ES3050913T3

ES3050913T3 - Stable formulations of polypeptides and uses thereof

Info

Publication number: ES3050913T3
Application number: ES20176028T
Authority: ES
Inventors: Ann Brigé; Christine Labeur; Brabandere Veronique De
Original assignee: Ablynx NV
Current assignee: Ablynx NV
Priority date: 2009-09-03
Filing date: 2010-09-03
Publication date: 2025-12-29
Anticipated expiration: 2030-09-03
Also published as: ES2831323T3; EP2805731A3; EP2473528B1; SI3725330T1; WO2011026948A1; WO2011026945A1; EP3725330B1; ES2617180T3; PT2473528E; DK2473527T3; EP2473527B1; EP3725330A1; HK1204284A1; FI3725330T3; LT2805731T; CY1121411T1; SI2805731T1; US20120244158A1; PL3438126T3; LT3725330T

Abstract

Se proporcionan formulaciones que contienen dominios variables individuales con buena solubilidad y estabilidad en diversas condiciones de almacenamiento, transporte y estrés. Estas formulaciones son útiles como formulación farmacéutica. La formulación comprende un vehículo acuoso con un pH de 5,5 a 8,0, un tampón seleccionado del grupo que consiste en histidina pH 6,0-6,5, hepes pH 7,0-8,0, MES pH 6,0, succinato pH 6,0-6,5 y acetato pH 5,5-6,0; un excipiente; y/o un surfactante seleccionado entre Tween 80, Tween 20 y poloxámeros. La formulación se caracteriza además por tener una concentración de sales inorgánicas de 150 mM o inferior. La invención se refiere además a envases y unidades farmacéuticas que comprenden dichas formulaciones, así como a métodos para su preparación y usos profilácticos y terapéuticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Formulaciones estables de polipéptidos y<usos>de las mismas

[0003] CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0004] La presente invención se refiere a formulaciones de dominios variables únicos. Más específicamente, la presente invención proporciona formulaciones que contienen dominios variables únicos con una buena solubilidad y buena estabilidad bajo diferentes condiciones de almacenamiento y estrés. Las formulaciones de la invención son adecuadas para su administración a sujetos humanos.

[0005] La invención se refiere además a recipientes y unidades farmacéuticas que comprenden dichas formulaciones y a usos profilácticos y terapéuticos de las formulaciones y unidades farmacéuticas de la invención.

[0006] Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invención quedarán claros a partir de la descripción adicional que se incluye a continuación.

[0007] TÉCNICA ANTECEDENTE

[0008] Los nanocuerpos (como se describe más adelante en este documento) se caracterizan por la formación del sitio de unión a antígeno por un dominio variable único, que no requiere interacción con otro dominio (por ejemplo, en forma de interacción VH/VL) para el reconocimiento del antígeno. Se han descrito nanocuerpos contra una amplia gama de dianas diferentes (documentos WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/040153, WO 06/122825, WO 07/104529, WO 08/020079, WO 08/074839, WO 08/071447, WO 08/074840, WO 08/074867, WO 08/077945, WO 08/101985, WO 08/142164, WO 09/068625, WO 08/142165, WO 09/068627) que podrían ser candidatos ideales para el desarrollo de fármacos. En el documento WO 08/020079 se describen nanocuerpos contra IL-6R que pueden inhibir la interacción IL-6/IL-6R. En el documento WO 09/068627 se han descrito nanocuerpos contra la subunidad p19 de IL-23 que bloquean la interacción de IL-23 con su receptor. En el documento WO 08/142164 se describen nanocuerpos contra RANKL que pueden inhibir la formación de osteoclastos. Recientemente se ha descubierto que el sistema OPG/RANKL/RANK es un factor regulador fundamental en la patogénesis de enfermedades y trastornos óseos como por ejemplo la osteoporosis.

[0009] Las proteínas, tales como los anticuerpos terapéuticos y los nanocuerpos, a menudo se transportan y/o almacenan para su uso posterior. Por lo tanto, es importante que dichas proteínas conserven la estabilidad y la actividad biológica de la proteína en diversas condiciones, tales como diferentes regímenes de temperatura y estrés mecánico.

[0010] Ciertas preparaciones anteriores de anticuerpos líquidos han mostrado vidas útiles cortas y pérdida de actividad biológica de los anticuerpos como resultado de inestabilidades químicas y/o físicas durante el transporte y el almacenamiento. La inestabilidad química puede ser causada por desamidación, racemización, hidrólisis, oxidación, eliminación beta o intercambio de disulfuro, y la inestabilidad física puede ser causada por desnaturalización, agregación, precipitación o adsorción de anticuerpos. Entre ellas, se sabe que la agregación, desamidación y oxidación son las causas más comunes de la degradación de anticuerpos (Cleland et al., 1993, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307-377). Se sabe poco sobre los componentes de formulación de fármacos que proporcionan formulaciones líquidas estables de nanocuerpos.

[0011] El documento WO 2010/077422 A2 se publicó el 8 de julio de 2010 y describe formulaciones de moléculas de unión a antígeno de dominio único (también denominadas en este documento "moléculas SDAB") que son útiles para la administración a un sujeto para el tratamiento de, por ejemplo, trastornos asociados al TNF.

[0012] Existe una necesidad de formulaciones líquidas estables de nanocuerpos que muestren una buena solubilidad del nanocuerpo y que exhiban mayor estabilidad, niveles bajos a indetectables de agregación, niveles bajos a indetectables de degradación del nanocuerpo, y muy poca o ninguna pérdida de actividad biológica del nanocuerpo, incluso en diferentes condiciones de transporte y almacenamiento.

[0013] SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0014] La presente invención proporciona formulaciones mejoradas (también denominadas"formulación(es) de la invención”)de polipéptidos que comprenden uno o más dominios variables únicos que muestran una buena solubilidad de los dominios variables únicos y conservan una mayor estabilidad de los dominios variables únicos en una variedad de condiciones diferentes de transporte, almacenamiento y uso. La presente invención se basa en el hallazgo de que la presencia en la formulación de ciertos tampones, ciertos excipientes y/o ciertos tensioactivos puede aumentar la solubilidad, la temperatura de fusión y/o la estabilidad de los dominios variables únicos presentes en la formulación. La presente invención proporciona datos de solubilidad para formulaciones con polipéptidos que comprenden uno o más dominios variables únicos (también denominados"polipéptido(s) de la invención")hasta 150 mg/ml y más. La invención demuestra además que dichas formulaciones pueden transportarse, manipularse a través de diversos dispositivos de administración y conservar la actividad, pureza y potencia en diferentes condiciones de estrés; condiciones de estrés mecánico; almacenamiento de la formulación en diversas condiciones de estrés, tales como diferentes ciclos de congelación/descongelación, a 2-8 °C, a 25 ± 5 °C y a temperatura elevada. La formulación de la presente invención comprende un vehículo acuoso que tiene un pH de 5,5 a 8,0 y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos a una concentración de 1 mg/ml a 200 mg/ml, formulándose dicha formulación para administración a un sujeto humano, y comprendiendo dicha formulación además un tampón a una concentración de 10 mM a 100 mM seleccionado de histidina pH 6,0-6,5,

[0015] en la que dicha formulación tiene una concentración de sal inorgánica de 150 mM o inferior, y

[0016] en la que el polipéptido comprende al menos un dominio variable único dirigido contra la seroalbúmina humana (HSA) con la condición de que la formulación no sea

[0017] • una formulación de ATN-103 a una concentración de 50 mg/ml, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa (peso/volumen), 0,01 % de polisorbato 80, pH 6,0;

[0018] • una formulación obtenible por liofilización de la formulación de ATN-103 a una concentración de 50 mg/ml, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa (peso/volumen), 0,01 % de polisorbato 80, pH 6,0, y reconstituyendo en agua estéril (USP) a una formulación de ATN-103 a una concentración de 100 mg/ml, 20 mM de histidina, 10 % de sacarosa, 0,02 % de polisorbato 80, pH 6,0;

[0019] • una formulación de ATN-103 a una concentración de aproximadamente 80 mg/ml, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato 80, pH 6,0;

[0020] • una formulación de 88 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 55 mM de NaCl, pH 6,1;

[0021] • una formulación de 89 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 55 mM de hidrocloruro de arginina, pH 6,1;

[0022] • una formulación de 88 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 100 mM de glicina, pH 6,0;

[0023] • una formulación de 99 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 100 mM de metionina, pH 6,0;

[0024] • una formulación de 88 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 8 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, pH 6,0;

[0025] • una formulación de 100 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, pH 6,0;

[0026] • una formulación de 118 mg/ml de ATN-103, 20 mM de histidina, 5 % de sacarosa, pH 6,0;

[0027] • una formulación de aproximadamente 1 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, pH 6,0;

[0028] • una formulación de aproximadamente 1 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, pH 6,5;

[0029] • una formulación de aproximadamente 1 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 150 mM de arginina HCl, pH 6,0;

[0030] • una formulación de aproximadamente 1 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 150 mM de arginina HCl, pH 6,5;

[0031] • una formulación de aproximadamente 1 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 75 mM de cloruro de sodio; pH 6,0;

[0032] • una formulación de aproximadamente 1 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 75 mM de cloruro de sodio; pH 6,5;

[0033] • una formulación de 100 mg/ml de ATN-103, 20 mM de histidina, 8 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80;

[0034] • una formulación de 100 mg/ml de ATN-103, 20 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 80 mM de glicina;

[0035] • una formulación de 100 mg/ml de ATN-103, 20 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 80 mM de glicina, 10 mM de metionina;

[0036] • una formulación de 100 mg/ml de ATN-103, 20 mM de histidina, 5 % de sorbitol;

[0037] • una formulación de 100 mg/ml de ATN-103, 20 mM de histidina, 5 % de sacarosa;

[0039] en la que ATN-103 es;

[0041] MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPG KGLEWVSEINTNG LITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVES GGGLVQPGMSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQM NSLRP EDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGG SG GGSE VQLVESGG G LVQPGGSLRLSCAASG FTFSDYWMY WVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLV TVSS.

[0043] Los presentes inventores observaron que las formulaciones que tienen 150 mM o menos de sal inorgánica muestran una estabilidad mucho mejor de los dominios variables únicos contenidos en la formulación. Las sales inorgánicas utilizadas con frecuencia en la formulación farmacéutica son NaCl y KCl. Los dominios variables únicos presentes en formulaciones que contienen 150 mM o menos de sal inorgánica han mostrado una mayor estabilidad (por ejemplo, menor tendencia a formar agregados, dímeros y/o piroglutamato,<o>a perder potencia) en diferentes condiciones de almacenamiento bajo estrés (tal como por ejemplo, durante el almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más)), una temperatura de fusión mejorada y/o una mayor solubilidad. Preferiblemente, la formulación contiene 100 mM o menos de sal inorgánica, más preferiblemente incluso 50 mM o menos de sal inorgánica. Lo más preferible es que la formulación no contenga ninguna sal inorgánica.

[0045] El polipéptido (también denominado"polipéptido de la invención”)que comprende uno o más dominios variables únicos para su uso en la formulación de la invención puede ser terapéutico o profiláctico, y puede ser útil en la prevención, el tratamiento y/o el manejo de una o más enfermedades y/o trastornos. En un aspecto específico, el polipéptido tiene al menos dos dominios variables únicos. En otro aspecto específico, el polipéptido tiene al menos tres dominios variables únicos. Los polipéptidos preferidos de la invención y los dominios variables únicos utilizados en el polipéptido de la invención se describen en los documentos WO 08/142164, WO 08/020079 y WO 09/068627. Los polipéptidos particularmente preferidos de la invención pueden seleccionarse de SEQ ID NO: 1 a 6.

[0047] El polipéptido de la invención puede estar presente en la formulación de la presente invención en una concentración de alrededor de 1 a 200 mg/ml, preferiblemente alrededor de 5 a 100 mg/ml, más preferiblemente alrededor de 5 a 50 mg/ml, lo más preferible alrededor de 5 a 30 mg/ml, tal como alrededor de 5 mg/ml, alrededor de 10 mg/ml, alrededor de 20 mg/ml, alrededor de 30 mg/ml, alrededor de 40 mg/ml, alrededor de 50 mg/ml, alrededor de 60 mg/ml, alrededor de 70 mg/ml, alrededor de 80 mg/ml, alrededor de 90 mg/ml, alrededor de 100 mg/ml, alrededor de 150 mg/ml.

[0048] En un aspecto de la invención, la formulación es homogénea. En otro aspecto, la formulación de la invención es estéril. Además del polipéptido de la invención, la formulación de la presente invención comprende al menos un vehículo acuoso (por ejemplo, agua destilada, agua MilliQ o WFI) y un tampón.

[0050] El pH de la formulación de la invención debe estar en el intervalo de 5,5 a 8,0, preferiblemente el pH está alrededor de 6,0 a 7,5, más preferiblemente alrededor de 6,2 a 7,5 o alrededor de 6,2 a 7,0. Lo más preferible es que el pH esté en el intervalo de 6,5 a 7,0, tal como por ejemplo pH 6,5. Se ha demostrado que estos intervalos de pH proporcionan una mayor temperatura de fusión a los polipéptidos presentes en la formulación de la invención.

[0052] Los tampones para uso en la formulación de la invención son hepes pH 7,0-8,0, histidina pH 6,0-6,5, más preferiblemente histidina pH 6,0, 6,2 o 6,5. Las formulaciones que comprenden uno de estos tampones han demostrado una muy buena solubilidad (tal como se define en el presente documento) de los polipéptidos de la invención, una temperatura de fusión mejorada de los polipéptidos presentes en la formulación y una mayor estabilidad (por ejemplo, menor tendencia a formar agregados, dímeros y/o piroglutamato, o a perder potencia) en diferentes condiciones de almacenamiento de estrés (tales como, por ejemplo, durante el almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más)). El tampón está preferiblemente en una concentración de alrededor de 10 a 20 mM, tal como 10 mM o 15 mM. En un aspecto específico, la formulación de la invención comprende un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 15 mM o un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM.

[0054] En consecuencia, la presente invención proporciona formulaciones estables de polipéptidos que comprenden uno o más dominios variables únicos, comprendiendo dichas formulaciones un vehículo acuoso, el polipéptido a una concentración de alrededor de 1 a 200 mg/ml, preferiblemente alrededor de 5 a 100 mg/ml, más preferiblemente alrededor de 5 a 50 mg/ml, lo más preferible alrededor de 5 a 30 mg/ml, tal como alrededor de 5 mg/ml, alrededor de 10 mg/ml, alrededor de 20 mg/ml, alrededor de 30 mg/ml, alrededor de 40 mg/ml, alrededor de 50 mg/ml, alrededor de 60 mg/ml, alrededor de 70 mg/ml, alrededor de 80 mg/ml, alrededor de 90 mg/ml, alrededor de 100 mg/ml, alrededor de 150 mg/ml, y un tampón tal como un tampón de histidina con un pH que varía de 6,0 a 7,0 a una concentración de alrededor de 10 a 20 mm.

[0056] Preferiblemente, la formulación de la invención es isotónica o ligeramente hipotónica y/o tiene una osmolalidad de alrededor de 290 ± 60 mOsm/kg, tal como alrededor de 240 o más, 250 o más o 260 o más. La isotonicidad de la formulación se puede ajustar aún más mediante la adición de uno o más excipientes y/o tonificantes.

[0058] Los excipientes/tonificantes preferidos para su uso en la formulación de la presente invención son sacáridos y/o polioles. Por consiguiente, en otro aspecto, la formulación de la invención comprende un sacárido y/o poliol. Las formulaciones que comprenden uno o más sacáridos y/o polioles han mostrado una mayor estabilidad (por ejemplo, menor tendencia a formar agregados, dímeros y/o piroglutamato, o a perder potencia) en diferentes condiciones de almacenamiento bajo estrés (tales como por ejemplo, durante el almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más) y durante condiciones de estrés mecánico) y/o una temperatura de fusión mejorada de los polipéptidos presentes en la formulación. En un aspecto específico de la invención, el excipiente presente en la formulación de la invención es un azúcar no reductor. En otro aspecto específico, el excipiente presente en la formulación de la invención es un disaoárido. En otro aspecto específico, el excipiente presente en la formulación de la invención se selecciona entre sacarosa, trehalosa, sorbitol y manitol. El sacárido y/o poliol está presente preferiblemente en la formulación de la invención en una concentración de alrededor de 1 % a 20 %, preferiblemente alrededor de 2,5 % a 15 %, más preferiblemente alrededor de 5 % a 10 %, tal como alrededor de 5 %, alrededor de 7,5 %, alrededor de 8 % o alrededor de 10 %.

[0060] Por consiguiente, la presente invención proporciona formulaciones estables de polipéptidos que comprenden uno o más dominios variables únicos, comprendiendo dichas formulaciones un vehículo acuoso, el polipéptido a una concentración de alrededor de 1 a 200 mg/ml, preferiblemente alrededor de 5 a 100 mg/ml, más preferiblemente alrededor de 5 a 50 mg/ml, lo más preferible alrededor de 5 a 30 mg/ml, tal como alrededor de 5 mg/ml, alrededor de 10 mg/ml, alrededor de 20 mg/ml, alrededor de 30 mg/ml, alrededor de 40 mg/ml, alrededor de 50 mg/ml, alrededor de 60 mg/ml, alrededor de 70 mg/ml, alrededor de 80 mg/ml, alrededor de 90 mg/ml, alrededor de 100 mg/ml, alrededor de 150 mg/ml, y un sacárido y/o poliol a una concentración de alrededor de 1 % a 20 %, preferiblemente alrededor de 2,5 % a 15 %, más preferiblemente alrededor de 5 % al 10 %, tal como alrededor de 5 %, alrededor de 7,5 %, alrededor de 8 % o alrededor de 10 %.

[0062] En otro aspecto específico, la formulación de la invención puede comprender uno o más tensioactivos (por ejemplo, TWEEN® 20, TWEEN® 80 o un poloxámero). Las formulaciones que comprenden un tensioactivo han mostrado una muy buena solubilidad (tal como se define en este documento) de los polipéptidos de la invención y/o una mayor estabilidad bajo estrés mecánico. El tensioactivo puede estar presente en una concentración en el intervalo de alrededor de 0,001 % a 1 % (preferiblemente entre alrededor de 0,001 % a 0,1 %, o alrededor de 0,01 % a 0,1 %, tal como alrededor de 0,001 %, alrededor de 0,005 %, alrededor de 0,01 %, alrededor de 0,02 %, alrededor de 0,05 %, alrededor de 0,08 %, alrededor de 0,1 %, alrededor de 0,5 %, o alrededor de 1 % de la formulación, preferiblemente alrededor de 0,01 %).

[0064] Por consiguiente, la presente invención proporciona formulaciones estables de polipéptidos que comprenden uno o más dominios variables únicos, comprendiendo dichas formulaciones un vehículo acuoso, el polipéptido a una concentración de alrededor de 1 a 200 mg/ml, preferiblemente alrededor de 5 a 100 mg/ml, más preferiblemente alrededor de 5 a 50 mg/ml, lo más preferible alrededor de 5 a 30 mg/ml, tal como alrededor de 5 mg/ml, alrededor de 10 mg/ml, alrededor de 20 mg/ml, alrededor de 30 mg/ml, alrededor de 40 mg/ml, alrededor de 50 mg/ml, alrededor de 60 mg/ml, alrededor de 70 mg/ml, alrededor de 80 mg/ml, alrededor de 90 mg/ml, alrededor de 100 mg/ml, alrededor de 150 mg/ml, y un tensioactivo (por ejemplo, Tween 20, Tween 80 o un poloxámero) a una concentración en el intervalo de alrededor de 0,001 % a 1 % (preferiblemente entre alrededor de 0,001 % a 0,1 %, o alrededor de 0,01 % a 0,1 %, como alrededor de 0,001 %, alrededor de 0,005 %, alrededor de 0,01 %, alrededor de 0,02 %, alrededor de 0,05 %, alrededor de 0,08 %, alrededor de 0,1 %, alrededor de 0,5 %, o alrededor de 1 % de la formulación, preferiblemente alrededor de 0,01 %).

[0066] Una formulación preferida de la invención puede comprender:

[0067] a) Un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 10 mM a 100 mM, tal como 10 mM a 20 mM;

[0068] b) Sacarosa en una concentración de 1% a10 %; y

[0069] c) Tween 80 en una concentración de 0,001 % a 1 %.

[0071] Otra formulación preferida de la invención puede comprender:

[0072] a) Un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 15 mM;

[0073] b) Sacarosa en una concentración de 8 %; y

[0074] c) Tween 80 en una concentración de 0,01 %.

[0076] Otra formulación preferida de la invención puede comprender:

[0077] a) Un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM a 100 mM, tal como 10 mM a 20 mM;

[0078] b) Sacarosa en una concentración de 1 % a 10 %; y

[0079] c) Tween 80 en una concentración de 0,001 % a 1 %.

[0081] Otra formulación preferida de la invención puede comprender:

[0082] a) Un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM;

[0083] b) Sacarosa en una concentración de 10 %; y

[0084] c) Tween 80 en una concentración de 0,005 %.

[0086] La presente invención proporciona formulaciones de un polipéptido que comprenden uno o más dominios variables únicos que exhiben alta solubilidad del polipéptido, poca o ninguna agregación del polipéptido y alta estabilidad durante largos períodos de almacenamiento.

[0088] En un aspecto, los componentes presentes en las formulaciones de la invención se han seleccionado de manera que los polipéptidos de la invención tengan una solubilidad de al menos 20 mg/ml, al menos 50 mg/ml, preferiblemente al menos 90 mg/ml, al menos 120 mg/ml, al menos 150 mg/ml o incluso 200 mg/ml o más.

[0089] En otro aspecto, I<os>componentes presentes en las formulaciones de la Invención se han seleccionado de tal manera que el polipéptido presente en la formulación de la Invención tiene una temperatura de fusión de al menos 59 °C o más (tal como 59,5 °C o más}, preferiblemente al menos 60 °C o más (tal como 60,5 °C o más}, más preferiblemente al menos 61 °C o más (tal como 61,5 °C o más} o al menos 62 °C o más (tal como 62,5 °C o más}, lo más preferible al menos 63 °C o más (tal como 63,5 °C o más} medida por el ensayo de desplazamiento térmico (TSA) y/o calorimetría diferencial de barrido (DSC}.

[0091] En aún otro aspecto, la formulación de la presente invención exhibe estabilidad bajo diversas condiciones de estrés tales como:

[0092] • múltiples ciclos de congelación/descongelación (hasta 10);

[0093] • almacenamiento a una temperatura de 2-8 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más);

[0094] • almacenamiento a una temperatura de 25 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más);

[0095] • almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más); y/o

[0096] • estrés mecánico.

[0098] El estrés mecánico tal como se utiliza en la presente invención puede ser cualquier forma de fuerza externa aplicada sobre la formulación que pueda afectar la estabilidad del polipéptido presente en la formulación. Sin ánimo de limitar, el estrés mecánico aplicado a la solución puede ser estrés de cizallamiento, tensión de agitación, estrés de agitación, estrés de rotación, etc. Preferiblemente, la formulación de la invención es estable bajo una o más de las siguientes formas de estrés mecánico:

[0099] • agitando la formulación durante 10 s a 1 min;

[0100] • empujando la formulación a través de una aguja (25G, preferiblemente 26G, más preferiblemente 27G, incluso más preferiblemente 28G, más preferiblemente 29G o más} con una jeringa (la jeringa utilizada puede ser cualquier jeringa disponible comercialmente, tal como por ejemplo una jeringa de 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 10 ml hasta 50 ml);

[0101] • girando durante dos días a 10 rpm; y/o

[0102] • agitando durante 1 hora a temperatura ambiente y/o 4-48 horas (tal como 4-8 horas, 12 horas, 24 horas o incluso 48 horas} a 4 °C a al menos 10 rpm (tal como 50 rpm, 100 rpm o más}.

[0104] Preferiblemente, las formulaciones de la presente invención son estables bajo más de una (tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete} de las condiciones de estrés anteriores, más preferiblemente bajo todas las condiciones de estrés anteriores.

[0106] En consecuencia, el polipéptido de la invención presente en la formulación de la invención:

[0107] • es estable después de múltiples (hasta 10} ciclos de congelación/descongelación, dicha estabilidad determinada por medición de 0D320/0D280, SE-HPLC, RP-HPLC, IEX-HPLC, ensayo de potencia (tal como Blacore o ELISA} y/o SDS-PAGE;

[0108] • es estable durante el almacenamiento a una temperatura de 2-8 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más}, dicha estabilidad determinada por medición de 0D320/0D280, SE-HPLC, RP-HPLC, IEX-HPLC, ensayo de potencia (tal como Biacore o ELISA} y/o SDS-PAGE;

[0109] • es estable durante el almacenamiento a una temperatura de 25 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más}, dicha estabilidad determinada por medición de 0D320/0D280, SE-HPLC, RP-HPLC, IEX-HPLC, ensayo de potencia (tal como Biacore o ELISA} y/o SDS-PAGE;

[0110] • es estable durante el almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más}, dicha estabilidad determinada por medición de 0D320/0D280, SE-HPLC, RP-HPLC, IEX-HPLC, ensayo de potencia (tal como Biacore o ELISA} y/o SDS-PAGE;

[0111] • es estable al agitar la formulación durante 10 s a 1 min;

[0112] • es estable al empujar la formulación a través de una aguja (25G, preferiblemente 26G, más preferiblemente 27G, incluso más preferiblemente 28G, más preferiblemente 29G o más} con una jeringa (la jeringa utilizada puede ser cualquier jeringa disponible comercialmente, tal como por ejemplo una jeringa de 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml hasta 50 ml);

[0113] • es estable al girar durante dos días a 10 rpm; y/o

[0114] • es estable cuando se agita durante 1 hora a temperatura ambiente y/o 4-48 horas (como 4-8 horas, 12 horas, 24 horas o incluso 48 horas) a 4 °C a al menos 10 rpm (tal como 50 rpm, 100 rpm o más).

[0116] La estabilidad de las formulaciones de la presente invención se puede demostrar por el hecho de que menos del 10 % de los polipéptidos forman piroglutamato en el ácido glutámico N-terminal (por ejemplo, según se evalúa mediante RP-HPLC) y/o menos del 10 % de los polipéptidos forman dímeros (por ejemplo, según se evalúa mediante SE-HPLC) durante el almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores. Preferiblemente, menos del 10 % de los polipéptidos forman piroglutamato en el ácido glutámico N-terminal (por ejemplo, según se evalúa mediante RP-HPLC) y menos del 10 % de los polipéptidos forman dímeros (por ejemplo, según se evalúa mediante SE-HPLC) durante el almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores.

[0118] En un aspecto específico, menos del 10 % de los polipéptidos presentes en la formulación de la invención forman piroglutamato en el ácido glutámico N-terminal (por ejemplo, según se evalúa mediante RP-HPLC) durante el almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C durante al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más). En otro aspecto específico, menos del 10 % de los polipéptidos forman dímeros (por ejemplo, según se evalúa mediante SE-HPLC) durante el almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C durante al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más). En aún otro aspecto específico, menos del 10 % de los polipéptidos presentes en la formulación de la invención forman piroglutamato en el ácido glutámico N-terminal (por ejemplo, según lo evaluado por RP-HPLC) durante el almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C durante al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más) y menos del 10 % de los polipéptidos forman dímeros (por ejemplo, según lo evaluado por SE-HPLC) durante el almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C durante al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más).

[0120] Aparte de esto y/o además, la estabilidad de las formulaciones de la presente invención se puede demostrar por el hecho de que sólo muestra niveles bajos a indetectables de agregación y/o formación de partículas (por ejemplo, evaluados mediante SE-HPLC, conteo de partículas subvisibles, ultracentrifugación analítica, dispersión de luz dinámica, medición de la relación 0D320/0D280 y/o dispersión de luz elástica) incluso durante el almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores. En un aspecto específico, las formulaciones de la presente invención muestran sólo niveles bajos a indetectables de agregación y/o formación de partículas (por ejemplo, según se evalúa mediante SE-HPLC, recuento de partículas subvisibles, ultracentrifugación analítica, dispersión de luz dinámica y/o medición de 0D320/0D280) a una temperatura de 37 ± 5 °C y/o 5 ± 5 °C durante al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más).

[0122] Aparte de esto y/o además, la estabilidad de las formulaciones de la presente invención se puede demostrar por el hecho de que sólo muestra niveles bajos a indetectables de fragmentación y/o degradación de los polipéptidos (por ejemplo, evaluados mediante SDS-PAGE, SE-HPLC, RP-HPLC y/o IEX-HPLC) incluso durante el almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores. En un aspecto específico, las formulaciones de la presente invención muestran sólo niveles bajos a indetectables de fragmentación y/o degradación de los polipéptidos (por ejemplo, según se evalúa mediante SDS-PAGE, SE-HPLC, RP-HPLC y/o IEX-HPLC) a una temperatura de 37 ± 5 °C durante al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más).

[0123] Aparte de esto y/o además, la estabilidad de las formulaciones de la presente invención se puede demostrar por el hecho de que muestra muy poca o ninguna pérdida de las actividades biológicas del polipéptido de la invención (por ejemplo, según se evalúa mediante ELISA y/o Biacore) incluso durante el almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores. En un aspecto específico, las formulaciones de la presente invención muestran muy poca o ninguna pérdida de las actividades biológicas del polipéptido de la invención (por ejemplo, según se evalúa mediante ELISA y/o Biacore) a una temperatura de 37 ± 5 °C durante al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más).

[0125] Más específicamente, en las formulaciones de la presente invención al menos el 80 % (preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 95 % o incluso al menos el 99%) de los polipéptidos retienen su actividad de unión a al menos uno (preferiblemente a todos) de sus dianas (por ejemplo, según se evalúa mediante ELISA y/o Biacore) después del almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores en comparación con la actividad de unión antes del almacenamiento.

[0127] En un aspecto específico, al menos el 80 % (preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 95 % o incluso al menos el 99%) de los polipéptidos retiene su actividad de unión (por ejemplo, según se evalúa mediante ELISA y/o Biacore) a al menos uno (preferiblemente a todos) de sus dianas después del almacenamiento a 37 ± 5 °C durante hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 2 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más} en comparación con la actividad de unión antes del almacenamiento.

[0129] En consecuencia, la presente invención proporciona formulaciones estables de polipéptidos que comprenden uno o más dominios variables únicos, en las que:

[0130] • menos del 10 % de los polipéptidos forman piroglutamato en el ácido glutámico N-terminal (por ejemplo, según se evaluó mediante RP-HPLC) durante el almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más);

[0131] • menos del 10 % de los polipéptidos forman dímeros (por ejemplo, según se evaluó mediante SE-HPLC) durante el almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más);

[0132] • al menos el 80 % de los polipéptidos conservan su actividad de unión (por ejemplo, evaluada mediante ELISA y/o Biacore) a al menos uno (preferiblemente a todos) de sus dianas después del almacenamiento a 37 ± 5 °C hasta 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 2 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más) en comparación con la actividad de unión antes del almacenamiento; y/o

[0133] • el polipéptido es estable bajo estrés mecánico.

[0135] En un aspecto preferido, la formulación de la invención es una formulación farmacéutica.

[0137] La presente invención proporciona además métodos para preparar las formulaciones estables de la invención. Los métodos de la invención pueden comprender las etapas de concentrar un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos e intercambiarlo con el tampón y/o excipiente preferido.

[0139] También se proporcionan recipientes, kits y dosificaciones unitarias farmacéuticas que comprenden las formulaciones de la invención para su uso, por ejemplo, por un profesional de la salud. En realizaciones específicas, los kits o dosis unitarias farmacéuticas que comprenden las formulaciones estables de la invención se formulan para la administración parenteral (por ejemplo, por vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y/o subcutánea) del polipéptido de la invención a un sujeto humano. Las formulaciones, envases, dosis unitarias farmacéuticas y/o kits pueden ser utilizados en profilaxis y/o terapia. En un aspecto específico, las formulaciones, recipientes, dosis unitarias farmacéuticas y/o kits se utilizan para la prevención y/o tratamiento de una o más enfermedades y/o trastornos tales como enfermedades y/o trastornos óseos (tales como, por ejemplo, osteoporosis, enfermedades óseas relacionadas con el cáncer, y/o pérdida ósea asociada con autoinmunidad y/o infección viral) o enfermedades autoinmunes (tales como, por ejemplo, artritis reumatoide).

[0141] Leyendas de las figuras

[0143] Figura 1.Los cromatogramas de SE-HPLC a 280 nm de RANKL008a formulados en tampones de fosfato (A) o histidina (B) con 50 mM de NaCI, 100 mM de NaCI o 10 % de manitol, antes y después de 10 ciclos de congelación/descongelación. Se muestra como recuadro una vista ampliada del pico principal.

[0145] Figura 2.Los cromatogramas de RP-HPLC a 280 nm de RANKL008a formulados en tampones de fosfato con 50 mM de NaCI, 100 mM de NaCI o 10 % de manitol, antes y después de 10 ciclos de congelación/descongelación. Se muestra como recuadro una vista ampliada del pico principal.

[0147] Figura 3.Los cromatogramas de SE-HPLC a 280 nm de RANKL008a formulados en tampón de fosfato con 50 mM de NaCI, 100 mM de NaCI o 10 % de manitol, tras dos semanas de incubación a 37 °C. Se muestra una ampliación del pico principal en el recuadro.

[0149] Figura 4.Figura que muestra la disminución dependiente del tiempo (A) y el aumento (B) del área superficial de, respectivamente, el pico principal (A) y los % de dímeros (B) observados en el análisis de SE-HPLC de RANKL008a formulado en diferentes tampones y almacenado hasta 10 semanas a 37 °C.

[0151] Figura 5.Los cromatogramas de RP-HPLC a 280 nm de RANKL008a formulados en tampón de fosfato con 50 mM de NaCI, 100 mM de NaCI o 10 % de manitol, tras dos semanas de incubación a 37 °C. Se muestra una ampliación del pico principal en el recuadro.

[0153] Figura 6.Superposición de los cromatogramas de IEX-HPLC a 280 nm de RANKL008a formulado en tampón de fosfato con 50 mM de NaCI, 100 mM de NaCI o 10 % de manitol, tras dos semanas de incubación a 37 °C. Se muestra una ampliación del pico principal y los postpicos como recuadro.

[0154] Figura 7.Cantidades relativas (%) del pico principal y I<os>dos postpicos observados en I<os>oromatogramas de IEX-HPLC de las muestras de estabilidad después del almacenamiento durante 10 semanas a 37 °C.

[0155] Figura 8.Fotografía y observación visual de los viales después de agitarlos. La muestra de RANKL008a, diluida (a 5 mg/ml) y sin diluir con o sin 0,01 % de Tween 80, se agitó fuertemente (10 s - 1 min).

[0156] Figura 9.Descripción general de las diluciones y las etapas realizadas en el estudio de Jeringabilidad como se describe en el Ejemplo 1.6.

[0157] Figura 10.Relaciones OD 320/278 y OD 350/278 (n=3) después del paso/almacenamiento de RANKL008a en Jeringas con diferentes diluyentes como se describe en el Ejemplo 1.6.

[0158] Figura 11.Potencia relativa de HSA y RANKL de RANKL008a después de la dilución en diferentes diluyentes y el paso/almacenamiento en Jeringas como se describe en el Ejemplo 1.6.

[0159] Figura 12.Descripción general del estudio del tamaño de la aguja/calibre con RANKL008a diluido como se describe en el Ejemplo 1.7.

[0160] Figura 13.Descripción general de un estudio adicional del tamaño de la aguja/calibre con RANKLO08a diluido y sin diluir como se describe en el Ejemplo 1.7.

[0161] Figura 14.Resumen de los resultados obtenidos para las pruebas de estabilidad térmica de IL6R304 (A, C, E) e IL6R305 (B, D, F) y en función de la concentración de NaCI (A, B), manitol añadido (C, D) y tampón/excipiente (E, F).

[0162] Figura 15.Resumen de los resultados obtenidos en las pruebas de estabilidad térmica de IL6R304 en tampón Tris pH 7,2 o Histidina pH 6,5, con sacarosa, glicina o manitol añadido como excipiente.

[0163] Figura 16.Termogramas (obtenidos después de restar las líneas base) de IL6R304 en los tampones como se indica en el gráfico.

[0164] Figura 17.Análisis PAMAS de IL6R304 formulado en PBS comparado con IL6R304 formulado en PBS 0,01 % o 0,02 % de Tween 80. Recuento de partículas: >10 gm, >25 gm, >50 gm, >100 gm y >200 gm.

[0165] Figura 18.SE-HPLC para la molécula IL6R304 en presencia de diferentes concentraciones de Tween 80.

[0166] Figura 19.(A)-(C): Valores logarítmicos de la concentración de nanocuerpo IL-6R soluble (eje Y) frente a la concentración de PEG6000 (%) (eje X), junto con los valores de solubilidad calculados. (D) representa un ejemplo de cómo se realiza el análisis de regresión lineal sobre los puntos de datos obtenidos para determinar la intersección con el eje X (del cual se puede deducir la solubilidad teórica al cero % de PEG6000).

[0167] Figura 20.Superposición de los cromatogramas de SE-HPLC de IL6R304 formulado a 10 mg/ml, almacenado durante 3 semanas a 37 °C. En el recuadro, ampliación en el pico principal para mostrar las diferencias dependientes del tampón en el % de agregados.

[0168] Figura 21.Figura que muestra las diferencias dependientes del tampón en el % de agregados (área superficial máxima en SE-HPLC) que se observaron en las muestras de estabilidad de IL6R304 e IL6R305 almacenadas durante 1 semana a 37 °C.

[0169] Figura 22.Figura que muestra las diferencias dependientes del tampón en el % de agregados (área superficial máxima en SE-HPLC) que se observaron en las muestras de estabilidad de IL6R304 e IL6R305 almacenadas durante 3 semanas a 37 °C.

[0170] Figura 23.Superposiciones de los cromatogramas de RP-HPLC de IL6R304 incubados durante 3 semanas a 37 °C en diferentes tampones de formulación. Se muestra como recuadro una vista ampliada del pico principal. Observe el aumento de dos prepicos menores y un postpico en las muestras de IL6R304 almacenadas durante 3 semanas.Figura 24.Datos de osmolalidad de IL6R304 (10 mg/ml) en los 12 tampones diferentes indicados en el gráfico. La barra horizontal define la región isotónica.

[0171] Figura 25.Figura que muestra el aumento dependiente del tiempo del % de oligómeros/agregados (eje Y) observado en el análisis de SE-HPLC de IL6R304 almacenado hasta 5 semanas a 37 °C (A) y 5 °C (B) en los tampones indicados en el gráfico. El % de oligómeros/agregados se expresa como la suma del % de las áreas superficiales del pico de prepico 1a, prepico 1b y prepico 2 con respecto al área superficial del pico total.

[0172] Figura 26.(A): el % de oligómeros (% de área superficial máxima) observado en I<os>tampones de histidina después del almacenamiento durante 3 semanas a 37 °C en comparación con la muestra equivalente en tampón de PBS. (B): aumento dependiente del tiempo y del tampón en los % de oligómeros observados en las muestras de estabilidad de IL-6R almacenadas hasta 5 semanas a 37 °C, a una concentración de 10 mg/ml en los tampones indicados en el gráfico.

[0173] Figura 27.Perfil de SE-HPLC de IL6R304 en los diferentes tampones como se muestra en la Tabla 21. IL6R304 fue menos propenso a la oligomerización en el tampón de L-histidina en comparación con el tampón de fosfato. (A) Se encontraron menos oligómeros, que se observaron como prepicos durante el análisis SE-HPLC, en las muestras de IL6R304 almacenadas durante 8 semanas a 37 °C en tampón de L-histidina (tampones 1-5) en comparación con el tampón de fosfato (tampones 6-10). La cantidad de oligómeros fue más baja en el tampón 3. (B) El efecto de los diferentes excipientes sobre la oligomerización de L-histidina frente a fosfato. Obsérvese que el área superficial del postpico fue mayor en fosfato en comparación con L-histidina.

[0174] Figura 28.Cinética de formación de oligómeros durante el almacenamiento de IL6R304 en diferentes tampones. La oligomerización fue significativamente más lenta en L-histidina (tampones 1-5) en comparación con el tampón de fosfato (tampones 6-10).

[0175] Figura 29.Superposición de los cromatogramas RP-HPLC de IL6R304 después del almacenamiento durante hasta 8 semanas a 37 °C en 10 tampones de formulación diferentes. Se muestra como recuadro una ampliación sobre el pico principal y los picos laterales.

[0176] Figura 30.Cinética de la formación de la variante piroglutamato de IL6R304 durante el almacenamiento en condiciones de estrés en diferentes tampones. Se forma menos piroglutamato en L-histidina en comparación con el tampón de fosfato.

[0177] Figura 31.índice de agregación antes y después de la agitación de IL6R304.

[0178] Figura 32.Presentación gráfica de los valores de Tm para 23IL0064 en función de la concentración de NaCI (A) y de la concentración de manitol (B), las Tm se obtuvieron en el ensayo de desplazamiento térmico a 0,1 mg/ml.

[0179] Figura 33.Representación gráfica de las temperaturas de fusión medidas para 23IL0075 en función del pH, en acetato 10 mM, en histidina 10 mM y en tampón de fosfato 10 mM. La concentración de proteína fue de 0,2 mg/ml. El escaneo se realizó a 1 °C/min, comenzando a 30 °C.

[0180] Figura 34.Cromatogramas de SE-HPLC (OD280) de 23IL0064 en 40 mM de histidina (pH 6,0) / 50 mM de NaCl. La muestra inicial se comparó con las muestras después de la concentración. No se observó formación de agregados debido a la concentración de la muestra en el tampón de histidina. La SE-HPLC se realizó con una columna Phenomenex BioSep SEC S-2000, con D-PBS como fase móvil a 0,2 ml/min.

[0181] Figura 35.Valores logarítmicos de la concentración de proteína soluble (eje Y) frente a la concentración de PEG6000 (%, eje X). El panel superior derecho representa un ejemplo de cómo se realiza el análisis de regresión lineal sobre los puntos de datos obtenidos para determinar la intersección con el eje X (del cual se puede deducir la solubilidad teórica al cero % de PEG6000). En el tampón de histidina, el experimento se realizó a dos concentraciones que se presentan en los dos gráficos inferiores. Para estos dos gráficos no fue posible realizar regresión.

[0182] Figura 36.Valores logarítmicos de la concentración de proteína soluble (eje Y) de p23IL0064 y 23IL0075 en tampón de fosfato 10 mM pH 7 con NaCl 50 mM frente a la concentración de PEG6000 (eje X). Mediante análisis de regresión y extrapolación hasta una concentración cero de PEG6000, se calcularon las concentraciones máximas teóricas de proteína (valores de solubilidad aparente), que fueron para ambas proteínas de aproximadamente 50 mg/ml. Este número sólo debe utilizarse después de la confirmación con otras técnicas.

[0183] Figura 37.Valores logarítmicos de la concentración de proteína soluble (eje Y) de p23IL0064 y p23IL0075 en tampón de histidina 40 mM pH 6,0 con NaCl 50 mM frente a la concentración de PEG6000 (eje X). En este gráfico no fue posible la regresión ya que no se produjo precipitación en la ventana PEG % explorada.

[0184] Figura 38.Cromatogramas de SE-HPLC (280 nm) de 25 gg de 23IL0064 muestras no estresadas y estresadas a 37 °C (3<w>y 4<w>) en D-PBS. La SE-HPLC se realizó en TSK-GEL G2000SWXL con D-PBS.

[0185] Figura 39.Cromatogramas de RP-HPLC (280 nm) de 25 gg de 23IL0064 no estresado y muestra estresada a 37 °C (4<w>) en D-PBS. La RP-HPLC se realizó en una columna Zorbax C-3 con un gradiente de agua/acetonitrilo 0,1 % TFA.

[0186] Figura 40.Representación gráfica del % del área de pico de los diferentes picos de RP-HPLC de 23IL0064 y sustancias relacionadas con el producto después de 6 semanas de estrés a 37 °C en diferentes tampones de formulación. La primera barra representa la muestra de referencia, almacenada a -80 °C hasta<su>análisis. El pre-pico 2 estaba presente en la muestra inicial y no aumentó durante el almacenamiento a 37 °C.

[0187] Figura 41.Superposición de cromatogramas de RP-HPLC (280 nm) de 23IL0064 en 20 mM de histidina pH 6,5 (conc.

[0188] 22,4 mg/ml). Comparación de 6 semanas a 37 °C, 6 semanas a 25 °C, 6 semanas a 4 °C y referencia de -80 °C. La RP-HPLC se realizó en una columna Zorbax 300SB-C3 con un gradiente de agua/acetonitrilo 0,1 %TFA (0,3 %/min) a 75 °C.

[0189] Figura 42.SDS-PAGE de muestras de estabilidad de 23IL0064 en 20mM Histidina pH 6,5 CONC estresadas durante 6 semanas a 4 °C, 25 °C, 37 °C y su referencia de -80 °C.

[0190] Figura 43.Dispersión de luz elástica medida a 500 nm en función de la temperatura para muestras de 23IL0075 con diferentes concentraciones (como se indica en la leyenda).

[0191] Figura 44.Dispersión de luz elástica medida a 500 nm en función de la temperatura para 250 pg/ml de 23IL0075 en fosfato 10 mM, pH 6,0. La temperatura de inicio de la formación de agregados se determina mediante ajuste lineal.

[0192] Figura 45.Dispersión de luz elástica medida a 500 nm en función de la temperatura para 250 pg/ml de 23IL0075 en acetato 10 mM, pH 6,0. La temperatura de inicio de la formación de agregados se determina mediante ajuste lineal.

[0193] Figura 46.Dispersión de luz elástica medida a 500 nm en función de la temperatura para 250 pg/ml de 23IL0075 en 10 mM de histidina, pH 6,0. La temperatura de inicio de la formación de agregados se determina mediante ajuste lineal.

[0194] Figura 47.Representación gráfica de la opalescencia (medida por OD500) (A) y el % de oligómeros (% pre-pico) detectados en SE-HPLC (B) después del estrés de congelación/descongelación. El porcentaje de oligómeros en la muestra de referencia fue de aproximadamente 0,4 %. En este estudio se compararon un tampón de acetato, de histidina y de fosfato, en combinación con manitol o una mezcla de manitol y glicina como excipientes, y Tween 80 o poloxámero en dos concentraciones diferentes como tensioactivos.

[0195] Figura 48.Representación gráfica de la opalescencia (medida por OD500) (A) y el % de oligómeros detectados en SE-HPLC (B) después del estrés de cizallamiento. El porcentaje de oligómeros en la muestra de referencia fue de aproximadamente 0,4 %. En este estudio se compararon un tampón de acetato, de histidina y de fosfato, en combinación con manitol o una mezcla de manitol y glicina como excipientes, y Tween 80 o poloxámero en dos concentraciones diferentes como tensioactivos.

[0196] Figura 49.Representación gráfica de la opalescencia (medida por OD500) (A) y el % de oligómeros detectados en SE-HPLC (B) en diferentes tampones de histidina después del estrés de congelación/descongelación. El porcentaje de oligómeros en la muestra de referencia fue de aproximadamente 0,4 %.*Para una muestra se incluyó la condición sin detergente.

[0197] Figura 50.Representación gráfica de la opalescencia (medida por OD500) (A), el % de oligómeros detectados en SE-HPLC (B) y el % de actividad (unión a albúmina) del nanocuerpo medido en Biacore (C) después del estrés de cizallamiento. El porcentaje de oligómeros en la muestra de referencia fue de aproximadamente 0,4 %. En este estudio no se incluyeron detergentes, para imitar la situación durante la etapa de concentración final del procedimiento DSP.

[0198] Figura 51.Cromatogramas de SE-HPLC (280 nm) de 23IL0075 a 25 mg/ml en 10 mM de histidina pH 6,0, 10 % de sacarosa, 0,005 % de Tween 80: la muestra de referencia comparada con 6 semanas de almacenamiento a 25 °C y 37 °C.

[0199] DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0200] A menos que indique o defina de otro modo, todos los términos usados tienen su significado habitual en la técnica, que será evidente para el experto. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales convencionales, tales como Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y, (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2.a edición, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6.a Ed.), Mosby/Elsevier, Edimburgo (2001); Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10.a Ed. Blackwell Publishing, R.U. (2001); y Janeway et al., "Immunobiology" (6a Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, Nueva York (2005), así como a los antecedentes técnicos generales citados en este documento.

[0201] Tal como se utiliza en este documento, el término "aislado" en el contexto de un polipéptido se refiere a un polipéptido que está sustancialmente libre de material celular o proteínas contaminantes de la célula o fuente de tejido de la que deriva,<o>sustancialmente libre de precursores químicosotros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un polipéptido en las que el polipéptido está separado de los componentes celulares de las células de las que está aislado<o>producido de forma recombinante, Por tanto, un polipéptido que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de un polipéptido que tiene menos de alrededor de 30 %, 20 %, 10 %<o>5 % (en peso seco) de proteína, polipéptido, péptido<o>anticuerpo heterólogo (también denominado "proteína contaminante"), Cuando el polipéptido se produce de forma recombinante, también puede estar sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de alrededor de 20 %, 10 %<o>5 % del volumen de la preparación del polipéptido, Cuando el polipéptido se produce mediante síntesis química, preferiblemente está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, está separado de los precursores químicos u otros productos químicos que participan en la síntesis del polipéptido, Por consiguiente, dichas preparaciones de un polipéptido tienen menos de alrededor de 30 %, 20 %, 10 %, 5 % (en peso seco) de precursores químicos<o>compuestos distintos del polipéptido de interés, En una realización específica, un polipéptido "aislado" se purifica mediante un procedimiento de purificación de varias etapas que comprende dos etapas de cromatografía (por ejemplo, intercambio de cationes e intercambio de aniones), una etapa de ultrafiltración de 100K, seguido de una etapa de intercambio de tampón y concentración en modo de ultrafiltración/diafiltración,

[0203] Tal como se utilizan en este documento, los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan indistintamente, Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "sujeto" y "sujetos" se refieren a un animal, preferiblemente un mamífero que incluye un no primate (por ejemplo, una vaca, un cerdo, un caballo, un gato, un perro, una rata y un ratón) y un primate (por ejemplo, un mono, como un mono cinomolgo, un chimpancé, un babuino y un ser humano), y más preferiblemente un ser humano, En una determinada realización, el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano, con una<o>más enfermedades<o>trastornos, En otra realización, el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano, en riesgo de desarrollar una<o>más enfermedades y/o trastornos,

[0205] Los términos "estabilidad" y "estable" tal como se utilizan en este documento en el contexto de una formulación que comprende un polipéptido que comprende uno<o>más dominios variables únicos se refieren a la resistencia del polipéptido en la formulación a la agregación, a la formación de productos de degradación y/o a la formación de productos de fragmentación en determinadas condiciones de transporte y/o almacenamiento, Aparte de esto y/o además, las formulaciones "estables" de la invención conservan la actividad biológica en determinadas condiciones de transporte y/o almacenamiento, La estabilidad de dicho polipéptido se puede evaluar por grados de agregación, degradación y/o fragmentación (medidos, por ejemplo, mediante SE-HPLC, RP-HPLC, IEX-HPLC, recuento de partículas subvisibles, ultracentrifugación analítica, dispersión de luz dinámica, medición de la relación 0D320/0D280, dispersión de luz elástica, etc,), y/o por % de actividad biológica (medida, por ejemplo, mediante ELISA, Biacore, etc,) en comparación con una formulación de referencia, Por ejemplo, una formulación de referencia puede ser un estándar de referencia congelado a -20 °C<o>por debajo de -65 °C (tal como por ejemplo - 80 °C) que consiste en el mismo polipéptido en la misma concentración en D-PBS<o>que consiste en el mismo polipéptido en la misma concentración y en el mismo tampón que las muestras estresadas pero sin aplicar las condiciones de estrés, referencia la cual da regularmente un único pico por SE-HPLC, RP-HPLC y/o IEX-HPLC y/o mantiene su actividad biológica en Biacore y/o ELISA,

[0207] La "solubilidad" se describe a menudo como la concentración máxima de proteína alcanzable en la que toda la proteína permanece en solución, En esta concentración, la proteína aún debería ser monomérica y estar libre de agregados, Para determinar la solubilidad de las proteínas sólo se dispone actualmente de un número limitado de técnicas (en su mayoría empíricas), Una primera y popular técnica consiste en concentrar la muestra mediante ultrafiltración centrífuga hasta el punto en que se forme una solución opalescente, Posteriormente se elimina la fracción insoluble y se mide el contenido de proteínas del sobrenadante, Se pueden utilizar dispositivos de concentración centrífuga, tal como por ejemplo los concentradores Vivaspin con un corte de peso molecular de 5 kDa, pero requieren cantidades razonables de proteína, La solubilidad también se puede controlar utilizando una macromolécula inerte tal como polietilenglicol (PEG; Mr > 6.000), que precipita las proteínas principalmente a través de un efecto de volumen excluido, un proceso que generalmente se puede entender en términos de una simple separación de fases coloidales, Se puede obtener una relación lineal logarítmica entre la solubilidad de la proteína y el porcentaje en peso de polietilenglicol, y a partir de este gráfico, la intersección arroja el valor de solubilidad, El término "buena solubilidad" del polipéptido de la invención, como se utiliza en este documento, significa que no se observa<o>se observa poca precipitación del polipéptido de la invención durante el procesamiento posterior (DSP) y/o durante el almacenamiento durante un tiempo corto<o>más largo a 5°<o>-20 °C en concentraciones que varían de 20 a 200 mg/ml<o>más, La formación de precipitados (oligómeros u otras partículas) se puede medir, por ejemplo, mediante SE-HPLC, medición de la relación 0D320/0D280 y/o dispersión elástica de luz, Preferiblemente, los polipéptidos presentes en las formulaciones de la presente invención tienen una solubilidad de al menos 20 mg/ml, al menos 30 mg/ml, al menos 40 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 60 mg/ml, al menos 65 mg/ml, al menos 70 mg/ml, al menos 80 mg/ml, al menos 90 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 110 mg/ml, al menos 120 mg/ml, al menos 130 mg/ml, al menos 140 mg/ml, al menos 150 mg/ml, al menos 200 mg/ml<o>incluso más, Preferiblemente, la relación 0D320/0D280 de las formulaciones de la presente invención es 0,05<o>inferior, tal como 0,01<o>inferior<o>0,005<o>inferior, La dispersión en la formulación de la presente invención debe estar dentro del límite de detección y preferiblemente ser inferior a 1000 abs, tal como 750 abs<o>menos<o>500 abs<o>menos,

[0208] La frase "niveles de agregación bajos a indefectables" como se utiliza en este documento se refiere a muestras que contienen no más del 5 %, no más del 4 %, no más del 3 %, no más del 2 %, no más del 1 % o no más del 0,5 % de agregación en peso de proteína. A menos que se indique explícitamente lo contrario, la agregación tal como se utiliza en la presente invención significa el desarrollo de agregados de alto peso molecular, es decir, agregados con un peso molecular aparente mayor/más alto que el peso molecular aparente observado en el análisis de SE-HPLC para dímeros del polipéptido de la invención (tal como, por ejemplo, 44 kDa como se observó para SEQ ID NO: 4; 36-38 kDa como se observó para SEQ ID<n>O'<s>1-3; y 36 kDa como se observó para SEQ iD NO: 5 en SE-HPLC) en comparación con marcadores de peso molecular. La agregación se puede evaluar mediante varios métodos conocidos en la técnica. Sin ser limitantes, los ejemplos incluyen cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (SE-HPLC), conteo de partículas subvisibles, ultracentrifugación analítica (AUC), dispersión de luz dinámica (DLS), dispersión de luz estática (SLS), dispersión de luz elástica, medición de 0D320/0D280, espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), dicroísmo circular (CD), técnicas de desplegamiento de proteínas inducido por urea, fluorescencia intrínseca de triptófano y/o técnicas de calorimetría diferencial de barrido.

[0210] El término "niveles bajos a indefectables de fragmentación y/o degradación" como se utiliza en este documento se refiere a muestras que contienen igual o más del 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de la proteína total, por ejemplo, en un solo pico según lo determinado por SE-HPLC, RP-HPLC y/o IEX-HPLC, que representa el polipéptido no degradado, y que no contiene otros picos individuales que tengan más del 5 %, más del 4 %, más del 3 %, más del 2 %, más del 1 % o más del 0,5 % de la proteína total en cada uno.

[0212] El término "muy poca o ninguna pérdida de las actividades biológicas" como se utiliza en este documento se refiere a las actividades del dominio variable único, incluidas, pero sin limitarse a, las capacidades de unión específicas del dominio variable único a la diana de interés, medidas mediante diversos ensayos inmunológicos, incluidos, pero sin limitarse a, ELISA y/o resonancia de plasmones superficiales (Biacore). En una realización, los dominios variables únicos de las formulaciones de la invención conservan al menos el 50 %, preferiblemente al menos el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o incluso el 99 % o más de la capacidad de unirse específicamente a un antígeno en comparación con una formulación de referencia, medida mediante un ensayo inmunológico conocido por un experto en la técnica o descrito en este documento. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo basado en ELISA (por ejemplo como se describe en la sección Ejemplos) para comparar la capacidad del dominio variable único para unirse específicamente a su diana. Una "formulación de referencia" como se utiliza en este documento se refiere a una formulación que se congela a una temperatura de -20 ± 5 °C o por debajo de -64 °C (como por ejemplo a -80 °C) que consiste en el mismo dominio variable único en la misma concentración en D-PBS o que consiste en los mismos dominios variables únicos en la misma concentración en el mismo tampón/excipientes que las muestras estresadas pero sin aplicar las condiciones de estrés, formulación de referencia la cual regularmente da un pico único por SE-HPLC, RP-HPLC y/o IEX-HPLC y/o mantiene su actividad biológica en Biacore y/o ELISA.

[0214] La frase "farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en este documento significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, o incluido en la Farmacopea de los Estados Unidos, la Farmacopea Europea u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. En este sentido, debe ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no provocar un efecto nocivo inaceptable en el sujeto.

[0216] Según la Farmacopea Europea, una solución se considera isotónica si tiene una osmolalidad de 290 ± 30 m0sm/kg. Por lo tanto, se realizaron mediciones de osmolalidad en las diferentes formulaciones utilizadas en los estudios de estabilidad. La isotonicidad se puede medir, por ejemplo, con un osmómetro de presión de vapor o de congelación de hielo.

[0218] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de un agente (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico) que es suficiente para reducir y/o mejorar la gravedad y/o duración de una o más enfermedades y/o trastornos.

[0220] El término "poliol" tal como se utiliza en este documento se refiere a azúcares que contienen muchos grupos hidroxilo (-0H) en comparación con un sacárido normal. Los polioles incluyen alcoholes y hidratos de carbono tales como manitol, sorbitol, maltitol, xilitol, isomalt, eritritol, lactitol, sacarosa, glucosa, galactosa, fructosa, fucosa, ribosa, lactosa, maltosa y celubiosa.

[0222] Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "agente terapéutico" y "agentes terapéuticos" se refieren a cualquier agente que pueda utilizarse en la prevención, el tratamiento y/o el manejo de una o más enfermedades y/o trastornos. En el contexto de la presente invención, el término "agente terapéutico" se refiere a un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos. En ciertas otras realizaciones, el término "agente terapéutico" se refiere a un agente distinto del polipéptido de la invención que podría usarse en la formulación.

[0224] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente terapéutico (por ejemplo, un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos), que es suficiente para reducir la gravedad de una o más enfermedades y/o trastornos.

[0225] El término "excipiente" como se utiliza en este documento se refiere a una sustancia inerte que se utiliza comúnmente como diluyente, vehículo, conservante, aglutinante o agente estabilizador para medicamentos que imparte una propiedad física beneficiosa a una formulación, tal como mayor estabilidad de las proteínas, mayor solubilidad de las proteínas y/o disminución de la viscosidad. Los ejemplos de excipientes incluyen, pero no se limitan a, proteínas (por ejemplo, seroalbúmina), aminoácidos (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, glicina), tensioactivos (por ejemplo, SDS, Tween 20, Tween 80, poloxámeros, polisorbato y tensioactivos no iónicos), sacáridos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, maltosa y trehalosa), polioles (por ejemplo, manitol y sorbitol), ácidos grasos y fosfolípidos (por ejemplo, alquilsulfonatos y caprilato). Para obtener información adicional sobre los excipientes, véase Remington's Pharmaceutical Sciences (por Joseph P. Remington, 18.a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA), que se incorpora al presente documento en su totalidad.

[0227] El término "dominio variable" o "dominio variable de inmunoglobulina" se refiere a la parte o dominio de una molécula de inmunoglobulina o anticuerpo que es parcial o totalmente responsable de la unión al antígeno. El término "dominio variable único" o "dominio variable único de inmunoglobulina" (ambos términos se utilizan indistintamente) define moléculas en las que el sitio de unión al antígeno está presente en, y formado por, un único dominio de inmunoglobulina. Esto diferencia a los dominios variables únicos de las inmunoglobulinas "convencionales" o sus fragmentos, en los que dos dominios de inmunoglobulina, en particular dos "dominios variables", interactúan para formar un sitio de unión al antígeno. Normalmente, en inmunoglobulinas convencionales, un dominio variable de la cadena pesada (VH) y un dominio variable de la cadena ligera (VL) interactúan para formar un sitio de unión al antígeno. En este caso, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) tanto de VH como de VL contribuirán al sitio de unión al antígeno, es decir, un total de 6 CDR estarán implicadas en la formación del sitio de unión al antígeno.

[0229] Por el contrario, el sitio de unión de un dominio variable único está formado por un único dominio VH o VL. Por lo tanto, el sitio de unión al antígeno de un dominio variable único está formado por no más de tres CDR. El término "dominio variable único" comprende fragmentos de inmunoglobulinas convencionales en los que el sitio de unión al antígeno está formado por un dominio variable único.

[0231] Generalmente, los dominios variables únicos serán secuencias de aminoácidos que consisten esencialmente en 4 regiones marco (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente); o cualquier fragmento adecuado de dicha secuencia de aminoácidos (que generalmente contendrá al menos algunos de los residuos de aminoácidos que forman al menos una de las CDR). Dichos dominios variables únicos y fragmentos son lo más preferentemente de modo que comprenden un pliegue de inmunoglobulina o son capaces de formar, en condiciones adecuadas, un pliegue de inmunoglobulina. Como tal, el dominio variable único puede comprender, por ejemplo, una secuencia de dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia V<l>) o un fragmento adecuado de la misma; o una secuencia de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia V<h>o una secuencia V<hh>) o un fragmento adecuado de la misma; siempre que sea capaz de formar una única unidad de unión a antígeno (es decir, una unidad de unión a antígeno funcional que consiste esencialmente en el dominio variable único, de modo que el dominio de unión único a antígeno no necesita interactuar con otro dominio variable para formar una unidad de unión a antígeno funcional, como es, por ejemplo, el caso de los dominios variables que están presentes, por ejemplo, en anticuerpos convencionales y fragmentos scFv que necesitan interactuar con otro dominio variable, por ejemplo, a través de una interacción V<h>/V<l>, para formar un dominio de unión a antígeno funcional).

[0233] En un aspecto de la invención, los dominios variables únicos son secuencias de dominio variable de cadena ligera (por ejemplo, una secuencia V<l>) o secuencias de dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, una secuencia V<h>); más específicamente, los dominios variables únicos pueden ser secuencias de dominio variable de cadena pesada que derivan de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional o secuencias de dominio variable de cadena pesada que derivan de un anticuerpo de cadena pesada.

[0235] El dominio variable único puede ser un anticuerpo de dominio (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para uso como anticuerpo de dominio), un anticuerpo de dominio único (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para uso como anticuerpo de dominio único), un "dAb" (o una secuencia de aminoácidos que sea adecuada para uso como dAb) o un Nanobody® (como se define en este documento, e incluyendo, pero sin limitarse a, una secuencia V<hh>) [Nota:Nanobody® yNanobodies® son marcas registradas de Ablynx NV]; otros dominios variables únicos, o cualquier fragmento adecuado de cualquiera de ellos. Para una descripción general de anticuerpos de dominio (único), también se hace referencia al estado de la técnica citado en el presente documento, así como al documento de patente EP 0 368 684. Para el término "dAb", se hace referencia, por ejemplo, a Ward et al. 1989 (Nature 341 (6242): 544-546), a Holt et al. 2003 (Trends Biotechnol. 21(11): 484-490); así como, por ejemplo, en los documentos WO 04/068820, WO 06/030220, WO 06/003388 y otras solicitudes de patente publicadas de Domantis Ltd. Cabe señalar también que, aunque menos preferidos en el contexto de la presente invención por no ser de origen mamífero, los dominios variables únicos pueden derivar de ciertas especies de tiburón (por ejemplo, los denominados "dominios igNAR", véase, por ejemplo, el documento WO 05/18629),

[0237] en particular, los polipéptidos de la invención pueden comprender uno o más nanocuerpos o un fragmento adecuado de los mismos. Para una descripción más detallada de los V<hh>y los nanocuerpos, se hace referencia al artículo de revisión de Muyldermans 2001 (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302); así como a las siguientes solicitudes de patente, que se mencionan como antecedentes generales de la técnica: WO 94/04678, WO 95/04079 y WO 96/34103 de Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 231 y WO 02/48193 de Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 y WO 03/055527 del Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO 03/050531 de Algonomics N.V. y Ablynx N.V.; WO 01/90190 del Consejo Nacional de Investigación de Canadá; WO 03/025020 (= EP 1433 793) del Instituto de Anticuerpos; así como WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 y WO 06/122825 de Ablynx N.V. y las solicitudes de patente publicadas por Ablynx N.V. También se hace referencia al estado de la técnica adicional mencionado en estas solicitudes y, en particular, a la lista de referencias mencionada en las páginas 41-43 de la solicitud Internacional WO 06/040153. Como se describe en estas referencias, los nanocuerpos (en particular las secuencias V<hh>y los nanocuerpos parcialmente humanizados) pueden caracterizarse en particular por la presencia de uno o más"residuos distintivos” en una o más de las secuencias del marco. Una descripción más detallada de los nanocuerpos, incluyendo la humanización y/o camelización de nanocuerpos, así como otras modificaciones, partes o fragmentos, derivados o "fusiones de nanocuerpos", construcciones multivalentes (incluyendo algunos ejemplos no limitantes de secuencias de enlace) y diferentes modificaciones para aumentar la vida media de los nanocuerpos y sus preparaciones se pueden encontrar, por ejemplo, en los documentos WO 08/101985 y WO 08/142164.

[0239] El número total de residuos aminoacídicos en un Nanobody puede estar en la región de 110-120, es preferiblemente 112-115, y es más preferiblemente 113. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las partes, fragmentos, análogos o derivados (como se describen con más detalle en el presente documento) de un Nanobody no están particularmente limitados en cuanto a su longitud y/o tamaño, siempre que dichas partes, fragmentos, análogos o derivados cumplan los requisitos adicionales expuestos brevemente en el presente documento y también sean preferiblemente adecuados para los fines descritos en el presente documento.

[0241] Por tanto, en el sentido de la presente invención, el término "dominio variable único" comprende polipéptidos que derivan de una fuente no humana, preferiblemente un camélido, preferiblemente un anticuerpo de cadena pesada de camélido. Pueden humanizarse, como se describió anteriormente. Además, el término comprende polipéptidos derivados de fuentes no camélidas, por ejemplo, ratón o humano, que han sido "camelizados", como se describió anteriormente.

[0243] El término "dominio variable único" también abarca dominios variables de diferente origen, que incluyen dominios variables de ratón, rata, conejo, burro, humano y camélido; así como dominios variables completamente humanos, humanizados o quiméricos. Por ejemplo, la invención comprende dominios variables de camélidos y dominios variables de camélidos humanizados, o dominios variables camelizados, por ejemplo, dAb camelizado como lo describen Ward et al (véase por ejemplo el documento WO 94/04678 y Davies y Riechmann (1994, FEBS Lett. 339(3): 285-290) y (1996, Protein Eng.9(6): 531-537)). Además, la invención comprende dominios variables fusionados, por ejemplo, construcciones multivalentes y/o multiespecíficas (para polipéptidos multivalentes y multiespecíficos que contienen uno o más dominios V<hh>y su preparación, también se hace referencia a Conrath et al. 2001 (J. Biol. Chem.

[0244] 276: 7346-7350), así como, por ejemplo, los documentos WO 96/34103 y WO 99/23221).

[0246] A menos que se indique lo contrario, el término "secuencia de inmunoglobulina", ya sea que se utilice aquí para referirse a un anticuerpo de cadena pesada o a un anticuerpo convencional de 4 cadenas, se utiliza como un término general para incluir tanto el anticuerpo de tamaño completo, las cadenas individuales del mismo, así como todas las partes, dominios o fragmentos del mismo (incluidos, pero sin limitarse a, los dominios de unión a antígeno o fragmentos como los dominios V<hh>o los dominios V<h>/V<l>, respectivamente). Las expresiones moléculas de unión al antígeno o proteína de unión al antígeno se usan indistintamente con secuencia de inmunoglobulina e incluyen Nanobodies.

[0247] Los dominios variables únicos proporcionados por la invención están preferiblemente en forma esencialmente aislada (como se define en este documento), o forman parte de un polipéptido de la invención (como se define en este documento), que puede comprender o consistir esencialmente en uno o más dominios variables únicos y que opcionalmente puede comprender además una o más secuencias de aminoácidos adicionales (todas opcionalmente unidas a través de uno o más enlazadores adecuados). Por ejemplo, y sin limitación, el uno o más dominios variables únicos pueden usarse como una unidad de unión en dicho polipéptido, que opcionalmente puede contener una o más secuencias de aminoácidos adicionales que pueden servir como una unidad de unión (es decir, contra uno o más dianas adicionales), para proporcionar un polipéptido monovalente, multivalente o multiespecífico de la invención, respectivamente como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 08/101985, WO 08/142164, WO 09/068625, WO 09/068627 y WO 08/020079. Dicha proteína o polipéptido también puede estar en forma esencialmente aislada (como se define en este documento) y los métodos de la presente invención para la expresión y/o producción de dominios variables únicos se aplican igualmente a polipéptidos que comprenden uno o más dominios variables únicos.

[0248] Según la invención, el término "dominio variable único" puede comprender construcciones que comprenden dos o más unidades de unión a antígeno en forma de dominio variable único, como se describió anteriormente. Por ejemplo, dos (o más) dominios variables con la misma o diferente especificidad de antígeno se pueden unir para formar, por ejemplo, una construcción bivalente, trivalente o multivalente. Combinando dominios variables de dos o más especificidades se pueden formar construcciones biespecíficas, triespecíficas, etc. Por ejemplo, un dominio variable según la invención puede comprender dos dominios variables dirigidos contra la diana A y un dominio variable dirigido contra la diana B. Dichas construcciones y modificaciones, que el experto en la técnica puede fácilmente visualizar, se engloban en el término dominio variable tal como se utiliza en el presente documento y también se denominan"polipéptido de la invención” o "polipéptidos de la invención",

[0250] Como se describe con más detalle en el párrafo m) de la página 53 del documento WO 08/020079, una secuencia de aminoácidos (tal como un nanocuerpo, un anticuerpo, un polipéptido de la invención o, en general, una proteína o polipéptido de unión a antígeno o un fragmento del mismo) que puede unirse (específicamente) a, que tiene afinidad por y/o que tiene especificidad por un determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína específicos (o por al menos una parte, fragmento o epítopo del mismo) se dice que va"contra"o está"dirigida contra"dicho determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína.

[0252] El polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos para su uso en la formulación de la invención puede ser terapéutico o profiláctico, y puede ser útil en el tratamiento y/o manejo de una o más enfermedades. En un aspecto específico, el polipéptido tiene al menos dos dominios variables únicos. En otro aspecto específico, el polipéptido tiene al menos tres dominios variables únicos. Preferiblemente, el polipéptido comprende al menos un dominio variable único dirigido contra HSA. En otro aspecto específico, el polipéptido comprende al menos un dominio variable único contra RANKL. En otro aspecto específico, el polipéptido comprende al menos un dominio variable único contra IL-6R. En otro aspecto específico, el polipéptido comprende al menos un dominio variable único contra IL-23. Más preferiblemente, el polipéptido está dirigido contra y/o se une específicamente a RANKL y HSA, IL-6R y HSA y/o IL-23 y HSA. En aún otro aspecto, el polipéptido comprende al menos un dominio variable único contra RANKL y al menos un dominio variable único contra HSA. En aún otro aspecto, el polipéptido comprende al menos un dominio variable único contra IL-6R y al menos un dominio variable único contra HSA. En aún otro aspecto, el polipéptido comprende al menos un dominio variable único contra IL-23 y al menos un dominio variable único contra HSA. En aún otro aspecto, el polipéptido comprende al menos dos dominios variables únicos contra RANKL y al menos un dominio variable único contra HSA. En aún otro aspecto, el polipéptido comprende al menos dos dominios variables únicos contra IL-6R y al menos un dominio variable único contra HSA. En aún otro aspecto, el polipéptido comprende al menos dos dominios variables únicos contra IL-23 y al menos un dominio variable único contra HSA. En un aspecto preferido, los dominios variables únicos utilizados en el polipéptido de la invención se seleccionan de los documentos WO 08/142164 (tal como por ejemplo SEQ ID NO's; 745 y/o 791 del documento WO 08/142164), WO 08/020079, WO 09/068627 (tal como, por ejemplo, las SEQ ID NO 2578, 2584 y/o 2585 del documento WO 09/068627), solicitud PCT n.2 PCT/EP2010/054747 de Ablynx N.V., solicitud PCT n.2 PCT/EP2010/054764 de Ablynx N.V. (tal como por ejemplo SEQ ID NO; 66 y/o 98 del documento PCT/EP2010/054764) y WO 08/028977 (tal como por ejemplo SEQ ID NO; 62 del documento WO 08/028977). Los polipéptidos preferidos de la invención se seleccionan de SEQ ID NO; 1 a 6.

[0253] La concentración de polipéptido de la invención presente en la formulación puede ser cualquier concentración del polipéptido que proporcione el efecto deseado al sujeto. En un aspecto preferido, la concentración del polipéptido de la invención es de 1 a 200 mg/ml, tal como alrededor de 1 mg/ml, alrededor de 2 mg/ml, alrededor de 5 mg/ml, alrededor de 10 mg/ml, alrededor de 15 mg/ml o alrededor de 20 mg/ml, alrededor de 30 mg/ml, alrededor de 40 mg/ml, alrededor de 50 mg/ml, alrededor de 60 mg/ml, alrededor de 65 mg/ml, alrededor de 70 mg/ml, alrededor de 80 mg/ml, alrededor de 90 mg/ml o alrededor de 100 mg/ml o más. En ciertas realizaciones, la concentración de polipéptido de la invención puede ser de 110 mg/ml o más, 120 mg/ml o más, 130 mg/ml o más, 140 mg/ml o más, 150 mg/ml o más o incluso 200 mg/ml o más. En un aspecto específico, una formulación de la invención comprende alrededor de 10 mg/ml de polipéptido de la invención,

[0255] La formulación de la invención se define en las reivindicaciones.

[0257] Las formulaciones estables de la presente invención comprenden polipéptidos de la invención que tienen una buena solubilidad y una alta estabilidad incluso durante el transporte y/o largos períodos de almacenamiento y que exhiben poca o ninguna agregación. Además del polipéptido de la invención, las formulaciones de la presente invención comprenden al menos un vehículo acuoso y un tampón. El vehículo utilizado en la formulación de la invención debe ser un vehículo líquido. Preferiblemente, el vehículo es un vehículo acuoso tal como, por ejemplo, agua destilada, agua MilliQ o agua para inyección (WFI).

[0259] La formulación no debe contener sal inorgánica en una concentración superior a 150 mM. Sin ser limitativos, las sales inorgánicas para uso en la formulación de la invención pueden seleccionarse entre NaCI y KCl. Por consiguiente, la formulación de la invención tiene una concentración de sal inorgánica de 150 mM o inferior, preferiblemente 120 mM o inferior, o 100 mM o inferior, más preferiblemente 90 mM o inferior, 80 mM o inferior, 75 mM o inferior, tal como 50 mM o inferior o incluso 40 mM o inferior, 25 mM o inferior, 10 mM o inferior o 5 mM o inferior. Lo más preferible es que la formulación no contenga ninguna sal inorgánica.

[0261] El pH de la formulación de la invención generalmente no debe ser igual al punto isoeléctrico del polipéptido particular de la invención presente en la formulación y puede variar de alrededor de 5,5 a alrededor de 8,0, o de alrededor de 6,0 a alrededor de 7,5, preferiblemente de alrededor de 6,2 a 7,5, alrededor de 6,5 a 7,5, lo más preferible de alrededor de 6,5 a 7,0. En un aspecto específico, la formulación de la invención tiene un pH de alrededor de 6,5. En otro aspecto específico, la formulación de la invención tiene un pH de alrededor de 7,0. En otro aspecto específico más, la formulación de la invención tiene un pH de alrededor de 6,0.

[0263] La formulación puede estar amortiguada por un tampón seleccionado del grupo que consiste en histidina pH 6,0-6,5, tal como histidina pH 6,5 o histidina pH 6,0.

[0265] La concentración del tampón presente en la formulación de la invención puede variar desde 10 mM a 50 mM, 10 mM a 25 mM, 10 mM a 20 mM. En un aspecto específico, la concentración de tampón en las formulaciones de la invención es 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM o 100 mM. Preferiblemente, la concentración está entre 10 y 20 mM, tal como 10 mM o 15 mM.

[0267] Se puede utilizar en la formulación de la invención cualquier forma de histidina adecuada para la formulación y administración parenteral. La pureza de la histidina debe ser al menos del 98 %, al menos del 99 % o al menos del 99,5 %. En un aspecto específico, una formulación de la invención comprende tampón de histidina 15 mM pH 6,5. En otro aspecto específico, una formulación de la invención comprende tampón de histidina 10 mM pH 6,0.

[0269] Además de o además de la histidina, se pueden utilizar tampones de hepes pH 7,0 en las formulaciones de la presente invención. En la formulación de la invención se puede utilizar cualquier forma de hepes adecuada para la formulación y administración parenteral. La pureza del hepes debe ser al menos del 98 %, al menos del 99 % o al menos del 99,5 %. En un aspecto específico, una formulación de la invención comprende 15 mM de tampón de hepes pH 7,0.

[0271] Un experto en la técnica entenderá que la formulación de la invención puede ser isotónica o ligeramente hipotónica con la sangre humana, es decir, la formulación de la invención tiene esencialmente la misma presión osmótica o una ligeramente inferior a la de la sangre humana. Esta formulación isotónica o ligeramente hipotónica generalmente tiene una presión osmótica de alrededor de 240 müSm/kg a alrededor de 320 müSm/kg, tal como alrededor de 240 müSm/kg o más, 250 mOSm/kg o más o 260 mOSm/kg o más.

[0273] La tonicidad de una formulación se ajusta mediante el uso de modificadores de tonicidad. Los "modificadores de tonicidad" son aquellas sustancias inertes farmacéuticamente aceptables que pueden añadirse a la formulación para proporcionar una isotonicidad de la formulación. Un modificador de tonicidad preferido en la formulación de la invención son los excipientes. Los excipientes preferidos para su uso en la formulación de la invención pueden seleccionarse entre azúcares, polioles y tensioactivos.

[0275] Por consiguiente, en otro aspecto, la formulación de la invención comprende un excipiente. Los excipientes preferidos incluyen polioles y/o azúcares. El poliol y/o azúcar puede ser un monosacárido tal como glucosa o mañosa, o un polisacárido que incluye disacáridos tales como (sin ser limitante) sacarosa y lactosa, así como derivados del azúcar que incluyen alcoholes de azúcar y ácidos de azúcar. Los polioles y alcoholes de azúcar incluyen (sin ser limitantes) manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol. Un ejemplo no limitante de un ácido de azúcar es el L-gluconato. Otros azúcares ejemplares incluyen (sin ser limitantes) trehalosa, glicina, maltosa, rafinosa, etc. La concentración del excipiente puede variar de alrededor de 1 % a 10 % (p:v), preferiblemente de alrededor de 2,5 % a 10 % (p:v), más preferiblemente de alrededor de 5 % a 10 % (p:v), tal como por ejemplo 5 % (p:v), 7,5 % (p:v), 8 % o 10 % (p:v). A lo largo de la presente invención la concentración del excipiente se dará como % (p:v). En un aspecto preferido, la formulación comprende sacarosa, preferiblemente a una concentración de aproximadamente 5 % a 10 % (peso:v), tal como alrededor de 8 % (peso:v).

[0277] En otro aspecto, la formulación de la invención comprende un tensioactivo. Un tensioactivo se refiere a un agente tensioactivo que comprende una porción hidrófoba y una porción hidrófila. En un aspecto preferido, el tensioactivo es no iónico. Ciertos tensioactivos no iónicos ejemplares incluyen (sin ser limitantes) PEG8000 y polisorbato, incluyendo sin ser limitantes, polisorbato 80 (Tween 80) y polisorbato 20 (Tween 20), Triton X-100, ésteres de polioxipropilenopolioxietileno (Pluronic®) y NP-40. En un aspecto específico, el tensioactivo se selecciona entre Tween 20, Tween 80 o un poloxámero. La concentración del tensioactivo puede variar de alrededor de 0,001 % a 1 % (v:v) (preferiblemente de alrededor de 0,001 % a 0,1 % (v:v), o 0,01 % a 0,1 % (v:v) tal como 0,001 % (v:v), 0,005 % (v:v), 0,01 % (v:v), 0,02 % (v:v), 0,05 % (v:v), 0,08 % (v:v), 0,1 % (v:v), 0,5 % (v:v), o 1 % (v:v) de la formulación, preferiblemente 0,01 % (v:v)). A lo largo de la presente invención, la concentración del tensioactivo se dará como % (v:v). En una realización específica, el tensioactivo es Tween 20 o Tween 80, que está en una concentración de 0,001 % (v:v), 0,005 % (v:v), 0,01 % (v:v), 0,02 % (v:v), 0,05 % (v:v), 0,08 % (v:v), 0,1 % (v:v), 0,5 % (v:v) o 1 % (v:v) de la formulación, preferiblemente 0,01 % (v:v).

[0279] En un aspecto preferido, la formulación de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas comprende además al menos dos componentes seleccionados entre:

[0280] a) Un tampón a una concentración de 10 mM a 100 mM seleccionado del grupo que consiste en histidina pH 6,0-6,5; b) Un excipiente en una concentración de 1% a20 %;

[0281] c) Un tensioactivo en una concentración de 0,001 % a 1 % seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o poloxámeros; en la que dicha formulación tiene una concentración de sal inorgánica de 150 mM o menor.

[0282] En un aspecto, además del polipéptido de la Invención, la formulación de la presente Invención puede comprender al menos un vehículo acuoso que tiene un pH de 5,5 a 8,0, un tampón seleccionado del grupo que consiste en histidina pH 6,0-6,5 y un excipiente. Preferiblemente el tampón es histidina pH 6,0-6,5 o hepes pH 7,0. Lo más preferible es que el tampón sea histidina pH 6,5 o histidina pH 6,0. El tampón tiene preferiblemente una concentración que varía de 10 mM a 50 mM, 10 mM a 25 mM, 10 mM a 20 mM. En un aspecto específico, la concentración de tampón en las formulaciones de la invención es 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM o 100 mM. En un aspecto preferido, la concentración está entre 10 y 20 mM, tal como 10 mM o 15 mM. En un aspecto específico, una formulación de la invención comprende 15 mM de tampón de histidina pH 6,5. En otro aspecto específico, una formulación de la invención comprende 10 mM de tampón de histidina pH 6,0. Los excipientes preferidos son polioles tales como manitol, sorbitol, etc., sacáridos tales como por ejemplo sacarosa, mañosa, trehalosa, etc. La concentración del excipiente puede variar de alrededor de 1 % a 20 %, preferiblemente de alrededor de 2,5 % a 15 %, más preferiblemente de alrededor de 5 % a 10 %, tal como por ejemplo 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %. En un aspecto preferido, la formulación comprende sacarosa, preferiblemente en una concentración de alrededor de 5 % a 10 %, tal como alrededor de 8 % 0 alrededor de 10 %. Por consiguiente, una formulación preferida de la invención puede comprender 15 mM de histidina pH 6,5 y 8 % de sacarosa. Otra formulación preferida de la invención puede comprender 10 mM de histidina pH 6,0 y 10 % de sacarosa.

[0284] En otro aspecto, además del polipéptido de la invención, la formulación de la presente invención puede comprender al menos un vehículo acuoso que tiene un pH de 5,5 a 8,0, un tampón seleccionado del grupo que consiste en histidina pH 6,0-6,5 y un tensioactivo. Lo más preferible es que el tampón sea histidina pH 6,5 o histidina pH 6,0. El tampón tiene preferiblemente una concentración que varía de 10 mM a 50 mM, 10 mM a 25 mM, 10 mM a 20 mM. En un aspecto específico, la concentración de tampón en la formulación de la invención es 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM o 100 mM. En un aspecto preferido, la concentración está entre 10 y 20 mM, tal como 10 mM o 15 mM. En un aspecto específico, una formulación de la invención comprende tampón de histidina 15 mM pH 6,5. En otro aspecto específico, una formulación de la invención comprende tampón de histidina 10 mM pH 6,0. El tensioactivo puede seleccionarse entre Tween 20, Tween 80 o poloxámeros. La concentración del tensioactivo puede variar de alrededor de 0,001 % a 1 % (preferiblemente de alrededor de 0,001 % a 0,1 %, o 0,01 % a 0,1 % tal como 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 %, o 1 % de la formulación, preferiblemente 0,01 %). En una realización específica, el tensioactivo es Tween 20 o Tween 80, que está en una concentración de 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 % o 1 % de la formulación, tal como por ejemplo 0,01 % de Tween 80 o 0,005 % de Tween 80. Por consiguiente, una formulación preferida de la invención puede comprender 15 mM de histidina pH 6,5 y 0,01 % de Tween 80. Otra formulación preferida de la invención puede comprender 10 mM de histidina pH 6,0 y 0,005 % de Tween 80.

[0286] En aún otro aspecto, además del polipéptido de la invención, la formulación de la presente invención puede comprender al menos un vehículo acuoso que tiene un pH de 5,5 a 8,0, un excipiente y un tensioactivo. Los excipientes preferidos son polioles tales como manitol, sorbitol, etc., sacáridos tales como por ejemplo sacarosa, mañosa, trehalosa, etc. La concentración del excipiente puede variar de alrededor de 1 % a 20 %, preferiblemente de alrededor de 2,5 % a 15 %, más preferiblemente de alrededor de 5 % a 10 %, tal como por ejemplo 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %. En un aspecto preferido, la formulación comprende sacarosa, preferiblemente en una concentración de aproximadamente 5 % a 10 %, tal como alrededor de 8 % o 10 %. El tensioactivo puede seleccionarse entre Tween 20, Tween 80 o un poloxámero. La concentración del tensioactivo puede variar de alrededor de 0,001 % a 1 % (preferiblemente de alrededor de 0,001 % a 0,1 %, o de 0,01 % a 0,1 % tal como 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 %, o 1 % de la formulación, preferiblemente 0,01 %). En una realización específica, el tensioactivo es Tween 20 o Tween 80, que está en una concentración de 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 % o 1 % de la formulación, tal como por ejemplo 0,01 % de Tween 80 o 0,005 % de Tween 80. Por consiguiente, una formulación preferida de la invención puede comprender 8 % de sacarosa y 0,01 % de Tween 80. Otra formulación preferida de la invención puede comprender 10 % de sacarosa y 0,005 % de Tween 80.

[0288] Por consiguiente, una formulación de la invención puede, además del polipéptido de la invención, comprender por ejemplo:

[0289] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,5, tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM a 100 mM; y

[0290] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol a una concentración de 1 % a 20 %. o

[0291] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,5, tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM a 100 mM; y

[0292] c) Un tensioactivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,001 % a 1 %. o

[0293] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 1% a20 %; y c) Un tensioactivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,001 % a 1 %. o

[0294] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,5, a una concentración de 15 mM; y

[0295] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol a una concentración de 1 % a 20 %. o

[0296] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 15 mM; y

[0297] <c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20<o>un poloxámero en una concentración de 0,001 % a o

[0298] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 10 mM a 100 mM; y b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol a una concentración del 8 %.

[0299] o

[0300] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración del 8 %; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,001 % a 1 %. o

[0301] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 10 mM a 100 mM; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero a una concentración de 0,01 %. o

[0302] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 1 % a 20 %; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero a una concentración de 0,01 %.

[0303] o

[0304] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM; y

[0305] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol a una concentración de 1 % a 20 %. o

[0306] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM; y

[0307] <c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,001 % a 1 %. o

[0308] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM a 100 mM; y b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol a una concentración del 10 %.

[0309] o

[0310] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración del 10 %; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,001 % a 1 %. o

[0311] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM a 100 mM; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero a una concentración de 0,005 %. o

[0312] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 1 % a 20 %; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero a una concentración de 0,005 %. o

[0313] a) Tampón de histidina pH 6,5 o pH 6,0 a una concentración de 10 mM a 100 mM; y

[0314] b) Sacarosa a una concentración de 1 % a 20 %.

[0315] o

[0316] a) Tampón de histidina pH 6,5 o pH 6,0 a una concentración de 10 mM a 100 mM; y

[0317] <c>) Tween 80 en una concentración de 0,001 % a 1 %.

[0318] o

[0319] b) Sacarosa en una concentración de 1 % a 20 %; y

[0320] <c>) Tween 80 en una concentración de 0,001 % a

[0321] o

[0322] a) tampón de histidina 15 mM pH 6,5; y

[0323] b) sacarosa al 8 %.

[0324] o

[0325] a) tampón de histidina 15 mM pH 6,5; y

[0326] <c>) Tween 80 al 0,01 %.

[0327] o

[0328] b) sacarosa al 8 %; y

[0329] <c>) Tween 80 al 0,01 %.

[0330] o

[0331] a) tampón de histidina 10 mM pH 6,0; y

[0332] b) sacarosa al 10 %.

[0333] o

[0334] a) tampón de histidina 10 mM pH 6,0; y

[0335] <c>) Tween 80 al 0,005 %.

[0336] o

[0337] b) sacarosa al 10 %; y

[0338] <c>) Tween 80 al 0,005 %.

[0340] En un aspecto preferido, la formulación de la invención puede comprender un polipéptido seleccionado entre SEQ ID NO: 1 a 6. Por consiguiente la formulación de la invención puede comprender:

[0341] a) rampón de histidina 15 mM pH 6,5;

[0342] b) sacarosa al 8 %; y

[0343] d) Un polipéptido seleccionado entre SEQ ID NO: 1 a 6 (por ejemplo, a una concentración de 10 mg/ml). o a) rampón de histidina 15 mM pH 6,5;

[0344] c) Tween 80 al 0,01 %; y

[0345] d) Un polipéptido seleccionado entre SEQ ID NO: 1 a 6 (por ejemplo, a una concentración de 10 mg/ml),<o>b) sacarosa al 8 %;

[0346] c) Tween 80 al 0,01 %; y

[0347] d) Un polipéptido seleccionado entre SEQ ID NO: 1 a 6 (por ejemplo, a una concentración de 10 mg/ml), o a) rampón de histidina 10 mM pH 6,0;

[0348] b) sacarosa al 10 %; y

[0349] c) Un polipéptido seleccionado entre SEQ ID NO: 1 a 6 (por ejemplo, a una concentración de 10 mg/ml), o a) rampón de histidina 10 mM pH 6,0;

[0350] c) Tween 80 al 0,005 %; y

[0351] d) Un polipéptido seleccionado entre SEQ ID NO: 1 a 6 (por ejemplo, a una concentración de 10 mg/ml), o b) sacarosa al 10 %;

[0352] c) Tween 80 al 0,005 %; y

[0353] d) Un polipéptido seleccionado entre SEQ ID NO: 1 a 6 (por ejemplo, en una concentración de 10 mg/ml),

[0355] En otro aspecto preferido, la formulación de la presente invención comprende un vehículo acuoso que tiene un pH de 5,5 a 8,0 y un polipéptido como se definió anteriormente("polipéptido de la invención”)que comprende uno o más dominios variables únicos a una concentración de 1 mg/ml a 200 mg/ml, formulándose dicha formulación para la administración a un sujeto humano, y comprende los componentes seleccionados de:

[0356] a) Un tampón a una concentración de 10 mM a 100 mM seleccionado del grupo que consiste en histidina pH 6,0-6,5; b) Un excipiente en una concentración de 1 % a 20 %; y

[0357] c) Un tensioactivo en una concentración de 0,001 % a 1 % seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero; en la que dicha formulación tiene una concentración de sal inorgánica de 150 mM o menor,

[0359] Por consiguiente, en este aspecto preferido, además del polipéptido de la invención, las formulaciones de la presente invención pueden comprender al menos un vehículo acuoso que tiene un pH de 5,5 a 8,0, un tampón seleccionado del grupo que consiste en histidina pH 6,0-6,5, un excipiente y un tensioactivo, Preferiblemente, el tampón se selecciona entre histidina pH 6,0-6,5 o hepes pH 7,0, Lo más preferible es que el tampón sea histidina pH 6,5 o histidina pH 6,0, El tampón tiene preferiblemente una concentración que varía de 10 mM a 50 mM, 10 mM a 25 mM, 10 mM a 20 mM, En un aspecto específico, la concentración de tampón en las formulaciones de la invención es 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM o 100 mM, En un aspecto preferido, la concentración está entre 10 y 20 mM, tal como 10 mM o 15 mM, En un aspecto específico, una formulación de la invención comprende tampón de histidina 15 mM pH 6,5, En otro aspecto específico, una formulación de la invención comprende tampón de histidina 10 mM pH 6,0, Los excipientes preferidos son polioles tales como manitol, sorbitol, etc,, sacáridos tales como por ejemplo sacarosa, mañosa, trehalosa, etc, La concentración del excipiente puede variar de alrededor de 1 % a 20 %, preferiblemente de alrededor de 2,5 % a 15 %, más preferiblemente de alrededor de 5 % a 10 %, tal como por ejemplo 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %, En un aspecto preferido, comprende sacarosa, preferiblemente en una concentración de alrededor de 5 % a 10 %, tal como alrededor de 8 % o 10 %, El tensioactivo puede seleccionarse entre Tween 20, Tween 80 o un poloxámero, La concentración del tensioactivo puede variar de alrededor de 0,001 % a 1 % (preferiblemente de alrededor de 0,001 % a 0,1 %, o 0,01 % a 0,1 % tal como 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 %, o 1 % de la formulación, preferiblemente 0,01 % o 0,005 %), En una realización específica, el tensioactivo es Tween 20 o Tween 80, que está en una concentración de 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 % o 1 % de la formulación, tal como por ejemplo 0,01 % de Tween 80 o 0,005 % de Tween 80, Por consiguiente, una formulación preferida de la invención puede comprender 15 mM de histidina pH 6,5, 8 % de sacarosa y 0,01 % de Tween 80, Otra formulación preferida de la invención puede comprender 10 mM de histidina pH 6,0, 10 % de sacarosa y 0,005 % de Tween 80,

[0361] Por consiguiente, una formulación de la invención puede comprender, además del polipéptido de la invención, por ejemplo:

[0362] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,5, un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM a 100 mM;

[0363] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 1 % a 20 %; y c) Un tensioactivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,001 % a 1 %, o

[0364] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 15 mM;

[0365] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 1 % a 20 %; y c) Un tensioactivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,001 % a 1 %, o

[0366] a) Un tampón seleccionado de un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 10 mM a 100 mM;

[0367] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 8 %; y c) Un tensioactivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,001 % a 1 %, o

[0368] a) Un tampón seleccionado de un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 10 mM a 100 mM;

[0369] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 1 % a 20 %; y c) Un tensioactivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,01 %, o

[0370] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 15 mM;

[0371] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 8 %; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20<o>un poloxámero en una concentración de 0,00l % a 1 %. o

[0372] a) Un tampón seleccionado de un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 10 mM a 100 mM;

[0373] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 8 %; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,01 %. o

[0374] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 15 mM;

[0375] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 1 % a 20 %; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,01 %. o

[0376] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM;

[0377] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 1 % a 20 %; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,001 % a 1 %. o

[0378] a) Un tampón seleccionado de un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM a 100 mM;

[0379] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 10 %; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,001 % a 1 %. o

[0380] a) Un tampón seleccionado de un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM a 100 mM;

[0381] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 1 % a 20 %; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,005 %. o

[0382] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM;

[0383] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 10 %; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,001 % a 1 %. o

[0384] a) Un tampón seleccionado de un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM a 100 mM;

[0385] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 10 %; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración del 0,005 %, o

[0386] a) Un tampón seleccionado entre un tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 15 mM;

[0387] b) Un excipiente seleccionado entre sacarosa, sorbitol, trehalosa y manitol en una concentración de 1 % a 20 %; y<c>) Un tensioaetivo seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero en una concentración de 0,005 %. o

[0388] a) Tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 10 mM a 100 mM;

[0389] b) Sacarosa en una concentración de 1 % a 20 %; y

[0390] <c>) Tween 80 en una concentración de 0,001 % a 1 %.

[0391] o

[0392] a) tampón de histidina 15 mM pH 6,5;

[0393] b) 8 % de sacarosa; y

[0394] <c>) 0,01 % de Tween 80.

[0395] o

[0396] a) Tampón de histidina pH 6,0 a una concentración de 10 mM a 100 mM;

[0397] b) Sacarosa en una concentración de 1 % a 20 %; y

[0398] <c>) Tween 80 en una concentración de 0,001 % a 1 %.

[0399] o

[0400] a) tampón de histidina 10 mM pH 6,0;

[0401] b) 10 % de sacarosa; y

[0402] <c>) 0,005 % de Tween 80.

[0404] En un aspecto preferido, la formulación de la invención puede comprender un polipéptido seleccionado entre SEQ ID NO: 1 a 6. Por consiguiente la formulación de la invención puede comprender:

[0405] a) tampón de histidina 15 mM pH 6,5;

[0406] b) sacarosa al 8 %;

[0407] c) 0,01 % de Tween 80; y

[0408] d) Un polipéptido seleccionado entre SEQ ID NO: 1 a 6 (por ejemplo, en una concentración de 10 mg/ml).

[0409] o

[0410] a) tampón de histidina 10 mM pH 6,0;

[0411] b) sacarosa al 10 %;

[0412] c) 0,005 % de Tween 80; y

[0413] d) Un polipéptido seleccionado entre SEQ ID NO: 1 a 6 (por ejemplo, en una concentración de 10 mg/ml).

[0415] Los componentes presentes en las formulaciones de la invención han sido seleccionados de tal manera que los polipéptidos de la invención tengan una buena solubilidad (tal como se define en este documento). Preferiblemente, los polipéptidos presentes en las formulaciones de la presente invención tienen una solubilidad de al menos 0,7 mM, al menos 0,8 mM, al menos 0,9 mM, al menos 1,0 mM, al menos 1,1 mM, al menos 1,2 mM, al menos 1,3 mM, al menos 1,4 mM, al menos 1,5 mM, al menos 1,6 mM, al menos 1,7 mM, al menos 1,8 mM, al menos 1,9 mM, al menos 2,0 mM, al menos 2,1 mM, al menos 2,2 mM, al menos 2,3 mM, al menos 2,4 mM, al menos 2,5 mM, al menos 2,6 mM, al menos 2,7 mM, al menos 2,8 mM, al menos 2,9 mM, al menos 3,0 mM, al menos 3,2 mM, al menos 3,4 mM, al menos 3,6 mM o más y/o al menos 20 mg/ml, al menos 30 mg/ml, al menos 40 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 60 mg/ml, al menos 65 mg/ml, al menos 70 mg/ml, al menos 80 mg/ml, al menos 90 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 110 mg/ml, al menos 120 mg/ml, al menos 130 mg/ml, al menos 140 mg/ml, al menos 150 mg/ml o Incluso 200 mg/ml o más según lo determinado por el método de exclusión de PEG o por ultraflltraclón centrífuga. Se ha obtenido una muy buena solubilidad de los polipéptidos de la Invención con una formulación que comprende un tampón de histidina pH 6,5 o con una formulación que comprende Tween 80. Por consiguiente, la presente invención se refiere a una formulación que comprende un vehículo acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos, formulándose dicha formulación para su administración a un sujeto humano. en la que dicha formulación comprende además al menos uno de:

[0416] a) Un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 10 mM a 100 mM (preferiblemente de 10 mM a 50 mM, más preferiblemente de 10 a 20 mM, tal como 15 mM);

[0417] c) Tween 80 en una concentración de 0,001 % a 1 % (preferiblemente de alrededor de 0,001 % a 0,1 %, o de 0,01 % a 0,1 % tal como 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 %, o 1 % de la formulación, preferiblemente 0,01 %);

[0418] en la que dicha formulación tiene una concentración de sal inorgánica de 150 mM o inferior; y en la que la solubilidad del polipéptido es al menos 20 mg/ml, al menos 50 mg/ml, preferiblemente al menos 90 mg/ml, al menos 120 mg/ml, al menos 150 mg/ml o incluso 200 mg/ml o más según lo determinado por el método de exclusión de PEG o por ultrafiltración centrífuga. En un aspecto preferido, la formulación comprende un tampón de histidina pH 6,5 a una concentración de 10 mM a 100 mM (preferiblemente de 10 mM a 50 mM, más preferiblemente de 10 a 20 mM, tal como 15 mM) y Tween 80 a una concentración de 0,001 % a 1 % (preferiblemente de alrededor de 0,001 % a 0,1 %, o de 0,01 % a 0,1 %, tal como 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 % o 1 % de la formulación, preferiblemente 0,01 %).

[0420] Aparte de esto y/o además, los polipéptidos de la invención presentes en la formulación de la invención deben tener preferiblemente una temperatura de fusión de al menos 59 °C o más (tal como 59,5 °C o más), preferiblemente al menos 60 °C o más (tal como 60,5 °C o más), más preferiblemente al menos 61 °C o más (tal como 61,5 °C o más) o al menos 62 °C o más (tal como 62,5 °C o más), lo más preferible al menos 63 °C o más (tal como 63,5 °C o más) medida mediante el ensayo de desplazamiento térmico (TSA) y/o calorimetría diferencial de barrido (DSC).

[0422] Sin ser limitante, la determinación del punto de fusión se puede realizar mediante el ensayo de desplazamiento térmico basado en fluorescencia, que se basa en el hecho de que al desplegarse térmicamente, las regiones hidrófobas de las proteínas, generalmente ocultas en el núcleo del pliegue de la proteína, se vuelven accesibles para unirse a un colorante fluorescente hidrófobo. La emisión de fluorescencia de este colorante se extingue en solución acuosa, mientras que al unirse a las zonas hidrófobas de una proteína desplegada se observa un aumento brusco en el rendimiento de fluorescencia de la sonda. El desplegamiento inducido por temperatura es típicamente un proceso de dos estados con una transición abrupta entre el estado plegado y desplegado, donde la temperatura de fusión (Tm) se define como la temperatura a la cual la mitad de la proteína está en el estado desplegado, es decir, se representa gráficamente la primera derivada de la señal de fluorescencia tras el calentamiento gradual de la muestra, y el pico observado (o picos cuando hay múltiples dominios y/o variantes del mismo dominio) representa la temperatura de fusión. El ensayo de desplazamiento térmico se puede realizar en un instrumento de PCR en tiempo real típico, en el que las curvas de fusión se pueden registrar con precisión en modo de alto rendimiento y con sólo pequeñas cantidades de proteína requeridas.

[0424] Durante un experimento de calorimetría diferencial de barrido, la muestra se calienta a una velocidad constante en un entorno adiabático (AT = 0). Se mide la energía necesaria para mantener la diferencia de temperatura entre una celda de referencia y la celda de muestra en cero, y se obtiene la capacidad térmica en función de la temperatura (Cp(T)). La temperatura correspondiente a la máxima capacidad calorífica representa la temperatura de fusión (T<m>). Si el proceso de desplegamiento dependiente de la temperatura es reversible, se pueden determinar otros parámetros termodinámicos tal como la entalpía de desplegamiento (AH<despiegamiento>).

[0426] Se han observado temperaturas de fusión aumentadas para los polipéptidos de la invención cuando están presentes en una formulación con un pH de alrededor de 6,0 a 8,0, preferiblemente de 6,2 a 7,5, más preferiblemente de 6,5 a 7,5, lo más preferible de 6,5-7,0. También se han obtenido temperaturas de fusión incrementadas para los polipéptidos de la invención cuando están presentes en una formulación que comprende hepes pH 7,0, histidina pH 6,0-6,5, MES pH 6,0 o acetato pH 6,0, o una formulación que comprende un excipiente, preferiblemente un sacárido y/o poliol tal como manitol, trehalosa, sorbitol o sacarosa. Por consiguiente, la presente invención se refiere a una formulación que comprende un vehículo acuoso a un pH de 6,0 a 8,0 y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos, formulándose dicha formulación para su administración a un sujeto humano, en la que dicha formulación comprende además al menos uno de:

[0427] a) Un tampón a una concentración de 10 mM a 100 mM (preferiblemente de 10 mM a 50 mM, más preferiblemente de 10 a 20 mM, tal como 15 mM o 10 mM) seleccionado del grupo que consiste en histidina pH 6,0-6,5;

[0428] b) Un excipiente, preferiblemente un sacárido y/o poliol tal como manitol, sorbitol, trehalosa o sacarosa en una concentración de 1 % a 20 % (preferiblemente 2,5 % a 15 %, más preferiblemente 5 % a 10 %, tal como 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %).

[0430] en la que dicha formulación tiene una concentración de sal inorgánica de 150 mM o inferior; y en la que la temperatura de fusión del polipéptido de la invención es al menos 59 °C o más (tal como 59,5 °C o más), preferiblemente al menos 60 °C o más (tal como 60,5 °C o más), más preferiblemente al menos 61 °C o más (tal como 61,5 °C o más) o al menos 62 °C o más (tal como 62,5 °C o más), lo más preferible al menos 63 °C o más (tal como 63,5 °C o más) medida mediante el ensayo de desplazamiento térmico (TSA) y/o calorimetría diferencial de barrido (DSC).

[0432] En un aspecto preferido, la formulación comprende un tampón a una concentración de 10 mM a 100 mM (preferiblemente de 10 mM a 50 mM, más preferiblemente de 10 a 20 mM, tal como 15 mM) seleccionado del grupo que consiste en histidina pH 6,0-6,5 y un excipiente, preferiblemente un sacárido y/o poliol tal como manitol, sorbitol, trehalosa o sacarosa a una concentración de 1 % a 20 % (preferiblemente de 2,5 % a 15 %, más preferiblemente de 5 % a 10 %, tal como 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %).

[0434] Aparte de esto y/o además, la formulación de la presente invención exhibe estabilidad bajo al menos una o más de las siguientes condiciones de estrés:

[0435] • múltiples ciclos de congelación/descongelación (hasta 10);

[0436] • almacenamiento a una temperatura de 2-8 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más);

[0437] • almacenamiento a una temperatura de 25 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más);

[0438] • almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más);

[0439] • estrés mecánico.

[0441] Preferiblemente, la formulación de la invención es estable bajo una o más de las siguientes formas de estrés mecánico:

[0442] • agitando la formulación durante 10 s a 1 min;

[0443] • empujando la formulación a través de una aguja (25G, preferiblemente 26G, más preferiblemente 27G, incluso más preferiblemente 28G, más preferiblemente 29G o más) con una jeringa (la jeringa utilizada puede ser cualquier jeringa disponible comercialmente, tal como por ejemplo una jeringa de 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml hasta 50 ml);

[0444] • girando durante dos días a 10 rpm; y/o

[0445] • agitando durante 1 hora a temperatura ambiente y/o 4-48 horas a 4 °C a al menos 10 rpm (tal como 50 rpm, 100 rpm o más).

[0447] Preferiblemente, la formulación de la presente invención es estable bajo más de una de las condiciones de estrés anteriores, tales como al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete o, más preferiblemente, bajo todas las condiciones de estrés anteriores.

[0449] En un aspecto, la formulación de la invención exhibe estabilidad bajo una o más formas de estrés mecánico y/o cortante. El estrés mecánico tal como se utiliza en la presente invención puede ser cualquier forma de fuerza externa aplicada sobre la formulación que pueda afectar la estabilidad del polipéptido presente en la formulación. Sin ser limitativo, el esfuerzo mecánico aplicado a la solución incluye esfuerzo cortante, esfuerzo de agitación, esfuerzo de sacudida, esfuerzo de rotación, etc. La formulación de la invención puede agitarse, por ejemplo, durante al menos 10 s, 20 s, 30 s, 40 s, 50 s hasta 1 minuto o más. La formulación de la invención puede introducirse a través de una jeringa (la jeringa utilizada puede ser cualquier jeringa disponible comercialmente, tal como, por ejemplo, una jeringa de 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml hasta 50 ml) con aguja una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces hasta 10 veces o más. Preferiblemente, la aguja tiene un tamaño de 25G (tal como 26G, 27G, 28G, 29G, 30G) o más. Más preferiblemente, el tamaño de las agujas es 27G o más. Además o alternativamente, la formulación de la invención puede rotarse durante 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día hasta dos días o más a 10 rpm. La formulación de la invención puede agitarse durante 1 hora a temperatura ambiente y/o 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas o incluso 48 horas o más a 2-8 °C. La velocidad de rotación es preferiblemente superior a 10 rpm, por ejemplo, 50 rpm, 100 rpm o más.

[0451] La estabilidad de la formulación bajo tensión mecánica se puede evaluar, por ejemplo, mediante inspección visual de la formulación o midiendo la relación 0D320/0D280. Preferiblemente, la relación 0D320/0D280 es 0,05 o inferior, tal como 0,01 o 0,005.

[0453] Se ha obtenido una buena estabilidad de los polipéptidos de la invención bajo estrés mecánico con una formulación que comprende un excipiente, preferiblemente un sacárido y/o poliol tal como manitol o sacarosa o que comprende Tween 80. En consecuencia, la presente invención se refiere a una formulación que comprende un vehículo acuoso y un polipéptido que comprende uno<o>más dominios variables únicos, formulándose dicha formulación para<su>administración a un sujeto humano, en la que dicha formulación comprende además al menos uno de:

[0454] b) Un excipiente, preferiblemente un sacárido y/o poliol tal como manitol o sacarosa en una concentración de 1 % a 20%(preferiblemente 2,5% a10 %, más preferiblemente 5% a10 %, tal como 5 %, 7,5 %, 8%o 10 %);

[0455] c) Un tensioactivo en una concentración de 0,001 % a 1 % (preferiblemente de alrededor de 0,001 % a 0,1 %, o 0,01 % a 0,1 % tal como 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 %, o 1 % de la formulación, preferiblemente 0,01 %) seleccionado entre Tween 20, Tween 80 o un poloxámero,

[0456] en la que dicha formulación tiene una concentración de sal inorgánica de 150 mM o inferior; y

[0457] en la que el polipéptido es estable bajo estrés mecánico según lo determinado por la medición de la relación 0D320/0D280. En un aspecto preferido, la formulación comprende un excipiente, preferiblemente un sacárido y/o poliol tal como manitol o sacarosa a una concentración de 1 % a 20 % (preferiblemente 2,5 % a 15 %, más preferiblemente 5 % a 10 %, tal como 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %) y un tensioactivo a una concentración de 0,001 % a 1 % (preferiblemente alrededor de 0,001 % a 0,1 %, o 0,01 % a 0,1 % tal como 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 %, o 1 % de la formulación, preferiblemente 0,01 % o 0,005 %) seleccionado entre Tween 20 y Tween 80. Una formulación preferida comprende 8 % de sacarosa y 0,01 % de Tween 80. Otra formulación preferida comprende 10 % de sacarosa y 0,005 % de Tween 80.

[0459] En un aspecto específico, la formulación de la invención comprende un excipiente, preferiblemente un sacárido y/o poliol tal como manitol o sacarosa a una concentración de 1 % a 20 % (preferiblemente 2,5 % a 15 %, más preferiblemente 5 % a 10 %, tal como 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %) y/o Tween 20, Tween 80 o un poloxámero (a una concentración que varía de alrededor de 0,001 % a 0,1 %, o 0,01 % a 0,1 % tal como 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 % o 1 % de la formulación, preferiblemente 0,01 %) y se caracteriza por que los polipéptidos presentes en la formulación son estables bajo estrés mecánico.

[0461] En un aspecto preferido, la formulación de la invención comprende un excipiente, preferiblemente un sacárido y/o poliol tal como manitol o sacarosa a una concentración de 1 % a 20 % (preferiblemente 2,5 % a 15 %, más preferiblemente 5 % a 10 %, tal como 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %) y/o Tween 80 (a una concentración de 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 %, o 1 % de la formulación, preferiblemente 0,01 % o 0,005 %) y se caracteriza por que los polipéptidos presentes en la formulación de la invención son estables al agitar la formulación durante al menos 10 s, 20 s, 30 s, 40 s, 50 s hasta 1 minuto o más. En otro aspecto preferido, la formulación de la invención comprende un excipiente, preferiblemente un sacárido y/o poliol tal como manitol o sacarosa a una concentración de 1 % a 20 % (preferiblemente de 2,5 % a 15 %, más preferiblemente de 5 % a 10 %, tal como 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %) y/o Tween 80 (a una concentración de 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 % o 1 % de la formulación, preferiblemente 0,01 % o 0,005 %) y se caracteriza por que los polipéptidos presentes en la formulación de la invención son estables al empujar la formulación a través de una jeringa (la jeringa utilizada puede ser cualquier jeringa disponible comercialmente, tal como por ejemplo una jeringa de 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, hasta 50 ml) con un tamaño de aguja de 25G o más (tal como 26G, 27G, 28G, 29G, 30G o más, preferiblemente 27G o más) una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces hasta 10 veces o más. En otro aspecto preferido, la formulación de la invención comprende un excipiente, preferiblemente un sacárido y/o poliol tal como manitol o sacarosa a una concentración de 1 % a 20 % (preferiblemente 2,5 % a 15 %, más preferiblemente 5 % a 10 %, tal como 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %) y/o Tween 80 (a una concentración de 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 % o 1 % de la formulación, preferiblemente 0,01 % o 0,005 %) y se caracteriza por que los polipéptidos presentes en la formulación de la invención son estables cuando se rota la formulación durante 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas, 1 día hasta dos días o más a 10 rpm. En otro aspecto preferido, la formulación de la invención comprende un excipiente, preferiblemente un sacárido y/o poliol tal como manitol o sacarosa a una concentración del 1 % al 20 % (preferiblemente 2,5 % a 15 %, más preferiblemente de 5 % a 10 %, tal como 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %) y/o Tween 80 (a una concentración de 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 % o 1 % de la formulación, preferiblemente 0,01 % o 0,005 %) y se caracteriza por que los polipéptidos presentes en la formulación de la invención son estables cuando se agita la formulación durante 1 hora a temperatura ambiente y/o 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas o incluso 48 horas o más a 2-80C a al menos 10 rpm (como 50 rpm, 100 rpm o más).

[0463] Un "ciclo de congelación/descongelación" o "ciclo F/T" se define como la congelación de una muestra en un congelador (-20 ± 5 °C) o ultracongelador (por debajo de -64 °C (tal como por ejemplo a -80 °C)) hasta que esté sólida, seguido de una descongelación a temperatura ambiente hasta que todos los cristales de hielo hayan desaparecido visualmente. En un aspecto, la formulación de la invención exhibe estabilidad bajo múltiples (hasta 10) ciclos de congelación/descongelación. La formulación de la invención puede exhibir estabilidad bajo al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 5 hasta al menos 10 ciclos de congelación/descongelación, tales como por ejemplo 10 ciclos a -20 °C, 2 ciclos a -80 °C 1 ciclo a -20 °C o 2 ciclos a -80 °C 6 ciclos a -20 °C.

[0465] En otro aspecto, la formulación de la invención presenta estabilidad al almacenarse a una temperatura de 5 ± 5 °C. La formulación de la invención puede presentar estabilidad al almacenarse a una temperatura de 5 ± 5 °C durante al menos 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 10 semanas, hasta 3 meses, 6 meses, 11 meses, 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más.

[0466] En otro aspecto, la formulación de la Invención presenta estabilidad al almacenarse a una temperatura de 25 ± 50C. La formulación de la Invención puede presentar estabilidad al almacenarse a una temperatura de 25 ± 5 °C durante al menos 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más.

[0468] En otro aspecto, la formulación de la invención presenta estabilidad al almacenarse a una temperatura de 37 ± 5 °C. La formulación de la invención puede presentar estabilidad al almacenarse a una temperatura de 37 ± 5 °C durante al menos 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más.

[0470] Como es sabido por el experto en la técnica, las temperaturas indicadas en este texto pueden estar sujetas a variaciones normales.

[0472] Preferiblemente, en aquellas formulaciones que sean estables bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores:

[0473] • menos del 10 % (más preferiblemente menos del 5 %, incluso más preferiblemente menos del 3%, lo más preferible menos del 1 %) del polipéptido de la invención forma piroglutamato en el ácido glutámico N-terminal (por ejemplo, según se evalúa mediante RP-HPLC) durante el almacenamiento en (una de las) condiciones de estrés anteriores, tales como, por ejemplo, a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más);

[0474] • menos del 10 % (más preferiblemente menos del 5 %, incluso más preferiblemente menos del 3%, lo más preferible menos del 1 %) del polipéptido de la invención forma dímeros (por ejemplo, según se evalúa mediante SE-HPLC) durante el almacenamiento en (una de las) condiciones de estrés anteriores, tales como, por ejemplo, a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más);

[0475] • al menos el 80 % (al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,5 %) de los polipéptidos de la invención conservan su actividad de unión (por ejemplo, según se evaluó mediante ELISA y/o Biacore) a al menos uno de sus (preferiblemente a todos sus) dianas después del almacenamiento en (una de las) condiciones de estrés anteriores, tal como por ejemplo a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más) en comparación con la actividad de unión antes de la condición de estrés.

[0477] La estabilidad de las formulaciones se puede evaluar mediante diversos métodos analíticos y/o inmunológicos conocidos en la técnica. El contenido proteico de los polipéptidos de la invención puede detectarse, por ejemplo, mediante métodos espectrofotométricos.

[0479] SDS-PAGE permite la visualización de los polipéptidos en una muestra dada mediante tinción directa. La SDS-PAGE se utiliza para separar las proteínas según su tamaño. Se pueden realizar análisis SDS-PAGE tanto reductores como no reductores.

[0481] La distribución del tamaño molecular y las cantidades relativas del polipéptido de la invención y las impurezas proteicas se pueden determinar mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento con exclusión por tamaño (SE-HPLC). La cantidad relativa de una impureza de proteína específica, expresada como porcentaje del área, se puede calcular dividiendo el área del pico correspondiente a la impureza entre el área integrada total. Los métodos de SE-HPLC son conocidos por el experto en la técnica y también se describen en la sección de Ejemplos.

[0483] La cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase reversa (RP-HPLC) separa las moléculas con respecto a las diferencias en hidrofobicidad, y se basa en la interacción reversible entre la molécula y la fase estacionaria hidrófoba. En este ensayo se puede utilizar una columna Zorbax 300SB-C3 (Agilent Technologies, Palo Alto, EE. üü.). La cantidad relativa de una impureza de proteína específica, expresada como porcentaje del área, se puede calcular dividiendo el área del pico correspondiente a la impureza entre el área integrada total. Los métodos de RP-HPLC son conocidos por el experto en la técnica y también se describen en la sección de Ejemplos.

[0485] Los polipéptidos de la invención y sus variantes de carga se pueden separar mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento de intercambio iónico (IEX-HPLC). Con este método también se pueden detectar posibles impurezas. La cantidad relativa de una impureza de proteína específica, expresada como porcentaje del área, se puede calcular dividiendo el área del pico correspondiente a la impureza entre el área integrada total. Los métodos de IEX-HPLC son conocidos por el experto en la técnica y también se describen en la sección de Ejemplos.

[0487] Los polipéptidos presentes en la formulación de la invención preferiblemente no forman piroglutamato en el ácido glutámico N-terminal. La formación de piroglutamato en la muestra se puede medir, por ejemplo, mediante RP-HPLC. Por ejemplo, el análisis por RP-HPLC de una formulación que contenía SEQ ID NO: 4 después de un almacenamiento durante 10 semanas a una temperatura de 37 °C, mostró la formación de piroglutamato como un pico separado a los 18-19 minutos. Preferiblemente, en la formulación de la invención, menos del 10 % (más preferiblemente menos del 5 %, incluso más preferiblemente menos del 3%, más preferiblemente menos del 1 %) de los polipéptidos forman piroglutamato en el ácido glutámico N-terminal (por ejemplo, según se evalúa mediante RP-HPLC) bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores.

[0489] Se ha observado poca o ninguna formación de piroglutamato de los polipéptidos de la invención en formulaciones con un pH de 7,0 o inferior, preferiblemente 6,5 o inferior, tales como 6,5, 6,0 o 5,5, por ejemplo en tampones de histidina y tampones de acetato. En consecuencia, la presente invención se refiere a una formulación que comprende un vehículo acuoso a un pH de 7,0 o inferior y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos, formulándose dicha formulación para su administración a un sujeto humano, en la que dicha formulación comprende además:

[0491] a) Un tampón a una concentración de 10 mM a 100 mM (preferiblemente de 10 mM a 50 mM, más preferiblemente de 10 a 20 mM, tal como 15 mM o 10 mM) seleccionado del grupo que consiste en histidina pH 6,0-6,5,

[0493] en la que dicha formulación tiene una concentración de sal inorgánica de 150 mM o inferior; y

[0495] en la que menos del 10 % (preferiblemente menos de 8 %, más preferiblemente menos de 7%, lo más preferible menos de 5 %) de los polipéptidos forman piroglutamato en el ácido glutámico N-terminal durante una o más de las condiciones de estrés anteriores (tal como durante el almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más)), el % de piroglutamato medido por RP-HPLC. En un aspecto preferido, la formulación comprende un tampón de histidina pH 6,5 a 15 mM. En otro aspecto preferido, la formulación comprende un tampón de histidina pH 6,0 a 10 mM.

[0497] Los polipéptidos presentes en la formulación de la invención preferiblemente tampoco forman dímeros. La formación de dímeros en la muestra se puede medir, por ejemplo, mediante SE-HPLC. Por ejemplo, el análisis en SE-HPLC de una formulación que contenía SEQ ID NO: 4 después de almacenamiento durante 10 semanas a una temperatura de 37 °C, mostró la formación de un pico separado que eluía a un peso molecular aparente de 44 kDa en comparación con los marcadores de peso molecular, mientras que el polipéptido monomérico eluía entre los marcadores de peso molecular de 44 y 17 kDa. Este pico separado a 44 kDa representó una forma dimérica de SEQ ID NO: 4. Preferiblemente, en la formulación de la invención, menos de 10 % (más preferiblemente menos de 5 %, incluso más preferiblemente menos de 3%, más preferiblemente menos de 1 %) de los polipéptidos forman dímeros (por ejemplo, según se evalúa mediante SE-HPLC) durante el almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores.

[0499] Se ha observado poca o ninguna formación de dímeros de los polipéptidos de la invención en formulaciones con un tampón de histidina o un tampón de acetato y en formulaciones que comprenden un excipiente, preferiblemente un sacárido y/o poliol tal como manitol, trehalosa, sorbitol o sacarosa. Por consiguiente, la presente invención se refiere a una formulación que comprende un vehículo acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos, formulándose dicha formulación para su administración a un sujeto humano, en la que dicha formulación comprende además al menos uno de:

[0501] a) Un tampón a una concentración de 10 mM a 100 mM (preferiblemente de 10 mM a 50 mM, más preferiblemente de 10 a 20 mM, tal como 15 mM o 10 mM) seleccionado del grupo que consiste en histidina pH 6,0-6,5;

[0503] b) Un excipiente, preferiblemente un sacárido, un azúcar no reductor y/o un poliol tal como manitol, trehalosa, sorbitol o sacarosa en una concentración de 1 % a 20 % (preferiblemente 2,5 % a 15 %, más preferiblemente 5 % a 10 %, tal como 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %),

[0505] en la que dicha formulación tiene una concentración de sal inorgánica de 150 mM o inferior; y

[0507] en la que menos de 10 % (preferiblemente menos de 8 %, más preferiblemente menos de 7%, lo más preferible menos de 5 %) de los polipéptidos forman dímeros durante una o más de las condiciones de estrés anteriores (tal como durante el almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más)), el % de dímeros medido por SE-HPLC. En un aspecto preferido, la formulación comprende un tampón de histidina pH 6,5 a 15 mM. En otro aspecto preferido, la formulación comprende un tampón de histidina pH 6,0 a 10 mM. En un aspecto preferido, la formulación comprende un tampón a una concentración de 10 mM a 100 mM (preferiblemente 10 mM a 50 mM, más preferiblemente 10 a 20 mM, tal como 15 mM o 10 mM) seleccionado del grupo que consiste en histidina pH 6,0-6,5 y un excipiente, preferiblemente un sacárido, azúcar no reductor y/o poliol tal como manitol, trehalosa, sorbitol o sacarosa a una concentración de 1 % a 20 % (preferiblemente 2,5 % a 15 %, más preferiblemente 5 % a 10 %, tal como 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %), tal como, por ejemplo, 15 mM de histidina pH 6,5 y 8 % de sacarosa; o 10 mM de histidina pH 6,0 y 10 % de sacarosa.

[0508] Preferiblemente, en la formulación de la invención, menos de 10 % (más preferiblemente menos de 5 %, incluso más preferiblemente menos de 3 %, lo más preferible menos de 1 %) de los polipéptidos forman piroglutamato en el ácido glutámico N-terminal (por ejemplo, como se evalúa mediante RP-HPLC) y menos de 10 % (más preferiblemente menos de 5 %, incluso más preferiblemente menos de 3 %, lo más preferible menos de 1 %) de los polipéptidos forman dímeros (por ejemplo, como se evalúa mediante SE-HPLC) durante el almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores.

[0510] Aparte de esto y/o además, la formulación de la presente invención debe mostrar sólo niveles bajos a indetectables de agregación incluso durante el almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés mencionadas anteriormente. Por ejemplo, en la formulación de la invención, no más del 5 %, no más del 4%, no más del 3%, no más del 2 %, no más del 1 %, y lo más preferible, no más del 0,5 % de los polipéptidos forman un agregado después del almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores.

[0512] La agregación, tal como se utiliza en la presente invención, significa el desarrollo de agregados de alto peso molecular, es decir, agregados con un peso molecular aparente en el análisis de SE-HPLC mayor que el peso molecular observado para los dímeros. Como se describió anteriormente, 44 kDa es el peso molecular aparente observado en el análisis de SE-HPLC para los dímeros de SEQ ID NO: 4, 36-38 kDa es el peso molecular aparente observado en el análisis de SE-HPLC para los dímeros de SEQ ID NO: 1-3, y 36 kDa es el peso molecular aparente observado en el análisis de SE-HPLC para los dímeros de SEQ ID NO: 5. La agregación se puede evaluar mediante varios métodos conocidos en la técnica. Sin ánimo de limitarse a ello, los ejemplos incluyen SE-HPLC, ultracentrifugación analítica, dispersión de luz dinámica, recuento de partículas subvisibles y medición de OD320/OD280.

[0514] En una ultracentrífuga analítica, una muestra que está siendo centrifugada puede ser monitorizada en tiempo real a través de un sistema de detección óptica, usando un sistema sensible al índice de refracción óptico de interferencia y/o absorción de luz ultravioleta. Esto permite al operador observar la evolución de la concentración de la muestra frente al perfil del eje de rotación como resultado del campo centrífugo aplicado. Con instrumentación moderna, estas observaciones se digitalizan electrónicamente y se almacenan para un posterior análisis matemático. Normalmente se realizan dos tipos de experimentos en estos instrumentos: experimentos de velocidad de sedimentación y experimentos de equilibrio de sedimentación.

[0516] Los experimentos de velocidad de sedimentación tienen como objetivo interpretar todo el curso temporal de la sedimentación e informar sobre la forma y la masa molar de las macromoléculas disueltas, así como su distribución de tamaño (Perez-Ramirez y Steckert (2005) Therapeutic Proteins: Methods and Protocols. C.M. Smales y D.C. James, Eds. Vol. 308: 301-318. Humana Press Inc, Totowa, NJ, US.). La resolución de tamaño de este método escala aproximadamente con el cuadrado de los radios de las partículas, y ajustando la velocidad del rotor del experimento se pueden cubrir intervalos de tamaño de 100 Da a 10 GDa. Los experimentos de velocidad de sedimentación también se pueden utilizar para estudiar equilibrios químicos reversibles entre especies macromoleculares, ya sea monitorizando el número y la masa molar de los complejos macromoleculares, obteniendo información sobre la composición del complejo a partir del análisis de múltiples señales que explotan las diferencias en la señal espectroscópica de cada componente, o siguiendo la dependencia de la composición de las velocidades de sedimentación del sistema macromolecular, como se describe en la teoría de Gilbert-Jenkins.

[0518] Los experimentos de equilibrio de sedimentación se ocupan únicamente del estado estable final del experimento, en los que la sedimentación se equilibra mediante la difusión que se opone a los gradientes de concentración, lo que da como resultado un perfil de concentración independiente del tiempo. Las distribuciones de equilibrio de sedimentación en el campo centrífugo se caracterizan por distribuciones de Boltzmann. Este experimento es insensible a la forma de la macromolécula e informa directamente sobre la masa molar de las macromoléculas y, para mezclas que reaccionan químicamente, sobre las constantes de equilibrio químico.

[0520] Los tipos de información que se pueden obtener de una ultracentrífuga analítica incluyen la forma general de las macromoléculas, los cambios conformacionales en las macromoléculas, y las distribuciones de tamaño de las muestras macromoleculares. Para macromoléculas, tales como las proteínas, que existen en equilibrio químico con diferentes complejos no covalentes, se puede estudiar la estequiometría del número y de las subunidades de los complejos y las constantes de equilibrio. (véase también Scott D, J., Harding S.E. y Rowe A.J. Analytical Ultracentrifugation Techniques and Methods, RSC Publishing)

[0522] La dispersión de luz dinámica (también conocida como espectroscopia de correlación de fotones o dispersión de luz cuasielástica) es una técnica de física que se puede utilizar para determinar el perfil de distribución de tamaño de partículas pequeñas en solución. Cuando un rayo de luz pasa a través de una dispersión coloidal, las partículas o gotitas dispersan parte de la luz en todas las direcciones. Cuando las partículas son muy pequeñas en comparación con la longitud de onda de la luz, la intensidad de la luz dispersada es uniforme en todas las direcciones (dispersión de Rayleigh); para partículas más grandes (de más de 250 nm de diámetro aproximadamente), la intensidad depende del ángulo (dispersión de Mie). Si la luz es coherente y monocromática, como por ejemplo la de un láser, es posible observar fluctuaciones dependientes del tiempo en la intensidad dispersa utilizando un detector adecuado, tal como un fotomultiplicador capaz de operar en modo de conteo de fotones.

[0523] Estas fluctuaciones surgen del hecho de que las partículas son lo suficientemente pequeñas como para experimentar un movimiento térmico (browniano) aleatorio, y por lo tanto la distancia entre ellas varía constantemente. La interferencia constructiva y destructiva de la luz dispersada por partículas vecinas dentro de la zona iluminada da lugar a una fluctuación de intensidad en el plano del detector que, al surgir del movimiento de las partículas, contiene información sobre dicho movimiento. El análisis de la dependencia temporal de la fluctuación de la intensidad puede por tanto proporcionar el coeficiente de difusión de las partículas a partir del cual, mediante la ecuación de Stokes Einstein, conociendo la viscosidad del medio, se puede calcular el radio hidrodinámico o diámetro de las partículas. (véase también Berne B. J. y Pécora R. Dynamic Light Scattering With Applications to Chemistry, Biology and Physics, Dover Publications)

[0525] La agregación también se puede medir con el instrumento PAMAS SVSS-C (Small Volume Syringe System-C) (PArtikelMess - und AnalyseSysteme GMBH}, que es un analizador de distribución de tamaño de partículas para fluidos de baja viscosidad. Utiliza el principio de oscurecimiento de la luz para detectar partículas subvisibles en el intervalo de tamaño de 1 gm - 200 gm. Los criterios de validación/límites específicos de la Farmacopea Europea (EP<2.9.19 Contaminación por partículas: partículas subvisibles) para parenterales de pequeño y gran volumen se definen por losrecuentos totales por recipiente:

[0526] •Para partículas > 10 gm, no más de 6000 recuentos por recipiente

[0527] • Para partículas > 25 gm, no más de 600 recuentos por recipiente

[0529] La relación 0D320/0D280 también es una medida de turbidez o presencia de partículas en la muestra. En un aspecto preferido, la relación 0D320/0D280 de la formulación de la invención debe ser 0,05 o inferior, preferiblemente 0,01 o inferior, tal como 0,005 o inferior.

[0531] La tendencia a la formación de agregados de un polipéptido en una determinada formulación también se puede medir mediante la dispersión elástica de la luz. La dispersión elástica de la luz se puede medir en un espectrofluorómetro (por ejemplo, longitud de onda de excitación y emisión de 500 nm) mediante desnaturalización inducida por temperatura, medida por ejemplo en un ángulo de 90°. Preferiblemente, la dispersión máxima permanecerá dentro del límite de detección de absorción. La dispersión debe ser de 1000 abs. o menos, preferiblemente 750 abs o menos, tal como 500 abs o menos.

[0533] No se ha observado formación de partículas en formulaciones que comprenden un tampón de histidina pH 6,0-6,5 en diferentes condiciones de estrés (tal como, por ejemplo, almacenamiento a una temperatura de 5 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más) o almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más)). En consecuencia, la presente invención se refiere a una formulación que comprende un vehículo acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos, formulándose dicha formulación para su administración a un sujeto humano, en la que dicha formulación comprende además:

[0535] a) Un tampón de histidina pH 6,0-6,5 a una concentración de 10 mM a 100 mM (preferiblemente de 10 mM a 50 mM, más preferiblemente de 10 a 20 mM, tal como 15 mM),

[0537] en la que dicha formulación tiene una concentración de sal inorgánica de 150 mM o inferior; y en la que no hay partículas presentes en una o más de las condiciones de estrés anteriores (por ejemplo, cuando se almacena a una temperatura de 5 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más) o cuando se almacena a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más)) medida mediante la medición de la relación 0D320/0D280 y/o dispersión elástica de la luz. En un aspecto preferido, la formulación comprende un tampón de histidina pH 6,5 a 15 mM. En otro aspecto preferido, la formulación comprende un tampón de histidina pH 6,0 a 10 mM.

[0539] Aparte de esto y/o además, la formulación de la presente invención muestra sólo niveles bajos a indetectables de fragmentación y/o degradación incluso durante el almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés mencionadas anteriormente. La fragmentación y la degradación se pueden medir, por ejemplo, mediante SE-HPLC y/o RP-HPLC. Por ejemplo, el análisis en SE-HPLC de una formulación que contenía SEQ ID NO: 4 después de almacenarla durante 10 semanas a una temperatura de 37 °C, mostró la formación de algunos postpicos menores, que representan productos de degradación de SEQ ID N0: 4. Por ejemplo, el análisis por RP-HPLC de una formulación que contenía SEQ ID N0: 4 después de un almacenamiento durante 10 semanas a una temperatura de 37 °C, mostró la formación de algunos picos menores a los 8-9 minutos, que representan productos de degradación. Preferiblemente, en la formulación de la invención, no más del 5 %, no más del 4%, no más del 3%, no más del 2 %, no más del 1 %, no más del 0,5 %, no más del 0,1 %, no más del 0,05 %, y lo más preferible, no más del 0,01 % de los polipéptidos muestran degradación y/o fragmentación después del almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores.

[0540] Las técnicas de dispersión de luz estática (SLS), filtración de flujo tangencial (TFF), espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), dicrofsmo circular (CD), técnicas de desplegamiento de proteínas inducido por urea, fluorescencia intrínseca de triptófano y/o unión a proteínas del ácido 1-anilino-8-naftalenosulfónico (ANS) también se pueden utilizar para evaluar las propiedades físicas y la estabilidad de los polipéptidos.

[0542] Aparte de esto y/o además, la formulación de la presente invención muestra muy poca o ninguna pérdida de potencia y/o actividad biológica de sus polipéptidos, incluso durante el almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés mencionadas anteriormente.

[0544] La potencia y/o actividad biológica de una sustancia biológica describe la capacidad o habilidad específica de dicha sustancia biológica para lograr un efecto biológico definido. La potencia y las actividades biológicas de los polipéptidos de la invención se pueden evaluar mediante diversos ensayos que incluyen cualquier ensayo in vitro adecuado, ensayo basado en células, ensayo in vivo y/o modelo animal conocido per se, o cualquier combinación de los mismos, dependiendo de la enfermedad o trastorno específico involucrado. Los ensayos in vitro adecuados serán claros para la persona experta, y por ejemplo incluyen ELISA; ensayo de unión FACS; Blacore; ensayo de unión competitiva (AlphaScreen®, Perkin Elmer, Massachusetts, EE. UU.; FMAT); ensayo TRAP (ensayo de diferenciación de osteoclastos; Rissanen et al. 2005, J. Bone Miner. Res. 20, Supl. 1: S256); ensayo del gen reportero NF-kappaB (Mizukami et al. 2002, Mol. Cell. Biol. 22: 992-1000). Por ejemplo, SEQ ID NO: 4 interactúa con R<a>NKL y bloquea la interacción de este ligando con RANK, evitando así la señalización a través de este receptor. Las SEQ ID NO: 1 a 3 interactúan con IL-6R y bloquean la interacción de este receptor con IL-6. Las SEQ ID NO: 5 y 6 interactúan con IL-23 y bloquean la interacción de este ligando con su receptor. Se puede determinar la potencia de las SEQ ID NO: 1 al 6 para bloquear la respectiva interacción ligando/receptor, por ejemplo mediante ELISA, Biacore, AlphaScreen®.

[0546] Por ejemplo, en una realización, el análisis cinético de Biacore utiliza tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) para monitorizar interacciones macromoleculares en tiempo real, y se utiliza para determinar las constantes de asociación y disociación de los polipéptidos de la formulación de la invención a su diana. El análisis cinético de Biacore comprende el análisis de la unión y disociación de la diana de los chips con polipéptidos inmovilizados de la invención en su superficie. Un estudio cinético típico de Biacore implica la inyección de 250 gl de reactivo polipeptídico en concentración variable en tampón HBS que contiene 0,005 % de Tween 20 sobre la superficie de un chip sensor, sobre el que se ha inmovilizado el antígeno. En el sistema BIAcore 3000, el ligando se inmoviliza en dextrano carboximetilado sobre una superficie de oro, mientras que el segundo socio (analito) se captura a medida que fluye sobre la superficie del ligando inmovilizado. Los ligandos inmovilizados son notablemente resistentes y mantienen su actividad biológica. Los analitos unidos se pueden extraer del ligando inmovilizado sin afectar su actividad para permitir muchos ciclos de unión y regeneración en la misma superficie inmovilizada. La interacción se detecta en tiempo real mediante SPR y con alta sensibilidad. Debido a que la misma afinidad puede reflejar diferentes constantes de asociación y disociación, este instrumento se destaca sobre la mayoría de los otros métodos de medición de afinidad, ya que mide las constantes de asociación (ka) y disociación (kd). También son factibles experimentos de determinación de concentración.

[0548] La formulación de la presente invención casi no exhibe pérdida en las actividades biológicas del polipéptido durante el almacenamiento prolongado bajo las condiciones descritas anteriormente, como se evalúa mediante varios ensayos inmunológicos que incluyen, por ejemplo, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y la resonancia de plasmones superficiales para medir la capacidad del polipéptido para unirse específicamente a un antígeno. Los polipéptidos presentes en la formulación de la presente invención conservan, incluso en las condiciones de estrés definidas anteriormente (tales como el almacenamiento bajo cierto estrés de temperatura durante períodos definidos), más del 80 %, más del 85 %, más del 90 %, más del 95 %, más del 98 %, más del 99 % o más del 99,5 % de sus actividades biológicas iniciales (por ejemplo, la capacidad de unirse a RANKL, IL-6R, IL-23 y/o HSA) de los polipéptidos antes del almacenamiento. En algunas realizaciones, los polipéptidos en la formulación de la invención retienen bajo las condiciones de estrés definidas anteriormente al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,5 % de la actividad biológica (por ejemplo, la capacidad de unirse a RANKL, IL-6R, IL-23 y/o HSA) en comparación con los polipéptidos presentes en una formulación de referencia antes del almacenamiento.

[0550] En una realización, los polipéptidos de la invención se unen a HSA. En las formulaciones de la presente invención, al menos el 80 % (preferiblemente al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,5 %) de dichos polipéptidos conservan su actividad de unión a HSA bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores (tal como almacenamiento bajo cierto estrés de temperatura durante períodos definidos) en comparación con la actividad de unión antes de la condición de estrés. Sin ánimo de ser limitativo, la unión de los polipéptidos a HSA se puede determinar por ejemplo mediante ELISA y/o Biacore.

[0552] En otra realización, los polipéptidos de la invención se unen a RANKL. En la formulación de la presente invención, al menos el 80 % (al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,5 %) de dichos polipéptidos conservan su actividad de unión a RANKL después del almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores en comparación con la actividad de unión antes del almacenamiento.

[0553] En otra realización, I<os>polipéptidos de la invención se unen a IL-6R. En la formulación de la presente invención, al menos el 80 % (al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,5 %) de dichos polipéptidos conservan su actividad de unión a IL-6R después del almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores en comparación con la actividad de unión antes del almacenamiento.

[0554] En otra realización, los polipéptidos de la invención se unen a IL-23. En la formulación de la presente invención, al menos el 80 % (al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,5 %) de dichos polipéptidos conservan su actividad de unión a IL-23 después del almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores en comparación con la actividad de unión antes del almacenamiento.

[0555] En un aspecto preferido, al menos el 80 % (al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,5 %) de los polipéptidos presentes en la formulación de la invención conservan su actividad de unión a todas sus dianas (tales como, por ejemplo, RANKL y HSA, IL-6R y HSA o IL-23 y HSA) después del almacenamiento bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores en comparación con la actividad de unión antes del almacenamiento.

[0557] Los modelos animales adecuados para determinar la potencia y/o actividad biológica de los polipéptidos presentes en las formulaciones de la invención serán claros para el experto en la técnica, y dependerán de la enfermedad y/o trastorno que se pretende prevenir y/o tratar con el polipéptido de la invención. Modelos animales adecuados para probar la potencia y/o actividad biológica de SEQ ID NO: 1 a 6 se describen, por ejemplo, en los documentos WO 08/020079, WO 09/068627 y WO 08/142164.

[0559] Se ha observado poca o ninguna pérdida de potencia de los polipéptidos de la invención en formulaciones con un tampón de histidina y en formulaciones que comprenden un excipiente, preferiblemente un sacárido, azúcar no reductor y/o poliol tal como manitol, sorbitol, trehalosa o sacarosa. Por consiguiente, la presente invención se refiere a una formulación que comprende un vehículo acuoso y un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos, formulándose dicha formulación para su administración a un sujeto humano, en la que dicha formulación comprende además al menos uno de:

[0560] a) Un tampón de histidina a una concentración de 10 mM a 100 mM (preferiblemente de 10 mM a 50 mM, más preferiblemente de 10 a 20 mM, tal como 15 mM o 10 mM);

[0562] b) Un excipiente, preferiblemente un sacárido, azúcar no reductor y/o poliol tal como manitol, sorbitol, trehalosa o sacarosa en una concentración de 1 % a 20 % (preferiblemente 2,5 % a 15 %, más preferiblemente 5 % a 10 %, tal como 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %),

[0564] en la que dicha formulación tiene una concentración de sal inorgánica de 150 mM o inferior; y

[0566] en la que al menos el 80 % (preferiblemente al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,5 %) de los polipéptidos retienen su actividad de unión a al menos una (preferiblemente a todas) de sus dianas bajo una o más de las condiciones de estrés anteriores (tal como durante el almacenamiento a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más)) en comparación con la actividad de unión antes de las condiciones de estrés, dicha actividad de unión medida por ELISA y/o Blacore. En un aspecto preferido, la formulación comprende un tampón de histidina a una concentración de 10 mM a 100 mM (preferiblemente 10 mM a 50 mM, más preferiblemente 10 a 20 mM, tal como 15 mM o 10 mM) y un excipiente, preferiblemente un sacárido, azúcar no reductor y/o poliol tal como manitol, sorbitol, trehalosa o sacarosa a una concentración de 1 % a 20 % (preferiblemente 2,5 % a 15 %, más preferiblemente 5 % a 10 %, tal como 5 %, 7,5 %, 8 % o 10 %), tal como, por ejemplo, 15 mM de histidina pH 6,5 y 8 % de sacarosa; o 10 mM de histidina pH 6,0 y 10 % de sacarosa.

[0568] Por consiguiente, en las formulaciones estables de la presente invención, preferiblemente:

[0569] • el polipéptido de la invención tiene una solubilidad de al menos 20 mg/ml, al menos 50 mg/ml, preferiblemente al menos 90 mg/ml, al menos 120 mg/ml, al menos 150 mg/ml o incluso 200 mg/ml o más) (por ejemplo, según se evalúa mediante el método de exclusión de PEG o mediante ultrafiltración centrífuga);

[0570] • el polipéptido de la invención tiene una temperatura de fusión de al menos 59 °C o más (tal como 59,5 °C o más), preferiblemente al menos 60 °C o más (tal como 60,5 °C o más), más preferiblemente al menos 61 °C o más (tal como 61,5 °C o más) o al menos 62 °C o más (tal como 62,5 °C o más), lo más preferible al menos 63 °C o más (tal como 63,5 °C o más) (por ejemplo, según se evalúa mediante TSA o DSC);

[0571] • menos del 10 % (más preferiblemente menos del 5 %, incluso más preferiblemente menos del 3%, lo más preferible menos del 1 %) del polipéptido de la invención forma piroglutamato en el ácido glutámico N-terminal (por ejemplo, según se evalúa mediante RP-HPLC) durante el almacenamiento bajo una o más (de las anteriores) condiciones de estrés, tales como, por ejemplo, a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más);

[0572] • menos del 10 % (más preferiblemente menos del 5 %, incluso más preferiblemente menos del 3%, lo más preferible menos del 1 %) del polipéptido de la invención forma dímeros (por ejemplo, según se evalúa mediante SE-HPLC) durante el almacenamiento bajo una<o>más (de las anteriores} condiciones de estrés, tales como, por ejemplo, a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más);

[0573] • al menos el 80 % (al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 99,5 %) de los polipéptidos de la invención conservan su actividad de unión (por ejemplo, evaluada mediante ELISA o Biacore) a al menos una (preferiblemente a todas) de sus dianas después del almacenamiento en una o más (de las anteriores) condiciones de estrés, tal como, por ejemplo, a una temperatura de 37 ± 5 °C hasta al menos 2 semanas (preferiblemente al menos 3 semanas, al menos 5 semanas, al menos 8 semanas, al menos 10 semanas, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más) en comparación con la actividad de unión antes de la condición de estrés; y/o

[0574] • El polipéptido de la invención es estable bajo una o más de las siguientes condiciones de estrés mecánico: ° agitar la formulación durante 10 s a 1 min;

[0575] ° empujar la formulación a través de una aguja (25G, preferiblemente 26G, más preferiblemente 27G, incluso más preferiblemente 28G, lo más preferible 29G o más) con una jeringa (la jeringa utilizada puede ser cualquier jeringa disponible comercialmente, tal como por ejemplo una jeringa de 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml hasta 50 ml);

[0576] ° girar durante dos días a 10 rpm; y/o

[0577] ° agitar durante 1 hora a temperatura ambiente y/o 4-48 horas a 4 °C a al menos 10 rpm (tal como 50 rpm, 100 rpm o más).

[0579] Un ejemplo de una formulación preferida de la invención con estas características comprende 10 mg/ml del polipéptido de la invención, 15 mM de histidina pH 6,5, 8 % de sacarosa y 0,01 % de Tween 80. Otro ejemplo de una formulación preferida de la invención con estas características comprende 10 mg/ml del polipéptido de la invención, 10 mM de histidina pH 6,0, 10 % de sacarosa y 0,005 % de Tween 80,

[0581] Los métodos generales para producir los dominios variables únicos y/o polipéptidos presentes en la formulación de la invención son conocidos por el experto en la técnica y/o se han descrito en la técnica. Los dominios variables únicos y/o polipéptidos se pueden producir en cualquier huésped conocido por el experto en la técnica. Por ejemplo, pero sin ser limitante, los dominios variables únicos y/o polipéptidos pueden producirse en huéspedes procariotas entre los que se encuentra E. coli, o huéspedes eucariotas, por ejemplo huéspedes eucariotas seleccionados de células de insectos, células de mamíferos, y huéspedes eucariotas inferiores que comprenden levaduras tales como Pichia, Hansenula, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, preferiblemente Pichia pastoris. La producción de nanocuerpos en huéspedes procariotas y eucariotas inferiores tal comoPichia pastorisse ha descrito, por ejemplo, en los documentos<w>O 94/04678, WO 94/25591 y WO 08/142164. El contenido de estas solicitudes se menciona explícitamente en relación con técnicas y métodos generales de cultivo generales, incluidos medios y condiciones adecuados. El experto en la técnica también puede diseñar construcciones genéticas adecuadas para la expresión de los polipéptidos de la invención en diferentes huéspedes basándose en la presente solicitud y el conocimiento general común. La presente invención también se refiere a condiciones y construcciones genéticas descritas en la técnica, por ejemplo los métodos generales de cultivo, plásmidos, promotores y secuencias líderes descritos en los documentos WO 94/25591, WO 08/020079, Gasser et al. 2006 (Biotechnol. Bioeng. 94: 535); Gasser et al. 2007 (Appl. Environ. Microbiol. 73: 6499); o Damasceno et al. 2007 (Microbiol. Biotechnol. 74: 381).

[0583] Más particularmente, el método para la expresión y/o producción de un polipéptido que comprende uno o más dominios variables únicos comprende al menos las etapas de:

[0584] a} cultivar un huésped o una célula huésped (según se define en este documento) en condiciones que sean tales que dicho huésped o dicha célula huésped se multiplique;

[0585] b} mantener dicho huésped o célula huésped en condiciones que sean tales que dicho huésped o célula huésped exprese y/o produzca el polipéptido;

[0586] c} aislar y/o purificar el polipéptido segregado del medio.

[0588] Para producir/obtener la expresión del polipéptido, la célula huésped transformada o el organismo huésped transformado generalmente pueden conservarse, mantenerse y/o cultivarse en condiciones tales que el polipéptido (deseado) se exprese/produzca. Las condiciones adecuadas serán claras para el experto en la técnica, y normalmente dependerán de la célula huésped/organismo huésped utilizado, así como de los elementos reguladores que controlan la expresión de la secuencia nucleotídica (relevante). Nuevamente se hace referencia a los manuales y solicitudes de patentes mencionados anteriormente.

[0590] Generalmente, las condiciones adecuadas pueden incluir el uso de un medio adecuado, la presencia de una fuente adecuada de alimento y/o nutrientes adecuados, el uso de una temperatura adecuada, y opcionalmente la presencia de un factor o compuesto inductor adecuado (por ejemplo, cuando las secuencias nucleotídicas de la invención están bajo el control de un promotor inducible); todo lo cual se puede seleccionar por la persona experta. Nuevamente, bajo tales condiciones, las secuencias de aminoácidos de la invención pueden expresarse de manera constitutiva, de manera transitoria, o sólo cuando son inducidas adecuadamente.

[0592] El polipéptido de la invención puede entonces aislarse de la célula huésped/organismo huésped y/o del medio en el que se cultivó dicha célula huésped u organismo huésped, utilizando técnicas de aislamiento y/o purificación de proteínas conocidas per se, tales como técnicas de cromatografía y/o electroforesis (preparativas), técnicas de precipitación diferencial, técnicas de afinidad (por ejemplo, utilizando una secuencia de aminoácidos específica y escindióle fusionada con el polipéptido de la invención) y/o técnicas inmunológicas preparativas (es decir, utilizando anticuerpos contra el polipéptido que se va a aislar).

[0594] En la presente invención, el hospedador puede eliminarse del medio de cultivo por medios rutinarios. Por ejemplo, el hospedador puede eliminarse mediante centrifugación o filtración. La disolución obtenida mediante la eliminación del hospedador del medio de cultivo también se denomina sobrenadante de cultivo o sobrenadante de cultivo clarificado. Los polipéptidos de la invención pueden purificarse del sobrenadante de cultivo mediante métodos estándar. Los métodos estándar incluyen, pero no se limitan a, métodos cromatográficos, incluida la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía de interacción hidrofóbica, la cromatografía de intercambio iónico, y la cromatografía de afinidad. Estos métodos se pueden realizar solos o en combinación con otros métodos de purificación, por ejemplo, precipitación o electroforesis en gel. El experto en la técnica puede diseñar combinaciones adecuadas de métodos de purificación para los polipéptidos de la invención basándose en el conocimiento general común. Para ejemplos específicos, se hace referencia a la técnica citada en el presente documento.

[0596] En una realización ejemplar, los polipéptidos de la invención pueden purificarse a partir del sobrenadante de cultivo mediante una combinación de cromatografía de afinidad en proteína A, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño. La referencia a cualquier "etapa de purificación" incluye, pero no se limita a, estos métodos particulares.

[0598] Más específicamente, los polipéptidos de la invención se pueden purificar a partir del sobrenadante de cultivo mediante un procedimiento en el que el sobrenadante clarificado (obtenido por centrifugación) se captura en cualquier combinación de columnas seleccionadas de (sin ser limitante) resina de cromatografía de afinidad tal como resina de Proteína A, cromatografía de intercambio catiónico (CIEC) o cromatografía de intercambio aniónico (AIEC) utilizando, por ejemplo, Poros 50HS (POROS), SOURCE 30S o SOURCE 155 (GE Healthcare), SP Sepharose (GE Healthcare), Capto S (<g>E Healthcare), Capto<m>M<c>(GE Healthcare) o Poros 50HQ (POROS),<s>ORCE 30Q o<s>ORCE 15Q (GE Healthcare), Q Sepharose (GE Healthcare), Capto Q y DEAE Sepharose (GE Healthcare), cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC) utilizando, por ejemplo, Superdex 75 o Superdex 200 (GE Healthcare), cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) utilizando por ejemplo octil, butil sepharosa o equivalentes, incluyendo opcionalmente también una etapa de filtración de flujo tangencial (TFF). Se puede utilizar cualquier combinación de columnas para la purificación de los polipéptidos de la invención, tal como por ejemplo resina de Proteína A seguida de cromatografía de intercambio catiónico, o dos etapas de cromatografía de intercambio catiónico.

[0600] La presente invención también proporciona métodos para preparar las formulaciones estables de la invención que comprenden los polipéptidos de la invención. Más particularmente, la presente invención proporciona métodos para preparar formulaciones estables de dichos polipéptidos, comprendiendo dichos métodos concentrar una fracción que contiene el polipéptido purificado hasta la concentración final de polipéptido usando, por ejemplo, una membrana semipermeable con un corte de peso molecular (MW) apropiado (por ejemplo, un corte de 5 kD para dominios variables únicos; un corte de 10 kD para polipéptidos bivalentes que comprenden dos dominios variables únicos; o un corte de 15 kD para polipéptidos trivalentes que comprenden tres dominios variables únicos), y diafiltrar y/o ultrafiltrar para intercambiar el tampón y concentrar aún más la fracción de polipéptido en el tampón de formulación usando la misma membrana. Como se describió extensamente anteriormente, el tampón de formulación de la presente invención puede comprender además al menos uno de:

[0601] a) Un tampón a una concentración de 10 mM a 100 mM seleccionado del grupo que consiste en histidina pH 6,0-6,5; b) Un excipiente en una concentración de 1 % a 20 %;

[0602] c) Un tensioactivo en una concentración de 0,001 % a 1 % seleccionado entre Tween 80, Tween 20 o un poloxámero.

[0603] El pH de la formulación puede variar de alrededor de 5,5 a alrededor de 8,0, o puede variar de alrededor de 6,0 a alrededor de 7,5, preferiblemente de alrededor de 6,2 a 7,5, de alrededor de 6,2 a 7,0, más preferiblemente de alrededor de 6,5 a 7,0.

[0605] Se añadirá un tensioactivo (por ejemplo, Tween 20, Tween 80 o poloxámero) después de la etapa final de diafiltración/ultrafiltración a una concentración en el intervalo de alrededor de 0 % a 1 %, preferiblemente 0,001 % a 0,1 %, o 0,01 % a 0,1 %, tal como 0,001 %, 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,05 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,5 %, o 1 % de la formulación, preferiblemente 0,01 % o 0,005 %.

[0607] La formulación de la presente invención se puede esterilizar mediante diversos métodos de esterilización, que incluyen filtración estéril, radiación, etc. En una realización específica, la formulación de polipéptido se esteriliza por filtro con un filtro de 0,2 micrómetros preesterilizado.

[0608] Preferiblemente, la formulación de la presente invención se suministra en un recipiente herméticamente cerrado. Las formulaciones líquidas pueden comprender una cantidad entre 1 ml y 20 ml, preferiblemente alrededor de 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml o 20 ml.

[0610] La formulación de la presente invención se puede preparar como formas de dosificación unitarias preparando un vial que contenga una alícuota de la formulación para un solo uso. Por ejemplo, una dosis unitaria de formulación líquida por vial puede contener 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml o 20 ml de la formulación. Las formas de dosificación unitarias farmacéuticas pueden hacerse adecuadas para cualquier forma de administración del polipéptido de la invención, incluyendo (sin ser limitativa) administración parenteral, administración tópica, administración pulmonar, administración intranasal, administración vaginal, administración enteral, administración rectal, administración oral y/o administración sublingual. En un aspecto, la presente invención se refiere a una forma de dosificación unitaria farmacéutica adecuada para administración parenteral (tal como por ejemplo intravenosa, intraarterial, intramuscular, intracerebral, intraósea, intradérmica, intratecal, intraperitoneal, subcutánea, etc.) a un sujeto, que comprende una formulación de la invención en un recipiente adecuado. En otro aspecto preferido, el sujeto es un humano. En una realización específica, las formulaciones de la presente invención se formulan en viales de dosis única como un líquido estéril que contiene 10 mg/ml de una de SEQ ID NO: 1 a 6, tampón de histidina 15 mM a pH 6,5, 8 % de sacarosa y 0,01 % de Tween 80. En otra realización específica, las formulaciones de la presente invención se formulan en viales de dosis única como un líquido estéril que contiene 10 mg/ml de una de SEQ ID NO: 1 a 6, tampón de histidina 10 mM a pH 6,0, 10 % de sacarosa y 0,005 % de Tween 80.

[0612] La cantidad de una formulación de la presente invención que será eficaz en la prevención, tratamiento y/o manejo de una determinada enfermedad o trastorno puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar bien conocidas en la técnica o descritas en este documento. La dosis precisa a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración, y deberá decidirse según el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o de modelos animales. Para las formulaciones del polipéptido comprendidas en la invención, la dosis administrada a un paciente puede calcularse además utilizando el peso del paciente en kilogramos (kg) multiplicado por la dosis a administrar en mg/kg.

[0614] El volumen requerido (en ml) a administrar se determina entonces dividiendo la dosis en mg requerida entre la concentración de la formulación de polipéptido. El volumen final requerido calculado se obtendrá juntando el contenido de tantos viales como sean necesarios en jeringas para administrar la formulación polipeptídica de la invención.

[0615] La presente invención también abarca un producto farmacéutico terminado, envasado y etiquetado. Este artículo de fabricación o kit incluye la forma de dosificación unitaria adecuada en un recipiente o envase apropiado, tal como un vial de vidrio u otro recipiente que esté sellado herméticamente. En una realización, la forma de dosificación unitaria es adecuada para administración intravenosa, intramuscular, intranasal, oral, tópica o subcutánea. De esta manera, la invención comprende formulaciones, preferiblemente estériles, adecuadas para cada vía de administración. En el caso de formas de dosificación adecuadas para administración parenteral (tal como por ejemplo administración subcutánea), el ingrediente activo, por ejemplo, el polipéptido de la invención, es estéril y adecuado para administración como una solución libre de partículas.

[0617] Como ocurre con cualquier producto farmacéutico, el material de embalaje y el recipiente están diseñados para proteger la estabilidad del producto durante el almacenamiento y el transporte. Además, los productos de la invención incluyen instrucciones de uso u otro material informativo que aconseja al médico, técnico o paciente sobre cómo prevenir o tratar adecuadamente la enfermedad o trastorno en cuestión. En otras palabras, el artículo de fabricación incluye instrucciones que indican o sugieren un régimen de dosificación que incluye, pero no se limita a, dosis reales, procedimientos de monitorización, y otra información de monitorización.

[0619] Específicamente, la invención proporciona un artículo de fabricación que comprende material de embalaje, tal como una caja, botella, tubo, vial, recipiente, rociador, insuflador, bolsa intravenosa (iv), sobre, y similares; y al menos una forma de dosificación unitaria de un agente farmacéutico contenido dentro de dicho material de embalaje, en el que dicho agente farmacéutico comprende la formulación que contiene el polipéptido. El material de embalaje incluye instrucciones que indican que dicho polipéptido se puede utilizar para prevenir, tratar y/o controlar uno o más síntomas asociados con la enfermedad o trastorno mediante la administración de dosis específicas y el uso de regímenes de dosificación específicos como se describe en este documento.

[0621] La invención también proporciona un artículo de fabricación que comprende material de embalaje, tal como una caja, botella, tubo, vial, recipiente, pulverizador, insuflador, bolsa intravenosa (iv), sobre, y similares; y al menos una forma de dosificación unitaria de cada agente farmacéutico contenido dentro de dicho material de embalaje, en el que un agente farmacéutico comprende una formulación que contiene el polipéptido de interés, y en el que dicho material de embalaje incluye instrucciones que indican que dichos agentes pueden usarse para prevenir, tratar y/o controlar la enfermedad o trastorno administrando dosis específicas y utilizando regímenes de dosificación específicos como se describe en este documento.

[0622] La invención también proporciona un artículo de fabricación que comprende material de embalaje, tal como una caja, botella, tubo, vial, recipiente, pulverizador, insuflador, bolsa intravenosa (iv), sobre, y similares; y al menos una forma de dosificación unitaria de cada agente farmacéutico contenido dentro de dicho material de embalaje, en el que un agente farmacéutico comprende una formulación que contiene el polipéptido, y en el que dicho material de embalaje incluye instrucciones que indican que dichos agentes pueden usarse para prevenir, tratar y/o controlar uno o más síntomas asociados con la enfermedad o trastorno administrando dosis específicas y utilizando regímenes de dosificación específicos como se describe en este documento.

[0624] Las formulaciones, recipientes, dosis unitarias farmacéuticas y kits de la presente invención pueden administrarse a un sujeto para prevenir, tratar y/o controlar una enfermedad y/o trastorno específico. En un aspecto específico, las formulaciones, recipientes, dosis unitarias farmacéuticas y kits de la presente invención se administran a un sujeto para prevenir, tratar y/o controlar una enfermedad y/o trastorno asociado con o caracterizado por la expresión y/o actividad aberrante de una determinada diana o uno o más síntomas de la misma. En otro aspecto específico, las formulaciones, recipientes, dosis unitarias farmacéuticas y kits de la presente invención se administran a un sujeto para prevenir, tratar y/o manejar enfermedades y/o trastornos asociados con la expresión y/o actividad aberrante de RANKL, enfermedades y/o trastornos asociados con la sobreexpresión de IL-6, o enfermedades y trastornos asociados con citocinas heterodímeras y sus receptores, o uno o más síntomas de los mismos.

[0626] Las enfermedades y trastornos asociados con la expresión y/o actividad aberrante de RANKL son, por ejemplo, enfermedades y trastornos óseos, e incluyen (sin limitarse a) las siguientes enfermedades y trastornos: Osteoporosis (McCIung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33), incluyendo, pero no limitado a, osteoporosis primaria, osteoporosis endocrina (incluyendo, pero no limitado a, hipertiroidismo, hiperparatiroidismo (Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232), síndrome de Cushing y acromegalia), formas hereditarias y congénitas de osteoporosis (incluidas, pero no limitado a, osteogénesis imperfecta, homocistinuria, síndrome de Menkes, síndrome de Riley-Day), osteoporosis debida a la inmovilización de las extremidades, osteoporosis inducida por glucocorticoides (Locklin et al. 2001, Bone 28 (Supl.): S80; McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33; Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232) y osteoporosis posmenopáusica (McCIung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33); enfermedad de Paget (juvenil o familiar) (Cundy et al. 2002, Hum. Mol. Genet. 11: 2119-2127; Whyte et al. 2002, J. Bone Miner. Res. 17: 26-29; Whyte et al. 2002, N. Engl. J. Med. 347: 175-184; Johnson-Pais et al. 2003, J. Bone Miner Res. 18: 376-380; Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232; Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); Osteomielitis, es decir, una lesión infecciosa en el hueso que provoca pérdida ósea; Hipercalcemia (Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232}, incluyendo, pero no limitado a, hipercalcemia resultante de tumores sólidos (incluyendo, pero no limitado a, mama, pulmón y riñón) y neoplasias hematológicas (incluyendo, pero no limitado a, mieloma múltiple (Sordillo y Pearse 2003, Cáncer 97 (3 Supl): 802-812; Vanderkerken et al. 2003, Cáncer Res. 63: 287-289), linfoma y leucemia), hipercalcemia idiopática e hipercalcemia asociada con hipertiroidismo y trastornos de la función renal; Pérdida ósea, incluyendo pero no limitado a, osteopenia después de una cirugía, osteopenia inducida por la administración de esteroides, osteopenia asociada con trastornos del intestino delgado y grueso, y osteopenia asociada con enfermedades hepáticas y renales crónicas; Osteonecrosis, es decir, muerte de células óseas, incluyendo, pero no limitado a, osteonecrosis asociada con lesión traumática, osteonecrosis asociada con la enfermedad de Gaucher, osteonecrosis asociada con anemia de células falciformes, osteonecrosis asociada con lupus eritematoso sistémico, osteonecrosis asociada con artritis reumatoide, osteonecrosis asociada con enfermedad periodontal, osteonecrosis asociada con metástasis osteolítica, y osteonecrosis asociada con otra afección; Pérdida ósea asociada con trastornos artríticos tales como artritis psoriásica, artritis reumatoide, pérdida de cartílago y erosión articular asociada con artritis reumatoide (Bezerra et al.

[0627] 2005, Brazilian Journal of Medical and Biological Research 38: 161-170; Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem.

[0628] 97: 226-232); Artritis (Bezerra et al. 2005, Brazilian Journal of Medical and Biological Research 38: 161-170), incluida la artritis inflamatoria (McCIung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33), Artritis inducida por colágeno (Bezerra et al. 2005, Brazilian Journal of Medical and Biological Research 38: 161-170); Osteólisis periprotésica (McCIung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33; Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); Enfermedad ósea relacionada con el cáncer (McCIung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33); Pérdida ósea asociada con la terapia con inhibidores de la aromatasa (Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050); Pérdida ósea asociada con la terapia de privación de andrógenos (Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050); Pérdida ósea asociada a metástasis ósea; Pérdida ósea asociada a enfermedades que afectan al sistema inmunológico, tales como leucemias en adultos y niños, metástasis de cáncer, autoinmunidad y diversas infecciones virales (Holstead Jones et al. 2002, Ann. Rheum. Dis. 61 (Supl II): ii32-ii39); Trastornos osteopénicos tal como leucemia en adultos y niños (Oliveri et al. 1999, Henry Ford Hosp. Med. 39: 45-48); infecciones crónicas tales como hepatitis C o VIH (Stellon et al. 1985, Gastroenterology 89: 1078-1083); trastornos autoinmunes tal como diabetes mellitus (Piepkorn et al. 1997, Horm. Metab. Res. 29: 584-91) y lupus eritematoso (Seitz et al. 1985, Ann. Rheum Dis. 44: 438-445); enfermedades alérgicas tal como asma (Ebeling et al. 1998, J. Bone Min. Res. 13: 1283-1289); metástasis óseas líticas en cánceres múltiples tal como cáncer de mama (Coleman 1998, Curr. Opin. Oncol. 10 (Supl 1): 7-13); Cáncer de próstata; Enfermedad ósea por mieloma (Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); Infecciones periodontales (Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); Hiperfosfatasia esquelética expansiva (Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Blochem. 97: 226-232); Metástasis óseas (Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050; Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232).

[0629] También queda comprendida dentro del alcance de la presente invención la prevención y/o tratamiento con las formulaciones, recipientes, dosis unitarias farmacéuticas y kits de la invención de otras enfermedades y trastornos asociados a un desequilibrio en la ruta de RANKL/RANK/OPG. Estas enfermedades y trastornos incluyen, pero no se limitan a, osteoporosis, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, asma, artritis reumatoide, esclerosis múltiple y mieloma múltiple (Sordillo y Pearse 2003, Cáncer 97 (3 Supl): 802-812; Vanderkerken et al. 2003, Cáncer Res. 63: 287-289); Enfermedades vasculares (Anandarajah y Schwarz 2006, J. Cell Biochem.97:226-232) y Enfermedades cardiovasculares (Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol, Ther. 6: 1041-1050).

[0631] También queda comprendida dentro del alcance de la presente invención la prevención y/o tratamiento con las formulaciones, recipientes, dosis unitarias farmacéuticas y kits de la invención de enfermedades y trastornos asociados con la osteopetrosis tales como osteopetrosis tarda, osteopetrosis congénita y enfermedad del hueso marmóreo.

[0632] Las enfermedades y trastornos causados por la expresión y/o actividad aberrante, tal como la producción o señalización excesiva de IL-6, incluyen septicemia (Starnes et al., 1999) y diversas formas de cáncer, tal como la enfermedad del mieloma múltiple (MM), el carcinoma de células renales (RCC), la leucemia de células plasmáticas (Klein et al., 1991), el linfoma, el trastorno linfoproliferativo B (BLPD) y el cáncer de próstata. Ejemplos no limitantes de otras enfermedades causadas por la expresión y/o actividad aberrante, tal como la producción o señalización excesiva de IL-6, incluyen la resorción ósea (osteoporosis) (Roodman et al., 1992; Jilka et al., 1992), la caquexia (Strassman et al., 1992), la psoriasis, la glomerulonefritis proliferativa mesangial, el sarcoma de Kaposi, el linfoma relacionado con SIDA (Emilie et al., 1994), enfermedades y trastornos inflamatorios tales como la artritis reumatoide, la artritis idiopática juvenil de inicio sistémico, la hipergammaglobulinemia (Grau et al., 1990), la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, el lupus eritematoso sistémico (LES), la esclerosis múltiple, la enfermedad de Castleman, la gammapatía IgM, el mixoma cardíaco, el asma (en particular el asma alérgico) y la diabetes mellitus autoinmune dependiente de la insulina (Campbell et al., 1991).

[0634] Las enfermedades y trastornos asociados con las citocinas heterodiméricas y sus receptores incluyen inflamación y trastornos inflamatorios tales como enfermedades intestinales (colitis, enfermedad de Crohn, EII), enfermedades infecciosas, psoriasis, cáncer, enfermedades autoinmunes (tal como EM), carcoiditis, rechazo de trasplantes, fibrosis quística, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, artritis reumatoide, infección viral e inmunodeficiencia variable común.

[0636] Las formulaciones, recipientes, dosis unitarias farmacéuticas y kits de la presente invención también pueden utilizarse de forma ventajosa en combinación con una o más terapias adicionales (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos adicionales), preferiblemente terapias útiles en la prevención, tratamiento y/o gestión de la (misma u otra) enfermedad o trastorno. Cuando se utilizan una o más terapias adicionales (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos), se pueden administrar por separado, en cualquier forma apropiada y por cualquier vía adecuada. Los agentes terapéuticos o profilácticos incluyen, pero no se limitan a, moléculas pequeñas, fármacos sintéticos, péptidos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos (por ejemplo, nucleótidos de ADN y<a>R<n>que incluyen, pero no se limitan a, secuencias nucleotídicas antisentido, hélices triples, ARNi y secuencias nucleotídicas que codifican proteínas, polipéptidos o péptidos biológicamente activos), anticuerpos, otros dominios variables únicos, moléculas inorgánicas sintéticas o naturales, agentes miméticos, y moléculas orgánicas sintéticas o naturales. Cualquier terapia (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) que se sabe que es útil, o que se ha utilizado o se está utilizando actualmente para la prevención, el tratamiento y/o el manejo de uno o más síntomas asociados con una enfermedad o trastorno específico, se puede utilizar en combinación con las formulaciones de la presente invención de acuerdo con la invención descrita en este documento.

[0638] Una formulación de la invención puede administrarse a un mamífero, preferiblemente un ser humano, simultáneamente con una o más terapias adicionales (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos adicionales). El término "concurrentemente" no se limita a la administración de agentes/terapias profilácticos o terapéuticos exactamente al mismo tiempo, sino que significa que la formulación de la invención y el otro agente/terapia se administran a un mamífero en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo tal que el polipéptido contenido en la formulación puede actuar junto con el otro agente/terapia para proporcionar un mayor beneficio que si se administraran de otra manera. Por ejemplo, la formulación de la invención y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos pueden administrarse al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden en diferentes puntos de tiempo; sin embargo, si no se administran al mismo tiempo, deben administrarse suficientemente cerca en el tiempo para proporcionar el efecto terapéutico o profiláctico deseado.

[0640] Cuando se utilizan en combinación con otras terapias (por ejemplo, agentes profilácticos y/o terapéuticos), las formulaciones de la invención y la otra terapia pueden actuar de forma aditiva o sinérgica. La invención contempla la administración de una formulación de la invención en combinación con otras terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) por la misma o diferentes vías de administración, por ejemplo, oral y parenteral.

[0642] Se conocen diversos sistemas de administración, y pueden utilizarse para administrar la formulación de la presente invención. Los métodos de administración de formulaciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y, preferiblemente, subcutánea), administración epidural, administración tópica, y administración mucosa (por ejemplo, vías intranasal y oral). En una realización específica, las formulaciones líquidas de la presente invención se administran por vía parenferal.

[0643] La invención se describirá ahora con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitativos:

[0644] EJEMPLOS Y EJEMPLOS COMPARATIVOS

[0645] Ejemplo 1: Formulación y estudios de estabilidad con RANKL008a

[0646] Ejemplo 1.1: Materiales y métodos utilizados en el estudio

[0647] 1.1.1 Dominios variables únicos

[0648] RANKL008a (SEQ ID NO: 4; EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVS s it g s g g s t y y a d s v k g r f t is r d n a k n t l y l q m n s l r p e d t a v y y c a a y ir p d t y l s r d y r k y d y w g q g t l v t v s s g g g g s g g g s e v q l v e s g g g l v q p g n s l r l s c a a s g f t f s s f g m s w v r q a p g k g l e w v s s is g s g s d t l y a d s v k g r f t is r d n a k t t l y l q m n s l r p e d t a v y y c t ig g s l s r s s q g t l v t v s s g g g g s g g g s e v q l v e s g g g l v q p g g s l r l s c a a s g f t f s s y p m g w f r q a p g k g r e f v s s it g s g g s t y y a d s v k g r f t is r d n a k n t l y l q m n s l r p e d t a v y y c AAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS) se ha descrito como SEQ ID NO: 759 en el documento WO 2008/142164, RANKL008a es un nanocuerpo biespecífico trivalente que consiste en tres dominios variables humanizados de un anticuerpo de llama de cadena pesada, de los cuales dos subunidades idénticas son específicas para unirse a RANKL mientras que la subunidad restante se une a HSA, Las subunidades se fusionan de cabeza a cola con un enlazador G/S en el siguiente formato: RANKL13H5-9GS-Alb8-9GS-RANKL13H5,

[0649] RANKL008a se expresó en Pichia pastoris, y se purificó en SP Sepharose como una etapa de captura y un filtro Q como una etapa de pulido, o en SP Sepharose como una etapa de captura y Capto MMC como una etapa de pulido, o alternativamente utilizando una etapa de captura con ProtA seguido de una etapa de pulido con SP Sepharose, La concentración del nanocuerpo y el cambio de tampón a PBS, 10 mM de fosfato 100 mM de NaCI, 10 mM de fosfato 5 % de manitol o 10 mM de fosfato 115 mM de NaCI u otros tampones se realizaron mediante UF/DF o diálisis, Se realizó una filtración final en un filtro de 0,22 pm, Los diferentes lotes de RANKL008a tenían concentraciones que variaban desde 143 a 62,8 mg/ml, La mayoría de los lotes se prepararon en concentraciones de alrededor de 60-85 mg/ml,

[0650] 1.1.2 Otros reactivos

[0651] Todos los reactivos utilizados en el estudio son reactivos químicos estándar de máxima pureza, La composición completa de D-PBS fue 137 mM de NaCI, 2,7 mM de KCI, 10 mM de fosfato de sodio dibásico, 2 mM de fosfato de potasio monobásico,

[0652] 1.1.3 Equipos y columnas para pruebas

[0653] Los experimentos de HPLC se llevaron a cabo en un instrumento Agilent serie 1200 de Agilent Technologies (Palo Alto, EE, UU,), Las columnas utilizadas fueron:

[0654] • RP-HPLC: Zorbax 300SB-C35 micrómetros;

[0655] • SE-HPLC: TSKgel G2000SW<xl>(Tosoh Bioscience, Japan);

[0656] • IEX-HPLC: Columna Dionex ProPac<w>CX-10;

[0657] La concentración de los lotes de RANKL008a purificados se determinó mediante espectroscopia a 280 nm utilizando un NanoDrop ND-1000 (Thermoscientific), un espectrofotómetro Uvikon 943 (Kontron Instruments) o un biofotómetro Eppendorf 613,

[0658] La distribución del tamaño de partículas se midió en un contador de partículas PAMAS SVSS-C (PArtikelMess-und AnalyseSysteme GMBH),

[0659] Para las mediciones de potencia se utilizó un Biacore 3000 (GE Healthcare), Se realizaron ensayos de potencia basados en ELISA utilizando equipo de laboratorio estándar e instrumentación de lectura de placas,

[0660] La medición de la osmolalidad se realizó con un osmómetro modelo 3320 de Advanced Instruments,

[0661] 1.1.4 ELISA de inhibición para la medición de la potencia de RANKL

[0662] RANKL008a interactúa con el ligando del activador del receptor humano (soluble) del factor nuclear kappaB (RANKL) y bloquea la interacción de este ligando con su activador del receptor humano del factor nuclear kappaB (RANK), evitando así la señalización a través de este receptor, La potencia de RANKL008a se midió mediante un ensayo de inhibición basado en ELISA que permite evaluar la potencia relativa de los restos de unión a RANKL de un lote desconocido de RANKL008a con respecto al de un lote de referencia,

[0663] Para la referencia, el contro l y las muestras de prueba, se prepararon diferentes diluciones de nanocuerpos. Estas diluciones se preincubaron con una cantidad constante de 5 ng/ml de RANKL soluble y una cantidad constante de 200 ng/ml de RANK-Fc . Posteriorm ente, esta m ezcla se transfirió a una placa de m icrotitu lación recubierta con un nanocuerpo anti-Fc no bloqueante. Después del lavado, se detectó el RANKL unido residual con un anticuerpo anti-RANKL hum ano biotin ilado policlonal, seguido de una detección de estreptavid ina m arcada con peroxidasa de rábano picante (HRP).

[0664] La potencia relativa de las m uestras de prueba en com paración con las m uestras de referencia se analizó m ediante el uso del software PLA 2.0 (S tegmann Systems).

[0665] 1.1.5 ELISA para la unión a HSA

[0666] La potencia relativa del resto de unión a HSA en RANKL008a se midió m ediante una prueba de ELISA. Brevemente, HSA se revistió sobre una placa de ELISA Maxisorp de m últip les pocilios de plástico mediante adsorción. Después de b loquear los sitios de unión en exceso en las placas con Superblock T20, se aplicó en la placa una serie de diluciones de referencias, contro l y m uestras de prueba. Posteriorm ente se detectó el nanocuerpo unido utilizando un nanocuerpo bivalente anti-nanocuerpo, conjugado directam ente con peroxidasa de rábano picante (HRP).

[0667] La potencia relativa de las muestras de prueba en com paración con las m uestras de referencia se analizó m ediante el uso del software PLA 2.0 (Stegmann Systems).

[0668] 1.1.6 Ensayo de pureza de RANKL008a mediante cromatografía de líquidos de alta resolución por exclusión por tamaño (SE-HPLC)

[0669] El ensayo de SE-HPLC consistió en una colum na de gel de sílice TSKgel G 2000SW xl preem paquetada, una fase móvil que consistía en KCl, NaCi y tam pón de fosfato pH 7,2 (D-PBS), y detección UV a 280 nm. La cantidad relativa de la proteína específica, varian te o im purezas expresada com o porcentaje del área se calculó divid iendo el área del pico correspondiente a la proteína específica o a cua lqu ier im pureza de proteína entre el área tota l de todos los picos integrados.

[0670] 1.1.7 Ensayo de pureza de RANKL008a mediante cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC)

[0671] En el ensayo de RP-HPLC se utilizó una colum na Zorbax 300SB-C3 (Agilent Technologies, Palo Alto, EE. UU.). La cantidad relativa de una im pureza prote ica específica se determ inó m idiendo la absorbancia de luz de los com ponentes que eluían de la colum na de RP-HPLC. La cantidad relativa de la proteína específica, variante o im purezas expresada com o porcenta je del área se calculó divid iendo el área del pico correspondiente a la proteína específica o a cua lquier im pureza de proteína entre el área total de todos los picos integrados.

[0672] 1.1.8 Ensayo de pureza de RANKL008a mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento de intercambio iónico (IEX-HPLC)

[0673] El ensayo de IEX-HPLC com binó el uso de una colum na de intercam bio catiónico débil D ionex ProPac W CX-10 preem paquetada, una fase móvil com puesta por un tam pón de citrato pH 5,5, y detección UV a 280 nm. Después de cargar las proteínas en la colum na, los m ateriales unidos se eluyeron m ediante un gradiente de cloruro de sodio. La cantidad relativa de la proteína específica, varian te o im purezas expresada com o porcentaje del área se calculó d iv idiendo el área del pico correspondiente a la proteína específica o a cua lqu ier im pureza de proteína entre el área tota l de todos los picos integrados.

[0674] 1.1.9 Determinación de la potencia relativa en Biacore

[0675] RANKL o HSA se inmovilizó en el chip de B iacore (acoplam iento de am ina utilizando el kit de acoplam iento de am ina de Biacore). Después de una etapa de preacondicionam iento de 5 inyecciones de RANKL008a, todas las muestras se diluyeron hasta 2,5 nM por trip licado, y se analizaron en el chip. Las pendientes se determ inaron utilizando el método de ajuste general y el m odelo de ajuste lineal (software BIAevaluation). Para determ inar la tasa de unión inicial (IBR), se seleccionó la pendiente entre 5 s y 30 s. Los valores de estas pendientes se transfirieron a Excel, y se determ inó el porcentaje de activ idad/potencia en com paración con el material de referencia de RANKL008a. La potencia de B iacore se expresa así com o potencia relativa en com paración con los m ateriales de referencia.

[0676] Ejemplo 1.2: Estabilidad del nanocuerpo en diferentes tampones después de diferentes ciclos de congelación/descongelación

[0677] Se realizó un estudio de estabilidad de congelación/descongelación para determ inar el efecto de la congelación y descongelación repetidas en la recuperación, la estabilidad fís ica y la estabilidad quím ica de RANKL008a. Alícuotas del lote RANKL008a, form uladas a ~60-85 mg/ml en los tam pones 1-12 indicados en la Tabla 1, se som etieron a 10 ciclos de oongelación/desoongelación (F/T) a -200C. Un ciclo F/T se define como la congelación de la muestra durante 1 hora en un congelador a -20 °C, seguido de una descongelación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras estresadas se compararon con material de referencia (almacenado a 4 °C) utilizando SE-HPLC (Figura 1 (A); figura representativa de los experimentos realizados en tampón de fosfato), RP-HPLC (Figura 2; figura representativa de los experimentos realizados en tampón de fosfato) y los ensayos de potencia de ELISA (Tabla 2). Todos los demás datos de los experimentos de congelación y descongelación muestran patrones similares a los que se muestran en las Figuras 1 y 2 (excepto la Figura 1 (B), véase más abajo).

[0679] Someter RANKL008a a 10 ciclos F/T no tuvo un efecto significativo en su estabilidad: los perfiles de SE-HPLC y RP-HPLC fueron comparables entre los lotes de referencia y el material sometido a múltiples ciclos de congelación/descongelación. No hubo disminución en el área superficial total y no se formaron nuevos picos, excepto en 20 mM de L-histidina, pH 5,5 10 % manitol y 20 mM de L-histidina, pH 6 10 % manitol, en los que el pico principal tenía un hombro muy pequeño en los cromatogramas de SE-HPLC (Figura 1 (B) que muestra los datos a pH 5,5 y en la que el hombro menor en el pico principal está indicado por una flecha). En la Tabla 3 y Tabla 4 se incluyen datos para la integración de los diferentes picos (expresados como % de área superficial) en el análisis de SE-HPLC y RP-HPLC respectivamente. Estos datos demuestran que no se producen cambios en los perfiles después de 10 ciclos de congelación y descongelación.

[0681] El análisis mediante ensayos de potencia de ELISA no indicó pérdida de actividad después de la congelación y descongelación repetidas en todas las formulaciones, excepto en 20 mM de histidina, pH 5,5 10 % de manitol, en la que pareció haber una menor potencia de unión a RANKL y HSA.

[0683] Ejemplo 1.3: Estabilidad del nanocuerpo en diferentes tampones cuando se almacena a 37 °C hasta 10 semanas

[0685] RANKL008a se formuló en diferentes tampones a ~60-85 mg/ml (tampones 1-12 indicados en la Tabla 1). Se evaluó la estabilidad de las diferentes muestras en condiciones de estrés acelerado a 37 °C ± 3 °C. Se tomaron muestras tras 2, 3, 5 y 10 semanas de almacenamiento a esta temperatura, y se analizaron mediante SE-HPLC, RP-HPLC e IEX-HPLC. Se llevó a cabo el Biacore en las muestras almacenadas durante 10 semanas para evaluar la pérdida de potencia.

[0687] 1.3.1 Análisis de SE-HPLC

[0689] Los resultados del análisis de una muestra por SE-HPLC se dan en la Figura 3, en la que se muestra un ejemplo de la muestra almacenada durante dos semanas a 37 °C en presencia de 50 o 100 mM de sal o tampón de fosfato de manitol al 10 %. El almacenamiento a 37 °C dio como resultado la formación de un prepico claro que eluyó alrededor de 40 minutos y algunos postpicos menores cerca del pico principal; en el tiempo de elución de 60 minutos (véase inserto en la Figura 3) se pudieron observar algunos fragmentos de degradación. En la Tabla 3 se resumen los datos de integración de todas las muestras analizadas para los diferentes picos observados (excepto los picos después del tiempo de elución de 60 minutos). El área del pico del prepico aumentó con el tiempo, pero se redujo con la adición de manitol al tampón (Tabla 3). Los postpicos después del tiempo de elución de 60 minutos correspondieron a productos de degradación (debido a la actividad proteolítica restante en la muestra). El área relativa (%) de estos picos aumentó sólo ligeramente, lo que implica que la degradación se limitó al mínimo.

[0691] El prepico representó la forma dimérica de RANKL008a. El área superficial del pico del prepico aumentó con el tiempo de almacenamiento (Tabla 3), y estuvo acompañada por una disminución concomitante en el área superficial del pico principal (Tabla 3). La propensión a formar dímeros fue significativamente menor en las formulaciones que contenían 10 % de manitol, lo que pareció tener un efecto positivo en la supresión del proceso de dimerización. Obsérvense las cantidades significativamente inferiores de dímeros observados en los tampones de acetato e histidina (pH 5,5) que contienen 10 % de manitol (Tabla 1 y Figura 4). La Figura 4(A) resume el porcentaje de área superficial del pico principal en los diferentes tampones y en diferentes puntos de tiempo cuando se almacena a 37 °C. La Figura 4(B) resume los datos del porcentaje de prepico (dímero).

[0693] 1.3.2 Análisis de RP-HPLC

[0695] En la Figura 5 se muestra un RP-HPLC representativo, en la que se representa el cromatograma de RP-HPLC de una muestra de RANKL008a almacenada en tampón de fosfato con diferentes concentraciones de sal o manitol al 10 %. Los perfiles de RP-HPLC de RANKL008a formulados en los 12 tampones diferentes fueron comparables a esta figura. En la Tabla 4 se resumen los datos de integración para los diferentes picos detectados. En la Figura 5, el recuadro muestra una ampliación en el pico principal en el que se pueden discriminar los dos pre-picos, mientras que el postpico que está completamente resuelto en la línea base desde el pico principal es la variante de piroglutamato de RANKL008a en el que el ácido glutámico N-terminal se ha convertido en la forma de piroglutamato.

[0697] Hubo dos diferencias entre los perfiles de RP-HPLC del lote de referencia y las muestras de almacenamiento. En primer lugar, el pico de piroglutamato aumentó con el aumento del tiempo de incubación y fue más evidente en el tampón de fosfato a pH 7 que a pH 5,5<o>pH 6. En segundo lugar, se estaba formando un pre-pico en función del tiempo de almacenamiento. El área superficial de este pico fue mayor en el tampón de fosfato.

[0698] No hubo diferencias en los perfiles de RP-HPLC de las muestras sin o con manitol.

[0699] 1.3.3 Análisis de IEX-HPLC

[0700] En la Figura 6 se muestra un cromatograma de IEX-HPLC representativo del RANKL008a almacenado durante 2 semanas en tampón de fosfato con diferentes concentraciones de sal o 10 % de manitol. El recuadro muestra un acercamiento al pico principal en el que se observa un postpico 1 menor y un postpico 2 más significativo. Los resultados del análisis de las diferentes muestras por IEX-HPLC se muestran en la Tabla 5 y la Figura 7.

[0701] El primer postpico constituyó como máximo el 4,5 % del áre superficial total del pico. El área superficial de este pico fue la más alta en el tampón de fosfato, y la más baja o incluso ausente en los tampones que contenían manitol. Por otra parte, el área del pico del segundo pico fue sustancial, aunque significativamente menor en los tampones que contenían 10 % de manitol (Figura 7). El material que eluyó en el postpico se recogió mediante recolección de fracciones y se volvió a cromatografiar en la columna de SE-HLC descrita anteriormente. Este postpico 2 eluye en el cromatograma de SE-HPLC en la posición del dímero, lo que demuestra que i) este dímero no se disocia en estas condiciones, y que ii) este dímero eluye más tarde en la columna de IEX-HpLC. Por lo tanto podemos concluir que el post-pico 2 es la forma dimerizada del RANKL008a.

[0702] 1.3.4 Análisis de potencia Biacore del RANKLO08a almacenado a 37 °C

[0703] La unión a RANKL y HSA de RANKL008a en muestras de estabilidad almacenadas durante 10 semanas a 37 °C se comparó con la actividad del lote de referencia sin estrés mediante el análisis Biacore. Las potencias relativas se dan en la Tabla 6, y se expresan como % de actividad en comparación con el lote de referencia.

[0704] Después de 10 semanas de almacenamiento a 37 °C, la potencia relativa de RANKL008a para unirse a RANKL había disminuido hasta el 70-80 % en los diferentes tampones (Tabla 6). En histidina, pH 6 10 % manitol, la actividad se mantuvo más alta (87,4 %). Cuanto mayor sea la concentración de NaCI en el tampón, menor será la potencia relativa en la muestra (compare los valores obtenidos en tampones con 50 mM de NaCI y 100 mM de NaCI en la Tabla 6). La potencia relativa de unión a HSA disminuyó considerablemente en comparación con la actividad de unión a RANKL tras 10 semanas de almacenamiento a 37 °C. Sin embargo, esta disminución de la actividad fue menos significativa en los tampones que contienen manitol que en los que contenían NaCI. Como se observó para la unión a RANKL, el porcentaje de actividad en HSA disminuyó con el aumento de las concentraciones de NaCI en los diferentes tampones.

[0705] Ejemplo 1.4: Medición de la osmolalidad de los nanocuerpos en los diferentes tampones

[0706] Se realizaron mediciones de osmolalidad en las diferentes formulaciones utilizadas en los estudios de estabilidad:

[0708]

[0710] Ejemplo 1.5: Estabilidad de los nanocuerpos durante el estrés mecánico

[0711] Se realizaron experimentos de estrés mecánico en RANKL008a (62,2 mg/ml) en un tampón de fosfato 10 mM pH 7,0 con 115 mM de NaCI. La muestra de RANKL008a se diluyó (en tampón de fosfato 10 mM pH 7,0 con 115 mM) o no se diluyó con y sin Tween 80 al 0,01 %. Las muestras se agitaron, revolvieron, rotaron y empujaron a través de una aguja con una jeringa (la jeringa utilizada puede ser cualquier jeringa disponible comercialmente, tal como por ejemplo una jeringa de 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml hasta 50 ml) de la siguiente manera:

[0712] • Diluidas a 5 mg/ml o sin diluir y agitadas (10 s - 1 min);

[0713] • Empujadas a través de una jeringa (3 ml) con aguja 25G (sin diluir) (10x);

[0714] • Giradas (10 rpm) en un mezclador de extremo a extremo durante 2 días a temperatura ambiente (sin diluir) • Agitadas 1 hora a temperatura ambiente durante 2 días a 5 °C (diluidas a 5 mg/ml).

[0715] Las diferentes muestras se compararon visualmente para detectar posibles diferencias en el aspecto.

[0716] Una agitación fuerte durante un corto tiempo (10<s>) provocó una fuerte formación de espuma en las muestras en ausencia de Tween 80; la muestra diluida se volvió muy opaca (Figura 8), mientras que esto fue menos pronunciado para la muestra sin diluir. En presencia del Tween 80, no se observó esta opacidad.

[0718] La muestra de RANKL008a sin diluir con y sin 0,01 % de Tween 80 se introdujo 10 veces a través de una aguja (25G) con una jeringa de 3 ml. La muestra sin Tween 80 se volvió opaca, también se formó espuma y se observaron pequeñas burbujas de aire al golpear el vial; en el vial con 0,01 % de Tween 80, la opacidad fue limitada.

[0720] La muestra de RANKL008a sin diluir con o sin 0,01 % de Tween 80 se rotó durante 2 días a 10 rpm. Ambas muestras se mantuvieron transparentes.

[0722] La muestra de RANKL008a diluida (hasta 5 mg/ml) con o sin Tween 80 al 0,01 % se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y durante 2 días más a 5 °C. Las observaciones visuales son las siguientes: la agitación durante 1 hora a temperatura ambiente indujo una opacidad que no se observó en presencia de Tween 80 al 0,01 %. Después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, la muestra sin Tween 80 estaba ligeramente opaca, mientras que la muestra con Tween 80 permaneció transparente. Después de 2 días de agitación a 5 °C, ambas muestras eran opacas, pero la opacidad en la muestra sin Tween 80 fue mayor.

[0724] Con la adición de 0,01 % de Tween 80, la muestra RANKL008a era menos o nada opaca después del estrés mecánico, y había menos formación de espuma. Esto indica que la muestra es menos susceptible a la desnaturalización en la interfaz aire-agua si se añade Tween 80.

[0726] Ejemplo 1.6: Jeringuabilidad de las diferentes formulaciones de nanocuerpo

[0728] Se determinó el efecto del uso de diferentes diluyentes (es decir, solución salina, tampón de fosfato sin Tween 80 o tampón de fosfato con Tween 80) sobre el contenido, el aspecto visual y la potencia de RANKL008a a baja concentración (0,28 mg/ml) después del paso por diferentes jeringas y agujas. RANKL008a se diluyó en diferentes diluyentes, y luego se pasó o almacenó durante 24 horas en jeringas (Becton Dickinson) (Figura 9). La Figura 9 contiene las leyendas de las diferentes muestras generadas durante este experimento, en el que se aplican los siguientes códigos:

[0729] S25/0: almacenamiento a 25 °C durante 0 minutos

[0730] 525/24: almacenamiento a 25 °C durante 24 h

[0731] -TW: tampón menos Tween 80

[0732] +TW: tampón Tween 80

[0733] PLACEBO se refiere al siguiente tampón: 10 mM de Na2HP04 pH 7,0 115 mM de NaCI

[0734] TUB: muestra almacenada en un tubo de poliestireno

[0736] La inspección visual y la determinación del contenido de RANKL008a después de la dilución en diferentes diluyentes y el paso/almacenamiento en jeringas se detallan en la Tabla 7. Los datos sobre la medición de la turbidez a 320 y 350 nm se dan en la Figura 10. La potencia relativa por HSA y RANKL de RANKL008a después de la dilución en diferentes diluyentes y el paso/almacenamiento en jeringas se muestra en la Figura 11.

[0738] El paso a través de una jeringa aumentó ligeramente la turbidez cuando se utilizaron 10 mM de Na2HP04, 115 mM de NaCI (pH 7,0). La dilución en solución salina provocó una caída en la actividad de unión a RANKL/HSA del 18-34,0 %. Se observó un efecto similar utilizando 10 mM de Na2HP04, 115 mM de NaCI (pH 7,0) sin Tween 80, es decir, una caída del 15-27 %. Por el contrario, la dilución en 10 mM de Na2HP04, 115 mM de NaCI (pH 7,0) con Tween 80 no pareció tener un efecto dramático, lo que confirma el papel beneficioso del Tween 80 en el tampón.

[0740] Ejemplo 1.7: Estabilidad de las formulaciones de nanocuerpos durante el paso por jeringas con diferentes tamaños de aguja

[0742] Se evaluó el efecto del paso por jeringas sobre el aspecto visual del RANKL008a utilizando diferentes tamaños de aguja y combinaciones de tamaños de aguja. RANKL008a se diluyó en un tubo Eppendorf (TUB) en 10 mM de Na2HP04, 115 mM de NaCI, 0,01 % de Tween 80 (v:v), (pH 7,0) hasta una concentración final de 0,28 mg/ml, seguido de un solo paso a través de una jeringa Becton Dickinson de 1 ml equipada con diferentes agujas (es decir, Terumo 18G, 23G, 27G y 30G) (Figura 12). En esta Figura y Tabla 8 se aplican los siguientes códigos:

[0743] +TW: tampón Tween 80

[0744] PLACEB0 se refiere al siguiente tampón: 10 mM de Na2HP04 pH 7,0 115 mM de NaCI

[0745] TUB: muestra almacenada en un tubo de poliestireno

[0746] 18G/18G: muestra extraída con una aguja de 18G y expulsada a través de una aguja de 18G

[0747] 18G/27G: extraída con una aguja de 18G y expulsada a través de una aguja de 27G

[0748] El resto de la codificación es similar a los dos ejemplos dados anteriormente.

[0750] La turbidez se determinó mediante inspección visual y por medición de la absorción en longitudes de onda de 320 nm, 340 nm, 350 nm y/o 500 nm, y determinando la relación del valor obtenido sobre la absorción a A278 nm (principalmente 320/278 y 350/278). Se consideró significativo una relación >0,05. La inspección visual, el contenido y la turbidez de RANKL008a antes (TUB) y después del paso a través de jeringas con diferentes tamaños de aguja se muestran en la Tabla 8.

[0752] En un experimento adicional, RANKL008a se sometió a un solo paso a través de una jeringa de 1 ml equipada con diferentes tamaños de aguja (es decir, 27G y 29G), tanto sin diluir (65 mg/ml) como diluido en 10 mM de Na2HPÜ4, 115 mM de NaCl, 0,01 % de Tween 80 (v:v), (pH 7,0) hasta una concentración final de 0,28 mg/ml (Figura 13). La inspección visual, el contenido y la turbidez de RANKL008a antes (TUB) y después del paso a través de jeringas con diferentes tamaños de aguja se muestran en la Tabla 9.

[0754] En la Tabla 9 y la Figura 13 se utilizan los siguientes códigos:

[0755] +TW: tampón Tween 80

[0756] PLACEBO se refiere al siguiente tampón: 10 mM de Na2HPÜ4 pH 7,0 115 mM de NaCl

[0757] TUB: muestra almacenada en un tubo de poliestireno

[0758] 27G/27G: muestra extraída con una aguja de 27G y expulsada a través de una aguja de 27G

[0759] 29G/29G: extraída con una aguja de 29G y expulsada a través de una aguja de 29G

[0760] T: aguja Terumo, aguja B Becton Dickinson

[0761] 0028 se refiere a una concentración de 0,28 mg/ml, 6500 a alrededor de 65 mg/ml.

[0763] Diferentes combinaciones de tamaños de agujas no tuvieron un efecto significativo en la recuperación de RANKL008a ni en la turbidez de la muestra tanto en concentraciones bajas (0,28 mg/ml) como altas (62,8 mg/ml) (hasta los tamaños de calibre 29 y 27 respectivamente). En ambos experimentos, los valores de turbidez fueron bajos (<0,05).

[0765] Ejemplo 2: Formulación y estudios de estabilidad con nanocuerpos que se unen a IL-6R

[0767] Ejemplo 2.1: Materiales y métodos utilizados en el estudio

[0769] 2.1.1 Dominios variables únicos

[0771] Los tres nanocuerpos que se utilizaron en este estudio se han descrito en la solicitud PCT n2 PCT/EP2010/054764 de Ablynx NV. IL6R304 es un nanocuerpo biespecífico que consiste en dos dominios variables humanizados de un anticuerpo de llama de cadena pesada, uno que se une a IL-6R y el otro (Alb8) que se une a HSA. Los nanocuerpos biespecíficos trivalentes IL6R305 e IL6R306 consisten en dos subunidades idénticas que son específicas para IL-6R, mientras que la tercera subunidad se une a HSA. La construcción de las subunidades difiere en IL6R305 e IL6R306 (véase la Tabla C-27 del documento PCT/EP2010/054764). Las subunidades de los tres nanocuerpos están fusionadas cabeza con cola con un enlazador 9G/S. Las secuencias y características de los tres nanocuerpos se detallan en la Tabla 10.

[0773] Los nanocuerpos se expresaron en Pichia pastoris. La concentración del nanocuerpo y el cambio de tampón a PBS u otro tampón de formulación se realizó mediante UF/DF (Sartorius Hydrosart Sartocon Slice 200, 10 kDa). Se realizó una filtración final a 0,22 gm. En la Tabla 11 se ofrece una descripción general de los diferentes lotes de nanocuerpos de IL-6R.

[0775] Se utilizaron muestras no estresadas en PBS u otras formulaciones como material de referencia para analizar la estabilidad del almacenamiento de las muestras.

[0777] 2.1.2 Otros reactivos

[0779] Los reactivos utilizados en el estudio se detallan en la Tabla 12. La composición completa de D-PBS fue 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de fosfato de sodio dibásico, 2 mM de fosfato de potasio monobásico.

[0781] 2.1.3 Equipos y métodos para mediciones

[0783] Los experimentos de HPLC se llevaron a cabo en un instrumento de la serie Agilent 1200 de Agilent Technologies (Palo Alto, EE. UU.) o en un instrumento Dionex Ultimate 3000. Las columnas utilizadas fueron:

[0784] • RP-HPLC: Zorbax 300SB-C3 de 5 micrómetros, 4,6 X 150 mm (Agilent, n.2 de cat. 883995-909) o Zorbax 300SB-C8 de 5 micrómetros, 4,6 X 150 mm (Agilent, n.2 de cat. 883995-906);

[0785] • SE-HPLC: Phenomenex BioSep SEC S2000 (00H-2145-KD)

[0787] Las determinaciones de concentración de los nanocuerpos se realizaron con NanoDrop ND-1000 (Thermoscientific), con un espectrofotómetro Uvikon 943 (Kontron Instruments) o con un biofotómetro Eppendorf 6131 a 280 nm.

[0789] La distribución del tamaño de partículas se midió en un contador de partículas PAMAS SVSS-C (PArtikelMess-und AnalyseSysteme GMBH).

[0791] La medición de la osmolalidad se realizó con un osmómetro modelo 3320 de Advanced Instruments.

[0792] Para medir la actividad de unión, se utilizó Biacore 3000 (GE Healthcare),

[0793] El ensayo de desplazamiento térmico (TSA) se realizó en un dispositivo LightCycler480 Q-PCR (Roche),

[0794] Para la determinación de la Tm se utilizó un calorímetro diferencial de barrido capilar VP automatizado (DSC, MicroCal),

[0795] 2.1.4 Ensayo de pureza de los nanocuerpos de IL-6R mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión por tamaño

[0796] (SE-HPLC)

[0797] El ensayo de SE-HPLC consistió en una columna Phenomenex BioSep SEC S2000 preempaquetada, una fase móvil compuesta por KCl, NaCI y tampón de fosfato pH 7,2 (D-PBS), y detección UV a 280 nm, La cantidad relativa de impureza de proteína específica se expresó como porcentaje de área, y se calculó dividiendo el área del pico correspondiente a la impureza de proteína entre el área integrada total,

[0798] El método puede resolver y cuantificar las cantidades relativas de material intacto e impurezas relacionadas con el producto, tales como agregados y fragmentos de degradación,

[0799] 2.1.5 Ensayo de pureza de los nanocuerpos de IL-6R mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa

[0800] (RP-HPLC)

[0801] En el ensayo de RP-HPLC, se utilizó una columna Zorbax 300SB-C3 o Zorbax 300SB-C8 (Agilent Technologies, Palo Alto, EE, UU.) a temperaturas elevadas, Con la columna C3, la fase móvil A consistió en 0,1 % de TFA y la fase móvil B consistió en 0,1 % de TFA en ACN/isopropanol, Con la columna C8, la fase móvil A consistió en 0,1 % de TFA y la fase móvil B consistió en 0,1 % de TFA en 1-propanoI, La cantidad relativa de una impureza proteica específica se determinó midiendo la absorbancia de luz (280 nm) de los componentes que eluían de la columna de RP-HPLC, La cantidad relativa de una impureza proteica específica, expresada como porcentaje del área, se calculó dividiendo el área del pico correspondiente a la impureza entre el área integrada total,

[0802] 2.1.6 Medición de la distribución del tamaño de partículas (PAMAS)

[0803] Las mediciones en el contador de partículas PAMAS SVSS-C se realizaron de la siguiente manera: 100 gl de muestra se diluyeron 1/10 en 1 ml de agua MilliQ, y se realizaron 10 mediciones consecutivas en los 16 canales (diámetro establecido: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 50, 100, 150 y 200 gm), Para el cálculo del valor promedio se excluyeron las 2 primeras mediciones y se tuvo en cuenta el factor de dilución, Los resultados se dan como datos acumulativos (recuento total de partículas >x gm) o datos diferenciales (recuento total de partículas entre diámetros x e y gm), Sólo se presentan los datos acumulativos,

[0804] 2.1.7 Medición de afinidad en Biacore

[0805] Primero se inmovilizó un chip con HSA (acoplamiento de amina utilizando el kit de acoplamiento de amina de Biacore), Después de una etapa de preacondicionamiento de 5 inyecciones del nanocuerpo, todas las muestras se diluyeron hasta 2,5 nM por triplicado y se analizaron en el chip, Se incluyó en el experimento un control de calidad de los chips utilizando la muestra de referencia, para detectar cualquier pérdida de actividad o disminución de la respuesta (deterioro del chip), Las pendientes se determinaron utilizando el método de ajuste general y el modelo de ajuste lineal (software BIAevaluation), Para determinar la tasa de unión inicial (IBR), se seleccionó la pendiente entre 5 s y 30 s, Los valores de estas pendientes se transfirieron a Excel, y se determinó el porcentaje de actividad respecto a la referencia,

[0806] 2.1.8 Ensayo de potencia basado en ELISA para la unión a HSA

[0807] La seroalbúmina humana (HSA) se inmovilizó en una placa de ELISA Maxisorp de múltiples pocilios mediante adsorción, Después de bloquear los sitios de unión en exceso en las placas con el tampón de bloqueo Superblock T20 (PBS), se aplicó una serie de diluciones de muestras de prueba y de referencia en la placa, Posteriormente se detectó el nanocuerpo unido utilizando un nanocuerpo bivalente anti-nanocuerpo conjugado directamente con peroxidasa de rábano picante (HRP), En presencia de H2O2, HRP cataliza una reacción química con tetrametilbencidina (es TMB) que da como resultado la formación de un color, La reacción se detuvo añadiendo HCI 1N, La densidad óptica del color se midió a 450 nm,

[0808] 2.1.9 Ensayo de potencia basado en ELISS para la unión a IL-6R

[0809] Para las muestras de referencia, control y prueba, se prepararon diferentes diluciones de I<os>nanocuerpos. Estas diluciones se preincubaron con una cantidad constante de 100 ng/ml de IL-6, seguido de la adición de 4 ng/ml de IL-6R soluble. Posteriormente, esta mezcla se transfirió a una placa de microtitulación recubierta con un nanocuerpo anti-IL-6R no neutralizante. Después del lavado, se detectó IL-6 unida residual con anticuerpo monoclonal anti-IL-6 humana biotinilado, seguido de detección de estreptavidina marcada con HRP. En presencia de H2O2, HRP cataliza una reacción química con tetrametilbencidina (es TMB) que da como resultado la formación de un color. La reacción se detuvo añadiendo HCl 1N. La densidad óptica del color se midió a 450 nm. La potencia relativa de las muestras de prueba en comparación con la muestra de referencia se analizó mediante el uso del software PLA 2.0.

[0811] 2.1.10 Enfoque isoeléctrico capilar (cIEF)

[0813] El enfoque isoeléctrico capilar (clEF) es una técnica de análisis/separación que diferencia las proteínas con respecto a la carga, es decir, separa las proteínas según sus puntos isoeléctricos (pl). El principio de separación es similar al IEF basado en gel/plano pero se diferencia principalmente en su formato, es decir, la separación se realiza en un tubo abierto de formato estrecho (capilar) eliminando la necesidad de cualquier soporte de matriz anticonvectiva. Además, clEF es un instrumento totalmente automatizado con detección y adquisición de datos en línea. Una desventaja del clEF tradicional en un instrumento CE convencional es que las zonas enfocadas (estacionarias) deben movilizarse más allá del área de detección de punto único para registrar la señal. Durante la movilización, las zonas pueden ensancharse con pérdida de resolución de los contaminantes y disminución de la detectabilidad. Además, aumentará el tiempo de análisis y el riesgo de agregación/precipitación de proteínas. Al obtener imágenes cIEF, el procedimiento de enfoque se sigue en tiempo real en toda la columna/capilar mediante una cámara CCD, excluyendo la etapa de movilización. Una vez completado el procedimiento de enfoque, la ejecución del análisis finaliza.

[0815] Ejemplo 2.2: Determinación de Tm

[0817] La temperatura de fusión (Tm) en diferentes tampones se determinó utilizando el ensayo de desplazamiento térmico basado en fluorescencia (TSA, para IL6R304 e IL6R305) y mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC, para IL6R304).

[0819] 2.2.1 Ensayo de desplazamiento térmico

[0821] El ensayo de desplazamiento térmico o TSA se puede realizar en una placa de 96 pocilios en un dispositivo Q-PCR para evaluar el efecto del par de tampones, la fuerza iónica, el pH y los excipientes en la estabilidad térmica de las proteínas. El ensayo da como resultado un valor de Tm que es indicativo de la estabilidad térmica en los tampones probados. Brevemente, el ensayo sigue los cambios de señal de un colorante de fluorescencia, tal como Sypro Orange, mientras la proteína sufre un desplegamiento térmico. Cuando se añade Sypro Orange a una solución de proteína correctamente plegada, se expone a un entorno acuoso y su señal de fluorescencia se apaga. Cuando la temperatura aumenta, la proteína sufre un desplegamiento térmico y expone su región central hidrófoba. Sypro Orange se une entonces a las regiones hidrófobas y las desactiva, lo que provoca un aumento de la señal de fluorescencia.

[0823] En un primer experimento, se evaluó la Tm para IL6R304 e IL6R305 en diferentes tampones, excipientes y combinaciones de los mismos utilizando el ensayo de TSA. Los valores de Tm obtenidos se muestran gráficamente en la Figura 14 y la Figura 15.

[0825] En todas las condiciones probadas, los valores de Tm fueron ligeramente superiores para IL6R304 que para IL6R305. Los tampones y excipientes probados tuvieron un efecto similar en los valores de Tm de IL6R304 e IL6R305:

[0826] Efecto del pH del tampón: los puntos de fusión más altos se obtuvieron en el tampón de Hepes (pH 7 y pH 8) y L-histidina pH 6,5, seguido del tampón de fosfato (pH 6,7 y 7,7), Tris pH 7,2 y el tampón de succinato pH 6,2. Los puntos de fusión más bajos se obtuvieron en PBS (58,82 °C para IL6R304) y en los tampones con el pH más bajo, es decir, succinato pH 5,2 y L-histidina pH 5,5. El punto de fusión más alto en L-histidina, pH 6,5, se correlaciona bien con la mayor solubilidad de IL6R304 en este tampón (véase el Ejemplo 2.3).

[0828] Efecto de la concentración de [NaCI]: las temperaturas de fusión más altas se midieron cuando no se añadió cloruro de sodio a los tampones. Los valores de Tm disminuyeron gradualmente a medida que aumentaba la concentración de NaCI; el efecto se estabiliza a 300 mM de NaCl.

[0830] Efecto de los excipientes manitol, sacarosa y glicina: todos los excipientes probados parecieron tener un efecto estabilizador sobre IL6R304 e IL6R305, ya que las temperaturas de fusión aumentaron con el aumento de la concentración del excipiente. Los valores de Tm más altos se obtuvieron en tampones que contenían 7,5 % de manitol o 5 % de sacarosa.

[0832] En resumen, IL6R304 e IL6R305 parecían ser más estables en tampones que tenían un pH neutro y que contenían una baja concentración de NaCl y cantidades significativas de manitol o sacarosa. Esto se representa esquemáticamente en la Tabla 13. La L-histidina a un pH de 6,5 resultó ser un buen tampón para llevar adelante futuras pruebas de estabilidad y trabajos de formulación. Otro argumento importante para proceder con un tampón de L-histidina es que se ha demostrado que la solubilidad de IL6R304 aumenta drásticamente en este tampón en comparación con PBS (véase el Ejemplo 2.3). Se deben evitar Ios tampones que contengan altas concentraciones de NaCI, aunque es preferible utilizar tampones de Hepes a pH neutro.

[0834] 2.2.2 Calorimetría diferencial de barrido

[0836] Para identificar otros tampones adecuados para ser utilizados en protocolos de purificación, es decir, en los que la proteína muestra una estabilidad aceptable, se utilizó calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar la temperatura de fusión de IL6R304 en diferentes tampones candidatos.

[0838] La Figura 16 muestra los resultados de un experimento de DSC realizado en IL6R304 formulado en diferentes tampones. Las temperaturas de fusión más altas se observaron en MES (pH 6,0) y Hepes (pH 7,0), mientras que el acetato, el Tris-HCl y el fosfato indican una estabilidad térmica ligeramente inferior. El valor de Tm obtenido en citrato (pH 3,5) fue en promedio 10 °C menor que en los otros tampones. Todos los picos de fusión de capacidad térmica (Cp) fueron nítidos y bastante simétricos en todos los tampones. El restablecimiento de una línea de base después de la transición indicó que no se habían producido precipitaciones.

[0840] En la Tabla 14 se muestra una descripción general de todos los valores de Tm obtenidos en los experimentos de DSC. De estos resultados podemos concluir que añadir más NaCI conduce a una disminución gradual de la temperatura de fusión, como también se observó en el T<s>A.

[0842] 2.2.3 Experimento de TSA utilizando diseño experimental

[0844] Se realizó un segundo experimento de TSA en IL6R304 utilizando un diseño experimental (DOE). El DOE consistió en diferentes etapas. El resultado de cada etapa se utilizó para definir el DOE para la siguiente etapa. Brevemente, las configuraciones experimentales y los resultados obtenidos fueron los siguientes:

[0845] • Etapa 1: Se probaron L-histidina, succinato, fosfato y Tris a diferentes pH (6-7) y concentraciones de tampón (10-40 mM). Se encontró que las formulaciones más prometedoras eran las de tampones de L-histidina y fosfato de baja fuerza iónica con un pH de 7 y 6, respectivamente.

[0846] • Etapa 2: se probó el efecto de añadir NaCI y diferentes excipientes a 15 mM de L-histidina pH 6,5 y 7 y 15 mM de fosfato pH 6 y 6,5. Se incluyó un representante de tres familias de excipientes: manitol (poliol), sacarosa (azúcar no reductor) y arginina (aminoácido). Se concluyó que la arginina y/o el NaCI disminuyen la Tm de IL6R304. Se alcanzó una temperatura de fusión máxima en sacarosa o una mezcla de sacarosa/manitol (10 % en total). Además, se obtuvo una Tm más alta en L-histidina que en fosfato. Para ambos tampones, los mejores resultados se obtuvieron a pH 6,5.

[0847] • Etapa 3: se probaron otros representantes, es decir, sorbitol, xilitol, ribitol, trehalosa y glicina, de las tres familias de excipientes en 15 mM de L-histidina y 15 mM de fosfato, ambos a pH 6,5. Nuevamente, la Tm de IL6R304 fue mayor en el tampón de L-histidina que en el fosfato para todos los excipientes y combinaciones de excipientes. La mejor formulación del tampón contenía 10 % de sorbitol o trehalosa. (Tabla 15)

[0848] En una cuarta etapa, el resultado del análisis estadístico del DOE se confirmó mediante una repetición del TSA y mediante calorimetría diferencial de barrido.

[0850] Ejemplo 2.3: Solubilidad de los nanocuerpos en diferentes tampones

[0852] 2.3.1 Solubilidad en PBS y efecto de Tween 80

[0854] Durante el procesamiento posterior y el almacenamiento de los nanocuerpos IL6R304, IL6R305 e IL6R306 en tampón D-PBS, se produjo precipitación. Los precipitados ya se formaron durante el almacenamiento durante la noche a 5 °C o -20 °C, incluso en muestras que se filtraron (0,22 gm) antes del almacenamiento. Esto no sólo provocó una pérdida significativa de producto, sino que también hizo que fuera inconveniente realizar experimentos posteriores, ya que era necesario incorporar constantemente etapas de filtración. A partir de estas observaciones, quedó claro que el PBS no es un tampón de formulación adecuado para ninguno de los nanocuerpos IL-6R, y que era necesario identificar tampones de almacenamiento alternativos. En un experimento inicial, se evaluó si el Tween 80 podía evitar que se produjera esta precipitación (agregación).

[0856] Brevemente, IL6R304 (P#051108nr1) se diluyó a 2 mg/ml en tampón de PBS, tampón de PBS 0,1 % (v:v) Tween 80, o tampón de PBS 0,2 % (v:v) Tween 80. Las tres muestras se almacenaron durante 4 días a 5 °C, y posteriormente se analizaron para encontrar partículas visibles (prueba de aspecto por inspección visual; Tabla 16), recuentos de partículas subvisibles (PAMAS; Figura 17), mediante espectroscopia UV (relación A320/A280, es decir, medida de la presencia de partículas; Tabla 16) y SE-HPLC (Figura 18). Se encontraron partículas significativamente en más cantidad y de mayor tamaño en la muestra de IL6R304 formulada en PBS en comparación con la muestra de IL6R304 formulada en PBS Tween 80.

[0858] 2.3.2 Experimentos de concentración para determinar la solubilidad de IL6R304 e IL6R305

[0859] IL6R304 e IL6R305, ambos formulados en PBS, se concentraron etapa a etapa con un concentrador Vivascience (Vivaspin 5005000 MWCO, concentrador de 500 pl). Durante el experimento de concentración, el retenido se mezcló suavemente con regularidad y se analizó visualmente para detectar partículas/precipitación. La presencia de agregados insolubles en el retenido se verificó comprobando la concentración de proteína antes y después de la centrifugación a máxima velocidad. Con base en los resultados del ensayo de desplazamiento térmico (véase el Ejemplo 2.2.1}, también se analizó la solubilidad de IL6R304 en 20 mM de histidina, pH 6,5.

[0861] En conclusión, la solubilidad de IL6R304 e IL6R305 en PBS fue limitada, con valores estimados de 20 mg/ml y 15 mg/ml, respectivamente (concentración a la que se produjo la precipitación de proteínas}. No se observó precipitación de IL6R304 en una concentración entre 20 y 90 mg/ml en el tampón de L-histidina, lo que sugiere que la solubilidad se puede aumentar significativamente cambiando el tampón de formulación. Obsérvese que no se ha observado ninguna pérdida significativa de proteínas.

[0863] 2.3.3 Determinación de la solubilidad teórica

[0865] La solubilidad teórica de IL6R304 e IL6R305 se determinó utilizando el método de exclusión de PEG en tampón de PBS (IL6R304, IL6R305} o en 20 mM de L-histidina, pH 6,5 (IL6R304). Brevemente, una solución concentrada de nanocuerpo (30-80 mg/ml) en el tampón respectivo se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente en presencia de concentraciones crecientes de PEG6000. Después de la centrifugación a 20000xgdurante 3 minutos, se representaron gráficamente los valores logarítmicos de la [concentración de proteína soluble] frente a la concentración de PEG6000 (Figura 19). Mediante análisis de regresión y extrapolación a una concentración cero de PEG6000, se pudo obtener la concentración máxima teórica de proteína (y, por tanto, los valores de solubilidad) para los nanocuerpos en los tampones probados. Los valores de solubilidad obtenidos se correlacionaron bien con los valores obtenidos experimentalmente utilizando los experimentos de concentración por etapas con los concentradores centrífugos Vivaspin. Al comparar la solubilidad de IL6R304 en PBS y L-histidina pH 6,5, se pudo concluir que la solubilidad de IL6R304 aumentó significativamente en el tampón de L-histidina.

[0867] Ejemplo 2.4: Estudio de estabilidad de almacenamiento de los nanocuerpos a 37 °C

[0869] Se realizó un estudio de estabilidad de almacenamiento inicial para obtener una comprensión general de la estabilidad de los nanocuerpos de IL-6R y para determinar si añadir manitol en el tampón de formulación tiene un efecto beneficioso en la minimización de la formación de dímeros potenciales, como se observó para RANKL008a (véase el Ejemplo 1.3).

[0871] Los tres nanocuerpos de IL-6R se formularon en diferentes tampones (Tabla 17) a una concentración de 10 mg/ml (IL6R304), 7,1 mg/ml (IL6R305) y 10,3 mg/ml (IL6R306). Se evaluó la estabilidad de las diferentes muestras en condiciones de estrés acelerado a 37 °C. Las muestras se analizaron después de una semana mediante SE-HPLC y RP-HPLC. También se analizaron muestras seleccionadas de IL6R304 e IL6R305 después de 3 semanas de almacenamiento.

[0873] 2.4.1 Análisis de SE-HPLC

[0875] Para los tres nanocuerpos de IL-6R, el almacenamiento prolongado a 37 °C dio como resultado la formación de prepicos y algunos postpicos menores. Los postpicos probablemente correspondían a productos de degradación (debido a la actividad proteolítica restante en la muestra). El área superficial de estos postpicos permaneció muy baja, lo que sugiere sólo una degradación mínima después de 3 semanas a 37 °C.

[0877] Los tres nanocuerpos de IL-6R tenían una fuerte tendencia a formar dímeros/oligómeros (agregados), que eran visibles como prepico(s) en los cromatogramas del análisis de SE-HPLC. En la Figura 20 se muestra un cromatograma de ejemplo. El área del pico del prepico aumentó significativamente con el tiempo (representada como % de agregados en la Figura 21 y la Figura 22) y estuvo acompañada por una disminución concomitante en el área superficial del pico principal. La propensión a formar dímeros/oligómeros parecía ser algo mayor para IL6R305 que para IL6R304. Además, se formaron más dímeros/oligómeros en PBS en comparación con los otros tampones que se probaron; es importante destacar que las menores cantidades de oligómeros se observaron en las formulaciones que contenían manitol.

[0879] 2.4.2 Análisis de RP-HPLC

[0881] El perfil de RP-HPLC de IL6R304 en el punto de tiempo 0 semanas incluyó un pico principal con un hombro que eluía antes del material principal, y un postpico que no estaba bien resuelto a partir del pico principal. Lo más probable es que este postpico corresponda a la variante de IL6R304 que contiene piroglutamato. El área superficial de este pico aumentó con el tiempo de almacenamiento, y fue mayor en tampón de PBS y fosfato en comparación con los tampones de acetato e histidina. Después de 3 semanas de almacenamiento, las áreas superficiales de dos prepicos no identificados hasta ahora aumentaron (Figura 23).

[0882] El perfil de RP-HPLC de IL6R305 en el punto de tiempo 0 semanas incluyó un pico principal con algunos prepicos menores. El poder de resolución del método de RP-HPLC utilizado fue insuficiente para separar la variante que contenía piroglutamato del material principal.

[0884] Ejemplo 2.5: Medición de la osmolalidad

[0886] Según la Farmacopea Europea, una solución se considera isotónica si tiene una osmolalidad de 290 ± 30 mOsm/kg; por lo tanto, se realizaron mediciones de osmolalidad en 20 mM de L-histidina pH 6,5 que contenía diferentes concentraciones de excipientes para definir el intervalo de concentración de excipientes que sería aceptable para una formulación líquida isotónica de IL6R304.

[0888] IL6R304 (10 mg/ml) se formuló en los diferentes tampones de la Tabla 18. Los resultados de la medición de la osmolalidad de estas formulaciones se muestran en la Figura 24.

[0890] Ejemplo 2.6: Estudio de estabilidad de almacenamiento de IL6R304 a 5 °C y 37 °C

[0892] En la Tabla 18 y la Tabla 19 se presenta una descripción general de los diferentes tampones de formulación y métodos utilizados en las pruebas de estabilidad del lote P#051108nr1 de IL6R304, respectivamente. Debido a que se descubrió que IL6R304 era propenso a la agregación y precipitación, se añadió Tween 80 a la mayoría de las formulaciones.

[0894] 2.6.1 Aspecto y OD280

[0896] No se observó turbidez en las muestras almacenadas durante 5 semanas a 5 °C, lo que indica que 20 mM de L-histidina a pH 6,5 es un tampón de almacenamiento mucho mejor para IL6R304 que PBS.

[0898] Después de almacenarlas durante 1 semana a 37 °C, se observó una ligera turbidez en las 12 muestras. En las muestras de IL6R304 en los tampones 1,2, 3, 7, 8 y 9 se observó más opalescencia en comparación con IL6R304 en los tampones 4, 5, 6, 10, 11 y 12, que contenían manitol. Después de almacenarlas durante 2 semanas a 37 °C, se observó una turbidez ligeramente mayor en comparación con las muestras de 1 semana. Sin embargo, la tendencia observada para las muestras de 1 semana continuó: las muestras de IL6R304 en los tampones 1, 2, 3, 7, 8 y 9 mostraron más opalescencia en comparación con los tampones que contenían manitol. Después de 5 semanas de almacenamiento a 37 °C, la turbidez todavía estaba presente y ligeramente menos en las muestras que contenían manitol. Sin embargo, parecía que la turbidez no había aumentado en comparación con las muestras de 2 semanas.

[0899] A pesar de la opacidad observada en las muestras estresadas, la concentración de proteína en las muestras no disminuyó significativamente (datos no mostrados) aunque hubo una ligera tendencia hacia una menor concentración debido a una mayor turbidez. Además, la relación 0D320/0D280, que es una medida de turbidez o presencia de partículas, fue <0,05 en todas las condiciones del tampón. De hecho, la proporción fue 2-10 veces menor que la observada en la muestra no estresada en PBS, lo que demuestra nuevamente que el tampón de L-histidina pH 6,5 tiene un efecto estabilizador sobre IL6R304.

[0901] 2.6.2 Análisis de SE-HPLC

[0903] Se analizaron muestras del material de referencia (0 semanas) y muestras almacenadas hasta 6 meses a 5 °C y 37 °C mediante SE-HPLC.

[0905] No se observaron diferencias entre los perfiles de SE-HPLC de las muestras de referencia (a las 0 semanas) y las muestras almacenadas hasta 5 semanas a 5 °C. Además, no se observaron diferencias significativas entre los distintos tampones. Las pequeñas cantidades de agregados ya presentes en el material de inicio no aumentaron con el tiempo de almacenamiento prolongado (Figura 25(B)), lo que indica que el tampón de histidina tuvo un efecto estabilizador sobre ILR304, incluso en ausencia de excipientes tales como Tween 80, manitol o sacarosa. Téngase en cuenta que IL6R304 formó agregados cuando se almacenó durante un corto período (horas-días) a 5 °C en tampón de D-PBS.

[0906] El análisis de SE-HPLC de las muestras almacenadas durante 6 meses a 5 °C tampoco mostró un aumento en el porcentaje del área de los prepicos, lo que significa que no se formaron oligómeros en estas condiciones de almacenamiento, ni siquiera en la formulación que contenía sólo 20 mM de L-histidina, pH 6,5, es decir, sin Tween-80 ni ningún excipiente (datos no mostrados).

[0908] El almacenamiento prolongado a 37 °C dio lugar a la formación de prepicos y algunos postpicos menores. Los postpicos probablemente correspondían a productos de degradación (debido a la actividad proteolítica restante en la muestra). El área relativa (%) de estos picos aumentó sólo ligeramente, lo que implica que la degradación se limitó al mínimo. Los otros picos visibles en los cromatogramas eran picos de fondo que surgían de los componentes del tampón.

[0910] El área del pico de los prepicos aumentó significativamente con el tiempo (Figura 25 (A) y Figura 26 (B)). Dada la posición relativa de los prepicos con respecto al pico principal, lo más probable es que los prepicos representaran formas diméricasoligoméricas (agregados) de IL6R304. El área superficial del pico del prepico aumentó con el tiempo de almacenamiento, y estuvo acompañada por una disminución concomitante en el área superficial del pico principal.

[0911] Una observación importante fue que la propensión a formar dímeros/oligómeros dependía del tampón: la propensión a oligomerizar era significativamente menor en las formulaciones que contenían manitol y sacarosa. La glicina no pareció tener un efecto tan positivo en la prevención del proceso de oligomerización. El Tween 80 no tuvo ningún efecto inhibidor sobre la formación de oligómeros.

[0912] Es importante destacar que el porcentaje de oligómeros observado en los 12 tampones de L-histidina después del almacenamiento durante 3 semanas a 37 °C fue significativamente menor que la muestra equivalente en tampón de D-PBS, es decir, 2,2-4,6 % en L-histidina, pH 6,5 en comparación con 11,7 % de PBS (Figura 26 (A)). Este efecto dependiente del tampón sobre la estabilidad física de IL6R304 se correlacionó muy bien con las diferencias dependientes del tampón observadas en las pruebas de estabilidad térmica de IL6R304 (Ejemplo 2.2): se encontró que la temperatura de fusión de IL6R304 era sólo 58,8 °C en PBS, pero es 62,8 °C en 20 mM de L-histidina, pH 6,5. Se demostró que aumentar la estabilidad intrínseca de IL6R304 cambiando el tampón de formulación de PBS a L-histidina tuvo un claro efecto beneficioso sobre su estabilidad durante el almacenamiento.

[0913] En las muestras almacenadas durante 6 meses a 37 °C, el menor % de oligómeros se encontró en la formulación que contenía 10 % de sacarosa, corroborando nuevamente el efecto estabilizador de la sacarosa sobre IL6R304 (Tabla 20).

[0914] 2.6.3 Análisis de RP-HPLC

[0915] Se analizaron muestras del material de referencia (0 semanas) y muestras almacenadas hasta 5 semanas a 5 °C y 37 °C mediante RP-HPLC.

[0916] Los perfiles de RP-HPLC en el punto temporal 0 semanas incluyeron un pico principal, dos prepicos y un postpico mal resuelto. Es muy probable que este postpico corresponda a la variante de IL6R304 que contiene piroglutamato. Se determinó que los perfiles de RP-HPLC del lote de referencia y las muestras de estabilidad almacenadas durante hasta 5 semanas a 5 °C eran comparables.

[0917] En las muestras de estabilidad almacenadas a 37 °C, el área superficial del pico de piroglutamato aumentó con el tiempo de almacenamiento, mientras que el área superficial del pico principal disminuyó. El área total se mantuvo sin cambios.

[0918] Después de 5 semanas de almacenamiento a 37 °C, el área superficial de los dos prepicos había aumentado en todas las condiciones del tampón. La identidad de estas variantes es desconocida por el momento, pero podrían corresponder a fragmentos de degradación.

[0919] No hubo diferencias significativas dependientes del tampón en los perfiles de RP-HPLC de las diferentes muestras, lo que sugiere que las modificaciones químicas, tales como la formación y oxidación de piroglutamato que normalmente se detectan mediante RP-HPLC, fueron limitadas y actualmente no se vieron afectadas por el tampón.

[0920] Ejemplo 2.7: Estudio de estabilidad de almacenamiento de IL6R304 a -70 °C, -20 °C, 5 °C, 25 °C y 37 °CIL6R304 se formuló a 10 mg/ml en los 10 tampones diferentes que se muestran en la Tabla 21, y se almacenó a -70 °C, -20 °C, 5 °C y 37 °C durante 8 semanas y a 25 °C durante 1 semana. La estabilidad de las muestras se analizó mediante SE-HPLC, RP-HPLC, OD280 e inspección visual. También se analizaron muestras seleccionadas utilizando Biacore (unión a HSA) y ensayos de potencia (HSA e IL-6R).

[0921] 2.7.1. Almacenamiento durante 8 semanas a -70 °C, -20 °C, 5 °C y 1 semana a 25 °C

[0922] Se demostró que IL6R304 es estable después del almacenamiento durante 8 semanas a -70 °C, -20 °C, 5 °C y durante 1 semana a 25 °C en los 10 tampones probados. No se observaron diferencias significativas en la potencia, turbidez, perfiles de SE-HPLC y RP-HPLC entre el material de referencia y las 10 muestras de almacenamiento diferentes.

[0923] 2.7.2. Conservación durante 8 semanas a 37 °C

[0924] Aspecto y OD280

[0925] En comparación con las muestras almacenadas a -70 °C, -20 °C y 5 °C, se observó turbidez en las muestras almacenadas a 37 °C. Los valores de absorbancia a 350 nm aumentaron en consecuencia hasta >0,01 UA en la mayoría de los tampones, aunque la relación A350/A280 se mantuvo <0,05 en todas las condiciones del tampón. A pesar de la opacidad observada en las muestras estresadas, la concentración de proteína en las muestras no había disminuido significativamente.

[0927] SE-HPLC

[0929] El almacenamiento prolongado a 37 °C dio como resultado la formación dependiente del tiempo de un postpico y un prepico. El postpico tiene un tiempo de retención entre 22 y 23 minutos, y probablemente corresponde a fragmentos de degradación de IL6R304. Sin embargo, el área superficial de este pico se mantuvo baja (aproximadamente un 2 %), lo que sugiere una degradación mínima tras 8 semanas a 37 °C. Los demás postpicos visibles en los cromatogramas eran picos de fondo originados por los componentes del tampón.

[0931] El perfil de SE-HPLC de IL6R304 en el punto temporal 0 semanas incluyó un pico principal y dos prepicos menores, que no se resolvieron completamente en la línea base. El área superficial de los prepicos aumentó con el tiempo, y estuvo acompañada por una disminución concomitante en el área superficial del pico principal. Dada la posición relativa y la heterogeneidad de los prepicos, lo más probable es que representaran formas diméricas y/o oligoméricas de IL6R304. Debido a esta heterogeneidad y a la disminución de la resolución entre los prepicos a lo largo del tiempo, los picos se integraron, para simplificar, como un solo pico.

[0933] Una observación importante fue que la propensión a formar dímeros/oligómeros dependía del tampón: se formaban aproximadamente el doble de oligómeros en el tampón de L-histidina en comparación con el tampón de fosfato (Figura 27, Figura 28). La menor cantidad de oligómeros se observó en la formulación que contenía trehalosa, seguido de la formulación que contenía sacarosa. En general, después del almacenamiento de IL6R304 a 37 °C durante varias semanas, la cantidad de oligómeros presentes en estos tampones fue significativamente menor que la observada anteriormente en D-PBS o en L-histidina pH 6,5 sin ningún excipiente.

[0935] La presencia de un azúcar no reductor suprimió considerablemente el grado de oligomerización de IL6R304.

[0937] RP-HPLC

[0939] Los cromatogramas de RP-HPLC de las muestras de estabilidad de ILR304 almacenadas durante hasta 8 semanas a 37 °C se muestran en la Figura 29.

[0941] El perfil de RP-HPLC de ILR304 en el punto temporal 0 semanas incluyó un pico principal, con 2 hombros mal resueltos que eluían antes del material principal, un primer postpico correspondiente a la variante de ILR304 que contiene piroglutamato, y un segundo postpico, correspondiente a la variante de ILR304 a la que le falta un puente disulfuro. La identidad de ambas variantes se confirmó mediante LC-MS.

[0943] Después de almacenarse durante 1 semana, el área superficial del segundo postpico había disminuido hasta un % de área relativa de 0, probablemente debido a la oxidación espontánea en la molécula correctamente plegada.

[0945] El área superficial del pico de piroglutamato aumentó con el tiempo de almacenamiento, mientras que el área superficial del pico principal disminuyó. El área superficial total no cambió significativamente con el tiempo ni entre los diferentes tampones. La Figura 30 demuestra claramente que la cinética de formación de piroglutamato fue diferente en L-histidina, pH 6,5 frente a fosfato, pH 6,5. En todos los puntos de tiempo, había menos piroglutamato presente en el tampón de L-histidina. Por otra parte, no hubo correlación entre el tipo de excipiente presente en el tampón y la cantidad de piroglutamato observada.

[0947] Después de 8 semanas de almacenamiento, se formaron dos nuevos postpicos. El primer postpico estaba situado entre el pico principal y el pico de piroglutamato, mientras que el segundo postpico eluía justo después del pico de piroglutamato. Actualmente se desconoce la identidad de estas variantes.

[0949] Enfoque isoeléctrico capilar (clEF)

[0951] Los datos de integración de clEF de IL6R304 almacenado durante 8 semanas a 37 °C en los diferentes tampones se muestran en la Tabla 22. Las muestras formuladas en 15 mM de L-histidina, pH 6,5 contienen menos variantes de carga en comparación con el tampón de fosfato.

[0953] Ensayo de potencia y Biacore

[0955] La potencia de las muestras almacenadas durante 8 semanas a 37 °C en los tampones 1 a 5 se determinó con respecto a un lote de referencia sin estrés utilizando el ELISA de unión a HSA y el ELISA de inhibición para IL-6R como se describe en los Ejemplos 2.1.8 y 2.1.9 (Tabla 23). También se analizó la funcionalidad de unión a HSA de las muestras almacenadas en los tampones 1 a 10 utilizando Biacore (Tabla 24). Se incluyeron como moléculas de referencia muestras formuladas en los mismos tampones y almacenadas a -70 °C.

[0956] Mientras que Ios ensayos de potencia mostraron potencias de unión a HSA e IL-6R comparables entre las muestras de estabilidad y el material de referencia, el análisis de Biacore demostró algunas diferencias en las actividades de unión a HSA.

[0958] En general, las actividades de las muestras formuladas en tampón de fosfato (tampones 6-10) fueron menores que en L-histidina (tampones 1-5). Se observó una pérdida de funcionalidad de aproximadamente el 16 % en los tampones que contenían una combinación de sacarosa y glicina (tampones 4 y 9). La combinación de sacarosa y manitol (tampón 5 y 10) no mostró pérdida de funcionalidad de IL6R304 en el tampón de L-histidina, mientras que se observó una disminución del 10 % en el tampón de fosfato. Las formulaciones que contienen manitol, sacarosa o trehalosa mostraron una actividad de entre el 90 y el 100 % después del almacenamiento durante 8 semanas a 37 °C.

[0960] Conclusión general sobre el estudio de estabilidad de almacenamiento a 37 °C

[0962] El almacenamiento durante hasta 8 semanas de IL6R304 en diferentes tampones de formulación en condiciones de estrés térmico (37 °C) dio como resultado las siguientes observaciones:

[0963] • La propensión de IL6R304 a formar oligómeros dependía del tampón y del excipiente: se formaban aproximadamente el doble de oligómeros en el tampón de L-histidina en comparación con el tampón de fosfato, mientras que la presencia de un azúcar no reductor suprimía aún más el grado de oligomerización de IL6R304;

[0964] • La estabilidad química de IL6R304 fue mejor en el tampón de L-histidina en comparación con el tampón de fosfato;

[0965] • La actividad de unión a HSA se mantuvo durante más tiempo en el tampón de L-histidina en comparación con el tampón de fosfato.

[0967] Ejemplo 2.8: Estabilidad bajo estrés de agitación

[0969] IL6R304 se formuló a 1 mg/ml en los 10 tampones diferentes que se muestran en la Tabla 21. Se agitaron alícuotas de 5 ml a máxima velocidad durante un máximo de 24 horas a 2-8 °C. Las muestras se analizaron después de 2, 4 y 24 horas de agitación.

[0971] Todas las soluciones permanecieron transparentes después de 2 horas de agitación (Tabla 25). Se observó un aumento de la turbidez en seis de diez tampones después de 4 horas. La opalescencia más alta se presentó en el tampón 10. En general, el aumento de la turbidez fue más pronunciado en los tampones de fosfato (tampón 6-10). Estas observaciones se confirmaron después de la determinación del índice de agregación, definido como 100 * OD350 / (OD280 - OD350) (Figura 31). No se observaron agregados solubles durante la SE-HPLC de las diferentes muestras.

[0973] En conclusión, los datos de estrés de agitación sugieren una estabilidad de estrés de agitación algo mejor de IL6R304 en L-histidina, pH 6,5 en comparación con el tampón de fosfato, pH 6,5. N<o>se observaron diferencias significativas entre los distintos excipientes, aunque se observó una turbidez ligeramente mayor en presencia de 10 % de trehalosa y 2,5 % de manitol/5 % de sacarosa.

[0975] Ejemplo 2.9: Estudio de estabilidad a largo plazo a -70 °C, 5 °C y 25 °C

[0977] El lote CMC-D-0048 de IL6R304, formulado en 15 mM de L-histidina, 8 % de sacarosa y 0,01 % de Tween80 (pH 6,5) a 10,52 mg/ml, se almacenó durante 6 meses a -70 °C, 5 °C y 25 °C. Las muestras se analizaron tras 3 y 6 meses de almacenamiento mediante inspección visual (aspecto), A280 (contenido), SEC-HPLC, clEF, RP-HPLC y ensayos de potencia (ensayo de inhibición de IL6R y ensayo de unión a HSA). Los resultados se resumen en la Tabla 42, Tabla 43 y Tabla 44 para el almacenamiento a -70 °C, 5 °C y 25 °C, respectivamente.

[0979] N<o>hubo cambios significativos en el aspecto, el contenido, la potencia, los perfiles de clEF y HPLC entre la muestra de control (punto de tiempo 0 meses) y todas las muestras de prueba almacenadas a -70 °C o 5 °C, Io que indica que IL6R304 es estable durante al menos 6 meses en estas condiciones.

[0980] Respecto a la muestra almacenada a 25 °C, se realizaron las siguientes observaciones al comparar los resultados de las muestras estresadas y la muestra de control:

[0981] • SE-HPLC: hay un aumento pequeño, aunque gradual, en el área superficial del prepico (oligómeros) y del postpico (fragmentos de degradación).

[0982] • clEF: se está formando un postpico que se cree que corresponde a la variante de piroglutamato.

[0983] • RP-HPLC: se están formando tres picos nuevos, es decir, un prepico, probablemente correspondiente a fragmentos de degradación que están presentes en las muestras (véanse también datos de SEC-HPLC) y dos postpicos aún no identificados. El área superficial del prepico 2 y del postpico 2 (piroglutamato) aumenta gradualmente con el tiempo de incubación prolongado.

[0984] • N<o>se observa pérdida de potencia en las muestras almacenadas hasta 6 meses a 25 °C.

[0986] Ejemplo 3: Formulación y estudios de estabilidad con nanocuerpos que se unen a IL23

[0987] Ejemplo 3.1: Materiales y métodos utilizados en el estudio

[0988] 3.1.1 Dominios variables únicos

[0989] 23IL0064 (SEQ ID NO: 5; EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSLPASGNIFNLLTIAWYRQAPGKG r e l v a t in s g s r t y y a d s v k g r f t is r d n s k k t l y l q m n s l r p e d t a v y y c q t s g s g s p n f w g q g t l v t v s s g g g g s GGGSEVQLVESGGGIVQPGNSIRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVsStSGSGSDTLYADSVKGRFTÍSR d n a k t t l y l q m n s l r p e d t a v y y c t ig g s l s r s s q g t l v f v s s g g g g s g g g s e v q l l e s g g g l v q p g g s l r l s c a a s g r t l s s y a m g w f r q a p g k g r e f v s r is q g g t a iy y a d s v k g r f t is r d n s k n t l y l q m n s l r p e d t a v y y c a k d p s PYYRGSAYLLSGSYDSWGQGTLVTVSS) se ha descrito como SEQ ID NO: 2616 en el documento WO 2009/068627.

[0990] 23IL0064 consiste en tres dominios variables humanizados de un anticuerpo de llama de cadena pesada: 119A3v16 y 81A12v4, que se unen a diferentes epítopos de IL23 p19, y el ALB8, que se une a HSA. 23IL0075 (SEQ ID NO: 6; EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSLPASGNIFNLLTIAWYRQAPGKGRELVATINSGSRTYYADSVK GRFTISRDNSKKTLYLQMNSLRPEDTAVYYCQTSGSGSPNFWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQP GNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPED TAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGEGEGSGGGSEVQLLESGGELVAPGGSLRLSCAASGRTLSSYAMGWFFRQA PG KGREFVARISQGGTAIYVADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAKDPSPYVRGSAYLLSGSYDSWG QGTLVTVSS) se ha descrito como SEQ ID NO: 2622 en el documento WO 2009/068627. 23110075 consiste en tres dominios variables humanizados de un anticuerpo de llama de cadena pesada: 119A3v16 y 81A12v5, que se unen a diferentes epítopos de IL23 p19, y el ALB8, que se une a HSA. Las subunidades de ambos nanocuerpos están fusionadas cabeza con cola con un enlazador 9G/S.

[0991] 23IL0064 (3,79 mg/ml en D-PBS) y 23IL0075 (4,21 mg/ml en D-PBS) se expresaron en Pichia pastoris. Después de clarificar el caldo de fermentación mediante una etapa de centrifugación, seguido de una etapa de TFF, los nanocuerpos se capturaron en MabCapture A (Poros), seguido de una elución a pH 2,6 usando glicina 100 mM. Se realizó un cambio de tampón a 1/10 D-PBS, y los nanocuerpos se pulieron aún más en Poros 50HS (Poros). Finalmente, se realizó un tratamiento con 50 mM de OGP para la eliminación de LPS, seguido de una etapa final de exclusión por tamaño utilizando Superdex 75 pg (GE Healthcare).

[0992] Se utilizaron muestras no estresadas en D-PBS u otras formulaciones como material de referencia para analizar la estabilidad del almacenamiento de las muestras.

[0993] 3.1.2 Otros reactivos críticos

[0994] Los reactivos utilizados en el estudio se detallan en la Tabla 26. La composición completa de D-PBS fue 137 mM de NaCI, 2,7 mM de KCI, 10 mM de fosfato de sodio dibásico, 2 mM de fosfato de potasio monobásico.

[0995] 3.1.3 Equipos y métodos para mediciones

[0996] Los experimentos de HPLC se llevaron a cabo en un instrumento Agilent serie 1200 de Agilent Technologies (Palo Alto, EE. UU.). Las columnas utilizadas fueron:

[0997] • RP-HPLC: Zorbax 300SB-C3 de 5 micrómetros, 4,6 X 150 mm (Agilent, n.2 de cat. 883995-909) y Zorbax 300SB-C8 de 5 micrómetros, 4,6 X 150 mm (Agilent, n.2 de cat. 883995-906)

[0998] • SE-HPLC: TSKgel G2000SW<xl>(Tosoh Bioscience, Japan; Part#08540)

[0999] • IEX-HPLC: : ProPac WCX-10, 4x250 mm, 10 pm (Dionex)

[1000] Las determinaciones de concentración de los nanocuerpos se realizaron con NanoDrop ND-1000 (Thermoscientific), con un espectrofotómetro Uvikon 943 (Kontron Instruments) o un biofotómetro Eppendorf 6131 a 280 nm.

[1001] La distribución del tamaño de partículas se midió en un contador de partículas PAMAS SVSS-C (PArtikelMess- und AnalyseSysteme GMBH).

[1002] La medición de la osmolalidad se realizó con un osmómetro modelo 3320 de Advanced Instruments.

[1003] El ensayo de desplazamiento térmico se realizó en un dispositivo LightCycIer480 Q-PCR (Roche).

[1004] Para la determinación de la Tm se utilizó un calorímetro diferencial de barrido capilar VP automatizado (DSC, MicroCal).

[1005] La dispersión de luz elástica se midió en un espectrofluorómetro Jasco (FP-6500).

[1006] 3.1.4 Ensayo de pureza de los nanocuerpos mediante cromatografía de líquidos de alta resolución por exclusión por tamaño (SE-HPLC)

[1007] El ensayo de SE-HPLC consistió en una colum na de gel de sílice TSKgel G 2000SW xl preem paquetada equipada con un filtro precolum na de colum na de guarda, una fase móvil com puesta por KCI, NaCI y tam pón de fosfato pH 7,2 (D-PBS) y detección UV a 280 nm. La cantidad relativa de im pureza de proteína específica se expresó com o porcentaje de área, y se calculó divid iendo el área del pico correspondiente a la im pureza de proteína específica entre el área in tegrada total.

[1008] 3.1.5 Ensayo de pureza de los nanocuerpos mediante cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC)

[1009] En el ensayo de RP-HPLC se utilizó una colum na Zorbax 300SB-C3 o una colum na Zorbax 300SB-C8 (Agilent Technologies, Palo A lto, EE. UU.). La cantidad relativa de una im pureza de proteína específica se determ inó m idiendo la absorbancia de luz de los com ponentes que eluían de la colum na de RP-HPLC. La cantidad relativa de una im pureza de proteína específica, expresada com o % de área, se calculó d iv idiendo el área del pico correspondiente a la im pureza entre el área integrada total.

[1010] 3.1.6 Ensayo de pureza de los nanocuerpos mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento de intercambio iónico (IEX-HPLC)

[1011] El ensayo de IEX-HPLC com binó el uso de una colum na de intercam bio catiónico débil D ionex ProPac W CX-10 preem paquetada, una fase móvil com puesta por un tam pón de citrato pH 5,5, y detección UV a 280 nm. Después de cargar las proteínas en la colum na, los m ateriales unidos se eluyeron m ediante un gradiente de cloruro de sodio. La cantidad relativa de la proteína específica, varian te o im purezas expresada com o porcentaje del área se calculó d iv idiendo el área del pico correspondiente a la proteína específica o a cua lqu ier im pureza de proteína entre el área tota l de todos los picos integrados.

[1012] 3.1.7 Medición de la distribución del tamaño de partículas (PAMAS)

[1013] Las m ediciones en el contador de partículas PAMAS SVSS-C se realizaron de la siguiente manera: 100 pl de muestra se diluyeron 1/10 en 1 ml de agua MilliQ, y se realizaron 10 m ediciones consecutivas en los 16 canales (diámetro establecido: 1 ,2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 50, 100, 150 y 200 pm). Para el cálculo del va lor prom edio se excluyeron las 2 prim eras m ediciones y se tuvo en cuenta el factor de dilución. Los resultados se dan com o datos acum ulativos (recuento tota l de partículas >x pm) o datos diferencia les (recuento tota l de partículas entre d iám etros x e y pm). Sólo se presentan los datos acum ulativos.

[1014] 3.1.8 Enfoque isoeléctrico capilar (clEF)

[1015] El enfoque isoeléctrico cap ila r (clEF) es una técn ica de análisis/separación que dife rencia las proteínas con respecto a la carga, es decir, separa las proteínas según sus puntos isoeléctricos (pl). El princip io de separación es s im ilar al IEF basado en ge l/plano pero se dife rencia principalm ente en su form ato, es decir, la separación se realiza en un tubo abierto de form ato estrecho (capilar) e lim inando la necesidad de cua lqu ier soporte de m atriz anticonvectiva. Además, c lEF es un instrum ento to ta lm ente autom atizado con detección y adquisición de datos en línea. Una desventa ja del c lEF tradic ional en un instrum ento CE convencional es que las zonas enfocadas (estacionarias) deben m ovilizarse más allá del área de detección de punto único para reg istrar la señal. Durante la movilización, las zonas pueden ensancharse con pérdida de resolución de los contam inantes y dism inución de la detectabilidad. Adem ás, aum entará el tiem po de análisis y el riesgo de agregación/precip itación de proteínas. Al ob tener im ágenes clEF, el procedim iento de enfoque se sigue en tiem po real en toda la colum na/capila r m ediante una cám ara CCD, excluyendo la etapa de m ovilización. Una vez com pletado el procedim iento de enfoque, la ejecución del análisis finaliza.

[1016] Ejemplo 3.2: Temperatura de fusión de los nanocuerpos

[1017] La m edición de la tem peratura de fusión de una proteína en diferentes tam pones es una form a más rápida de detectar tam pones en los que la proteína tiene la m ayor estabilidad física. Se acepta generalm ente que esto perm itirá predecir la estabilidad a largo plazo a tem peraturas más bajas. La tem peratura de fusión se puede determ inar utilizando muchas técn icas diferentes.

[1018] 3.2.1 Temperatura de fusión de 23IL0064 en diferentes tampones de formulación medida mediante ensayo de desplazamiento térmico

[1019] Utilizam os el ensayo de desplazam iento térm ico (TSA), que m ide el cam bio en la intensidad de fluorescencia cuando el naranja Sypro se une a las partes hidrófobas de la proteína que está experim entando un desplegam iento térm ico. El ensayo de desplazam iento térm ico se realizó en el dispositivo LightCycIer480 Q-PCR (Roche) utilizando placas de 96 pocillos.

[1020] En un prim er estudio, se evaluó el efecto del par tam pón, la fuerza iónica y el pH sobre la estabilidad term odinám ica de 23IL0064 en un experim ento de análisis de desplazam iento térm ico. Los tam pones probados utilizados se presentan en la Tabla 28. Cada tam pón se probó en un intervalo de pH que abarca 1 unidad de pH a lrededor de su pKa. En la Figura 32 se presenta una visión general de los resultados. Las tem peraturas de fusión dism inuyeron a medida que aumentaba la concentración de sal. Además, I<os>valores de pH 5,2 y 5,5 parecieron menos favorables en comparación con los valores de pH 6,2 y superiores. Los mejores tampones fueron Hepes (pH 7 y 8) e Histidina pH 6,5. En todos los tampones, la adición de manitol aumentó ligeramente las temperaturas de fusión.

[1021] 3.2.2 Temperatura de fusión de 23IL0064 y 23IL0075 en diferentes tampones de formulación medida mediante ensayo de desplazamiento térmico y calorimetría diferencial de barrido (DSC)

[1022] Se analizaron 23IL0064 y 23IL0075 en paralelo en diferentes tampones de formulación y purificación mediante el ensayo de desplazamiento térmico (TSA) (Tablas 34) y DSC (Tabla 33). Para ambas moléculas y en todos los tampones probados (acetato, MES, Hepes, TRIS e Histidina), las temperaturas de fusión disminuyeron con el aumento de la concentración de NaCl, y las temperaturas de fusión fueron más altas en presencia de manitol.

[1023] 3.2.3 Temperatura de fusión de 23IL0075 en una amplia gama de tampones de formulación medida mediante ensayo de desplazamiento térmico

[1024] La temperatura de fusión de 23IL0075 en otro intervalo de tampones y un intervalo de pH más bajo fue examinada por TSA. Para ello, se planteó un diseño de experimentos para investigar la Tm de 23IL0075 variando los siguientes parámetros: intervalo de pH entre 5 y 6, concentración del tampón entre 10 y 50 mM, y 4 tampones diferentes: histidina, acetato, fosfato y succinato. Se realizó un diseño factorial completo diseño compuesto central, en total se probaron 22 tampones diferentes en 84 experimentos. Los experimentos se dividieron en dos placas de 96 pocilios, en la segunda placa se amplió el intervalo de pH a 4,8 y 6,2, y la concentración del tampón a 7 y 65 mM. El tampón de fosfato sólo se probó a pH 6 y 6,2. A partir de los resultados experimentales, para cada tampón se construyó un modelo que se utilizó para predecir las Tm en función de la concentración del tampón y el pH. Los resultados se muestran en la Tabla 35.

[1025] El succinato claramente tuvo los valores de Tm previstos más bajos en general. Para el acetato y la histidina en concentraciones bajas y pH alto, se obtuvieron los valores de Tm previstos más altos. De hecho, el modelo mostró para todos los tampones valores de Tm más altos previstos para concentraciones de tampón más bajas. Según la optimización numérica de Design-Expert del modelo, el mejor tampón fue el tampón de histidina pH 6,2 (deseabilidad 1), seguido de cerca por el acetato pH 6 (deseabilidad 0,96) y el fosfato pH 6 (deseabilidad 0,90).

[1026] 3.2.4 Confirmación de Tm mediante calorimetría diferencial de barrido

[1027] Confirmamos la determinación de Tm mediante calorimetría diferencial de barrido en los tampones seleccionados en el Ejemplo 3.2.3. Los resultados se muestran en el gráfico de la Figura 33. Las tendencias fueron idénticas a las observadas en el TSA, aunque los valores absolutos de la Tm fueron más altos: alrededor de 62 °C en DSC en comparación con alrededor de 59 °C en el TSA.

[1028] 3.2.5 Temperatura de fusión de 23IL0075 en una variedad de tampones de formulación para explorar una amplia gama de excipientes medida mediante ensayo de desplazamiento térmico

[1029] Se preparó un segundo diseño de experimentos (DOE) para estudiar la influencia de algunas combinaciones de excipientes en la estabilidad termodinámica de 231L0075. Se estudió la combinación de un azúcar o un poliol (manitol, sacarosa o sorbitol), con un aminoácido (glicina o mezcla de arginina/ácido glutámico), y un detergente no iónico (Tween 80, Tween 20 o P-F68). Estas combinaciones se probaron en tres tampones (10 mM de acetato pH 5,5, 10 mM de histidina pH 6,0 y 10 mM de fosfato pH 6,0) (véase la Tabla 35). Con base en las temperaturas de fusión medidas, se calcularon las composiciones de tampón óptimas (véase la Tabla 36). Se predijeron las temperaturas de fusión más altas para el tampón de histidina y las temperaturas de fusión más bajas para el tampón de fosfato. Para los tres tampones, la sacarosa resultó ser el mejor excipiente, y la mezcla de arginina y ácido glutámico el peor. El manitol y el sorbitol, solos o en combinación con glicina, también fueron buenos excipientes, aunque siempre dieron una Tm ligeramente inferior a la de la sacarosa. La glicina por sí sola no fue tan eficaz.

[1030] Ejemplo 3.3: Solubilidad de los nanocuerpos

[1031] 3.3.1 Experimentos de concentración para determinar la solubilidad de 23IL0064

[1032] El nanocuerpo de IL2323IL0064, respectivamente en tampón de D-PBS, en fosfato sódico 10 mM pH 7 con NaCl 50 mM, y en L-histidina 40 mM pH 6 con NaCl 50 mM, se concentró por etapas con un concentrador Vivaspin (concentradores Vivascience 5000 MWCO de 0,5 mi y 5 mi). Durante el experimento de concentración, el retenido se mezcló suavemente y con regularidad, y la concentración se determinó mediante mediciones de OD280. La presencia de agregados insolubles en el retenido se verificó comprobando la concentración de proteína antes y después de la centrifugación a máxima velocidad en una centrífuga Eppendorf de sobremesa. En los tres tampones se pudo alcanzar una concentración de 50 mg/ml sin precipitación visual. La solución de proteína se transfirió entonces del concentrador Vivaspin® de 5 mi al de 0,5 mi, y se concentró a una fuerza centrífuga mucho mayor (15000xg en lugar de 1500xg). Esto provocó una concentración adicional rápida, y las concentraciones locales cerca de la membrana fueron incluso mucho más altas que la concentración promedio medida después de la recuperación del retenido. En la Tabla 27 se resumen las concentraciones finales alcanzadas, obtenidas después de pipetear hacia arriba y hacia abajo el retenido y centrifugar para eliminar el precipitado.

[1034] Todas las muestras también se analizaron mediante SE-HPLC. La concentración en tampón de D-PBS produjo un aumento en el porcentaje del prepico. En el tampón de fosfato de 10 mM y en el tampón de histidina de 40 mM, ambos con NaCI de 50 mM, el perfil de SE-HPLC se mantuvo exactamente igual a 83 y 150 mg/ml en comparación con el material de partida (Figura 34). Se utilizó un método de SE-HPLC genérico en una columna Phenomenex BioSep SEC S-2000, con D-PBS como fase móvil a 0,2 ml/min.

[1036] Una muestra de las soluciones concentradas de proteína 23IL0064 vhasta 55 mg/ml utilizando los tampones respectivos para su uso posterior en el método de precipitación con PEG.

[1038] 3.3.2 Determinación de la solubilidad teórica de 23IL0064

[1040] La solubilidad teórica de 23IL0064 se determinó utilizando el método de exclusión de PEG en tampón de D-PBS, en fosfato de sodio 10 mM pH 7, NaCI 50 mM, y en L-histidina 40 mM pH 6, NaCI 50 mM. Brevemente, una solución concentrada de nanocuerpo (55 mg/ml) en el tampón respectivo se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente en presencia de concentraciones crecientes de PEG6000. Después de la centrifugación a 20000xgdurante 3 minutos, se representaron gráficamente los valores logarítmicos de la [concentración de proteína soluble] frente a la concentración de PEG6000 (Figura 35). Mediante análisis de regresión y extrapolación a una concentración cero de PEG6000, se pudo obtener la concentración máxima teórica de proteína (y, por tanto, los valores de solubilidad) para el nanocuerpo en los tampones probados.

[1042] Al extrapolar los gráficos de regresión hasta una concentración cero de PEG6000, se calculó un valor de solubilidad teórica de 60 mg/ml y de 288 mg/ml para 23IL0064 en D-PBS y en tampón de fosfato 10 mM/NaCI 50 mM respectivamente. 23IL0064 mostró una solubilidad extremadamente buena en el tampón de histidina: en el experimento de 55 mg/ml sólo a una concentración de PEG del 27 % la proteína comenzó a precipitar ligeramente. Por lo tanto, el experimento se repitió con la proteína disuelta a 150 mg/ml. Allí sólo se produjo una precipitación de PEG del 10 %, pero no quedó volumen para las mediciones de OD. Por lo tanto, la solubilidad en realidad era demasiado alta para obtener un valor en este ensayo.

[1044] En conclusión, la mayor solubilidad se obtuvo en 40 mM de histidina, pH 6, con 50 mM de NaCI. En tampón de fosfato con 50 mM de NaCI, la solubilidad fue mejor que en D-PBS (con 137 mM de NaCI).

[1046] 3.3.3 Determinación de la solubilidad teórica de 23IL0064 y 23IL0075

[1048] La solubilidad teórica se determinó para 23IL0064 y 23IL0075 utilizando el método de exclusión de PEG en fosfato de sodio 10 mM pH 7, NaCI 50 mM, y en L-histidina 40 mM pH 6, NaCI 50 mM (los mismos tampones que se utilizaron en el estudio de solubilidad previo para 23IL0064 descrito anteriormente). Los gráficos (Figura 36 y Figura 37) que representan la concentración de proteína en el sobrenadante en función del % de concentración de PEG fueron muy similares a los obtenidos en el experimento anterior. Nuevamente la solubilidad aparente en histidina fue mayor que en el tampón de fosfato, y no se pudo calcular debido a la precipitación mínima bajo las concentraciones de proteína (5 mg/ml) y PEG (26,7%) utilizadas. La solubilidad calculada en tampón de fosfato pH 7 para 23IL0064 y 23IL0075 fue menor que en el experimento anterior, es decir, 55 y 42 mg/ml respectivamente, mientras que observamos hasta 288 mg/ml en el experimento anterior. Debemos destacar, sin embargo, que estos experimentos se realizaron pipeteando volúmenes extremadamente bajos de soluciones altamente viscosas, y por lo tanto los números absolutos de solubilidad deben confirmarse con otras técnicas.

[1050] Ejemplo 3.4: Estudios de estabilidad estresada para 23IL0064 en D-PBS

[1052] Se realizó un estudio de estabilidad estresada inicial a 37 °C en D-PBS. El lote original se esterilizó a través de un filtro de 0,22 gm, y se almacenaron 500 gl a 37 °C en viales eppendorf de 1,5 ml para cada punto de tiempo (4, 8, 12, 16, 20 y 24 semanas). Además, se almacenaron aproximadamente 9 x 100 gl a -20 °C (referencia). Ya después de 3 semanas se analizó una primera muestra mediante SE-HPLC, y se detectó un prepico de agregados (3%) (Figura 38). Después de 4 semanas a 37 °C, el área total del pico en SE-HPLC y en RP-HPLC se redujo a sólo la mitad de la muestra de referencia (Figuras 38 y 39). Por lo tanto, decidimos finalizar prematuramente el estudio de estabilidad. En algunas de las muestras restantes, el contenido todavía se midió por OD280 después de la centrifugación. La pérdida de material en la muestra de 4<w>-37 °C por precipitación (todas las muestras se centrifugaron antes del análisis) se confirmó en las 3 muestras adicionales sometidas a estrés durante 6 semanas a 37 °C: en 2 de las 3 muestras se perdió la mitad del material (Tabla 29).

[1054] Se puede concluir que el 23IL0064 en D-PBS formó fácilmente agregados que precipitaron tras un almacenamiento de 4 semanas a 37 °C. En el análisis por RP-HPLC de la muestra sometida a estrés a 37 °C, se observó también un 12 % de postpico, correspondiente a la formación de piroglutamato N-terminal (Figura 41).

[1056] Ejemplo 3.5: Estudio de estabilidad estresada para 23IL0064 en tampón de histidina

[1057] A partir de I<os>resultados descritos en I<os>ejemplos anteriores sobre la solubilidad, el ensayo de desplazamiento térmico y la estabilidad estresada a 37 °C en D-PBS para 23IL0064, se concluyó que el fosfato no era el tampón óptimo para la formulación de 23IL0064. En el TSA descrito en el Ejemplo 3.2.2, exploramos algunos tampones de formulación potenciales, y las Tm más altas se obtuvieron en histidina pH 6,5, Hepes pH 7 y Hepes pH 8. En el experimento de solubilidad (véase el Ejemplo 3.3), la solubilidad en una histidina 40 mM pH 6, con 50 mM de NaCI fue muy alta. Por lo tanto, decidimos probar la estabilidad de almacenamiento en tampón de histidina. En la Tabla 30 se proporciona una lista de tampones de formulación probados. El objetivo de este montaje fue comparar la histidina pH 6,5 con la histidina pH 6, investigar la influencia de algunos excipientes comúnmente utilizados, y la influencia de una mayor concentración en la estabilidad (diferencia entre 5 mg/ml y 22 mg/ml). También se incluyó una muestra en Hepes pH 8, para ser analizada únicamente después de 3 semanas a 37 °C.

[1059] Para este estudio, se dializaron 3,2 ml del lote original en tampón de Hepes 20 mM pH 8, y se dializaron aproximadamente 65 ml (aprox. 246 g) en tampón de Histidina 20 mM pH 6,5. L<os>excipientes se añadieron en soluciones concentradas (2x), y la muestra a pH 6 se preparó añadiendo HCl. Las muestras se concentraron entonces hasta aproximadamente 5 mg/ml, se esterilizaron a través de un filtro de 0,22 gm, y se dividieron en alícuotas en eppendorfs de 1,5 ml (500 gl/eppendorf) para su almacenamiento en las diferentes condiciones.

[1061] 3.5.1 Estabilidad durante la congelación y descongelación

[1063] Una muestra de cada una de las formulaciones anteriores en histidina se sometió a 10 ciclos de congelación/descongelación. Las muestras se analizaron mediante RP-HPLC y contenido OD280. N<o>se observó ninguna diferencia con la muestra de referencia (una congelación/descongelación).

[1065] 3.5.2 Esfuerzo cortante

[1067] D<os>muestras de cada una de las formulaciones anteriores en histidina se sometieron a esfuerzo cortante. La prueba se realizó en una cámara fría (4-8°C) en pequeños tubos de vidrio con 300 gl de solución de proteína, se agitó a través de una barra magnética durante 4 y 8 horas a una velocidad de rotación media.

[1069] En todas las muestras estresadas con 4 y 8 horas de cizallamiento se presentó una opalescencia clara. Esto se cuantificó mediante el análisis del contenido de OD280 después de la centrifugación de las muestras. El análisis por SE-HPLC no reveló ningún agregado. El análisis de RP-HPLC después de 4 horas de esfuerzo cortante no mostró degradación, pero después de 8 horas de estrés apareció algún aumento del prepico no resuelto, especialmente en la muestra concentrada. También en SDS-PAGE generalmente no se detectó degradación. En la Tabla 31 se da una clasificación bruta basada en la opalescencia y la pérdida de material en el análisis de contenido.

[1071] 3.5.3 Almacenamiento a 4 °C, 25 °C y 37 °C durante 6 semanas

[1073] El primer análisis se realizó después de 2,5 semanas de almacenamiento a 25 °C y 37 °C. Las muestras se analizaron mediante RP-HPLC (véase también la Tabla 32), SE-HPLC, SDS-PAGE y<o>D 280/350. Se observó muy poca degradación después de 2,5 semanas (datos no mostrados). A continuación se analizan I<os>resultados después de 6 semanas de almacenamiento a 37 °C (para la muestra en Hepes pH 8, se analizan I<os>resultados a 37 °C de 2,5 semanas).

[1075] Análisis de RP-HPLC

[1077] El análisis de RP-HPLC se realizó principalmente para detectar la degradación química. El estrés a 25 °C y a 37 °C generalmente provocó un aumento del postpico correspondiente al piroglutamato N-terminal. Este postpico aumentó menos en el tampón de histidina pH 6 que en el de pH 6,5, y más rápidamente en el tampón de Hepes pH 8: por ejemplo, después de 2,5 semanas a 37 °C, hubo un 11 % de postpico de piroglutamato en Hepes pH 8, un 7 % en histidina pH 6,5, y un 5 % en histidina pH 6 (datos no mostrados).

[1079] Además apareció un segundo postpico desconocido. En la Figura 40 se ofrece una descripción general de I<os>datos de integración. En la Figura 41 se muestra una superposición entre I<os>cromatogramas obtenidos para las diferentes temperaturas de almacenamiento de 23IL0064 en tampón de histidina pH 6,5 a 22 mg/ml.

[1081] Análisis de SE-HPLC

[1083] En las muestras a 5 mg/ml estresadas durante 6 semanas a 37 °C, se observaron pequeñas cantidades de agregados (entre 0,5 y 1 %). L<os>picos se integraron. L<os>perpicos y postpicos separados nunca fueron superiores al 1 por ciento.

[1084] Sin embargo, en la muestra de 22,4 mg/ml, se detectaron 3 % de agregados en la muestra almacenada a 37 °C.

[1085] Análisis de SDS-PAGE

[1086] El análisis por SDS-PAGE mostró poca degradación. En las muestras sometidas a estrés a 37 °C durante 6 semanas, se observó un ligero aumento en la intensidad de una banda de degradación a un Mw de aproximadamente 27 kDa, y se observaron algunas bandas delgadas debajo de la banda principal (Figura 42). No se observó ninguna diferencia entre los diferentes tampones de formulación.

[1088] Análisis de OD280, OD350 y partículas subvisibles

[1090] Todas las muestras del estudio de estabilidad de almacenamiento se analizaron más a fondo para determinar su contenido de nanocuerpos (por OD280), su opacidad (por OD350), y para detectar partículas subvisibles (por PAMAS). Se obtuvieron resultados muy similares entre la referencia y las muestras de almacenamiento a diferentes temperaturas (datos no mostrados).

[1092] Ejemplo 3.6: Dispersión de luz elástica

[1094] La tendencia a la formación de agregados de 23IL0075 en los diferentes tampones de formulación se determinó utilizando la dispersión de luz elástica medida en un ángulo de 90° por desnaturalización inducida por temperatura medida en el espectrofluorómetro Jasco (longitud de onda de excitación y emisión 500 nm). Primero buscamos la concentración óptima de proteína, utilizando el tampón de fosfato 10 mM pH 6,0. En concentraciones de 175 pg/ml de 23110075 o inferiores no se observó ningún aumento en la intensidad de dispersión en el intervalo de temperatura probado: (45-95 °C). Sólo a 250 pg/ml se observó dispersión. La curva parecía mostrar dos transiciones, lo que podría indicar la formación de dos tipos diferentes de agregados (véase la Figura 43).

[1096] El experimento se repitió para los tampones de acetato y de histidina, ambos a pH 6,0. Las temperaturas de inicio de la agregación en los tres tampones fueron muy similares (Tabla 37). La principal diferencia entre los tres tampones fue la dispersión máxima: permaneció dentro del intervalo del detector (alrededor de 435 abs) para la histidina mientras que salió del intervalo tanto en los tampones de fosfato como de acetato (Figuras 44 y 45). En la histidina, la segunda transición estaba ausente (Figura 46). Como la dispersión es proporcional al nivel de agregados formados, esto indicó que la histidina 10 mM sería un tampón de formulación más óptimo que el acetato 10 mM y el fosfato 10 mM pH 6.

[1098] Ejemplo 3.7. Estudio de congelación/descongelación y esfuerzo cortante en 23IL0075 en un tampón de formulación de histidina, acetato y fosfato con manitol o una mezcla de manitol y glicina como excipientes, y un detergente no iónico como tensioactivo

[1100] Se ha investigado la sensibilidad de 23IL0075 a la congelación/descongelación y al cizallamiento o agitación en diferentes tampones de formulación candidatos (véase la Tabla 38). El estudio del estrés por congelación/descongelación consistió en 10 ciclos: se congeló una muestra de 100 pl en un tubo Eppendorf a -20 °C hasta que estuvo completamente congelada, y se descongeló a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de un mezclamiento suave. La prueba de estrés cortante se realizó en una cámara fría (4-8°C) en pequeños tubos de vidrio con 150 pl de solución de proteína; la solución de proteína se agitó a través de una barra magnética durante 4 horas a una velocidad de rotación media. Todas las muestras fueron analizadas por RP-HPLC, SE-HPLC y OD500, algunas muestras también por Biacore. En la RP-HPLC no se detectó influencia del cizallamiento ni de la congelación/descongelación.

[1102] En SE-HPLC, dependiendo del tampón de formulación, el estrés de congelación/descongelación provocó un aumento en el porcentaje de pre-pico de hasta un 2,5 % (Figura 47 (B)). Una mezcla de manitol y glicina protegió mejor contra el estrés por congelación/descongelación que sólo manitol como excipiente (Figura 47).

[1104] En las muestras sometidas a esfuerzo cortante, apenas se detectó un aumento del porcentaje de pre-pico en SE-HPLC, pero se midió hasta 10 veces más opalescencia (OD500) que en las muestras de congelación/descongelación. La densidad óptica a 500 nm (OD500) aumentó en las muestras agitadas, y se correlacionó con la opalescencia en las muestras. Concluimos que en el tampón de histidina con 0,05 % de Poloxámero o con 0,005 % de Tween 80 la opalescencia se mantuvo más baja (Figura 48).

[1106] Ejemplo 3.8. Estudio de estabilidad frente a congelación/descongelación, estrés por esfuerzo cortante y estrés térmico (37 °C) para 23IL0075 en un tampón de formulación de histidina con diferentes combinaciones de excipientes.

[1108] Con base en las conclusiones del Ejemplo 3.7, probamos además la estabilidad de congelación/descongelación, tensión cortante y tensión térmica (37 °C) en diferentes tampones de formulación de histidina (Figura 49 y Figura 50). Se probaron diferentes excipientes en una formulación con 25 mg/ml de proteína. En la Tabla 39 se presenta una descripción general de los tampones de formulación probados en F/T y la estabilidad de almacenamiento. En la Figura 49 se presentan los resultados de las mediciones de OD500 y SE-HPLC después del estrés de congelación/descongelación. Se observó un aumento insignificante de OD500. En SE-HPLC, observamos un aumento de oligómeros sólo para la muestra con 5,4 % de manitol como excipiente. En la Tabla 40 se presentan los tampones probados para esfuerzo cortante. Aquí no se incluyeron detergentes, para imitar la situación durante la etapa de concentración final del procedimiento DSP. En la Figura 50 se presentan los resultados de OD500, SE-HPLC y Biacore obtenidos después de 4 horas de agitación de la formulación. La agitación de la muestra provocó un aumento en la absorción de OD500, pero no influyó en el % de oligómeros solubles medido por SE-HPLC. Estas muestras también fueron analizadas para determinar la unión a albúmina en Biacore. Concluimos que la proteína estuvo mejor protegida contra el esfuerzo cortante con sacarosa al 10 %, seguido de una mezcla de manitol y glicina como excipientes. Comparando los valores con los valores del Ejemplo 3.7, vemos que los resultados fueron reproducibles, y que para la tensión cortante la adición de algún detergente fue beneficiosa.

[1109] Las muestras de estabilidad acelerada a 25 mg/ml en los diferentes tampones de formulación candidatos se analizaron mediante OD500, SE-HPLC y RP-HPLC después de 3 y 6 semanas de almacenamiento. En SE-HPLC, el aumento de oligómeros sólo se observó a 37 °C (Figura 51). En la RP-HPLC, el postpico correspondiente al piroglutamato aumentó de 3 % a 4 % tras 6 semanas de almacenamiento a 25 °C, pero alcanzó un promedio de 9 % tras 6 semanas a 37 °C. En la Tabla 41 se muestran los resultados de RP-HPLC y SE-HPLC tras 3 y 6 semanas de almacenamiento a 37 °C y 6 semanas a 25 °C. Los valores de OD500 se mantuvieron para todos los tampones (excepto un valor atípico) por debajo de 0,01.

[1110] TABLAS

[1111] Tabla 1. Descripción general de los diferentes tampones de formulación de RANKL008a utilizados en pruebas de estabilidad.

[1113]

[1115] Tabla 2.Potencias relativas de los restos de unión a HSA y RANKL de RANKL008a después de 10 ciclos de F/T determinadas mediante ensayos de potencia ELISA (inhibición y unión a HSA).

[1117]

[1118]

[1120] Tabla 3.Datos de integración (% del área superficial total) de I<os>diferentes picos observados en I<os>cromatogramas de SE-HPLC de RANKL008a después de 10 ciclos F/T o almacenados a 37 °C en diferentes tampones de formulación en todos los puntos de tiempo probados y en comparación con cada muestra de control (cada una amortiguada

[1122]

[1124] Tabla 4.Datos de integración (% del área superficial total) de los diferentes picos observados en los cromatogramas de RP-HPLC de RANKL008a después de 10 ciclos F/T o almacenados a 37 °C en diferentes tampones de formulación en todos los puntos de tiempo probados y en comparación con cada muestra de control (cada una amortiguada

[1127] Tabla 5.Datos de integración (% del área superficial total) de I<os>diferentes picos observados en I<os>cromatogramas de IEX-HPLC de RANKL008a almacenados durante 10 semanas a 37 °C en diferentes tampones de formulación.

[1128]

[1131] Tabla 6.Potencias relativas de los restos de unión a HSA y RANKL de RANKLO08a después de 10 semanas a 37 °C según lo medido mediante análisis Biacore.

[1132]

[1134] Tabla 7.inspección visual y determinación del contenido de RANKL008a después de la dilución hasta 0,28 mg/ml en diferentes diluyentes y paso/almacenamiento en jeringas (consulte la Figura 9).

[1135]

[1137] Tabla 8.inspección visual, contenido (intervalo de confianza) y turbidez de RANKL008a diluido hasta 0,28 mg/ml antes (TUB) y después del paso a través de jeringas con diferentes tamaños de aguja como se describe en el Ejemplo 1.8.

[1138]

[1139]

[1141] Tabla 9.inspección visual, contenido (con intervalo de confianza del 95 %) y turbidez de RANKL008a antes (TUB) y después del paso a través de jeringas con diferentes tamaños de aguja como se describe en el Ejemplo 1.7 a una concentración de 0,28 mg/ml o alrededor de 65 mg/ml.

[1143]

[1145] Tabla 10.Secuencias de proteínas de los nanocuerpos utilizados en el Ejemplo 2

[1147]

[1148]

[1150] Tabla 11.Descripción general de I<os>lotes de IL6R utilizados en I<os>estudios de formulación y estabilidad descritos en el Ejemplo 2.

[1152]

[1154] Tabla 12.Reactivos utilizados en el estudio de formulación y estabilidad descrito en el Ejemplo 2

[1156]

[1157]

[1159] Tabla 13.Resumen de I<os>resultados del ensayo TSA. L<os>va lores de Tm obtenidos en el tam pón diferente están codificados de blanco a gris oscuro, es decir, de valores de Tm más altos a más bajos.

[1161]

[1163] Tabla 14.Descripción general de los valores de Tm obtenidos por DSC utilizando IL6R304.

[1165]

[1167] Tabla 15.Descripción general de los resultados de Tm obtenidos por DSC y TSA utilizando IL6R304 form ulado en diferentes tam pones.

[1169]

[1171] Tabla 16.Aspecto visual, espectroscopia UV y datos PAMAS que dem uestran una m ayor solubilidad de IL6R304 en presencia de Tween 80.

[1172]

[1174] Tabla 17.Descripción general de I<os>d iferentes tam pones de form ulación utilizados en las pruebas de estabilidad inicial de IL6R304, IL6R305 e IL6R306.

[1176]

[1178] Tabla 18.Descripción general de los diferentes tam pones de form ulación utilizados en las pruebas de estabilidad de IL6R304.

[1180]

[1181]

[1183] Tabla 19.M étodos utilizados para eva luar la estabilidad de IL6R304 en diferentes puntos de tiem po (representados com o x sem anas o w ) después del a lm acenam iento a 5 °C y 37 0C.

[1185]

[1187] Tabla 20.Descripción general de los resultados de la integración de SE-HPLC después del alm acenam iento durante 6 meses a 37 °C.

[1189]

[1191] Tabla 21.Descripción general de los diferentes tam pones de form ulación probados en el estudio de estabilidad.

[1192]

[1193]

[1195] Tabla 22.Datos de integración de<c>IEF de IL6R304 alm acenado durante<8>sem anas a 37 °C en I<os>d iferentes tam pones

[1197]

[1199] Tabla 23.Potencia relativa de IL6R304 después de<8>sem anas a 37 °C en com paración con B5#030309nr2.3-5.

[1201]

[1203] Tabla 24.Resumen de los resultados de Biacore para la unión a HSA de las muestras de estabilidad alm acenadas durante<8>sem anas a 37 °C, expresado com o % de actividad en com paración con la m uestra equivalente a lm acenada a -70 °C.

[1205]

[1207] Tabla 25.Aspecto de IL6R304 después de 0, 2, 4 y 24 horas de agitación a 2-8°C.

[1208]

[1210] Tabla 26.Reactivos utilizados en la form ulación y estudio de estabilidad descritos en I<os>E jemplos 3.

[1212]

[1214] Tabla 27.Concentraciones fina les obtenidas después de la concentración de 23IL0064 utilizando filtros V ivaspin. La filtración se detuvo en el m om ento en que el volum en final fue lim itado<( 1 0 0>a<2 0 0>pl) y se produjo pérdida de proteínas. Todas las m uestras se analizaron por SE-HPLC: el porcenta je de pre-pico (% del área superficial total) representa agregados en la muestra.

[1216]

[1218] Tabla 28.Tampones probados en un ensayo de desplazam iento térm ico para 23IL0064.

[1220]

[1221]

[1223] Tabla 29.Concentraciones m edidas por Nanodrop (prom edio de 2 m ediciones) en las m uestras som etidas a estrés a 37<0>C. La concentración se determ inó tras un centrifugado corto a alta velocidad (1 min a 15 000 x g).

[1225]

[1227] Tabla 30.la m po nes probados en estabilidad estresada para 23IL0064.

[1229]

[1231] Tabla 31.Clasificación bruta del grado de opalescencia y pérdida de m aterial inducida por el estrés de ciza llam iento para 23IL0064 en diferentes tam pones de form ulación.

[1233]

[1235] Tabla 32.Datos de integración del análisis de RP-HPLC de las muestras de estabilidad de 23IL0064 en diferentes condiciones de tam pón (com paración de<6>sem anas a 37 °C,<6>sem anas a 25 °C,<6>sem anas a 4 °C y -80 °C Ref).

[1236]

[1237] Tabla 32.Continuación,

[1238]

[1240] Tabla 33.Tem peraturas de fusión de 23IL0064 y 23IL0075 en diferentes tam pones determ inadas por calorim etría diferencial de barrido (a 1 mg/ml), El escaneo se realizó a 1 °C/m in, com enzando a 30 °C,

[1241]

[1242]

[1244] Tabla 34.Tem peraturas de fusión para 23IL0064 y 23IL0075 en tam pones determ inadas m ediante ensayo de desplazam iento térm ico (a<0 , 1>mg/ml).

[1245]

[1247] Tabla 35.

[1248]

[1250] Soluciones para acetato

[1251]

[1252]

[1254] Tabla 35.Continuación,

[1255]

[1256]

[1258] Soluciones para succinato

[1260]

[1262] Tabla 36.Resultados de optim ización basados en las tem peraturas de fusión obtenidas en la selección de una am plia gam a de excip ientes en un tam pón de histidina, acetato o fosfato para la form ulación de 23IL0075. Los resultados se ordenaron de m ayor a m enor va lo r de Tm. La com posición de la form ulación debe leerse com binando la identidad de los excip ientes en las colum nas 2 a 4 y la cantidad de cada excip iente en las colum nas 5 a 7.

[1264]

[1265]

[1267] Tabla 36.Continuación,

[1268]

[1269]

[1272] Tabla 37.Com paración de las tem peraturas de inicio de agregación y la dispersión m áxim a alcanzada para 23IL0075 en 3 tam pones (250 pg/m l), m edidas mediante dispersión de luz elástica. (Intervalo de tem peratura: 45-95 °C, gradiente de tem peratura: 2°C /m in, paso de datos: 1°C, longitud de onda (ex/em): 500 nm, ancho de banda (ex/em): 3 nm.)

[1274]

[1275]

[1277] Tabla 38.Lista de tam pones probados en el estudio de estrés por congelación/descongelación y agitación de 23IL0075<( 1 0>mg/ml)

[1279]

[1281] Tabla 39.Estudio de estabilidad de 23IL0075 en H istid ina 10mM pH 6,0 con diferentes excipientes. Las m uestras fueron som etidas a estrés por congelación/descongelación 10X y se alm acenaron a diferentes tem peraturas (-70 °C, 5 °C, 25 °C y 37 °C) para un estudio de estabilidad. Las m uestras estresadas y de estabilidad se analizaron utilizando medición de OD, RP-HPLC y SE-HPLC.

[1283]

[1284]

[1287] Tabla 40.M uestras som etidas a esfuerzo cortante por agitación. Las m uestras fueron posteriorm ente analizadas por m ediciones de OD, RP-HPLC, SE-HPLC y Biacore.

[1289]

[1292] Tabla 41. Resultados de la crom atogra fía de SE-HPLC y RP-HPLC de 23IL0075 a 25 mg/ml en diferentes tam pones de form ulación candidatos (detalles en la tab la anterior) en un estudio de estabilidad acelerada a 25 y 37 °C.

[1294]

[1296] *En la m uestra de referencia 0.3 a 0.4% pre-pico en SE-HPLC;

[1297] **Se observó un porcentaje de post-p ico en RP-HPLC;

[1298] ***La m uestra som etida a estrés durante<6>sem anas a 37 °C en manitol y Poloxam er 188 fue un va lor atípico tam bién en función del va lor OD500 que fue 0,1 en com paración con los valores OD500 siem pre inferiores a 0,01 para todas las dem ás muestras.

[1300] Tabla 42.Datos de estabilidad del lote de IL6R304 CM C-D-0048, alm acenado a -70 °C.

[1302]

[1303]

[1305] Tabla 43.Datos de estabilidad del lote de IL6R304 CM C-D-0048, alm acenado a 5<0>C.

[1306]

[1308] Tabla 44.Datos de estabilidad del lote de IL6R304 CM C-D-0048, alm acenado a 25 °C.

[1309]

[1310]

[1311] 

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Una form ulación que com prende un vehículo acuoso con un pH de 5,5 a 8,0 y un po lipéptido que com prende uno o más dom in ios variab les únicos a una concentración de<1>mg/ml a<2 0 0>mg/ml, form ulándose dicha form ulación para su adm inistración a un sujeto humano, y com prendiendo dicha form ulación adem ás un tam pón a una concentración de 10 mM a 100 mM seleccionado entre histid ina pH 6,0-6,5.

en la que dicha form ulación tiene una concentración de sal inorgánica de 150 mM o inferior, y

en la que el po lipéptido com prende al m enos un dom in io variab le único d irig ido contra la seroalbúm ina hum ana (HSA) con la condición de que la form ulación no sea

- una form ulación de ATN-103 a una concentración de 50 mg/ml, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa (peso/volum en), 0,01%de polisorbato 80, pH 6,0;

- una form ulación obtenible por liofilización de la form ulación de ATN-103 a una concentración de 50 mg/ml, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa (peso/volum en), 0,01 % de polisorbato 80, pH 6,0, y reconstituyendo en agua estéril (USP) a una form ulación de ATN-103 a una concentración de 100 mg/ml, 20 mM de histidina, 10 % de sacarosa, 0,02 % de polisorbato 80, pH 6,0;

- una form ulación de ATN-103 a una concentración de aproxim adam ente 80 mg/ml, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato 80, pH 6,0;

- una form ulación de<8 8>mg/ml de a TN<- 1>03,<1 0>mM de histidina, 5 % de sacarosa,<0 , 0 1>% de polisorbato-80, 55 mM de NaCl, pH 6,1;

- una form ulación de 89 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 55 mM de hidrocloruro de arginina, pH 6,1;

- una form ulación de<8 8>mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 100 mM de glicina, pH 6,0;

- una form ulación de 99 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 100 mM de metionina, pH 6,0;

- una form ulación de<8 8>mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina,<8>% de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, pH 6,0; - una form ulación de 100 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, pH 6,0; - una form ulación de 118 mg/ml de ATN-103, 20 mM de histidina, 5 % de sacarosa, pH 6,0;

- una form ulación de aproxim adam ente 1 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, pH 6,0;

- una form ulación de aproxim adam ente 1 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, pH 6,5;

- una form ulación de aproxim adam ente 1 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 150 mM de argin ina HCl, pH 6,0;

- una form ulación de aproxim adam ente 1 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 150 mM de argin ina HCl, pH 6,5;

- una form ulación de aproxim adam ente 1 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 75 mM de cloruro de sodio; pH 6,0;

- una form ulación de aproxim adam ente 1 mg/ml de ATN-103, 10 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 75 mM de cloruro de sodio; pH 6,5;

- una form ulación de 100 mg/ml de ATN-103, 20 mM de histidina,<8>% de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80;

- una form ulación de 100 mg/ml de ATN-103, 20 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 80 mM de glicina;

- una form ulación de 100 mg/ml de ATN-103, 20 mM de histidina, 5 % de sacarosa, 0,01 % de polisorbato-80, 80 mM de glicina, 10 mM de metionina;

- una form ulación de 100 mg/ml de ATN-103, 20 mM de histidina, 5 % de sorbitol;

- una form ulación de 100 mg/ml de ATN-103, 20 mM de histidina, 5 % de sacarosa;

en la que ATN-103 es:

MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLE

WVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTV

SSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGS

GSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSG

GGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPD

SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSS.

2. La form ulación de la reivindicación 1, que no contiene ninguna sal inorgánica.

3. La form ulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que la concentración de po lipéptido es 5 a 100 mg/ml, más preferib lem ente 5 a 50 mg/ml, ta l com o 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml o incluso más.

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4. La form ulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el dom inio variab le único d irig ido contra seroalbúm ina hum ana (HSA) consiste en EVQ LVESG G G LVQ PG NSLRLSCAASG FTFSSFG M SW VRQ AP g k g l e w v s s is g s g s d t l y a d s v k g r f t i s r d n a k t t l y l q m n s l r p e d t a v y y c t i g g s l s r s s q g t l v t v s s . 5. La form ulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que

- el polipéptido tiene una solubilidad de al m enos 20 mg/ml, preferib lem ente 50 mg/ml o más, más preferib lem ente 90 mg/ml o más o 120 mg/ml o más, más preferib lem ente 150 mg/ml o más, o incluso 200 mg/ml o más, según se determ ina m ediante el m étodo de exclusión de PEG o m ediante un experim ento de concentración;

- el polipéptido tiene una tem peratura de fusión de al menos 59 °C o más, preferib lem ente al m enos 60 °C o más, más preferib lem ente al m enos 61 °C o más o al m enos 62 °C o más, lo más preferib le al menos 63 °C o más, m edida m ediante el ensayo de desplazam iento térm ico (TSA) y/o calorim etría diferencial de barrido (DSC);

- no hay partículas presentes según lo m edido por O D320/O D280 y/o dispersión de luz elástica;

- menos del 10 % del polipéptido form a pirog lutam ato en el ácido glutám ico N-term inal durante el alm acenam iento a una tem peratura de 37 ± 5 °C hasta al m enos 2 sem anas (preferib lem ente al menos 3 sem anas, al m enos 5 sem anas, al m enos<8>sem anas, al menos 10 sem anas, al m enos 3 meses, al menos<6>meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más), el % de piroglutam ato según se mide por RP-HPLC;

- m enos del 10 % del po lipéptido form a dím eros durante el alm acenam iento a una tem peratura de 37 ± 5 °C hasta al m enos 2 sem anas (preferib lem ente al m enos 3 sem anas, al m enos 5 sem anas, al menos<8>sem anas, al m enos 10 sem anas, al m enos 3 meses, al menos<6>meses, al m enos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más), el % de dím eros según se mide por SE-HPLC;

- al menos el 80 % de los polipéptidos conserva su actividad de unión a al m enos uno de sus objetivos después del alm acenam iento a 37 ± 5 °C hasta al m enos 2 sem anas (preferib lem ente al m enos 3 sem anas, al m enos 5 semanas, al m enos 2 meses, al m enos<6>meses, al menos 1 año, 1,5 años o incluso 2 años o más) en com paración con la actividad de unión antes del alm acenam iento, dicha actividad de unión según se mide por ELISA y/o Biacore; y/o - el polipéptido es estable durante el estrés mecánico.

<6>. La form ulación de cualquiera de las re ivindicaciones 1 a 5, en la que el tam pón es un tam pón de histid ina pH 6,5 o histid ina pH 6,0.

7. La form ulación de la reivindicación<6>, en la que el tam pón de histid ina tiene una concentración de 10 a 50 mM, más preferib lem ente de 10 a 20 mM, tal com o a lrededor de 10 mM o 15 mM.

<8>. La form ulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el excipiente se selecciona entre manitol, trehalosa, sorbitol y sacarosa.

9. La form ulación de la reivindicación<8>, en la que el excip iente tiene una concentración de 2,5 % a 15 %, más preferib lem ente de 5 % a<1 0>%, tal com o a lrededor de 5 %, 7,5 %,<8>% y<1 0>%.

10. La form ulación de cua lqu iera de las reivindicaciones 1 a 9, que com prende adem ás un tensioactivo en una concentración de<0 , 0 0 1>% a<1>% seleccionado entre po lisorbato<2 0>, polisorbato 80 o un poloxám ero.

11. La form ulación de la reivindicación 10, en la que el tensioactivo tiene una concentración de 0,01 % a 0,1 %, preferib lem ente de 0,01 % a 0,05 %, tal com o alrededor de 0,01 % o 0,005 %.

12. La form ulación de cualquiera de las re ivindicaciones 1 a 11, que com prende:

a) Un tam pón de histidina pH 6,5 o pH 6,0 a una concentración de 10 mM a 100 mM;

b) Sacarosa en una concentración de 1 % a 20 %; y

c) Polisorbato 80 en una concentración de 0,001 % a 1 %.

13. Un m étodo para la preparación de una form ulación de cua lqu iera de las re ivindicaciones 1 a 12, que com prende al menos la etapa de concentrar el po lipéptido e intercam biarlo con el tam pón y/o excip iente seleccionado.

14. Un recipiente sellado que contiene una form ulación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

15. Una form a de dosificación unitaria farm acéutica adecuada para adm inistración parenteral a un ser humano, que com prende una form ulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones<1>a<1 2>en un recipiente adecuado. 16. Un kit que com prende uno o más de los recipientes sellados según la reivindicación 14 y/o form as de dosificación unitarias farm acéuticas según la reivindicación 15, e instrucciones para el uso de la form ulación.

17. La form ulación, recipiente, unidad farm acéutica farm acéutica o kit según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para uso en terapia.

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