ES3049784T3 - Compstatin analogues and their medical uses - Google Patents

Abstract

Se describen análogos de compstatina con una actividad de unión e inhibición del complemento mejoradas en comparación con el péptido compstatina de 13 aminoácidos (ICVVQDWGHHRCT (cíclico C2-C12)), en particular análogos de compstatina que además poseen propiedades fisicoquímicas útiles. Los análogos tienen un enlace tioéter en lugar de un enlace disulfuro entre las cadenas laterales de los residuos correspondientes a las cisteínas 2 y 12 de compstatina, lo que puede aumentar la estabilidad. Los análogos también pueden tener un residuo de isoleucina en la posición 3 en lugar del residuo de valina de tipo silvestre, lo que proporciona a los péptidos de compstatina una actividad de unión e inhibición del complemento mejoradas y también permite la introducción de otras modificaciones, por ejemplo, modificaciones capaces de aumentar la solubilidad, como la introducción de aminoácidos cargados o polares en la posición 9 y/o la introducción de secuencias N- y/o C-terminales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Análogos de compstatina y sus usos médicos

[0005] Campo de la invención

[0007] La presente invención se refiere a la inhibición de la activación de la cascada del complemento en el cuerpo y, más particularmente, a los análogos de compstatina que son capaces de unirse a la proteína C3 e inhibir la activación del complemento. La presente invención también se refiere a los usos médicos de los análogos de compstatina, en particular, para el tratamiento de afecciones caracterizadas por la activación no deseada de la cascada del complemento, tales como enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias.

[0009] Antecedentes de la invención

[0011] El sistema del complemento humano es un actor poderoso en la defensa contra los organismos patógenos y en la mediación de las respuestas inmunitarias. El complemento puede activarse a través de tres rutas distintas: las vías clásica y alternativa de las lectinas. El principal acontecimiento de activación que comparten las tres rutas es la escisión proteolítica de la proteína central del sistema del complemento, C3, en sus productos de activación C3a y C3b por convertasas de C3. La generación de estos fragmentos conduce a la opsonización de células patógenas por C3b e iC3b, un proceso que las vuelve susceptibles a la fagocitosis o eliminación, y a la activación de células inmunitarias a través de una interacción con los receptores del complemento (Markiewski y Lambris, 2007, Am. J. Pathol., 171: 715­ 727). El depósito de C3b en las células diana también induce la formación de nuevos complejos de convertasa y, de este modo, inicia un bucle de autoamplificación. Un conjunto de proteínas plasmáticas y unidas a la superficie celular regula cuidadosamente la activación del complemento para evitar que las células hospedadoras se ataquen a sí mismas mediante la cascada del complemento. Sin embargo, la activación excesiva o la regulación inapropiada del complemento pueden conducir a una serie de afecciones patológicas, que varían desde enfermedades autoinmunitarias a inflamatorias (Holers, 2003, Clin. Immunol., 107: 140-51; Markiewski y Lambris, 2007, citado anteriormente; Ricklin y Lambris, 2007, Nat. Biotechnol., 25: 1265-75; Sahu et al., 2000, J. Immunol., 165: 2491-9). Por lo tanto, el desarrollo de inhibidores del complemento terapéuticos es sumamente conveniente. En este contexto, C3 y C3b han surgido como dianas prometedoras debido a que su papel fundamental en la cascada permite la inhibición simultánea de la iniciación, amplificación y activación aguas abajo del complemento (Ricklin y Lambris, 2007, citado anteriormente).

[0013] La compstatina se identificó por primera vez como un péptido de 27 aminoácidos y fue el primer inhibidor del complemento no derivado del huésped que demostró ser capaz de bloquear las tres vías de activación (Sahu et al., 1996, J. Immunol., 157: 884-91; patente de EE.UU. N.°: 6319897). Se ha demostrado que es posible truncar la compstatina sin pérdida de actividad a un péptido de 13 aminoácidos. Sin embargo, los intentos de truncar aún más este péptido condujeron a la pérdida de actividad. La secuencia del péptido de compstatina truncado (o "núcleo") de 13 aminoácidos es Ne<1>-Cys<2>-Val<3>-Val<4>-Gln<5>-Asp<6>-Trp<7>-Gly<8>-His<9>-His<10>-Arg<11>-Cys<12>-Thr<13>-NH<2>, donde Cys<2>y Cys<12>están unidos por enlaces disulfuro. Este tridecapéptido cíclico se une a C3 (y fragmentos de C3), inhibiendo de este modo la activación de la cascada del complemento aguas abajo y evitando la escisión de C3 nativo por las convertasas de C3. Su eficacia inhibidora se confirmó mediante una serie de estudios que utilizaron modelos experimentales que apuntaron a su potencial como agente terapéutico (Fiane et al, 1999a, Xenotransplantation, 6: 52-65; Fiane et al, 1999b, Transplant Proc., 31:934- 935; Nilssonet al.,1998, Blood, 92: 1661-1667; Ricklin y Lambris, 2008, Adv. Exp. Med..Biol., 632: 273-292; Schmidt et al., 2003, J. Biomed. Mater. Res., A66: 491-499; Soulika et al., 2000, Clin. Immunol., 96: 212-221).

[0015] La optimización progresiva del péptido de compstatina de 13 aminoácidos ha llevado a análogos con actividad biológica mejorada (Ricklin y Lambris, 2008, citado anteriormente; los documentos WO 2004/026328; WO 2007/062249, WO 2013/036778, WO 2014/100407).

[0017] Estudios anteriores de estructura-actividad han identificado la naturaleza cíclica del péptido de compstatina y la presencia tanto de un giro • como de un grupo hidrofóbico como características clave de la molécula (Morikis et al., 1998, Protein Sci., 7: 619-627; los documentos WO 99/13899; Morikis et al., 2002, J. Biol. Chem., 277:14942-14953; Ricklin y Lambris, 2008, citado anteriormente). Se descubrió que los restos hidrofóbicos en las posiciones 4 y 7 son de particular importancia y su modificación con aminoácidos no naturales generó un análogo con una actividad mejorada 264 veces sobre el péptido de compstatina original (Katragadda et al., 2006, J. Med. Chem., 49: 4616-4622; WO 2007/062249). Se describen intentos adicionales para optimizar la compstatina para su uso en el tratamiento de trastornos oculares en el documento WO 2007/044668.

[0019] Si bien las etapas de optimización anteriores se han basado en estudios de cribado combinatorios, estructuras de solución y modelos computacionales (Chiu et al., 2008, Chem. Biol. Drug Des., 72: 249-256; Mulakala et al., 2007, Bioorg. Med. Chem., 15: 1638-1644; Ricklin y Lambris, 2008, citado anteriormente), la publicación de una estructura cocristalina de compstatina en complejo con el fragmento del complemento C3c (Janssen et al., 2007, J. Biol. Chem., 282: 29241-29247; documento WO 2008/153963) proporcionó una base para iniciar la optimización racional. La estructura cristalina reveló un sitio de unión poco profundo en la interfaz de los dominios de macroglobulina (MG) 4 y 5 de C3c y mostró que 9 de los 13 aminoácidos estaban directamente implicados en la unión, ya sea a través de enlaces de hidrógeno o interacciones hidrofóbicas. En comparación con la estructura del péptido de compstatina en solución (Morikis et al., 1998, citado anteriormente), la forma unida de la compstatina experimentó un cambio conformacional, con un cambio en la ubicación del giro • de los residuos 5-8 a 8-11 (Janssen et al., 2007, citado anteriormente; WO 2008/153963).

[0021] En vista de su potencial terapéutico en AMD, C3G, PNH y otras enfermedades, sigue siendo un problema en la técnica optimizar aún más los análogos de compstatina, por ejemplo, para lograr una actividad aún mayor y/o para modular las propiedades farmacocinéticas, tal como una mayor semividain vivoy/o propiedades fisicoquímicas tales como una mayor solubilidad o estabilidad.

[0023] Sumario de la invención

[0025] En términos generales, la presente invención se basa en el trabajo para desarrollar una nueva familia de análogos de compstatina que tengan una unión mejorada y una actividad inhibidora del complemento en comparación con el péptido de compstatina de 13 aminoácidos (ICVVQDWGHHRCT (C2-C12 cíclico)). En algunos casos, estos análogos de compstatina poseen adicionalmente propiedades fisicoquímicas útiles, tales como mayor solubilidad y propiedades farmacocinéticas. En particular, los presentes inventores descubrieron que la introducción de un resto de isoleucina en la posición 3 en lugar del resto de valina de tipo salvaje condujo a péptidos de compstatina con actividad de unión e inhibición del complemento mejorada. Los presentes inventores descubrieron además que la introducción de isoleucina en la posición 3 permite la introducción de otras modificaciones, por ejemplo, modificaciones que son capaces de aumentar la solubilidad, tal como la introducción de ácido glutámico en la posición 6, aminoácidos concretos cargados o polares en la posición 9 y/o la introducción de secuencias N- y/o C-terminales. Un ejemplo de tales modificaciones adicionales incluye la sustitución de Ile en la posición 1 por Tyr, Phe o Sar, sustitución de Val en la posición 4 por Trp, un análogo de Trp (como se describe en el presente documento); sustitución de Asp en la posición 6 por Glu; sustitución de His en la posición 9 por Ala, Glu, Asp, Lys, Ser o Arg; sustitución de Arg en la posición 11 por Ser; sustitución de Thr en la posición 13 por Ser, Glu, Ser o Ile. Los péptidos de compstatina preferidos que incluyen una o más de estas modificaciones tienen una solubilidad mejorada, por ejemplo, en comparación con el péptido de compstatina de 13 aminoácidos (ICVVQDWGHHRCT (C2-C12 cíclico)). Ejemplos adicionales de estos péptidos de compstatina combinan la modificación en la posición 9 con extensiones al N-terminal y/o C-terminal del péptido. La adición de acilación también tiene efectos ventajosos sobre la farmacocinética.

[0027] Por otra parte, en los compuestos de la invención, los restos correspondientes a la cisteína 2 y la cisteína 12 de la compstatina tienen cadenas laterales que están unidas a través de un enlace tioéter, en lugar del enlace disulfuro que se encuentra en la compstatina. Entre otras ventajas, se cree que esto puede proporcionar mejoras en la estabilidad (por ejemplo, estabilidad física o química) en comparación con moléculas equivalentes que contienen enlaces disulfuro en las posiciones correspondientes.

[0029] En consecuencia, la presente invención proporciona un análogo de compstatina que tiene la secuencia:

[0030] Ac-SEFA(1)I[1-Me-Trp]QDWGEHRhC(1)TEGE-[Peg3]ES-[K*]-NH<2>

[0032] en donde las cadenas laterales de los restos designados A(1) y hC(1) forman un puente de cistationina, y

[0033] en donde K* es un resto de lisina unido covalentemente a un grupo Z<1>- o Z<1>-Z<2>-; en donde:

[0035] Z<1>es COOH-alquileno C<12-22>-(CO)-; y

[0036] Z<2>se selecciona entre:

[0038] [•Glu];

[0039] [•Glu][Peg3][Peg3];

[0040] [(Piperazina-1-il)-acetilo][Peg3][Peg3];

[0041] [yGlu]G[yGlu];

[0042] [•Glu]K[●Glu];

[0043] [•Glu]KG[●Glu]; o

[0044] [yGlu]G[Peg3][yGlu][Peg3]

[0045] donde Peg3 ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico;

[0046] o una sal y/o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0048] En algunas realizaciones, Z<1>es HOOC-(CH<2>)<12-22>- (CO)-.

[0050] En algunas realizaciones, Z<1>se selecciona entre:

[0052] HOOC-(CH<2>)<12>-(CO)-;

[0053] HOOC-(CH<2>)<14>-(CO)-;

[0054] HOOC-(CH<2>)<16>-(CO)-;

[0055] HOOC-(CH<2>)<18>-(CO)-; o

[0056] HOOC-(CH<2>)<20>-(CO)-; y

[0057] Z<2>se selecciona entre:

[0059] [•Glu];

[0060] [•Glu][Peg3][Peg3]-;

[0061] [(Piperazina-1-il)-acetilo][Peg3][Peg3];

[0062] [yGlu]G[yGlu];

[0063] [•Glu]K[●Glu];

[0064] [•Glu]KG[●Glu]; o

[0065] [yGlu]G[Peg3][yGlu][Peg3].

[0067] Por ejemplo, Z<1>- o Z<1>-Z<2>- se pueden seleccionar entre:

[0069] 15-carboxi-pentadecanoílo;

[0070] 15-carboxi-pentadecanoil[●Glu],

[0071] 15-carboxi-pentadecanoil[●Glu][Peg3][Peg3];

[0072] 19-carboxi-nonadecanoil[●Glu][Peg3][Peg3];

[0073] 15-carboxi-pentadecanoil[(Piperazina-1-il)-acetilo][Peg3][Peg3];

[0074] 17-carboxi-heptadecanoil[●Glu]G[●Glu];

[0075] 17-carboxi-heptadecanoil[●Glu]K[●Glu];

[0076] 17-carboxi-heptadecanoil[●Glu]KG[●Glu];

[0077] 17-carboxi-heptadecanoil[●Glu]G[Peg3pGlu][Peg3];

[0078] 15-carboxi-pentadecanoil[yGlu]G[yGlu];

[0079] 17-carboxi-heptadecanoílo;

[0080] 17-carboxi-heptadecanoil[●Glu]

[0081] 19-carboxi-nonadecanoil[●Glu]G[●Glu]; y

[0082] 17-carboxi-heptadecanoil[●Glu][Peg3][Peg3].

[0084] El análogo de compstatina puede ser:

[0086] Ac-SEFA(1)I[1-Me-Trp]QDWGEHRhC(1)TEGE[Peg3]ES-K([17-carboxi-heptadecanoilpGlu])-NH<2>

[0087] en donde las cadenas laterales de los restos designados A(1) y hC(1) forman un puente de cistationina o una sal y/o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.

[0089] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición que comprende un análogo de compstatina de la presente invención o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en mezcla con un vehículo. En algunos casos, la composición es una composición farmacéutica y el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0091] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un análogo de compstatina de la presente invención, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en mezcla con un portador, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0093] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un análogo de compstatina de la presente invención para su uso en terapia.

[0095] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un análogo de compstatina de la presente invención para su uso en un método de profilaxis o tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Stargardt, periodontitis, retinopatía diabética, glaucoma, uveítis, artritis reumatoide, lesión de la médula espinal, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, cáncer y trastornos respiratorios tales como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), inflamación alérgica, enfisema, bronquitis, bronquiectasia, fibrosis quística, tuberculosis, neumonía, síndrome de dificultad respiratoria (SDR - del recién nacido y del adulto), rinitis y sinusitis; infecciones bacterianas tales como sepsis, lesión por isquemiareperfusión en diversos tejidos, infarto de miocardio, anafilaxia, hemoglobinuria paroxística nocturna, anemia hemolítica autoinmunitaria, psoriasis, hidradentitis supurativa, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, síndrome CHAPLE, glomeropatía C3, nefropatía de IgA, síndrome urémico hemolítico atípico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa o síndrome antifosfolípido. Se entenderá que el efecto terapéutico está mediado a través de un efecto sobre la activación del complemento.

[0097] Las realizaciones de la presente invención se describirán ahora a modo de ejemplo y no de limitación.

[0099] Descripción de las Figuras

[0101] Figura 1 (a-g): Actividad "ex vivo" normalizada de la vía alternativa del complemento a lo largo del tiempo después de la administración de un compuesto de prueba en el tiempo 0 a primates no humanos. Los compuestos se administraron por vía subcutánea a una dosis de 1840 nmol/kg. La actividad del complemento (vía alternativa) se midió usando el kit de Wieslab. La actividad se normalizó usando la muestra previa a la dosis (0) (ajustada al 100%) y el control negativo incluido en el kit. Se muestra la actividad normalizada o la actividad normalizada promedio para animales y la desviación estándar. (a) compuesto 61 (2 animales); (b) compuesto 123, compuesto 126 y compuesto 128, todos con un animal por compuesto y Cp40 (2 animales); (c) compuesto 107, compuesto 111, compuesto 118 y compuesto 119, todos con 2 animales por compuesto; (d) compuesto 104 y compuesto 106 con 2 animales por compuesto; (e) compuesto 54 (2 animales) y compuesto 122, compuesto 124, compuesto 139 y compuesto 140, todos con 1 animal por compuesto; (f) compuesto 141, compuesto 142, compuesto 127 y compuesto 130, todos con un animal por compuesto; (g) compuestos 146, 148 y 150 (todos un animal cada uno) y Cp40 (cuatro animales); (h) compuestos 147 y 148 (un animal cada uno).

[0102] Figura 2: Los cursos de tiempo que muestran la degradación a lo largo del tiempo de los compuestos 126 y 156 a 50 mg/ml en los tampones F1, F2, F3: Compuesto 126y: F1 (•), F2 ( • ) y F3 (•) Compuesto 156: F1 (+), F2 (x) y F3 (. ).

[0103] Figura 3: Esquema de la ruta sintética para el compuesto 146 (Esquema 1b)

[0104] Descripción detallada

[0105] "y/o" cuando se utiliza en el presente documento, "y/o" debe interpretarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados, con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" ha de interpretarse como la divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno de ellos se estableciera individualmente en el presente documento.

[0106] A menos que el contexto indique otra cosa, las descripciones y definiciones de las características establecidas anteriormente no se limitan a ningún aspecto o realización particular de la invención y se aplican igualmente a todos los aspectos y realizaciones que se describen.

[0107] Varias publicaciones, incluidas patentes, solicitudes publicadas, artículos técnicos y artículos académicos se citan a lo largo de la memoria descriptiva.

[0108] A menos que se defina de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos utilizados en la presente solicitud tendrán los significados que entiende normalmente la persona normalmente experta en la materia. En general, la nomenclatura utilizada en relación con, y las técnicas de, química, biología molecular, biología celular y del cáncer, inmunología, microbiología, farmacología y química de las proteínas y del ácido nucleico, descritos en el presente documento, son las bien conocidas y comúnmente usadas en la materia.

[0109] Cada realización de la invención descrita en el presente documento puede tomarse sola o en combinación con una o más de otras realizaciones de la invención.

[0110] A menos que se especifique lo contrario, se proporcionan las siguientes definiciones de términos específicos que se usan en la presente descripción escrita.

[0111] Definiciones

[0112] A lo largo de esta memoria descriptiva, el término "comprenden" y sus variantes gramaticales, tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un número entero o componente o grupo de números enteros o componentes, pero no la exclusión de ningún otro número entero o componente o grupo de números enteros o componentes.

[0113] Las formas en singular "un", "una", y "el/la" incluyen los plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0114] El término "incluyendo" se utiliza para significar "incluyendo pero sin limitaciones". "Que incluye" y "que incluye pero sin limitaciones" se pueden usar de manera indistinta.

[0115] Los términos "paciente", "sujeto" e "individuo" pueden usarse indistintamente. Un sujeto puede ser un mamífero, incluyendo un ser humano o un mamífero no humano, tal como un primate no humano (por ejemplo, un gran simio, los monos del Viejo Mundo o los monos del Nuevo Mundo), animal de ganado (por ejemplo, bovino o porcino), animal de compañía (por ejemplo, canino o felino) o animal de laboratorio tal como un roedor (por ejemplo, ratón o rata). En la presente descripción y en las reivindicaciones se utilizan los códigos de tres letras y de una letra convencionales para los aminoácidos de origen natural, es decir, A (Ala), G (Gly), L (Leu), I (lle), V (Val), F (Phe), W (Trp), S (Ser), T (Thr), Y (Tyr), N (Asn), Q (Gln), D (Asp), E (Glu), K (Lys), R (Arg), H (His), M (Met), C (Cys) y P (Pro); así como códigos de tres letras generalmente aceptados para otros • -aminoácidos, tal como norleucina (Nle), sarcosina (Sar), homocisteína (hCys; hC), ácido • -aminoisobutírico (Aib), ácido 2,3-diaminopropanoico (Dap), ácido 2,4diaminobutanoico (Dab) y ácido 2,5-diaminopentanoico (ornitina; Orn), 1-metil-triptófano(1-Me-Trp, 1Me-Trp o IMeTrp), 1-formil-triptófano (1-For-Trp o 1For-Trp o 1ForTrp), 1-naftaleno (1-Nal o 1Nal), 2-naftaleno (2-Nal o 2Nal), 5-metil-triptófano (5-Me-Trp o 5Me-Trp o 5MeTrp), p-benzoil-fenilalanina (Bpa) 2-indanilglicina (2Igl o 2-Igl). Otros • ­ aminoácidos pueden mostrarse entre corchetes "[ ]" (por ejemplo, "[Nle]") cuando se usan en una fórmula o secuencia general en la presente memoria descriptiva, especialmente cuando el resto de la fórmula o secuencia se muestra usando el código de una sola letra. Los 20 aminoácidos "de origen natural" enumerados anteriormente son aquellos que están codificados por el código genético estándar, y también pueden denominarse aminoácidos "proteinogénicos".

[0116] Gamma-Glu y beta-Asp, también denominados yGlu (• -Glu) y •Asp (• -Asp) (o isoGlu e isoAsp), se refiere a glutamato o aspartato que participan en enlaces peptídicos a través del ácido • -o • -carboxílico respectivamente (normalmente considerados como los grupos carboxilo de cadena lateral), en lugar de en la configuración convencional. De forma similar, *Lys o isoLys se refiere a la lisina que participa en un enlace peptídico a través del grupo épsilon amino (normalmente considerado como el grupo amino de cadena lateral) en lugar del grupo alfa amino.

[0118] Beta-Ala, también conocido como •-Ala o •Ala, se refiere a ácido 3-aminopropanoico.

[0120] Peg3 se refiere a un resto de ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (también conocido como ácido {2-[2-aminoetoxi]etoxi}acético) y Peg4 se refiere a un resto de 11-amino-3,6,9- ácido trioxaundecanoico. El resto de Peg3 también puede indicarse [8-amino-3,6-dioxaoctanoilo].

[0123]

[0126] A menos que se especifique lo contrario, los restos de aminoácidos en los péptidos de la invención son de configuración L. Sin embargo, en algunos casos, también pueden incorporarse aminoácidos de configuración D. En el presente contexto, un código de aminoácido escrito con una letra minúscula representa la configuración D de dicho aminoácido, por ejemplo "k" representa la configuración D de la lisina (K), o un aminoácido de configuración D puede escribirse como (d)X o {d}X, donde X es el aminoácido, por ejemplo (d)Y o {d}Y representa la configuración D de la tirosina (Y).

[0128] En los compuestos descritos en el presente documento, las cadenas laterales de los restos en las posiciones correspondientes a los restos de cisteína en las posiciones 2 y 12 de la compstatina están unidas por un enlace tioéter. Por conveniencia, estas posiciones pueden denominarse posiciones X2 y X12.

[0130] Por lo tanto, las cadenas laterales de los restos en X2 y X12 pueden representar juntas un puente de cistationina. Un puente de cistationina puede tener dos orientaciones:

[0133]

[0136] [CH<2>,S] Cistionina 1 (Ctt1) o gamma-cistationina

[0137] y

[0138]

[0141] [S, CH<2>] Cistionina 2 (Ctt2) o delta-cistationina

[0142] Para facilitar la referencia, puede ser conveniente referirse a los restos nominalmente presentes en las posiciones X2 y X12 "antes" de la formación de un tioéter.

[0143] Se puede considerar que un puente de cistationina consiste en el átomo de azufre de una cadena lateral de homocisteína unido covalentemente al átomo de carbono beta (es decir, el átomo de carbono de la cadena lateral) de un resto de alanina.

[0144] Como alternativa, se puede considerar que un puente de cistationina es el producto de una reacción de condensación entre la homocisteína y la serina para formar un enlace tioéter.

[0145] Por tanto, en algunos compuestos descritos en el presente documento:

[0146] X2 es homocisteína (hC) y X12 es alanina (A) (designada cistationina 1 (Ctt1) o gamma-cistationina) o

[0147] X2 es alanina (A) y X12 es homocisteína (hC) (designada cistationina 2 (Ctt2) o delta-cistationina).

[0148] La notación usada no debe tomarse para implicar ningún método concreto de síntesis.

[0149] Como alternativa, las cadenas laterales de los restos en X2 y X12 pueden representar juntas un puente de lantionina (3,3-tiodialanina):

[0152]

[0154] Se puede considerar que un puente de lantionina consiste en el átomo de azufre de una cadena lateral de cisteína unido covalentemente al átomo de carbono beta (es decir, el átomo de carbono de la cadena lateral) de un resto de alanina. Como alternativa, podría considerarse que es el producto de una reacción de condensación entre cisteína y serina.

[0156] Por tanto, puede ser conveniente hacer referencia a los restos nominalmente presentes en X2 y X12 como cisteína y alanina.

[0158] En el contexto de los péptidos de la invención, un puente de lantionina es simétrico y puede tener solo una orientación, por lo que es irrelevante qué resto se considera que está presente en cada posición.

[0160] (De forma aún más alternativa, un puente de lantionina puede considerarse que es un dímero tioéter de cisteína, por lo que los restos en X2 y X12 podrían designarse cada uno como cisteína. Sin embargo, se entenderá que están unidos por un enlace tioéter en lugar de un enlace disulfuro).

[0162] Por tanto, en algunas realizaciones, los compuestos descritos en el presente documento

[0164] X2 es homocisteína y X12 es alanina (Ctt 1; gamma-cistationina);

[0165] X2 es alanina y X12 es homocisteína (Ctt 2; delta-cistationina); o

[0166] X2 es cisteína y X12 es alanina.

[0168] Además de los compuestos que tienen enlaces tioéter entre los restos en las posiciones X2 y X12, los ejemplos describen moléculas que tienen secuencias de estructura peptídica y acilaciones similares a los compuestos de la invención, pero contienen restos de cisteína en las posiciones X2 y X12 unidos por un enlace disulfuro.

[0170] En las fórmulas que usan la notación de aminoácidos de una sola letra en esta memoria descriptiva, los restos cuyas cadenas laterales participan en el enlace covalente se indican con "(1)".

[0172] Por tanto, por ejemplo:

[0174] la secuencia IC(1)IWQDWGAHRC(1)T contiene un enlace disulfuro;

[0175] la secuencia IhC(1)IWQDWGAHRA(1)T contiene un puente Ctt 1 (gamma-cistationina);

[0176] la secuencia IA(1)IWQDWGAHRhC(1)T contiene un puente Ctt 2 (delta-cistationina);

[0177] las secuencias<i>C(1)IWQDWGAHRA(1)T e IA(1)IWQDWGAHRC(1)T contienen ambas un puente lantionina y representarían el mismo compuesto;

[0179] Los grupos terminales presentes en los extremos N y C de la estructura peptídica pueden designarse como Y1 e Y2 respectivamente. Por tanto, Y1 está unido al átomo de nitrógeno del grupo amino N-terminal e Y2 está unido al átomo de carbono del carbonilo C-terminal.

[0181] Y1 = hidrógeno (también indicado como "H-" o "Hy-") indica un átomo de hidrógeno, correspondiente a la presencia de un grupo amino primario o secundario libre en el extremo N-terminal. Y1 = acetilo ("Ac") indica la presencia de un grupo acetilamida secundario en el extremo N-terminal.

[0183] Y2 = "OH" o "NH<2>" indica la presencia de un grupo carboxi (COOH) o un grupo amido (CONH<2>) en el extremo C-terminal de la molécula.

[0185] Cualquiera o ambos de Y1 e Y2 pueden ser, de forma alternativa, un grupo lipofílico • . Típicamente, solo uno de Y1 o Y2 será un grupo lipofílico • .

[0187] En algunas realizaciones, comprenda o no la molécula un grupo lipofílico en algún otro lugar, Y2 es NH<2>u OH. En algunas realizaciones, Y1 es hidrógeno o acetilo e Y2 es OH o NH<2>.

[0189] En algunas realizaciones, comprenda o no la molécula un grupo lipofílico en algún otro lugar, Y2 es NH<2>. En algunas realizaciones, Y1 es hidrógeno o acetilo e Y2 es NH<2>.

[0191] En algunas realizaciones, comprenda o no la molécula un grupo lipofílico en algún otro lugar, Y2 es NH<2>.e Y1 es acetilo.

[0193] A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones se utilizan diversos términos relacionados con los métodos y otros aspectos de la presente invención. A tales términos se les debe proporcionar su significado habitual en la técnica, a menos que se indique otra cosa. Otros términos definidos de manera específica deben interpretarse de manera concordante con la definición proporcionada en el presente documento. El término "aproximadamente", como se usa en el presente documento, cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcarvariaciones del ± 20 % o ± 10 %, en algunas realizaciones ±5 %, en algunas realizaciones ± 1 % y en algunas realizaciones ±0,1 % a partir del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para fabricar y utilizar los compuestos y composiciones divulgados.

[0194] La expresión "compstatina de longitud completa" como se usa en el presente documento se refiere a un péptido de 27 aminoácidos que tiene la secuencia IC(1)VVQDWGHHRC(1)TAGHMANLTSHASAI, en donde C(1) indica el resto de cisteína unido por un enlace disulfuro. Como se ha descrito anteriormente, una forma truncada de la compstatina de longitud completa, el tridecapéptido Ile<1>-Cys<2>-Val<3>-Val<4>-Gln<5>-Asp<6>-Trp<7>-Gly<8>-su<9>-su<10>-Arg<11>-Cys<12>-Thr<13>-NH<2>unido por un enlace disulfuro entre los restos de cisteína en las posiciones 2 y 12 conserva la actividad del péptido de longitud completa. Una versión acetilada en el extremo N de este péptido tridecapéptido se denomina en el presente documento "Ac-compstatina".

[0196] La expresión "análogo de compstatina" se refiere a una Ac-compstatina modificada que comprende una o más sustituciones de aminoácidos de orinen natural y/o no naturales, o análogos de aminoácidos, así como modificaciones dentro o entre diversos aminoácidos, como se describe con mayor detalle en el presente documento. Un análogo de compstatina puede comprender aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 modificaciones de aminoácidos con respecto a Accompstatina. Un análogo de compstatina puede comprender 5, 6, 7, 8 o más modificaciones de aminoácidos con respecto a Ac-compstatina. Un análogo de compstatina puede comprender aproximadamente 5, 6, 7 u 8 modificaciones de aminoácidos con respecto a Ac-compstatina.

[0198] El término "análogo" se usa con frecuencia para una proteína o péptido en cuestión antes de que experimente una modificación química adicional (derivatización) y, en particular, una acilación. El producto resultante de tal modificación química (derivatización) a veces se denomina "derivado" o "análogo acilado". Sin embargo, en el contexto de esta solicitud, el término "análogo" designa análogos de Ac-compstatina así como derivados (acilados) de tales análogos de Ac-compstatina.

[0200] Cuando se hace referencia a la posición de los aminoácidos o análogos dentro de la Ac-compstatina o análogos de compstatina, las posiciones se numeran del 1 (Ile en la compstatina) al 13 (Thr en la compstatina). Por ejemplo, el resto Gly ocupa la "posición 8". Como se usa para describir los péptidos análogos de compstatina de la presente invención, "C(1)" indica un enlace disulfuro entre los respectivos restos de cisteína en el análogo de compstatina.

[0201] Las expresiones "farmacéuticamente activo" y "biológicamente activo" se refieren a la capacidad de los compuestos para unirse a C3 o a fragmentos de la misma e inhibir la activación del complemento. Estas actividades biológicas de los análogos de compstatina pueden medirse mediante uno o más de varios ensayos reconocidos en la técnica, como se describe con mayor detalle en el presente documento.

[0203] Como se usan en el presente documento, "L-aminoácido" se refiere a cualquiera de los alfa-aminoácidos levógiros de origen natural normalmente presentes en proteínas o los ésteres de alquilo de los alfa-aminoácidos. La expresión "D-aminoácido" se refiere a alfa-aminoácidos dextrógiros. A menos que se especifique lo contrario, todos los aminoácidos a los que se hace referencia en el presente documento son L-aminoácidos.

[0205] "Hidrofóbico" o "no polar" se utilizan como sinónimos en el presente documento y se refieren a cualquier interacción intermolecular o intramolecular no caracterizada por un dipolo.

[0207] Como se usan en el presente documento, "sales farmacéuticamente aceptables" hace referencia a derivados de los compuestos divulgados en donde el compuesto original se modifica preparando sales de ácidos o bases del mismo. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, sales ácidas minerales u orgánicas de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Por tanto, la expresión "sal de adición de ácido" se refiere al correspondiente derivado de sal de un compuesto parental que se ha preparado mediante la adición de un ácido. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales convencionales o las sales de amonio cuaternario del compuesto parental formado, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos y orgánicos. Por ejemplo, tales sales convencionales incluyen, pero sin limitación, las obtenidas a partir de ácidos inorgánicos, tales como, clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico y similares; y las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos, tales como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etanodisulfónico, oxálico, isetiónico y similares. Determinados compuestos ácidos o básicos de la presente invención pueden existir en forma de iones híbridos. Todas las formas de los compuestos, incluido ácido libre, base libre y zwiteriones, se contemplan dentro del alcance de la presente invención.

[0209] Análogos de compstatina

[0211] Ac-compstatina, un péptido de 13 aminoácidos acetilado en el extremo N-terminal, se sabe que se une a C3 e impide la escisión mediada por convertasa de C3. Desde su descubrimiento por expresión en fagos, se ha llevado a cabo modificación de la secuencia de Ac-Compstatina de 13 aminoácidos en un esfuerzo por encontrar análogos con actividad biológica aumentada. Sin embargo, en la secuencia central entre los dos restos de cisteínas en las posiciones 2 y 12, los experimentos de barrido de alanina han producido previamente análogos que muestran solo mejoras modestas en la actividad biológica, tolerándose pocas modificaciones. Las modificaciones incluyen cambiar la valina en la posición 4 a triptófano, o un análogo de triptófano, lo que conduce a un aumento de la actividad biológica, y cambiar la histidina en la posición 9 a alanina o análogos de la misma.

[0212] En particular, en intentos previos de introducir modificaciones en el resto de valina en la posición 3, reemplazándolo con glicina, alanina, D-valina o la leucina se ha demostrado que conducen a una disminución de la actividad biológica. En contraste con estos procesos de la técnica anterior, los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que un cambio de valina a isoleucina se tolera bien y proporciona mejoras en la actividad biológica, como se muestra en los Ejemplos a continuación.

[0213] Sin desear quedar ligados a teoría específica alguna, los presentes inventores razonaron que esta modificación podría combinarse con la introducción de uno o más aminoácidos polares o cargados en la secuencia central y puede usarse como un enfoque para aumentar la capacidad de los péptidos de compstatina para solubilizarse. Inicialmente, el ácido glutámico o la serina en la posición 9 se combinaron con la valina 3 y condujeron a una disminución de la actividad en comparación con la secuencia de referencia 4W9A. Sin embargo, cuando estos cambios se combinaron con la introducción de isoleucina en la posición 3, se observó un sorprendente aumento en la actividad biológica, en particular para la combinación de isoleucina en la posición 3 y ácido glutámico en la posición 9. Esta observación se correlaciona con una unión mejorada a C3 medida por resonancia de plasmón superficial (SPR), véase la tabla 7 y la tabla 8. En una serie adicional de experimentos para validar estos hallazgos, los péptidos de compstatina con ácido glutámico en la posición 9 se combinan con diferentes sustituciones en la posición 3 que normalmente se considerarían sustituciones "conservadoras" para la isoleucina, mostrando de nuevo que los péptidos con isoleucina en la posición 3 son los más activos.

[0214] En conjunto, estos experimentos muestran que reemplazar el resto de valina en la posición 3 con isoleucina sorprendentemente proporciona péptidos de compstatina que tienen una actividad biológica aumentada y una unión mejorada a C3. Además, los experimentos demuestran sorprendentemente que estos cambios se pueden combinar fácilmente con otras modificaciones en la secuencia central de los análogos de compstatina y con la adición de secuencias N y C-terminales, por ejemplo, para mejorar la solubilidad de los péptidos de compstatina, por ejemplo a concentraciones más altas.

[0215] La introducción de isoleucina en lugar de valina en la posición 3 de otro compuesto de la técnica anterior denominado "Cp40" (Qu et al., Immunobiology 2013, 281(4): 496-505; también denominado en dicho artículo "péptido 14) también aumentó la afinidad de unión a C3 medida por SPR.

[0216] Sustituyentes lipofílicos

[0217] Los análogos de compstatina portan un grupo lipofílico, que puede designarse • .

[0218] El grupo lipofílico está unido covalentemente a la cadena lateral del resto de Lys C-terminal del análogo.

[0219] El grupo lipofílico • se une típicamente a través de un grupo acilo. Por tanto, la modificación puede denominarse acilación, pero también puede denominarse lipidación.

[0220] El grupo lipofílico incluye un grupo alquileno de cadena larga derivado de un ácido graso, denominado Z<1>en el presente documento y denominado sustituyente lipofílico. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que un sustituyente lipofílico se une a proteínas plasmáticas (por ejemplo, albúmina) en el torrente sanguíneo, protegiendo así los compuestos usados en el contexto de la invención de la degradación enzimática y, por lo tanto, mejorando la semivida de los compuestos. El sustituyente lipofílico también puede modular la potencia del compuesto.

[0221] Z<1>puede unirse directamente a la secuencia de aminoácidos o mediante un espaciador Z<2>como se define en el presente documento.

[0222] En otras palabras, • puede ser Z<1>- o Z<1>-Z<2>-.

[0223] El término "conjugado" se usa en este caso para describir la unión covalente de un resto químico identificable a otro y la relación estructural entre tales restos. No debe considerarse que implica ningún método concreto de síntesis. El uno o más espaciadores Z<2>, cuando están presentes, se utilizan para proporcionar una separación entre el compuesto y el sustituyente lipofílico Z<1>.

[0224] Z<1>es un COOH-alquileno C<12-22>-(CO)-, en donde el alquileno puede ser lineal o ramificado y puede estar saturado o insaturado, y puede incorporar opcionalmente un resto fenileno o piperazinileno en su longitud.

[0225] Típicamente, los grupos Z<1>derivan de ácidos •,• -dicarboxílicos saturados de cadena larga de fórmula HOOC-(CH<2>)<12-22>-COOH, preferentemente de ácidos •,• -dicarboxílicos saturados de cadena larga que tienen un número par de átomos de carbono en la cadena alifática.

[0226] Por ejemplo, Z<1>puede ser:

[0227] 13-carboxitridecanoílo, es decir, HOOC-(CH<2>)<i2>-(CO)-;

[0228] 15-carboxipentadecanoílo, es decir, HOOC-(CH<2>)<14>-(CO)-;

[0229] 17-carboxiheptadecanoílo, es decir, HOOC-(CH<2>)<16>-(CO)-;

[0230] 19-carboxinonadecanoílo, es decir, HOOC-(CH<2>)<18>-(CO)-; o

[0231] 21-carboxiheneicosanoílo, es decir, HOOC-(CH<2>)<20>-(CO)-Como se ha mencionado anteriormente, el sustituyente lipofílico Z<1>puede conjugarse a la cadena lateral de aminoácido mediante uno o más espaciadores Z<2>.

[0232] Cuando está presente, el espaciador está unido al sustituyente lipofílico y a la cadena lateral de aminoácidos.

[0233] Z<2>se selecciona entre:

[0234] [•Glu];

[0235] [•Glu][Peg3][Peg3]-;

[0236] [(Piperazina-1-il)-acetilo][Peg3][Peg3];

[0237] [•Glu]-G-[●Glu];

[0238] [•Glu]-K-[●Glu];

[0239] [yGlu]-KG-[yGlu]; y

[0240] [•Glu]-G-[Peg3][●Glu][Peg3].

[0241] Z<2>se une adecuadamente en cada lado mediante un enlace amida. Se pueden usar otros enlaces adecuados, con la sustitución de átomos proporcional; por ejemplo, se prevén enlaces sulfinamida, sulfonamida o éster o enlaces amino, éter o tioéter.

[0242] Los grupos Z<1>derivados de ácidos •,• -dicarboxílicos saturados de cadena larga de fórmula HOOC-(CH<2>)<12-22>-COOH se describen e ilustran a continuación

[0245]

[0247] En este caso, la cadena lateral de un resto de Lys está unida covalentemente a un espaciador yGlu (Z2) a través de un enlace amida. Un grupo 15-carboxipentadecanoilo (Z1) se une covalentemente al espaciador yGlu a través de un enlace amida. Esta combinación de resto lipofílico y espaciador, conjugado a un resto de Lys, puede denominarse mediante la notación abreviada K(15-carboxipentadecanoil-●-Glu), por ejemplo, cuando se muestra en fórmulas de compuestos específicos. yGlu también puede denominarse isoGlu.

[0248] Ciertos grupos • preferidos (Z1- y Z1-Z2-) incluyen:

[0249] [15-carboxi-pentadecanoil];

[0250] [15-carboxi-pentadecanoil][yGlu],

[0251] [15-carboxi-pentadecanoilpGlu][Peg3][Peg3];

[0252] [19-carboxi-nonadecanoil][●Glu][Peg3][Peg3];

[0253] [15-carboxi-pentadecanoil][(Piperazina-1-il)-acetilo][Peg3][Peg3];

[0254] [17-carboxi-heptadecanoilpGlu]G[●Glu];

[0255] [17-carboxi-heptadecanoilpGlu]K[●Glu];

[0256] [17-carboxi-heptadecanoilpGlu]KG[●Glu];

[0257] [17-carboxi-heptadecanoilpGlu]G[Peg3][●Glu][Peg3];

[0258] [15-carboxi-pentadecanoilpGlu]G●Glu];

[0259] [17-carboxi-heptadecanoil];

[0260] [17-carboxi-heptadecanoilpGlu]

[0261] [19-carboxi-nonadecanoil][●Glu]G[●Glu]; y

[0262] [17-carboxi-heptadecanoilpGlu][Peg3][Peg3].

[0263] Estructuras ilustrativas de grupos • (Z1- y Z1-Z2- ) se muestran a continuación, donde la línea ondulada indica el enlace al péptido (a una cadena lateral de aminoácido, nitrógeno N-terminal o carbono C-terminal):

[0264] [19-carboxi-nonadecanoil][yGlu]G[yGlu]:

[0267]

[0269] [17-carboxi-heptadecanoil][*Glu]G[*Glu]:

[0272]

[0274] [15-carboxi-pentadecanoil]-:

[0277]

[0279] [17-carboxi-heptadecanoil]-:

[0282]

[0284] [(15-carboxi-pentadecanoil)-[(Piperazina-1-il)-acetilo][Peg3][Peg3]:

[0287]

[0289] [17-carboxi-heptadecanoil][*Glu]:

[0292]

[0294] [17-carboxi-heptadecanoil][*Glu]G[Peg3][*Glu][Peg3]:

[0295]

[0297] [17-carboxi-heptadecanoil][*Glu]KG[*Glu]:

[0300]

[0302] [17-carboxi-heptadecanoil][*Glu]K[*Glu]:

[0305]

[0307] [17-carboxi-heptadecanoil][*Glu][Peg3][Peg3]:

[0310]

[0312] El experto en la materia conocerá bien las técnicas adecuadas para preparar los compuestos empleados en el contexto de la invención. Para ejemplos de química adecuada, véanse los documentos WO98/08871, WO00/55184, WO00/55119, Madsen et al., J. Med. Chem. 50:6126-32 (2007) y Knudsen et al., J. Med Chem. 43:1664-1669 (2000). Se ha demostrado que los análogos de compstatina fabricados en la técnica anterior poseen una actividad mejorada en comparación con el péptido original, es decir, hasta aproximadamente 99 veces (Mallik, B. et al, 2005, citado anteriormente; documento WO 2004/026328) y hasta aproximadamente 264 veces (Katragadda et al., 2006, citado anteriormente; el documento WO2007/062249).

[0313] En concordancia con la presente invención, se ha empleado información sobre las características biológicas y fisicoquímicas de la unión de Ac-compstatina a C3 para diseñar análogos de compstatina con actividad significativamente mejorada en comparación con los análogos de compstatina originales.

[0314] Preferentemente, los análogos de compstatina tienen mayor actividad que Ac-compstatina, por ejemplo, una actividad al menos 10 veces mayor, una actividad al menos 20 veces mayor, una actividad al menos 30 veces mayor que la Accompstatina. En otras realizaciones, los análogos tienen una actividad al menos 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, 100-, 110­ , 120-, 130-, 140-, 150 veces o más mayor que la Ac-compstatina, en comparación con el uso de los ensayos descritos en los ejemplos.

[0316] Un compuesto de la invención normalmente tiene mayor actividad que un compuesto por lo demás idéntico que tiene valina en lugar de isoleucina en la posición correspondiente a Val3 de compstatina.

[0318] Los análogos de compstatina son capaces de unirse a C3 y/o C3b y de inhibir la activación de la cascada del complemento, en particular aguas abajo de C3, por ejemplo, inhibiendo la escisión de C3 por convertasas C3.

[0320] Los análogos de compstatina también son típicamente capaces de inhibir la hemólisis impulsada por el complemento. La hemólisis impulsada por el complemento se evalúa típicamente (en un "ensayo de hemólisis") poniendo en contacto suero de una primera especie de mamífero (por ejemplo, suero humano) con eritrocitos (glóbulos rojos; RBC, por sus siglas en inglés) de una segunda especie de mamífero (por ejemplo, ovejas o cualquier otra especie adecuada), típicamente en presencia de inmunoglobulina de mamífero capaz de unirse a los eritrocitos. El complemento en el suero se activa por la inmunoglobulina unida a células, lo que conduce a la lisis de los eritrocitos, es decir, hemólisis. La inmunoglobulina puede ser de la primera especie o puede ser de una tercera especie de mamífero siempre que sea capaz de activar el complemento de la primera especie.

[0322] En dicho ensayo, un compuesto de prueba normalmente se preincubará con el suero antes de que el suero entre en contacto con los eritrocitos. Los eritrocitos también pueden preincubarse con la inmunoglobulina antes de entrar en contacto con el suero.

[0324] En los ejemplos siguientes, el suero humano se preincuba con un compuesto de prueba y los eritrocitos de oveja se preincuban con antisuero de conejo contra eritrocitos de oveja, antes de que se combinen el suero y los eritrocitos.

[0325] Por tanto, la actividad de los análogos de compstatina puede determinarse con referencia a una o más actividades biológicas seleccionadas entre (1) unión a la proteína C3, (2) unión a la proteína C3b, (3) inhibición de la escisión de C3 nativa por convertasas C3 e (4) inhibición de la activación del sistema del complemento.

[0327] Por lo tanto, un análogo de compstatina de la invención puede unirse a C3 o C3b con una mayor afinidad que la de la compstatina. Por ejemplo, pueden tener una Kd al menos aproximadamente 10 veces menor, al menos 20 veces menor o al menos 30 veces menor que la Ac-compstatina, por ejemplo, al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 o 150 veces menos que Ac-compstatina. La Kd puede determinarse mediante resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés), por ejemplo, usando un ensayo como se describe en el Ejemplo 4.

[0329] Un análogo de compstatina de la invención normalmente se une a C3 o C3b con una mayor afinidad (es decir, una Kd más baja) que la de un compuesto por lo demás idéntico que tiene valina en lugar de isoleucina en la posición correspondiente a Val3 de compstatina.

[0331] Un análogo de compstatina de la invención puede tener una mayor capacidad para inhibir la hemólisis que Accompstatina. Por ejemplo, puede inhibir la hemólisis con una CI<50>al menos 10 veces, al menos 20 veces o al menos 30 veces menor que la Ac-compstatina, por ejemplo, al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300-350, 400, 450, 500 veces menor que la Ac-compstatina.

[0333] Un análogo de compstatina de la invención normalmente tiene una mayor capacidad para inhibir la hemólisis (es decir, una CI<50>más baja) que un compuesto por lo demás idéntico que tiene valina en lugar de isoleucina en la posición correspondiente a Val3 de compstatina.

[0335] Preferentemente, el efectoin vitrode los compuestos de la presente invención se evalúa midiendo su efecto inhibidor sobre la vía clásica del complemento en un ensayo de hemólisis, por ejemplo, usando el ensayo descrito en el Ejemplo 2.

[0337] Los análogos de compstatina que tienen acilación pueden tener una actividad absoluta más baja que un compuesto por lo demás idéntico que carece de acilación, pero tienen beneficios adicionales que incluyen una semividain vivoprolongada que puede compensar cualquier reducción aparente de la actividad absoluta.

[0339] Síntesis de análogos de compstatina

[0341] Se prefiere sintetizar análogos de compstatina de la presente invención por medio de metodología de síntesis de péptidos en fase sólida o en fase líquida. En este contexto, se puede hacer referencia al documento WO 98/11125 y, entre muchos otros, Fields, G.B.et al.,2002, "Principles and practice of solid-phase peptide synthesis". En: Synthetic Peptides (2a Edición) y los ejemplos del presente documento.

[0343] Los detalles con respecto a la síntesis y las estructuras de los análogos de compstatina que contienen puentes de cistationina y lantionina entre los restos en las posiciones X2 y X12 se proporcionan en el documento WO2012/040259 y en Knerr et al., ACS Chem Biol. 15 de julio de 2011; 6(7): 753-760 (D0I:10.1021/cb2000378). Se pueden encontrar más detalles relevantes con respecto a la química de cistationina y lantionina en de Araujo et al., 2014, Nature Communications; 5:3165 (DOI: 10.1038/ncomms4165) y en Muttenthaler et al., J. Med. Chem. 2010, 53, 8585-8596 (DOI: 10.1021/jm100989w).

[0345] En concordancia con la presente invención, un análogo de compstatina de la invención puede sintetizarse o producirse de varias maneras, incluyendo, por ejemplo, un método que comprende:

[0347] (a) sintetizar los análogos de compstatina por medio de metodología de síntesis de péptidos en fase sólida o en fase líquida y recuperar los análogos de compstatina sintetizados así obtenidos; o

[0348] (b) expresar una secuencia peptídica precursora a partir de una construcción de ácido nucleico que codifica el péptido precursor, recuperar el producto de expresión y modificar el péptido precursor para producir un compuesto de la invención.

[0350] El péptido precursor puede modificarse mediante la introducción de uno o más aminoácidos no proteinogénicos, por ejemplo Aib, Orn, Dap, 1-Me-Trp, 1 -Nal, 2-Nal, Sar, yGlu o Dab, o mediante la introducción de grupos terminales Y1 y/o Y2 apropiados.

[0352] La expresión se realiza típicamente a partir de un ácido nucleico que codifica el péptido precursor, que puede realizarse en una célula o en un sistema de expresión libre de células que comprende dicho ácido nucleico.

[0354] Se prefiere sintetizar los análogos de la invención por medio de síntesis peptídica en fase sólida o en fase líquida. En este contexto, se hace referencia al documento WO 98/11125 y, entre muchos otros, Fields, GB et al., 2002, "Principles and practice of solid-phase peptide synthesis". En: Synthetic Peptides (2a Edición) y los ejemplos del presente documento.

[0356] Para la expresión recombinante, los fragmentos de ácido nucleico que codifican el péptido precursor normalmente se insertarán en vectores adecuados para formar vectores de clonación o expresión. Los vectores pueden, dependiendo de la finalidad y el tipo de aplicación, estar en forma de plásmidos, fagos, cósmidos, mini-cromosomas o virus, pero también el ADN desnudo que solo se expresa transitoriamente en ciertas células es un vector importante. Los vectores de clonación y expresión preferidos (vectores plasmídicos) son capaces de replicación autónoma, permitiendo así un alto número de copias para los fines de expresión de alto nivel o replicación de alto nivel para la clonación posterior.

[0357] En términos generales, un vector de expresión comprende las siguientes características en la dirección 5 ' *3 ' y en el enlace operable: un promotor para dirigir la expresión del fragmento de ácido nucleico, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido líder que permite la secreción (a la fase extracelular o, cuando sea aplicable, al periplasma), del fragmento de ácido nucleico que codifica el péptido precursor y, opcionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica un terminador. Pueden comprender características adicionales tales como marcadores seleccionables y orígenes de replicación. Cuando se trabaja con vectores de expresión en cepas productoras o líneas celulares, puede preferirse que el vector sea capaz de integrarse en el genoma de la célula huésped. El experto en la materia está muy familiarizado con los vectores adecuados y puede diseñar uno de acuerdo con sus requisitos específicos.

[0359] Los vectores de la invención se usan para transformar células huésped para producir el péptido precursor. Tales células transformadas pueden ser células cultivadas o líneas celulares usadas para la propagación de los fragmentos de ácido nucleico y vectores, y/o usadas para la producción recombinante de los péptidos precursores.

[0361] Las células transformadas preferidas son microorganismos tales como bacterias [tales como las especiesEscherichia(por ejemploE. coli), Bacillus(por ejemplo,Bacillus subtilis),Salmonella o micobacterias (preferentemente no patógenas, por ejemplo,M. bovisBCG, levaduras (por ejemplo,Saccharomyces cerevisiaeyPichia pastoris)y protozoos. Como alternativa, las células eucariotas pueden derivar de un organismo multicelular, es decir, puede ser una célula fúngica, una célula de insecto, una célula de alga, una célula vegetal o una célula animal, tal como una célula de célula de mamífero. Para los fines de clonación y/o expresión optimizada, se prefiere que la célula transformada sea capaz de replicar el fragmento de ácido nucleico de la invención. Las células que expresan el fragmento nucleico pueden usarse para la preparación a pequeña o gran escala de los péptidos de la invención.

[0362] Cuando se produce el péptido precursor por medio de células transformadas, es conveniente, aunque está lejos de ser esencial, que el producto de expresión se secrete en el medio de cultivo.

[0364] Afecciones médicas

[0366] En un amplio aspecto, la presente invención proporciona análogos de compstatina de la presente invención para su uso como medicamento o para su uso en terapia.

[0368] Los análogos de compstatina descritos en el presente documento tienen actividades biológicas de unión a la proteína C3 y/o inhibición de la activación del complemento. En general, los análogos de compstatina de la presente invención pueden usarse para el tratamiento o prevención de afecciones asociadas con la activación excesiva o no deseada del sistema del complemento. El complemento puede activarse a través de tres rutas distintas: la clásica, la de las lectinas y la alternativa. El principal acontecimiento de activación que comparten las tres rutas es la escisión proteolítica de la proteína central del sistema del complemento, C3, en sus productos de activación C3a y C3b por convertasas de C3. La generación de estos fragmentos conduce a la opsonización de células patógenas por C3b e iC3b, un proceso que las vuelve susceptibles a la fagocitosis o eliminación, y a la activación de células inmunitarias a través de una interacción con los receptores del complemento (Markiewski y Lambris, 2007, Am. J. Pathol., 171: 715-727). El depósito de C3b en las células diana también induce la formación de nuevos complejos de convertasa y, de este modo, inicia un bucle de autoamplificación. Un conjunto de proteínas plasmáticas y unidas a la superficie celular regula cuidadosamente la activación del complemento para evitar que las células hospedadoras se ataquen a sí mismas mediante la cascada del complemento. El tridecapéptido cíclico de 13 aminoácidos utilizado como punto de referencia para el diseño de los análogos de compstatina de la presente invención inhibe la activación del complemento al unirse a C3 y/o C3b, impidiendo la escisión de C3 nativa por las convertasas C3. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, los presentes inventores creen que los análogos de compstatina de la presente invención también funcionan de esta manera y pueden compartir una o más actividades biológicas seleccionadas entre (1) unión a la proteína C3, (2) unión a la proteína C3b, (3) inhibición de la escisión de C3 nativa por convertasas C3 y/e (4) inhibición de la activación del sistema del complemento. La actividad biológica de los análogos de compstatina de la presente invención puede determinarsein vitromediante la medición de su efecto inhibidor de la vía clásica del complemento en un ensayo de hemólisis, por ejemplo, usando un protocolo que se expone en los ejemplos siguientes.

[0370] La activación excesiva o la regulación inapropiada del complemento pueden conducir a una serie de afecciones patológicas, que varían desde enfermedades autoinmunitarias a enfermedades inflamatorias (Holers, 2003, Clin. Immunol., 107: 140-51; Markiewski y Lambris, 2007, citado anteriormente; Ricklin y Lambris, 2007, Nat. Biotechnol., 25: 1265-75; Sahu et al., 2000, J. Immunol., 165: 2491-9). Por lo tanto, la inhibición de la activación del complemento puede usarse para facilitar el tratamiento de enfermedades o afecciones, incluidas degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Stargardt, periodontitis, retinopatía diabética, glaucoma, uveítis, artritis reumatoide, lesión de la médula espinal, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, cáncer y trastornos respiratorios tales como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), inflamación alérgica, enfisema, bronquitis, bronquiectasia, fibrosis quística, tuberculosis, neumonía, síndrome de dificultad respiratoria (SDR - del recién nacido y del adulto), rinitis y sinusitis; infecciones bacterianas tales como sepsis, lesión por isquemia-reperfusión en diversos tejidos, infarto de miocardio, anafilaxia, hemoglobinuria paroxística nocturna, anemia hemolítica autoinmunitaria, psoriasis, hidradentitis supurativa, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, síndrome CHAPLE, glomeropatía C3, nefropatía de IgA, síndrome urémico hemolítico atípico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y síndrome antifosfolípidos. El análogo de la invención también puede encontrar uso en) la inhibición de la activación del complemento que se produce durante el trasplante de células u órganos sólidos o en el uso de órganos artificiales o implantes (por ejemplo, recubriendo o tratando de otra manera las células, órganos, órganos artificiales o implantes con un péptido de la invención); o inhibición de la activación del complemento que se produce durante la derivación extracorpórea de fluidos fisiológicos (sangre, orina) (por ejemplo, recubriendo el tubo a través del cual se derivan los fluidos con un análogo de compstatina de la presente invención).

[0372] Composiciones farmacéuticas y administración

[0374] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición que comprende un análogo de compstatina de acuerdo con la invención o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un vehículo. En una realización de la invención, la composición es una composición farmacéutica y el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende un análogo de compstatina de acuerdo con la invención, o una sal y/o solvato del mismo, junto con un transportador, excipiente o vehículo. En consecuencia, los análogos de compstatina de la presente invención, o sales o derivados de los mismos, especialmente sales y/o solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos, pueden formularse como composiciones o composiciones farmacéuticas preparadas para su almacenamiento o administración, y que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un análogo de compstatina de la presente invención, o una sal o derivado del mismo.

[0376] Las bases adecuadas formadas con bases incluyen sales de metales, tales como sales de metales alcalinos o metales alcalinotérreos.

[0378] En una realización, una composición farmacéutica de la invención es una en donde el análogo de compstatina está en forma de una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable.

[0380] Como será evidente para un experto en la materia médica, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un análogo de compstatina o composición farmacéutica del mismo de la presente invención variará dependiendo de, entre otras cosas, la edad, el peso y/o el sexo del sujeto (paciente) que se va a tratar. Otros factores que pueden ser relevantes incluyen las características físicas del paciente específico que hay que tener en cuenta, la dieta del paciente, la naturaleza de cualquier medicamento simultáneo, el o los compuestos concretos empleados, el modo de administración concreto, el o los efectos farmacológicos deseados y la indicación terapéutica concreta. Debido a que estos factores y su relación con la determinación de esta cantidad son bien conocidos en la materia médica, la determinación de los niveles de dosificación terapéuticamente eficaces, la cantidad necesaria para lograr el resultado deseado de tratar y/o prevenir y/o remediar la malabsorción y/o la inflamación de bajo grado descrita en el presente documento, así como otras indicaciones médicas divulgadas en el presente documento, estará dentro del ámbito del experto.

[0382] Como se usan en el presente documento, la expresión "una cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que reduce los síntomas de una afección o enfermedad dada y, preferentemente, que normaliza las respuestas fisiológicas en un individuo con dicha afección o enfermedad. La reducción de los síntomas o la normalización de las respuestas fisiológicas se puede determinar utilizando métodos rutinarios de la materia y pueden variar con una afección o patología dada. En un aspecto, una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más análogos de compstatina, o composiciones farmacéuticas de los mismos, es una cantidad que restablece un parámetro fisiológico mensurable a sustancialmente el mismo valor (preferentemente dentro del 30 %, más preferentemente dentro del 20 % y aún más preferentemente dentro del 10 % del valor) del parámetro en un individuo sin la afección o enfermedad en cuestión.

[0384] En una realización de la invención, la administración de un compuesto o composición farmacéutica de la presente invención comienza a niveles de dosificación más bajos, aumentando los niveles de dosificación hasta que se logre el efecto deseado de prevención/tratamiento de la indicación médica relevante. Esto definiría una cantidad terapéuticamente eficaz. Para los análogos de compstatina de la presente invención, ya sea solos o como parte de una composición farmacéutica, tales dosis humanas del análogo de compstatina activo pueden estar entre aproximadamente 0,01 pmol/kg y 500 pmol/kg de peso corporal, entre aproximadamente 0,01 pmol/kg y 300 pmol/kg de peso corporal, entre 0,01 pmol/kg y 100 pmol/kg de peso corporal, entre 0,1 pmol/kg y 50 pmol/kg de peso corporal, entre 1 pmol/kg y 10 pmol/kg de peso corporal, entre 5 pmol/kg y 5 pmol/kg de peso corporal, entre 10 pmol/kg y 1 pmol/kg de peso corporal, entre 50 pmol/kg y 0,1 pmol/kg de peso corporal, entre 100 pmol/kg y 0,01 pmol/kg de peso corporal, entre 0,001 pmol/kg y 0,5 pmol/kg de peso corporal, entre 0,05 pmol/kg y 0,1 pmol/kg de peso corporal.

[0385] Por supuesto, la dosis y el régimen terapéuticos más apropiados para el tratamiento del paciente variarán con la enfermedad o afección que se va a tratar y según el peso y los demás parámetros del paciente. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, se espera que las dosis, en el intervalo de mg/kg y una duración o frecuencia de tratamiento más corta o más larga puedan producir resultados terapéuticamente útiles, tal como una inhibición estadísticamente significativa de las vías del complemento alternativa y clásica. Las dosis y el régimen de administración más adecuados para el uso en seres humanos pueden determinarse a partir de los resultados obtenidos con la presente invención y confirmarse en ensayos clínicos debidamente diseñados.

[0387] Un protocolo de dosificación y tratamiento eficaz puede determinarse por medios convencionales, comenzando con una dosis baja en animales de laboratorio y, a continuación, aumentando la dosis mientras se controlan los efectos, así como variando de manera sistemática la pauta posológica. A la hora de determinar una dosificación óptima para un sujeto dado, el clínico puede tener en cuenta numerosos factores.

[0389] Para la administración local en el ojo, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en solución salina isotónica estéril con pH ajustado o agua, ya sea con o sin un conservante tal como cloruro de benzalconio. Como alternativa, para usos oftálmicos, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una pomada tal como vaselina, o como colirios. Los métodos de administración local en los ojos incluyen, por ejemplo, inyección coroidea, inyección transescleral o colocación de un parche escleral, cateterismo arterial selectivo, colirios o pomadas oculares, administración intraocular incluyendo transretinal, bulbar subconjuntival, inyección intravítrea, inyección supracoroidea, inyección subtenoniana, inyección en el bolsillo escleral y reducción escleral, mediante bomba osmótica, etc. El agente también se puede administrar de forma alternativa por vía intravascular, tal como por vía intravenosa (IV) o intraarterial. En inyección coroidea y parche escleral, el médico utiliza un abordaje local del ojo después de iniciar la anestesia adecuada, incluyendo analgésicos y oftalmopléjicos. Una aguja que contiene el compuesto terapéutico es dirigida a la coroides o esclerótica del sujeto y se inserta en condiciones estériles. Cuando la aguja está colocada adecuadamente, se inyecta el compuesto en la coroides o la esclerótica o en ambas. Cuando utilice cualquiera de estos métodos, el médico puede elegir una formulación de liberación sostenida o de acción más prolongada. Por tanto, el procedimiento se puede repetir solo cada varios meses o varios años, dependiendo de la tolerancia del sujeto al tratamiento y la respuesta.

[0391] Se proporcionan los ejemplos siguientes para describir la invención con mayor detalle. Su objetivo es ilustrar, no limitar, la invención. Los compuestos descritos tienen propiedades particularmente ventajosas como resultado de sus secuencias de aminoácidos y/o acilación concretas. Además de los compuestos que tienen restos unidos por enlaces tioéter en las posiciones correspondientes a las posiciones 2 y 12 de la compstatina, algunos de los compuestos descritos a continuación tienen restos de cisteína unidos por enlaces disulfuro en esas posiciones. Se cree que los compuestos similares o idénticos de otro modo que contienen enlaces tioéter tendrán propiedades ventajosas similares y/o mostrarán mejoras en la estabilidad, tales como la estabilidad química (resistencia a la degradación) o la estabilidad física (resistencia a la agregación). Sin embargo, únicamente los compuestos cubiertos por las reivindicaciones son compuestos de la invención,

[0393] Ejemplo 1: Síntesis de análogos de compstatina

[0395] Síntesis peptídica general

[0396]

[0397] Aparato y estrategia de síntesis

[0398] Los péptidos se sintetizaron por lotes manualmente o en un sintetizador de péptidos, tal como un sintetizador de péptidos CEM Liberty o un sintetizador Symphony X, de acuerdo con procedimientos de síntesis de péptidos en fase sólida que usan 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) como grupo protector de N-* -amino y grupos de protección comunes adecuados para funcionalidades de cadena lateral.

[0399] Se usaron resinas a base de soporte polimérico, tal como, por ejemplo, TentaGel™. La resina se hinchó en DMF antes del inicio de la síntesis en fase sólida.

[0400] Procedimientos de acoplamiento de aminoácidos estándar

[0401] Acoplamiento peptídico manual

[0402] El acoplamiento manual se realizó con 2-3 equiv. de aminoácido protegido por Fmoc y, HATU:NMM (2-3: 4-6 equivalentes), HBTU:NMM (2-3: 4-6 equivalentes), DIC:Oxyma (2-3: 2-3) o DIC:Oxyma:DIPEA (2-3: 2-3: 0,3-6). Tiempos de acoplamiento de aminoácidos de 45 minutos a 1 hora mientras se agita seguido de un lavado a fondo.Sintetizador de péptidos CEM Liberty

[0403] Se añadió a la resina una solución de reactivo de acoplamiento (4 equivalentes) de aminoácido protegido con Fmoc (4 equivalentes) y base (8 equivalentes). La mezcla se calentó mediante la unidad de microondas a 70-75 °C durante 5 minutos o se acopló sin calentar durante 60 minutos. Durante el acoplamiento, se burbujeó nitrógeno a través de la mezcla.

[0404] Sintetizador Symphony X

[0405] Los reactivos de acoplamiento de aminoácidos se transfirieron a los recipientes de reacción en el siguiente orden: aminoácido protegidos con Fmoc (4 equivalentes), HATU (4 equivalentes) y DIPEA (8 equivalentes). El tiempo de acoplamiento fue de 10 minutos a temperatura ambiente (ta) a menos que se indique lo contrario. La resina se lavó con DMF (5 x 0,5 min). En caso de acoplamientos repetidos, el tiempo de acoplamiento fue en todos los casos de 45 min a ta.

[0406] Desprotección Fmoc

[0407] Desprotección manual de Fmoc

[0408] Después de un lavado a fondo de la resina, se añadió una solución de piperazina al 20 v/v/% en DMF y la mezcla se dejó reaccionar durante 30 min mientras se agitaba. Después del acoplamiento, la resina se lavó adecuadamente.Sintetizador de péptidos CEM Liberty

[0409] El grupo Fmoc se desprotegió usando piperidina en DMF u otros disolventes adecuados. La solución de desprotección se añadió al recipiente de reacción y la mezcla se calentó durante 30 segundos, alcanzando aproximadamente 40 °C. El recipiente de reacción se drenó y se añadió solución de desprotección nueva y posteriormente se calentó a 70­ 75 °C durante 3 minutos. Después de drenar el recipiente de reacción, la resina se lavó con DMF u otros disolventes adecuados.

[0410] Sintetizador Symphony X

[0411] La desprotección de Fmoc se realizó durante 2,5 minutos usando piperidina al 40 % en DMF y se repitió usando las mismas condiciones. La resina se lavó con DMF (5 x 0,5 min).

[0412] Acilación de la cadena lateral

[0413] Fmoc-Lys(Dde)-OH o aminoácido con un grupo protector de cadena lateral ortogonal alternativo se introdujo en la posición de la acilación (lipidación de cadena lateral). El N-terminal del péptido lineal se acetiló o se protegió con Boc. Mientras el péptido aún estaba unido a la resina, el grupo protector de la cadena lateral de lisina '-amina se escindió selectivamente usando hidrato de hidrazina recién preparado (2-4 %) en NMP durante 2 x 15 minutos. La cadena lateral de lisina desprotegida se alargó a continuación usando condiciones de acoplamiento estándar y desprotecciones de Fmoc con el bloque componente deseado de acuerdo con la secuencia específica. El resto lipídico se acopló como la última etapa.

[0414] Como alternativa, la acilación de la cadena lateral se ensambló antes del ensamblaje del péptido lineal. Dde-Lys(Fmoc)-OH o, como alternativa, otros grupos de protección ortogonales se introdujeron en el C-terminal en la posición de la acilación (lipidación de cadena lateral). El grupo Fmoc se eliminó a continuación como se describe en la sección de desprotección y la cadena lateral de lisina desprotegida se alargó usando condiciones de acoplamiento de aminoácidos estándar y desprotecciones de Fmoc con el bloque componente deseado. El resto de lipidación se acopló como la última etapa. Mientras la lisina ramificada aún estaba unida a la resina, el grupo protector ortogonal N-terminal (Dde) se escindió selectivamente usando hidrato de hidrazina recién preparado (2-4 %) en NMP durante 2 x 15 min y continuó la síntesis peptídica estándar.

[0415] Incorporación de Dde-hCvs(Fmoc-Ala-OAlil)-OH (n ° 1) o Dde-Ala(Fmoc-hCvs-OAllvl)-OH(n.° 2)

[0416] 1,5-3,0 equiv. del n.° 1 o n.° 2 (esquema 1a) y el bloque componente se incorporó usando reactivos de acoplamiento estándar y un tiempo de acoplamiento extendido de 2,5 horas a 12 horas.

[0417] Desprotección de alilo y formación de la lactama:

[0418] Después del ensamblaje del péptido ramificado sobre resina, el grupo OAII se eliminó tratando la resina con una solución de Pd(P(C6H5)3]4 en CHCb/AcOH/NMM durante 3 horas después de un lavado a fondo con DMF. El grupo Fmoc se eliminó usando condiciones de desprotección estándar. El enlace amida formado entre la amina libre y el ácido carboxílico se formó usando PyAOP, HOBt y DIPEA (3:5:5) en DMF durante la noche.

[0419] Liberación de péptido del soporte sólido

[0420] La resina peptídica seca se trató con TFA y depuradores adecuados durante aproximadamente 2 horas. El volumen del filtrado se redujo y el péptido en bruto se precipitó después de la adición de éter dietílico. El precipitado de péptido en bruto se lavó varias veces con éter dietílico y finalmente se secó.

[0421] Purificación por HPLC del péptido en bruto

[0422] El péptido en bruto se purificó por HPLC preparativa de fase inversa usando un aparato de HPLC convencional, tal como una Gilson GX-281 con combinación de bomba 331/332, para la aplicación de gradiente binario equipado con una columna, tal como una columna Gemini NX 5u C18 110A de 5 x 25 cm o una Phenomenex Luna C18250 x21 mm 100 A, y un colector de fracciones que usa un flujo de 20-40 ml/min con un gradiente adecuado de tampón A (0,1 % de ácido fómico) o A (0,1 % de TFA ac.) y tampón B (0,1 % de ácido fórmico, 90 % de MeCN, ac.) o B (0,1 % de TFA, 90% de MeCN, ac.). Las fracciones se analizaron mediante HPLC analítica y MS y las fracciones seleccionadas se combinaron y liofilizaron. El producto final se caracterizó mediante HPLC y MS.

[0423] Formación del enlace disulfuro

[0424] Después de la purificación y liofilización del péptido lineal en bruto, el péptido se redisolvió en 0,1 % de TFA en agua, acetonitrilo y ácido acético. La concentración de la solución peptídica se mantuvo a aproximadamente 1-2 mg/ml. Se añadió gota a gota una solución de yodo en metanol (aproximadamente 1,5 equivalentes) durante la agitación hasta que la solución de péptido obtuvo un color naranja. Después de 10-15 min, la reacción se completó y el exceso de yodo se inactivó con una solución de ácido ascórbico en agua (1 equivalentes) hasta que la solución de péptido se volvió incolora. La solución de péptido se diluyó con agua antes de la purificación en HPLC preparativa.

[0425] HPLC analítica

[0426] Las purezas finales se determinaron mediante HPLC analítica (serie Agilent 1100/1200) equipada con muestreador automático, desgasificador, celda de flujo de 20 pl y software Chromeleon. La HPLC se hizo funcionar con un flujo de 1,2 ml/min a 40 °C usando una columna analítica, tal como la columna Kinetex 2,6 pm XB-C18 100A 100X8,6 mm. El compuesto se detectó y se cuantificó a 215 nm. Los tampones A (0,1 % de TFA, ac.) y el tampón B (0,1 % de TFA, 90% de MeCN, ac.).

[0427] Espectroscopia de masas

[0428] El análisis de MS final se determinó en una espectroscopia de masas convencional, por ejemplo Waters Xevo G2 TOF, equipado con detector de electropulverización con calibración de masa de bloqueo y software MassLynx. Se hizo funcionar en modo positivo usando inyección directa y una tensión de cono de 15 V (1 TOF), 30 V (2 TOF) o 45 V (3 TOF) como se especifica en el cromatograma. La precisión fue de 5 ppm con una resolución típica de 15.000­ 20.000.

[0429] Síntesis del compuesto n.° 24:

[0430] Ac-IC(1)IWQDWGEHRC(1)TEGE-NH<2>

[0431] La síntesis de péptidos en fase sólida se realizó en un sintetizador de péptidos Symphony X utilizando química de Fmoc estándar. TentaGel S RAM (2,51 g; 0,23 mmol/g) se hinchó en DMF (20 ml) y el grupo Fmoc se desprotegió de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.

[0432] Acoplamiento de aminoácidos

[0433] Los aminoácidos protegidos con Fmoc adecuados de acuerdo con la secuencia se acoplaron como se ha descrito anteriormente usando HATU como reactivo de acoplamiento. Todos los acoplamientos de aminoácidos se realizaron a t.a.

[0434] Desprotección Fmoc

[0435] La desprotección final se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.

[0436] Escisión del péptido del soporte sólido

[0437] La resina-péptido se lavó con EtOH (3 * 10 ml) y Et2O (3 * 10 ml) y se secó hasta peso constante a temperatura ambiente (t.a.). El péptido se liberó de la resina mediante tratamiento con TFA/DODT (95/5; 60 ml, 2 h; t.a). El volumen del filtrado se redujo y el péptido en bruto se precipitó después de la adición de éter dietílico. El precipitado de péptido en bruto se lavó varias veces con éter dietílico y finalmente se secó para producir 760 mg de producto de péptido en bruto (pureza ~30 %).

[0438] Purificación por HPLC del péptido lineal en bruto

[0439] El péptido en bruto se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa usando un Gilson GX-281 con combinación de bomba 331/332 para aplicación de gradiente binario equipado con una columnaGemini NX 5u C18110A de 5 x25 cmy un colector de fracciones y se ejecutaron a 35 ml/min con un gradiente de tampón A (0,1 % de TFA, ac.) y tampón B (0,1 % de TFA, 90% de MeCN, ac.) gradiente del 20 % de B al 45 % de B en 47 minutos. Las fracciones se analizaron por HPLC analítica y MS y las fracciones relevantes se agruparon y liofilizaron para producir 190 mg, con una pureza del 85 % como se caracteriza por HPLC y MS como se ha descrito anteriormente. PM monoisotópico calculado 2001,58 m/z, Hallado 2001,81 m/z.

[0440] Formación del enlace disulfuro

[0441] Los 190 mg de péptido lineal purificado se disolvieron en 220 ml de agua/acetonitrilo (65 %/35 %) con 0,1 % de TFA. Se añadió gota a gota una solución de yodo en metanol (2,2 ml, aproximadamente 1,5 equivalentes de yodo) durante la agitación hasta que la solución de péptido obtuvo un color naranja. La reacción se siguió por HPLC analítica y se encontró que la reacción se había completado después de 10-15 min. El exceso de yodo se redujo con una solución de ácido ascórbico en agua (220 pl, aproximadamente 1 equivalente) hasta que la solución de péptido se volvió incolora. El volumen de la solución de péptido se redujo ligeramente mediante evaporación rotatoria antes de la purificación en HPLC preparativa.

[0442] Purificación por HPLC del péptido oxidado

[0443] El péptido en bruto se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa usando un Gilson GX-281 con combinación de bomba 331/332 para aplicación de gradiente binario equipado con una columnaGemini NX 5u C18110A de 5 x25 cmy un colector de fracciones y se ejecutaron a 35 ml/min con un gradiente de tampón A (0,1 % de TFA, ac.) y tampón B (0,1 % de TFA, 90% de MeCN, ac.) gradiente del 20 % de B al 45 % de B en 47 minutos. Las fracciones se analizaron por HPLC analítica y MS y las fracciones relevantes se agruparon y liofilizaron para producir 138 mg, con una pureza del 92% como se caracteriza por HPLC y MS como se ha descrito anteriormente. PM monoisotópico calculado 1999,83 m/z, Hallado 1999,54 m/z.

[0444] Síntesis del compuesto n.° 119

[0445] Ac-SEFC(1)I[1 -Me-Trp]QDWGEHRC(1)[Sar]EGA-K([17-carboxi-heptadecanoil][*Glu]G[Peg3][*Glu][Peg3])-NH<2>La síntesis de péptidos en fase sólida se realizó en un sintetizador de péptidos Symphony X utilizando química de Fmoc estándar. TentaGel S RAM (3 x 1,3 ~g; 0,22 mmol/g) se hinchó en DMF (3 x 10 ml) antes de usar y el grupo Fmoc se desprotegió de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.

[0446] Acoplamiento de aminoácidos

[0447] Los aminoácidos protegidos con Fmoc adecuados de acuerdo con la secuencia se acoplaron como se ha descrito anteriormente usando HATU como reactivo de acoplamiento. Todos los acoplamientos se realizaron a t.a. La lisina usada para la incorporación del resto ramificado se incorporó como Fmoc-Lys(Dde)-OH para el acoplamiento ortogonal de la cadena lateral.

[0448] Desprotección Fmoc

[0449] La desprotección final se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.

[0450] Acilación de la cadena lateral

[0451] Mientras el péptido aún estaba unido a la resina, el grupo protector de cadena lateral ortogonal (Dde) se escindió selectivamente usando hidrato de hidrazina recién preparado (4 %) en NMP durante 2 x 15 min. La cadena lateral de lisina desprotegida se acopló por duplicado con Fmoc-Peg3-OH seguido de acoplamientos individuales con Fmoc-Glu-OtBu, Fmoc-Peg3-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu-OtBu y, por último, el resto de ácido graso mono éster tercbutílico de ácido 17-carboxi-heptadecanoico usando condiciones de acoplamiento estándar.

[0452] Escisión del péptido del soporte sólido

[0453] La resina-péptido se lavó con EtOH (3 * 15 ml) y Et2O (3 * 150 ml) y se secó hasta peso constante a t.a. El péptido se escindió de la resina mediante tratamiento con TFA/DODT (95/5; 120 ml, 2 h; t.a.). El volumen del filtrado se redujo y el péptido en bruto se precipitó después de la adición de éter dietílico. El precipitado de péptido bruto se lavó varias veces con éter dietílico y finalmente se secó para producir 2,36 g de producto de péptido bruto (pureza ~41-48 %).Purificación por HPLC del péptido lineal en bruto

[0454] El péptido bruto se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa usando una Gilson GX-281 con combinación de bomba 331/332 para aplicación de gradiente binario equipado con una columnaGemini NX 5u C18110A de 5 x 25 cm y un colector de fracciones y se ejecutaron a 35 ml/min con un gradiente de tampón A (0,1 % de TFA, ac.) y tampón B (0,1 % de TFA, 90% de MeCN, ac.) gradiente del 30 % de B al 60 % de B en 47 minutos. Las fracciones se analizaron por HPLC analítica y MS y las fracciones relevantes se agruparon y liofilizaron para producir 744 mg, con una pureza del 84% como se caracteriza por HPLC y MS como se ha descrito anteriormente. PM monoisotópico calculado 3207,47 m/z, Hallado 3207,32 m/z.

[0455] Formación del enlace disulfuro

[0456] Los 744 mg de péptido lineal purificado se disolvieron en 350 ml de 0,1 % de TFA en agua, 150 ml de acetonitrilo y 100 ml de ácido acético, dando una solución transparente. Se añadió gota a gota una solución de yodo en metanol (4,7 ml, aproximadamente 1,5 equivalentes de yodo) durante la agitación hasta que la solución de péptido obtuvo un color naranja. La reacción se siguió mediante HPLC analítica. Después de 10-15 min, la reacción se completó y el exceso de yodo se inactivó con una solución de ácido ascórbico en agua (150 pl, aproximadamente 1 equivalente) dando una solución incolora. El volumen de la solución de péptido se redujo ligeramente mediante evaporación rotatoria antes de la purificación en HPLC preparativa.

[0457] Purificación por HPLC del péptido oxidado

[0458] El péptido bruto se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa usando una Gilson GX-281 con combinación de bomba 331/332 para aplicación de gradiente binario equipado con una columnaGemini NX 5u C18110A de 5 x 25 cm y un colector de fracciones y se ejecutaron a 35 ml/min con un gradiente de tampón A (0,1 % de TFA, ac.) y tampón B (0,1 % de TFA,

[0459] 90% de MeCN, ac.) gradiente del 30 % de B al 60 % de B en 47 minutos. Las fracciones se analizaron por HPLC analítica y MS y las fracciones relevantes se agruparon y liofilizaron para producir 510 mg, con una pureza del 91% como se caracteriza por HPLC y MS como se ha descrito anteriormente. PM monoisotópico calculado 3205,47 m/z, Hallado 3205,23 m/z.

[0460] Síntesis del compuesto n.° 146

[0461] Ac-SEFA(1)I[1-Me-Trp]QDWGEHRhC(1)[Sar]EGE[Peg3][Peg3]-K([17-carboxi-heptadecanoil][*Glu]G[*Glu])-NH2

[0463] General

[0464] La síntesis de péptidos en fase sólida se realizó de forma manual usando química de Fmoc estándar. Rink amide-MBHA (0,5 mmol, 0,214 mmol/g, ~2,3 g) se hinchó en DMF:DCM durante la noche antes de usar y el grupo Fmoc se desprotegió de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.

[0465] Acoplamiento de aminoácidos

[0466] Los aminoácidos protegidos con Fmoc adecuados de acuerdo con la secuencia se acoplaron como se ha descrito anteriormente usando HBTU:NMM o HATU:NMM como reactivo de acoplamiento usando entre 2-3 equivalentes de aminoácidos. Todos los acoplamientos se realizaron a temperatura ambiente (t.a.) durante 1-3 horas a menos que se mencione lo contrario. La lisina usada para la incorporación del resto ramificado se incorporó como Dde-Lys(Fmoc)-OH para acoplamiento ortogonal.

[0467] Desprotección Fmoc

[0468] La desprotección final se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.

[0469] Etapas 1 y 2 (Esquema 1b)

[0470] Después de la unión de Dde-Lys(Fmoc)-OH a la resina y la desprotección de Fmoc, los siguientes aminoácidos se acoplaron a la lisina '-amina: Fmoc-Glu-OtBu, Fmoc-Peg3-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu-OtBu y, por último, el resto de ácido graso mono éster terc-butílico de ácido 17-carboxi-heptadecanoico usando HATU:NM<m>como reactivo de acoplamiento. Mientras el péptido aún estaba unido a la resina, el grupo protector (Dde) se escindió selectivamente usando hidrato de hidrazina recién preparado (2-4 %) en NMP durante 2 x 15 min. Después de un lavado minucioso con NMP, los aminoácidos en C-terminal se acoplaron usando condiciones estándar (HATU:NMM en la mayoría de los casos) que terminaron con el acoplamiento de la sarcosina.

[0471] Etapas 3 y 4 (Esquema 1b)

[0472] Después de una desprotección estándar de Fmoc, el bloque componente Dde-hCys(Fmoc-Ala-OAllyl)-OH (n.° 1, esquema 1a) se incorporó usando 3 equivalentes de n.° 1 y HATU:NMM (3:6) durante 2,5 horas a t.a. Los aminoácidos N-terminales se acoplaron usando 3 equivalentes de aminoácidos y HBTU:NMM (3:6) durante 1 hora a t.a. terminando con la acetilación del N-terminal usando Ac2O:DCM (1:2) durante 2 horas.

[0473] Etapa 5 (Esquema 1b)

[0474] La síntesis continuó eliminando el grupo de protección Dde de la amina N-terminal usando hidrato de hidrazina recién preparado (4 %) en NMP durante 2 x 15 minutos. Después de un lavado a fondo con NMP, la amina libre y el ácido carboxílico se acoplaron formando una lactama usando 3 equivalentes de aminoácidos y HATU:NMM (3:6) durante 1 hora a t.a.

[0475] Etapa 6 (Esquema 1b)

[0476] Después del ensamblaje del péptido ramificado sobre resina, el grupo alilo se eliminó tratando la resina con una solución de Pd(P(C<6>H<5>)<3>]<4>en CHCb/AcOH/NMM durante 3 horas. La resina se lavó a fondo y el grupo Fmoc se eliminó usando condiciones de desprotección estándar. La lactama se formó usando PyAOP, HOBt y DIPEA (3:5:5) en DMF durante la noche.

[0477] Escisión del péptido del soporte sólido (Etapa 7, esquema 1b)

[0478] La resina-péptido se lavó con EtOH (3 * 15 ml) y Et<2>O (3 * 150 ml) y se secó. El péptido se liberó de la resina mediante tratamiento con TFA/EDT/Tioanisol/Fenol/H<2>O (87,5/2,5/5/2,5/2,5; 35 ml, 2 h; t.a.). El volumen del filtrado se redujo y el péptido en bruto se precipitó después de la adición de éter dietílico. El precipitado de péptido en bruto se lavó varias veces con éter dietílico y finalmente se secó para producir 1,4 g de producto de péptido en bruto (pureza del 23 %).Purificación por HPLC del péptido final

[0479] El péptido en bruto se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa equipada con una columnaPhenomenex LunaC18 110A de 5 x25 cmy un colector de fracciones y se ejecutaron a 35 ml/min con un gradiente de tampón A (0,1 % de TFA, ac.) y tampón B (0,1 % de TFA, 90% de MecN, ac.) gradiente del 30 % de B al 60 % de B en 47 minutos. Las fracciones se analizaron por HPLC analítica y MS y las fracciones relevantes se agruparon y liofilizaron para producir 125,5 mg, con una pureza del 90,3% como se caracteriza por HPLC y MS como se ha descrito anteriormente. PM monoisotópico calculado 3245,52 m/z, Hallado 3245,32 m/z.

[0480] T l 1 : m r f r n i ni r i lf r :

[0482]

[0483] continuación

[0484]

[0485] continuación

[0486]

[0487] continuación

[0488]

[0490] Tabla 1b Com uestos de delta-cistationina Ctt2

[0491]

[0492]

[0493] continuación

[0495]

[0497] T l 1 m mm - i i nin 1

[0499]

[0501] Ejemplo 2: Ensayo de hemolisisin vitro

[0502] Método

[0503] El efectoin vitrode los compuestos de prueba se evaluó midiendo su efecto inhibidor sobre la vía clásica del complemento en un ensayo de hemólisis.

[0504] Brevemente, los compuestos de prueba y los compuestos de referencia se disolvieron en DMSO y se diluyeron en tampón de ensayo Tris/Caseína (Tris 10 mM, NaCl 145 mM, MgCh 0,5 mM, CaCl20,15 mM, y 0,1 % P/V de caseína, ajustado a pH 7,4) como diluciones en serie de 9 puntos en una placa de 96 pocillos. Glóbulos rojos de oveja (RBC) sensibilizados recubiertos con antisuero antieritrocitos de oveja de conejo (Complement Technology, Inc., TX, EE. UU.) se lavaron en tampón de ensayo de Tris/Caseína. Se añadieron 50 pl de cada pocillo de compuesto diluido a una placa de 96 pocillos que contenía 50 pl de suero humano diluido (Complement Technology, Inc., TX, EE.UU.) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. El factor de dilución de suero se optimizó para cada lote de suero para obtener un 70-90 % de hemólisis máxima usando el protocolo. A continuación, se añadieron 50 pl de glóbulos rojos de oveja sensibilizados a todos los pocillos (107 por pocillo).

[0505] Después de 30 minutos de incubación a 37 °C con agitación suave, la reacción se detuvo mediante la adición de 50 pl de tampón de terminación Tris por pocillo (EDTA 10 mM), Tris 10 mM, NaCl 145 mM, ajustado a pH 7,4). A continuación, los glóbulos rojos se eliminaron por centrifugación y se midió la hemólisis del sobrenadante resultante por absorbancia a 405 nm.

[0506] La respuesta se normalizó en relación con un control positivo y negativo (vehículo) para calcular la CI50 a partir de la curva de respuesta a la concentración usando el modelo no lineal logístico de 4 parámetros (4PL) para el ajuste de la curva. Todos los valores se basan en n=>2 determinaciones independientes.

[0507] Tabla 2: Efecto del intercambio de valina a isoleucina. El compuesto 1 difiere del compuesto de la técnica anterior 4W A l r l r n i Il n l r V l n l i i n .

[0509]

[0511] Se ensayaron compuestos adicionales como se muestra a continuación.

[0512] Tabla 3: Análisisin vitrode la inhibición de la hemólisis

[0515]

[0516] continuación

[0517]

[0518] continuación

[0519]

[0520] continuación

[0522]

[0524] Los siguientes pares de compuestos, cada uno de las cuales difiere solo en la posición 3, muestran que los efectos de reemplazar valina por isoleucina se observan en compuestos que tienen diversas secuencias de la cadena principal peptídica.

[0525]

[0526] También se demostró que la isoleucina en la posición 3 es superior en comparación con otros residuos que a menudo se consideran sustituciones "conservadoras" para la isoleucina.

[0527] Tabla 5: Efecto sobr l h m li i if r n r n l i i n A -I 1 XW DWGEHRC(1)T-NH2

[0530]

[0532] Debido a la alta concentración de C3 que se encuentra en el suero, puede ser difícil usar el ensayo de hemólisis para diferenciar entre compuestos que tienen una afinidad muy alta por C3.

[0533] En tales circunstancias, puede ser posible determinar una jerarquía más precisa de afinidad de unión a C3 mediante mediciones de SPR usando C3 inmovilizado, tal como se describe a continuación.

[0534] Ejemplo 3: Ensayo de solubilidad

[0535] Materiales y método

[0536] Solubilidad del compuesto a 10 mg/ml

[0537] La solubilidad de los compuestos se evaluó midiendo la dispersión de la luz a lo largo de un intervalo de pH de un pH de 4 a un pH de 7,5.

[0538] Los compuestos se disolvieron en una solución madre de 20 mg/ml en H2O a pH 2,5 o pH 10. Estas soluciones madre se diluyeron 1:1 con solución tamponada 200 mM para alcanzar una solución final de 10 mg/ml de compuesto en tampón 100 mM. Las 5 condiciones investigadas fueron (1) acetato pH 4,0, (2) acetato pH 5,0, (3) fosfato pH 6,0, (4) fosfato pH 7 y (5) fosfato pH 7,5.

[0539] Estas muestras se equilibraron durante 15 minutos a temperatura ambiente, antes de evaluar la solubilidad mediante inspección visual y las mediciones de absorbancia en un lector de microplacas SpectraMax 190 (Molecular Devices).Inspección visual

[0540] La inspección visual incluyó la comprobación manual de la placa de 96 pocillos en busca de pocillos que fueran transparentes o no transparentes. Además de esto, se toma una fotografía de la placa de 96 pocillos.

[0541] Lector de microplacas y dispersión de luz

[0542] La absorbancia se midió a cuatro longitudes de onda: 280 nm, 325 nm, 340 nm y 360 nm en una microplaca de 96 pocillos transparente UV en un lector de microplacas SpectraMax 190 (Molecular Devices). Los compuestos no absorben a 325-360 nm y la señal en estas longitudes de onda son, por lo tanto, una expresión de la dispersión de la luz, que refleja la presencia de partículas visibles o subvisibles que se detectan como señal aumentada.

[0543] La dispersión de la luz se normalizó a la señal de soluciones tampón puras (100 mM) y la solubilidad del compuesto se evaluó como buena (+) o mala (-). El criterio para esto fue una combinación de inspección visual y dispersión de luz que no excediera de 0,1 UA, donde los valores por debajo de 0,1 UA son buenos en muestras visualmente claras.Solubilidad de Comp, N.° 24:

[0544] Solución madre

[0545] El compuesto n.° 24 se pesó cuidadosamente y se disolvió en pH 2,5 H2O-CL La solución madre se equilibró 15 días a temperatura ambiente, punto en el que no había partículas visibles presentes. Se prepararon soluciones madre de tampón 200 mM para cada condición de pH.

[0546] Ensayo de solubilidad:

[0547] Las formulaciones para las pruebas de solubilidad se prepararon mezclando 50 pl de solución madre comp. n.° 24 y 50 pl de solución madre tampón con una mezcla suave pipeteando la solución un par de veces. Esto se realizó para cada condición de tampón/pH en una microplaca de 96 pocillos transparente a UV (Corning 96 pocillos REF 3635).

[0548] Las muestras de referencia sin comp n.° 24 se prepararon mezclando 50 pl a pH 2,5 H2O-CI y 50 pl de solución madre de tampón. La placa se cubrió con una tapa y se dejó 15 minutos a temperatura ambiente antes de evaluar la solubilidad.

[0549] Medición de la solubilidad:

[0550] La solubilidad se evaluó mediante inspección visual de cada formulación y una fotografía tomada en una caja de fotos. Se midió la dispersión de la luz a 280 nm, 325 nm, 340 nm y 360 nm en lector de microplacas SpectraMax 190 (Molecular Devices).

[0551] La inspección visual reveló que las condiciones 1, 2 y 3 estaban turbias y la condición 2 contenía adicionalmente precipitados visibles. La medición de la absorbancia confirmó la evaluación visual con las condiciones 1, 2 y 3 superando todas el umbral de 0,1 UA. Por lo tanto, las condiciones 4 y 5 se consideraron buenas condiciones para la solubilidad de 10 mg/ml comp n.° 24.

[0552] De forma similar, se ensayó la solubilidad de compuestos adicionales (Tabla 6).

[0553] Tabla 6: Tabla de la mayoría de los compuestos solubles, como se han analizado a 10 mg/ml. "+" indica solubilidad en la condición dada, según se determina por que la absorbancia UV es inferior a 0,1 UA a 340 nm y la muestra es transparente cuando se inspecciona manualmente. "-" indica falta de solubilidad en la condición dada, ya que la

[0555]

[0556] continuación

[0558]

[0561] Tabla 6 cont.

[0563]

[0566] Ejemplo 4: Mediciones de la afinidad por resonancia de plasmón superficial (SPR)

[0568] Método

[0570] Se usó resonancia de plasmón superficial (SPR) para caracterizar péptidos con respecto a su afinidad de unión (Kd) por C3. Se inmovilizó C3 humano (n.° de catálogo técnico del complemento A113c) en celdas de flujo individuales de chips de sensor CM5 (GE Healthcare) usando acoplamiento de amina estándar a una densidad de aproximadamente 3o0o unidades de resonancia (UR) en un tampón que consiste en fosfato 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,05 % de Tween20.

[0572] Para los experimentos de interacción, se usó y realizó un enfoque de experimento de múltiples ciclos usando un Biacore™T200 o Biacore™instrument X100 (GE Healthcare) a 25 °C. Los péptidos se inyectaron en series de concentración crecientes (5-8 concentraciones diferentes) durante 60-120 segundos a un caudal de 30 pl/min en un tampón que consistía en tampón Tris 10 mM a pH 7,4, con NaCl 150 mM y 0,05 % de Tween20. A esto le siguió un período de disociación de hasta 10 minutos. La superficie de C3 se regeneró entre ciclos mediante una inyección de 45 segundos de MgCl23 M.

[0574] Los sensogramas se referenciaron doblemente (superficie de referencia, espacios en blanco) antes del análisis de los perfiles cinéticos ajustando globalmente los datos a un modelo de unión de Langmuir 1:1 para obtener tasas de asociación y disociación para el cálculo de la constante de disociación de equilibrio Kd. Cada péptido se examinó en al menos 2 experimentos independientes.

[0576] Tabla 7: Afinidades de unión de los análogos de compstatina por C3 según se determina mediante un ensayo de r n n i l m n rfi i l n inm viliz .

[0578]

[0579] continuación

[0580]

[0582] Los siguientes pares de compuestos, que difieren solo en la posición 3, muestran los efectos de reemplazar valina por isoleucina en diferentes estructuras peptídicas.

[0583]

[0586] Ejemplo 5: Perfilado de compuestos de prueba en primates no humanos (PNH)

[0587] Macacos cangrejeros(Macaca fascicularis)machos sanos recibieron administraciones subcutáneas individuales de cada sustancia de ensayo. Los compuestos se formularon en fosfato 20 mM ajustado con NaOH a pH 7,5 y manitol para isotonicidad y se dosificaron a 1840 nmol/kg. Se recogió sangre de una vena femoral de cada animal en los siguientes momentos: Antes de la dosis, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96 y 120 h (10 tiempos de muestreo). La sangre se recogió en tubos de separación de suero y se dejó coagular a temperatura ambiente. Los tubos se centrifugaron y el suero resultante se dividió en alícuotas y se ultracongeló sobre hielo seco y se almacenó a -80 °C nominalmente hasta el análisis. Todos los estudios de PNH se realizaron de acuerdo con las leyes y reglamentos de bienestar animal, incluida la aprobación del estudio por un proceso de revisión ética local.

[0588] El suero aislado de primates no humanos en puntos de tiempo específicos después de la dosificación se analizó para determinar la actividad del complemento de la vía alternativa usando el kit Complement system Alternative Pathway WIESLABO de Svar Life Science (anteriormente Euro diagnostic AB, Suecia) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, las muestras de suero o los controles se diluyeron en tampón y se incubaron en tiras de microtitulación recubiertas con activadores específicos de la vía alternativa. Los pocillos se lavaron y se detectó el C5b-9 formado usando los reactivos colorimétricos incluidos. La absorbancia se midió a 405 nm. El porcentaje de actividad de la vía alternativa del complemento se calculó para cada animal y punto de tiempo en relación con la actividad antes de la dosis (0 horas) del animal individual con la resta del control negativo. Esto refleja la actividad farmacológica de los compuestos.

[0589] En un experimento distinto, macacos cangrejeros(Macaca fascicularis)machos sanos recibieron una administración subcutánea de 460 nmol/kg de la sustancia de ensayo 14 días antes de la administración de 1840 nmol/kg de la misma sustancia de ensayo. Se recogió sangre de una vena femoral de cada animal en los siguientes momentos basándose en la segunda dosificación: Antes de la dosis, 0,25, 0,5, 2, 4, 24, 48, 72, 96 y 120 h (10 tiempos de muestreo). El análisis de la muestra se realizó como se ha descrito para las muestras anteriores, sin embargo, con determinaciones individuales de actividad.

[0590] Los resultados del kit de la vía alternativa WIESLAB® se muestran en la Figura 1. Las figuras 1a-1g muestran resultados de experimentos realizados sin predosificación. La figura 1h muestra los resultados del único experimento realizado con predosificación.

[0591] En la figura 1a, el compuesto no acilado 61 tuvo una duración de acción relativamente corta a pesar de la alta afinidad por C3. Lo mismo se observa para los compuestos no acilados Cp40 (figura 1b) y el compuesto 54 (figura 1e). Por el contrario, los compuestos acilados en las figuras 1b, 1c, 1d, 1e, 1f y 1g en general poseían una actividad farmacológica de mayor duraciónin vivoen comparación con los compuestos no acilados a pesar de una menor afinidad. Aunque generalmente se sabe que la acilación de péptidos aumenta la semividain vivo,sorprendentemente se descubrió que la duraciónin vivode la eficacia farmacológica se prolongó hasta este punto.

[0592] Para evaluar la semivida farmacocinética (t1^ ), las muestras de suero aisladas de primates no humanos en puntos de tiempo específicos después de la dosificación se analizaron para determinar el compuesto farmacológico total después de la preparación de la muestra mediante extracción en fase sólida (SPE) y espectrometría de masas por cromatografía líquida (LC-MS/MS) usando un patrón interno análogo. Para cada paciente se usó una sola medición de las concentraciones en suero para el cálculo de los parámetros farmacocinéticos utilizando el enfoque no compartimental en Phoenix WinNonlin 6.3. La semivida de eliminación terminal plasmática (t1^ ) se determinó como ln(2)/ke donde *z es la magnitud de la pendiente de la regresión lineal logarítmica del perfil logarítmico de la concentración frente al tiempo durante la fase terminal.

[0593] Los datos farmacocinéticos (PK) se muestran en la tabla 9.

[0594] Tabla 9: Datos PK en PNH:

[0597]

[0598] continuación

[0601]

[0603] Las determinaciones son aproximadas, como la t / determinada durante menos de tres veces la semivida esperada. Ejemplo 6: Estabilidad química de los análogos de compstatina con puente de cistationina

[0604] Materiales y métodos

[0605] Estabilidad química de los análogos de compstatina con cistationina o puente disulfuro.

[0606] La estabilidad se evaluó en tres formulaciones a 50 mg/ml de péptido, F1: fosfato 20 mM pH 5.5, F2: fosfato 20 mM pH 6,5 y F3: fosfato 20 mM pH 7,5. Las formulaciones se prepararon mediante disolución directa del péptido de las porciones liofilizadas en las formulaciones respectivas. El pH se ajustó al objetivo con NaOH 1 M y HCl 1 M.

[0607] La estabilidad química se evaluó en condiciones aceleradas (14 días, 40 °C) y se evaluó como el cambio en la pureza mediante HPLC de fase inversa y cambio en el contenido de oligómero covalente mediante SEC desnaturalizante. Las formulaciones se colocaron a 40 °C con puntos de análisis a T= 0, 7 y 14 días. En cada punto de tiempo, se extrajo un pequeño volumen y se diluyó a 2 mg/ml y se analizó mediante HPLC de fase inversa y SEC desnaturalizante.Método de HPLC de fase inversa para la determinación de la pureza

[0608] La pureza se evaluó mediante HPLC de fase inversa usando un sistema Ultimate 3000 para aplicación de gradiente binario equipado con una columna Kinetix C18 (n.° de cat. 00F-4462-Y0, 150 mm x 3 mm, 2,6 pm) ciclo a 0,5 ml/min con una gradiente de tampón A (0,3 % de TFA, ac.) y tampón B (0,3 % de TFA, 90% de MeCN, ac.) gradiente de 40 % de B a 70 % de B durante 20 minutos. La detección se realizó usando un detector de matriz de diodos ajustado a 220 nm.

[0609] Método de SEC desnaturalizante para la determinación de la pureza

[0610] La formación de oligómeros covalentes se evaluó mediante SEC desnaturalizante (cromatografía de exclusión por tamaño) usando el sistema Ultimate 3000 equipado con una columna TSKgel SuperSW 2000 (n.° de cat. 818674, 300 mm x 3 mm, 4 pm) ejecutado a 0,5 ml/min con flujo isocrático de tampón A (0,1 % de TFA, 45 % de MeCN, ac.), 10 minutos. La detección se realizó usando un detector de matriz de diodos ajustado a 215 nm.

[0611] Estabilidad química del Como. n.° 126 (disulfuro)y 156 (cistationina):

[0612] Preparación de muestras:

[0613] Los compuestos 126 y 156 se pesaron cuidadosamente y se disolvieron en las formulaciones F1, F2 y F3 a una concentración objetivo de 50 mg/ml. Una vez disueltos visualmente, la concentración se confirmó mediante la absorbancia a 280 nm y las muestras se colocaron en estabilidad a 40 °C.

[0614] Ensayo de estabilidad química:

[0615] Las muestras para el análisis se extrajeron en T = 0, 7 y 14 días de una cámara climática a 40 °C. El volumen extraído se disolvió 1:25 (concentración final: 2 mg/ml) en fosfato 20 mM a pH 5,5, 6,5 o 7,5 y se midió mediante HPLC de fase inversa y SEC desnaturalizante por inyección de 0,4 pl (carga de columna 0,8 pg).

[0616] Los cromatogramas resultantes se integraron para determinar la pureza química mediante HPLC de fase inversa y el contenido de oligómero covalente mediante SEC desnaturalizante. El cambio en la pureza y el correspondiente aumento en el contenido de oligómero covalente muestra que el compuesto 156 es significativamente más estable que el compuesto 126, como se muestra en la Figura 2.

[0617] Los datos de pureza química del almacenamiento de 2 semanas a 40 °C de cinco compuestos basados en disulfuro (compuestos 111, 119, 123, 126 y 142) y cinco compuestos basados en cistationina (compuestos 147, 148, 150, 153 y 156) se resumen en la Tabla 10.

[0619] Los datos muestran que los compuestos con un puente de cistationina tienen una estabilidad química significativamente mejor que los compuestos con un puente disulfuro a pH 5,5-7,5.

[0621] Tabla 10: Pureza normalizada (HPLC) y contenido de oligómero covalente (SEC) de péptidos después de 14 días de almacenamiento a 40 °C en las formulaciones F1 F2 F3.

[0623]

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

1. Un análogo de compstatina que tiene la secuencia:

Ac-SEFA(1)I[1-Me-Trp]QDWGEHRhC(1)TEGE-[Peg3]ES-[K*]-NH2

en donde las cadenas laterales de los restos designados A(1) y hC(1) forman un puente de cistationina, y en donde K* es un resto de lisina unido covalentemente a un grupo Z1- o Z1-Z2-; en donde:

Z1 es COOH-alquileno C12-22-(CO)-; y

Z2 se selecciona entre:

[•Glu];

[•Glu][Peg3][Peg3];

[(Piperazina-1-il)-acetilo][Peg3][Peg3];

[•Glu]G[●Glu];

[•Glu]K[●Glu];

[•Glu]KG[●Glu]; o

[•Glu]G[Peg3][●Glu][Peg3]

donde Peg3 representa ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico;

o una sal y/o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo.

2. Un análogo de compstatina o una sal y/o unsolvato farmacéuticamente aceptables del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde Z1 es HOOC-(CH2)12-22- (CO)-.

3. Un análogo de compstatina o una sal y/o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde Z1 se selecciona entre:

HOOC-(CH2)12-(CO)-;

HOOC-(CH2)14-(CO)-;

HOOC-(CH2)16-(CO)-;

HOOC-(CH2)18-(CO)-; o

HOOC-(CH2)20-(CO)-; y

en donde Z2 se selecciona entre:

[•Glu];

[•Glu][Peg3][Peg3]-;

[(Piperazina-1-il)-acetilo][Peg3][Peg3];

[yGlu]G[yGlu];

[yGlu]K[yGlu];

[yGlu]KG[yGlu]; o

[•Glu]G[Peg3][●Glu][Peg3].

4. Un análogo de compstatina o una sal y/o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde Z1- o Z1-Z2- se seleccionan entre:

15-carboxi-pentadecanoílo;

15-carboxi-pentadecanoil[●Glu],

15-carboxi-pentadecanoil[●Glu][Peg3][Peg3];

19-carboxi-nonadecanoil[●Glu][Peg3][Peg3];

15-carboxi-pentadecanoil[(Piperazina-1-il)-acetilo][Peg3][Peg3];

17-carboxi-heptadecanoil[●Glu]G[●Glu];

17-carboxi-heptadecanoil[●Glu]K[●Glu];

17-carboxi-heptadecanoil[●Glu]KG[●Glu];

17-carboxi-heptadecanoil[●Glu]G[Peg3pGlu][Peg3];

15-carboxi-pentadecanoil[●Glu]G[●Glu];

17-carboxi-heptadecanoílo;

17-carboxi-heptadecanoil[●Glu]

19-carboxi-nonadecanoil[●Glu]G[●Glu]; y

17-carboxi-heptadecanoil[●Glu][Peg3][Peg3].

5. Un análogo de compstatina de acuerdo con la reivindicación 1 que es:

Ac-SEFA(1)I[1-Me-Trp]QDWGEHRhC(1)TEGE[Peg3]ES-K([17-carboxi-heptadecanoilpGlu])-NH2

en donde las cadenas laterales de los restos designados A(1) y hC(1) forman un puente de cistationina o una sal y/o

un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo.

6. Una composición que comprende un análogo de compstatina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una sal y/o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en mezcla con un vehículo.

7. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la composición es una composición farmacéutica y el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Una composición farmacéutica que comprende un análogo de compstatina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una sal y/o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en mezcla con un vehículo, un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptables.

9. Un análogo de compstatina o una sal y/o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en terapia.

10. Un análogo de compstatina o una sal y/o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en un método de profilaxis o tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Stargardt, periodontitis, retinopatía diabética, glaucoma, uveítis, artritis reumatoide, lesión de la médula espinal, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, cáncer y trastornos respiratorios tales como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), inflamación alérgica, enfisema, bronquitis, bronquiectasia, fibrosis quística, tuberculosis, neumonía, síndrome de dificultad respiratoria (SDR - del recién nacido y del adulto), rinitis y sinusitis; infecciones bacterianas tales como sepsis, lesión por isquemia-reperfusión en diversos tejidos, infarto de miocardio, anafilaxia, hemoglobinuria paroxística nocturna, anemia hemolítica autoinmunitaria, psoriasis, hidradentitis supurativa, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico, síndrome CHAPLE, glomeropatía C3, nefropatía de IgA, síndrome urémico hemolítico atípico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa o síndrome antifosfolípido.