ES3050608T3 - Improved reprogramming methods and cell culture platforms - Google Patents

Improved reprogramming methods and cell culture platforms

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ES3050608T3
ES3050608T3 ES20207188T ES20207188T ES3050608T3 ES 3050608 T3 ES3050608 T3 ES 3050608T3 ES 20207188 T ES20207188 T ES 20207188T ES 20207188 T ES20207188 T ES 20207188T ES 3050608 T3 ES3050608 T3 ES 3050608T3
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culture
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Bahram Valamehr
Peter Flynn
Ramzey Abujarour
Megan Robinson
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Fate Therapeutics Inc
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Fate Therapeutics Inc
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Abstract

La invención proporciona métodos para la fabricación de células pluripotentes. En particular, proporciona métodos mejorados para la fabricación de células pluripotentes con pluripotencia fundamental. En diversas realizaciones, la invención contempla, en parte, el uso de una composición que comprende: (a) un agonista de la vía Wnt; (b) un inhibidor de MEK; y (c) un inhibidor de ROCK. En ciertas realizaciones, la composición comprende además bFGF o LIF. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Métodos de reprogramación mejorados y plataformas de cultivo celular
[0003] Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
[0004] Esta solicitud reivindica el beneficio en virtud 35 U.S.C. § 119(e) de la Solicitud Provisional US- 61/947.979, presentada el 4 de marzo de 2014.
[0005] Declaración sobre el listado de secuencias
[0006] El listado de secuencias asociado a esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel. El nombre del archivo de texto que contiene el listado de secuencias es FATE_122_01WO_ST25.txt. El archivo de texto tiene un tamaño de 8 KB, se creó el 4 de marzo de 2015 y se presenta electrónicamente a través de EFS-Web, al mismo tiempo que se presenta la memoria descriptiva.
[0007] Antecedentes
[0008] Campo técnico
[0009] La invención se refiere generalmente a métodos para fabricar células pluripotentes. En particular, la invención se refiere a plataformas de cultivo mejoradas para fabricar células pluripotentes con pluripotencia de estado fundamental.
[0010] Descripción de la técnica relacionada
[0011] Los esfuerzos actuales de detección de enfermedades y toxicología basados en células madre pluripotentes y las terapias de células madre pluripotentes auto/alogénicas del futuro requerirán métodos robustos y reproducibles de generación y expansión de líneas celulares de células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Las hiPSC se han generado por la expresión ectópica de factores de pluripotencia introducidos a través de sistemas de expresión retro y lentivirales que integran el genoma. Los esfuerzos para eliminar tantos eventos de integración como sea posible han incluido sustituir inhibidores de moléculas pequeñas para un número de factores de reprogramación. Además, los métodos no integrativos han demostrado ser ineficientes y laboriosos, requieren factores de reprogramación adicionales o no son eficaces para reprogramar todas las células somáticas (Lee y col., 2013).
[0012] Todavía deben abordarse varios desafíos asociados con el cultivo de células madre pluripotentes para permitir que las células se vuelvan adecuadas para futuras aplicaciones industriales y clínicas. En el sistema de cultivo convencional más comúnmente utilizado, las hESC y las hiPSC se mantienen en las células alimentadoras mientras se pasan (se someten a pasaje) como grumos para evitar la muerte celular extensa y las aberraciones genómicas (Thomson y col., 1998). La incapacidad de las hiPSC de cultivo celular individual en un entorno libre de alimentadores (FF) limita gravemente las potenciales aplicaciones de detección a escala industrial o terapia celular (Skottman y col., 2007; Valamehr y col., 2011). Además, los esfuerzos recientes de mejorar las hiPSC se han centrado en hiPSC derivadas de lentivirus que no estaban libres de transgén, limitando la relevancia terapéutica de dichos esfuerzos. Otro desafío que aún no se ha abordado con éxito, aparte de la modificación del genoma, es la propensión a la diferenciación espontánea de células madre pluripotentes humanas en cultivo (Pera y Trounson, 2004; Sathananthan y Trounson, 2005; Valamehr y col., 2011).
[0013] Se han descrito estudios en hESC y hiPSC, pero la expresión ectópica continua de genes de pluripotencia fue necesaria para mantener el estado fundamental que da como resultado células madre pluripotentes humanas modificadas en el genoma (Hanna y col., 2010a), que no son adecuadas para células pluripotentes de grado industrial y clínico.
[0014] Por consiguiente, la ausencia de composiciones y métodos para la generación libre de huella o transgén de alto rendimiento de productos de células pluripotentes humanas ha demostrado hasta ahora ser un obstáculo sustancial en el desarrollo y comercialización de futuras terapias con células madre pluripotentes.
[0015] Breve resumen
[0016] La invención generalmente proporciona plataformas de cultivo celular mejoradas.
[0017] En diversas realizaciones, la invención contempla, en parte, una composición que comprende: (a) un inhibidor de GSK3; (b) un inhibidor de MEK; y (c) un inhibidor de ROCK, en donde la composición no comprende un inhibidor de TGFpR.
[0018] En determinadas realizaciones, el inhibidor de GSK3 es CHIR99021 o BIO.
[0019] En realizaciones adicionales, el inhibidor de MEK es PD98059 o PD032901.
[0020] En realizaciones adicionales, el inhibidor de ROCK es tiazovivina o Y27632.
[0021] En algunas realizaciones, el inhibidor de GSK3 es CHIR99021; el inhibidor de MEK es PD032901; y el inhibidor de ROCK es la tiazovivina.
[0022] En determinadas realizaciones, cualquiera de las composiciones anteriores comprende además bFGF o LIF.
[0023] En realizaciones adicionales, cualquiera de las composiciones anteriores comprende además bFGF y LIF.
[0024] En algunas realizaciones, un método para cultivar una o más células pluripotentes que comprende cultivar la una o más células pluripotentes en un medio de cultivo celular según cualquiera de los medios de cultivo anteriores.
[0025] En realizaciones adicionales, las una o más células pluripotentes son células madre embrionarias (ESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC).
[0026] En realizaciones particulares, la una o más células no pluripotentes son iPSC.
[0027] En determinadas realizaciones, la composición comprende una población de células pluripotentes.
[0028] En realizaciones adicionales, la población de células pluripotentes es una población homogénea de células pluripotentes.
[0029] En determinadas realizaciones, al menos el 95 % de la población de células pluripotentes expresa SSEA4-FITC y TRA1-81 o TRA1-60.
[0030] En algunas realizaciones, como máximo el 5 % de la población de células pluripotentes expresa a-actina de músculo liso (SMA), TUJ1 o FoxA2.
[0031] En determinadas realizaciones, las células pluripotentes se cultivaron previamente en un medio de cultivo celular que comprende un inhibidor de TGFpR.
[0032] En realizaciones adicionales, el cultivo de las células pluripotentes en el medio de cultivo celular reduce la diferenciación espontánea de las células cultivadas.
[0033] En una realización, la expresión de uno o más genes marcadores de diferenciación en las células cultivadas disminuye en al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en comparación con la expresión del uno o más genes marcadores de diferenciación en una célula pluripotente cultivada en un medio que comprende un inhibidor de TGFpR, donde los genes marcadores de diferenciación se seleccionan del grupo que consiste en: FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, gen T (Brachyury) y ZIC1.
[0034] En otra realización, el uno o más genes marcadores de diferenciación se selecciona del grupo que consiste en gen T, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 y TUJ1.
[0035] En otra realización más, la expresión de dos o más genes marcadores de diferenciación disminuye en las células cultivadas en al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en comparación con la expresión de los dos o más genes marcadores de diferenciación en una célula pluripotente cultivada en un medio que comprende un inhibidor de TGFpR, donde los genes marcadores de diferenciación se seleccionan del grupo que consiste en: FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, gen T (Brachyury) y ZIC1.
[0036] En aún otra realización más, los dos o más genes marcadores de diferenciación se seleccionan del grupo que consiste en gen T, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 y TUJ1.
[0037] En una determinada realización, la expresión de tres o más genes marcadores de diferenciación disminuye en las células cultivadas en al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en comparación con la expresión de los tres o más genes marcadores de diferenciación en una célula pluripotente cultivada en un medio que comprende un inhibidor de TGFpR, donde los genes marcadores de diferenciación se seleccionan del grupo que consiste en: FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, gen T (Brachyury) y ZIC1.
[0038] En una determinada realización, los tres o más genes marcadores de diferenciación se seleccionan del grupo que consiste en gen T, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 y TUJ1.
[0039] En una realización adicional, la expresión de cinco o más genes marcadores de diferenciación disminuye en las células cultivadas en al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en comparación con la expresión de los cinco o más genes marcadores de diferenciación en una célula pluripotente cultivada en un medio que comprende un inhibidor de TGFpR, donde los genes marcadores de diferenciación se seleccionan del grupo que consiste en: FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, gen T (Brachyury) y ZIC1.
[0040] En una realización adicional, los cinco o más genes marcadores de diferenciación se seleccionan del grupo que consiste en gen T, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 y TUJ1.
[0041] En una determinada realización, el cultivo de las células pluripotentes en el medio de cultivo celular mantiene o induce un estado fundamental de pluripotencia.
[0042] En determinadas realizaciones, el estado fundamental de pluripotencia de la una o más células pluripotentes se mantiene durante al menos 5 pasajes.
[0043] En determinadas realizaciones, el estado fundamental de pluripotencia de la una o más células pluripotentes se mantiene durante al menos 10 pasajes.
[0044] En otras determinadas realizaciones, el estado fundamental de pluripotencia de la una o más células pluripotentes se mantiene durante al menos 50 pasajes.
[0045] En determinadas realizaciones adicionales, el estado fundamental de pluripotencia de la una o más células pluripotentes se mantiene durante al menos 100 pasajes.
[0046] En diversas realizaciones, los métodos anteriores comprenden además disociar la una o más células pluripotentes durante el pasaje.
[0047] En determinadas realizaciones, la viabilidad de la una o más células pluripotentes se mantiene durante el pasaje. En determinadas realizaciones, la una o más células pluripotentes comprenden un cariotipo normal.
[0048] En determinadas realizaciones adicionales, la una o más células pluripotentes se cultivan en un entorno libre de alimentador.
[0049] En determinadas realizaciones adicionales, la estabilidad genómica de la una o más células pluripotentes se mantiene durante al menos 10 pasajes.
[0050] En determinadas realizaciones relacionadas, la estabilidad genómica de la una o más células pluripotentes se mantiene durante al menos 50 pasajes.
[0051] En determinadas otras realizaciones, la estabilidad genómica de la una o más células pluripotentes se mantiene durante al menos 100 pasajes.
[0052] En diversas realizaciones, la presente invención contempla, en parte, un método para adaptar células pluripotentes a un cultivo sin alimentador que comprende: (a) aislar una o más células pluripotentes que se cultivan en presencia de células alimentadoras; (b) cultivar la una o más células pluripotentes en un medio de cultivo celular químicamente definido que comprende: un agonista de la ruta de Wnt, opcionalmente donde el agonista de la ruta de Wnt es un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de ROCK, en donde el medio no comprende ningún inhibidor de TGFpR.
[0053] En diversas determinadas realizaciones, la presente invención contempla, en parte, un método para cultivar células pluripotentes pasadas enzimáticamente como células individuales que comprende: (a) tratar enzimáticamente una o más células pluripotentes para pasar una sola célula pluripotente; (b) cultivar la célula pluripotente individual en un entorno libre de alimentador;(c) cultivar la célula pluripotente única en un medio de cultivo celular químicamente definido que comprende: un agonista de la ruta de Wnt, opcionalmente donde el agonista de la ruta de Wnt es un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de ROCK, en donde el medio no comprende ningún inhibidor de TGFpR.
[0055] En diversas realizaciones determinadas, la presente invención contempla, en parte, un método para reducir la diferenciación espontánea de una o más células pluripotentes que comprende: (a) cultivar la una o más células pluripotentes en un entorno libre de alimentador; (b) cultivar la una o más células pluripotentes en un medio de cultivo celular químicamente definido que comprende: un agonista de la ruta de Wnt, opcionalmente donde el agonista de la ruta de Wnt es un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de ROCK, en donde el medio no comprende ningún inhibidor de TGFpR.
[0057] La presente invención contempla un método in vitro de fabricación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) que comprende: (a) obtener una o más células no pluripotentes; (b) reprogramar la una o más células no pluripotentes a un estado pluripotente; (c) cultivar las células pluripotentes en un medio de cultivo celular que no comprende un inhibidor de TGFpR produciendo de este modo iPSC.
[0059] En determinadas realizaciones, la una o más células no pluripotentes comprenden una célula somática.
[0061] En algunas realizaciones, la una o más células no pluripotentes comprenden una célula madre adulta.
[0063] En determinadas realizaciones, la una o más células no pluripotentes se reprograman a un estado pluripotente aumentando la expresión de OCT4 endógena en la célula.
[0065] En realizaciones adicionales, la reprogramación de la una o más células no pluripotentes al estado pluripotente comprende introducir uno o más polinucleótidos que codifican uno o más factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2, NANOG, Klf4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB y SV40LT en la una o más células no pluripotentes.
[0067] En realizaciones adicionales, la reprogramación de la una o más células no pluripotentes al estado pluripotente comprende introducir uno o más polinucleótidos que codifican una o más copias de factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2, NANOG, Klf4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB y SV40LT en la una o más células no pluripotentes.
[0069] En determinadas realizaciones, la reprogramación de la una o más células no pluripotentes al estado pluripotente comprende introducir uno o más polinucleótidos que codifican una o más copias de factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2 y NANOG en la una o más células no pluripotentes.
[0071] En determinadas realizaciones, la reprogramación de la una o más células no pluripotentes al estado pluripotente comprende introducir uno o más polinucleótidos que codifican una o más copias de factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, NANOG, ECAT1, UTF1 y ESRRB en la una o más células no pluripotentes.
[0073] En determinadas realizaciones, la reprogramación de la una o más células no pluripotentes al estado pluripotente comprende introducir uno o más polinucleótidos que codifican una o más copias de factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, ECAT1 y UTF1 en la una o más células no pluripotentes.
[0075] En determinadas realizaciones, el uno o más polinucleótidos son un vector lentiviral.
[0077] En algunas realizaciones, el uno o más polinucleótidos son un vector episomal.
[0079] En determinadas realizaciones relacionadas, el medio de cultivo celular comprende un agonista de la ruta de Wnt, opcionalmente donde el agonista de la ruta de Wnt es un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de ROCK.
[0081] En determinadas realizaciones adicionales, la reprogramación de la una o más células no pluripotentes comprende poner en contacto la una o más células no pluripotentes con un agonista de la ruta de Wnt, opcionalmente donde el agonista de la ruta de Wnt es un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de TGFpR, y opcionalmente un inhibidor de ROCK.
[0083] En realizaciones adicionales, las iPSC comprenden una población de iPSC.
[0085] En determinadas realizaciones, la población de iPSC es una población homogénea de iPSC.
[0087] En determinadas realizaciones, al menos el 95 % de la población de iPSC expresa SSEA4 y TRA1-81 o TRA1-60.
[0088] En determinadas realizaciones, como máximo el 5 % de la población de células pluripotentes expresa a-actina de músculo liso (SMA), TUJ1 o FoxA2.
[0089] En determinadas realizaciones, el cultivo de las células pluripotentes en el medio de cultivo celular reduce la diferenciación espontánea, o mantiene o induce un estado fundamental de pluripotencia.
[0090] En realizaciones adicionales, la expresión de uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, o cinco o más genes marcadores de diferenciación disminuye en las iPSC en al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en comparación con la expresión del uno o más genes marcadores de diferenciación en iPSC cultivadas en un medio que comprende un inhibidor de TGFpR, donde los genes marcadores de diferenciación se seleccionan del grupo que consiste en: FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, gen T (Brachyury) y ZIC1.
[0091] En determinadas realizaciones, el uno o más genes marcadores de diferenciación se selecciona del grupo que consiste en gen T, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 y TUJ1.
[0092] En determinadas realizaciones, la reducción en la diferenciación espontánea se mantiene durante al menos 5 pasajes. En otras realizaciones, la reducción en la diferenciación espontánea se mantiene durante al menos 10 pasajes. En determinadas realizaciones, la reducción en la diferenciación espontánea se mantiene durante al menos 50 pasajes.
[0093] En realizaciones adicionales, la reducción en la diferenciación espontánea se mantiene durante al menos 100 pasajes. En realizaciones adicionales, los métodos anteriores comprenden disociar las iPSC durante el pasaje.
[0094] En realizaciones adicionales, la viabilidad de las iPSC se mantiene durante el pasaje.
[0095] En determinadas realizaciones, las iPSC comprenden un cariotipo normal.
[0096] En otras realizaciones, las iPSC se cultivan en un entorno libre de alimentador.
[0097] En determinadas realizaciones, la estabilidad genómica de las iPSC se mantiene durante al menos 10 pasajes. En realizaciones adicionales, la estabilidad genómica de las iPSC se mantiene durante al menos 50 pasajes.
[0098] En determinadas realizaciones adicionales, la estabilidad genómica de las iPSC se mantiene durante al menos 100 pasajes.
[0099] En diversas realizaciones, la invención proporciona, en parte, una célula madre pluripotente inducida (iPSC) que comprende pluripotencia en estado fundamental producida según una cualquiera de las realizaciones anteriores. En diversas realizaciones determinadas, la invención proporciona, en parte, una célula madre pluripotente inducida (iPSC) que comprende pluripotencia en estado fundamental, en donde la iPSC no comprende ningún polinucleótido introducido de forma exógena que codifica un polipéptido del factor de reprogramación.
[0100] La invención proporciona, un método in vitro de fabricación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) que comprende: a) obtener una o más células madre pluripotentes; (b) cultivar la una o más células madre pluripotentes en un medio de cultivo celular que no comprende un inhibidor de TGFpR, produciendo de este modo iPSC en estado fundamental.
[0101] En determinadas realizaciones, la una o más iPSC comprenden una célula somática reprogramada.
[0102] En realizaciones adicionales, la una o más iPSC comprenden una célula madre adulta reprogramada.
[0103] En otras realizaciones, la una o más iPSC se reprogramaron a un estado pluripotente aumentando la expresión de OCT4 endógena en la una o más iPSC.
[0104] En determinadas realizaciones, la una o más iPSC se reprogramaron introduciendo uno o más polinucleótidos que codifican uno o más factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2, NANOG, Klf4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB y SV40LT en la una o más células no pluripotentes.
[0105] En determinadas realizaciones, la una o más iPSC se reprogramaron introduciendo uno o más polinucleótidos que codifican una o más copias de factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, y SV40LT.
[0106] En realizaciones adicionales, la una o más iPSC se reprogramaron introduciendo uno o más polinucleótidos que codifican una o más copias de factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2 y NANOG en la una o más células no pluripotentes.
[0107] En realizaciones adicionales, la una o más iPSC se reprogramaron introduciendo uno o más polinucleótidos que codifican una o más copias de factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, NANOG, ECAT1, UTF1 y ESRRB en la una o más células no pluripotentes.
[0108] En otra realización, la una o más iPSC se reprogramaron introduciendo uno o más polinucleótidos que codifican una o más copias de factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, ECAT1 y UTF1 en la una o más células no pluripotentes.
[0109] En diversas realizaciones, un vector lentiviral comprende el uno o más polinucleótidos.
[0110] En determinadas realizaciones, un vector episomal comprende el uno o más polinucleótidos.
[0111] En otras realizaciones, el medio de cultivo celular comprende un agonista de la ruta de Wnt, opcionalmente donde el agonista de la ruta de Wnt es un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de ROCK.
[0112] En determinadas realizaciones, obtener la una o más iPSC comprende poner en contacto la una o más células no pluripotentes o células parcialmente pluripotentes con un agonista de la ruta de Wnt, opcionalmente donde el agonista de la ruta de Wnt es un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de TGFpR, y opcionalmente un inhibidor de ROCK para producir la una o más iPSC.
[0113] En realizaciones adicionales, las iPSC comprenden una población de iPSC.
[0114] En realizaciones adicionales, la población de iPSC es una población homogénea de iPSC.
[0115] En determinadas realizaciones, al menos el 95 % de la población de iPSC expresa SSEA4 y TRA1-81 o TRA1-60. En realizaciones particulares, la una o más iPSC se obtienen reprogramando una población de células pluripotentes, en donde como máximo el 5 % de la población de células pluripotentes expresa a-actina de músculo liso (SMA), TUJ1 o FoxA2.
[0116] En realizaciones adicionales, los métodos anteriores comprenden cultivar la una o más iPSC en el medio de cultivo celular reduce la diferenciación espontánea o mantiene o induce un estado fundamental de pluripotencia.
[0117] En determinadas realizaciones, las iPSC con diferenciación espontánea reducida comprenden una expresión génica donde la expresión de uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, o cinco o más genes marcadores de diferenciación disminuye en las iPSC en al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en comparación con la expresión del uno o más genes marcadores de diferenciación en iPSC cultivadas en un medio que comprende un inhibidor de TGFpR, donde los genes marcadores de diferenciación se seleccionan del grupo que consiste en: FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, gen T (Brachyury) y ZIC1.
[0118] En realizaciones adicionales, el uno o más genes marcadores de diferenciación se selecciona del grupo que consiste en gen T, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2 y TUJ1.
[0119] En otras realizaciones, la diferenciación espontánea reducida se mantiene durante al menos 5 pasajes.
[0120] En determinadas realizaciones, la diferenciación espontánea reducida se mantiene durante al menos 10 pasajes. En realizaciones adicionales, la diferenciación espontánea reducida se mantiene durante al menos 50 pasajes. En determinadas realizaciones, la diferenciación espontánea reducida se mantiene durante al menos 100 pasajes. En realizaciones adicionales, los métodos anteriores comprenden disociar la una o más iPSC durante el pasaje.
[0121] En determinadas realizaciones, la viabilidad de la una o más iPSC se mantiene durante el pasaje.
[0122] En otras realizaciones, la una o más iPSC comprenden un cariotipo normal.
[0123] En realizaciones adicionales, la una o más iPSC se cultivan en un entorno libre de alimentador.
[0124] En determinadas realizaciones, la estabilidad genómica de la una o más iPSC se mantiene durante al menos 10 pasajes.
[0125] En realizaciones adicionales, la estabilidad genómica de la una o más iPSC se mantiene durante al menos 50 pasajes. En determinadas realizaciones, la estabilidad genómica de la una o más iPSC se mantiene durante al menos 100 pasajes.
[0126] En diversas realizaciones particulares, la invención proporciona, en parte, una célula madre pluripotente inducida (iPSC) que comprende pluripotencia en estado fundamental producida según una cualquiera de las realizaciones anteriores.
[0127] En diversas realizaciones, la invención proporciona, en parte, una célula madre pluripotente inducida (iPSC) que comprende pluripotencia en estado fundamental, en donde la iPSC no comprende ningún polinucleótido introducido de forma exógena que codifica un polipéptido del factor de reprogramación.
[0128] En algunas realizaciones, se proporciona un método para reprogramar una célula no pluripotente en una célula pluripotente que comprende introducir en la célula no pluripotente (i) uno o más polinucleótidos que codifican al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de ESRRB, o (ii) al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido UTF1, un polipéptido de<NANOG y un polipéptido de>ESRR<b>,<reprogramando de este modo la célula no pluripotente en una célula pluripotente.>En una realización particular, la introducción comprende (i) introducir uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de ESRRB, o (ii) introducir un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de ESRRB.
[0129] En otra realización, la introducción comprende (i) introducir uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1 y un polipéptido de UTF1, o (ii) introducir un polipéptido de OCT-4, un polipéptido de ECAT1 y un polipéptido de UTF1.
[0130] En algunas realizaciones, el uno o más polinucleótidos son introducidos por un retrovirus, virus Sendai, un adenovirus, un episoma, minicírculo, sistema de vector con casete de expresión o ARNm.
[0131] En una determinada realización, el retrovirus es un lentivirus.
[0132] En otra realización, la célula pluripotente está libre de polinucleótidos exógenos.
[0133] En otra realización, el uno o más polinucleótidos se escinden mediante escisión mediada por CRE.
[0134] En algunas realizaciones, el método comprende además introducir en la célula no pluripotente (i) un polinucleótido que codifica un polipéptido SV40LT, o (ii) un polipéptido SV40LT.
[0135] En una realización, el método comprende poner en contacto la célula no pluripotente con al menos uno de un inhibidor de TGFpR, un agonista de la ruta de Wnt, un inhibidor de MEK y un inhibidor de ROCK, donde el agonista de la ruta de Wnt es opcionalmente un inhibidor de GSK3.
[0136] En otra realización, la célula no pluripotente se pone en contacto con un inhibidor de TGFpR, un agonista de la ruta de Wnt, un inhibidor de MEK y un inhibidor de ROCK, donde el agonista de la ruta de Wnt es opcionalmente un inhibidor de GSK3.
[0137] En una determinada realización, el método comprende además cultivar la célula pluripotente en un medio de cultivo que comprende un agonista de la ruta de Wnt, un inhibidor de MEK y un inhibidor de ROCK, en donde el agonista de la ruta de Wnt es opcionalmente un inhibidor de GSK3, y donde el medio de cultivo no contiene inhibidor de TGFpR. En algunas realizaciones, el inhibidor de Rock es tiazovivina o Y27632, el inhibidor de TGFpR es A-83-01 o SB431542, el inhibidor de GSK3 es CHIR99021 o BIO, o el inhibidor de MEK es PD98059 o PD032901.
[0138] En otra realización, la pluripotencia de la célula pluripotente se mantiene durante al menos 5 divisiones celulares o al menos 10 divisiones celulares.
[0139] En una determinada realización, el uno o más polinucleótidos se introducen como un vector policistrónico que comprende una pluralidad de polinucleótidos que están separados por al menos un péptido 2A.
[0140] En una realización, el vector policistrónico comprende una pluralidad de polinucleótidos que codifican un polipéptido de OCT4.
[0141] En algunas realizaciones, el método comprende identificar la célula pluripotente seleccionando la expresión de OCT4 en la célula pluripotente.
[0142] En una realización, seleccionar la expresión de OCT4 comprende seleccionar la expresión ectópica de Oct-4.
[0143] En otra realización, el cultivo produce una población de células madre pluripotentes.
[0144] En otra realización, la población de células madre pluripotentes es al menos 70 % homogénea, al menos 80 % homogénea o al menos 90 % homogénea.
[0145] En otra realización más, al menos 70 %, al menos 80 % o al menos 90 % de la población de células pluripotentes expresa SSEA y T ra-181.
[0146] En una realización, la célula pluripotente o población de células pluripotentes son capaces de realizar pasajes de células individuales.
[0147] En una realización, las células producidas por pasajes de células individuales tienen un cariotipo normal.
[0148] En una realización, la invención proporciona una célula pluripotente producida según el método de uno cualquiera de los métodos anteriores.
[0149] En otra realización, la invención proporciona una composición que comprende una célula no pluripotente aislada que comprende (i) uno o más polinucleótidos exógenos que codifican al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de ESRRB, o (ii) al menos un polipéptido exógeno seleccionado de un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de ESRRB.
[0150] En una realización, la célula comprende (i) uno o más polinucleótidos exógenos que codifican al menos dos de un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de ESRRB, o (ii) al menos dos polipéptidos exógenos seleccionados de un polipéptido de OCT4, un polipéptido de<ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de>E<s>R<r>B.
[0151] En otra realización, la célula comprende (i) uno o más polinucleótidos exógenos que codifican al menos tres de un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de ESRRB, o (ii) al menos tres polipéptidos exógenos seleccionados de un polipéptido de OCT4, un polipéptido de<ECAT 1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de>E<s>R<r>B.
[0152] En una determinada realización, la célula comprende (i) uno o más polinucleótidos exógenos que codifican un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de ESRRB, o (ii) un polipéptido de OCT4 exógeno, un polipéptido de ECAT1 exógeno, un polipéptido de UTF1 exógeno, un polipéptido de NANOG exógeno y un polipéptido de ESRRB exógeno.
[0153] En otra realización, la célula comprende uno o más polinucleótidos exógenos que codifican un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1 y un polipéptido de UTF1, o un polipéptido de OCT4 exógeno, un polipéptido de ECAT1 exógeno y un polipéptido de UTF1 exógeno.
[0154] En una realización, la célula se ha puesto en contacto con al menos uno de un inhibidor de TGFpR, un inhibidor de GSK3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de ROCK.
[0155] En otra realización, la célula se ha puesto en contacto con un inhibidor de TGFpR, un activador de la ruta de Wnt, un inhibidor de MEK y un inhibidor de ROCK, en donde el activador de la ruta de Wnt es opcionalmente un inhibidor de GSK3.
[0156] En una determinada realización, el inhibidor de Rock es tiazovivina o Y27632, el inhibidor de TGFpR es A-83-01 o SB431542, el inhibidor de GSK3 es CHIR99021 o BIO, o el inhibidor de MEK es PD98059 o PD032901.
[0157] En otra realización, el uno o más polinucleótidos exógenos se introducen en la célula no pluripotente mediante un retrovirus, virus Sendai, un adenovirus, un episoma, un minicírculo, un sistema de vector con casete de expresión o ARNm.
[0158] En otra realización, el retrovirus es un lentivirus.
[0159] En una determinada realización, la célula está libre de polinucleótidos exógenos.
[0160] En una realización, el uno o más polinucleótidos exógenos se eliminan mediante escisión mediada por CRE.
[0161] En otra realización, la célula comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de antígeno SV40LT o un polipéptido de antígeno SV40LT exógeno.
[0162] En una realización, el uno o más polinucleótidos exógenos se introducen como un vector policistrónico que comprende una pluralidad de polinucleótidos que están separados por al menos un péptido 2A.
[0163] En otra realización, el vector policistrónico comprende una pluralidad de polinucleótidos que codifican un polipéptido de OCT4.
[0164] En una realización, el polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de OCT4 está unido a un marcador seleccionable.
[0165] En una realización particular, la invención proporciona una composición que consiste en al menos uno de, al menos dos de, o al menos tres de (i) un ADNc que codifica un polipéptido de OCT4, (ii) un ADNc que codifica un polipéptido de ECAT1, (iii) un ADNc que codifica un polipéptido de UTF1, (iv) un ADNc que codifica un polipéptido de NANOG, y (v) un ADNc que codifica un polipéptido de ESRRB.
[0166] En una realización, la composición consiste en un ADNc que codifica un polipéptido de OCT4, un ADNc que codifica un polipéptido de ECAT1, un ADNc que codifica un polipéptido de UTF1, un ADNc que codifica un polipéptido de NANOG y un ADNc que codifica un polipéptido de ESRRB.
[0167] En otra realización, la composición consiste en un ADNc que codifica un polipéptido de OCT4, un ADNc que codifica un polipéptido de ECAT1 y un ADNc que codifica un polipéptido de UTF1.
[0168] En una determinada realización, cada ADNc se codifica en un retrovirus, el virus Sendai, un adenovirus, un episoma, un minicírculo, un sistema de vector con casete de expresión o ARNm.
[0169] En una realización, la invención proporciona un vector que comprende uno o más polinucleótidos que codifican al menos un polipéptido de factor de reprogramación seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de ESRRB.
[0170] En una realización, el uno o más polinucleótidos codifican un polipéptido de OCT, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de ESRRB.
[0171] En otra realización, el uno o más polinucleótidos codifican un polipéptido de OCT, un polipéptido de ECAT1 y un polipéptido de UTF1.
[0172] En otra realización particular, el vector comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido de antígeno SV40LT.
[0173] En una realización, el vector es un retrovirus, virus Sendai, un adenovirus, un episoma, minicírculo, sistema de vector con casete de expresión o ARNm.
[0174] En una realización, el retrovirus es un lentivirus.
[0175] En una realización particular, la invención proporciona un kit para reprogramar una célula no pluripotente en una célula pluripotente, comprendiendo el kit: uno o más polinucleótidos que codifican al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG o un polipéptido de ESRRB; o al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG o un polipéptido de ESRRB; y al menos uno de un inhibidor de TGFpR, un activador de la ruta de Wnt, un inhibidor de MEK y un inhibidor de ROCK, donde el activador de la ruta de Wnt es opcionalmente un inhibidor de GSK3.
[0176] En una realización, el uno o más polinucleótidos codifican un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de ESRRB, o el al menos un polipéptido comprende un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1, un polipéptido de UTF1, un polipéptido de NANOG y un polipéptido de ESRRB.
[0178] En otra realización, el uno o más polinucleótidos codifican un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1 y un polipéptido de UTF1, o el al menos un polipéptido comprende un polipéptido de OCT4, un polipéptido de ECAT1 y un polipéptido de UTF1.
[0180] En una realización, el kit comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de antígeno SV40LT o un polipéptido de antígeno SV40LT.
[0182] En otra realización, el kit comprende un inhibidor de TGFpR, un activador de la ruta de Wnt, un inhibidor de MEK y un inhibidor de ROCK, donde el activador de la ruta de Wnt es opcionalmente un inhibidor de GSK3.
[0184] En una realización, el inhibidor de Rock es tiazovivina o Y27632, el inhibidor de TGFpR es A-83-01 o SB431542, el inhibidor de GSK3 es CHIR99021 o BIO, o el inhibidor de MEK es PD98059 o PD032901.
[0186] En otra realización, el al menos un polinucleótido está codificado en un retrovirus, virus Sendai, un adenovirus, un episoma, un minicírculo, un sistema de vector con casete de expresión o ARNm.
[0188] En otra realización, el retrovirus es un lentivirus.
[0190] En una realización, el al menos un polinucleótido está codificado en un vector policistrónico estando cada polinucleótido separado por un péptido 2A.
[0192] En otra realización más, el vector policistrónico comprende dos o más polinucleótidos que codifican un polipéptido de OCT4.
[0194] En una determinada realización, el al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de OCT4 está unido a un marcador seleccionable.
[0196] En otra realización particular, la invención proporciona un método para producir una población de células madre pluripotentes que comprende: proporcionar una población de células no pluripotentes; introducir en la población de células no pluripotentes un polinucleótido que codifica un polipéptido OCT4 que está unido a un marcador seleccionable; incubar la población de células no pluripotentes con el polinucleótido bajo condiciones suficientes para reprogramar al menos una porción de la población de células no pluripotentes en células pluripotentes; seleccionar células que expresan el marcador seleccionable proporcionando de este modo una población de células madre pluripotentes.
[0198] En otra realización, el polinucleótido se introduce como un vector policistrónico que comprende una pluralidad de polinucleótidos que codifican un polipéptido de OCT4.
[0200] En una realización, la pluralidad de polinucleótidos está separada por al menos un péptido 2A.
[0202] En otra realización, al menos el 10 % de las células de la población de células expresan SSEA y TRA-181.
[0204] Breve descripción de las diferentes vistas de los dibujos
[0206] LasFiguras 1A-1Emuestran los resultados de una plataforma de cultivo de múltiples etapas para mejorar la reprogramación y el mantenimiento de hiPSC. (1A) El clon FTi088 de hiPSC generado por lentivirus mantuvo una población homogénea de células indiferenciadas en SMC4, mientras que se observó diferenciación espontánea en la línea FTi096 de hiPSC generada por lentivirus cultivada en SMC4. La diferenciación espontánea se minimizó cuando FTi096 se trasfirió a FMM durante 3 pasajes, como se muestra por la morfología (paneles superiores) y la citometría de flujo para SSEA4 y TRA1-81 (paneles inferiores). (1B) qRT-PCR para la expresión transgénica del elemento viral WPRE. La expresión se normalizó con respecto a GAPDH y en relación con la expresión de WPRE de la línea de fibroblastos parental cuatro días después de la infección lentiviral (Día 4 P.I.). La línea de fibroblastos no infectados (fibroblastos) y la línea ESC humana HUES9 se utilizaron como controles negativos. El valor de cada conjunto se indica encima de la barra. (1C) Cribado del efecto de varios componentes del medio en la población de SSEA4 y TRA1 -81 de hiPSC inducida por lentivirus sin transgén tras 10 pasajes; eliminación de SB431542 (-TGFpRi), aumento de 10 a 100 ng/mL de bFGF, adición de 10 ng/mL de LIF. (1D) La línea celular de fibroblastos se transfectó con la construcción lentiviral que contenía el conjunto de genes OCT4/Klf4/SOX2 y se dividió en varios medios (medio convencional; Conv.), cultivado durante 17 días y clasificado para la población doble positiva SSEA4 y TRA1-81 en el día 17. La puerta de clasificación está resaltada en azul. Cada conjunto se cultivó durante 10 días adicionales en los medios respectivos, excepto para el conjunto SMC4 que se dividió en FMM y SMC4. En el día 27, los cultivos se reclasificaron para la población doble positiva para SSEA4 y TRA1 -81, se sembraron a una densidad normalizada de eventos clasificados y se mantuvieron en los medios respectivos durante 9 días adicionales. La selección del conjunto de cultivos convencionales se expandió para lograr un número normalizado de células. El día 36, cada cultivo se tiñó para determinar la expresión de OCT4 y NANOG. Imágenes inmunocitoquímicas representativas mostradas en el panel derecho para cada conjunto. (1E) Recuentos de colonias de tinción del día 36 como se explica en (1D). Las barras de error representan triplicados para FRM a FMM y FRM y duplicados para FMM y hESC.
[0208] LasFiguras 2A-2Emuestran que las hiPSC reprogramadas episomales individuales se seleccionan de manera eficiente y se siembran en placas de 96 pocillos para la expansión clonal. (2A) Ilustración esquemática de la sincronización de la inducción episomal, la plataforma de cultivo de múltiples etapas, la clasificación por citometría de flujo y la expansión clonal. (2B) Perfil de citometría de flujo de reprogramación inducida episomal mantenido en la transición de FRM a FMM en cultivo de FF (descrito en 2A) en los días indicados después de la transfección. La estrategia de clasificación utilizada para cada línea parental (población SSEA4+/TRA1-81+/CD30+) se ilustra en colores respectivos, correspondientes al panel de histograma inferior que representa el porcentaje de pocillos de la placa de 96 pocillos que contiene clones de hiPSC individuales. Los pocillos que contenían múltiples clones o clones diferenciados no se puntuaron. La línea continua representa el porcentaje medio entre todas las derivaciones con líneas de puntos que representan la desviación estándar. (2C) Perfil de flujo de FTC007 inducido para reprogramar 19 días después de la transfección mantenido en medio convencional en presencia de células MEF. La población inducida se tomó de la misma población de FTC007 en (2B), sin embargo, se trató en diferentes cultivos a partir de entonces. (2D) Análisis inmunocitoquímico de diversos marcadores de pluripotencia de colonias clasificadas en placa de 96 pocillos. Los paneles de la esquina derecha representan la tinción DAPI. (2E) qRT-PCR para la expresión de NANOG para cada pocillo de una placa de 96 pocillos de clasificación directa SSEA4/TRA1-81/CD30 (FACS) a 3 células por pocillo. El rango de expresión está entre cero y cuatro veces la expresión relativa a las ESC humanas H1 como se describe en la leyenda y se normaliza a GAPDH.
[0210] LasFiguras 3A-3Fmuestran que los clones de hiPSC reprogramados episomales mantienen su estado indiferenciado y están libres de secuencia transgénica. (3A) Morfología típica de clones de hiPSC 24 horas después del pasaje de células individuales. (3B) Imágenes representativas del clon de hiPSC durante el cultivo. (3C) Análisis de PCR para ADN episomal derivado de varios clones de hiPSC. Carril 1, FTC007-c1 p4; Carril 2, FTC007-c21 p4; Carril 3, FTC016-c25 p5; Carril 4, FTC016-c36 p5; Carril 5, FTC017-c11 p7; Carril 6, FTC017-c14 p7; Carril 7, FTC017-c17 p6 (una línea que mantiene construcciones episomales usó un control positivo); Carril 8, FTC007 no transfectado; Carril 9, hiPSC generado utilizando construcciones lentivirales (para servir como control contra la contaminación cruzada); Carril 10, vector episomal utilizado como control positivo. Se utilizó la entrada de 100 ng de ADN genómico y 35 ciclos de PCR para todos los conjuntos. (3D) Marcadores de pluripotencia detectados por inmunofluorescencia para la<expresión de OCT4,>NA<n>O<g>, T<r>A1<-81 y TRA160. (3E) Perfil de citometría de flujo para clones de hiPSC>seleccionados a partir de diversas líneas parentales. Expresión superficial de perfiles SSEA4/TRA1-81 en la fila superior. Expresión intracelular de perfiles OCT4/NANOG en la fila inferior. (3F) Análisis de qRT-PCR para la expresión génica pluripotente endógena. Los datos se normalizaron a GAPDH y en relación con las hESC HUES9. En el caso de la expresión KLF4, dos puntos de datos excedieron 15 veces más que HUES9 y se observaron en el gráfico. Las barras de error representan la desviación estándar de las réplicas.
[0212] LasFiguras 4A-4Emuestran que la estabilidad genómica y la pluripotencia se mantienen durante el cultivo continuo de células individuales y FF. (4A) Análisis citogenético en 20 a 40 células en metafase con banda G de varios clones de hiPSC mantenidos en FF y cultivo de células individuales. (4B) Perfil de citometría de flujo y análisis citogenético de clones de hiPSC pasados a largo plazo (p25-30) en FF y cultivo de células individuales. (4C) Diferenciación dirigida de tres a cuatro días de FTC017-c11. (4D) Formación de cuerpos embrioides y diferenciación de clones de hiPSC que demuestran diferenciación de trilinaje. Inmunocitoquímica realizada 28 días después de la diferenciación: Ectodermo, TUJ1; Mesodermo, alfa actina del músculo liso (aSMA); Endodermo, AFP. (4E) Secciones histológicas de teratoma derivadas de FTC007-c21 y FTC016-c25 que representan cada linaje somático. Flechas negras, endodermo; flechas blancas, ectodermo; flechas grises, mesodermo.
[0214] LasFiguras 5A-5Jmuestran la derivación de clones de hiPSC con un número mínimo de factores de reprogramación. (5A) OCT4, SOX2 y NANOG se clonaron en pCEP4 en diversos formatos. La tabla representa los sistemas y abreviaturas de vectores. (5B) Perfil de citometría de flujo de SSEA4 y TRA1-81 de la cinética de reprogramación inducida por diversas combinaciones de genes el día 13 después de la inducción. (5C) Histograma de eficiencia que representa la presencia de clones de hiPSC positivos para TRA1 -81 en pocillos de placa de 96 pocillos a 3 y 9 células por pocillo. (5D) Análisis de PCR para ADN episomal derivado de varios clones de hiPSC. Carril 12xO+OS+ONS+T-c7 p6; Carril 2, 2xO+OS+ ONS T-c10 p6; Carril 3, 2xO+ONS+T-c5 p5; Carril 4, 2xO+ONS+T-c9 p5; Carril 5, 2xO+OS+T-c7 p7; Carril 6, 2xO+OS+T-c9 p6; Carril 7, FTC007 no transfectado; Carril 8, hiPSC generada utilizando construcciones lentivirales; Carril 9, vector episomal utilizado como control positivo. Se utilizó la entrada de 100 ng de ADN genómico y 35 ciclos de PCR para todos los conjuntos. (5E) Morfología del clon 9 derivado de 2xO+OS+T. (5F) Marcadores de pluripotencia detectados por inmunofluorescencia para la expresión de OCT4, NANOG, TRA1-81 y TRA160. Imágenes tomadas con un aumento de 10x. (5G) Perfil de flujo de clones de hiPSC derivados de conjuntos de genes seleccionados. Expresión superficial de perfiles SSEA4/TRA1-81 en la fila superior. Expresión intracelular de perfiles OCT4/NANOG en la fila inferior. (5H) Diferenciación dirigida de clones de hiPSC seleccionados aproximadamente 72 a 96 h después de la inducción. (5I) Análisis citogenético de células en metafase de banda G de varios clones de hiPSC mantenidos en FF y cultivo de células individuales. (5J) Secciones histológicas de teratoma derivadas del clon de hiPSC 2xO+OS+ONS+T-c10. Panel izquierdo, endodermo; panel central, mesodermo; panel derecho, ectodermo.
[0215] LasFiguras 6A-6Bmuestran el perfil de expresión génica relativa de hiPSC inducidas por episomas de factor mínimo en FMM. Los resultados del mapa de calor se derivaron de una matriz dinámica Fluidigm que representa los niveles relativos de expresión génica (RQ) de los genes de pluripotencia (6A) y diferenciación (6B) de las líneas hiPSC mantenidas convencionalmente, las hESC H1 mantenidas convencionalmente y las líneas hiPSC episomales derivadas utilizando varias combinaciones de genes mantenidas en FMM. La expresión génica relativa para cada línea se anota dentro de cada recuadro y se codifica por colores en función de tres niveles de expresión resumidos en la leyenda (abajo a la derecha). Todos los conjuntos se realizaron por duplicado, normalizados a la expresión media de dos genes constitutivos (GAPDH y HPRT1) y referenciados al nivel de expresión medio de seis líneas convencionales de control (OSK hiPSC y H1 hESC en Me F) que representan el valor 1x.
[0217] LasFiguras7A-7G muestran que las hiPSC mantenidas por FMM tienen una expresión reducida de genes diferenciados y representan el estado fundamental. (7A) Un total de 339 conjuntos de sondas se expresaron diferencialmente entre el cultivo convencional y FMM en más o menos de 2,5 veces. Agrupamiento jerárquico en los 339 conjuntos de sondas utilizando un método de ligamiento completo basado en mediciones de distancia euclidiana. (7B) El análisis de enriquecimiento de procesos biológicos de ontología génica (D.A.V.I.D.) de los 213 conjuntos de sondas dio lugar a una suprarregulación de 2,5 veces o más con cultivo convencional (en comparación con el cultivo FMM). (7C) Listas de genes representativas de estados de pluripotencia fundamental o metaestables. Lista derivada de las referencias anotadas en el texto. 7(D) Agrupamiento jerárquico en los 231 conjuntos de sondas correspondientes a los genes en (7C) utilizando un método de ligamiento completo basado en mediciones de distancia euclidiana. (7E) Intensidades de RMA (log2) para los conjuntos de sondas correspondientes a los genes en (7C). El panel izquierdo representa 39 conjuntos de sondas para el estado fundamental, el panel derecho representa 188 conjuntos de sondas para el estado metaestable. Los niveles medios de intensidad de cultivo convencional se representan en el eje X mientras que la intensidad promedi de FMM/SMC4 está en el eje Y, la línea negra indica la misma expresión. (7F) Comparación de la expresión génica de genes localizados en el cromosoma X entre el clon de hiPSC derivado y cultivado en cultivo en medio convencional y su homólogo adaptado al cultivo de SMC4 utilizando conjuntos de sondas Affymetrix. Se destacan los conjuntos de sondas asociados con la expresión del gen XIST. (7G) Imágenes representativas de HEK27me3 en clon de hiPSC mantenido en FMM o adaptado a cultivo convencional durante 5 pasajes. La flecha punteada en el panel izquierdo apunta a un núcleo representativo ausente de tinción con H3K27me3, mientras que la flecha continua en el panel derecho apunta a un núcleo positivo para la tinción con H3K27me3. Los porcentajes de tinción positiva del núcleo se indican en la parte inferior izquierda de cada panel. Las células cultivadas de FMM tienen unos núcleos más grandes. Barra de escala = 50 pm.
[0219] LasFiguras 8A-8Dmuestran la reprogramación episomal inducida con FRM y FMM. (8A) Perfil de flujo SSEA4 y TRA1 -81 en día 10 del grupo de reprogramación. (8B) Morfología representativa de la colonia típica observada durante la reprogramación. Imagen tomada el día 13 después de la transfección. (8C) Las células de fibroblastos reprogramados episomales mantenidos en FRM durante los primeros 14 días se dividieron y se mantuvieron en FRM o se cambiaron a FMM. Los cultivos de reprogramación se clasificaron después para SSEA4/TRA1-81/CD30 el día 21 después de la transfección y se mantuvieron en FRM o FMM durante 10 días adicionales antes del análisis. (8D) Morfología y perfil de flujo de cultivos representativos en FRM o FMM. La flecha blanca apunta a regiones de células diferenciadas en un cultivo que consiste en una mezcla de población indiferenciada y diferenciada. La flecha negra apunta a los bordes afilados de una población en su mayoría indiferenciada. Los paneles inferiores son perfiles de flujo representativos. FSC; Dispersión lateral directa.
[0221] LasFiguras 9A-9Bmuestran la reprogramación de varias líneas parentales. (9A) Tabla resumen de las líneas celulares de partida utilizadas en este estudio. Además de la información específica relacionada con cada línea, se observa el porcentaje de población SSEA4/TRA1-81/CD30 positiva en el momento de la clasificación posterior a la transfección episomal. (9B) Ilustración que representa el tipo y cultivo de células sanguíneas del cordón umbilical enriquecidas con CD34. Se utilizó un volumen de 0,5 ml de sangre del cordón umbilical previamente mantenido en un banco para extraer 65.000 células CD34+CD45+Lin- que se cultivaron en suspensión durante 6 días antes de la transfección episomal.
[0223] LasFiguras 10A-10Gmuestran la caracterización de las hiPSC durante el proceso de reprogramación y mantenimiento. (10A) Morfología típica de colonias tres días después de la clasificación en placas de 96 pocillos de una sola célula. La barra de escala representa 400 pm. (10B) Morfología representativa de una colonia de tipo hiPSC derivada de una sola célula 7-9 días después de la clasificación de varias células de partida. La barra de escala representa 1000 pm. (10C) Inmunocitoquímica para la expresión de NANOG de colonias de tipo hiPSC en placas de 96 pocillos. (10D) El análisis del perfil de flujo del día 16 de FTC007 indujo la reprogramación y se mantuvo en placas de cultivo recubiertas con Matrigel o vitronectina. (10E) Imagen de campo brillante, (10F) inmunofluorescencia para OCT4 y NANOG o (10G) análisis de citometría de flujo para SSEA4 y TRA1-81 de FTC016-c28 mantenido en FMM de forma continua en Matrigel o durante 5 pasajes de vitronectina.
[0225] LasFiguras 11A-11Cmuestran ejemplos de reprogramación génica mínima con la plataforma de cultivo FMM. (11A) Morfología de las células tratadas con higromicina desde el día 2 hasta el 5 después de la transfección con la construcción episomal que contiene el casete de selección de higromicina. (11B) Los grupos de reprogramación se mantuvieron durante más tiempo y se perfilaron el día 16 después de la transfección. (11C) Aparición de cultivo mantenido en Matrigel o vitronectina.
[0227] LasFiguras 12A-12Emuestran las características de las hiPSC cultivadas en múltiples condiciones. (12A) El FTi111 derivado de lentivirus y mantenido por SMC4 mostró las características de pluripotencia y mantuvo la integridad genómica. (12B) Representación de la estrategia de descongelación de FTi111 p43. Un solo vial se descongeló en cuatro entornos de cultivo como se indica. Los cultivos supervivientes se pasaron en el cultivo respectivo con la excepción del cultivo convencional complementado con tiazovivina en células alimentadoras, que se trasfirió al cultivo convencional sin tiazovivina en presencia de células alimentadoras y se pasaron como grupo. (12C) Morfología de células en recuperación en varios cultivos después de la descongelación. No se identificaron células supervivientes en el cultivo convencional sin tiazovivina en presencia de células alimentadoras. (12D) Morfología de conjuntos de cultivos en el pasaje 3 después de la descongelación. La morfología de colonia más grande se asoció con el cultivo convencional. Barra de escala de 1000 pm. (12E) Análisis de qRT-PCR para la expresión génica pluripotente endógena de cada conjunto de cultivos. Los datos se normalizaron a GAPDH y en relación con las hESC H1.
[0229] LasFiguras 13A-13Emuestran la ontología génica de los perfiles de expresión génica de hiPSC cultivadas en diversas condiciones. (13A) Tabla que describe la derivación y el mantenimiento de cada línea descrita en los estudios de expresión génica global. (13B) Un total de 300 conjuntos de sondas se expresaron diferencialmente entre las condiciones de cultivo convencional y de molécula pequeña (FMM y SMC4) en más o menos de 2,5 veces. Agrupamiento jerárquico en los 300 conjuntos de sondas utilizando un método de ligamiento completo basado en mediciones de distancia euclidiana. (13C) El análisis de enriquecimiento de procesos biológicos de ontología génica (D.A.V.I.D.) de los 133 conjuntos de sondas dio lugar a una suprarregulación de 2,5 veces o más con cultivo convencional (en comparación con el cultivo de moléculas pequeñas). (13D) El análisis de enriquecimiento de procesos biológicos de ontología génica (D.A.V.I.D.) de los 167 conjuntos de sondas dio lugar a una suprarregulación de 2,5 veces o más con cultivo de moléculas pequeñas (en comparación con el cultivo convencional). (13E) El análisis de enriquecimiento del proceso biológico de ontología génica de los 126 conjuntos de sondas dio lugar a una suprarregulación de 2,5 veces o más con cultivo FMM (en comparación con el cultivo convencional).
[0231] LasFiguras 14A-14Fmuestran mapas de clonación que ilustran ejemplos de las construcciones lentivirales (14A-14B) y construcciones episomales (14C-14F) utilizadas para la reprogramación. Las construcciones lentivirales incluyen un promotor EF1a y un sitio LOXP para la escisión de transgenes mediada por CRE. Las construcciones episomales también incluyen un promotor EF1a.
[0233] LasFiguras 15A-15Cmuestran el análisis de flujo representativo para varias combinaciones de factores de reprogramación en los días 8-15. Se indujeron células de fibroblastos humanos con varias combinaciones de factores de reprogramación mediados por lentivirus, incluidos OCT4, ECAT1 y UTF1.
[0235] LasFiguras 16A-16Dmuestran el análisis de flujo representativo y las características morfológicas de iPSC para varias combinaciones de factores de reprogramación en los días 21-27. Los datos muestran que se pueden utilizar combinaciones de reprogramación únicas para derivar SSEA4+/TRA181+ hiPSC.
[0237] LasFiguras 17A-17Bmuestran una eficiencia de reprogramación lentiviral altamente mejorada como se ilustra mediante análisis de flujo (poblaciones SSEA4+/TRA181+ y CD30+) y características morfológicas de iPSC. Las células de fibroblastos humanos se reprogramaron con OCT4, ECAT1, UTF1, ESRRB y NANOG. Las células se reprogramaron utilizando FRM y se mantuvieron en FMM.
[0239] LasFiguras 18A-18Dmuestran análisis de flujo representativo e imágenes de fase de cuatro clones de iPSC establecidos después de 7-9 pasajes después de la clasificación de 96 pocillos. Los clones se generaron con factores de reprogramación lentiviral (OCT4, ECAT1, UTF1, ESRRB y NANOG) con FRM y se mantuvieron en FMM. Las poblaciones que expresan alta SSEA4+/TRA181 indican pluripotencia.
[0241] LasFiguras 19A-19Bmuestran un análisis de flujo representativo para la expresión de OCT4 y NANOG en células de fibroblastos humanos reprogramados con factores de reprogramación lentiviral OCT4, ECAT1, UTF1, NANOG y ESRRB. Los clones se reprogramaron utilizando FRM y se mantuvieron en FMM. Las poblaciones que expresan OCT4+/NANOG+ alto indican pluripotencia.
[0243] LasFiguras 20A-20Cmuestran el análisis de cariotipo de clones de hIPSC derivados de células de fibroblastos humanos reprogramados con factores de reprogramación lentiviral OCT4, ECAT1, UTF1, NANOG y ESRRB. Los clones se reprogramaron utilizando FRM y se mantuvieron en FMM. Los clones muestran un cariotipo masculino normal.
[0245] LaFigura 21muestra la eficiencia de clasificación de placas de 96 pocillos de la combinación de factores de reprogramación OCT4/ESRRB/NANOG/ECAT1/UTF1 en comparación con la combinación de factores de reprogramación OCT4/NANOG/SOX2/T GRANDE.
[0246] LasFiguras 22A-22Bmuestran imágenes de colonias durante la expansión de 96 pocilios para células reprogramadas con (22A) OCT4-P2A-OCT4 /NANOG-P2A-ESRRB-T2A-LIN28/ECAT1-T2A-UTF1 a los 4, 6 y 11 días, y (22B) OCT4-P2A-ESRRB/OCT4-P2A-NANOG/ ECAT1 T2A-UTF1 para dos pocillos a los 7 días y un pocillo a los 10 días.
[0248] LasFiguras 23A-23Cmuestran (23A) un resumen de los resultados del análisis de flujo que demuestra el efecto de la estequiometría del factor de reprogramación y el uso de un marcador genético para la selección de células con expresión ectópica de OCT4, (23B) análisis de flujo para fibroblastos humanos reprogramados con antígeno T grande SV40/OCT4-P2A-NANOG-T2A-SOX2 episomal sin selección de OCT4, y (23C) análisis de flujo para fibroblastos humanos reprogramados con antígeno T grande SV40/OCT4-P2A-NANOG-T2A-SOX2 episomal/ OCT2-P2A-OCT4-puromicina.
[0250] LaFigura 24muestra el análisis inmunofluorescente de clones de iPSC derivados teñidos para marcadores de pluripotencia OCT4 (verde) y TRA181 (rojo) con DAPI en azul.
[0252] LaFigura 25muestra imágenes de clones clasificados en placas de 96 pocillos SSEA4+/TRA181 /CD30+ después de la escisión mediada por CRE. Las colonias se clasificaron a partir de un clon de iPSC derivado originalmente de células de fibroblastos humanos, se reprogramaron con los factores lentivirales OCT4, ECAT1, UTF1, NANOG y ESRRB, y a continuación se escindieron para detectar transgenes. Las colonias clasificadas muestran un fenotipo de iPSC.
[0254] Descripción detallada
[0256] A. Visión general
[0258] Los métodos existentes para la producción y el mantenimiento de células pluripotentes aún no han realizado cultivos homogéneos de células pluripotentes libres de huella, libres de diferenciación espontánea y susceptibles de pasaje de células individuales de alta resolución/alta clonalidad y expansión a gran escala. Las células pluripotentes del estado fundamental pueden conferir cualidades y características que superen estos desafíos. Sin embargo, hasta la fecha, no existen métodos confiables o robustos para la generación de alto rendimiento de células pluripotentes en estado fundamental en condiciones sin alimentador. Por lo tanto, los métodos existentes pueden no ser adecuados para la producción de células pluripotentes de grado industrial o clínico. La invención contemplada en la presente memoria aborda la necesidad de la generación robusta de células pluripotentes estables en o con características de pluripotencia en estado fundamental y resuelve problemas en la fabricación de células pluripotentes estables adecuadas para uso industrial y clínico.
[0260] En general, la invención se refiere a composiciones y métodos para la fabricación mejorada de células pluripotentes, particularmente células con diferenciación espontánea reducida, incluidas células pluripotentes en estado fundamental. Más particularmente, la invención se refiere a una plataforma de cultivo de múltiples etapas que utiliza moduladores de moléculas pequeñas de las vías de transducción de señales celulares, de una manera específica de la etapa y permite la derivación y el mantenimiento de células pluripotentes hasta el punto en que los métodos de cultivo y los métodos para derivar células pluripotentes ya no son una fuente de variabilidad y/o actividad de activación para el uso posterior. Además, la plataforma de cultivo contemplada en la presente memoria permite la derivación y el mantenimiento de células pluripotentes en condiciones libres de alimentador, con estabilidad genómica mejorada, estado indiferenciado mejorado, diferenciación espontánea reducida, homogeneidad de cultivo mejorada, supervivencia mejorada en el cultivo, disociación y pasaje de células pluripotentes individuales, y métodos mejorados de células de reprogramación libres de transgén o huella a pluripotencia en estado fundamental. Por lo tanto, las composiciones y métodos contemplados en la presente memoria permiten la fabricación de células pluripotentes que son apropiadas para uso industrial y clínico y/o células pluripotentes en estado fundamental.
[0262] Hasta la fecha, ninguna plataforma impulsada por moléculas pequeñas ha demostrado la capacidad de mejorar la reprogramación y apoyar el cultivo de células individuales y FF de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) libres de huella derivadas de células humanas (Nichols y Smith, 2012). Las plataformas de cultivo contempladas en la presente memoria proporcionan, en parte, la aplicación de combinaciones específicas de inhibidores de moléculas pequeñas de una manera específica de la etapa para permitir una reprogramación rápida y robusta y un cultivo estable a largo plazo de células madre pluripotentes. En diversas realizaciones, se proporciona una plataforma de cultivo para inducir o mantener un estado pluripotente indiferenciado mejorado, incluida la pluripotencia del estado fundamental. La plataforma contemplada en la presente memoria también proporciona un sistema de cultivo robusto para la producción y el mantenimiento de la pluripotencia del estado fundamental en iPSC humanas (hiPSC). En una realización, las plataformas de cultivo permiten un método de reprogramación libre de transgén o huella. En realizaciones particulares, la plataforma contemplada en la presente memoria representa un método mejorado para la fabricación de hiPSC que supera los desafíos clave en la derivación múltiple y el mantenimiento de hiPSC sin transgén.
[0263] La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, química orgánica, biología molecular, microbiología, técnicas de ADN recombinante, genética, inmunología, biología celular, protocolos de células madre, cultivo celular y biología transgénica que están dentro de la experiencia de la técnica, muchos de los cuales se describen a continuación con fines ilustrativos. Tales técnicas se explican completamente en la literatura.Véase, p. ej.,Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición, 2001); Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, 1989); Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, actualizado en julio de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methodsfrom Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Asociados y Wiley-Interscience; Globe, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I&II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, Nueva York, 1992); Guthrie y Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, Nueva York, 1991); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell<Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Fire y col.,>R<n>A<Interference>Technology: From Basic Science to Drug Development (Cambridge University Press, Cambridge, 2005); Schepers, RNA Interference in Practice (Wiley-VCH, 2005); Engelke, RNA Interference (RNAi): The Nuts & Bolts of siRNA Technology (DNA Press, 2003); Gott, RNA Interference, Editing, and Modification: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology; Human Press, Totowa, NJ, 2004); Sohail, Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC, 2004); Clarke and Sanseau, microRNA: Biology, Function & Expression (Nuts & Bolts series; DNA Press, 2006); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir and C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6a edición, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, ed., 2002); Embryonic Stem Cell Protocols: Volumen I: Isolation and Characterization (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, ed., 2006); Embryonic Stem Cell Protocols: Volumen II: Differentiation Models (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, ed., 2006); Human Embryonic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kursad Turksen ed., 2006); Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney, and Bruce A. Bunnell eds., 2008); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Medicine) (Christopher A. Klug, y Craig T. Jordan eds., 2001); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kevin D. Bunting ed., 2008) Neural Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Leslie P. Weiner ed., 2008); Hogan y col., Methods of Manipulating the Mouse Embryo (2a edición, 1994); Nagy y col., Methods of Manipulating the Mouse Embryo (3a edición, 2002), y The Zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 4a ed., (Univ. of Oregon Press, Eugene, OR, 2000).
[0265] B. Definiciones
[0267] Salvo que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Para los fines de la presente invención, se definen a continuación los siguientes términos.
[0269] Los artículos “ un” , “ una” y “el” se utilizan en la presente memoria para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.
[0271] Debe entenderse que el uso de la alternativa (p. ej., “o” ) significa una, ambas o cualquier combinación de las alternativas.
[0273] El término “y/o” debe entenderse con el significado de una o ambas alternativas.
[0275] Como se utiliza en la presente memoria, el término “alrededor de” o “ aproximadamente” se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía hasta en un 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % en comparación con una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. El término “aproximadamente” se refiere a un intervalo de cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud ±15 %, ±10 %, ±9 %, ±8 %, ±7 %, ±6 %, ±5 %, ±4 %, ±3 %, ±2 % o ±1 % alrededor de una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.
[0277] Como se utiliza en la presente memoria, el término “sustancialmente” o “esencialmente” se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que es aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o mayor en comparación con una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. En una realización, los términos “esencialmente el mismo” o “ sustancialmente el mismo” se refieren a un intervalo de cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que es aproximadamente el mismo que una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.
[0278] Como se utiliza en la presente memoria, las expresiones “sustancialmente libre de” y “esencialmente libre de” se utilizan indistintamente, y cuando se utilizan para describir una composición, tal como una población celular o medios de cultivo, se refieren a una composición que está libre de una sustancia específica, tal como, 95 % libre, 96 % libre, 97 % libre, 98 % libre, 99 % libre de la sustancia especificada, o es indetectable al medirla por medios convencionales. Se puede aplicar un significado similar al término “ ausencia de” , cuando se refiere a la ausencia de una sustancia o componente particular de una composición.
[0280] Como se utiliza en la presente memoria, el término “ apreciable” se refiere a un rango de cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud o un evento que es fácilmente detectable por uno o más métodos estándar. Los términos “ no apreciable” y equivalentes se refieren a un rango de cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud o un evento que no es fácilmente detectable o indetectable por métodos estándar. En una realización, un evento no es apreciable si ocurre menos del 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,1 %, 0,01 %, 0,001 % o menos del tiempo.
[0282] A lo largo de esta memoria descriptiva, salvo que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que las palabras “comprender” , “comprende” y “que comprende” implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. En realizaciones particulares, los términos “ incluir” , “ tiene” , “contiene” y “comprender” se utilizan como sinónimos.
[0283] Por “que consiste en” se entiende que incluye, y se limita a, lo que sigue a la frase “que consiste en” . Por lo tanto, la frase “que consiste en” indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos.
[0285] Por “que consiste esencialmente en” se entiende que incluye cualquier elemento enumerado después de la frase, y se limita a otros elementos que no interfieren ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la descripción para los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase “que consiste esencialmente en” indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, pero que ningún otro elemento es opcional y puede o no estar presente dependiendo de si afectan o no a la actividad o acción de los elementos enumerados.
[0287] La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a “una realización” , “una realización particular” , “ una realización relacionada” , “una determinada realización” , “ una realización adicional” u “otra realización” o combinaciones de estas expresiones significa que un rasgo, estructura o característica particular descrita en relación con la realización se incluye en al menos una realización de la presente invención. Por lo tanto, las menciones de las frases anteriores en diversos lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no se refieren necesariamente a la misma realización. Además, los rasgos, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.
[0289] El término“ ex vivo"se refiere generalmente a actividades que tienen lugar fuera de un organismo, tales como experimentación o mediciones realizadas en o sobre tejido vivo en un entorno artificial fuera del organismo, preferiblemente con una alteración mínima de las condiciones naturales. En realizaciones particulares, los procedimientos “ ex vivo” implican la extracción de células o tejidos vivos de un organismo y su cultivo en un aparato de laboratorio, usualmente en condiciones estériles, y típicamente durante unas pocas horas o hasta aproximadamente 24 horas, pero dependiendo de las circunstancias, incluso hasta 48 o 72 horas. En determinadas realizaciones, tales tejidos o células se pueden recolectar y congelar, y a continuación descongelar para el tratamientoex vivo.Los experimentos o procedimientos de cultivo de tejidos que duran más de unos pocos días utilizando células o tejidos vivos se consideran típicamente“ in vitro",aunque en determinadas realizaciones este término se puede utilizar indistintamente conex vivo.
[0291] El término“in vivo"se refiere generalmente a actividades que tienen lugar dentro de un organismo.
[0293] Como se utiliza en la presente memoria, los términos “ reprogramación” o “desdiferenciación” o “aumento de la potencia celular” o “ aumento de la potencia de desarrollo” se refieren a un método para aumentar la potencia de una célula o desdiferenciar la célula a un estado menos diferenciado. Por ejemplo, una célula que tiene una mayor potencia celular tiene más plasticidad de desarrollo (es decir, puede diferenciarse en más tipos de células) en comparación con la misma célula en el estado no reprogramado. En otras palabras, una célula reprogramada es aquella que se encuentra en un estado menos diferenciado que la misma célula en un estado no reprogramado.
[0295] Como se utiliza en la presente memoria, el término “ potencia” se refiere a la suma de todas las opciones de desarrollo accesibles para la célula (es decir, la potencia de desarrollo). Un experto en la técnica reconocería que la potencia celular es un continuo, que va desde la célula más plástica, una célula madre totipotente, que tiene la mayor potencia de desarrollo hasta la célula menos plástica, una célula diferenciada terminalmente, que tiene la menor potencia de desarrollo. El continuo de potencia celular incluye, aunque no de forma limitativa, células totipotentes, células pluripotentes, células multipotentes, células oligopotentes, células unipotentes y células diferenciadas terminalmente.
[0296] Como se utiliza en la presente memoria, el término “pluripotente” se refiere a la capacidad de una célula para formar todos los linajes del cuerpo o soma (es decir, el embrión propiamente dicho). Por ejemplo, una célula madre embrionaria es un tipo de célula madre pluripotente que es capaz de formar células de cada una de las tres capas germinales: el ectodermo, el mesodermo y el endodermo.
[0298] La pluripotencia se puede determinar, en parte, evaluando las características de pluripotencia de las células. Las características de pluripotencia incluyen, aunque no de forma limitativa: (i) morfología de células madre pluripotentes; (ii) el potencial de autorrenovación ilimitada (iii) expresión de marcadores de células madre pluripotentes que incluyen,<aunque no de forma limitativa, SSEA1 (solo de ratón), SSEA3/4; SSEA5, TRA1 -60/81; TRA1 -85, TRA2-54,>GC<t>M-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/prominina, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 y/o CD50; (iv) capacidad para diferenciarse de los tres linajes somáticos (ectodermo, mesodermo y endodermo) (v) formación de teratoma que consiste en los tres linajes somáticos; y (vi) formación de cuerpos embrioides que consisten en células de los tres linajes somáticos;
[0300] Anteriormente se han descrito dos tipos de pluripotencia: el estado de pluripotencia “cebado” o “ metaestable” similar a las células madre epiblásticas (EpiSC) del blastocisto tardío y el estado de pluripotencia “ ingenuo” o “fundamental” similar a la masa celular interna del blastocisto temprano/preimplantación. Si bien ambos estados pluripotentes presentan las características descritas anteriormente, el estado ingenuo o fundamental presenta además; (i) preinactivación o reactivación del cromosoma X en células femeninas (ii) mejora de la clonalidad y la supervivencia durante el cultivo de células individuales (iii) reducción global en la metilación del ADN, (iv) reducción de la deposición de la marca de cromatina represiva H3K27me3 en promotores de genes reguladores del desarrollo, y (v) reducción de la expresión de marcadores de diferenciación en relación con las células pluripotentes en estado cebado. Las metodologías estándar de reprogramación celular en las que los genes de pluripotencia exógenos se introducen en una célula somática, se expresan y a continuación se silencian o se eliminan de las células pluripotentes resultantes generalmente tienen características del estado cebado de pluripotencia. En condiciones de cultivo celular pluripotente estándar, dichas células permanecen en el estado cebado salvo que se mantenga la expresión transgénica exógena, donde se observan las características del estado fundamental.
[0302] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ morfología de células madre pluripotentes” se refiere a las características morfológicas clásicas de una célula madre embrionaria. La morfología normal de las células madre embrionarias se caracteriza por ser redonda y de forma pequeña, con una alta relación núcleo-citoplasma, la notable presencia de nucleolos y el típico espaciamiento intercelular.
[0304] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ perfil de expresión génica” , “ firma de expresión génica” , “panel de expresión génica” , “panel de genes” o “firma génica” se refiere a la expresión o niveles de expresión de una pluralidad de genes que sirve para distinguir una célula o población de células de otra célula o población de células. Por ejemplo, una población de células pluripotentes mantenida en un medio para evitar la diferenciación espontánea puede mostrar un perfil de expresión génica que comprende una disminución de la expresión de genes de diferenciación en relación con una población de control de células pluripotentes del mismo origen que no se mantienen en el mismo medio.
[0306] Como se utiliza en la presente memoria, el término “gen marcador de diferenciación” o “gen de diferenciación” se refiere a genes cuya expresión es indicativa de la diferenciación celular que ocurre dentro de una célula, tal como una célula pluripotente. Los genes marcadores de diferenciación incluyen, aunque no de forma limitativa, los siguientes genes: FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1 D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, gen T (Brachyury) y ZIC1.
[0308] Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “perfil de gen marcador de diferenciación” o “perfil de gen de diferenciación” , “ perfil de expresión de gen de diferenciación” , “ firma de expresión de gen de diferenciación” , “ panel de expresión de gen de diferenciación” , “panel de gen de diferenciación” o “firma de gen de diferenciación” se refiere a la expresión o niveles de expresión de una pluralidad de genes marcadores de diferenciación.
[0310] En realizaciones particulares, una población de células pluripotentes que muestra una diferenciación espontánea disminuida puede caracterizarse por una disminución en la expresión de un gen marcador de diferenciación o un perfil de genes marcadores de diferenciación. Por ejemplo, la diferenciación espontánea disminuida en una célula pluripotente o población de células pluripotentes puede indicarse cuando un conjunto dado de condiciones de cultivo provoca una disminución en la expresión de uno o más genes marcadores de diferenciación de al menos 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más en comparación con la expresión de los genes marcadores de diferenciación de una célula pluripotente de control o población de células pluripotentes que carecen de las mismas condiciones de cultivo.
[0312] “ Expresión génica” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a los niveles relativos de expresión y/o patrón de expresión de un gen en una muestra biológica, tal como células pluripotentes, o una población de células que comprende células pluripotentes. En realizaciones particulares, las células pluripotentes son iPSC.
[0313] Cualquier método disponible en la técnica para detectar la expresión de los genes que caracterizan las células de la invención se abarcan en la presente memoria. Como se utiliza en la presente memoria, el término “detección de expresión” significa determinar la cantidad o presencia de un transcrito de ARN o su producto de expresión de un gen. Los métodos para detectar la expresión de genes, es decir, el perfil de expresión génica, incluyen métodos basados en el análisis de hibridación de polinucleótidos, métodos basados en la secuenciación de polinucleótidos, métodos de inmunohistoquímica y métodos basados en proteómica. Los métodos generalmente detectan productos de expresión (p. ej., ARNm) de los genes de interés. En algunas realizaciones, se utilizan los métodos basados en PCR, tales como PCR de transcripción inversa (RT-PCR) (Weis y col., TIG 8:263-64, 1992), y métodos basados en matrices tales como micromatrices (Schena y col., Science 270:467-70, 1995).
[0315] “Adherir” se refiere a células que se unen a un recipiente, por ejemplo, una célula que se une a una placa o matraz de cultivo celular de plástico estéril (o plástico recubierto) en presencia de un medio de cultivo apropiado. Determinadas clases de células no se mantienen o no crecen en un cultivo salvo que se adhieran al recipiente de cultivo celular. Determinadas clases de células (“células no adherentes” ) se mantienen y/o proliferan en cultivo sin adherirse.
[0317] “ Cultivo” o “cultivo celular” se refiere al mantenimiento, crecimiento y/o diferenciación de células en un entornoin vitro.“ Medio de cultivo celular” , “ medio de cultivo” (“ medio” singular en cada caso), “ suplemento” y “ suplemento de medios” se refieren a composiciones nutritivas que cultivan cultivos celulares.
[0319] “ Cultivar” se refiere al mantenimiento, propagación (crecimiento) y/o diferenciación de células fuera del tejido o del cuerpo, por ejemplo, en una placa o matraz de cultivo celular de plástico estéril (o plástico recubierto). “ Cultivo” puede utilizar un medio de cultivo como fuente de nutrientes, hormonas y/u otros factores útiles para propagar y/o mantener las células.
[0321] Como se utiliza en la presente memoria, una célula “disociada” se refiere a una célula que se ha separado o purificado sustancialmente de otras células o de una superficie(p. e j,una superficie de placa de cultivo). Por ejemplo, las células se pueden disociar de un animal o tejido mediante métodos mecánicos o enzimáticos. Alternativamente, las células que se agreganin vitropueden disociarse entre sí, tal como mediante disociación en una suspensión de grupos, células individuales o una mezcla de células individuales y grupos, enzimática o mecánicamente. En aún otra realización alternativa, las células adherentes se disocian de una placa de cultivo u otra superficie. Por lo tanto, la disociación puede implicar romper las interacciones celulares con la matriz extracelular (MEC) y los sustratos (p. ej., superficies de cultivo), o romper la MEC entre las células.
[0323] Como se utiliza en la presente memoria, los términos “enriquecer” y “enriqueciendo” se refieren a aumentar la cantidad de un componente especificado en una composición, tal como una composición de células, y “enriquecido” , cuando se utiliza para describir una composición de células tal como una población de células, se refiere a una población de células que tiene una cantidad aumentada proporcionalmente de un componente especificado en comparación con la proporción de dicho componente en la población de células antes de enriquecerse. Por ejemplo, una composición tal como una población de células puede enriquecerse con respecto a un tipo de célula diana (es decir, células que tienen características específicas), teniendo de este modo una mayor proporción o porcentaje del tipo de célula diana en comparación con la proporción de las células diana presentes en la población de células antes de enriquecerse. Una población de células puede enriquecerse para un tipo de célula diana mediante métodos de selección y clasificación de células conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, una población de células se enriquece mediante un proceso de clasificación o selección como se describe en los ejemplos de la presente memoria. En una realización particular, un método que enriquece para una población de células diana enriquece la población de células con respecto a la población de células diana en al menos aproximadamente un 20 %, lo que significa que la población de células enriquecida comprende proporcionalmente aproximadamente un 20 % más del tipo de célula diana que en la población antes de que se enriqueciera la población. En una realización, un método que enriquece para una población de células diana enriquece la población de células con respecto a la población de células diana proporcionalmente en al menos aproximadamente 30+%, 40+%, 50+%, 60+%, 70+%, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 %, o al menos aproximadamente 98 %, o en realizaciones particulares aproximadamente 99 %.
[0325] En determinadas realizaciones, una población de células se enriquece con respecto a la cantidad de células pluripotentes o células que presentan características de pluripotencia. En determinadas realizaciones de la invención, una población de células que se somete a reprogramación se enriquece para células diana que tienen características de pluripotencia, tales como expresión de marcadores de pluripotencia que incluyen, sin limitarse a, SSEA3, SSEA4, TRA 1 -60, TRA-1 -81, CD30 o CD50.
[0327] En realizaciones particulares, una población de células, tal como una población de células sometidas a reprogramación, se agota de células no pluripotentes utilizando marcadores de superficie específicos para linajes celulares diferenciados o células no pluripotentes, que pueden incluir, por ejemplo, CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 o CD7. Por lo tanto, la población celular resultante se puede describir como una población de células enriquecidas en células pluripotentes.
[0329] En determinadas realizaciones, las células enriquecidas comprenden un perfil de expresión de genes o proteínas distinto, por ejemplo, expresión en la superficie celular de al menos dos marcadores de pluripotencia tales como SSEA3, SSEA4, TRA 1 -60, TRA-1 -81, CD30 y CD50. En algunas realizaciones, las células enriquecidas comprenden dos o más marcadores de pluripotencia. En determinadas realizaciones, las células enriquecidas expresan SSEA4 en combinación con TRA-181 o TRA-160. En realizaciones más particulares, las células enriquecidas expresan SSEA4, TRA181 y CD30. En una realización, una población de células comprende al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de las células enriquecidas, tales como células pluripotentes.
[0331] Por lo tanto, en algunas realizaciones, los métodos para enriquecer una población de células para células pluripotentes comprenden clasificar la población celular basándose en la expresión de la superficie celular de marcadores de pluripotencia, tales como SSEA3, SSEA4, TRA 1-60, TRA- 1-81, CD30 y CD50, y recoger la fracción de células que expresan dichos marcadores para obtener una población de células enriquecida con células pluripotentes. En otras realizaciones, una población de células se enriquece en células pluripotentes clasificando la población celular en función de la expresión en la superficie celular de marcadores de células en diferenciación o diferenciadas, tales como CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 y CD7, y agotando la población celular de dichas células para obtener una población de células que se enriquece en células pluripotentes. En determinadas realizaciones, la población celular se clasifica en función de la expresión de CD13, y las células CD13+ se eliminan de la población celular para obtener una población de células enriquecidas en células pluripotentes.
[0333] Como se utiliza en la presente memoria, “células alimentadoras” o “alimentadores” son términos utilizados para describir células de un tipo que se cocultivan con células de un segundo tipo para proporcionar un entorno en el que las células del segundo tipo pueden crecer, ya que las células alimentadoras proporcionan factores de crecimiento y nutrientes para el soporte del segundo tipo de célula. Las células alimentadoras son opcionalmente de una especie diferente a las células que están soportando. Por ejemplo, determinados tipos de células humanas, incluidas las células madre, pueden estar respaldadas por cultivos primarios de fibroblastos embrionarios de ratón y fibroblastos embrionarios de ratón inmortalizados. Las células alimentadoras pueden inactivarse típicamente cuando se cocultivan con otras células mediante irradiación o tratamiento con un agente antimitótico tal como mitomicina c, para evitar que superen las células que están soportando. Sin limitar lo anterior, un tipo de célula alimentadora específica puede ser un alimentador humano, tal como un fibroblasto de piel humana. Otro tipo de célula alimentadora pueden ser los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF).
[0335] Como se utiliza en la presente memoria, un entorno “ libre de alimentadores” (FF) se refiere a un entorno tal como un cultivo celular o medio de cultivo esencialmente libre de células alimentadoras y/o que no ha sido preacondicionado por el cultivo de células alimentadoras. El medio “preacondicionado” se refiere a un medio cosechado después de que las células alimentadoras se hayan cultivado dentro del medio durante un período de tiempo, tal como durante al menos un día. El medio preacondicionado contiene muchas sustancias mediadoras, incluidos factores de crecimiento y citoquinas secretadas por las células alimentadoras cultivadas en el medio.
[0337] La estabilidad genómica se refiere a la capacidad de una célula para replicar fielmente el ADN y mantener la integridad del proceso de replicación del ADN. Como se utiliza en la presente memoria, los términos “células genómicamente estables” y “células que tienen estabilidad genómica” se refieren a células que presentan una frecuencia de mutaciones y aberraciones cromosómicas (tales como translocaciones, aneuploidía, variaciones en el número de copias y duplicaciones) que es sustancialmente similar a la frecuencia de mutaciones y aberraciones cromosómicas con respecto a las células humanas somáticas normales.
[0339] “ Ingrediente” se refiere a cualquier compuesto u otro material, ya sea de origen químico o biológico que puede utilizarse en medios de cultivo celular para mantener y/o promover el crecimiento y/o diferenciación de las células. Los términos “componente” , “ nutriente” e “ ingrediente” se pueden utilizar indistintamente. Los ingredientes convencionales utilizados para los medios de cultivo celular pueden incluir, aunque no de forma limitativa, aminoácidos, sales, metales, azúcares, lípidos, ácidos nucleicos, hormonas, vitaminas, ácidos grasos, proteínas y similares. Los expertos en la técnica pueden seleccionar otros ingredientes que promuevan y/o mantengan el cultivo de célulasex vivosegún sea necesario para un efecto deseado.
[0341] “Aislar” o “aislamiento” se refiere a separar y recolectar una composición o material de su entorno natural, tal como la separación de células individuales o cultivos celulares del tejido o el cuerpo. En un aspecto, una población o composición de células está sustancialmente libre de células y materiales con los que se puede asociar en la naturaleza. “Aislado” o “ purificado” o “sustancialmente puro” , con respecto a una población diana de células, se refiere a una población de células que es al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, y en determinadas realizaciones, al menos aproximadamente 95 % pura, con respecto a las células diana que constituyen una población celular total. La pureza de una población o composición de células se puede evaluar mediante métodos apropiados que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una población sustancialmente pura de células pluripotentes se refiere a una población de células que es al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 % y, en determinadas realizaciones, al menos aproximadamente 95 % y, en determinadas realizaciones, aproximadamente 98 % pura, con respecto a las células pluripotentes que constituyen la población celular total. El término “esencialmente puro” se utiliza indistintamente en la presente memoria con “sustancialmente puro” .
[0342] “ Pase” o “pasaje” se refiere al acto de subdividir y sembrar células en múltiples superficies o recipientes de cultivo celular cuando las células han proliferado hasta un grado deseado. En algunas realizaciones, los términos “ pase” o “pasaje” se refieren a subdividir, diluir y sembrar las células. A medida que las células se pasan de la superficie o recipiente de cultivo primario a un conjunto posterior de superficies o recipientes, los cultivos posteriores pueden denominarse en la presente memoria “cultivo secundario” o “primer pasaje” , etc. Cada acto de subdividir y sembrar en un nuevo recipiente de cultivo se considera un pasaje.
[0344] “Colocar en placas” se refiere a colocar una célula o células en un recipiente de cultivo de modo que las células se adhieran y se extiendan sobre un recipiente de cultivo celular.
[0346] Un “factor de pluripotencia” se refiere a un agente capaz de aumentar la potencia de desarrollo de una célula, ya sea solo o en combinación con otros agentes. Los factores de pluripotencia incluyen, sin limitación, polinucleótidos, polipéptidos y moléculas pequeñas capaces de aumentar la potencia de desarrollo de una célula. Los factores de pluripotencia ilustrativos incluyen, por ejemplo, factores de transcripción y agentes de reprogramación de moléculas pequeñas.
[0348] “ Proliferar” se refiere a la propiedad de una célula que se divide en dos células esencialmente idénticas o una población de células que aumenta en número(p. e j,para reproducirse).
[0350] “ Propagación” se refiere al crecimiento(p. ej.,reproducción a través de la proliferación celular) de células fuera del tejido o del cuerpo, por ejemplo, en un recipiente estéril tal como una placa o matraz de cultivo celular de plástico (o de plástico recubierto).
[0352] “Cultivo primario” se refiere a células, tejido y/o cultivo donde las células aisladas se colocan en un primer recipiente de cultivo con medio de cultivo. Las células, el tejido y/o el cultivo pueden ser sostenidos y/o pueden proliferar, sin embargo, siempre que las células, el tejido y/o el cultivo permanezcan en el primer recipiente, las células, el tejido y/o el cultivo se denominan cultivo primario.
[0354] Los términos “agente de reprogramación de molécula pequeña” o “compuesto de reprogramación de molécula pequeña” se utilizan indistintamente en la presente memoria y se refieren a moléculas pequeñas que pueden aumentar la potencia de desarrollo de una célula, ya sea sola o en combinación con otros factores de pluripotencia. Una “ molécula pequeña” se refiere a un agente que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD, menos de aproximadamente 4 kD, menos de aproximadamente 3 kD, menos de aproximadamente 2 kD, menos de aproximadamente 1 kD o menos de aproximadamente 0,5 kD. Las moléculas pequeñas incluyen, aunque no de forma limitativa: ácidos nucleicos, peptidomiméticos, peptoides, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas. Las bibliotecas de mezclas químicas y/o biológicas, tales como extractos fúngicos, bacterianos o de algas, son conocidas en la técnica y se pueden utilizar como fuente de moléculas pequeñas en determinadas realizaciones. En realizaciones particulares, el agente de reprogramación de moléculas pequeñas utilizado en la presente memoria tiene un peso molecular de menos de 10.000 daltons, por ejemplo, menos de 8000, 6000, 4000, 2000 daltons, p. ej., entre 50-1500, 500-1500, 200-2000, 500-5000 daltons.
[0356] C. Células
[0358] En una determinada realización, una o más células pueden cultivarse, disociarse y pasarse utilizando las composiciones y los métodos contemplados en la presente memoria. En una realización, las células individuales se cultivaron, se disociaron y se pasaron utilizando las composiciones y los métodos contemplados en la presente memoria. En otra realización, se cultiva, disocia y pasa una población de células o una pluralidad de células utilizando las composiciones y los métodos contemplados en la presente memoria.
[0360] Una población inicial de células adecuada para su uso en determinadas realizaciones puede derivar esencialmente de cualquier fuente adecuada, y puede ser heterogénea u homogénea con respecto a los tipos de células o al estado de pluripotencia. Las células adecuadas incluyen células fetales y células adultas. Además, las células adecuadas pueden ser de origen mamífero,p. ej.,de un roedor, un gato, un perro, un cerdo, una cabra, una oveja, un caballo, una vaca o un primate. En una realización, las células son células humanas.
[0362] Las células pueden ser células madre somáticas, no pluripotentes, incompletas o parcialmente pluripotentes, células multipotentes, células oligopotentes, células unipotentes, células diferenciadas terminalmente o una población mixta de células que comprende cualquier combinación de las anteriores. Las células pluripotentes adecuadas para su uso en determinadas realizaciones incluyen, aunque no de forma limitativa, células madre de origen natural, células madre embrionarias o iPSC. Una población “ mixta” de células es una población de células de diversos grados de potencia de desarrollo. Por ejemplo, una población mixta de células puede comprender células que se someten a reprogramación, de modo que la población mixta comprende células pluripotentes, células parcialmente pluripotentes y células no pluripotentes, tales como células completamente diferenciadas.
[0363] En una realización, la población inicial de células se selecciona de células madre/progenitoras adultas o neonatales. En determinadas realizaciones, la población inicial de células madre/progenitoras se selecciona del grupo que consiste en: células madre/progenitoras mesodérmicas, células madre/progenitoras endodérmicas y células madre/progenitoras ectodérmicas.
[0365] Los ejemplos ilustrativos de células madre/progenitoras mesodérmicas incluyen, aunque no de forma limitativa: células madre/progenitoras mesodérmicas, células madre/progenitoras endoteliales, células madre/progenitoras de médula ósea, células madre/progenitoras de cordón umbilical, células madre/progenitoras derivadas de tejido adiposo, células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSC), células madre/progenitoras mesenquimatosas, células madre/progenitoras musculares, células madre/progenitoras renales, células madre/progenitoras de osteoblastos, células madre/progenitoras de condrocitos y similares.
[0367] Los ejemplos ilustrativos de células madre/progenitoras ectodérmicas incluyen, aunque no de forma limitativa, células madre/progenitoras neurales, células madre/progenitoras retinianas, células madre/progenitoras cutáneas y similares.
[0368] Los ejemplos ilustrativos de células madre/progenitoras endodérmicas incluyen, aunque no de forma limitativa, células madre/progenitoras hepáticas, células madre/progenitoras pancreáticas, células madre/progenitoras epiteliales y similares.
[0370] En determinadas realizaciones, la población inicial de células puede ser una población heterogénea u homogénea de células seleccionadas del grupo que consiste en: células de los islotes pancreáticos, células del SNC, células del SNP, células del músculo cardíaco, células del músculo esquelético, células del músculo liso, células hematopoyéticas, células óseas, células hepáticas, células adiposas, células renales, células pulmonares, condrocitos, células de la piel, células foliculares, células vasculares, células epiteliales, células inmunitarias, células endoteliales y similares.
[0371] D. Plataformas de cultivo para reducir la diferenciación espontánea e inducir la pluripotencia del estado fundamental
[0372] El banco de células, el modelado de enfermedades y las aplicaciones de terapia celular han exigido cada vez más la fabricación de células pluripotentes de alta calidad. Por ejemplo, la derivación de alto rendimiento de iPSC libres de huella y su expansión en sistemas que permitan una producción a escala sigue siendo técnicamente difícil de alcanzar. En realizaciones particulares, se contemplan plataformas de cultivo que permiten la generación, selección y expansión rápida y paralela de células pluripotentes utilizando inhibidores de la ruta de moléculas pequeñas en composiciones de medios específicos de la etapa. Las plataformas contempladas en la presente memoria admiten una reprogramación eficiente y acelerada utilizando factores de reprogramación mínimos en un entorno completamente libre de alimentadores; permiten el cultivo de células individuales y la expansión de células pluripotentes mientras se mantiene una población pluripotente homogénea y genómicamente estable. Además, las plataformas de cultivo contempladas en la presente memoria proporcionan el cultivo de células pluripotentes, incluidas hESC y hiPSC, a un estado reducido de diferenciación espontánea y un estado fundamental común de pluripotencia, independientemente de los antecedentes genéticos e independiente de la expresión transgénica.
[0374] Las plataformas de cultivo contempladas en la presente memoria son útiles, en parte, para la producción de células pluripotentes de grado industrial o clínico que tienen una diferenciación espontánea reducida en cultivo. En una realización, se inducen células no pluripotentes para que se conviertan en células pluripotentes y se cultivan para mantener la pluripotencia. En otra realización, se inducen células no pluripotentes para que se conviertan en células pluripotentes y se cultivan para lograr y/o mantener una diferenciación espontánea reducida en el cultivo. En otra realización, se inducen células no pluripotentes para que se conviertan en células pluripotentes y se cultivan para lograr y/o mantener la pluripotencia del estado fundamental.
[0376] En diversas realizaciones, las plataformas de cultivo contempladas en la presente memoria mantienen la pluripotencia del estado fundamental, cariotipos normales, y la estabilidad genómica de una o más células de pluripotencia durante al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más pasajes, incluyendo cualquier número intermedio de pasajes.
[0378] En otras realizaciones, las plataformas de cultivo contempladas en la presente memoria mantienen una diferenciación espontánea reducida en una o más células de pluripotencia durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más pasajes, incluyendo cualquier número intermedio de pasajes.
[0380] En una realización, la plataforma de cultivo comprende un medio de cultivo celular que comprende un medio de cultivo celular y un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de Rho quinasa (ROCK). En diversas realizaciones, los medios de cultivo celular contemplados en la presente memoria no comprenden o carecen de un inhibidor de las vías de señalización de TGFp/activina, incluidos los inhibidores del receptor de TGFp (TGFpR) y los inhibidores de ALK5. Sin querer limitarse a ninguna teoría en particular, los inventores descubrieron sorprendentemente que, si bien los inhibidores de TGFpR/ALK5 aumentan la eficiencia de la reprogramación, estos inhibidores contrarrestan el mantenimiento, la calidad y la homogeneidad a largo plazo de una población de células pluripotentes, es decir, la inhibición de la señalización de la ruta de TGFp mejoró la eficiencia de la reprogramación celular, pero se requiere un alivio de esta inhibición para el mantenimiento posterior de la población de células pluripotentes en sistemas de cultivoin vitro, particularmente en sistemas que utilizan pasaje enzimático, células individuales y libres de células alimentadoras donde se prefiere una población pluripotente homogénea con diferenciación espontánea reducida y más particularmente donde la expresión transgénica está ausente. Además, el cultivo de células pluripotentes metaestables en medios que comprenden un inhibidor de GSK-3 y un inhibidor de MEK y, opcionalmente, un inhibidor de ROCK, pero que carecen de inhibidores de TGFpR/ALK5, como se describe en la presente memoria, hace la transición de las células pluripotentes para lograr una diferenciación espontánea reducida y/o lograr la pluripotencia del estado fundamental. La plataforma de medios de cultivo contemplada en la presente memoria también permite la reprogramación eficiente y el cultivo a largo plazo de células pluripotentes en entornos libres de alimentador. Además, aunque “un inhibidor de ALK5” no pretende abarcar inhibidores de quinasa no específicos, debe entenderse que un “ inhibidor de ALK5” abarca inhibidores que inhiben ALK4 y/o ALK7 además de ALK5, tales como, por ejemplo, SB-431542 (véase, p. ej., Inman y col., J Mol. Pharmacol. 62(1): 65-74 (2002).
[0382] En una realización preferida, la plataforma de cultivo comprende un medio de cultivo celular que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK, un inhibidor de Rho quinasa (ROCK) y, opcionalmente, LIF y/o bFGF, y no comprende ningún inhibidor de molécula pequeña de una ruta de señalización de TGFp/activina que incluye, aunque no de forma limitativa, inhibidores de TGFpR o ALK5.
[0384] En realizaciones adicionales, el medio de cultivo celular está sustancialmente libre de citoquinas y/o factores de crecimiento y, opcionalmente, en un entorno libre de alimentador. En otras realizaciones, el medio de cultivo celular contiene suplementos tales como sueros, extractos, factores de crecimiento, hormonas, citoquinas y similares.
[0385] En una realización preferida, la plataforma de cultivo comprende cultivos libres de alimentador.
[0387] Las plataformas de cultivo contempladas en la presente memoria también ofrecen numerosas ventajas, tales como la fabricación de una población homogénea de células pluripotentes de grado industrial o clínico que tienen una diferenciación espontánea reducida y/o logran la pluripotencia del estado fundamental. Como se utiliza en la presente memoria, el término “ homogéneo” se refiere a una población de células donde cada célula es la misma o sustancialmente la misma que las otras células en la población. En una realización, una célula es la misma que otras células en la población si cada célula expresa uno o más de los mismos marcadores de pluripotencia que se contemplan en la presente memoria, p. ej., SSEA4 y TRA1-81. En una realización, la población es homogénea si al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o más de las células son iguales o sustancialmente iguales que otras células en la población.
[0389] 1. Receptor de tgfb/inhibidores de ALK5
[0391] Los inhibidores del receptor TGFp (p. ej., ALK5) pueden incluir anticuerpos, variantes negativas dominantes y ácidos nucleicos antisentido que suprimen la expresión de receptores TGFp (p. ej., ALK5). Los ejemplos de inhibidores del receptor TGFp/ALK5 incluyen, aunque no de forma limitativa, SB431542 (véase, p. ej., Inman, y col., Molecular Pharmacology 62(1):65-74 (2002)), A-83-01, también conocido como 3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-p-pirazol-1-carbotioamida (véase,p. e j,Tojo, y col., Cancer Science 96(11):791-800 (2005), y comercialmente disponible de, p. ej., Toicris Bioscience); 2-(3-(6-metilpiridina-2-il)-1 H-pirazol-4-il)-1,5-naftiridina, Wnt3a/BIO (véase,p. ej.,Dalton, y col., WO2008/094597), BMP4 (véase, Dalton, supra), GW788388 ({4-[3-(piridin-2-il)-1 H-pirazol-4-il]piridin-2-il}-N-(tetrahidro-2H-piran-4-il)benzamida) (véase,p. ej.,Gellibert, y col., Journal of Medicinal Chemistry 49(7): 2210-2221 (2006)), SM16 (véase, p. ej., Suzuki, y col., Cancer Research 67(5): 2351 - 2359 (2007)), IN-1130 (3-((5-(6-metilpiridina-2-il)-4-(quinoxalin-6-il)-1H-imidazol-2-il)metil)benzamida) (véase, p. ej., Kim, y col., Xenobiotica 38(3):325-339 (2008)), GW6604 (2-fenil-4-(3-piridin-2-il-1 H-pirazol-4-il)piridina) (véase, p. ej., de Gouville, y col., Drug News Perspective 19(2):85-90 (2006)), SB-505124 (clorhidrato de 2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-2-terc-butil-3H-imidazol-4-il)-6-metilpiridina) (véase, p. ej., DaCosta, y col., Molecular Pharmacology 65(3):744-752 (2004)) y derivados de pirimidina (véase, p. ej., los enumerados en Stiefl, y col., WO2008/006583). Además, aunque no se pretende que “un inhibidor de ALK5” abarque inhibidores de quinasa no específicos, debe entenderse que un “ inhibidor de ALK5” abarca inhibidores que inhiben ALK4 y/o ALK7 además de ALK5, tales como, por ejemplo, SB-431542 (véase,p. e j,Inman, y col., J, Mol. Pharmacol. 62(1): 65-74 (2002). Sin pretender limitar el alcance de la invención, se cree que los inhibidores de ALK5 afectan el proceso de conversión/transición mesenquimal a epitelial (MET). La ruta de TGFp/activina es un impulsor de la transición epitelial a mesenquimal (EMT). Por lo tanto, la inhibición de la ruta de TGFp/activina puede facilitar el proceso MET (es decir, la reprogramación).
[0393] En vista de los datos de la presente memoria que muestran el efecto de inhibición de ALK5, se cree que la inhibición de la ruta de TGFp/activina tendrá efectos similares de inhibición de ALK5. Por lo tanto, cualquier inhibidor (p. ej., corriente arriba o corriente abajo) de la ruta de TGFp/activina se puede utilizar en combinación con, o en lugar de, inhibidores de ALK5 como se describe en cada párrafo de la presente memoria. Los ejemplos de inhibidores de la ruta de TGFp/activina incluyen, aunque no de forma limitativa: Inhibidores del receptor TGFp, inhibidores de la fosforilación de SMAD 2/3, inhibidores de la interacción de SMAD 2/3 y SMAD 4, y activadores/agonistas de SMAD 6 y SMAD 7. Además, las categorizaciones que se describen a continuación son meramente para fines organizativos y un experto en la técnica sabrá que los compuestos pueden afectar a uno o más puntos dentro de una ruta y, por lo tanto, los compuestos pueden funcionar en más de una de las categorías definidas.
[0395] Los inhibidores del receptor de TGFp (TGFpR) pueden incluir anticuerpos, variantes negativas dominantes y ARNpi o ácidos nucleicos antisentido que se dirigen a los receptores de TGFp. Los ejemplos específicos de inhibidores del receptor de TGFp incluyen, aunque no de forma limitativa, SU5416; clorhidrato de 2-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-2-tercbutil-3H-imidazol-4-il)-6-metilpiridina (SB-505124); lerdelimumb (CAT-152); metelimumab (CAT-192); GC-1008; ID11; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; Ki26894; SB-203580; SD-093; Gleevec; 3,5,7,2',4'-pentahidroxiflavona (Morin); activina-M108A; P144; TBR2-Fc soluble; y células tumorales transfectadas antisentido que se dirigen a los receptores de TGFp. (Véase,p. ej.,Wrzesinski, y col., Clinical Cancer Research 13(18):5262-5270 (2007); Kaminska, y col., Acta Biochimica Polonica 52(2):329-337 (2005); and Chang, y col., Frontiers in Bioscience 12:4393-4401 (2007)).
[0397] Los inhibidores de la fosforilación de SMAD 2/3 pueden incluir anticuerpos, variantes negativas dominantes y ácidos nucleicos antisentido que se dirigen a SMAD2 o SMAD3. Los ejemplos específicos de inhibidores incluyen PD169316; SB203580; SB-431542; LY364947; A77-01; y 3,5,7,2',4'-pentahidroxiflavona (Morin). (Véase, p. ej., Wrzesinski, supra; Kaminska, supra; Shimanuki, y col., Oncogene 26:3311 -3320 (2007); y Kataoka, y col., EP1992360.
[0399] Los inhibidores de la interacción de SMAD 2/3 y smad4 pueden incluir anticuerpos, variantes negativas dominantes y ácidos nucleicos antisentido que se dirigen a SMAD2, SMAD3 y/o smad4. Los ejemplos específicos de inhibidores de la interacción de SMAD 2/3 y SMAD4 incluyen, aunque no de forma limitativa, Trx-SARA, Trx-xFoxH1b y Trx-Lef1. (Véase,p. ej.,Cui, y col., Oncogene 24:3864-3874 (2005) y Zhao, y col., Molecular Biology of the Cell, 17:3819-3831 (2006)).
[0401] Los activadores/agonistas de SMAD 6 y SMAD 7 incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos, variantes negativas dominantes y ácidos nucleicos antisentido que se dirigen a SMAD 6 o SMAD 7. Los ejemplos específicos de inhibidores incluyen, aunque no de forma limitativa, smad7 como PTO-oligonucleótidos. (Véase,p. e j,Miyazono, y col., US6534476, y Steinbrecher, y col., US2005119203).
[0403] 2. Agonistas de la ruta de WNT
[0405] Como se utiliza en la presente memoria, los términos “ agente promotor de la señal de Wnt” , “ agente activador de la ruta de Wnt” o “ agonista de la ruta de Wnt” se refieren a un agonista de la ruta de señalización de Wnt, que incluye, aunque no de forma limitativa, un agonista de uno o más de Wnt1, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt10a, Wntl0b, Wnt11, Wnt14, Wnt15, o Wnt16. Los agonistas de la ruta de Wnt incluyen además, aunque no de forma limitativa, uno o más de los siguientes polipéptidos o un fragmento de los mismos: un polipéptido Dkk, un polipéptido de media luna, un polipéptido de cerberus, un polipéptido de axina, un polipéptido de Frzb, un polipéptido de factor de células T, o un polipéptido de disheveled negativo dominante.
[0407] Los ejemplos no limitativos de agonistas de la ruta de Wnt incluyen además uno o más de los siguientes: un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Wnt, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido Wnt, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor Wnt activado, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un receptor Wnt activado, una molécula orgánica pequeña que promueve la señalización de Wnt/p-catenina, una molécula orgánica pequeña que inhibe la expresión o actividad de un antagonista de Wnt, un oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión de un antagonista de Wnt, una ribozima que inhibe la expresión de un antagonista de Wnt, una construcción de ARNi, ARNpi o ARNhc que inhibe la expresión de un antagonista de Wnt, un anticuerpo que se une e inhibe la actividad de un antagonista de Wnt, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de p-catenina, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de p-catenina, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de Lef-1, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido Lef-1.
[0409] Los agonistas de la ruta Wnt incluyen además inhibidores de GSK3, tales como, por ejemplo, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido GSK-3, GSK3a o GSK3p negativo dominante, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido GSK-3, GSK3a o GSK3p negativo dominante, una molécula orgánica pequeña que se une e inhibe la expresión o actividad de GSK-3, GSK3p. a, o GSK3p, una construcción de ARNi, siRNA o shRNA que se une e inhibe la expresión y/o actividad del GSK-3, GSK3a o GSK3p, un oligonucleótido antisentido que se une a e inhibe la expresión del GSK-3, GSK3a o GSK3p, un anticuerpo que se une e inhibe la expresión y/o la actividad del GSK-3, GSK3a o GSK3p, una ribozima que se une e inhibe la expresión del GSK-3, GSK3a o GSK3p y de cualquier reactivo independiente del GSK-3 que active los genes diana de la p-catenina similar en efecto a la inhibición de GSK-3.
[0411] 3. Inhibidores de GSK-3B
[0412] Los inhibidores de GSK-3p son agonistas de la ruta de Wnt ilustrativos específicos adecuados para su uso en las composiciones contempladas en la presente memoria, y pueden incluir, aunque no de forma limitativa, polinucleótidos, polipéptidos y moléculas pequeñas. Los inhibidores de GSK-3p contemplados en la presente memoria pueden disminuir la expresión de GSK-3p y/o la actividad de GSK-3p. Los ejemplos ilustrativos de inhibidores de GSK-3p contemplados en la presente memoria incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos anti-GSK-3p, variantes de GSK-3p negativas dominantes, ARNpi, ARNhc, miARN y ácidos nucleicos antisentido que se dirigen a GSK-3p.
[0413] Otros inhibidores de GSK-3p ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa: Kenpaullona, l-Azakenpaullona,CHIR99021, CHIR98014, AR-A014418, CT 99021, CT 20026, SB216763, AR-A014418, litio, SB 415286, TDZD-8, BIO, bio-acetoxima, (5-metil-1H-pirazol-3-il)-(2-fenilquinazolin-4-il)amina, complejo de piridocarbazol-ciclopentadienilrutenio, TDZD-8 4-bencil-2-metil-1,2,4-tiadiazolidin-3,5-diona, 2-tio(3-yodobencil)-5-(1 -piridil)-[1,3,4]-oxadiazol, OTDZT, alfa-4-dibromoacetofenona, AR-AO 144-18, 3-(1-(3-hidroxipropil)-1H-pirrolo[2,3-<b]piridin-3-il]-4-pirazin-2-il-pirrol-2,5-diona; compuesto de pirrolopirimidina TWS1 19, L803>H-K<e>A<p>P<a>P<pq>S<p>P-NH2<o>su forma miristoilada; 2-cloro-1-(4,5-dibromo-tiofen-2-il)-etanona; GF109203X; RO318220; TDZD-8; TIBPO; y OTDZT.
[0414] En realizaciones ilustrativas particulares, el inhibidor de GSK-3p es CHIR99021, BIO o Kenpaullona.
[0416] En una realización preferida, el inhibidor de GSK-3p es CHIR99021.
[0418] 4. Inhibidores de ERK/MEK
[0420] Los inhibidores de ERK/MEK adecuados para su uso en las composiciones contempladas en la presente memoria incluyen, aunque no de forma limitativa, polinucleótidos, polipéptidos y moléculas pequeñas. Los inhibidores de<ERK/MEK contemplados en la presente memoria pueden disminuir la expresión de>M<e>K<o ERK y/o la actividad de>MEK o ERK. Los ejemplos ilustrativos de inhibidores de MEK/ERK contemplados en la presente memoria incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos anti-MEK o anti-ERK, variantes de MEK o ERK negativas dominantes, ARNpi, ARNhc, miARN y ácidos nucleicos antisentido que se dirigen a MEK o ERK.
[0422] Otros inhibidores de ERK/MEK ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, PD0325901, PD98059, UO126, SL327, ARRY- 162, PD184161, PD184352, sunitinib, sorafenib, vandetanib, pazopanib, axitinib, GSKl 120212, ARRY-438162, RO5126766, XL518, AZD8330, RDEAl 19, AZD6244, FR180204 y PTK787.
[0424] Los inhibidores de MEK/ERK ilustrativos adicionales incluyen los compuestos descritos en las solicitudes de patente internacionales publicadas WO 99/01426, WO 02/06213, WO 03/077914, WO 05/051301 y WO2007/044084.
[0426] Otros ejemplos ilustrativos de inhibidores de MEK/ERK incluyen los siguientes compuestos: (2,3-dihidroxi-propoxi)-amida de ácido 6- (4-bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-e-5-carboxílico; (2-hidroxi-etoxi)-amida de ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-(tetrahidro-piran-2-ilm-etil)-3H-benzoimidazol-5-carboxílico, ácido 1-[6-(4-bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimida- zol-5-il]-2-hidroxi-etanona, (2-hidroxi-1,1-dimetil-etoxi)-amida de ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenilamino) -7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-e-5-carboxílico, (2-hidroxi-etoxi)-amida de ácido 6-(4-bromo-2-cloro-fenilamino)-7-fluoro-3-(tetrahidrofuran-2-ilm-etil)-3H-benzoimidazol-5-carboxílico, (2-hidroxi-etoxi)-amida de ácido 6-(4-bromo-2-fluoro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-e-5-carboxílico, (2-hidroxi-etoxi)-amida de ácido 6-(2,4-dicloro-fenilamino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-5-carboxílico, (2-hidroxi-etoxi)-amida de 6-(4-bromo-2-cloro-fenil-amino)-7-fluoro-3-metil-3H-benzoimidazol-e-5-carboxílico, denominado de aquí en adelante inhibidor de MEK 1; 2-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-N-(2-hidroxietoxi)-1,5-dimetil-6-oxo-1,6-dihidropiridina-3-carboxamida; denominado a continuación en la memoria inhibidor de MEK 2; y 4-(4-bromo-2-fluorofenilamino)-N-(2-hidroxietoxi)-1,5-dimetil-6--oxo-1,6-dihidropiridazina-3-carboxamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
[0428] En una realización preferida, el inhibidor de MEK/ERK es PD98059.
[0430] 5. Inhibidores de rock
[0432] Las quinasas asociadas a Rho (ROCK) son serina/treonina quinasas que sirven como efectores corriente abajo de las quinasas Rho (de las cuales existen tres isoformas: RhoA, RhoB y RhoC). Los inhibidores de ROCK adecuados para su uso en las composiciones contempladas en la presente memoria incluyen, aunque no de forma limitativa, polinucleótidos, polipéptidos y moléculas pequeñas. Los inhibidores de ROCK contemplados en la presente memoria pueden disminuir la expresión de ROCK y/o la actividad de ROCK. Los ejemplos ilustrativos de inhibidores de ROCK contemplados en la presente memoria incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos anti-ROCK, variantes de ROCK negativas dominantes, ARNpi, ARNhc, miARN y ácidos nucleicos antisentido que se dirigen a ROCK.
[0434] Los inhibidores de ROCK ilustrativos contemplados en la presente memoria incluyen, aunque no de forma limitativa: tiazovivina, Y27632, Fasudil, AR122-86, Y27632 H-1152, Y-30141, Wf-536, HA-1077, hidroxil-HA-1077, GSK269962A, SB-772077-B, N-(4-piridil)-N'-(2,4,6-triclorofenil)urea, 3-(4-piridil)-1 H-indol e inhibidores de ROCK y (R)-(+)-trans-N-(4-piridil)-4-(1 -aminoetil)-ciclohexanocarboxamida descritos en la patente estadounidense n.° 8.044.201.
[0435] En una realización, el inhibidor de ROCK es tiazovivina, Y27632 o pirintegrina.
[0437] En una realización preferida, el inhibidor de ROCK es tiazovivina.
[0439] La cantidad de moléculas pequeñas en las composiciones y medios de cultivo celular contemplados en la presente memoria puede variar y puede optimizarse según las condiciones de cultivo específicas, que incluyen las moléculas y combinaciones específicas utilizadas, el tipo de célula que se cultiva en el medio y la aplicación específica. En una realización, una molécula pequeña está presente en una composición a una concentración suficiente para inducir pluripotencia, mejorar la eficiencia de la reprogramación, aumentar o mantener la potencia de una célula, o inducir o mantener la pluripotencia del estado fundamental.
[0441] En determinadas realizaciones, las concentraciones y combinaciones preferidas de las moléculas pequeñas en los medios de cultivo celular de la invención se muestran en la Tabla 1 como medio de mantenimiento de destino (FMM). Los componentes del medio pueden estar presentes en el medio en cantidades dentro de un intervalo óptimo de aproximadamente las concentraciones óptimas que se muestran en la Tabla 1. El medio de reprogramación de destino (FRM) es útil en las plataformas de cultivo contempladas en la presente memoria que incluye la reprogramación de células, pero no es adecuado para el establecimiento y mantenimiento a largo plazo de células pluripotentes en estado fundamental.
[0443] Tabla 1
[0445]
[0448] 6. Citocinas y factores de crecimiento
[0450] En determinadas realizaciones, el medio de cultivo celular de la invención está sustancialmente libre de citoquinas y/o factores de crecimiento. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo celular contiene uno o más suplementos que incluyen, pero no se limitan a, sueros, extractos, factores de crecimiento, hormonas, citoquinas y similares.
[0451] En una realización ilustrativa, el medio de cultivo puede comprender una o más de, proteínas ECM, laminina 1, fibronectina, isotipos de colágeno IV, proteasas, inhibidores de proteasas, proteínas de adhesión a la superficie celular, proteínas de señalización celular, cadherinas, canal intracelular de cloruro 1, receptor transmembrana PTK7, factor de crecimiento similar a la insulina o inhibina beta A, pero no comprende inductores de la ruta de señalización de TGFp/activina/nodal y activina A. En otras realizaciones, el medio puede comprender inductores de la ruta de señalización de TGFp/activina/nodal.
[0453] En otra realización ilustrativa, un medio de cultivo comprende una o más de las siguientes citoquinas o factores de crecimiento: factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos ácido (aFGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor inhibidor de leucemia (LIF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1), factor de crecimiento similar a insulina 2 (IGF-2), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), transferrina del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF), diversas interleucinas (tales como IL-1 a IL-18), diversos factores estimulantes de colonias (tales como factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF)), diversos interferones (tales como IFN-y) y otras citoquinas que tienen efectos sobre las células madre tales como factor de células madre (SCF) y eritropoyetina (Epo). Estas citoquinas se pueden obtener comercialmente, por ejemplo, de R&D Systems, Minneapolis, Mn , y pueden ser naturales o recombinantes. En determinadas realizaciones, los factores de crecimiento y las citoquinas se pueden añadir a las concentraciones contempladas en la presente memoria. En determinadas realizaciones, se pueden añadir factores de crecimiento y citoquinas a concentraciones que se determinan empíricamente o guiadas por la técnica de citoquinas establecida.
[0455] 7. Sustratos de cultivo
[0457] Se puede utilizar cualquier recipiente o recipiente de cultivo celular adecuado como soporte para los cultivos celulares en el medio basal y/o los suplementos de cultivo celular. No es necesario ningún recubrimiento de sustrato sobre el soporte. Sin embargo, el recubrimiento de la superficie de un recipiente de cultivo con sustratos que promueven la adhesión (por ejemplo, colágenos, fibronectinas, polipéptidos que contienen RGD, gelatinas y similares) promueve la unión de las células y, en realizaciones particulares, puede mejorar el efecto de los medios de cultivo celular y suplementos descritos en la presente memoria. Los sustratos adecuados para cultivar y pasar células son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, vitronectina, gelatina, laminina, fibronectina, colágeno, elastina, osteopontina, mezclas de matrices producidas por líneas celulares de origen natural tales como Matrigel™ y superficies sintéticas o artificiales tales como monocapas de poliamina y monocapas carboxilo-terminales.
[0459] En una realización, una plataforma de cultivo contemplada en la presente memoria comprende un sustrato que comprende Matrigel™ o vitronectina.
[0461] 8. Entornos libres de alimentador
[0463] Los métodos existentes para cultivar células pluripotentes dependen en gran medida de células alimentadoras o medios preacondicionados con células alimentadoras y que contienen suero bovino fetal; sin embargo, dichos entornos pueden ser inadecuados para producir células para uso clínico y terapéutico. Por ejemplo, las células cultivadas en dichos entornos xeno-contaminados generalmente se consideran inadecuadas para el trasplante de células humanas porque la exposición a componentes animales puede presentar un riesgo grave de rechazo inmunitario y transmitir patógenos no identificados a los pacientes tratados, y podría reactivar potencialmente los retrovirus animales. Los sistemas de cultivo que utilizan medios de cultivo libres de animales, tales como los entornos libres de alimentadores contemplados en la presente memoria, facilitan la fabricación de líneas celulares de grado clínico, particularmente líneas celulares hESC y hiPSC.
[0465] En determinadas realizaciones, el entorno libre de células alimentadoras está esencialmente libre de células alimentadoras humanas, que incluyen, sin limitarse a, fibroblastos embrionarios de ratón, fibroblastos humanos, queratinocitos y células madre embrionarias, y no está preacondicionado por células alimentadoras. El medio de cultivo celular libre de alimentador es adecuado para su uso en el cultivo de células pluripotentes, la reprogramación de células, el cultivo unicelular, la disociación y el pasaje de células pluripotentes, la clasificación celular de células pluripotentes, la generación de células pluripotentes en estado fundamental y el mantenimiento de la pluripotencia en estado fundamental. En determinadas realizaciones, el entorno libre de alimentador se utiliza para inducir la pluripotencia, mejorar la eficiencia de la reprogramación y/o aumentar o mantener la potencia de una célula. En determinadas realizaciones, el entorno libre de alimentador está sustancialmente libre de citoquinas y factores de crecimiento, incluido bFGF.
[0467] 9. Disociación
[0469] Una de las ventajas ofrecidas por las plataformas de cultivo contempladas en la presente memoria es la viabilidad y supervivencia mejoradas del cultivo, el pasaje y la disociación de células pluripotentes de estado fundamental único. La disociación de células en células individuales, tal como en una suspensión de células individuales, se puede lograr por medios enzimáticos o mecánicos. Cualquier agente enzimático conocido en la técnica para permitir la disociación de células en células individuales puede utilizarse en los métodos de la invención. En una realización, el agente de disociación se selecciona de tripsina/EDTA, TrypLE-Select, colagenasa IV y dispasa.
[0471] También se puede utilizar un quelante, tal como EDTA, Accutase o AccuMax, solo o en combinación con un agente enzimático, en la disociación de células según los métodos contemplados en la presente memoria. El agente de disociación puede disolverse en PBS libre de calcio y magnesio para facilitar la disociación en células individuales.
[0472] Para mejorar la supervivencia de las células durante y después de la disociación, se puede añadir una sustancia promotora de la supervivencia (p. ej., factor de crecimiento, inhibidores de las vías celulares implicadas en la muerte celular y la apoptosis, o medios acondicionados),p. ej.,un inhibidor de ROCK tal como tiazovivina.
[0473] Las técnicas en el cultivo celular y la recolección de medios se describen en Hu y col., Curr. Opin. Biotechnol. 8:148, 1997; K. Kitano, Biotechnology 17:73, 1991; Curr. Opin. Biotechnol. 2:375, 1991; Birch y col., Bioprocess Technol.
[0474] 19:251, 1990; “Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach” (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); “Guide to Techniques in Mouse Development” (P. M. Wasserman y col. eds., Academic Press 1993); “ Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro” (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); “ Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy” (P. D. Rathjen y col., 1993).
[0475] La diferenciación de células madre se revisa en Robertson, Meth. Cell Biol. 75:173, 1997; and Pedersen, Reprod. Fertil. Dev. 10:31,1998.
[0477] 10. Estrategias de enriquecimiento y agotamiento
[0479] En realizaciones particulares, se proporcionan estrategias para enriquecer una población de células para células pluripotentes, p. ej., iPSC. En una realización, el enriquecimiento proporciona un método para derivar colonias de iPSC clonales en un tiempo relativamente corto, mejorando de este modo la eficiencia de la generación de iPSC. El enriquecimiento puede comprender clasificar una población de células, que se han inducido para reprogramar, para identificar y obtener células que expresan marcadores de pluripotencia, obteniendo de este modo una población de células enriquecidas en células pluripotentes. Una metodología de enriquecimiento adicional comprende el agotamiento de células que expresan marcadores de diferenciación o células no pluripotentes para obtener una población enriquecida de células pluripotentes. En algunas realizaciones, las células se cultivan después de inducir la reprogramación durante aproximadamente 4 a 30 días, aproximadamente 4 a 24 días, aproximadamente 6 a 22 días o aproximadamente 8 a aproximadamente 12 días.
[0481] En una realización, enriquecer una población de células en células pluripotentes comprende preparar una suspensión de células individuales disociando las células en la población y resuspendiendo las células. Las células disociadas pueden resuspenderse en cualquier solución o medio adecuado para mantener las células o realizar la clasificación celular. En determinadas realizaciones, la suspensión de células individuales contiene un inhibidor de GSK3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de Rock, y carece de un inhibidor de TFGp. En determinadas realizaciones, el inhibidor de GSK3 es CHIR99021, el inhibidor de MEK es PD0325901 y el inhibidor de Rock es tiazovivina.
[0483] En una determinada realización, una población de células se clasifica para seleccionar positivamente células pluripotentes, y/o la población se agota de células no reprogramadas o no pluripotentes, obteniendo de este modo una población de células enriquecidas en células pluripotentes. En una realización, se prepara una suspensión de células individuales, y a continuación las células individuales se preparan para la clasificación, tal como mediante tinción para marcadores de pluripotencia utilizando, p. ej., anticuerpos apropiados. Las células se pueden clasificar mediante cualquier método adecuado de clasificación de células, tal como mediante clasificación por perlas magnéticas o citometría de flujo (FACS).
[0485] Las células se pueden clasificar en función de varios marcadores de pluripotencia, que incluyen la expresión de SSEA3/4, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/prominina, CD140a, CD56, CD73, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, Klf4, SSEA1 (ratón), CD30, SSEA5, CD90 y CD50. En diversas realizaciones, las células se clasifican en función de al menos dos, al menos tres o al menos cuatro marcadores de pluripotencia. En determinadas realizaciones, las células se clasifican en función de la expresión de SSEA4, y en determinadas realizaciones en función de la expresión de SSEA4 en combinación con TRA1-81 o TRA1-60. En determinadas realizaciones, las células se clasifican en función de la expresión de SSEA4, TRA1-81 o TRA1-60 y CD30. En determinadas realizaciones, las células se agotan inicialmente para células no reprogramadas utilizando marcadores de superficie de células en diferenciación que incluyen, aunque no de forma limitativa, CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 o CD7, y a continuación se enriquecen para marcadores pluripotentes tales como SSEA4, TRA1-81 y CD30.
[0487] Una población enriquecida en células pluripotentes se puede colocar en un sistema de cultivo celular, tal como medio de hESC convencional o el medio de cultivo celular de la invención. El sistema de cultivo celular puede complementarse con células alimentadoras, u opcionalmente ser un entorno libre de alimentadores. En algunas realizaciones, las células clasificadas que expresan marcadores de pluripotencia se colocan en un sistema de cultivo suplementado con células alimentadoras y a continuación se transfieren a un entorno libre de alimentadores. En una realización, el medio de cultivo celular es un entorno libre de alimentadores y comprende un inhibidor de GSK3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de Rock, y carece de un inhibidor de TGFp. En determinadas realizaciones, el inhibidor de GSK3 es CHIR99021, el inhibidor de MEK es PD0325901 y el inhibidor de Rock es tiazovivina. En otras realizaciones particulares de la invención, el sistema de cultivo celular es un entorno libre de alimentador que comprende una placa de tejido recubierta con Matrigel™. En una realización, el sistema de cultivo celular comprende el medio FMM descrito en la Tabla 1.
[0489] La población celular enriquecida puede cultivarse en los sistemas de cultivo celular descritos en la presente memoria para obtener colonias de iPSC en estado fundamental, que aparecen típicamente de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 días después de la clasificación; aproximadamente 5-9 días después de la clasificación, o aproximadamente 5-7 días después de la clasificación. Las colonias de iPSC se pueden recoger u ordenar para la expansión clonal. utilizando las estrategias de enriquecimiento contempladas en la presente memoria, la población de células se enriquece al menos aproximadamente 3 veces, 5 veces o 10 veces o más en células pluripotentes.
[0491] En algunas realizaciones, una población de células sometidas a reprogramación o una población de células pluripotentes está agotada de células diferenciadas. En una realización, una población de células pluripotentes o células inducidas a reprogramarse puede agotarse de células que tienen marcadores de superficie celular de células diferenciadas. Los ejemplos ilustrativos de marcadores de superficie celular de células en diferenciación incluyen, aunque no de forma limitativa, CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 o CD7. En realizaciones particulares, el CD13 se utiliza como un marcador de superficie de células en diferenciación.
[0493] En otras realizaciones, una población de células inducidas para diferenciarse en un linaje deseado y se agotan las células pluripotentes para obtener una población enriquecida de células en diferenciación o diferenciadas. En algunas realizaciones, la población de células diferenciadas comprende una población de células, tales como ESC o iPSC que se ha inducido a diferenciarse en un linaje específico. Una población de células puede agotarse de células pluripotentes utilizando las técnicas de clasificación de células negativas descritas anteriormente (“ panning” ), tales como la clasificación de células en la población según perlas magnéticas o FAC basadas en marcadores de pluripotencia. En algunas realizaciones, una población de células que comprende células diferenciadas se clasifica por FAC utilizando marcadores de pluripotencia, y se obtiene una fracción que está agotada de células que expresan marcadores de pluripotencia. En otras realizaciones, una población de células se clasifica por FAC en función de marcadores de diferenciación, tales como marcadores específicos de linaje como CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 o CD7, para obtener una fracción agotada de marcadores de pluripotencia. El CD13 se utiliza como marcador de superficie de células diferenciadoras en realizaciones particulares de la invención.
[0495] E. Plataformas de cultivo para la reprogramación de células
[0497] Se están llevando a cabo varias estrategias para inducir la pluripotencia, o aumentar la potencia, en las células (Takahashi, K., y Yamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006); Takahashi y col., Cell 131, 861-872 (2007); Yu y col., Science 318, 1917-1920 (2007); Zhou y col., Cell Stem Cell 4, 381-384 (2009); Kim y col., Cell Stem Cell 4, 472-476 (2009); Yamanaka y col., 2009; Saha, K., Jaenisch, R., Cell Stem Cell 5, 584-595 (2009)), y mejorar la eficiencia de la reprogramación (Shi y col., Cell Stem Cell 2, 525-528 (2008a); Shi y col., Cell Stem Cell 3, 568-574 (2008b); Huangfu y col., Nat Biotechnol 26, 795-797 (2008a); Huangfu y col., Nat Biotechnol 26, 1269-1275 (2008b); Silva y col., Plos Bio 6, e253. doi: 10.1371/journal. pbio. 0060253 (2008); Lyssiotis y col., PNAS 106, 8912-8917 (2009); Ichida y col., Cell Stem Cell 5, 491-503 (2009); Maherali, N., Hochedlinger, K., Curr Biol 19, 1718-1723 (2009b); Esteban y col., Cell Stem Cell 6, 71-79 (2010); Feng y col., Cell Stem Cell 4, 301-312 (2009)). Sin embargo, los métodos existentes aún no han dado cuenta de una solución de alto rendimiento para la fabricación de células pluripotentes de grado industrial o clínico, es decir, poblaciones de células pluripotentes libres de transgenes clonales con pluripotencia homogénea, sin diferenciación espontánea significativa y con la capacidad de cultivar y expandir la población celular utilizando un pasaje enzimático de una sola célula en sistemas de cultivo de células alimentadoras definidos y libres de xeno.
[0498] Las plataformas de cultivo contempladas en la presente memoria son útiles, en parte, para la producción de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) de alto grado. En una realización, se reprograman células no pluripotentes en pluripotencia y se cultivan para mantener la pluripotencia. En otra realización, las iPSC se cultivan hasta la pluripotencia del estado fundamental.
[0500] En diversas realizaciones, las plataformas de cultivo permiten un método de reprogramación libre de transgén y/o huella. Las plataformas de cultivo contempladas en la presente memoria proporcionan una reprogramación episomal altamente eficiente con una reducción significativa en el tiempo y el esfuerzo necesarios para la generación de hiPSC. Sin querer limitarse a ninguna teoría en particular, se contempla que tanto al bloquear las señales de diferenciación al principio del proceso de reprogramación como al promover la transición del mesénquima al epitelio (MET) a través de la inhibición de moléculas pequeñas de vías específicas (MEK, ERK, TGFp y ROCK), la eficiencia de la generación de hiPSC mejora significativamente utilizando vectores episomales, en FF y sistemas de cultivo de células individuales.
[0501] En una realización, la plataforma de cultivo comprende reprogramar una o más células no pluripotentes a un estado pluripotente que comprende aumentar la expresión de OCT4 endógena en la célula. La expresión de OCT4 endógena en la célula puede aumentarse mediante la introducción de uno o más polinucleótidos, polipéptidos o inductores de molécula pequeña de la expresión de OCT4. En una realización, la introducción de un polinucleótido que codifica OCT4 o un polipéptido de OCT4 en una célula es suficiente para inducir la expresión endógena de OCT4 en la célula.
[0502] En una realización, la plataforma de cultivo comprende reprogramar una o más células no pluripotentes que comprende introducir uno o más polinucleótidos que codifican uno o más factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2, NA<n>O<g>, Klf4, LIN28, C-MYC y SV40LT en la una o más células no pluripotentes. En otra realización, la plataforma de cultivo comprende reprogramar una o más células no pluripotentes que comprende introducir uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2, NANOG, Klf4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, Klf2, Klf5, L-MYC, N-MYC, LRH1 y UTF1 en la una o más células no pluripotentes.
[0503] En una realización, la plataforma de cultivo comprende reprogramar una o más células no pluripotentes que comprende introducir uno o más polinucleótidos que codifican uno o más factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, NANOG, ESRRB, ECAT1 y UTF1 en la una o más células no pluripotentes. En otra realización, la plataforma de cultivo comprende reprogramar una o más células no pluripotentes que comprende introducir uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, NANOG, ESRRB, ECAT1 y UTF1 en la una o más células no pluripotentes.
[0505] Como se utiliza en la presente memoria, en realizaciones particulares, el término “ introducir” se refiere a un proceso que comprende poner en contacto una célula con un polinucleótido, polipéptido o molécula pequeña. Una etapa de introducción también puede comprender microinyección de polinucleótidos o polipéptidos en la célula, el uso de liposomas para administrar polinucleótidos o polipéptidos en la célula, o fusión de polinucleótidos o polipéptidos a restos permeables a las células para introducirlos en la célula.
[0507] En determinadas realizaciones, uno o más polinucleótidos que codifican 1, 2, 3, 4, 5 o más copias de uno o más de los factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2, NANOG, Klf4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT 1, SOX1, SOX3, Klf2, Klf5, L-MYC, N-MYC, LRH1 y UTF1 pueden introducirse en una célula no pluripotente para reprogramar la célula. El número de copias de cada factor de reprogramación introducido en la célula puede ser el mismo o diferente en cualquier combinación adecuada para lograr la pluripotencia del estado fundamental como se contempla en la presente memoria.
[0509] En una realización, uno o más polinucleótidos que codifican 1, 2, 3, 4, 5 o más copias de uno o más de los factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2 y NANOG se introducen en la célula no pluripotente.
[0511] En una realización, uno o más polinucleótidos que codifican 1, 2, 3, 4, 5 o más copias de cada uno de OCT4, SOX2 y NANOG se introducen en la célula no pluripotente.
[0513] En una realización, uno o más polinucleótidos que codifican 1,2, 3, 4, 5 o más copias de cada uno de OCT4 y SOX2 se introducen en la célula no pluripotente.
[0515] En una realización, uno o más polinucleótidos que codifican 1, 2, 3, 4, 5 o más copias de OCT4 se introducen en la célula no pluripotente.
[0517] En una realización, se introducen uno o más polinucleótidos que codifican 2 copias de OCT4, 2 copias de SOX2 y 2 copias de NANOG en la célula no pluripotente, introduciéndose SV40LT opcionalmente en la célula no pluripotente.
[0518] En otra realización, uno o más polinucleótidos que codifican 3 copias de OCT4, 2 copias de SOX2, una copia de NANOG y una copia de UTF1 se introducen en la célula no pluripotente.
[0520] En diversas realizaciones ilustrativas, una plataforma de cultivo que comprende reprogramar una célula no pluripotente comprende introducir de 1 a 5 copias de un polinucleótido que codifica OCT4; 1 a 3 copias de un polinucleótido que codifica SOX2 y, opcionalmente, 1 a 2 copias de un polinucleótido que codifica NANOG. Los polinucleótidos pueden introducirse en la célula como cualquier combinación de uno o más polinucleótidos más grandes. En un ejemplo no limitativo, uno o más polinucleótidos que codifican de 1 a 4 copias de OCT4, 1 o 2 copias de SOX2 y 1 copia de NANOG se introducen en una célula no pluripotente. En otro ejemplo no limitativo, la reprogramación de células no pluripotentes al estado pluripotente comprende introducir un primer polinucleótido que codifica 2 copias de OCT4, un segundo polinucleótido que codifica 1 copia de OCT4 y 1 copia de SOX2; y un tercer polinucleótido que codifica 1 copia de OCT4, 1 copia de SOX2 y 1 copia de NANOG, en las células no pluripotentes. En un ejemplo no limitativo adicional, la reprogramación de una o más células no pluripotentes comprende introducir un primer polinucleótido que codifica 2 copias de OCT4 y un segundo polinucleótido que codifica 1 copia de OCT4, 1 copia de SOX2 y 1 copia de NANOG, en la una o más células no pluripotentes. En otro ejemplo no limitativo adicional, un primer polinucleótido que codifica 2 copias de OCT4 y un segundo polinucleótido que codifica 1 copia de OCT4 y 1 copia de SOX2 se introducen en la una o más células no pluripotentes para producir una célula pluripotente.
[0522] En una realización, un único vector que comprende un polinucleótido que comprende cualquier número y combinación de los factores de reprogramación contemplados en la presente memoria se introduce en una célula no pluripotente y es suficiente para reprogramar la célula a un estado pluripotente.
[0524] En una realización, uno o más vectores que comprenden 1,2, 3, 4, 5 o más polinucleótidos que comprenden cualquier número y combinación de los factores de reprogramación contemplados en la presente memoria se introducen en una célula no pluripotente y son suficientes para reprogramar la célula a un estado pluripotente.
[0526] En una realización preferida, uno o más vectores que comprenden el uno o más polinucleótidos contemplados en la presente memoria para reprogramar una célula no somática se utilizan para introducir el uno o más polinucleótidos en la célula y son suficientes para reprogramar la célula.
[0527] En la realización más preferida, uno o más vectores episomales que comprenden el uno o más polinucleótidos contemplados en la presente memoria para reprogramar una célula no somática se utilizan para introducir el uno o más polinucleótidos en la célula y son suficientes para reprogramar la célula. Las células pluripotentes que muestran diferenciación espontánea reducida y/o el estado fundamental pueden fabricarse con vectores episomales como se contempla en la presente memoria, y a continuación cultivarse hasta la pérdida del vector para obtener células pluripotentes que muestran diferenciación espontánea reducida y/o el estado fundamental que no comprenden ácidos nucleicos exógenos que codifican factores de reprogramación.
[0529] Se contempla además que cuando el polinucleótido o vector que lo comprende un polinucleótido que codifica al menos dos factores de reprogramación o al menos dos copias de un factor de reprogramación, el polinucleótido comprende una secuencia IRE<s>o un polinucleótido que codifica una secuencia polipeptídica de autoescisión entre cada uno de los factores de reprogramación como se contempla en la presente memoria.
[0531] En algunos aspectos, la eficiencia de la reprogramación de células no pluripotentes aumenta mediante la selección de la expresión ectópica de uno o más polinucleótidos de factores de reprogramación después de que los polinucleótidos de factores de reprogramación se introducen en las células no pluripotentes. Dicha selección puede tener lugar, por ejemplo, uniendo uno o más de los polinucleótidos del factor de reprogramación a un marcador seleccionable, introduciendo los polinucleótidos del factor de reprogramación y el marcador seleccionable en las células no pluripotentes, y seleccionando aquellas células que expresan el marcador seleccionable, donde la selección identifica células que tienen una mayor eficiencia de reprogramación en relación con las células que carecen de expresión del marcador y sus polinucleótidos del factor de reprogramación asociados. Un experto en la técnica apreciará que en realizaciones particulares se puede utilizar cualquier marcador seleccionable que identifique la expresión de los polinucleótidos de reprogramación introducidos por la célula no pluripotente.
[0533] Un ejemplo no limitativo de dicho marcador seleccionable incluye, aunque no de forma limitativa, genes de resistencia a antibióticos tales como resistencia a puromicina. Los marcadores seleccionables pueden estar vinculados a uno o más de los siguientes polinucleótidos de factor de reprogramación: OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1 y UTF1. En algunas realizaciones, se introduce una combinación específica de polinucleótidos del factor de reprogramación como un vector policistrónico, estando el marcador seleccionable unido a la combinación específica de polinucleótidos del factor de reprogramación. La combinación específica de polinucleótidos de factor de reprogramación puede codificar dos o más copias de los polinucleótidos de factor de reprogramación descritos en la presente memoria.
[0534] En una realización no limitativa, el vector policistrónico codifica dos o más copias de un polinucleótido OCT4 unido a un marcador seleccionable, tal como un gen que codifica la resistencia a la puromicina.
[0536] En algunos aspectos, un vector policistrónico que codifica uno o más polinucleótidos de factor de reprogramación y un marcador seleccionable se introducen en células no pluripotentes además de uno o más polinucleótidos de factor de reprogramación separados, en donde la selección de células que expresan el marcador seleccionable produce una población de células que tienen mayor eficiencia de reprogramación que las células que carecen de expresión del marcador seleccionable.
[0538] En un ejemplo no limitativo de este proceso de selección, los polinucleótidos OCT4, NANOG y SOX2 se introducen en células no pluripotentes además de un vector policistrónico que codifica dos o más copias de OCT4 unidas a un gen de resistencia a la puromicina. La selección posterior de células no pluripotentes que expresan el marcador seleccionable identifica células no pluripotentes con mayor eficiencia de reprogramación en relación con las células no pluripotentes que no expresan el marcador seleccionable. Las células seleccionadas pueden tener una eficiencia de reprogramación de al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 30 % o al menos 40 %.
[0539] Las moléculas pequeñas a menudo se incluyen en las etapas de reprogramación de realizaciones preferidas particulares. Sin querer limitarse a ninguna teoría en particular, se contempla que la inclusión de inhibidores de moléculas pequeñas de diversas vías de diferenciación aumenta la eficiencia y la cinética de la reprogramación. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, las plataformas de cultivo que comprenden la reprogramación de células no pluripotentes comprenden introducir uno o más factores de reprogramación en las células como se contempla en la presente memoria y poner en contacto las células con un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un inhibidor de TGFpR y un inhibidor de ROCK.
[0541] Las mejoras en la eficiencia de la reprogramación se pueden medir mediante (1) una disminución en el tiempo requerido para la reprogramación y generación de células pluripotentes (p. ej., acortando el tiempo para generar células pluripotentes en al menos un día en comparación con un proceso similar o igual sin la molécula pequeña), o alternativamente, o en combinación, (2) un aumento en el número de células pluripotentes generadas por un proceso particular(p. ej.,aumentando el número de células reprogramadas en un período de tiempo determinado en al menos 10 %, 30 %, 50 %, 100 %, 200 %, 500 %, etc. en comparación con un proceso similar o igual sin la molécula pequeña). En algunas realizaciones, se observa una mejora de 2 a 20 veces en la eficiencia de reprogramación. En algunas realizaciones, la eficiencia de reprogramación se mejora en más de 20 veces. En algunas realizaciones, se observa una mejora de más de 100 veces en la eficiencia con respecto al método sin el agente de reprogramación de moléculas pequeñas(p. e j,un aumento de más de 100 veces en la cantidad de células pluripotentes generadas).
[0543] En una realización, una plataforma de cultivo contemplada en la presente memoria comprende reprogramar células no pluripotentes mediante la introducción de uno o más factores de reprogramación en las células como se contempla en la presente memoria y poner en contacto las células con un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de TGFpR, y opcionalmente un inhibidor de ROCK.
[0545] En una realización preferida, una plataforma de cultivo contemplada en la presente memoria comprende reprogramar células no pluripotentes mediante la introducción de uno o más factores de reprogramación en las células como se contempla en la presente memoria y poner en contacto las células con un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un inhibidor de TGFpR y un inhibidor de ROCK.
[0547] En una realización más preferida, una plataforma de cultivo contemplada en la presente memoria comprende reprogramar células no pluripotentes mediante la introducción de uno o más factores de reprogramación en las células como se contempla en la presente memoria y poner en contacto las células con un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un inhibidor de TGFpR y un inhibidor de ROCK, donde el inhibidor de ROCK es tiazovivina.
[0549] Sin embargo, para permitir el cultivo a largo plazo de células pluripotentes en sistemas de cultivo de pasajes enzimáticos y sin células alimentadoras con diferenciación espontánea reducida o no significativa o para inducir y/o mantener la pluripotencia del estado fundamental, las iPSC requieren un cultivo posterior en un medio de cultivo celular que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK y, opcionalmente, un inhibidor de Rho quinasa (ROCK), donde el medio de cultivo celular no comprende, o carece de, un inhibidor de las vías de señalización de TGFp/activina, incluidos los inhibidores del receptor de TGFp (TGFpR) y los inhibidores de ALK5, como se contempla en la presente memoria. Sin querer limitarse a ninguna teoría en particular, se contempla que el cultivo a largo plazo de células pluripotentes con un inhibidor de TGFpR/ALK5 conduce a la diferenciación espontánea de las iPSC sin transgén cultivadas y, en última instancia, a la pérdida de la pluripotencia del estado fundamental.
[0551] En varias realizaciones, se emplea una plataforma de cultivo de dos etapas para reprogramar de forma estable las células somáticas para lograr una diferenciación espontánea reducida en el cultivo, incluida la pluripotencia del estado fundamental. En determinadas realizaciones, una célula no pluripotente se reprograma mediante cualquier método adecuado descrito en la técnica y, posteriormente, la célula somática reprogramada se cultiva para lograr una diferenciación espontánea reducida en el cultivo cultivando la célula en un medio que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de Rho quinasa (ROCK), donde el medio carece de un inhibidor de TGFpR/ALK5. En algunas realizaciones, la célula somática reprogramada se cultiva para proporcionar células pluripotentes en estado fundamental.
[0553] En determinadas realizaciones, una célula no pluripotente se reprograma mediante los métodos descritos en la presente memoria y, posteriormente, la célula somática reprogramada se cultiva hasta un estado fundamental estable de pluripotencia cultivando la célula en un medio que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de Rho quinasa (ROCK), en donde el medio carece de un inhibidor de TGFpR/ALK5.
[0555] En algunas realizaciones, una célula no pluripotente se reprograma introduciendo uno o más factores de reprogramación y cultivando la célula en un medio que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK, un inhibidor de Rho quinasa (ROCK) y un inhibidor de TGFpR/ALK5, y posteriormente, la célula somática reprogramada se cultiva para proporcionar células con diferenciación espontánea reducida cultivando la célula en un medio que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de Rho quinasa (ROCK), en donde el medio carece de un inhibidor de TGFpR/ALK5.
[0557] En algunas realizaciones, una célula no pluripotente se reprograma introduciendo uno o más factores de reprogramación y cultivando la célula en un medio que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK, un inhibidor de Rho quinasa (ROCK) y un inhibidor de TGFpR/ALK5, y posteriormente, la célula somática reprogramada se cultiva a un estado fundamental estable de pluripotencia cultivando la célula en un medio que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de Rho quinasa (ROCK), en donde el medio carece de un inhibidor de TGFpR/ALK5.
[0559] En realizaciones preferidas, una célula no pluripotente se reprograma mediante la introducción de uno o más factores de reprogramación y el cultivo de la célula en un medio que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK, un inhibidor de Rho quinasa (ROCK) y un inhibidor de TGFpR/ALK5, y posteriormente, la célula somática reprogramada se cultiva a un estado fundamental estable de pluripotencia mediante el cultivo de la célula en un medio que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de Rho quinasa (ROCK), en donde el medio carece de un inhibidor de TGFpR/ALK5 y en donde no hay expresión residual significativa del transgén de reprogramación.
[0561] En una realización, una célula no pluripotente se reprograma mediante la introducción de uno o más factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2, NANOG, Klf4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1 y UTF1 como se describe en otra parte de la presente memoria y el cultivo de la célula en un medio que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK, un inhibidor de Rho quinasa (ROCK) y un inhibidor de TGFpR/ALK5, y posteriormente, la célula somática reprogramada se cultiva en un medio que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de Rho quinasa (ROCK), en donde el medio carece de un inhibidor de TGFpR/ALK5.
[0563] En una realización preferida, una célula no pluripotente se reprograma mediante la introducción de uno o más factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2, NANOG, Klf4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1 y UTF1 como se describe en otra parte de la presente memoria y el cultivo de la célula en un medio que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK, un inhibidor de Rho quinasa (ROCK) y un inhibidor de TGFpR/ALK5, y posteriormente, la célula somática reprogramada se cultiva en un medio que comprende un inhibidor de GSK-3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de Rho quinasa (ROCK) donde el inhibidor de Rock es tiazovivina, en donde el medio carece de un inhibidor de TGFpR/ALK5.
[0565] En diversas realizaciones, se proporcionan métodos para fabricar células pluripotentes con diferenciación espontánea reducida y/o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) por el estado fundamental utilizando las plataformas de cultivo contempladas en la presente memoria.
[0567] En determinadas realizaciones, las células pluripotentes con diferenciación espontánea reducida y/o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) por el estado fundamental se fabrican utilizando un material de partida que comprende una o más células madre no pluripotentes o parcialmente pluripotentes y cultivando la una o más células madre pluripotentes o parcialmente pluripotentes en un medio de cultivo que no comprende ningún inhibidor de TGFpR. El material de partida puede obtenerse o crearse. Por ejemplo, las células madre no pluripotentes o parcialmente pluripotentes pueden proporcionarse de un proveedor comercial u otra fuente o podrían obtenersede novo:las células no pluripotentes también podrían aislarse de un tejido u órgano; y las células parcialmente pluripotentes también podrían generarse reprogramando células somáticas o células madre adultas. En algunas realizaciones, las células madre embrionarias pluripotentes, o células pluripotentes obtenidas por transferencia nuclear somática, pueden inducirse para lograr la pluripotencia del estado fundamental utilizando los medios de cultivo y las plataformas descritas en la presente memoria.
[0569] En determinadas realizaciones, una población de una o más IPSC puede comprender células somáticas reprogramadas o células madre adultas reprogramadas. En determinadas realizaciones, las IPSC pueden generarse mediante cualquier método conocido, ya sea realizando el método u obteniendo las IPSC generadas por el método.
[0570] Los métodos ilustrativos para generar las iPSC incluyen, aunque no de forma limitativa: aumentar la expresión de OCT4 endógena en células no pluripotentes; introducir uno o más polinucleótidos, opcionalmente en una o más copias, que codifican uno o más factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2, NANOG, Klf4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1 y UTF1 en la una o más células no pluripotentes; o introducir uno o más polinucleótidos, opcionalmente en una o más copias, que codifican uno o más factores de reprogramación seleccionados del grupo que consiste en: OCT4, SOX2 y NANOG en la una o más células no pluripotentes. Los métodos para generar IPSC pueden comprender además poner en contacto la una o más células no pluripotentes o células parcialmente pluripotentes con un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de TGFpR, y opcionalmente un inhibidor de ROCK para producir la una o más iPSC.
[0572] En determinadas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de ROCK.
[0574] En realizaciones preferidas, el medio de cultivo celular comprende un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; y un inhibidor de ROCK, donde el inhibidor de ROCK es tiazovivina.
[0576] En realizaciones particulares, el cultivo de la una o más células pluripotentes,p. ej.IPSC, en el medio de cultivo celular mantiene o induce un estado fundamental de pluripotencia, viabilidad, cariotipo normal, estabilidad genómica y tasa disminuida de diferenciación espontánea que puede mantenerse durante al menos 5 pasajes, al menos 10 pasajes, al menos 50 pasajes, al menos 100 pasajes o más, incluyendo cualquier número intermedio de pasajes.
[0578] F. Caracterización de células pluripotentes
[0580] Las células pluripotentes fabricadas utilizando las plataformas de cultivo contempladas en la presente memoria pueden comprender además la selección o validación del producto celular pluripotente, que incluye, por ejemplo, células pluripotentes en estado fundamental o células pluripotentes con diferenciación espontánea reducida. Las células pluripotentes se pueden seleccionar y/o validar después de la reprogramación y el cultivo posterior con las composiciones y métodos contemplados en la presente memoria, o después de que las células pluripotentes se hayan trasferido a los métodos de cultivo contemplados en la presente memoria, si las células pluripotentes no se reprogramaron. La pluripotencia de las células puede caracterizarse y/o seleccionarse en función de cambios morfológicos, moleculares y/o bioquímicos relevantes y detectables asociados con la pluripotencia.
[0582] Las características específicas de la pluripotencia celular que se pueden monitorizar, por separado o en combinación, al evaluar la potencia de una célula incluyen, aunque no de forma limitativa, expresión génica, metilación y característicasin vivoein vitrotales como: i) morfología de células madre pluripotentes que es redonda; ii) expresión de marcadores de células madre pluripotentes que incluyen SSEA3/4 (células madre pluripotentes humanas); TRA 1-60/81; TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/prominina, CD140a, CD56, CD73, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30, SSEA5, CD90 y/o CD50, y combinaciones de los anteriores; iii) formación de teratomas de células madre pluripotentes; iv) formación de cuerpos embrioides y diferenciación trilinajein vitro:y v) reactivación del cromosoma X inactivo. En determinadas realizaciones, se utiliza un subconjunto de cualquiera de las características anteriores para monitorizar la potencia celular. En una realización, las células pluripotentes se caracterizan por tener una morfología de colonia redonda, expresión de SSEA4, TRA1-81 y OCT4, y la capacidad de formar cuerpos embrioides y teratomas.
[0584] En otra realización, las células pluripotentes que tienen diferenciación espontánea reducida en cultivoin vitropueden identificarse mediante una firma de expresión génica que comprende al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % de disminución en la expresión de uno o más de los siguientes genes marcadores de diferenciación en comparación con células pluripotentes cultivadas en presencia de un inhibidor de TGFpR: FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1 D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, gen T (Brachyury) y ZIC1.
[0586] En una realización, las células pluripotentes que tienen una diferenciación espontánea reducida se caracterizan por la disminución de la expresión de uno o más genes marcadores de diferenciación, que incluyen, aunque no de forma limitativa: gen T, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2, y TUJ1. En determinadas realizaciones, las células pluripotentes que tienen diferenciación espontánea reducida pueden identificarse mediante una firma de expresión génica que comprende al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % de disminución en la expresión de uno o más genes marcadores de diferenciación (p. ej., gen T, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2, TUJ1) en comparación con células pluripotentes cultivadas en presencia de un inhibidor de TGFpR. En otras determinadas realizaciones, las células pluripotentes que tienen diferenciación espontánea reducida pueden identificarse mediante una firma de expresión génica que comprende al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % de disminución en la expresión de uno o más genes marcadores de diferenciación (p. ej., gen T, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2, TUJ1).
[0588] En determinadas realizaciones, las células pluripotentes en estado fundamental han reprimido significativamente la expresión de Xist y la expresión de marcadores tempranos de células diferenciadas,p. ej.,Foxa2, Sox17 y Brachyury, mientras que las células pluripotentes cultivadas convencionales muestran solo una modesta represión de la expresión de Xist y una expresión significativa de marcadores de diferenciación temprana.
[0590] En determinadas realizaciones, las células pluripotentes en estado fundamental conservan características de pluripotencia en estado fundamental para múltiples pasajes celulares, tales como, por ejemplo, al menos 1,3, 5, 7, 10, 15, 20 o más pasajes.
[0592] G. Polinucleótidos
[0594] En diversas realizaciones ilustrativas, la presente invención contempla, en parte, los polinucleótidos, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos y polipéptidos de fusión contemplados en la presente memoria y las composiciones que los comprenden. En diversas realizaciones ilustrativas, la presente invención contempla, en parte, la reprogramación de células no pluripotentes con polinucleótidos que codifican una o más copias de al menos un factor de reprogramación. Los factores de reprogramación para su uso con las plataformas de cultivo descritas en la presente memoria incluyen, aunque no de forma limitativa: OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, C-MYC, SV40LT, hTERT, SALL4, GLIS, ESRRB, DPPA2, ECAT1, SOX1, SOX3, KLF2, KLF5, L-MYC, N-MYC, LRH1 Y UTF1. En realizaciones preferidas, un polinucleótido comprende una secuencia de un factor de reprogramación como se establece en la presente memoria.
[0596] Como se utiliza en la presente memoria, el término “gen” puede referirse a una secuencia de polinucleótidos que comprende potenciadores, promotores, intrones, exones y similares. En determinadas realizaciones, el término “gen” se refiere a una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido, independientemente de si la secuencia de polinucleótidos es idéntica a la secuencia genómica que codifica el polipéptido.
[0598] Un “ polinucleótido aislado” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un polinucleótido que se ha purificado a partir de las secuencias que lo flanquean en un estado de origen natural, p. ej., un fragmento de ADN que se ha eliminado de las secuencias que normalmente son adyacentes al fragmento. En realizaciones particulares, un “polinucleótido aislado” se refiere a un ADN complementario (ADNc), un ADN recombinante u otro polinucleótido que no existe en la naturaleza y que ha sido fabricado por la mano del hombre.
[0600] En determinadas realizaciones, uno o más polinucleótidos pueden disponerse en cualquier orden adecuado dentro de un polinucleótido más grande, tal como un vector. En realizaciones preferidas, el vector es un vector episomal.
[0601] Los polinucleótidos contemplados en la presente memoria, independientemente de la longitud de la secuencia codificante en sí, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como secuencias de control de la expresión, promotores y/o potenciadores, regiones no traducidas (UTR), secuencias de Kozak, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, múltiples sitios de clonación, sitios de entrada ribosómica interna (IRES), sitios de reconocimiento de recombinasa (p. ej., sitios LoxP, FRT y Att), codones de terminación, señales de terminación transcripcional y polinucleótidos que codifican polipéptidos de autoescisión, etiquetas de epítopo, como se describe en otra parte de la presente memoria o como se conoce en la técnica, de modo que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que se puede emplear un fragmento de polinucleótido de casi cualquier longitud, con la longitud total preferiblemente limitada por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante previsto.
[0603] Los polinucleótidos se pueden preparar, manipular y/o expresar utilizando cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas conocidas y disponibles en la técnica. Para expresar un polipéptido deseado, se puede insertar una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en el vector apropiado. Ejemplos de vectores son plásmidos, secuencias de replicación autónoma y elementos transponibles. Los vectores ilustrativos adicionales incluyen, sin limitación, plásmidos, fagémidos, cósmidos, cromosomas artificiales tales como cromosoma artificial de levadura (YAC), cromosoma artificial bacteriano (BAC) o cromosoma artificial derivado de P1 (PAC), bacteriófagos tales como fago lambda o fago M13 y virus animales. Los ejemplos de categorías de virus animales útiles como vectores incluyen, sin limitación, retrovirus (incluyendo lentivirus), adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus (p. ej., virus del herpes simple), poxvirus, baculovirus, papilomavirus y papovavirus (p. ej., SV40). Los ejemplos de vectores de expresión son vectores pClneo (Promega) para la expresión en células de mamífero; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ y pLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) para la transferencia y expresión génica mediada por lentivirus en células de mamífero. En determinadas realizaciones, las secuencias codificantes de polipéptidos descritos en la presente memoria pueden ligarse en dichos vectores de expresión para la expresión de los polipéptidos en células de mamífero.
[0604] En determinadas realizaciones, el vector es un vector episomal o un vector que se mantiene extracromosómicamente. Como se utiliza en la presente memoria, el término “episomal” se refiere a un vector que es capaz de replicarse sin integración en el ADN cromosómico del huésped y sin pérdida gradual de una célula huésped en división, lo que también significa que dicho vector se replica extracromosómica o episómicamente. El vector se modifica para albergar la secuencia que codifica el origen de la replicación del ADN u “ori” de un virus del herpes linfotrófico o un virus del herpes gamma, un adenovirus, SV40, un virus del papiloma bovino o una levadura, específicamente un origen de replicación de un virus del herpes linfotrófico o un virus del herpes gamma correspondiente a oriP de EBV. En un aspecto particular, el virus del herpes linfotrófico puede ser el virus de Epstein Barr (EBV), el virus del herpes del sarcoma de Kaposi (KSHV), el virus del herpes saimiri (HS) o el virus de la enfermedad de Marek (MDV). El virus de Epstein Barr (EBV) y el virus del herpes del sarcoma de Kaposi (KSHV) también son ejemplos de un herpesvirus gamma. Típicamente, la célula hospedadora comprende la proteína transactivadora de replicación viral que activa la replicación.
[0606] “Secuencias de control de la expresión” , “elementos de control” o “secuencias reguladoras” presentes en un vector de expresión son aquellas regiones no traducidas del vector origen de replicación, casetes de selección, promotores, potenciadores, intrones de señales de inicio de la traducción (secuencia Shine Dalgarno o secuencia Kozak), una secuencia de poliadenilación, regiones no traducidas 5' y 3' - que interactúan con las proteínas celulares huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Dichos elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema vectorial y del huésped utilizado, se puede utilizar cualquier cantidad de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluidos promotores ubicuos y promotores inducibles.
[0608] El término “ unido operativamente” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. En una realización, el término se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de la expresión (tal como un promotor y/o potenciador) y una segunda secuencia polinucleotídica, en donde la secuencia de control de la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
[0610] Secuencias de control de expresión generalizadas ilustrativas para su uso en realizaciones particulares de la invención incluyen, aunque no de forma limitativa, un promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV), un virus del mono viral 40 (SV40)(p. e j,temprano o tardío), promotor de LTR del virus de la leucemia murina (MoMLV) de Moloney, un promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), un promotor del virus del herpes simple (HSV) (timidina quinasa), promotores H5, P7.5 y P11 del virus vaccinia, un promotor del factor de elongación 1 -alfa (EF1a), respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1), ferritina H (FerH), ferritina L (FerL), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), factor de iniciación de la traducción eucariota 4A1 (EIF4A1), proteína 5 de choque térmico 70kDa (HSPA5), proteína de choque térmico 90kDa beta, miembro 1 (HSP90B1), proteína de choque térmico 70kDa (HSP70), pkinesina (p-KIN), el locus humano ROSA 26 (Irions y col., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), un promotor de ubiquitina C (UBC), un promotor de fosfoglicerato quinasa-1 (PGK), un promotor de citomegalovirus/p-actina de pollo (CAG) y un promotor de p-actina.
[0612] Los ejemplos ilustrativos de promotores/sistemas inducibles incluyen, aunque no de forma limitativa, promotores inducibles por esteroides tales como promotores para genes que codifican receptores de glucocorticoides o estrógenos (inducibles por tratamiento con la hormona correspondiente), promotor de metalotionina (inducible por tratamiento con diversos metales pesados), promotor MX-1 (inducible por interferón), el sistema regulable por mifepristona “ GeneSwitch” (Sirin y col., 2003, Gene, 323:67), el interruptor génico inducible por cumato (WO 2002/088346), sistemas reguladores dependientes de tetraciclina, etc.
[0614] La expresión condicional también se puede lograr mediante el uso de una ADN recombinasa específica del sitio. Según determinadas realizaciones de la invención, los polinucleótidos comprenden al menos uno (típicamente dos) sitio(s) para la recombinación mediada por una recombinasa específica del sitio. Como se utiliza en la presente memoria, los términos “ recombinasa” o “ recombinasa específica de sitio” incluyen proteínas de escisión o de integración, enzimas, cofactores o proteínas asociadas que están implicadas en reacciones de recombinación que implican uno o más sitios de recombinación(p. e j,dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más), que pueden ser proteínas de tipo salvaje (véase Landy, Current Opinion en Biotechnology 3:699-707 (1993)), o mutantes, derivados (p. ej., proteínas de fusión que contienen las secuencias de proteínas de recombinación o fragmentos de las mismas), fragmentos y variantes de los mismos. Los ejemplos ilustrativos de recombinasas adecuadas para su uso en realizaciones particulares de la presente invención incluyen, aunque no de forma limitativa: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, OC31, Cin, Tn3 resolvasa, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 y ParA.
[0616] En realizaciones particulares, los polinucleótidos contemplados en la presente memoria incluyen uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos. En realizaciones particulares, para lograr una traducción eficiente de cada uno de la pluralidad de polipéptidos, las secuencias de polinucleótidos pueden separarse por una o más secuencias de IRES o secuencias de polinucleótidos que codifican polipéptidos autoescindibles. Como se utiliza en la presente memoria, un “sitio de entrada al ribosoma interno” o “ IRES” se refiere a un elemento que promueve la entrada directa del ribosoma interno al codón de iniciación, tal como ATG, de un cistrón (una región codificante de proteínas), lo que conduce a la traducción independiente de caperuza del gen. Véase, p. ej., Jackson y col., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) y Jackson y Kaminski. 1995. RNA 1 (10):985-1000. Los ejemplos de IRES generalmente empleados por los expertos en la técnica incluyen los descritos en la patente US-6.692.736. Los ejemplos adicionales de “ IRES” conocidos en la técnica incluyen, aunque no de forma limitativa, IRES obtenibles a partir de picornavirus (Jackson y col., 1990).
[0618] H. Polipéptidos
[0620] La presente invención contempla, en parte, composiciones que comprenden polipéptidos, polipéptidos de fusión y vectores que expresan polipéptidos. En realizaciones preferidas, un polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la presente memoria. “ Polipéptido” , “ fragmento de polipéptido” , “péptido” y “ proteína” se utilizan indistintamente, salvo que se especifique lo contrario, y según el significado convencional, es decir, como una secuencia de aminoácidos. En una realización, un “ polipéptido” incluye polipéptidos de fusión y otras variantes. Los polipéptidos se pueden preparar utilizando cualquiera de una variedad de técnicas recombinantes y/o sintéticas bien conocidas. Los polipéptidos no se limitan a una longitud específica,p. ej.,pueden comprender una secuencia de proteína de longitud completa, un fragmento de una proteína de longitud completa o una proteína de fusión, y pueden incluir modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural.
[0621] Un “péptido aislado” o un “polipéptido aislado” y similares, como se utiliza en la presente memoria, se refieren al aislamiento y/o purificaciónin vitrode una molécula de péptido o polipéptido de un entorno celular, y de asociación con otros componentes de la célula, es decir, no está asociado significativamente con sustanciasin vivo.
[0623] En una realización, cuando se desea la expresión de dos o más polipéptidos, las secuencias de polinucleótidos que los codifican pueden estar separadas por una secuencia IRES como se aborda en otra parte de la presente memoria. En otra realización, dos o más polipéptidos pueden expresarse como una proteína de fusión que comprende una señal de escisión polipeptídica entre cada uno de los dominios polipeptídicos descritos en la presente memoria. Además, el sitio polipeptídico se puede colocar en cualquier secuencia peptídica enlazadora. Los ejemplos de señales de escisión de polipéptidos incluyen sitios de reconocimiento de escisión de polipéptidos tales como sitios de escisión de proteasas, sitios de escisión de nucleasas(p. ej.,sitios de reconocimiento de enzimas de restricción raros, sitios de reconocimiento de ribozimas de autoescisión) y oligopéptidos virales de autoescisión (véase deFelipe y Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26).
[0625] El experto conoce los sitios de escisión de proteasas y péptidos de autoescisión adecuados (véase, p. ej., en Ryan y col., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak y col., (2004) Nature Biotech. 5, 589-594). Los sitios de escisión de proteasa ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, los sitios de escisión de proteasas NIa de potivirus (p. ej., proteasa de virus de grabado de tabaco), proteasas HC de potivirus, proteasas P1 (P35) de potivirus, proteasas NIa de byovirus, proteasas codificadas por ARN-2 de byovirus, proteasas L de aftovirus, proteasas 2A de enterovirus, proteasas 2A de rinovirus, proteasas 3C de picoma, proteasas 24K de comovirus, proteasas 24K de nepovirus, proteasa similar a 3C de RTSV (virus tungroesférico de arroz), proteasa similar a 3C de PYVF (virus de la mancha amarilla de la pastinaca), heparina, trombina, factor Xa y enteroquinasa. Debido a su alta rigurosidad de escisión, se prefieren los sitios de escisión de la proteasa TEV (virus del grabado del tabaco) en una realización, p. ej., EXXYXQ(G/S) (Id. de sec. n.° 29), por ejemplo, ENLYFQG (Id. de sec. n.° 30) y ENLYFQS (Id. de sec. n.° 31), en donde X representa cualquier aminoácido (la escisión por TEV ocurre entre Q y G o Q y S).
[0626] En determinadas realizaciones, el sitio de polipéptido de autoescisión comprende un sitio, secuencia o dominio 2A o similar a 2A (Donnelly y col., 2001. J. Gen. Virol. 82:1027-1041). En una determinada realización, el péptido 2A viral es un péptido 2A de aftovirus, un péptido 2A de potivirus o un péptido 2A de cardiovirus.
[0627] En una realización, el péptido 2A viral se selecciona del grupo que consiste en: un péptido 2A del virus de la fiebre aftosa (FMDV), un péptido 2A del virus de la rinitis equina A (ERAV), un péptido 2A del virus Thosea asigna (TaV), un péptido 2A del teschovirus-1 porcino (PTV-1), un péptido 2A del teilovirus y un péptido 2A del virus de la encefalomiocarditis.
[0628] Tabla 2: Los ejemplos de sitios 2A incluyen las siguientes secuencias:
[0630]
[0632] En realizaciones preferidas, un vector que codifica uno o más polipéptidos de factor de reprogramación comprende uno o más de los mismos o diferentes sitios de escisión de proteasa entre cada uno de los factores de reprogramación. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no a modo de limitación.
[0633] Ejemplos
[0634] Los ejemplos descritos en la presente memoria identificaron una plataforma para la generación, selección y expansión rápida y paralela de hiPSC utilizando inhibidores de la ruta de moléculas pequeñas en composiciones de medios específicos de la etapa. La plataforma apoyó la reprogramación episomal eficiente y acelerada utilizando factores de reprogramación mínimos en un entorno completamente libre de alimentadores. Las hiPSC resultantes estaban libres de transgén, se cultivaban fácilmente y se expandían como células individuales mientras se mantenía una población pluripotente homogénea y genómicamente estable. Las hiPSC generadas o mantenidas en las composiciones de medios contempladas en los ejemplos presentan propiedades asociadas con el estado fundamental de pluripotencia y representan un sistema robusto de alto rendimiento para la fabricación de hiPSC uniformes de grado industrial o clínico.
[0635] Ejemplo 1
[0636] Identificación de una plataforma media para el mantenimiento a largo plazo y la expansión de ipsc
[0637] Visión general
[0638] La mayoría de las líneas hiPSC derivadas de lentivirus en cultivos suplementados con SMC4 mantienen una población homogénea de células indiferenciadas; sin embargo; el silenciamiento del factor de reprogramación transgénico en un subconjunto de líneas mostró varios grados de diferenciación espontánea en cultivo extendido (Figura 1A y B). Por lo tanto, se evaluaron varios componentes del cultivo celular para identificar las condiciones para el mantenimiento de la pluripotencia durante el cultivo continuo de FF y el pasaje enzimático de células individuales independientemente de la expresión transgénica residual. Se identificó un sistema de cultivo de múltiples etapas que se dirige a vías únicas en diferentes etapas del proceso de reprogramación y mantenimiento como un enfoque eficiente y sólido para la generación de hiPSC.
[0640] Resultados
[0642] La inhibición de la ruta de TGFp durante el mantenimiento a largo plazo se identificó como un factor significativo en la diferenciación espontánea de líneas hiPSC con expresión transgénica silenciada (Figura 1C). Una de las líneas celulares de iPSC que se encontró que experimentaba diferenciación espontánea se trasfirió al cultivo en una nueva formulación de medio, medio de mantenimiento de destino (FMM) (Tabla 1). Se eliminó la diferenciación espontánea y se estableció una población homogénea de células positivas para SSEA4/TRA1-81 dentro de 2-3 pasajes (Figura 1A).
[0644] También se comparó la reprogramación lentiviral OCT4/Klf4/SOX2 (OKS) en cultivo convencional (medio hESC en células alimentadoras MEF), medio suplementado con SMC4 en cultivo FF o el FMM recién formulado en cultivo FF (Figura 1D). Diecisiete días después de la inducción de la reprogramación lentiviral, las células positivas para SSEA4/TRA1-81 se seleccionaron mediante FAC y se volvieron a sembrar en SMC4 o FMM para su comparación (Figura 1D). SMC4 mejoró la cinética de la reprogramación y dio como resultado significativamente más células positivas para SSEA4/TRA1 -81 en el día 17 después de la inducción (2,72 % frente a 0,76 % para FMM y 0,10 % para el cultivo convencional; Figura 1D) que la reprogramación con FMM.
[0646] Después de la clasificación inicial, las células se mantuvieron en sus respectivas condiciones durante 10 días, seguido de una segunda selección de citometría de flujo positiva para SSEA4/TRA1-81 (Figura 1D). Los cultivos se mantuvieron durante 9 días adicionales (total de 36 días después de la infección) y se calificaron para las colonias indiferenciadas en función de la coexpresión de OCT4 y NANOG (Figura 1D y 1E). La combinación de la reprogramación inicial en SMC4 seguida de una transición a FMM finalmente dio como resultado más colonias positivas para OCT4/NANOG y una cantidad significativamente reducida de colonias negativas para OCT4/NANOG en relación con el mantenimiento continuo en SMC4 (Figura 1D y 1E). Aunque se detectaron colonias positivas para OCT4/NANOG en cultivos mantenidos exclusivamente en FMM, el número y el tamaño de las colonias parecieron inferiores al enfoque de medios específicos de la etapa.
[0648] Estos resultados muestran que un novedoso sistema de cultivo de múltiples etapas que se dirige a vías únicas en diferentes etapas del proceso de reprogramación y mantenimiento dio como resultado la fabricación eficiente de hiPSC de alta calidad.
[0650] Ejemplo 2
[0652] Plataforma para la fabricación de hipsc sin transgén en un pasaje de célula individual y formato ff
[0654] Visión general
[0656] La eficiencia de los métodos de reprogramación no integrativa que utilizan sistemas de vectores episomales es extremadamente baja (<0,001 %), especialmente en entornos FF (Narsinh y col., 2011; O'Doherty y col., 2013). La inducción episomal se ensayó en un sistema de cultivo de múltiples etapas que incluye dos medios: Se ha demostrado que el medio de reprogramación de destino (FRM) que contiene SMC4 y aditivos del medio mejora la reprogramación y FMM (Figura 2A y Tabla 1).
[0658] Resultados
[0660] Se utilizó un sistema de expresión episomal que consiste en la combinación génica OCT4/SOX2/NANOG/Klf4/LIN28/MYC/SV40LT (OSNKLMT) para transfectar varias células de fibroblastos. Veinticuatro horas después de la inducción de la expresión episomal, el cultivo de reprogramación se trasfiere a FRM para mejorar la cinética de reprogramación. Se observó la formación temprana de colonias dentro de la primera semana y para el día 10, se detectó una gran población de células positivas para SSEA4/TRA1-81 (>1 %) (Figura 8A y 8B). El día 14, el cultivo de reprogramación respaldado por FRM se dividió en medios FRM o FMM. El día 21, se utilizó FACS para identificar células positivas para SSEA4/TRA1-81/CD30 en los cultivos (Figura 8C). El FRM mantuvo los cultivos tanto en células diferenciadas como indiferenciadas, mientras que los cultivos de FMM contenían principalmente células indiferenciadas (figura 8D).
[0662] El rendimiento y la solidez de este enfoque se probaron con fibroblastos y células CD34+ expandidas a partir de volúmenes mínimos de sangre de cordón umbilical de donantes de diferentes edades, géneros y etnia (Figura 9A y 9B). La reprogramación de células somáticas se indujo como se describe en la Figura 2A con el conjunto de combinación de genes episomales OSNKLMT y la citometría de flujo de placa de 96 pocillos clasificada para hiPSC individuales entre los días 16 y 21 (Figura 2B). Se observó una gran población de células positivas para SSEA4-TRA1 -81/CD30 para la mayoría de las líneas probadas. En comparación con un experimento de reprogramación paralela utilizando medio convencional y células alimentadoras, el sistema de medios FRM y FMM dio como resultado un aumento significativo en el número de clones de hiPSC (8,55 % en FRM/FMM frente a 0,02 % en cultivo convencional para la línea de fibroblastos FTC007; Figura 2B y 2C). En promedio, se observaron 22 hiPSC clónales por placa de 96 pocillos para cada línea somática (Figuras 2B, 10A y 10B), incluido el fibroblasto FTC008 que se había observado previamente que era refractario a la reprogramación lentiviral con medio SMC4. Las colonias se confirmaron posteriormente como clones de hiPSC genuinos mediante el análisis de la expresión de marcadores intracelulares y de superficie y qRTPCR directa para NANOG (Figura 2D, 2E y 10C). También se aumentó la eficiencia de la reprogramación utilizando el proceso de clasificación y selección de 96 pocillos (Figura 2E). También se observó una eficiencia de reprogramación similar con el recubrimiento superficial definido de vitronectina (Figura 10D).
[0664] Estos datos mostraron que la plataforma era robusta y reproducible cuando se aplicaba a la reprogramación episomal y permitía realizar múltiples experimentos de reprogramación en paralelo de una manera de alto rendimiento con un esfuerzo mínimo y sin comprometer la calidad del producto final iPSC.
[0666] Ejemplo 3
[0668] Pasaje y expansión a largo plazo de líneas hipsc libres de transgénicos en fmm
[0670] Visión general
[0672] El pasaje a largo plazo y la expansión de hiPSC utilizando la plataforma de medios de múltiples etapas de FRM y FMM se estudió utilizando clones de hiPSC del Ejemplo 2, expandidos como células individuales en cultivo de FF (Figura 3A y 3B).
[0674] Resultados
[0676] Las líneas hiPSC reprogramadas según el Ejemplo 2 perdieron ADN episomal por el pasaje 4-7 y, por lo tanto, pluripotentes independientes de los factores de reprogramación basados en transgén (Figura 3C). Las líneas hiPSC mantuvieron una población homogénea de células indiferenciadas positivas para SSEA4, TRA1 -81, OCT4 y NANOG. Además, estas líneas mantuvieron características pluripotentes (Figura 3F) en ausencia de estrategias de limpieza que se utilizan comúnmente en cultivos pluripotentes (Figura 3D y 3E). Se observó una expansión similar de cultivos de hiPSC uniformes cuando se reemplazó Matrigel con el recubrimiento superficial definido vitronectina durante el cultivo rutinario de pasajes de células individuales (Figura 10E-10G).
[0678] A menudo se detectan anomalías genómicas en líneas de hESC y hiPSC cultivadas como células individuales en un entorno de FF (Laurent y col., 2011; Taapken y col., 2011). El análisis de cariotipo de todas las líneas hiPSC analizadas demostró estabilidad genómica en cultivo FMM (Figura 4A). Además, los clones de hiPSC cultivados de células individuales y FF mantenidos en FMM durante un período prolongado (25-30 pasajes) continuaron manteniendo su perfil indiferenciado y estabilidad genómica sin la necesidad de limpieza o selección del cultivo (Figura 4B).
[0680] Los clones de hiPSC derivados de episomas mantenidos en FMM también dieron lugar fácilmente a los tres linajes somáticos, diferenciaciónin vitroa través de cuerpos embrioides y diferenciaciónin vivopor formación de teratoma (Figura 4C-E).
[0682] Estos datos demostraron que la plataforma de medios de múltiples etapas FRM y FMM permite que los clones de hiPSC libres de transgén se generen y expandan fácilmente en FF y en formato de pasaje enzimático de células individuales mientras se mantiene una población homogénea de células pluripotentes y genómicamente estables.
[0683] Ejemplo 4
[0685] La plataforma multimedia de múltiples etapas permite la reprogramación episomal con genes mínimos
[0687] Visión general
[0689] Un sistema de expresión eficiente libre de huella con la dependencia reducida de oncogenes tales como KLF4, MYC y LIN28 o la necesidad de derribar P53 en el proceso de reprogramación sería de gran valor para las terapias con células madre pluripotentes (Lee y col., 2013; Okita y col., 2011; Yu y col., 2009). Debido a que la plataforma de medios de múltiples etapas demostró ser una plataforma extremadamente eficiente y robusta para la generación y expansión de células hiPSC libres de transgén utilizando factores de reprogramación OSNKLM<t>, la robustez de la plataforma se midió en comparación con el requisito del factor de reprogramación.
[0691] Resultados
[0693] Se construyeron varios casetes de expresión episomal que contenían conjuntos de genes mínimos, incluidos OCT4/NANOG/SOX2 (ONS), OCT4/SOX2 (OS) u OCT4/OCT4 (2xO) en un intento de variar la combinación y la dosificación de la expresión génica (Figura 5A). Se transfectó una línea celular de fibroblastos con combinaciones de OCT4, NANOG, SOX2 y SV40LT y se cultivó utilizando la plataforma FRM/FMM. SV40LT solo no produjo ninguna célula SSEA4/TRA1-81 positiva verdadera en el día 13 de la reprogramación, pero mejoró la supervivencia celular después de la transfección (Figuras 5B y 11A). Las diversas combinaciones de factores de reprogramación dieron como resultado una reprogramación eficiente como lo demuestra la aparición de poblaciones positivas para SSEA4/TRA1-81 al principio del proceso de reprogramación (>0,5 % para OCT4/SOX2/SV40LT y >3,5 % para OCT4/NANOG/SOX2/SV40LT en el día 13; Figura 5B). Los cultivos reprogramados para días adicionales aumentaron significativamente la población positiva para SSEA4/TRA1-81 (>4,0 % para OCT4/SOX2/SV40LT en el día 16; Figura 11B). Sorprendentemente, el porcentaje de células reprogramadas observado fue comparable a los sistemas lentivirales y episomales inducidos que contienen los oncogenes KLF4 y MYC (Figuras 2B, 5B y 11B).
[0695] Se llevaron a cabo varias combinaciones de factores de reprogramación y se trasfirieron al medio FMM antes de la clasificación por citometría de flujo y la selección de clones de hiPSC individuales. De manera similar a la reprogramación episomal de OSNKLMT, las líneas de hiPSC clonales se derivaron fácilmente de combinaciones que contenían genes mínimos OCT4, SOX2 y SV40LT (2xO OS T), así como otras combinaciones (Figura 5C). Los clones de hiPSC que habían perdido transgenes y marcadores de vectores episomales por los pasajes 5-7 se llevaron a cabo para un análisis adicional (Figura 5D). Los clones seleccionados se pasaron continuamente como células individuales en un entorno FF y mantuvieron una población homogénea de células indiferenciadas genómicamente estables y mostraron la capacidad de diferenciarse de manera eficiente en los tres linajes somáticos (Figuras 5E-J).
[0696] En conjunto, estos datos indicaron que las hiPSC se generaron fácilmente por la expresión transitoria de genes de reprogramación mínima en la plataforma de reprogramación basada en citometría de flujo FRM/FMM.
[0698] Ejemplo 5
[0700] La plataforma fmm apoya la pluripotencia del estado fundamental
[0702] Visión general
[0704] Para evaluar más a fondo la plataforma FMM, se compararon las características de expresión génica de las células somáticas reprogramadas por los métodos existentes con las características de expresión génica de las células somáticas reprogramadas utilizando la plataforma FMM contemplada en la presente memoria. Se evaluaron las diferencias de expresión génica entre la molécula pequeña y los cultivos de hiPSC mantenidos convencionalmente (Hanna y col., 2010b; Saha y Jaenisch, 2009).
[0706] Resultados
[0708] En un conjunto de experimentos, se evaluaron los patrones de expresión génica entre el cultivo mediado por moléculas pequeñas y el cultivo convencional. Se generó un clon FTi111 de hiPSC inducido por lentivirus y se mantuvo en cultivo de moléculas pequeñas y se demostró que era pluripotente. El clon se descongeló directamente en diversos entornos de cultivo que incluyen: i) medio convencional con células alimentadoras y ii) medio que contiene inhibidor de molécula pequeña con células alimentadoras o en superficies de FF (Figura 12A y 12B). Las colonias de hiPSC en cultivo convencional solo se recuperaron en presencia de tiazovivina, un inhibidor de ROCK y posteriormente convirtiendo las células recuperadas en cultivo de aglomeración (Figura 12B y 12C). Cada conjunto de condiciones de cultivo demostró una morfología de colonia única (Figura 12D) y un patrón distinto de expresión génica para marcadores pluripotentes (Figura 12E). El cultivo mantenido convencionalmente en células alimentadoras se parecía más a los controles de hESC H1 y HUES9 mantenidos en cultivo convencional que sus cultivos homólogos mantenidos en moléculas pequeñas (Figura 12E). Estos datos mostraron que existen distintos patrones de expresión génica entre el cultivo mediado por moléculas pequeñas y el cultivo convencional.
[0710] También se evaluaron las diferencias en la expresión génica entre hiPSC derivadas utilizando inducción lentiviral y cultivo ESC/alimentador convencional, y líneas derivadas episomales y además entre líneas episomales derivadas con diferentes combinaciones de factores de reprogramación mantenidos en la plataforma FRM/FMM. Se utilizó el análisis de qRT-PCR de alto contenido para cuantificar la expresión génica asociada con la pluripotencia y la diferenciación. La mayoría de los genes de pluripotencia estudiados mostraron patrones de expresión comparables entre hiPSC mantenidos en cultivo FMM o cultivos convencionales que contienen células alimentadoras (Figura 6A). Sin embargo, se observaron diferencias entre las líneas celulares en la evaluación de genes asociados con la diferenciación (Figura 6B). Las hiPSC mantenidas en FMM mostraron una menor expresión de la mayoría de los genes asociados con los tres linajes somáticos en comparación con las hiPSC y las hESC H1 mantenidas en medio convencional y en células alimentadoras. Un subconjunto de líneas inducidas por el conjunto de genes episomales OSNKLMT pareció mostrar expresión de linaje de ectodermo, OTX2 y TUJ1, mientras que esta expresión fue insignificante en las hiPSC derivadas episomalmente sin el uso de Lin28, KLF4 y c-MYC (Figura 6B). Sorprendentemente, la expresión de todos los genes de diferenciación probados se suprimió completamente en todas las hiPSC derivadas de conjuntos de genes mínimos episomales y se mantuvo en FMM (Figura 6B). En conjunto, estos datos indicaron que la plataforma FRM/FMM puede reprogramar células de manera robusta con pocos factores de reprogramación basados en episomas y puede mantener las hiPSC en un estado pluripotente fundamental estable.
[0711] Los patrones de expresión génica global se determinaron para hiPSC derivadas de los siguientes métodos: i) inducción episomal mantenida en FMM, ii) inducción episomal mantenida en FMM pero cambiada a medio convencional durante tres pasajes, iii) inducción lentiviral mantenida en SMC4; y iv) inducción lentiviral mantenida en cultivo convencional (Figura 13A, 13B). Antes de evaluar los perfiles de expresión génica, se determinó que todas las líneas eran pluripotentes, genómicamente estables; y capaces de diferenciarse de los tres linajes somáticos. El análisis de grupos de genes diferencialmente expresados entre el cultivo de moléculas pequeñas y el cultivo convencional reveló que las líneas hiPSC se agruparon en función de las condiciones de cultivo actuales y no por el método de derivación y cultivo originales (Figura 13B). La clasificación de la ontología génica de 300 genes que muestran diferencias de expresión de 2,5 veces identificó la diferenciación y el desarrollo como las principales categorías altamente enriquecidas en el grupo de cultivo convencional, mientras que los genes regulados positivamente en el grupo de cultivo de moléculas pequeñas se asociaron principalmente con la regulación de la proliferación celular y el desarrollo sexual (Figura 13C y 13D).
[0713] Se repitieron los análisis de expresión génica y se compararon directamente los sistemas de cultivo FMM, convencionales o de transición (FMM, Conv, FMM^-Conv, Conv^FMM; Figura 13A). El análisis de grupos produjo dos grupos separados en función del sistema de cultivo actual, independientemente del método de generación o del sistema de cultivo anterior (Figura 7A). Por ejemplo, el clon de hiPSC FTC016-c28 se generó y mantuvo bajo la plataforma FRM/FMM, antes de la transición al cultivo convencional. Este clon se agrupó con cultivos mantenidos exclusivamente en cultivo convencional y no con su línea parental mantenida en FMM; se observaron resultados comparables con líneas tales como un clon de hiPSC inducido por lentivirus OKS que se generó en cultivo convencional y se agrupó dentro del conjunto convencional hasta la transición a FMM, sobre el cual se agrupó dentro del grupo FMM (Figura 7A). La ontología génica categorizó el cultivo convencional para enriquecerlo con genes asociados con la diferenciación y el desarrollo (es decir, valor p=2,2E-10, proceso de especificación del patrón; Figuras 7B y 13E). En conjunto, estos datos mostraron que los genes asociados con la propensión a la diferenciación se reducen significativamente en el cultivo de FMM y las hiPSC se pueden adaptar a la plataforma de cultivo de FMM para reducir el potencial de diferenciación espontánea.
[0715] Se compilaron listas de genes para representar el estado fundamental y los estados metaestables de las células madre pluripotentes humanas (De Los Angeles y col., 2012; Han y col., 2011; Hanna y col., 2010a; Hirata y col., 2012; Nichols y Smith, 2012; Valamehr y col., 2012; Zhou y col., 2010) (Figura 7C). La agrupación de genes basada en estas listas de genes se realizó para líneas hiPSC en FMM o cultivo convencional (Figura 7D). De manera similar a la comparación de la expresión génica global, el agrupamiento de genes enfocado mostró una separación de las líneas celulares en función de sus condiciones de cultivo actuales con perfiles que parecen ser interconvertibles. Por ejemplo, el clon FTC016-c28 de hiPSC se trasfirió de FMM a cultivo convencional agrupado con hESC H1 y no con su línea hiPSC parental mantenida en FMM (Figura 7D). De manera similar, un clon de hiPSC lentiviral derivado de una línea de fibroblastos mantenida en cultivo convencional se agrupó con hESC HUES9 y otros clones de hiPSC en cultivo convencional; sin embargo, cuando se cambió a FMM, se agrupó con una hiPSC episomal derivada de sangre del cordón umbilical, así como otras líneas cultivadas de FMM (Figura 7D). La distribución de genes representativos de los estados fundamental y metaestables dentro de los dos grupos se determinó representando las intensidades promedio para cada conjunto de sondas con respecto a la molécula pequeña (SMC4/FMM) frente al cultivo convencional (Figura 7E). Sorprendentemente, la mayoría de los genes asociados con el estado fundamental mostraron una expresión elevada en el grupo de cultivo de moléculas pequeñas, y se detectó una mayor expresión de genes asociados con el estado metaestable en el grupo de cultivo convencional (Figura 7E).
[0717] El estado de inactivación de X de las hiPSC cultivadas y mantenidas en cultivo convencional se comparó con su homólogo adaptado al cultivo de moléculas pequeñas y se mantuvo durante 10 pasajes (Figura 7F). Las hiPSC mantenidas en cultivo de moléculas pequeñas mostraron un aumento en la expresión génica del cromosoma X en comparación con el cultivo convencional, lo que sugirió la reactivación del cromosoma X silenciado (Figura 7F). La excepción notable fue el transcrito específico X-inactivo (XIST) que se reguló negativamente en el cambio al cultivo de moléculas pequeñas (Figura 7F). Se proporcionó evidencia adicional de la activación de X mediante la tinción diferencial de H3K27me3 en hiPSC cultivadas en FMM en relación con su cultivo homólogo adaptado al medio convencional (Figura 7G). La mayoría de las hiPSC en FMM carecían de tinción H3K27me3; considerando que la mayoría de las hiPSC en cultivo convencional mostraron focos nucleares de H3K27me3 con la aparición de un tamaño nuclear reducido, lo que sugirió la inactivación de X (<10 % de tinción de H3K27me3 en FMM en comparación con >90 % de tinción de H3K27me3 en cultivo convencional; Figura 7G).
[0719] Ejemplo 6
[0721] Mantenimiento de hipsc en cultivo de moléculas pequeñas
[0723] Las hiPSC derivadas (fibroblastos o células sanguíneas inducidas con varias combinaciones de factores de reprogramación que incluyen OCT4/NANOG/SOX2, OCT4/ECAT1/UTF1 u OCT4/ECAT1/UTF1/ESRRB/NANOG) se pasaron de forma rutinaria como células individuales una vez que la confluencia del cultivo alcanzó el 75-90 %. Para la disociación de células individuales, las hiPSC se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Mediatech) y se trataron con Accutase (Millipore) durante 3 a 5 min a 37 0C, seguido de pipeteo para garantizar la disociación de células individuales. A continuación, la suspensión de células individuales se mezcló en igual volumen con medio convencional, se centrifugó a 225 g durante 4 min, se resuspendió en medio de mantenimiento de destino (FMM) y se sembró en placas sobre superficies recubiertas con Matrigel (Corning) calificadas para hESC. Se preparó Matrigel y se utilizó para recubrir superficies según las instrucciones del fabricante. Los pasajes fueron típicamente 1:3-1:6, las placas de cultivo de tejidos se recubrieron previamente con Matrigel durante 1-4 horas a 37 0C y se alimentaron cada dos o tres días con FMM. Los cultivos celulares se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 0C y 5 % de CO2. El medio convencional consiste en DMEM/F12 (Mediatech), 20 % de reemplazo de suero Knock-Out (Life Technologies), 1x Glutagro (Mediatech), 1x Aminoácidos No Esenciales (NEAA) (Mediatech), 1x Pen/Estrep (Mediatech) y p-Mercaptoetanol 100 pM. El FMM consiste en medio convencional complementado con 5 pM de tiazovivina (sintetizada internamente), 0,4 pM de PD0325901 (Biovision), 1 pM de CHIR99021 (Biovision), 100 ng/ml de bFGF (Life Technologies) y 10 ng/mL de hLIF (Millipore). El análisis de flujo y la morfología para cultivos expandidos en FMM se presentan en las Figuras 18A-D y 19A-B. Las células expandidas en FMM también demostraron un cariotipo normal en múltiples pasajes como se muestra en las Figuras 20A-D.
[0725] Ejemplo 7
[0727] Reprogramación con genes mínimos en cultivos de moléculas pequeñas
[0729] Para iniciar la reprogramación, se indujo la expresión ectópica de los factores de reprogramación mediante transducción lentiviral utilizando NIL, lentivirus de integración tradicional o electroporación con vectores episomales. Como se ilustra en las Figuras 14A-B, el sistema de expresión lentiviral consistió en varias características que incluyen un promotor EF1a, combinaciones de genes específicos (Tabla 3) y un sitio LOXP en el extremo 3’ para permitir la escisión mediada por CRE de los transgenes integrados. Tras la escisión de CRE, el genoma de hiPSC derivado ya no contenía transgenes y estaba esencialmente libre de huella. Como se ilustra en las Figuras 14C-F, las construcciones episomales tenían características únicas que incluían un promotor EF1 a y factores de reprogramación únicos. Tras la transfección, las construcciones episomales residían en el núcleo y actuaban de una manera transmediada que no se integraba en el genoma.
[0731] Para la infección por lentivirus, las células de fibroblastos humanos de partida se sembraron a 7x104-1 x105 células por pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta con Matrigel (Corning) según las instrucciones del fabricante. Se añadió sobrenadante lentiviral fresco de células 293T a las células de partida a una dilución de 1:2 (una parte de sobrenadante lentiviral: una parte de medio de fibroblastos). El sobrenadante viral NIL se utilizó a una concentración de 1x y no se diluyó. Si se usó virus previamente congelado, no se diluyó y se usó a una concentración de 1x. Los sobrenadantes virales de varios factores se combinaron (Tabla 3) hasta un total de 2 mL de medio por 6 pocillos. Esto se complementó con 5 pg/mL de polibreno (Millipore) y Hepes 10 mM (Meditech) seguido de infección por centrifugación. Las placas de seis pocillos se sellaron con parafilm y se centrifugaron a 600 g durante 90 min a 32 0C. A continuación, las placas se trasfirieron a incubadoras a 37 0C y CO2 al 5 % durante 12-16 h. Después de la incubación con lentivirus, las células se lavaron con PBS y el medio de cultivo se cambió a medio 50/50 que contenía una parte de medio de reprogramación de destino (FRM) y una parte de medio de fibroblastos. El medio se cambió completamente a FRM entre 4 y 6 días después de la infección. FRM consiste en medio convencional (descrito anteriormente) complementado con 5 pM de tiazovivina (sintetizada internamente), 0,4 pM de PD0325901 (Biovision), 1 pM de CHIR99021 (Biovision), 2 pM de SB431542 (Biovision), 100 ng/ml de bFGF (Life Technologies), 10 ng/ml de hLIF (Millipore), 1x suplemento de N2 (Life Technologies) y 1x suplemento de B27 (Life Technologies). Una vez que los pocillos se volvieron confluentes, las células se pasaron a placas de 10 cm previamente recubiertas con Matrigel. El pasaje consistió en disociación con Accutase (Millipore) sobre la superficie recubierta con Matrigel (como se ha descrito anteriormente). Entre los días 14 y 18 o cuando las colonias de iPSC estuvieron presentes, los medios de cultivo se cambiaron de FRM a FMM. Las células disociadas de células individuales se expandieron sobre placas recubiertas con Matrigel con FMM y se mantuvieron hasta la clasificación de citometría de flujo. Los resultados para la expresión del fenotipo hiPSC se presentan en la Tabla 3, Figuras 15A-C (a los 8-15 días) y Figuras 16A-D, Figuras 17A-B (Oct-4/Ecat1/UTF1/Esrrb/Nanog en la semana 4).
[0733] Tabla 3: Combinaciones de factores de reprogramación y expresión de fenotipo pluripotente
[0735]
[0736]
[0739] Para la reprogramación del vector episomal, la transfección de células de fibroblastos o de sangre de cordón umbilical mediante el uso de los plásmidos ilustrados en la Figura 13 se realizó mediante el uso del sistema de transfección NEON (Life Technologies). Aproximadamente, se cotransfectó un total de 3 pg de plásmidos episomales que contenían factores de reprogramación con EBNA (en forma de ARNm o como un casete en el plásmido de clonación pCDNA) en 5x105 células de fibroblastos o 2,5x105 células de sangre del cordón umbilical utilizando ajustes de 1650 v/10 ms/3 pulsos en tampones apropiados como se describe en el manual del producto. Las células transfectadas se sembraron directamente en un pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta con Matrigel que contenía medio de fibroblastos o medio de cultivo de sangre de cordón umbilical (dependiendo del tipo de célula) suplementado con 4 ng/mL de bFGF y 5 pg/mL de fibronectina (BD Biosciences) sin antibióticos. El medio de cultivo de sangre del cordón umbilical consiste en SFMII CC110 (Stem Cell Technologies). Veinticuatro horas después de la transfección, se añadió FRM al cultivo en igual volumen. Para los cultivos de fibroblastos, se añadieron al cultivo cuarenta y ocho horas después de la transfección 50 pg/mL de higromicina (Corning). El medio de cultivo se cambió por completo a FRM el día 5 con higromicina eliminada 7 días después de la transfección. Todos los cultivos de reprogramación se cambiaron a FMM 14 días después de la transfección. Para los cultivos de sangre del cordón umbilical, veinticuatro horas después de la transfección, se añadió FRM en igual volumen y se añadió continuamente cada pocos días hasta el día 14 después de la transfección, donde el cultivo se aspiró y se reemplazó por completo con FMM. En ambos casos, se observaron grupos de células redondeadas adherentes alrededor de 5 a 7 días después de la transfección. Una vez en FMM, todos los cultivos de reprogramación se mantuvieron y se realizaron pasajes de células individuales utilizando Accutase en superficies recubiertas con Matrigel (descritas anteriormente). Las células disociadas de células individuales se expandieron sobre placas recubiertas con Matrigel con FMM y se mantuvieron hasta la clasificación de citometría de flujo.
[0741] Ejemplo 8
[0743] Influencia de los factores de reprogramación y su estequiometría
[0745] Las células de fibroblastos humanos se infectaron por centrifugación con lentivirus que contenían varios factores de reprogramación. Todas las muestras se infectaron con OCT4, SOX2, NANOG y SV40LT utilizando un plásmido lentiviral que no contenía un factor de selección de antibióticos. Las células se coinfectaron con un único plásmido lentiviral que contenía un casete de selección de puromicina, así como varios factores de reprogramación. Estos factores incluyeron OCT4-P2A-SOX2, OCT4-P2A-NANOG-T2A-SOX2 u OCT4-P2A-OCT4. Dos días después de la infección, se añadieron 500 ng/mL de puromicina (Life Technologies) en medio 50/50 a cada pocilio. El día 5, después de tres días de selección con puromicina, el medio se cambió a FRM sin puromicina. El día 14, los medios se cambiaron a FMM. Entre los días 24 y 27, se realizó un análisis de flujo para las poblaciones SSEA4+/TRA181+. Se observó que el aumento de la expresión de OCT4 mejora significativamente la eficiencia de reprogramación (Figura 23A).
[0747] Ejemplo 9
[0749] Procedimientos experimentales
[0751] Mantenimiento de hiPSC en sistema de cultivo convencional
[0753] Las hiPSC cultivadas convencionalmente se mantuvieron en células alimentadoras MEF (Millipore) tratadas con mitomicina C y se cultivaron con medio convencional (denominado medio convencional en el texto) que contenía DMEM/F12 (Mediatech), 20 % v/v de reemplazo de suero knockout (Life Technologies), 1 % v/v de aminoácidos no esenciales (Mediatech), 2 mM de L-glutamina (Mediatech), 100 pM de p-mercaptoetanol (Life Technologies) y 10 ng/mL de bFGF (Life Technologies). Tras la confluencia, las hiPSC cultivadas convencionalmente se disociaron enzimáticamente utilizando 1 mg/mL de colagenasa IV (Life Technologies) durante 7 min a 37 0C seguido de disociación mecánica en trozos pequeños (denominados pasajes de grupo), se recogieron y se pasaron diluidos 1:3-1:4 en células alimentadoras recién sembradas cada 5-7 días con adición diaria de medio convencional. En caso de diferenciación espontánea excesiva, las colonias se recogieron manualmente y se cortaron en trozos pequeños utilizando la punta de la jeringa de insulina (Becton Dickinson) y se trasfirieron a células alimentadoras recién sembradas. Los cultivos celulares se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 0C y 5 % de CO2.
[0755] Reprogramación de células somáticas
[0757] Para iniciar la reprogramación, se indujo la expresión ectópica de los factores de reprogramación mediante transducción lentiviral o transfección de vectores episomales. Se siguió la transfección lentiviral como se ha descrito anteriormente (Valamehr y col., 2012). En resumen, las células de partida se colocaron en placas a 1x105 células por pocillo de una placa de 6 pocillos en una superficie recubierta con Matrigel (BD Biosciences). A menos que se especifique, todos los recubrimientos de Matrigel consisten en añadir solución de Matrigel (1 alícuota de Matrigel resuspendida en 25 mL de DMEM/F12) a las superficies de cultivo tisular y permitir una incubación de 2-4 h a 37 0C. El sobrenadante de las células 293T que generan el lentivirus que expresa el transgén OCT4/SOX2/Klf4 se añadió a las células de partida a una dilución de 1:2 (una parte de sobrenadante lentiviral: una parte de medio de fibroblastos), complementado con 4 pg/mL de polibreno (Millipore), y se trasfirió a 37 0C y 5 % de CO2 durante 12-16 h. Medio de fibroblastos: DMEM (Mediatech), 10 % FBS (Life Technologies), 1x glutamax (Life Technologies), 1x aminoácidos no esenciales (Mediatech). Después de la incubación con lentivirus, las células se lavaron tres veces con PBS y se alimentaron con medio de fibroblastos. 48 horas después de la transfección, el medio de cultivo se cambió a medio 50/50 que contenía una parte de FRM (o SMC4) y una parte de medio de fibroblastos. El medio se cambió completamente a FRM (o SMC4) una vez que el cultivo se pasó a un recipiente más grande, generalmente entre los días 4 y 6 después de la infección. El pasaje consiste en la disociación con Accutase sobre una superficie recubierta con Matrigel (como se describe a continuación). Los cultivos se mantuvieron en FRM (o SMC4) hasta la siguiente aplicación.
[0759] Para la reprogramación de vectores episomales, la transfección de fibroblastos o células sanguíneas del cordón umbilical utilizando el conjunto de genes OCT4/SOX2/NANOG/Klf4/LIN28/MYC/SV40LT (A14703, Life Technologies) se realizó utilizando el sistema de transfección NEON (Life Technologies). Aproximadamente, se transfectaron 4 pg del conjunto de vectores en 5x105 células de fibroblastos o 2,5x105 células de sangre del cordón umbilical utilizando ajustes de 1650 v/10 ms/3 pulsos en tampones apropiados como se describe en el manual del producto. Las células transfectadas se colocaron directamente en una placa de 10 cm (fibroblastos) o un pocillo de placa de 6 pocillos (sangre del cordón umbilical) recubierto con Matrigel y que contenía medio de cultivo de fibroblastos o medio de cultivo de sangre del cordón umbilical (dependiendo del tipo de célula) suplementado con 10 ng/mL de bFGF y 5 pg/mL de fibronectina (BD Biosciences). Medio de cultivo de sangre del cordón umbilical: SFMII CC110 (Stem Cell Technologies). Veinticuatro horas después de la transfección, se añadió FRM al cultivo en igual volumen. Para los cultivos de fibroblastos, se añadieron al cultivo cuarenta y ocho horas después de la transfección 50 pg/mL de higromicina (Mediatech). El medio de cultivo se cambió a FRM completo el día 5 con higromicina eliminada el día 7 después de la transfección. Todos los cultivos de reprogramación se cambiaron a FMM el día 14 después de la transfección. Para los cultivos de sangre del cordón umbilical, veinticuatro horas después de la transfección, se añadió FRM en igual volumen y se añadió continuamente cada pocos días hasta el día 14 después de la transfección, donde el cultivo se aspiró y se reemplazó por completo con FMM. En ambos casos, se observaron grupos de células redondeadas adherentes alrededor de los días 5 a 7 posteriores a la transfección. Una vez en FMM, se mantuvieron todos los cultivos de reprogramación y se realizaron pasajes de células individuales utilizando Accutase. Las células disociadas de células individuales se expandieron sobre placas recubiertas con Matrigel con FMM y se mantuvieron hasta la clasificación de citometría de flujo. En los estudios de recubrimiento superficial con vitronectina (Life Technologies), todos los aspectos se mantuvieron iguales, excepto la sustitución de Matrigel por vitronectina. Para la reprogramación episomal de factor reducido, se construyó la estructura del vector pCEP4 (Life Technologies) para contener OCT4-P2A-OCT4, OCT4-P2A-SOX2 u OCT4-P2A- NANOG-T2A-SOX2 bajo la regulación del promotor EF1a. La transfección de vectores episomales de factor reducido siguió el mismo protocolo que se ha descrito anteriormente con la excepción de algunas modificaciones. EBNA se cotransfectó como ARNm de EBNA (20 pg) o casete de vector (2 pg) (Howden y col., 2006). La selección de higromicina se mantuvo durante 10 días y se introdujo FMM el día 16.
[0761] Generación de lentivirus
[0763] 293T (ATCC) se mantuvieron en medio de fibroblastos sin antibióticos y no se les permitió alcanzar más del 80 % de confluencia. El medio de fibroblastos consistió en DMEM (Mediatech), 10 % de suero fetal bovino (FBS) (Life Technologies), 1x Glutagro (Mediatech) y 1x NEAA (Mediatech). Las células se pasaron mediante un primer lavado con PBS seguido de una incubación de 4 minutos a 37 0C con tripsina al 0,05 % (Mediatech). Las células disociadas se resuspendieron en medio de fibroblastos, se centrifugaron a 225 g durante 4 min y se sembraron en las placas deseadas. Para generar lentivirus de integración, se pasaron 293T el día 1 a 3,5x106 células por placa de 10 cm para cada preparación viral. El día 2, el medio se cambió a 10 mL de medio de fibroblastos fresco 1 hora antes de la transfección. El ADN se transfectó utilizando el kit CalPhos (Clontech). Lo siguiente se combinó para la transfección: 5 pg de plásmido de clonación lentiviral que contiene los genes de interés, 3,2 pg de plásmido de empaquetamiento ppAX, 630 ng de plásmido de empaquetamiento pMDG, 87 pL de solución de calcio y agua hasta 700 pL. Se añadieron 700 pL de solución de HBS mientras se creaban burbujas utilizando una pipeta serológica de 1 mL. Esto se incubó a temperatura ambiente durante 15 min y a continuación se añadió gota a gota a una placa de 10 cm de 293Ts. El día 3, se retiró el sobrenadante viral, se descartó y se añadieron 15 mL de medio de fibroblastos fresco a la placa. El día 4, 48 h después de la transfección, se recogió el sobrenadante viral y se almacenó a 4 0C. Se añadieron 15 mL de medio de fibroblastos a la placa. El día 5, 72 h después de la transfección, se recogió el sobrenadante viral y se añadió al sobrenadante del día 4. Este grupo viral se filtró utilizando un filtro de 0,45 pm y se verificó el título utilizando un Lenti-X GoStix (Clontech). El virus se utilizó para una infección o se congeló en alícuotas a -80 0C. Para generar lentivirus no integrante (NIL) (Invivogen), se siguió el protocolo según las instrucciones del fabricante utilizando un matraz T75 para cada preparación viral. Se recogieron los sobrenadantes virales 48, 72 y 96 horas después de la transfección, se agruparon, se filtraron y se titularon como se ha descrito anteriormente. Se utilizó virus del NIL para una infección o se congeló en alícuotas a -80 0C.
[0765] Mantenimiento de hiPSC en cultivo de moléculas pequeñas
[0767] Las hiPSC derivadas se pasaron rutinariamente como células individuales una vez que la confluencia del cultivo alcanzó el 75-90 %. Téngase en cuenta que el exceso de confluencia puede dar lugar a la diferenciación. Para la disociación de células individuales, las hiPSC se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Mediatech) y se trataron con Accutase durante 3 a 5 min a 37 0C, seguido de pipeteo para garantizar la disociación de células individuales. A continuación, la suspensión de células individuales se mezcló en igual volumen con medio convencional, se centrifugó a 225 g durante 4 min, se resuspendió en FMM y se colocó en placas sobre una superficie recubierta con Matrigel. Los pasajes fueron típicamente 1:4-1:8, se transfirieron a placas de cultivo de tejidos previamente recubiertas con Matrigel durante 2-4 horas a 37°Cy se alimentaron cada dos días con FMM. Los cultivos celulares se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 0C y 5 % de CO2. Las formulaciones de medio para FMM y FRM se describen en la Tabla 1. El cultivo de SMC4 se abordó anteriormente (Valamehr y col., 2012). En resumen, se añaden moléculas pequeñas PD0325901 0,4 mM (Biovision), CHIR99021 1 mM (Biovision), tiazovivina 5 mM y SB431542 2 mM (Biovision) al medio de cultivo convencional y se someten a pasajes según el protocolo.
[0768] Análisis y clasificación por citometría de flujo
[0770] Los grupos de reprogramación disociados de células individuales (descritos anteriormente) se resuspendieron en tampón de tinción enfriado que contenía solución salina equilibrada de Hanks (MediaTech), suero bovino fetal al 4 % (Invitrogen), 1 x penicilina/estreptomicina (Mediatech) y Hepes 10 mM (Mediatech). Se añadieron anticuerpos primarios conjugados, incluidos SSEA4-FITC, TRA1 -81 -Alexa Fluor-647 y CD30-PE (BD Biosciences), a la solución celular y se incubaron en hielo durante 15 min. Todos los anticuerpos se utilizaron a 7-10 pL en 100 pL de tampón de tinción por millón de células. La solución se lavó una vez en tampón de tinción, se centrifugó a 225 g durante 4 min y se resuspendió en tampón de tinción que contenía 10 pM de tiazovivina y se mantuvo en hielo para la clasificación por citometría de flujo. La clasificación por citometría de flujo se realizó en FACS Aria II (BD Biosciences) utilizando la estrategia de activación descrita anteriormente. Las células clasificadas se expulsaron directamente en placas de 96 pocillos utilizando la boquilla de 100 pM, a concentraciones de 3 y 9 eventos por pocillo. La clasificación de 3 células por pocillo fue la concentración preferida de los inventores, ya que notaron que los eventos clasificados no se correlacionaban necesariamente con el número real de células observadas en cada pocillo después de la clasificación y que 3 células por pocillo proporcionaron un número preferido de pocillos que contenían colonias individuales. Cada pocillo se llenó previamente con 200 pl de FMM suplementado con 5 pg/ml de fibronectina y penicilina/estreptomicina 1x (Mediatech) y se recubrió previamente durante la noche con Matrigel 5x. El recubrimiento previo con Matrigel 5x incluye añadir una alícuota de Matrigel a 5 ml de DMEM/F12, a continuación se incuba durante la noche a 4 0C para permitir una resuspensión adecuada y, finalmente, se añade a placas de 96 pocillos a 50 pl por pocillo, seguido de una incubación durante la noche a 37 0C. El Matrigel 5x se aspira inmediatamente antes de la adición de medio a cada pocillo. Tras la finalización de la clasificación, se centrifugaron placas de 96 pocillos durante 1-2 min en 225 g antes de la incubación. Las placas se dejaron sin alterar durante siete días. En el séptimo día, se retiraron 150 pL de medio de cada pocilio y se reemplazaron con 100 pL de FMM. Los pocilios se realimentaron con 100 pL adicionales de FMM el día 10 después de la clasificación. La formación de colonias se detectó ya el día 2 y la mayoría de las colonias se expandieron entre los días 7-10 después de la clasificación. En el primer pasaje, los pocillos se lavaron con PBS y se disociaron con 30 pL de Accutase durante aproximadamente 10 min a 37 0C. La necesidad de un tratamiento prolongado con Accutase refleja la compacidad de las colonias que han permanecido inactivas en el cultivo durante un tiempo prolongado. Después de observarse la disociación de las células, se añaden 200 pL de FMM a cada pocillo y se pipetean varias veces para romper la colonia. La colonia disociada se transfiere a otro pocillo de una placa de 96 pocillos previamente recubierta con Matrigel 5x y a continuación se centrifuga durante 2 min a 225 g antes de la incubación. Este pasaje 1:1 se lleva a cabo para extender la colonia temprana. Los pasajes posteriores se realizan de forma rutinaria con tratamiento con Accutase durante 3-5 min y expansión de 1:4 en pocillos más grandes previamente recubiertos con Matrigel 1x en FMM. El análisis de citometría de flujo se realizó en Guava EasyCyte 8 HT (Millipore) y se analizó utilizando FCS Express 4 (De Novo Software).
[0772] Rt-pcr en tiempo real y análisis fluidigm
[0774] El ARN total se aisló utilizando el kit de aislamiento de ARN Pico Pure (Life Technologies). El ADN complementario (ADNc) se transcribió de forma inversa a partir de 100 ng de ARN total aislado utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad). El ADNc se utilizó a continuación para la preamplificación de 22 genes diana específicos y dos genes de control de referencia utilizando el kit TaqMan PreAmp Master Mix (Life Technologies) y una concentración 0,2x de ensayos TaqMan agrupados. La amplificación específica de la diana (STA) a partir de ADNc se realizó utilizando 14 ciclos de amplificación con las condiciones de ciclo estándar establecidas en el protocolo del fabricante. Las reacciones de ADNc preamplificadas (n=48) se diluyeron 1:5 (en agua estéril) y se utilizaron como plantilla para las reacciones de PCR cuantitativa en tiempo real. Las matrices dinámicas 48.48 (Fluidigm) se cargaron utilizando un controlador NanoFlex IFC MX (Fluidigm) con ensayos TaqMan cargados por duplicado y las reacciones en tiempo real se realizaron utilizando un sistema BioMark Real-Time PCR (Fluidigm). Los resultados se analizaron utilizando el software BioMark Real-Time PCR Analysis (Fluidigm). Las muestras con umbrales de ciclo (Ct) superiores a 32 se excluyeron de los cálculos. Los Ct promedio se calcularon a partir de los duplicados de ensayo y los Ct delta-delta (AACt) se calcularon utilizando la media de dos genes de referencia (GAPDH y HPRT1) frente a la mediana de seis líneas celulares MEF de control (OSK hiPSC en MEF y H1 ESC). Los resultados de la expresión génica relativa (RQ) se muestran en Excel (Microsoft) en formato de mapa de calor.
[0776] Tabla 4. Sondas TaqMan marcadas con FAM
[0778]
[0779]
[0782] Presencia de prueba de transgenes
[0784] El ADN genómico se aisló utilizando el kit QIAamp® DNA Mini y digestión con proteinasa K (Qiagen). Se amplificaron 100 ng del ADN genómico utilizando conjuntos de cebadores específicos de transgén (Tabla 5 a continuación) (Yu y col., 2007) utilizando el kit de mezcla maestra de PCR Taq (Qiagen). Las reacciones de PCR se realizaron durante 35 ciclos de la siguiente manera: 94 °C durante 30 s (desnaturalización), 60-64 °C durante 30 s (hibridación) y 72 durante 1 min (extensión). Como controles negativos se utilizaron ADN genómico de fibroblastos y hiPSC generadas utilizando métodos lentivirales. El ADN de las construcciones episomales se utilizó como control positivo.
[0786] Tabla 5. Conjuntos de cebadores específicos de transgén
[0788]
[0789]
[0792] Análisis de inmunocitoquímica
[0794] Las células se fijaron utilizando paraformaldehído al 4 % v/v (Alfa Aesar), se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween al 0,2 % v/v (PBST) (Fisher Scientific) y se permeabilizaron utilizando TritonX-100 al 0,15 % v/v (Sigma-Aldrich) en PBS durante 1 h a 25 °C. Después de la permeabilización, las células se bloquearon con BSA al 1 % v/v (Invitrogen) en PBST (PBSTB) (Fisher Scientific) durante 30 min a 25 °C. Después de la eliminación suave de PBSTB, las células se incubaron con anticuerpo primario en PBSTB durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio incluyen OCT4 (Santa Cruz), NANOG (Santa Cruz), TRA160 (Millipore), t Ra 1-81 (Millipore), SSEA4 (Millipore), p-III Tubulina (T<u>J1 , R&D Systems), a-actina de músculo liso (Sigma), FoxA2 (R&D Systems), Sox17 (R&D Systems), NESTIN (Abcam) y Alfa-1-Fetoproteína (Dako). Después de la incubación durante la noche, las células se lavaron tres veces con PBST y se tiñeron con anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488 o 555; Invitrogen) diluido 1:250 en PBSTB durante 1 h a 37 °C. Las células se lavaron tres veces en PBST y se tiñeron con tinte Hoechst (Invitrogen). Para el análisis de tinción con H3K27me3, las hiPSC se cultivaron de 72 a 96 h en cubreobjetos y se fijaron con paraformaldehído al 4 % (Electron Microscopy Science, EMS) en PBS durante 15 min a 25 °C. La permeabilización celular se realizó con Triton X-100 al 0,1 % en PBS durante 1 hora a 25 °C, y a continuación las células se incubaron con solución de bloqueo (BSA al 1 % en PBS) durante 30 min a 25 °C. Después del bloqueo, los cubreobjetos se incubaron con una dilución 1:1600 de anticuerpo anti-trimetilhistona H3 (Lys27) (Millipore 07-449, H3K27me3) en solución de bloqueo, durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos secundarios fueron anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo con Alexa Fluor 555 (Life Technologies, A21429). Los núcleos se contratiñeron con DAPI y se observaron con un microscopio invertido Axio Observer (Carl Zeiss). Las imágenes se capturaron con el AxioVS40 v4.8.1.0 (Carl Zeiss Imaging Solutions Gmbh).
[0796] Las células reprogramadas según el Ejemplo 7 se fijaron utilizando paraformaldehído al 4 % v/v (Alfa Aesar), se lavaron con PBS (Mediatech) y se permeabilizaron utilizando T ritonX-100 al 0,15 % v/v (Sigma-Aldrich) en PBS durante 1 hora a 25 °C. Después de la permeabilización, las células se bloquearon con BSA al 1 % v/v (Sigma) en PBS (PBSB) durante 30 minutos a 25° C. Después de la eliminación suave de PBSB, las células se incubaron con anticuerpo primario en PBSB durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio incluyen OCT4 (Santa Cruz) y TRA181 (Millipore). Después de la incubación durante la noche, las células se lavaron tres veces con PBS y se tiñeron con anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488 o 555; Life Technologies) diluido 1:250 en PBSB durante 1 h a 37 °C. Las células se lavaron tres veces en PBS y se tiñeron con tinte Hoechst (Invitrogen). Las células teñidas se observaron con un microscopio invertido Axio Observer (Carl Zeiss). Las imágenes se capturaron con el AxioVS40 v4.8.1.0 (Carl Zeiss Imaging Solutions Gmbh).
[0798] Análisis de diferenciación (EB y dirigido)
[0800] Las hiPSC se diferenciaron como EB en medio de diferenciación que contenía DMEM/F12 (Mediatech), suero bovino fetal al 20 % (Invitrogen), aminoácidos no esenciales al 1 % (Mediatech), 2 mM de L-glutamina (Mediatech) y 100 qM de p-mercaptoetanol. En resumen, para la formación de EB, las hiPSC se sembraron en FMM y se cambiaron a convencionales al día siguiente para cebar las células. Después de 3 a 4 días en medio convencional, los cultivos se disociaron de células individuales con Accutase (Millipore) y se resuspendieron en medio de diferenciación que incluía 10 qM de Y27632 a una concentración final de 100.000 células/mL. Obsérvese que se utiliza el inhibidor de ROCK Y27632 en lugar de tiazovivina para la formación de EB. Las células se sembraron a 100 qL/pocillo en una placa de cultivo no tisular de 96 pocillos con fondo en V (Nunc) y se centrifugaron a 950 g durante 5 min. Al día siguiente, los “grupos similares a bolas” compactos se trasfirieron a una placa de 6 pocillos de unión ultrabaja (Corning) utilizando P1000 a aproximadamente 30-40 EB/pocillo en medio de diferenciación. Después de 7 días, los EB se trasfirieron 1:1 a una placa de 6 pocillos recubierta con Matrigel y se alimentaron con medio de diferenciación cada tres días. Después de 3 semanas en cultivo, las células se fijaron y se tiñeron. Para la diferenciación monocapa dirigida, las hiPSC se sembraron en pocillos recubiertos con Matrigel en FMM para proporcionar una confluencia del 50 % y 90 % al día siguiente. Ambas densidades fueron inducidas a diferenciarse. Para la inducción neural, los medios FMM se reemplazaron con medios hESC complementados con 10 qM de SB431542 y 100 nM de LDN-193189 (ambos inhibidores de SMAD, Biovision). Después de 2 días, los medios de diferenciación se complementaron con 3 qM de CHIR99021 (Biovision) además de los inhibidores duales de SMAD. Las células se fijaron dos días después y se tiñeron para Nestin (Abcam). Para la diferenciación del mesodermo, los medios se reemplazaron con RPMI (Mediatech) complementado con 1x aditivo de medios B27 (Life Technologies), 3 qM de CHIR99021,4 ng/ml de bFGF y 10 ng/ml de BMP4. El medio se cambió cada dos días y las células se fijaron el 4° día y se tiñeron para aSMA (Sigma). La diferenciación del endodermo se realizó utilizando el kit de identificación funcional de células madre pluripotentes humanas (R&D Systems). Las hiPSC se incubaron con medios de diferenciación del endodermo durante 3 días, se fijaron y se tiñeron para SOX17 (R&D Systems).
[0802] Análisis de la expresión génica
[0804] El ARN se extrajo utilizando el kit de aislamiento de ARN PicoPure (Life Technologies) utilizando el protocolo recomendado por el fabricante. El ARN total se cuantificó utilizando el espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). En resumen, se preparó ARNa biotinilado a partir de aproximadamente 100 ng de ARN total utilizando el protocolo estándar para el kit de amplificación de ARNa MessageAmp II (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX) utilizando la amplificación de segunda ronda opcional y a continuación se transcribió en ARNa marcado con biotina utilizando el kit mejorado con biotina MessageAmp II (Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX) utilizando el protocolo estándar. El ARNa marcado con biotina se purificó y fragmentó según las recomendaciones de Affymetrix. Se utilizaron 20 pg de ARNa fragmentado para hibridar con los chips U133-plus-2.0 del genoma humano (Affymetrix Inc. Santa Clara, CA) durante 16 horas a 45 0C. Las matrices se lavaron y tiñeron en la Affymetrix Fluidics Station 450 y se escanearon utilizando el Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G. Los archivos de datos de expresión bruta están disponibles en Gene Expression Omnibus (GSE50868). Los datos de la imagen se analizaron utilizando el software Affymetrix Expression Console utilizando la configuración de análisis predeterminada. Las matrices se normalizaron mediante un análisis robusto de múltiples matrices a escala logarítmica (RMA, Affymetrix) y se visualizaron en Spotfire for Genomics 4.5 (Tibco Spotfire, Palo Alto, CA). El análisis de enriquecimiento de la ruta de biológica de las sondas expresadas diferencialmente se realizó contra la base de datos Gene Ontology (GO) (enriquecimiento singular a proceso biológico GO y valor p < 0,01) utilizando la base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado (DAVID v6.7). Se realizó un agrupamiento jerárquico para comparar los perfiles de expresión génica entre muestras en función de los niveles de expresión de Log2 utilizando un método de agrupamiento de ligamiento completo con mediciones de distancia euclidiana (Spotfire for Genomics 4.5). Los conjuntos de sondas para el agrupamiento se seleccionaron mediante un diferencial general en los niveles de expresión (>< 2,5 veces) o la presencia en listas de genes específicos que definen un estado fundamental o metaestable. Para la comparación de la expresión génica del cromosoma X, las intensidades de chip del gen Affymetrix normalizadas por RMA se convirtieron en valores de expresión lineal tomando el 2A[intensidad de log2 de RMA]. Las relaciones de expresión lineal se calcularon como el conjunto de expresiones sencillas dividido por el conjunto de expresiones cebadas. Las relaciones de expresión para todos los conjuntos de sondas mapeados en el cromosoma X se visualizaron en Spotfire 4.5 con los conjuntos de sondas con una relación de enriquecimiento superior o inferior a 2 veces resaltados.
[0806] Análisis de cariotipo
[0808] El análisis citogenético se realizó en veinte a cuarenta células en metafase de banda G por WiCell Research Institute (Madison, WI).
[0810] Formación de teratoma
[0812] Se inyectaron hiPSC disociadas de células individuales, a concentraciones de 0,5 y 3 millones de células por 200 pL de solución (100 pL FMM y 100 pL Matrigel) por vía subcutánea en ratones NOD/SCID/y null. Después de 5-6 semanas (inyección de 3 millones de células) y 7-8 semanas (inyección de 0,5 millones de células), los teratomas se cosecharon en PBS, se fijaron durante la noche a temperatura ambiente en paraformaldehído al 4 % y se mantuvieron posteriormente en etanol al 70 % a temperatura ambiente para su procesamiento. Las muestras se enviaron a UCSD Histology Core Facility para su corte y tinción con hematoxilina y eosina. Las secciones se examinaron, interpretaron y fotografiaron utilizando un microscopio Nikon Eclipse TS100 equipado con una cámara Nikon DS-Fi1.
[0814] Análisis estadístico
[0816] Se utilizó la prueba t de Student para las evaluaciones estadísticas relacionadas con la desviación estándar. Se utilizó el software StepOne v2.2 (Life Technologies) para determinar los valores mínimos y máximos de RQ (barras de error) relacionados con los datos de qRTPCR.
[0818] En general, en las siguientes reivindicaciones, los términos utilizados no deben interpretarse como limitativos de las reivindicaciones a las realizaciones específicas descritas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES
i .Un métodoin vitropara obtener células pluripotentes inducidas que comprende:
(a) obtener células no pluripotentes;
(b) reprogramar las células no pluripotentes en células pluripotentes inducidas; y (c) cultivar las células pluripotentes inducidas en un medio de cultivo que comprende:
un inhibidor de GSK3;
un inhibidor de MEK; y
un inhibidor de ROCK,
manteniendo de este modo la pluripotencia de las células cultivadas, y en donde (i) las células pluripotentes inducidas son células humanas, (ii) el medio de cultivo no comprende células alimentadoras no humanas y (iii) el medio de cultivo no comprende un inhibidor de TGFpR.
2. El método de la reivindicación 1, en donde las células pluripotentes inducidas comprenden una población homogénea de células pluripotentes, opcionalmente donde
(i) al menos el 95 % de la población de células pluripotentes expresa SSEA4-FITC y TRA1-81 o TRA1-60; o
(ii) como máximo el 5 % de la población de células pluripotentes expresa a-actina de músculo liso (SMA), TUJ1 o FoxA2.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende además el pasaje de las células pluripotentes inducidas cultivadas; y opcionalmente disociar las células pluripotentes inducidas en células individuales antes de o durante el pasaje, en un medio de cultivo que comprende un inhibidor de GSK3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de ROCK.
4. El método de la reivindicación 1, en donde las células pluripotentes inducidas cultivadas comprenden una expresión disminuida de uno, dos, tres, cuatro, cinco o más genes marcadores de diferenciación en al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en comparación con la expresión de los genes marcadores de diferenciación en una célula pluripotente inducida cultivada en un medio que comprende un inhibidor de TGFpR; donde el uno, dos, tres, cuatro, cinco o más genes marcadores de diferenciación se (i) seleccionan del grupo que consiste en: FOXA2, FGF5, SOX17, XIST, NODAL, COL3A1, OTX2, DUSP6, EOMES, NR2F2, NR0B1, CXCR4, CYP2B6, GATA3, GATA4, ERBB4, GATA6, HOXC6, INHA, SMAD6, RORA, NIPBL, TNFSF11, CDH11, ZIC4, GAL, SOX3, PITX2, APOA2, CXCL5, CER1, FOXQ1, MLL5, DPP10, GSC, PCDH10, CTCFL, PCDH20, TSHZ1, MEGF10, MYC, DKK1, BMP2, LEFTY2, HES1, CDX2, GNAS, EGR1, COL3A1, TCF4, HEPH, KDR, TOX, FOXA1, LCK, PCDH7, CD1D FOXG1, LEFTY1, TUJ1, gen T (Brachyury) y ZIC1; o (ii) seleccionan del grupo que consiste en: gen T, CXCR4, NODAL, GATA4, SOX17, FOXA2, OTX2, y TUJ1.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además, antes de la etapa (c) de cultivar la célula pluripotente inducida en dicho medio de cultivo, aislar células pluripotentes inducidas que se cultivan en presencia de células alimentadoras y/o un inhibidor de TGFpR.
6. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa (b) de reprogramación comprende además (i) aumentar la expresión de OCT4 endógena en las células no pluripotentes; o (ii) introducir en las células no pluripotentes uno o más de:
(A) un vector que comprende al menos dos polinucleótidos que codifican OCT4;
(B) un vector que comprende al menos un polinucleótido que codifica ECAT1 y al menos un polinucleótido que codifica UTF1;
(C) un vector que comprende al menos un polinucleótido que codifica NANOG y al menos un polinucleótido que codifica ESRRB;
(D) un vector que comprende al menos un polinucleótido que codifica OCT4 y al menos un polinucleótido que codifica ESRRB; y
(E) un vector que comprende al menos un polinucleótido que codifica OCT4 y al menos un polinucleótido que codifica DPPA2;
donde las células no pluripotentes comprenden (i) una célula somática; o (ii) una célula madre adulta.
7.El método de la reivindicación 6, en donde el método comprende además poner en contacto las células no pluripotentes de la etapa (b) con una mezcla que comprende un inhibidor de GSK3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de TGFpR, y opcionalmente un inhibidor de ROCK.
El método de la reivindicación 1, que comprende además:
(A) tratar las células pluripotentes inducidas para obtener células pluripotentes disociadas de células individuales antes del cultivo; y
(B) cultivar y pasar las células tratadas de la etapa (A) en dicho medio de cultivo.
El método de la reivindicación 1, en donde
(i) el inhibidor de GSK3 es CHIR99021 o BIO;
(ii) el inhibidor de MEK es PD98059 o PD032901;
(iii) el inhibidor de ROCK es tiazovivina o Y27632;
(iv) el inhibidor de GSK3 es CHIR99021; el inhibidor de MEK es PD032901; y el inhibidor de ROCK es tiazovivina; o
(v) el medio de cultivo comprende además bFGF y/o LIF.
Un método para obtener células madre pluripotentes inducidas por célula individual o una población clonal de las mismas, y en donde el método comprende:
a) disociar las células madre pluripotentes inducidas y suspender las células disociadas resultantes en un medio libre de alimentador para proporcionar una suspensión celular libre de alimentador, en donde el medio libre de alimentador no comprende un inhibidor de TGFpR;
b) clasificar la suspensión celular libre de alimentador para obtener una población enriquecida en células madre pluripotentes inducidas individuales; y
c) cultivar la población enriquecida en células madre pluripotentes inducidas individuales obtenidas en la etapa b) en un medio libre de alimentador que comprende un inhibidor de GSK3, un inhibidor de MEK y un inhibidor de ROCK, en donde el medio libre de alimentador no comprende un inhibidor de TGFpR,
en donde la pluripotencia y la viabilidad de las células madre pluripotentes se mantienen en la célula madre pluripotente única y su población clonal.
El método de la reivindicación 10, en donde el método tiene una o más de las siguientes características:
(i) la clasificación de la etapa b) se realiza mediante perlas magnéticas o citometría de flujo para las células que expresan uno o más marcadores de pluripotencia;
(ii) la población enriquecida de células madre pluripotentes únicas está enriquecida en un nivel seleccionado del grupo que consiste en: al menos el 20 %, al menos el 50 %, al menos el 100 %, al menos el 200 % y al menos el 500 % con respecto a las células que expresan uno o más marcadores de pluripotencia;
(iii) el uno o más marcadores de pluripotencia comprenden SSEA4, TRA160, TRA181, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD30, CD50, CD133/ prominina, CD140a, CD56, CD73, CD105, CD31, CD34, OCT4, Nanog o Sox2, y
(iv) las células madre pluripotentes inducidas individuales cultivadas y enriquecidas son iPSC en estado fundamental.
El método de la reivindicación 11, en donde
(i) el inhibidor de GSK3 es CHIR99021 o BIO;
(ii) el inhibidor de MEK es PD98059 o PD032901;
(iii) el inhibidor de ROCK es tiazovivina o Y27632;
(iv) el inhibidor de GSK3 es CHIR99021; el inhibidor de MEK es PD032901; y el inhibidor de ROCK es tiazovivina; o
(v) el medio de cultivo comprende además bFGF y/o LIF.
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