RS67302B1

RS67302B1 - Gen za rezistenciju na patogen roda heterodera

Info

Publication number: RS67302B1
Application number: RS20251007A
Authority: RS
Inventors: Ottó Törjék; Dietrich Borchardt; Wolfgang Mechelke; Werner Beyer; Britta Schulz; Jens Christoph Lein
Original assignee: Kws Saat Se & Co Kgaa
Priority date: 2018-05-09
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2025-11-28
Also published as: HRP20251258T1; EP3567111B1; ES3047057T3; EP3567111A1; DK3567111T3; LT3567111T; PL3567111T3; PT3567111T; FI3567111T3

Description

[0001] Opis

[0003] OBLAST PRONALASKA

[0005] Predmetna prijava se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji, kada je prisutan u biljci, može da dâ rezistenciju na patogen roda Heterodera - posebno na cističnu nematodu repe Heterodera schachtii, i, posebno, u biljci vrste Beta vulgaris - kao i na polipeptid koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom. Konkretno, molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa predmetnom prijavom karakteriše se time što je efekat rezistencije prema patogenima roda Heterodera, koji je dat prisustvom molekula nukleinske kiseline, dominantan. Štaviše, predmetna prijava se odnosi na Heterodera-rezistentnu biljku, biljnu ćeliju, biljni organ, biljno tkivo, deo biljke, ili seme ili potomka biljke, koji sadrže molekul nukleinske kiseline ili njegove delove kao endogeni gen, kao editovani gen, ili kao transgen. Štaviše, predmetna prijava takođe objavljuje postupke za povećanje rezistencije prema patogenu roda Heterodera, kod biljke, posebno kod biljke vrste Beta vulgaris, kao i postupke za proizvodnju ili identifikovanje i eventualno selektovanje Heterodera-rezistentne biljke. Predmetna prijava takođe objavljuje postupke za praćenje zaraze patogenom Heterodera schachtii, kao i oligonukleotidne probe i prajmere za hibridizaciju sa molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom.

[0007] POZADINA PRONALASKA

[0009] Kod komercijalno uzgajane šećerne repe, prijavljeno je da više od dvadeset četiri različitih vrsta nematoda uzrokuje ekonomsku štetu (Hafez, Sugar Beet nematodes in Idaho and Eastern Oregon (1997), Univerzitet u Ajdahu, Poljoprivredni fakultet). Najozbiljnija štetočina nematoda repe je cistična nematoda repe (Heterodera schachtii) (Cooke, Agricultural Zoology Reviews 2 (1987), 132‑183) koja ima najveći ekonomski značaj u većini nemačkih i evropskih područja u kojima se uzgaja repa. Prvi put je detektovana 1859. godine u Nemačkoj, i na osnovu procene trenutno 10‑25% površina za proizvodnju šećerne repe može biti zaraženo ovom štetočinom širom sveta, što uzrokuje gubitak prinosa do 80% (Hafez 1997), pri čemu gubitak prinosa zavisi od količine nematoda u zemljištu, vremena setve i zaraze šećerne repe, kao i od vremenskih uslova.

[0010] Cistična nematoda repe je biljna patogena nematoda i može uzrokovati značajan gubitak prinosa ne samo kod šećerne repe već i kod drugih repa kao što su crvena repa, stočna repa i blitva, kao i kod drugih biljaka iz porodice Amaranthaceae, kao što je spanać, i Brassicacea, kao što su uljana repica, kupus, kineski kupus, karfiol, prokelj, brokoli, repa, rotkva i stočna keleraba, ozbiljno oštećujući korenov sistem, naročito tokom leta. Ova nematoda takođe inficira mnoge uobičajene korove kao što su divlja repa, tarčužak, loboda i tušt.

[0011] U poljima šećerne repe, zaraza cističnim nematodama repe inicijalno se pojavljuje u formi kružnih do ovalnih područja zakržljalih biljaka. Nematode se hrane korenom biljke, smanjujući sposobnost biljke da apsorbuje hranljive materije i vodu. Prema tome nadzemni simptomi izgledaju kao nedostatak hranljivih materija ili suša, proređenost, slab rast, zakržljavanje, žutilo i uvenuće, pri čemu simptomi variraju u zavisnosti od faze rasta u vreme infekcije. Kada su sadnice inficirane, simptomi uključuju zakržljavanje i smanjen rast listova, a stariji spoljni listovi postaju žuti i svenuli tokom vrućeg perioda dana. Zaraženi usev sadrži manje biljke smanjene vrednosti i kvaliteta i imaće slabiju mogućnost kompeticije sa korovima.

[0012] Širenje bolesti je kontinuirano i proizvođačima je sve teže da izađu na kraj sa štetočinama. Međutim, ključno je kontrolisati štetočine, pošto velika populacija nematoda u zemljištu može učiniti proizvodnju šećerne repe neekonomičnom. Postoje različiti postupci za borbu protiv bolesti, ali nijedna od trenutno primenjenih praksi nije zadovoljavajuća. Hemijska kontrola Heterodera schachtii putem nematocida ne samo da stvara troškove za poljoprivrednika i zagađuje životnu sredinu, već više nije dozvoljena u mnogim zemljama, dok dekontaminacija zemljišta nije primenljiva na većim poljima. Štaviše, plodored u kome se šećerna repa gaji samo svake četvrte godine ili čak ređe kako bi se redukovala populacija nematoda nije uvek izvodljiv i nije dovoljno efikasan. Još jedna uobičajena praksa upravljanja uključuje kultivaciju međuuseva koji su rezistentni na nematode, kao što su uljana rotkva ili slačica. Ove biljke privlače štetočine ali inhibiraju njihovo razviće i razmnožavanje, što redukuje populaciju štetočina. Takođe je moguće gajiti rezistentne ili tolerantne sorte šećerne repe. Do sada je najefikasniji postupak za smanjenje populacije nematoda u zemljištu bio gajenje rezistentnih sorti šećerne repe.

[0013] [0006] U međuvremenu, na tržištu se nude kultivari šećerne repe koji su rezistentni i tolerantni na nematode koji nose, na primer, glavni gen rezistencije prema Heterodera schachtii iz Beta procumbens (Heijbroek et al., Euphytica 38 (1988), 121‑131; Lange et al., Proceedings of the 53rd IIRB Congress, Brussels (1990), 89‑102). U translociranom segmentu Beta procumbens, tj. segmentu hromozoma 1 B. procumbens integrisanom na kraju hromozoma 9 B. vulgaris, Hs1pro‑1 gen identifikovan je pozicionim kloniranjem kao uzročni faktor (Cai et al., Science 275 (1997), 832‑834). Međutim, integracijom segmenta hromozoma 1 Beta procumbens u genom Beta vulgaris ne samo da se u biljku introdukuje željena rezistencija na Heterodera schachtii, već često i neželjene osobine, kao što je, na primer, redukovan prinos, usled nasleđivanja dodatnih gena koji su povezani sa pozitivnom osobinom rezistencije na Heterodera. Ovaj fenomen je poznat i pod terminom „teret povezanosti“ (linkage drag). Stoga, upotreba ovog gena u oplemenjivanju ima ograničenja usled značajnog smanjenja prinosa zbog tereta povezanosti i pored toga i usled nestabilnosti translokacije.

[0014] Još jedan izvor rezistencije na nematode pronađen je kod divlje morske repe B. vulgaris subsp. maritima u materijalu koji je prikupljen u Francuskoj (Hijner, Meded. Inst. rat. Suikerprod.21 (1951), 1‑13). Međutim, genetička i funkcionalna pozadina rezistencije na Heterodera i identitet gena rezistencije do sada su bili potpuno nejasni.

[0015] Međutim, kao što je prethodno pomenuto, nedostatak kultivara koji imaju opisane rezistencije sastoji se u tome što je razvoj kultivara veoma naporan i komplikovan usled složenog nasleđivanja, i što takvi kultivari imaju znatno lošije prinose u odnosu na normalne kultivare, u odsustvu zaraze. Između ostalog, ovo može biti povezano sa epigenetičkom interakcijom nekih gena rezistencije sa genima koji su odgovorni za proizvodnju šećera, što dovodi do redukovanog fitnesa biljaka, u odsustvu patogena.

[0016] Upotreba novih tehnika oplemenjivanja zasnovanih na editovanju gena, npr. pomoću TALE nukleaza ili CRISPR sistema, i transgenih pristupa, nemoguća je u praksi pošto geni koji su uključeni u razvoj rezistencije nisu identifikovani i okarakterisani.

[0017] Za održivo oplemenjivanje prema cističnoj nematodi repe, to jest za suzbijanje opasnosti od varijanti Heterodera koje zaobilaze rezistenciju, neophodno je kontinuirano identifikovati nove gene rezistencije i integrisati ih u genske pulove kultivisanih biljaka kao što je šećerna repa. Konkretno, cilj se sastojao u obezbeđivanju pogodnih gena rezistencije koji, kada su prisutni u biljci, sami po sebi već proizvode veoma veliki, dominantni efekat rezistencije prema Heterodera schachtii. U skladu sa pronalaskom, ovaj cilj se postiže putem primera izvođenja koji su okarakterisani u patentnim zahtevima.

[0019] OPIS PRONALASKA

[0021] Pronalazak je definisan osobinama iz nezavisnih patentnih zahteva.

[0022] Predmetna prijava se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je u stanju da dâ rezistenciju prema patogenu roda Heterodera - posebno prema cističnoj nematodi repe Heterodera schachtii - kod biljke, i posebno, kod Beta vulgaris subsp. vulgaris. Molekul nukleinske kiseline, kada je prisutan u biljci, proizvodi dominantan efekat rezistencije prema Heterodera schachtii.

[0023] Štaviše, predmetna prijava se odnosi na Heterodera-rezistentnu biljku, biljnu ćeliju, biljni organ, biljno tkivo, deo biljke, seme, semenski materijal, ili potomka biljke, koji endogeno ili transgeno sadrže molekul nukleinske kiseline ili njegove delove. U skladu sa predmetnom prijavom, izuzete su one biljke i njihove komponente koje su dobijene isključivo putem suštinski biološkog postupka.

[0024] Postupci za povećanje rezistencije na Heterodera kod biljke, posebno kod biljke vrste Beta vulgaris, kao i postupci za proizvodnju ili identifikovanje i eventualno selektovanje Heterodera-rezistentne biljke, takođe su objavljeni u predmetnoj prijavi. Predmetna prijava se takođe odnosi na postupke za praćenje zaraze patogenom Heterodera schachtii, kao i na oligonukleotide kao probe i prajmere za hibridizaciju sa molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom.

[0025] Predmetni pronalazak se odnosi na

[0027] [1] molekul nukleinske kiseline za povećanje rezistencije prema nematodi roda Heterodera kod biljke Beta vulgaris u kojoj se molekul nukleinske kiseline eksprimira, okarakterisan time da je molekul nukleinske kiseline odabran iz grupe koja se sastoji od:

[0029] (a) nukleotidne sekvence koja sadrži sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 1, 4 i 7;

[0030] (b) nukleotidne sekvence koja sadrži kodirajuću sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 2, 5 i 8;

[0031] (c) nukleotidne sekvence koja hibridizuje sa komplementarnom sekvencom nukleotidne sekvence koja je u skladu sa (a), (b), (f) ili (g) pod strogim uslovima; (d) nukleotidne sekvence koja sadrži sekvencu koja je najmanje 90% identična sekvenci nukleotidne sekvence bilo koje od (a) ili (b);

[0032] (e) nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 3, 6 i 9; (f) nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 94% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 3, 6 i 9;

[0033] (g) nukleotidne sekvence koja je varijanta DNK sekvence bilo koje od (a) do (f) usled degeneracije genetičkog koda, pri čemu su strogi uslovi definisani kao hibridizacija u 4 x SSC na 65 °C, i naknadno ponovljeno ispiranje u 0,1 x SSC na 65 °C tokom približno 1 sata ukupno.

[0035] Predmetna prijava objavljuje

[0037] [2] molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa [1], koji se karakteriše time što molekul nukleinske kiseline daje rezistenciju prema patogenu roda Heterodera koji je dominantan u biljci,

[0039] [3] molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa [1] ili [2], koji se karakteriše time što molekul nukleinske kiseline potiče od Beta vulgaris subsp. maritima.

[0041] [4] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa [1].

[0043] [5] Predmetni pronalazak se odnosi na vektor ili ekspresionu kasetu koji sadrže molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa [1]. Molekul nukleinske kiseline je poželjno heterolog prema vektoru ili ekspresionoj kaseti ili je molekul nukleinske kiseline poželjno povezan sa heterologim regulatornim elementom, poželjno promotorom ili terminatorom.

[0045] [6] Predmetni pronalazak se odnosi na ćeliju koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa [1] kao transgen, ili vektor ili ekspresionu kasetu koji su u skladu sa [5].

[0047] [7] Predmetna prijava objavljuje

[0048] biljku ili njen deo, koja se karakteriše time što biljka ili njen deo sadrži molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa jednom od [1] do [3] endogeno ili transgeno, ili vektor ili ekspresionu kasetu koji su u skladu sa [5], pri čemu je poželjno da biljka koja endogeno sadrži molekul nukleinske kiseline bude biljka roda Beta, posebno vrste Beta vulgaris, - ali ne Beta vulgaris subsp. maritima. Poželjno navedena biljka je biljka koja ima rezistenciju prema patogenu roda Heterodera,

[0050] [8] biljku koja je u skladu sa [7], koja se karakteriše time što je biljka hibridna biljka,

[0052] [9] biljku koja je u skladu sa [7] ili [8], koja se karakteriše time što je molekul nukleinske kiseline prisutan heterozigotno ili homozigotno u genomu biljke.

[0054] [10] Premetna prijava objavljuje semena ili potomke biljke koja je su skladu sa jednom od [7] do [9], pri čemu seme ili potomak transgeno ili endogeno sadrži molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa jednom od [1] do [3], ili vektor ili ekspresionu kasetu koji su u skladu sa [5].

[0056] [11] Predmetni pronalazak se odnosi na seme biljke Beta vulgaris, koje se karakteriše time što biljka nije B. vulgaris subsp. maritima, pri čemu seme sadrži molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa [1], pri čemu je seme dobijeno iz biljke koja je proizvedena postupkom koji je u skladu sa [13] do [15] ili pri čemu seme nije seme biljke koja je dobijena isključivo putem suštinski biološkog postupka, opciono pri čemu je seme tehnički tretirano, pri čemu je tehnički tretman odabran iz grupe koja se sastoji od:

[0058] (a) Poliranja

[0059] (b) Presvlačenja poželjno peletiranja

[0060] (c) Inkrustacije

[0061] (d) Bojenja.

[0063] [12] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za povećanje rezistencije na nematode roda Heterodera kod biljke Beta vulgaris, koji uključuje sledeće korake:

[0065] (i) integracije molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa [1] putem homologijom usmerene popravke - poželjno, uz podršku nukleaze usmerene na mesto - u genom najmanje jedne ćelije biljke, i opciono regeneracije biljke iz biljne ćelije; ili

[0066] (ii) povećanja ekspresije molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa [1] u biljci modifikacijom nativnog promotora ili fuzijom molekula nukleinske kiseline sa heterologim promotorom koji pokazuje veću aktivnost u poređenju sa nativnim promotorom; ili

[0067] (iii) transformacije biljne ćelije sa molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa [1], ili vektorom ili ekspresionom kasetom koji su u skladu sa [5], i regeneracije transgene biljke iz transformisane biljne ćelije.

[0069] [13] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju biljke Beta vulgaris koja ima rezistenciju prema nematodi roda Heterodera, koji uključuje sledeće korake:

[0071] (a) transformacije biljne ćelije sa molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa [1], ili vektorom ili ekspresionom kasetom koji su u skladu sa [5]; i

[0072] (b) regeneracije transgene biljke iz transformisane biljne ćelije; ili

[0074] (i) introdukcije nukleaze usmerene na mesto i matriksa za popravku u ćeliju biljke, pri čemu je nukleaza usmerena na mesto sposobna da generiše najmanje jedan jednolančani prekid ili najmanje jedan dvolančani prekid DNK u genomu ćelije, poželjno uzvodno i/ili nizvodno od ciljnog regiona i matriks za popravku sadrži molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa [1];

[0075] (ii) kultivacije ćelije iz (i) pod uslovima koji omogućavaju homologijom usmerenu popravku ili homologu rekombinaciju, pri čemu se molekul nukleinske kiseline integriše iz matriksa za popravku u genom biljke; i

[0076] (iii) regeneracije biljke iz ćelije modifikovane u (ii).

[0078] [14] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak koji je u skladu sa [13], koji se karakteriše time što ciljni region

[0080] a) je lociran između markera koji je u skladu sa SEQ ID NO: 10 i markera koji je u skladu sa SEQ ID NO: 11, ili

[0081] b) je omeđen markerom koji je u skladu sa SEQ ID NO: 10 i markerom koji je u skladu sa SEQ ID NO: 11, ili

[0082] c) sadrži hromozomski interval između markera koji je u skladu sa SEQ ID NO: 10 i markera koji je u skladu sa SEQ ID NO: 11.

[0083] [15] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak koji je u skladu sa [13] ili [14], koji se karakteriše time što se najmanje jedan jednolančani prekid ili najmanje jedan dvolančani prekid dešava na poziciji koja je najviše 10.000 baznih parova uzvodno i/ili nizvodno od ciljnog regiona.

[0085] [16] Predmetna prijava objavljuje biljku ili njen deo, koja je dobijena ili koja se može dobiti postupkom koji je u skladu sa jednom od [13] do [15].

[0087] [17] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za identifikovanje, i opciono obezbeđivanje ili selektovanje biljke Beta vulgaris koja je rezistentna prema nematodi roda Heterodera, koji se karakteriše time što postupak uključuje najmanje korak (i) ili (ii):

[0089] (i) detekcije prisustva i/ili ekspresije molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa [1], ili prisustva polipeptida koji je u skladu sa [4], u biljci Beta vulgaris ili delu biljke Beta vulgaris; i/ili

[0090] (ii) detekcije najmanje jednog regiona koji je lociran između markera koji je u skladu sa SEQ ID NO 10 i markera koji je u skladu sa SEQ ID NO 11, omeđen je markerom koji je u skladu sa SEQ ID NO 10 i markerom koji je u skladu sa SEQ ID NO 11, ili sadrži hromozomski interval između markera koji je u skladu sa SEQ ID NO 10 i markera koji je u skladu sa SEQ ID NO 11, koji kosegregira sa nukleotidnom sekvencom molekula nukleinske kiseline koji je(su) u skladu sa [1]; i

[0091] (iii) opcione selekcije biljke Beta vulgaris koja ima rezistenciju prema nematodi roda Heterodera

[0093] pri čemu je marker koji je u skladu sa SEQ ID NO 10 polimorfizam pojedinačnog nukleotida (SNP) na poziciji 56940072 bp hromozoma 5 koji se odnosi na genotip EL10 Beta vulgaris, pri čemu je navedeni nukleotid G ili T, i marker koji je u skladu sa SEQ ID NO 11 je polimorfizam pojedinačnog nukleotida (SNP) na poziciji 57809807 bp hromozoma 5 koji se odnosi na genotip EL10 Beta vulgaris, pri čemu je navedeni nukleotid G ili T.

[0095] [18] Predmetna prijava objavljuje postupak za identifikaciju molekula nukleinske kiseline koji, kada je prisutan u biljci, može da dâ rezistenciju prema patogenu roda Heterodera kod biljke, poželjno kod biljke vrste Beta vulgaris, koji se karakteriše time što postupak uključuje sledeće korake:

[0096] (i) poređenja aminokiselinske sekvence polipeptida koji je u skladu sa [4] sa aminokiselinskim sekvencama iz baze podataka sekvenci, ili identifikacije alelnih varijanti koje kodiraju polipeptid koji je u skladu sa [4] u genotipovima biljke;

[0097] (ii) identifikacije aminokiselinske sekvence, ili alelne varijante, koja kodira aminokiselinsku sekvencu, pri čemu je aminokiselinska sekvenca najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 94%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci polipeptida koji je u skladu sa [4];

[0098] (iii) introdukcije molekula nukleinske kiseline, ili alelne varijante, koja kodira identifikovanu aminokiselinsku sekvencu u biljku, poželjno u biljku vrste Beta vulgaris, i ekspresije molekula nukleinske kiseline u biljci; i

[0099] (iv) detekcije rezistencije prema patogenu roda Heterodera.

[0101] [19] Predmetna prijava objavljuje postupak za kultivaciju biljaka, poželjno biljaka vrste Beta vulgaris, koji uključuje

[0103] (i) obezbeđivanje biljaka koje su u skladu sa jednom od [7] do [9], proizvodnju biljaka uz pomoć postupka koji je u skladu sa jednom od [13] do [16], ili identifikaciju i selekciju biljaka uz pomoć postupka koji je u skladu sa [17], i

[0104] (ii) kultivaciju biljaka iz (i) ili njihovih potomaka,

[0106] pri čemu postupak sprečava zarazu kultivisanih biljaka patogenom roda Heterodera.

[0108] [20] Predmetna prijava objavljuje oligonukleotid dužine od najmanje 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 - poželjno, najmanje 21, 22, 23, 24, ili 25, posebno poželjno, najmanje 30, 35, 40, 45, ili 50, i, posebno poželjno, najmanje 100, 200, 300, ili 500 - nukleotida, koji oligonukleotid specifično hibridizuje sa nukleotidnom sekvencom kao što je definisano u jednoj od [1] do [3].

[0110] [21] Predmetna prijava objavljuje par oligonukleotida - poželjno, oligonukleotide koji su u skladu sa [20] ili komplet koji sadrži ove oligonukleotide - pri čemu su oligonukleotidi pogodni za hibridizaciju kao direktni prajmer i reverzni prajmer za region u genomu Beta vulgaris koji kosegregira u Beta vulgaris sa rezistencijom prema patogenu roda Heterodera koju daje molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa jednom od [1] do [3], poželjno pri

[0113] 1

[0114] čemu je region u genomu Beta vulgaris lociran između markera s5e3001s02 i markera s5e4668xxx, omeđen je markerom s5e3001s02 i markerom s5e4668xxx, ili sadrži hromozomski interval između markera s5e3001s02 i markera s5e4668xxx.

[0116] [22] Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu oligonukleotidnog prajmera dužine od najmanje 20 nukleotida, koji oligonukleotid specifično hibridizuje kao proba sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od

[0118] (i) nukleotidne sekvence koja sadrži sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO 1, 4 i 7;

[0119] (ii) nukleotidne sekvence koja sadrži kodirajuću sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO 2, 5 i 8;

[0120] (iii) nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO 3, 6 i 9,

[0122] za amplifikaciju regiona specifičnog za molekul nukleinske kiseline iz [1] u lančanoj reakciji polimeraze.

[0124] [23] Predmetna prijava objavljuje postupak, biljku, ili deo biljke ili par oligonukleotida koji su u skladu sa bilo kojom od prethodnih stavki, pri čemu

[0126] s5e3001s02 je polimorfizam pojedinačnog nukleotida (SNP), poželjno na poziciji 56940072 bp hromozoma 5 koji se odnosi na genotip EL10 Beta vulgaris, pri čemu je navedeni nukleotid G ili T, poželjno polimorfizam pojedinačnog nukleotida (SNP) kao što je izneto u SEQ ID NO: 10, poželjnije navedeni nukleotid je T; i/ili

[0128] s5e4668xxx je polimorfizam pojedinačnog nukleotida (SNP), poželjno na poziciji 57809807 bp hromozoma 5 koji se odnosi na genotip EL10 Beta vulgaris, pri čemu je navedeni nukleotid G ili T, poželjno polimorfizam pojedinačnog nukleotida (SNP) kao što je izneto u SEQ ID NO: 11, poželjnije navedeni nukleotid je T.

[0130] [24] Predmetna prijava objavljuje biljku koja je u skladu sa [7], pri čemu biljka ili peletirano seme takve biljke ima genom koji omogućava razvoj tela repe koje ima minimalnu svežu masu od 200 g, 250 g, 300 g, 350 g, 400 g, 450 g ili 500 g i maksimalnu masu od 100 g, 1100 g, 1200 g, 1300 g, 1400 g, 1500 g, 1600 g, 1700 g, 1800 g, 1900 g ili 2000 g.

[0132] [25] Predmetna prijava objavljuje biljku koja je u skladu sa [7] ili [24], biljku šećerne repe ili peletirano seme takve biljke pri čemu genom biljke šećerne repe omogućava razvoj tela repe koje ima koncentraciju saharoze u svežoj masi tela repe od najmanje 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ili čak 20% (procenat po masi).

[0134] Prvo, neki od termina koji se upotrebljavaju u ovoj prijavi detaljno su objašnjeni u nastavku:

[0135] Rod Heterodera obuhvata različite vrste, npr. vrste Heterodera amygdali, Heterodera arenaria, Heterodera aucklandica, Heterodera avenae, Heterodera bergeniae, Heterodera bifenestra, Heterodera cacti, Heterodera cajani, Heterodera canadensis, Heterodera cardiolata, Heterodera carotae, Heterodera cicero, Heterodera cruciferae, Heterodera delvii, Heterodera elachista, Heterodera filipjevi, Heterodera gambiensis, Heterodera glycines, Heterodera goettingiana, Heterodera hordecalis, Heterodera humuli, Heterodera latipons, Heterodera longicaudata, Heterodera medicaginis, Heterodera oryzae, Heterodera oryzicola, Heterodera rosii, Heterodera rostochiensis, Heterodera sacchari, Heterodera schachtii, Heterodera tabacum, Heterodera trifolii, Heterodera ustinovi i Heterodera zeae.

[0136] U vezi sa specifikacijom dužine nukleotidne sekvence, termin „približno“ označava odstupanje od /- 200 baznih parova - poželjno, od /- 100 baznih parova, a posebno poželjno, od /- 50 baznih parova.

[0137] „Biljka roda Beta“ pripada porodici štirova (Amaranthaceae). Među ovim biljkama su biljke vrsta Beta macrocarpa, Beta vulgaris, Beta lomatogona, Beta macrorhiza, Beta corolliflora, Beta trigyna, i Beta nana. Biljka vrste Beta vulgaris je, posebno, biljka podvrste Beta vulgaris subsp. vulgaris. Na primer, među njima su Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima (šećerna repa u užem smislu), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. vulgaris (blitva), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. conditiva (cvekla), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. crassa/alba (stočna repa). Treba napomenuti da se nukleinska kiselina koja je u skladu sa pronalaskom ne javlja u prirodi u šećernoj repi, blitvi, cvekli, ili stočnoj repi, ali može biti introdukovana u njih ljudskim delovanjem.

[0138] [0019] „Funkcionalni fragment“ nukleotidne sekvence znači segment nukleotidne sekvence koji ima funkcionalnost identičnu ili uporedivu sa funkcionalnošću kompletne nukleotidne sekvence iz koje funkcionalni fragment potiče. Kao takav, funkcionalni fragment može posedovati nukleotidnu sekvencu koja je identična ili homologa ukupnoj nukleotidnoj sekvenci na dužini od najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, ili 99%. Ovo takođe eksplicitno obuhvata opseg od 90-100%. Štaviše, „funkcionalni fragment“ nukleotidne sekvence može takođe značiti segment nukleotidne sekvence koji modifikuje funkcionalnost cele nukleotidne sekvence, npr. tokom post transkripcionog ili transkripcionog utišavanja gena. Kao takav, funkcionalni fragment nukleotidne sekvence može da sadrži najmanje 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 - poželjno, najmanje 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, ili 140, i, posebno poželjno, najmanje 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, ili 1.000 -uzastopnih nukleotida ukupne nukleotidne sekvence. Ovo takođe eksplicitno obuhvata opseg od 21 do 50 nukleotida.

[0139] „Funkcionalni deo“ proteina znači segment proteina, ili deo aminokiselinske sekvence, koja kodira protein, pri čemu segment može ispoljavati funkcionalnost identičnu ili uporedivu sa funkcionalnošću celog proteina u biljnoj ćeliji. Na dužini od najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, ili 99%, funkcionalni deo proteina ima aminokiselinsku sekvencu koja je identična ili, uzimajući u obzir konzervativne i polukonzervativne zamene aminokiselina, slična proteinu iz kog funkcionalni deo potiče.

[0140] Termin „heterologi“ znači da introdukovani polinukleotid potiče iz ćelije ili organizma sa drugačijom genetičkom pozadinom, iste vrste ili druge vrste, ili je homolog prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćinu, ali je zatim lociran u drugačijem genetičkom okruženju i stoga se razlikuje od odgovarajućeg polinukleotida koji je moguće prirodno prisutan. Heterologi polinukleotid može biti prisutan pored odgovarajućeg endogenog gena.

[0141] U smislu pronalaska, pod „homologim“ se podrazumeva protein istog filogenetskog porekla; pod „analogim“ se podrazumeva protein koji ispoljava istu funkciju, ali ima drugačije filogenetsko poreklo; pod „ortologim“ se podrazumeva protein iz druge vrste koji ispoljava istu funkciju; a pod „paralogim“ se podrazumeva protein koji se pojavio unutar vrste usled duplikacije, pri čemu ova kopija bilo zadržava istu proteinsku funkciju, menja svoj ekspresioni templat, ali ne i funkciju, menja svoju proteinsku funkciju, ili deli originalnu gensku funkciju između obe kopije.

[0142] Pod „hibridizovanjem“ ili „hibridizacijom“ se podrazumeva proces u kome se jednolančani molekul nukleinske kiseline vezuje za lanac nukleinske kiseline koji je komplementaran u najvećoj mogućoj meri, tj. formira bazne parove sa njim. Standardni postupci za hibridizaciju su opisani, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,

[0145] 1

[0146] 2001. Pod ovim se poželjno podrazumeva da najmanje 60% - poželjnije, najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, ili 85%, a posebno poželjno, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% - baza molekula nukleinske kiseline formira sparivanje baza sa lancem nukleinske kiseline koji je komplementaran u najvećoj mogućoj meri. Mogućnost takvog vezivanja zavisi od strogosti uslova hibridizacije. Termin „strogost“ odnosi se na uslove hibridizacije. Visoka strogost je prisutna kada je sparivanje baza otežano; niska strogost je prisutna ukoliko je sparivanje baza olakšano. Na primer, strogost uslova hibridizacije zavisi od koncentracije soli ili jonske jačine i temperature. Generalno, strogost se može povećati povećanjem temperature i/ili smanjenjem sadržaja soli. Pod „strogim uslovima hibridizacije“ se podrazumevaju oni uslovi pod kojima se hibridizacija pretežno dešava samo između homologih molekula nukleinskih kiselina. Termin „uslovi hibridizacije“ se prema tome odnosi ne samo na uslove koji preovladavaju u samom dodavanju nukleinskih kiselina, već i na uslove koji preovladavaju u narednim koracima ispiranja. Na primer, strogi uslovi hibridizacije su uslovi pod kojima se, pretežno, hibridizuju samo oni molekuli nukleinskih kiselina koji imaju najmanje 70% - poželjno, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, ili najmanje 95% - identičnosti sekvence. Strogi uslovi hibridizacije su, na primer: hibridizacija u 4 x SSC na 65 °C, i naknadno ponovljeno ispiranje u 0,1 x SSC na 65 °C tokom približno 1 sata ukupno. Hibridizacija se poželjno dešava pod strogim uslovima.

[0147] U odnosu na nukleinsku kiselinu u obliku dvolančane DNK, „komplementarna“ nukleotidna sekvenca znači da drugi lanac DNK komplementaran prvom lancu DNK ima nukleotide koji odgovaraju bazama prvog lanca, u skladu sa pravilima sparivanja baza. Komplementarna sekvenca je, poželjno, potpuno komplementarna kontrasekvenci, i stoga poželjno ima istu dužinu.

[0148] Pod „izolovanim molekulom nukleinske kiseline“ se podrazumeva molekul nukleinske kiseline koji je ekstrahovan iz svog prirodnog ili originalnog okruženja. Termin takođe obuhvata sintetički proizveden molekul nukleinske kiseline. Pod „izolovanim polipeptidom“ se podrazumeva polipeptid koji je ekstrahovan iz svog prirodnog ili originalnog okruženja. Termin takođe obuhvata sintetički proizveden polipeptid.

[0149] [0026] „Molekularni marker“ je nukleinska kiselina koja je polimorfna u biljnoj populaciji i upotrebljava se kao referentna ili orijentaciona tačka. Marker za detekciju rekombinacionog događaja trebalo bi da bude pogodan za praćenje razlika ili polimorfizama unutar biljne populacije. Takav marker je stoga u stanju da detektuje i razlikuje različita alelna stanja (alele). Termin „molekularni marker“ se takođe odnosi na nukleotidne sekvence koje su komplementarne ili barem u velikoj meri komplementarne ili homologe genomskim sekvencama - na primer, nukleinske kiseline koje se upotrebljavaju kao probe ili prajmeri. Ove razlike na nivou DNK mogu se naći kao markeri i to su, na primer, razlike u polinukleotidnim sekvencama, npr. SSR (jednostavni ponovci sekvenci), RFLP (polimorfizmi dužine restrikcionih fragmenata), FLP (polimorfizmi dužine fragmenata) ili SNP (polimorfizmi pojedinačnog nukleotida). Markeri mogu biti izvedeni iz genomskih ili eksprimiranih nukleinskih kiselina, npr. splajsovanih RNK, cDNA, ili EST, a mogu se odnositi i na nukleinske kiseline koje se upotrebljavaju kao probe ili parovi prajmera i kao takve su pogodne za amplifikaciju fragmenta sekvence upotrebom postupaka koji su zasnovani na PCR. Markeri koji opisuju genetičke polimorfizme (između delova populacije) mogu se detektovati upotrebom dobro utvrđenih postupaka iz stanja tehnike (An Introduction to Genetic Analysis, 7th edition, Griffiths, Miller, Suzuki, et al., 2000). Na primer, među njima su sekvenciranje DNK, amplifikacija specifična za sekvencu zasnovana na PCR, verifikacija RFLP, verifikacija polinukleotidnih polimorfizama pomoću alel-specifične hibridizacije (ASH), detekcija amplifikovanih varijabilnih sekvenci biljnog genoma, detekcija 3SR (samoodrživa replikacija sekvence), detekcija SSR, SNP, RFLP, ili AFLP (polimorfizmi dužine amplifikovanog fragmenta). Štaviše, poznati su i postupci za detekciju EST (eksprimirane oznake sekvenci) i SSR markera izvedenih iz EST sekvenci i RAPD (nasumično amplifikovane polimorfne DNK). U zavisnosti od konteksta, termin „marker“ u opisu može takođe značiti specifičnu poziciju hromozoma u genomu vrste gde se može naći specifični marker (na primer, SNP).

[0150] Markeri takođe uključuju sintetičke oligonukleotide koji mogu biti povezani sa jednim ili više molekula za detekciju, pri čemu se molekuli za detekciju mogu upotrebljavati za reakciju detekcije ili generisanje signala unutar obima postupka verifikacije. Sintetički oligonukleotidi takođe uključuju obeležene prajmere. Obeleženi prajmeri su veštačka jedinjenja, ne javljaju se u prirodi, i ne mogu se izolovati iz prirode. Proizvodnja takvih jedinjenja je detaljnije objašnjena u nastavku.

[0151] „Promotor“ je netranslatirana, regulatorna DNK sekvenca, tipično uzvodno od kodirajućeg regiona, koja sadrži tačku vezivanja za RNK polimerazu i inicira transkripciju DNK. Promotor dodatno sadrži druge elemente koji deluju kao regulatorni gen za ekspresiju gena (na primer, cis-regulatorne elemente). „Sržni ili minimalni promotor“ je promotor koji ima osnovne elemente koji su potrebni za inicijaciju transkripcije (na primer, TATA boks i/ili inicijator).

[0154] 1

[0155] „Patogen“ znači organizam koji, u interakciji sa biljkom, dovodi do simptoma bolesti u jednom ili više organa biljke. Kao što se ovde upotrebljava, patogen označava nematodu, posebno nematodu roda Heterodera.

[0156] Pod „patogenom infekcijom“ se podrazumeva najraniji trenutak u kome patogen interaguje sa tkivom biljke domaćina. U ovom smislu, „zaraza“ znači dešavanje kontakta između patogena i domaćina. U slučaju Heterodera schachtii, ciste se aktiviraju u zemljištu, juvenilne jedinke će se izlegati kada se završi razviće do juvenilnih jedinki drugog stadijuma i zaraze korene biljaka domaćina. Nematode prodiru u zonu izduživanja iza vrha korena i pokreću transformaciju ćelija korena u sincicijum (specijalizovane strukture za ishranu). Sincicijum se istovremeno povećava sa razvićem nematode do odraslih jedinki i može dovesti do neadekvatnog funkcionisanja korena, što ograničava performanse useva i rezultuje gubitkom prinosa. Bez biljaka domaćina, Heterodera schachtii može preživeti unutar cista u zemljištu godinama.

[0157] Biljni „organi“ znače, na primer, listove, izdanak, stabljiku, korene, hipokotil, vegetativne pupoljke, meristeme, embrione, antere, semene zametke, semena, ili plodove. „Delovi biljke“ uključuju, ali nisu ograničeni na, izdanak ili stabljiku, listove, cvetove, cvast, korene, plodove, i semena, kao i polen. Termin „delovi biljke“ takođe znači asocijaciju više organa, npr. cvet ili seme, ili deo organa, npr. poprečni presek kroz biljni izdanak. Biljna „tkiva“ su, na primer, tkivo kalusa, tkivo za skladištenje, meristemsko tkivo, tkivo lista, tkivo izdanka, tkivo korena, tkivo tumora biljke, ili reproduktivno tkivo, kao i kambijum, parenhim, vaskularno tkivo, sklerenhim, i epidermis. Međutim, tkivo nije ograničeno na ovaj spisak. Na primer, pod biljnim „ćelijama“ se podrazumevaju, na primer, izolovane ćelije koje imaju ćelijski zid ili njihovi agregati, ili protoplasti.

[0158] U vezi sa predmetnim pronalaskom, termin „regulatorna sekvenca“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja utiče na specifičnost i/ili jačinu ekspresije, npr. tako što regulatorna sekvenca daje definisanu tkivnu specifičnost. Takva regulatorna sekvenca može biti locirana uzvodno od tačke inicijacije transkripcije minimalnog promotora, ali i nizvodno od nje, npr. u transkribovanoj, ali ne i translatiranoj, lider sekvenci ili unutar introna. Termin „regulatorna sekvenca“ takođe može obuhvatiti ceo promotor ili cis-element koji je pogodan za upotrebu unutar promotora.

[0159] Termin „rezistencija“ treba shvatiti u širokom smislu i pokriva opseg zaštite od usporavanja do potpunog blokiranja razvoja bolesti. Jedan primer važnog patogena je Heterodera schachtii. Rezistentna biljna ćelija iz pronalaska ili rezistentna biljka iz pronalaska poželjno postiže rezistenciju na Heterodera schachtii koja je definisana kao

[0162] 1

[0163] sposobnost biljke da ograniči razmnožavanje nematoda. Na primer, povećanje rezistencije može se izmeriti uzimanjem uzoraka zemljišta i određivanjem količine nematoda i/ili određivanjem količine cista koje su formirane na korenima biljaka.

[0164] „Transgena biljka“ se odnosi na biljku u čiji je genom integrisan najmanje jedan polinukleotid. Pritom to može biti heterologi polinukleotid ili egzogeni polinukleotid. Polinukleotid je, poželjno, stabilno integrisan, što znači da je integrisani polinukleotid stabilno očuvan u biljci, da se eksprimira, i da se takođe može stabilno prenositi na potomke. Stabilna introdukcija polinukleotida u genom biljke takođe uključuje integraciju u genom biljke prethodne roditeljske generacije, pri čemu se polinukleotid može stabilno dalje prenositi. Termin „heterologi“ znači da introdukovani polinukleotid potiče iz ćelije ili organizma sa drugačijom genetičkom pozadinom, pri čemu ćelija ili organizam može pripadati istoj vrsti ili drugoj vrsti, ili je homolog prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćinu, na primer, ali je zatim lociran u drugačijem genetičkom okruženju i stoga se razlikuje od odgovarajućeg polinukleotida koji je moguće prirodno prisutan. Heterologi polinukleotid može biti prisutan pored odgovarajućeg endogenog gena.

[0165] Kao što se ovde upotrebljava, biljka znači bilo koju dikotiledonu ili monokotiledonu biljku, posebno biljku iz porodice Amaranthaceae, kao što su Beta vulgaris i Spinacia oleracea, i Brassicacea, kao što su Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Raphanus sativus, Brassica juncacea, Brassica nigra, Eruca vesicaria subsp. sativa.

[0166] Dizajn i primeri izvođenja opisani su putem primera sa pozivanjem na priložene sekvence i slike.

[0167] Sl. 1 Ilustracija mapiranja sekvence i asembliranja unutar ciljnog regiona na hromozomu 5 (xosa: fizička udaljenost u hiljadama baznih parova (1k = 1000 bp)):

[0169] Gornji deo = asembliranje devet anotiranih gena (#1-#9); smer vrhova strelica simbolizuje 5’‑3’ smer svakog mogućeg gena.

[0170] Srednji deo = ilustracije različitih genetičkih introgresija pristupa iz B. vulgaris subsp. maritima (BM); događaji rekombinacije naznačeni su u skladu sa njihovom lokalizacijom.

[0171] Donji deo = fizičko mapiranje kandidat gena LRR1, LRR2 i LRR3 u skladu sa SEQ ID NO 1, 4 i 7.

[0174] 1

[0175] DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0177] Predmetna prijava se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je u stanju da dâ rezistenciju prema patogenu roda Heterodera kada je prisutan u biljci - posebno u biljci vrste Beta vulgaris, poželjnije u Beta vulgaris subsp. vulgaris. Konkretno, molekul nukleinske kiseline daje rezistenciju prema patogenu roda Heterodera kod biljke u kojoj se eksprimira polipeptid koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline. U skladu sa objavom, patogen je Heterodera schachtii, koja je među najvažnijim patogenim nematodama šećerne repe i može uzrokovati gubitak prinosa do 80%. Heterodera schachtii može uzrokovati značajan gubitak prinosa ne samo kod šećerne repe već i kod drugih repa kao što su crvena i srebrna repa, rabarbara i spanać, kao i kod povrtarskih kultura iz porodice kupusnjača kao što su kupus, kineski kupus, karfiol, prokelj, brokoli, repa, rotkva i stočna keleraba, ozbiljno oštećujući korenov sistem.

[0178] Predmetna prijava je zasnovana na finom genetičkom mapiranju, identifikaciji, izolaciji, i karakterizaciji gena i genskih lokusa, respektivno, koji potiču od donora Beta vulgaris subsp. maritima, čije prisustvo u biljci - posebno u Beta vulgaris subsp. vulgaris -koreliše sa ili je uzročno za rezistenciju dotične biljke na infekciju sa Heterodera. Inicijalni materijal bila je populacija Beta vulgaris subsp. maritima koja je sakupljena u Francuskoj (Hijner 1951).

[0179] Pomoću intenzivnog finog mapiranja i kloniranja na osnovu mape identifikovan je i sekvenciran lokus rezistencije, što omogućava poređenje sekvenci između rezistentnog i osetljivog referentnog genotipa (Sl. 1). Pokazano je da ciljni region ima visok stepen složenosti pošto lokus rezistencije sadrži velike duplikacije sekvenci i posebno kod osetljivih genotipova nekoliko retrotranspozona je ugrađeno u ciljni region. Pronađeno je da lokus rezistencije sadrži sedam anotiranih gena, uključujući tri tandemski ponovljena LRR gena koji su identifikovani kao kandidat geni koji daju rezistenciju na Heterodera (LRR1, LRR2 i LRR3), pri čemu tri LRR gena pokazuju sličnost sekvenci.

[0180] Stoga, predmetna prijava se odnosi na molekul nukleinske kiseline i na polipeptid koji je kodiran navedenim molekulom nukleinske kiseline, respektivno, koji poželjno daje rezistenciju prema patogenu roda Heterodera, posebno prema Heterodera schachtii. Molekul nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska daje - posebno, kod biljke roda Beta -rezistenciju na ovaj patogen. Molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom može biti izolovani molekul nukleinske kiseline. Poželjno je DNK, i, posebno poželjno, cDNA (kodirajuća DNK). Biljka je poželjno biljka vrste Beta vulgaris - posebno poželjno, biljka podvrste Beta vulgaris subsp. vulgaris; među njima su, na primer, kultivari šećerne repe, cvekle, stočne repe, blitve, i švajcarske blitve.

[0183] 1

[0184] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži DNK sekvencu koja je izneta u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1, 4 i 7 i/ili kodirajuću sekvencu u skladu sa bilo kojom od SEQ ID NO: 2, 5 i 8. Štaviše, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja je u skladu sa jednom od SEQ ID NO: 3, 6 i 9.

[0185] Kao što je prethodno pomenuto, gen koji je identifikovan u skladu sa pronalaskom je gen/protein rezistencije tipa NBS-LRR, koji karakterišu specifični strukturni motivi. Opšta struktura takvih proteina rezistencije kod biljaka je već dobro ispitana (Martin et al., Annual Review Plant Biology 54 (2003), 23‑61). Međutim, princip strukturnog primera izvođenja -posebno onoga što je poznato kao LRR domen, koji se primenjuje kao potencijalni domen za detekciju za većinu nepoznatih patogenih efektora - je nepredvidiv, a funkcionalna pozadina gena rezistencije, tj. genetička struktura, je generalno uglavnom nepoznata. Identifikacija gena ili proteina koji daju rezistenciju na Heterodera samo na osnovu poznatog strukturnog motiva je, kao posledica toga, nemoguća. Štaviše, ispostavilo se da region sekvence ima visok stepen složenosti pošto lokus rezistencije sadrži veliku duplikaciju sekvence i kod osetljivih genotipova nekoliko retrotranspozona je ugrađeno u ciljni region, što naročito otežava razvoj dijagnostičkih markera, kao i asembliranje podataka o sekvenci.

[0186] Štaviše, supstitucije, delecije, insercije, adicije, i/ili bilo koja druga promena mogu se introdukovati u DNK sekvencu nukleotidne sekvence koja je u skladu sa pronalaskom koje, same ili u kombinacijama, zapravo menjaju nukleotidnu sekvencu, pri čemu modifikovana nukleotidna sekvenca može, međutim, obavljati istu funkciju kao i inicijalna sekvenca. Predmetni slučaj obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži DNK sekvencu koja je alel ili derivat nemodifikovane sekvence nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska i koja kada je prisutna u biljci daje rezistenciju prema patogenu roda Heterodera, posebno na Heterodera schachtii. Štaviše, predmetni slučaj se bavi kodiranjem aminokiselinske sekvence koja daje rezistenciju prema patogenu roda Heterodera, posebno na Heterodera schachtii. U dodatnom primeru izvođenja, pronalazak prema tome uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji predstavlja derivat polipeptida koji je kodiran nukleotidnom sekvencom koja je u skladu sa pronalaskom, ili koji uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je u skladu sa pronalaskom. Izvedena aminokiselinska sekvenca koja ima najmanje jednu supstituciju, deleciju, inserciju, ili adiciju jedne ili više aminokiselina, pri čemu je funkcionalnost kodiranog polipeptida/proteina očuvana, predstavlja derivat polipeptida. Supstitucije, delecije, insercije, adicije, i/ili bilo koja druga promena, bilo same ili u kombinacijama, koje zapravo

[0189] 1

[0190] menjaju nukleotidnu sekvencu, ali obavljaju istu funkciju kao i inicijalna sekvenca, mogu se prema tome introdukovati u nukleotidnu sekvencu upotrebom konvencionalnih postupaka koji su poznati u stanju tehnike, npr. putem mutageneze usmerene na mesto, TILLING, PCR-posredovane mutageneze, hemijski indukovane mutageneze, editovanja genoma itd.

[0191] Supstitucija jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima ista ili ekvivalentna ili slična hemijska/fizička svojstva označava se kao „konzervativna supstitucija“ ili „polukonzervativna supstitucija“. Primeri fizičkih/hemijskih svojstava aminokiseline su, na primer, hidrofobija ili naelektrisanje. Koja aminokiselinska supstitucija predstavlja konzervativnu ili polukonzervativnu supstituciju poznato je osobi sa iskustvom u struci. Štaviše, opšte znanje omogućava osobi sa iskustvom u struci da prepozna, identifikuje, i detektuje koje delecije i adicije aminokiselina su bezopasne za funkcionalnost proteina rezistencije, i na kojim pozicijama su one moguće. Osoba sa iskustvom u struci je svesna da, u slučaju predmetnog NBS-LRR proteina za modifikacije aminokiselinske sekvence (supstitucije, delecije, insercije, ili adicije jedne ili više aminokiselina), funkcionalnost, posebno, konzervisanih domena mora biti očuvana, i da su prema tome moguće samo ograničene prethodne modifikacije u ovim domenima.

[0192] Objava stoga uključuje funkcionalni fragment nukleotidne sekvence koja je u skladu sa pronalaskom. Termin „fragment“ prema tome uključuje gene sa nukleotidnom sekvencom dovoljno sličnom prethodno pomenutoj nukleotidnoj sekvenci. Termin „dovoljno sličan“ znači da prva nukleotidna sekvenca ili aminokiselinska sekvenca ima dovoljan ili minimalan broj identičnih ili ekvivalentnih nukleotida ili aminokiselinskih grupa u odnosu na drugu nukleotidnu sekvencu ili drugu aminokiselinsku sekvencu.

[0193] U odnosu na aminokiselinsku sekvencu, posle modifikacije, na primer putem prethodno pomenutog postupka, ona takođe ima zajednički strukturni domen i/ili poseduje zajedničku funkcionalnu aktivnost. Nukleotidne sekvence ili aminokiselinske sekvence koje imaju identičnost od najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili najmanje 100% sa nukleotidnom sekvencom ili aminokiselinskom sekvencom koja je u skladu sa pronalaskom, ovde su definisane kao dovoljno slične. Ovo takođe eksplicitno obuhvata opseg od 90% do 100%. Za funkcionalne fragmente, dovoljna sličnost je utvrđena ukoliko nukleotidna sekvenca ili aminokiselinska sekvenca generalno imaju isto svojstvo kao prethodno imenovane nukleotidna sekvenca ili aminokiselinska sekvenca iz predmetnog pronalaska. Te nukleotidne sekvence koje kodiraju derivat ili kodiraju izvedenu aminokiselinsku sekvencu generišu se

[0196] 2

[0197] bilo direktno ili indirektno (na primer, putem koraka amplifikacije ili replikacije) iz inicijalne nukleotidne sekvence koja odgovara nukleotidnoj sekvenci koja je u skladu sa pronalaskom na celoj dužini, ili barem delimično.

[0198] U skladu sa tim, predmetni pronalazak uključuje nukleotidnu sekvencu koja je sposobna da hibridizuje, pod strogim uslovima, sa nukleotidnom sekvencom koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci koja je u skladu sa pronalaskom ili nukleotidnoj sekvenci koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja je u skladu sa pronalaskom i pri čemu je navedena nukleotidna sekvenca, poželjno kada je prisutna i/ili eksprimirana u biljci, sposobna da dâ rezistenciju prema nematodi roda Heterodera.

[0199] Štaviše, opšte je poznato da je genetički kod redundantan, prema tome pokazuje mnoštvo kombinacija kodona od tri bazna para koje određuju aminokiselinu. Stoga, predmetni pronalazak uključuje varijantnu DNK sekvencu usled degeneracije genetičkog koda, koja je, međutim, i dalje poželjno, kada je prisutna i/ili eksprimirana u biljci, sposobna da dâ rezistenciju prema patogenu roda Heterodera.

[0200] U skladu sa predmetnom objavom, molekul(i) nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska, bilo sami ili u kombinaciji, daje(ju) rezistenciju prema patogenu roda Heterodera, poželjno kada su prisutni i/ili eksprimirani u biljci, poželjnije pri čemu je rezistencija prema patogenu roda Heterodera rezistencija na Heterodera schachtii i/ili je biljka biljka podvrste Beta vulgaris subsp. vulgaris.

[0201] Molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom ili lokus rezistencije iz predmetnog pronalaska karakterišu se time što, poželjno kada su prisutni u biljci i/ili nakon ekspresije u biljci, oni daju dominantan efekat rezistencije prema patogenu roda Heterodera -poželjno, prema Heterodera schachtii - ili kodiraju polipeptide koji su sposobni da daju dominantan efekat rezistencije prema patogenu roda Heterodera - poželjno, prema Heterodera schachtii.

[0202] U skladu sa predmetnim pronalaskom, molekul nukleinske kiseline daje rezistenciju prema patogenu roda Heterodera, posebno na Heterodera schachtii, poželjno kada je prisutan i/ili eksprimiran u biljci, poželjno u biljci podvrste Beta vulgaris subsp. vulgaris, pri čemu su najmanje dva ili tri molekula nukleinske kiseline odabrana iz grupe koja se sastoji od:

[0204] (a) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu iz predmetnog pronalaska koja sadrži DNK sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO 1, cDNA sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO 2, koja hibridizuje sa komplementarnom sekvencom nukleotidne sekvence koja je u skladu sa SEQ ID NO 1 ili 2, koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO 3 i/ili koja je jedan od prethodno pomenutih alela, derivata ili varijanti nukleinske i aminokiselinske sekvence; (b) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu iz predmetnog pronalaska koja sadrži DNK sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO 4, cDNA sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO 5, koja hibridizuje sa komplementarnom sekvencom nukleotidne sekvence koja je u skladu sa SEQ ID NO 4 ili 5, koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO 6 i/ili koja je jedan od prethodno pomenutih alela, derivata ili varijanti nukleinske i aminokiselinske sekvence; (c) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu iz predmetnog pronalaska koja sadrži DNK sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO 7, cDNA sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO 8, koja hibridizuje sa komplementarnom sekvencom nukleotidne sekvence koja je u skladu sa SEQ ID NO 7 ili 8, koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO 9 i/ili koja je jedan od prethodno pomenutih alela, derivata ili varijanti nukleinske i aminokiselinske sekvence.

[0206] Kao što je objavljeno, kombinacija dva molekula nukleinske kiseline koji su opisani u (a) i (b) daje rezistenciju na Heterodera, posebno na Heterodera schachtii kada je prisutna u biljci, poželjno u biljci vrste Beta vulgaris.

[0207] Kao što je objavljeno, kombinacija dva molekula nukleinske kiseline koji su opisani u (a) i (c) daje rezistenciju na Heterodera, posebno na Heterodera schachtii kada je prisutna u biljci, poželjno u biljci vrste Beta vulgaris.

[0208] Kao što je objavljeno, kombinacija dva molekula nukleinske kiseline koji su opisani u (b) i (c) daje rezistenciju na Heterodera, posebno na Heterodera schachtii kada je prisutna u biljci, poželjno u biljci vrste Beta vulgaris.

[0209] Kombinacija može biti jedan ili više molekula nukleinske kiseline. Međutim, kombinacija može biti uključena i u komplet. Ukoliko je kombinacija uključena u komplet, nukleinske kiseline (a) (b) i/ili (c) iz kombinacije kao što je prethodno opisano mogu biti sve deo jednog molekula nukleinske kiseline ili mogu biti deo različitih molekula nukleinske kiseline.

[0210] U ovom kontekstu, takođe su objavljeni polipeptidi/proteini koji su kodirani kombinacijom kao što je prethodno definisano. Kombinacija proteina može biti sadržana u kompletu koji je takođe deo pronalaska.

[0211] Štaviše objavljena je biljka koja sadrži kombinaciju molekula nukleinske kiseline kao što je prethodno opisano. Kombinacija može biti deo biljke na transgeni ili endogeni način.

[0212] Štaviše, jedna ili dve sekvence mogu biti deo biljke kao transgeni, dok su druge jedna ili dve sekvence deo biljaka kao endogeni.

[0213] U dodatnom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom karakteriše se time što, poželjno kada je prisutan u biljci ili nakon ekspresije u biljci, već sam po sebi daje dominantan efekat rezistencije prema patogenu roda Heterodera -poželjno, prema Heterodera schachtii - ili što kodira polipeptid koji je sposoban da dâ dominantan efekat rezistencije prema patogenu roda Heterodera.

[0214] Kao što je objavljeno, molekul nukleinske kiseline kao što je opisano u (b) u kontekstu kombinacije inovativnih molekula nukleinske kiseline daje rezistenciju prema patogenu roda Heterodera, posebno na Heterodera schachtii, poželjno kada je prisutan i/ili eksprimiran u biljci, posebno u biljci podvrste Beta vulgaris subsp. vulgaris.

[0215] Kao što je objavljeno, molekul nukleinske kiseline kao što je opisano u (c) u kontekstu kombinacije inovativnih molekula nukleinske kiseline daje rezistenciju prema patogenu roda Heterodera, posebno na Heterodera schachtii, poželjno kada je prisutan i/ili eksprimiran u biljci, posebno u biljci vrste Beta vulgaris.

[0216] Kao što je objavljeno, molekul nukleinske kiseline kao što je opisano u (a) u kontekstu kombinacije inovativnih molekula nukleinske kiseline daje rezistenciju prema patogenu roda Heterodera, posebno na Heterodera schachtii kada je prisutan i/ili eksprimiran u biljci, posebno u biljci podvrste Beta vulgaris subsp. vulgaris.

[0217] Kao što je već prethodno opisano, do sada, biljke Beta vulgaris subsp. vulgaris koje su rezistentne na Heterodera nisu mogle biti generisane bez introdukovanja često neželjenih osobina, kao što je, na primer, redukovan prinos, usled nasleđivanja dodatnih gena koji su povezani sa pozitivnom osobinom rezistencije na Heterodera. Nedostatak kultivara koji imaju opisane rezistencije stoga se sastoji u tome da je razvoj kultivara veoma naporan i komplikovan usled komplikovanog nasleđivanja, i u tome da takvi kultivari imaju znatno lošije performanse prinosa u odnosu na normalne kultivare, u odsustvu zaraze. Između ostalog, ovo može biti povezano sa epigenetičkom interakcijom nekih gena rezistencije sa genima koji su odgovorni za proizvodnju šećera, što dovodi do redukovanog fitnesa biljaka, u odsustvu patogena.

[0218] Štaviše, za održivo oplemenjivanje prema cističnoj nematodi repe, to jest za suzbijanje opasnosti od varijanti Heterodera schachtii koje zaobilaze rezistenciju, neophodno je kontinuirano identifikovati nove gene rezistencije i integrisati ih u genske pulove kultivisanih biljaka kao što je šećerna repa.

[0221] 2

[0222] U ovom kontekstu, pronalazači su po prvi put izolovali i identifikovali novi gen rezistencije na Heterodera koji se može upotrebljavati za znatno pojednostavljeno oplemenjivanje. Putem ciljane abd olakšane inkorporacije ovog gena u elitne linije, sada je moguće veoma brzo razviti sorte sa veoma visokim prinosom i visokom rezistencijom na Heterodera i obezbediti dodatni gen rezistencije koji bi se mogao upotrebljavati u suzbijanju varijanti Heterodera koje su zaobišle tradicionalnu rezistenciju. Mogući pristupi za introgresiju jedne ili više sekvenci koje daju rezistenciju u skladu sa pronalaskom mogu se dobiti, na primer, pregledom populacija B. vulgaris subsp. maritima. Pregled se može oslanjati na identifikaciju biljke koja sadrži jednu ili više sekvenci koje daju rezistenciju u skladu sa pronalaskom. Identifikacija se može obaviti kao što je opisano na drugom mestu ovde. Poželjno pregled ili identifikacija uključuje upotrebu molekularnih markera koji su dijagnostički za lokus rezistencije. Štaviše, biljke koje sadrže sekvence koje daju rezistenciju mogu se nabaviti od CPO Wageningen, Postbus 18, 6700 AA Wageningen/NL, npr. od pristupa BMH.

[0223] Kao što je objavljeno, po prvi put je obezbeđena biljka Beta vulgaris subsp. vulgaris, kao što je biljka šećerne repe, biljka blitve, biljka crvene repe ili cvekle, biljka stočne repe, koja ima rezistenciju prema patogenu roda Heterodera, posebno prema Heterodera schachtii. Nabrojane biljke su sve kultivisane biljke, usevi ili biljke koje su pogodne za poljoprivrednu kultivaciju i koje imaju rezistenciju. Naročito takvi usevi sadrže podzemni organ za skladištenje koji se može upotrebljavati kao hrana, sirovina ili industrijski izvor šećera ili drugih hemijskih jedinjenja i koji sadrži rezistenciju. Organ za skladištenje može biti, na primer, telo šećerne repe koje sadrži saharozu, konzumno telo crvene repe ili hranljivo telo stočne repe. Podzemni organ za skladištenje može činiti više od 50%, a za šećernu repu čak i više od 70% ukupne biomase potpuno odrasle biljke. Štaviše, objavljena su takođe semena ili semenski materijal ovih biljaka. Semena ili semenski materijal mogu se tehnički tretirati kao što je dodatno opisano u nastavku.

[0224] Predmetna objava uključuje nukleinsku kiselinu koja kodira protein koji je u skladu sa bilo kojom od SEQ ID NO 3, 6 i 9, pri čemu je, u specifičnom primeru izvođenja, nukleinska kiselina koja se javlja u prirodi koja je u skladu sa bilo kojom od SEQ ID NO 1, 4 i 7 isključena.

[0225] [0067] Štaviše, predmetna objava se odnosi na rekombinantni i/ili heterologi molekul DNK koji sadrži sekvence molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom. Ovaj molekul DNK, štaviše, poželjno ima regulatornu sekvencu. On može prema tome biti operativno povezan sa ovom regulatornom sekvencom ili biti pod uticajem ove regulatorne sekvence. Ova regulatorna sekvenca je poželjno promotor sekvenca i/ili druge sekvence elemenata za kontrolu transkripcije ili translacije - na primer, cis-elementi. Regulatorna sekvenca, koja kontroliše ekspresiju gena koji uključuje molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, poželjno je sekvenca koja je u stanju da dâ ili moduliše ekspresiju, kao rezultat patogene infekcije. Ovaj promotor je poželjno u stanju da kontroliše ekspresiju DNK sekvence specifično u korenu biljke. Regulatorna sekvenca može biti heterologa eksprimirajućoj sekvenci. Takav pristup ima prednost što osoba sa iskustvom u struci može bolje da prilagodi stopu ekspresije sekvence koja se eksprimira, tkivo u kome se ekspresija dešava, i trenutak u kome se ekspresija dešava, tako što bira onu regulatornu sekvencu koja je najpogodnija za odgovarajući slučaj upotrebe. Heterologa DNK sekvenca poželjno uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira komponentu odbrane biljke od patogena (primer: geni rezistencije (R-geni) ili geni koji kodiraju enzime koji su uključeni u prenos signala, kao što su kinaze ili fosfataze, i za G-protein, ili koji kodiraju patogeni efektor (ono što je poznato kao geni avirulencije (avr))). Heterologa DNK sekvenca može biti jedna od DNK sekvenci koja je u skladu sa pronalaskom. Heterologa DNK sekvenca može takođe dodatno kodirati dodatne komponente odbrane biljke od patogena. Heterologa DNK sekvenca može prema tome biti dizajnirana tako da se posle njene transkripcije stvara policistronska iRNK.

[0226] Predmetna prijava štaviše se takođe odnosi na polipeptid koji može biti kodiran molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom i njegovim funkcionalno i/ili imunološki aktivnim fragmentom, kao i na antitelo koje se specifično vezuje za polipeptid ili za njegov fragment. Polipeptid posebno poželjno ima aminokiselinsku sekvencu koja je u skladu sa bilo kojom od SEQ ID NO 3, 6 ili 9. Rekombinantna proizvodnja proteina, polipeptida, i fragmenata je poznata osobi sa iskustvom u struci (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, ili Wingfield, P. T., 2008, Production of Recombinant Proteins, Current Protocols in Protein Science, 52:5.0:5.0.1‑5.0.4). Poliklonska ili monoklonska antitela na protein koji je u skladu sa pronalaskom mogu proizvesti osobe sa iskustvom u struci u skladu sa poznatim postupcima (E. Harlow et al., editor, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)). Proizvodnja monoklonskih antitela, kao i Fab i F(ab’)<2>fragmenata koji su takođe korisni u postupcima detekcije proteina, može se izvesti putem različitih konvencionalnih postupaka (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 98-118, New York: Academic Press (1983)). Antitela se zatim mogu upotrebljavati za pregled ekspresionih cDNA biblioteka kako bi se identifikovali identični, homologi, ili heterologi geni pomoću imunološkog pregleda (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

[0229] 2

[0230] Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, ili Ausubel et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology." John Wiley & Sons), ili se mogu upotrebljavati za Western blot analize. Posebno, predmetna objava se odnosi na antitela koja selektivno detektuju polipeptid koji je kodiran alelom koji daje rezistenciju na Heterodera koji je u skladu sa pronalaskom, i suštinski ne detektuju polipeptid koji je kodiran odgovarajuće osetljivim alelom, tj. detektuju manje, za faktor 2 - poželjno, faktor 5, i, poželjnije, faktor 10 ili više - polipeptid koji je kodiran odgovarajuće osetljivim alelom nego polipeptid koji je kodiran alelom koji daje rezistenciju na Heterodera koji je u skladu sa pronalaskom.

[0231] Kao što je objavljeno, antitelo je okarakterisano time što je sintetički polipeptid koji se ne javlja u prirodi.

[0232] Štaviše, antitela kao što je objavljeno mogu biti povezana sa fluorescentnom bojom kako bi se mogla upotrebljavati u imunohistohemijskom postupku, na primer, i izazvala bojenje antitela. Fluorescentna boja može biti fluorohrom. Antitela takođe mogu biti prisutna povezana sa drugim signalnim molekulima. Među njima su, na primer, biotin, radioizotopi, reporterski enzimi kao što je alkalna fosfataza, ili oligonukleotidi.

[0233] Dodatni predmet pronalaska su vektori ili ekspresione kasete koje uključuju molekul nukleinske kiseline ili molekul rekombinantne DNK koji su u skladu sa pronalaskom -moguće pod kontrolom regulatornih elemenata i, posebno, pod kontrolom funkcionalnih regulatornih elemenata u biljkama, kao i negativnih i/ili pozitivnih selekcionih markera. Vektorska okosnica je prema tome heterologa molekulu nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, što znači da se takav vektor ne javlja u prirodi i ne može se izolovati iz prirode. Vektor je plazmid, kozmid, fag ili ekspresioni vektor, transformacioni vektor, šatl vektor ili klonirajući vektor; može biti dvolančani ili jednolančani, linearan ili kružni; ili može transformisati prokariotski ili eukariotski organizam bilo putem integracije u njegov genom ili vanhromozomski. Molekul nukleinske kiseline ili molekul DNK koji je u skladu sa pronalaskom u ekspresionom vektoru ili ekspresionoj kaseti je, poželjno, operativno povezan sa jednom ili više regulatornih sekvenci koje omogućavaju transkripciju i, opciono, ekspresiju u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji; (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001). Ove regulatorne sekvence su poželjno promotori ili terminatori - posebno, početna tačka inicijacije transkripcije, lokacija vezivanja ribozoma, signal za obradu RNK, lokacija za terminaciju transkripcije, i/ili signal poliadenilacije. Na primer, molekul nukleinske kiseline je ovde pod kontrolom pogodnog promotora i/ili terminatora. Pogodni promotori mogu biti konstitutivni promotori (primer: 35S promotor iz „virusa mozaika karfiola“ (Odell et al., Nature 313

[0236] 2

[0237] (1985), 810-812); naročito su pogodni oni promotori koji su patogeno inducibilni (primer: PR1 promotor iz peršuna (Rushton et al., EMBO J. 15 (1996), 5,690‑5,700)). Posebno pogodni patogeno inducibilni promotori su sintetički ili himerni promotori koji se ne javljaju u prirodi, sastavljeni su od više elemenata, i sadrže minimalni promotor, i imaju najmanje jedan cis-regulatorni element uzvodno od minimalnog promotora, koji najmanje jedan cisregulatorni element služi kao lokacija vezivanja za posebne transkripcione faktore. Himerni promotori su dizajnirani u skladu sa željenim zahtevima i indukuju se ili se vrši njihova represija putem različitih faktora. Primeri takvih promotora nalaze se u WO 00/29592, WO 2007/147395, i WO 2013/091612. Na primer, pogodan terminator je nos-terminator (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet.1 (1982), 561‑573).

[0238] Pogodni promotori i terminatori mogu takođe biti nativni promotor i nativni terminator. Vektori ili ekspresione kasete dodatno sadrže konvencionalne indikatorske/reporterske gene ili gene rezistencije za detekciju prenosa željenog vektora ili molekula DNK/molekula nukleinske kiseline, i za selekciju jedinki koje ih sadrže, pošto je direktna detekcija putem ekspresije gena uglavnom prilično teška. Pošto molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom ovde sâm kodira polipeptid koji daje rezistenciju na cističnu nematodu repe, nije neophodno za ekspresiju u biljnim ćelijama da se obezbedi dodatni gen rezistencije; međutim, on se preporučuje, kako bi se omogućila brza selekcija.

[0239] Primeri indikatorskih/reporterskih gena su, na primer, gen luciferaze i gen koji kodira zeleni fluorescentni protein (GFP). Oni, štaviše, takođe omogućavaju testove za aktivnost i/ili regulaciju promotora gena. Primeri gena rezistencije - naročito za transformacije biljaka - su gen neomicin fosfotransferaze, gen higromicin fosfotransferaze, ili gen koji kodira fosfinotricin acetiltransferazu. Dodatni markeri pozitivne selekcije mogu biti enzimi koji obezbeđuju transformisanoj biljci selekcionu prednost u odnosu na netransformisanu biljku -posebno, nutritivnu prednost, npr. manoza-6-fosfat izomeraza ili ksiloza izomeraza. Međutim, ovo ne isključuje dodatne indikatorske/reporterske gene ili gene rezistencije koji su poznati osobi sa iskustvom u struci. U poželjnom primeru izvođenja, vektor je biljni vektor. Štaviše, ekspresiona kaseta može biti prisutna kao integrisana u biljni genom.

[0240] U dodatnom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na ćelije koje uključuju vektore, molekule rekombinantne DNK, i/ili molekule nukleinske kiseline koji su u skladu sa pronalaskom. Ćelija u smislu pronalaska može biti prokariotska (na primer, bakterijska) ili eukariotska ćelija (na primer, biljna ćelija ili ćelija kvasca). Ćelija je poželjno agrobakterija kao što su Agrobacterium tumefaciens ili Agrobacterium rhizogenes, ćelija Escherichia coli, ili biljna ćelija; biljna ćelija je posebno poželjno ćelija biljke roda Beta, vrste Beta vulgaris, ili

[0243] 2

[0244] podvrste Beta vulgaris subsp. vulgaris. Ćelija može biti prisutna i kao kultura. Pronalazak takođe kao posledica toga pokriva ćelijsku kulturu koja sadrži takve ćelije. Ćelijska kultura je poželjno čista kultura ili izolat koji ne sadrži ćelije drugog tipa.

[0245] Osobi sa iskustvom u struci poznati su brojni postupci, kao što su konjugacija ili elektroporacija, pomoću kojih može introdukovati molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, molekul rekombinantne DNK, i/ili vektor ili ekspresionu kasetu iz predmetnog pronalaska u agrobakteriju, i postupci kao što su različiti postupci transformacije (biolistička transformacija, transformacija posredovana agrobakterijom) pomoću kojih može introdukovati molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, molekul DNK, i/ili vektor iz predmetnog pronalaska u biljnu ćeliju (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).

[0246] Štaviše, predmetna objava se poželjno odnosi na Heterodera-rezistentnu biljku -poželjno, biljku vrste Beta vulgaris subsp. vulgaris ili njen deo - koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom koji daje rezistenciju na Heterodera. Heterodera-rezistentna biljka može sadržati molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom kao transgen ili kao endogen. U skladu sa objavom, po prvi put su proizvedene biljke podvrste Beta vulgaris subsp. vulgaris koje sadrže molekul nukleinske kiseline kao što je opisano. Objava takođe uključuje biljke podvrste Beta vulgaris subsp. vulgaris koje sadrže molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom kao endogen.

[0247] Deo može prema tome biti ćelija, tkivo, organ, ili kombinacija više ćelija, tkiva, ili organa. Kombinacija više organa je, na primer, cvet ili seme. Heterodera-rezistentna biljka iz predmetnog pronalaska poželjno pokazuje poboljšanu rezistenciju na Heterodera - posebno, Heterodera schachtii – u odnosu na odgovarajuću biljku koja ne sadrži molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom (kontrolna biljka). Kontrolna biljka idealno ima identičan genotip kao biljka iz predmetnog pronalaska, i gajena je pod identičnim uslovima, ali ne sadrži molekul nukleinske kiseline koji daje rezistenciju. Nivo rezistencije, npr. na patogen roda Heterodera, posebno Heterodera schachtii, može se kvalitativno utvrditi kod biljaka roda Beta određivanjem ocena (videti npr. Primer 1). Veća rezistencija se manifestuje u poboljšanju rezistencije za najmanje jednu ocenu, za najmanje dve ocene i, poželjno, za najmanje tri ili više ocena.

[0248] Biljna ćelija ili biljka ili njen deo koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom - posebno, biljka roda Beta - poželjno pokazuje veću rezistenciju na patogen roda Heterodera - posebno na Heterodera schachtii - nego odgovarajuća biljna ćelija

[0251] 2

[0252] ili biljka ili njen deo koji ne sadrži molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, ili može sadržati osetljivu alelnu varijantu molekula nukleinske kiseline. Nivo rezistencije prema patogenu roda Heterodera, npr. prema Heterodera schachtii, može se kvalitativno utvrditi kod biljaka roda Beta određivanjem ocena. Veća rezistencija se manifestuje u poboljšanju rezistencije za najmanje jednu ocenu, za najmanje dve ocene i, poželjno, za najmanje tri ili više ocena.

[0253] U slučaju transgene biljne ćelije, ili biljke ili njenog dela, ovo sadrži molekul nukleinske kiseline ili molekul DNK koji je u skladu sa pronalaskom kao transgen ili vektor ili ekspresionu kasetu iz predmetnog pronalaska. Takva transgena biljna ćelija ili biljka ili njen deo je, na primer, ona koja je transformisana - poželjno, stabilno - sa molekulom nukleinske kiseline, molekulom DNK koji je u skladu sa pronalaskom, ili sa vektorom ili ekspresionom kasetom iz predmetnog pronalaska. Molekul nukleinske kiseline je operativno povezan sa jednom ili više regulatornih sekvenci koje omogućavaju transkripciju i, opciono, ekspresiju u biljnoj ćeliji. Ukupna struktura sačinjena od molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom i regulatorne(ih) sekvence(i) tada predstavlja transgen. Takve regulatorne sekvence su, na primer, promotor ili terminator. Brojni funkcionalni promotori i terminatori koji se mogu primeniti u biljkama poznati su osobi sa iskustvom u struci.

[0254] Objava takođe uključuje vakuolu ćelije koja je u skladu sa pronalaskom, i supstance koje se u njoj skladište (kao što je saharoza).

[0255] Štaviše, predmetna prijava se takođe odnosi na ćelijski ekstrakt iz ćelije - poželjno, iz biljne ćelije, posebno poželjno, iz ćelije Beta vulgaris, i, naročito poželjno, iz ćelije jedne od sledećih useva: šećerna repa, blitva, ili cvekla. Nijedna biljka se ne može regenerisati iz ćelijskog ekstrakta. Ovde je objavljen biljni genom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja je u skladu sa pronalaskom. Nijedna biljka se ne može regenerisati iz biljnog genoma kao takvog.

[0256] Koncentracija šećera ili saharoze iz ćelijskog ekstrakta može se prema tome povećati u odnosu na ćeliju koja nije ćelija koja je u skladu sa pronalaskom, ali koja pripada istoj vrsti ili usevu. Ovo se posebno odnosi na uslove kada je zaražena patogenom roda Heterodera.

[0257] Takođe je ovde objavljena upotreba ćelijskog ekstrakta za proizvodnju šećera (saharoze) ili za proizvodnju (sirovog) soka - poželjno, (sirovog) soka od cvekle.

[0258] Slično tome, ovde je objavljen šećer - posebno saharoza - koji je sadržan u ćelijama koje su u skladu sa pronalaskom i njihovim vakuolama.

[0259] Dodatni aspekt predmetne objave je semenski materijal koji sadrži semena koja sadrže molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom. Molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom može biti prisutan transgeno ili endogeno. Semenski materijal i

[0262] 2

[0263] semena mogu biti tehnički tretirani. Objava stoga takođe sadrži tehnički tretirani semenski materijal i tehnički tretirana semena. Različite vrste tehnički tretiranog semenskog materijala detaljno su objašnjene u nastavku, pri čemu termin semenski materijal takođe uključuje semena: Tehnički tretirani semenski materijal može biti prisutan u poliranom obliku. Time se uklanja spoljašnji sloj semena, tako da seme poprima zaobljeniji oblik. Ovo je korisno kod setve, optimalno uniforman oblik dovodi do uniformne raspodele zrna semenskog materijala. Tehnički tretirani semenski materijal dalje obuhvata pilirani semenski materijal. Semenski materijal se time postavlja na masu za piliranje koja štiti semenski materijal koji se u njoj nalazi i dovodi do veće mase, tako da pilirani semenski materijal pokazuje veću sposobnost rezistencije u pogledu zanošenja vetrom i stoga je manje podložan oduvavanju vetrom, a istovremeno je omogućeno preciznije pozicioniranje tokom setve. Kao što je objavljeno, sva zrna piliranog semenskog materijala iz serije ili jedinice koja je namenjena za prodaju mogu imati suštinski isti oblik i istu masu. Moguća su odstupanja od 5% u prečniku i masi. Međutim, odstupanja poželjno ne prelaze 1%. Kao jednu od glavnih komponenti, masa za piliranje može da sadrži, na primer, mineralno jedinjenje kao što je glina i/ili treset. Dodatne moguće komponente nabrojane su u US 4,067,141. Štaviše, masa za piliranje može da sadrži dodatne hemijske agense koji pozitivno utiču na kultivaciju u praksi. To ovde mogu biti supstance koje se ubrajaju u agense za đubrenje. Štaviše, to mogu biti fungicidi, insekticidi, i/ili antifidanti (anti-feedants). Fungicidi mogu biti tiram i/ili himeksazol i/ili drugi fungicidi. Insekticid može biti supstanca iz grupe neonikotinoida. Supstanca iz grupe neonikotinoida je poželjno imidakloprid (ATC kod: QP53AX17) i/ili klotianidin (CAS broj 210880‑92‑5). Štaviše, insekticid može biti i ciflutrin (CAS broj 68359‑37‑5) ili beta-ciflutrin.

[0264] [0086] Pilirani semenski materijal je specifična vrsta presvučenog semenskog materijala. U ovom kontekstu, tehnički tretirani semenski materijal obuhvata i presvučeni semenski materijal. Međutim, objava nije ograničena samo na pilirani semenski materijal, već se može primeniti sa bilo kojim oblikom presvučenog semenskog materijala. Objava se stoga odnosi i na presvučeni semenski materijal, koji uključuje pilirani semenski materijal, ali nije ograničen na ovo. Suvo presvlačenje, vlažno presvlačenje, i suspenziono presvlačenje su stoga takođe obuhvaćeni. Presvlačenje može pritom sadržati i najmanje jednu boju, tako da se presvučeni semenski materijal može brzo razlikovati od nepresvučenog semenskog materijala, a štaviše, obezbeđuje se dobra vidljivost u okruženju nakon setve. Presvlačenje može takođe sadržati one agrohemikalije koje su opisane u kontekstu mase za piliranje. Objava stoga uključuje takav presvučeni semenski materijal pri čemu presvlačenje sadrži najmanje jedan antifidant, kao što je insekticid i/ili najmanje jedan fungicid. Opciono, može se primeniti takozvano elektronsko presvlačenje (presvlačenje primenom električne energije). Međutim, elektronsko presvlačenje nije presvlačenje u strogom smislu te reči.

[0265] Dodatni oblik tehnički tretiranog semenskog materijala je inkrustirani semenski materijal. U ovom kontekstu se takođe govori o onome što je poznato kao oblaganje, kao i o semenskom materijalu koji je tretiran oblaganjem. Razlika u odnosu na pilirani semenski materijal je u tome što zrna semena zadržavaju svoj prvobitni oblik, pri čemu je ovaj postupak naročito ekonomičan. Postupak je opisan u EP 0 334 258 A1, na primer. Dodatni oblik tehnički tretiranog semenskog materijala je naklijano ili prajmirano seme. Naklijani semenski materijal se prethodno tretira pregerminacijom, dok je prajmirani semenski materijal prethodno tretiran prajmiranjem („germinacija“). Pregerminirani i prajmirani semenski materijal imaju prednost kraćeg vremena nicanja. Vreme nicanja posle setve je u isto vreme jače sinhronizovano. Ovo omogućava bolju agrotehničku obradu tokom kultivacije, a naročito tokom žetve, i, pored toga, povećava količinu prinosa. Kod pregerminacije, semenski materijal klija dok radikul ne izađe iz ljuske semenskog materijala, a proces se potom zaustavlja. Kod prajmiranja, proces se zaustavlja pre nego što radikul izađe iz ljuske semenskog materijala. U poređenju sa pregerminiranim semenskim materijalom, semenski materijal koji je podvrgnut prajmiranju je neosetljiv na stres ponovnog sušenja i, posle takvog ponovnog sušenja, ima duži rok trajanja u poređenju sa pregerminiranim semenskim materijalom, za koji se ponovno sušenje generalno ne preporučuje. U ovom kontekstu, tehnički prethodno tretirani semenski materijal takođe uključuje prajmirani i ponovo osušeni semenski materijal. Proces pregerminacije je objašnjen u US 4,905,411 A. Različiti primeri izvođenja prajmiranja su objašnjeni u EP 0 686 340 A1. Pored ovoga, takođe je moguće istovremeno pilirati i prajmirati semenski materijal u jednom procesu. Ovaj postupak je opisan u EP 2 002 702 B1. Prajmirani semenski materijal koji je pored toga i piliran, obuhvaćen je predmetnim pronalaskom.

[0266] Tehnički tretirani semenski materijal može dodatno biti opremljen sa jednom ili više od prethodno objašnjenih rezistencija na herbicide. Ovo omogućava dodatno poboljšanu agrotehničku kultivaciju, pošto se tehnički tretirani semenski materijal može upotrebljavati na polju koje je prethodno tretirano sredstvom za uništavanje korova, i koje je prema tome bez korova.

[0267] Pored ovoga, objava takođe obuhvata smešu koja sadrži semenski materijal ili semena koja su u skladu sa pronalaskom, i masu za presvlačenje kao što je prethodno definisano. Masa za presvlačenje je prema tome poželjno primerno izvedena kao masa za piliranje, kao što je prethodno definisano.

[0270] 1

[0271] Prilikom skladištenja semenskog materijala, poželjno je odabrati uslove skladištenja koji ne utiču negativno na stabilnost ili rok trajanja semenskog materijala. Fluktuacije vlažnosti mogu, naročito, ovde imati nepovoljan efekat. Takođe je objavljen postupak za skladištenje semenskog materijala u kontejneru koji je istovremeno vodoodbojan i prozračan. Takav kontejner može biti dizajniran kao kartonska kutija. Takva kartonska kutija može opciono posedovati unutrašnju paroizolaciju. Ukoliko je kartonska kutija dizajnirana kao dupleks kartonska kutija, njena stabilnost se povećava. Semenski materijal koji je u skladu sa objavom koji uključuje takav kontejner i takvu kartonsku kutiju, ili tehnički tretirani semenski materijal, takođe je deo objave. Takođe je deo objave da je semenski materijal ili tehnički tretirani semenski materijal sadržan u takvoj kartonskoj kutiji.

[0272] Takođe je objavljena hibridna biljka ili dvostruko haploidna biljka. Hibridne biljke i dvostruko haploidne biljke se ne javljaju u prirodi i ne mogu se izolovati iz prirode. Kao što je objavljeno, molekul nukleinske kiseline je prisutan u heterozigotnom ili homozigotnom obliku. U slučaju hibridne biljke, molekul nukleinske kiseline može biti prisutan i u hemizigotnom obliku. Objava takođe obuhvata hibridna semena i dvostruko haploidna semena koja sadrže nukleinsku kiselinu koja je u skladu sa pronalaskom ili polipeptid koji je u skladu sa pronalaskom.

[0273] Predmetna objava sadrži biljku - poželjno, vrste Beta vulgaris - koja se karakteriše time što je rezistencija prema patogenu roda Heterodera kod ove biljke dodatno povećana. Na primer, ovo se može postići pomoću „slaganja gena“, tj. rezistencija se povećava upotrebom ovog doznog efekta. Za ovo, biljke koje su u skladu sa pronalaskom koje sadrže alel koji daje rezistenciju na Heterodera prekomerno su transformisane ovim alelom rezistencije kako bi se povećala količina transkripcije gena u biljci. Alternativni pristup uključuje editovanje gena/mutagenezu usmerenu na mesto ili TILLING-posredovanu modifikaciju nativnog promotora alela koji daje rezistenciju, kako bi se povećala njegova stopa ekspresije, ili modifikaciju samog alela LRR gena koji daje rezistenciju, kako bi se povećala njegova aktivnost ili stabilnost. Takav postupak za povećanje aktivnosti putem modifikacije gena rezistencije opisan je u WO 2006/128444 A2, na primer, i može se izvesti pomoću tehnika koje su poznate osobi sa iskustvom u struci. Dodatni pristup može uključivati fuziju molekula nukleinske kiseline koji je u skadu sa pronalaskom sa heterologim promotorom koji pokazuje veću aktivnost u poređenju sa nativnim promotorom - posebno, nakon infekcije sa Heterodera.

[0274] Kao što je objavljeno, biljka dodatno, transgeno ili endogeno, može da sadrži drugi molekul nukleinske kiseline na različitoj poziciji u genomu, koji kodira polipeptid koji je

[0277] 2

[0278] sposoban da dâ rezistenciju na Heterodera u biljci u kojoj se polipeptid eksprimira. Na primer, jedan ili više gena rezistencije ili lokusa rezistencije koji su opisani u stanju tehnike mogu -ukoliko već nisu prisutni u inicijalnom genotipu - biti introdukovani u predmetnu biljku putem ukrštanja, transformacije, homologijom usmerene popravke na ili homologe rekombinacije u biljci. Među njima su, na primer, Hs1pro‑1 gen iz B. procumbens (Cai et al., Science 275 (1997), 832‑834).

[0279] Povećanje rezistencije može se dogoditi putem integracije molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom u genom najmanje jedne ćelije biljke vrste Beta vulgaris, kao i mogućom regeneracijom biljke iz biljne ćelije. Integracija se može dogoditi bilo putem polnog ukrštanja, npr. sa jednom od prethodno pomenutih Beta vulgaris subsp. maritima i naknadnom selekcijom, ili putem homologijom usmerene popravke ili homologe rekombinacije. Dva potonja navedena postupka su poželjno podržana nukleazama usmerenim na mesto koje mogu biti odabrane od, ali nisu ograničene na, sledeće: CRISPR nukleaza, uključujući Cas9, CasX, CasY, ili Cpf1 nukleazu, TALE nukleaza, nukleaza sa cinkovim prstom, meganukleaza, Argonaut nukleaza, restrikciona endonukleaza, uključujući FokI ili njenu varijantu, rekombinaza, ili dve, specifične za mesto, endonukleaze koje prave prekide (nicking).

[0280] Alternativni pristup uključuje povećanje ekspresije molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom u biljci. Ovo se može dogoditi putem modifikacije nativnog promotora, pri čemu se modifikacija poželjno događa pomoću editovanja gena ili mutageneze usmerene na mesto koja je posredovana putem nukleaza usmerenih na mesto i, opciono, modela popravke. Primeri takvih nukleaza su već prethodno nabrojani. Povećanje ekspresije molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom može se takođe dogoditi putem fuzije molekula nukleinske kiseline sa heterologim promotorom, koji pokazuje veću aktivnost u poređenju sa nativnim promotorom - posebno, posle infekcije sa Heterodera. Fuzija se takođe može dogoditi putem nukleaze usmerene na mesto i modela popravke, ali i putem direktnog insertovanja posle dvolančanog prekida.

[0281] Kao što je već prethodno pomenuto, postupak za povećanje rezistencije na Heterodera može takođe rezultovati povećanjem aktivnosti i/ili stabilnosti polipeptida koji je u skladu sa pronalaskom, putem modifikacije nukleotidne sekvence molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom. Takav postupak za povećanje aktivnosti putem modifikacije gena rezistencije opisan je u WO 2006/128444 A2, na primer, i može se izvesti pomoću tehnika koje su poznate osobi sa iskustvom u struci. Ovaj pristup je detaljnije objašnjen u nastavku.

[0282] Kao što se ovde upotrebljava, „nukleaza usmerena na mesto“ (SDN) je enzim koji je sposoban da indukuje prekid dvolančane DNK na određenoj nukleotidnoj sekvenci, nazvanoj „mesto prepoznavanja“. SDN može, na primer, biti odabrana iz grupe koja se sastoji od meganukleaze, TAL efektorske nukleaze, nukleaze sa cinkovim prstom, CRISPR sistema kao što su CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, CRISPR/-CasX ili CRISPR/CasY. Retko-isecajuće endonukleaze su SDN koje imaju mesto prepoznavanja poželjno od oko 14 do 70 uzastopnih nukleotida, i prema tome imaju veoma nisku učestalost isecanja, čak i u većim genomima kao što je većina biljnih genoma. Homing endonukleaze, takođe nazvane meganukleaze, čine porodicu takvih retko-isecajućih endonukleaza. One mogu biti kodirane intronima, nezavisnim genima ili međusekvencama, i pokazuju upečatljiva strukturna i funkcionalna svojstva koja ih razlikuju od klasičnijih restrikcionih enzima, uobičajeno iz bakterijskih sistema restrikcione modifikacije tipa II. Njihova mesta prepoznavanja imaju opštu asimetriju koja je u suprotnosti sa karakterističnom dijadnom simetrijom većine mesta prepoznavanja restrikcionih enzima. Pokazano je da nekoliko homing endonukleaza koje su kodirane intronima ili inteinima promovišu homing svojih odgovarajućih genetičkih elemenata u alelna mesta bez introna ili inteina. Pravljenjem dvolančanog prekida specifičnog za mesto u alelima bez introna ili inteina, ove nukleaze stvaraju rekombinogene krajeve, koji se uključuju u proces konverzije gena koji duplicira kodirajuću sekvencu i dovodi do insercije introna ili međusekvence na nivou DNK. Lista drugih retko-isecajućih meganukleaza i njihovih odgovarajućih mesta prepoznavanja obezbeđena je u Tabeli I u WO 03/004659 (strane 17 do 20) (inkorporisano ovde putem reference).

[0283] Štaviše, dostupni su postupci za dizajniranje prilagođeno skrojenih retko-isecajućih endonukleaza koje prepoznaju u osnovi bilo koju ciljnu nukleotidnu sekvencu po izboru. Ukratko, himerni restrikcioni enzimi mogu se pripremiti upotrebom hibrida između domena cinkovog prsta koji je dizajniran tako da prepoznaje specifičnu nukleotidnu sekvencu i nespecifičnog DNK-isecajućeg domena iz prirodnog restrikcionog enzima, kao što je FokI. Takvi postupci su opisani npr. u WO 03/080809, WO 94/18313 ili WO 95/09233 i u Isalan et al., 2001, Nature Biotechnology 19, 656‑660; Liu et al.1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525‑5530).

[0284] Sledeći primer prilagođeno dizajniranih endonukleaza uključuje takozvane TALE nukleaze (TALEN), koje se zasnivaju na efektorima sličnim aktivatoru transkripcije (TALE) iz bakterijskog roda Xanthomonas fuzionisanim sa katalitičkim domenom nukleaze (npr. FokI ili njena varijanta). Specifičnost vezivanja DNK ovih TALE je definisana parom varijabilnih aminokiselinskih ostataka (repeat-variable diresidues - RVD) iz tandemski aranžiranih

[0287] 4

[0288] ponavljajućih jedinica od 34/35 aminokiselina, tako da jedan RVD specifično prepoznaje jedan nukleotid u ciljnoj DNK. Ponavljajuće jedinice mogu se asemblirati tako da prepoznaju praktično bilo koju ciljnu sekvencu i fuzionisane sa katalitičkim domenom nukleaze stvaraju endonukleaze specifične za sekvencu (videti npr. Boch et al., 2009, Science 326:p1509‑1512; Moscou and Bogdanove, 2009, Science 326:p1501; i WO 2010/079430, WO 2011/072246, WO 2011/154393, WO 2011/146121, WO 2012/001527, WO 2012/093833, WO 2012/104729, WO 2012/138927, WO 2012/138939). WO2012/138927 dodatno opisuje monomerne (kompaktne) TALEN i TALEN sa različitim katalitičkim domenima i njihove kombinacije.

[0289] Nedavno, opisan je novi tip prilagodljivog endonukleaznog sistema; takozvani CRISPR/Cas sistem. CRISPR sistem u svom prirodnom okruženju opisuje molekulski kompleks koji sadrži najmanje jednu malu i pojedinačnu nekodirajuću RNK u kombinaciji sa Cas nukleazom ili drugom CRISPR nukleazom kao što je Cpfl nukleaza (Zetsche et al., "Cpf1 Is a Single RNA-Guides Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System", Cell, 163, pp.

[0290] 1-13, October 2015) koja može da proizvede specifičan dvolančani prekid DNK. Trenutno su CRISPR sistemi kategorisani u 2 klase koje sadrže pet tipova CRISPR sistema, sistem tipa II, na primer, koji upotrebljava Cas9 kao efektor i sistem tipa V koji upotrebljava Cpf1 kao efektorski molekul (Makarova et al., Nature Rev. Microbiol., 2015). U veštačkim CRISPR sistemima, sintetička nekodirajuća RNK i CRISPR nukleaza i/ili opciono modifikovana CRISPR nukleaza, modifikovana tako da deluje kao nikaza ili kojoj nedostaje bilo kakva nukleazna funkcija, mogu se upotrebljavati u kombinaciji sa najmanje jednom sintetičkom ili veštačkom vodećom RNK ili gRNA koja kombinuje funkciju crRNA i/ili tracrRNA (Makarova et al., 2015, supra). Imunski odgovor koji je posredovan CRISPR/Cas u prirodnim sistemima zahteva CRISPR-RNK (crRNA), pri čemu maturacija ove vodeće RNK, koja kontroliše specifičnu aktivaciju CRISPR nukleaze, značajno varira između različitih CRISPR sistema koji su do sada okarakterisani. Prvo, invazivna DNK, takođe poznata kao spejser, integrisana je između dva susedna ponavljajuća regiona na proksimalnom kraju CRISPR lokusa. CRISPR sistemi tipa II kodiraju Cas9 nukleazu kao ključni enzim za korak interferencije, koji sistem sadrži i crRNA i takođe i trans-aktivirajuću RNK (tracrRNA) kao vodeći motiv. One hibridizuju i formiraju dvolančane (ds) RNK regione koje prepoznaje RNaza III i mogu se isecati kako bi se formirale zrele crRNA. One se zatim povezuju sa Cas molekulom kako bi usmerile nukleazu specifično ka ciljnom regionu nukleinske kiseline. Rekombinantni gRNA molekuli mogu da sadrže i varijabilni region prepoznavanja DNK i takođe i Cas interakcioni region i stoga mogu biti specifično dizajnirani, nezavisno od specifične ciljne nukleinske kiseline i željene Cas nukleaze. Kao dodatni bezbednosni mehanizam, PAM (motivi susedni protospejseru) moraju biti prisutni u ciljnom regionu nukleinske kiseline; to su DNK sekvence koje se direktno nadovezuju na DNK koju prepoznaje Cas9/RNK kompleks. PAM sekvenca za Cas9 iz Streptococcus pyogenes opisana je kao „NGG“ ili „NAG“ (standardni IUPAC nukleotidni kod) (Jinek et al, „A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity“, Science 2012, 337: 816‑821). PAM sekvenca za Cas9 iz Staphylococcus aureus je „NNGRRT“ ili „NNGRR(N)“. Poznate su i druge varijante CRISPR/-Cas9 sistema. Stoga, Neisseria meningitidis Cas9 iseca na PAM sekvenci NNNNGATT. Streptococcus thermophilus Cas9 iseca na PAM sekvenci NNAGAAW. Nedavno je opisan još jedan PAM motiv NNNNRYAC za CRISPR sistem iz Campylobacter (WO 2016/021973 A1). Za Cpfl nukleaze opisano je da Cpf1-crRNA kompleks, bez tracrRNA, efikasno prepoznaje i iseca ciljnu DNK kojoj prethodi kratki T-bogati PAM za razliku od uobičajeno G-bogatih PAM koje prepoznaju Cas9 sistemi (Zetsche et al., supra). Štaviše, upotrebom modifikovanih CRISPR polipeptida, mogu se dobiti specifični jednolančani prekidi. Kombinovana upotreba Cas nikaza sa različitim rekombinantnim gRNA takođe može indukovati visoko specifične dvolančane prekide DNK pomoću dvostrukog pravljenja prekida DNK. Štaviše, upotrebom dve gRNA, može se optimizovati specifičnost vezivanja za DNK i stoga isecanje DNK. Dodatni CRISPR efektori kao što su CasX i CasY efektori koji su prvobitno opisani za bakterije, u međuvremenu su dostupni i predstavljaju dodatne efektore koji se mogu upotrebljavati u svrhe projektovanja genoma (Burstein et al., „New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes“, Nature, 2017, 542, 237‑241).

[0291] [0101] Mesto isecanja SDN odnosi se na tačnu lokaciju na DNK gde se indukuje dvolančani prekid DNK. Mesto isecanja može, ali i ne mora biti sadržano u (preklapati se sa) mestom prepoznavanja SDN i stoga se kaže da je mesto isecanja SDN locirano na ili blizu njegovog mesta prepoznavanja. Mesto prepoznavanja SDN enzima, koje se ponekad označava i kao mesto vezivanja, je nukleotidna sekvenca koju (specifično) prepoznaje SDN enzim i određuje njegovu specifičnost vezivanja. Na primer, TALEN ili ZNF monomer ima mesto prepoznavanja koje je određeno njihovim RVD ponovcima ili ZF ponovcima, respektivno, dok je njegovo mesto isecanja određeno njegovim nukleaznim domenom (npr. FokI) i uobičajeno je locirano izvan mesta prepoznavanja. U slučaju dimernih TALEN ili ZFN, mesto isecanja je locirano između dva mesta prepoznavanja/vezivanja odgovarajućih monomera, a ovaj međuregion DNK gde se dešava isecanje označava se kao spejser region. U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, mesto prepoznavanja je locirano u ciljnom regionu.

[0292] Osoba sa iskustvom u struci mogla bi ili da izabere SDN koja prepoznaje određeno mesto prepoznavanja i indukuje prekid lanca na mestu isecanja na ili u blizini unapred odabranog mesta ili da konstruiše takvu SDN. Alternativno, mesto prepoznavanja SDN može biti introdukovano u ciljni genom upotrebom bilo kog konvencionalnog postupka transformacije ili ukrštanjem sa organizmom koji ima mesto prepoznavanja SDN u svom genomu, a bilo koja željena DNK može biti naknadno introdukovana na ili u blizini mesta isecanja te SDN.

[0293] Kao što je objavljeno, molekul nukleinske kiseline za popravku može se dodatno introdukovati u biljnu ćeliju.

[0294] Kao što se ovde upotrebljava, „matriks za popravku“ je jednolančani ili dvolančani molekul DNK ili molekul RNK koji se upotrebljava kao templat za modifikaciju genomske DNK na unapred odabranom mestu u blizini ili na mestu isecanja. Kao što se ovde upotrebljava, „upotreba kao templat za modifikaciju genomske DNK“ znači da se matriks za popravku kopira ili integriše na unapred odabranom mestu homologom rekombinacijom između omeđavajućeg(ih) regiona i odgovarajućeg(ih) homologog(ih) regiona u ciljnom genomu koji omeđava unapred odabrano mesto, opciono u kombinaciji sa spajanjem nehomologih krajeva (NHEJ) na jednom od dva kraja matriksa za popravku (npr. u slučaju da postoji samo jedan omeđavajući region). Integracija homologom rekombinacijom će omogućiti precizno spajanje matriksa za popravku sa ciljnim genomom do nivoa nukleotida, dok NHEJ može rezultovati malim insercijama/delecijama na spoju između matriksa za popravku i genomske DNK.

[0295] [0105] „Editor baza“, kao što se ovde upotrebljava, označava protein ili njegov fragment koji ima sposobnost da posreduje u ciljanoj modifikaciji baze, tj. konverziji baze od interesa što rezultuje tačkastom mutacijom od interesa. Poželjno, najmanje jedan editor baza u kontekstu predmetnog pronalaska privremeno ili trajno je fuzionisan sa najmanje jednom SDN, poželjno najmanje jednom nefunkcionalnom SDN, ili opciono sa komponentom najmanje jedne (nefunkcionalne) SDN. Fuzija može biti kovalentna i/ili nekovalentna. Više publikacija je pokazalo ciljanu konverziju baze, prvenstveno citidina (C) u timin (T), upotrebom CRISPR/Cas9 nikaze ili nefunkcionalne nukleaze koja je povezana sa domenom citidin deaminaze, apolipoprotein B iRNK-editujućim katalitičkim polipeptidom (APOBEC1), npr. APOBEC izvedenim iz pacova. Deaminacija citozina (C) je katalizovana citidin deaminazama i rezultuje uracilom (U), koji ima svojstva sparivanja baza kao timin (T). Većina poznatih citidin deaminaza deluje na RNK, a nekoliko primera za koje se zna da prihvataju DNK zahtevaju jednolančanu (ss) DNK. Studije o dCas9-ciljnom DNK kompleksu otkrivaju da je najmanje devet nukleotida (nt) dislociranog lanca DNK nespareno nakon formiranja Cas9-vodeća RNK-DNK ʼR-petljaʻ kompleksa (Jore et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 18, 529‑536 (2011)). Zaista, u strukturi Cas9 R-petlje kompleksa, prvih 11 nt protospejsera na dislociranom lancu DNK je neuređeno, što sugeriše da njihovo kretanje nije jako ograničeno. Takođe se spekulisalo da bi Cas9 nikaza-indukovane mutacije na citozinima u ne-templat lancu mogle nastati iz njihove dostupnosti ćelijskim enzimima citozin deaminaze. Pretpostavljeno je da bi podskup ovog dela ssDNA u R-petlji mogao da posluži kao efikasan supstrat za dCas9-vezanu citidin deaminazu kako bi se izvršila direktna, programabilna konverzija C u U u DNK (Komor et al., supra). Nedavno su Goudelli et al ((2017). Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 551(7681), 464.) opisali adeninske editore baza (ABE) koji posreduju u konverziji A•T u G•C u genomskoj DNK.

[0296] Kao što se ovde upotrebljava, modifikacija genoma znači da je genom promenjen za najmanje jedan nukleotid. Ovo se može desiti zamenom najmanje jednog nukleotida i/ili delecijom najmanje jednog nukleotida i/ili insercijom najmanje jednog nukleotida, sve dok to rezultuje ukupnom promenom najmanje jednog nukleotida u poređenju sa nukleotidnom sekvencom unapred odabranog genomskog ciljnog mesta pre modifikacije, čime se omogućava identifikacija modifikacije, npr. tehnikama kao što su sekvenciranje ili PCR analiza i slično, sa čime će osoba sa iskustvom biti dobro upoznata.

[0297] Kao što se ovde upotrebljava „unapred odabrano mesto“ ili „unapred definisano mesto“ ukazuje na određenu nukleotidnu sekvencu u genomu (npr. nukleusni genom) na kojoj lokaciji je poželjno insertovati, zameniti i/ili deletirati jedan ili više nukleotida. Ovo može biti npr. endogeni lokus ili određena nukleotidna sekvenca u ili povezana sa prethodno introdukovanom stranom DNK ili transgenom. Unapred odabrano mesto može biti određena nukleotidna pozicija na (posle) koje je namenjeno insertovanje jednog ili više nukleotida. Unapred odabrano mesto takođe može da sadrži sekvencu jednog ili više nukleotida koji treba da se izmene (zamene) ili deletiraju.

[0298] [0108] Kao što se ovde upotrebljava, „omeđavajući region“ je region molekula nukleinske kiseline za popravku koji ima nukleotidnu sekvencu koja je homologa nukleotidnoj sekvenci DNK regiona koji omeđava (tj. uzvodno ili nizvodno) unapred odabrano mesto. Biće jasno da dužina i procenat identičnosti sekvence omeđavajućih regiona treba da budu odabrani tako da omoguće homologu rekombinaciju između navedenih omeđavajućih regiona i njihovog odgovarajućeg DNK regiona uzvodno ili nizvodno od unapred odabranog mesta. DNK region ili regioni koji omeđavaju unapred odabrano mesto i koji imaju homologiju sa omeđavajućim DNK regionom ili regionima molekula nukleinske kiseline za popravku takođe se označavaju kao homologi region ili regioni u genomskoj DNK.

[0299] Kako bi se imala dovoljna homologija za rekombinaciju, omeđavajući DNK regioni molekula nukleinske kiseline za popravku mogu varirati u dužini, i trebalo bi da budu dugački najmanje oko 10 nt, oko 15 nt ili oko 20 nt. Međutim, omeđavajući region može biti onoliko dugačak koliko je praktično moguće (npr. do oko 100‑150 kb, kao što su kompletni bakterijski veštački hromozomi (BAC). Poželjno, omeđavajući region biće od oko 50 nt do oko 2000 nt, npr. oko 100 nt, 200 nt, 500 nt ili 1000 nt. Štaviše, regioni koji omeđavaju DNK od interesa ne moraju biti identični regionima homologije (DNK regioni koji omeđavaju unapred odabrano mesto) i mogu imati između oko 80% i oko 100% identičnosti sekvence, poželjno oko 95% do oko 100% identičnosti sekvence sa DNK regionima koji omeđavaju unapred odabrano mesto. Što je omeđavajući region duži, to je manje strog zahtev za homologiju. Štaviše, kako bi se postigla izmena ciljne DNK sekvence na unapred odabranom mestu bez promene DNK sekvence susednih DNK sekvenci, omeđavajuće DNK sekvence bi poželjno trebalo da budu identične uzvodnim i nizvodnim DNK regionima koji omeđavaju unapred odabrano mesto.

[0300] Kao što se ovde upotrebljava, „uzvodno“ ukazuje na lokaciju na molekulu nukleinske kiseline koja je bliža 5’ kraju navedenog molekula nukleinske kiseline. Slično tome, termin „nizvodno“ označava lokaciju na molekulu nukleinske kiseline koja je bliža 3’ kraju navedenog molekula nukleinske kiseline. Radi izbegavanja sumnje, molekuli nukleinske kiseline i njihove sekvence su tipično predstavljeni u smeru od 5’ ka 3’ (sleva nadesno).

[0301] Dodatni aspekt predmetnog pronalaska je postupak za proizvodnju biljke Beta vulgaris koja ima rezistenciju prema nematodi roda Heterodera, kao što se ovde zahteva zaštita patenta.

[0302] Ovde je objavljen postupak za proizvodnju Heterodera-rezistentne biljke, koji se može dogoditi putem transformacije biljne ćelije sa molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, molekulom rekombinantne DNK, ili vektorom ili ekspresionom kasetom, i regeneracijom transgene biljke iz transformisane biljne ćelije (videti Primer 3) ili putem ukrštanja i selekcije, npr. sa jednom od prethodno pomenutih Beta vulgaris subsp. maritima. Vektori ili ekspresione kasete, kao i postupci za transformaciju biljaka, već su prethodno opisani.

[0303] Postupak za proizvodnju Heterodera-rezistentne biljke alternativno uključuje, kao što je prethodno opisano, introdukciju nukleaze usmerene na mesto i matriksa za popravku u ćeliju biljke, poželjno biljke vrste Beta vulgaris, pri čemu je nukleaza usmerena na mesto sposobna da generiše najmanje jedan jednolančani prekid ili najmanje jedan dvolančani prekid DNK u genomu ćelije - poželjno, uzvodno i/ili nizvodno od ciljnog regiona - i matriks za popravku sadrži molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom. Postupak pored toga uključuje kultivaciju ove ćelije pod uslovima koji omogućavaju homologijom usmerenu popravku ili homologu rekombinaciju, pri čemu se molekul nukleinske kiseline inkorporiše iz matriksa za popravku u genom biljke. Pored toga, obuhvaćena je regeneracija biljke iz modifikovane biljne ćelije.

[0304] Ciljni region može biti alelna varijanta molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, pri čemu alelna varijanta, kada je prisutna u biljci, ne daje rezistenciju na Heterodera. Identifikovano je da alelna varijanta sadrži retrotranspozone.

[0305] Kao što je opisano u vezi sa molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, mogu se introdukovati supstitucije, delecije, insercije, adicije, i/ili bilo koja druga promena koja, bilo sama ili u kombinacijama, zapravo menja nukleotidnu sekvencu, ali obavlja istu funkciju kao inicijalna sekvenca - ovde, nukleotidna sekvenca alelne varijante molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom. Prema tome, nukleotidna sekvenca može predstavljati derivat nukleotidne sekvence alelne varijante molekula nukleinske kiseline kao što je objavljeno, ili aminokiselinska sekvenca koja predstavlja derivat aminokiselinske sekvence alelne varijante kao što je objavljeno. Izvedena nukleotidna ili aminokiselinska sekvenca koja ima najmanje jednu supstituciju, deleciju, inserciju, ili adiciju jedne ili više nukleinskih kiselina ili aminokiselina, pri čemu je funkcionalnost gena očuvana, predstavlja derivat nukleotidne ili aminokiselinske sekvence. Nukleotidna sekvenca, upotrebom konvencionalnih postupaka koji su poznati u stanju tehnike, npr. putem mutageneze usmerene na mesto, TILLING, PCR-posredovane mutageneze, hemijski indukovane mutageneze, editovanja genoma, editovanja baza itd, supstitucija, delecija, insercija, adicija, i/ili bilo koje druge promene, bilo same ili u kombinacijama sa genom, mogu se prema tome introdukovati, što zapravo menja nukleotidnu sekvencu, ali obavlja istu funkciju kao i inicijalna sekvenca.

[0306] Što se tiče aminokiselinske sekvence, posle modifikacije putem prethodno pomenutog postupka, ona takođe ima zajednički strukturni domen i/ili poseduje zajedničku funkcionalnu aktivnost. Nukleotidne sekvence ili aminokiselinske sekvence koje su najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%,

[0309] 4

[0310] najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili najmanje 100% identične nukleotidnoj sekvenci ili aminokiselinskoj sekvenci navedene alelne varijante molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom ovde su definisane kao dovoljno slične. U skladu sa tim, predmetni pronalazak uključuje nukleotidnu sekvencu koja je sposobna da hibridizuje, pod strogim uslovima, sa nukleotidnom sekvencom koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci alelne varijante molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom ili nukleotidnoj sekvenci koja kodira odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu.

[0311] Poželjno najmanje jedan dvolančani prekid se dešava na poziciji koja je najviše 10.000 baznih parova, poželjno najmanje 5.000 baznih parova, poželjnije najmanje 1.000 baznih parova, uzvodno i/ili nizvodno od ciljnog regiona, ili koja je najviše 10.000 baznih parova, poželjno najmanje 5.000 baznih parova, poželjnije najmanje 1.000 baznih parova, udaljena od alelne varijante kao što je objavljeno.

[0312] Za osobu sa iskustvom u struci, može biti očigledno da se mogu javiti brojne, različite osetljive sekvence koje su izvedene iz molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, ali ne daju rezistenciju na Heterodera, tako da se prethodno navedena sekvenca treba smatrati samo primerom sekvence. Naravno, osetljive varijante molekula nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska ne moraju sadržati samo retrotranspozone kao što je prethodno opisano, već sve vrste mutacija koje su poznate osobi sa iskustvom u struci i koje su prethodno pomenute u DNK ili cDNA sekvenci ili u promotorskom regionu mogu dovesti do osetljivih alela.

[0313] Kao što je prethodno opisano, kvantitativnim nasleđivanjem QTL, ne samo da se često u biljku introdukuje željena rezistencija prema patogenu roda Heterodera, već često i neželjene osobine kao što je, na primer, redukovan prinos, usled nasleđivanja dodatnih gena koji nisu povezani sa pozitivnom osobinom rezistencije. Prema tome, poželjno, introdukcija molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom ili prethodno opisane kombinacije molekula nukleinske kiseline, koja već sama po sebi pokazuje dominantan efekat rezistencije, ili vektora ili ekspresione kasete, nije povezana sa introdukcijom neželjenih osobina, pri čemu, poželjno, nema negativnog uticaja na prinos.

[0314] [0120] Iako su analize QTL koje su ranije bile poznate iz stanja tehnike mogle da detektuju stvarne QTL, osnovni genomski regioni koji su pokazali efekat QTL takođe su posredovali u prethodno opisanim nedostacima, zbog čega se u ovom kontekstu razmatra i „teret povezanosti“. Istovremeno, QTL i efekti povezani sa njima nisu bili jednoobrazno opisani u odgovarajućem stanju tehnike, i samo su posredovali u slabom efektu, tako da je korišćenje ovih rezultata u oplemenjivanju Heterodera-rezistentnih biljaka bilo moguće samo u ograničenoj meri, i uglavnom je bilo neizvesno. Ciljano oplemenjivanje i kontrolisana integracija gena rezistencije u genski pul šećerne repe sada su omogućeni pomoću identifikacije gena rezistencije koji je ovde opisan. Ovo osigurava oplemenjivanje i generisanje potpuno novih Heterodera-rezistentnih kultivara koji pokazuju visoku rezistenciju na patogen, bez negativnog uticaja na prinos šećera.

[0315] Dodatni aspekt predmetnog pronalaska je postupak za identifikovanje, i opciono obezbeđivanje ili selekciju, biljke Beta vulgaris koja je rezistentna prema nematodi roda Heterodera kao što se ovde zahteva zaštita patenta.

[0316] Ovde je objavljen postupak za identifikaciju, i moguće obezbeđivanje, biljke vrste Beta vulgaris koja je rezistentna na patogen Heterodera, koji se karakteriše time što postupak uključuje korak detekcije prisustva i/ili ekspresije molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom ili polipeptida koji je u skladu sa pronalaskom u biljci ili njenom uzorku/delu. Prisustvo i/ili ekspresija molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, ili polipeptida koji je u skladu sa pronalaskom, može se testirati pomoću standardnih postupaka koji su poznati osobi sa iskustvom u struci, npr. pomoću PCR, RT-PCR, ili Western blot analize.

[0317] [0123] Štaviše, postupak identifikacije kao što je objavljeno takođe uključuje detekciju molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom pomoću detekcije najmanje jednog polimorfizma u sekvenci koja daje rezistenciju, tj. sekvenci molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom. Kao što je već prethodno opisano, osobi sa iskustvom u struci može biti očigledno da postoje brojne osetljive sekvence, tj. brojne sekvence koje kodiraju alelnu varijantu molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom. Objava kao posledica toga uključuje detekciju najmanje jednog polimorfizma upotrebom molekularnih markera koji detektuju polimorfizme - posebno, dijagnostičke polimorfizme. Ova detekcija se poželjno dešava upotrebom najmanje jednog molekularnog markera po polimorfizmu - posebno, po dijagnostičkom polimorfizmu. Osobi sa iskustvom u struci je poznato koje tehnike markera treba primeniti za detekciju odgovarajućeg polimorfizma, i kako se konstruišu molekularni markeri za to (videti Advances in Seed Science and Technology Vol. I, Vanangamudi et al., 2008). Štaviše, predmetna objava obuhvata molekularne markere koji opisuju ili detektuju polimorfizam u sekvencama molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom. Prema tome je takođe moguće upotrebljavati markere koji ne razlikuju različite polimorfizme, sve dok su markeri u stanju da detektuju takav polimorfizam kakav se javlja u molekulu nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, ali ne sadrži osetljivu alelnu varijantu.

[0318] Alternativno ili dodatno, postupak identifikacije kao što je objavljeno uključuje korak detektovanja najmanje jednog markerskog lokusa u nukleotidnoj sekvenci molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom. Kao rezultat toga, generiše se signal, npr. fluorescentni signal ili amplifikacija sekvence. Štaviše, prethodni postupci identifikacije takođe predstavljaju postupke za selekciju biljke koja pokazuje rezistenciju na Heterodera koja je uskladu sa pronalaskom. Postupak za selekciju uključuje završni korak selektovanja rezistentne biljke.

[0319] U ovom kontekstu, predmetna objava takođe uključuje razvoj ili proizvodnju molekularnih markera koji su pogodni za detektovanje prethodno pomenutih polimorfizama rezistentnog alela ili konstruisanje hibridizacionih proba koje se specifično vezuju za nukleotidnu sekvencu molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, ili proizvodnju para molekula nukleinske kiseline koji je pogodan za amplifikaciju, u PCR, regiona koji je specifičan za molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, i stoga za njihovo detektovanje u biljci ili biljnoj ćeliji.

[0320] Objava poželjno uključuje postupak za proizvodnju oligonukleotida dužine najmanje 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 - poželjno, najmanje 21, 22, 23, 24, ili 25, posebno poželjno, najmanje 30, 35, 40, 45, ili 50, i, naročito poželjno, najmanje 100, 200, 300, 500, ili 1.000 -nukleotida koji specifično hibridizuju sa nukleotidnom sekvencom molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom ili molekulom nukleinske kiseline koji je komplementaran njemu, ili parom molekula nukleinske kiseline - poželjno u obliku oligonukleotida - koji je pogodan za prikačinjanje kao direktan i reverzni prajmer za region koji je specifičan za molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, i za amplifikovanje ovoga u lančanoj reakciji polimeraze (PCR), ili koji je pogodan za hibridizaciju kao direktan i reverzni prajmer za region u genomu Beta vulgaris koji, u Beta vulgaris ima kosegregaciju sa rezistencijom na Heterodera koju daje polipeptid koji je u skladu sa pronalaskom ili sa molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom.

[0321] Postupak za proizvodnju oligonukleotida inicijalno uključuje: poređenje nukleotidne sekvence molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom sa nukleotidnom sekvencom odgovarajućeg molekula nukleinske kiseline koji ne daje rezistenciju; identifikaciju razlika u sekvencama između dve nukleotidne sekvence; i generisanje molekula nukleinske kiseline - ovde znači oligonukleotida - koji se specifično vezuju za molekul

[0324] 4

[0325] nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, ali ne i za molekul nukleinske kiseline koji ne posreduje u rezistenciji.

[0326] Štaviše, oligonukleotid kao što je objavljeno može biti povezan sa fluorescentnom bojom kako bi se generisao fluorescentni signal, npr. pod ekscitacijom putem svetlosti odgovarajuće talasne dužine. Fluorescentna boja može biti fluorohrom. Oligonukleotidi kao što je ovde objavljeno mogu biti kuplovani sa drugim jedinjenjima koja su pogodna za generisanje signala. Takvi oligonukleotidi se ne javljaju u prirodi i takođe se ne mogu izolovati iz prirode. Sledeće se izvodi kako bi se proizveli tako obeleženi oligonukleotidi: DNK može biti obeležena bio-ortogonalno. Za ovo, DNK može biti obeležena in vivo ili in vitro sa nukleozidnim analozima, koji, na primer, mogu potom biti kuplovani sa fluoroforom prema Štaudingerovoj (Staudinger) reakciji. Pored ovoga, DNK može takođe biti hemijski obezbeđena sa fluoroforama. Oligonukleotidi mogu biti obeleženi putem sinteze fosforamidita sa fluoroforama koje se, na primer, upotrebljavaju u QPCR, sekvenciranju DNK, i in situ hibridizaciji. Štaviše, DNK se može enzimski generisati tokom lančane reakcije polimeraze sa fluorescentnim nukleotidima, ili obeležiti sa ligazom ili terminalnom dezoksinukleotidil transferazom. DNK se takođe može detektovati indirektno putem biotinilacije i fluorescentnog avidina. Za kuplovanje, fluorescein, fluorescentni lantanidi, zlatne nanočestice, ugljenične nanotube, ili kvantne tačke, između ostalog, upotrebljavaju se kao fluorofore. Jedna od najčešće upotrebljavanih fluorescentnih supstanci je FAM (karboksifluorescein). Kao posledica toga, oligonukleotidi i, posebno, prajmeri koji poseduju FAM oznaku obuhvaćeni su pronalaskom. FAM je poželjno prisutan kao 6-FAM, pri čemu se - u zavisnosti od željene talasne dužine emisije i ekscitacije – međutim, mogu se upotrebljavati i druge FAM varijante, npr. 5-FAM. Primeri dodatnih fluorescentnih markera su AlexaFluor, ATTO, Dabcyl, HEX, Rox, TET, Texas Red, i Yakima Yellow. U zavisnosti od oblasti upotrebe, oligonukleotidi mogu biti opremljeni sa modifikacijama baza ili šećernofosfatne kičme. Među njima su, između ostalih, amino-dT, azid-dT, 2-aminopurin, 5-Br-dC, 2’-dezoksiinozin (INO), 3’-dezoksi-A, C, G, 5-Met-dC, 5-OH-Met-dCN6-Met-dA, i drugi.

[0327] Štaviše, predmetna objava se takođe odnosi na marker čip („DNK čip“ ili mikročip) koji sadrži najmanje jedan oligonukleotid kao što je objavljeno, a koji je pogodan za detekciju. Marker čip je pogodan za primenu u jednom ili više postupaka detekcije kao što je objavljeno.

[0328] [0130] Objava takođe uključuje postupak za proizvodnju proteina koji je u skladu sa pronalaskom. Postupak uključuje obezbeđivanje ili kultivaciju ćelijske kulture koja sadrži bilo koju od SEQ ID NO 2, 5 i 8, i naknadnu ekspresiju proteina kodiranog bilo kojom od SEQ ID NO 2, 5 i 8.

[0329] Štaviše, predmetna objava se takođe odnosi na Heterodera-rezistentnu biljku ili njen deo koji je identifikovan i, ukoliko je primenljivo, selektovan, putem postupka kao što je opisano u prethodnom tekstu. Konkretno, predmetna objava se odnosi na populaciju biljaka koja sadrži biljke koje su dostupne u skladu sa jednim od postupaka koji su opisani u prethodnom tekstu, i koje su poželjno rezistentne na cističnu nematodu repe, i karakteriše ih prisustvo molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom. Populacija poželjno ima najmanje 10 - poželjno, najmanje 50, poželjnije, najmanje 100, posebno poželjno, najmanje 500, i, posebno u poljoprivrednoj kultivaciji, poželjno najmanje 1.000 - biljaka. Udeo biljaka u populaciji koje ne nose molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom i/ili su podložne zarazi sa Heterodera, posebno sa Heterodera schachtii, je poželjno ispod 25% - poželjno, ispod 20%, poželjnije, ispod 15%, još poželjnije, 10%, i, posebno, poželjno ispod 5%, ukoliko su uopšte prisutne.

[0330] Sa finim mapiranjem koje je prethodno opisano, gen(i) koji daje(u) rezistenciju na Heterodera u genomu mogli bi se identifikovati. Ovo zauzvrat predstavlja osnovu za razvoj DNK hibridizacionih proba ili genetičkih markera u ciljnom regionu, pomoću kojih bi se gen koji posreduje u rezistenciji na Heterodera mogao detektovati, ili razlikovati od gena koji ne daje rezistenciju.

[0331] DNK hibridizacione probe mogu biti izvedene iz sekvence gena koji daje(u) rezistenciju na Heterodera i mogu se upotrebljavati za pregled genomskih i/ili cDNA banaka željenog organizma. Probe se mogu upotrebljavati za amplifikaciju identifikovanih homologih gena putem poznatog procesa lančane reakcije polimeraze (PCR), i za proveru da li je gen koji daje rezistenciju na Heterodera endogeno prisutan u organizmu, ili je uspešno introdukovan heterologo.

[0332] Osoba sa iskustvom u struci može ovde da pribegne uobičajenim postupcima hibridizacije, kloniranja, i sekvenciranja, koji su, na primer, navedeni u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Osoba sa iskustvom u struci takođe može sintetisati i upotrebiti oligonukleotidne prajmere za amplifikaciju sekvenci gena koji daje(u) rezistenciju na Heterodera. Kako bi se postigla specifična hibridizacija, takve probe treba da budu specifične i da imaju dužinu od najmanje 15 nukleotida - poželjno, najmanje 20 nukleotida. Detaljan vodič za hibridizaciju nukleinskih kiselina može se naći u Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid

[0335] 4

[0336] Probes, Deo 1, poglavlje 2, „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe tests.“ Elsevier, New York (1993); i u Current Protocols in Molecular Biology, poglavlje 2, Ausubel et al., eds., Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1995).

[0337] Prema tome, molekul nukleinske kiseline dužine najmanje 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 -poželjno, najmanje 21, 22, 23, 24, ili 25, posebno poželjno, najmanje 30, 35, 40, 45, ili 50, i, naročito poželjno, najmanje 100, 200, 300, 500, ili 1.000 - nukleotida je predmet predmetne objave, pri čemu ovaj molekul nukleinske kiseline specifično hibridizuje sa prethodno opisanom nukleotidnom sekvencom koja je u skladu sa pronalaskom koja sadrži gen(e) koji daje(u) rezistenciju na Heterodera. Ovo takođe eksplicitno obuhvata opseg od 15 do 35 nukleotida.

[0338] Predmetna objava se stoga takođe odnosi na markere kao oligonukleotide - posebno, oligonukleotidne prajmere. Oni sadrže molekul nukleinske kiseline dužine najmanje 15 nukleotida koji specifično hibridizuje sa nukleotidnom sekvencom koja je definisana kao u prethodnom tekstu.

[0339] Posebno, predmetna objava obuhvata par molekula nukleinske kiseline - poželjno, u obliku oligonukleotida ili kompleta koji sadrži ovaj par oligonukleotida - koji je pogodan za hibridizaciju kao direktni i reverzni prajmer za region koji je specifičan za molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, i za amplifikaciju ovoga u lančanoj reakciji polimeraze (PCR), ili koji je pogodan kao direktni i reverzni prajmer za hibridizaciju sa regionom u genomu Beta vulgaris koji, kod Beta vulgaris, pokazuje kosegregaciju sa rezistencijom prema patogenu roda Heterodera koju daje polipeptid koji je u skladu sa pronalaskom, ili sa molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom. Poželjno region u genomu Beta vulgaris je lociran između markera s5e3001s02 i markera s5e4668xxx, omeđen je markerom s5e3001s02 i markerom s5e4668xxx, ili sadrži hromozomski interval između markera s5e3001s02 i markera s5e4668xxx.

[0340] Sledeće prednosti za oplemenjivanje i razvoj novih rezistentnih biljnih linija roda Beta takođe se mogu postići putem predmetnog pronalaska. Informacije o sekvenci, kao i identifikovani polimorfizmi koji omogućavaju razlikovanje između rezistentnih i potencijalno podložnih alela objavljenog gena, tj. između alela koji daju rezistenciju prema patogenu roda Heterodera i alela koji nisu sposobni da daju ovu rezistenciju, omogućavaju razvoj markera što predstavlja važno olakšanje za oplemenjivača biljaka - posebno u pogledu razvoja optimizovanih elitnih linija bez „tereta povezanosti“. Štaviše, znanje o sekvencijalnoj

[0343] 4

[0344] strukturi može se upotrebljavati za identifikaciju dodatnih gena rezistencije - posebno, prema Heterodera - koji su homologi ili ortologi, na primer.

[0345] Prema tome, predmetna objava takođe obuhvata postupak za identifikaciju dodatnih molekula nukleinske kiseline koji daju rezistenciju prema patogenu roda Heterodera kada su prisutni u biljci i koji kodiraju polipeptide ili dodatne proteine koji su sposobni da daju rezistenciju prema patogenu roda Heterodera u biljci u kojoj se polipeptid eksprimira, respektivno. Osoba sa iskustvom u struci može prema tome upotrebljavati baze podataka, koristeći pogodne profile pretraživanja i kompjuterske programe za pregled homologih sekvenci ili za poređenje sekvenci. Štaviše, pomoću konvencionalnih tehnika molekularne biologije, osoba sa iskustvom u struci može sama izvesti dodatne DNK sekvence koje kodiraju proteine rezistencije na Heterodera. Na primer, odgovarajuće hibridizacione probe mogu biti izvedene iz sekvence molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom i mogu se upotrebljavati za pregled genomskih i/ili cDNA banaka željenog organizma. Osoba sa iskustvom u struci može ovde da pribegne uobičajenim postupcima hibridizacije, kloniranja, i sekvenciranja, koji su, na primer, navedeni u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Upotrebljavajući poznate sekvence, osoba sa iskustvom u struci može takođe da sintetiše i upotrebljava oligonukleotidne prajmere za amplifikaciju sekvenci molekula nukleinske kiseline koji daju rezistenciju na Heterodera.

[0346] Predmetna objava prema tome obuhvata postupak za identifikaciju molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji je sposoban da dâ rezistenciju na Heterodera kod biljke vrste Beta vulgaris u kojoj se polipeptid eksprimira. Postupak prema tome uključuje poređenje aminokiselinske sekvence polipeptida koji je u skladu sa pronalaskom koja, kod Beta vulgaris subsp. vulgaris, daje rezistenciju prema patogenu roda Heterodera sa aminokiselinskim sekvencama iz baze podataka sekvenci, ili sa sekvencama alelnih varijanti polipeptida koji je u skladu sa pronalaskom u genotipovima vrste Beta vulgaris. Štaviše, postupak kao što je objavljeno uključuje identifikaciju aminokiselinske sekvence ili alelne varijante koja je najmanje 70%, poželjno najmanje 80% identična aminokiselinskoj sekvenci polipeptida koji je u skladu sa pronalaskom, kao i introdukciju molekula nukleinske kiseline koji kodira identifikovanu aminokiselinsku sekvencu ili alelnu varijantu u biljku vrste Beta vulgaris; ekspresiju molekula nukleinske kiseline u biljci; i, opciono, naknadnu verifikaciju rezistencije prema patogenu roda Heterodera.

[0347] Kao što je opisano u prethodnom tekstu, dodatni proteini koji daju rezistenciju na Heterodera ili njihovi kodirajući geni, tj. homolozi, analozi, i ortolozi, koji su najmanje 70% -

[0350] 4

[0351] poželjno, najmanje 80%, posebno poželjno, najmanje 90%, naročito poželjno, najmanje 95%, ili čak 98% - identični aminokiselinskoj sekvenci polipeptida koju kodira molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, mogu se identifikovati putem klasičnih bioinformatičkih pristupa (pretraživanje baza podataka i kompjuterski programi za pregled homologih sekvenci).

[0352] Objava dodatno uključuje biljku ili seme koje sadrži nukleinsku kiselinu iz pronalaska kao što je ovde opisano, pri čemu biljka ili seme takve biljke ima genom koji omogućava razvoj tela cvekle koje ima minimalnu svežu masu od 200 g, 250 g, 300 g, 350 g, 400 g, 450 g ili 500 g i maksimalnu masu od 100 g, 1100 g, 1200 g, 1300 g, 1400 g, 1500 g, 1600 g, 1700 g, 1800 g, 1900 g ili 2000 g. Odgovarajuća genetička kompozicija za razvoj takvog tela repe dostupna je na primer putem sledećih sorti BTS 8629, BTS 8735, BTS 8500, BTS 8767 ili BTS 8749. Osoba sa iskustvom u struci zna kako da prenese nukleinsku kiselinu koja je u skladu sa pronalaskom u biljku koja ima takvu genetičku kompoziciju. Seme u ovom primeru izvođenja može biti peletirano seme.

[0353] Objava dodatno uključuje biljku ili seme koje sadrži nukleinsku kiselinu iz pronalaska kao što je ovde opisano, pri čemu biljka ili seme takve biljke ima genom koji omogućava razvoj tela cvekle koje ima koncentraciju saharoze u svežoj masi tela cvekle od najmanje 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ili čak 20% (procenat po masi).

[0354] Termin homolog(zi) na taj način znači da dotični geni (iz dve različite biljne vrste) imaju suštinski istu funkciju i zajedničkog pretka, i prema tome tipično pokazuju značajnu identičnost u svojim nukleinskim kiselinama ili kodiranim aminokiselinskim sekvencama. Međutim, postoje i mnogi geni koji su homologi jedni drugima, bez proteinskih sekvenci koje rezultuju smislenim sparenim poravnanjem. Nasuprot tome, termin analog(zi) opisuje gene ili proteine koji (slično tome) imaju identičnu ili sličnu funkciju, ali nisu stvoreni iz iste strukture, tj. nemaju zajedničkog pretka. U ovom slučaju, često se ne može utvrditi značajna identičnost u njihovoj sekvenci nukleinske kiseline ili kodiranoj aminokiselinskoj sekvenci, ili, u najboljem slučaju, u specifičnim funkcionalnim domenima.

[0355] U kontekstu sekvenciranja genoma, homolozi su, radi anotacije, preciznije klasifikovani. U tu svrhu su introdukovani termini ortologija i paralogija. Ortolozi su geni koji su povezani putem događaja specijacije. Paralozi su geni koji se mogu pratiti do događaja duplikacije.

[0356] Gen je, tada, u osnovi homolog ili analog ili ortolog u smislu predmetnog pronalaska ukoliko je u stanju da dâ rezistenciju na Heterodera kod biljke. Za proveru se upotrebljavaju postupci koji su već opisani u prethodnom tekstu, koji su poznati osobi sa iskustvom u struci,

[0359] 4

[0360] npr. amplifikacija identifikovanog homologa ili analoga ili ortologa pomoću PCR, kloniranje u ekspresione vektore, introdukcija u ciljnu biljku ili biljnu ćeliju, i provera rezistencije.

[0361] Kao što je prethodno opisano, upotreba koja je ovde objavljena alela gena rezistencije u cis- ili transgenetičkim pristupima otvara mogućnost novih rezistentnih vrsta roda Beta koje, upotrebom doznog efekta, pokazuju poboljšanu rezistenciju, ili kod kojih se može izbeći prekid rezistencije i optimizovati razvoj rezistencije putem gomilanja objavljenog gena sa drugim genima rezistencije. Takođe su moguće modifikacije gena pomoću tilling postupka ili ciljanog projektovanja kako bi se razvili novi aleli rezistencije.

[0362] Predmetna objava se takođe odnosi na upotrebu u biljci identifikovanog alela gena koji daje rezistenciju na Heterodera u genetičkoj ili molekularnoj gomili sa drugim genetičkim elementima koji mogu dati agronomski povoljna svojstva. Ekonomska vrednost kultivisanih biljaka može se time značajno povećati, na primer, tako što se performansa prinosa povećava u poređenju sa biljkama koje poseduju istu genetiku, ali nisu opremljene nukleinskom kiselinom koja je u skladu sa pronalaskom. Štaviše, mogu se otvoriti nova područja useva za biljku koja ranije nisu bila dostupna za kultivaciju ove biljke usled biotičkih faktora kao što je jak pritisak patogena. Konkretno, predmetna objava se odnosi na upotrebu identifikovanog alela gena koji daje rezistenciju na Heterodera u postupcima za kontrolu zaraze sa patogenom Heterodera schachtii u poljoprivrednoj ili hortikulturnoj kultivaciji biljaka roda Beta, npr. koji obuhvataju identifikaciju i selekciju biljaka roda Beta uz pomoć jednog od postupaka koji su opisani u prethodnom tekstu i/ili kultivaciju tako odabranih biljaka ili njihovih potomaka. Predmetna objava stoga uključuje postupak za kultivaciju biljaka vrste Beta vulgaris, uključujući, u prvom koraku, obezbeđivanje Heterodera-rezistentnih biljaka vrste Beta vulgaris, kao što je objavljeno, ili proizvodnju biljaka vrste Beta vulgaris uz pomoć postupka proizvodnje kao što je objavljeno, ili identifikaciju i selekciju biljaka vrste Beta vulgaris uz pomoć postupka identifikacije koji je u skladu sa pronalaskom koji je opisan u prethodnom tekstu; i uključujući, u drugom koraku, kultivaciju biljaka iz prvog koraka, ili raspoređivanje semenskog materijala biljaka iz prvog koraka, ili odgajanje biljaka iz prvog koraka. Postupak kultivacije na taj način suzbija zarazu kultivisanih biljaka od strane Heterodera. Postupak kultivacije može biti deo postupka za proizvodnju šećera. Postupak za proizvodnju šećera uključuje korake postupka kultivacije, i dodatno, kao pretposlednji korak, žetvu kultivisanih biljaka i, kao poslednji korak, ekstrakciju šećera iz prethodno navedenih biljaka.

[0363] Postupak kultivacije može takođe biti deo postupka za proizvodnju semenskog materijala. Postupak za proizvodnju semenskog materijala uključuje korake postupka kultivacije, i dodatno, kao pretposlednji korak, vernalizaciju kultivisanih biljaka i, kao

[0366] 4

[0367] poslednji korak, ekstrakciju semena iz prethodno navedenih biljaka. Ekstrahovana semena mogu opciono biti pilirana, kako bi se dobio pilirani semenski materijal vrste Beta vulgaris. U ovom slučaju, to je postupak za proizvodnju piliranog semenskog materijala.

[0368] Štaviše, postupak za proizvodnju semenskog materijala može biti dizajniran kao postupak za proizvodnju Heterodera-rezistentnog semenskog materijala. Postupak za proizvodnju Heterodera-rezistentnog semenskog materijala uključuje korake iz prethodno opisanog postupka za proizvodnju semenskog materijala, i dodatno, kao poslednji korak, verifikaciju nukleinske kiseline koja je u skladu sa pronalaskom koja je u skladu sa ovde opisanim postupkom u najmanje jednom od ekstrahovanih semena - poželjno, u najmanje 0,1% ili u najmanje 1% ekstrahovanih semena. Verifikacija se posebno poželjno implementira tako da seme ostane klijavo. To znači da ekstrakcija DNK potrebne za verifikaciju iz semena ne neutrališe klijavost semena. U takvom slučaju, verifikacija nukleinske kiseline koja je u skladu sa pronalaskom mogla se dogoditi u naročito velikom udelu svih ekstrahovanih semena. Na primer, verifikacija se može dogoditi u najmanje 2% - poželjno, najmanje 3%, posebno poželjno, najmanje 4% - svih ekstrahovanih semena.

[0369] Biljke kao što je objavljeno, njihove ćelije, ili semena koja su u skladu sa pronalaskom mogu posedovati dodatna, agronomski povoljna svojstva, ili biti opremljena takvim svojstvima. Jedan primer je tolerancija ili rezistencija na herbicid kao što su glifosat, glufozinat, ili ALS inhibitori. Tolerancija na glifosat ili ALS-inhibitor herbicid je poželjna. Specifični primer izvođenja rezistencije na glifosat objavljen je u US 7,335,816 B2. Takva rezistencija na glifosat je, na primer, dostupna iz semenskog materijala koji se čuva u NCIMB, Aberdin (Škotska, Velika Britanija), pod pristupnim brojem NCIMB 41158 ili NCIMB 41159. Takva semena se mogu upotrebljavati kako bi se dobila biljka šećerne repe koja je tolerantna na glifosat. Rezistencija na glifosat se takođe može introdukovati u druge vrste roda Beta putem ukrštanja.

[0370] Objava stoga obuhvata i biljke, njihove ćelije, ili semena ili semenski materijal, okarakterisane time što sadrže molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, i štaviše time što se DNK fragment genomske DNK biljke, njenih delova, ili semena može amplifikovati putem lančane reakcije polimeraze sa prvim i drugim prajmerom.

[0371] [0153] Specifičan primer izvođenja rezistencije na ALS-inhibitor herbicid objavljen je u dokumentu, WO 2012/049268 A1. Na primer, takva rezistencija na ALS-inhibitor herbicid dostupna je iz depozita NCIMB, Aberdin, Velika Britanija, pod brojem NCIMB 41705. Štaviše, takva rezistencija na ALS-inhibitor može se proizvesti putem tilling postupka ili mutageneze usmerene na mesto, npr. putem editovanja gena, kao što je putem upotrebe CRISPR/Cas. Pronalazak stoga takođe obuhvata biljke, njihove ćelije, ili semena ili semenski materijal, okarakterisane time što sadrže molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom, i štaviše time što pokazuju mutaciju u endogenom genu acetolaktat sintaze, pri čemu gen acetolaktat sintaze kodira protein acetolaktat sintazu koji, kao rezultat mutacije na poziciji 569, ima drugačiju aminokiselinu nego što je triptofan. Kao rezultat mutacije, aminokiselina na poziciji 569 poželjno je alanin, glicin, izoleucin, leucin, metionin, fenilalanin, prolin, valin, ili arginin. Štaviše, mutacija može biti prisutna i heterozigotno i homozigotno u biljkama, njihovim ćelijama ili semenima, ili u semenskom materijalu. Preporučujemo homozigotno prisustvo mutacije, pošto to promoviše stabilniju ili intenzivniju fenotipsku pojavu rezistencije.

[0372] Brojni dodatni herbicidi i njihova primena poznati su osobi sa iskustvom u struci iz stanja tehnike. On može da pribegne stanju tehnike kako bi stekao znanje o tome koji genetički elementi treba da se upotrebljavaju na koji način kako bi se kod biljaka implementirala odgovarajuća tolerancija.

[0373] Još jedan primer agronomski povoljnog svojstva je dodatna rezistencija na patogene, pri čemu patogeni mogu biti insekti, virusi, nematode, bakterije, ili gljivice, na primer. Na primer, široka odbrana biljke od patogena može se postići putem kombinacije različitih rezistencija/tolerancija na patogene, pošto genetički elementi mogu pokazivati aditivne efekte jedni prema drugima. Na primer, brojni geni rezistencije za ovo poznati su osobi sa iskustvom u struci kao genetički elementi. Na primer, US 2016/0152999 A1 objavljuje RZ gen rezistencije prema bolesti rizomanija. Ovu bolest uzrokuje patogen „Virus nekrotičnog žutila nerava repe“. Nekoliko rezistencija na bolesti koje su sadržane u jednoj biljci imaju sinergističke efekte jedna na drugu. Ukoliko je biljka prvi put zaražena patogenom, njen imunski sistem je normalno oslabljen, a epidermis kao spoljna barijera je često oštećen, tako da se povećava verovatnoća dodatnih infekcija. Dodatni primer agronomski povoljnog svojstva je tolerancija na hladnoću ili tolerancija na mraz. Biljke koje pokazuju ovo svojstvo mogu već biti posejane ranije u godini, ili mogu ostati na polju duže, što može dovesti do povećanja prinosa, na primer. Ovde takođe osoba sa iskustvom u struci može pribeći stanju tehnike kako bi pronašla pogodne genetičke elemente. Dodatni primeri agronomski povoljnih svojstava su efikasnost korišćenja vode, efikasnost korišćenja azota, i prinos. Genetički elementi koji se mogu upotrebljavati za davanje takvih svojstava mogu se naći u stanju tehnike.

[0374] Štaviše, osobi sa iskustvom u struci poznate su brojne modifikacije za odbranu od patogena. Pored porodica R-gena koje se često opisuju, mogu se povoljno upotrebljavati

[0377] 1

[0378] Avr/R pristup, komplementacija Avr gena (WO 2013/127379), autoaktivacija R-gena (WO 2006/128444), ili HIGS (utišavanje gena indukovano od strane domaćina) pristup (npr. WO 2013/050024). Posebno, autoaktivacija R-gena može biti važna za predmetni pronalazak. Za ovo, treba stvoriti nukleinsku kiselinu koja kodira autoaktivirani protein rezistencije za generisanje rezistencije na patogene kod biljaka. Ova nukleinska kiselina zatim ima samo ograničen deo NBS-LRR gena rezistencije, kao što je wb-R-gen, koji se proteže nizvodno od 5' kraja kodirajućeg regiona NBS-LRR gena rezistencije do početka kodiranja za NBS domen NBS-LRR gena rezistencije.

[0379] U ovom kontekstu, ovde je takođe objavljen postupak koji sadrži korak uklanjanja tog regiona nukleinske kiseline koji je u skladu sa pronalaskom koji kodira N-terminusni region i koji počinje sa p-petljom u NBS domenu, i proteže se do kraja N-terminusnog regiona.

[0380] Proteini rezistencije koje kodiraju takve skraćene nukleinske kiseline su generalno autoaktivirani, tako da ovi proteini rezistencije pokreću imunsku reakciju kod biljke, čak i u odsustvu povezanog patogena, i stoga povećavaju bazalni imunitet biljke. Štaviše, objavljena je takva skraćena nukleinska kiselina koja je u skladu sa pronalaskom, i polipeptid koji je njome kodiran.

[0381] Štaviše, objava takođe uključuje upotrebu alela gena koji daje rezistenciju na Heterodera, koji je identifikovan postupkom koji je prethodno opisan, za kombinaciju sa jednom od prethodnih modifikacija, ili sa genetičkim elementom koji je opisan u prethodnom tekstu koji može preneti kod biljke jedno ili više agronomski povoljnih svojstava.

[0382] Pored biljke, predmetna objava se takođe odnosi na semena ili potomstvo, ili na organ, deo biljke, tkivo, ili njenu ćeliju u proizvodnji proizvoda koji se tipično proizvode od održivih sirovina, kao što su prehrambeni proizvodi i hrana za životinje - poželjno, šećer ili sirup (melasa), pri čemu se melasa takođe upotrebljava za industrijske primene, npr. u proizvodnji alkohola ili kao medijum za rast za proizvodnju biotehnoloških proizvoda, u proizvodnji materijala ili supstanci za hemijsku industriju, npr. rafinisanih hemikalija, farmaceutskih proizvoda ili njihovih prekursora, dijagnostike, kozmetike, bioetanola, ili biogasa. Primer upotrebe šećerne repe kao biogene sirovine u postrojenjima za biogas opisan je u prijavi DE 10 2012 022 178 A1; videti, na primer, paragraf 10.

[0383] Sledeći primeri objašnjavaju pronalazak. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, upotrebljavani su standardni postupci molekularne biologije; videti, na primer, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001, Fritsch et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989; Mayer et al., Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, eds., Academic Press,

[0386] 2

[0387] London, 1987, i Weir et al., Handbook of Experimental Immunology, sveske I-IV, Blackwell, eds., 1986.

[0388] Neke od najvažnijih sekvenci koje su u skladu sa pronalaskom detaljno su objašnjene u nastavku:

[0390] - SEQ ID NO 1: genomska DNK sekvenca LLR2 gena koji daje rezistenciju na Heterodera iz Beta vulgaris subsp. maritima.

[0391] - SEQ ID NO 2: cDNA sekvenca LLR2 gena koji daje rezistenciju na Heterodera kao što se ne javlja u prirodi.

[0392] - SEQ ID NO 3: aminokiselinska sekvenca LLR2 proteina koji daje rezistenciju na Heterodera kao što je kodiran od strane SEQ ID NO 1 ili SEQ ID NO 2.

[0393] - SEQ ID NO 4: genomska DNK sekvenca LLR1 gena koji daje rezistenciju na Heterodera iz Beta vulgaris subsp. maritima.

[0394] - SEQ ID NO 5: cDNA sekvenca LLR1 gena koji daje rezistenciju na Heterodera kao što se ne javlja u prirodi.

[0395] - SEQ ID NO 6: aminokiselinska sekvenca LLR1 proteina koji daje rezistenciju na Heterodera kodiran od strane SEQ ID NO 4 ili SEQ ID NO 5.

[0396] - SEQ ID NO 7: genomska DNK sekvenca LLR3 gena koji daje rezistenciju na Heterodera iz Beta vulgaris subsp. maritima.

[0397] - SEQ ID NO 8: cDNA sekvenca LLR3 gena koji daje rezistenciju na Heterodera kao što se ne javlja u prirodi.

[0398] - SEQ ID NO 9: aminokiselinska sekvenca LLR3 proteina koji daje rezistenciju na Heterodera kao što je kodiran od strane SEQ ID NO 7 ili SEQ ID NO 8.

[0399] - SEQ ID NO 10: molekularni marker s5e3001s02

[0400] - SEQ ID NO 11: molekularni marker s5e4668xxx

[0402] PRIMERI

[0404] Primer 1: Sprovođenje testa na nematode

[0406]

[0408] 1) Biljke koje su u skladu sa pronalaskom posejane su u tresetni supstrat za staklenike.

[0409] 2) Biljke su presađene posle nicanja u fazi kotiledona u plastične saksije od oko 30 ml (oko 2*1*15 cm) napunjene kvarcnim peskom kao pojedinačne biljke (jedna biljka/saksiji). Alternativno, biljčice iz kulture tkiva mogu se direktno preneti u plastične saksije. Uslovi temperature i svetlosti: 16/8 sati svetlosti/mraka sa promenom temperature 23 °C/12 °C.

[0410] 3) Nedelju dana posle presađivanja, zaraza je simulirana primenom 600 larvi Heterodera schachtii.

[0411] 4) Procena biljaka i broja cista obavljena je 4 nedelje posle infekcije pod binokularom.

[0413] Primer 2: Asembliranje gena

[0415] Lokus rezistencije je lociran na hromozomu 5 i ciljni region je redukovan u nekoliko koraka mapiranja na omeđavajuće markere s5e5864s01 (Integrisana genetička mapa: 9,17 cM) i s5e4503s02 (9,74 cM) koji obuhvataju fizičku udaljenost od 119341 bp u referentnoj fizičkoj mapi (ZR_BPMv7 - referentna sekvenca osetljiva na monogermiju). U BAC pregledu rezistentne donorske linije, identifikovana su 3 BAC klona za ciljni genomski region. BAC klonovi su sekvencirani upotrebom PacBio postupka (Fichot, Erin B., and R. Sean Norman. "Microbial phylogenetic profiling with the Pacific Biosciences seqvencing platform." Microbiome 1.1 (2013): 10). Ovaj postupak omogućava proizvodnju dužih neprekinutih sekvenci kontiga i time olakšava naknadno asembliranje kontiga koje su generisane iz genomskih područja koja sadrže ponavljajuće sekvence. Asemblirana je sekvenca rezistencije bez praznina, što je omogućilo poređenje sekvenci između rezistentnog i osetljivog referentnog genotipa i razvoj novih markera u ciljnom regionu. U novom koraku finog mapiranja upotrebom dostupnih rekombinanata, ciljni region je redukovan na dva nova omeđavajuća markera koji obuhvataju deo sekvence od 26484 bp u rezistentnom i 39587 bp u osetljivom genotipu. Redukovani ciljni region sadrži samo 9 anotiranih gena. Među ovim genima, 3 tandemski ponovljena LRR gena identifikovana su kao potencijalni uzročni kandidat geni za rezistenciju na NRBMH (LRR1, LRR2 i LRR3 (Slika 1)). Ciljni region pokazuje visok stepen složenosti: a) sekvenca rezistencije sadrži veliku duplikaciju sekvence; b) LRR geni pokazuju sličnost sekvenci; c) kod osetljivih genotipova nekoliko retrotranspozona je ugrađeno u ciljni region. Zbog složenosti sekvence, asembliranje RR i ss sekvenci bila je visoko zahtevna i veoma složena procedura.

[0416] Unutar redukovanog ciljanog regiona, detektovano je 5 rekombinacija i fenotipizirano je 180 potomaka ovih rekombinanata. Fenotipovi su određeni intenzivnim statističkim

[0419] 4

[0420] metodama (t-test, analiza snage). Od ovih 5 rekombinanata, uzorak od 10 biljaka po identifikatoru analiziran je sa specifičnim dominantnim markerima koji su razvijeni za 3 LRR gena. Bilo je moguće testirati funkcionalnost 3 LRR gena. Kao primer rezultata, LRR1 gen ni u jednom od rekombinanata ne pokazuje suprotstavljene podatke, tj. svi rekombinanti koji nose LRR1 gen su rezistentni.

[0421] Proces „kloniranja na osnovu mape“ obuhvatao je sledeće korake: fino genetičko mapiranje, fizičko mapiranje, analizu sekvenci WHG (celi genom), konstruisanje nekoliko velikih segregirajućih populacija, rekombinantni pregled, razvoj markera u ciljnom regionu, uporedno sekvenciranje BAC u rezistentnom genotipu, analizu sekvenci rezistentnog i osetljivog genotipa, bioinformatičke analize, predviđanje proteina, poređenje proteina. Sledeći koraci bili su ključni za ovaj pronalazak: fino mapiranje zajedno sa intenzivnom fenotipizacijom, identifikacija i sekvenciranje rezistentnih BAC klonova, razvoj dominantnih markera za 3 LRR gena, analiza sekvenci i poređenje sekvenci i proteina između RR (rezistentnih) i ss (podložnih) genotipova.

[0423] Primer 3: Introdukcija gena koji daje rezistenciju kao transgena pomoću transformacije gena u Beta vulgaris subsp. vulgaris

[0425] Transgeni pristup proizvodnji Heterodera-rezistentnih biljaka služio je ne samo za alternativnu validaciju LRR gena kao gena koji daje(u) rezistenciju, već i kao način proizvodnje transgenih događaja rezistencije koji daju novu rezistenciju na Heterodera ili poboljšavaju već postojeću rezistenciju na Heterodera.

[0426] LRR gen od interesa kloniran je u binarni vektor pZFN-nptII (Slika 2) pomoću sledećih standardnih procedura kloniranja: Unutar T-DNA ovog vektora, cDNA gena rezistencije je klonirana između dupliciranog CaMV 35S promotora i terminatora nopalin sintaze (NOS), kako bi se osigurao visok, konstitutivni nivo ekspresije gena rezistencije u transgenoj biljci. T-DNA takođe uključuje gen neomicin fosfotransferaze II (nptII), koji daje rezistenciju na niz aminoglikozidnih antibiotika kao što su kanamicin ili paromomicin. Ove rezistencije na antibiotike upotrebljene su za selekciju transgenih biljnih ćelija i tkiva. NOS promotor i pAG7 terminator omeđavaju nptII gen. Okosnica binarnog vektora takođe sadrži colE1 i pVS1 oridžin za replikaciju plazmida u Escherichia coli ili Agrobacterium tumefaciens. aadA gen daje rezistenciju na streptomicin/spektinomicin za selekciju bakterija. pZFN-nptII-LRR plazmid je transformisan u soj agrobakterije AGL‑1 pomoću standardne procedure.

[0427] Transformacija šećerne repe obavila se u skladu sa Lindzi i Galoa (Lindsey & Gallois 1990), „Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterium tumefaciens.“ Journal of experimental botany 41.5, 529‑536.). Za ovo su kao početni materijal upotrebljeni „mikropropagirani izdanci“ genotipa 04E05B1DH5, koji nosi isključivo osetljive alele identifikovanog gena. Izdanci su umnoženi u odgovarajućem medijumu u skladu sa Lindzi i Galoa (1990). Kako bi se indukovao što veći broj meristema, „izdanci“ su prebačeni u drugi medijum (videti Lindzi i Galoa (1990)) i inkubirani u mraku tokom nekoliko nedelja na približno 30 °C. Soj Agrobacterium AGL‑1 sa vektorom pZFN-nptII-LRR kultivisan je u dodatnom medijumu (videti Lindzi i Galoa (1990)), dodatno obezbeđenim sa odgovarajućim antibioticima za selekciju. Preseci meristemskog tkiva zasnovani na izdanku koji treba tretirati inkubirani su sa agrobakterijom tokom nekoliko sati u dodatnom medijumu (videti Lindzi i Galoa (1990)). Biljni eksplantati i agrobakterije su kokultivisani u mraku tokom najmanje 2 dana u medijumu (videti Lindzi i Galoa (1990)), a inokulisani eksplantati su potom inkubirani u mraku tokom približno 2 nedelje u dodatnom medijumu (videti Lindzi i Galoa (1990)). Eksplantati su potom dodatno propagirani u dodatnom medijumu (videti Lindzi i Galoa (1990)) i subkultivisani, kako bi se omogućila selekcija transgenog tkiva. Materijal lista je zatim ekstrahovan iz zelenih, rastućih „izdanaka“ i ispitan pomoću PCR na prisustvo transgena. Pogodni „izdanci“ su ožiljeni i potom preneti u staklenik za proizvodnju T1 semenskog materijala. Rezistencija na Heterodera kod T1 biljaka može se zatim testirati pomoću protokola koji je opisan u Primeru 1.

Claims

1. Patentni zahtevi

1. Molekul nukleinske kiseline za povećanje rezistencije prema nematodi roda Heterodera kod biljke Beta vulgaris u kojoj se molekul nukleinske kiseline eksprimira, naznačeno time što je molekul nukleinske kiseline odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) nukleotidne sekvence koja sadrži sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 1, 4 i 7;

(b) nukleotidne sekvence koja sadrži kodirajuću sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 2, 5 i 8;

(c) nukleotidne sekvence koja hibridizuje sa komplementarnom sekvencom nukleotidne sekvence koja je u skladu sa (a), (b), (f) ili (g) pod strogim uslovima; (d) nukleotidne sekvence koja sadrži sekvencu koja je najmanje 90% identična sekvenci nukleotidne sekvence bilo koje od (a) ili (b);

(e) nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 3, 6 i 9;

(f) nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 94% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 3, 6 i 9;

(g) nukleotidne sekvence koja je varijanta DNK sekvence bilo koje od (a) do (f) usled degeneracije genetičkog koda,

pri čemu su strogi uslovi definisani kao hibridizacija u 4 x SSC na 65 °C, i naknadno ponovljeno ispiranje u 0,1 x SSC na 65 °C tokom približno 1 sata ukupno.

2. Polipeptid naznačen time što je kodiran molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa patentnim zahtevom 1.

3. Vektor ili ekspresiona kaseta naznačeni time što sadrže molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa patentnim zahtevom 1.

4. Ćelija naznačena time što sadrži molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa patentnim zahtevom 1 kao transgen, ili vektor ili ekspresionu kasetu koji su u skladu sa patentnim zahtevom 3.

5. Seme biljke Beta vulgaris, naznačeno time što biljka nije B. vulgaris subsp. maritima, pri čemu seme sadrži molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa patentnim zahtevom 1, pri čemu seme nije isključivo dobijeno putem suštinski biološkog postupka.

6. Seme biljke Beta vulgaris koje je u skladu sa patentnim zahtevom 5, naznačeno time što je seme tehnički tretirano, pri čemu je tehnički tretman odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) Poliranja

(b) Presvlačenja poželjno peletiranja

(c) Inkrustacije

(d) Bojenja.

7. Postupak za povećanje rezistencije na nematodu roda Heterodera kod biljke Beta vulgaris, naznačen time što uključuje sledeće korake:

(i) integracije molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa patentnim zahtevom 1 pomoću homologijom usmerene popravke u genom najmanje jedne ćelije biljke, i regeneracije biljke iz biljne ćelije; ili

(ii) povećanja ekspresije molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa patentnim zahtevom 1 u biljci modifikacijom nativnog promotora ili fuzijom molekula nukleinske kiseline sa heterologim promotorom koji pokazuje veću aktivnost u poređenju sa nativnim promotorom; ili

(iii) transformacije biljne ćelije sa molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili vektorom ili ekspresionom kasetom koji su u skladu sa patentnim zahtevom 3, i regeneracije transgene biljke iz transformisane biljne ćelije.

8. Postupak za povećanje rezistencije na nematodu roda Heterodera kod biljke Beta vulgaris koji je u skladu sa patentnim zahtevom 7, naznačen time što je homologijom usmerena popravka promovisana pomoću nukleaze usmerene na mesto.

9. Postupak za proizvodnju biljke Beta vulgaris koja ima rezistenciju prema nematodi roda Heterodera, naznačen time što uključuje sledeće korake:

(a) transformacije biljne ćelije sa molekulom nukleinske kiseline koji je u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili vektorom ili ekspresionom kasetom koji su u skladu sa patentnim zahtevom 3; i

(b) regeneracije transgene biljke iz transformisane biljne ćelije; ili

(i) introdukcije nukleaze usmerene na mesto i matriksa za popravku u ćeliju biljke, pri čemu je nukleaza usmerena na mesto sposobna da generiše najmanje jedan jednolančani prekid ili najmanje jedan dvolančani prekid DNK u genomu ćelije uzvodno i/ili nizvodno od ciljnog regiona i matriks za popravku sadrži molekul nukleinske kiseline koji je u skladu sa patentnim zahtevom 1;

(ii) kultivacije ćelije iz (i) pod uslovima koji omogućavaju homologijom usmerenu popravku ili homologu rekombinaciju, pri čemu se molekul nukleinske kiseline integriše iz matriksa za popravku u genom biljke; i (iii) regeneracije biljke iz ćelije modifikovane u (ii).

10. Postupak koji je u skladu sa patentnim zahtevom 9, naznačen time što ciljni region

a) je lociran između markera koji je u skladu sa SEQ ID NO: 10 i markera koji je u skladu sa SEQ ID NO: 11, ili

b) je omeđen markerom koji je u skladu sa SEQ ID NO: 10 i markerom koji je u skladu sa SEQ ID NO: 11, ili

c) sadrži hromozomski interval između markera koji je u skladu sa SEQ ID NO: 10 i markera koji je u skladu sa SEQ ID NO: 11.

11. Postupak koji je u skladu sa patentnim zahtevom 9 ili 10, naznačen time što se najmanje jedan jednolančani prekid ili najmanje jedan dvolančani prekid dešava na poziciji koja je najviše 10.000 baznih parova uzvodno i/ili nizvodno od ciljnog regiona.

12. Postupak za identifikovanje, i selektovanje, biljke Beta vulgaris koja je rezistentna prema nematodi roda Heterodera, naznačeno time što postupak uključuje najmanje korak (i) ili (ii):

(i) detekcije prisustva i/ili ekspresije molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili prisustva polipeptida koji je u skladu sa patentnim zahtevom 2, u biljci Beta vulgaris ili delu biljke Beta vulgaris; i/ili

(ii) detekcije najmanje jednog regiona koji je lociran između markera koji je u skladu sa SEQ ID NO 10 i markera koji je u skladu sa SEQ ID NO 11, omeđen je markerom koji je u skladu sa SEQ ID NO 10 i markerom koji je u skladu sa SEQ ID NO 11, ili sadrži hromozomski interval između markera koji je u skladu sa SEQ ID NO 10 i markera koji je u skladu sa SEQ ID NO 11, koji kosegregira sa nukleotidnom sekvencom molekula nukleinske kiseline koji je u skladu sa patentnim zahtevom 1; i

(iii) selekcije biljke Beta vulgaris koja ima rezistenciju prema nematodi roda Heterodera,

pri čemu je marker koji je u skladu sa SEQ ID NO 10 polimorfizam pojedinačnog nukleotida (SNP) na poziciji 56940072 bp hromozoma 5 koji se odnosi na genotip EL10 Beta vulgaris, pri čemu je navedeni nukleotid T, i marker koji je u skladu sa SEQ ID NO 11 je polimorfizam pojedinačnog nukleotida (SNP) na poziciji 57809807 bp hromozoma 5 koji se odnosi na genotip EL10 Beta vulgaris, pri čemu je navedeni nukleotid T.

13. Upotreba oligonukleotidnog prajmera dužine od najmanje 20 nukleotida, naznačeno time što oligonukleotid specifično hibridizuje kao proba sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od

(i) nukleotidne sekvence koja sadrži sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO 1, 4 i 7;

(ii) nukleotidne sekvence koja sadrži kodirajuću sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO 2, 5 i 8;

(iii) nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO 3, 6 i 9,

za amplifikaciju regiona specifičnog za molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1 u lančanoj reakciji polimeraze.

1