ES3054134T3

ES3054134T3 - Slow intraventricular delivery

Info

Publication number: ES3054134T3
Application number: ES18188582T
Authority: ES
Inventors: James Dodge; Marco Passini; Lamya Shihabuddin; Seng Cheng
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2006-02-09
Filing date: 2007-02-08
Publication date: 2026-01-30
Anticipated expiration: 2027-02-08
Also published as: JP2016028711A; US20190328682A1; CA2641359A1; DK1988823T3; JP2014012694A; PT1988823T; US11253485B2; LT1988823T; CA2641359C; EP1988823A4; MX392030B; CA3168881C; JP6408970B2; MX361816B; WO2007095056A2; MX358492B; JP2009526066A; EP3459441A1; IL248492A0; CN101404927A

Abstract

Las enfermedades neurológicas, incluidas las enfermedades por depósito lisosomal, pueden tratarse con éxito mediante la administración intraventricular de agentes terapéuticos para eludir la barrera hematoencefálica. De igual manera, los agentes de diagnóstico y anestésicos pueden administrarse al cerebro de esta manera. La administración puede realizarse lentamente para lograr el máximo efecto. Esta administración permite una mayor penetración en las porciones distales del cerebro. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Administración intraventricular lenta

[0003] CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

[0004] Esta invención se refiere a la administración de agentes al cerebro. En particular, se refiere al diagnóstico, tratamiento, y formación de imágenes del cerebro.

[0005] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0006] Un grupo de trastornos metabólicos, conocidos como enfermedades del almacenamiento lisosómico (LSD), incluye alrededor de cuarenta trastornos genéticos, muchos de los cuales implican defectos genéticos en diversas hidrolasas lisosómicas. En la Tabla 1 se enumeran las enfermedades del almacenamiento lisosómico representativas y las enzimas defectuosas asociadas.

[0008] TABLA 1

[0010]

[0011]

[0013] La característica distintiva de LSD es la acumulación anormal de metabolitos en los lisosomas, lo que conduce a la formación de grandes números de lisosomas hinchados en el pericarion. Un reto importante para tratar LSD (en oposición al tratamiento de una enzimopatía específica del hígado) es la necesidad de invertir la patología del almacenamiento lisosómico en múltiples tejidos distintos. Algunas LSD se pueden tratar eficazmente mediante infusión intravenosa de la enzima perdida, conocido como terapia de sustitución enzimática (ERT). Por ejemplo, los pacientes con Gaucher tipo 1 tienen solamente enfermedad visceral, y responden favorablemente a la ERT con glucocerebrosidasa recombinante (Cerezyme<™>, Genzyme Corp.). Sin embargo, los pacientes con enfermedad metabólica que afecta al SNC (por ejemplo, enfermedad de Gaucher tipo 2 o 3) no responden eficazmente a la ERT intravenosa, debido a que se evita que la enzima de sustitución entre en el cerebro mediante la barrera hematoencefálica (BBB). Además, los intentos para introducir una enzima de sustitución en el cerebro mediante inyección directa se han limitado en parte debido a la citotoxicidad enzimática en concentraciones locales elevadas y a las velocidades de difusión parenquimatosa limitadas en el cerebro (Partridge, Peptide Drug Delivery to the Brain, Raven Press, 1991).

[0014] Según la entrada P17405 de UniProtKB/Swiss-Prot, los defectos en el gen SMPD1, situado en el cromosoma 11, (11p15.4-p15.1), son la causa de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A (NPA), también denominada como la forma infantil clásica. La enfermedad de Niemann-Pick es un trastorno recesivo clínica y genéticamente heterogéneo. Está causado por la acumulación de esfingomielina y otros lípidos metabólicamente relacionados en los lisosomas, dando como resultado neurodegeneración desde el comienzo de la vida temprana. Los pacientes pueden mostrar xantomas, pigmentación, hepatoesplenomegalia, linfadenopatía, y retraso mental. La enfermedad de Niemann-Pick se produce más frecuentemente entre individuos de linaje judío asquenazíes que en la población general. La NPA se caracteriza por un comienzo muy temprano en la infancia y un curso que progresa rápidamente, conduciendo a la muerte en tres años. La enzima esfingomielinasa ácida (aSM) convierte esfingomielina en ceramida. aSM también tiene actividades de fosfolipasa C frente a 1,2-diacilglicerolfosfocolina y 1,2-diacilglicerolfosfoglicerol. La enzima convierte esfingomielina H<2>O → N-acilesfingosina fosfato de colina.

[0015] Hay una necesidad continua en la técnica de métodos para tratar las LSDs que tienen patologías de enfermedad tanto cerebral como visceral. Hay una necesidad continua en la técnica de métodos para acceder a porciones del cerebro con agentes de diagnóstico y terapéuticos que no atraviesan fácilmente la barrera hematoencefálica.

[0016] SUMARIO

[0017] La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente que es adecuado para la administración al cerebro de un paciente, para uso en un método que comprende: estimar el recambio del líquido cefalorraquídeo del paciente, administrar la composición farmacéutica al paciente a través de un ventrículo lateral del cerebro a una velocidad tal que la administración proporcione una dosis única del agente durante un tiempo mayor o igual al 50% del tiempo de recambio estimado del líquido cefalorraquídeo en el paciente, en el que la composición farmacéutica comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz del agente, y en el que la composición farmacéutica comprende al menos alrededor de 0,01% en peso del agente.

[0018] Se puede seleccionar una velocidad de administración y un tiempo total de administración del agente a través de un ventrículo lateral del cerebro en función del tiempo de recambio estimado. Se puede configurar una bomba para que administre el agente a dicha velocidad seleccionada durante dicho tiempo total de administración.

[0019] Se puede seleccionar una velocidad y un tiempo total de administración para la liberación del agente a través de un ventrículo lateral del cerebro en función del tiempo de recambio estimado. El agente se puede administrar al paciente a dicha velocidad seleccionada durante dicho tiempo total de administración.

[0020] El agente puede administrarse al paciente a través de un ventrículo lateral del cerebro a una velocidad tal que la administración de una sola dosis continúe al menos hasta que el agente sea detectable en el suero del paciente. Según una realización de la invención, el agente es esfingomielinasa ácida, y se trata a un paciente con enfermedad de Niemann-Pick A o B. Se puede administrar al paciente una esfingomielinasa ácida mediante inyección intraventricular en el cerebro en una cantidad suficiente para reducir los niveles de esfingomielina en dicho cerebro. En un caso de la divulgación (que no se reivindica como tal), se proporciona un kit para tratar un paciente con la enfermedad de Niemann-Pick A, B o D. El kit comprende esfingomielinasa ácida y un catéter para la administración de dicha esfingomielinasa ácida a los ventrículos cerebrales del paciente.

[0021] En otro caso de la divulgación (que no se reivindica como tal), se proporciona un kit para tratar un paciente con la enfermedad de Niemann-Pick A, B o D. El kit comprende una esfingomielinasa ácida y una bomba para administrar dicha esfingomielinasa ácida a los ventrículos del cerebro del paciente.

[0022] Se puede tratar un paciente que tiene una enfermedad del almacenamiento lisosómico que está provocada por una deficiencia enzimática, lo que conduce a la acumulación del sustrato de la enzima. La enzima se administra al paciente vía administración intraventricular al cerebro. La velocidad de administración es tal que la administración de una única dosis se consume en más de cuatro horas. De ese modo se reducen los niveles del sustrato en dicho cerebro. Estos y otros casos, que serán manifiestos para los expertos en la técnica al leer la memoria descriptiva, proporcionan métodos para administrar agentes a porciones del cerebro difíciles de alcanzar.

[0023] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIG. 1 muestra el diagrama de secciones del cerebro que se analizaron en busca de esfingomielina. S1 está en la parte frontal del cerebro, y S5 está en la parte posterior del cerebro.

[0024] FIG. 2 muestra que la administración intraventricular de rhASM reduce los niveles de SPM en el cerebro de ratón ASMKO.

[0025] FIG.3 muestra que la administración intraventricular de rhASM reduce los niveles de SPM en el hígado, bazo y pulmón ASMKO.

[0026] FIG.4 muestra la tinción de hASM en el cerebro tras la infusión intraventricular.

[0027] FIG. 5 muestra que la infusión intraventricular de rhASM durante un período de 6 h reduce los niveles de SPM en el cerebro de ratón ASMKO.

[0028] FIG. 6 muestra que la infusión intraventricular de rhASM durante un período de 6 h reduce los niveles de SPM en el hígado, suero y pulmón ASMKO.

[0029] FIG.7 muestra variantes de hASM documentadas y su relación con la enfermedad o actividad enzimática.

[0030] FIG.8 muestra el sistema ventricular que baña todo el cerebro y la médula espinal con fluido cerebroespinal.

[0031] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0032] Los inventores han descubierto que la administración intraventricular de agentes a pacientes a una velocidad lenta, en lugar de en una administración de bolo, incrementa la penetración eficaz de los agentes en posiciones distantes del cerebro desde el sitio de introducción. Los agentes que se pueden administrar de esta manera son cualesquiera, pero sin incluir, agentes de diagnóstico, agentes formadores de imágenes, agentes anestésicos, y agentes terapéuticos. Este modo de administración es particularmente útil para agentes que no pueden atravesar la barrera hematoencefálica.

[0033] Los solicitantes han observado que la administración intraventricular de bolo no es muy eficaz, mientras que la infusión lenta es muy eficaz. Aunque los solicitantes no desean estar sujetos a ninguna teoría de funcionamiento particular, se cree que la infusión lenta es eficaz debido al recambio del líquido cefalorraquídeo (LCR). Aunque las estimaciones y cálculos en la bibliografía varían, se cree que el fluido cerebroespinal de un humano adulto se recambia en alrededor de 4, 5, 6, 7, u 8 horas. La velocidad de recambio puede variar dependiendo del tamaño del individuo y del volumen de fluido cerebroespinal en el individuo. De este modo, por ejemplo, los niños tienen menos fluido cerebroespinal que los adultos, y por lo tanto tienen un tiempo de recambio más corto. La infusión lenta de la invención se puede medir de manera que el tiempo de administración sea aproximadamente igual a o mayor que el tiempo de recambio del LCR. En ciertos casos, la medición puede ser un tiempo fijo, por ejemplo mayor que 2, 4, 6, 8, o 10 horas, o se puede ajustar para que sea una fracción del tiempo de recambio estimado, por ejemplo mayor que 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, o 400%. De acuerdo con la invención, se administra una sola dosis del agente al paciente durante un tiempo mayor o igual al 50% del tiempo de recambio estimado. El LCR se vacía en el sistema sanguíneo venoso. La administración se puede llevar a cabo durante un tiempo hasta que el agente administrado es detectable en el suero del paciente. También se puede detectar y/o medir el agente administrado en otras partes del SNC, tales como en la médula espinal y en el espacio subaracnoideo. Estos, también, pueden utilizarse como criterios de valoración para la administración.

[0034] El LCR se segrega a una velocidad de alrededor de 430 a 600 ml/día, o alrededor de 0,35 a 0,4 por minuto en adultos, y el volumen en cualquier momento dado es aproximadamente 80 a 150 ml, sustituyéndose todo el volumen cada seis a ocho horas. Se estima que los neonatos producen 0,15 ml por minuto. Los plexos coroideos de los ventrículos laterales son los más grandes, y producen la mayor parte del LCR. El fluido fluye a través de los agujeros intraventriculares en el tercer ventrículo, está aumentado por el fluido formado en el plexo coroideo de ese ventrículo, y pasa a través del acueducto cerebral de Silvio al cuarto ventrículo. El LCR fluye desde el 4º ventrículo hasta el agujero de Magendie al espacio subaracnoideo que rodea a la médula espinal; el LCR fluye desde el 4º ventrículo al agujero de Lushka al espacio subaracnoideo que rodea al cerebro. La membrana aracnoidea forra el espacio subaracnoideo; las vellosidades aracnoideas son parte de la membrana. Las vellosidades aracnoideas son bombas que captan el LCR y lo devuelven a la circulación venosa. El LCR se reabsorbe en la sangre a través de las vellosidades aracnoideas.

[0036] La administración más lenta que el bolo, según la descripción, tiene la ventaja de administrar agentes a porciones del cerebro que no son alcanzadas con un bolo. El agente administrado mediante bolo se acumula en la capa ependimaria o en el parénquima adyacente al sitio de inyección. Por el contrario, se encuentra que los agentes administrados lentamente acceden a regiones distantes del parénquima desde el sitio de inyección (administración generalizada a lo largo del eje anterior a posterior del cerebro; además, administración generalizada dorsal y ventralmente a la capa ependimaria), al tercer ventrículo, al acueducto de Silvio, al cuarto ventrículo, a los agujeros de Lushka, a los agujeros de Magendie, a la médula espinal, al espacio subaracnoideo, y al suero. Desde el suero, también alcanza a órganos periféricos.

[0038] El LCR se vacía en la sangre vía las vellosidades aracnoideas y senos vasculares intracraneales, administrando de ese modo las enzimas a los órganos viscerales. Los órganos viscerales que se ven afectados a menudo en la enfermedad de Niemann-Pick son los pulmones, bazo, riñón, e hígado. La infusión intraventricular lenta proporciona cantidades reducidas de sustrato en al menos estos órganos viscerales.

[0040] La reducción del sustrato acumulado en el cerebro, los pulmones, el bazo, el riñón y/o el hígado es drástica. Se pueden lograr reducciones de más de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. La reducción lograda no es necesariamente uniforme de un paciente a otro, o incluso de un órgano a otro dentro de un mismo paciente.

[0042] Los agentes para la administración pueden ser cualesquiera que son conocidos en la técnica para el tratamiento y formación de imágenes de cerebros. Los agentes formadores de imágenes pueden ser radioactivos, radio-opacos, fluorescentes, etc. Los agentes terapéuticos pueden ser cualesquiera que sean útiles para tratar enfermedades neurológicas u otras enfermedades cerebrales. Los anestésicos pueden ser para tratar dolor crónico o agudo, por ejemplo hidrocloruro de lidocaína y morfina. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen las enzimas que son deficientes en enfermedades del almacenamiento lisosómico. Otros posibles agentes para uso incluyen vectores de ácidos nucleicos, tales como vectores plasmídicos y víricos, ARNpi, ARN antisentido, etc. Otros agentes terapéuticos incluyen aquellos que incrementan o disminuyen la excitación de las neuronas en el cerebro. Estos incluyen agonistas o antagonistas de glutamato, GABA, y dopamina. Los ejemplos específicos incluyen cicloserina, carboxifenilglicina, ácido glutámico, dizocilpina, ketamina, dextrometorfano, baclofeno, muscimol, gabacina, saclofeno, haloperidol, y metanosulfonato. Agentes adicionales que se pueden usar son agentes antiinflamatorios, en particular agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como indometacina e inhibidores de ciclooxigenasas.

[0044] Los ácidos nucleicos se pueden administrar en cualquier vector deseado. Estos incluyen vectores víricos o no víricos, incluyendo vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, y vectores plasmídicos. Los tipos ejemplares de virus incluyen HSV (virus del herpes simple), AAV (virus adenoasociado), VIH (virus de la inmunodeficiencia humana), VIB (virus de la inmunodeficiencia bovina), y MLV (virus de la leucemia murina). Los ácidos nucleicos se pueden administrar en cualquier formato deseado que proporcione niveles de administración suficientemente eficientes, incluyendo en partículas víricas, en liposomas, en nanopartículas, y complejados con polímeros.

[0046] El adenovirus es un virus de ADN nuclear, sin cubierta, con un genoma de alrededor de 36 kb, que se ha caracterizado bastante bien a través de estudios en genética clásica y biología molecular (Hurwitz, M.S., Adenoviruses Virology, 3ª edición, Fields et al., eds., Raven Press, Nueva York, 1996; Hitt, M.M. et al., Adenovirus Vectors, The Development of Human Gene Therapy, Friedman, T. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York 1999). Los genes víricos se clasifican en unidades transcripcionales tempranas (denominadas E1-E4) y tardías (denominadas L1-L5), que hacen referencia a la generación de dos clases temporales de proteínas víricas. La demarcación de estos sucesos es la replicación del ADN vírico. Los adenovirus humanos se dividen en numerosos serotipos (aproximadamente 47, numerados en consecuencia y clasificados en 6 grupos: A, B, C, D, E y F), en base a las propiedades que incluyen la hemaglutinación de glóbulos rojos, oncogenicidad, composiciones y homologías de aminoácidos de ADN y de proteínas, y relaciones antigénicas.

[0048] Los vectores adenovíricos recombinantes tienen varias ventajas para uso como vehículos de administración de genes, incluyendo tropismo para células tanto que se dividen como las que no se dividen, potencial patógeno mínimo, capacidad para replicarse a títulos elevados para la preparación de lotes de vectores, y el potencial para portar grandes insertos (Berkner, K.L., Curr. Top. Micro. Immunol.158:39-66, 1992; Jolly, D., Cancer Gene Therapy 1:51-641994). Se han diseñado vectores adenovíricos con deleciones de diversas secuencias genéticas adenovíricas, tales como los vectores pseudoadenovíricos (PAVs) y adenovíricos parcialmente suprimidos (denominados “DeAd”), para aprovechar las características deseables de los adenovirus que los hacen un vehículo adecuado para la administración de ácidos nucleicos a células receptoras.

[0050] En particular, los vectores pseudoadenovíricos (PAVs), también conocidos como “adenovirus sin región vírica codificante (gutless)” o vectores miniadenovíricos, son vectores adenovíricos derivados del genoma de un adenovirus que contiene secuencias nucleotídicas que actúan en cis mínimas requeridas para la replicación y empaquetamiento del genoma del vector y que puede contener uno o más transgenes (véase la patente U.S. nº 5.882.877, que cubre los vectores pseudoadenovíricos (PAV) y los métodos para producir PAV, incorporada aquí como referencia). Los PAV se han diseñado para aprovechar las características deseables de los adenovirus que los hacen un vehículo adecuado para la administración de genes. Aunque los vectores adenovíricos pueden portar generalmente insertos de hasta 8 kb de tamaño mediante la supresión de regiones que son prescindibles para el crecimiento vírico, la capacidad portadora máxima se puede lograr con el uso de vectores adenovíricos que contienen supresiones de la mayoría de las secuencias codificantes víricas, incluyendo los PAV. Véanse la patente U.S. nº 5.882.877 de Gregory et al.; Kochanek et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5731-5736,. 1996; Parks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13565-13570, 1996; Lieber et al., J. Virol. 70:8944-8960, 1996; Fisher et al., Virology 217:11-22, 1996; patente U.S. nº 5.670.488; Publicación PCT nº WO96/33280, publicada el 24 de octubre de 1996; Publicación PCT nº WO96/40955, publicada el 19 de diciembre de 1996; Publicación PCT nº WO97/25446, publicada el 19 de julio de 1997; Publicación PCT nº WO95/29993, publicada el 9 de noviembre de 1995; Publicación PCT nº WO97/00326, publicada el 3 de enero de 1997; Morral et al., Hum. Gene Ther.10:2709-2716, 1998. Tales PAVs, que pueden alojar hasta alrededor de 36 kb de ácido nucleico extraño, son ventajosos debido a que la capacidad portadora del vector está optimizada, mientras que el potencial para respuestas inmunes del hospedante al vector, o la generación de virus competentes para la replicación, está reducido. Los vectores PAV contienen las secuencias nucleotídicas de repeticiones terminales invertidas (ITR) en 5’ e ITR en 3’ que contienen el origen de replicación, y la secuencia nucleotídica que actúa en cis requerida para el empaquetamiento del genoma del PAV, y pueden alojar uno o más transgenes con elementos reguladores apropiados, por ejemplo promotores, potenciadores, etc.

[0052] Otros vectores adenovíricos parcialmente suprimidos proporcionan un vector adenovírico parcialmente suprimido (denominado “DeAd”), en el que la mayoría de los genes tempranos adenovíricos requeridos para la replicación del virus están suprimidos del vector y están situados dentro de un cromosoma de célula productora bajo el control de un promotor condicional. Los genes adenovíricos suprimibles que se sitúan en la célula productora pueden incluir E1A/E1B, E2, E4 (solamente es necesario situar en la célula ORF6 y ORF6/7), pIX y pIVa2. E3 también se puede suprimir del vector, pero puesto que no se requiere para la producción del vector, se puede omitir de la célula productora. Los genes tardíos adenovíricos, normalmente bajo el control del promotor tardío principal (MLP), están presentes en el vector, pero el MLP se puede sustituir por un promotor condicional.

[0054] Los promotores condicionales adecuados para uso en vectores DeAd y estirpes celulares productoras incluyen aquellos con las siguientes características: baja expresión basal en el estado sin inducir, de manera que los genes adenovíricos citotóxicos o citostáticos no se expresan en niveles dañinos para la célula; y expresión de nivel elevado en el estado inducido, de manera que se producen cantidades suficientes de proteínas víricas para apoyar la replicación y ensamblaje del vector. Los promotores condicionales preferidos, adecuados para uso en vectores DeAd y estirpes celulares productoras, incluyen el sistema de control de gen dimerizador, basado en los agentes inmunosupresores FK506 y rapamicina, el sistema de control del gen de ecdisona, y el sistema de control del gen de tetraciclina. También puede ser útil en la presente invención la tecnología GeneSwitch<™>(Valentis, Inc., Woodlands, TX), descrita en Abruzzese et al., Hum. Gene Ther. 1999 10:1499-507, cuya divulgación se incorpora aquí por referencia. El sistema de expresión adenovírico parcialmente suprimido se describe adicionalmente en el documento WO99/57296, cuya divulgación se incorpora aquí como referencia.

[0056] El virus adenoasociado (AAV) es un parvovirus de ADN humano monocatenario cuyo genoma tiene un tamaño de 4,6 kb. El genoma del AAV contiene dos genes principales: el gen rep, que codifica las proteínas rep (Rep 76, Rep 68, Rep 52, y Rep 40), y el gen cap, que codifica la replicación, rescate, transcripción e integración del AAV, mientras que las proteínas cap forman la partícula vírica del AAV. AAV deriva su nombre de su dependencia de un adenovirus u otro virus auxiliar (por ejemplo, virus del herpes) para suministrar productos genéticos esenciales que permiten al AAV llevar a cabo una infección productiva, es decir, reproducirse en la célula hospedante. En ausencia del virus auxiliar, AAV se integra como un provirus en el cromosoma de la célula del hospedante, hasta que es rescatado por superinfección de la célula hospedante con un virus auxiliar, habitualmente un adenovirus (Muzyczka, Curr. Top. Micor. Immunol.158:97-127, 1992).

[0058] El interés en el AAV como un vector de transferencia de genes resulta de varias características únicas de su biología. En ambos extremos del genoma del AAV hay una secuencia nucleotídica conocida como una repetición terminal invertida (ITR), que contiene las secuencias nucleotídicas que actúan en cis requeridas para la replicación, rescate, empaquetamiento e integración del virus. La función de integración de la ITR, mediada por la proteína rep en trans, permite que el genoma del AAV se integre en un cromosoma celular tras la infección, en ausencia de virus auxiliar. Esta propiedad única del virus tiene relevancia para el uso de AAV en la transferencia de genes, ya que permite una integración de un AAV recombinante, que contiene un gen de interés, en el genoma celular. Por lo tanto, mediante el uso de vectores rAAV, se puede lograr la transformación genética estable, ideal para muchas de las metas de transferencia de genes. Además, el sitio de integración para el AAV está bien establecido, y se ha localizado en el cromosoma 19 de seres humanos (Kotin et al., Proc. Natl. Acad. Sci.87:2211-2215, 1990). Esta predictibilidad del sitio de integración reduce el peligro de sucesos de inserción aleatorios en el genoma celular que pueden activar o inactivar genes hospedantes o interrumpir secuencias codificantes, consecuencias que pueden limitar el uso de vectores cuya integración de AAV, eliminación de este gen en el diseño de vectores de rAAV puede dar como resultado patrones de integración alterados que se han observado con los vectores de rAAV (Ponnazhagan et al., Hum Gene Ther. 8:275-284, 1997).

[0060] Hay otras ventajas para el uso de AAV para la transferencia de genes. El intervalo de hospedantes del AAV es amplio. Además, a diferencia de los retrovirus, AAV puede infectar tanto a células en reposo como a células en división. Además, AAV no se ha asociado con enfermedad humana, obviando muchas de las preocupaciones que han surgido con vectores de transferencia de genes derivados de retrovirus.

[0062] Los enfoques estándar para la generación de vectores de rAAV recombinantes han requerido la coordinación de una serie de sucesos intracelulares: la transfección de la célula hospedante con un genoma del vector de rAAV que contiene un transgén de interés flanqueado por las secuencias de ITR del AAV, la transfección de la célula hospedante por un plásmido que codifica los genes para las proteínas rep y cap del AAV que se requieren en trans, y la infección con un virus auxiliar de la célula transfectada para suministrar las funciones auxiliares no de AAV requeridas en trans (Muzyczka, N., Curr. Top. Micor. Immunol.158:97-129, 1992). Las proteínas adenovíricas (o de otros virus auxiliares) activan la transcripción del gen rep del AAV, y las proteínas rep activan entonces la transcripción de los genes cap del AAV. Las proteínas cap utilizan entonces las secuencias de ITR para empaquetar el genoma del rAAV en una partícula vírica de rAAV. Por lo tanto, la eficiencia del empaquetamiento está determinada, en parte, por la disponibilidad de cantidades adecuadas de las proteínas estructurales, así como por la accesibilidad de cualesquiera secuencias de empaquetamiento que actúan en cis requeridas en el genoma del vector de rAAV.

[0064] Los vectores retrovíricos son una herramienta habitual para la administración de genes (Miller, Nature (1992) 357:455-460). La capacidad de los vectores retrovíricos para administrar un gen de una sola copia, no reordenado, en un amplio intervalo de células somáticas de roedores, de primates y de seres humanos hace a los vectores retrovíricos muy adecuados para transferir genes a una célula.

[0066] Los retrovirus son virus de ARN en los que el genoma vírico es ARN. Cuando una célula hospedante es infectada con un retrovirus, el ARN genómico es transcrito de forma inversa en un intermedio de ADN que se integra muy eficientemente en el ADN cromosómico de células infectadas. Este intermedio de ADN integrado se denomina provirus. La transcripción del provirus y el ensamblaje en virus infeccioso se producen en presencia de un virus auxiliar apropiado, o en una estirpe celular que contiene secuencias apropiadas que permiten el encapsidamiento sin producción coincidente de un virus auxiliar contaminante. No es necesario un virus auxiliar para la producción del retrovirus recombinante si las secuencias para el encapsidamiento se proporcionan mediante cotransfección con vectores apropiados.

[0068] El genoma retrovírico y el ADN provírico tienen tres genes: el gag, el pol, y el env, que están flanqueados por dos secuencias de repetición terminal larga (LTR). El gen gag codifica las proteínas estructurales internas (matriz, cápside, y nucleocápside); el gen pol codifica la ADN polimerasa dirigida por ARN (transcriptasa inversa); y el gen env codifica las glicoproteínas de la cubierta vírica. Las LTR 5' y 3' sirven para promover la transcripción y la poliadenilación de los ARN del virión. La LTR contiene todas las otras secuencias que actúan en cis necesarias para la replicación vírica. Los lentivirus tienen genes adicionales que incluyen vif, vpr, tat, rev, vpu, nef, y vpx (en HIV-1, IDV-2 y/o SIV). Adyacentes a la LTR 5’ se encuentran secuencias necesarias para la transcripción inversa del genoma (el sitio de unión del cebador de ARNt), y para el encapsidamiento eficiente del ARN vírico en partículas (el sitio Psi). Si las secuencias necesarias para el encapsidamiento (o empaquetamiento de ARN retrovírico en viriones infecciosos) faltan en el genoma vírico, el resultado es un defecto en cis que evita el encapsidamiento del ARN genómico. Sin embargo, el mutante resultante todavía es capaz de dirigir la síntesis de todas las proteínas viriónicas.

[0070] Los lentivirus son retrovirus complejos que, además de los genes retrovíricos habituales gag, pol y env, contienen otros genes con función reguladora o estructural. La mayor complejidad permite que el lentivirus module su ciclo de vida, como en el transcurso de la infección latente. Un lentivirus típico es el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el agente etiológico del SIDA.In vivo, el VIH puede infectar células terminalmente diferenciadas que raramente se dividen, tales como linfocitos y macrófagos.In vitro, el VIH puede infectar cultivos primarios de macrófagos derivados de monocitos (MDM), así como células HeLa-Cd4 o linfoides T cuyo ciclo celular se ha detenido mediante tratamiento con afidicolina o irradiación gamma. La infección de las células depende de la importación nuclear activa de complejos de preintegración del VIH a través de los poros nucleares de las células diana. Eso ocurre por la interacción de múltiples determinantes moleculares, parcialmente redundantes, en el complejo con la maquinaria de importación nuclear de la célula diana. Los determinantes identificados incluyen una señal de localización nuclear funcional (NLS) en la proteína de la matriz gag (MA), la proteína asociada al virión cariofílico, vpr, y un resto de fosfotirosina C-terminal en la proteína gag MA. El uso de retrovirus para terapia génica se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense 6,013,516 y en la patente estadounidense 5,994,136, cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia.

[0071] Los inventores han descubierto que la administración intraventricular de enzimas de hidrolasas lisosómicas a pacientes que tienen deficiencia de las enzimas conduce a un estado metabólico mejorado tanto del cerebro como de los órganos viscerales (no SNC) afectados. Esto es particularmente cierto cuando la velocidad de administración es lenta, con respecto a una administración de bolo. Una enzima particularmente útil para tratar Niemann-Pick A, B, o D, es la esfingomielinasa ácida (aSM), tal como la mostrada en la SEQ ID NO: 1.<1>Los restos 1-46 constituyen la secuencia señal que se escinde en el momento de la secreción.

[0073] Aunque en SEQ ID NO: 1 se muestra una secuencia de aminoácidos particular, también se pueden utilizar variantes normales en la población humana que conservan la actividad. Típicamente, estas variantes normales difieren en justamente uno o dos restos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1. Las variantes a usar deberían ser al menos 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idénticas a SEQ ID NO: 1. Las variantes que están asociadas con enfermedad o actividad reducida no se deberían usar. Típicamente, se administrará la forma madura de la enzima. Esto comenzará con el resto 47 como se muestra en la SEQ ID NO: 1. Las variantes que están asociadas a enfermedades se muestran en la FIG.7.

[0075] Los kits según la presente descripción son ensamblajes de componentes distintos. Aunque se pueden envasar en un único recipiente, se pueden subenvasar por separado. Incluso un único recipiente se puede dividir en compartimentos. Típicamente, un conjunto de instrucciones acompañará al kit y proporcionará instrucciones para administrar los agentes de diagnóstico, terapéuticos, o anestésicos, tales como las enzimas de hidrolasas lisosómicas, intraventricularmente. Las instrucciones pueden estar en forma impresa, en forma electrónica, como un vídeo o DVD de instrucciones, en un disco compacto, en un disquete, en internet con una dirección en el envase, o una combinación de estos medios. Además del agente, una o más cánulas o catéteres, y/o una bomba, se pueden proporcionar otros componentes, tales como diluyentes, amortiguadores, disolventes, cinta, tornillos, y herramientas de mantenimiento. La materia impresa u otros materiales instructivos pueden correlacionar el volumen del LCR, el tiempo de recambio del LCR, el peso del paciente, la edad del paciente, la velocidad de administración, el tiempo de administración, y/u otros parámetros. Las bombas se pueden calibrar para administrar a velocidades específicas en base al volumen del LCR y/o del tiempo de recambio y/o de la edad del paciente y/o del peso del paciente.

[0077] Las poblaciones tratadas mediante los métodos de la descripción incluyen, pero no se limitan a, pacientes que tienen o están en riesgo de desarrollar un trastorno neurometabólico, por ejemplo una LSD, tales como las enfermedades enumeradas en la Tabla 1, particularmente si tal enfermedad afecta al SNC y a órganos viscerales. En una realización ilustrativa, la enfermedad es la enfermedad de Niemann-Pick tipo A. Si se ha determinado la predisposición genética a la enfermedad, el tratamiento puede comenzar prenatalmente. Otras enfermedades o afecciones que se pueden tratar incluyen, pero no se limitan a, pacientes neuroquirúrgicos, pacientes con apoplejía, enfermedad de Huntington, epilepsia, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Lou Gehrig, enfermedad de Alzheimer.

[0079] Un agente, tal como una enzima de hidrolasa lisosómica, se puede incorporar en una composición farmacéutica. La composición puede ser útil para diagnosticar, anestesiar, o tratar, por ejemplo inhibir, atenuar, prevenir, o mejorar, una afección caracterizada por un nivel insuficiente de una actividad de hidrolasa lisosómica. La composición farmacéutica se puede administrar a un sujeto que sufre una deficiencia de la hidrolasa lisosómica, o a alguien que está en riesgo de desarrollar dicha deficiencia. Las composiciones deberían contener una cantidad diagnóstica, anestésica, terapéutica o profiláctica eficaz del agente, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéutico puede ser cualquier sustancia no tóxica compatible, adecuada para administrar los polipéptidos al paciente. Como vehículo, se pueden usar agua estéril, alcohol, grasas, y ceras. También se pueden incorporar en las composiciones farmacéuticas adyuvantes, agentes amortiguadores, agentes dispersantes, y similares, farmacéuticamente aceptables. El vehículo se puede combinar con el agente en cualquier forma adecuada para la administración mediante inyección o infusión intraventricular (también posiblemente intravenosa o intratecal), o de otro modo. Los vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, disolución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL.TM. (BASF, Parsippany, N.J.), o disolución salina amortiguada con fosfato (PBS), otras disoluciones salinas, disoluciones de dextrosa, disoluciones de glicerol, emulsiones de agua y de aceites, tales como las obtenidas con aceites de origen de petróleo, animal, vegetal, o sintético (aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, o aceite de sésamo). Se puede utilizar un LCR artificial como vehículo. El vehículo será preferiblemente estéril, y estará libre de pirógenos. La concentración del agente en la composición farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, desde al menos alrededor de 0,01% en peso a 0,1% en peso, a alrededor de 1% en peso, hasta tanto como 20% en peso o más.

[0081] Para la administración intraventricular, la composición puede ser estéril, y debería ser fluida. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe conservar frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio.

[0083] La dosis de cualquier agente, ya sea aSM u otra enzima de hidrolasa lisosómica, puede variar en cierto modo de un individuo a otro, dependiendo del agente o enzima particular y su actividad in vivo específica, la vía de administración, el estado médico, la edad, peso o sexo del paciente, las sensibilidades del paciente al agente aSM o a los componentes del vehículo, y otros factores que el médico a cargo será capaz de tener en cuenta fácilmente. Aunque las dosis pueden variar dependiendo de la enfermedad y del paciente, la enzima se administra generalmente al paciente en cantidades de alrededor de 0,1 a alrededor de 1000 miligramos por 50 kg de paciente al mes, preferiblemente de alrededor de 1 a alrededor de 500 miligramos por 50 kg de paciente al mes.

[0084] Una forma para administrar una infusión lenta es usar una bomba. Tales bombas están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Alzet (Cupertino, CA) o Medtronic (Minneapolis, MN). La bomba puede ser implantable, o externa. Otra forma práctica de administrar las enzimas es mediante una cánula o un catéter. La cánula o catéter se puede usar para múltiples administraciones separadas en el tiempo. Las cánulas y catéteres se pueden implantar estereotácticamente. Se contempla que se usarán múltiples administraciones para tratar al paciente típico con una enfermedad del almacenamiento lisosómico. Los catéteres y las bombas se pueden usar por separado o en combinación. Los catéteres se pueden insertar quirúrgicamente, como se conoce en la técnica. Los kits pueden comprender un agente y un catéter y/o una bomba. La bomba puede tener ajustes adecuados para velocidades de administración en base al volumen del LCR en un individuo.

[0085] La descripción anterior describe generalmente la presente invención. Todas las referencias aquí divulgadas se incorporan expresamente como referencia. Se puede obtener una comprensión más completa mediante la referencia a los siguientes ejemplos específicos, que se proporcionan aquí simplemente con fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la invención.

[0086] EJEMPLO 1

[0087] Modelo animal

[0088] Los ratones ASMKO son un modelo aceptado de enfermedad de Niemann-Pick tipos A y B (Horinouchi et al. (1995) Nat. Genetics, 10:288-293; Jin et al. (2002) J. Clin. Invest., 109:1183-1191; y Otterbach (1995) Cell, 81:1053-1061). La enfermedad de Niemann-Pick (NPD) se clasifica como una enfermedad del almacenamiento lisosómico, y es un trastorno neurometabólico heredado caracterizado por una deficiencia genética en esfingomielinasa ácida (ASM; esfingomielina colinafosfohidrolasa, EC 3.1.3.12). La falta de proteína ASM funcional da como resultado la acumulación del sustrato esfingomielina en los lisosomas de las neuronas y glías a lo largo del cerebro. Esto conduce a la formación de gran cantidad de lisosomas hinchados en el pericarion, que son una característica distintiva y el fenotipo celular primario de la NPD tipo A. La presencia de lisosomas hinchados se correlaciona con la pérdida de la función celular normal y un curso neurodegenerativo progresivo que conduce a la muerte del individuo afectado en la primera infancia (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases, eds. Scriver et al., McGraw-Hill, Nueva York, 2001, págs.3589-3610). Los fenotipos celulares secundarios (por ejemplo, anomalías metabólicas adicionales) también están asociados con esta enfermedad, principalmente la acumulación en nivel elevado de colesterol en el compartimento lisosómico. La esfingomielina tiene una fuerte afinidad por el colesterol, lo que da como resultado el secuestro de grandes cantidades de colesterol en los lisosomas de ratones ASMKO y de pacientes humanos (Leventhal et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:44976-44983; Slotte (1997) Subcell. Biochem., 28:277-293; y Viana et al. (1990) J. Med. Genet., 27:499-504.)

[0089] EJEMPLO 2

[0090] "Infusión intraventricular de rhASM en el ratón ASMKO II"

[0091] Objetivo: Determinar qué efecto tiene la infusión intraventricular de rhASM sobre la patología del almacenamiento (es decir, almacenamiento de esfingomielina y de colesterol) en el cerebro del ratón ASMKO.

[0092] Métodos: A ratones ASMKO se les implantó estereotácticamente una cánula guía permanente entre 12 y 13 semanas de vida. A las 14 semanas de vida, se infundió a los ratones 0,250 mg de hASM (n = 5) a lo largo de un período de 24 h (~,01 mg/h) durante cuatro días consecutivos (se administró un total de 1 mg) usando una sonda de infusión (se ajusta dentro de la cánula guía), que está conectada a una bomba. La hASM liofilizada se disolvió en líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) antes de la infusión. Los ratones se sacrificaron 3 días después de la infusión. En el momento del sacrificio, a los ratones se les sobredosificó con euthasol (>150 mg/kg), y después se perfundieron con PBS o con paraformaldehído al 4%. El cerebro, el hígado, los pulmones y el bazo se retiraron y se analizaron para determinar los niveles de esfingomielina (SPM). El tejido cerebral se dividió en 5 secciones antes del análisis de SPM (S1 = parte frontal del cerebro, S5 = parte posterior del cerebro; véase la Fig.1).

[0093] Tabla 2.

[0095]

[0096] Resumen de resultados: La infusión intraventricular de hASM a 0,250 mg/24 h durante 4 días consecutivos (1 mg total) dio como resultado la tinción de hASM y el aclaramiento de filipina (es decir, almacenamiento de colesterol) en el cerebro ASMKO. El análisis bioquímico mostró que la infusión intraventricular de hASM también condujo a una reducción global en los niveles de SPM en el cerebro. Los niveles de SPM se redujeron hasta el de los niveles de tipo salvaje (WT). También se observó una reducción significativa en SPM en el hígado y en el bazo (se observó una tendencia descendente en el pulmón).

[0097] EJEMPLO 3

[0098] “Administración intraventricular de hASM en ratones ASMKO III”

[0099] Objetivo: determinar la dosis eficaz más baja durante un período de infusión de 6 horas.

[0100] Métodos: A ratones ASMKO se les implantó estereotácticamente una cánula guía permanente entre 12 y 13 semanas de vida. A las 14 semanas de vida, se infundió a los ratones durante un período de 6 semanas una de las siguientes dosis de hASM: 10 mg/kg (0,250 mg; n = 12), 3 mg/kg (0,075 mg; n = 7), 1 mg/kg (0,025 mg; n = 7), 0,3 mg/kg (0,0075 mg; n = 7), o LCRa (líquido cefalorraquídeo artificial; n = 7). Dos ratones de cada nivel de dosis se perfundieron con paraformaldehído al 4% inmediatamente después de la infusión de 6 h, para evaluar la distribución de la enzima en el cerebro (también se recogió sangre de éstos, para determinar los niveles de hASM del suero). Los restantes ratones de cada grupo se sacrificaron 1 semana después de la infusión. El tejido del cerebro, del hígado y del pulmón de estos ratones se analizó para determinar los niveles de SPM, como en el estudio 05-0208.

[0101] Tabla 3.

[0103]

[0105] Resumen de resultados: hASM intraventricular a lo largo de un período de 6 h condujo a una reducción significativa en los niveles de SPM por todo el cerebro, independientemente de la dosis. Los niveles de SPM cerebrales, en ratones tratados con dosis > 0,025 mg, se redujeron hasta los niveles de WT. Los niveles de SPM de órganos viscerales también se redujeron significativamente (pero no hasta los niveles de WT), de una manera dependiente de la dosis. En apoyo a este hallazgo, la proteína hASM también se detectó en el suero de ratones ASMKO a los que se les infundió proteína hASM. El análisis histológico mostró que la proteína hASM estaba ampliamente distribuida por todo el cerebro (desde S1 hasta S5) tras la administración intraventricular de hASM.

[0106] EJEMPLO 4

[0107] "Infusión intraventricular de rhASM en ratones ASMKO IV"

[0108] Objetivo: Determinar (1) el tiempo que tarda SPM en reacumularse en el cerebro (y en la médula espinal) después de una infusión de 6 h de hASM (dosis = 0,025 mg); (2) si hay diferencias de sexo en respuesta a la administración intraventricular de hASM (experimentos previos demuestran que hay diferencias de sexo en la acumulación de sustrato en el hígado; se desconoce si esto ocurre o no en el cerebro).

[0109] Métodos: A ratones ASMKO se les implantó estereotácticamente una cánula guía permanente entre 12 y 13 semanas de vida. A las 14 semanas de vida, a los ratones se les infundió 0,025 mg de hASM a lo largo de un período de 6 h. Tras la administración intraventricular de hASM, los ratones se sacrificaron a 1 semana después de la infusión (n = 7 machos, 7 hembras), o a las 2 semanas después de la infusión (n = 7 machos, 7 hembras), o a las 3 semanas después de la infusión (n = 7 machos, 7 hembras). En el momento del sacrificio, se retiraron el cerebro, la médula espinal, el hígado y los pulmones para el análisis de SPM.

[0111]

[0112]

[0114] Se preparan muestras de tejido para el análisis de SPM.

[0115] EJEMPLO 5

[0116] “Efecto de la infusión intraventricular de rhASM sobre la función cognitiva en ratones ASMKO”

[0118] Objetivo: determinar si la infusión intraventricular de rhASM alivia los déficits cognitivos inducidos por la enfermedad en ratones ASMKO

[0119] Métodos: A ratones ASMKO se les implantará estereotácticamente una cánula guía permanente entre 9 y 10 semanas de vida. A las 13 semanas de vida, a los ratones se les infundirá a lo largo de un período de 6 h con 0,025 mg de hASM. A las 14 y 16 semanas de vida, los ratones se someterán a pruebas cognitivas utilizando el laberinto de Barnes.

[0120] EJEMPLO 6

[0121] “Distribución de la proteína hASM en el SNC de ASMKO tras la infusión intraventricular”

[0123] Objetivo: determinar la distribución de la proteína hASM (en función del tiempo) en el cerebro y la médula espinal de ratones ASMKO tras una infusión intraventricular

[0124] Métodos: A ratones ASMKO se les implantará estereotácticamente una cánula guía permanente entre 12 y 13 semanas de vida. A las 14 semanas de vida, a los ratones se les infundirá a lo largo de un período de 6 h con 0,025 mg de hASM. Tras el procedimiento de infusión, los ratones se sacrificaron inmediatamente, o 1 semana o 2 semanas o 3 semanas más tarde.

[0125] Referencias

[0127] 1. 1) Belichenko PV, Dickson PI, Passage M, Jungles S, Mobley WC, Kakkis ED. Penetration, diffusion, and uptake of recombinant human alpha-1-iduronidase after intraventricular injection into the rat brain. Mol Genet Metab.2005;86(1-2):141-9.

[0128] 2. 2) Kakkis E, McEntee M, Vogler C, Le S, Levy B, Belichenko P, Mobley W, Dickson P, Hanson S, Passage M.

[0129] Intrathecal enzyme replacement therapy reduces lysosomal storage in the brain and meninges of the canine model of MPS I. Mol Genet Metab.2004;83(1-2):163-74.

[0130] 3. 3) Bembi B, Ciana G, Zanatta M, et al. Cerebrospinal-fluid infusion of alglucerase in the treatment for acute neuronopathic Gaucher's disease. Pediatr Res 1995;38:A425.

[0131] 4. 4) Lonser RR, Walbridge S, Murray GJ, Aizenberg MR, Vortmeyer AO, Aerts JM, Brady RO, Oldfield EH.

[0132] Convection perfusion of glucocerebrosidase for neuronopathic Gaucher's disease. Ann Neurol. abr.

[0133] 2005;57(4):542-8.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un agente adecuado para la administración al cerebro de un paciente, para uso en un método que comprende: estimar el tiempo de recambio del líquido cefalorraquídeo del paciente, administrar la composición farmacéutica al paciente a través de un ventrículo lateral del cerebro a una velocidad tal que la administración proporcione una dosis única del agente durante un tiempo mayor o igual al 50% del tiempo de recambio estimado del líquido cefalorraquídeo en el paciente.

en la que la composición farmacéutica comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz del agente,

y en la que la composición farmacéutica comprende al menos alrededor de 0,01% en peso del agente.

2. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1, en la que el agente es un agente de formación de imágenes que es radiopaco, fluorescente, o radiactivo.

3. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1, en la que el agente se selecciona del grupo que consiste en esfingomielinasa, alfa-L-iduronidasa, glucocerebrosidasa, alfa-galactosidasa A, maltasa ácida, hexosaminidasa, o alfa-glucosidasa.

4. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1, en la que el paciente tiene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick B, síndrome de Hurler, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry, enfermedad de Pompe, enfermedad de Tay-Sachs, o enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo II.

5. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1, en la que el agente es esfingomielinasa ácida, y el paciente tiene la enfermedad de Niemann-Pick A o B.

6. La composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la composición farmacéutica se administra mediante un catéter, una bomba, o una bomba implantable.