ES3051617T3 - Method for immunosensing on a lipid layer using magnetic tunnel junctions ii - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al campo del diagnóstico. En particular, se refiere a un método para determinar un analito sospechoso de estar presente en una muestra, que comprende poner en contacto dicha muestra con un elemento sensor que comprende una capa de anclaje que está presente en un soporte sólido, un primer agente aglutinante que es capaz de unirse específicamente al analito, que está anclado en la capa de anclaje, un segundo agente aglutinante que es capaz de unirse específicamente al analito cuando se une al primer agente aglutinante y que está inmovilizado en el soporte sólido, comprendiendo dicho segundo agente aglutinante al menos una etiqueta magnética, y una unión túnel magnética en proximidad funcional al segundo agente aglutinante que genera una señal obtenida en proximidad a la al menos una etiqueta magnética del segundo agente aglutinante, durante un tiempo y en condiciones que permiten la unión específica del analito sospechoso de estar presente en la muestra al primer agente aglutinante y la unión específica del segundo agente aglutinante al analito unido al primer agente aglutinante y detectar la formación del complejo del primer agente aglutinante, analito y segundo agente aglutinante basándose en una señal alterada que se genera por la unión túnel magnética mediante la cual se determina el analito. La presente invención, además, se refiere a un dispositivo y a un kit para determinar un analito que se sospecha que está presente en una muestra y al uso de dicho dispositivo para determinar un analito que se sospecha que está presente en una muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Procedimiento para inmunodetección en una capa lipídica usando puntos de unión de túnel magnéticos II

[0004] La presente invención se refiere al campo del diagnóstico. En particular, se refiere a un procedimiento para determinar un analito que se sospecha que está presente en una muestra que comprende poner en contacto dicha muestra con un elemento sensor que comprende una capa de anclaje que está presente en un soporte sólido, un primer agente de unión que se puede unir específicamente al analito y que se ancla en la capa de anclaje, un segundo agente de unión que se puede unir específicamente al analito cuando se une al primer agente de unión y que se inmoviliza en el sólido soporte, comprendiendo dicho segundo agente de unión al menos un marcador magnético, y un punto de unión de túnel magnético en proximidad funcional con respecto al segundo agente de unión que genera una señal provocada en proximidad con respecto al al menos un marcador magnético del segundo agente de unión, durante un tiempo y en condiciones que permiten la unión específica del analito que se sospecha que está presente en la muestra al primer agente de unión y la unión específica del segundo agente de unión al analito unido al primer agente de unión y detectar la formación del complejo del primer agente de unión, el analito y el segundo agente de unión en base a una señal alterada que se genera por el punto de unión de túnel magnético con lo que se determina el analito. La presente invención, además, se refiere a un dispositivo y un kit para determinar un analito que se sospecha que está presente en una muestra y al uso de dicho dispositivo para determinar un analito que se sospecha que está presente en una muestra.

[0006] El documento WO 2015/175856, así como el documento WO 2020/180645 y el documento US 2014/272939 divulgan un procedimiento que comprende la formación de un complejo del analito de interés, un reactivo de captura presente en una superficie que comprende una región de anclaje y un reactivo de detección enlazado a una sonda de ácido nucleico. El principio subyacente a la detección en el procedimiento de estos documentos se basa en un proceso de extensión que da como resultado la secuencia extendida que forma la región de anclaje; véase, por ejemplo, la fig. 1(a) y la página 3, líneas 22-24 del documento WO 2015/175856 que describe: "extender la sonda para formar una secuencia extendida que comprende una región de anclaje que une el reactivo de anclaje; unir la secuencia extendida al reactivo de anclaje; y medir la cantidad de secuencia extendida unida a la superficie". Por tanto, la región de anclaje de estos documentos se forma "extendiendo la sonda para formar una secuencia extendida que comprende una región de anclaje que une el reactivo de anclaje". Por consiguiente, la región de anclaje de estos documentos se diseña para participar en la unión al reactivo de anclaje del reactivo de captura. El documento WO 2007/024676 se refiere a procedimientos para detectar al menos un analito diana en una muestra. Los procedimientos comprenden el uso de un analito diana con al menos dos sitios de unión; el analito diana se puede unir por dos tipos diferentes de sondas de captura y, opcionalmente, un tipo de sonda detectora (véase la página 4, líneas 10-18). Se proporciona una primera sonda de captura en un sustrato, es decir, se podría interpretar como que está inmovilizada en un soporte. Sin embargo, las otras sondas no parecen estar ancladas en una capa de anclaje. El documento WO 2007/024676 divulga una superficie recubierta como un sustrato adecuado (página 8, línea 21 a página 9, línea 4). Esta capa sobre un sustrato se podría interpretar como una capa de anclaje en un soporte sólido.

[0008] Los inmunoanálisis se usan ampliamente para diversos propósitos de diagnóstico. Se han desarrollado varias configuraciones para inmunoanálisis. Uno de los inmunoanálisis más populares es el ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA).

[0010] En ELISA, una muestra líquida que contiene un analito de interés o que se sospecha que contiene un analito de interés se aplica sobre una fase sólida estacionaria con propiedades de unión especiales debido a la presencia de anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos tales como aptámeros. Después de la aplicación de muestra, se añaden secuencialmente múltiples reactivos, se incuban y se retiran mediante lavado para llevar a cabo y detener una reacción de detección analítica. Después de llevar a cabo todas estas etapas, se cambian las propiedades físicas o químicas en la configuración, normalmente la fase líquida, que se pueden detectar. Típicamente, un cambio óptico tal como la aparición de color por el producto de una reacción enzimática ocurrirá en la fase líquida final. Estos cambios se correlacionan con la presencia o abundancia del analito de interés presente en la muestra investigada. La lectura típicamente cuantitativa se basa normalmente en la detección de la intensidad de la luz transmitida por espectrofotometría, que implica la cuantificación de la transmisión de alguna longitud de onda específica de luz a través del líquido. La sensibilidad de la detección depende de la amplificación de la señal durante las reacciones analíticas. Puesto que las reacciones enzimáticas son procesos de amplificación muy bien conocidos, la señal se genera por enzimas que se enlazan a los reactivos de detección en proporciones fijas para permitir una cuantificación exacta.

[0012] Para una configuración de ELISA, el agente de unión al analito, por ejemplo, un anticuerpo, se inmoviliza en una fase sólida, tal como una estructura de soporte sólido. Normalmente, el anticuerpo se recubre y se seca sobre el fondo transparente y, a veces, también sobre la pared lateral de un pocillo en una placa de múltiples pocillos analítica o en un tubo de análisis. Sin embargo, también se pueden usar nanopartículas u otras microesferas como fases sólidas para ELISA.

[0014] Para la investigación y el diagnóstico, a menudo se usan ELISA en el formato de los denominados ELISA de tipo sándwich. En un formato de tipo sándwich, se usa un anticuerpo de captura inmovilizado para capturar, es decir, unirse específicamente a, un analito presente en una muestra aplicada a dicho anticuerpo inmovilizado. Después de que el anticuerpo de captura se ha unido específicamente al analito, el material de la muestra se retira mediante lavado. En una etapa posterior, el analito unido al anticuerpo inmovilizado se incuba con un anticuerpo de detección que se une específicamente al analito o al complejo de analito y anticuerpo de captura. El anticuerpo de detección contiene típicamente un conector detectable o una molécula adaptadora que permite atraer dichos marcadores detectables de una solución.

[0016] Sin embargo, en vista de los complejos inmunitarios frágiles que se requieren para la generación de señales y los diversos componentes usados para un ELISA de este tipo en el formato de tipo sándwich, existen muchas posibilidades de unión no deseada de anticuerpos de detección y, por tanto, de generación de señales positivas falsas. Por lo tanto, los ELISA de tipo sándwich usados para la investigación a menudo necesitan validación debido al riesgo de resultados positivos falsos. Además, existen limitaciones con respecto a la sensibilidad y especificidad debido a las diversas desventajas de un formato de ensayo multicomponente tan frágil.

[0018] El problema técnico subyacente a la presente invención se puede ver como la provisión de medios y procedimientos para cumplir con las necesidades mencionadas anteriormente. El problema técnico se resuelve por los modos de realización caracterizados en las reivindicaciones y en el presente documento a continuación.

[0019] La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar un analito que se sospecha que está presente en una muestra que comprende:

[0021] (a) poner en contacto dicha muestra con un elemento sensor que comprende:

[0023] (i) una capa de anclaje que está presente en un soporte sólido;

[0025] (ii) un primer agente de unión que se puede unir específicamente al analito y que se ancla en la capa de anclaje;

[0026] (iii) un segundo agente de unión que se puede unir específicamente al analito cuando se une al primer agente de unión y que se inmoviliza en el soporte sólido, comprendiendo dicho segundo agente de unión al menos un marcador magnético; y

[0028] (iv) un punto de unión de túnel magnético en proximidad funcional con respecto al segundo agente de unión que genera una señal provocada en proximidad con respecto al al menos un marcador magnético del segundo agente de unión;

[0030] durante un tiempo y en condiciones que permiten la unión específica del analito que se sospecha que está presente en la muestra al primer agente de unión y la unión específica del segundo agente de unión al analito unido al primer agente de unión; y

[0032] (b) detectar la formación del complejo del primer agente de unión, el analito y el segundo agente de unión en base a una señal alterada que se genera por el punto de unión de túnel magnético con lo que se determina el analito.

[0034] Se ha de entender que en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "un" o "una" puede querer decir uno o más, dependiendo del contexto en el que se use. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un" elemento puede querer decir que se puede utilizar al menos un elemento.

[0036] Como se usa en lo que sigue, los términos "tener", "comprender" o "incluir" quieren decir tener un significado no limitante o un significado limitante. Por tanto, estos términos que tienen un significado limitante se pueden referir a una situación en la que, además del rasgo característico introducido por estos términos, no están presentes otros rasgos característicos en un modo de realización descrito, es decir, los términos tienen un significado limitante en el sentido de "que consisten en" o "que consisten esencialmente en". Los términos que tienen un significado no limitante se refieren a una situación donde, además del rasgo característico introducido por estos términos, están presentes uno o más de otros rasgos característicos en un modo de realización descrito.

[0038] Además, como se usa en lo que sigue, los términos "preferentemente", "más preferentemente", "lo más preferentemente", "en particular", "más en particular", "típicamente" y "más típicamente" o términos similares se usan junto con rasgos característicos adicionales o alternativos, sin restringir posibilidades alternativas.

[0040] Además, se entenderá que el término "al menos uno" como se usa en el presente documento quiere decir que uno o más de los elementos a los que se hace referencia después del término se pueden usar de acuerdo con la invención. Por ejemplo, si el término indica que se usará al menos un elemento, esto se puede entender como un elemento o más de un elemento, es decir, dos, tres, cuatro, cinco o cualquier otro número. Dependiendo del elemento, el término se refiere a lo que el experto en la técnica entiende en cuanto a qué límite superior se puede referir el término, si lo hay.

[0041] El procedimiento de acuerdo con la presente invención puede consistir en las etapas (a) y (b) mencionadas anteriormente o puede comprender etapas adicionales, tales como pretratar o aislar la muestra antes de la etapa (a) y/o después de la etapa (b) una o más etapas adicionales de evaluación del analito determinado, por ejemplo, comparándolo con referencias para proporcionar una conclusión de diagnóstico, pronóstico, pertinente para el medio ambiente, pertinente para la agricultura o pertinente analíticamente dependiendo del objetivo de la determinación del analito.

[0043] El término "determinar", como se usa en el presente documento, engloba cualquier clase de determinación cualitativa o cuantitativa del analito. Una determinación cualitativa tiene como objetivo determinar la presencia o la ausencia del analito en la muestra, mientras que la determinación cuantitativa tiene como objetivo determinar la cantidad del analito. La determinación cuantitativa, es decir, la determinación de la cantidad, incluye determinar la cantidad absoluta (por ejemplo, la cantidad total en peso o el número de moléculas presentes en la muestra) o una cantidad relativa (por ejemplo, una cantidad relativa al volumen de muestra (concentración) o una clasificación tal como una puntuación (por ejemplo, "cantidad alta", "cantidad baja" y similares). Típicamente, determinar un analito comprende determinar la presencia, ausencia o cantidad de dicho analito.

[0045] El término "analito" como se hace referencia en el presente documento se refiere a cualquier tipo de molécula o agente que es adecuado para determinarse por el procedimiento de la invención. Se entenderá que una molécula o agente de este tipo puede tener un tamaño y/o estructura que permite la unión del primer y segundo agentes de unión a los que se hace referencia en el presente documento. Además, también puede haber limitaciones de tamaño superior, puesto que el primer y segundo agentes de unión, así como el agente de enlace, deben poder ejercer sus funciones como se describe en otra parte en el presente documento en detalle. Típicamente, el analito al que se hace referencia en el presente documento es una molécula biológica tal como una proteína, un péptido, un ácido nucleico, por ejemplo, un ADN o ARN o una molécula pequeña tal como un lípido o metabolito, un policétido que incluye, por ejemplo, flavonoides e isoflavonoides, un isoprenoide que incluye, por ejemplo, terpenos, esteroles, esteroides, carotenoides, xantofilas, un carbohidrato, un fenilpropanoide, un alcaloide, un bencenoide, un indol, una porfirina, una hormona, una vitamina, un cofactor, una lignina, un glucosinolato, una purina, una pirimidina, un nucleósido, un nucleótido, un alcohol, un alcano, un alqueno, un alquino, un compuesto aromático, una cetona, un aldehído, un ácido carboxílico, un éster, una amina, una imina, una amida, un cianuro, un aminoácido, un tiol, un tioéster, un éster de fosfato, un éster de sulfato, un tioéter, un sulfóxido o un éter. La molécula pequeña puede ser, por ejemplo, una toxina. Sin embargo, el procedimiento de la invención también se puede usar para determinar virus o incluso células bacterianas como analitos. Los analitos que se van a determinar por la presente invención también pueden ser moléculas que están presentes en muestras ambientales y que pueden ser útiles como indicadores para, por ejemplo, contaminación ambiental, agricultura u otras condiciones ambientales. Típicamente, dicho analito es una proteína, péptido, virus, célula bacteriana o molécula pequeña, preferentemente, toxina de molécula pequeña.

[0047] El término "muestra" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier parte o alícuota de una composición que comprende o se sospecha que comprende el analito que se va a determinar. Una muestra de este tipo puede ser una muestra biológica, típicamente, aislada de un organismo, tal como un líquido corporal o muestra de biopsia, o puede ser una composición que comprende un organismo tal como células cultivadas. Típicamente, dicha muestra biológica se investiga por el procedimiento de la invención con propósitos médicos, tales como diagnosticar o predecir una enfermedad o afección médica. Además, la muestra puede ser una muestra ambiental o una muestra artificial. Una muestra ambiental se puede derivar de cualquier fuente natural no biológica, por ejemplo, soluciones de origen ambiental tales como agua o de composiciones tales como suelo. Una muestra artificial puede ser una muestra obtenida de una fuente artificial, por ejemplo, una composición de producto que se puede fabricar o una composición intermedia que se puede producir durante un procedimiento de fabricación de un producto. Dichas muestras artificiales se pueden investigar, por ejemplo, con propósitos de control de calidad o para determinar la cantidad de ingredientes específicos. Típicamente, dicha muestra de acuerdo con el procedimiento de la presente invención es una muestra biológica, preferentemente, una muestra de líquido corporal o de biopsia.

[0049] El término "elemento sensor" como se usa de acuerdo con la presente invención comprende un soporte sólido que tiene una superficie que está cubierta por una capa de anclaje. Además, el elemento sensor comprenderá además una disposición molecular como se describe anteriormente, es decir, un primer agente de unión que se puede unir específicamente al analito, que se ancla en la capa de anclaje y un segundo agente de unión que se puede unir específicamente al analito cuando se une al primer agente de unión, que se inmoviliza en el soporte sólido y que comprende al menos un marcador magnético. Además, un punto de unión de túnel magnético estará en proximidad funcional con respecto al segundo agente de unión de modo que se puede provocar una señal si al menos un marcador magnético del segundo agente de unión está en proximidad funcional con respecto a dicho punto de unión de túnel magnético.

[0051] El término "capa de anclaje" como se hace referencia en el presente documento engloba cualquier capa molecular que puede asociar moléculas y, en particular, el primer agente de unión de acuerdo con la invención. La asociación del primer agente de unión al que se hace referencia de acuerdo con la presente invención permitirá movimientos moleculares del primer agente de unión o cualquier molécula de anclaje fijada al mismo dentro de la capa de anclaje o en su superficie. La dicha capa de anclaje es, típicamente, una capa lipídica o una bicapa lipídica. El experto en la técnica conoce bien cómo se puede cubrir un soporte sólido con una capa de anclaje de este tipo y qué lípidos se pueden usar para crear una capa lipídica o bicapa lipídica. Las capas lipídicas o bicapas lipídicas típicas adecuadas para su uso como una capa de anclaje de acuerdo con la invención pueden incluir, por ejemplo, una capa fosfolipídica o bicapa fosfolipídica. Dicha capa fosfolipídica o bicapa fosfolipídica puede comprender, en particular, una o más fosfatidilcolinas, tales como 1 -oleoil-2-palmitoil-fosfatidilcolina, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina y/o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1-carboxipentil)ácido iminodiacético)succinilo], o una mezcla de una o más fosfatidilcolinas y colesterol. Además, las bicapas lipídicas soportadas y las membranas lipídicas de bicapa ancladas pueden encontrar uso como una capa de anclaje de acuerdo con la invención. Estas son membranas lipídicas modelo comúnmente usadas conocidas en la técnica.

[0053] El término "soporte sólido", como se usa en el presente documento, se refiere a una composición sólida de materia que puede servir como base para inmovilizar moléculas y, en particular, el segundo agente de unión. Un soporte sólido puede comprender compuestos inorgánicos u orgánicos o ambos. Típicamente, los compuestos inorgánicos adecuados para un soporte sólido se pueden seleccionar del grupo que consiste en: sílice, vidrio poroso, aluminosilicatos, borosilicatos, óxidos metálicos (por ejemplo, óxido de aluminio, óxido de hierro, óxido de níquel) y arcilla que contiene uno o más de estos. De forma alternativa, el soporte sólido puede comprender un compuesto orgánico tal como un polímero reticulado. Los ejemplos no limitantes de un polímero reticulado adecuado se pueden seleccionar del grupo que consiste en: poliamida, poliéter, poliestireno y mezclas de los mismos. El experto en la técnica conoce bien cómo seleccionar un soporte sólido adecuado en base a la clase de muestra que se va a investigar, el procedimiento contemplado para la detección del analito, el tipo de marcador magnético que se va a usar para detectar el analito y/o la clase de segundo agente de unión usado para el elemento sensor. El soporte sólido también comprenderá un punto de unión de túnel magnético en proximidad funcional con respecto a un segundo agente de unión inmovilizado en el dicho soporte sólido.

[0055] Por "proximidad funcional" se entenderá que el punto de unión de túnel magnético se localiza con respecto al segundo agente de unión a una distancia y en un lugar que permiten la generación de una señal provocada por el al menos un marcador magnético del segundo agente de unión. Dicha señal se puede alterar si dicho primer agente de unión se convierte en parte de un complejo conjuntamente con el segundo agente de unión y el analito como se define en otra parte en el presente documento.

[0057] El sensor comprenderá además un primer agente de unión que se puede unir específicamente al analito. Dicho primer agente de unión se anclará en la capa de anclaje.

[0059] El término "primer agente de unión" al que se hace referencia en el presente documento se refiere a una molécula que se puede unir específicamente al analito, es decir, una molécula que no se une a y, por tanto, no reacciona de forma cruzada con otras moléculas que no sean el analito que se sospecha que está presente en la muestra. La unión específica, en principio, se puede someter a prueba por técnicas bien conocidas en la técnica que incluyen ensayos de cribado para identificar agentes que se unen específicamente a un analito de colecciones que comprenden diferentes agentes candidatos.

[0061] Las moléculas que se pueden usar, preferentemente, como primeros agentes de unión que se pueden unir específicamente a un analito deseado pueden ser anticuerpos. Los anticuerpos como agentes de unión como se entiende de acuerdo con la presente invención engloban todos los tipos de anticuerpos que, preferentemente, se unen específicamente al analito. Preferentemente, un anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo quimérico o cualquier fragmento de dichos anticuerpos que todavía se puede unir específicamente al analito. Dichos fragmentos comprendidos por el término anticuerpo como se usa en el presente documento engloban un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo sintético, un fragmento Fab, F(ab)2 Fv o scFv o un derivado modificado químicamente de cualquiera de estos fragmentos de anticuerpo. Se pueden obtener anticuerpos o fragmentos de los mismos, en general, que se unen específicamente a un analito deseado usando procedimientos que se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales por las técnicas que comprenden la fusión de células de mieloma de ratón a células de bazo derivadas de mamíferos inmunizados y, preferentemente, ratones inmunizados (Kohler 1975, Nature 256, 495 y Galfré 1981, Meth. Enzymol. 73.3). El experto en la técnica conoce bien cómo se puede someter a prueba la unión específica por técnicas bien conocidas en la técnica, tales como técnicas inmunológicas o bioquímicas que incluyen inmunoanálisis, separación celular o inmunoelectrotransferencia o mediciones de resonancia de plasmón superficial.

[0063] Además, las moléculas que se pueden usar, preferentemente, como primeros agentes de unión que se pueden unir específicamente a un analito deseado pueden ser aptámeros. Un aptámero como agente de unión de acuerdo con la presente invención puede ser una molécula de ácido oligonucleico o peptídica que se une a un analito diana específico (Ellington 1990, Nature 346 (6287): 818-22). Bock 1992, Nature 355 (6360): 564-6). Los aptámeros de ácido oligonucleico se genomanipulan a través de rondas repetidas de selección o la denominada evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (tecnología SELEX). Normalmente, los aptámeros peptídicos comprenden un bucle peptídico variable fijado en ambos extremos a un armazón proteínico. Esta restricción estructural doble incrementará la afinidad de unión del aptámero peptídico en el intervalo nanomolar. Dicha longitud de bucle peptídico variable se compone, preferentemente, de diez a veinte aminoácidos, y el armazón puede ser cualquier proteína que tenga propiedades de solubilidad y compacidad mejoradas, tales como tiorredoxina A. La selección del aptámero peptídico se puede realizar usando diferentes sistemas que incluyen, por ejemplo, el sistema de doble híbrido de levadura (véase, por ejemplo, Hoppe-Seyler 2000, J Mol Med. 78 (8): 426­ 30). También se engloba de acuerdo con la presente invención cualquier fragmento de dichos aptámeros que todavía se puedan unir específicamente al analito. Dichos fragmentos se pueden usar en forma aislada o pueden ser parte de moléculas de fusión, es decir, moléculas que comprenden dicho fragmento de aptámero, así como otras partes tales como restos conectores o moléculas adaptadoras. El experto en la técnica conoce bien cómo se puede someter a prueba la unión específica por técnicas bien conocidas en la técnica, tales como mediciones de resonancia de plasmón superficial.

[0065] Las moléculas que se pueden usar, preferentemente, como primeros agentes de unión que se pueden unir específicamente a un analito deseado también pueden ser moléculas receptoras. Una molécula receptora como agente de unión como se hace referencia de acuerdo con la presente invención es, típicamente, una proteína que se une específicamente a un ligando y que se activa tras la unión de ligando para ejercer su función biológica. Una molécula receptora de este tipo o un fragmento de la misma que todavía se puede unir específicamente al ligando también se puede usar como un agente de unión de acuerdo con la presente invención para el ligando como analito o una molécula que se deriva del ligando pero que todavía se puede unir por la molécula receptora o fragmento de la misma tal como variantes que actúan de forma antagonista o agonista de un ligando. Preferentemente, la molécula receptora contemplada como un agente de unión de acuerdo con la presente invención puede ser una proteína receptora de tipo transmembranaria, tal como un receptor acoplado a proteína G, por ejemplo, un receptor metabólico, un receptor enlazado a enzima tal como una tirosina cinasa receptora, por ejemplo, un receptor de factor de crecimiento, un receptor inmunológico, tal como un receptor de virus, un antígeno de superficie celular, un receptor de linfocitos T, por ejemplo, CD4, CD3 o CD8, o una proteína de MHC, una molécula de adherencia celular, tal como una integrina, cadherina, selectina o sindecano, un receptor neuronal o un receptor de patógenos tal como receptores de tipo Toll. La molécula receptora también puede ser una proteína receptora nuclear tal como un receptor de hormona nuclear, por ejemplo, el receptor de glucocorticoides, el receptor de ácido retinoico o el receptor de hormona tiroidea. El experto en la técnica conoce bien las moléculas receptoras o fragmentos de las mismas que se unen específicamente a un analito que se va a determinar o fragmentos del mismo. Además, se puede someter a prueba la unión específica por técnicas bien conocidas en la técnica, tales como mediciones de resonancia de plasmón superficial.

[0067] Sin embargo, las moléculas que se pueden usar, preferentemente, como primeros agentes de unión que se pueden unir específicamente a un analito deseado también pueden ser moléculas de ligando. Una molécula de ligando como agente de unión como se hace referencia de acuerdo con la presente invención es, típicamente, una proteína o péptido que se une específicamente a una molécula receptora y que se activa tras la unión de receptor a la dicha molécula receptora. Una molécula de ligando de este tipo o un fragmento de la misma que todavía se puede unir específicamente a la molécula receptora también se puede usar como un agente de unión de acuerdo con la presente invención para el receptor como analito o una molécula que se deriva de la molécula receptora pero que todavía se puede unir por la molécula de ligando o fragmento de la misma tal como variantes solubles de un receptor. Además, un ligando también puede ser cualquier antígeno que se pueda usar para determinar un determinado anticuerpo en una muestra de un organismo. Preferentemente, la molécula de ligando contemplada como agente de unión de acuerdo con la presente invención puede ser una hormona peptídica, un neurotransmisor, un factor de crecimiento, tal como angiopoyetina, una BMP, un factor neutrotrófico, EGF, una epifrina, EPO, un FGF, un GDNF, un GDF, insulina o un factor de crecimiento insulínico, un TGF, una neurotrofina, un VEGF, una citocina, tal como una interleucina, interferón, linfocina, monocina, factor estimulante de colonias o quimiocina, una proteína de matriz extracelular tal como fibronectina, vitronectina, colágeno, anquirina o laminina, o similares. El experto en la técnica conoce bien las moléculas de ligando o fragmentos de las mismas que se unen específicamente a un analito que se va a determinar o fragmentos del mismo. Además, se puede someter a prueba la unión específica por técnicas bien conocidas en la técnica, tales como mediciones de resonancia de plasmón superficial.

[0069] Además preferentemente, el primer agente de unión puede ser una proteína de repetición de anquirina diseñada (DARPin). Las DARPin son proteínas miméticas de anticuerpos genomanipuladas que se pueden diseñar para lograr una unión a proteínas diana altamente específica y de alta afinidad. Se derivan de las proteínas de repetición de anquirina naturales. Típicamente, las DARPin comprenden al menos tres módulos de repetición, de los que la mayoría de los módulos N terminales y la mayoría de los C terminales (también denominados "caperuzas") protegen el núcleo hidrófobo de la proteína (Binz 2003, Journal of Molecular Biology. 332 (2): 489-503).

[0071] Típicamente, dicho primer agente de unión se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo o fragmento del mismo, un aptámero, una molécula receptora o fragmento de la misma, y una molécula de ligando o fragmento de la misma. Más típicamente, es un anticuerpo o fragmento del mismo o un aptámero.

[0073] Además, el primer agente de unión de acuerdo con la presente invención se anclará en la capa de anclaje. Un primer agente de unión anclado como se hace referencia de acuerdo con la presente invención, típicamente, se asociará con o estará dentro de la capa de anclaje. En consecuencia, está, típicamente, limitado en sus movimientos a esencialmente en dos dimensiones en el espacio.

[0075] Preferentemente, dicho primer agente de unión se ancla en la capa de anclaje por medio de una molécula de anclaje, más preferentemente, un lípido. Los lípidos adecuados para anclar un primer agente de unión de acuerdo con la presente invención dependen de la naturaleza de la capa de anclaje y se pueden elegir por el experto en la técnica sin más. La molécula de anclaje se puede enlazar típicamente a al menos un, preferentemente, una pluralidad de, primer agente de unión por medio de una molécula conectora. Las moléculas conectoras adecuadas permiten fijar muchos primeros agentes de unión y al menos una molécula de anclaje. Preferentemente, una molécula conectora adecuada puede ser una molécula de ciclo-ADN. Por tanto, se puede anclar una pluralidad de primeros agentes de unión a la capa de anclaje por medio de la misma molécula de anclaje.

[0077] Típicamente, la cantidad de dicho primer agente de unión excede la cantidad de dicho segundo agente de unión en un factor entre 10 y 100, entre 20 y 80, entre 30 y 70 o entre 40 y 60.

[0079] El sensor también comprenderá un segundo agente de unión que se puede unir específicamente al analito cuando se une al primer agente de unión. El dicho segundo agente de unión se inmovilizará en el soporte sólido. Además, habrá proximidad funcional entre el punto de unión de túnel magnético y el segundo agente de unión como se describe en otra parte en el presente documento. En consecuencia, el segundo agente de unión, asimismo, estará en proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético. Además, el segundo agente de unión comprenderá al menos un marcador magnético.

[0081] El término "segundo agente de unión" que se puede unir específicamente al analito se refiere a una molécula que se puede unir específicamente al analito o al analito cuando se une al primer agente de unión, es decir, una molécula que no se une a y, por tanto, no reacciona de forma cruzada con otras moléculas que no sean el analito que se sospecha que está presente en la muestra o el complejo del analito y el primer agente de unión. Típicamente, dicho segundo agente de unión se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo o fragmento del mismo, un aptámero, una molécula receptora o fragmento de la misma, y una molécula de ligando o fragmento de la misma. Más típicamente, es un anticuerpo o fragmento del mismo o un aptámero. Típicamente, el segundo agente de unión es de las mismas clases de moléculas mencionadas anteriormente que el primer agente de unión. Las definiciones para un anticuerpo o fragmento del mismo, un aptámero, una molécula receptora o fragmento de la misma, y una molécula de ligando o fragmento de la misma realizadas de acuerdo con el primer agente de unión se aplicanmutatis mutandispara el segundo agente de unión.

[0083] El segundo agente de unión se inmovilizará en el soporte sólido. La inmovilización de dicho segundo agente de unión, preferentemente, es una inmovilización permanente. Las técnicas adecuadas para inmovilizar el segundo agente de unión en el soporte sólido dependen de la naturaleza del soporte sólido y/o la naturaleza del segundo agente de unión y son bien conocidas por el experto en la técnica. Se entenderá que tras la inmovilización, el segundo agente de unión no podrá mover su posición dentro o fuera de la capa de anclaje. Sin embargo, el segundo agente de unión podrá llevar a cabo flexión y otros movimientos moleculares o cambios conformacionales requeridos para unirse al analito o a un primer agente de unión unido al analito.

[0085] La interacción del segundo agente de unión y el analito y el primer agente de unión será, preferentemente, una interacción reversible. Se contempla que la tasa de asociación sea típicamente mayor que la tasa de disociación de modo que los complejos del primer agente de unión, el analito y el segundo agente de unión permanezcan estables durante un determinado tiempo, lo que permite su determinación por detección de la presencia o abundancia o la tasa de aparición del al menos un marcador magnético dentro de la proximidad con respecto a la posición del segundo agente de unión durante dicho margen de tiempo.

[0087] El segundo agente de unión puede comprender el al menos un marcador magnético como parte de la molécula. De forma alternativa, el al menos un marcador magnético se puede enlazar a la segunda molécula de unión por un conector. Se contemplan el enlace permanente, así como el enlace reversible, de acuerdo con la presente invención. El enlace reversible se puede lograr, por ejemplo, usando sistemas de adaptadores moleculares a base de biotina-estreptavidina bien conocidos en la técnica.

[0089] Se entenderá que el al menos un marcador magnético se localiza, típicamente, fuera de proximidad funcional si el segundo agente de unión está en un estado no unido y se localiza en proximidad funcional si el segundo agente de unión es parte del complejo. En consecuencia, los cambios conformacionales del segundo agente de unión y/o el al menos un marcador magnético provocarán una posición alterada del dicho marcador magnético con respecto al punto de unión de túnel magnético. Una alteración de la señal generada por el punto de unión de túnel magnético, en este caso, la detección de una señal o la abundancia de una señal, será indicativa de la formación de complejo y, en consecuencia, de la presencia del analito en la muestra.

[0091] También típicamente, el dicho al menos un marcador magnético se localiza fuera de la capa de anclaje si el segundo agente de unión está en un estado no unido y se localiza en la capa de anclaje si el segundo agente de unión es parte del complejo. En este caso, el al menos un marcador magnético también se localiza fuera de proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético y se localiza en proximidad funcional dentro de la capa de anclaje después de la formación de complejo. Por tanto, una alteración de la señal generada por el punto de unión de túnel magnético, en este caso, la detección de una señal o la abundancia de una señal, será indicativa de la formación de complejo y, en consecuencia, también de la presencia del analito en la muestra.

[0092] Se entenderá que el al menos un marcador magnético, típicamente, también se localiza en proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético con una primera tasa de aparición si el segundo agente de unión está en un estado no unido y se pone en proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético con una segunda tasa de aparición si el segundo agente de unión es parte del complejo, en el que dicha segunda tasa de aparición es mayor que la primera tasa de aparición. Sin quedar vinculado a ninguna teoría, las propiedades físicas y químicas del segundo agente de unión no unido y el segundo agente de unión que es parte de un complejo difieren y, por tanto, los movimientos moleculares cambian y la tasa de aparición del al menos un marcador magnético en proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético se altera como consecuencia de ello. Por tanto, una alteración de la señal generada por el punto de unión de túnel magnético, en este caso, la detección de una tasa de aparición alterada del al menos un marcador magnético en proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético será indicativa de la formación de complejo y, en consecuencia, de la presencia del analito en la muestra.

[0094] El término "marcador magnético", como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas que se pueden detectar en proximidad funcional con respecto a un punto de unión de túnel magnético. En consecuencia, se contempla típicamente un marcador magnético de acuerdo con la presente invención como marcador magnético. Los marcadores magnéticos típicos comprenden nanopartículas de hierro-platino, nanopartículas de hierro, nanopartículas de níquel o nanopartículas de cobalto. El marcador magnético se puede unir de forma reversible o permanente al segundo agente de unión. Con este fin, el marcador magnético puede ser una molécula que se puede unir de forma reversible al segundo agente de unión o puede ser una molécula o resto que ya es parte del dicho segundo agente de unión. Típicamente, dicho marcador magnético comprende un conector que se puede enlazar covalentemente por el agente de enlace al soporte sólido.

[0096] El término "punto de unión de túnel magnético", como se usa en el presente documento, se refiere a detectores magneto-sensibles tales como puntos de unión de túnel magnéticos o válvulas de giro magnéticas (véase, por ejemplo, el documento US 5.981.297; Fernandes 2020, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 30, 102287 o Denmark 2019, Journal of Electronic Materials (48): 4749-4761).

[0098] El punto de unión de túnel magnético como detector del elemento sensor, típicamente, se coloca debajo del soporte sólido y dicho detector puede detectar selectivamente una señal en proximidad funcional con respecto a dicho segundo elemento de unión. Dependiendo del marcador magnético, se pueden aplicar diferentes técnicas de detección. Además, dependiendo de la técnica de detección, puede ser necesario aplicar un campo magnético al punto de unión de túnel magnético.

[0100] Se entenderá que la señal alterada detectada a partir del marcador magnético se puede transmitir posteriormente a una unidad de evaluación. Dicha unidad de evaluación puede comprender, preferentemente, un elemento de procesamiento de datos, tal como un ordenador, con un algoritmo implementado para determinar la presencia, ausencia o cantidad de un analito en la muestra en base a la(s) señal(es) detectada(s) del/de los marcador(es) magnético(s).

[0102] Un algoritmo implementado de este tipo puede evaluar las señales medidas provocadas a partir del/de los marcador(es) magnético(s) en un complejo del segundo agente de unión, el analito y el primer agente de unión para determinar la intensidad de señal, la duración de señal y otros parámetros predeterminados. En base a dicha evaluación, se pueden identificar y validar señales verdaderamente positivas y se pueden identificar e ignorar las señales de ruido para evaluaciones adicionales. El experto en la técnica conoce bien qué algoritmos se pueden usar y cómo se pueden implementar en el dispositivo de la presente invención. Preferentemente, la formación del complejo del primer agente de unión, el analito y el segundo agente de unión se detecta midiendo la intensidad y/o duración de una señal provocada por el al menos un marcador magnético. Más preferentemente, dicha señal se puede detectar durante un período de tiempo característico predeterminado. Las características de las señales verdaderas son, preferentemente, la formación dentro de un primer margen de tiempo dependiendo de una o más constantes de asociación para el complejo que comprende el primer agente de unión, el analito y el segundo agente de unión, la persistencia durante un margen de tiempo predefinido y la disociación dentro de un segundo margen de tiempo dependiendo de una o más constantes de disociación para el complejo que comprende el primer agente de unión, el analito y el segundo agente de unión. Típicamente, una señal verdadera se puede detectar durante un tiempo significativamente más largo que una señal provocada por al menos una marcador magnético comprendida por un primer agente de unión que se mueve libremente, que pasa aleatoriamente por la capa de anclaje en proximidad con respecto al segundo agente de unión inmovilizado. Este último solo generará una señal de ruido corta.

[0104] Para una evaluación precisa de las señales de las marcadores magnéticos detectadas de acuerdo con el procedimiento de la presente invención y para determinar el analito basado en las mismas, se puede aplicar un algoritmo implementado por ordenador y, en particular, algoritmos de inteligencia artificial, algoritmos de aprendizaje automático y similares.

[0106] En la etapa (a) de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, una muestra que comprende el analito que se va a determinar o que se sospecha que comprende el analito que se va a determinar se pone en contacto con un biosensor como se especifica en otra parte en el presente documento en detalle.

[0108] El término "poner en contacto", como se usa en el presente documento, se refiere a poner los componentes mencionados anteriormente en proximidad física de modo que el primer y/o segundo agente de unión se pueda unir al analito si está presente en la muestra. Se entenderá que la unión del primer agente de unión al analito y del segundo agente de unión al analito o el complejo del primer agente de unión y el analito puede requerir tiempo y aplicar condiciones adecuadas. El experto en la técnica conoce bien qué tiempo se requiere para lograr la unión y qué condiciones es necesario aplicar. Por ejemplo, la muestra y los agentes de unión se pueden disolver o mezclar con tampones ajustando las concentraciones de sal y/o el valor de pH. Se entenderá que los tampones adecuados y otros componentes auxiliares que se pueden aplicar dependen de los agentes de unión que se van a usar y de la naturaleza química del analito que se va a determinar.

[0110] En la etapa (a) del procedimiento de la presente invención, el primer agente de unión y el analito también se ponen en contacto con un segundo agente de unión inmovilizado en el soporte sólido que se puede unir específicamente al analito o al primer agente de unión cuando se une al analito. Típicamente, la disposición en el elemento sensor que comprende el primer agente de unión anclado a la capa de anclaje y el segundo agente de unión inmovilizado se proporciona antes de la aplicación de la muestra. Sin embargo, la muestra se puede poner en contacto con el primer agente de unión y aplicarse a una capa de anclaje que comprende el segundo agente de unión inmovilizado también en un soporte sólido.

[0112] Como resultado de las actividades mencionadas anteriormente que se producen durante la etapa (a) del procedimiento de la presente invención, un analito se unirá por el primer agente de unión. El dicho complejo del analito y el primer agente de unión se moverá dentro de la capa de anclaje y se unirá por el segundo agente de unión inmovilizado en el soporte sólido de modo que se genere un complejo que comprenda el primer agente de unión, el analito y el segundo agente de unión ("bloqueo"). Debido a la cinética de unión molecular, este complejo persistirá en proximidad con respecto a la posición de inmovilización de la segunda molécula de unión en el soporte sólido durante un margen de tiempo característico hasta que se disuelva ("desbloqueo"). El segundo agente de unión aplicado en el procedimiento de la presente invención comprenderá al menos un marcador magnético, típicamente, unido de forma permanente o bien reversible al mismo.

[0114] En la etapa (b) del procedimiento de la presente invención, el complejo mencionado anteriormente del primer agente de unión, el analito y el segundo agente de unión se detecta en base a la señal provocada a partir del al menos un marcador magnético que se genera por el punto de unión de túnel magnético, con lo que se determina el analito.

[0116] El término "detectar", como se usa en el presente documento, se refiere a identificar la presencia, la ausencia y/o la cantidad de marcadores magnéticos. Se entenderá que el marcador magnético genera típicamente una señal que se puede medir por el punto de unión de túnel magnético. La intensidad y/o duración de señal es, típicamente, indicativa de la cantidad de las moléculas de marcador magnético presentes en el complejo en proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético. Preferentemente, la formación del complejo del primer agente de unión, el analito y el segundo agente de unión se detecta midiendo la intensidad y/o duración de una señal provocada por el al menos un marcador magnético. Más preferentemente, dicha señal se puede detectar durante un período de tiempo característico predeterminado. Sin embargo, detectar como se hace referencia en el presente documento puede englobar además detectar una señal alterada. En particular, si el al menos un marcador magnético comprendido en el segundo agente de unión está en proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético con una primera tasa de aparición y el comportamiento de movimiento molecular se altera tras la formación de complejo, la formación de complejo se puede detectar por una segunda tasa de aparición observable después de la formación de complejo. Por tanto, la detección, como se usa en el presente documento, también puede englobar la detección de una tasa de aparición alterada de la(s) señal(es) provocada(s) por el al menos un marcador magnético cuando está en proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético.

[0118] En el procedimiento de la presente invención, se pueden usar un primer y un segundo agentes de unión para determinar diferentes analitos. En un caso de este tipo, se entenderá que una vez que se forman los complejos para dichos analitos diferentes, cada complejo debe poseer un marcador magnético diferente que pueda generar una señal en el punto de unión de túnel magnético que difiera en al menos una característica de señal.

[0120] En un modo de realización particular del procedimiento de la presente invención, dicho soporte sólido es un pocillo o un área de detección subdividida predeterminada. Preferentemente, cada pocillo o área de detección subdividida predeterminada tiene inmovilizada en él una cantidad predefinida del segundo agente de unión. Dicho procedimiento es en particular útil para determinar un analito que comprende determinar la cantidad de dicho analito. Típicamente, dicha cantidad se determina contando los pocillos o áreas de detección subdivididas predeterminadas en las que se ha formado un complejo. De acuerdo con este modo de realización particular, se detecta la presencia o ausencia o la cantidad de analito para cada pocillo o área subdividida predeterminada. Posteriormente, se determinará el número de pocillos o áreas subdivididas predeterminadas positivos. Un pocillo o área subdividida predeterminada positiva será aquella que presenta una señal característica para una formación de complejo apropiada como se describe en otra parte en el presente documento que tiene una intensidad o duración predeterminada, por ejemplo, una señal medible por encima de un umbral de intensidad predeterminada y/o durante un margen de tiempo predeterminado. En base a los pocillos o áreas subdivididas predeterminadas positivos y la cantidad predefinida del segundo agente de unión inmovilizado en cada uno de dichos pocillos o áreas subdivididas predeterminadas, se puede determinar la cantidad de analito, por ejemplo, por cálculos. Por ejemplo, si cada pocillo o área subdividida predeterminada contiene idealmente un segundo agente de unión, la presencia de una molécula de analito en una muestra generará un complejo. Por tanto, si se determina la presencia de un complejo en un pocillo o en un área subdividida predeterminada, esta presencia refleja la presencia de un analito presente en la muestra. Por tanto, el uso de una cantidad predefinida de segundos agentes de unión en elementos aislados tales como pocillos o cualesquiera otras áreas subdivididas predeterminadas, permite la determinación cuantitativa o semicuantitativa de moléculas de analito presentes en una muestra. Esta técnica también se llama detección "digital".

[0122] En el procedimiento de la presente invención, en particular, con el propósito de detección digital, dicha muestra se pone en contacto con al menos 100 elementos sensores, al menos 300 elementos sensores, al menos 500 elementos sensores, al menos 1000 elementos sensores, al menos 5000 elementos sensores, al menos 10.000 elementos sensores, al menos 50.000 elementos sensores o al menos 100.000 elementos sensores. Más preferentemente, la cantidad de dicho analito comprende contar las señales medidas individuales generadas por los puntos de unión de túnel magnéticos.

[0124] De forma ventajosa, se ha descubierto de acuerdo con la presente invención que el uso de un primer agente de unión limitado en sus movimientos a esencialmente dos dimensiones por asociación a una capa de anclaje tal como una capa lipídica en un formato de ensayo de tipo sándwich mejora la sensibilidad y suprime el ruido de fondo no deseado. De acuerdo con la presente invención, un complejo inmunitario que comprende un primer agente de unión, por ejemplo, un anticuerpo, un analito que se va a determinar, un segundo agente de unión, por ejemplo, un anticuerpo, se forma con una determinada cinética, persiste durante un determinado margen de tiempo y se disuelve con una determinada cinética (principio de "bloqueo, desbloqueo"). Además, dependiendo de la configuración molecular usada, se puede esperar una señal de una determinada intensidad. Por tanto, en el procedimiento de la presente invención se determina una medición cinética de la formación de complejo y la disolución de complejo en lugar de un único acontecimiento de formación. Esto permite mediciones dinámicas en tiempo real e incluso puede hacer que las etapas de lavado y otros tratamientos sean innecesarios. Debido al uso de la capa de anclaje, también se reducirán los acontecimientos que provocan ruido en el soporte sólido. Dependiendo de la naturaleza del detector, es posible singularizar esencialmente los acontecimientos de formación de complejo. De acuerdo con la presente invención, se usa un detector magneto-sensible que mide una señal provocada por un marcador magnético que se asocia con un único segundo agente de unión que inicia la formación de complejo en presencia de una molécula de analito, se entenderá que la formación de complejo representará la dicha molécula de analito presente en la muestra. En un formato digital de este tipo, se puede usar el número de señales recibidas por los detectores individuales para contar las moléculas de analito presentes en la muestra.

[0125] Gracias a la presente invención, es posible la determinación de un analito en una muestra con una sensibilidad y especificidad mejoradas. Además, incluso se pueden determinar acontecimientos de una única molécula.

[0127] La presente invención se refiere a un dispositivo para determinar un analito que se sospecha que está presente en una muestra que comprende un elemento sensor que comprende:

[0129] (i) una capa de anclaje que está presente en un soporte sólido;

[0131] (ii) un primer agente de unión que se puede unir específicamente al analito, que se ancla en la capa de anclaje;

[0132] (iii) un segundo agente de unión que se puede unir específicamente al analito cuando se une al primer agente de unión y que se inmoviliza en el soporte sólido, comprendiendo dicho segundo agente de unión al menos un marcador magnético; y

[0134] (iv) un punto de unión de túnel magnético en proximidad funcional con respecto al segundo agente de unión que genera una señal provocada en proximidad con respecto al al menos un marcador magnético del segundo agente de unión.

[0136] El término "dispositivo" como se usa en el presente documento se refiere a un sistema que comprende los componentes mencionados anteriormente enlazados de forma funcional entre sí para permitir la determinación del analito de acuerdo con el procedimiento de la invención.

[0137] El elemento sensor de acuerdo con la presente invención se puede localizar en una zona de reacción comprendida por el dispositivo. La zona de reacción puede permitir directamente la aplicación de muestra o bien se puede conectar a una zona de carga donde se aplica la muestra. En este último caso, la muestra se puede transportar activa o pasivamente por medio de la conexión entre la zona de carga y la zona de reacción a la zona de reacción. Además, la zona de reacción también se conectará a un detector. Los detectores y técnicas de detección adecuados se describen en otra parte en el presente documento en detalle. La conexión entre la zona de reacción y el detector deberá ser de modo que el detector pueda detectar los marcadores magnéticos. Las conexiones adecuadas dependen de las técnicas usadas para medir la presencia o la cantidad de marcador(es) magnético(s). El elemento sensor también comprende un punto de unión de túnel magnético en proximidad funcional con respecto al segundo agente de unión que genera una señal provocada en proximidad con respecto al al menos un marcador magnético del segundo agente de unión.

[0139] La presente invención, en general, se refiere al uso del dispositivo de la invención para determinar un analito que se sospecha que está presente en una muestra en dicha muestra.

[0141] La presente invención se refiere, además, a un kit para determinar un analito que se sospecha que está presente en una muestra que comprende el dispositivo de la presente invención.

[0143] El término "kit", como se usa en el presente documento, se refiere a un conjunto de componentes requeridos para llevar a cabo el procedimiento de la presente invención, incluyendo el dispositivo de la presente invención. Típicamente, los componentes del kit se proporcionan en recipientes separados o dentro de un único recipiente. El recipiente también comprende típicamente instrucciones para llevar a cabo el procedimiento de la presente invención. Estas instrucciones pueden estar en forma de un manual o se pueden proporcionar por un código de programa informático que puede llevar a cabo o admitir la determinación del analito al que se hace referencia en los procedimientos de la presente invención cuando se implementa en un ordenador o en un dispositivo de procesamiento de datos. El código de programa informático se puede proporcionar en un medio o dispositivo de almacenamiento de datos como un medio de almacenamiento óptico (por ejemplo, un disco compacto) o directamente en un ordenador o dispositivo de procesamiento de datos o se puede proporcionar en un formato de descarga tal como un enlace a un servidor o nube accesible. Además, el kit puede comprender, normalmente, soluciones de analito con cantidades estandarizadas para calibración o validación u otras cantidades de referencia. El kit de acuerdo con la presente invención también puede comprender otros componentes que son necesarios para llevar a cabo el procedimiento de la invención, tales como soluciones de lavado, disolventes y/o reactivos requeridos para la detección del marcador magnético.

[0145] Figuras

[0147] Figura 1:una vista esquemática de la disposición de sensor. A la izquierda, se muestra un segundo agente de unión libre en una fase de "desbloqueo". El segundo agente de unión se inmoviliza en el soporte sólido y comprende un marcador magnético fuera de la capa de anclaje, así como el dominio de unión, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo. A la derecha, se muestra un complejo que comprende el primer agente de unión, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, que se ancla en la capa de anclaje por medio de un anclaje lipídico, un analito y el segundo agente de unión (fase de "bloqueo"). Debido a la unión de la unión del segundo agente de unión al analito, el marcador magnético se sitúa en la capa de anclaje y, por tanto, en proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético mostrado debajo del soporte sólido. Como consecuencia, se genera una señal o señal alterada que se puede usar para detectar la presencia del complejo y, por consiguiente, la presencia de una molécula de analito en la muestra.

[0149] Figura 2:una vista esquemática de la disposición de sensor. (A) Se muestra un segundo agente de unión libre en una fase de "desbloqueo". Teniendo el segundo agente de unión un dominio de unión, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, estando dicho segundo agente de unión inmovilizado en el soporte sólido y comprende un marcador magnético dentro o fuera de la capa de anclaje que depende de los movimientos moleculares que se pueden realizar por el segundo agente de unión. En esta fase de desbloqueo, el segundo agente de unión deberá poder realizar grandes movimientos moleculares, de modo que la tasa de aparición del marcador magnético en proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético será baja. Como consecuencia, solo se produce un número límite de señales dentro de un margen de tiempo predefinido. (B) Se muestra un segundo agente de unión en un complejo con un analito y un primer agente de unión, es decir, en una fase de "bloqueo". En esta fase de bloqueo, el segundo agente de unión deberá poder realizar solo movimientos moleculares menores, de modo que la tasa de aparición del marcador magnético en proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético será alta. Como consecuencia, solo se produce un mayor número de señales dentro de un margen de tiempo predefinido en comparación con (A).

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

1.Un procedimiento para determinar un analito que se sospecha que está presente en una muestra que comprende:

(a) poner en contacto dicha muestra con un elemento sensor que comprende:

(i) una capa de anclaje que está presente en un soporte sólido;

(ii) un primer agente de unión que se puede unir específicamente al analito, que se ancla en la capa de anclaje; (iii) un segundo agente de unión que se puede unir específicamente al analito cuando se une al primer agente de unión y que se inmoviliza en el soporte sólido, comprendiendo dicho segundo agente de unión al menos un marcador magnético; y

(iv) un punto de unión de túnel magnético en proximidad funcional con respecto al segundo agente de unión que genera una señal provocada en proximidad con respecto al al menos un marcador magnético del segundo agente de unión;

durante un tiempo y en condiciones que permiten la unión específica del analito que se sospecha que está presente en la muestra al primer agente de unión y la unión específica del segundo agente de unión al analito unido al primer agente de unión; y

(b) detectar la formación del complejo del primer agente de unión, el analito y el segundo agente de unión en base a una señal alterada que se genera por el punto de unión de túnel magnético con lo que se determina el analito.

2.El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha formación del complejo del primer agente de unión, el analito y el segundo agente de unión se detecta midiendo la intensidad y/o duración de una señal provocada por el al menos un marcador magnético.

3.El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicha señal se puede detectar durante un período de tiempo característico predeterminado.

4.El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho al menos un marcador magnético se localiza fuera de proximidad funcional si el segundo agente de unión está en un estado no unido y se localiza en proximidad funcional si el segundo agente de unión es parte del complejo.

5.El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho al menos un marcador magnético se localiza fuera de la capa de anclaje si el segundo agente de unión está en un estado no unido y se localiza en la capa de anclaje si el segundo agente de unión es parte del complejo.

6.El procedimiento de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho al menos un marcador magnético se localiza en proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético con una primera tasa de aparición si el segundo agente de unión está en un estado no unido y se pone en proximidad funcional con respecto al punto de unión de túnel magnético con una segunda tasa de aparición si el segundo agente de unión es parte del complejo, en el que dicha segunda tasa de aparición es mayor que la primera tasa de aparición.

7.El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha capa de anclaje es una capa lipídica o bicapa lipídica.

8.El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho primer agente de unión se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo o fragmento del mismo, un aptámero, una molécula receptora o fragmento de la misma y una molécula de ligando o fragmento de la misma.

9.El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho segundo agente de unión se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo o fragmento del mismo, un aptámero, una molécula receptora o fragmento de la misma y una molécula de ligando o fragmento de la misma.

10.El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha determinación de un analito comprende determinar la cantidad de dicho analito.

11.El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha muestra se pone en contacto con al menos 100 elementos sensores, al menos 300 elementos sensores, al menos 500 elementos sensores, al menos 1000 elementos sensores, al menos 5000 elementos sensores, al menos 10.000 elementos sensores, al menos 50.000 elementos sensores o al menos 100.000 elementos sensores.

12.El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicha determinación de la cantidad de dicho analito comprende contar las señales medidas individuales generadas por los puntos de unión de túnel magnéticos.

13.Un dispositivo para determinar un analito que se sospecha que está presente en una muestra que comprende un elemento sensor que comprende:

(i) una capa de anclaje que está presente en un soporte sólido;

(ii) un primer agente de unión que se puede unir específicamente al analito, que se ancla en la capa de anclaje; (iii) un segundo agente de unión que se puede unir específicamente al analito cuando se une al primer agente de unión y que se inmoviliza en el soporte sólido, comprendiendo dicho segundo agente de unión al menos un marcador magnético; y

(iv) un punto de unión de túnel magnético en proximidad funcional con respecto al segundo agente de unión que genera una señal provocada en proximidad con respecto al al menos un marcador magnético del segundo agente de unión.

14.Uso del dispositivo de la reivindicación 13 para determinar un analito que se sospecha que está presente en una muestra en dicha muestra.

15.Un kit para determinar un analito que se sospecha que está presente en una muestra que comprende el dispositivo de la reivindicación 13.