ES3052184T3

ES3052184T3 - Anthracycline encapsulated with polysaccharide for use in the treatment of tumours

Info

Publication number: ES3052184T3
Application number: ES19724635T
Authority: ES
Inventors: Iga Wasiak; Adam Kiciak; Tomasz Ciach; Aleksandra Kulikowska-Darlak; Piotr Pietrzak; Agnieszka Sobiecka; Wioletta Kosnik; Joanna Pietras; Pawel Zero; Pawel Zuk; Justyna Malkowska; Kinga Adamska; Mikolaj Chrominski
Original assignee: Nanovelos SA
Current assignee: Nanovelos SA
Priority date: 2018-03-06
Filing date: 2019-03-05
Publication date: 2026-01-02
Anticipated expiration: 2039-03-05
Also published as: PL424773A1; EP3761955B1; CN112165933B; PL3761955T3; US20210052616A1; WO2019172790A1; EP3761955A1; CN112165933A; KR20200128694A; KR102860522B1; EP3761955C0

Abstract

La invención se refiere a una nueva forma de fármaco en forma de antraciclina encapsulada con un polisacárido seleccionado entre epirubicina, daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina, especialmente encapsulada con dextrano, para su uso en el tratamiento de tumores específicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Antraciclina encapsulada con polisacárido para su uso en el tratamiento de tumores

[0003] Campo técnico

[0004] La invención se refiere a una nueva forma de un fármaco en forma de antraciclina encapsulada con un polisacárido, seleccionado de epirubicina, daunorubicina, doxorubicina, idarubicina, especialmente encapsulada con dextrano, para su uso en el tratamiento de tumores específicos. La nueva forma de administración de fármacos permite aumentar la cantidad relativa de agente quimioterápico administrado, mejorar su direccionamiento al sitio del efecto deseado mientras se garantiza una menor toxicidad para el organismo, lo que hace posible aumentar la eficacia de la terapia antitumoral (contra el cáncer) llevada a cabo usando una antraciclina encapsulada con un polisacárido.Estado de la técnica

[0005] Las antraciclinas pertenecen al grupo de antibióticos antineoplásicos y se usan ampliamente como fármacos quimioterápicos de dosis baja para diversos tumores, en particular, leucemia, cáncer de mama metastásico, cáncer de ovario y cáncer colorrectal. Las antraciclinas interfieren en el funcionamiento de procesos celulares esenciales, incluyendo la lectura y replicación del ADN y la síntesis de proteínas celulares. Estos fármacos incluyen doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, epirubicina, dactinomicina y bleomicina. Las antraciclinas tienen una estructura química muy similar. Las antraciclinas están entre los grupos más activos de fármacos quimioterápicos. Son altamente eficaces contra un espectro de tumores, incluyendo tanto neoplasias hematológicas como tumores sólidos (linfoma, cáncer gástrico, cáncer de pulmón no microcítico, sarcoma, cáncer de mama). Entre los muchos derivados producidos, actualmente se usan varias antraciclinas como fármacos, incluyendo doxorubicina (DOX), daunorubicina (DAU), epirubicina (EPI) e idarubicina (IDA) [véase la bibliografía, punto 200].

[0006] El uso clínico de antraciclinas está limitado por el desarrollo de resistencia a células tumorales y toxicidad para tejidos sanos. Los efectos secundarios particularmente graves de la administración de antraciclina incluyen náuseas y vómitos, mucositis, estomatitis, caída del cabello, mielosupresión, que son reversibles en su mayor parte. La supresión de la médula ósea, aunque reversible, predispone al paciente a complicaciones graves, tales como infecciones durante el tratamiento. La administración de antraciclinas también provoca efectos secundarios irreversibles debido a su alta toxicidad: necrosis de tejidos blandos en el sitio de administración en caso de administración extravascular no intencionada, así como alta cardiotoxicidad (en particular en forma de cardiomiopatía congestiva crónica e insuficiencia cardíaca). Una alta cardiotoxicidad plantea un riesgo particularmente alto cuando se administran antraciclinas en su forma actual, ya que los radicales libres producidos por las antraciclinas provocan peroxidación del retículo sarcoplásmico del corazón, lo que conduce a necrosis mediada por Ca<2+>del miocardio. Dicha toxicidad es selectiva para el tejido cardíaco porque la catalasa capaz de neutralizar radicales libres no está presente en el tejido cardíaco [véase la bibliografía, punto 207].

[0007] Para limitar los efectos secundarios, se estableció que las dosis máximas acumuladas recomendadas de antraciclinas DAU y DOX deben ascender a 500 o de 450 a 600 mg/m<2>, respectivamente [véase la bibliografía, punto 201].

[0008] En diversas situaciones, pueden usarse antraciclinas individuales indistintamente; sin embargo, como regla [véase la bibliografía, punto 202]:

[0009] − la doxorubicina (DOX) se usa para tratar tumores de mama, cáncer de mama, tumores sólidos pediátricos, tumor de Wilms, sarcoma, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma de Ewing, linfoma no Hodgkin, linfoma agresivo, leucemia linfática, leucemia mieloblástica, leucemia aguda, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, cáncer de endometrio, cáncer de pulmón microcítico, cáncer gástrico, cáncer de tiroides papilar y folicular, cáncer de vejiga, osteosarcoma, neuroblastoma,

[0010] − la daunorubicina (DAU) se usa para tratar leucemia, particularmente leucemia linfoblástica aguda y leucemia mieloide,

[0011] − la idarubicina (IDA) se usa para tratar leucemia, especialmente leucemia mieloide aguda y leucemia linfática aguda y cáncer de mama;

[0012] − la epirubicina (EPI) se usa para tratar cáncer de mama, linfoma, incluyendo linfoma maligno, linfoma no Hodgkin, sarcoma, incluyendo de tejidos blandos, cáncer de ovario, leucemia, cáncer de pulmón microcítico, tumor gástrico, tumor de vejiga.

[0013] La patente PL221351 da a conocer un método para obtener nanopartículas a partir de polisacáridos y sus derivados, que son portadores de sustancias activas debido a su oxidación parcial específica para formar grupos aldehído y la unión de compuestos que contienen una amina u otro grupo con una unión a R-NH2 que reacciona con grupos aldehído, en el que la sustancia activa que contiene un grupo de amina, amida o hidrazida puede ser un fármaco, por ejemplo, daunorubicina, doxorubicina. Por consiguiente, el documento PL221351 da a conocer un método para producir antraciclinas encapsuladas con un polisacárido.

[0014] La patente KR 2017 0093400 A da a conocer perlas de dextrano que comprenden un agente antineoplásico de antraciclina tal como clorhidrato de doxorubicina, clorhidrato de epirubicina, idarubicina, daunorubicina.

[0015] Iga WasiakET AL(“Dextran Nanoparticle Synthesis and Properties”, PLOS ONE, vol. 11) da a conocer nanopartículas de dextrano que encapsulan doxorubicina, las nanopartículas se usan para el portador de fármacos, el diámetro de las nanopartículas es de entre 90 y 120 nm.

[0016] AGARWAL AET AL(“Dextran conjugated dendritic nanoconstructs as potential vectors for anti-cancer agent”, BIOMATERIALS, vol. 30, páginas 3588-3596) da a conocer dendrímeros que comprenden dextrano y doxorubicina. Los dendrímeros permiten buenos rendimiento y seguridad del fármaco pero con efectos secundarios y toxicidad reducidos.

[0017] El primer fármaco autorizado para uso médico (FDA, 1995) basado en nanopartículas fue una combinación de liposomas y doxorubicina. Desde entonces, se han autorizado varias combinaciones de nanopartículas con fármacos de antraciclina para uso terapéutico. Sin embargo, todas las soluciones se basan en liposomas, y sólo implican dos fármacos de este grupo: doxorubicina y daunorubicina [véase la bibliografía, punto 208].

[0018] La eficacia de las antraciclinas en el tratamiento de tumores, especialmente doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, epirubicina, se reduce debido a la falta de administración dirigida de fármacos a tejidos con lesiones neoplásicas y bajo índice terapéutico, así como toxicidad relativamente alta.

[0019] Sumario de la invención

[0020] La invención se refiere a una antraciclina encapsulada con un polisacárido para su uso en el tratamiento de tumores, caracterizada porque la antraciclina es epirubicina, el tumor es cáncer de ovario y el polisacárido es dextrano.

[0021] En una realización preferible, la antraciclina encapsulada con un polisacárido para el tratamiento de tumores, las partículas de antraciclina usadas para el tratamiento de tumores tienen un tamaño promedio en el intervalo de 10-500 nm, más preferiblemente 50-200 nm, lo más preferiblemente 70-160 nm (diámetros en un estado hidratado). En dicha realización de la invención, las antraciclinas encapsuladas con un polisacárido pueden usarse para monoterapia, terapia de combinación, uso simultáneo o posterior en terapia antitumoral. Un agente quimioterápico conocido, por ejemplo, cis-platino o un agente radioterápico puede ser un componente auxiliar adicional. Una terapia de este tipo reduce efectos secundarios no deseados.

[0022] En general, las antraciclinas encapsuladas con un polisacárido están destinadas a la administración intravenosa, aunque en realizaciones específicas, por ejemplo, para el tratamiento del cáncer de vejiga, pueden usarse como infusiones intravesicales.

[0023] Las antraciclinas encapsuladas con un polisacárido en uso para el tratamiento del tumor según la invención en forma de formulaciones inyectables terminadas comprenden disoluciones estériles isotónicas acuosas y no acuosas, que contienen opcionalmente antioxidantes, tampones, aditivos isotónicos y similares. Un portador típico es, por ejemplo, agua para inyección o solución salina.

[0024] En general, la formulación para uso final que contiene antraciclinas encapsuladas con un polisacárido para su uso en el tratamiento de tumores según la invención se obtiene diluyéndola o mezclándola con un portador o diluyente. La dosis de antraciclinas encapsuladas con un polisacárido para su uso en el tratamiento del tumor de la invención se determina teniendo en cuenta el tipo de tumor, el tipo de terapia, la edad del paciente, el peso del paciente, la superficie corporal aproximada del paciente, así como otras circunstancias especiales tales como parámetros hepáticos, riñones, antecedentes cardíacos, etc. Un experto en la técnica podrá determinar la dosis correcta para un paciente particular. Sin embargo, la dosis única administrada no debe superar la dosis máxima tolerada establecida para una antraciclina específica encapsulada en un polisacárido específico.

[0025] Breve descripción de las figuras

[0026] Para entenderse mejor la invención, el alcance de la invención se limita a epirubicina encapsulada con dextrano, que se ilustra en realizaciones y las figuras adjuntas, en las que:

[0027] La figura 1 muestra la distribución de diámetros de las nanopartículas obtenidas con el fármaco (A) NPs_EPI, B) NPs-DAU. Distribución de diámetro obtenida después de rehidratación repetida de nanopartículas en agua para inyección después de 3 h.

[0028] La figura 2 es una comparación de citotoxicidad con líneas tumorales seleccionadas. Nanopartículas con epirubicina encapsulada en las líneas A) A2780, B) A549, C) ACHN, D) AU565, E) COLO205, F) OVCAR-3, G) PANC1, H) HeLa y I) MCF7. La designación Epi- se refiere a epirubicina administrada sola, NPs_Epi es la administración de epirubicina encapsulada en dextrano.

[0029] La figura 3 es una comparación de citotoxicidad con líneas tumorales seleccionadas. Nanopartículas con daunorubicina encapsulada en las líneas A) A2780, B) MCF7 C) HeLa, D) OVCAR-3, E) AU565. La designación DAU- se refiere a daunorubicina administrada sola, NPs_DAU es la administración de daunorubicina encapsulada en dextrano.

[0030] La figura 4. El gráfico muestra los cambios en el tamaño tumoral y el peso corporal en ratones durante la determinación de la eficacia antitumoral de epirubicina encapsulada (NPs_Epi) en nanopartículas de dextrano, administrada en dos dosis: 1/2 de MTD (dosis de 3,75 mg/kg de p.c.) y 3/4 de MTD (22,5 mg/kg de p.c.) en comparación con el control (que recibe agua para inyección) y la administración de epirubicina no encapsulada (dosis de 15 mg/kg de p.c.).

[0031] Realizaciones de la invención

[0032] Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar la invención y para clarificar los aspectos individuales de la misma, y no para limitarla, y no debe considerarse que sean equivalentes al alcance total de la misma, que se define en las reivindicaciones adjuntas. En los ejemplos a continuación, a menos que se indique lo contrario, se emplearon materiales y métodos convencionales tal como se usan en la técnica, o se procedió según las recomendaciones del fabricante para materiales y métodos particulares.

[0033] Ejemplos

[0034] Ejemplo 1

[0035] Producción de antraciclinas encapsuladas con un polisacárido

[0036] (a) Preparación de epirubicina encapsulada en dextrano (NPs_EPI)

[0037] Se preparó epirubicina encapsulada en dextrano según el método de preparación de nanopartículas a partir de polisacáridos tal como se describe en la patente PL221251 (véanse, en particular, los ejemplos 2 y 4) que usan dextrano con un peso molecular de 70 kDa (grado de oxidación del 5-15 %) y clorhidrato de dodecilamina. El grado de sustitución de grupos aldehído producidos en dextrano por dodecilamina como agente de enrollamiento es del 10-20 %. El grado de sustitución de grupos aldehído producidos en dextrano por epirubicina es del 4-10 %. Los otros grupos aldehído generados se sustituyeron con alanina. Se prepararon nanopartículas con un tamaño promedio de entre 80 y 140 nm (figura 1A) tal como se mide en disoluciones acuosas usando el equipo NanoSight LM 10 (láser de 405 nm). El contenido de epirubicina determinado en una materia seca de nanopartículas es del 3,0 - 5 %. Se liofilizaron las nanopartículas obtenidas y se almacenaron en recipientes sellados a la temperatura de 4 °C. Antes de las pruebas, se rehidrataron (suspendieron) las nanopartículas de nuevo durante 3 h en agua para inyección.

[0038] (b) Preparación de daunorubicina encapsulada en dextrano (NPs_DAU)(nanopartículas comparativas, que no forman parte de la invención)

[0039] Se preparó daunorubicina encapsulada en dextrano según el método de preparación de nanopartículas a partir de polisacáridos tal como se describe en la patente PL221251 (véanse, en particular, los ejemplos 2 y 4) usando dextrano con un peso molecular de 70 kDa (grado de oxidación del 5-15 %) y clorhidrato de dodecilamina. El grado de sustitución de grupos aldehído producidos en dextrano por dodecilamina de agente de bobinado es del 10-20 %. El grado de sustitución de grupos aldehído producidos en dextrano por daunorubicina es del 4-10 %. Los otros grupos aldehído generados se sustituyeron con alanina. Se produjeron nanopartículas con un tamaño promedio de entre 80 y 140 nm (figura 1B) tal como se mide en disoluciones acuosas usando el equipo NanoSight LM 10 (láser de 405 nm). El contenido de daunorubicina determinado en una materia seca de nanopartículas es del 3,0 - 5 %. Se liofilizaron las nanopartículas obtenidas y se almacenaron en recipientes sellados a la temperatura de 4 °C. Antes de las pruebas, se rehidrataron (suspendieron) las nanopartículas de nuevo durante 3 h en agua para inyección.

[0040] (c) Preparación de doxorubicina encapsulada en dextrano (NPs_DOX)(nanopartículas comparativas, que no forman parte de la invención)

[0041] Se preparó doxorubicina encapsulada en dextrano según el método de preparación de nanopartículas a partir de polisacáridos tal como se describe en la patente PL221251 (véanse, en particular, los ejemplos 2 y 4) usando dextrano con un peso molecular de 70 kDa (grado de oxidación del 5-15 %) y clorhidrato de dodecilamina. El grado de sustitución de grupos aldehído producidos en dextrano por dodecilamina como agente de enrollamiento es del 10-20 %. El grado de sustitución de grupos aldehído producidos en dextrano por doxorubicina es del 4-10 %. Los otros grupos aldehído generados se sustituyeron con alanina. Se produjeron nanopartículas de 80-150 nm tal como se mide en disoluciones acuosas usando el equipo NanoSight LM 10 (láser de 405 nm). El contenido de doxorubicina determinado en una materia seca de nanopartículas es del 3,0-5 %. Se liofilizaron las nanopartículas obtenidas y se almacenaron en recipientes sellados a la temperatura de 4 °C. Antes de las pruebas, se rehidrataron (suspendieron) las nanopartículas de nuevo durante 3 h en agua para inyección.

[0042] (d) Preparación de idarubicina encapsulada en dextrano (NPs_IDA)(nanopartículas comparativas, que no forman parte de la invención)

[0043] Se preparó idarubicina encapsulada en dextrano según el método de preparación de nanopartículas a partir de polisacáridos tal como se describe en la patente PL221251 (véanse, en particular, los ejemplos 2 y 4) usando dextrano con un peso molecular de 70 kDa (grado de oxidación del 5-15 %) y clorhidrato de dodecilamina. El grado de sustitución de grupos aldehído producidos en dextrano por dodecilamina como agente de enrollamiento es del 10-20 %. El grado de sustitución de grupos aldehído producidos en dextrano por idarubicina es del 4-10 %. Los otros grupos aldehído generados se sustituyeron con alanina. Se produjeron nanopartículas con un tamaño promedio de 80 - 150 nm, tal como se mide en disoluciones acuosas usando el equipo NanoSight LM 10 (láser de 405 nm). El contenido de idarubicina determinado en una materia seca de nanopartículas es del 3,0-5 %. Se liofilizaron las nanopartículas obtenidas y se almacenaron en recipientes sellados a la temperatura de 4 °C. Antes de las pruebas, se rehidrataron (suspendieron) las nanopartículas de nuevo durante 3 h en agua para inyección.

[0044] Se usó un método similar para preparar nanopartículas encapsuladas con otro polisacárido: celulosa, amilosa, almidón y heparina, que encapsula: epirubicina, daunorubicina, doxorubicina e idarubicina. Se usó un método similar para obtener nanopartículas de polisacáridos particulares dextrano y celulosa, amilosa, almidón, heparina, que no contenían antraciclinas, y que sirvieron como controles en estudios adicionales.

[0045] Ejemplo 2

[0046] Determinación de la citotoxicidad de antraciclinas encapsuladas con un polisacárido en líneas celulares (nanopartículas combinadas con el fármaco)

[0047] La invención se limita a epirubicina encapsulada en nanopartículas de dextrano.

[0048] El objeto del estudio fue determinar la citotoxicidad de una combinación de antraciclinas encapsuladas con un polisacárido EPI, DAU, DOX, IDA en líneas celulares. Se evaluó la toxicidad usando un método cuantitativo basado en la técnica colorimétrica (MTT) [véase el punto 203 de la bibliografía]. En este ensayo, la ámbar deshidrogenasa presente en las células convierte la sal de tetrazolio soluble (bromuro de 3-4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) en una forma reducida. La reacción produce formazano cristalino de color morado insoluble en agua. El número de cristales formados depende de la actividad enzimática de modo que es directamente proporcional al número de células viables en la muestra. La medición espectrofotométrica requiere el uso de un disolvente orgánico para disolver los cristales obtenidos (isopropanol). Se mide el cambio en la intensidad de color mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 570 nm. Se realizó la prueba para varias diluciones (9) de disoluciones de nanopartículas que contenían la antraciclina sometida a prueba. La concentración de nivel inicial de nanopartículas para las pruebas de MTT fue de 2,5 mg de nanopartículas/ml. Se compararon los resultados con los resultados de citotoxicidad obtenidos para fármacos puros con concentración de fármaco equimolar (igual a la concentración encapsulada en nanopartículas). El estudio también se realizó para nanopartículas libres de fármaco (se obtuvo el propio portador de manera similar a las nanopartículas con el fármaco). Se usaron células no expuestas a sustancias tóxicas como control para estudios de toxicidad.

[0049] Protocolo del estudio[véanse los puntos 204, 205 de la bibliografía].

[0050] Después de alcanzar una confluencia del 85-90 %, se tripsinizaron las células usando una disolución de tripsina al 0,25 %. Entonces se centrifugaron las células (1200 rpm, 5 min) y se suspendieron en un medio de cultivo adecuado para una línea celular particular. El medio no contenía rojo de fenol. Se sembraron las células a una concentración de 1000 células/100 µl de medio por pocillo de cultivo (placas de 96 pocillos). Se incubaron las placas preparadas (37 °C/5 %CO<2>/de 22 h a 26 h). Posteriormente, se reemplazó el medio de cultivo por uno nuevo (100 µl) que contenía la concentración apropiada de las nanopartículas sometidas a prueba y se dejó aparte durante 24 h (37 °C/5 %CO<2>). Después de transcurrir el tiempo de prueba, se retiró el medio y se reemplazó por 50 µl de una disolución de reactivo de MTT a una concentración de 1 mg/ml. Se incubó la placa durante 2 horas (37 °C/5 % de CO<2>). Posteriormente, se retiró la disolución de MTT y se añadieron 100 µl de isopropanol. Después de agitar la placa en el agitador durante 2 minutos, se leyeron los resultados para una longitud de onda de 570 nm (valor de referencia de 650 nm). El valor medio de la absorbancia leída DO570 de las células no expuestas a un agente tóxico (control) debe estar por encima de 0,7 [véase el punto 206 de la bibliografía].

[0051] Análisis de datos

[0052] Una disminución del número de células viables provoca una disminución de la actividad metabólica en la muestra. Esta reducción se correlaciona directamente con la cantidad de formazano de color azul y morado formado, monitorizado basándose en la densidad óptica a 570 nm. Se usa la siguiente ecuación (C.1) para calcular la reducción de viabilidad en comparación con el control:

[0054]

[0056] en la que: • DO570e es el valor medio de la absorbancia medida de las muestras de prueba; • DO570b es el valor medio de la absorbancia medida del control.

[0057] Los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente usando la prueba Q de Dixon.

[0058] Tabla 1. Líneas celulares sometidas a rueba:

[0061]

[0063] La toxicidad de la formulación de nanopartículas de prueba que contiene una antraciclina debe ser similar a la de un fármaco puro. No debe haber toxicidad de las nanopartículas tal cuales.

[0064] Análisis de toxicidad de nanopartículas de polisacárido sin antraciclina

[0065] Los resultados obtenidos confirmaron la falta de toxicidad del portador solo en forma de nanopartículas de polisacárido en forma de nanopartículas de dextrano para todas las líneas celulares sometidas a prueba. Se obtuvieron resultados similares para los otros portadores de polisacárido (portadores en forma de nanopartículas de celulosa, amilosa, almidón y heparina).

[0066] La concentración más alta de nanopartículas (2,5 mg nanopartículas/ml) provoca una disminución de hasta el 20 % de la toxicidad (tabla 1).

[0067] Tabla 1. Muestra el resultado del ensayo de citotoxicidad de MTT en la línea celular HeLa para el portador de dextrano

[0069]

[0071] donde D.E.: desviación estándar para n=8

[0073] Análisis de toxicidad de nanopartículas de polisacárido con antraciclina

[0075] Los estudios realizados para nanopartículas que contienen antraciclina (producidas según el ejemplo 1) mostraron en su mayoría un perfil de toxicidad similar al de un fármaco puro (por ejemplo, figura 2, gráfico de toxicidad de nanopartículas de DAU para la línea celular MCF-7 y nanopartículas de EPI para la línea celular COLO 205). Por otro lado, se observó mayor toxicidadin vitropara algunas líneas celulares a pesar del uso de una concentración de fármaco equimolar (por ejemplo, figura 3D (OVCAR3_NPs-DAU) gráfico de toxicidad para nanopartículas de DAU-dextrano en la línea celular OVCAR-3, figuras 2A, B, C, F, G gráficos de toxicidad para NPs_EPI). Tal resultado indica que las líneas celulares seleccionadas, y, por consiguiente, los tumores correspondientes, son más sensibles a fármacos encapsulados en nanopartículas de polisacárido debido a que no hay ningún mecanismo de defensa frente a fármacos encapsulados en nanopartículas de polisacárido o al aumento de absorción por las células de tales estructuras. Para las pruebas con animales dadas a conocer en los siguientes ejemplos, se seleccionaron líneas tumorales con una respuesta tóxica más alta en una línea tumoral dada que el fármaco puro o que tenían al menos la misma respuesta. Tal elección estaba dictada por la mayor eficacia esperada de la formulación contra el tumor o al menos la misma eficacia de la formulación en la forma encapsulada con el polisacárido. Se presentan los resultados obtenidos en los gráficos de la figura 2 y la figura 3 y en la tabla 2 a continuación.

[0076]

[0078] 

[0080]

[0081]

[0082]

[0083]

[0085] 

[0088]  Ejemplo 3.

[0089] Determinación de la eficacia antitumoral de antraciclinas encapsuladas con un polisacárido

[0090] A) Determinación de una dosis máxima tolerada (MTD) para epirubicina encapsulada en dextrano (NPs-EPI)Se realizó la evaluación de la toxicidad tras dosis única de antraciclina encapsulada con un polisacárido en forma de epirubicina encapsulada en dextrano (NPs-EPI) tal como se produce en el ejemplo 1 con la determinación de MTD usando el procedimiento de toxicidad tras dosis única por vía oral - aumento y disminución según el procedimiento de OCDE n.º 425 con una modificación de la vía de administración del material de prueba.

[0091] La administración intravenosa(i.v.; en la vena caudal) estaba dictada por cómo se administra epirubicina en su forma usada actualmente, es decir, clorhidrato de epirubicina (EPI), a pacientes, y se administrarán NPs-EPI si se demuestra su eficacia antitumoral.

[0092] El método de evaluación de toxicidad tras dosis única usado es un método alternativo recomendado por la OCDE (procedimiento 425 de la OCDE), que tiene en cuenta el objetivo de mejorar el bienestar animal y el principio de las 3R(reemplazo, reducción, refinamiento).

[0093] El procedimiento de evaluación de la toxicidad tras dosis única de dosis más alta-más baja implica administrar material de prueba a un animal individual a una dosis única más baja que la mediana de dosis letal esperada (DL<50>). Dependiendo del efecto obtenido tras la administración de la primera dosis del material de prueba o referencia, al siguiente sujeto se le administró una dosis aumentada o reducida en un coeficiente fijo. Este procedimiento se continuó secuencialmente hasta alcanzar una dosis, cuyo aumento (por el coeficiente establecido) provocó la muerte, y cuya disminución (por el coeficiente establecido) dio como resultado la supervivencia del animal.

[0094] Tras la determinación de la MTD para NPs-EPI (epirubicina encapsulada en dextrano) en la parte A del experimento, se realizó la parte B del experimento para comparar la toxicidad tras dosis única y la MTD de EPI libre (en forma de clorhidrato de epirubicina) a una dosis equivalente a la dosis del fármaco contenido en la combinación del mismo con NPs (EPI-NPs) a una dosis que constituye la MTD.

[0095] B) Evaluación comparativa de la toxicidad tras dosis única y la MTD de EPI libre a una dosis equivalente a la del fármaco contenido en la combinación del mismo con NPs (NPs-EPI) a una dosis que constituye la MTD

[0096] Se llevó a cabo la evaluación de la toxicidad tras dosis única de EPI a una dosis equivalente a su contenido en la dosis que constituye la MTD de NPs-EPI (determinada durante la implementación de la parte A del experimento) usando el método de aumento y disminución según el procedimiento OCDE no 425.

[0097] Se administraron a ratones una vez epirubicina encapsulada en dextrano (NPs-EPI) y epirubicina en forma libre, es decir, de clorhidrato de epirubicina EPI, en la vena caudal. Dos horas antes de la administración de NPs-EPI y EPI, los animales fueron privados de alimento. 30 minutos después de la administración de NPs-EPI (material de prueba) y EPI (material de referencia), se puso de nuevo el pienso a disposición de los ratones. La administración de otra dosis al siguiente animal tuvo lugar después de que se obtuvo el resultado de la administración de la dosis previa. La dosis de nivel inicial de NPs-EPI contenía el equivalente de 27,39 mg de EPl/kg de p.c. (peso corporal). La EPI como material de referencia se administró a una dosis de 30 y 31 mg/kg de p.c. Se administraron NPs-EPI y EPI a ratones en forma de disoluciones acuosas (agua para inyección) en volúmenes de no más de 0,18 cm<3>/ratón. La cantidad de la dosis administrada al siguiente animal dependía del resultado de la administración de la dosis previa. Si el animal sobrevivió 48 horas después de la administración, se aumentó la dosis para el siguiente animal en un coeficiente modificado de más de 1 y menos de 1,3 (se usaron los coeficientes 1,02; 1,05; 1,10 y 1,15). Si moría el animal, se redujo la dosis para el siguiente sujeto en el mismo coeficiente. Se administró el material de prueba hasta que se alcanzó la dosis en la que 3 animales posteriores sobrevivieron a la administración de la dosis más alta. Mediante el procedimiento de la OCDE n.º 425, el coeficiente de modificación de la dosis recomendado es de 3,2, pero debido a la pequeña diferencia entre la dosis terapéutica mínima y la MTD para la EPI, fue necesario usar un coeficiente mediante el cual se modificaron dosis sucesivas de la nueva formulación de dicho fármaco (NPs-EPI) que era significativamente menor de 1,3 (no tal como se proporciona en 425 de la OCDE). El método de los animales de codificación individual no se conocía por las personas que se encargaron de los animales y realizaron los procedimientos planificados que forman parte del estudio.

[0098] Por consiguiente, se determinó la dosis máxima tolerada (MTD) para la antraciclina NPs-EPI encapsulada con un polisacárido para la administración intravenosa a ratones en 30 mg/kg de p.c. (basado en la EPI) (90 mg/m<2>).

[0099] C) Determinación de la eficacia antitumoral de epirubicina encapsulada en nanopartículas de dextrano en tumor de ovario

[0100] El objeto del estudio es determinar la eficacia antitumoral y los posibles efectos adversos de la terapia con NPs-EPI frente a la forma clásica de EPI en ratones con xenoinjerto implantado (modelo de tumor de ovario). El estudio usó epirubicina encapsulada en nanopartículas de dextrano (NPs-EPI) preparadas según el ejemplo 1. La epirubicina no penetra en la barrera hematoencefálica, y se elimina en tres etapas. La semivida biológica (t<1/2>) es de 15-45 h, aprox.

[0101] 40 h en promedio.

[0102] Obtención de un modelo de estudio tumoral

[0103] Para desarrollar un modelo tumoral, se implantaron células tumorales de ovario de la línea OVCAR3 en ratones hembra de la cepa endogámica CByJ.Cg-Foxn1<nu>/cmdb. Después de la anestesia, se inyectaron 5 x 10<5>células tumorales de ovario (células de la línea OVCAR3) en el volumen de 100 µl de PBS y Matrigel por vía subcutánea (s.c.) en el lado derecho de los ratones hembra. Durante la implantación celular, los animales no experimentaron ningún dolor, ya que se introdujeron previamente en un estado de narcosis por inhalación leve usando isoflurano. Después de que el tumor creció hasta el tamaño de aprox.150 mm<3>, se dividieron los ratones en 3 grupos:

[0104] K1/OVCAR3 - grupo de control A, que recibió agua para inyección;

[0105] NPs/EPI/OVCAR3 - el grupo que recibió epirubicina encapsulada con nanopartículas de dextrano (NPs-EPI) en la cantidad de 22,5 mg/kg de p.c. (67,5 mg/m<2>) - grupo de prueba B, y grupo de prueba C que recibió NPs-EPI en la cantidad de 3,75 mg/kg de p.c. (11,25 mg/m<2>);

[0106] EPI/OVCAR3 - grupo de referencia D, que recibió epirubicina en la forma convencional como clorhidrato de epirubicina en la cantidad de 15 mg/kg de p.c. (45 mg/m<2>).

[0107] Se trataron todos los ratones, excepto los animales que constituyen el grupo de referencia, con EPI encapsulada en nanopartículas de dextrano (NPs-EPI) o la forma convencional (EPI). Durante el tratamiento, se midió el tamaño de los tumores y se observaron los animales estrechamente. Después del final del tratamiento, se realizaron mediciones tumorales, exámenes hematológicos, así como exámenes macroscópicos e histopatológicos de órganos internos y tumores para permitir la evaluación de la eficacia y seguridad de usar la terapia antitumoral con NPs-EPI en comparación con la forma convencional del fármaco.

[0108] Procedimientos realizados en el grupo de control K1/OVCAR3 (administración de agua para inyección en la vena caudal)

[0109] A las hembras con tumores inducidos, que constituyen el grupo de referencia (K1/OVCAR3), calificadas para la evaluación de la eficacia antitumoral de NPs-EPI en un modelo de ratón de tumor de ovario (línea celular OVCAR3), se les administró agua para inyección cada dos días (10 administraciones) en la vena caudal. Se administró agua para inyección (duración de la administración única - 30 segundos/ratón) a un volumen de 0,18 cm<3>/ratón. Durante la administración intravenosa de agua para inyección, los animales no experimentaron ningún dolor asociado con el método de administración, ya que se había anestesiado previamente el sitio de administración pulverizándolo con lidocaína al 10 %. Se administró el agua para inyección 10 veces. Se sacrificaron todos los ratones de este grupo un día después de los 10ª administración de agua para inyección.

[0110] Procedimiento en el grupo de prueba EPIIOVCAR3-modelo de ratón del tumor de ovario con células de la línea OVCAR3 implantadas

[0111] A ratones hembra con tumores inducidos calificados para la evaluación de la eficacia antitumoral de EPI/OVCAR3 en un modelo de ratón de tumor de ovario, la línea celular OVCAR3, se administró EPI en la vena caudal (duración de la aplicación - 30 segundos/ratón), una vez al día, cada dos días (2 administraciones) a una dosis equivalente al contenido de fármaco en una dosis de 15 mg/kg de p.c. de EPI (1/2 MTD para epirubicina en nanopartículas de dextrano) se administró a ratones en forma de disoluciones acuosas en volúmenes de no más de 0,18 cm<3>/ratón. Para administrar la misma dosis de EPI a los animales, se pesaron los animales antes de cada administración, y se modificó el volumen de las disoluciones administradas en función del cambio en el peso corporal. Durante la administración intravenosa de disoluciones de EPI, los animales no experimentaron ningún dolor asociado con el método de administración, ya que se anestesió el sitio de administración pulverizándolo con lidocaína al 10 %.Administración de NPs-EPI en el grupo de prueba NPsEPIIOVCAR3 a dosis de 3,75 y 22,5 mg/kg de p.c. en un modelo de ratón del tumor de ovario con células de la línea OVCAR3 implantadas

[0112] A ratones hembra con tumores inducidos calificados para la evaluación de la eficacia antitumoral de NPs-EPI en el modelo de ratón de tumor de ovario (línea celular OVCAR3) se les administró NPs-EPI en la vena caudal una vez al día, cada dos días a dosis de 3,75 mg/kg de p.c. que constituyen 1/8, y 22,5 mg/kg de p.c. que constituyen 3/4 de la MTD para NPs-EPI administrado a ratones como disoluciones acuosas en volúmenes de no más de 0,18 cm<3>/ratón. Para administrar la misma dosis de NPs-EPI a los animales, se pesaron los animales antes de cada administración, y se modificó el volumen de las disoluciones administradas en función del cambio en el peso corporal. Durante la administración intravenosa de disoluciones de NPs-EPI, los animales no experimentaron ningún dolor asociado con el método de administración, ya que se había anestesiado previamente el sitio de administración pulverizándolo con lidocaína al 10 %.

[0113] Se presentan los resultados obtenidos en gráficos en las figuras 4A y B y en las tablas 4-15 a continuación.

[0114] Tabla 4. Peso corporal de los ratones en el grupo de K1/OVCAR durante la administración intravenosa de agua para in ección resultados detallados .

[0116]

[0118] Tabla 5. Tamaño tumoral de los ratones en el grupo de K1/OVCAR durante la administración intravenosa de agua ara in ección resultados detallados .

[0120]

[0122] Tabla 6. Resultados de observaciones macroscópicas durante la necropsia de los ratones en el grupo de K1/OVCAR al ue se le administró a ua ara in ección ratón n.º 3

[0124]

[0125] Tabla 7. Peso corporal de los ratones del grupo de NPsEPI/OVCAR3 durante la administración intravenosa de NPs-EPI a una dosis de 375 m /k de .c. resultados detallados

[0127]

[0130] Tabla 8. Tamaño tumoral en los ratones del grupo de NPsEPI/OVCAR3 durante la administración intravenosa de NPs-EPI a una dosis de 375 m /k de .c. resultados detallados .

[0132]

[0135] Tabla 9. Resultados de observaciones macroscópicas durante la necropsia del grupo de NPsEPI/OVCAR3 que recibió NPs-EPI a una dosis de 3,75 mg/kg de p.c. (ratón #17).

[0138]

[0139] Tabla 10. Peso corporal de los ratones del grupo de NPsEPI/OVCAR3 durante la administración intravenosa de NPs-EPI a una dosis de 2250 m /k de .c. resultados detallados

[0141]

[0144] *** - peso del ratón antes de la necropsia

[0146] Tabla 11. Tamaño tumoral en los ratones del grupo de NPsEPI/OVCAR3 durante la administración intravenosa de NPs-EPI a una dosis de 225 m /k de .c. resultados detallados .

[0148]

[0151] Tabla 12. Resultados de observaciones macroscópicas durante la necropsia del ratón n.º 4 que recibió NPs-EPI a una dosis de 22,5 mg/kg de p.c.

[0154]

[0155] Tabla 13. Peso corporal de los ratones del grupo de EPI/OVCAR3 durante la administración intravenosa de NPs-EPI a una dosis de 15 m /k de .c. resultados detallados

[0158]

[0160] *** - peso del ratón antes de la necropsia

[0162] Tabla 14. Tamaño tumoral en los ratones del grupo de EPI/OVCAR3 durante la administración intravenosa de EPI a una dosis de 15 m /k de .c. resultados detallados .

[0164]

[0166] * - el ratón murió directamente después de la administración de EPI

[0168] Tabla 15. Resultados de observaciones macroscópicas durante la necropsia del grupo de EPI/OVCAR3 que recibió EPI a una dosis de 15 mg/kg de p.c. (ratón #5).

[0171]

[0172] de la piel.

[0173] La administración de EPI a los ratones del grupo de EPI/OVCAR3 dio como resultado la muerte de los ratones tan pronto como el 4º día después de la primera administración del fármaco (después de la segunda administración), un ratón murió directamente después de la primera administración de EPI, mientras que los ratones del grupo de NPs/EPI/OVCAR3 que recibieron NPs-EPI en ambas concentraciones sobrevivieron al final del experimento.

[0174] Los ratones del grupo de EPI/OVCAR3 que recibieron EPI presentaron grave inflamación y cambios en la estructura del hígado, así como cambios en el color y la estructura del bazo en comparación con el grupo de control de K1/OVCAR. Tales cambios no se observaron en el grupo de NPsEPI/OVCAR3, que recibió NPs-EPI. El fármaco puro da como resultado un daño significativo en vasos sanguíneos locales, daño hepático y la necesidad de sacrificar los animales debido a caquexia, que no se observa para epirubicina administrada en la forma encapsulada con un polisacárido.

[0175] Se observa una disminución significativa del tamaño del tumor de ovario inducido en los ratones del grupo de NPsEPI/OVCAR3 que recibieron NPs-EPI en ambas concentraciones (figuras 4A y B) en comparación con el tamaño de los tumores en el grupo de control, con una disminución aumentada del tamaño tumoral observada cuando se administra una dosis más alta de NPs-EPI.

[0176] Sorprendentemente, se halló que el uso de una antraciclina encapsulada con un polisacárido en lugar de su forma no encapsulada, por ejemplo, NPs-EPI en lugar de EPI, reduce la toxicidad del fármaco suficientemente (a pesar de no ser una forma del fármaco con un factor de direccionamiento a células diana unido) para permitir la administración intravenosa de una dosis más alta del fármaco y lograr una reducción más rápida del volumen tumoral.

[0177] Ejemplo 4.

[0178] Comparación de la eficacia antitumoral, seguridad, efectos secundarios de la terapia usando NPs-EPI de epirubicina encapsulada y EPI en forma libre en un modelo de tumor de ovario de ratón con células de la línea OVCAR3 implantadas

[0179] Según el ejemplo 1, se prepararon nanopartículas de dextrano NPs sin epirubicina, nanopartículas con epirubicina encapsuladas en nanopartículas de dextrano (NPs-EPI). Se cambió el protocolo de administración en comparación con el ejemplo 3 para administrar la dosis de EPI o NPs-EPI cada 3 días en una cantidad basada en 10 mg/kg de p.c. de epirubicina o administrar NPs como control. Siguiendo el ejemplo 3, se obtuvieron ratones que constituían un modelo de prueba de tumor de ovario, que se dividieron en 3 grupos.

[0180] L - - grupo de control al que se le inyectaron NPs;

[0181] J - el grupo de prueba que recibió epirubicina encapsulada en nanopartículas de dextrano (NPs-EPI) en la cantidad de 10 mg/kg de p.c.

[0182] K - el grupo de prueba que recibió epirubicina en forma de clorhidrato de epirubicina en la cantidad de 10 mg/kg de p.c.

[0183] Los resultados obtenidos en forma del tamaño de los cambios tumorales en ratones individuales y el volumen tumoral promedio se presentan en las tablas 16 y 17 a continuación.

[0184] Tabla 16. Cambios en el volumen tumoral tras administraciones osteriores de NPs-EPI EPI NPs a ratones.

[0186]

[0188] E porcentaje de aumento (↑) o disminución (↓) del volumen tumoral en comparación con el volumen antes del comienzo de la administración

[0189] F se sacrificó el ratón antes por motivos humanitarios

[0190] G tras 12 administraciones en todos los animales en el grupo

[0191] H tras de 3 a 7 administraciones en todos los animales en el grupo

[0192] I después de 3 administraciones en todos los animales en el grupo

[0193] Tabla 17. Comparación de cambios en el volumen tumoral promedio tras administraciones posteriores de NPs-EPI, EPI NPs a ratones.

[0195]

[0197] G tras 12 administraciones en todos los animales en el grupo

[0198] H tras de 3 a 7 administraciones en todos los animales en el grupo

[0199] I después de 3 administraciones en todos los animales en el grupo

[0200] J porcentaje de aumento (↑) o disminución (↓) del volumen tumoral promedio en comparación en el grupo con el volumen antes del comienzo de la administración

[0201] K se sacrificaron todos los ratones del grupo antes por motivos humanitarios

[0202] Los resultados presentados indican que la epirubicina encapsulada en nanopartículas de dextrano (NPs-EPI) tiene una mayor eficacia antitumoral y efectos adversos menos pronunciados que la EPI. La mayor toxicidad de EPI también se demuestra por el hecho de que tan pronto como tras 3 administraciones de dosis de fármaco, el peso corporal disminuyó en un 22,55 % en promedio, mientras que durante todo el tratamiento con NPs-EPI (3-7 dosis), el peso corporal de los animales disminuyó en un promedio del 11,37 %.

[0203] Por tanto, la administración de NPs-EPI mejora y prolonga el tiempo de supervivencia total.

[0204] El análisis del cambio promedio en el volumen tumoral mostró que en los animales tratados con NPs-EPI, los tumores disminuyeron en promedio en un 4,31 % tan pronto como después de la administración de la primera dosis, mientras que en los animales que recibieron EPI durante el mismo periodo se observó que el tumor aumentaba en un 3,63 % en promedio. Durante la administración de NPs-EPI, se observó una mayor eficacia a lo largo del tiempo, lo que puede confirmar la liberación gradual del fármaco a partir de nanopartículas de dextrano. Las imágenes microscópicas de órganos internos indicaron una menor toxicidad de NPs-EPI a una dosis de 10 mg/kg de p.c. frente a la dosis equivalente de EPI (tabla 18).

[0205] Tabla 18.

[0207]

[0209] La administración de NPs-EPI dio como resultado, de manera observable, un aumento de la supervivencia de los ratones, lo que permitió la administración del fármaco durante un tiempo más largo, lo que indica que la encapsulación de EPI en nanopartículas de polisacárido mejora la eficacia del tratamiento con una disminución de la toxicidad.

[0210] El uso de fármacos del grupo de las antraciclinas, preferiblemente epirubicina, daunorubicina, doxorubicina, idarubicina en forma de nanopartículas encapsuladas con un polisacárido, en particular, nanopartículas de epirubicina, daunorubicina, doxorubicina, idarubicina encapsuladas con dextrano reduce la toxicidad de estos compuestos. La encapsulación de estas antraciclinas con dextrano permite administrar una dosis intravenosa más alta del fármaco, tal como epirubicina, tal como se demuestra en cultivos tisulares de diversos tumores, cuyo tratamiento usa estas antraciclinas, así como en un modelo de ratón de tumor de ovario.

[0211] Debido a curvas similares de efecto sobre cultivos tisulares de tumor de mama, cáncer cervicouterino, cáncer de ovario, tumor de páncreas, tumor de riñón, tumor de pulmón, líneas de cáncer de tumor colorrectal obtenidas para epirubicina, daunorubicina, doxorubicina, idarubicina encapsulada tanto con dextrano como con otros polisacáridos, que en la nueva forma reducen la toxicidad de dichos fármacos para el organismo (no estando claro el mecanismo de ello, ya que son partículas sin partículas de direccionamiento unidas), se obtienen resultados similares de eficacia aumentada del fármaco combinados con una toxicidad sistémica reducida, con la posibilidad de administrar una dosis más alta del fármaco para epirubicina, daunorubicina, doxorubicina, idarubicina encapsuladas tanto con dextrano como con otros polisacáridos: celulosa y sus derivados, amilosa, almidón y heparina.

[0212] Sorprendentemente, se halló que la nueva forma de administración de antraciclina en forma de epirubicina, daunorubicina, doxorubicina, idarubicina encapsuladas con un polisacárido, particularmente epirubicina encapsulada con dextrano, permite lograr un efecto terapéutico mientras se usan dosis más bajas del fármaco, y también permite administrar dosis más altas del fármaco, una terapia más larga debido a su toxicidad reducida para el organismo, lo que proporciona una eficacia mejorada del tratamiento del tumor. El fármaco puro da como resultado un daño significativo en vasos sanguíneos locales, daño hepático, tal como se observa en un modelo con animales, ya que en un estudio con EPI a modo de ejemplo fue necesario sacrificar los animales debido a caquexia mucho antes que cuando se administran NPs-EPI.

[0213] Lo que es muy prometedor no solo es el logro inesperado del efecto de la toxicidad reducida del fármaco, sino también la posibilidad de usar epirubicina encapsulada, particularmente encapsulada con dextrano, para tratar el tumor de páncreas (toxicidad significativamente aumentada observada para células PNAC1 - figura 3G.), en cuyo tratamiento, según la técnica, este agente quimioterápico fue completamente ineficaz a pesar de los intentos realizados.

[0214] Bibliografía

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Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Antraciclina encapsulada con un polisacárido para su uso en el tratamiento de tumores, caracterizada porque la antraciclina es epirubicina, el tumor es cáncer de ovario y el polisacárido es dextrano.

2. Antraciclina encapsulada con el polisacárido para su uso en el tratamiento de tumores según la reivindicación 1, caracterizada porque las partículas de antraciclina encapsuladas con el polisacárido tienen en el estado hidratado un tamaño promedio en el intervalo de 10-500 nm, más preferiblemente 50-200 nm, lo más preferiblemente 70-160 nm.