RS59830B1 - Optimizovana monoklonska antitela protiv inhibitora puta faktora tkiva (tfpi) - Google Patents

Description

Polje otelotvorenja

[0001] Pružena su izolovana monoklonska antitela i njihovi fragmenti koji vezuju ljudski inhibitor puta faktora tkiva (TFPI).

Pozadina

[0002] Koagulacija krvi je proces pomoću koga krv formira stabilne ugruške za zaustavljanje krvarenja. Proces uključuje brojne proenzime i prokofaktore (ili „faktori koagulacije“) koji cirkulišu u krvi. Ovi proenzimi i prokofaktori interakuju kroz nekoliko puteva kroz koji se konvertuju, bilo sekvencijalno ili istovremeno, u aktiviran oblik. Na kraju, proces rezultuje aktiviranjem protrombina za trombin aktiviranim Faktorom X (FXa) u prisustvu faktora Va, jonskog kalcijuma i trombocita. Aktivirani trombin uzrokuje agregaciju trombocita i pretvara fibrinogen u fibrin, koji se zatim povezuje aktiviranim Faktorom XIII (FXIIIa) kako bi se formirao ugrušak.

[0003] Proces koji dovodi do aktivacije Faktora X može se izvršiti putem dva različita puta: put za aktiviranje kontakta (ranije poznat kao interni put) i put faktora tkiva (ranije poznat kao eksterni put). Ranije se smatralo da se kaskada koagulacije sastoji od dva puta jednake važnosti koja su povezani za zajednički put. Sada je poznato da je primarni put za iniciranje krvne koagulacije putni faktora tkiva.

[0004] Faktor X se može aktivirati faktorom tkiva (TF) u kombinaciji sa aktiviranim Faktorom VII (FVIIa). Kompleks faktora VIIa i njegovog suštinskog kofaktora, TF, je snažan inicijator kaskade ugrušaka.

[0005] Postupak koagulacije faktora tkiva negativno se kontroliše inhibitorima pomoću inhibitora puta faktora tkiva („TFPI“). TFPI je prirodni FXa-zavisni inhibitor povratne sprege FVIIa/TF kompleksa. On je član multivivalentnih inhibitora serin proteaze Kunic-tipa.

Fiziološki, TFPI se vezuje za aktivirani Faktor X (FXa) da bi se formirao heterodimerni kompleks, koji zatim interakuje sa kompleksom FVIIa/TF da inhibira njegovu aktivnost, čime se isključuje faktor tkiva puta koagulacije. U principu, blokiranje aktivnosti TFPI može vratiti aktivnost FXa i FVIIa/TF, time produžujući trajanje delovanja faktora tkiva i povećava generisanje FXa, što je uobičajeni defekt u hemofiliji A i B.

[0006] Zaista, neki preliminarni eksperimentalni dokazi ukazuju da blokiranje aktivnosti TFPI antitelima protiv TFPI normalizuje produženo vreme koagulacije ili skraćuje vreme krvarenja. Na primer, Nordfang et al. su pkazali da je produženo razblaženo protrombinsko vreme hemofilije plazme normalizovano nakon tretiranja plazme antitelima na TFPI (Thromb. Haemost., 1991, 66(4): 464-467). Slično tome, Erhardtsen et al. su pokazali da je vreme krvarenja u zečjem modelu hemofilije A znatno skraćeno anti-TFPI antitelima (Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995, 6: 388-394). Ove studije sugerišu da inhibicija TFPI pomoću anti-TFPI antitela može biti korisna za lečenje hemofilije A ili B. U ovim istraživanjima korišćeno je samo poliklonsko anti-TFPI antitelo.

[0007] Pomoću tehnika hibridoma, pripremljena su i identifikovana monoklonska antitela protiv rekombinantnog ljudskog TFPI (rhTFPI). Pogledati Yang et al., Chin. Med. J., 1998, 111(8): 718-721. Testiran je efekat monoklonskih antitela na razblaženo protrombinsko vreme (PT) i aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme (APTT). Eksperimenti su pokazali da je anti-TFPI monoklonsko antitelo skraćeno vreme koagulacije razblaženog tromboplastina plazme kojoj nedostaje Faktor IX. Predloženo je da putevi faktora tkiva igraju važnu ulogu ne samo u fiziološkoj koagulaciji već i u krvarenju hemofilije (Yang et al., Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997, 22(4): 297-300).

[0008] Prema tome, antitela specifična za TFPI su potrebna za lečenje hematoloških oboljenja i raka.

[0009] Generalno, terapeutska antitela za ljudska oboljenja su generisana korišćenjem genetičkog inženjeringa za stvaranje mišjih, himernih, humanizovanih ili potpuno ljudskih antitela. Pokazano je da mišja monoklonska antitela imaju ograničenu upotrebu kao terapeutski agensi zbog kratkog polu života u serumu, nemogućnosti pokretanja ljudskih efektorskih funkcija i proizvodnje ljudskih antimišjih-antitela (Brekke and Sandlie, „Therapeutic Antibodies for ljudsk Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century“, Nature 2, 53, 52-62, Jan.2003). Pokazano je da himerna antitela dovode do odgovora ljudskih anti-himernih antitela. humanizovana antitela dodatno umanjuju mišju komponentu antitela. Međutim, potpuno ljudsko antitelo u potpunosti izbegava imunogenost povezanu sa mišjim elementima. Prema tome, postoji potreba da se razviju potpuno ljudska antitela kako bi se izbegla imunogenost povezana sa drugim oblikom genetski modifikovanih monoklonskih antitela. Konkretno, hronični profilaktički tretman, kakav bi bio potreban za lečenje hemofilijom sa monoklonskim antitelima anti-TFPI, ima visok rizik od razvoja imunog odgovora na terapiju ako se koristi antitelo sa mišjom komponentom ili mišjim poreklom zbog čestih potrebnih dozira i dugotrajne terapije. Na primer, terapija antitela za hemofiliju A može zahtevati nedeljno doziranje tokom života pacijenta. Ovo bi bio kontinuirani izazov imunološkom sistemu. Prema tome, postoji potreba za potpuno ljudsko antitelo za terapiju antitela za hemofiliju i srodne genetske i stečene nedostatke ili defekte u koagulaciji.

[0010] Terapeutska antitela su izrađena kroz tehnologiju hibridoma koju su opisali Koehler i Milstein u „Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity“, Nature 256, 495-497 (1975). Potpuno ljudska antitela mogu takođe biti rekombinantna u prokariotima i eukariotima. Rekombinantna proizvodnja antitela u ćeliji domaćina, a ne hibridoma, je poželjna za terapeutsko antitelo. Rekombinantna proizvodnja ima prednosti veće konzistencije proizvoda, verovatnijeg višeg nivoa proizvodnje i kontrolisane proizvodnje koja smanjuje ili eliminiše prisustvo belančevina iz životinja. Iz ovih razloga, poželjno je imati rekombinantno proizvedeno monoklonsko anti-TFPI antitelo.

[0011] Pored toga, pošto se TFPI vezuje za aktivirani faktor X (FXa) sa visokim afinitetom, efikasno anti-TFPI antitelo treba da ima uporedivi afinitet. Prema tome, poželjno je imati anti-TFPI antitelo koje ima afinitet vezivanja koja se može takmičiti sa vezivanjem TFPI/FXa. Antitela ovog pronalaska imaju poboljšana svojstva u poređenju sa onima obelodanjenim u WO 2010/017196 A2. Naročito je poboljšan afinitet. Antitela sa teškim i lakim lancima prema ovde opisanom pronalasku su stoga poboljšane varijante onih iz WVO 2010/017196 A2.

Rezime

[0012] Pružena su monoklonska antitela za ljudski inhibitor puta faktora tkiva (TFPI). Dalje su pruženi izolovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju iste. Farmaceutski sastavi koji sadrže anti-TFPI monoklonska antitela i postupke lečenja genetskih i stečenih nedostataka ili defekta u koagulaciji, kao što su hemofilija A i B, takođe su pruženi. Takođe su pruženi postupci za skraćivanje vremena krvarenja davanjem anti-TFPI monoklonskog antitela pacijentu kom je to potrebno. Takođe su pruženi postupci za proizvodnju monoklonskih antitela koji vezuju ljudsku TFPI prema predmetnom pronalasku.

[0013] U nekim otelotvorenjima, monoklonska antitela za TFPI su optimizovana, na primer, da imaju povećan afinitet ili povećanu funkcionalnu aktivnost.

Kratak opis crteža

[0014]

Slika 1 prikazuje grafik sa stubićima koji ilustruje odabrane varijante 2A8 sa pojedinačnim supstitucijama aminokiselina koje su pokazale veću potentnost u skraćivanju vremena zgrušavanja u plazmi ljudske hemofilije A pomoću dPT testa. Slika 2 prikazuje grafik koji pokazuje efekat odabranih jednom aminokiselinom mutiranih anti-TFPI antitela na vreme zgrušavanja anti-faktor VIII antiteloindukovane ljudske hemofilne krvi.

Slika 3 prikazuje grafik koji pokazuje da 4B7-D62R ima mnogo više potencijala u skraćivanju vremena zgrušavanja u krvi ljudske hemofilije A izazvane antitelom, u poređenju sa roditeljskim 4B7 antitelom i u manjoj meri, nego u poređenju sa pojedinačnim supstitucijama aminokiselina unutar 2A8.

Slika 4 prikazuje su dva grafika koji pokazuju preživljavanje miševa sa hemofilijom A tretiranih roditeljskim antitelom 2A8 i varijantom 2A8 koja ima višestruke supstitucije aminokiselina (A200) na način zavisan od doze u poređenju sa kontrolnim mišem IgG1 (CTX IgG1).

Na Slici 5 prikazan je grafikon koji pokazuje da je varijanta 2A8 poboljšala zgrušavanje u ljudskoj hemofiliji C (FXI-deficientnoj) plazmi na način zavisan od doze i njegovi efekti su uporedivi sa rekombinantnim FVIIa.

Detaljan opis

Definicije

[0015] izraz „inhibitor puta faktora tkiva“ ili „TFPI“, kad se ovde koristi, odnosi se na bilo koju varijantu, izoform i homolog vrste ljudskog TFPI koji se prirodno eksprimira ćelijama. U poželjnom otelotvorenju pronalaska, vezivanje antitela iz pronalaska u TFPI smanjuje vreme zgrušavanja krvi.

[0016] kad se ovde koristi, „antitelo“ se odnosi na celo antitelo i svaki fragment-vezujući antigen (tj., „deo za vezivanje antigena“) ili njegov pojedinačni lanac. Izraz obuhvata molekul celokupnog imunoglobulina (npr. IgG antitelo) koji se prirodno javlja ili formira normalnim rekombinatornim procesima imunoglobulinskih gena ili imunološki aktivni deo molekula imunoglobulina, kao što je fragment antitela, koji zadržava specifične vezujuće aktivnost. Bez obzira na strukturu, fragment antitela se vezuje sa istim antigenom koji prepoznaje antitelo u punoj dužini. Na primer, fragment antitela anti-TFPI monoklonskog antitela se vezuje za epitop TFPI. Funkcija vezivanja antigena antitela može se izvršiti fragmentima antitela u punoj dužini. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih izrazom „deo za vezivanje antigena“ antitela uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od domena VL, VH, CLi CH1; (ii) F(ab')2fragment, dvovalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta vezana disulfidnim mostom u predelu zgloba; (Iii) Fd fragment koji se sastoji od domena VHi CH1; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VLi VHdomena jednog kraka antitela, (v) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VHdomena ; (vi) izolovnu regiju za određivanje komplementarnosti (CDR); (vii) minitela, diatela, triatela, tetratela i kapa tela (pogledati npr. Ill et al., Protein Eng 1997;10:949-57); (viii) Kamel IgG; i (ix) IgNAR. Pored toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirana od strane zasebnih gena, mogu se povezati, koristeći rekombinantne postupke, sintetičkim veznikom koji im omogućava da budu napravljeni kao pojedinačni proteinski lanac u kome se VLi VHregije uparuju da formiraju monovalentne molekule (poznatih kao Fv sa jednim lancem (scFv), pogledati npr. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takva antitela sa jednim lancem takođe su namenjena da budu obuhvaćena pojmom „deo za vezivanje antigena“ antitela. Ovi fragmenti antitela se dobijaju koristeći konvencionalne tehnike poznate stručnjacima u oblasti, a fragmenti se analiziraju za korisnost na isti način kao i netaknuta antitela.

[0017] Dalje, pretpostavlja se da fragment koji se vezuje za antigen može biti obuhvaćen mimetikom antitela. Izraz „mimetik antitela“ ili „mimetik“, kad se ovde koristi, podrazumeva protein koji pokazuje vezivanje slično antitelu, ali je manje alternativno antitelo ili neantitelski protein. Takav mimetik antitela može biti sadržan u skeli. Izraz „skela“ odnosi se na polipeptidnu platformu za inženjering novih proizvoda sa prilagođenim funkcijama i karakteristikama.

[0018] Kad se ovde koriste, izrazi „inhibicija vezivanja“ i „blokiranje vezivanja“ (npr., upućivanje na inhibiciju/blokiranje vezivanja TFPI liganda na TFPI) se koriste međusobno zamenjivo i obuhvataju i delimičnu i potpunu inhibiciju ili blokadu. Inhibicija i blokiranje takođe imaju za cilj da uključe bilo kakvo merljivo smanjenje afiniteta vezivanja TFPI na fiziološki supstrat kada je u dodiru sa anti-TFPI antitelom u poređenju sa TFPI koji nije u dodiru sa anti-TFPI antitelom, npr. blokiranjem interakciju TFPI sa faktorom Xa ili blokiranjem interakcije kompleksa TFPI-faktor Xa sa faktorom tkiva, faktorom VIIa ili kompleksom faktor tkiva/faktor VIIa za najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50% , 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%.

[0019] Izrazi „monoklonsko antitelo“ ili „sastav monoklonskih antitela“ kako se ovde koriste odnose se na preparat molekula antitela jednog molekularnog sastava. Sastav monoklonskog antitela prikazuje jednu vezujuću specifičnost i afinitet za određeni epitop. Shodno tome, pojam „ljudsko monoklonsko antitelo“ odnosi se na antitela koja prikazuju jedinstvenu vezujuću specifičnost koja ima promenjive i konstantne regije izvedene iz ljudskih germline sekvenci imunoglobulina. Ljudska antitela iz ovog pronalaska mogu uključivati ostatke aminokiselina koji nisu kodirani ljudskim germline sekvencama imunoglobulina (npr. mutacije koje su uvedene nasumice ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo).

[0020] „Izolovano antitelo“, kad se ovde koristi, namenjeno je da se odnosi na antitelo koje je u suštini bez drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr. Izolovano antitelo koje se vezuje za TFPI je u suštini bez antitela koja se vezuju za druge antigene osim TFPI). Izolovano antitelo koje se vezuje za epitop, izoform ili varijantu ljudskog TFPI može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost prema drugim srodnim antigenima, npr., od drugih vrsta (npr. TFPI homologi vrsta). Osim toga, izolovano antitelo može biti u suštini bez drugih ćelijskih materijala i/ili hemikalija.

[0021] Kad se ovde koristi, „specifično vezivanje“ odnosi se na vezivanje antitela na unapred određeni antigen. Tipično, antitelo se vezuje sa afinitetom od najmanje oko 10<5>M<-1>i vezuje se na unapred određeni antigena sa afinitetom koji je viši, na primer, najmanje dva puta veći, nego njegov afinitet za vezivanje za irelevantni antigen (npr, BSA, kazein), osim unapred određenog antigena ili povezanog antigena. Izrazi „antitelo koje prepoznaje antigen“ i „antitelo specifično za antigen“ se ovde zamenjuju izrazom „antitelo koje se specifično vezuje za antigen“.

[0022] Kad se ovde koristi, izraz „visoki afinitet“ za IgG antitelo se odnosi na afinitet vezivanja najmanje oko 10<7>M<-1>, u nekim otelotvorenjima najmanje oko 10<8>M<-1>, u nekim otelotvorenjima najmanje oko 110<9>M<-1>, 10<10>M<-1>, 10<11>M<-1>ili viđe, npr. Do 10<13>M<-1>ili više. Međutim, vezivanje „visokog afiniteta“ može varirati za druge izotipe antitela. Na primer, vezivanje sa „visokim afinitetom“ za izotipe IgM odnosi se na afinitet vezivanja barem oko 1,0 x 10<7>M<-1>. kad se ovde koristi, „izotip“ se odnosi na klasu antitela (npr., IgM ili IgG1) koji je kodiran genima konstantne regije teškog lanca.

[0023] „Regija za određivanje komplementarnosti“ ili „CDR“ odnosi se na jednu od tri hipervarijabilne regije u varijabilnoj regiji teškog lanca ili varijabilnoj regiji lakog lanca molekula antitela koji formiraju N-terminalnu antigen vezujuću površinu Što je komplementarno trodimenzionalnoj strukturi vezanog antigena. Polazeći od N-terminusa teškog ili lakog lanca, ove regije za određivanje komplementarnosti označavaju se kao „CDR1“, „CDR2“, i „CDR3“, respektivno. CDR su uključeni u antigen-antitelo vezivanje, a CDR3 sadrži jedinstvenu regiju specifičnu za antigena-antitelo vezivanje. Stoga, mesto za vezivanje antigena može sadržati šest CDR, koje sadrže CDR regije iz svakog od teških i lakih lanaca V regije.

[0024] Kad se ovde koristi, „konzervativne supstitucije“ se odnosi na modifikacije polipeptida koje uključuju supstituciju jedne ili više aminokiselina za aminokiseline koje imaju slične biohemijske osobine koje ne dovode do gubitka biološke ili biohemijske funkcije polipeptida. „Konzervativna supstitucija aminokiselina“ je ona u kojoj se aminokiselinski ostatak zamenjuje aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u struci. Ove prodice uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), ne-naponskim polarnim bočnim lancima (npr glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarnim bočnim lancima (npr, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranatim bočnim lancima (npr, treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Predviđeno je da antitela iz ovog pronalaska mogu imati konzervativne supstitucije aminokiselina i još uvek zadržavaju aktivnost.

[0025] Za nukleinske kiseline i polipeptide, izraz „značajna homologija“ znači da su dve nukleinske kiseline ili dva polipeptida ili njihove označene sekvence, kada se optimalno poravnaju i uporede, identične sa odgovarajućim nukleotida ili aminokiselinskim umetanjima ili brisanjima, po najmanje 80% nukleotida ili aminokiselina, obično najmanje oko 85%, poželjno oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ili 95%, poželjnije najmanje oko 96%, 97% 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4% ili 99,5% nukleotida ili aminokiselina. Alternativno, značajna homologija za nukleinske kiseline postoji kada se segmenti hibridizuju pod uslovima selektivne hibridizacije do komplementa niza. Pronalazak uključuje sekvence nukleinskih kiselina i polipeptidne sekvence koje imaju značajnu homologiju specifičnim sekvencama nukleinske kiseline i sekvencama aminokiselina opisanih ovde.

[0026] Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih položaja koje dele sekvence (tj.% homologije = # identičnih položaja/ukupan # položaja x 100), uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svakog praznine, koje treba uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma, kao što je, bez ograničavanja na, AlignX™ modul od VectorNTI ™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Za AlignX™, podrazumevani parametri višestrukog poravnavanja su: gap opening penalty: 10; gap extension penalty: 0.05; gap separation penalty range: 8; % identity for alignment delay: 40. (dalji detalji se mogu naći na http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-Communities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-softwarefor-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html).

[0027] Drugi postupak za određivanje najboljeg ukupnog odgovora između sekvence upita (sekvenca sadašnjeg pronalaska) i predmetne sekvence, koja se takođe naziva globalno poravnavanje sekvence, može se odrediti pomoću kompjuterskog programa CLUSTALW (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 1994, 2(22): 4673-4680), koja se zasniva na algoritmu Higgins et al., (Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191). U poravnanju sekvenci, upitne i predmetna sekvenca su obe DNK sekvence.

Rezultat navedenog globalnog poravnanja sekvence je u procentu identičnosti. Poželjni parametri koji se koriste u CLUSTALW poravnanju DNK sekvenci za izračunavanje procenta identičnosti putem uparenog poravnanja su: Matrix = IUB, k-tuple = 1, Number of Top Diagonals = 5, Gap Penalty = 3, Gap Open Penalty = 10, Gap Extension Penalty = 0.1. For multiple alignments, the following CLUSTALW parameters are preferred: Gap Opening Penalty = 10, Gap Extension Parameter = 0.05; Gap Separation Penalty Range = 8; % Identity for Alignment Delay = 40.

[0028] Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celoj ćeliji, u ćelijskom lizatu ili u delimično prečišćenom ili u suštini čistom obliku. Nukleinska kiselina je „izolovana“ ili „izrađena u suštini čista“ kada se prečisti od drugih ćelijskih komponenti sa kojima je obično povezana u prirodnom okruženju. Za izolaciju nukleinske kiseline mogu se koristiti standardne tehnike kao što su: alkaln/SDS tretman, CsCl grupisanje, hromatografija kolone, elektroforeza agaroznog gela i druge tehnike dobro poznati u struci.

Monoklonska antitela optimizovana za visok afinitet i funkcionalnu aktivnost

[0029] Nekoliko anti-TFPI antitela je identifikovano u prethodnoj studiji i opisani u PCT prijavi br. PCT/US2009/052702 podnetoj 4. avgusta 2009, koja je ovde navedena kao referenca za sve ciljeve. Ova anti-TFPI antitela mogu biti dodatno optimizovana, na primer poboljšanjem njihovog afiniteta i aktivnosti blokiranja na TFPI. Takva optimizacija se može izvršiti, na primer, korišćenjem mutageneze zasićenja na mestima regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) ili ostataka u neposrednoj blizini CDR-a, tj. oko 3 ili 4 ostatka pored CDR-a antitela.

[0030] Takođe su pružena monoklonska antitela koja imaju povećan ili visok afinitet prema TFPI. U nekim otelotvorenjima anti-TFPI antitela imaju afinitet vezivanja najmanje oko 10<7>M<-1>, u nekim otelotvorenjima najmanje oko 10<8>M<-1>, u nekim otelotvorenjima najmanje oko 10<9>M<-1>, 10<10>M<-1>, 10<11>M<-1>ili više , npr. do 10<13>M<-1>ili više.

[0031] Mutageneza mesta zasićenja u i pored CDR-a dva anti-TFPI roditeljskah antitela, ovde označena kao 2A8 i 4B7, korišćena je za optimizaciju antitela za afinitet i funkcionalnu aktivnost. Takođe je pretpostavljeno da se ista optimizacija može izvesti na bilo kom od antitela opisanih u prethodnom PCT/US2009/052702.

[0032] U nekim otelotvorenjima mutageneza mesta zasićenja CDR-a mogu se izvršiti na anti-TFPI antitelima. Za 2A8, CDR-e u teškom lancu prikazanom u SEQ ID NO: 1 odgovaraju ostacima FTFRSYGMS (ostaci 27 do 35), SIRGSSSSTYYADSVKG (ostaci od 50 do 66) i

1

KYRYWFDY (ostaci od 99 do 106). Za laki lanac 2A8 prikazan u SEQ ID NO: 2, CDR-e odgovaraju ostacima SGDNLRNYYAH (ostaci 23 do 33), YYDNNRPS (ostaci od 48 do 55) i QSWDDGVPV (ostaci od 88 do 96). Za 4B7, CDR-e u teškom lancu prikazan0m u SEQ ID NO: 3 odgovaraju ostacima DSVSSNSAAWS (ostaci 27 do 37), IIYKRSKWYNDYAVSVX (ostaci od 52 do 70) i WHSDKHWGFDY (ostaci 102 do 112). Za laki lanac 4B7 prikazan u SEQ ID NO: 4, CDR-e odgovaraju ostacima RSSQSLVFSDGNTYLN (ostaci od 24 do 39), KGSNRAS (ostaci 55 do 61) i QQYDSYPLT (ostaci 94 do 102) SEQ ID NO: 4.

Modifikacija može biti izvedena u bilo kojoj od šest CDR-a pojedinačno ili se mogu izvršiti kombinacije modifikacija. Dalje, dve ili više modifikacija mogu biti napravljene u jednoj CDR-i. U drugim otelotvorenjima, modifikacije se takođe mogu uvesti u neposrednoj blizini CDR-a, na primer oko 3 ili 4 ostatka sa obe strane svake CDR-e.

[0033] Ukratko, pojedinačne i/ili višestruke modifikacije aminokiselina su uvedene i analizirane kako bi optimizovale, npr. poboljšale afinitet, roditeljskih antitela 2A8 i 4B7. Prvo, pojedinačne aminokiselinske modifikacije su uvedene u šest CDR-a ili blizu CDR-a svakog antitela, nakon čega sledi analiza TFPI-vezujućih svojstava. Izmene koje su povećale vezujući signal za TFPI odabrane su za kombinaciju sa jednom ili više drugih modifikacija i analizirane za dalje povećanje signala vezivanja. Nakon svake analize, odabrane varijante antitela korišćene su za merenje njihovog afiniteta prema TFPI i aktivnosti u blokiranju TFPI aktivnosti i skraćivanje vremena zgrušavanja. Prema tome, u nekim otelotvorenjima pruženo je izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva koji ima povećan afinitet prema TFPI u poređenju sa neizmenjenim roditeljskim antitelima. Osim toga, u nekim otelotvorenjima pruženo je izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva koji ima povećanu aktivnost blokiranja TFPI u poređenju sa neizmenjenim roditeljskim antitelima. U nekim otelotvorenjima pruženo je izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva koji ima skraćeno vreme zgrušavanja u poređenju sa neizmenjenim roditeljskim antitelima.

[0034] U nekim otelotvorenjima, uvedene su dodatne modifikacije aminokiselina kako bi se smanjilo odstupanje od germline sekvence. U drugim otelotvorenjima, uvedene su modifikacije aminokiselina kako bi se olakšala proizvodnja antitela u velikim proizvodnim procesima.

[0035] Antitelo može biti specifično za vrstu ili može reagovati sa više vrsta. U nekim otelotvorenjima, antitelo može posebno reagovati ili reagovati sa TFPI čoveka, miša, pacova, zeca, zamorca, majmuna, svinje, psa, mačke ili drugih vrsta sisara.

[0036] Antitelo može biti bilo koji od različitih klasa antitela, kao što su, bez ograničavanja na, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, sekretorno IgA, IgD, i IgE antitela.

[0037] U jednoj realizaciji, pruženo je izolovano potpuno ljudsko monoklonsko antitelo za ljudski inhibitor puta faktora tkiva.

[0038] U drugom otelotvorenju, pruženo je izolovano potpuno ljudsko monoklonsko antitelo za Kunicov domen 2 ljudskog inhibitora puta faktora tkiva.

2A8 Varijante

[0039] Prema tome, ovde je opisano izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva, pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, pri čemu navedena aminokiselinska sekvenca obuhvata jednu ili više aminokiselinskih modifikacija. U nekim otelotvorenjima modifikacija teškog lanca 2A8 je zamena, umetanje ili brisanje.

[0040] U nekim otelotvorenjima supstitucije se nalaze u CDR-i teškog lanca 2A8. U drugim otelotvorenjima supstitucije se nalaze van CDR-i teškog lanca 2A8.

[0041] U nekim opisanim otelotvorenjima ili varijantama, supstitucija teškog lanca 2A8 je na položaju odabranom od S31, G33, S35, I51, S54, S55, K99 i F104 U nekim opisanim otelotvorenjima ili varijantama, supstitucija teškog lanca 2A8 može takođe da uključuje položaj izabran od Q1, R30, M34, S50, R52 i S56. Na primer, supstitucija može biti izabrana od Q1E, R30S, S31P, S31V, G33A, G33K, G33P, M34I, M34K, S35L, S35D, S50A, I51D, I51E, R52S, S54F, S54D, S55A, S55G, S55R, S56G, K99V, K99L, i F104Y. Dalje, u nekim opisanim otelotvorenjima ili varijantama, antitelo može da obuhvata dve ili više supstitucije izabrane od Q1E, R30S, S31P, S31V, G33A, G33K, G33P, M34I, M34K,S35L, S35D, S50A, I51D, I51E, R52S, S54F, S54D, S55A, S55G, S55R, S56G, K99V, K99L, i F104Y.

[0042] U nekim opisanim varijantama, teški lanac 2A8 ima naredne supstitucije relativne u odnosu na SEQ ID NO :1: S31V+I51D+S54F+K99V; G33P+S35D+S54F+K99L; S35D+I51D+S55R+K99V; S35L+S54F+K99V; S31V+G33P+S35D; S35D+I51D+K99L; S31V+I51D+S55R+K99L; S31V+S35D+I51D+K99V; G33P+I51D+S54F; i51D+S54F+K99L; S35D+K99L; S31V+G33P+I51D+S54F+K99V;

S35D+I51E+S55R+K99L; S31V+K99V; S31V+I51E+S55R+K99V; S35D+S55R+K99L; S31V+S54F+K99L; S31V+I51D+S55R+K99V; S31V+S35D+S55R; S31V+S35D;

S31V+I51D+S55R; S35D+S54F+S55R+K99L; S31V+S35D+S54F S31V+S35L+I51D+S54F+K99V; i S31V+S35L+I51E+S54F+K99V.

[0043] U nekim opisanim varijantama, teški lanac 2A8 ima naredne supstitucije relativne u odnosu na SEQ ID NO:1: G33A+S35D+S55R+K99L; G33P+I51D+S54F;

G33P+S35D+S54F+K99L; i51D+S54F+K99L; M34I+S35D+S55R+K99L;

M34K+S35D+S55R+K99L; Q1E+R30S+S35D+S55G+S56G+K99L;

Q1E+R30S+S35D+S55R+S56G+K99L; Q1E+S31V S50A+I51D+S55R+S56G+K99V; Q1E+S35D+S55R+K99L; R30S+S31V+I51D+S55R+K99V; R30S+S35D+S55R+K99L; S31V+G33A+I51D+S55R+K99V; S31V+G33P+I51D+S54F+K99V; S31V+G33P+S35D; S31V+I51D+R52S+S55R+K99V; S31V+I51D+S54F+K99V; S31V+I51D+S55R;

S31V+I51D+S55R+K99L; S31V+I51D+S55R+K99V; S31V+I51D+S55R+S56G+K99V; S31V+I51E+S55R+K99V; S31V+K99V; S31V+S35D; S31V+S35D+I51D+K99V;

S31V+S35D+S54F; S31V+S35D+S55R; S31V+S35L+I51D+S54F+K99V;

S31V+S35L+I51E+S54F+K99V; S31V+S50A+I51D+S55R+K99V; S31V+S54F+K99L; S35D+I51D+K99L; S35D+I51D+S55R+K99V; S35D+I51E+S55R+K99L; S35D+K99L; S35D+R52S+K99L; S35D+R52S+S55R+K99L; S35D+S50A+K99L;

S35D+S50A+S55R+K99L; S35D+S54F+S55R+K99L; S35D+S55G+K99L;

S35D+S55R+K99L; S35D+S55R+S56G+K99L; S35D+S56G+K99L; i S35L+S54F+K99V.

[0044] U nekim otelotvorenjima, teški lanac 2A8 ima jedno ili više brisanja. U nekim varijantama, brisanja se nalaze u CDR-i teškog lanca 2A8. U nekim otelotvorenjima, brisanja su locirana izvan CDR-e teškog lanca 2A8. U nekim opisanim otelotvorenjima ili varijantama, na primer, brisanje je na položaju izabranom od I51, S56 i S57.

[0045] Ovde je opisano izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, pri čemu navedena aminokiselinska sekvenca sadrži jednu ili

1

više aminokiselinsku modifikaciju. U nekim otelotvorenjima, modifikacija je supstitucija, umetanje ili brisanje,

[0046] U nekim otelotvorenjima supstitucije se nalaze u CDR-i lakog lanca 2A8. U drugim otelotvorenjima supstitucije se nalaze van CDR-i lakog lanca 2A8.

[0047] U nekim opisanim otelotvorenjima ili varijantama, supstitucija lakog lanca 2A8 je na položaju odabranom od A32, Y48, N51, N52, P54, D91, D92 i V96. U nekim opisanim otelotvorenjima ili varijantama, supstitucija lakog lanca 2A8 može takođe da uključuje položaj izabran od D1, I2, A13, S21, N26, R28, N29, H33, Y49, G56, E80, S89, G93, V94 i P95. Na primer, supstitucija može biti izabrana od D1S, I2Y, A13S, S21T, N26A, R28P, N29K, A32N, H33Y, Y48F, Y49R, N51S, N51V, N52G, P54L,G56D, E80M, S89A, D91L, D91R, D91W, D91K, D92S, D92T, G93S, V94T, P95V, P95A, V96G, V96M i V96W. Dalje, u nekim opisanim otelotvorenjima ili varijantama, antitelo može da obuhvata dve ili više supstitucije izabrane od D1S, I2Y, A13S, S21T, N26A, R28P, N29K, A32N, H33Y, Y48F, Y49R, N51S, N51V, N52G, P54L, G56D, E80M, S89A, D91L, D91R, D91W, D91K, D92S, D92T, G93S, V94T, P95V, P95A, V96G, V96M i V96W.

[0048] U nekim opisanim varijantama, laki lanac 2A8 ima naredne supstitucije relativne u odnosu na SEQ ID NO:2: Y48F+N51V; Y48F+N52G; Y48F+D91K; Y48F+D91L+V96W; Y48F+D91W; Y48F+N52G+D91L+V96W; Y48F+N51V+V96W; D91L+V96W;

Y48F+N51V+D91W; Y48F+N51V+D91L+V96W; N51V+D91W;

Y48F+N51V+G56D+V96W; Y48F+N51V+D91L; i N51V+D91K.

[0049] U nekim opisanim varijantama, laki lanac 2A8 ima naredne supstitucije relativne u odnosu na SEQ ID NO:2: A13S+Y48F+N51V+D91W;

D1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+E80M+D91L+D92S+V94T+V96W;

D1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+N51S+E80M+D91L+D92S+V94T+V96W; D1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+N51V+E80M+D91W;

D1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+N51V+E80M+S89A+D91W+D92S+G93S+V 94T;

D1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+N29K+Y48F+Y49R+N51S+E80M+D91L+D92S+V94T+V9 6W; D1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+Y48F+N51V+E80M+D91W;

D1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+Y48F+N51V+E80M+S89A+D91W+D92S+G93S+V94T; D1S+Y48F+N51V+D91W; D91L+V96W; H33Y+Y48F+N51V+D91W; i2Y+Y48F+N51V+D91W; N26A+Y48F+N51V+D91W; N29K+Y48F+N51V+D91W; N51V+D91K; N51V+D91W; R28P+Y48F+N51V+D91W; S21T+Y48F+N51V+D91W; Y48F+D91K; Y48F+D91L+D92S+V96W; Y48F+D91L+G93S+V96W;

Y48F+D91L+P95V+V96W; Y48F+D91L+V94T+V96W; Y48F+D91L+V96W;

Y48F+D91W; Y48F+N51S+D91L+V96W; Y48F+N51V; Y48F+N51V+D91L;

Y48F+N51V+D91L+V96W; Y48F+N51V+D91W; Y48F+N51V+D91W+D92S;

Y48F+N51V+D91W+G93S; Y48F+N51V+D91W+P95V; Y48F+N51V+D91W+V94T; Y48F+N51V+E80M+D91W; Y48F+N51V+G56D+V96W; Y48F+N51V+S89A+D91W; Y48F+N51V+S89A+D91W+D92S+G93S+V94T+P95A; Y48F+N51V+V96W;

Y48F+N52G; Y48F+N52G+D91L+V96W; i Y48F+S89A+D91L+V96W.

[0050] Takođe je ovde opisano izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva, gde antitelo obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:1, gde navedena aminokiselinska sekvenca teškog lanca obuhvata jednu ili više aminokiselinsku modifikaciju; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:2, gde navedena aminokiselinska sekvenca lakog lanca obuhvata jednu ili više aminokiselinsku modifikaciju. Ovde su pruženi primeri modifikacija koje mogu da se urade.

[0051] U nekim otelotvorenjima izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, i 11.

[0052] U nekim otelotvorenjima izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, i 18.

[0053] U nekim ovde otelotvorenjima, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, i 11; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, i 18. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu

1

u SEQ ID NO: 5; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 12. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 6; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 13. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 7; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 14. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 15. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 9; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 16. U nekim otelotvorenjima, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 10; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 17. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 11; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 18.

4B7 varijante

[0054] Takođe je opisano ovde izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva, gde antitelo obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:3 koja obuhvata jednu ili više aminokiselinsku modifikaciju. U nekim opisanim varijantama, modifikacija teškog lanca od 4B7 je supstitucija, umetanje ili brisanje

[0055] U nekim opisanim varijantama, supstitucije se nalaze u CDR-ma teškog lanca od 4B7. U drugim opisanim varijantama, supstitucije se nalaze van CDR-a teškog lanca od 4B7.

[0056] U nekim opisanim varijantama, supstitucija teškog lanca od 4B7 je na položaju odabranom od S30, N32, S57, K58, N61, D62, H103, H107, G109 i Y112. U nekim opisanim varijantama, supstitucija teškog lanca od 4B7 može takođe da uključuje položaj izabran od

1

Q1, S37, G44, I53 i K55. Na primer, supstitucija može biti izabrana od Q1E, S30R, N32D, N32E, S33G, S37N, G44S, I53T, K55Y, S57K, S57R, K58M, N61G, N61T, D62I, D62R, D62Q, D62L, D62S, D62V, D62N, D62K, H103D, H103G, H107M, G109A i Y112D. Dalje, u nekim opisanim varijantama, antitelo može da obuhvata dve ili više supstitucije izabrane od Q1E, S30R, N32D, N32E, S33G, S37N, G44S, I53T, K55Y, S57K, S57R, K58M, N61G, N61T, D62I, D62R, D62Q, D62L, D62S, D62V, D62N, D62K, H103D, H103G, H107M, G109A i Y112D.

[0057] U nekim opisanim varijantama, teški lanac od4B7 ima naredne supstitucije relativne u odnosu na SEQ ID NO:3:

N32D+D62Q+H107M+Y112D; N32D+D62R+H103D+H107M+Y112D;

N32D+D62R+H107M+Y112D; N32D+D62R+Y112D; D62Q+Y112D; D62R+Y112D; D62R+H107M+Y112D; N32D+D62Q+Y112D; N32D+D62R+H107M;

N32D+D62S+H107M+Y112D; D62Q+H107M+Y112D; N32D+D62R+H103D;

D62S+H107M+Y112D; S30R+S57K; N61G+D62V; i K58M+D62N. U nekim varijantama, teški lanac od4B7 ima naredne supstitucije relativne u odnosu na SEQ ID NO:3:

D62Q+H107M+Y112D; D62Q+Y112D; D62R+H107M+Y112D; D62R+Y112D;

D62S+H107M+Y112D; N32D+D62K+Y112D; N32D+D62Q+H107M+Y112D;

N32D+D62Q+Y112D; N32D+D62R+H103D; N32D+D62R+H103D+H107M+Y112D; N32D+D62R+H107M; N32D+D62R+H107M+Y112D; N32D+D62R+Y112D;

N32D+D62S+H107M+Y112D; N32D+G44S+D62R+Y112D; N32D+I53T+D62Q+Y112D; N32D+I53T+D62R+Y112D; N32D+K55Y+D62Q+Y112D; N32D+K55Y+D62R+Y112D; N32D+S37N+D62R+Y112D; Q1E+N32D+D62R+Y112D;

Q1E+N32D+G44S+K55Y+D62R+Y112D; N32D+G44S+K55Y+D62R+Y112D;

S30R+S57K; N61G+D62V; i K58M+D62N.

[0058] Dalje, ovde je opisano izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva, gde antitelo obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:4 koja obuhvata jednu ili više aminokiselinsku modifikaciju. U nekim opisanim varijantama, modifikacija lakog lanca od 4B7 je izabrana od supstitucije, umetanja ili brisanja.

[0059] U nekim opisanim varijantama, supstitucije se nalaze u CDR-ma lakog lanca od 4B7. U drugim opisanim varijantama, supstitucije se nalaze van CDR-a lakog lanca od 4B7.

1

[0060] U nekim opisanim varijantama, supstitucija lakog lanca od 4B7 je na položaju odabranom od F31, S32, D33, N35, Y37, Y54, G56, S57, S61 i D97. U nekim opisanim varijantama, supstitucija lakog lanca od 4B7 može takođe da uključuje položaj izabran od M4, V30, T36, N39, L42, K44, Q50, L51, K55, A60 i S98. Na primer, supstitucija može biti izabrana od M4I, M4L, V30L, F31I, F31M, F31Y, F31H, S32L, S32R, S32Y, D33F, D33R, N35I, N35L, N35T, N35V, T36N, Y37F, N39D, L42Q, K44R, Q50R, L51R, Y54F, K55L, G56D, G56A, G56V, S57Y, A60D, S61C, D97M, D97T i S98H. Dalje, u nekim opisanim varijantama, antitelo može da obuhvata dve ili više supstitucije izabrane od M4I, M4L, V30L, F31I, F31M, F31Y, S32L, S32R, S32Y, D33F, D33R, N35I, N35L, N35T, N35V, T36N, Y37F, N39D, L42Q, K44R, Q50R, Y54F, K55L, G56D, G56A, G56V, S57Y, A60D, S61C, D97M, D97T i S98H.

[0061] U nekim opisanim varijantama, laki lanac od 4B7 ima naredne supstitucije relativne u odnosu na SEQ ID NO:4: S32R+N35T; S32R+N35T+D97T; S32R+D33F+N35I;

S32R+D33F+N35I+D97T; S32R+D33F+N35T; S32R+D33F; S32R+D33R+N35I;

S32R+D33R+N35I+D97T; S32R+D33R; S32R+D33R+N35T; N35T+D97T; D33F+N35I; D33F+N35I+D97T; D33F+N35T+Y37F; D33R+N35I; D33R+N35I+D97T; D33R+N35T; F31I+S32R+N35I+D97T; F31I+S32R+D33F+N35I+D97T; F31I+S32R+D33F+N35T;

F31I+S32R+D33R+N35I+D97T; F31I+N35I; F31I+D33F+N35I; F31I+D33F+N35I+D97T; F31I+D33R+N35I; F31I+D33R; F31M+S32L+D33R+N35I+D97T;

F31M+S32R+D33F+N35I; F31M+S32R+D33F+N35I+D97T; F31M+S32R+D33F+D97T; F31M+S32R+D33R+N35I; F31M+S32R+D33R+N35I+D97T; F31M+S32R+D33R;

F31M+S32R+D33R+N35T; F31M+D33F+N35I; F31M+D33F; F31M+D33F+N35T;

F31M+D33R+N35I; F31M+D33R; S32R+N35I; F31M+D33F+N35T+Y37F; N35V+G56D; N35L+G56A; i D33F+Y54F.

[0062] U nekim opisanim varijantama, laki lanac od 4B7 ima naredne supstitucije relativne u odnosu na SEQ ID NO:4: D33F+N35I; D33F+N35I+D97T; D33F+N35T+Y37F;

D33R+N35I; D33R+N35I+D97T; D33R+N35T; F31H+S32R+D33F+N35I+D97T;

F31I+D33F+N35I; F31I+D33F+N35I+D97T; F31I+D33F+N35I+K44R;

F31I+D33F+N35I+L42Q; F31I+D33F+N35I+S98H; F31I+D33F+N35I+T36N; F31I+D33R; F31I+D33R+N35I; F31I+N35I; F31I+S32R+D33F+N35I+D97T; F31I+S32R+D33F+N35T; F31I+S32R+D33R+N35I+D97T; F31I+S32R+N35I+D97T; F31M+D33F;

1

F31M+D33F+N35I; F31M+D33F+N35T; F31M+D33F+N35T+Y37F; F31M+D33R;

F31M+D33R+N35I; F31M+S32L+D33R+N35I+D97T; F31M+S32R+D33F+D97T;

F31M+S32R+D33F+N35I; F31M+S32R+D33F+N35I+D97T; F31M+S32R+D33R;

F31M+S32R+D33R+N35I; F31M+S32R+D33R+N35I+D97T; F31M+S32R+D33R+N35T; F31Y+S32R+D33F+N35I+D97T; M4I+S32R+D33F+N35I+D97T;

M4L+S32R+D33F+N35I+D97T; N35T+D97T; S32R+D33F; S32R+D33F+N35I;

S32R+D33F+N35I+A60D+D97T; S32R+D33F+N35I+D97T;

S32R+D33F+N35I+D97T+S98H; S32R+D33F+N35I+G56V+D97T;

S32R+D33F+N35I+K44R+D97T; S32R+D33F+N35I+K55L+D97T;

S32R+D33F+N35I+L42Q+D97T; S32R+D33F+N35I+L51R+D97T;

S32R+D33F+N35I+N39D+D97T; S32R+D33F+N35I+Q50R+D97T;

S32R+D33F+N35I+T36N+D97T; S32R+D33F+N35T; S32R+D33R; S32R+D33R+N35I; S32R+D33R+N35I+D97T; S32R+D33R+N35T; S32R+N35I; S32R+N35T;

S32R+N35T+D97T; V30L+F31I+D33F+N35I; V30L+S32R+D33F+N35I+D97T;

V30L+S32R+D33F+N35I+T36N+D97T; V30L+S32R+N35I+T36N; N35V+G56D;

N35L+G56A; i D33F+Y54F.

[0063] Takođe je opisano izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva, gde antitelo obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:3, gde navedena aminokiselinska sekvenca teškog lanca obuhvata jednu ili više aminokiselinsku modifikaciju; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:4, gde navedena aminokiselinska sekvenca lakog lanca obuhvata jednu ili više aminokiselinsku modifikaciju. Primeri modifikacija koje mogu da se urade su pruženi ovde.

[0064] U nekim opisanim varijantama izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 i 26.

[0065] U nekim opisanim varijantama izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 i 34.

1

[0066] U nekim ovde opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 i 26; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 i 34. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 19; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 27. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 20; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 28. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 21; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 29. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 22; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 30. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 23; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 31. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 24; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 32. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 25; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 33. U nekim opisanim varijantama, izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva obuhvata: a) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 26; i b) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 34.

Kombinacije 2A8/4B7 varijanti

[0067] Takođe je posmatrano izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva može sadržati kombinacije teških i lakih lanaca 2A8 i 4B7.

2

[0068] Shodno tome, opisano je izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva, pri čemu antitelo sadrži: a) teški lanac 2A8 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, pri čemu navedena aminokiselinska sekvenca teškog lanca sadrži jednu ili više aminokiselinsku modifikaciju; i b) laki lanac 4B7 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4, pri čemu pomenuta aminokiselinska sekvenca lakog lanca sadrži jednu ili više modifikacija aminokiselina.

Primeri modifikacija koji se mogu napraviti su navedeni gore.

[0069] Takođe je opisano izolovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva, gde antitelo sadrži: a) teški lanac 4B7 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 3, pri čemu navedena aminokiselinska sekvenca teškog lanca sadrži jednu ili više aminokiselinsku modifikaciju; i b) laki lanac 2A8 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, pri čemu navedena aminokiselinska sekvenca teškog lanca sadrži jednu ili više aminokiselinsku modifikaciju. Primeri modifikacija koji se mogu napraviti su navedeni gore.

[0070] U nekim otelotvorenjima pruženo je monoklonsko antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva, gde antitelo sadrži: a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 i 26; i b) laki lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 i 34.

Nukleinske kiseline, vektori i ćelije domaćini

[0071] Takođe su pruženi izolovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koje od monoklonskih antitela opisanih gore.

[0072] Prema tome, opisan je izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva, gde antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, gde pomenuta aminokiselinska sekvenca teškog lanca sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija. Primeri takvih modifikacija su opisani iznad.

[0073] Takođe je opisan izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva, gde antitelo sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, pri čemu pomenuta aminokiselinska sekvenca lakog lanca sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija. Primeri takvih modifikacija su opisani iznad.

[0074] Takođe je pružen izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva, pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 3, pri čemu navedena aminokiselinska sekvenca teškog lanca sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija. Primeri takvih modifikacija su opisani iznad.

[0075] Takođe je pružen izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo koje se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4, pri čemu pomenuta aminokiselinska sekvenca lakog lanca sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija. Primeri takvih modifikacija su opisani iznad.

[0076] Pored toga, takođe su pruženi vektori koji sadrže molekule izolovanih nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koje od monoklonskih antitela opisanih iznad i ćelije domaćini koje sadrže takve vektore.

Metode pripreme antitela na TFPI

[0077] Monoklonsko antitelo može se dobiti rekombinantno eksprimiranjem nukleotidne sekvence koja kodira varijabilne regije monoklonskog antitela u skladu sa otelotvorenjima pronalaska u ćeliji domaćinu. Uz pomoć vektora eksprimiranja, nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu može se transfektovati i eksprimirati u ćeliji domaćinu pogodnoj za proizvodnju. Shodno tome, takođe je pružen postupak za proizvodnju monoklonskog antitela koji se vezuje sa ljudskim TFPI koji sadrži:

(a) transfekciju molekula nukleinske kiseline koji kodira monoklonsko antitelo pronalaska u ćeliju domaćinu,

(b) kultivisanje ćelije domaćina tako da se eksprimira monoklonsko antitelo u ćeliji domaćinu, i opciono

(c) izolovanje i pročišćavanje proizvedenog monoklonskog antitela, pri čemu molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira monoklonsko antitelo iz ovog pronalaska.

[0078] U jednom primeru, kako bi se eksprimirala antitela ili fragmenti antitela, DNK koje kodiraju delimične ili pune lake i teške lance, dobijene standardnim molekularnim biološkim tehnikama, umetnute su u vektore eksprimiranja tako da su geni operativno povezani sa transkripcijskim i translacionim kontrolnim sekvencama. U tom kontekstu, izraz „operativno povezani“ namerava označi da je gen antitela ligiran u vektor tako da transkripcijske i translacione kontrolne sekvence unutar vektora služe svojoj nameravanoj funkciji regulisanja transkripcije i translacije gena antitela. Vektori eksprimiranja i sekvence kontrole eksprimiranja su izabrani da budu kompatibilni sa korišćenom ćelijom domaćina eksprimiranja. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu se ubaciti u odvojene vektore ili, obično, oba gena se ubacuju u isti vektor eksprimiranja. Geni antitela ubacuju se u vektor eksprimiranja standardnim postupcima (npr., ligiranje komplementarnih mesta restrikcije na fragment gena i vektora antitela, ili tanka završna ligacija ukoliko nema prisutnih mesta za ograničenje). Varijabilne regije lakog i teškog lanca antitela opisanih ovde mogu se koristiti za stvaranje gena antitela pune dužine kog izotipa antitela ubacivanjem u vektore eksprimiranja koji već kodiraju konstantne regije lakog lanca i konstantne regije teškog lanca željenog izotopa tako da VHsegment je operativno povezan sa CHsegmentom unutar vektora, i VLsegment je operativno povezan sa CLsegmentom unutar vektora.

Dodatno ili alternativno, rekombinantni vektor eksprimiranja može kodirati signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Geni lanca antitela mogu biti klonirani u vektor tako da je signalni peptid povezan u okviru sa amino terminusom gena lanca antitela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni signalni peptid (tj. signalni peptid iz ne-imunoglobulinskog proteina).

[0079] Osim gena koji kodiraju lanac antitela, rekombinantni vektori eksprimiranja pronalaska nose regulatorne sekvence koje kontrolišu eksprimiranje gena lanca antitela u ćeliji domaćinu. Izraz „regulatorna sekvenca“ ima za cilj da obuhvati promotere, poboljšavače i druge elemente kontrole eksprimiranja (npr., signale poliadenilacije) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanca antitela. Takve regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Stručnjaci u ovoj oblasti će ceniti da dizajn

2

vektora eksprimiranja, uključujući i izbor regulatornih sekvenci, može zavisiti od faktora kao što su izbor ćelije domaćina za transformaciju, nivo eksprimiranja željenog proteina itd.

Primeri regulatornih sekvenci za eksprimiranje ćelija domaćina sisara uključuju virusne elemente koji usmeravaju visoke nivoe eksprimiranja proteina u ćelijama sisara, kao što su promoteri i/ili poboljšavači dobijeni iz citomegalovirusa (CMV), Simian Virusa 40 (SV40), adenovirusa, (npr. adenovirus veliki kasni promoter (AdMLP)) i polioma. Alternativno, mogu se koristiti ne-viralne regulatorne sekvence, kao što su promoter ubikvitina ili promoter ßglobina.

[0080] Pored gena lanca antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni vektori eksprimiranja mogu nositi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćinima (npr., poreklo replikacije) i selektabilne markerske gene. Selektabilni markerski gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je vektor uveden (pogledati, npr., U.S. Pat. Nos.4,399,216, 4,634,665 and 5,179,017, all by Axel et al.). Na primer, tipičan selektabilni markerski gen daje otpor prema lekovima, kao što je G418, higromicin ili metotreksat, ćeliji domaćinu u koju je vektor uveden. Primeri selektabilnih markerskih gena uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za upotrebu u dhfr-ćelijama domaćinima sa selekcijom/amplifikacijom metotreksata) i neo gen (za selekciju G418).

[0081] Za eksprimiranje lakih i teških lanaca, vektor eksprimiranja koji kodira teške i lake lance transfektuje se u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Razni oblici izraza „transfekcija“ imaju za cilj da obuhvate širok spektar tehnika koje se obično koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr. elektroporacija, precipitacija kalcijum-fosfata, DEAE-dekstran transfekcija i slično. Iako je teoretski moguće eksprimirati antitela pronalaska u ili prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina, eksprimiranje antitela u eukariotskim ćelijama i najpoželjnije sisarskim ćelijama domaćinima, je najpoželjnija jer su takve eukariotske ćelije, a naročito ćelije sisara, verovatnije od prokariotskih ćelija da sakupe i luče ispravno savijeno i imunološki aktivno antitelo.

[0082] Primeri sisarskih ćelija domaćina za eksprimiranje rekombinantnih antitela uključuju jajne ćelije kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr-CHO ćelije, opisane kod Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, koje se koriste sa DHFR selektabilnim markerom, npr. Kao što je opisano u R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol.159:601-621), NSO ćelijama mieloma, COS ćelijama, HKB11 ćelijama i SP2 ćelijama. Kada se rekombinantni vektori eksprimiranja koji kodiraju gene antitela uvedu u sisarske ćelije domaćine, antitela se proizvede kultivacijom ćelija domaćina u vremenskom periodu koji je dovoljan da omogući eksprimiranje antitela u ćelijama domaćina ili lučenje antitela u medijumu za kulturu u kom gajene ćelije raste. Antitela se mogu dobiti iz medijuma za kulturu koristeći standardne postupke pročišćavanja proteina, kao što su ultrafiltracija, hromatografija isključivanja veličine, hromatografija jonske razmene i centrifugiranje.

Korišćenje sekvenci delimičnih antitela za eksprimiranje netaknutih antitela

[0083] Antitela međusobno interakuju sa ciljanim antigenom pretežno putem aminokiselinskih ostataka koji se nalaze u šest CDR-a teškog i lakog lanca. Iz tog razloga, sekvence aminokiselina unutar CDR-a su više raznolike između pojedinačnih antitela od sekvenci izvan CDR-a. Pošto su CDR sekvence odgovorne za većinu antitelo-antigen interakcija, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja imitiraju osobine specifičnih prirodnih antitela stvaranjem vektora eksprimiranja koji uključuju CDR sekvence od specifičnih prirodno nastalih antitela graftovanih na okvirne sekvence iz različitih antitela sa različitim svojstvima (pogledati npr. Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525; and Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

86:10029-10033). Ovakve okvirne sekvence mogu se dobiti iz javnih baza podataka DNK koje uključuju genske sekvence germline antitela. Ove germline sekvence će se razlikovati od sekvenci gena zrelog antitela, jer neće uključivati potpuno složene varijabilne gene, koji se formiraju time što se V(D)J udružuju tokom sazrevanja B ćelija. Nije neophodno da se dobije celokupna DNK sekvenca određenog antitela kako bi se rekonstruisalo netaknuto rekombinantno antitelo koje ima vezujuća svojstva slična onima iz originalnog antitela (vidi WO 99/45962). Delimična sekvenca teškog i lakog lanca koja obuhvata CDR regije je obično dovoljna za ovu svrhu. Delimična sekvenca se koristi da bi se odredilo koji germline varijabilni genski segment i povezujući genski segmenti doprinose rekombinovanim varijabilnim genima antitela. Sekvenca za germinalnu liniju se zatim koristi za popunjavanje nedostajućih delova varijabilnih regija. Lider sekvence teškog i lakog lanca cepaju tokom sazrevanja proteina i ne doprinose osobinama konačnog antitela. Iz tog razloga, neophodno je koristiti odgovarajuću lider sekvencu za konstrukciju eksprimiranja. Da bi dodali nedostajuće sekvence, klonirane cDNK sekvence mogu se kombinovati sa sintetičkim oligonukleotidima pomoću ligacije ili PCR amplifikacije. Alternativno, čitava varijabilna regija se može sintetisati kao skup kratkih, preklapajućih, oligonukleotida i kombinovati pomoću PCR amplifikacije kako bi se stvorio potpuno sintetički klon varijabine regije. Ovaj proces ima

2

određene prednosti kao što su eliminacija ili uključivanje ili određena mesta ograničenja ili optimizacija određenih kodona.

[0084] Nukleotidne sekvence transkripata teškog i lakog lanca koriste se za dizajniranje seta preklapanja sintetičkih oligonukleotida da bi se stvorile sintetičke V sekvence sa identičnim kapacitetima kodiranja aminokiselina kao prirodne sekvence. Sintetičke sekvence teškog i lakog lanca mogu se razlikovati od prirodnih sekvenci. Na primer: nizovi ponovljenih nukleotidnih baza su prekinuti da bi se olakšala sinteza oligonukleotida i PCR amplifikacija; optimalna mesta inicijacije translacije su inkorporirana prema Kozakovim pravilima (Kozak, 1991, J. Biol. Chem.266:19867-19870); i mesta restrikcije su projektovana uzvodno ili nizvodno od mesta inicijacije translacije.

[0085] Za varijabilne regije teškog i lakog lanca, optimizovane kodirajuće i odgovarajuće nekodirajuće linije sekvenci su podeljene na 30-50 nukleotidnih sekcija na otprilike središtu odgovarajućeg ne-kodirajućeg oligonukleotida. Prema tome, za svaki lanac, oligonukleotidi se mogu sastaviti u preklapajuće dvostruke setove koji obuhvataju segmente od 150-400 nukleotida. Zatim se grupe koriste kao šabloni za proizvodnju PCR amplifikacionih proizvoda od 150-400 nukleotida. Tipično, jedan set varijabilne regije oligonukleotida će se razvrstati u dve grupe koje se zasebno pojačavaju da generišu dva PCR proizvoda koji se preklapaju. Ovi proizvodi koji se preklapaju zatim se kombinuju pomoću PCR amplifikacije kako bi se formirala potpuna varijabilna regija. Takođe je poželjno uključiti preklapajući fragment konstantne regije teškog ili lakog lanca u PCR amplifikaciju kako bi se generisali fragmenti koji se lako mogu klonirati u konstrukcije vektora eksprimiranja.

[0086] Rekonstruisane varijabilne regije teškog i lakog lanca se zatim kombinuju sa kloniranim promoterom, inicijacijom translacije, konstantnom regijom, 3' netranslatiranim, poliadenilacijom i sekvencama završetka transkripcije kako bi se formirali konstrukti vektora eksprimiranja. Konstrukti eksprimiranja teškog i laganog lanca mogu se kombinovati u jedan vektor, ko-transfektovati, serijski transfektovati ili se odvojeno transfektovati u ćelije domaćina koje se onda spoje kako bi formirale ćeliju domaćina koja eksprimira oba lanca.

[0087] Tako, u drugom aspektu, strukturne osobine ljudskog anti-TFPI antitela koriste se za stvaranje strukturno povezanih ljudskih anti-TFPI antitela koja zadržavaju funkciju vezivanja za TFPI. Preciznije, jedna ili više CDR specifično identifikovanih regija teškog i lakog lanca

2

monoklonskih antitela iz ovog pronalaska mogu se kombinovati rekombinantno sa poznatim ljudskim okvirom i CDR-ama radi stvaranja dodatnih, rekombinantno projektovanih, ljudskih anti-TFPI antitela prema pronalasku.

Farmaceutski sastavi

[0088] Takođe su pruženi farmaceutski sastavi koji sadrže terapeutski efikasne količine anti-TFPI monoklonskih antitela i farmaceutski prihvatljivog nosača. „Farmaceutski prihvatljiv nosač“ je supstanca koja se može dodati aktivnom sastojku da bi se pomoglo formulisanju ili stabilizaciji preparata i ne izaziva značajne štetne toksikološke efekte pacijentu. Primeri takvih nosača su dobro poznati stručnjacima i uključuju vodu, šećere poput maltoze ili saharoze, albumin, soli kao što je natrijum hlorid itd. Drugi nosači su opisani na primer u Remington's Pharmaceutical Sciences od E. W. Martin Takvi sastavi sadrže terapeutski efikasnu količinu najmanje jednog anti-TFPI monoklonskog antitela.

[0089] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne pudere za vanredno pripremanje sterilnih injektibilnih rastvora ili disperzije.

Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u struci. Sastav je poželjno formulisan za parenteralnu injekciju. Sastav se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosilac može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilenglikol i slično) i odgovarajuće njiove smeše. U nekim slučajevima, to će uključivati izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol ili natrijum-hlorid u sastavu.

[0090] Sterilni injektibilni rastvori mogu biti pripremljeni inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u potrebnu količinu u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih gore, po potrebi, a zatim mikrofiltracijom sterilizacije. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koje sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektibilnih rastvora, neki postupci pripreme su vakuumsko sušenje i liofilizacija, što daje prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz ranije sterilnog filtriranog rastvora.

Farmaceutska upotreba

2

[0091] Monoklonsko antitelo može se koristiti u terapeutske svrhe za lečenje genetskih i stečenih nedostataka ili defekata u koagulaciji. Na primer, monoklonska antitela u gore opisanim otelotvorenjima mogu se koristiti za blokiranje interakcije TFPI sa FXa ili za sprečavanje TFPI-zavisne inhibicije aktivnosti TF/FVIIa. Pored toga, monoklonsko antitelo se takođe može koristiti za obnavljanje TF/FVIIa generisanja FXa kako bi se zaobišla insuficijencija FVIII ili FIX-zavisna amplifikacija FXa.

[0092] Monoklonska antitela imaju terapeutsku primenu u lečenju poremećaja hemostaze, kao što su trombocitopenija, poremećaji trombocita i poremećaji krvarenja (npr., hemofilija A, hemofilija B i hemoflija C). Ovi poremećaji mogu se tretirati davanjem terapeutski efikasne količine anti-TFPI monoklonskog antitela pacijentu kom je to potrebno.

Monoklonska antitela takođe imaju terapeutsku primenu u lečenju nekontrolisanih krvarenja u indikacijama kao što su trauma i hemoragični moždani udar. Tako je takođe pružen postupak za skraćivanje vremena krvarenja koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine anti-TFPI monoklonskog antitela prema pronalasku pacijentu kom je to potrebno.

[0093] Antitela mogu da se koriste kao monoterapija ili u kombinaciji sa drugim terapijama kako bi se suočili sa hemostatskim poremećajem. Na primer, za istovremenu primenu jednog ili više antitela iz ovog pronalaska sa faktorima koagulacije kao što su faktor VIIa, faktor VIII ili faktor IX se veruje da je korisna za liječenje hemofilije. U jednom aspektu pružen je postupak za lečenje genetskih i stečenih nedostataka ili defekata u koagulaciji koji obuhvata davanje (a) prve količine monoklonskog antitela koji se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva i (b) druge količine faktora VIII ili faktora IX, gde su pomenuta prva i druga količina zajedno efikasne za lečenje pomenutih nedostataka ili defekata. U još jednom otelotvorenju, pružen je postupak za lečenje genetskih i stečenih nedostataka ili defekata u koagulaciji koji obuhvata primenu (a) prve količine monoklonskog antitela koji se vezuje za ljudski inhibitor puta faktora tkiva i (b) druge količinu faktora VIII ili faktora IX, gde su pomenuta prva i druga količina zajedno su efikasne za lečenje pomenutih nedostataka ili defekata, i dalje, pri čemu faktor VII nije primenjivan zajedno sa njima. Pronalazak takođe uključuje farmaceutski sastav koji sadrži terapeutski efikasnu količinu kombinacije monoklonskog antitela prema pronalasku i faktora VIII ili faktora IX, pri čemu sastav ne sadrži faktor VII. „Faktor VII“ uključuje faktor VII i faktor VIIa. Ove kombinovane terapije će verovatno smanjiti potrebnu količinu infuzije faktora koagulacije. Istovremena primena ili kombinovana terapija podrazumeva primenu dva terapijska leka gde je svaki formulisan

2

odvojeno ili su formulisani zajedno u jednom sastavu i, kada se formulišu odvojeno, primenjuju se ili približno u isto vrijeme ili u različito vreme, ali tokom istog terapijskog perioda.

[0094] U nekim otelotvorenjima, jedno ili više antitela opisanih ovde mogu se koristiti u kombinaciji radi reagovanja na hemostatički poremećaj. Na primer, istovremena primena dva ili više antitela opisanih ovde za korišćenje u tretmanu hemofilije ili drugih hemostatskih poremećaja.

[0095] Farmaceutske sastave mogu biti parenteralno davane pacijentima koji pate od hemofilije A ili B u dozama i učestalostima koje mogu da variraju sa ozbiljnošću epizoda krvarenja ili, u slučaju profilaktičke terapije, mogu da variraju sa težinom pacijentovog nedostatka zgrušavanja.

[0096] Sastavi se mogu primenjivati pacijentima kojima je potrebna bolus ili kontinuirana infuzija. Na primer, bolus primena antitela pronalaska prisutna kao fragment Fab može biti u količini od 0,0025 do 100 mg/kg telesne težine, 0,025 do 0,25 mg/kg, 0,010 do 0,10 mg/kg ili 0,10-0,50 mg/kg. Za kontinuiranu infuziju, inventivno antitelo prisutno u obliku Fab fragmenta može se davati od 0,001 do 100 mg/kg telesne težine/minut, 0,0125 do 1,25 mg/kg/min, 0,010 do 0,75 mg/kg/min, 0,010 do 1,0 mg/kg/min. ili 0,10-0,50 mg/kg/min tokom perioda 1-24 sata, 1-12 sati, 2-12 sati, 6-12 sati, 2-8 sati ili 1-2 sata. Za primenu antitela pronalaska prisutnog kao antitelo u punoj dužini (sa punim konstantnim regijama), količine doze mogu biti oko 1-10 mg/kg telesne težine, 2-8 mg/kg ili 5-6 mg/kg. Takva antitela pune dužine se obično primenjuju infuzijom koja se produžava u periodu od trideset minuta do tri sata. Učestalost primene zavisiće od težine stanja. Frekvencija može biti od tri puta nedeljno do svake dve nedelje do šest meseci.

[0097] Pored toga, sastavi se mogu davati pacijentima putem potkožne injekcije. Na primer, doza od 10 do 100 mg anti-TFPI antitela može se davati pacijentima putem potkožne injekcije nedeljno, dvonedeljno ili mesečno.

[0098] kad se ovde koristi, „terapeutski efikasna količina“ označava količinu anti-TFPI monoklonskog antitela ili kombinacije takvih antitela i faktora VIII ili faktora IX koja je potrebna da bi se efektivno povećalo vreme zgrušavanja in vivo ili na drugi način izazvala

2

merljiva korist in vivo pacientu koji ima potrebu za tim. Precizna količina će zavisiti od brojnih faktora, uključujući, ali ne ograničavajući se na komponente i fizičke karakteristike terapeutskog sastava, ciljanu populaciju pacijenta, pojedinačnog pacijente i slično i lako je može odrediti stručnjak.

Primeri

Primer 1. Kloniranje, eksprimiranje i kvantifikacija nivoa eksprimiranja antitela [0099] Teški i laki lanac divljeg tipa Fab 2A8 i 4B7 koji nose c-myc-obeležje i heksa-histidin obeležje na C-terminusu teškog lanca su subklonirani u pET28a bakterijski vektor eksprimiranja (Novagen/Merck Chemicals Ltd., Nottingham, UK) i transformisani u Top10F' ćelije (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany). Alternativno, mogu se koristiti drugi bakterijski vektori eksprimiranja (npr. vektorski sistem pQE, Qiagen GmbH, Hilden, Germany) i linije (npr. DH5a, Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany). Varijante su generisane standardnom oligo-zasnovanom usmerenom mutagenezom i potvrđene sekvenciranjem DNK. Konkretno, ostaci aminokiselina unutar ili okolo komplementarnih regija za određivanje su modifikovani unutar teškog i/ili lakog lanca.

[0100] Kako bi bili u mogućnosti da koriste divlja ili mutirana antitela kao konkurenti, epitopska obeležja locirana na C-terminusu teškog lanca su ili uklonjena ili zamenjena pomoću standardnih tehnika zasnovanih na PCR-u. Konkretno, za 4B7 c-myc-obeležje je zamenjeno za hemataglutinin (HA) epitopsko obeležje za sve varijante koje su analizirane. Za razliku od toga, divlji tip 4B7 ili varijante koji se koriste kao konkurenti nosili su c-mycobeležje. U slučaju 2A8, c-myc-epitop obeležje je ili zamenjeno sa HA-obeležjem ili izbrisano, što rezultuje varijantom koja je prikazivala samo 6x histidinsko epitopsko obeležje na svom C-terminusu.

[0101] Za eksprimiranje, varijante su transformisane u BL21starDE3 Escherichia coli liniju (Invitrogen, C6010-03), inokulirane u kulturi preko noći u LB medijumu koji sadrži kanamicin (30 µg/ml) i inkubirane na 37°C tokom 18 sati. Kultura eksprimiranja generisana je inokulacijom kultura preko noći 1:20 u svežem LB medijumu sa kanamicinom (30 µg/ml). Posle 6 sati, 1 mM izopropil-B-D-1-tiogalaktopiranozid (Roth, 2316,5) je dodat da indukuje eksprimiranje antitela i kulture su inkubirane tokom dodatnih 18 sati na 30°C. Alternativno, kulture su preko noći inokulirane 1:20 u autoindukcionom medijumu Overnight Express TB (Merck, 71491) i inkubirane na 30°C tokom 24 sata.

[0102] Za kvantifikaciju nivoa eksprimiranja korišćen je ELISA pristup. Ukratko, MTP ploče (Nunc maxisorp black, 460518) su inkubirane sa Fab-specifičnim antitelom (Sigma, I5260) razblaženim u puferu za oblaganje (Candor Bioscience GmbH, 121500) na 4°C preko noći, isprane sa PBST (fosfatni pufer: 137mM NaCl, Merck 1.06404.5000; 2.7mM KC1, Merck 1.04936.1000; 10mM Na2HPO4, Merck 1.06586.2500, 1.8mM KH2PO4, Merck 1.04871.5000; sadrži 0.05% Tween 20 Acros Organics, 233360010), blokirane sa 2% mlekom u PBST 1 sat na sobnoj temperaturi i ponovo oprane. Kulture su razblažene u 0,25% mleku sa skramom (Fluka analytical, 70166) u PBS i vezane za MTP ploče na 1h na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja sa PBST, uhvaćena antitela su inkubirana sa HRP-spojenim anti-Fab antitelom (Sigma, A0293) i detektovana inkubacijom ploča sa 10 µm amplex crvenim supstratom (Invitrogen, A12222) tokom 10 do 30 minuta na sobnoj temperaturi u mraku praćeno merenjem fluorescencije. Nivoi eksprimiranja su normalizovani nakon određivanja koncentracije u odnosu na prečišćeno antitelo divljeg tipa (2A8 ili 4B7).

Primer 2. Određivanje aktivnosti i unakrsne reaktivnosti između vrsta generisanih varijanti antitela

[0103] Da bi se odredila aktivnost mutiranih varijanti antitela na ljudski ili mišji TFPI (American Diagnostica, 4900B i R&D Systems, 2975-P1, respektivno) ravnotežni ili kompetitivni ELISA format test je korišćen. Ukratko, MTP ploče (Mesoscale Discovery, L21XA-4 ili Nunc maxisorp black, 460518) su obložene sa 0,04-2 µg/ml ljudskog ili mišjeg TFPI razblaženog u fosfatnom puferu (PBS) ili u puferu za oblaganje (Candor Bioscience GmbH, 121500), respektivno, inkubirane preko noći na 4°C. Nakon pranja, ploče su blokirane sa 3% goveđim serum albuminom (Sigma, A4503) u PBST u trajanju od 1 sata na sobnoj temperaturi, a korak pranja je ponovljen. Za vezivanje antitela 10-25 µl supernatanta za kultivaciju normalizovanih za svoje respektivne nivoe eksprimiranja antitela (ako nije drugačije naznačeno) dodati su na ploče 1 sat na RT, nakon čega se peru sa PBST. Vezane divlje vrste i varijante su tada ili detektovane od strane specifičnih antitela za epitopsko obeležavanje ili je uključen korak nadmetanja. Za nadmetanje je dodato 50-300 nM konkurentskog ili slobodnog antigena i inkubirano 20 minuta do 24 sata na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja, preostali varijante su detektovane sa specifičnim antitelom obeleženim epitopom spojenim sa peroksidazom rena (Biomol, anti-c-myc A190-105P za 2A8 varijante i anti-HA A190-108P za 4B7 varijante) ili putem anti-mic (Sigma, C3956) ili anti-HA antitelom (Sigma, H6908) koje je prethodno obeleženo sa sulfo-NHS reagensom

1

prema uputstvima proizvođača za elektrohemiluminiscentnu detekciju (Mesoscale Discovery, R91AN-1). Za detekciju signala u maxisorp pločama 10 µm amplex red supstrata (Invitrogen, A12222) je dodato i inkubirano tokom 10 do 30 minuta na sobnoj temperaturi u mraku što je praćeno merenjem fluorescencije. Za detekciju u MSD pločama MSD Read Buffer T je razblažen do 2x u H2O (Mesoscale Discovery, R92TC-1), dodat na ploče, i signal elektrohemiluminiscencije je detektovan na 620 nm koristeći Mesoscale Discovery Sector Imager 6000.

Primer 3. Pojedinačne i višestruke supstitucije aminokiselina

[0104] U Tabeli 1 je navedeno nekoliko primera pojedinačnih zamena aminokiselina uvedenih u teški ili lakši lanac 2A8. Nivo eksprimiranja varijanti analiziran je četiri puta u kvantifikacionom ELISA. Posle normalizacije na odgovarajući nivo eksprimiranja, performanse su analizirane četiri puta u kompetitivnom ELISA na ljudskom i mišjem TFPI i određene su odnosi varijante prema divljim tipu (wt). Greške su izračunate propagacijom grešaka iz standardnih devijacija.

Tabela 1. Analiza pojedinačnih aminokiselinskih supstitucija unutar 2A8.

2

[0105] U Tabeli 2 su navedeni neki primeri kombinovanih supstitucija aminokiselina u 2A8 TFPI antitelima. Iako nije svaka kombinacija data u Tabeli 2, pretpostavljeno je da TFPI antitelo može sadržati bilo koju kombinaciju predloženih modifikacija. Nivo eksprimiranja varijanti je analiziran četiri puta u kvantifikacionom ELISA. Ako nije drugačije naznačeno, varijante su normalizovane do odgovarajućeg nivoa eksprimiranja i performanse su analizirane četiri puta u konkurentnoj ELISA na ljudskom i mišjem TFPI što je praćeno izračunavanjem odnosa varijante sa referencom (HC_K99L). Vrednosti su označene sa „#“ u slučaju da su performanse varijante analizirane bez prethodne normalizacije i da su odnosi varijante i reference normalizovane na nivo eksprimiranja deljenjem signala testa sa nivoom eksprimiranja. U slučajevima gde su korišćene različite reference u kompetitivnom ELISA i gde su varijante analizirane bez prethodne normalizacije, vrednosti su označene sa „*“. Za ove varijante, vrednost navedena u tabeli je izračunata množenjem odnosa varijante/alternativne reference sa alternativnom referencom/HC_K99L. Greške su izračunate propagacijom grešaka iz standardnih devijacija. ;;;4 ; ; ; ;;; [0106] U Tabeli 3 dato je nekoliko primera pojedinačnih i/ili dvostrukih aminokiselinskih supstitucija uvedenih u teški i/ili laki lanac 4B7. Nivo eksprimiranja varijanti analiziran je četiri puta u kvantifikacionom ELISA. Nakon normalizacije do odgovarajućeg nivoa eksprimiranja, performanse su analizirane četiri puta u kompetetivnom ELISA na ljudskom TFPI i u ravnotežnom ELISA na mišjem TFPI, praćeno određivanjem odnosima varijante prema divljem tipu. Greške su izračunate propagacijom grešaka iz standardnih devijacija. ;;Tabela 3. Analiza pojedinačnih i dvostrukih aminokiselinskih supstitucija unutar 4B7. ;; ; ;;; [0107] U Tabeli 4 su navedeni neki primeri kombinacija aminokiselinskih supstitucija u okviru 4B7 TFPI antitela. Iako nije svaka kombinacija data u Tabeli 4, pretpostavljeno je da TFPI antitelo može sadržati svaku kombinaciju pruženih modifikacija. Nivo eksprimiranja varijanti je analiziran ćetiri puta u kvantifikacionom ELISA. Ako nije drugačije naznačeno, varijante su normalizovane do odgovarajućeg nivoa eksprimiranja i performanse su analizirane četiri puta u kompetetivnom ELISA na ljudskom i mišjem TFPI, a zatim je izračunat odnos varijante sa referencom (HC_D62R). U slučajevima gde su korišćene različite reference i gde su varijante analizirane bez prethodne normalizacije, vrednosti su označene sa „*“. Za ove varijante, vrednost navedena u tabeli izračunata je množenjem odnosa varijante/alternativne reference sa alternativnom referencom/HC_D62R. Greške su izračunate propagacijom grešaka iz standardnih devijacija. nb: nije utvrđeno nikakvo vezivanje u uslovima korišćenja testa.

Tabela 4. Primer višestrukih aminokiselinskih supstitucija unutar 4B7.

�

Primer 4. Pročišćavanje antitela

[0108] Ćelije se sakupljaju centrifugiranjem na 9000 rpm/min tokom 30 min na 4°C i skladište se na -20°C. Supernatant je zamenjen puferom A (50 mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10 mM imidazola pH 8,0), koncentrisan i prečišćen korišćenjem postupka prečišćavanja u dva koraka. Ukratko, 100 ml koncentrisan supernatant je postavljen na 5 ml Ni-NTA superprotočnoj koloni (Qiagen, 1018142), ispran prvo sa 5x zapremina kolone pufera A, i zatim 5x zapremine kolone 4,3% pufera B (50 mM NaH2PO4300 mM NaCI, 250 MM imidazola pH 8,0) i eluiran sa 7 zapremina pufera B. Fragmenti se kombinuju i dijalizuju u PBS. U drugom koraku prečišćavanja, pročišćena antitela Ni-NTA inkubirana su sa afinitetnom matricom specifičnom za laki lanac, tj. za hvatanje lambda ili kapa (BAC 0849.010 i BAC 0833.10, respektivno) za 2A8 i 4B7, respektivno. Nakon inkubacije na 4°C preko noći, matrica je stavljena u kolonu, isprana sa 5 zapremina PBS, 5 zapremina 500 mM arginina 100 mM NaH2PO4, 100 mM NaCl pH6.0 i ponovo 5 zapremina PBS. Antitela su eluirana sa 6 zapremina 100 mM glicina pH3,0, a zatim 3 zapremine od 100 mM glicina pH2,0 u 1/10 ukupne zapremina 1M HEPES pH 7,5 za neutralizaciju eluenata. Konačno, eluati su dijalizovani u PBS preko noći na 4°C. Prečišćena antitela analizirana su sa SDS-PAGE i masenom spektrometrijom.

Primer 5. Merenje afiniteta vezivanja antitela na TFPI uz pomoć površinske plazmonske rezonance (Biacore)

[0109] Ljudski ili mišji TFPI je imobilisan na površini za analizu. Za imobilizaciju liganda korišćeni su CM5 čipovi i komplet za uparivanje amina (GE HealthCare) u skladu sa uputstvima proizvođača. Količina imobilizovanog TFPI bila je približno 70 RU da bi se prilagodila masi antitela koja bi mogla generisati RMax od 100 RU. Parentalna i afinitetna zrela anti-TFPI antitela su bila u mobilnoj fazi. Određivanje afiniteta izvršeno je sa najmanje pet različitih koncentracija (0,1, 0,4, 1,6, 6,4 i 25 nM) prečišćenih antitela.

[0110] Analizirajući varijante antitela koji sadrže pojedine mutacije u CDR regijama, identifikovali smo mnoge klonove koji su imali veći signal u testu vezivanja Elisa. Izabrani klonovi su pročišćeni i njihov afinitet prema ljudskom ili mišjem TFPI analiziran je pomoću Biacore. Kao što je prikazano u Tabeli 5 i Tabeli 6, ovi klonovi imaju veći afinitet prema TFPI nego roditeljska antitela 2A8 ili 4B7. Iako neki od 2A8 mutanata imaju sporiju brzinu asocijacije (ka) od roditeljskog antitela 2A8, svi ovi mutanti imaju mnogo sporiju brzinu disocijacije (kd) nego 2A8. Sve u svemu, ove pojedinačne mutacije povećavaju afinitet 2A8 u opsegu od 1,47 puta do 7,22 puta na ljudskom TFPI, i 1,71 puta do 7,20 puta na mišjem TFPI. Kada smo analizirali varijante 4B7, mutacija D62R u domenu CDR2 teškog lanca značajno je povećala signal. Ovaj klon je izabran za merenje afiniteta. Kao što je prikazano u Tabeli 5 i Tabeli 6, ova pojedinačna mutacija povećava afinitet 4B7 za ljudsku TFPI od 11,1 nM do 58,2 pM, poboljšanje od 191 puta. Spora brzina disocijacije (kd) od 4B7HcD62R uglavnom doprinosi njegovom poboljšanju afiniteta, od 8,40x10<-3>/s od 4B7 do 1,65x10<-4>od 4B7HcD62R, približno poboljšanje od 50 puta. Slično tome, ova mutacija povećava afinitet 4B7 za mišji TFPI sa 58,6 nM na 427 pM, poboljšanje od 137 puta.

Tabela 5. Afinitet izabranih 2A8 ili 4B7 varijanti (jedna mutacija) na ljudski TFPI

Tabela 6. Afinitet izabranih 2A8 and 4B7 varijanti (jedna mutacija) na mišji TFPI

4

[0111] Zatim je ispitivan afinitet vezivanja višestrukih mutacija unutar 2A8 i 4B7. Kao što je prikazano u Tabeli 7(a) i Tabeli 8 (a), mutanti 2A8 koje sadrže višestruke mutacije u CDR domenima imaju veći afinitet od jedinstvenog mutiranog 2A8 na vezivanje ljudskog TFPI i mišjeg TFPI. Na primer, 2A8-200 ima 53,7 puta veći afinitet od 2A8 na ljudsko TFPI vezivanje, i 55,4 puta veći afinitet na mišje TFPI vezivanje. Kao što je prikazano u Tabeli 7(b) i Tabeli 8(b), mutanti 4B7 koji sadrže višestruke mutacije u CDR domenima imaju veći afinitet nego pojedinačni mutanti 4B7 na vezivanje ljudskog TFPI i mišjeg TFPI. Te varijante iz roditeljskih 2A8 i 4B7 sekvenci date u Tabelama 7 i 8 takođe su date u spisku sekvenci. SEQ ID NO: 5-11 odgovaraju varijantama teškog lanca 2A8 navedenim u Tabeli 7 i 8. SEQ ID NO: 12-18 odgovaraju varijantama lakog lanca 2A8. SEQ ID NOs: 19-26 odgovaraju varijantama teškog lanca 4B7 navedenim u Tabeli 7 i 8. SEQ ID NOs: 27-34 odgovaraju varijantama lakog lanca 4B7.

�

Primer 6. Antitela sa poboljšanim afinitetom pokazala su veću potenciju u obnavljanju aktivnosti FXa

[0112] Da bi se utvrdilo da li anti-TFPI antitela sa poboljšanim afinitetom takođe poboljšavaju svoju potenciju u obnavljanju FXa aktivnosti blokirajući inhibitorni efekat TFPI proteina, izvršili smo FXa test obnavljanja. U ovom testu, različita naznačena količina pojedinačnih antitela poboljšanih afiniteta (30 mL) je inkubirana sa fiksnom količinom rekombinantnog TFPI čoveka, miša ili pacova (20 mL, 6,6 nM) u ukupnoj reakcionoj mešavini od 50 µl tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, 50 µl FXa (3,39 nM) je dodato u reakcionu smešu i inkubirano na 37°C tokom 30 min. Zatim je u reakcionu smešu dodato 20 mL supstrata Spectrozyme FXa. Nakon inkubacije od 12 min, apsorbancije svake komorice je pročitana na 405 nm korišćenjem čitača ploča (Molecular Device). Za svaki eksperiment dobijena je linearna standardna kriva iste količine FXa (3,39 nM) inhibiranog poznatim količinama TFPI.100% obnovljena FXa aktivnost je definisana kao aktivnost FXa bez dodavanja bilo koje količine TFPI i 0% aktivnosti je definisana kao FXa aktivnost u prisustvu TFPI proteina (6,6 nM). Prema tome, izračunata je polovična maksimalna inhibitorna koncentracija (IC50) za svako pojedinačno anti-TFPI antitelo, od kojih su neka navedena u tabeli 9. Polu-maksimalna efektivna koncentracija (EC50) takođe je izračunata za odabrane 2A8 varijante drugog kruga i date su u Tabeli 10.

Tabela 9. IC50 i potencija poboljšanja za izabrana anti-TFPI antitela sa jednom aminokiselinskom supstitucijom koristeći FXa test obnavljanja u poređenju sa svojim roditeljskim antitelima, 2A8 i 4B7, respektivno.

4

Tabela 10. EC50 i stepen poboljšanja za izabrana anti-TFPI antitela koja imaju višestruke aminokiselinske supstitucije u poređenju sa roditeljskim 2A8.

Primer 7. Antitela sa poboljšanim afinitetom su pokazala veću potenciju za skraćenje vremena zgrušavanja u dPT testu

[0113] Da bi se potvrdilo da li ova antitela sa poboljšanim afinitetom takođe imaju poboljšan potencijal za skraćivanje vremena zgrušavanja, dPT je izveden da odredi efekat odabranih afinitetno zrelih antitela na vreme koagulacije koristeći plazmu ljudske hemofilije A. dPT test se izvršava u suštini kao što je opisano u Welsch et al. (Thrombosis Res., 1991, 64(2): 213-222). Ukratko, plazma ljudske hemofilije A (George King Biomedical) se priprema

4

mešanjem plazme sa 0,1 zapremine kontrolnog pufera (kao negativnom kontrolom) ili naznačenih anti-TFPI antitela. Nakon inkubacije 30 minuta na 25°C, svaki od pripremljenih uzoraka u plazmi (100 µL) kombinuje se sa 100 µL adekvatno razređenog (1:500 razređivanje) Simplastina (Biometieux) kao izvorom tromboplastina i 100 µL 25 mM kalcijum hlorida. Vreme zgrušavanja se određuje pomoću fibrometra STA4 (Stago) odmah nakon dodavanja kalcijum hlorida.

Primer 8. Antitela sa poboljšanim afinitetom pokazala su veću potenciju u skraćivanju vremena zgrušavanja celokupne krvi korišćenjem krvi ljudske hemofilije A krvi izazvane anti-Faktor VIII antitelom

[0114] Da bi se potvrdilo da li antitela poboljšana afinitetom pokazuju veću potentnost u skraćivanju vremena zgrušavanja, koristili smo ROTEM sistem za testiranje efekta ovih antitela na vreme zgrušavanja krvi ljudske hemofilije A izazvane FVIIII-neutrališućim antitelom, koja imitira krv pacijenta sa hemofilijom A sa inhibitorima. Sistem ROTEM (Pentapharm GmbH) obuhvata četvorokanalni instrument, računar, plazma standarde, aktivatore i šolje i zatvarače za jednokratnu upotrebu. Trombelastografski parametri ROTEM hemostaznih sistema uključuju: Vreme zgrušavanja (CT), što odražava vreme reakcije (vreme potrebno za dobijanje 2 mm amplitude nakon iniciranja sakupljanja podataka) za iniciranje krvarenja krvi; Vreme formiranja krvnog ugruška (CFT) i alfa ugao kako bi se odrazilo širenje ugrušaka, i maksimalna amplituda i maksimalni modul elastičnosti kako bi se odrazila tvrdoća tkiva. U testu ROTEM, 300 µl sveže izvučene citratne cele krvi, u kojoj je aktivnost FVIII neutralisana dodatkom poliklonskih antitela protiv FVIII, korišćeno je za testiranje efekta anti-TFPI antitela sa poboljšanim afinitetu u poređenju sa roditeljskim anti-TFPI antitelima. Sve komponente su rekonstituisane i pomešane u skladu sa uputstvima proizvođača, uz prikupljanje podataka za vremenski period potreban za svaki sistem.

Ukratko, uzorci su mešani povlačenjem/izdavanjem 300 µl krvi ili plazme sa automatizovanom pipetom u ROTEM šolje uz dodavanje 20 µl CaCl2(200 mmol), praćeno odmah mešanjem uzorka i iniciranjem prikupljanja podataka. Podaci su prikupljeni za 2 sata korišćenjem računarske kontrole (softver verzija 2.96) ROTEM sistema.

[0115] Primerni rezultat ROTEM testa za detektovanje uticaja anti-TFPI antitela sa poboljšanim afinitetom kod skraćivanja vremena zgrušavanja krvi prikazan je na Slikama 2 i 3. Slika 2 prikazuje efekat odabranog afinitetno zrelog anti-TFPI antitela na vreme zgrušavanja krvi ljudske hemofilije izazvane antitelom. Mnoga antitela sa poboljšanim

4

afinitetom, 2A8-9 i 2A8-17, pokazuju mnogo više potencije u skraćivanju vremena zgrušavanja kod krvi ljudske hemofilije A izazvane antitelom, dok je 2A8-10, čiji afinitet vezivanja za TFPI nije poboljšan, ostala na sličnoj potenciji zgrušavanja, u poređenju sa roditeljskim 2A8 antitelom.

Primer 9. Antitela sa poboljšanim afinitetom pokazuju bolju stopu preživljavanja modelu transekcije repne vene miševa sa hemofilijom A

[0116] Da bi se utvrdilo da li antitela sa poboljšanim afinitetimom imaju više potencijala u zaštitnom uticaju na krvareće miševe, korišćen je model transekcije repne vene miševa sa hemofilijom A. Miševi su dozirani kroz infuziju repne vena sa različitim naznačenim količinama roditeljskog anti-TFPI antitela 2A8 ili raznim naznačenim količinama A200, 24 sata pre povrede. Na 24 sata posle doziranja, leva vena repa 2,7 mm od vrha (u prečniku) je bila transektovana. Opstanak je primećen tokom 24 sata posle transekcije. Dokazano je da je stopa preživljavanja zavisna od doze kada se daje sa rekombinantni FVIII (10 IU/kg do 30 IU/kg).

[0117] Slika 4 pokazuje da je izabrano antitelo sa poboljšanim afinitetom značajno produžilo opstanak miševa sa hemofilijom A na način koji zavisi od doze u poređenju sa kontrolnim mišem IgG1 (CTX IgG1) i pokazalo bolju stopu preživljavanja od roditeljskog antitela 2A8 u svakoj od ekvivalentnih doza.

Primer 10. Antitela sa poboljšanim afinitetom pokazala su povećano zgrušavanje koristeći plazmu ljudske hemofilije C (FXI-deficijentna)

[0118] Dalje, ROTEM test je korišćen da bi se testirao efekat antitela na vreme zgrušavanja kod ljudske Faktor XI deficijente (FXI-deficiente) plazme, koja imitira pacijente sa hemofilijom C. Rezultat ovog ROTEM testa u otkrivanju efekta anti-TFPI antitela sa poboljšanim afinitetom na skraćivanje vremena zgrušavanja plazme je prikazan na Slici 5. Slika 5 pokazuje da je varijanta 2A8, 2A8-200, poboljšava zgrušavanje u plazme ljudske hemofilije C na način zavisan od doze, i njeni efekti su uporedivi sa rekombinantnim FVIIa.

4

1

2

4

1

2

4

Claims (2)

Patentni zahtevi

1. Ljudsko monoklonsko IgG antitelo koje se specifično vezuje za ljudski inhibitor putanje faktora tkiva, gde

a) ljudski teški lanac obuhvata SEQ ID NO: 10 i

b) ljudski laki lanac obuhvata SEQ ID NO: 17.

2. Farmaceutski sastav koji obuhvata ljudski monoklonsko IgG antitelo prema patentnom zahtevu 1.