ES3049282T3 - Predicting cell culture performance in bioreactors - Google Patents

Predicting cell culture performance in bioreactors

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Abstract

Un método computacional para modelar un biorreactor combina modelos mecanísticos de la cinética de los flujos metabólicos y análisis del balance de flujo para predecir el rendimiento del cultivo celular. Los modelos mecanísticos incluyen los efectos de las variables de proceso que describen el entorno extracelular, como la temperatura, la acidez, la osmolaridad o las concentraciones de metabolitos. El método limita las tasas de flujo basándose en los modelos mecanísticos y las calcula considerando objetivos metabólicos adecuados. El método simula la evolución temporal de las variables de proceso del biorreactor basándose en la información del usuario y calcula métricas de rendimiento para mostrarlas al usuario, controlar el biorreactor o entrenar un modelo de inteligencia artificial del mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Predicción del rendimiento del cultivo celular en biorreactores
[0005] CAMPO DE DIVULGACIÓN
[0007] Esta divulgación se refiere generalmente a métodos de modelado informático de biorreactores y los procesos biológicos asociados con el fin de mejorar el diseño y/u operación de bioprocesos.
[0009] ANTECEDENTES
[0011] La biotecnología usa células vivas para producir compuestos bioquímicos valiosos. Se pueden modificar diferentes células para producir una amplia variedad de productos bioquímicos diana para usos medicinales, agrícolas u otros usos. Los profesionales construyen y usan biorreactores para cultivar cultivos celulares que producen productos diana junto con otros subproductos metabólicos. Maximizar el volumen y la calidad del producto objetivo para un determinado coste de producción es uno de los principales objetivos del diseño de biorreactores.
[0013] Un biorreactor puede configurarse y controlarse para operar en una variedad de modos y con diferentes objetivos. El primer objetivo del proceso puede ser cultivar una cantidad suficiente de cultivo celular sin usar más de la cantidad necesaria de nutrientes del sustrato. El tipo de biomasa celular cultivada en el biorreactor puede depender de una aplicación, con algunos biocultivos populares, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), que se usan para una serie de aplicaciones diferentes. En un modo de funcionamiento de un biorreactor, denominado modo discontinuo, el crecimiento de un biocultivo puede tener lugar sin que fluya ningún líquido hacia o fuera del reactor, particularmente si el sistema de control del biorreactor puede mantener buenas condiciones para el crecimiento. Las buenas condiciones para el crecimiento pueden requerir temperatura, acidez y concentraciones adecuadas de metabolitos de sustrato. A medida que la biomasa en crecimiento consume metabolitos de sustrato, un flujo de entrada puede ayudar a reponer los metabolitos necesarios para el crecimiento, formando una configuración discontinua alimentada de un biorreactor. Los subproductos metabólicos producidos durante el crecimiento pueden comprometer la optimización de las condiciones de crecimiento. La adición de corrientes de flujo de entrada y salida, formando una configuración continua de biorreactor, puede aliviar los efectos negativos de los subproductos metabólicos, así como ofrecer más control sobre la duración de la etapa de crecimiento celular. Se puede añadir un filtro a la corriente de salida para evitar la eliminación de la biomasa celular, formando una configuración de perfusión del biorreactor.
[0015] Una vez que se produce una cantidad suficiente de biomasa en el biorreactor, la siguiente etapa de operación puede priorizar la generación y recogida de un producto metabólico diana. Dichos productos diana pueden incluir anticuerpos terapéuticos u otros productos biológicos. Inducir a las células a desplazar la energía metabólica del cultivo de la biomasa a la producción del producto diana a menudo implica introducir un factor de estrés. El estrés puede comprender una reducción en la temperatura óptima del hospedador, haciendo que las células gasten más energía en el metabolismo sin crecimiento que, a su vez, puede dar como resultado un aumento de la producción diana.
[0017] La optimización de todas las etapas de las operaciones del biorreactor plantea un reto significativo. Las muchas decisiones pueden incluir cuándo pasar del crecimiento a la producción, cuándo empezar a cosechar, cuándo y en qué cantidades suministrar y eliminar metabolitos, cómo controlar el entorno del biorreactor. A menudo, se realizan muchos experimentosin vivocaros y que consumen mucho tiempo para seleccionar las condiciones de funcionamiento. Los métodos alternativos para optimizar y controlar las operaciones con biorreactores aportarían considerables beneficios a la industria y al público al que presta servicios.
[0019] SUMARIO
[0021] Se usa un método computacional para modelar un biorreactor que da cuenta de la falta de homogeneidad espacial para predecir el rendimiento del cultivo celular, para mejorar y/u optimizar el diseño y/u operación del biorreactor. En un aspecto, el método comprende recibir una pluralidad de valores actuales de variables de proceso, describiendo las variables de proceso el primer contenido virtual de una primera parte del biorreactor modelado y uno o más contenidos virtuales adicionales de una o más partes adicionales correspondientes del biorreactor modelado, e incluyendo los contenidos virtuales la biomasa celular virtual en una disolución extracelular virtual. El método también comprende calcular, mediante el procesamiento de hardware de un sistema informático, nuevos valores de las variables de proceso durante un período de tiempo simulado. El método calcula los nuevos valores al menos en parte mediante: la generación de una pluralidad de restricciones en las tasas de flujo de flujos metabólicos que describen la biomasa celular virtual modelando uno o más efectos de al menos algunos de los valores actuales de las variables de proceso sobre la cinética de reacción metabólica; el cálculo de las tasas de flujo de los flujos metabólicos realizando un análisis de balance de flujo sujeto a un objetivo metabólico y la pluralidad generada de las restricciones sobre las tasas de flujo; el cálculo de las tasas de cambio de al menos algunas de las variables de proceso basándose al menos en parte en las tasas de flujo calculadas; y la actualización de uno o más de los valores actuales de las variables de proceso al menos en parte integrando una o más de las tasas de cambio calculadas para una etapa de tiempo virtual dentro del periodo de tiempo simulado. El método comprende además el cálculo, mediante el hardware de procesamiento, de una métrica del biorreactor modelado computacionalmente basada en los nuevos valores calculados de las variables de proceso, y la generación, mediante el hardware de procesamiento, y basándose en la métrica del biorreactor modelado, de uno o más de: i) información mostrada a un usuario a través de una interfaz de usuario, ii) un ajuste de control para un biorreactor del mundo real, o iii) un conjunto de entrenamiento para un modelo de inteligencia artificial de un biorreactor. Para cualquier método descrito en el presente documento, el método puede comprender además opcionalmente cultivar células de mamífero en un biorreactor usando uno o más parámetros identificados en el biorreactor modelado. A modo de ejemplo, las células de mamífero pueden codificar una proteína terapéutica y pueden producir la proteína terapéutica cuando se cultivan en el biorreactor. Los ejemplos de células de mamífero incluyen células CHO y células BHK. Por concisión, un "biorreactor" también puede denominarse en el presente documento un "reactor" y a menos que se indique explícitamente lo contrario, se entenderá que estos términos son intercambiables en el presente documento.
[0023] En otro aspecto, el medio legible por ordenador no transitorio almacena instrucciones para modelar computacionalmente un biorreactor, en donde las instrucciones, cuando son ejecutadas por uno o más procesadores, hacen que el uno o más procesadores reciban una pluralidad de valores actuales de variables de proceso, describiendo las variables de proceso contenidos virtuales del biorreactor modelado e incluyendo los contenidos virtuales biomasa celular virtual en una disolución extracelular virtual. Las instrucciones también hacen que el uno o más procesadores calculen, mediante el hardware de procesamiento de un sistema informático, nuevos valores de las variables de proceso durante un período de tiempo simulado. El uno o más procesadores calcula los nuevos valores al menos en parte mediante: la generación de una pluralidad de restricciones en las tasas de flujo de flujos metabólicos que describen la biomasa celular virtual modelando uno o más efectos de al menos algunos de los valores actuales de las variables de proceso sobre la cinética de reacción metabólica; el cálculo de las tasas de flujo de los flujos metabólicos realizando un análisis de balance de flujo sujeto a un objetivo metabólico y la pluralidad generada de las restricciones sobre las tasas de flujo; el cálculo de las tasas de cambio de al menos algunas de las variables de proceso basándose al menos en parte en las tasas de flujo calculadas; y la actualización de uno o más de los valores actuales de las variables de proceso al menos en parte integrando una o más de las tasas de cambio calculadas para una etapa de tiempo virtual dentro del periodo de tiempo simulado. Las instrucciones también hacen que el uno o más procesadores calculen, mediante el hardware de procesamiento, una métrica del biorreactor modelado basada en los nuevos valores calculados de las variables de proceso, y generen, mediante el hardware de procesamiento, y basándose en la métrica del biorreactor modelado, una o más de: i) información mostrada a un usuario a través de una interfaz de usuario, ii) un ajuste de control para un biorreactor del mundo real, o iii) un conjunto de entrenamiento para un modelo de inteligencia artificial de un biorreactor.
[0025] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0027] La Figura 1 ilustra un proceso a modo de ejemplo para modelar computacionalmente un biorreactor y un modelo computacional correspondiente.
[0028] La Figura 2 es un gráfico que representa un efecto a modo de ejemplo de un desplazamiento de temperatura sobre una variable de estrés en una implementación del proceso de modelado de la Figura 1.
[0029] La Figura 3 ilustra un sistema informático a modo de ejemplo que puede implementar el proceso de modelado de la Figura 1.
[0030] Las Figuras 4A y 4B ilustran paneles de una interfaz de usuario a modo de ejemplo para recibir entradas de usuario. La Figura 5 ilustra una interfaz de usuario a modo de ejemplo para mostrar salidas a un usuario.
[0031] La Figura 6 muestra un sistema de control de biorreactor a modo de ejemplo.
[0032] La Figura 7 es un diagrama de flujo que representa un método a modo de ejemplo de modelado computacional de un biorreactor.
[0033] La Figura 8 ilustra una comparación entre un modelo de biorreactor y observaciones experimentales.
[0034] Las Figuras 9A y 9B ilustran una relación entre un modelo metabólico de un biorreactor no homogéneo modelado con porciones homogéneas y un campo de velocidad que se puede calcular usando dinámica de fluidos computacional (CFD).
[0036] DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0038] Gran parte de la descripción en el presente documento se centra en un modelo metabólico (biológico y bioquímico) de un biorreactor configurado, por ejemplo, para producir un determinado producto biológico. Aunque la descripción trata principalmente a un biorreactor como una mezcla homogénea de disolución extracelular y una biomasa celular, el modelo metabólico puede adaptarse fácilmente para tener en cuenta la falta de homogeneidad espacial en un biorreactor. Para ello, el modelo metabólico puede integrarse de manera informática con un modelo computacional de física del transporte. Por lo tanto, ciertas partes de esta descripción describen la integración del modelo, lo que demuestra la aplicabilidad general del modelo metabólico a biorreactores que no necesitan mezclarse bien.
[0040] La Figura 1 ilustra un proceso 100 a modo de ejemplo para modelar computacionalmente un biorreactor en una serie de etapas de tiempo, incluyendo una etapa de tiempo 102 representado, con un modelo computacional 104 correspondiente representado en un espacio virtual 110. Se entiende que la etapa de tiempo 102 puede repetirse cualquier número adecuado de veces durante el proceso de modelado 100. Los contenidos virtuales de un biorreactor modelado 120 pueden incluir una disolución extracelular virtual 124 y biomasa celular virtual 130 dispuesta dentro de la disolución extracelular virtual 124. Por conveniencia, el biorreactor modelado 120 puede denominarse en el presente documento un "biorreactor", la disolución extracelular virtual 124 puede denominarse en el presente documento "disolución extracelular" (o, simplemente, "disolución") y la biomasa celular virtual 130 puede denominarse en el presente documento "biomasa celular" (o, simplemente, "biomasa"). Una colección de flujos 132a-i puede representar al menos en parte el estado de la biomasa 130. Una corriente de entrada 140 virtual y una corriente de salida 142 virtual pueden, respectivamente, reponer y agotar los contenidos virtuales del biorreactor 120 modelado. Un filtro virtual 144 puede facilitar, permitir, restringir o prevenir selectivamente los flujos de algunos contenidos fuera del biorreactor 120 modelado. Por ejemplo, para modelar un biorreactor en modo de operación de perfusión, el filtro 144 puede permitir el flujo de la disolución extracelular 124, al tiempo que restringe o previene el flujo de la biomasa celular 130. Por el contrario, excluir o poner a cero las corrientes virtuales de entrada y salida 140, 142 modela un biorreactor en modo de operación por lotes. En general, el cambio del flujo y/o las composiciones de las corrientes virtuales de entrada y salida 140, 142 puede permitir modelar configuraciones o modos de operación por lotes, por lotes alimentados, continuos y/o de perfusión del biorreactor 120.
[0042] En algunas implementaciones, el proceso de modelado 100 puede configurarse para modelar la heterogeneidad espacial de un biorreactor. La heterogeneidad espacial puede referirse, por ejemplo, a variaciones espaciales en la composición de la disolución extracelular, concentración o composición de biomasa celular, o en otros parámetros del proceso (por ejemplo, temperatura) en diferentes ubicaciones dentro de un biorreactor. En un biorreactor bien mezclado, dichas diferencias pueden ser pequeñas y un modelo homogéneo puede simular un biorreactor bien mezclado con suficiente precisión. En el modelado de biorreactores menos bien mezclados, por otro lado, la consideración computacional de la falta de homogeneidad espacial puede mejorar sustancialmente la precisión del modelo. Para ello, el modelo metabólico descrito aquí puede acoplarse con modelos físicos de transporte de masa y calor dentro de un reactor. En algunas implementaciones, los modelos de dinámica de fluidos computacional (CFD) pueden cooperar con el modelo metabólico tal como se analiza en el presente documento. En general, el modelado de la falta de homogeneidad puede realizarse en vista de una compensación entre la precisión y la complejidad computacional.
[0044] Para modelar la falta de homogeneidad espacial usando el proceso de modelado 100, el biorreactor modelado/virtual 120 puede modelar una parte de un biorreactor no homogéneo. Por lo tanto, en el contexto de un modelo de biorreactor espacialmente no homogéneo, el biorreactor 120 puede considerarse una parte de un biorreactor no homogéneo. Es decir, el biorreactor no homogéneo modelado se puede dividir en partes de una cualquiera de varias maneras adecuadas, dependiendo, por ejemplo, del grado de falta de homogeneidad y del modelo físico acoplado. En algunas implementaciones, al menos 2, 5, 10, 20 u otro número adecuado de partes (incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados) de dimensiones variadas pueden representar diferentes regiones de un biorreactor (por ejemplo, entradas y salidas, parte central, etc.). En algunas implementaciones, el volumen del biorreactor se puede dividir en al menos 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 o cualquier otro número adecuado de partes (incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados) representados por elementos de volumen finito, que también pueden, por ejemplo, servir como elementos de volumen finito de un modelo CFD.
[0045] Se puede suponer que la parte modelada representada por el biorreactor 120 es sustancialmente homogénea. Por consiguiente, la disolución extracelular 124 puede modelar una parte de la disolución extracelular correspondiente a la porción modelada del reactor no homogéneo, y la biomasa 130 puede modelar una parte correspondiente de biomasa distribuida a lo largo del biorreactor no homogéneo. La corriente de entrada 140 puede modelar el transporte de masas (es decir, el flujo de disolución extracelular y biomasa) en la parte (modelada por el biorreactor 120) del biorreactor no homogéneo desde una o más partes vecinas del biorreactor no homogéneo. De manera análoga, la corriente de salida 142 puede modelar el transporte de masas (es decir, flujo de disolución extracelular y biomasa) fuera de la parte (representada por el biorreactor 120) del biorreactor no homogéneo a partes vecinas del biorreactor no homogéneo. De esta manera, se puede unir una colección de modelos de biorreactor homogéneos (representando cada uno una parte de un biorreactor no homogéneo) para modelar el biorreactor no homogéneo. Se pueden añadir corrientes de entrada y salida que reponen y agotan el biorreactor no homogéneo a las corrientes de entrada y salida 140, 142 de una parte del biorreactor no homogéneo con entradas o salidas al exterior del biorreactor no homogéneo. En tal caso, se puede pensar que al menos partes de las corrientes de entrada y salida 140, 142 tienen en cuenta las condiciones de límite de entrada y salida del modelo de biorreactor no homogéneo ensamblado a partir de modelos de biorreactor homogéneos.
[0047] Un modelo computacional (por ejemplo, CFD) puede configurarse para calcular corrientes de entrada y salida (por ejemplo, corrientes 140,142) de cada parte (por ejemplo, biorreactor 120) del modelo de biorreactor no homogéneo. En algunas implementaciones, cada parte del biorreactor no homogéneo modelado por el proceso 100 puede corresponder a un elemento de volumen finito del modelo CFD, tal como se ha analizado anteriormente. En general, sin embargo, la discretización espacial para el modelo CFD no tiene por qué ser la misma que la discretización espacial en partes del reactor para aplicar el proceso de modelado 100. Por ejemplo, el modelo<c>F<d>puede calcular un campo de velocidad dentro del biorreactor no homogéneo modelado a una resolución espacial. El campo de velocidad se puede combinar con la composición del biorreactor calculada por el modelo metabólico a una resolución espacial diferente para actualizar las corrientes de entrada y salida 140, 142 para cada una de las partes de biorreactor representadas por el modelo metabólico.
[0048] El cálculo de un campo de velocidad puede depender de la configuración física (por ejemplo, los mecanismos de mezcla) del biorreactor. En algunos biorreactores, la convección natural puede ser el mecanismo de mezcla dominante. Es decir, los gradientes de temperatura debidos a procesos metabólicos o el control de temperatura del reactor pueden impulsar la convección. En otras implementaciones, los fluidos inyectados, tales como sustrato líquido o gas, pueden impulsar la convección. Adicional o alternativamente, los impulsores u otros mecanismos de mezcla adecuados pueden forzar los procesos de mezcla. Se pueden usar modelos computacionales o empíricos para calcular un campo de velocidad a escalas de tiempo adecuadas. Por ejemplo, una vez calculado, se puede suponer que un campo de velocidad es sustancialmente constante hasta que haya un cambio sustantivo en una propiedad física (por ejemplo, cambio de viscosidad debido al crecimiento de biomasa) de los contenidos del biorreactor o de una manera de impulsar el proceso de mezcla (por ejemplo, cambio en las tasas de flujo de entrada o salida impuestas por el control del biorreactor).
[0050] Las resoluciones temporales del modelo metabólico y del modelo físico, al igual que las resoluciones espaciales, no tienen por qué ser las mismas, al menos en vista de la discusión anterior. Es decir, la etapa de tiempo 102 del proceso de modelado 100 describe el modelo de proceso metabólico. Se hace referencia en el presente documento a los aspectos de integración del proceso de modelado 100, aplicado a partes de un biorreactor no homogéneo, con el modelado de la mezcla (por ejemplo, mediante CFD) u otros procesos físicos dentro del reactor no homogéneo, según sea necesario.
[0052] El proceso de modelado 100 y el modelo computacional 104, implementados en el software que se ejecuta en hardware de un sistema informático, pueden simular el funcionamiento de un biorreactor 120 virtual durante un periodo de tiempo simulado compuesto por la serie de etapas de tiempo 102. El proceso de modelado 100 comprende recibir (de un usuario, o de una etapa de tiempo 102 anterior) valores actuales 150a de variables de proceso al comienzo de una etapa de tiempo 102 y, al final de la etapa de tiempo 102, generar valores actualizados 150b de al menos algunas de esas variables de proceso a través de una serie de etapas computacionales. En contextos en los que no está en juego la temporización precisa con respecto a cualquier etapa de tiempo 102 dada, los valores actuales 150a y los valores actualizados 150b pueden denominarse colectivamente en el presente documento simplemente "valores" de variables de proceso. Las variables de proceso pueden ser un conjunto de variables que describen el modelo computacional 104 del biorreactor. En algunas implementaciones, las variables de proceso pueden reflejar valores de variables de control 152, condiciones de proceso, condiciones experimentales, composición de medios, parámetros de biorreactor, constantes de modelo y/o una variedad de otros términos que describen parámetros del modelo computacional 104. Las variables de proceso pueden incluir variables descriptivas o indicativas de una diversidad de propiedades físicas, químicas y bioquímicas de la disolución extracelular 124, tales como volumen, temperatura, acidez o pH, osmolaridad, osmolalidad, masa, densidad, así como composiciones químicas y bioquímicas de la disolución. Además, las variables de proceso pueden indicar la cantidad o concentración de la biomasa celular 130 dispuesta en la disolución extracelular 124 dentro del biorreactor 120 modelado. Adicional o alternativamente, las variables de proceso 150 pueden indicar concentraciones o cantidades absolutas de una diversidad de metabolitos inorgánicos u orgánicos dispuestos en la disolución extracelular 124 o dentro de la biomasa 130. Los metabolitos disueltos, con concentraciones extracelulares o intracelulares indicadas por las variables de proceso 150, pueden incluir gases, sales, iones, metales, minerales, azúcares, aminoácidos, ácidos grasos y/u otros ácidos orgánicos y/o sus bases conjugadas. Más específicamente, los metabolitos disueltos pueden incluir oxígeno, dióxido de carbono, amoniaco, glucosa, sacarosa, lactosa, lactato, glutamina, glutamato, alanina, asparagina, aspartato y/o una variedad de otros productos químicos o bioquímicos. Las variables de proceso también pueden indicar concentraciones de uno o más productos metabólicos diana (o, simplemente, productos diana), que pueden incluir anticuerpos, péptidos, proteínas terapéuticas u otros productos biológicos. Las variables de proceso también pueden indicar concentraciones de uno o más de una diversidad de subproductos metabólicos (o, simplemente, subproductos), que, junto con los productos diana, se pueden generar mediante biomasa celular 120 virtual. Los productos objetivo y subproductos pueden denominarse colectivamente productos metabólicos (o, simplemente, productos).
[0054] Para determinar los valores actualizados 150b de las variables de proceso a partir de los valores actuales 150a de las variables de proceso, el proceso de modelado 100 puede calcular las velocidades o tasas de al menos algunos de los flujos 132a-i asociados con la biomasa celular 130. Los flujos 132a-i pueden corresponder al crecimiento 132a de la biomasa celular 130, captación de metabolitos del sustrato 132b, c, eliminación o secreción de productos diana metabólicos y subproductos 132 d, e y/o flujos que representan una diversidad de flujos de la vía metabólica intracelular 132f-i. Los flujos de la vía metabólica intracelular 132f-i pueden representar conversiones metabólicas de varios metabolitos en varios otros metabolitos, tal como se indica en la Figura 1 por las topologías de las representaciones de flujo. Por ejemplo, el flujo 132f puede representar una reacción o vía metabólica donde dos metabolitos se combinan para producir otro metabolito, el flujo 132g puede representar una reacción o vía metabólica donde un metabolito produce otros dos metabolitos, el flujo 132h puede representar una reacción o vía metabólica donde dos metabolitos se combinan para producir otros dos metabolitos, y el flujo 132i puede representar una reacción o vía metabólica donde dos metabolitos se combinan para producir tres metabolitos. El flujo de crecimiento 132a puede modelarse en algunas implementaciones como una salida de otro flujo que representa adicionalmente un proceso metabólico intracelular. Colectivamente, los flujos 132a-i pueden representar una red metabólica para modelar un tipo dado de células que producen la biomasa celular 130. La red metabólica para células bacterianas modeladas, tal comoEscherichia coli (E. coli),puede ser diferente de la red metabólica para células reproductoras de mamíferos modeladas, tales como células CHO. Los flujos 132a-i en la Figura 1 son para ilustración general, y una red metabólica puede contener flujos que contienen de cero a más de una docena de entradas y/o salidas. Además, una red metabólica puede comprender 5, 20, 100, 500, 2500 o cualquier otro número adecuado de vías metabólicas.
[0056] Los metabolitos intracelulares dispuestos en la biomasa celular 130 modelada por los flujos 132a-i de la red metabólica pueden incluir algunos o todos los metabolitos modelados en la disolución extracelular: oxígeno, dióxido de carbono, amoniaco, otros gases, sales, iones, metales, minerales, glucosa, sacarosa, lactosa, lactato, glutamina, glutamato, glicina, alanina, asparagina, aspartato y/o una variedad de otros productos químicos o bioquímicos. Los metabolitos intracelulares que participan en los flujos 132a-i también pueden incluir una diversidad de enzimas, proteínas, aminoácidos y/o moléculas de ADP (difosfato de adenosina) y ATP (trifosfato de adenosina) implicadas en la transferencia de energía. En las variables del proceso pueden incluirse variables indicativas de concentraciones intracelulares de metabolitos.
[0058] Cada flujo de la vía metabólica puede cuantificarse mediante una tasa de flujo que caracteriza la tasa de conversión de los metabolitos asociados con el flujo. Las tasas de flujo también se pueden denominar en el presente documento velocidades de flujo. Ciertas tasas de flujo pueden representar, ser equivalentes, ser indicativas o de otro modo relacionarse con las tasas de cambio de algunas variables de proceso con respecto al tiempo. Por ejemplo, la tasa del flujo de crecimiento 132a puede representar la tasa de cambio de la variable de proceso indicativa de concentración o cantidad total de biomasa celular 130 dispuesta en la disolución extracelular 124. La tasa de un flujo 132b o 132c de captación de metabolitos, al menos en determinadas condiciones de funcionamiento del biorreactor modelado, puede representar la tasa de cambio de la variable del proceso indicativa de la cantidad o concentración del metabolito correspondiente en la disolución extracelular 124. Por ejemplo, la tasa de captación de oxígeno puede representar la tasa de cambio de la variable del proceso indicativa de la concentración de oxígeno extracelular, mientras que la tasa de captación de glucosa puede representar la tasa de cambio de la variable del proceso indicativa de la concentración de glucosa. Las velocidades de flujos correspondientes a la generación de productos o subproductos diana por la biomasa celular 130 pueden representar las tasas de cambio de variables de proceso asociadas con las cantidades o concentraciones de los productos o subproductos diana correspondientes en la disolución extracelular 124.
[0060] Como se ha señalado anteriormente, además de la disolución extracelular 124 y la biomasa celular 130, el modelo computacional 104 puede incluir descripciones de una o más corrientes de entrada 140 virtuales y/o una o más corrientes de salida 142 virtuales. En el presente documento, la una o más corrientes de entrada 140 se pueden denominar, por simplicidad, como una "corriente de entrada virtual" singular o "corriente de entrada", y la una o más corrientes de salida 140 se pueden referir, por simplicidad, como una "corriente de salida virtual" singular o "corriente de salida". Las descripciones de las corrientes 140, 142 pueden incluir variables que indican composiciones y/o tasa de flujo asociadas con la corriente de entrada 140 y la corriente de salida 142. En algunas implementaciones, el valor absoluto de una suma de caudales volumétricos de la corriente de entrada 140 de líquido y el valor absoluto de una suma de caudales volumétricos de la corriente de salida 142 son iguales, lo que conduce al volumen constante de la disolución extracelular. Las implementaciones donde los caudales de la corriente de entrada 140 y la corriente de salida 142 no están equilibrados dan lugar a un cambio de volumen de la disolución extracelular 124. La corriente de entrada 140 virtual y la corriente de salida 142 virtual pueden afectar a las tasas de cambio de las variables de proceso, incluidas las indicativas de la composición de la disolución extracelular 124, por ejemplo, reponiendo los metabolitos del sustrato y/o agotando los contenidos virtuales del biorreactor 120 modelado.
[0062] Volviendo al proceso de modelado 100, los valores actuales 150a de las variables de proceso pueden servir como entradas en un modelo cinético 160. El modelo cinético 160 puede calcular una serie de restricciones 164 sobre las tasas de flujo, es decir, las velocidades de al menos algunos de los flujos 132a-i asociados con la biomasa 130. Las restricciones 164 pueden imponer, por ejemplo, límites superiores a las tasas de flujo que representan la captación de metabolitos del sustrato. Por consiguiente, las restricciones 164 pueden restringir las tasas de cambio de las variables del proceso indicativas de las cantidades o concentraciones de los metabolitos del sustrato asociados con los flujos restringidos. Por ejemplo, las restricciones pueden representar tasas máximas de captación de oxígeno, glucosa, asparagina y/o glutamina y/o glicina y, en consecuencia, las tasas máximas de cambio de variables del proceso indicativas de cantidades o concentraciones de oxígeno, glucosa, asparagina, glutamina y/o glicina en la disolución extracelular 124 en ausencia de los efectos de las corrientes de entrada 140 y salida 142.
[0064] El modelo cinético 160 puede calcular los efectos de los valores actuales 150a de las variables de proceso sobre la cinética de la reacción metabólica que, a su vez, afectan a las restricciones sobre las tasas de flujo. Por ejemplo, tal como se calcula mediante el modelo cinético 160, las tasas de captación máximas pueden depender de otras variables de proceso que son indicativas o descriptivas de las propiedades físicas o químicas de la disolución extracelular 124. Como ejemplo más específico, las variables del proceso indicativas de la temperatura, acidez o pH de la disolución extracelular y/u osmolaridad pueden afectar a las tasas de captación máximas.
[0066] El modelo cinético 160 puede calcular los efectos de los valores actuales 150a de las variables de proceso indicativas de temperatura, acidez y/u osmolaridad sobre las tasas máximas de captación de metabolitos pesando o multiplicando las tasas máximas óptimas de captación por factores de condición del proceso que tienen en cuenta las desviaciones de las condiciones óptimas. Las tasas máximas óptimas de captación pueden corresponder a los límites superiores de las tasas de captación en condiciones de proceso ideales. Los factores de condición del proceso pueden entonces actuar como factores de corrección indicativos de la reducción de las tasas de captación debidas a condiciones no ideales. Los factores de condición del proceso pueden definirse en una variedad de formas funcionales. Por ejemplo, los factores de condición del proceso pueden tener un valor de unidad para condiciones óptimas del proceso para una captación de metabolito dada, y disminuir de la unidad con una desviación creciente de las condiciones óptimas del proceso. Los factores de condición del proceso pueden adoptar formas distintas o similares para diferentes tasas de captación de metabolitos, y las condiciones óptimas pueden ser distintas o similares para diferentes captaciones de metabolitos.
[0068] En algunas implementaciones, el modelo cinético 160 calcula los efectos de los valores actuales 150a indicativos de concentraciones de uno o más subproductos metabólicos sobre la cinética de reacción metabólica. Por ejemplo, las concentraciones de amoniaco y lactato pueden reducir las tasas máximas de captación de glucosa, glutamina, asparagina y otros metabolitos del sustrato.
[0070] En algunas implementaciones, el modelo cinético 160 modela los efectos de los valores actuales 150a de las variables de proceso sobre una restricción de velocidad para el flujo metabólico intracelular responsable del mantenimiento celular y la tasa de consumo de energía correspondiente. El flujo de mantenimiento celular puede modelar la vía metabólica que consume parte de la energía disponible para la biomasa celular 130 en forma de ATP sin cultivar la biomasa celular 132. El flujo de mantenimiento celular, en algunas implementaciones, puede estar estrechamente acoplado con el flujo que produce el producto diana. En otras palabras, calcular la restricción sobre la tasa de flujo para la producción del producto diana puede incluir calcular el límite inferior de la tasa de consumo de energía para el mantenimiento celular.
[0072] Para calcular el límite inferior de la tasa de consumo de energía para el mantenimiento celular, el modelo cinético 160 puede explicar el efecto de los valores actuales 150a relevantes de las variables de proceso. En algunas implementaciones, se puede definir una variable de "estrés" para cuantificar cómo las variables de proceso afectan el límite inferior de la tasa de consumo de energía para el mantenimiento celular. El estrés, a su vez, puede ser una función de los cambios en la temperatura de la disolución extracelular a lo largo del tiempo y el diferencial de temperatura que experimenta o detecta la biomasa celular 130. En algunas implementaciones, el estrés se evalúa como un efecto acumulativo del diferencial de temperatura integrado a lo largo del tiempo. Adicional o alternativamente, en algunas implementaciones, diferentes variables de estrés contribuyen a calcular la tasa de consumo de energía mínima para el mantenimiento celular, y/o variables de estrés explican el estado o los cambios en la temperatura, osmolaridad, concentraciones de subproductos y/o alta densidad celular de la biomasa 130.
[0074] El cálculo de los efectos de las variables de proceso 150a actuales sobre las restricciones de velocidad de flujo 164 por el modelo cinético 160 puede basarse en datos experimentales. Las fórmulas matemáticas para el cálculo pueden derivarse de modelos teóricos, pueden ser empíricas y/o pueden combinar factores empíricos con derivaciones teóricas. En cualquier caso, las fórmulas para calcular los efectos de las variables de proceso actuales 150a pueden incluir coeficientes o parámetros de modelo que se pueden obtener con un procedimiento de calibración, por ejemplo, ajustando los datos de calibración. En algunas implementaciones, los datos de calibración incluyen datos experimentales. Adicional o alternativamente, se pueden usar datos generados computacionalmente para al menos parte de la calibración. Los algoritmos de ajuste, regresión y/u optimización pueden ayudar a calcular los parámetros del modelo cinético a partir de los datos de calibración.
[0076] En algunas implementaciones, antes de calcular los efectos de las variables de proceso sobre las restricciones de la tasa de flujo 164, el modelo cinético actualiza al menos algunas de las variables de proceso basándose en las variables de control 152. Las variables de control pueden incluir ajustes de temperatura, ajustes de acidez o cualesquiera otras variables adecuadas que puedan representar ajustes de control virtual del biorreactor 130. El proceso de modelado 100 puede recibir las variables de control 152 con tiempos asociados dentro de los periodos de tiempo simulados antes de comenzar la simulación, o puede recibir las variables de control 152 en cualquier momento durante el periodo de tiempo simulado.
[0078] Las restricciones 164 calculadas por el modelo cinético 160, como se ha analizado anteriormente, pueden definir límites superiores o inferiores de las tasas de algunos de los flujos 132a-i que modelan las vías metabólicas de la biomasa celular 130 virtual. El proceso de modelado 100 puede usar entonces las restricciones 164 para realizar un análisis de balance de flujo 170 que calcula simultáneamente las tasas de flujo 174 para todos los flujos modelados dentro de la red metabólica de la biomasa celular 130. El análisis de balance de flujo 170 puede determinar las tasas de flujo que garantizan que las concentraciones de metabolitos intracelulares en la biomasa modelada 130 están sustancialmente en estado estacionario. Por ejemplo, si uno de los flujos consume ciertos metabolitos intracelulares, mientras que produce otros metabolitos, otros flujos pueden equilibrar el primer flujo consumiendo o eliminando todos los metabolitos producidos por el primer flujo y produciendo o captando de la disolución extracelular 124 todos los metabolitos consumidos por el primer fundente. Los metabolitos que son captados por los flujos en la biomasa celular 130 pueden eliminarse de la disolución extracelular 124, mientras que los metabolitos que se eliminan de la biomasa celular 130 por los flujos pueden depositarse en la disolución extracelular 124. Por consiguiente, aunque el análisis del balance de flujo puede mantener las tasas de cambio de las concentraciones intracelulares o cantidades de metabolitos sustancialmente en cero, puede contribuir a las tasas de cambio de los metabolitos extracelulares, que pueden incluir metabolitos de sustrato, productos diana y subproductos, y las variables de proceso asociadas.
[0079] Adicional o alternativamente para contribuir al cálculo de los cambios en las concentraciones de metabolitos extracelulares, el análisis de balance de flujo 170 puede determinar la tasa de crecimiento de la biomasa celular 130. En algunas implementaciones, la tasa de crecimiento determinada puede ser negativa, modelando la muerte celular o el desgaste de la biomasa celular 130. La muerte o desgaste modelada de la biomasa celular 130 puede tener lugar cuando las restricciones sobre las tasas de flujo incluyen un límite inferior sobre la tasa de consumo de energía para el mantenimiento celular, y la energía no puede ser producida a la tasa requerida por los flujos metabólicos en vista de otras restricciones de la velocidad de flujo. En esta circunstancia, el proceso de modelado 100 puede ignorar la restricción de energía mínima de mantenimiento para el análisis de balance de flujo 170, y puede calcular una tasa de muerte basada en el déficit en la tasa de producción de energía de mantenimiento.
[0081] Además de las restricciones 164 calculadas por el modelo cinético 160, el análisis de balance de flujo 170 puede usar un objetivo metabólico 172 (o, simplemente, un objetivo metabólico) definido por el proceso de modelado 100 para representar el objetivo biológico de la biomasa virtual 130. Sin la función objetivo metabólica 172, el análisis de balance de flujo 170 puede no alcanzar una solución única, sino que puede conducir a un espacio de soluciones con muchas o un conjunto infinito de posibles tasas de flujo que mantienen los metabolitos intracelulares en estado estacionario. Por lo tanto, la función objetivo metabólica puede servir para restringir el análisis de balance de flujo 170 a una solución única. En otras implementaciones, la solución al análisis de balance de flujo 170 puede no ser único incluso con la inclusión de la función objetivo metabólica 172.
[0083] Se puede usar una diversidad de funciones objetivas metabólicas 172 en diferentes implementaciones. Por ejemplo, la función objetivo metabólica 172 puede conducir a una solución del análisis de balance de flujo 170 que maximiza la tasa de crecimiento de la biomasa celular 130. Como alternativa, la función objetivo metabólica 172 puede conducir a una solución del análisis de balance de flujo 170 que minimiza una combinación lineal de tasas de captación de metabolitos. La combinación lineal puede ser una suma o una suma ponderada de algunas o todas las tasas de flujo de captación. En algunas implementaciones, una función objetivo metabólica combina una pluralidad de requisitos, limitaciones o restricciones. Por ejemplo, la función objetivo metabólica 172 puede combinar maximizar la tasa de crecimiento mientras se minimiza una combinación lineal de tasas de flujo de captación. En otra implementación, el objetivo metabólico 172 maximiza el flujo asociado con la energía de mantenimiento celular mientras minimiza la combinación lineal de las tasas de flujo de captación.
[0085] Algunas o todas las tasas de flujo 174 calculadas mediante el análisis de balance de flujo 170 pueden corresponder a las tasas de cambio de algunas de las variables de proceso en ausencia de contribuciones de la corriente de entrada 140 y la corriente de salida 142. Las tasas 174 pueden servir como entrada a un módulo de integración de tasas 180 que puede usar las tasas para calcular los valores actualizados 150b de las variables de proceso. Los valores actualizados 150b de las variables de proceso pueden convertirse entonces en los valores actuales 150a de las variables de proceso para la siguiente etapa de tiempo.
[0087] El módulo de integración de velocidad 180 puede calcular las tasas de cambio con el tiempo de las variables de proceso usando las tasas de flujo 174 proporcionadas por el módulo de análisis de balance de flujo 170. En algunas implementaciones, las tasas de cambio con el tiempo de algunas de las variables de proceso corresponden directamente a algunas de las tasas de flujo 174. En otras implementaciones, las variables de flujo de entrada y salida 182 descriptivas de la corriente de entrada 140 y la corriente de salida 142 contribuyen a calcular las tasas de cambio de las variables de proceso. Las variables de flujo de entrada y salida 182 pueden contener información acerca de los caudales y las composiciones de la corriente de entrada 140 y la corriente de salida 142. Las contribuciones de la corriente de entrada 140 y la corriente de salida 142 pueden ignorarse cuando se modela un biorreactor 120 en modo de funcionamiento por lotes. Cuando se modela un biorreactor 120 en modo operativo por lotes alimentados, las variables de flujo 182 correspondientes a la corriente de entrada 140 pueden contribuir al cálculo de los valores actualizados 150b de las variables de proceso. Cuando se modela un biorreactor 120 en modos operativos continuos o de perfusión, las variables de flujo 182 correspondientes tanto a la corriente de entrada 140 como a la corriente de salida 142 pueden contribuir cada una al cálculo de los valores actualizados 150b de las variables de proceso. En algunas implementaciones, cuando, por ejemplo, se cosecha virtualmente el contenido del biorreactor 120 modelado sin reponer, solo las variables de flujo 182 correspondientes a la corriente de salida 142 contribuyen a las tasas de cambio de las variables de proceso 150.
[0089] Las variables de flujo 182 que definen la corriente de entrada 140 y la corriente de salida 142 que contribuyen al cálculo del conjunto actualizado 150b de variables de proceso pueden incluir las tasas de flujo de volumen total de las corrientes 140, 142 (que pueden ser o no iguales), así como variables de flujo que definen composiciones de la corriente de entrada 140 y la corriente de salida 142. Aunque la composición de la corriente de entrada 140 puede definirse directamente mediante variables de flujo de entrada, es decir, independientemente de los cálculos realizados en el proceso de modelado 100, el cálculo de la composición de la corriente de salida 142 puede basarse en los valores actuales 150a de las variables de proceso que describen la composición de la disolución extracelular 124. Adicional o alternativamente, las variables de flujo 182 que contribuyen al cálculo de la composición de la corriente de salida 142 pueden definir la selectividad del filtro de salida 144. Por ejemplo, la concentración de glucosa de la corriente de entrada 140 puede definirse directamente como una variable de flujo de entrada, mientras que la concentración de glucosa de la corriente de salida 142 puede calcularse a partir de la variable de flujo de salida indicativa de la selectividad de glucosa del filtro de salida 144 y la variable de proceso indicativa de la concentración de glucosa en la disolución extracelular 124. De manera análoga, para otros metabolitos o para la biomasa celular 130, los cálculos de concentraciones en la corriente de salida 142 pueden basarse en las variables de proceso indicativas de concentraciones correspondientes en la disolución extracelular 124, así como en las variables de flujo de salida indicativas de los valores correspondientes de la selectividad del filtro de salida 144.
[0091] Cuando se modela la falta de homogeneidad del biorreactor, las corrientes de entrada y salida 140, 142 pueden representar los flujos que conectan diferentes partes del biorreactor (cada una modelada como un biorreactor homogéneo, por ejemplo, biorreactor 120), como se analiza en el presente documento. Las variables de flujo de entrada y salida 182 se pueden calcular, por consiguiente, en vista de un campo de velocidad obtenido a partir de un modelo físico (por ejemplo, un modelo CFD).
[0093] El módulo de integración de velocidad 180 puede construir ecuaciones diferenciales o de diferencia usando las velocidades de flujo 174, las variables de flujo de entrada/salida 182 que combinan variables de flujo de entrada y variables de flujo de salida, y los valores actuales 150a de las variables de proceso. El módulo de integración de velocidad 180 puede calcular posteriormente los valores actualizados 150b de las variables de proceso usando un diferencial numérico o un solucionador de ecuaciones de diferencia. La etapa de tiempo 102 para integrar las tasas puede ser igual a varios segundos, varios minutos, varias horas, varios días o cualquier otro periodo de tiempo adecuado, dependiendo de la implementación. Una vez que calcula los valores actualizados 150b de las variables de proceso, el proceso de modelado 100 puede reemplazar uno o más de los valores actuales 150a de las variables de proceso con los valores actualizados 150b. Los valores actuales reemplazados 150a se pueden desechar o guardar en una memoria de ordenador para cálculos adicionales. El proceso de modelado se repite para una etapa de tiempo posterior (por ejemplo, la misma duración que la etapa de tiempo 102) con el nuevo conjunto de valores actuales 150a, y se repite hasta la expiración del periodo de tiempo simulado.
[0095] En un biorreactor no homogéneo, los valores actuales y actualizados 150a,b de las variables de proceso pueden considerarse como muestras o valores representativos (para cada parte de biorreactor) de las distribuciones espaciales de las variables de proceso. Por lo tanto, las ecuaciones diferenciales o de diferencia construidas por el módulo de integración 180 pueden ser ecuaciones diferenciales o de diferencia parciales con las derivadas parciales del tiempo, como se describe a continuación. El módulo de integración 180 puede construir las derivadas parciales del tiempo (o diferencias) basándose en valores variables de proceso en regiones vecinas. El módulo de integración 180 puede combinar las derivadas parciales espaciales de los valores variables de proceso con el campo de velocidad (por ejemplo, calculado mediante un modelo CFD) para calcular los valores actualizados 150b de las variables de proceso. En una implementación de ejemplo, los productos de puntos entre vectores de gradiente de variables de proceso y velocidades locales pueden representar la diferencia entre las corrientes de entrada y salida 140, 142 para una región de volumen finito que representa una parte del biorreactor no homogéneo.
[0097] En algunas implementaciones, algunas de las variables de proceso se actualizan en base a los valores recibidos de las variables de control 152. En algunas implementaciones, el modelo cinético 160 usa las variables de control para actualizar los valores de las variables de proceso antes de usar las variables de proceso para calcular las restricciones 164 sobre las tasas de flujo. Otras partes del proceso de modelado también pueden actualizar las variables de proceso basándose en las variables de control 152. Las variables de control pueden incluir ajustes de temperatura en diferentes momentos del periodo de tiempo simulado, tiempos para cambiar el filtro 144, tiempos para cambiar las tasas y/o composiciones de las corrientes de entrada 140 y salida 144, o cualesquiera otras variables adecuadas que puedan representar ajustes de control virtual del biorreactor 130. En algunas implementaciones, el módulo de integración de tasas 180 puede construir y resolver ecuaciones diferenciales o de diferencia que representan una respuesta gradual de las variables de proceso a las variables de control correspondientes. Por ejemplo, cuando una variable de control de temperatura cambia de una etapa de tiempo 102 a la siguiente, la variable de proceso para la temperatura de la disolución extracelular se puede ajustar en múltiples etapas de tiempo mediante el módulo de integración de velocidad 180. En otras implementaciones, las variables de proceso toman instantáneamente los valores de las variables de control, modelando una respuesta que es más rápida que la etapa de tiempo virtual 102.
[0099] La discusión anterior elucida y proporciona detalles de implementaciones de modo de ejemplo del modelo cinético 160. Como se ha analizado anteriormente, el modelo cinético 160 genera una pluralidad de restricciones 164 sobre las tasas de flujo modelando uno o más efectos de al menos algunos de los valores actuales 150a de las variables de proceso sobre la cinética de la reacción metabólica. Los efectos modelados pueden incluir, por ejemplo, el efecto de la temperatura, la acidez y/u la osmolaridad en un límite superior de una tasa de captación de metabolitos. El modelo puede definir un límite superior de una tasa de flujo asociada con una captación dada de metabolito para algunas condiciones ideales, que pueden incluir temperatura ideal, acidez ideal y/u osmolaridad ideal. El modelo cinético 160 puede calcular los efectos de condiciones no ideales multiplicando el límite superior para condiciones ideales por un factor de corrección. Un factor de corrección indicativo de una reducción en la tasa de captación debido a condiciones no ideales puede definirse como una función de una o más variables, tales como temperatura, acidez y/u osmolaridad. En algunas implementaciones, el factor de corrección o incluye un efecto de la concentración de un subproducto metabólico, tal como lactato o amoniaco.
[0101] En condiciones ideales, el límite superior de la tasa de captación de glucosa, por ejemplo, puede modelarse mediante la siguiente ecuación:
[0102] vmaxG¿c\GLC]
[0103] _KmaLC
[0104] “ C “ O+J^ÍL)
[0105] Vk^ clc/(Ecuación 1),
[0107] dondevglcse aproxima a un valor de saturación deVGLCmáxcuando las condiciones para la captación de glucosa son ideales y cuando la concentración de glucosa en la disolución extracelular es lo suficientemente grande para que cualquier aumento adicional no aumente apreciablemente la tasa de captación de glucosa. En la ecuación 1,[GLC]es la concentración de glucosa, yKmglces un parámetro de modelo cinético que describe la dependencia de la tasa de flujo de captación de glucosa sobre la concentración de glucosa. Cuando las condiciones no son ideales para la captación de glucosa, un factor de corrección, por ejemplo, C<g l c>(T,pH, n,[LAC],[NH3])< 1 puede multiplicar la tasa de captación de glucosa, donde el factor de corrección puede depender de una variedad de factores que incluyen la temperatura,T,acidez,pH,osmolaridad,n,concentración de lactato,[LAC],y/o concentración de amoniaco,[NH3]:
[0110]
(Ecuación 2).
[0112] Un factor de corrección puede depender de 1,2, 3, 4, 5 o cualquier otro número adecuado de valores actuales de las variables de proceso. Un factor de correcciónCglc(T, pH)puede representar una corrección que depende de la temperatura y la acidez, mientras que un factor de correcciónCglc(T, n, [NH3])puede representar una corrección que depende de la temperatura, la osmolaridad y la concentración de amoniaco. Un factor de corrección que depende de múltiples variables puede combinar una pluralidad de factores de corrección que dependen de una o más variables. Por ejemplo,Cglc(T, pH, n, [LAC])puede combinar cuatro factores de corrección definidos por separado: un factor de corrección para la temperatura,Cglct(T),un factor de corrección para la acidez,Cglcph(pH),un factor de corrección para la osmolaridad,CGLCw(n)y un factor de corrección para la concentración de lactato C<g l c [l a c ]>([LAC]),
por ejemplo. La combinación de factores constituyentes puede adoptar una variedad de expresiones matemáticas que representan adecuadamente la dependencia de la cinética de reacción de factores medioambientales en modelos mecanísticos. Por ejemplo, en algunas implementaciones, un factor de corrección dependiente de múltiples variables combina factores de corrección constituyentes por multiplicación, como se ejemplifica por la siguiente ecuación:
[0114] Cglc( J ,pH, [LAC])=CCLCt (T) CCLCpfi(pH)CCLC[lac]([LAC1)(Ecuación 3),
[0115] En otra implementación, un factor de corrección dependiente de múltiples variables combina factores de corrección constituyentes de otra manera:
[0117] Cgic(T .p H) =<i>-h i c TfH(l -<í>W O ) (<i - C GLCpl,(pH))>(Ecuación 4),
[0118] dondeKglct.phes un parámetro del modelo cinético 160 para la corrección. En la ecuación anterior, siKglct.ph= 1, el factor de corrección para la temperatura y el factor de corrección para la acidez tendrían que ser cero para hacer el factor de corrección total cero también.
[0120] Los factores de corrección se describieron anteriormente como factores de corrección para la captación de glucosa simplemente con el propósito de ilustración. Un factor de corrección para la captación de glutamina, la captación de asparagina o la captación de otro metabolito puede tener una forma similar. En general, para cualquier metabolito M, un factor de corrección puede depender de múltiples variables de proceso que incluyen, por ejemplo, temperatura, acidez, osmolaridad, concentración de lactato, concentración de amoniaco y/o cualquier otro metabolito, designado genéricamenteM2,que pueda afectar a la tasa máxima de flujo de captación para M. El factor de corrección resultanteCm(T, pH, n, [LAC], [NH3], [M2])puede combinar factores de corrección definidos por separado: un factor de corrección para la temperatura,Cmt(T),un factor de corrección para la acidez,CMpH(pH),un factor de corrección para la osmolaridad,CMw(n),un factor de corrección para la concentración de lactato C<m [l a c ]>([LAC]),
un factor de corrección para la concentración de amoniaco C<m [n h 3]>([NH3]) y un factor de corrección para la concentración deM2,C<m [M2]>([M2]).
[0121] Los factores de corrección para las variables de un solo proceso pueden adoptar una variedad de formas matemáticas que representan la dependencia mecánica de las restricciones de la tasa de flujo en el entorno. Estos factores de corrección pueden ser el resultado de derivaciones de principios básicos u observaciones empíricas. Un factor de corrección de la temperatura puede adoptar la siguiente forma:
[0123] cMm = n (t — Tmin) { i -e ^v < -T -W ) ) (Ecuación 5),
[0124] cuando la temperatura está entre valores mínimos y máximos tales queTmn < T<Tmáx, dtempes un coeficiente positivo de dependencia, yN= 1/máx{(T -Tmn)(1- edtemp(T - Tmáx))} normaliza el factor de corrección para tener un valor máximo de la unidad. Un factor de corrección para la acidez puede adoptar la siguiente forma:
[0125]
[0128] donde la acidez, representada por elpH,está entre valores mínimos y máximos tales quepHmín < pH < pHmáx,yN =1/máx{|(1 - 10pHmín- pH)(1 - 10pH ■pHmáx)l}normaliza el factor de corrección para tener un valor máximo de la unidad. Un factor de corrección para la osmolaridad puede adoptar la siguiente forma funcional:
[0131]
(Ecuación 7),
[0133] donde n > 0 es osmolaridad, ns y no,5 son coeficientes que determinan la dependencia de la osmolaridad, y N = 1 e-n05 /nS normaliza el factor de corrección para tener un valor máximo de la unidad. Un factor de corrección para el efecto de la concentración de metabolitos puede adoptar la forma de una ecuación de saturación:
[0136]
(Ecuación 8),
[0138] donde[M2]es la concentración de un metabolito que limita el flujo de captación y KmM2/M es un coeficiente que determina la dependencia del límite de la tasa de flujo de absorción de M sobre[M2],
[0140] En una implementación a modo de ejemplo, las tasas de captación máximas de glucosa, glutamina, asparagina y oxígeno, respectivamente, pueden calcularse de la siguiente manera:
[0143]
[0146] donde los factores de corrección debidos a temperatura y acidez no ideales sonCglc (T, pH), Cgln(T, pH), CAsn(T, pH)yCo2(T, pH),las concentraciones de glucosa[GLC],glutamina[GLN],asparagina [ASN], lactato[LAC],glutamato[GLU],amoniaco [NH<3>], aspartato [ASP] afectan a algunas de las tasas de captación, y los parámetros del modelo cinético 160 para calcular los límites de las tasas de flujo de captación anteriores se resumen en la Tabla 1 a continuación mediante el mecanismo cinético relevante. En algunas implementaciones, las entradas a las ecuaciones son concentraciones extracelulares de metabolitos, y en algunas implementaciones las entradas a las ecuaciones son concentraciones intracelulares. En otras implementaciones, una combinación de concentraciones extracelulares e intracelulares de metabolitos puede ser entradas para calcular las restricciones 164 en las tasas de flujo. En algunas implementaciones, parámetros adicionales del modelo cinético 160 cuantifican la dependencia de las tasas de flujo de captación de la temperatura, la acidez y los factores de corrección combinados.
[0148] Tabla 1. Parámetros del modelo cinético
[0150]
[0151]
[0154] Adicional o alternativamente al cálculo de las restricciones en las tasas de flujo de captación de metabolitos, el modelo cinético 160 puede calcular restricciones en una o más tasas de flujo para procesos metabólicos que determinan el consumo de energía para el mantenimiento celular y/o la generación de un producto diana. Aunque las restricciones en las tasas de captación de metabolitos pueden ser límites superiores en las tasas de captación, la restricción en la energía de mantenimiento puede ser un límite inferior de la tasa de flujo asociada. La energía de mantenimiento representa el requisito metabólico modelado de la biomasa celular 130 virtual que puede reflejar la energía usada por las células reales para sobrevivir en un entorno real. La energía puede representarse por la concentración intracelular o cantidad de ATP. Cuando la biomasa celular 130 produce más energía o ATP de la necesaria para el mantenimiento, la biomasa celular puede crecer con una tasa de crecimiento positiva. Por otro lado, cuando la biomasa celular 130 no produce la cantidad de ATP o energía necesaria para el mantenimiento, la biomasa celular 130 puede comenzar a disminuir o prácticamente a morir. El proceso de modelado 100 puede explicar la disminución en la biomasa celular 130 debido a la muerte o desgaste celular asignando una tasa de crecimiento negativo a una ecuación para el crecimiento.
[0156] El límite inferior de la energía de mantenimiento celular necesaria para prevenir la disminución de la biomasa celular puede depender de una variedad de factores ambientales representados por una o más variables del proceso. El modelo cinético 160 puede calcular una variable o factor de estrés, S, para representar al menos algunos de los factores ambientales que afectan a los requisitos de energía de mantenimiento. El proceso de modelado 100 puede calcular entonces la energía mínima de mantenimiento, como la tasa mínima de consumo de ATP como
[0158] VATP ~ v ATP,min(
V<1 T>«s ~.mntJ<)>(Ecuaci■ó'n 13),
[0159] dondeVATP.mmrepresenta el requisito de energía de mantenimiento cuando no hay estrés, o S = 0, yks,mntes un coeficiente que ajusta la influencia de la variable de estrés. Aunque la ecuación anterior representa una dependencia lineal del requisito de energía de mantenimiento en S, el modelo cinético 160 puede usar otras formas funcionales que incluyen polinomio, raíz cuadrada u otra potencia fraccionada, logarítmica, exponencial o una combinación de las formas precedentes, o cualquier otra relación adecuada. La variable de estrés en sí puede calcularse basándose en la temperatura, la acidez y/o cualesquiera otras variables de proceso adecuadas y sus cambios a lo largo del tiempo. La variable de estrés puede incluir una dependencia de las concentraciones de metabolitos, tales como subproductos metabólicos. Sin embargo, en algunas implementaciones, el modelo cinético 160 puede incluir por separado efectos de concentraciones de algunos metabolitos en el cálculo de la energía mínima de mantenimiento, tal como se expresa mediante la ecuación ilustrativa a continuación:
[0162]
(Ecuación 14),
[0164] dondekmntes la energía de mantenimiento adicional máxima o la tasa de consumo de ATP aproximada cuando una concentración significativa de lactato[LAC] >> Kmnt.LAoy concentración de amoniaco [NH3] »Kmnt,NH3están presentes en la disolución extracelular (o en disolución intracelular, en algunas implementaciones), yKmnt.LAo, Kmnt,NH3son parámetros del modelo cinético que determinan la influencia del lactato y el amoniaco, respectivamente, en la energía mínima de mantenimiento. Mientras que la ecuación anterior muestra un solo término aditivo que contempla la influencia de dos metabolitos, términos aditivos separados o cualquier otra dependencia funcional adecuada pueden tener en cuenta las concentraciones de metabolitos u otros factores ambientales que afectan la energía mínima de mantenimiento o la tasa de consumo mínimo de ATP para el mantenimiento celular.
[0165] Después de calcular el límite inferior de la energía de mantenimiento, el modelo cinético 160 puede calcular adicionalmente la tasa mínima de generación de un producto diana. El producto diana puede ser un anticuerpo u otro producto biológico adecuado. El modelo cinético 160 puede calcular la restricción inferior para la generación del producto diana usando una relación proporcional entre la energía mínima de mantenimiento y la generación de producto y aplicando factores de corrección que tienen en cuenta condiciones no ideales para la generación de producto. Por ejemplo, el modelo cinético 160 puede calcular la tasa mínima de generación de producto, donde el producto diana es un anticuerpo, mediante la siguiente ecuación:
[0168]
(Ecuación 15),
[0170] dondeCanti (T, pH)es un factor de corrección que tiene en cuenta la reducción de la generación de anticuerpos debido a la temperatura y acidez no ideales,[LAC]es la concentración de lactato,Kí,antii/laces un parámetro del modelo cinético que refleja el efecto inhibidor del lactato en la formación de producto, y es una constante de proporcionalidad que relaciona la tasa de consumo de ATP para el mantenimiento y la tasa de producción de anticuerpos. El factor de correcciónCanti (T, pH)puede tener una dependencia funcional similar de la temperatura y la acidez que los factores de corrección para las tasas de captación metabólica. Otros factores de corrección que, por ejemplo, representan efectos inhibidores adicionales de metabolitos pueden incluirse en el cálculo del límite inferior de anticuerpo u otra generación de producto diana.
[0172] Los parámetros cinéticos del modelo, tales como los usados en las ecuaciones 1-15 y enumerados en la Tabla 1, se pueden obtener usando un procedimiento de calibración o, simplemente, calibración. Los experimentos realizados con el fin de calibración pueden suministrar datos experimentales de calibración. Los experimentos para la calibración pueden ser experimentos de perfusión, experimentos por lotes o quimiostatos a pequeña escala y/o cualquier otro experimento adecuado. Adicional o alternativamente, los datos de calibración se pueden adaptar a partir de la bibliografía publicada, a partir de cálculos teóricos y/o cualquier combinación adecuada de fuentes. El procedimiento de calibración puede aplicar una diversidad de técnicas y/o algoritmos de regresión, ajuste u optimización, incluyendo, por ejemplo, Levenberg-Marquardt, evolución diferencial y/o algoritmos genéticos, a los datos de calibración para encontrar los parámetros del modelo cinético. El procedimiento de calibración puede combinar algoritmos de optimización global y local, y puede usar una o más de una variedad de funciones objetivas o de costes adecuadas. El procedimiento de calibración puede calcular los parámetros del modelo cinético por separado y antes de la ejecución del proceso de modelado 100. Sin embargo, en algunas implementaciones, una o más partes del procedimiento de calibración están integradas en el modelo cinético 160. Además, en algunas aplicaciones, se aplican diferentes conjuntos de parámetros del modelo cinético en diferentes etapas de la simulación, según se determina, por ejemplo, por los valores actuales de las variables de proceso 150a.
[0174] Los datos de calibración experimentales pueden incluir concentraciones en diferentes puntos del tiempo de un conjunto de metabolitos. Un error de calibración agregado que se ha de minimizar puede definirse como
[0177]
(Ecuación 16),
[0179] donde[Mk\sm (t)es la concentración simulada en el tiempo t de un metabolito k-ésimo,[Mk\exp(t) es la concentración experimental en el tiempo t de un metabolito k-ésimo, ywkes el peso del error para el metabolito k-ésimo en el error agregado. En esta implementación, el error del metabolito k-ésimo se calcula como la suma de cuadrados de errores de concentración relativa en diferentes momentos. En otras implementaciones, el error puede basarse en una combinación de errores de concentración absolutos y relativos. El error agregado es una suma ponderada de errores para cada metabolito. Los pesos de los diferentes metabolitos pueden enfatizar la importancia de algunas concentraciones de metabolitos en la calibración mientras se suprimen o excluyen otras concentraciones de metabolitos, y pueden depender del experimento. Por ejemplo, la concentración de glucosa puede ser más pertinente para un experimento que corresponde a la etapa de crecimiento de un bioproceso, mientras que las concentraciones de un anticuerpo pueden ser más pertinentes para un experimento que corresponde a la etapa de producción. En general, una diversidad de experimentos adecuados y formulaciones de función de error pueden ser apropiados para calibrar diferentes parámetros del modelo cinético.
[0181] La siguiente discusión elucida y proporciona detalles de implementaciones a modo de ejemplo del análisis de balance de flujo 170. El análisis de balance de flujo 170 usa las restricciones 164 generadas por el modelo cinético 160, tales como, por ejemplo, las tasas máximas de captación de metabolitos, la tasa mínima de consumo de energía para el mantenimiento celular y la tasa mínima asociada de generación de producto diana, para calcular un conjunto completo de velocidades de flujo 174 para el modelo metabólico de la biomasa celular 130. Diferentes modelos metabólicos pueden tener en cuenta diferentes metabolitos y una disposición diferente de las vías metabólicas. Cada flujo de la vía metabólica puede representar una reacción o un conjunto de reacciones que convierten colectivamente un conjunto de metabolitos en otro conjunto de metabolitos. Las proporciones en las que un flujo de la vía metabólica consume o produce metabolitos forman coeficientes estequiométricos para el flujo. La Tabla 2 a continuación ilustra una red a modo de ejemplo de flujos metabólicos que modelan células CHO configuradas para producir un producto de anticuerpo.
[0182] Tabla 2. Red a modo de eemplo de flu os de la vía metabólica
[0183]
[0184]
[0185] Los subíndices distinguen citosol o metabolitos celulares (c), metabolitos extracelulares (e) y metabolitos mitocondriales (m) que forman parte de procesos celulares. La Tabla 3 a continuación enumera y describe los metabolitos que participan en los flujos metabólicos en la Tabla 2.
[0187] Tabla 3. Definiciones de metabolitos
[0190]
[0193] El análisis de balance de flujo 170 del proceso de modelado 100 puede calcular las tasas de flujo para cada una de las vías metabólicas. Continuando con el ejemplo de la red metabólica descrita en la Tabla 2, el análisis de balance de flujo 170 puede determinar una tasa de flujo para cada una de las 34 vías metabólicas, sujeta a una serie de condiciones, limitaciones, restricciones u objetivos. Una restricción para el cálculo de los flujos puede ser el requisito de mantener el estado estacionario de las concentraciones de metabolito de la biomasa celular 130. Por ejemplo, la vía metabólica 33 en la Tabla 2 puede convertir, en proporciones iguales indicadas por los coeficientes estequiométricos de unidad, hidrógeno, dinucleótido de nicotinamida adenina reducido y piruvato en la forma no reducida de dinucleótido de nicotinamida adenina y lactato. El conjunto de otros flujos metabólicos puede entonces producir hidrógeno, dinucleótido de nicotinamida adenina reducida y consumir la forma no reducida de dinucleótido de nicotinamida adenina y lactato. Como otro ejemplo, la vía metabólica 14 de la Tabla 2 puede producir hidrógeno absorbiéndolo de la disolución extracelular 124 o consumir lactato eliminándolo en la disolución extracelular 124, pero puede no lograr ambas. Puede que no haya una vía para captar el piruvato de la disolución extracelular 124 o retirar el piruvato en la disolución extracelular 124, lo que conlleva el requisito de que el piruvato puede necesitar equilibrarse con flujos de la ruta intracelular. En general, las concentraciones de metabolitos intracelulares se pueden equilibraren
[0194] estado estacionario con flujos de la vía intracelular o interacciones con la disolución extracelular. La ecuación S ■ ü = 0 , donde S es la matriz estequiométrica de la red metabólica y un vector de velocidad, v, es el vector de todas las tasas de flujo, describe la condición en estado estacionario para el análisis de balance de flujo 170. Sin embargo, la condición de estado estacionario puede no ser suficiente para encontrar una solución única para el análisis de balance de flujo 170 y, por lo tanto, el análisis de balance de flujo 170 puede requerir otras restricciones 164 para limitar el conjunto de soluciones posibles.
[0196] Algunas de las vías metabólicas tienen en cuenta la eliminación de metabolitos de la biomasa celular 130 o la captación de metabolitos en la biomasa celular 130 de la disolución extracelular 124. La solución en estado estacionario del análisis de balance de flujo 170 puede depender de las restricciones para las tasas de flujo de captación o eliminación. Por ejemplo, los flujos de captación de metabolitos del sustrato pueden estar restringidos por la concentración de los metabolitos correspondientes en la disolución extracelular 124 y por condiciones ambientales no ideales, como se ha analizado anteriormente con referencia al modelo cinético 160. Para la red metabólica descrita por la Tabla 2, por ejemplo, el oxígeno puede estar en abundancia en la disolución extracelular, tal como se indica por la vía metabólica 5 de la Tabla 2 que omite la entrada extracelular de oxígeno. Sin embargo, la tasa máxima de captación de oxígeno puede estar restringida por la Ecuación 12, que tiene en cuenta la tasa máxima de captación para condiciones ideales y el factor de corrección de condición no ideal indicado por los valores actuales 150a de las variables de proceso. En algunas implementaciones, al menos algunas de las tasas de flujo metabólico correspondientes a las vías metabólicas 3-17 de la Tabla 2 están restringidas por las restricciones de velocidad 164 calculadas por el modelo cinético 160. En otras implementaciones, las restricciones de velocidad 164 calculadas por el modelo cinético 160 se aplican a vías metabólicas intracelulares que pueden verse afectadas indirectamente por condiciones extracelulares y tasas de captación. Por ejemplo, la restricción de glutamina de la ecuación 10 puede limitar la tasa de flujo de la vía metabólica 27, la restricción de glucosa de la Ecuación 9 puede limitar la tasa de flujo de la vía metabólica 34, y la restricción de asparagina de la Ecuación 11 puede limitar la tasa de flujo de la vía metabólica 25.
[0198] El análisis de balance de flujo 170 puede ser incapaz de calcular un conjunto único de tasas de flujo para la condición de estado estacionario bajo las restricciones 164 generadas por el modelo cinético 160 y puede obtener adicionalmente al menos un objetivo metabólico 172 definido para la biomasa celular 130. El objetivo metabólico para la biomasa celular 130 virtual en el modelo 104 informático puede corresponder a un objetivo biológico real de un cultivo celularin vivo.Una diversidad de funciones de objetivos metabólicos puede restringir el análisis de balance de flujo 170 en diferentes implementaciones, representando diferentes alternativas biológicas. La función de objetivos metabólicos 172 puede maximizar la tasa de crecimiento de la biomasa celular 130, minimizar una combinación lineal de tasas de captación de metabolitos, maximizar las tasas de flujo para rutas asociadas con la producción de energía o ATP, o generar otra limitación en el conjunto de tasas de flujo. En general, la función de objetivos metabólicos 172 puede calcular un coste o valor para cualquier conjunto de tasas de flujo representadas por el vector de velocidad, como puede representarse por un vector de velocidadv(conjunto de tasas de flujo) de una red metabólica. En algunas implementaciones, el análisis de balance de flujo 170 minimiza el coste o valor, mientras que en otras implementaciones el análisis de balance de flujo 170 maximiza el coste o valor. Además, la función de objetivos metabólicos puede depender de una diversidad de valores actuales 150a de variables de proceso, su historia y una variedad de otras variables que describen la biomasa celular 130 y su entorno en un momento actual y en momentos simulados previamente.
[0200] Considerando una colección deNvías metabólicas o reacciones con tasas de flujo v1, v2, ...vn-1, vnque son los elementos del vector de velocidad v, la función objetivo metabólica 172 puede tomar una variedad de expresiones matemáticas, ejemplificadas en la Tabla 4 a continuación. La tabla también proporciona explicaciones y motivaciones para las funciones metabólicas objetivas.
[0201] Tabla 4. Obetivos del estudio
[0203]
[0206] El análisis de balance de flujo 170 puede ser incapaz de encontrar una solución que satisfaga todas las restricciones generadas por el modelo cinético 160 para una función de objetivos metabólicos 172 dada. Específicamente, si la restricción sobre la tasa mínima del flujo de mantenimiento no puede satisfacerse para la función objetivo 172 que maximiza el crecimiento o una relación de crecimiento con alguna función de otras velocidades de flujo, el análisis de balance de flujo 170 puede cambiar a un objetivo metabólico 172 diferente y puede ignorar las restricciones sobre la tasa de flujo de mantenimiento mínima y la tasa de producción mínima de un producto diana. El análisis de balance de flujo 170 puede cambiar a un objetivo metabólico 172 que maximiza la velocidad de flujo de mantenimiento, por ejemplo. Tras encontrar una solución en estado estacionario que maximiza la tasa de flujo de mantenimiento, a la vez que satisface las restricciones restantes 164, tales como las tasas de captación máximas, el análisis de balance de flujo 170 puede calcular la tasa de muerte o la tasa de desgaste para la biomasa celular 130 basándose en la diferencia entre la tasa de flujo de mantenimiento mínima ignorada y la tasa de flujo de mantenimiento alcanzada. La ecuación de la tasa de muerte que representa la tasa de cambio de la biomasa 130, con respecto a la concentración de biomasa, se puede calcular usando
[0208] v d ~ c d { v ATP,mín ~ V ATP)
(Ecuación 17),
[0209] dondeVATP.mín - vatpuna diferencia positiva entre la tasa de flujo de mantenimiento mínima y la tasa de flujo de mantenimiento insuficiente calculada, ycdes un coeficiente de proporcionalidad que es un parámetro del proceso de modelado 100.
[0211] La siguiente discusión elucida y da detalles de implementaciones a modo de ejemplo del módulo de integración de tasas 180. Una vez que el análisis de balance de flujo 170 calcula las tasas de flujo 174, incluyendo la tasa de crecimiento o muerte de la biomasa celular 130, el módulo de integración de tasas 180 puede usar las tasas de flujo 174 calculadas para calcular los valores actualizados 150b de las variables de proceso. El módulo de integración de tasas 180 puede realizar un balance de masas para los contenidos virtuales del biorreactor 120. Adicional o alternativamente, el módulo de integración de tasas 180 puede calcular el consumo de entradas del biorreactor 120, incluyendo metabolitos de sustrato, y/o la producción del producto diana.
[0213] El módulo de integración de tasas 180 puede calcular primero las tasas de cambio con el tiempo de las variables de proceso y luego resolver o integrar numéricamente el diferencial o, en la forma de tiempo discreta, las ecuaciones de diferencia para las variables de proceso. Las ecuaciones para las tasas de cambio con el tiempo de las variables de proceso pueden incluir contribuciones de la corriente de entrada 140 y la corriente de salida 142. A continuación se muestran algunas ecuaciones a modo de ejemplo para un conjunto de variables de proceso. Por ejemplo, una ecuación general para la tasa de cambio con el tiempo de un metabolito en la disolución extracelular puede escribirse como
[0216]
(Ecuación 18),
[0218] donde[Me]es la concentración del metabolito en la disolución extracelular 124 (es decir, la variable de proceso en consideración),[B/OM]es la concentración de biomasa en la disolución extracelular 124,SMe,ies el coeficiente estequiométrico para el metabolito extracelularMeen un flujo de vía metabólicai, v¡es la tasa de flujo para el flujoisegún se calcula mediante el análisis de balance de flujo 170,Ves el volumen de la disolución extracelular 124,Fenes el caudal volumétrico de la corriente de entrada 140,Cinmes la concentración del metabolito M (la misma sustancia que el metabolito extracelularMe)en la corriente de entrada 140,Fsalidaes el caudal volumétrico de la corriente de
[0219] salida 142, y 7/wes el factor de transmisión o selectividad del filtro 144 para el metabolito M. La expresión es la contribución de la suma a la concentración extracelular deMepor todos los flujos de la red metabólica y puede simplificar hasta-vmovmcuando, en consecuencia, solo un flujo de captación o solo un flujo de eliminación (excreción) afecta a la concentración de metabolito extracelular deMe.En implementaciones del proceso de modelado 100 con múltiples corrientes de entrada, una suma sobre múltiples términos que representan las múltiples corrientes de entrada puede reemplazarFenCinm.El volumen V puede ser una variable de proceso con la tasa de cambio dada por
[0221] <£>
[0222] aL
[0223] t=F - F
[0224] iN 0UT(Ecuación 19),
[0226] y en implementaciones que mantienen el volumen sustancialmente constante,Fen = Fsalida.En algunas implementaciones, no hay filtro 144 para la corriente de salida 142 yTm= 1 para cada metabolito, mientras que en otras implementaciones el filtro no filtra sustancialmente un metabolito dado, lo que conducea Tm= 1 para un metabolito dado.
[0228] Para reactores no homogéneos, la Ecuación 18 puede representar una tasa de cambio de un metabolito en una parte dada de un biorreactor y ajustarse para tener en cuenta la falta de homogeneidad y la dinámica de mezcla, como se analiza en el presente documento. En algunas implementaciones, particularmente con discretización espacial comparativamente fina, el término aditivo que representa las corrientes de entrada y salida 140, 142 puede reemplazarse por un producto puntual de un gradiente de concentración para el metabolito con el campo de velocidad. Dicho enfoque, en cierto sentido, calcula la derivada total con respecto al tiempo basado en la derivada parcial con respecto al tiempo y las derivadas parciales con respecto a las dimensiones espaciales. En otras implementaciones, el término aditivo que representa las corrientes de entrada y salida 140, 142 puede ser el resultado de añadir contribuciones de flujo desde partes vecinas del biorreactor no homogéneo en vista de un campo de velocidad. En algunas discretizaciones del volumen del biorreactor, una parte puede incluir la corriente de entrada que viene desde el exterior del reactor, mientras que otra parte puede incluir la corriente de salida del reactor.
[0230] Volviendo a la discusión de un modelo de biorreactor homogéneo, aunque, como se discutió, sin perder la aplicabilidad general a biorreactores no homogéneos, la Ecuación 18 puede adaptarse para aplicarse a uno o más metabolitos específicos. Considerando, por ejemplo, una implementación de un proceso de modelado 100 donde la biomasa celular 130 se modela mediante las vías metabólicas de la Tabla 2, con una corriente de entrada 140 y una corriente de salida 142 que tienen caudalesFen = Fsalida = Funa concentración de glucosa en la corriente de entrada 140 deCinglcy una configuración de perfusión conTglc = Tanti= 1 yTbiom =0, las ecuaciones para la tasa de cambio con el tiempo para las concentraciones de glucosa, biomasa y el producto de anticuerpo pueden ser:
[0232] d\GLC]
[0233] dt - [B10M] v1s ^ ( C INclc- [GLC])(Ecuación 20),
[0236]
(Ecuación 21),
[0238] (Ecuación 22),
[0240] donde V<15>es la tasa de flujo para la ruta 15 para la captación de glucosa, V<16>es la tasa de flujo para la ruta 16 para la eliminación de anticuerpos, y V<17>es la tasa de flujo para la ruta 17 para la eliminación de biomasa. Aunque puede no haber una distinción en algunas implementaciones entre biomasa intracelular y biomasa extracelular, las definiciones en la Tabla 2 separan la ruta de generación de biomasa 19 de la ruta de eliminación de biomasa 17, representando la concentración de biomasa extracelular la biomasa celular 130 en la disolución extracelular 124.
[0242] El módulo de integración de velocidad 180 puede calcular la tasa de cambio con el tiempo de la biomasa celular 130 basándose en la tasa de muerte o desgaste calculada en el análisis de balance de flujo 170 como
[0245]
(Ecuación 23),
[0247] donde [BIOM\es la concentración de la biomasa celular 130 en la disolución extracelular 124, yVdes la tasa de muerte o tasa de desgaste calculada en el análisis de balance de flujo 170. Aunque la biomasa 130 solo puede dar cuenta de la biomasa celular viva virtual con procesos metabólicos en curso, en algunas implementaciones, la concentración o cantidad de células muertas o biomasa muerta es otra de las variables del proceso que se actualiza mediante el proceso de modelado 100. Cualquier disminución en la biomasa viva virtual 130 representada por [BIOM] puede contribuir a un aumento correspondiente en un valor de la variable de proceso que representa la biomasa muerta. Aunque la biomasa muerta puede no tener procesos metabólicos en curso, puede afectar a las propiedades de la disolución extracelular 124.
[0248] El módulo de integración de tasas 180 puede calcular cantidades totales de metabolitos de sustrato suministrados a través de una o más corrientes de entrada 140 y consumidas por la biomasa celular 130 y una cantidad total de producto eliminado o recogido a través de una o más corrientes de salida 142, a lo largo de la duración del periodo de tiempo simulado por el proceso de modelado 100. Por ejemplo, el producto de anticuerpo recogido se puede calcular usando
[0251]
(Ecuación 24),
[0253] dondeANTIes la cantidad en moles o masa del producto de anticuerpo recogido,Tanties una transmisión variable en el tiempo del anticuerpo por el filtro de salida 144,Fsalidaes un caudal que varía con el tiempo de la corriente de salida 142, y[ANTI]es la concentración o densidad molar del anticuerpo en la disolución extracelular 124. El caudal y la transmisión pueden variar con el tiempo para representar diferentes regímenes de operación o para simular el rendimiento del filtro de salida y pueden representarse mediante variables de proceso que se actualizan mediante el módulo de integración de tasas 180. Los regímenes de operación pueden representar una etapa de acumulación del producto en la disolución extracelular 124 y la etapa de recolección que se inicia una vez que la concentración del producto está en un nivel suficiente. Las etapas de acumulación y recolección separadas en la operación con biorreactor real pueden reducir el coste de separar el producto de la corriente de salida 142. La función de transmisión de filtrosTantipuede representar cambios de etapas en la transmisión cuando se reemplaza el filtro 144 o cambios graduales en la transmisión debido a la retención de algunos de los metabolitos filtrados u otros componentes de la corriente de salida 142.
[0255] En algunas implementaciones, el módulo de integración de velocidad 180 puede calcular el estrés sobre la biomasa celular 130 a partir de cambios en la temperatura, pH y/u otras variables de proceso. Estos cambios en las variables de proceso pueden depender de las variables de control 152. Las variables de control 152, en algunas implementaciones, se procesan mediante el análisis de balance de flujo 170 y/o el módulo de integración de tasas 180. El estrés puede acumularse con el tiempo, haciendo que el módulo de integración de tasas 180 sea adecuado para calcular la variable de proceso actualizada indicativa de estrés. Las variables de proceso adicionales pueden facilitar el cálculo del estrés. Por ejemplo, una variable de memoria de temperatura puede indicar una evolución con el tiempo de un efecto del desplazamiento de temperatura sobre el requerimiento de energía de mantenimiento de la biomasa celular 130.
[0257] El módulo de integración de tasas 180 puede usar una tasa de cambio con el tiempo calculada para una concentración de metabolito para calcular un valor actualizado de la variable de proceso correspondiente para la concentración, basándose en el valor actual de la variable de proceso, de la siguiente manera:
[0260]
(Ecuación 25),
[0262] donde[Me]n+1
puede representar el valor actualizado de la concentración extracelular del metabolito M después de la (n 1 )-ésima etapa de tiempo 102 del proceso de modelado 100,[Me]npuede representar el valor actual después ded\Me ]
[0263] la n-ésima etapa de tiempo 102,dtes la derivada calculada, y Afn+i es la duración de la (n 1)-ésima etapa de tiempo.
[0265] <í\Me]
[0266] Para reactores no homogéneos,dtpuede representar la derivada total para una parte del biorreactor, calculada, por ejemplo, en vista de los gradientes en la concentración y un campo de velocidad, como se analizó anteriormente. El campo de velocidad se puede actualizar en cada etapa de tiempo 102, más frecuentemente que la etapa de tiempo 102, o menos frecuentemente que la etapa de tiempo 102. El campo de velocidad puede actualizarse en respuesta a una determinada condición de activación en la simulación. Por ejemplo, un cambio en los caudales de corrientes simuladas que suministran el biorreactor, un cambio en la mezcla simulada del biorreactor o un cambio sustancial en una propiedad física del contenido del biorreactor puede desencadenar un nuevo cálculo del campo de velocidad.
[0267] En algunas implementaciones, la duración de cada etapa de tiempo 102 se mantiene constante, mientras que en otras implementaciones el proceso de modelado puede cambiar la duración de la etapa de tiempo 102 para diferentes valores de n. El cambio en la duración de cada etapa de tiempo 102 puede depender, por ejemplo, de las tasas de flujo calculadas 174, de los caudales de la corriente de entrada 140 o la corriente de salida 142, de las variables de control 152, y/o sobre los requisitos relativos a la velocidad o precisión de la ejecución del proceso de modelado 100.
[0268] El módulo de integración de tasas 180 puede usar una o más de una variedad de técnicas para integrar las derivadas o las tasas de cambio de las variables de proceso para implementar fórmulas de actualización variable de proceso distintas de la Ecuación 24. El módulo de integración de tasas 180 puede usar métodos de primer orden, segundo u orden superior que incluyen métodos de Euler, métodos de Runge-Kutta, fórmulas de diferenciación retrospectiva, técnicas de integración exponencial u otros métodos adecuados.
[0269] La parte iterativa del proceso de modelado 100 puede concluir cuando la variable de proceso correspondiente al tiempo virtual de la simulación indica el final del periodo de tiempo simulado. En la implementación, se pueden almacenar o guardar valores nuevos/actualizados de las variables de proceso calculadas por el proceso de modelado 100 en cada iteración de la etapa de tiempo 102 para un cálculo o procesamiento adicional. Por ejemplo, los valores calculados en diferentes momentos virtuales o diferentes iteraciones de la etapa de tiempo virtual 102 se pueden combinar para crear un conjunto de datos indicativo de la evolución con el tiempo de las variables de proceso.
[0271] Una vez completada la porción iterativa ejecutada para una secuencia de etapas de tiempo 102, el proceso de modelado 100 puede incluir un módulo adicional para calcular una o más métricas del biorreactor modelado computacionalmente 120 basándose en los nuevos valores calculados de las variables de proceso. Una métrica de la una o más métricas puede ser un valor numérico o una colección de valores numéricos en vectores, matrices u otras estructuras de datos adecuadas, un valor de texto o una colección de valores de texto en una estructura de datos adecuada, o un valor booleano o colección de valores booleanos en una estructura de datos adecuada. La métrica puede indicar la calidad de la simulación y la confianza en la salida, o puede ser una medida del rendimiento de un biorreactor real hipotético correspondiente a la simulación. Por ejemplo, la métrica puede ser indicativa de la eficiencia de convertir metabolitos de sustrato en el producto diana, calculándose la eficiencia en términos de coste financiero y/o tiempo. Adicional o alternativamente, la métrica puede ser indicativa de la cantidad total de producto diana producido y/o calidad del producto.
[0273] El proceso de modelado 100 puede incluir un módulo adicional para generar, basándose en la métrica del biorreactor modelado, información mostrada a un usuario a través de una interfaz de usuario, un ajuste de control para un biorreactor del mundo real y/o un conjunto de entrenamiento para un modelo de inteligencia artificial de un biorreactor hipotético del mundo real similar en funcionamiento al biorreactor simulado 120.
[0275] La Figura 2 es un gráfico 200 que representa un efecto a modo de ejemplo de un desplazamiento de temperatura en la variable de estrés calculado en una implementación del proceso de modelado 100. El gráfico 200 tiene un eje temporal horizontal 202 que representa el tiempo, que aumenta de izquierda a derecha, como se simuló mediante el proceso de modelado 100. Un eje vertical de temperatura 204 corresponde a un trazado sólido, etiquetado conTsól,que representa la temperatura de la disolución extracelular 124 y un trazado discontinuo, etiquetado conTmem,que representa la temperatura de la memoria, mientras que otro eje vertical 206 corresponde a un trazado punteado, marcado Estrés, para representar la variable de estrés analizada anteriormente.
[0277] Haciendo referencia aún a la Figura 2, una simulación implementada por el proceso de modelado 100 puede comenzar con la variable de proceso para la temperaturaTdisolde la disolución extracelular 124 a un nivelTique no introduce un estrés sustancial en la biomasa 130 virtual. El nivelTipuede corresponder a la temperatura óptima para el crecimiento de la biomasa celular 130. En un determinado momento, marcado ports,la temperatura de la disolución 124 puede disminuir hasta un nivel inferiorde T2
que es menor que la temperatura óptima para la biomasa celular 130. La disminución de la temperatura puede tener lugar en respuesta a una de las variables de control 152, y puede ser brusca, como se muestra en el gráfico 200, o puede ser más gradual. La brusquedad del desplazamiento de temperatura enTdisolpuede depender del mecanismo de control modelado para el biorreactor 120, incluyendo la velocidad y calidad de mezcla del contenido del biorreactor modelado. Incluso para el cambio brusco en la temperatura mostrado en el gráfico 200, la temperatura de memoriaTmemdetectada por la biomasa 130 puede cambiar más gradualmente, teniendo en cuenta la respuesta biológica a un desplazamiento de temperatura y puede seguir la evolución con el tiempo representada por la siguiente ecuación:
[0280]
(Ecuación 26),
[0282] dondektempes un parámetro del modelo que corresponde a la velocidad de adaptación de la biomasa celular 130 a un desplazamiento de temperatura. El módulo de integración de tasas 180 puede calcularTmem(í)integrando la Ecuación 25 y puede calcular elEstrésintegrando numéricamente el área entreTmemyTdisol,usando la ecuación
[0285]
(Ecuación 27),
[0287] con el resultado representado por la línea de puntos en la representación del gráfico 200 deEstrés.
[0289] La Figura 3 ilustra un sistema informático 300 a modo de ejemplo que puede implementar los métodos y técnicas descritos en el presente documento. El sistema informático 300 de la Figura 3 incluye un ordenador 310. Los componentes del ordenador 310 pueden incluir, pero sin limitación, uno o más procesadores 312 en conexión comunicativa, por medio de un bus de sistema 320, con una memoria de sistema 330. El uno o más procesadores 312 pueden incluir una o más unidades centrales de procesamiento (CPU) de un solo núcleo o de múltiples núcleos, unidades de procesamiento gráfico (GPU) o cualquier otra arquitectura de procesador adecuada. La memoria de sistema 330 puede incluir un componente de memoria de solo lectura (ROM) y un componente de memoria de acceso aleatorio (RAM), por ejemplo. El componente RAM de la memoria de sistema 330 puede ser cualquiera de varios tipos de RAM, incluyendo RAM estática (SRAM), RAM dinámica (DRAM), RAM dinámica sincrónica (SDRAM), SDRAM de doble velocidad de datos (DDR SDRAM) u otro tipo adecuado de RAM. El bus de sistema 320 puede incluir uno o más tipos de estructuras de bus que incluyen un bus de memoria o controlador de memoria, un bus periférico o un bus local, etc., y puede usar cualquier arquitectura de bus adecuada. A modo de ejemplo, y sin limitación, dichas arquitecturas incluyen el bus de arquitectura estándar de la industria (ISA), el bus de arquitectura de canales micro (MCA), el bus ISA mejorado (EISA) y el bus de interconexión de componentes periféricos (PCI) (también conocido como bus Mezzanine).
[0291] El uno o más procesadores 312 también pueden estar en conexión comunicativa, por medio del bus de sistema 320, con uno o más dispositivos periféricos e interfaces de red 340, y con una memoria interna no volátil 342. La memoria interna no volátil puede ser, por ejemplo, una unidad de disco duro (HDD) o una unidad de estado sólido (SSD), por ejemplo. Adicional o alternativamente, los dispositivos de memoria no volátiles externos 344 pueden estar en conexión comunicativa con el ordenador 310 a través de las interfaces periféricas y de dispositivo de red 340. El dispositivo periférico y las interfaces de red 340 pueden incluir una diversidad de conectores o adaptadores para conectarse comunicativamente con dispositivos fuera del paquete o carcasa del ordenador 310.
[0293] El dispositivo periférico y las interfaces de red 340 pueden incluir una o más interfaces de bus serie universal (USB), una o más conexiones de vídeo, incluyendo, sin carácter limitante, VGA (matriz de gráficos de vídeo), DVI (interfaz visual digital) y/o HDMI (interfaz multimedia de alta definición). El dispositivo periférico y las interfaces de red 340 pueden conectarse a uno o más dispositivos de interfaz de usuario 350, incluyendo y sin limitación un monitor 352, un teclado 354 y un ratón 356. En algunas implementaciones, algunos o todos los dispositivos de interfaz de usuario 350 son integrales al ordenador 310, y pueden estar en conexión comunicativa con el uno o más procesadores 312 a través del bus 320. Adicional o alternativamente, el monitor 352, el teclado 354 y el ratón 356 se pueden integrar como una pantalla táctil.
[0295] Adicional o alternativamente a la conexión a los dispositivos de interfaz de usuario 350, la interfaz de dispositivo periférico 340 puede conectarse comunicativamente a uno o más dispositivos de memoria no volátiles externos 344. Los dispositivos de memoria no volátiles 344 pueden incluir HDD, SSD, así como unidades de almacenamiento extraíbles para medios ópticos, magnéticos o electrónicos, incluyendo, pero sin limitación, disco compacto (CD), disco versátil digital (DVD), cinta magnética, disquete o memoria flash. Adicional o alternativamente, el dispositivo periférico y las interfaces de red 340 pueden conectarse comunicativamente a dispositivos de salida que incluyen, y no están limitados a impresoras, trazadores, altavoces o cualquier otro dispositivo de salida visual, auditivo, táctil o háptica adecuado.
[0297] El dispositivo periférico y las interfaces de red 340 pueden incluir uno o más adaptadores de red para conectarse comunicativamente a una o más redes (no representadas) que pueden incluir una red de área local (LAN) y/o una red de área amplia (WAN), tal como internet. Las conexiones pueden ser conexiones cableadas o conexiones inalámbricas, tales como, por ejemplo, el uso de señales de radio u ópticas. A través de la red conectada, el sistema informático 300 puede conectarse comunicativamente a otros sistemas informáticos, dispositivos periféricos u otros dispositivos.
[0299] Colectivamente, el uno o más procesadores 312, el bus 320, la memoria de sistema 330, el dispositivo periférico y las interfaces de red 340, la memoria no volátil interna 342, los dispositivos de memoria no volátiles externos 344 y los dispositivos de interfaz de usuario 350 se pueden denominar hardware de procesamiento del sistema informático 300. El hardware de procesamiento que implementa el proceso de modelado 100 de la Figura 1 puede omitir algunos de los elementos representados en la Figura 3 o comprender elementos adicionales.
[0301] En funcionamiento, el sistema informático 300 puede cargar instrucciones de programa para su ejecución por el uno o más procesadores 312 en la memoria de sistema 330. El sistema puede cargar las instrucciones de programa en la memoria de sistema 330 desde la memoria no volátil interna 342 o desde dispositivos de memoria no volátiles externos 344, por ejemplo. Las instrucciones de programa cargadas en la memoria del sistema pueden incluir un sistema operativo 362, así como una variedad de programas de aplicación 364. En algunas implementaciones, el sistema informático 300 puede hacer que otros sistemas informáticos en conexiones comunicativas con el sistema informático 300 carguen instrucciones de programa para su ejecución por los procesadores de los otros sistemas informáticos.
[0302] Los programas de aplicación 364 cargados en la memoria de sistema 330 del ordenador 310 pueden incluir un programa de simulación de biorreactor 365, que contiene instrucciones para implementar, al menos parcialmente, el proceso de modelado 100 de la Figura 1 usando el hardware de procesamiento del sistema informático 300. En algunas implementaciones, otros sistemas informáticos en conexión comunicativa con el sistema informático 300 pueden implementar partes del proceso de modelado 100 usando hardware de procesamiento de los otros sistemas informáticos. Los programas de aplicación 364 cargados en la memoria de sistema 330 del ordenador 310 pueden incluir adicionalmente un programa de implementación de interfaz de usuario 366 que configura el hardware del sistema informático 300 para implementar partes del proceso de modelado 100 o para contribuir o mejorar la implementación de diversas maneras. Por ejemplo, el programa de implementación de interfaz de usuario 366 puede configurar el hardware para recibir una pluralidad de los valores actuales 150a de las variables de proceso, las variables de control 152 y/o las variables de flujo de entrada y salida 182 al principio o, en algunas implementaciones, en el medio de la simulación. Adicional o alternativamente, el programa de implementación de interfaz de usuario 366 puede configurar el hardware para mostrar información a un usuario a través de una interfaz de usuario representada, por ejemplo, en el monitor 352.
[0304] El programa de implementación de interfaz de usuario 366 puede configurar el hardware para mostrar información a un usuario de diversas maneras. En este contexto, mostrar información puede significar presentarla en forma visual en el monitor 352, o en papel impreso, o en forma de audio a través de altavoces, o en forma táctil o háptica a través de dispositivos táctiles o hápticos o en una variedad de otras maneras adecuadas. El usuario que recibe la información mostrada puede ser un científico, un operario de biorreactores o cualquier otra persona interesada en la información mostrada. En algunas implementaciones, el usuario es otra máquina capaz de procesar la información mostrada y provocar una acción basada en la información procesada. En algunas implementaciones y/o escenarios, un usuario que recibe información a través de al menos uno de los dispositivos de interfaz de usuario 350 y un usuario que introduce información a través de al menos uno de los dispositivos de interfaz de usuario 350 son usuarios distintos.
[0305] Volviendo a los programas de aplicación 364 que pueden incluir un programa de simulación de biorreactor 365 y un programa de implementación de interfaz de usuario 366, los programas de aplicación 364, en funcionamiento, pueden acceder y alterar una parte de datos de programa 368 de la memoria de sistema 330. Los datos de programa 368 pueden incluir los datos recibidos al principio de la simulación junto con todos los nuevos datos calculados a lo largo del transcurso de la simulación. Los datos de programa 368 pueden incluir, por ejemplo, todos o algunos de los casos de los valores actuales 150a de las variables de proceso, los valores actualizados 150b de las variables de proceso, las variables de control 152 y/o las variables de flujo de entrada y salida 182. Los datos del programa 368 pueden incluir el índice o valor de la etapa de tiempo 102, junto con otros parámetros de tiempo de la simulación. Los otros parámetros de tiempo pueden incluir, por ejemplo, la hora de inicio virtual, la hora de finalización virtual y una variedad de tiempos de transición virtuales tales comots(es decir, el tiempo de desplazamiento de temperatura en la Figura 2). Adicionalmente, los datos de programa 368 pueden incluir la una o más métricas del biorreactor 120 modelado computacionalmente basándose en los nuevos valores calculados de las variables de proceso y la información de salida generada basándose en la una o más métricas. La información de salida generada puede incluir información destinada a ser mostrada a un usuario a través de una interfaz de usuario representada en uno o más de los dispositivos de interfaz de usuario 350 o un conjunto de entrenamiento para un modelo de inteligencia artificial de un biorreactor destinado, por ejemplo, para su almacenamiento en una memoria interna no volátil 342 o dispositivos de memoria externa no volátil 344.
[0307] En algunas implementaciones, el programa de simulación de biorreactor 365 y el programa de implementación de interfaz de usuario 366 son partes de una única aplicación. En otras implementaciones, el programa de simulación de biorreactor 365 y el programa de implementación de interfaz de usuario 366 son aplicaciones separadas que comparten los recursos de hardware del ordenador 310 simultáneamente o secuencialmente. Por ejemplo, el programa de implementación de interfaz de usuario 366 puede representar una interfaz de usuario en los dispositivos de interfaz de usuario 350 para recibir los datos necesarios para el programa de simulación de biorreactor 365, y almacenar los datos en la memoria interna no volátil 342 o los dispositivos de memoria externa no volátil 344. En un momento diferente, el programa de simulación de biorreactor 365 puede usar los datos almacenados por el programa de implementación de interfaz de usuario 366 (o por otra aplicación) para implementar el proceso de modelado de biorreactores 100, y para almacenar cualquier métrica generada u otros datos de salida en la memoria interna no volátil 342 o los dispositivos de memoria no volátil externa 344. En un momento posterior, el programa de implementación de interfaz de usuario 366 puede recuperar la salida del programa de simulación de biorreactor 365 y generar una salida adecuada para el usuario.
[0309] Las Figuras 4A y 4B ilustran dos paneles de una interfaz de usuario 400 a modo de ejemplo, que se puede representar en el monitor 352 mediante el programa de implementación de interfaz de usuario 366 que se ejecuta en el ordenador 310, por ejemplo. La interfaz de usuario 400 puede permitir que el proceso de modelado (por ejemplo, el proceso de modelado 100 de la Figura 1) reciba al menos algunos de los valores iniciales de las variables de proceso (por ejemplo, los valores actuales 150a para la primera etapa de tiempo 102). Con este fin, la interfaz de usuario 400 a modo de ejemplo puede incluir un panel 410 para recibir variables de condición experimentales del usuario, y otro panel 412 para recibir variables de composición de medios del usuario, introduciendo el usuario la información a través de los dispositivos de interfaz de usuario 350 (por ejemplo, el teclado 354 y el ratón 356). El panel de condiciones experimentales 410 en la Figura 4A puede contener celdas de entrada 422a-m donde el usuario puede introducir valores numéricos para los valores iniciales designados de las variables de proceso y los botones 424a-m que el usuario puede activar haciendo clic en un botón en el ratón 356 para hacer que los valores correspondientes se carguen en los datos de programa 368.
[0311] Algunos de los valores introducidos en el panel de condiciones experimentales 410 pueden establecer los valores de las variables de control 152 en el proceso de modelado 100. Por ejemplo, el cambio de filtro 422d, el tiempo de cosecha 422f y los tiempos de inyección de glucosa 422m pueden indicar los tiempos virtuales dentro del intervalo de tiempo simulado cuando las variables de proceso pueden cambiar basándose en los controles virtuales, en lugar de actualizar las variables de proceso integrando las tasas de cambio calculadas.
[0312] El panel de composición de medios 412 en la Figura 4B permite que el proceso de modelado 100 reciba del usuario, a través de las células de entrada 432a-h, valores variables iniciales del proceso indicativos de concentraciones de metabolitos en el medio discontinuo o la disolución extracelular 124 del modo discontinuo del biorreactor 120, y/o, a través de las células de entrada 442a-h, concentraciones de metabolitos en la corriente de entrada 140 durante el modo de perfusión de funcionamiento del biorreactor 120. Una vez que comienza el intervalo de tiempo de simulación correspondiente al modo de perfusión, las concentraciones de metabolitos en la corriente de entrada 140 pueden comenzar a afectar a las variables de proceso correspondientes a las concentraciones de metabolito en la disolución extracelular 124 alterando las tasas de cambio correspondientes calculadas por el módulo de integración de velocidad 180.
[0314] La Figura 5 ilustra una interfaz de usuario 500 a modo de ejemplo que muestra información al usuario. El programa de implementación de interfaz de usuario 366 de la Figura 3 puede representar la interfaz de usuario 500 en el monitor 352, por ejemplo. El programa de implementación de interfaz de usuario 366 puede generar la información necesaria para mostrar la interfaz de usuario 500 basándose en métricas calculadas por el programa de simulación de biorreactor 365, y mostrar la información en los paneles 510a-e. Las métricas mostradas pueden incluir trazados 512a-f que representan valores de varias variables de proceso durante el periodo de tiempo simulado. Un usuario puede seleccionar, a través de otra interfaz de usuario proporcionada por el programa de implementación de interfaz de usuario 366, qué variables mostrar. Adicional o alternativamente, el usuario puede elegir mostrar otro conjunto de trazados 514a-f que representan valores de un periodo de tiempo simulado previamente. Los trazados 512a-f, 514a-f de las dos simulaciones pueden reflejar diferentes condiciones de proceso, que pueden haber sido introducidas por el usuario, por ejemplo, a través de la interfaz de usuario 400.
[0316] En un ejemplo, los paneles 510a-e de la interfaz de usuario 500 muestran, respectivamente, un trazado 512a de la variable de biomasa, un trazado 512b de la variable de lactato, un trazado 512c de la variable de glucosa, un trazado 512d de la variable de amoniaco, un trazado 512e de la variable de permeado y un trazado 512f de la variable de anticuerpo. La comparación ofrecida por los trazados 514a-f correspondientes de una simulación previa puede proporcionar al usuario información útil sobre los cambios esperados en el rendimiento de ejecución de un biorreactor hipotético, sin tener que llevar a cabo un experimentoin vivocon un biorreactor del mundo real. Los trazados de permeado 512e, 514e pueden indicar la evolución temporal virtual, por ejemplo, a lo largo de varios días, de la concentración o cantidad del producto de anticuerpo recolectado de la corriente de salida 142. Los aumentos bruscos desde el valor basal cero de los trazados de permeado 512e, 514e pueden corresponder a iniciar la recolección virtual en los tiempos virtuales introducidos en la celda de entrada 422f para el tiempo de recolección de la interfaz de usuario 400A. El inicio de la recolección también puede corresponder a un cambio del modo discontinuo al modo de perfusión de operación del biorreactor 120 simulado, o un cambio en el filtro virtual 144 que controla la cantidad del producto de anticuerpo diana en la corriente de salida 142, y un cambio correspondiente en el cálculo de actualizaciones a la variable de concentración de anticuerpo por el módulo de integración de tasas 180. Por consiguiente, a medida que comienza la simulación de la recolección, los trazados 512f, 514f indicativos de la concentración de anticuerpo en la disolución extracelular comienzan a disminuir.
[0318] Los trazados 512a, 514a para la biomasa pueden indicar dos regiones distintas: una alta tasa de región de crecimiento seguida de la región de crecimiento más lenta. La transición entre las dos regiones puede corresponder a la introducción de estrés, por ejemplo, por caída de la temperatura de la disolución extracelular deTiaT2
en el momentots,tal como se muestra en la Figura 2, y basándose en los valores introducidos en las celdas de entrada 422g-i de la interfaz de usuario 400A. Los cambios correspondientes al desplazamiento de temperatura en las trazas de subproductos metabólicos 512b, 514b, 512d, 514d para lactato y amoniaco pueden indicar una disminución en la producción de lactato y un aumento en la producción de amoniaco, según se calcula mediante el análisis de balance de flujo 170 del proceso de modelado 100. La variabilidad en la primera mitad de los trazados de glucosa 512c, 514c puede corresponder a la introducción de inyecciones de glucosa en la corriente de flujo de entrada 140, de acuerdo con los valores introducidos en las celdas de entrada 422l-m de la interfaz de usuario 400A. En la implementación a modo de ejemplo, los trazados presentados en los paneles 510a-f implican una dependencia mutua de los valores variables de proceso calculados usando el proceso de modelado 100 por los programas de aplicación 365, 366 que se ejecutan en el sistema informático 300.
[0320] La Figura 6 ilustra un sistema de control de biorreactor 600, en una implementación donde el o los programas para modelar un biorreactor (por ejemplo, programa de simulación de biorreactor 365 y/u otra aplicación) hacen que el hardware de procesamiento del ordenador 610 genere un ajuste de control para un biorreactor del mundo real 620. El ordenador puede ser el ordenador 310 en la Figura 3, y puede comunicar la configuración de control sobre una de las interfaces de las interfaces periféricas y de red 340, por ejemplo. El sistema de control de biorreactor 600 puede incluir, además del biorreactor del mundo real 620, un controlador 630 y uno o más sensores 640. El controlador 630 puede estar en conexión comunicativa con el uno o más sensores 640 que detectan, miden y/o transducen las propiedades físicas, químicas y biológicas del biorreactor 620 y cualquier sistema conectado. Los sensores 640 pueden medir el peso del biorreactor 620, un nivel de líquido dentro del biorreactor 620, temperatura en una pluralidad de ubicaciones, acidez, turbidez, densidad óptica, osmolaridad, niveles de oxígeno, concentraciones de una diversidad de metabolitos, composiciones químicas de muestras sólidas, líquidas o gaseosas, recuentos celulares y cualquier otro indicador adecuado de rendimiento o funcionamiento del biorreactor 620 y/o componentes conectados de manera fluida o mecánica al biorreactor 620, por ejemplo.
[0321] El controlador 630 puede controlar, a través de una o más conexiones comunicativas, eléctricas o mecánicas, una diversidad de componentes mecánicos y/o eléctricos, incluyendo uno o más calentadores o intercambiadores de calor, uno o más mezcladores, transductores, bombas, válvulas y/u otros dispositivos para alterar las propiedades físicas, químicas y biológicas del biorreactor 620 y su contenido. En algunas implementaciones, el controlador 630 controla una o más cantidades asociadas con el biorreactor 620 (por ejemplo, temperatura, concentración de glucosa, etc.) usando el hardware, firmware y/o software de controlador proporcional-integral-derivativo (PID) respectivos. El controlador, por ejemplo, puede provocar un cambio en el caudal o composición de entrada del flujo en el biorreactor 620, y/o en la temperatura del contenido del biorreactor 620. El controlador puede iniciar cambios en los modos de operación del biorreactor 620, incluyendo, por ejemplo, el desplazamiento del modo de funcionamiento discontinuo al funcionamiento de flujo continuo al modo de perfusión, del modo de alta tasa de crecimiento en el entorno sustancialmente óptimo para el crecimiento celular al modo de estrés para aumentar la producción de un producto diana, del modo de producción al modo de recolección, y/o cualquier otro cambio deseado. El controlador 630 puede adoptar cualquiera de las acciones descritas anteriormente en respuesta a una o más configuraciones de control comunicadas al controlador 630 por el ordenador 610. Adicional o alternativamente, el controlador 630 puede comunicar las señales desde los sensores 640 al ordenador 610. El ordenador 610 puede usar las señales de los sensores 640 en la implementación del proceso de modelado 100. Por ejemplo, el ordenador 610 puede ajustar uno o más parámetros de modelado del modelo 104 basándose, al menos en parte, en las señales de sensor recibidas desde el controlador 630. En algunas implementaciones, los sensores 640 están en conexión comunicativa directa con el ordenador 610. En algunas implementaciones donde el ordenador 610 es el ordenador 310 de la Figura 3, un usuario puede introducir valores indicativos de señales de sensor a través de dispositivos de interfaz de usuario 350 o a través de dispositivos de memoria no volátiles externos 344. En algunas implementaciones, el controlador 630 implementa un control predictivo modelo (MPC) para controlar los componentes mecánicos y/o eléctricos.
[0323] Independientemente de que las señales de los sensores 640 se usen o no en la implementación del proceso de modelado 100, un ajuste de control generado por el ordenador 610 y basado al menos en parte en una métrica del biorreactor 120 modelado computacionalmente puede, por medio del controlador 630, alterar el funcionamiento del biorreactor del mundo real 620. Por ejemplo, el proceso de modelado 100 implementado en el ordenador 610 puede calcular una métrica indicativa de un tiempo óptimo para cambiar un modo de funcionamiento y enviar la configuración de control correspondiente al controlador 630. En algunas implementaciones, el ordenador 310 y el ordenador 610 son diferentes dispositivos en conexión comunicativa entre sí, y el ajuste de control es generado por el ordenador 310. El ajuste de control se puede transferir al ordenador 610 por medio de una red a través de uno del dispositivo periférico e interfaces de red 340, o por medio de uno de los dispositivos de memoria no volátil externa 344, por ejemplo. En algunas implementaciones, los ajustes de control para el biorreactor del mundo real 620 son parte del control basado en modelos en tiempo real del biorreactor 620. En otras implementaciones, el ajuste de control se basa en una métrica generada por un modelo en un momento previo como parte de un experimento informático relevante para el funcionamiento del biorreactor del mundo real 620.
[0325] La Figura 7 es un diagrama de flujo que representa un método 700 implementado por ordenador para modelar computacionalmente un biorreactor, de acuerdo con un ejemplo de implementación. El método 700 puede aplicar el modelo computacional 104 de la Figura 1, y puede incluir la ejecución del proceso de modelado 100 de la Figura 1, por ejemplo. Además, el método 700 puede implementarse mediante el procesador o los procesadores 312 del ordenador 310 (por ejemplo, cuando se ejecuta el programa de simulación del biorreactor 365), o mediante otro dispositivo de cálculo o sistema informático adecuado. El método 700 puede adaptarse para modelar biorreactores espacialmente no homogéneos usando, por ejemplo, las técnicas descritas anteriormente.
[0327] El método 700 incluye recibir una pluralidad de valores actuales de variables de proceso (bloque 710). Los valores se pueden recibir de un usuario a través de una interfaz gráfica de usuario, como se ejemplifica en las Figuras 4A y 4B y la discusión asociada. Como se ilustra en la Figura 6 y la discusión asociada, en algunas implementaciones, los valores recibidos pueden basarse en mediciones de un biorreactor real. Formas adicionales o alternativas de recibir u obtener los valores actuales de las variables de proceso pueden incluir cargar valores de la memoria del ordenador (por ejemplo, valores calculados previamente) y/o cargar valores por defecto predeterminados desde el almacenamiento del ordenador.
[0329] Las variables de proceso recibidas en el bloque 710 pueden describir contenidos virtuales de un biorreactor, tal como la biomasa celular 130 virtual en la disolución extracelular 124 virtual del biorreactor modelado 120 de la Figura 1, por ejemplo. Las variables de proceso pueden incluir temperatura, acidez y/o una o más variables indicativas de osmolaridad total, por ejemplo, que describen una disolución extracelular (por ejemplo, disolución extracelular 124), biomasa (por ejemplo, biomasa 130) y/o corrientes de entrada y salida (por ejemplo, corriente de entrada 140 y/o corriente de salida 142). Adicional o alternativamente, las variables de proceso pueden indicar la cantidad o concentración de biomasa virtual (por ejemplo, biomasa 130) y/o la cantidad o concentración de cualquiera de los metabolitos en una disolución extracelular virtual (por ejemplo, disolución 124) y/o corrientes de entrada y salida (por ejemplo, corriente de entrada 140 y/o corriente de salida 142). Los metabolitos con cantidades o concentraciones descritas por las variables del proceso pueden incluir oxígeno, dióxido de carbono, amoniaco, lactato, glucosa, asparagina, glutamina, glicina y/o cualquier otro metabolito adecuado. Las variables pueden describir cantidades o concentraciones de metabolitos extracelulares y/o intracelulares (dentro de las células virtuales). En algunas implementaciones, las variables de proceso describen concentraciones de metabolitos en diferentes orgánulos celulares o aparatos. Además, cuando el método 700 modela biorreactores no homogéneos, las variables de proceso pueden describir cada una de las partes modeladas del biorreactor.
[0331] Para calcular nuevos valores de las variables de proceso durante un periodo de tiempo simulado, el método 700 puede generar, en el bloque 720, para cada etapa de tiempo dada (por ejemplo, múltiples iteraciones de la etapa de tiempo 102), una pluralidad de restricciones sobre las tasas de flujo de flujos metabólicos (por ejemplo, que describe la biomasa celular 130 virtual). Los flujos metabólicos pueden ser los flujos representados como 132a-i de la Figura 1, los flujos enumerados en la Tabla 2, o cualquier otra descripción adecuada de vías metabólicas y/o reacciones bioquímicas en el proceso metabólico celular. Los flujos metabólicos pueden describir redes metabólicas de diferentes tipos de células, incluyendo células bacterianas, células animales y/o células fúngicas. Los tipos de células modeladas por la biomasa celular pueden incluir células madre o células reproductoras, tales como, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO).
[0333] El método 700 puede generar las restricciones sobre las tasas de flujo modelando uno o más efectos de al menos algunos de los valores actuales (por ejemplo, los valores actuales 150a) de las variables de proceso sobre la cinética de reacción metabólica usando un modelo cinético tal como, por ejemplo, el modelo cinético 160. Las tasas de flujo restringidas pueden incluir captación de glucosa, captación de glutamina, captación de asparagina, captación de oxígeno y/o cualquier otra tasa de flujo directa o indirectamente limitada, en el extremo alto y/o en el extremo bajo, por condiciones extracelulares (por ejemplo, las condiciones de la disolución extracelular 124). Las condiciones limitantes pueden incluir temperatura, acidez y/u osmolaridad, por ejemplo. Las restricciones sobre las tasas de flujo metabólico pueden incluir límites superiores y/o inferiores de las tasas de flujo para el crecimiento de biomasa o el consumo de energía para el mantenimiento celular. El modelado de uno o más efectos de los valores actuales de las variables de proceso sobre la cinética de reacción metabólica puede incluir calcular el efecto de la temperatura, la acidez y/u la osmolaridad en el límite superior de la tasa de captación de metabolitos multiplicando un límite superior en condiciones ideales con un factor de corrección indicativo de una reducción en la tasa de captación debido a condiciones no ideales. Los factores de corrección pueden construirse en vista de la observación experimental de cultivos celulares del mundo real afectados por cambios en las condiciones. Estas y otras observaciones experimentales pueden incluirse en un procedimiento de calibración para un modelo computacional, tal como el modelo computacional 104.
[0334] Los efectos de los valores actuales de las variables del proceso sobre la cinética de reacción metabólica pueden incluir el efecto del estrés sobre el límite inferior de la tasa de consumo de energía para el mantenimiento celular. El estrés puede aumentarse para inducir una tasa más alta de producción de un producto diana. En una implementación, como se ilustra en la Figura 2, un desplazamiento de temperatura induce estrés, requiriendo que la biomasa celular expanda más energía en procesos sin crecimiento. Otras formas de inducir estrés en la biomasa celular pueden ser cambiar la acidez u osmolaridad de la disolución extracelular. Los efectos de los valores actuales de las variables del proceso sobre la cinética de la reacción metabólica pueden incluir los efectos de los subproductos metabólicos. La concentración de lactato y la concentración de amoniaco pueden estar entre los factores que afectan las restricciones en las tasas de flujo calculadas por el modelo cinético. Modelar los efectos anteriores puede incluir calibrar los efectos modelados con datos experimentales de un cultivo celular del mundo real.
[0336] El método 700 puede continuar, en el bloque 730, con el cálculo de las tasas de flujo de los flujos metabólicos (por ejemplo, para la biomasa virtual 130), realizando un análisis de balance de flujo (por ejemplo, análisis de balance de flujo 170). El análisis del balance de flujo puede estar sujeto a un objetivo metabólico (por ejemplo, el objetivo metabólico 172) y la pluralidad generada de las restricciones (por ejemplo, restricciones 164) en las tasas de flujo. En la Tabla 4 anterior se enumeran algunos objetivos metabólicos a modo de ejemplo. Se puede generar una amplia clase de objetivos metabólicos minimizando una relación de combinaciones lineales de al menos algunas de las tasas de flujo y cuadrados de las tasas de flujo. Cada peso en las combinaciones lineales puede ser positivo, negativo o cero. Por lo tanto, el objetivo metabólico generado puede, por ejemplo, maximizar eficazmente el crecimiento por relación de flujo total, o maximizar el crecimiento en relación con el consumo de metabolitos del sustrato. En un escenario con energía de mantenimiento insuficiente, por ejemplo, puede ser imposible lograr un crecimiento no negativo, y maximizar la energía de mantenimiento puede ser el objetivo metabólico usado en el análisis del balance de flujo. Cuando hay suficiente energía de mantenimiento, maximizar la tasa de crecimiento de la biomasa virtual puede ser el objetivo metabólico usado en el análisis del balance de flujo.
[0338] En el bloque 740, el método 700 puede calcular las tasas de cambio de al menos algunas de las variables de proceso basándose al menos en parte en las tasas de flujo calculadas en el bloque 730. El cálculo de las tasas de cambio puede incluir recibir una o más variables indicativas de caudal y la composición de la corriente de entrada (por ejemplo, las variables de flujo 182 correspondientes a la corriente de entrada 140), la corriente de salida (por ejemplo, las variables de flujo 182 correspondientes a la corriente de salida 142) y/o el filtro de salida (por ejemplo, el filtro 144).
[0339] El método 700 puede actualizar entonces, en el bloque 750, uno o más de los valores actuales (por ejemplo, valores actuales 150a) de las variables de proceso, al menos en parte integrando una o más de las tasas de cambio calculadas durante la duración de la etapa de tiempo virtual. Esto puede concluir una iteración de una etapa de tiempo virtual dada. Por ejemplo, los valores actualizados al final de una etapa de tiempo pueden convertirse en los valores actuales usados para la siguiente etapa de tiempo. El bloque 750 se puede realizar mediante el módulo de integración de tasas 180 de la Figura 1, por ejemplo, cuando se calculan los valores actualizados 150b a partir de los valores actuales 150a. El método 700 puede calcular (usando, por ejemplo, el módulo de integración de tasas 180) los valores actualizados, al menos en parte, contabilizando las variables indicativas del caudal y la composición de las corrientes de entrada y/o salida. El método 700 puede incluir, en el bloque 750, las variables de corriente en la diferencia de balance de masas o ecuaciones diferenciales analizadas anteriormente, y resolver las ecuaciones mediante integración. Las ecuaciones de balance de masas pueden incluir, adicional o alternativamente, los efectos de las variables indicativas de las propiedades del filtro de salida virtual sobre la composición de la corriente de salida virtual.
[0340] Cuando el método 700 modela un biorreactor no homogéneo, el método puede incluir actualizar las variables de proceso para cada parte del biorreactor modelado al menos en parte basándose en un campo de velocidad calculado. El campo de velocidad se puede calcular, por ejemplo, usando un modelo CFD. El método 700 puede actualizar las variables de proceso para una parte del biorreactor en vista de las variables de proceso para las partes vecinas del biorreactor. En algunas implementaciones, el método 700 puede definir gradientes para al menos algunas de las variables de proceso en al menos algunas de las partes modeladas del biorreactor.
[0342] Antes de pasar al bloque 760, el método 700 puede iterar los bloques 710-750 para una parte o una totalidad del periodo de tiempo simulado, dividido en la secuencia de etapas de tiempo. En otras implementaciones, el bloque 760 se produce en paralelo con las iteraciones asociadas con uno o más de los bloques 720-750. En el bloque 760, los nuevos valores de las variables de proceso calculadas durante cualquier etapa o etapas de tiempo virtual se usan para calcular una métrica del biorreactor modelado o, más generalmente, un modelo del sistema que contiene el biorreactor virtual (por ejemplo, el modelo 104). La métrica del biorreactor modelado computacionalmente puede indicar la eficacia o eficiencia del biorreactor modelado computacionalmente en la producción de un producto diana. Por ejemplo, la métrica puede indicar una salida total del producto, un rendimiento con respecto a la energía y/o metabolitos del sustrato, productividad del reactor y/o calidad del producto diana. En algunas implementaciones, se calculan múltiples métricas en el bloque 760. La métrica o métricas, adicional o alternativamente, pueden incluir valores de al menos una de las variables de proceso en diferentes tiempos virtuales dentro del periodo de tiempo simulado, como se ilustra, por ejemplo, en la Figura 5 y la descripción asociada. Para un biorreactor no homogéneo, las métricas calculadas para porciones del biorreactor pueden contribuir a la métrica para el biorreactor en su conjunto. Sin embargo, en algunas implementaciones, la métrica del biorreactor puede basarse en una o más partes del biorreactor que incluyen la corriente de salida del biorreactor. Adicional o alternativamente, el método 700 puede generar, en el bloque 760, una métrica indicativa de falta de homogeneidad dentro del biorreactor.
[0344] En el bloque 770 del método 700, la información se puede generar y mostrar a un usuario a través de una interfaz de usuario representada, por ejemplo, en un monitor (por ejemplo, el monitor 352). El método 700 puede generar la información mostrada basándose, al menos en parte, en la métrica calculada en el bloque 760. En algunas implementaciones, el bloque 770 incluye adicional o alternativamente generar un ajuste de control para un biorreactor del mundo real (por ejemplo, biorreactor 620), tal como se representa, por ejemplo, en la Figura 6 y la descripción adjunta. En algunas implementaciones, el método 700 se integra en un esquema de control basado en un modelo de un biorreactor del mundo real (por ejemplo, usando control predictivo modelo). Cuando se modela biorreactores no homogéneos, el método 700 puede mostrar falta de homogeneidad en la interfaz de usuario, o generar una o más configuraciones de control basadas, por ejemplo, en una métrica calculada de falta de homogeneidad. Por ejemplo, la mezcla puede iniciarse o mejorarse cuando el indicativo métrico de la falta de homogeneidad supera un umbral.
[0345] Adicional o alternativamente, el bloque 770 puede incluir generar un conjunto de entrenamiento para un modelo de inteligencia artificial de un biorreactor usando la métrica calculada en el bloque 760 como una etiqueta de verdad fundamental para un modelo de biorreactor, siendo el modelo descrito mediante un conjunto de parámetros. Una pluralidad de ejecuciones del método 700 puede permitir una acumulación de una pluralidad de conjuntos de datos de parámetros de modelo y métricas correspondientes. Los conjuntos de datos pueden usarse para entrenar el modelo de inteligencia artificial basado en redes neuronales, redes neuronales convolucionales, árboles de decisión, algoritmos de agrupación y/u otras técnicas de aprendizaje automático adecuadas. El modelo de inteligencia artificial entrenado puede entonces estimar o predecir una nueva métrica basada en los parámetros del modelo de biorreactor, sin necesidad de ejecutar de nuevo el método de modelado computacional 700.
[0347] La Fig. 8 ilustra un ejemplo de evolución de variables de proceso y métricas calculadas usando el método 700. Se recibieron un conjunto de datos para variables iniciales del proceso (incluyendo pH, temperatura, composiciones de medios) y un programa de alimentación de medios (corriente de entrada) para un proceso de fabricación de un anticuerpo monoclonal. El proceso se modeló computacionalmente de acuerdo con el flujo de trabajo ilustrado en las Fig. 1 y 7 y descritos anteriormente. Los valores de las variables de proceso (en unidades arbitrarias) correspondientes a las concentraciones de metabolitos (CC-GLC, tal como se define en la Tabla 3), y las métricas de viabilidad celular, densidad celular viable (VCD) y producto de anticuerpo (título) calculadas por el modelo se representan como líneas sólidas en la Fig. 8. Los valores de las concentraciones de metabolitos, la densidad celular viable (VCD), la viabilidad celular y el título de anticuerpos medido durante una ejecución en el mundo real del mismo proceso de fabricación se representan como puntos en la misma escala que los valores calculados correspondientes. Los modelos computacionales predijeron sustancialmente el rendimiento del proceso en el mundo real observado. Las marcadas variaciones en las concentraciones de ciertos metabolitos se debieron a la alimentación discontinua del biorreactor -los metabolitos se añadieron como lotes en una determinada hora del día. Los metabolitos medidos carecen de las marcadas variaciones debido a que las mediciones se limitaron a la hora del día antes de la adición de metabolitos de alimentación. La métrica de viabilidad (VIAB) representa las células de la fracción en la biomasa que todavía son capaces de producir producto y depende del efecto acumulado de la muerte celular, como se ha descrito anteriormente. El VCD representa entonces la concentración de biomasa multiplicada por la viabilidad.
[0349] Las Fig. 9A y 9B ilustran esquemáticamente un ejemplo de enfoque para modelar la falta de homogeneidad espacial en un biorreactor 900. El biorreactor 900 puede incluir un accionador 905 u otro dispositivo de mezcla configurado para mezclar el contenido del biorreactor. La Fig. 9A ilustra un ejemplo de partición del biorreactor 900 en múltiples partes 910a-d. Un modelo metabólico homogéneo (por ejemplo, modelo 104) puede representar cada una de las partes 910a-d. Cada una de las partes 910a-d puede compartir un borde con una o más partes diferentes. En el ejemplo ilustrado, la parte 910c está dispuesta completamente dentro de la parte 910d, mientras que la parte 910d limita con las otras tres partes, es decir, 910a-c. Las entradas y salidas (no ilustradas) en el biorreactor 900 pueden añadir o eliminar metabolitos a o desde cualquiera de las partes modeladas 910a-c. Para cada una de las partes 910ad, las corrientes de entrada y salida modeladas (por ejemplo, corrientes 140, 142) pueden incluir flujo de contenidos virtuales debido a las entradas y salidas, así como a través de los bordes con las partes vecinas. El flujo de contenidos virtuales a través de los bordes entre las partes de biorreactor 910a-d puede seguir un ejemplo de campo de velocidad 920 ilustrado en la Fig. 9B. El cálculo de las corrientes de entrada y salida puede incluir estimar los gradientes de las variables de proceso en los bordes como diferencias correspondientes en los valores variables de proceso en las regiones limítrofes, integrar el campo de velocidad 920 en cada borde (y normal al borde) y multiplicar los gradientes estimados por los valores integrados del campo de velocidad 920 correspondientes a cada borde.
[0351] La Fig. 9B ilustra el campo de velocidad 920 como un conjunto de flechas discontinuas. Un modelo de CFD puede calcular el campo de velocidad 920 basándose en una discretización de volumen del biorreactor 900 y técnicas computacionales adecuadas. En algunas implementaciones, un método (por ejemplo, el método 700) de modelado computacional del biorreactor 900 puede determinar el campo de velocidad 920 basándose al menos en parte en mediciones (por ejemplo, velocimetría de partículas) o una combinación de campos de velocidad precalculados o medidos. El campo de velocidad 920 puede depender de la geometría del biorreactor 900 y del impulsor 905, así como de la velocidad del impulsor 905. El campo de velocidad 920 también puede depender de corrientes de entrada y salida de cualquiera de las entradas y salidas del biorreactor 900. De manera importante, en un conjunto estático de condiciones, el campo de velocidad 920 puede tener un estado estacionario desde el cual el modelo puede calcular el flujo de contenidos virtuales a través de los bordes entre las partes de biorreactor 910a-d. Adicional o alternativamente, la dinámica de fluidos y los modelos metabólicos acoplados pueden explicar los cambios dinámicos en el campo de velocidad 920 y el efecto correspondiente sobre la evolución de las concentraciones de metabolitos en las partes de biorreactor 910a-d.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Un método de modelado computacional de un biorreactor que tiene en cuenta la falta de homogeneidad espacial, en donde el método comprende:
recibir una pluralidad de valores actuales de variables de proceso, describiendo las variables de proceso el primer contenido virtual de una primera parte del biorreactor modelado y uno o más contenidos virtuales adicionales de una o más partes adicionales correspondientes del biorreactor modelado, e incluyendo los contenidos virtuales la biomasa celular virtual en una disolución extracelular virtual;
calcular, mediante el procesamiento de hardware de un sistema informático, nuevos valores de las variables de proceso durante un período de tiempo simulado, al menos en parte mediante
la generación de una pluralidad de restricciones en las tasas de flujo de flujos metabólicos que describen la biomasa celular virtual modelando uno o más efectos de al menos algunos de los valores actuales de las variables de proceso sobre la cinética de reacción metabólica,
el cálculo de las tasas de flujo de los flujos metabólicos realizando un análisis de balance de flujo sujeto a un objetivo metabólico y la pluralidad generada de las restricciones sobre las tasas de flujo,
el cálculo de las tasas de cambio de al menos algunas de las variables de proceso basándose al menos en parte en las tasas de flujo calculadas; y
la actualización de uno o más de los valores actuales de las variables de proceso al menos en parte integrando una o más de las tasas de cambio calculadas para una etapa de tiempo virtual dentro del periodo de tiempo simulado; el cálculo, mediante el hardware de procesamiento, de una métrica del biorreactor modelado computacionalmente basada en los nuevos valores calculados de las variables de proceso; y
la generación, mediante el hardware de procesamiento, y basándose en la métrica del biorreactor modelado, de uno o más de i) información mostrada a un usuario a través de una interfaz de usuario, ii) un ajuste de control para un biorreactor del mundo real, o iii) un conjunto de entrenamiento para un modelo de inteligencia artificial de un biorreactor.
2. El método de la reivindicación 1, en donde las variables de proceso incluyen
1) al menos una de: temperatura, acidez o una o más variables indicativas de osmolaridad total de los contenidos virtuales, o
2) una o más variables indicativas de concentración de la biomasa celular virtual y una o más variables indicativas de concentraciones de metabolitos extracelulares en la disolución extracelular virtual, opcionalmente en donde la una o más variables indicativas de las concentraciones de metabolito extracelular en la disolución extracelular virtual incluyen una o más variables indicativas de concentraciones de al menos uno de: oxígeno, dióxido de carbono, amoniaco, glucosa, asparagina, glutamina, glicina o al menos un producto metabólico diana, opcionalmente en donde las variables del proceso incluyen adicionalmente una o más variables indicativas de una o más concentraciones de metabolito intracelular en la biomasa celular virtual.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la pluralidad de las restricciones sobre las tasas de flujo incluye un límite superior en al menos uno de i) captación de glucosa, ii) captación de glutamina, iii) captación de asparagina, o iv) captación de oxígeno o la pluralidad de restricciones sobre las tasas de cambio incluye un límite inferior sobre una tasa de consumo de energía para el mantenimiento celular.
4. El método de la reivindicación 1, donde el uno o más efectos de al menos algunos de los valores actuales de las variables de proceso sobre la cinética de reacción metabólica incluye:
1) un efecto de un valor de al menos uno de i) temperatura, ii) acidez, o iii) osmolaridad en un límite superior de una tasa de captación de metabolitos, opcionalmente en donde modelar el uno o más efectos de al menos algunos de los valores actuales de las variables de proceso sobre la cinética de reacción metabólica incluye calcular el efecto del valor de al menos uno de: i) temperatura, ii) acidez, o iii) osmolaridad en el límite superior de la tasa de captación de metabolitos multiplicando el límite superior con un factor de corrección indicativo de una reducción en la tasa de captación debido a condiciones no ideales;
2) un efecto del estrés sobre un límite inferior de la tasa de consumo de energía para el mantenimiento celular, opcionalmente en donde modelar el efecto del estrés incluye calcular el efecto basándose al menos en parte en un efecto acumulativo de un desplazamiento de temperatura sobre la biomasa celular virtual; o
3) un efecto de la concentración de al menos uno de los subproductos metabólicos.
5. El método de la reivindicación 1, en donde modelar el uno o más efectos incluye calibrar los efectos modelados con datos experimentales de un cultivo celular del mundo real.
6. El método de la reivindicación 1, en donde el objetivo metabólico incluye:
1) minimizar una relación de combinaciones lineales de al menos algunas de las tasas de flujo y cuadrados de las tasas de flujo en el análisis de balance de flujo; o
2) minimizar una combinación lineal de al menos algunas de las tasas de flujo en el análisis de balance de flujo, opcionalmente en donde la combinación lineal es una suma de los flujos en el análisis de balance de flujo.
7. El método de la reivindicación 1, en donde el objetivo metabólico incluye maximizar la tasa de consumo de energía para el mantenimiento celular o maximizar una tasa de crecimiento de la biomasa celular virtual.
8. El método de la reivindicación 1, que comprende además:
1) recibir una o más variables indicativas de caudales y composiciones de una o más corrientes de entrada virtuales en el biorreactor modelado, y en donde actualizar los al menos algunos de los valores actuales de las variables de proceso incluye tener en cuenta los caudales y las composiciones de la una o más corrientes de entrada virtuales en al menos una de la primera porción o la una o más porciones adicionales del biorreactor modelado, opcionalmente en donde actualizar al menos algunos de los valores actuales de las variables de proceso incluye resolver ecuaciones de balance de masas, que opcionalmente comprende además:
recibir una o más variables indicativas de las propiedades de un filtro de salida virtual;
calcular composiciones de uno o más flujos de salida virtuales del biorreactor modelado usando las propiedades del filtro de salida virtual, y
en donde actualizar los al menos algunos de los valores actuales de las variables de proceso incluye contabilizar las composiciones de la una o más corrientes de salida virtuales de al menos una de la primera parte o la una o más partes adicionales del biorreactor modelado; o
2) recibir una o más variables de control, y actualizar un conjunto afectado de los valores actuales de las variables de proceso al menos en parte basándose en las variables de control recibidas.
9. El método de la reivindicación 1, en donde
1) la métrica del biorreactor modelado incluye valores de al menos una de las variables de proceso en diferentes tiempos virtuales dentro del periodo de tiempo simulado; o
2) la métrica del biorreactor modelado computacionalmente indica la eficacia o eficiencia del biorreactor modelado computacionalmente en la producción de un producto diana.
10. El método de la reivindicación 1, en donde
1) el método comprende generar el ajuste de control, y en donde el método comprende además controlar una entrada a un biorreactor del mundo real basándose en la configuración de control generada, o
2) el método comprende generar el conjunto de entrenamiento para un modelo de inteligencia artificial de un biorreactor.
11. El método de la reivindicación 1, en donde recibir la pluralidad de los valores actuales incluye al menos uno de i) recibir valores de un usuario a través de una interfaz gráfica de usuario;
ii) recibir valores basados en mediciones de un biorreactor real;
iii) cargar valores de la memoria del ordenador y basados en valores calculados previamente; o
iv) cargar valores por defecto predeterminados desde el almacenamiento del ordenador.
12. El método de la reivindicación 1, en donde:
las variables de proceso incluyen las primeras variables de proceso que describen los primeros contenidos virtuales y una o más variables de proceso adicionales que describen los respectivos contenidos virtuales del uno o más contenidos virtuales adicionales;
el método incluye además recibir una pluralidad de valores actuales de la una o más variables de proceso adicionales; y
el cálculo de los nuevos valores de las primeras variables de proceso durante el periodo de tiempo simulado se basa en parte en la pluralidad recibida de los valores actuales de la una o más variables de proceso adicionales.
13. El método de la reivindicación 12, en donde calcular los nuevos valores de las primeras variables de proceso durante el periodo de tiempo simulado incluye calcular un gradiente de al menos una de las primeras variables de proceso basándose en un valor de una correspondiente de la una o más variables de proceso adicionales.
14. El método de la reivindicación 12, que comprende además:
determinar una o más velocidades asociadas con el primer contenido virtual, opcionalmente en donde la determinación de la una o más velocidades se basa al menos en parte en la dinámica de fluidos computacional.
15. Un medio no transitorio legible por ordenador que almacena instrucciones que, cuando son ejecutadas por uno o más procesadores, hacen que el uno o más procesadores realicen el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
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