 163, páginas 1-13, octubre de 2015) que puede producir una rotura específica de la doble cadena del ADN. Actualmente, los sistemas CRISPR se clasifican en 2 clases que comprenden cinco tipos de sistemas CRISPR, el sistema tipo II, por ejemplo, que utiliza Cas9 como efector y el sistema tipo V que utiliza Cpfl como molécula efectora (Makarova et al., Nature Rev. Microbiol., 2015). En sistemas CRISPR artificiales, se puede utilizar un ARN sintético no codificante y una nucleasa CRISPR y/o opcionalmente una nucleasa CRISPR modificada, modificada para actuar como nickasa o que carece de cualquier función de nucleasa, en combinación con al menos un ARN guía sintético o artificial o un ARNg que combina la función de un ARNcr y/o un ARNtracr (Makarova et al., 2015, citado anteriormente). La respuesta inmune mediada por CRISPR/Cas en sistemas naturales requiere CRISPR-ARN (ARNcr), donde la maduración de este ARN guía, que controla la activación específica de la nucleasa CRISPR, varía significativamente entre los diversos sistemas CRISPR que se han caracterizado hasta ahora. En primer lugar, el ADN invasor, también conocido como espaciador, se integra entre dos regiones de repetición adyacentes en el extremo proximal del lugar CRISPR. Los sistemas CRISPR tipo II codifican una nucleasa Cas9 como enzima clave para la etapa de interferencia, sistema que contiene tanto un ARNcr como también un ARN transactivador (ARNtracr) como motivo guía. Estos se hibridan y forman regiones de ARN bicatenario (bc) que son reconocidas por la ARNasa III y pueden escindirse para formar ARNcr maduros. Estos a su vez se asocian con la molécula de Cas para dirigir la nucleasa específicamente a la región de ácido nucleico objetivo. Las moléculas de ARNg recombinante pueden comprender tanto la región de reconocimiento de ADN variable como también la región de interacción de Cas y, por lo tanto, pueden diseñarse específicamente, independientemente del ácido nucleico objetivo específico y de la nucleasa Cas deseada. Como mecanismo de seguridad adicional, los PAM (motivos adyacentes al protoespaciadores) deben estar presentes en la región del ácido nucleico objetivo; estos son secuencias de ADN que siguen directamente al ADN reconocido por el complejo Cas9/ARN. La secuencia PAM para Cas9 deStreptococcus pyogenesse ha descrito como "NGG" o "NAG" (código de nucleótidos IUPAC estándar) (Jinek et al., "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity", Science 2012, 337: 816-821). La secuencia PAM para Cas9 deStaphylococcus aureuses "NNGRRT" o "NNGRR(N)". Se conocen otras variantes del sistema CRISPR/Cas9. Por lo tanto, una Cas9 deNeisseria meningitidisescinde en la secuencia PAM NNNNGATT Una Cas9 deStreptococcus thermophilusescinde en la secuencia PAM NNAGAAW. Recientemente, se ha descrito un motivo PAM adicional, Nn Nn RYAC, para un sistema CRISPR deCampylobacter(Documento WO 2016/021973 A1). Para las nucleasas Cpfl se ha descrito que el complejo Cpf1-ARNcr, sin un ARNtracr, reconoce y escinde eficientemente el ADN objetivo precedido por un PAM corto rico en T en contraste con los PAM comúnmente ricos en G reconocidos por los sistemas Cas9 (Zetsche et al., citado anteriormente). Además, mediante el uso de polipéptidos CRISPR modificados, se pueden obtener roturas monocatenarias específicas. El uso combinado de nickasas Cas con varios ARNg recombinantes también puede inducir roturas de doble cadena de ADN altamente específicas mediante un doble mellado del ADN. Además, mediante el uso de dos ARNg, se puede optimizar la especificidad de la unión del ADN y, por lo tanto, la escisión del ADN. Otros efectores CRISPR, como los efectores CasX y CasY descritos originalmente para bacterias, están disponibles actualmente y representan otros efectores que pueden usarse con fines de ingeniería genómica (Burstein et al., "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes", Nature, 2017, 542, 237-241).

[0286] El sitio de escisión de un SDN se relaciona con la ubicación exacta en el ADN donde se induce la ruptura del ADN de doble cadena. El sitio de escisión puede o no estar comprendido en (superpuesto con) el sitio de reconocimiento del SDN y, por lo tanto, se dice que el sitio de escisión de un SDN está ubicado en o cerca de su sitio de reconocimiento. El sitio de reconocimiento de una enzima SDN, también denominado a veces sitio de unión, es la secuencia de nucleótidos que es (específicamente) reconocida por la enzima SDN y determina su especificidad de unión. Por ejemplo, un monómero TALEN o ZNF tiene un sitio de reconocimiento que está determinado por sus repeticiones RVD o repeticiones ZF respectivamente, mientras que su sitio de escisión está determinado por su dominio de nucleasa (por ejemplo, FokI) y generalmente está ubicado fuera del sitio de reconocimiento. En el caso de TALEN o ZFN diméricas, el sitio de escisión se ubica entre los dos sitios de reconocimiento/unión de los respectivos monómeros, esta región de ADN intermedia donde ocurre la escisión se denomina región espaciadora. En una realización de la presente invención, el sitio de reconocimiento está ubicado en la región objetivo.

[0288] Una persona experta en la materia podría elegir una SDN que reconozca un determinado sitio de reconocimiento e induzca una ruptura de cadena en un sitio de escisión en o en la proximidad del sitio preseleccionado o diseñar dicha SDN. Como alternativa, se puede introducir un sitio de reconocimiento de SDN en el genoma objetivo utilizando cualquier método de transformación convencional o cruzándolo con un organismo que tenga un sitio de reconocimiento de SDN en su genoma, y posteriormente se puede introducir cualquier ADN deseado en el sitio de escisión de ese SDN o en su proximidad.

[0290] Como se divulga, también se puede introducir una molécula de ácido nucleico reparadora en la célula de la planta.

[0292] Tal como se utiliza en el presente documento, una"matriz de reparación"es una molécula de ADN o ARN monocatenario o bicatenario que se utiliza como plantilla para la modificación del ADN genómico en el sitio preseleccionado en la proximidad o en el sitio de escisión. Tal como se utiliza en el presente documento,"utilizar como plantilla para la modificación del ADN genómico",significa que la matriz de reparación se copia o se integra en el sitio preseleccionado mediante recombinación homóloga entre la región o regiones flanqueantes y la región o regiones de homología correspondientes en el genoma objetivo que flanquean el sitio preseleccionado, opcionalmente en combinación con unión de extremos no homólogos (NHEJ) en uno de los dos extremos de la matriz de reparación (por ejemplo, en caso de que solo haya una región flanqueante). La integración por recombinación homóloga permitirá una unión precisa de la matriz de reparación al genoma objetivo hasta el nivel de nucleótido, mientras que NHEJ puede resultar en pequeñas inserciones/eliminaciones en la unión entre la matriz de reparación y el ADN genómico.

[0294] Un "editor de bases", como se utiliza en este documento, se refiere a una proteína o un fragmento de la misma que tiene la capacidad de mediar una modificación de bases específica, es decir, la conversión de una base de interés que resulta en una mutación puntual de interés. Preferiblemente, el al menos un editor de base en el contexto de la presente invención está fusionado temporal o permanentemente a al menos una SDN, preferiblemente al menos una SDN no funcional, u opcionalmente a un componente de al menos una SDN (no funcional). La fusión puede ser covalente y/o no covalente. Varias publicaciones han demostrado una conversión de bases dirigida, principalmente de citidina (C) a timina (T), utilizando una nickasa CRISPR/Cas9 o una nucleasa no funcional vinculada a un dominio de citidina desaminasa, el polipéptido catalítico de edición de ARNm de la apolipoproteína B (APOBEC1), por ejemplo, APOBEC derivado de rata. La desaminación de la citosina (C) es catalizada por las citidina desaminasas y da como resultado uracilo (U), que tiene las propiedades de apareamiento de bases de la timina (T). La mayoría de las citidina desaminasas conocidas operan sobre ARN, y los pocos ejemplos que se sabe que aceptan ADN requieren ADN monocatenario (mc). Los estudios sobre el complejo a Dn diana de dCas9 revelan que al menos nueve nucleótidos (nt) de la cadena de ADN desplazada están desapareados tras la formación del complejo del 'bucle R' de ARN-ADN guía Cas9 (Jore et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 18,529-536(2011)). De hecho, en la estructura del complejo del bucle R de Cas9, los primeros 11 nt del protoespaciador en la cadena de ADN desplazada están desordenados, lo que sugiere que su movimiento no está muy restringido. También se ha especulado que las mutaciones inducidas por la nickasa Cas9 en las citosinas de la cadena no molde podrían surgir de su accesibilidad por parte de las enzimas citosina desaminasas celulares. Se razonó que un subconjunto de este tramo de ADNmc en el bucle R podría servir como un sustrato eficiente para una citidina desaminasa unida a dCas9 para efectuar una conversión directa y programable de C a U en el ADN (Komor et al., citado anteriormente). Recientemente, Goudelli et al.,((2017).Programmable base editing of A^T to G^C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 551(7681), 464) describieron editores de bases de adenina (ABE) que median la conversión de A^T a G^C en el ADN genómico.

[0296] Tal como se utiliza en este documento, una modificación del genoma significa que el genoma ha cambiado en al menos un nucleótido. Esto puede ocurrir mediante el reemplazo de al menos un nucleótido y/o una eliminación de al menos un nucleótido y/o una inserción de al menos un nucleótido, siempre que resulte en un cambio total de al menos un nucleótido en comparación con la secuencia de nucleótidos del sitio objetivo genómico preseleccionado antes de la modificación, permitiendo así la identificación de la modificación, por ejemplo mediante técnicas tales como secuenciación o análisis de PCR y similares, de las cuales la persona experta estará bien al tanto.

[0298] Tal como se utiliza en este documento "un sitio preseleccionado" o "sitio predefinido" indica una secuencia de nucleótidos particular en el genoma (por ejemplo, el genoma nuclear) en cuya ubicación se desea insertar, reemplazar y/o eliminar uno o más nucleótidos. Esto puede ser, por ejemplo, un lugar endógeno o una secuencia de nucleótidos particular en un ADN extraño o transgén previamente introducido o vinculado a ellos. El sitio preseleccionado puede ser una posición de nucleótido particular en (después de) la cual se pretende realizar una inserción de uno o más nucleótidos. El sitio preseleccionado también puede comprender una secuencia de uno o más nucleótidos que se intercambiarán (reemplazarán) o eliminarán.

[0300] Tal como se utiliza en el presente documento, una "región flanqueante", es una región de la molécula de ácido nucleico de reparación que tiene una secuencia de nucleótidos que es homóloga a la secuencia de nucleótidos de la región de ADN que flanquea (es decir, secuencia arriba o secuencia abajo) del sitio preseleccionado. Quedará claro que la longitud y el porcentaje de identidad de secuencia de las regiones flanqueantes deben elegirse de manera que permitan la recombinación homóloga entre dichas regiones flanqueantes y su región de ADN correspondiente secuencia arriba o secuencia abajo del sitio preseleccionado. La región o regiones de ADN que flanquean el sitio preseleccionado que tienen homología con la región o regiones de ADN flanqueantes de la molécula de ácido nucleico de reparación también se denominan como la región o regiones de homología en el ADN genómico.

[0302] Para tener suficiente homología para la recombinación, las regiones de ADN flanqueantes de la molécula de ácido nucleico de reparación pueden variar en longitud y deben tener al menos aproximadamente 10 nt, aproximadamente 15 nt o aproximadamente 20 nt de longitud. Sin embargo, la región flanqueante puede ser tan larga como sea prácticamente posible (por ejemplo, hasta aproximadamente 100-150 kb, como los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) completos). Preferiblemente, la región de flanqueo tendrá aproximadamente 50 nt a aproximadamente 2000 nt, por ejemplo, aproximadamente 100 nt, 200 nt, 500 nt o 1000 nt. Además, las regiones que flanquean el ADN de interés no necesitan ser idénticas a las regiones de homología (las regiones de ADN que flanquean el sitio preseleccionado) y pueden tener entre aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 % de identidad de secuencia, preferiblemente aproximadamente 95 % a aproximadamente 100 % de identidad de secuencia con las regiones de ADN que flanquean el sitio preseleccionado. Cuanto más larga sea la región flanqueante, menos estricto será el requisito de homología. Además, para lograr el intercambio de la secuencia de ADN objetivo en el sitio preseleccionado sin cambiar la secuencia de ADN de las secuencias de ADN adyacentes, las secuencias de ADN flanqueantes deben ser preferiblemente idénticas a las regiones de ADN secuencia arriba y secuencia abajo que flanquean el sitio preseleccionado.

[0304] Tal como se utiliza en el presente documento, "secuencia arriba" indica una ubicación en una molécula de ácido nucleico que está más cerca del extremo 5' de dicha molécula de ácido nucleico. Asimismo, el término "secuencia abajo" se refiere a una ubicación en una molécula de ácido nucleico que está más cerca del extremo 3' de dicha molécula de ácido nucleico. Para evitar dudas, las moléculas de ácido nucleico y sus secuencias normalmente se representan en dirección 5' a 3' (de izquierda a derecha).

[0306] Un aspecto adicional de la presente invención es el método para producir una planta de Beta vulgaris que tiene resistencia hacia un nematodo del género Heterodera como se reivindica en este documento.

[0308] En este documento se divulga un método para producir una planta resistente a Heterodera, que puede tener lugar a través de la transformación de una célula de planta con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, la molécula de ADN recombinante, o con el vector o el casete de expresión, y la regeneración de la planta transgénica a partir de la célula de planta transformada (véase el Ejemplo 3) o a través de cruzamiento y selección, por ejemplo, con uno de losBeta vulgarissubespeciemarítimamencionados anteriormente. Ya se han descrito anteriormente vectores o casetes de expresión, así como métodos para transformar plantas.

[0309] El método para la producción de una planta resistente a Heterodera incluye alternativamente, como se describió anteriormente, la introducción de una nucleasa dirigida al sitio y una matriz de reparación en una célula de una planta, preferiblemente una planta de la especieBeta vulgaris,en donde la nucleasa dirigida al sitio es capaz de generar al menos una rotura de cadena sencilla o al menos una rotura de cadena doble del ADN en el genoma de la célula - preferiblemente, secuencia arriba y/o secuencia abajo de una región objetivo - y la matriz de reparación comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. El método incluye además el cultivo de esta célula en condiciones que permiten una reparación dirigida por homología o una recombinación homóloga, en donde la molécula de ácido nucleico se incorpora desde la matriz de reparación al genoma de la planta. Además, se abarca la regeneración de una planta a partir de la célula de planta modificada.

[0311] La región objetivo puede ser una variante alélica de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, en donde la variante alélica cuando está presente en una planta no confiere resistencia a Heterodera. Se ha identificado que la variante alélica contiene retrotransposones.

[0313] Como se describe en relación con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, se pueden introducir sustituciones, eliminaciones, inserciones, adiciones y/o cualquier otro cambio que, ya sea solo o en combinaciones, de hecho, cambien la secuencia de nucleótidos, pero realicen la misma función que la secuencia inicial - en este documento, la secuencia de nucleótidos de la variante alélica de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos puede representar un derivado de la secuencia de nucleótidos de la variante alélica de las moléculas de ácido nucleico divulgadas, o una secuencia de aminoácidos que representa un derivado de la secuencia de aminoácidos de la variante alélica como se divulga. Una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos derivada que tiene al menos una sustitución, eliminación, inserción o adición de uno o más ácidos nucleicos o aminoácidos, en donde se conserva la funcionalidad del gen, representa un derivado de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos, utilizando métodos convencionales que se conocen en la técnica anterior, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, TILLING, mutagénesis mediada por PCR, mutagénesis inducida químicamente, edición del genoma, edición de bases, etc., se pueden introducir sustituciones, eliminaciones, inserciones, adiciones y/o cualquier otro cambio, ya sea solo o en combinación con el gen, que de hecho cambian la secuencia de nucleótidos, pero realizan la misma función que la secuencia inicial.

[0315] Respecto a la secuencia de aminoácidos, después de la modificación a través de un método anteriormente mencionado, ésta también tiene un dominio estructural común y/o posee una actividad funcional común. Las secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos que son al menos en un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o al menos un 100 % idénticas a la secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos de la variante alélica citada de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención se definen en este documento como suficientemente similares. Por consiguiente, la presente invención incluye una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar, en condiciones rigurosas, con una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de la variante alélica de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente.

[0317] Preferiblemente, al menos una ruptura de doble cadena ocurre en una posición que está como máximo 10,000 pares de bases, preferiblemente al menos 5,000 pares de bases, más preferiblemente al menos 1,000 pares de bases, secuencia arriba y/o secuencia abajo de la región objetivo, o que está como máximo 10,000 pares de bases, preferiblemente al menos 5,000 pares de bases, más preferiblemente al menos 1,000 pares de bases, distante de las variante alélicas divulgadas.

[0319] Para el experto en la materia, puede resultar obvio que pueden existir numerosas secuencias sensibles diferentes que derivan de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, pero que no confieren resistencia a Heterodera, de modo que la secuencia enumerada anteriormente solo debe considerarse como un ejemplo de secuencia. Por supuesto, las variantes sensibles de la molécula de ácido nucleico de la presente invención pueden no contener solo retrotransposones como se describió anteriormente, sino que todo tipo de mutaciones conocidas por el experto en la materia y mencionadas anteriormente en la secuencia de ADN o ADNc o en la región promotora pueden conducir a alelos sensibles.

[0321] Como se ha descrito anteriormente, con la herencia cuantitativa de QTL, a menudo no solo se introduce en la planta la resistencia deseada hacia un patógeno del género Heterodera, sino también características a menudo no deseadas como, por ejemplo, un rendimiento reducido, debido a la herencia de genes adicionales que no están vinculados con la característica positiva de la resistencia. Por lo tanto, preferiblemente, la introducción de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o la combinación de moléculas de ácido nucleico descrita anteriormente, que ya muestra, por sí sola, un efecto de resistencia dominante, o del vector o del casete de expresión, no está vinculada con la introducción de características no deseadas, en donde, preferiblemente, el rendimiento no se ve afectado negativamente.

[0323] Aunque los análisis de QTL que se conocían previamente a partir de la técnica anterior podían detectar QTL reales, las regiones genómicas subyacentes que habían mostrado un efecto QTL también mediaban las desventajas descritas anteriormente, razón por la cual el "arrastre de ligamiento" también se analiza en este contexto. Al mismo tiempo, los QTL y los efectos relacionados con ellos no se describieron de manera uniforme en la técnica anterior respectiva y simplemente mediaron un efecto débil, de modo que la utilización de estos resultados en el fitomejoramiento de plantas resistentes a Heterodera solo fue posible en una medida limitada y fue en gran medida incierta. El fitomejoramiento dirigido y la integración controlada en el grupo de genes de la remolacha azucarera son ahora posibles por medio de la identificación del gen de resistencia descrito en el presente documento. Esto garantiza que el fitomejoramiento y la generación de variedades de cultivo completamente nuevos resistentes a Heterodera que exhiben una alta resistencia al patógeno, sin afectar negativamente el rendimiento de azúcar.

[0325] Un aspecto adicional de la presente invención es un método para identificar, y opcionalmente proporcionar o seleccionar, una planta deBeta vulgarisque sea resistente a un nematodo del género Heterodera como se reivindica en este documento.

[0327] En este documento se divulga un método para la identificación, y posiblemente el suministro, de una planta de la especieBeta vulgarisque es resistente al patógeno Heterodera, caracterizado porque el método incluye una etapa de detección de la presencia y/o de la expresión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o del polipéptido de acuerdo con la invención en la planta o una muestra/porción de la misma. La presencia y/o la expresión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, o del polipéptido de acuerdo con la invención, puede comprobarse mediante métodos estándar conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, mediante PCR, RT-PCR o transferencia Western.

[0329] Además, el método de identificación como el divulgado también incluye la detección de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención mediante la detección de al menos un polimorfismo en la secuencia que confiere resistencia, es decir, las secuencias de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Como ya se ha descrito anteriormente, puede resultar obvio para el experto en la materia que existen numerosas secuencias sensibles, es decir, numerosas secuencias que codifican la variante alélica de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. La divulgación incluye, en consecuencia, la detección de al menos un polimorfismo utilizando marcadores moleculares que detectan los polimorfismos - en particular, polimorfismos de diagnóstico. Esta detección ocurre preferiblemente utilizando al menos un marcador molecular por polimorfismo - en particular, por polimorfismo diagnóstico. El experto en la materia sabe qué técnicas de marcadores se deben aplicar para detectar un polimorfismo correspondiente y cómo se construyen los marcadores moleculares para ello (véase Advances in Seed Science And Technology, vol. I, Vanangamudi et al., 2008). Además, la presente divulgación abarca marcadores moleculares que describen o detectan un polimorfismo en las secuencias de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. De este modo, también es posible utilizar marcadores que no diferencien entre distintos polimorfismos, siempre que los marcadores sean capaces de detectar un polimorfismo tal como se presenta en la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, pero no esté contenido en la variante alélica sensible.

[0331] Alternativamente o adicionalmente, el método de identificación como se divulga incluye una etapa de detección de al menos un lugar marcador en la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Como resultado de esto, se genera una señal, por ejemplo, una señal de fluorescencia o una secuencia amplificada. Además, los métodos de identificación anteriores también representan métodos para la selección de una planta que exhibe la resistencia a Heterodera de acuerdo con la invención. El método de selección incluye una etapa final de selección de una planta resistente.

[0333] En este contexto, la presente divulgación también incluye el desarrollo o producción de marcadores moleculares que sean adecuados para detectar los polimorfismos antes mencionados del alelo resistente o la construcción de sondas de hibridación que se unan específicamente a la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, o la producción de un par de moléculas de ácido nucleico que sea adecuada para amplificar, en una PCR, una región que sea específica de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, y por lo tanto para detectar éstas en una planta o célula de planta.

[0334] La divulgación incluye preferiblemente un método para producir oligonucleótidos de al menos 15, 16, 17, 18, 19 o 20 - preferiblemente al menos 21, 22, 23, 24 o 25, particularmente preferiblemente al menos 30, 35, 40, 45 o 50, y, especialmente preferiblemente, al menos 100, 200, 300, 500 o 1,000 - nucleótidos de longitud que se hibridan específicamente con una secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o la molécula de ácido nucleico que es complementaria a esta, o un par de moléculas de ácido nucleico - preferiblemente, en forma de oligonucleótidos - que es adecuada para la unión como un cebador directo e inverso a una región que es específica de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, y para amplificar esta en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o que es adecuada para la hibridación como un cebador directo e inverso a una región en el genoma deBeta vulgarisque, enBeta vulgaris,tiene una segregación conjunta con la resistencia a Heterodera conferida por el polipéptido de acuerdo con la invención o con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

[0336] El método para la producción de oligonucleótidos incluye inicialmente: la comparación de la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención con la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico correspondiente que no confiere resistencia; la identificación de las diferencias de secuencia entre las dos secuencias de nucleótidos; y la generación de moléculas de ácido nucleico - en este caso, significa oligonucleótidos - que se unen específicamente a la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, pero no a la molécula de ácido nucleico que no media resistencia.

[0338] Además, el oligonucleótido tal como se divulga puede conectarse a un colorante fluorescente para generar una señal de fluorescencia, por ejemplo, bajo excitación a través de luz de la longitud de onda correspondiente. El colorante fluorescente puede ser fluorocromo. Los oligonucleótidos como se divulga en este documento pueden acoplarse con otros compuestos que sean adecuados para generar una señal. Estos oligonucleótidos no existen en la naturaleza y tampoco pueden aislarse de ella. Para producir dichos oligonucleótidos marcados se ejecuta lo siguiente: el ADN puede marcarse bioortogonalmente. Para ello se puede marcar el ADNin vivooin vitrocon análogos de nucleósidos, que, por ejemplo, pueden acoplarse posteriormente con un fluoróforo mediante la reacción de Staudinger. Además de esto, el ADN también puede estar provisto químicamente de fluoróforos. Los oligonucleótidos pueden marcarse mediante una síntesis de fosforamidita con fluoróforos que, por ejemplo, se utilizan en QPCR, secuenciación de ADN e hibridaciónin situ.Además, el ADN puede generarse enzimáticamente en el curso de una reacción en cadena de la polimerasa con nucleótidos fluorescentes, o marcarse con una ligasa o una desoxinucleotidil transferasa terminal. El ADN también puede detectarse indirectamente mediante biotinilación y avidina fluorescente. Para los acoplamientos se utilizan como fluoróforos, entre otros, fluoresceína, lantánidos fluorescentes, nanopartículas de oro, nanotubos de carbono o puntos cuánticos. Una de las sustancias fluorescentes más utilizadas es la FAM (carboxifluoresceína). En consecuencia, los oligonucleótidos y, en particular, los cebadores que poseen una marca FAM quedan abarcados por la invención. El FAM está presente preferiblemente como 6-FAM, en donde - dependiendo de la longitud de onda deseada de la emisión y excitación - pueden usarse también sin embargo otras variantes de FAM, por ejemplo, 5-FAM. Ejemplos de marcadores de fluorescencia adicionales son AlexaFluor, ATTO, Dabcyl, HEX, Rox, TET Texas Red y Yakima Yellow. Dependiendo del campo de uso, los oligonucleótidos pueden estar provistos de modificaciones de las bases o de la columna de fosfato de azúcar. Entre estos se encuentran, entre otros, amino-dT, azida-dT, 2-aminopurina, 5-Br-dC, 2'-desoxiinosina (INO), 3'-desoxi-A, C, G, 5-Met-dC, 5-OH-Met-dCN6-Met-dA y otros.

[0340] Además, la presente divulgación también se refiere a un chip marcador ("chip de ADN" o microarreglos) que contiene al menos un oligonucleótido como el divulgado que es adecuado para la detección. El chip marcador es adecuado para su aplicación en uno o más métodos de detección como se divulga.

[0342] La divulgación también incluye un método para la producción de la proteína de acuerdo con la invención. El método incluye la provisión o cultivo de un cultivo celular que contiene cualquiera de las SEQ ID Nos. 2, 5 y 8, y la expresión posterior de la proteína codificada por una cualquiera de las SEQ ID Nos. 2, 5 y 8.

[0344] Además, la presente divulgación también se refiere a una planta resistente a Heterodera o una porción de la misma que fue identificada y, si corresponde, seleccionada, a través de un método como el descrito anteriormente. En particular, la presente divulgación se refiere a una población de plantas que comprende plantas que están disponibles de acuerdo con uno de los métodos descritos anteriormente, y que preferiblemente son resistentes al nematodo del quiste de la remolacha, y se caracterizan por la presencia de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. La población tiene preferiblemente al menos 10 -preferiblemente, al menos 50, más preferiblemente, al menos 100, particularmente preferiblemente, al menos 500, y, particularmente en el cultivo agrícola, preferiblemente al menos 1,000 - plantas. La proporción de plantas de la población que no portan la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o son susceptibles a la infestación con Heterodera, en particular conHeterodera schachtiies preferiblemente inferior al 25 % -preferiblemente, inferior al 20 %, más preferiblemente, inferior al 15 %, incluso más preferiblemente, al 10 %, y, en particular, preferiblemente inferior al 5 %, si está presente.

[0346] Con el mapeo fino descrito anteriormente, se pudieron identificar el gen o genes que confieren resistencia a Heterodera en el genoma. Esto a su vez representa la base para el desarrollo de sondas de hibridación de ADN o marcadores genéticos en la región objetivo, con cuya ayuda se podría detectar el gen mediador de resistencia a Heterodera, o bien diferenciarlo del gen que no confiere resistencia.

[0348] Las sondas de hibridación de ADN pueden derivarse de la secuencia del gen o genes que confieren resistencia a Heterodera y usarse para la detección de bancos genómicos y/o de ADNc del organismo deseado. Las sondas se pueden utilizar para amplificar genes homólogos identificados a través del proceso conocido de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y para comprobar si el gen que confiere resistencia a Heterodera está presente de forma endógena en un organismo o se ha introducido con éxito de forma heteróloga.

[0350] El experto en la materia puede recurrir en este caso a métodos habituales de hibridación, clonación y secuenciación, que, por ejemplo, se enumeran en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. El experto en la materia también puede sintetizar y utilizar cebadores de oligonucleótidos para amplificar secuencias del gen o genes que confieren resistencia a Heterodera. Para lograr una hibridación específica, dichas sondas deben ser específicas y tener una longitud de al menos 15 nucleótidos - preferiblemente, al menos 20 nucleótidos. Se puede encontrar una guía detallada sobre la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte 1, Capitulo 2, "OverView of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays." Elsevier, New York (1993); y en Current Protocols in Molecular Biology, Capitulo 2, Ausubel et al., eds., Greene Publishing and Wiley lnterscience, New York (1995).

[0352] Por lo tanto, una molécula de ácido nucleico de al menos 15, 16, 17, 18, 19 o 20 - preferiblemente, al menos 21, 22, 23, 24 o 25, particularmente preferiblemente, al menos 30, 35, 40, 45 o 50, y, especialmente preferiblemente, al menos 100, 200, 300, 500 o 1,000 - nucleótidos de longitud es el objeto de la presente divulgación, en donde esta molécula de ácido nucleico se hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos descrita previamente de acuerdo con la invención que comprende el o los genes que confieren resistencia de Heterodera. Esto también abarca explícitamente el intervalo de 15 a 35 nucleótidos.

[0354] La presente divulgación también se refiere a marcadores como oligonucleótidos - en particular, oligonucleótidos cebadores. Estos comprenden una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud que se hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos definida como en el punto anterior.

[0356] En particular, la presente divulgación abarca un par de moléculas de ácido nucleico - preferiblemente en forma de oligonucleótidos o un kit que contiene este par de oligonucleótidos - que es adecuado para la hibridación como un cebador directo e inverso a una región que es específica para la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, y para amplificar esto en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o que es adecuado como un cebador directo e inverso para la hibridación con una región en el genomaBeta vulgarisque, enBeta vulgaris,exhibe una segregación conjuntamente con la resistencia hacia un patógeno del género Heterodera conferida por el polipéptido de acuerdo con la invención, o con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Preferiblemente la región en el genoma deBeta vulgarisse encuentra entre el marcador s5e3001s02 y el marcador s5e4668xxx, está flanqueado por el marcador s5e3001s02 y el marcador s5e4668xxx, o comprende un intervalo cromosómico entre el marcador s5e3001s02 y el marcador s5e4668xxx.

[0357] Las siguientes ventajas para el fitomejoramiento y desarrollo de nuevas líneas de plantas resistentes del género Beta también pueden lograrse mediante la presente invención. Información de la secuencia, así como los polimorfismos identificados que permiten una diferenciación entre alelos resistentes y potencialmente susceptibles del gen divulgado, es decir, entre los alelos que confieren una resistencia hacia un patógeno del género Heterodera y los alelos que no son capaces de conferir esta resistencia, hacen posible el desarrollo de marcadores que representa una importante facilitación para el fitomejorador - en particular, con respecto al desarrollo de líneas élite optimizadas sin "arrastre de ligamiento". Además, el conocimiento sobre la estructura secuencial puede utilizarse para la identificación de genes de resistencia adicionales - en particular, contra Heterodera - que sean homólogos u ortólogos, por ejemplo.

[0359] Por lo tanto, la presente divulgación también abarca un método para la identificación de moléculas de ácido nucleico adicionales que confieren una resistencia hacia un patógeno del género Heterodera cuando está presente en una planta y que codifican polipéptidos o proteínas adicionales que son capaces de conferir una resistencia hacia un patógeno del género Heterodera en una planta en donde se expresa el polipéptido, respectivamente. El experto en la materia podrá utilizar para ello bases de datos, empleando perfiles de búsqueda adecuados y programas informáticos para la búsqueda de secuencias homólogas o para la comparación de secuencias. Además, mediante técnicas convencionales de biología molecular, el experto en la materia puede derivar por sí mismo secuencias de ADN adicionales que codifican proteínas de resistencia de Heterodera. Por ejemplo, se pueden derivar sondas de hibridación adecuadas de la secuencia de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y usarse para la selección de bancos genómicos y/o de ADNc del organismo deseado. El experto en la materia puede recurrir en este caso a métodos habituales de hibridación, clonación y secuenciación, que, por ejemplo, se enumeran en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Utilizando secuencias conocidas, el experto en la materia también puede sintetizar y utilizar cebadores de oligonucleótidos para amplificar secuencias de moléculas de ácido nucleico que confieren resistencia a Heterodera.

[0361] Por lo tanto, la presente divulgación abarca un método para la identificación de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es capaz de conferir resistencia a Heterodera en una planta de la especieBeta vulgarisen donde se expresa el polipéptido. El método incluye por tanto la comparación de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de acuerdo con la invención que, enBeta vulgarissubespecievulgaris,confiere una resistencia frente a un patógeno del género Heterodera con secuencias de aminoácidos de una base de datos de secuencias, o con secuencias de variantes alélicas del polipéptido de acuerdo con la invención en genotipos de la especieBeta vulgaris.Además, el método divulgado incluye la identificación de una secuencia de aminoácidos o de una variante alélica que sea al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de acuerdo con la invención, así como la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifique la secuencia de aminoácidos o la variante alélica identificada en una planta de la especieBeta vulgaris;expresión de la molécula de ácido nucleico en la planta; y, opcionalmente, verificación posterior de la resistencia frente a un patógeno del género Heterodera.

[0363] Como se describió anteriormente, proteínas adicionales que confieren resistencia a Heterodera o sus genes codificantes, es decir, homólogos, análogos y ortólogos, que son al menos 70 % - preferiblemente, al menos 80 %, particularmente preferiblemente, al menos 90 %, especialmente preferiblemente, al menos 95 %, o incluso 98 % - idénticos a la secuencia de aminoácidos del polipéptido que está codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden identificarse a través de enfoques bioinformáticos clásicos (búsquedas en bases de datos y programas informáticos para la detección de secuencias homólogas).

[0365] La divulgación incluye además una planta o una semilla que comprende el ácido nucleico de la invención como se describe en este documento, en donde la planta o la semilla de dicha planta tiene un genoma que permite el desarrollo de un cuerpo de remolacha que tiene una masa fresca mínima de 200 g, 250 g, 300 g, 350 g, 400 g, 450 g o 500 g y una masa máxima de 100 g, 1100 g, 1200 g, 1300 g, 1400 g, 1500 g, 1600 g, 1700 g, 1800 g, 1900 g o 2000 g. La composición genética correspondiente para el desarrollo de dicho cuerpo de remolacha está disponible, por ejemplo, a través de las siguientes variedades BTS 8629, BTS 8735, BTS 8500, BTS 8767 o BTS 8749. El experto en la materia sabe cómo transferir el ácido nucleico de acuerdo con la invención a una planta que tiene dicha composición genética. En esta realización, la semilla puede ser una semilla granulada.

[0366] La divulgación incluye además una planta o una semilla que comprende el ácido nucleico de la invención como se describe en este documento, en donde la planta o la semilla de dicha planta tiene un genoma que permite el desarrollo de un cuerpo de remolacha que tiene una concentración de sacarosa en la masa fresca del cuerpo de remolacha de al menos 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o incluso 20 % (porcentaje en masa).

[0368] El término homólogo u homólogos significa que los genes en cuestión (de dos especies de plantas diferentes) tienen esencialmente la misma función y un ancestro común y, por lo tanto, suelen mostrar una identidad significativa en sus secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos codificados. Sin embargo, también hay muchos genes que son homólogos entre sí, sin que las secuencias de proteínas resulten en una alineación pareada significativa. En contraste con esto, el término análogo u análogos describe genes o proteínas que (igualmente) tienen una función idéntica o similar, pero no se crean a partir de la misma estructura, es decir, no tienen un ancestro común. En este caso, a menudo no se puede establecer una identidad significativa en su secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos codificados o, en el mejor de los casos, en dominios funcionales específicos.

[0370] En el contexto de la secuenciación del genoma, los homólogos se clasifican con mayor precisión para su anotación. Para ello se han introducido los términos ortología y paralogía. Los ortólogos son genes que están conectados a través de un evento de especiación. Los parálogos son genes que se remontan a un evento de duplicación.

[0372] Un gen es, entonces, fundamentalmente un homólogo o análogo u ortólogo en el sentido de la presente invención si es capaz de conferir resistencia a Heterodera en una planta. Para la comprobación se utilizan métodos ya descritos anteriormente, conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, la amplificación del homólogo o análogo u ortólogo identificado mediante PCR, clonación en vectores de expresión, introducción en la planta o célula de planta diana y comprobación de la resistencia.

[0374] Como se ha descrito anteriormente, el uso divulgado en el presente documento del alelo del gen resistente en enfoques cis o transgenéticos abre la posibilidad de nuevas especies resistentes del género Beta que, utilizando el efecto de la dosis, exhiben una resistencia mejorada, o en las que se puede evitar una ruptura de la resistencia y optimizar el desarrollo de la resistencia a través del apilamiento del gen divulgado con otros genes de resistencia. También son posibles modificaciones del gen mediante labranza o ingeniería dirigida para desarrollar nuevos alelos de resistencia.

[0375] La presente divulgación también se refiere al uso en una planta del alelo del gen que confiere resistencia a Heterodera identificado en una pila genética o molecular con otros elementos genéticos que pueden conferir propiedades agronómicamente ventajosas. De este modo, se puede aumentar notablemente el valor económico de las plantas cultivadas, puede aumentarse marcadamente, por lo tanto, en que, por ejemplo, se aumenta el desempeño del rendimiento en comparación con plantas que poseen la misma genética, pero que no han sido provistas del ácido nucleico de acuerdo con la invención. Además, se pueden abrir nuevas zonas de cultivo para una planta que antes no eran accesibles al cultivo de esta planta debido a factores bióticos como una fuerte presión de patógenos. En particular, la presente divulgación se refiere al uso del alelo identificado del gen que confiere resistencia a Heterodera en métodos para controlar una infestación con el patógenoHeterodera schachtiien el cultivo agrícola u hortícola de plantas del género Beta, por ejemplo, que comprende la identificación y selección de plantas del género Beta con ayuda de uno de los métodos descritos anteriormente y/o el cultivo de las plantas así seleccionadas o descendientes de las mismas. La presente divulgación incluye así un método para el cultivo de plantas de la especieBeta vulgaris,incluyendo, en una primera etapa, la provisión de plantas resistentes a Heterodera de la especieBeta vulgariscomo se divulga, o la producción de plantas de la especieBeta vulgariscon la ayuda del método de producción divulgado, o la identificación y selección de plantas de la especieBeta vulgariscon ayuda del método de identificación de acuerdo con la invención que se ha descrito anteriormente; e incluyendo, en una segunda etapa, el cultivo de las plantas de la primera etapa, o el despliegue de material de semilla de las plantas de la primera etapa, o el aumento de plantas de la primera etapa. El método de cultivo contrarresta así una infestación de las plantas cultivadas por Heterodera. El método de cultivo puede ser parte de un método para producir azúcar. El método para la producción de azúcar incluye las etapas del método de cultivo, y adicionalmente, como penúltima etapa, la cosecha de las plantas cultivadas, y, como última etapa, la extracción de azúcar de dichas plantas.

[0377] El método de cultivo también puede ser parte de un método para producir material de semillas. El método de producción de material de semilla incluye las etapas del método de cultivo, y adicionalmente, como penúltima etapa, la vernalización de las plantas cultivadas, y, como última etapa, la extracción de semillas de dichas plantas. Las semillas extraídas pueden opcionalmente ser apiladas, con el fin de obtener un material de semilla apilado de la especieBeta vulgaris.En este caso, se trata de un método para la producción de material de semilla apilado.

[0379] Además, el método para la producción de material de semilla puede diseñarse como un método para la producción de material de semilla resistente a Heterodera. El método para la producción de material de semilla resistente a Heterodera incluye las etapas del método descrito anteriormente para la producción de material de semilla, y adicionalmente, como última etapa, la verificación del ácido nucleico de acuerdo con la invención de acuerdo con un método descrito en este documento en al menos una de las semillas extraídas -preferiblemente, en al menos 0.1 % o en al menos 1 % de las semillas extraídas. La verificación se realiza de forma especialmente preferente de modo que la semilla permanezca germinable. Esto significa que la extracción del ADN necesaria para la verificación de la semilla no neutraliza la germinabilidad de la semilla. En tal caso, la verificación del ácido nucleico de acuerdo con la invención puede haber tenido lugar en una proporción especialmente grande de todas las semillas extraídas. Por ejemplo, la verificación puede tener lugar en al menos un 2 % - preferiblemente, al menos un 3 %, particularmente preferiblemente, al menos un 4 % -de todas las semillas extraídas.

[0381] Las plantas tal como se divulgan, sus células o semillas de acuerdo con la invención pueden poseer propiedades adicionales, agronómicamente ventajosas, o estar provistas de ellas. Un ejemplo es la tolerancia o resistencia a un herbicida como el glifosato, el glufosinato o los inhibidores de ALS. Se prefiere la tolerancia al glifosato o a un herbicida inhibidor de ALS. Una realización específica de la resistencia al glifosato se divulga en el documento US 7,335,816 B2. Esta resistencia al glifosato está disponible, por ejemplo, en los materiales de semillas almacenadas en el NCIMB, Aberdeen (Escocia, Reino Unido), con el número de acceso NCIMB 41158 o NCIMB 41159. Estas semillas pueden utilizarse para obtener una planta de remolacha azucarera tolerante al glifosato. La resistencia al glifosato también puede introducirse en otras especies del géneroBetamediante cruzamiento.

[0383] La divulgación también se refiere a plantas, sus células o semillas o material de semillas, caracterizado porque éstas contienen la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y además porque un fragmento de ADN del ADN genómico de la planta, porciones o semillas de la misma se puede amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa con un primer y un segundo cebador.

[0385] Una realización específica de la resistencia al herbicida inhibidor de ALS, se divulga en el documento WO 2012/049268 A1. Por ejemplo, un inhibidor de ALS resistente a herbicidas está disponible en un depósito del NCIMB en Aberdeen, Reino Unido, con el número NCIMB 41705. Además, dicha resistencia a los inhibidores de ALS se puede producir mediante labranza o mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, mediante la edición genética, como por ejemplo mediante el uso de CRISPR/Cas. La invención también abarca las plantas, sus células o semillas o material de semilla, caracterizadas porque éstas contienen la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y además porque presentan una mutación en un gen de acetolactato sintasa endógeno, en donde el gen de acetolactato sintasa codifica una proteína acetolactato sintasa que, como resultado de la mutación en la posición 569, tiene un aminoácido diferente al triptófano. Como resultado de la mutación, el aminoácido en la posición 569 es preferiblemente alanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, valina o arginina. Además, la mutación puede estar presente tanto de forma heterocigótica como homocigótica en las plantas, sus células o semillas, o en el material de semilla. Recomendamos la presencia homocigótica de la mutación, ya que ésta promueve una ocurrencia fenotípica más estable o más intensiva de la resistencia.

[0387] El experto en la materia conoce numerosos herbicidas adicionales y su aplicabilidad a partir del estado de la técnica. Puede recurrir al estado de la técnica para lograr conocimiento acerca de qué elementos genéticos deben utilizarse de qué manera para implementar una tolerancia correspondiente en las plantas.

[0389] Un ejemplo adicional de una propiedad agronómicamente ventajosa es una resistencia adicional a patógenos, donde los patógenos pueden ser insectos, virus, nematodos, bacterias u hongos, por ejemplo. Por ejemplo, una amplia defensa contra patógenos para una planta puede lograrse mediante una combinación de diferentes resistencias/tolerancias a patógenos, ya que los elementos genéticos pueden exhibir efectos aditivos entre sí. Por ejemplo, el experto en la materia conoce numerosos genes de resistencia a este tipo de enfermedades como elementos genéticos. Por ejemplo, el documento US 2016/0152999 A1 divulga un gen de resistencia RZ contra la enfermedad Rhizomania. Esta enfermedad es causada por el patógeno "virus de la vena amarilla necrótica de la remolacha". Varias resistencias a enfermedades contenidas en una planta tienen efectos sinérgicos entre sí. Si una planta es infestada por primera vez por un patógeno, su sistema inmunológico normalmente se debilita y la epidermis, como barrera externa, suele resultar dañada, de modo que aumenta la probabilidad de futuras infecciones. Un ejemplo adicional de una propiedad agronómicamente ventajosa es la tolerancia al frío o la tolerancia a las heladas. Las plantas que presentan esta propiedad pueden sembrarse ya a principios de año o pueden permanecer en el campo durante más tiempo, lo que puede conducir a mayores rendimientos, por ejemplo. En este caso, el experto en la materia también podrá recurrir al estado de la técnica para encontrar elementos genéticos adecuados. Otros ejemplos de propiedades agronómicamente ventajosas son la eficiencia en el uso del agua, la eficiencia en el uso del nitrógeno y el rendimiento. Se podrían encontrar en la técnica anterior elementos genéticos que podrían utilizarse para conferir tales propiedades.

[0391] Además, el experto en la materia conoce numerosas modificaciones para la defensa contra patógenos. Además de las familias de genes R que se describen a menudo, el enfoque Avr/R, la complementación del gen Avr (documento WO 2013/127379), la autoactivación de un gen R (documento WO 2006/128444), o el enfoque HIGS (silenciamiento génico inducido por el huésped) (por ejemplo, documento WO 2013/050024) puede utilizarse ventajosamente. En particular, la autoactivación de un gen R podría ser importante para la presente invención. Para ello se debe crear un ácido nucleico que codifique una proteína de resistencia autoactivada para la generación de resistencia a patógenos en plantas. Este ácido nucleico tiene entonces sólo una porción limitada de un gen de resistencia NBS-LRR, como el gen wb-R, que se extiende secuencia abajo desde el extremo 5' de la región codificante del gen de resistencia NBS-LRR hasta el comienzo de la codificación del dominio NBS del gen de resistencia NBS-LRR.

[0393] En este contexto, también se divulga en el presente documento un método que contiene la etapa de eliminación de aquella región del ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifica la región del extremo terminal N y que comienza con el bucle p en el dominio NBS, y se extiende hasta el final de la región del extremo terminal N.

[0395] Las proteínas de resistencia que están codificadas por estos ácidos nucleicos acortados generalmente se autoactivan, ya que estas proteínas de resistencia desencadenan una reacción inmune en la planta, incluso en ausencia del patógeno asociado, y aumentan así la inmunidad base de la planta. Además, se divulgan un ácido nucleico acortado de acuerdo con la invención y el polipéptido que está codificado por éste.

[0397] Además, la divulgación también incluye el uso del alelo del gen que confiere resistencia a Heterodera, identificado con un método descrito anteriormente, para su combinación con una de las modificaciones precedentes, o con un elemento genético descrito anteriormente que puede transmitir a una planta una o más propiedades agronómicamente ventajosas.

[0399] Además de la planta, la presente divulgación también se refiere a semillas o descendientes, o a un órgano, una parte de la planta, un tejido o una célula de la misma en la producción de productos que normalmente se producen a partir de materias primas sostenibles, tales como alimentos y piensos para animales -preferiblemente, azúcar o jarabe (melaza), en donde la melaza también se utiliza para aplicaciones industriales, por ejemplo, en la producción de alcohol o como medio de cultivo para la producción de productos biotecnológicos, en la producción de materiales o sustancias para la industria química, por ejemplo, productos químicos refinados, productos farmacéuticos o precursores de los mismos, compuestos para diagnóstico, cosméticos, bioetanol o biogás. En la solicitud DE 10 2012 022 178 A1 se describe un ejemplo del uso de remolacha azucarera como materia prima biogénica en plantas de biogás; véase, por ejemplo, el párrafo 10.

[0400] Los siguientes ejemplos explican la invención. A menos que se indique lo contrario, se han utilizado métodos estándar de biología molecular; véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, Fritsch et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989; Mayer et al., Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, eds., Academic Press, Londres, 1987, y Weir et al., Handbook of Experimental Immunology, Volumenes I-IV, Blackwell, eds., 1986.

[0401] Algunas de las secuencias más importantes de acuerdo con la invención se explican en detalle a continuación: - SEQ ID No. 1: secuencia de ADN genómico del gen LLR2 que confiere resistencia a Heterodera deBeta vulgaris subespecie marítima.

[0402] - SEQ ID No.2: secuencia de ADNc del gen LLR2 que confiere resistencia a Heterodera, ya que no se encuentra en la naturaleza.

[0403] - SEQ ID No. 3: secuencia de aminoácidos de la proteína LLR2 que confiere resistencia a Heterodera tal como está codificada por la SEQ ID No. 1 o la SEQ ID No. 2.

[0404] - SEQ ID No. 4: secuencia de ADN genómico del gen LLR1 que confiere resistencia a Heterodera deBeta vulgaris subespecie marítima.

[0405] - SEQ ID No. 5: secuencia de ADNc del gen LLR1 que confiere resistencia a Heterodera, ya que no se encuentra en la naturaleza.

[0406] - SEQ ID No. 6: secuencia de aminoácidos de la proteína LLR1 que confiere resistencia a Heterodera tal como está codificada por la SEQ ID No. 4 o la SEQ ID No. 5.

[0407] - SEQ ID No. 7: secuencia de ADN genómico del gen LLR3 que confiere resistencia a Heterodera deBeta vulgaris subespecie marítima.

[0408] - SEQ ID No. 8: secuencia de ADNc del gen LLR3 que confiere resistencia a Heterodera, ya que no se encuentra en la naturaleza.

[0409] - SEQ ID No. 9: secuencia de aminoácidos de la proteína LLR3 que confiere resistencia a Heterodera tal como está codificada por la SEQ ID No. 7 o la SEQ ID No. 8.

[0410] -SEQ ID No. 10: marcador molecular s5e3001s02

[0411] - SEQ ID No. 11: marcador molecular s5e4668xxx

[0412] Ejemplos

[0413] Ejemplo 1: Realización de una prueba de Nematodos

[0414] 1) Las plantas de acuerdo con la invención se sembraron en sustrato de turba de invernadero.

[0415] 2) Las plantas se trasplantaron después de la emergencia en la etapa de cotiledón en cajas plásticas de aproximadamente 30 ml (aproximadamente 2*1*15 cm) llenas de arena de cuarzo como plantas individuales (una planta/caja). Alternativamente, las plántulas de cultivo de tejidos se pueden transferir directamente a las cajas de plástico. Condiciones de temperatura y luz: 16/8 horas de luz/oscuridad con cambios de temperatura de 23°C/12°C.

[0416] 3) Una semana después del trasplante se simuló la infestación mediante la aplicación de 600 larvas deHeterodera schachtii.

[0417] 4) La evaluación de las plantas y el número de quistes se realizó 4 semanas después de la infección bajo el microscopio.

[0418] Ejemplo 2: Ensamblaje de genes

[0419] El lugar de resistencia se encuentra en el cromosoma 5 y la región objetivo se redujo en varias etapas de mapeo a los marcadores flanqueantes s5e5864s01 (Mapa genético integrado: 9,17 cM) y s5e4503s02 (9,74 cM) que encierran una distancia física de 119341 pb en el mapa físico de referencia (ZR_BPMv7 - secuencia de referencia sensible a un solo germen). En una prueba de detección de BAC de la línea donante resistente, se identificaron 3 clones BAC para la región genómica objetivo. Los clones BAC se secuenciaron mediante el método PacBio (Fichot, Erin B. y R. Sean Norman. "Microbial phylogenetic profiling with the Pacific Biosciences sequencing platform." Microbiome 1.1 (2013): 10). Este método permite producir secuencias de contigs más largas y facilita así el ensamblaje posterior de contigs generados a partir de zonas genómicas que contienen secuencias repetitivas. Se ensambló una secuencia resistente sin espacios que permitió realizar comparaciones de secuencias entre el genotipo de referencia resistente y el sensible y desarrollar nuevos marcadores en la región objetivo. En una nueva etapa de mapeo fino utilizando los recombinantes disponibles, la región objetivo se redujo a dos nuevos marcadores flanqueantes que encierran un tramo de secuencia de 26484 pb en el genotipo resistente y 39587 pb en el genotipo sensible. La región objetivo reducida contiene solo 9 genes anotados. Entre estos genes, se identificaron tres genes LRR repetidos en tándem como posibles genes candidatos causales para la resistencia a NRBMH (LRR1, LRR2 y LRR3 (Figura 1)). La región objetivo muestra un alto grado de complejidad: a) la secuencia resistente contiene una gran duplicación de secuencia; b) los genes LRR muestran similitud de secuencia; c) en genotipos sensibles varios retrotransposones están incrustados en la región objetivo. Debido a la complejidad de la secuencia, el ensamblaje de las secuencias RR y ss fue un procedimiento muy exigente y complejo.

[0421] Dentro de la región objetivo reducida, se detectaron 5 recombinaciones y se fenotipificaron 180 descendientes de estos recombinantes. Los fenotipos se determinaron con métodos estadísticos intensivos (prueba t, análisis de potencia). De estos 5 recombinantes, se analizó una muestra de 10 plantas por Ident con marcadores dominantes específicos desarrollados para los 3 genes LRR. Fue posible probar la funcionalidad de los 3 genes LRR. Como resultado ejemplar, el gen LRR1 no muestra en ninguno de los recombinantes datos contradictorios, es decir, todos los recombinantes que portan el gen LRR1 son resistentes.

[0423] El proceso de "clonación basada en mapas" implicó las siguientes etapas: mapeo genético fino, mapeo físico, análisis de secuencias del WHG (genoma completo), construcción de varias poblaciones segregantes grandes, cribado recombinante, desarrollo de marcadores en la región objetivo, secuenciación comparativa de BAC en el genotipo resistente, análisis de secuencias de genotipos resistentes y sensibles, análisis bioinformáticos, predicción de proteínas, comparación de proteínas. Las siguientes etapas fueron cruciales para esta invención: mapeo fino acoplado con fenotipado intensivo, identificación y secuenciación de clones BAC resistentes, desarrollo de marcadores dominantes para los 3 genes LRR, análisis de secuencia y comparaciones de secuencias y proteínas entre genotipos R<r>(resistentes) y ss (susceptibles).

[0425] Ejemplo 3: Introducción del gen que confiere resistencia como transgén mediante transformación genética enBeta vulgarissubespecievulgaris

[0427] El enfoque transgénico para la producción de plantas resistentes aHeteroderano sólo sirvieron para la validación alternativa del gen o genes LRR como gen o genes que confieren resistencia, sino también como un medio para producir eventos de resistencia transgénica que confieren una nueva resistencia aHeteroderao mejorar las ya existentes resistenciasa Heterodera.

[0429] El gen LRR de interés se clonó en el vector binario pZFN-nptII (Figura 2) mediante los siguientes procedimientos de clonación estándar: dentro del T-ADN de este vector, el ADNc del gen de resistencia fue clonado entre el promotor 35S duplicado de CaMV y el terminador de la nopalina sintasa (NOS), con el fin de asegurar un alto nivel de expresión constitutiva del gen de resistencia en la planta transgénica. El T-ADN incluye además el gen de neomicina fosfotransferasa II(nptlI),que confiere resistencia a un ancho de banda de antibióticos aminoglucósidos como la kanamicina o la paromomicina. Estas resistencias a los antibióticos se utilizaron para la selección de células y tejidos de plantas transgénicos. El promotorNOSy el terminadorpAG7flanquea el gennptII.La columna vertebral del vector binario contiene además el origencolEIy elpVS1de la replicación del plásmido enEscherichia colioAgrobacterium tumefaciens.El genaadAconfiere resistencia a la estreptomicina/espectinomicina para la selección de bacterias. El plásmido pZFN-nptII-LRR se transformó en la cepa de agrobacterium AGL-1 mediante el procedimiento estándar.

[0431] La transformación de la remolacha azucarera se llevó a cabo de acuerdo con Lindsey & Gallois (1990), "Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterium tumefaciens". Journal of experimental botany 41.5, 529-536). Para ello se utilizaron como material de partida "brotes micropropagados" del genotipo 04E05B1DH5, que porta exclusivamente alelos sensibles del gen identificado. Los brotes se multiplicaron en el medio correspondiente de acuerdo con Lindsey & Gallois (1990). Para inducir la mayor cantidad posible de meristemos, los "brotes" se transfirieron a un medio diferente (véase Lindsey & Gallois (1990)) y se incubaron en la oscuridad durante varias semanas a aproximadamente 30 °C. La cepa AGL-1 de Agrobacterium con el vector pZFN-nptII-LRR se cultivó en un medio adicional (véase Lindsey & Gallois (1990)), al que se le administraron los antibióticos correspondientes para la selección. Se incubaron secciones de tejido meristémico del brote a tratar con agrobacterium durante varias horas en un medio adicional (ver Lindsey & Gallois (1990)). Los explantes de plantas y las agrobacterias se cultivaron conjuntamente en la oscuridad durante al menos 2 días en un medio (véase Lindsey & Gallois (1990)), y los explantes inoculados se incubaron posteriormente en la oscuridad durante aproximadamente 2 semanas en un medio adicional (véase Lindsey & Gallois (1990)). Los explantes fueron luego propagados en un medio adicional (véase Lindsey & Gallois (1990)) y subcultivados, para permitir la selección del tejido transgénico. Luego se extrajo material de las hojas de los "brotes" verdes en crecimiento y se examinó mediante PCR para detectar la presencia del transgén. Los "brotes" adecuados fueron enraizados y posteriormente transferidos a un invernadero para la producción de material de semilla T1. La resistencia a Heterodera en plantas T1 se puede probar mediante el protocolo descrito en el Ejemplo 1.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nuclei

una planta de Beta vulgaris en donde se expresa la molécula de ácido nucleico, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ ID NO 1,4 y 7;

(b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia codificante seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ ID NO 2, 5 y 8;

(c) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con una secuencia complementaria de una secuencia de nucleótidos de acuerdo con (a), (b), (f) o (g) en condiciones rigurosas;

(d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que es al menos 90 % idéntica a la secuencia de la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (a) o (b);

(e) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ ID NO 3, 6 y 9;

(f) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 94 % idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ Id NO 3, 6 y 9;

(g) una secuencia de nucleótidos que es una variante de una secuencia de ADN de cualquiera de (a) a (f) debido a la degeneración del código genético,

donde las condiciones rigurosas se definen como hibridación en 4 x SSC a 65 °C y lavado repetido posterior en 0.1 x SSC a 65 °C durante aproximadamente 1 hora en total.

2. Polipéptido que está codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Vector o casete de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

4. Célula que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 como transgén, o el vector o casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Semilla de una planta de Beta vulgaris, caracterizada porque la planta no esB. vulgarissubespeciemarítima,en donde la semilla comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la semilla no se obtiene exclusivamente mediante un proceso esencialmente biológico.

6. La semilla de una planta de Beta vulgaris de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la semilla ha sido tratada técnicamente, seleccionándose el tratamiento técnico del grupo que consiste en:

(a) Pulido

(b) Recubrimiento preferentemente en granulado

(c) Incrustación

(d) Coloración.

7. Método para aumentar la resistencia a un nematodo del género Heterodera en una planta de Beta vulgaris, que incluye las siguientes etapas:

(i) la integración de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 mediante reparación dirigida por homología en el genoma de al menos una célula de una planta, y la regeneración de una planta a partir de la célula de planta; o

(ii) aumento de la expresión de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 en la planta mediante modificación del promotor nativo o mediante fusión de la molécula de ácido nucleico con un promotor heterólogo que exhibe una mayor actividad en comparación con el promotor nativo; o

(iii) transformación de una célula de planta con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, o el vector o el casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 3, y regeneración de la planta transgénica a partir de la célula de planta transformada.

8. Método para aumentar la resistencia a un nematodo del género Heterodera en una planta de Beta vulgaris de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la reparación dirigida por homología es promovida por una nucleasa dirigida al sitio.

9. Método para producir una planta de Beta vulgaris con resistencia a un nematodo del género Heterodera, que incluye las siguientes etapas:

(a) la transformación de una célula de planta con la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, o el vector o el casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 3; y

(b) la regeneración de la planta transgénica a partir de la célula de planta transformada; o

(i) introducción de una nucleasa dirigida al sitio y una matriz de reparación en una célula de una planta, en donde la nucleasa dirigida al sitio es capaz de generar al menos una rotura de cadena sencilla o al menos una rotura de cadena doble del ADN en el genoma de la célula secuencia arriba y/o secuencia abajo de una región objetivo y la matriz de reparación comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1; (ii) el cultivo de la célula a partir de (i) en condiciones que permitan una reparación dirigida por homología o una recombinación homóloga, en donde la molécula de ácido nucleico se integra desde la matriz de reparación al genoma de la planta; y

(iii) regeneración de una planta a partir de la célula modificada en (ii),

10. Método de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque la región objetivo

a) se encuentra entre un marcador de acuerdo con la SEQ ID NO: 10 y un marcador de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, o

b) está flanqueada por un marcador de acuerdo con la SEQ ID NO: 10 y un marcador de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, o

c) comprende un intervalo cromosómico entre un marcador de acuerdo con la SEQ ID NO: 10 y un marcador de acuerdo con la SEQ ID NO: 11.

11. Método de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, caracterizado porque al menos una rotura de cadena sencilla o al menos una rotura de cadena doble se produce en una posición que está como máximo 10,000 pares de bases secuencia arriba y/o secuencia abajo de la región objetivo.

12. Método para identificar y seleccionar una planta de Beta vulgaris resistente a un nematodo del género Heterodera, caracterizado porque el método incluye al menos la etapa (i) o (ii):

(i) detección de la presencia y/o expresión de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, o la presencia del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2, en la planta de Beta vulgaris o una porción de la planta de Beta vulgaris; y/o

(ii) detección de al menos una región que se encuentra entre el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 10 y el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 11, está flanqueada por el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 10 y el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 11, o comprende un intervalo cromosómico entre el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 10 y el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 11, segregándose conjuntamente con la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1; y (iii) selección de la planta de Beta vulgaris con resistencia a un nematodo del género Heterodera, en donde el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 10 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 56940072 pb del cromosoma 5 referenciado al genotipo EL10 de Beta vulgaris, en donde dicho nucleótido es T, y el marcador de acuerdo con la SEQ ID NO 11 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en la posición 57809807 pb del cromosoma 5 referenciado al genotipo EL10 de Beta vulgaris, en donde dicho nucleótido es T

13. Uso de un cebador oligonucleotídico de al menos 20 nucleótidos de longitud, cuyo oligonucleótido se hibrida específicamente como sonda con cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en

(i) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ ID NO 1,4 y 7;

(ii) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia codificante seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ ID NO 2, 5 y 8;

(iii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ ID NO 3, 6 y 9,

para amplificar una región específica de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 en una reacción en cadena de la polimerasa.