ES3055536T3

ES3055536T3 - Anti-pd-1 antibodies for use in the treatment of cancer

Info

Publication number: ES3055536T3
Application number: ES24150762T
Authority: ES
Inventors: Weidong Jiang; pei-hua Lin; Chi-Ling Tseng
Original assignee: Shanghai Henlius Biotech Inc
Current assignee: Shanghai Henlius Biotech Inc
Priority date: 2016-09-16
Filing date: 2017-09-09
Publication date: 2026-02-12
Anticipated expiration: 2037-09-09
Also published as: HUE067813T2; EP3512885A4; LT4339615T; EP4339615B1; TW201815823A; FIC20260002I1; ES2977137T3; US20210277122A1; FI4339615T3; RS67443B1; FR25C1022I2; MY199683A; KR102391338B1; JP2020501598A; EP4696785A2; BR112019005129A2; SMT202500445T1; US11028173B2; EP4339615A3; DK4339615T3

Abstract

Se proporcionan anticuerpos anti-PD-1 y sus fragmentos de unión a antígeno. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los anticuerpos anti-PD-1 o sus fragmentos de unión a antígeno, vectores de expresión relacionados y células huésped. Se proporcionan métodos para la producción de anticuerpos anti-PD-1 y sus fragmentos de unión a antígeno. También se proporcionan composiciones farmacéuticas relacionadas y sus métodos de uso para el tratamiento de sujetos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Anticuerpos anti-PD-1 para su uso en el tratamiento de cáncer

[0003] Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

[0004] Esta solicitud internacional PCT reivindica el beneficio de y la prioridad a la solicitud de patente provisional estadounidense n.º 62/395.832, que se presentó el 16 de septiembre de 2016. Esta solicitud internacional PCT también reivindica el beneficio de y la prioridad a la solicitud de patente provisional estadounidense n.º 62/519.590, que se presentó el 14 de junio de 2017.

[0005] Campo de la invención

[0006] La invención se refiere generalmente a anticuerpos anti-PD-1, y a métodos de uso de los mismos, en el tratamiento de cánceres humanos.

[0007] Antecedentes de la invención

[0008] La proteína de muerte programada 1 (PD-1) es un receptor de punto de control inmunitario clave expresado por células T y B activadas y media en la inmunosupresión. PD-1 es un miembro de la familia de receptores CD28, que incluye CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1, y BTLA. Se han identificado dos ligandos de glicoproteína de superficie celular para PD-1, ligando de muerte programada 1 (PD-L1) y ligando de muerte programada 2 (PD-L2), que se expresan en células presentadoras de antígeno, así como en muchos cánceres humanos, y se ha demostrado que regulan por disminución la activación de células T y la secreción de citocinas tras la unión a PD-1 (Freemanet al., 2000; Latchmanet al., 2001). A diferencia de CTLA-4, PD-1 funciona principalmente en tejidos periféricos donde las células T activadas pueden encontrar los ligandos inmunosupresores PD-L1 (B7-H1) y PD-L2 (B7-DC) expresados por células tumorales y/o estromales (Flieset al., 2011; Topalianet al., 2012a). La inhibición de la interacción PD-1/PD-L1 media en una potente actividad antitumoral en modelos preclínicos (patentes estadounidenses n.<os>8.008.449 y 7.943.743), y el uso de inhibidores de Ac de la interacción PD-1/PD-L1 para tratar el cáncer ha entrado en ensayos clínicos (Brahmeret al., 2010; Flieset al., 2011; Topalianet al., 2012b; Brahmeret al., 2012). El documento WO 2016/077397 describe anticuerpos que se unen selectivamente a PD-1 y sus isoformas y homólogos, y composiciones que comprenden los anticuerpos. El documento US 2016/0159905 describe anticuerpos antagonistas que se unen a la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) y métodos de uso. Hassan, I.et al. (2021) Structural basis of HLX10 PD-1 receptor recognition, a promising anti-PD-1 antibody clinical candidate for cancer immunotherapy. PLOS ONE, vol.16, n.º 12, e0257972, DOI: 10.1371/journal.pone.0257972 es un artículo científico publicado posteriormente por los mismos autores/inventores que da a conocer el anticuerpo de esta solicitud.

[0009] Existe la necesidad de desarrollar productos terapéuticos anticancerosos dirigidos contra PD-1. La presente invención satisface esta y otras necesidades.

[0010] Sumario de la invención

[0011] La invención proporciona un anticuerpo anti-PD-1 según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de cáncer tal como se define por las reivindicaciones. El anticuerpo anti-PD-1 de la invención comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera (LC) (V<L>) que comprende (1) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos KASQDVTTAVA (SEQ ID NO: 9); (2) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRHT (SEQ ID NO: 10); y (3) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHYTIPWT (SEQ ID NO: 11), y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (HC) (V<H>) que comprende (1) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSNYGMS (SEQ ID NO: 12); (2) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos TISGGGSNIY (SEQ ID NO: 13); y (3) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos VSYYYGIDF (SEQ ID NO: 14); en el que el anticuerpo anti-PD-1 se administra por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea, y en el que el anticuerpo comprende una secuencia de Fc de una IgG4 humana.

[0012] En el presente documento también se describen anticuerpos madurados por afinidad contra anticuerpo anti-PD-1 humanizado h1G4. En el presente documento también se describe un anticuerpo anti-PD-1 madurado (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-1, 33B) que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera (LC) que comprende (1) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos KASTDVTTAVA (SEQ ID NO: 15); (2) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASLRHT (SEQ ID NO: 16); y (3) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHYGIPWT (SEQ ID NO: 17), y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (HC) que comprende (1) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos FRFSNYGMS (SEQ ID NO: 18); (2) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos TISGGGSNAY (SEQ ID NO: 19); y (3) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos TSYYYGIDF (SEQ ID NO: 20).

[0013] En el presente documento también se describe un anticuerpo anti-PD-1 madurado (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-1, 66E) que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera (LC) que comprende (1) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos KAKQDVTTAVA (SEQ ID NO: 21); (2) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRHT (SEQ ID NO: 10); y (3) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHYWIPWT (SEQ ID NO: 22), y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (HC) que comprende (1) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSNYGMS (SEQ ID NO: 12); (2) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos TISGGGSNIY (SEQ ID NO: 13); y (3) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos VSYYYGIDL (SEQ ID NO: 23).

[0014] En el presente documento también se describe un anticuerpo anti-PD-1 madurado (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-1, 711D) que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera (LC) que comprende (1) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos KASQDVTNAVA (SEQ ID NO: 24); (2) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRHT (SEQ ID NO: 10); y (3) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHYTIPWT (SEQ ID NO: 11), y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (HC) que comprende (1) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSNYGMS (SEQ ID NO: 12); (2) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos TISGGGSNIY (SEQ ID NO: 13); y (3) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SSYYYGIDL (SEQ ID NO: 25).

[0015] Las secuencias de las CDR indicadas en el presente documento se proporcionan en la tabla 1 a continuación.

[0017] TABLA 1

[0020]

[0022] En el presente documento también se describe un anticuerpo anti-PD-1 que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera (LC) que comprende (1) una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 21 y 24; (2) una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 10 ó 16; (3) una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 17, 22, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (HC) que comprende (1) una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 12 ó 18; (2) una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 13 ó 19; y (3) una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 20, 23, y 25.

[0023] La invención también proporciona un anticuerpo anti-PD-1 que comprende una secuencia de cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 4 y una secuencia de cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 2.

[0024] La invención también proporciona un anticuerpo anti-PD-1 humanizado que comprende una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 8 y una secuencia de cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 6.

[0025] Según la presente invención, el anticuerpo comprende una secuencia de Fc de una IgG4 humana. También descrito en el presente documento, el fragmento de unión a antígeno del anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab’, F(ab)’2, Fv de cadena sencilla (scFv), un fragmento de Fv, un diacuerpo, y un anticuerpo lineal. En algunas realizaciones según (o tal como se aplica a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo tal como se define por las reivindicaciones es un anticuerpo multiespecífico.

[0026] En algunas realizaciones según (o tal como se aplica a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti-PD-1 tal como se define por las reivindicaciones está conjugado con un agente terapéutico. En algunas realizaciones según (o tal como se aplica a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti-PD-1 tal como se define por las reivindicaciones está conjugado con un marcador. En algunas realizaciones según (o tal como se aplica a) cualquiera de las realizaciones anteriores, el marcador se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, un colorante fluorescente, y una enzima.

[0027] También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para el anticuerpo anti-PD-1 según (o tal como se aplica a) cualquiera de las realizaciones anteriores. También se describe un vector de expresión que codifica para la molécula de ácido nucleico según (o tal como se aplica a) cualquiera de las realizaciones anteriores. También se describen células que comprenden el vector de expresión según (o tal como se aplica a) cualquiera de las realizaciones anteriores. Además, se describe un método de producción de un anticuerpo que comprende cultivar una célula y recuperar el anticuerpo de la misma a partir del cultivo celular. La célula puede ser una célula mamífera. La célula mamífera puede ser una célula CHO. La célula puede ser una línea celular mamífera estable. La línea celular mamífera estable puede ser una línea celular CHO.

[0028] También se describe una composición que comprende el anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0029] También se describe un método de detección de una proteína PD-1 en una muestra de un paciente poniendo en contacto el anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento con la muestra y detectando el anticuerpo anti-PD-1 unido a la proteína PD-1. El anticuerpo anti-PD-1 puede usarse en un ensayo de inmunohistoquímica (IHC) o en un ensayo ELISA.

[0030] La invención también proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-PD-1 según las reivindicaciones para su uso en el tratamiento de cáncer tal como se define en las reivindicaciones. El cáncer puede seleccionarse de melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo, TNBC), cáncer gástrico, linfoma de Hodgkin clásico (cHL), linfoma no Hodgkinlinfoma de células B mediastínico primario (NHL-PMBCL), mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)), cáncer de esófago, carcinoma de nasofaringe (NPC), cáncer de vías biliares, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, y cáncer de glándulas salivales. Al sujeto puede administrársele además un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un agente antineoplásico, un agente quimioterápico, un agente inhibidor del crecimiento y un agente citotóxico. Al sujeto puede administrársele además radioterapia. Al sujeto puede administrársele además un anticuerpo terapéutico contra VEGF, VEGFR2, o EGFR.

[0031] Breve descripción de los dibujos

[0032] Figuras 1A-1B. Unión de c1G4 a proteína PD-1 recombinante. La figura 1A muestra los resultados de ELISA realizados para comparar la unión de anticuerpos anti-PD-1 c1G4 y anti-PD-1 de referencia a PD-1-His. La figura 1B muestra los resultados de un segundo conjunto de ELISA realizados para comparar la unión de anticuerpos anti-PD-1 c1G4 y anti-PD-1 de referencia a PD-1-AP. Los datos indican que c1G4 y el anticuerpo anti-PD-1 de referencia pueden unirse tanto a PD-1-His como a PD-1-AP.

[0033] Figuras 2A-2B. Bloqueo y competición de unión a ligando de PD-1 de c1G4. La figura 2A muestra los resultados de ELISA realizados para comparar la capacidad de anticuerpos anti-PD-1 c1G4 y anti-PD-1 de referencia para bloquear la unión de PD-L1 y PD-1. Se halló que tanto c1G4 como anticuerpo anti-PD-1 de referencia bloqueaban la unión de PD-L1 a PD-1. La figura 2B muestra los resultados de ELISA realizados para determinar la capacidad de anticuerpo anti-PD-1 c1G4 para competir con anticuerpo anti-PD-1 de referencia por la unión a PD-1-His. Los datos indican que tanto c1G4 como anticuerpo anti-PD-1 de referencia pueden bloquear la unión de PD-L1 a PD-1, y c1G4 puede competir con el anticuerpo anti-PD-1 ref por la unión a PD-1-His.

[0034] Figuras 3A-3B. Unión de c1G4 a células CHO-S que expresan PD-1. Se sometió a prueba la unión de anticuerpo c1G4 a células CHO-S (figura 3A) y células CHO-S transfectadas con PD-1 (figura 3B) mediante citometría de flujo. Se usaron anticuerpos anti-PD-1 y anti-PD-L1 de referencia como control positivo y control negativo, respectivamente. Los datos indican que c1G4 se unió a las células CHO transfectadas con PD-1 humana pero no a las células CHO no transfectadas.

[0035] Figura 4. Bloqueo de unión de ligando a PD-1 por anticuerpo c1G4 seleccionado. Se sometió a prueba el anticuerpo anti-PD-1 c1G4 para determinar la capacidad para bloquear la unión del ligando PD-L1 a células CHO-S que expresan PD-1 usando un ensayo de citometría de flujo. Se usaron anticuerpos anti-PD-1 y anti-PD-L1 de referencia como control positivo y control negativo, respectivamente. El anticuerpo monoclonal anti-PD-1 c1G4 bloqueó la unión de PD-L1 a células CHO-S transfectadas con PD-1, tal como se mide mediante la intensidad de fluorescencia media (IFM) de la tinción. Estos datos demuestran que el anticuerpo anti-PD-1 c1G4 bloquea la unión del ligando PD-L1 a PD-1 de superficie celular.

[0036] Figuras 5A-5B. Efecto de anticuerpo anti-PD-1 c1G4 sobre la producción de citocinas en una reacción linfocitaria mixta (RLM). El anticuerpo monoclonal c1G4 contra PD-1 humana fomenta la secreción de IFN-γ y la secreción de IL-2 en un ensayo de reacción linfocitaria mixta. Se usaron anticuerpo anti-PD-1 de referencia y Avastin (anticuerpo anti-VEGF) como control positivo y control negativo, respectivamente. La figura 5A ilustra un gráfico de barras que muestra la secreción de IL-2 dependiente de la concentración; la figura 5B ilustra un gráfico de barras que muestra la secreción de IFN-γ dependiente de la concentración.

[0037] Figura 6. Efecto de anticuerpo anti-PD-1 c1G4 sobre la proliferación de células T en una reacción linfocitaria mixta (RLM). El anticuerpo monoclonal c1G4 contra PD-1 humana fomenta la proliferación de células T CD4<+>y CD8<+>en un ensayo de reacción linfocitaria mixta. Se usaron anticuerpo anti-PD-1 de referencia y Avastin (anticuerpo anti-VEGF) como control positivo y control negativo, respectivamente. La figura 6A ilustra un gráfico de barras que muestra la proliferación de células T CD4<+>a diversas concentraciones de anticuerpos; la figura 6B ilustra un gráfico de barras que muestra la proliferación de células T CD8<+>a diversas concentraciones de anticuerpos.

[0038] Figura 7. Actividad de inhibición de crecimiento tumoral del anticuerpo c1G4. A los ratones (n=4/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de líneas celulares de cáncer de colon humano HT29 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 2:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal anticuerpos anti-PD-1 a los ratones dos veces a la semana desde el día 1. Las curvas de crecimiento tumoral se mostraron en la figura 7A. El volumen tumoral individual en el día 28 se presentó en la figura 7B. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM.

[0039] Figura 8. Alineación de secuencias para c1G4 y h1G4. La figura 8A muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras de c1G4, h1G4 humanizado, región variable de cadena ligera de la línea germinal humana IGKV1-39*01, y nivolumab (NIV). La figura 8B muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de c1G4, h1G4 humanizado, región variable de cadena pesada de la línea germinal humana IGHV3-11*04, y nivolumab (NIV). Las CDR (regiones determinantes de complementariedad) injertadas a partir de c1G4 para la humanización se marcaron con texto en negrita y subrayado.

[0040] Figura 9. Unión de anticuerpo anti-PD-1 humanizado a células CHO-S que expresan PD-1. Se sometió a prueba la unión de anticuerpo c1G4 original y h1G4 humanizado a PD-1 sobre la superficie celular mediante citometría de flujo. Se usaron anticuerpos anti-PD-1 y anti-PD-L1 de referencia como control positivo y control negativo, respectivamente.

[0041] Figura 10. Bloqueo de unión de ligando a PD-1 por anticuerpo h1G4 humanizado. Se sometió a prueba el anticuerpo anti-PD-1 humanizado h1G4 para determinar la capacidad para bloquear la unión del ligando PD-L1 a células CHO-S que expresan PD-1 usando un ensayo de citometría de flujo. Se usaron anticuerpos anti-PD-1 y anti-PD-L1 de referencia como control positivo y control negativo, respectivamente. Tanto c1G4 como h1G4 bloquearon la unión de PD-L1 a células CHO-S transfectadas con PD-1, tal como se mide mediante la intensidad de fluorescencia media (IFM) de la tinción.

[0042] Las figuras 11A-11D ilustran reactividad cruzada entre especies de h1G4 con proteínas PD-1 humana (figura 11A), de macaco cangrejero (figura 11B), de ratón (figura 11C), y de rata (figura 11D). Todos los puntos de datos son el promedio de triplicado ± DE.

[0043] Figura 12. Unión de anticuerpo anti-PD-1 humanizado a células T humanas activadas. Se sometió a prueba la unión de h1G4 humanizado a células T humanas mediante citometría de flujo. Se usaron anticuerpo anti-PD-1 de referencia y Avastin (anticuerpo anti-VEGF) como control positivo y control negativo, respectivamente.

[0044] Figura 13. Efecto de h1G4 sobre la producción de citocinas en una reacción linfocitaria mixta (RLM). El anticuerpo h1G4 humanizado contra PD-1 humana fomenta la secreción de IFN-γ y la secreción de IL-2 en un ensayo de reacción linfocitaria mixta. Se usaron anticuerpo anti-PD-1 de referencia y Avastin (anticuerpo anti-VEGF) como control positivo y control negativo, respectivamente. La figura 13A ilustra un gráfico de barras que muestra la secreción de IL-2 dependiente de la concentración; la figura 13B ilustra un gráfico de barras que muestra la secreción de IFN-γ dependiente de la concentración.

[0045] Figura 14. Efecto de h1G4 sobre la proliferación de células T en una reacción linfocitaria mixta (RLM). El anticuerpo h1G4 humanizado contra PD-1 humana fomenta la proliferación de células T CD4<+>y CD8<+>en un ensayo de reacción linfocitaria mixta. Se usaron anticuerpo anti-PD-1 de referencia y Avastin (anticuerpo anti-VEGF) como control positivo y control negativo, respectivamente. La figura 14A ilustra un gráfico de barras que muestra la proliferación de células T CD4<+>a diversas concentraciones de anticuerpos; la figura 14B ilustra un gráfico de barras que muestra la proliferación de células T CD8<+>a diversas concentraciones de anticuerpos. Figura 15. Actividad de inhibición de crecimiento tumoral del anticuerpo h1G4 en modelo de xenoinjerto HT29/PBMC. A los ratones (n=4/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de líneas celulares de cáncer de colon humano HT29 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 3:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal anticuerpos anti-PD-1 a los ratones dos veces a la semana desde el día 1. Las curvas de crecimiento tumoral se mostraron en la figura 15A. El volumen tumoral individual en el día 21 se presentó en la figura 15B. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM.

[0046] Figura 16. Actividad de inhibición de crecimiento tumoral del anticuerpo h1G4 en modelo de xenoinjerto NCI-H292/PBMC. A los ratones (n=4/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de líneas celulares de NSCLC humano NCI-H292 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 3:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal anticuerpos anti-PD-1 a los ratones dos veces a la semana desde el día 1. Las curvas de crecimiento tumoral se mostraron en la figura 16A. El volumen tumoral individual en el día 25 se presentó en la figura 16B. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM.

[0047] Figura 17. Actividad de inhibición de crecimiento tumoral del anticuerpo h1G4 en ratones hPD1 KI. A los ratones con inserción génica de PD-1 humana (hPD1 KI) (n=4/grupo) se les injertó por vía subcutánea células MC38-huPD-L1 (MC38 transfectadas con PD-L1 humano). Los tratamientos con anticuerpos se iniciaron cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 75 mm<3>. Se inyectaron por vía intraperitoneal anticuerpos anti-PD-1 a los ratones dos veces a la semana. Todos los puntos de datos son las medias ± DE.

[0048] Figura 18. Estudio de eficacia de h1G4 en un modelo de xenoinjerto de línea celular de cáncer de mama triple negativo (TNBC) en ratones NSG humanizados. A los ratones NSG humanizados (n=9/grupo) se les inocularon por vía subcutánea células MDA-MB-231. Los tratamientos con anticuerpos se iniciaron cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 60-150 mm<3>. Los días de dosificación se indicaron mediante flechas. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM.

[0049] Figura 19. Efecto de anticuerpos anti-PD-1 humanos sobre la producción de citocinas en una reacción linfocitaria mixta (RLM). Los anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1 humana fomentan la secreción de IFN-γ y la secreción de IL-2 en un ensayo de reacción linfocitaria mixta. Se usaron anticuerpo anti-PD-1 de referencia y Avastin (anticuerpo anti-VEGF) como control positivo y control negativo, respectivamente. La figura 19A ilustra un gráfico de barras que muestra la secreción de IL-2 dependiente de la concentración; la figura 19B ilustra un gráfico de barras que muestra la secreción de IFN-γ dependiente de la concentración.

[0050] Figura 20. Actividad de inhibición de crecimiento tumoral de anticuerpos anti-PD-1 humanos en modelo de xenoinjerto HT29/PBMC. A los ratones (n=4/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de línea celular de cáncer de colon humana HT29 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 3:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal anticuerpos anti-PD-1 a los ratones dos veces a la semana desde el día 1. El volumen tumoral se midió dos veces a la semana. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM.

[0051] Figura 21. Combinación de anticuerpo monoclonal anti-PD-1 y anti-VEGF en modelo de xenoinjerto HT29/PBMC. A los ratones (n=4/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de línea celular de cáncer de colon humana HT29 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 3:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal AcM anti-PD-1, AcM anti-VEGF (HLX04), o AcM anti-PD-1 más AcM anti-VEGF a los ratones. Los días de dosificación se indicaron mediante flechas. El volumen tumoral se midió dos veces a la semana. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM.

[0052] Figura 22. Actividad de inhibición de crecimiento tumoral de AcM anti-PD-1 más AcM anti-VEGF en modelo de ratón de xenoinjerto de NSCLC. A los ratones (n=4/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de células de NSCLC humanas NCI-H292 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 3:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal los anticuerpos anti-PD-1 (h1G4) y anti-VEGF (HLX04) a los ratones dos veces a la semana desde el día 1. Las curvas de crecimiento tumoral se mostraron en la figura 22A. El volumen tumoral individual en el día 21 se presentó en la figura 22B. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM.

[0053] Figura 23. Actividad de inhibición de crecimiento tumoral de AcM anti-PD-1 más AcM anti-VEGFR2 en modelo de ratón de xenoinjerto de NSCLC. A los ratones (n=4/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de células de NSCLC humanas NCI-H292 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 3:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal los anticuerpos anti-PD-1 (h1G4) y anti-VEGFR2 (HLX06) a los ratones dos veces a la semana desde el día 1. Las curvas de crecimiento tumoral se mostraron en la figura 23A. El volumen tumoral individual en el día 21 se presentó en la figura 23B. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM. Figura 24. Actividad de inhibición de crecimiento tumoral de AcM anti-PD-1 más AcM anti-EGFR en modelo de ratón de xenoinjerto de NSCLC. A los ratones (n=4/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de células de NSCLC humanas NCI-H292 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 3:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal los anticuerpos anti-PD-1 (HLX10) y anti-EGFR (HLX07) a los ratones dos veces a la semana desde el día 1. Las curvas de crecimiento tumoral se mostraron en la figura 24A. El volumen tumoral individual en el día 21 se presentó en la figura 24B. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM. Figura 25. Actividad de inhibición de crecimiento tumoral de AcM anti-PD-1 más AcM anti-EGFR en modelo de ratón de xenoinjerto de HT-29 (KRAS<WT>, BRAF<V600E>). A los ratones (n=5/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de células de cáncer de colon humanas HT-29 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 3:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal los anticuerpos anti-PD-1 (HLX10) y anti-EGFR (HLX07) a los ratones dos veces a la semana desde el día 1. Las curvas de crecimiento tumoral se mostraron en la figura 25A. El volumen tumoral individual en el día 21 se presentó en la figura 25B. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM.

[0054] Descripción detallada de la invención

[0055] La presente invención proporciona novedosos anticuerpos anti-PD-1 para su uso en el tratamiento de cáncer tal como se define en las reivindicaciones. Los inventores han hallado sorprendentemente que los anticuerpos anti PD-1, por ejemplo, anticuerpos c1G4 quiméricos y h1G4 humanizados descritos en el presente documento, así como sus anticuerpos madurados por afinidad, por ejemplo, 33B, 66E, y 711D, potencian la secreción de IL-2 e IFN-γ por células T y la proliferación de células T CD4<+>y CD8<+>. Los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el presente documento también presentan una eficacia y/o actividades antitumorales potenciadas en comparación con OPDIVO<®>(nivolumab), un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 IgG4 humanizado aprobado por la FDA usado para tratar el cáncer.

[0056] También se describen inmunoconjugados, ácidos nucleicos que codifican para los novedosos anticuerpos anti-PD-1 descritos en el presente documento, y composiciones (tales como composiciones farmacéuticas) y métodos de uso de los novedosos anticuerpos anti-PD-1 para detectar PD-1 en una muestra (tal como una muestrain vivooex vivo), y composiciones que comprenden tales anticuerpos para su uso en el tratamiento de cáncer.

[0057] Definiciones

[0058] Tal como se usa en el presente documento, “tratamiento” o “tratar” es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados incluyendo resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: aliviar uno o más síntomas resultantes de la enfermedad, disminuir la extensión de la enfermedad, estabilizar la enfermedad (por ejemplo, prevenir o retrasar el empeoramiento de la enfermedad), prevenir o retrasar la diseminación (por ejemplo, metástasis) de la enfermedad, prevenir o retrasar la recidiva de la enfermedad, retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad, mejorar el estado de enfermedad, proporcionar una remisión (parcial o total) de la enfermedad, disminuir la dosis de uno o más de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad, aumentar o mejorar la calidad de vida, aumentar la ganancia de peso y/o, prolongar la supervivencia. “Tratamiento” también abarca una reducción de la consecuencia patológica del cáncer (tal como, por ejemplo, volumen tumoral). Los métodos descritos en el presente documento contemplan uno cualquiera o más de estos aspectos de tratamiento.

[0059] Los términos “recidiva”, “recaída” o “en recaída” se refieren al regreso de un cáncer o una enfermedad después de la evaluación clínica de la desaparición de la enfermedad. Un diagnóstico de metástasis distante o recidiva local puede considerarse una recaída.

[0060] El término “insensible” o “resistente” se refiere a un cáncer o una enfermedad que no ha respondido al tratamiento.

[0061] El término “terapia adyuvante” se refiere a un tratamiento administrado después de la terapia primaria, habitualmente cirugía. La terapia adyuvante para el cáncer o la enfermedad puede incluir inmunoterapia, quimioterapia, radioterapia, o terapia hormonal.

[0062] El término “terapia de mantenimiento” se refiere a un retratamiento programado que se administra para ayudar a mantener los efectos de un tratamiento previo. La terapia de mantenimiento se administra con frecuencia para ayudar a mantener un cáncer en remisión o prolongar una respuesta a una terapia específica independientemente de la progresión de la enfermedad.

[0063] El término “cáncer invasivo” se refiere a un cáncer que se ha diseminado más allá de la capa de tejido en la que se inició a los tejidos circundantes normales. Los cánceres invasivos pueden ser cánceres metastásicos o no. El término “cáncer no invasivo” se refiere a un cáncer muy temprano o un cáncer que no se ha diseminado más allá del tejido de origen.

[0064] El término “supervivencia libre de progresión” en oncología se refiere a la duración de tiempo durante y después del tratamiento en la que no crece un cáncer. La supervivencia libre de progresión incluye la cantidad de tiempo en la que los pacientes han experimentado una respuesta completa o una respuesta parcial, así como la cantidad de tiempo en la que los pacientes han experimentado una enfermedad estable.

[0065] El término “enfermedad progresiva” en oncología puede referirse a un crecimiento tumoral de más del 20 % desde que comenzó el tratamiento, debido o bien a un aumento de la masa o bien a una diseminación en el tumor.

[0066] Un “trastorno” es cualquier estado que se beneficiaría de un tratamiento con el anticuerpo. Por ejemplo, mamíferos que padecen o necesitan profilaxis contra una actividad de PD-1 anómala. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicos y agudos incluyendo aquellos estados patológicos que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitativos de trastornos que van a tratarse en el presente documento incluyen cáncer (tal como cáncer de cabeza y cuello, cáncer de garganta, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, etc.).

[0067] “Tumor”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sean maligno o benigno, y a la totalidad de células y tejidos precancerosos y cancerosos.

[0069] El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales individuales (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas, y neutralizantes), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos policlonales, anticuerpos de cadena sencilla, y fragmentos de anticuerpo (véase a continuación), siempre que se unan específicamente a un polipéptido nativo y/o presenten una actividad biológica o actividad inmunológica de esta invención. El anticuerpo puede unirse a una forma oligomérica de una proteína diana, por ejemplo, una forma trimérica. El anticuerpo puede unirse específicamente a una proteína, cuya unión puede inhibirse por un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, un anticuerpo depositado, etc.). La expresión “fragmento o análogo funcional” de un anticuerpo es un compuesto que tiene una actividad biológica cualitativa en común con un anticuerpo al que está haciéndose referencia. Por ejemplo, un fragmento o análogo funcional de un anticuerpo de esta invención tal como se define en las reivindicaciones puede ser uno que puede unirse específicamente a PD-1. El anticuerpo puede prevenir o reducir sustancialmente la capacidad de PD-1 para inducir la proliferación celular.

[0071] Un “anticuerpo aislado” es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. El anticuerpo puede purificarse (1) hasta más del 95 % en peso de anticuerpo tal como se determina mediante el método de Lowry, y lo más preferiblemente más del 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando tinción con azul de Coomassie o, preferiblemente, con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpoin situdentro de células recombinantes dado que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará normalmente mediante al menos una etapa de purificación.

[0073] La unidad de anticuerpo de 4 cadenas básica es una glicoproteína heterotetramérica compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consiste en 5 de la unidad heterotetramérica básica junto con un polipéptido adicional denominado cadena J y, por tanto, contiene 10 sitios de unión a antígeno, mientras que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizarse para formar ensamblajes polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades de 4 cadenas básicas junto con la cadena J). En general, en el caso de las IgG, la unidad de 4 cadenas tiene aproximadamente 150.000 Dalton. Cada cadena L está unida a una cadena H mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí mediante uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de cadena H. Cada una de las cadenas H y L también tiene puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena H tiene, en el extremo N-terminal, un dominio variable (V<H>) seguido de tres dominios constantes (C<H>) para cada una de las cadenas α y γ y cuatro dominios C<H>para los isotipos µ y ε. Cada cadena L tiene, en el extremo N-terminal, un dominio variable (V<L>) seguido de un dominio constante (C<L>) en su otro extremo. V<L>está alineado con V<H>y C<L>está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (C<H>1). Se cree que residuos de aminoácido particulares forman una superficie de contacto entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El emparejamiento de un V<H>y un V<L>juntos forma un sitio de unión a antígeno individual. Para la estructura y las propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8ª edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y capítulo 6.

[0075] La cadena L de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (C<H>), las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, que tienen cadenas pesadas denominadas α, δ, γ, ε, y µ, respectivamente. Las clases γ y α se dividen adicionalmente en subclases basándose en diferencias relativamente pequeñas en la secuencia y la función de C<H>, por ejemplo, los seres humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2.

[0077] El término “variable” se refiere al hecho de que determinados segmentos de los dominios variables difieren extensamente en cuanto a secuencia entre los anticuerpos. El dominio V media en la unión a antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye de manera uniforme a través del tramo de 110 aminoácidos de los dominios variables. En su lugar, las regiones V consisten en tramos relativamente invariantes denominados regiones de entramado (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de extrema variabilidad denominadas “regiones hipervariables” que tienen, cada una, una longitud de 9-12 aminoácidos. Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden, cada uno, cuatro FR, que mayormente adoptan una configuración de lámina beta, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina beta. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Servicio Sanitario Público, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

[0079] Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término “CDR” o “región determinante de complementariedad” signifique los sitios de combinación de antígeno no contiguos encontrados dentro de la región variable de polipéptidos de cadena tanto pesada como ligera. Estas regiones particulares se han descrito por Kabatet al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabatet al., Departamento de Servicios Sanitarios y Sociales de Estados Unidos, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991); por Chothiaet al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); y por MacCallumet al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), donde las definiciones incluyen solapamiento o subconjuntos de residuos de aminoácido cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o anticuerpos injertados o variantes de los mismos esté dentro del alcance del término tal como se define y usa en el presente documento. Los residuos de aminoácido que abarcan las CDR tal como se definen por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a continuación en la tabla 2 como comparación.

[0082] TABLA 2

[0085]

[0088] El término “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen de manera natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin contaminarse por otros anticuerpos. No debe interpretarse que el modificador “monoclonal” requiera la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden prepararse mediante la metodología de hibridoma descrita por primera vez por Kohleret al. Nature. 256:495 (1975), o pueden prepararse usando métodos de ADN recombinante en células bacterianas, animales eucariotas o vegetales (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas en Clacksonet al., Nature, 352:624-628 (1991), Markset al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), y los ejemplos a continuación, por ejemplo.

[0090] Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen anticuerpos “quiméricos” en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son idénticas u homólogas a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten una actividad biológica (véanse la patente estadounidense n.º 4.816.567; y Morrisonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos “primatizados” que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, cercopitécido, simio, etc.), y secuencias de región constante humanas.

[0092] Un anticuerpo “intacto” es uno que comprende un sitio de unión a antígeno, así como un C<L>y al menos dominios constantes de cadena pesada, C<H>1, C<H>2 y C<H>3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o una variante de secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

[0093] Los “fragmentos de anticuerpo” comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región variable o de unión a antígeno del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)<2>, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (véanse el ejemplo 2 de la patente estadounidense n.º 5.641.870; Zapataet al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. La expresión “anticuerpos lineales” se refiere generalmente a los anticuerpos descritos en Zapataet al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (V<H>-C<H>1-V<H>-C<H>1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

[0095] La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos “Fab”, y un fragmento “Fc” residual, una denominación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de región variable de la cadena H (V<H>), y el primer dominio constante de una cadena pesada (C<H>1). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión a antígeno, es decir, tiene un único sitio de unión a antígeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un único fragmento F(ab’)<2>grande que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab unidos por disulfuro que tiene actividad de unión a antígeno divalente y todavía puede reticular el antígeno. Los fragmentos Fab’ difieren de los fragmentos Fab en que tienen unos pocos residuos adicionales en el extremo carboxilo-terminal del dominio C<H>1, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab’-SH es la denominación en el presente documento para Fab’ en el que residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab’)<2>se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab’ que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

[0097] El fragmento Fc comprende las porciones carboxilo-terminales de ambas cadenas H mantenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de anticuerpos se determinan por las secuencias en la región Fc, región que también es la parte reconocida por los receptores de Fc (FcR) encontrados en determinados tipos de células.

[0098] Una “región Fc variante” comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una “modificación de aminoácido” tal como se define en el presente documento. Preferiblemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido parental, por ejemplo, desde aproximadamente una hasta aproximadamente diez sustituciones de aminoácido, y preferiblemente desde aproximadamente una hasta aproximadamente cinco sustituciones de aminoácido en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido parental. La región Fc variante en el presente documento puede presentar al menos aproximadamente el 80 % de homología, al menos aproximadamente el 85 % de homología, al menos aproximadamente el 90 % de homología, al menos aproximadamente el 95 % de homología o al menos aproximadamente el 99 % de homología con una región Fc de secuencia nativa. La región Fc variante en el presente documento puede presentar al menos aproximadamente el 80 % de homología, al menos aproximadamente el 85 % de homología, al menos aproximadamente el 90 % de homología, al menos aproximadamente el 95 % de homología o al menos aproximadamente el 99 % de homología con una región Fc de un polipéptido parental.

[0100] El término “polipéptido que comprende región Fc” se refiere a un polipéptido, tal como un anticuerpo o una inmunoadhesina (véanse las definiciones en otra parte en el presente documento), que comprende una región Fc. La lisina C-terminal (residuo 447 según el sistema de numeración EU) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la purificación del polipéptido o mediante ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica para el polipéptido. Por consiguiente, una composición que comprende polipéptidos, incluyendo anticuerpos, que tienen una región Fc según esta invención puede comprender poblaciones de polipéptidos con todos los residuos K447 eliminados, poblaciones de polipéptidos sin residuos K447 eliminados o poblaciones de polipéptidos que tienen una mezcla de polipéptidos con y sin el residuo K447.

[0102] Las “funciones efectoras” de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o región Fc variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento; unión a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular; y activación de células B. Una “región Fc de secuencia nativa” comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Se describen ejemplos de secuencias de Fc en, por ejemplo, pero sin limitarse a, Kabatet al., Sequences of Immunological Interest. 5ª ed. Servicio Sanitario Público, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1991)).

[0104] “Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión a y reconocimiento de antígeno completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y un dominio de región variable de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. A partir del plegamiento de estos dos dominios surgen seis bucles hipervariables (3 bucles de cada una de las cadenas H y L) que contribuyen a los residuos de aminoácido para la unión a antígeno y confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo.

[0105] Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas de un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

[0107] “Fv de cadena sencilla” también abreviado como “sFv” o “scFv” son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo V<H>y V<L>conectados en una única cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido sFv comprende además un ligador polipeptídico entre los dominios V<H>y V<L>que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore (eds.), Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, véase a continuación.

[0109] El término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo preparados mediante la construcción de fragmentos sFv (véase el párrafo anterior) con ligadores cortos (de aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios V<H>y V<L>, de manera que se logra el emparejamiento intercadena, pero no intracadena, de los dominios V, dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv “cruzados” en los que los dominios V<H>y V<L>de los dos anticuerpos están presentes en cadenas polipeptídicas diferentes. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, el documento EP 404,097; el documento WO 93/11161; y Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

[0111] Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, una rata, un conejo o un primate no humano que tiene la especificidad, la afinidad, y la capacidad de anticuerpo deseadas. En algunos casos, los residuos de región de entramado (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes.

[0113] Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en el que la totalidad o sustancialmente la totalidad de los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Joneset al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmannet al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992).

[0115] “Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” u “homología” con respecto a las secuencias de polipéptido y anticuerpo identificadas en el presente documento se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en el polipéptido que está comparándose, después de alinear las secuencias teniendo en cuenta cualesquiera sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. La alineación con propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de diversas maneras que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que están comparándose. Sin embargo, con los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue escrito por Genentech, Inc. y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de Estados Unidos, Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.º de registro de Derechos de Autor de Estados Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen mediante el programa ALIGN-2 y no varían.

[0117] Los términos “receptor de Fc” o “FcR” se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. Un FcR tal como se describe en el presente documento puede ser uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcγRI, FcγRII, y FcγRIII, incluyendo variantes alélicas y formas sometidas a corte y empalme alternativo de estos receptores. Los receptores FcγRII incluyen FcγRIIA (un “receptor activante”) y FcγRIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor activante FcγRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcγRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase una revisión en M. Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). El término incluye alotipos, tales como alotipos de FcγRIIIA: FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIIA-Val158, FcγRIIA-R131 y/o FcγRIIA-H131. Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capelet al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haaset al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). En el presente documento, el término “FcR” abarca otros FcR, incluyendo los que se identificarán en el futuro. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyeret al., J. Immunol.117:587 (1976) y Kimet al., J. Immunol.24:249 (1994)).

[0118] El término “FcRn” se refiere al receptor neonatal de Fc (FcRn). FcRn es estructuralmente similar al complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) y consiste en una cadena α unida de manera no covalente a microglobulina β2. Las múltiples funciones del receptor neonatal de Fc, FcRn, se revisan en Ghetie y Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766. FcRn desempeña un papel en el traspaso pasivo de inmunoglobulinas IgG de la madre al hijo y la regulación de los niveles séricos de IgG. FcRn puede actuar como receptor de rescate, uniendo y transportando IgG sometidas a pinocitosis en forma intacta tanto en el interior como a través de las células, y rescatándolas de una ruta degradativa predeterminada.

[0119] El “dominio C<H>1” de una región Fc de IgG humana (también denominado “C1” de dominio “H1”) se extiende habitualmente desde aproximadamente el aminoácido 118 hasta aproximadamente el aminoácido 215 (sistema de numeración EU).

[0120] “Región bisagra” se define generalmente como el tramo desde Glu216 hasta Pro230 de IgG1 humana (Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)). Las regiones bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgG1 colocando los residuos de cisteína primero y último que forman enlaces S-S entre cadenas pesadas en las mismas posiciones.

[0121] La “región bisagra inferior” de una región Fc se define normalmente como el tramo de residuos inmediatamente C-terminal con respecto a la región bisagra, es decir, los residuos 233 a 239 de la región Fc. En informes previos, la unión a FcR se atribuyó generalmente a los residuos de aminoácido en la región bisagra inferior de una región Fc de IgG.

[0122] El “dominio C<H>2” de una región Fc de IgG humana (también denominado “C2” de dominio “H2”) se extiende habitualmente desde aproximadamente el aminoácido 231 hasta aproximadamente el aminoácido 340. El dominio C<H>2 es único porque no está estrechamente emparejado con otro dominio. En su lugar, dos cadenas de hidrato de carbono ramificadas unidas por N están interpuestas entre los dos dominios C<H>2 de una molécula de IgG nativa intacta. Se ha especulado que el hidrato de carbono puede proporcionar un sustituto para el emparejamiento dominio-dominio y ayudar a estabilizar el dominio C<H>2. Burton, Molec Immunol. 22:161-206 (1985).

[0123] El “dominio C<H>3” (también denominado dominio “C2” o “H3”) comprende el tramo de residuos C-terminal con respecto a un dominio C<H>2 en una región Fc (es decir, desde aproximadamente el residuo de aminoácido 341 hasta el extremo C-terminal de una secuencia de anticuerpo, normalmente el residuo de aminoácido 446 ó 447 de una IgG).

[0124] Una “región Fc funcional” presenta una “función efectora” de una región Fc de secuencia nativa. Las “funciones efectoras” a modo de ejemplo incluyen unión a C1q; citotoxicidad dependiente del complemento; unión a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Tales funciones efectoras requieren generalmente que se combine la región Fc con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden evaluarse usando diversos ensayos tal como se da a conocer en el presente documento, por ejemplo.

[0125] “C1q” es un polipéptido que incluye un sitio de unión para la región Fc de una inmunoglobulina. C1q junto con dos serina proteasas, C1r y C1s, forman el complejo C1, el primer componente de la ruta de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). C1q humano puede adquirirse comercialmente de, por ejemplo, Quidel, San Diego, CA.

[0126] El término “dominio de unión” se refiere a la región de un polipéptido que se une a otra molécula. En el caso de un FcR, el dominio de unión puede comprender una porción de una cadena polipeptídica del mismo (por ejemplo, la cadena alfa del mismo) que es responsable de la unión a una región Fc. Un dominio de unión útil es el dominio extracelular de una cadena alfa de FcR.

[0127] Un anticuerpo con una Fc de IgG variante con actividad de ADCC o afinidad de unión a FcR “alterada” es uno que tiene actividad de ADCC y/o actividad de unión a FcR (por ejemplo, FcγR o FcRn) o bien potenciada o bien disminuida en comparación con un polipéptido parental o con un polipéptido que comprende una región Fc de secuencia nativa. La Fc variante que “presenta unión aumentada” a un FcR se une a al menos un FcR con mayor afinidad (por ejemplo, menor valor de Kd aparente o CI<50>) que el polipéptido parental o una Fc de IgG de secuencia nativa. La mejora de la unión en comparación con un polipéptido parental puede ser una mejora de la unión de aproximadamente 3 veces, preferiblemente de aproximadamente 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200, hasta 500 veces, o de aproximadamente el 25 % al 1000 %. La variante de polipéptido que “presenta una unión disminuida” a un FcR se une a al menos un FcR con menor afinidad (por ejemplo, mayor valor de Kd aparente o CI<50>) que un polipéptido parental. La disminución de la unión en comparación con un polipéptido parental puede ser una disminución de la unión de aproximadamente el 40 % o más.

[0129] “Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos” o “ADCC” se refiere a una forma de citotoxicidad en la que Ig secretada unida a los receptores de Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, células citolíticas naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana portadora de antígeno y posteriormente destruyan la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos “arman” las células citotóxicas y son absolutamente necesarios para tal destrucción. Las células primarias para mediar en ADCC, las células NK, expresan FcγRIII únicamente, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol.9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo de ADCCin vitro, tal como el descrito en la patente estadounidense n.º 5.500.362 ó 5.821.337 o en los ejemplos a continuación. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células citolíticas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarsein vivo,por ejemplo, en un modelo animal tal como el dado a conocer en Clyneset al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

[0131] El polipéptido que comprende una región Fc variante que “presenta ADCC aumentada” o media en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras humanas más eficazmente que un polipéptido que tiene Fc de IgG de tipo natural o un polipéptido parental es uno que,in vitrooin vivo, es sustancialmente más eficaz en la mediación de ADCC, cuando las cantidades del polipéptido con región Fc variante y el polipéptido con región Fc de tipo natural (o el polipéptido parental) en el ensayo son esencialmente iguales. Generalmente, tales variantes se identificarán usando cualquier ensayo de ADCCin vitroconocido en la técnica, tal como ensayos o métodos para determinar la actividad de ADCC, por ejemplo, en un modelo animal, etc. La variante preferida puede ser desde aproximadamente 5 veces hasta aproximadamente 100 veces, por ejemplo, desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 50 veces, más eficaz en la mediación de ADCC que la Fc de tipo natural (o el polipéptido parental).

[0133] “Citotoxicidad dependiente del complemento” o “CDC” se refiere a la lisis de una célula diana en presencia de complemento. La activación de la ruta clásica del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que están unidos a su antígeno relacionado. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoroet al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Las variantes polipeptídicas con secuencias de aminoácidos de región Fc alteradas y capacidad de unión a C1q aumentada o disminuida se describen en la patente estadounidense n.º 6.194.551B1 y el documento WO99/51642. Véase también Idusogieet al. J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).

[0135] Una “cantidad eficaz” de un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento del mismo) o una composición tal como se da a conocer en el presente documento es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito indicado específicamente. Una “cantidad eficaz” puede determinarse empíricamente y mediante métodos conocidos referentes al propósito indicado. El término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento del mismo) o una composición tal como se da a conocer en el presente documento que es eficaz para “tratar” una enfermedad o un trastorno en un mamífero (también conocido como paciente). En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento del mismo) o la composición tal como se da a conocer en el presente documento puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño o peso tumoral; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y preferiblemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierta medida y preferiblemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en cierta medida, el crecimiento tumoral; y/o aliviar, en cierta medida, uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida en que el anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento del mismo) o la composición tal como se da a conocer en el presente documento puede prevenir el crecimiento de y/o destruir células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. La cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una cantidad inhibidora de crecimiento. La cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una cantidad que prolonga la supervivencia de un paciente. La cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una cantidad que mejora la supervivencia libre de progresión de un paciente.

[0137] Una “cantidad inhibidora de crecimiento” de un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento del mismo) o una composición tal como se da a conocer en el presente documento de esta invención es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente un tumor, por ejemplo, una célula cancerosa, o bienin vitroo bienin vivo.Una “cantidad inhibidora de crecimiento” de un anticuerpo de esta invención con los propósitos de inhibir el crecimiento de células neoplásicas puede determinarse empíricamente y mediante métodos conocidos o mediante los ejemplos proporcionados en el presente documento.

[0138] Una “cantidad citotóxica” de un anticuerpo anti-PD-1 de esta invención es una cantidad capaz de provocar la destrucción de una célula, especialmente un tumor, por ejemplo, una célula cancerosa, o bienin vitroo bienin vivo.Una “cantidad citotóxica” de un anticuerpo anti-PD-1 de esta invención con los propósitos de inhibir el crecimiento de células neoplásicas puede determinarse empíricamente y mediante métodos conocidos en la técnica.

[0139] Una “cantidad inhibidora de crecimiento” de un anticuerpo anti-PD-1 de esta invención es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente un tumor, por ejemplo, una célula cancerosa, o bienin vitroo bienin vivo.Una “cantidad inhibidora de crecimiento” de un anticuerpo anti-PD-1 de esta invención con los propósitos de inhibir el crecimiento de células neoplásicas puede determinarse empíricamente y mediante métodos conocidos o mediante los ejemplos proporcionados en el presente documento.

[0140] Tal como se usa en el presente documento, por “farmacéuticamente aceptable” o “farmacológicamente compatible” se entiende un material que no es indeseable biológicamente o de otro modo, por ejemplo, el material puede incorporarse en una composición farmacéutica administrada a un paciente sin provocar ningún efecto biológico indeseable significativo ni interaccionar de manera perjudicial con ninguno de los demás componentes de la composición en la que está contenido. Los portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables han cumplido preferiblemente los estándares requeridos de pruebas toxicológicas y de fabricación y/o se incluyen en la Guía de Principios Inactivos preparada por la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos.

[0141] Se pretende que el término “detectar” incluya determinar la presencia o ausencia de una sustancia o cuantificar la cantidad de una sustancia (tal como PD-1). Por tanto, el término se refiere al uso de los materiales, las composiciones, y los métodos de la presente divulgación para determinaciones cualitativas y cuantitativas. En general, la técnica particular usada para la detección no es crítica para la práctica de la divulgación.

[0142] Por ejemplo, “detectar” puede incluir: observar la presencia o ausencia de producto génico de PD-1, moléculas de ARNm, o un polipéptido de PD-1; un cambio de los niveles de un polipéptido de PD-1 o la cantidad unida a una diana; un cambio de la función/actividad biológica de un polipéptido de PD-1. “Detectar” puede incluir detectar los niveles de PD-1 de tipo natural (por ejemplo, niveles de ARNm o polipéptido). Detectar puede incluir cuantificar un cambio (aumento o disminución) de cualquier valor entre el 10 % y el 90 %, o de cualquier valor entre el 30 % y el 60 %, o superior al 100 %, en comparación con un control. Detectar puede incluir cuantificar un cambio de cualquier valor entre 2 veces y 10 veces, inclusive, o más, por ejemplo, de 100 veces.

[0143] El término “marcador” cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o una composición detectable que se conjuga de manera directa o indirecta con el anticuerpo. El propio marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisotópicos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o una composición sustrato que es detectable.

[0144] La referencia a “aproximadamente” un valor o parámetro en el presente documento se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido por el experto en este campo técnico. La referencia a “aproximadamente” un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) aspectos que se refieren a ese valor o parámetro propiamente dicho.Por ejemplo, una descripción referente a “aproximadamente X” incluye la descripción de “X”.

[0145] Se entiende que las realizaciones de la invención descrita en el presente documento incluyen “que comprende”, “que consiste en”, y “que consiste esencialmente en” realizaciones.

[0146] Anticuerpos anti-PD-1

[0147] La presente invención se basa en la identificación de novedosos anticuerpos que se unen al receptor de PD-1 (PD-1). Los anticuerpos anti-PD-1 pueden usarse en una variedad de métodos terapéuticos y diagnósticos. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PD-1 pueden usarse solos o en combinación con otros agentes en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por una expresión de PD-1 anómala o una actividad de PD-1 anómala, incluyendo, por ejemplo, melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo, TNBC), cáncer gástrico, linfoma de Hodgkin clásico (cHL), linfoma no Hodgkin-linfoma de células B mediastínico primario (NHL-PMBCL), mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de esófago, carcinoma de nasofaringe (NPC), cáncer de vías biliares, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides. Los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden usarse para detectar la proteína PD-1 en pacientes o muestras de pacientes mediante la administración de los anticuerpos anti-PD-1 a los pacientes y la detección del anticuerpo anti-PD-1 unido a la proteína PD-1 en una muestra del paciente (por ejemplo,in vivooexvivo) o mediante la puesta en contacto de los anticuerpos anti-PD-1 con muestras de los pacientes y la detección cualitativa o cuantitativa del anticuerpo anti-PD-1 unido a la proteína PD-1.

[0148] La proteína de muerte celular programada 1 (también conocida como PD-1 y CD279 (grupo de diferenciación 279)) es una proteína que, en seres humanos, está codificada por el genPDCD1. PD-1 es un receptor de superficie celular que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas y se expresa en células T y células pro-B. PD-1 se une a dos ligandos, PD-L1 y PD-L2. PD-1, que funciona como punto de control inmunitario, desempeña un papel importante en la regulación por disminución del sistema inmunitario previniendo la activación de células T, lo que a su vez reduce la autoinmunidad y fomenta la autotolerancia. El efecto inhibidor de PD-1 se logra a través de un mecanismo dual de fomentar la apoptosis (muerte celular programada) en células T específicas de antígeno en los ganglios linfáticos, mientras que reduce simultáneamente la apoptosis en células T reguladoras (células T supresoras).

[0149] Un anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo que se une a PD-1 con suficiente afinidad y especificidad. Preferiblemente, un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento (o el fragmento de unión a antígeno del mismo) puede usarse como agente terapéutico en para dirigirse a, e interferir con, enfermedades o afecciones en las que está implicada la actividad de PD-1. Un anticuerpo anti-PD-1 habitualmente no se unirá a otra superfamilia de inmunoglobulinas. Preferiblemente, el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 humanizado recombinante.

[0150] Según la presente invención, el anticuerpo anti-PD-1 comprende las CDR, la región variable de cadena pesada, y/o la región variable ligera tal como se define por las reivindicaciones.

[0151] En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 de la invención es un anticuerpo anti-PD-1 quimérico c1G4 y/o un anticuerpo anti-PD-1 humanizado h1G4, que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera (LC) que comprende (1) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos KASQDVTTAVA (SEQ ID NO: 9); (2) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRHT (SEQ ID NO: 10); y (3) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHYTIPWT (SEQ ID NO: 11), y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (HC) que comprende (1) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSNYGMS (SEQ ID NO: 12); (2) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos TISGGGSNIY (SEQ ID NO: 13); y (3) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos VSYYYGIDF (SEQ ID NO: 14).

[0152] Se proporcionan secuencias de aminoácidos y nucleótidos de longitud completa de las cadenas ligeras y pesadas de c1G4 y h1G4 y sus secuencias de CDR en la lista de secuencias a continuación.

[0153] La invención también proporciona un anticuerpo anti-PD-1 tal como se define por las reivindicaciones, que comprende una secuencia de cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 4 y una secuencia de cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 2 para su uso tal como se define por las reivindicaciones.

[0154] La invención también proporciona un anticuerpo anti-PD-1 humanizado tal como se define por las reivindicaciones, que comprende una secuencia de cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 8 y una secuencia de cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 6 para su uso tal como se define por las reivindicaciones.

[0155] La presente divulgación también describe anticuerpos madurados por afinidad contra anticuerpo anti-PD-1 humanizado h1G4. En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 madurado (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-1, 33B) que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera (LC) que comprende (1) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos KASTDVTTAVA (SEQ ID NO: 15); (2) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASLRHT (SEQ ID NO: 16); y (3) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHYGIPWT (SEQ ID NO: 17), y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (HC) que comprende (1) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos FRFSNYGMS (SEQ ID NO: 18); (2) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos TISGGGSNAY (SEQ ID NO: 19); y (3) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos TSYYYGIDF (SEQ ID NO: 20).

[0156] En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 madurado (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-1, 66E) que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera (LC) que comprende (1) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos KAKQDVTTAVA (SEQ ID NO: 21); (2) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRHT (SEQ ID NO: 10); y (3) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHYWIPWT (SEQ ID NO: 22), y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (HC) que comprende (1) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSNYGMS (SEQ ID NO: 12); (2) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos TISGGGSNIY (SEQ ID NO: 13); y (3) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos VSYYYGIDL (SEQ ID NO: 23).

[0157] En el presente documento se describe un anticuerpo anti-PD-1 madurado (por ejemplo, anticuerpo anti-PD-1, 711D) que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera (LC) que comprende (1) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos KASQDVTNAVA (SEQ ID NO: 24); (2) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRHT (SEQ ID NO: 10); y (3) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHYTIPWT (SEQ ID NO: 11), y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (HC) que comprende (1) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSNYGMS (SEQ ID NO: 12); (2) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos TISGGGSNIY (SEQ ID NO: 13); y (3) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SSYYYGIDL (SEQ ID NO: 25).

[0159] La(s) sustitución/sustituciones de aminoácido puede(n) ser sustitución/sustituciones de aminoácido conservadora(s). Las sustituciones de aminoácido pueden no reducir sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, pueden realizarse alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras tal como se proporcionan en el presente documento) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión a PD-1. La afinidad de unión de las variantes de anticuerpo anti-PD-1 puede evaluarse usando los métodos descritos en los ejemplos a continuación.

[0161] Las sustituciones conservadoras se muestran en la tabla 3 bajo el encabezado de “sustituciones conservadoras”. Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 3 bajo el encabezado de “sustituciones a modo de ejemplo”, y tal como se describe adicionalmente a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Pueden introducirse sustituciones de aminoácido en un anticuerpo de interés y pueden cribarse los productos en busca de una actividad deseada, por ejemplo, unión a PD-1 mantenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida, o ADCC o CDC mejorada.

[0164] TABLA 3: SUSTITUCIONES CONSERVADORAS

[0167]

[0170] Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Una variante sustitucional a modo de ejemplo es un anticuerpo madurado por afinidad, que puede generarse de manera conveniente, por ejemplo, usando técnicas de maduración por afinidad basada en presentación en fago tales como las descritas en el presente documento. Brevemente, se mutan uno o más residuos de CDR y se presentan en fago los anticuerpos variantes y se criban en busca de una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión). Pueden realizarse alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Tales alteraciones pueden realizarse en “puntos calientes” de HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o SDR (a-CDR), sometiéndose a prueba V<H>o V<L>variante resultante para determinar la afinidad de unión. La maduración por afinidad mediante construcción y reselección a partir de bibliotecas secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboomet al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brienet al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).

[0172] En algunas divulgaciones de maduración por afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración mediante cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR propensa a errores, intercambio de cadenas, o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). Luego se crea una biblioteca secundaria. Luego se criba la biblioteca para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno pueden identificarse específicamente, por ejemplo, usando modelado o mutagénesis de barrido de alanina. Con frecuencia se seleccionan como diana CDR-H3 y CDR-L3 en particular.

[0174] Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia de dominio variable de cadena ligera (V<L>) que comprende (1) una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 21 y 24; (2) una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 10 ó 16; (3) una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 17, 22, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (V<H>) que comprende (1) una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 12 ó 18; (2) una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 13 ó 19; y (3) una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 20, 23, y 25.

[0176] Los dominios variables de cadena pesada y ligera pueden combinarse en todas las combinaciones por pares posibles para generar varios anticuerpos anti-PD-1.

[0178] El anticuerpo anti-PD-1 puede carecer de un motivo de N-glicosilación en la región variable de cadena pesada o cadena ligera que puede provocar diferencias dentro de un lote de anticuerpos, dando como resultado una función, una inmunogenicidad, o una estabilidad alterada. Los métodos de análisis de la glicosilación de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, cromatografía (tal como cromatografía de intercambio catiónico (CEX) o cromatografía de líquidos), espectrometría de masas (tal como espectrometría de masas de ionización por electropulverización), y electroforesis capilar-dodecilsulfato de sodio. Tales métodos se describen en, por ejemplo, Junget al. (2011) Curr Op Biotechnol. 22(6):858-67; Cummings RD, Etzler ME. Antibodies and Lectins in Glycan Analysis. En: Varki A, Cummings RD, Esko JD,et al., editores. Essentials of Glycobiology. 2ª edición. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Capítulo 45; Mulloy B, Hart GW, Stanley P. Structural Analysis of Glycans. En: Varki A, Cummings RD, Esko JD,et al., editores. Essentials of Glycobiology. 2ª edición. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Capítulo 47; Leymarie,et al. (2012) Anal Chem. 84(7): 3040-3048; Fernández (2005) European Biopharmaceutical Review. págs.106-110; y Raju, T. (2013) Methods Mol Biol.988: 169-180.

[0180] El anticuerpo anti-PD-1 puede tener una afinidad de unión más fuerte por una PD-1 que la que tiene por un homólogo de esa PD-1. Normalmente, el anticuerpo anti-PD-1 “se une específicamente” a PD-1 (es decir, tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no más de aproximadamente 1 x 10<-7>M, preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10<-8>y lo más preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10<-9>M), pero tiene una afinidad de unión por un miembro de la familia de PD-1 que es al menos aproximadamente 50 veces, o al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces más débil que su afinidad de unión por PD-1. El anticuerpo anti-PD-1 que se une específicamente a PD-1 puede ser de cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos tal como se definieron anteriormente, pero preferiblemente es un anticuerpo humanizado o humano.

[0182] El grado de unión del anticuerpo anti-PD-1 a una proteína no diana puede ser menor de aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo a PD-1 tal como se determina mediante métodos conocidos en la técnica, tales como ELISA, análisis por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), o radioinmunoprecipitación (RIA). La unión específica puede medirse, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control, que generalmente es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica puede determinarse mediante competición con una molécula de control que es similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, se indica unión específica si la unión de la diana marcada a una sonda se inhibe de manera competitiva por diana no marcada en exceso. El término “unión específica” o “se une específicamente a” o es “específico de” un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular tal como se usa en el presente documento puede presentarse, por ejemplo, por una molécula que tiene una Kd para la diana de al menos aproximadamente 10 M, alternativamente al menos aproximadamente 10 M, alternativamente al menos aproximadamente 10<-6>M, alternativamente al menos aproximadamente 10<-7>M, alternativamente al menos aproximadamente 10<-8>M, alternativamente al menos aproximadamente 10<-9>M, alternativamente al menos aproximadamente 10<-10>M, alternativamente al menos aproximadamente 10<-11>M, alternativamente al menos aproximadamente 10<-12>M, o superior. El término “unión específica” puede referirse a unión donde una molécula se une a un polipéptido particular o un epítopo en un polipéptido particular sin unión sustancial a ningún otro polipéptido o epítopo polipeptídico.

[0184] La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo de acción de los anticuerpos terapéuticos contra células tumorales. ADCC es una defensa inmunitaria mediada por células mediante la cual una célula efectora del sistema inmunitario provoca activamente la lisis de una célula diana (por ejemplo, una célula cancerosa), a cuyos antígenos de superficie de membrana se han unido anticuerpos específicos (por ejemplo, tales como un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento). El anticuerpo anti-PD-1 puede presentar una función efectora de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) similar a OPDIVO<®>o nivolumab, tal como se demuestra, por ejemplo, mediante los ensayos descritos en el ejemplo.

[0186] Por ejemplo, la actividad de función efectora de ADCC de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede ser al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, al menos aproximadamente el 100 %, o más del 100 % (por ejemplo, aproximadamente el 105 %, aproximadamente el 106 %, aproximadamente el 107 %, aproximadamente el 108 %, aproximadamente el 109 %, aproximadamente el 110 %, aproximadamente el 111 %, aproximadamente el 112 %, aproximadamente el 113 %, aproximadamente el 114 %, aproximadamente el 115 %, aproximadamente el 116 %, aproximadamente el 117 %, aproximadamente el 118 %, aproximadamente el 119 %, aproximadamente el 120 %, aproximadamente el 121 %, aproximadamente el 122 %, aproximadamente el 123 %, aproximadamente el 124 %, aproximadamente el 125 %, o aproximadamente el 130 %) de la actividad de función efectora de ADCC de OPDIVO<®>(nivolumab), incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.

[0187] El anticuerpo anti-PD-1 puede presentar una afinidad de unión por PD-1 similar a OPDIVO<®>. La unión a PD-1 puede demostrarse mediante ELISA, tal como se describe en los ejemplos. Por ejemplo, la afinidad de unión del anticuerpo anti-PD-1 por PD-1 es aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 100 %, o más del 100 % (por ejemplo, aproximadamente el 105 %, aproximadamente el 106 %, aproximadamente el 107 %, aproximadamente el 108 %, aproximadamente el 109 %, aproximadamente el 110 %, aproximadamente el 111 %, aproximadamente el 112 %, aproximadamente el 113 %, aproximadamente el 114 %, aproximadamente el 115 %, aproximadamente el 116 %, aproximadamente el 117 %, aproximadamente el 118 %, aproximadamente el 119 %, aproximadamente el 120 %, aproximadamente el 121 %, aproximadamente el 122 %, aproximadamente el 123 %, aproximadamente el 124 %, aproximadamente el 125 %, o más de aproximadamente el 125 %) mayor que la afinidad de unión de OPDIVO<®>(nivolumab) por PD-1.

[0189] El anticuerpo anti-PD-1 puede unirse a una PD-1 humana con una Kd de entre aproximadamente 0,1 pM y 200 pM (0,2 nM), por ejemplo, aproximadamente 0,1 pM, aproximadamente 0,25 pM, aproximadamente 0,5 pM, aproximadamente 0,75 pM, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 30 pM, aproximadamente 40 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 70 pM, aproximadamente 80 pM, aproximadamente 90 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 110 pM, aproximadamente 120 pM, aproximadamente 130 pM, aproximadamente 140 pM, aproximadamente 150 pM, aproximadamente 160 pM, aproximadamente 170 pM, aproximadamente 180 pM, aproximadamente 190 pM, o más de aproximadamente 190 pM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. La afinidad de unión del anticuerpo anti-PD-1 por PD-1 puede ser aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 100 %, o más de aproximadamente el 100 % (por ejemplo, aproximadamente el 105 %, aproximadamente el 110 %, aproximadamente el 120 %, o aproximadamente el 130 %) mayor que la afinidad de unión de OPDIVO<®>(nivolumab) por PD-1. La afinidad de unión del anticuerpo anti-PD-1 por PD-1 puede ser aproximadamente 1,1 veces, aproximadamente 1,2 veces, aproximadamente 1,3 veces, aproximadamente 1,4 veces, aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 1,6 veces, aproximadamente 1,7 veces, aproximadamente 1,8 veces, aproximadamente 1,9 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 2,25 veces, aproximadamente 2,5 veces, aproximadamente 2,75 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 3,25 veces, aproximadamente 3,5 veces, aproximadamente 3,75 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 4,25 veces, aproximadamente 4,5 veces, aproximadamente 4,75 veces, o más de aproximadamente 4,75 veces mayor que la afinidad de unión de OPDIVO<®>(nivolumab) por PD-1, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.

[0190] Los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el presente documento pueden tener semividasin vivoprolongadas en comparación con OPDIVO<®>. La semividain vivode un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede ser no más corta que la semividain vivode OPDIVO<®>.

[0192] Los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el presente documento pueden presentar propiedades farmacocinéticas que son similares a las de OPDIVO<®>(nivolumab) o su biosimilar. Los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el presente documento pueden presentar un AUC (área bajo la curva) que es aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, o más del 95 % (tal como aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 %, o más de aproximadamente el 99 %) de los perfiles de concentración sérica-tiempo de OPDIVO<®>(nivolumab) o su biosimilar, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.

[0194] En el contexto de la presente invención, el anticuerpo comprende una secuencia de Fc de una IgG4 humana. La secuencia de Fc puede haberse alterado o cambiado de otro modo, de manera que carece de función efectora de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), con frecuencia relacionada con su unión a receptores de Fc (FcR). Hay muchos ejemplos de cambios o mutaciones en secuencias de Fc que pueden alterar la función efectora. Por ejemplo, el documento WO 00/42072 y Shieldset al. J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) describen variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a FcR. El anticuerpo puede estar en forma de Fab, Fab’, F(ab)’<2>, Fv de cadena sencilla (scFv), un fragmento de Fv, un diacuerpo, y un anticuerpo lineal. Además, el anticuerpo puede ser un anticuerpo multiespecífico que se une a PD-1, pero también se une a una o más de otras dianas e inhibe su función. El anticuerpo puede conjugarse con un agente terapéutico (por ejemplo, un agente citotóxico, un radioisótopo y un agente quimioterápico) o un marcador para detectar PD-1 en muestras de pacientes oin vivomediante obtención de imágenes (por ejemplo, un radioisótopo, un colorante fluorescente, y una enzima). Otras modificaciones incluyen la conjugación de toxinas con los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el presente documento.

[0196] También se contemplan moléculas de ácido nucleico que codifican para los anticuerpos anti-PD-1, vectores de expresión que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican para los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el presente documento, y células que comprenden las moléculas de ácido nucleico. Estos anticuerpos pueden usarse en las terapias descritas en el presente documento y para detectar la proteína PD-1 en muestras de pacientes (por ejemplo, mediante FACS, inmunohistoquímica (IHC), ensayos ELISA) o en pacientes.

[0198] Anticuerpos monoclonales

[0200] Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse, por ejemplo, usando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975) o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (patente estadounidense n.º 4.816.567) o pueden producirse mediante los métodos descritos en el presente documento en los ejemplos a continuación. En un método de hibridoma, normalmente se inmuniza un hámster, ratón, u otro animal huésped apropiado con un agente de inmunización para obtener linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente de inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarsein vitro.

[0202] El agente de inmunización incluirá normalmente un polipéptido o una proteína de fusión de la proteína de interés o una composición que comprende la proteína. Generalmente, o bien se usan linfocitos de sangre periférica (“PBL”) si se desean células de origen humano, o bien se usan células de bazo o células de ganglio linfático si se desean fuentes mamíferas no humanas. Luego se fusionan los linfocitos con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, Nueva York: Academic Press, 1986, págs. 59-103). Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células mamíferas transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino, y humano. Habitualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (“medio HAT”), sustancias que previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

[0204] Líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficiente, soportan una expresión de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, a partir del Centro de Distribución de Células del Instituto Salk, San Diego, California y la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-ser humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeuret al. MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, Inc.: Nueva York, 1987, págs.

[0205] 51-63).

[0206] Luego puede someterse a ensayo el medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma puede determinarse mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de uniónin vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA). Tales técnicas y ensayos se conocen en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

[0207] Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y hacerse crecer mediante métodos convencionales. Goding, citado anteriormente.Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden hacerse crecerin vivocomo ascitis en un mamífero.

[0208] Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o líquido ascítico mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

[0209] Los anticuerpos monoclonales también pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente estadounidense n.º 4.816.567. El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que pueden unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma descritas en el presente documento sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otro modo proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante por dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homólogas (patente estadounidense n.º 4.816.567; Morrisonet al., citado anteriormente)o uniendo de manera covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia codificante para un polipéptido distinto de inmunoglobulina. Un polipéptido distinto de inmunoglobulina de este tipo puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo descrito en el presente documento, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo descrito en el presente documento para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

[0210] Un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede expresarse por una línea celular mamífera estable. Un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede expresarse a partir de una línea celular mamífera estable a un título de aproximadamente 2,0 gramos/litro, aproximadamente 2,5 gramos/litro, aproximadamente 3,0 gramos/litro, aproximadamente 3,5 gramos/litro, aproximadamente 4,0 gramos/litro, aproximadamente 4,5 gramos/litro, aproximadamente 5,0 gramos/litro, aproximadamente 5,5 gramos/litro, aproximadamente 6 gramos/litro, aproximadamente 6,5 gramos/litro, aproximadamente 7,0 gramos/litro, o más de aproximadamente 7,0 gramos/litro, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. En determinadas realizaciones, la línea celular mamífera estable a partir de la cual se expresa un anticuerpo anti-PD-1 proporcionado por la invención es una línea celular CHO.

[0211] Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. En la técnica se conocen métodos para preparar anticuerpos monovalentes. Por ejemplo, un método implica la expresión recombinante de cadena pesada modificada y cadena ligera de inmunoglobulina. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc para prevenir la reticulación de cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes se sustituyen por otro residuo de aminoácido o se delecionan para prevenir la reticulación.

[0212] También son adecuados métodosin vitropara preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, puede lograrse usando, pero sin limitarse a, técnicas conocidas en la técnica.

[0213] Anticuerpos humanos y humanizados

[0214] Los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)<2>, u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que normalmente contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una CDR del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, o conejo que tiene la especificidad, la afinidad, y la capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de entramado de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o entramado importadas. En general, el anticuerpo humanizado puede comprender sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en el que la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones FR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá preferiblemente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Joneset al. Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmannet al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

[0216] Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humanos se denominan con frecuencia residuos de “importación”, que normalmente se toman de un dominio variable de “importación”. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Joneset al. Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmannet al. Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyenet al. Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo las CDR o secuencias de CDR de roedor por secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos “humanizados” son anticuerpos (patente estadounidense n.º 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

[0218] Como alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que, tras la inmunización, pueden producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de región de unión de cadena pesada (JH) de anticuerpo en ratones mutantes de línea germinal y quiméricos da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de línea germinal humana a tales ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno. Véanse, por ejemplo, Jakobovitset al. PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovitset al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemannet al. Year in Immunol., 7:33 (1993); las patentes estadounidenses n.<os>5.545.806, 5.569.825, 5.591.669; 5.545.807; y el documento WO 97/17852.

[0220] Alternativamente, los anticuerpos humanos pueden producirse introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado de manera parcial o completa. Tras la exposición, se observa la producción de anticuerpos humanos que se asemeja estrechamente a la observada en seres humanos en todos los aspectos, incluyendo reordenación de genes, ensamblaje, y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.<os>5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016, y Markset al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberget al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwildet al. Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).

[0222] Alternativamente, puede usarse la tecnología de presentación en fago (McCaffertyet al., Nature 348:552-553, 1990) para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpo humanosin vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. Según esta técnica, las secuencias de dominio V de anticuerpo se clonan en marco en un gen de proteína de envoltura mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. La presentación en fago puede realizarse en una variedad de formatos, por ejemplo, tal como se describe a continuación en la sección de ejemplos o tal como se revisa en, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Pueden usarse varias fuentes de segmentos de gen V para la presentación en fago. Clacksonet al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron una amplia gama de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos contra una amplia gama de antígenos (incluyendo autoantígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Markset al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffithet al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Véanse también las patentes estadounidenses n.<os>5.565.332 y 5.573.905.

[0224] Tal como se comentó anteriormente, los anticuerpos humanos también pueden generarse por células B activadasin vitro(véanse las patentes estadounidenses n.<os>5.567.610 y 5.229.275).

[0225] Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo bibliotecas de presentación en fago. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Markset al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Las técnicas de Coleet al.y Boerneret al.también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos. Coleet al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág.77 (1985) y Boerneret al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991).

[0226] Anticuerpos multiespecíficos

[0227] Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión por dos o más antígenos diferentes (por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos). Por ejemplo, una de las especificidades de unión puede ser por la proteína a5~1, y la otra puede ser por cualquier otro antígeno. Preferiblemente, el otro antígeno puede ser una proteína o un receptor o una subunidad de receptor de superficie celular. Por ejemplo, la proteína de superficie celular puede ser un receptor de células citolíticas naturales (NK). Por tanto, un anticuerpo biespecífico descrito en el presente documento puede unirse tanto a PD-1 como a, por ejemplo, un segundo receptor de superficie celular.

[0228] En la técnica se conocen bien métodos adecuados para preparar anticuerpos biespecíficos. Por ejemplo, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la expresión conjunta de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes. Milstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983). Debido a la selección aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se logra habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se dan a conocer procedimientos similares en el documento WO 93/08829 y en Trauneckeret al., EMBO, 10: 3655-3659 (1991).

[0229] Pueden fusionarse dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, C<H>2, y C<H>3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (C<H>1) que contiene el sitio necesario para la unión de cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Se insertan ADN que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, en vectores de expresión independientes, y se transfectan conjuntamente en un organismo huésped adecuado. Para más detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Sureshet al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

[0230] También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir del cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucinas. Kostelnyet al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucinas a partir de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab’ de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y luego volvieron a oxidarse para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de “diacuerpo” descrita por Hollingeret al., PNAS USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un V<H>conectado a un V<L>por un ligador que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, se fuerza a los dominios V<H>y V<L>de un fragmento a emparejarse con los dominios V<L>y V<H>complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha notificado otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv). Véase Gruberet al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

[0231] Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tuttet al. J. Immunol.147: 60 (1991).

[0232] Anticuerpos heteroconjugados

[0233] Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos de manera covalente. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (patente estadounidense n.º 4.676.980), y para el tratamiento de infección por VIH. Documentos WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089. Se contempla que los anticuerpos pueden prepararsein vitrousando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los dados a conocer, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º 4.676.980.

[0234] Modificación por ingeniería de la función efectora

[0235] Puede ser deseable modificar el anticuerpo descrito en el presente documento con respecto a la función efectora, para potenciar, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento de cáncer. Por ejemplo, puede(n) introducirse un(os) residuo(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo de ese modo la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una destrucción celular mediada por el complemento y una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) aumentadas. Véanse Caronet al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shapes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada también pueden prepararse usando agentes de reticulación heterobifuncionales tal como se describe en Wolffet al., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede modificarse por ingeniería para que tenga regiones Fc duales y pueda tener de ese modo capacidades de ADCC y lisis por el complemento potenciadas. Véase Stevensonet al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230(1989). Pueden realizarse mutaciones o alteraciones en las secuencias de región Fc para mejorar la unión a FcR (por ejemplo, FcγR, FcRn). Un anticuerpo descrito en el presente documento puede tener al menos una función efectora alterada seleccionada del grupo que consiste en ADCC, CDC, y unión a FcRn mejorada en comparación con una IgG nativa o un anticuerpo parental. Se describen ejemplos de varias mutaciones específicas útiles en, por ejemplo, Shields, RLet al. (2001) JBC 276(6):6591-6604; Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487-490; y el documento WO 00/42072.

[0236] La mutación de receptor de Fc puede ser una sustitución de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ó 439 de la región Fc, en la que la numeración de los residuos en la región Fc es según el sistema de numeración EU. La mutación de receptor de Fc puede ser una sustitución D265A. La mutación de receptor de Fc puede ser una sustitución N297A. Se exponen mutaciones adecuadas adicionales en la patente estadounidense n.º 7.332.581.

[0237] Inmunoconjugados

[0238] La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterápico, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal, o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

[0239] Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A diftérica, fragmentos activos de no unión de toxina diftérica, cadena A de exotoxina (dePseudomonas aeruginosa),cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii, proteínas diantinas, proteínas dePhytolaca americana(PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor deMomordica charantia, curcina, crotina, inhibidor deSapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Están disponibles una variedad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen<212>Bi,<131>I,<131>In,<90>Y, y<186>Re. Los agentes quimioterápicos a modo de ejemplo útiles en la generación de tales inmunoconjugados incluyen los descritos en otra parte en el presente documento.

[0240] Un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede conjugarse con maitansina, un maitansinoide, o caliqueamicina. Un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede conjugarse con el maitansinoide DM1.

[0241] Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tal como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de bis-flúor activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitettaet al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación de radionucleótidos con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026.

[0242] El anticuerpo puede conjugarse con un “receptor” (tal como estreptavidina) para su utilización en el direccionamiento previo al tumor, en el que el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido a partir de la circulación usando un agente de aclaramiento y luego la administración de un “ligando” (por ejemplo, avidina) que está conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido).

[0243] Modificaciones covalentes

[0244] Las modificaciones covalentes de los anticuerpos anti-PD-1 se incluyen dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos de aminoácido seleccionados como diana de un polipéptido con un agente de derivatización orgánico que puede reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N-terminales o C-terminales del polipéptido. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular el polipéptido a una superficie o matriz de soporte insoluble en agua para su uso en el método para purificar anticuerpos, y viceversa. Los agentes de reticulación usados comúnmente incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como propionato de 3,3’-ditiobis(succinimidilo), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como 3-[(p-azidofenil)-ditio]propioimidato de metilo.

[0245] Otras modificaciones incluyen desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo para dar los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos α-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86 (1983)), acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

[0246] Otro tipo de modificación covalente del polipéptido comprende la unión del polipéptido a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes estadounidenses n.<os>4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; ó 4.179.337.

[0247] Moléculas quiméricas

[0248] Un anticuerpo anti-PD-1 de la presente invención para su uso tal como se define por las reivindicaciones también puede modificarse si es ventajoso de una manera para formar una molécula quimérica que comprende el polipéptido fusionado con otra secuencia de aminoácidos o polipeptídica heteróloga (por ejemplo, inmunoadhesinas o pepticuerpos).

[0249] Una molécula quimérica de este tipo puede comprender una fusión del polipéptido con un dominio de transducción de proteína que selecciona como diana el polipéptido para su administración a diversos tejidos y más particularmente a través de la barrera hematoencefálica, usando, por ejemplo, el dominio de transducción de proteína de la proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia humana (Schwarzeet al., 1999, Science 285: 1569-72).

[0250] Una molécula quimérica de este tipo puede comprender una fusión del polipéptido con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta con epítopo se coloca generalmente en el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal del polipéptido. La presencia de tales formas etiquetadas con epítopo del polipéptido puede detectarse usando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la provisión de la etiqueta con epítopo permite que el polipéptido se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad usando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se une a la etiqueta con epítopo. En la técnica se conocen diversos polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos. Los ejemplos incluyen etiquetas de poli-histidina (poli-His) o poli-histidina-glicina (poli-His-Gly); el polipéptido etiqueta HA del virus de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Fieldet al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 contra la misma (Evanet al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la etiqueta glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple y su anticuerpo (Paborskyet al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag (Hoppet al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido con epítopo de KT3 (Martinet al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido con epítopo de α-tubulina (Skinneret al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y la etiqueta proteica con epítopo del gen 10 de T7 (Lutz-Freyermuthet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)).

[0251] Alternativamente, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (por ejemplo, una “inmunoadhesina”), una fusión de este tipo puede ser con la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig descritas en el presente documento incluyen polipéptidos que comprenden aproximadamente o sólo los residuos 94-243, los residuos 33-53 o los residuos 33-52 de ser humano en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. De manera particularmente preferida, la fusión con inmunoglobulina puede incluir las regiones bisagra, C<H>2 y C<H>3, o bisagra, C<H>1, C<H>2 y C<H>3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones con inmunoglobulina, véase también la patente estadounidense n.º 5.428.130 concedida el 27 de junio de 1995.

[0252] Inmunoliposomas

[0254] Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epsteinet al., PNAS USA, 82: 3688 (1985); Hwanget al., PNAS USA, 77: 4030 (1980); y las patentes estadounidenses n.<os>4.485.045 y 4.544.545. Se dan a conocer liposomas con tiempo de circulación aumentado en la patente estadounidense n.º 5.013.556.

[0256] Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab’ del anticuerpo pueden conjugarse con los liposomas tal como se describe en Martinet al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Dentro del liposoma también está contenido opcionalmente un agente antineoplásico, un agente inhibidor del crecimiento, o un agente quimioterápico (tal como doxorrubicina). Véase Gabizonet al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989).

[0258] Tratamiento usando anticuerpos anti-PD-1

[0260] Los anticuerpos anti-PD-1 y/o las composiciones descritos en el presente documento pueden administrarse a sujetos (por ejemplo, mamíferos tales como seres humanos) para tratar enfermedades y trastornos que implican una actividad de PD-1 anómala, incluyendo, por ejemplo, cáncer (tal como cáncer de cabeza y cuello, cáncer de garganta, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, etc.). La invención proporciona anticuerpos anti-PD-1 tal como se definen en las reivindicaciones para su uso en el tratamiento de cáncer tal como se define en las reivindicaciones (tal como melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo, TNBC), cáncer gástrico, linfoma de Hodgkin clásico (cHL), linfoma no Hodgkin-linfoma de células B mediastínico primario (NHL-PMBCL), mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de esófago, carcinoma de nasofaringe (NPC), cáncer de vías biliares, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides) en un sujeto.

[0261] En el presente documento también se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento para su uso en el tratamiento de cáncer (melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo, TNBC), cáncer gástrico, linfoma de Hodgkin clásico (cHL), linfoma no Hodgkin-linfoma de células B mediastínico primario (NHL-PMBCL), mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de esófago, carcinoma de nasofaringe (NPC), cáncer de vías biliares, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides) en un sujeto. El sujeto que va a tratarse puede ser un mamífero (por ejemplo, ser humano, primate no humano, rata, ratón, vaca, caballo, cerdo, oveja, cabra, perro, gato, etc.). El sujeto puede ser un ser humano. El sujeto puede ser un paciente clínico, un voluntario de ensayo clínico, un animal de experimentación, etc. Puede sospecharse que el sujeto padece o tiene riesgo de padecer un cáncer (tal como melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo, TNBC), cáncer gástrico, linfoma de Hodgkin clásico (cHL), linfoma no Hodgkin-linfoma de células B mediastínico primario (NHL-PMBCL), mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de esófago, carcinoma de nasofaringe (NPC), cáncer de vías biliares, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides) o puede diagnosticársele un cáncer o cualquier otra enfermedad que tenga una expresión o actividad de PD-1 anómala.

[0262] En la técnica se conocen muchos métodos diagnósticos para el cáncer (tal como melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo, TNBC), cáncer gástrico, linfoma de Hodgkin clásico (cHL), linfoma no Hodgkin-linfoma de células B mediastínico primario (NHL-PMBCL), mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de esófago, carcinoma de nasofaringe (NPC), cáncer de vías biliares, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides) o cualquier otra enfermedad que presenta una actividad de PD-1 anómala y la delimitación clínica de esas enfermedades. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, inmunohistoquímica, PCR, hibridación fluorescentein situ(FISH). Se describen detalles adicionales sobre métodos diagnósticos para una expresión o actividad de PD-1 anómala en, por ejemplo, Guptaet al. (2009) Mod Pathol. 22(1): 128-133; López-Ríoset al. (2013) J Clin Pathol. 66(5): 381-385; Ellisonet al. (2013) J Clin Pathol 66(2): 79-89; y Guhaet al. (2013) PLoS ONE 8(6): e67782.

[0264] La administración puede ser por cualquier vía adecuada incluyendo, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, o subcutánea. Los anticuerpos anti-PD-1 y/o las composiciones descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con un segundo, tercer, o cuarto agente (incluyendo, por ejemplo, un agente antineoplásico, un agente inhibidor del crecimiento, un agente citotóxico, o un agente quimioterápico) para tratar las enfermedades o los trastornos que implican una actividad de PD-1 anómala. Tales agentes incluyen, por ejemplo, docetaxel, gefitinib, FOLFIRI (irinotecán, 5-fluorouracilo, y leucovorina), irinotecán, cisplatino, carboplatino, paclitaxel, bevacizumab (anticuerpo anti-VEGF), FOLFOX-4 (fluorouracilo, leucovorina, y oxaliplatino para infusión), afatinib, gemcitabina, capecitabina, pemetrexed, tivantinib, everólimus, CpG-ODN, rapamicina, lenalidomida, vemurafenib, endostatina, lapatinib, PX-866, Imprime PGG, e irlotinibm. Los anticuerpos anti-PD-1 pueden conjugarse con el agente adicional.

[0266] Los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con una o más terapias adicionales, tales como radioterapia, cirugía, quimioterapia, y/o terapia dirigida. Los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con radioterapia. La combinación de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento y radioterapia puede usarse para tratar un cáncer seleccionado del grupo que consiste en melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo, TNBC), cáncer gástrico, linfoma de Hodgkin clásico (cHL), linfoma no Hodgkin-linfoma de células B mediastínico primario (NHL-PMBCL), mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de esófago, carcinoma de nasofaringe (NPC), cáncer de vías biliares, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, y cáncer de tiroides.

[0268] Dependiendo de la indicación que va a tratarse y de factores relevantes para la dosificación con la que esté familiarizado un médico experto en el campo, los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el presente documento se administrarán a una dosificación que sea eficaz para el tratamiento de esa indicación mientras minimiza la toxicidad y los efectos secundarios. Para el tratamiento de un cáncer (tal como melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo, TNBC), cáncer gástrico, linfoma de Hodgkin clásico (cHL), linfoma no Hodgkin-linfoma de células B mediastínico primario (NHL-PMBCL), mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de esófago, carcinoma de nasofaringe (NPC), cáncer de vías biliares, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides), una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 1000 µg; sin embargo, dosis por debajo o por encima de este intervalo a modo de ejemplo están dentro del alcance de la invención. La dosis diaria puede ser de aproximadamente 0,1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal total (por ejemplo, aproximadamente 5 µg/kg, aproximadamente 10 µg/kg, aproximadamente 100 µg/kg, aproximadamente 500 µg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, o un intervalo definido por cualesquiera dos de los valores anteriores), preferiblemente desde aproximadamente 0,3 µg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal total (por ejemplo, aproximadamente 0,5 µg/kg, aproximadamente 1 µg/kg, aproximadamente 50 µg/kg, aproximadamente 150 µg/kg, aproximadamente 300 µg/kg, aproximadamente 750 µg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, o un intervalo definido por cualesquiera dos de los valores anteriores), más preferiblemente desde aproximadamente 1 µg/kg hasta 1 mg/kg de peso corporal total (por ejemplo, aproximadamente 3 µg/kg, aproximadamente 15 µg/kg, aproximadamente 75 µg/kg, aproximadamente 300 µg/kg, aproximadamente 900 µg/kg, o un intervalo definido por cualesquiera dos de los valores anteriores), e incluso más preferiblemente desde aproximadamente 0,5 hasta 10 mg/kg de peso corporal al día (por ejemplo, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, o un intervalo definido por cualesquiera dos de los valores anteriores, incluyendo cualquier intervalo entre los valores anteriormente). Tal como se indicó anteriormente, la eficacia terapéutica o profiláctica puede monitorizarse mediante la evaluación periódica de los pacientes tratados. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo del estado, el tratamiento se repite hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas y están dentro del alcance de la invención. La dosificación deseada puede administrarse mediante una única administración en bolo de la composición, mediante múltiples administraciones en bolo de la composición, o mediante administración por infusión continua de la composición.

[0269] Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-PD-1 puede administrarse una, dos, tres, o cuatro veces al día. Las composiciones también pueden administrarse con menos frecuencia que al día, por ejemplo, seis veces a la semana, cinco veces a la semana, cuatro veces a la semana, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, o una vez cada seis meses. Las composiciones también pueden administrarse en una formulación de liberación sostenida, tal como en un implante que libera gradualmente la composición para su uso a lo largo de un periodo de tiempo, y que permite que la composición se administre con menos frecuencia, tal como una vez al mes, una vez cada 2-6 meses, una vez cada año, o incluso como una administración única. Los dispositivos de liberación sostenida (tales como microgránulos, nanopartículas, micropartículas, nanoesferas, microesferas, y similares) pueden administrarse por inyección.

[0270] El anticuerpo puede administrarse en una dosis diaria única, o la dosis diaria total puede administrarse en dosificaciones divididas de dos, tres, o cuatro veces al día. Las composiciones también pueden administrarse con menos frecuencia que al día, por ejemplo, seis veces a la semana, cinco veces a la semana, cuatro veces a la semana, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, o una vez cada seis meses. El anticuerpo también puede administrarse en una formulación de liberación sostenida, tal como en un implante que libera gradualmente la composición para su uso a lo largo de un periodo de tiempo, y que permite que la composición se administre con menos frecuencia, tal como una vez al mes, una vez cada 2-6 meses, una vez cada año, o incluso como una administración única. Los dispositivos de liberación sostenida (tales como microgránulos, nanopartículas, micropartículas, nanoesferas, microesferas, y similares) pueden administrarse por inyección o implantarse quirúrgicamente en diversas ubicaciones.

[0272] Los tratamientos del cáncer pueden evaluarse mediante, por ejemplo, pero sin limitarse a, regresión tumoral, reducción de tamaño o peso tumoral, tiempo hasta la progresión, duración de supervivencia, supervivencia libre de progresión, tasa de respuesta global, duración de la respuesta, calidad de vida, expresión y/o actividad de proteínas. Pueden emplearse enfoques para determinar la eficacia de la terapia, incluyendo, por ejemplo, medición de la respuesta a través de obtención de imágenes radiológicas.

[0274] La eficacia del tratamiento puede medirse como porcentaje de inhibición de crecimiento tumoral (% de ICT), calculado usando la ecuación 100-(T/C x 100), donde T es el volumen tumoral relativo medio del tumor tratado, y C es el volumen tumoral relativo medio de un tumor no tratado. El % de ICT puede ser de aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, o más del 95 %. El % de ICT de un anticuerpo anti-PD-1 puede ser igual o superior al % de ICT de OPDIVO<®>, tal como aproximadamente 1,1 veces, aproximadamente 1,2 veces, aproximadamente 1,3 veces, aproximadamente 1,4 veces, aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 1,6 veces, aproximadamente 1,7 veces, aproximadamente 1,8 veces, aproximadamente 1,9 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 2,1 veces, aproximadamente 2,2 veces, aproximadamente 2,3 veces, aproximadamente 2,4 veces, aproximadamente 2,5 veces, aproximadamente 2,6 veces, aproximadamente 2,7 veces, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores, o más de aproximadamente 2,7 veces mayor que el % de ICT de OPDIVO<®>.

[0276] Formulaciones farmacéuticas

[0278] Los anticuerpos anti-PD-1 pueden formularse con portadores o excipientes adecuados de manera que sean adecuados para su administración. Se obtienen formulaciones adecuadas de los anticuerpos mezclando un anticuerpo (o fragmento del mismo) que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptable opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los portadores, excipientes, o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol; alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metilparabeno o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa, o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN<™>, PLURONICS<™>o polietilenglicol (PEG). Se describen formulaciones de anticuerpos a modo de ejemplo en el documento WO98/56418. Se describen formulaciones liofilizadas adaptadas para administración subcutánea en el documento WO97/04801. Tales formulaciones liofilizadas pueden reconstituirse con un diluyente adecuado hasta una alta concentración de proteína y la formulación reconstituida puede administrarse por vía subcutánea al mamífero que va a tratarse en el presente documento.

[0280] La formulación en el presente documento también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que esté tratándose, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten de manera adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente un agente antineoplásico, un agente inhibidor del crecimiento, un agente citotóxico, o un agente quimioterápico. Tales moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento, y de otros factores comentados anteriormente. Estos se usan generalmente en las mismas dosificaciones y con vías de administración tal como se describen en el presente documento o aproximadamente desde el 1 hasta el 99 % de las dosificaciones empleadas hasta ahora. Los principios activos también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se dan a conocer en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. 1980). Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el antagonista, estando las matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente estadounidense n.º 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT<™>(microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

[0282] Pueden usarse lipofectinas o liposomas para administrar los polipéptidos y anticuerpos (o fragmentos de los mismos) o las composiciones de esta invención a las células. Cuando se usan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas peptídicas que conservan la capacidad para unirse a la secuencia de proteína diana. Tales péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Véase, por ejemplo, Marascoet al., PNAS USA, 90: 7889-7893 (1993).

[0284] Los principios activos también pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de gelatina o hidroximetilcelulosa y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se dan a conocer en Remington’s PHARMACEUTICAL SCIENCES, citado anteriormente.

[0286] Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo (o fragmento del mismo), estando las matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente estadounidense n.º 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT<™>(microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares mediante intercambio de tiodisulfuro, la estabilización puede conseguirse modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de disoluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

[0288] La formulación puede comprender un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento a una concentración mayor de aproximadamente 0,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 1 mg/ml, mayor de aproximadamente 2 mg/ml, mayor de aproximadamente 3 mg/ml, mayor de aproximadamente 4 mg/ml, mayor de aproximadamente 5 mg/ml, mayor de aproximadamente 6 mg/ml, mayor de aproximadamente 7 mg/ml, mayor de aproximadamente 8 mg/ml, mayor de aproximadamente 9 mg/ml, mayor de aproximadamente 10 mg/ml, mayor de aproximadamente 11 mg/ml, mayor de aproximadamente 12 mg/ml, mayor de aproximadamente 13 mg/ml, mayor de aproximadamente 14 mg/ml, mayor de aproximadamente 15 mg/ml, mayor de aproximadamente 16 mg/ml, mayor de aproximadamente 17 mg/ml, mayor de aproximadamente 18 mg/ml, mayor de aproximadamente 19 mg/ml, mayor de aproximadamente 20 mg/ml, mayor de aproximadamente 21 mg/ml, mayor de aproximadamente 22 mg/ml, mayor de aproximadamente 23 mg/ml, mayor de aproximadamente 24 mg/ml, mayor de aproximadamente 25 mg/ml, mayor de aproximadamente 26 mg/ml, mayor de aproximadamente 27 mg/ml, mayor de aproximadamente 28 mg/ml, mayor de aproximadamente 29 mg/ml, o mayor de aproximadamente 30 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.

[0290] El anticuerpo anti-PD-1 puede formularse (por ejemplo, a una concentración mayor de aproximadamente 0,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 1 mg/ml, mayor de aproximadamente 5 mg/ml, mayor de aproximadamente 10 mg/ml, mayor de aproximadamente 15 mg/ml, mayor de aproximadamente 20 mg/ml, o mayor de aproximadamente 25 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) en un tampón que comprende citrato, NaCl, acetato, succinato, glicina, polisorbato 80 (Tween 80), o cualquier combinación de los anteriores. El anticuerpo anti-PD-1 puede formularse (por ejemplo, a una concentración mayor de aproximadamente 0,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 1 mg/ml, mayor de aproximadamente 5 mg/ml, mayor de aproximadamente 10 mg/ml, mayor de aproximadamente 15 mg/ml, mayor de aproximadamente 20 mg/ml, o mayor de aproximadamente 25 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) en un tampón que comprende de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 150 mM de glicina. El anticuerpo anti-PD-1 puede formularse en un tampón que comprende de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM de NaCl. El anticuerpo anti-PD-1 puede formularse (por ejemplo, a una concentración mayor de aproximadamente 0,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 1 mg/ml, mayor de aproximadamente 5 mg/ml, mayor de aproximadamente 10 mg/ml, mayor de aproximadamente 15 mg/ml, mayor de aproximadamente 20 mg/ml, o mayor de aproximadamente 25 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) en un tampón que comprende de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM de acetato. El anticuerpo anti-PD-1 puede formularse en un tampón que comprende de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM de succinato. El anticuerpo anti-PD-1 puede formularse (por ejemplo, a una concentración mayor de aproximadamente 0,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 1 mg/ml, mayor de aproximadamente 5 mg/ml, mayor de aproximadamente 10 mg/ml, mayor de aproximadamente 15 mg/ml, mayor de aproximadamente 20 mg/ml, o mayor de aproximadamente 25 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) en un tampón que comprende de aproximadamente el 0,005 % a aproximadamente el 0,02 % de polisorbato 80. El anticuerpo anti-PD-1 puede formularse en un tampón que tiene un pH de entre aproximadamente 5,1 y 5,6. El anticuerpo anti-PD-1 puede formularse en un tampón que comprende 10 mM de citrato, 100 mM de NaCl, 100 mM de glicina, y el 0,01 % de polisorbato 80, en el que la formulación es a pH=5,5.

[0292] Una formulación (tal como una formulación que comprende un tampón que comprende 10 mM de citrato, 100 mM de NaCl, 100 mM de glicina, y el 0,01 % de polisorbato 80, en el que la formulación es a pH=5,5) que comprende un anticuerpo contra PD-1 descrito en el presente documento (por ejemplo, a una concentración mayor de aproximadamente 0,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 1 mg/ml, mayor de aproximadamente 5 mg/ml, mayor de aproximadamente 10 mg/ml, mayor de aproximadamente 15 mg/ml, mayor de aproximadamente 20 mg/ml, o mayor de aproximadamente 25 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) puede ser estable a temperatura ambiente (tal como a aproximadamente 20-25 ºC) durante aproximadamente 0,5 semanas, 1,0 semana, 1,5 semanas, 2,0 semanas, 2,5 semanas, 3,5 semanas, 4,0 semanas, 4,5 semanas, o 5,0 semanas, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. Una formulación (tal como una formulación que comprende un tampón que comprende 10 mM de citrato, 100 mM de NaCl, 100 mM de glicina, y el 0,01 % de polisorbato 80, en el que la formulación es a pH=5,5) que comprende un anticuerpo contra PD-1 descrito en el presente documento (por ejemplo, a una concentración mayor de aproximadamente 0,5 mg/ml, mayor de aproximadamente 1 mg/ml, mayor de aproximadamente 5 mg/ml, mayor de aproximadamente 10 mg/ml, mayor de aproximadamente 15 mg/ml, mayor de aproximadamente 20 mg/ml, o mayor de aproximadamente 25 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) puede ser estable en condiciones aceleradas (tales como almacenamiento a aproximadamente 37 ºC) durante aproximadamente 0,5 semanas, 1,0 semana, 1,5 semanas, 2,0 semanas, 2,5 semanas, 3,5 semanas, 4,0 semanas, 4,5 semanas, o 5,0 semanas, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.

[0294] La cromatografía de exclusión molecular (SEC) es un método bien conocido y ampliamente usado que se usa en estudios de estabilidad de proteínas para detectar la fragmentación y la agregación potenciales, correspondientes a instabilidades físicas y químicas. Una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede mostrar un aumento de menos de aproximadamente el 1,6 %, el 1,4 %, el 1,2 %, el 1,0 %, el 0,8 %, el 0,6 %, el 0,4 %, el 0,2 %, o el 0,1 % de especies de alto peso molecular (HMWS) después de 1 semana a 37 ºC, con respecto al % inicial de especies de alto peso molecular, tal como se mide usando SEC, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. Una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede mostrar un aumento de menos de aproximadamente el 2,0 %, el 1,8 %, el 1,6 %, el 1,4 %, el 1,2 %, el 1,0 %, el 0,8 %, el 0,6 %, el 0,4 %, el 0,2 %, o el 0,1 % de especies de alto peso molecular después de 2 semanas a 37 ºC, con respecto al % inicial de especies de alto peso molecular, tal como se mide usando SEC, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. Una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-EFGR descrito en el presente documento puede mostrar un aumento de menos de aproximadamente el 3,3 %, el 3,2 %, el 3,1 %, el 3,0 %, el 2,9 %, el 2,8 %, el 2,7 %, el 2,6 %, el 2,5 %, el 2,4 %, el 2,2 %, el 2,0 %, el 1,8 %, el 1,6 %, el 1,4 %, el 1,2 %, el 1,0 %, el 0,8 %, el 0,6 %, el 0,4 %, el 0,2 %, o el 0,1 % de especies de alto peso molecular después de 4 semanas a 37 ºC, con respecto al % inicial de especies de alto peso molecular, tal como se mide usando SEC, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.

[0296] Una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede mostrar un aumento de menos de aproximadamente el 1,6 %, el 1,4 %, el 1,2 %, el 1,0 %, el 0,8 %, el 0,6 %, el 0,4 %, el 0,2 %, o el 0,1 % de especies de bajo peso molecular (LMWS) después de 1 semana a 37 ºC, con respecto al % inicial de especies de bajo peso molecular, tal como se mide usando SEC, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. Una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede mostrar un aumento de menos de aproximadamente el 2,0 %, el 1,8 %, el 1,6 %, el 1,4 %, el 1,2 %, el 1,0 %, el 0,8 %, el 0,6 %, el 0,4 %, el 0,2 %, o el 0,1 % de especies de bajo peso molecular después de 2 semanas a 37 ºC, con respecto al % inicial de especies de bajo peso molecular, tal como se mide usando SEC, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. Una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede mostrar un aumento de menos de aproximadamente el 2,4 %, el 2,2 %, el 2,0 %, el 1,8 %, el 1,6 %, el 1,4 %, el 1,2 %, el 1,0 %, el 0,8 %, el 0,6 %, el 0,4 %, el 0,2 %, o el 0,1 % de especies de bajo peso molecular después de 4 semanas a 37 ºC, con respecto al % inicial de especies de bajo peso molecular, tal como se mide usando SEC, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.

[0298] Una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede mostrar una disminución de no más de aproximadamente el 0,2 %, el 0,4 %, el 0,6 %, el 0,8 %, el 0,9 %, el 1,0 %, el 1,1 %, el 1,2 %, el 1,3 %, el 1,4 %, el 1,6 %, el 1,7 %, el 1,8 %, el 1,9 %, el 2 %, el 2,1 %, el 2,2 %, el 2,3 %, el 2,4 %, el 2,5 %, el 2,6 %, el 2,7 %, el 2,8 %, el 2,9 %, el 3,0 %, el 3,1 %, el 3,2 %, el 3,3 %, el 3,4 %, o el 3,5 % de monómero después de 1 semana a 37 ºC, con respecto al % inicial de monómero, tal como se mide usando SEC, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. Una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede mostrar una disminución de no más de aproximadamente el 0,2 %, el 0,4 %, el 0,6 %, el 0,8 %, el 0,9 %, el 1,0 %, el 1,1 %, el 1,2 %, el 1,3 %, el 1,4 %, el 1,6 %, el 1,7 %, el 1,8 %, el 1,9 %, el 2,0 %, el 2,1 %, el 2,2 %, el 2,3 %, el 2,4 %, el 2,5 %, el 2,6 %, el 2,7 %, el 2,8 %, el 2,9 %, el 3,0 %, el 3,1 %, el 3,2 %, el 3,3 %, el 3,4 %, o el 3,5 % de monómero después de 2 semanas a 37 ºC, con respecto al % inicial de monómero, tal como se mide usando SEC, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. Una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-EFGR descrito en el presente documento puede mostrar una disminución de no más de aproximadamente el 0,2 %, el 0,4 %, el 0,6 %, el 0,8 %, el 0,9 %, el 1,0 %, el 1,1 %, el 1,2 %, el 1,3 %, el 1,4 %, el 1,6 %, el 1,7 %, el 1,8 %, el 1,9 %, el 2 %, el 2,1 %, el 2,2 %, el 2,3 %, el 2,4 %, el 2,5 %, el 2,6 %, el 2,7 %, el 2,8 %, el 2,9 %, el 3,0 %, el 3,1 %, el 3,2 %, el 3,3 %, el 3,4 %, o el 3,5 % de monómero después de 2 semanas a 37 ºC, con respecto al % inicial de monómero, tal como se mide usando SEC, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.

[0300] La cromatografía de intercambio catiónico (CEX) es una herramienta bien conocida y ampliamente usada para detectar eventos de degradación de proteínas tales como desamidación u oxidación (Moorhouseet al. (1997) J. Pharm. Biomed. Anal. 16, 593-603). Los productos de degradación se denominan normalmente especies ácidas o básicas en comparación con gnts con mayor pI aparente. Las especies ácidas son las variantes que eluyen antes que el pico principal de la CEX, mientras que las especies básicas son las variantes que eluyen después del pico principal de la CEX. La fracción de picos ácidos de una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede ser de no más de aproximadamente el 7 %, el 8 %, el 9 %, el 10 %, el 11 %, el 12 %, el 13 %, el 14 %, o el 15 % de la proteína total después de 1 semana a 37 ºC, tal como se mide usando CEX, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. La fracción de picos ácidos de una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede ser de no más de aproximadamente el 8 %, el 9 %, el 10 %, el 11 %, el 12 %, el 13 %, el 14 %, el 15 %, el 16 %, el 17 %, o el 18 % de la proteína total después de 2 semanas a 37 ºC, tal como se mide usando CEX, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. La fracción de picos ácidos de una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-EFGR descrito en el presente documento puede ser de no más de aproximadamente el 8 %, el 9 %, el 10 %, el 11 %, el 12 %, el 13 %, el 14 %, el 15 %, el 16 %, el 17 %, el 18 %, el 19 %, el 20 %, el 21 %, el 22 %, el 23 %, el 24 %, el 25 %, el 26 %, o el 27 % de la proteína total después de 2 semanas a 37 ºC, tal como se mide usando CEX, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.

[0302] La fracción de picos básicos de una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede ser de no más de aproximadamente el 39 %, el 40 %, el 41 %, el 42 %, el 43 %, el 44 %, el 45 %, o el 46 % de la proteína total después de 1 semana a 37 ºC, tal como se mide usando CEX, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. La fracción de picos básicos de una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede ser de no más de aproximadamente el 39 %, el 40 %, el 41 %, el 42 %, el 43 %, el 44 %, el 45 %, o el 46 % de la proteína total después de 2 semanas a 37 ºC, tal como se mide usando CEX, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. La fracción de picos básicos de una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede ser de no más de aproximadamente el 39 %, el 40 %, el 41 %, el 42 %, el 43 %, el 44 %, el 45 %, o el 46 % de la proteína total después de 4 semanas a 37 ºC, tal como se mide usando CEX, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.

[0304] La fracción de picos principales de una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede ser de no menos de aproximadamente el 32 %, el 33 %, el 34 %, el 35 %, el 36 %, el 37 %, el 38 %, el 39 %, el 40 %, el 41 %, el 42 %, el 43 %, el 44 %, el 45 %, o el 46 % de la proteína total después de 1 semana a 37 ºC, tal como se mide usando CEX, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. La fracción de picos básicos de una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede ser de no menos de aproximadamente el 32 %, el 33 %, el 34 %, el 35 %, el 36 %, el 37 %, el 38 %, el 39 %, el 40 %, el 41 %, el 42 %, el 43 %, el 44 %, el 45 %, o el 46 % de la proteína total después de 2 semanas a 37 ºC, tal como se mide usando CEX, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores. La fracción de picos básicos de una formulación que comprende 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, o 25 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento puede ser de no menos de aproximadamente el 32 %, el 33 %, el 34 %, el 35 %, el 36 %, el 37 %, el 38 %, el 39 %, el 40 %, el 41 %, el 42 %, el 43 %, el 44 %, el 45 %, o el 46 % de la proteína total después de 4 semanas at 37 ºC, tal como se mide usando CEX, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.

[0305] Las formulaciones que van a usarse para la administraciónin vivodeben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración estériles.

[0306] Métodos de diagnóstico y obtención de imágenes usando anticuerpos anti-PD-1

[0307] Pueden usarse anticuerpos anti-PD-1 marcados, fragmentos de los mismos, y derivados y análogos de los mismos, que se unen específicamente a un polipéptido de PD-1, con propósitos diagnósticos para detectar, diagnosticar, o monitorizar enfermedades y/o trastornos asociados con la expresión, expresión aberrante y/o actividad de PD-1. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el presente documento pueden usarse en ensayos de obtención de imágenes y ensayos diagnósticosin situ, in vivo, ex vivo,ein vitro. Los métodos para detectar la expresión de un polipéptido de PD-1 comprenden (a) someter a ensayo la expresión del polipéptido en células (por ejemplo, tejido) o líquido corporal de un individuo usando uno o más anticuerpos de esta invención y (b) comparar el nivel de expresión génica con un nivel de expresión génica de referencia, mediante lo cual un aumento o una disminución del nivel de expresión génica sometido a ensayo en comparación con el nivel de expresión de referencia es indicativo de expresión aberrante.

[0308] En el presente documento también se describe un método para diagnosticar una enfermedad o un trastorno asociado con la expresión o expresión aberrante de PD-1 en un animal (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano). Los métodos comprenden detectar moléculas de PD-1 en el mamífero. El diagnóstico puede comprender: (a) administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 marcado a un mamífero; (b) esperar un intervalo de tiempo tras la administración para permitir que el anticuerpo anti-PD-1 marcado se concentre preferentemente en sitios en el sujeto donde se expresa la molécula de PD-1 (y para que la molécula marcada no unida se aclare hasta el nivel de fondo); (c) determinar el nivel de fondo; y (d) detectar la molécula marcada en el sujeto, de manera que la detección de molécula marcada por encima del nivel de fondo indica que el sujeto padece una enfermedad o un trastorno particular asociado con la expresión o expresión aberrante de PD-1. El nivel de fondo puede determinarse mediante diversos métodos, incluyendo comparar la cantidad de molécula marcada detectada con un valor de referencia previamente determinado para un sistema particular.

[0309] Los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el presente documento pueden usarse para someter a ensayo los niveles de proteína en una muestra biológica usando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, Jalkanen,et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen,et al., J. Cell. Biol.

[0310] 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica de proteínas incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). En la técnica se conocen marcadores de ensayo de anticuerpos adecuados e incluyen marcadores enzimáticos, tales como glucosa oxidasa; radioisótopos, tales como yodo (<131>I,<125>I,<123>I,<121>I), carbono (<14>C), azufre (<35>S), tritio (<3>H), indio (<115m>In,<113m>In,<112>In,<111>In), y tecnecio (<99>Tc,<99m>Tc), talio (<201>Tl), galio (<68>Ga,<67>Ga), paladio (<103>Pd) molibdeno (<99>Mo), xenón (<133>Xe), flúor (<18>F),<153>Sm,<177>Lu,<159>Gd,<149>Pm,<140>La,<175>Yb,<166>Ho,<90>Y,<47>Sc,<186>Re,<188>Re,<142>Pr,<105>Rh,<97>Ru; luminol; y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.

[0311] Pueden aplicarse técnicas conocidas en la técnica a los anticuerpos marcados descritos en el presente documento. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a, el uso de agentes de conjugación bifuncionales (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.<os>5.756.065; 5.714.631; 5.696.239; 5.652.361; 5.505.931; 5.489.425; 5.435.990; 5.428.139; 5.342.604; 5.274.119; 4.994.560; y 5.808.003).

[0312] Alternativamente, o adicionalmente, pueden medirse los niveles de un ácido nucleico o ARNm que codifica para el polipéptido de PD-1 en la célula, por ejemplo, mediante hibridación fluorescentein situusando una sonda basada en ácido nucleico correspondiente a un ácido nucleico que codifica para PD-1 o el complemento del mismo; (FISH; véase el documento WO98/45479 publicado en octubre de 1998), técnicas de transferencia de tipo Southern, transferencia de tipo Northern, o reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tales como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR). También puede estudiarse la sobreexpresión de PD-1 midiendo el antígeno desprendido en un líquido biológico tal como suero, por ejemplo, usando ensayos basados en anticuerpos (véanse también, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.933.294 concedida el 12 de junio de 1990; el documento WO91/05264 publicado el 18 de abril de 1991; la patente estadounidense 5.401.638 concedida el 28 de marzo de 1995; y Siaset al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Aparte de los ensayos anteriores, están disponibles diversos ensayosin vivoyex vivopara el experto. Por ejemplo, pueden exponerse células dentro del cuerpo del mamífero a un anticuerpo que está opcionalmente marcado con un marcador detectable, por ejemplo, un isótopo radiactivo, y puede evaluarse la unión del anticuerpo a las células, por ejemplo, mediante exploración externa en busca de radiactividad o mediante análisis de una muestra (por ejemplo, una biopsia u otra muestra biológica) tomada de un mamífero previamente expuesto al anticuerpo. Artículos de fabricación y kits

[0313] En el presente documento también se describe un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de cáncer, tal como melanoma, NSCLC, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo, TNBC), cáncer gástrico, linfoma de Hodgkin clásico (cHL), linfoma no Hodgkin-linfoma de células B mediastínico primario (NHL-PMBCL), mesotelioma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células pequeñas), cáncer de esófago, carcinoma de nasofaringe (NPC), cáncer de vías biliares, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, y cáncer de glándulas salivales. El artículo de fabricación puede comprender un recipiente y un rótulo o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. Generalmente, el recipiente alberga una composición que es eficaz para tratar la afección y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón que puede perforarse mediante una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento del mismo) descrito en el presente documento. El rótulo o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección particular. El rótulo o prospecto del envase comprenderá adicionalmente instrucciones para administrar la composición de anticuerpo al paciente. También se contemplan artículos de fabricación y kits que comprenden las terapias combinatorias descritas en el presente documento.

[0314] El prospecto del envase se refiere a instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, el uso, la dosificación, la administración, las contraindicaciones y/o las advertencias referentes al uso de tales productos terapéuticos. El prospecto del envase puede indicar que la composición se usa para tratar el cáncer (tal como cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, o cáncer colorrectal).

[0315] Adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas.

[0316] También se describen kits que son útiles para diversos propósitos, por ejemplo, para el aislamiento o la detección de PD-1 en pacientes, opcionalmente en combinación con los artículos de fabricación. Para el aislamiento y la purificación de PD-1, el kit puede contener un anticuerpo anti-PD-1 (o fragmento del mismo) descrito en el presente documento acoplado a perlas (por ejemplo, perlas SEPHAROSE<™>). Los kits pueden contener los anticuerpos para la detección y la cuantificación de PD-1in vitro,por ejemplo, en un ELISA o una inmunotransferencia de tipo Western. Al igual que con el artículo de fabricación, el kit comprende un recipiente y un rótulo o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Por ejemplo, el recipiente alberga una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-PD-1 descrito en el presente documento. Pueden incluirse recipientes adicionales que contienen, por ejemplo, diluyentes y tampones, anticuerpos de control. El rótulo o prospecto del envase puede proporcionar una descripción de la composición, así como instrucciones para el uso diagnóstico oin vitroprevisto.

[0317] Ejemplos

[0318] EJEMPLO 1

[0319] Desarrollo de anticuerpos anti-PD-1

[0320] El desarrollo de anticuerpos anti-PD-1 se resume tal como sigue. Se identificaron clones de anticuerpo anti-PD-1 positivos mediante el cribado de una biblioteca de fagos de Fab generada a partir de hibridomas construidos a partir de PD-1 (ratones inmunizados con antígeno PD-1_ECD etiquetado con 6xHis recombinante purificado). Se realizaron ensayos funcionalesin vitro, descritos con mayor detalle a continuación, para caracterizar los clones. Brevemente, se incubaron diluciones en serie de clones de hibridoma con placas recubiertas de proteína PD-1-His durante una hora a temperatura ambiente, y se monitorizó la actividad de unión a PD-1 a 450 nm. Se bloquearon las placas con leche al 5 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron con PBS-Tween 20 (PBST) antes de la adición de diluciones de hibridoma. Después de la incubación con clones de hibridoma, se lavaron las placas con PBST, se incubaron con anticuerpo anti-IgG de ratón-HRP 1:4000 a temperatura ambiente durante 1 hora, se lavaron con PBST, se desarrollaron con tetrametilbencidina (TMB), y finalmente se usó H<2>SO<4>para detener la reacción, y se midió la absorbancia a 450 nm.

[0321] La citometría de flujo mostró que los clones con números de ID 11, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 27, y 28 pudieron unirse a PD-1. Las condiciones de citometría de flujo para evaluar la unión a PD-1 incluyen las etapas de: 1) lavar 4E+05 células CHO-S que expresan PD-1 con PBS (FBS al 2 %) dos veces; 2) añadir el sobrenadante de hibridoma, incubar a 4 ºC durante 30 min; 3) centrifugar las células durante 5 min a 500 x g; 4) lavar con PBS (FBS al 2 %) dos veces; 5) añadir anticuerpo de cabra anti-IgG humana-FITC diluido 1:150, incubar a 4 ºC durante 30 min; 6) lavar las células con PBS (FBS al 2 %) dos veces; y 7) suspender las células en 50 µl de 1x PBS, analizar mediante citometría de flujo.

[0322] Se usó citometría de flujo para evaluar la capacidad de los sobrenadantes de hibridoma para bloquear la unión entre PD-L1 y PD-1. Los resultados revelaron que el clon n.º 11 bloqueó la unión de manera equivalente al anticuerpo anti-PD-1 de referencia, por ejemplo, nivolumab. El ensayo de unión por citometría de flujo realizado incluye las etapas de: 1) lavar 4E+05 células por muestra con PBS (FBS al 2 %) dos veces; 2) mezclar 8 µg/ml de biotina-PDL1 y sobrenadante de hibridoma, siendo la razón en volumen de 1:1; 3) añadir los 60 µl de mezcla de la etapa 2 a células e incubar a 4 ºC durante 30 min; 4) lavar las células con PBS (FBS al 2 %) dos veces; 5) incubar las células con avidina-FITC (dilución 1:65) durante 30 min a 4 ºC; y 6) lavar las células con PBS (FBS al 2 %) dos veces.

[0323] Se identificó una colonia de PD-1 positiva (c1G4) en células competentes SS320. A continuación se proporcionan las características y secuencias del clon c1G4.

[0324] EJEMPLO 2

[0325] Generación del anticuerpo anti-PD-1 humanizado 1G4 (h1G4)

[0326] Se generó el anticuerpo anti-PD-1 humanizado 1G4 (h1G4) usando la región variable de cadena ligera de la línea germinal humana IGKV1-39*01 y la región variable de cadena pesada de la línea germinal humana IGHV3-11*04. Brevemente, se realizó la humanización injertando los residuos de CDR de la cadena ligera y cadena pesada de c1G4 quimérico en entramados de cadena ligera y cadena pesada similares de inmunoglobulina humana. Pueden generarse bibliotecas del anticuerpo humanizado injertado con CDR para la maduración por afinidad basada en presentación en fagoin vitropara potenciar la afinidad por su antígeno

[0327] La alineación de secuencias para c1G4 y h1G4 se muestra en las figuras 8A y 8B. La figura 8A muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras de c1G4 quimérico, h1G4 humanizado, región variable de cadena ligera de la línea germinal humana IGKV1-39*01, y nivolumab (NIV). La figura 8B muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de c1G4 quimérico, h1G4 humanizado, región variable de cadena pesada de la línea germinal humana IGHV3-11*04, y nivolumab (NIV). Las CDR (regiones determinantes de complementariedad) injertadas a partir de c1G4 para la humanización se marcaron con texto en negrita y subrayado.

[0328] EJEMPLO 3

[0329] Determinación de la constante de disociación en equilibrio (KD) de c1G4 y h1G4

[0330] Se midieron la cinética y afinidad de unión usando resonancia de plasmón superficial (SPR). En primer lugar, se inmovilizó anticuerpo anti-Fc de IgG humana sobre un chip sensor y luego se capturó el anticuerpo anti-PD-1 de referencia, c1G4, y h1G4 con una Rmáx de ~150 UR. Se llevaron a cabo los experimentos a 25 ºC, y se realizaron las mediciones con diluciones en serie de PD-1-His desde 58,8 nM hasta 7,35 nM pasando los anticuerpos capturados en tampón HBS-P+ complementado con BSA al 0,1 % (p/v). Todos los datos se analizaron con el software de evaluación y las curvas se ajustaron con un modelo de unión de Langmuir 1:1. Se midieron las cinéticas de asociación y disociación, junto con la afinidad calculada (KD), mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). En la siguiente tabla 4 también se mostró la mejora de la afinidad para c1G4 y h1G4 a diferencia del anticuerpo anti-PD-1 ref. Los datos son representativos de dos experimentos independientes realizados por duplicado.

[0331] Tabla 4

[0334]

[0336] EJEMPLO 4

[0337] Características de unión de anticuerpos quiméricos c1G4 y humanizados h1G4

[0338] Unión de c1G4 a proteína PD-1 recombinante

[0339] Se realizaron ensayos ELISA para evaluar la unión de c1G4 quimérico y el anticuerpo anti-PD-1 de referencia a PD-1. Se capturaron diluciones en serie de c1G4 quimérico y el anticuerpo anti-PD-1 de referencia con PD-1-His en pocillos de una placa de microtitulación. Se cuantificó la cantidad de anticuerpo capturado en cada pocillo usando un anticuerpo secundario anti-Fc de IgG humana conjugado con HRP. Se añadió el anticuerpo secundario conjugado con HRP a los pocillos, y, después de una incubación, se eliminó por lavado el exceso de anticuerpo secundario. Se añadió TMB a los pocillos, y, después de una incubación, se detuvo la reacción, y se midió la actividad de HRP monitorizando el aumento de absorbancia a 450 nm. Los resultados de ELISA realizados para comparar la unión de los anticuerpos anti-PD-1 quiméricos c1G4 y el anticuerpo anti-PD-1 de referencia a PD-1-His se muestran en la figura 1A.

[0340] La figura 1B muestra los resultados de un segundo conjunto de ELISA realizados para comparar la unión de los anticuerpos anti-PD-1 quiméricos c1G4 y el anticuerpo anti-PD-1 de referencia a PD-1-AP. Se capturaron diluciones en serie de c1G4 quimérico y el anticuerpo anti-PD-1 de referencia con anticuerpo anti-Fc de IgG humana en pocillos de una placa de microtitulación. Se cuantificó la cantidad de anticuerpo capturado en cada pocillo usando PD-1 conjugada con AP. Después de una incubación, se eliminó por lavado el exceso de PD-1-AP. Se añadió sustrato de fosfatasa alcalina a los pocillos, y, después de una incubación, se detuvo la reacción, y se midió la actividad de AP monitorizando el aumento de absorbancia a 405 nm.

[0341] Los resultados indican que c1G4 quimérico y el anticuerpo anti-PD-1 de referencia pueden unirse tanto a PD-1-His como a PD-1-AP.

[0342] Bloqueo y competición de la unión a ligando de PD-1 de c1G4

[0343] Se incubaron diluciones en serie de c1G4 quimérico y el anticuerpo anti-PD-1 de referencia con PD-L1-AP a TA durante 2 horas. Se añadió cada mezcla de anticuerpo:antígeno a pocillos recubiertos de PD-1-His de una placa de microtitulación. Después de una incubación y un lavado, se añadió pNPP a los pocillos y se incubó durante 1 hora para la detección de PD-L1-AP unido. Se midió la actividad de AP monitorizando el aumento de absorbancia a 405 nm. La figura 2A muestra los resultados de ELISA realizados para comparar la capacidad de los anticuerpos anti-PD-1 quiméricos c1G4 y el anticuerpo anti-PD-1 de referencia para bloquear la unión de PD-L1 y PD-1. Se halló que tanto c1G4 quimérico como el anticuerpo anti-PD-1 de referencia bloquearon la unión de PD-L1 a PD-1.

[0344] La figura 2B muestra los resultados de ELISA realizados para determinar la capacidad del anticuerpo anti-PD-1 quimérico c1G4 para competir con el anticuerpo anti-PD-1 de referencia por la unión a PD-1-His. Se mezclaron previamente diluciones en serie de c1G4 quimérico y el anticuerpo anti-PD-1 de referencia con una concentración fija de PD-1-His (0,1 µg/ml) a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se unieron a una concentración fija de la placa recubierta de anticuerpo anti-PD-1 de referencia (4 µg/ml). Se cuantificó la cantidad de PD-1-His unida en cada pocillo usando un anticuerpo secundario anti-His conjugado con HRP. Después de una incubación, se eliminó por lavado el exceso de anticuerpo secundario. Se añadió TMB a los pocillos, y, después de una incubación, se detuvo la reacción, y se midió la actividad de HRP monitorizando el aumento de absorbancia a 450 nm. Se añadió una concentración fija de PD-1-His (0,1 µg/ml) a una concentración fija de una placa recubierta de NIV (4 µg/ml) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se añadieron diluciones en serie de c1G4 quimérico y el anticuerpo anti-PD-1 de referencia a los pocillos. Después de una incubación y un lavado, se cuantificó la cantidad de PD-1-His unida en cada pocillo usando un anticuerpo secundario anti-His conjugado con HRP.

[0345] Estos datos indican que tanto c1G4 quimérico como el anticuerpo anti-PD-1 de referencia pueden bloquear la unión de PD-L1 a PD-1, y c1G4 quimérico puede competir con el anticuerpo anti-PD-1 ref por la unión a PD-1-His.

[0346] Unión de c1G4 y h1G4 a células CHO-S que expresan PD-1

[0347] Se desarrollaron y usaron líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) que expresan PD-1 humana recombinante en la superficie celular para determinar la especificidad de anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1 mediante citometría de flujo. Se transfectaron células CHO con plásmidos de expresión que contenían ADNc de longitud completa que codifica para formas transmembrana de PD-1. Se evaluó la unión de los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 c1G4 y h1G4 incubando las células transfectadas con los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 diluidos en serie en tampón FACS (PBS con FBS al 1 %). Se lavaron las células con tampón de flujo y se detectó la unión con estreptavidina-PE y un Ac de conejo anti-Fcγ de IgG humana marcado con biotina. Se realizaron análisis por citometría de flujo usando el dispositivo Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc.).

[0348] Las figuras 3A y 3B proporcionan la unión de anticuerpo c1G4 a células CHO-S (figura 3A) y células CHO-S transfectadas con PD-1 (figura 3B) mediante citometría de flujo. Se usaron anticuerpos anti-PD-1 y anti-PD-L1 de referencia como control positivo y control negativo, respectivamente. Los resultados indican que c1G4 se unió a las células CHO transfectadas con PD-1 pero no a las células CHO no transfectadas con PD-1 humana.

[0349] Las características de unión de anticuerpo c1G4 original y h1G4 humanizado a PD-1 sobre la superficie celular se muestran en la figura 9.

[0350] Bloqueo de unión de ligando a PD-1 por anticuerpos c1G4 y h1G4 seleccionados

[0351] Se sometieron a prueba los anticuerpos anti-PD-1 c1G4 y h1G4 para determinar la capacidad para bloquear la unión del ligando PD-L1 a células CHO-S que expresan PD-1 usando un ensayo de citometría de flujo. Se usaron los anticuerpos anti-PD-1 y anti-PD-L1 como control positivo y control negativo, respectivamente. Se suspendieron células CHO-S que expresan PD-1 en tampón FACS (PBS con FBS al 1 %). Se añadieron diversas concentraciones de los anticuerpos anti-PD-1 c1G4 y h1G4 y los anticuerpos anti-PD-1 y anti-PD-L1 de referencia a la suspensión celular y se incubaron a 4 ºC durante 30 minutos. Se eliminó por lavado el anticuerpo no unido y se añadió proteína de fusión PD-L1-Fc marcada con biotina y se incubó a 4 ºC durante 30 minutos. Se lavaron las células y luego se tiñeron con estreptavidina-PE a 4 ºC durante 30 minutos. Se realizaron análisis por citometría de flujo usando el dispositivo Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc.).

[0352] El anticuerpo monoclonal anti-PD-1 c1G4 bloqueó la unión de PD-L1 a células CHO-S transfectadas con PD-1, tal como se mide mediante la intensidad de fluorescencia media (IFM) de la tinción. Estos datos demuestran que tanto c1G4 como h1G4 bloquearon la unión de PD-L1 a células CHO-S transfectadas con PD-1, tal como se mide mediante la intensidad de fluorescencia media (IFM) de la tinción (figuras 4 y 10).

[0353] Unión de anticuerpo anti-PD-1 humanizado a células T humanas activadas

[0354] Se aislaron células T humanas a partir de PBMC usando el kit de enriquecimiento de células T humanas MagniSort<™>(eBioscience). Se activaron las células T aisladas mediante fitohemaglutinina (PHA) 5 µg/ml durante 3 días para estimular la expresión de PD-1. Se recogieron las células T activadas y se incubaron en tampón FACS (PBS con FBS al 2 %) con bloqueador de Fc humana (eBioscience) durante 20 minutos a 4 ºC.

[0355] Se evaluó la unión de anticuerpo monoclonal anti-PD-1 incubando las células T activadas con los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 diluido en serie en tampón FACS. Se lavaron las células con tampón de flujo y se detectó la unión con un Ac de conejo anti-Fcγ de IgG humana marcado con FITC. Se realizaron análisis por citometría de flujo usando el dispositivo Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc.). Se usaron anticuerpo anti-PD-1 de referencia y Avastin (anticuerpo anti-VEGF) como control positivo y control negativo, respectivamente. Los resultados de la unión de anticuerpo anti-PD-1 humanizado h1G4 a células T humanas activadas se muestran en la figura 12.

[0356] EJEMPLO 5

[0357] Efecto de anticuerpo anti-PD-1 c1G4 y h1G4 sobre la producción de citocinas en una reacción linfocitaria mixta (RLM)

[0358] Se empleó una reacción linfocitaria mixta para demostrar el efecto de bloqueo de la ruta de PD-1 para células efectoras linfocitarias. Se sometieron a prueba las células T en el ensayo para determinar la proliferación, la secreción de IFN-gamma y la secreción de IL-2 en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-PD-1.

[0359] Se purificaron células T humanas a partir de PBMC usando el reactivo Lympho-kwik T (One Lambda, Inc.). Se suspendieron células T aisladas en PBS y se marcaron con 1 µM de CFSE a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de lavar las células con el medio completo (RPMI-1640 con FBS al 10 %), se suspendieron células T marcadas con CFSE en el medio completo a la concentración de 1E6/células.

[0360] Se generaron células dendríticas alogénicas a partir de PBMC. Se incubaron las PBMC aisladas con 200 U/ml de IL-3 humana recombinante (eBioscience) durante la noche para permitir la unión de la población de monocitos/macrófagos a las placas. Se retiraron las células no adherentes y se lavaron las placas dos veces con el medio completo. Luego se cultivaron las células en las placas en el medio completo que contenía 200 U/ml de IL-4 humana (eBioscience) y 200 U/ml de GM-CSF humano (eBioscience) durante 6 días. Se hicieron madurar células dendríticas derivadas de monocitos mediante la adición de TNF-alfa (100 U/ml) al cultivo en el día 6 e incubación durante la noche. Se sometieron a tripsinización las DC maduradas, se recogieron, y se suspendieron en el medio completo a la concentración de 1E5/células.

[0361] Cada reacción contenía 10<5>células T marcadas con CFSE y 10<4>células dendríticas alogénicas en un volumen total de 200 µl. Se añadieron anticuerpos monoclonales anti-PD-1 c1G4 o h1G4 a cada cultivo a diferentes concentraciones de anticuerpo. O bien no se usó ningún anticuerpo o bien se usó un anticuerpo anti-VEGF (Avastin) como control negativo. Se usó un anticuerpo anti-PD-1 de referencia como control positivo. Se cultivaron las células durante 5 días a 37 ºC. Después del día 5, se tomaron 100 µl de medio a partir de cada cultivo para la medición de citocinas. Se midieron los niveles de citocinas usando kits MAX<™>Deluxe de ELISA para IFN-γ o IL-2 humana (BioLegend). Se recogieron las células y se analizaron para determinar la proliferación de células T mediante citometría de flujo.

[0362] La figura 5A ilustra la secreción de IL-2 dependiente de la concentración fomentada por el anticuerpo monoclonal c1G4 contra PD-1 humana, y la figura 5B ilustra la secreción de IFN-γ dependiente de la concentración por el anticuerpo monoclonal c1G4 contra PD-1 humana.

[0363] La figura 13A ilustra la secreción de IL-2 dependiente de la concentración fomentada por el anticuerpo monoclonal h1G4 contra PD-1 humana, y la figura 13B ilustra la secreción de IFN-γ dependiente de la concentración por el anticuerpo monoclonal h1G4 contra PD-1 humana.

[0364] El anticuerpo monoclonal c1G4 contra PD-1 humana fomenta la proliferación de células T CD4<+>y CD8<+>en un ensayo de reacción linfocitaria mixta. La figura 6A ilustra la proliferación de células T CD4<+>a diversas concentraciones de anticuerpos c1G4, y la figura 6B ilustra la proliferación de células T CD8<+>a diversas concentraciones de anticuerpos c1G4. La figura 14A ilustra la proliferación de células T CD4<+>a diversas concentraciones de anticuerpos h1G4, y la figura 14B ilustra la proliferación de células T CD8<+>a diversas concentraciones de anticuerpos h1G4.

[0365] En resumen, estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 c1G4 y h1G4 fomentan la proliferación de células T, la secreción de IFN-gamma y la secreción de IL-2. En cambio, los cultivos que contienen el anticuerpo de control negativo no mostraron ningún aumento de la proliferación de células T, la secreción de IFN-gamma o la secreción de IL-2.

[0366] EJEMPLO 6

[0367] Actividad de inhibición de crecimiento tumoral de los anticuerpos c1G4 y h1G4

[0368] Se investigó la actividadin vivode anticuerpos anti-PD-1 humana en modelos de ratón de xenoinjerto usando ratones NOD/SCID inmunodeprimidos (diabéticos no obesos/con inmunodeficiencia combinada grave). Se mezclaron células cancerosas y PBMC humanas aisladas inmediatamente antes de la administración subcutánea a la razón de células efectoras con respecto a diana (E:T) indicada. A cada ratón se le inocularon de manera bilateral las mezclas de células cancerosas y PBMC humanas. Se asignaron cuatro ratones a cada grupo experimental. Se administró por vía intraperitoneal la primera dosis del artículo de prueba 1 día después del injerto de células cancerosas/efectoras. Los ratones recibieron dosis del artículo de prueba dos veces a la semana durante 3-4 semanas. Se observó la formación de tumor en cada animal dos veces a la semana. Se midieron los tumores con un compás calibrador y se calcularon los volúmenes tumorales (V) usando la siguiente fórmula: V (mm<3>) = 0,5 × (longitud (mm) × anchura (mm) × anchura (mm)/2).

[0369] Las curvas de crecimiento tumoral con anticuerpos c1G4 o h1G4 en modelo de xenoinjerto HT29/PBMC se mostraron en las figuras 7A y 15A, respectivamente. El volumen tumoral individual en el día 28 con c1G4 o en el día 21 con h1G4 en modelo de xenoinjerto HT29/PBMC se presentaron en las figuras 7B y 15B, respectivamente. Además, las curvas de crecimiento tumoral con anticuerpo h1G4 en NCI-H292/PBMC se mostraron en la figura 16A. El volumen tumoral individual en el día 25 con anticuerpo h1G4 se presentó en la figura 16B. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM.

[0370] Además, también se estudió la terapia de combinación de anticuerpo monoclonal anti-PD-1 y anti-VEGF en modelo de xenoinjerto HT29/PBMC. Los datos que indican una inhibición tumoral potenciada con la combinación de anticuerpo anti-PD-1 y anti-VEGF se presentan en la figura 21.

[0371] EJEMPLO 7

[0372] Reactividad cruzada entre especies de h1G4

[0373] Se adquirieron proteínas de fusión de PD-1 de ser humano, rata, ratón, y macaco cangrejero recombinantes de Sino Biological Inc. Se inmovilizó PD-1/Fc (9 ng por pocillo) sobre una placa de ensayo de 96 pocillos mediante incubación durante la noche a 4 ºC. Se bloquearon los sitios de unión no específica usando leche desnatada al 5 % en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar las placas tres veces con PBST, se incubaron las concentraciones indicadas de h1G4, anticuerpo anti-PD-1 de referencia (control positivo), y HLX01 (control negativo) con las proteínas inmovilizadas durante una hora a temperatura ambiente. Se lavaron las placas tres veces con PBST y luego se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con anticuerpo de cabra anti-F(ab)’<2>de IgG humana marcado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories) diluido 1/10.000 en PBS. Después del lavado, se desarrollaron las placas usando TMB (eBioscience). Se leyó la absorbancia a la longitud de onda de 450 nm mediante un lector de microplacas Vmax (Molecular Devices). Las figuras 11A-11D muestran la reactividad cruzada entre especies de h1G4 con proteínas PD-1 humana (figura 11A), de macaco cangrejero (figura 11B), de ratón (figura 11C), y de rata (figura 11D).

[0374] EJEMPLO 8

[0375] Actividad de inhibición de crecimiento tumoral del anticuerpo h1G4

[0376] Actividad de inhibición de crecimiento tumoral del anticuerpo h1G4 en ratones hPD1 KI

[0377] Se investigó la actividadin vivode anticuerpos anti-PD-1 humana en ratones C57BL/6 con inserción génica de PD-1 humana (ratones hPD1 KI). A los ratones se les inocularon por vía subcutánea células de cáncer de colon de ratón transfectadas con PD-L1 humano (1E6 células por ratón). Los tratamientos con anticuerpos se iniciaron cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 75 mm<3>(día 9). Se asignaron cuatro animales a cada grupo experimental antes del tratamiento. Los animales recibieron dosis de anticuerpos anti-PD-1 dos veces a la semana durante 3-4 semanas. Se observó la formación de tumor en cada animal dos veces a la semana. Se midieron los tumores con un compás calibrador y se calcularon los volúmenes tumorales (V) usando la siguiente fórmula: V (mm<3>) = 0,5 × (longitud (mm) × anchura (mm) × anchura (mm)/2). La actividad de inhibición de crecimiento tumoral del anticuerpo h1G4 en ratones hPD1 KI se muestra en la figura 17.

[0378] Estudio de eficacia de h1G4 en un modelo de xenoinjerto de línea celular de cáncer de mama triple negativo (TNBC) en ratones NSG humanizados

[0379] A ratones NSG humanizados (NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ) se les inoculó por vía subcutánea MDA-MB-231 (línea celular de cáncer de mama triple negativo humano). Se aleatorizaron los ratones en 3 grupos (n=9/grupo) basándose en el volumen tumoral según la tabla cuando los volúmenes tumorales alcanzaron ~60-150 mm<3>. A los ratones se les dosificó por vía intraperitoneal h1G4 una vez cada 7 días en los días de estudio 0, 7, 14, 21, y 28. Se inyectó por vía intraperitoneal Keytruda (anticuerpo anti-PD-1) una vez cada 5 días en los días de estudio 0, 5, 10, 15, y 20. Se observó la formación de tumor en cada animal cada 3-4 días. Se midieron los tumores con un compás calibrador y se calcularon los volúmenes tumorales (V) usando la siguiente fórmula: V (mm<3>) = 0,5 × (longitud (mm) × anchura (mm) × anchura (mm)/2). La figura 18 ilustra el estudio de eficacia de h1G4 en un modelo de xenoinjerto de línea celular de cáncer de mama triple negativo (TNBC) en ratones NSG humanizados.

[0380] EJEMPLO 9

[0381] Determinación de la constante de disociación en equilibrio (KD) de los anticuerpos anti-PD-1 madurados por afinidad 33B, 66E, y 711D

[0382] Se usó el anticuerpo anti-PD-1 humanizado h1G4 en experimentos de maduración por afinidad basada en presentación en fagoin vitropara generar clones con rendimiento de unión mejorado. Se generaron bibliotecas de ácido nucleico tanto de CDR-L1/CDR-L3/CDR-H3 (centrándose en 3 CDR) como de CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 (centrándose en 6 CDR) de h1G4 mediante PCR, se clonaron en un vector de presentación en fago, y se transformaron en células TG1 o SS320 deE. colipara producir una biblioteca de fagos. Después de tres rondas de cribado con PD-1-His biotinilada acoplada a Dynabeads<®>M-280 magnéticas recubiertas de estreptavidina (Thermo Fisher Scientific n.º 11205D) para ambas bibliotecas, se seleccionaron tres clones de Fab, es decir, 33B, 66E y 711D, mediante ELISA. Se midieron características cinéticas adicionales mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) (véase el mismo método de SPR tal como se describió anteriormente para la figura 9) usando IgG de longitud completa de 33B, 66E y 711D y se halló que tenían un rendimiento de unión que era equivalente a o mejor que el anticuerpo anti-PD-1 de referencia.

[0383] La tabla 5 muestra una secuencia de aminoácidos de las CDR de 33B, 66E, y 711D seleccionadas a partir de la maduración por afinidad basada en presentación en fago en comparación con h1G4.

[0384] Tabla 5

[0387]

[0389] La tabla 6 muestra la cinética de asociación y disociación, junto con la afinidad (KD) calculada, de 33B, 66E, y 711D medidas mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). En la tabla 6 también se mostró la mejora de la afinidad de los anticuerpos anti-PD-1 a diferencia del anticuerpo anti-PD-1 de referencia. Los datos son representativos de dos experimentos independientes realizados por duplicado.

[0390] Tabla 6

[0393]

[0395] EJEMPLO 10

[0396] Funciones de los anticuerpos madurados por afinidad

[0397] Efecto de los anticuerpos anti-PD-1 humanos (33B, 66E y 711D) sobre la producción de citocinas en una reacción linfocitaria mixta (RLM)

[0398] Siguiendo el mismo método tal como se describió anteriormente, este estudio muestra que los anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1 humana, tales como 66E y 711D, fomentan la secreción de IFN-γ y la secreción de IL-2 en un ensayo de reacción linfocitaria mixta. Se usaron anticuerpo anti-PD-1 de referencia y Avastin (anticuerpo anti-VEGF) como control positivo y control negativo, respectivamente. La figura 19A ilustra la secreción de IL-2 dependiente de la concentración por los anticuerpos madurados por afinidad, y la figura 19B ilustra la secreción de IFN-γ dependiente de la concentración por los anticuerpos madurados por afinidad.

[0399] Actividad de inhibición de crecimiento tumoral de anticuerpos anti-PD-1 humanos en modelo de xenoinjerto HT29/PBMC

[0400] Siguiendo el mismo método tal como se describió anteriormente, a los ratones (n=4/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de línea celular de cáncer de colon humana HT29 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 3:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal anticuerpos anti-PD-1 a los ratones dos veces a la semana desde el día 1. El volumen tumoral se midió dos veces a la semana. La actividad de inhibición de crecimiento tumoral de anticuerpos anti-PD-1 madurados por afinidad humanos en modelo de xenoinjerto HT29/PBMC se muestra en la figura 20. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM.

[0401] EJEMPLO 11

[0402] Terapias de combinación de PD-1

[0403] Se investigó la actividadin vivode la terapia de combinación con anticuerpo anti-PD-1 y otros anticuerpos terapéuticos en modelos de ratón de xenoinjerto usando ratones NOD/SCID inmunodeprimidos (diabéticos no obesos/con inmunodeficiencia combinada grave). Se mezclaron células cancerosas y PBMC humanas aisladas inmediatamente antes de la administración subcutánea a la razón de células efectoras con respecto a diana (E:T) indicada. A cada ratón se les inocularon de manera bilateral las mezclas de células cancerosas y PBMC humanas. Se asignaron cuatro o cinco animales a cada grupo experimental. Se administró por vía intraperitoneal la primera dosis del artículo de prueba 1 día después del injerto de células cancerosas/efectoras. Los animales recibieron dosis del artículo de prueba dos veces a la semana durante 3-4 semanas. Se observó la formación de tumor en cada animal dos veces a la semana. Se midieron los tumores con un compás calibrador y se calcularon los volúmenes tumorales (V) usando la siguiente fórmula:

[0404] V (mm<3>) = 0,5 × (longitud (mm) × anchura (mm) × anchura (mm)/2)

[0405] Actividad de inhibición de crecimiento tumoral de AcM anti-PD-1 más AcM anti-VEGF en modelo de ratón de xenoinjerto de NSCLC

[0406] En estos estudios, a los ratones (n=4/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de células de NSCLC humanas NCI-H292 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 3:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal los anticuerpos anti-PD-1 (h1G4) y anti-VEGF (HLX04) a los ratones dos veces a la semana desde el día 1. Las curvas de crecimiento tumoral se mostraron en la figura 22A. El volumen tumoral individual en el día 21 se presentó en la figura 22B. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM. Estos datos ilustran que el AcM anti-PD-1, h1G4, en combinación con el AcM anti-VEGF, HLX04, suprimen el crecimiento tumoral de xenoinjertos de NCI-H292 más eficazmente que cualquier agente usado solo.

[0407] En otros estudios, a los ratones (n=4/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de células de NSCLC humanas NCI-H292 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 3:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal los anticuerpos anti-PD-1 (h1G4) y anti-VEGFR2 (HLX06) a los ratones dos veces a la semana desde el día 1. Las curvas de crecimiento tumoral se mostraron en la figura 23A. El volumen tumoral individual en el día 21 se presentó en la figura 23B. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM. Estos datos ilustran que el AcM anti-PD-1, h1G4, en combinación con el AcM anti-VEGFR2, HLX06, suprimen el crecimiento tumoral de xenoinjertos de NCI-H292 más eficazmente que cualquier agente usado solo.

[0408] Actividad de inhibición de crecimiento tumoral de AcM anti-PD-1 más AcM anti-EGFR en modelo de ratón de xenoinjerto de NSCLC

[0409] Siguiendo el mismo método tal como se describió anteriormente, a los ratones (n=4/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de células de NSCLC humanas NCI-H292 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 3:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal los anticuerpos anti-PD-1 (HLX10) y anti-EGFR (HLX07) a los ratones dos veces a la semana desde el día 1. Las curvas de crecimiento tumoral se mostraron en la figura 24A. El volumen tumoral individual en el día 21 se presentó en la figura 24B. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM. Estos datos indican que el AcM anti-PD-1, HLX10 (h1G4), en combinación con el AcM anti-EGFR, HLX07, suprimen el crecimiento tumoral de xenoinjertos de NCI-H292 más eficazmente que cualquier agente usado solo.

[0410] Además, a los ratones (n=5/grupo) se les injertó por vía subcutánea la mezcla de células de cáncer de colon humanas HT-29 y PBMC humanas recién aisladas (células cancerosas:PBMC = 3:1). Se inyectaron por vía intraperitoneal los anticuerpos anti-PD-1 (HLX10) y anti-EGFR (HLX07) a los ratones dos veces a la semana desde el día 1. Las curvas de crecimiento tumoral se mostraron en la figura 25A. El volumen tumoral individual en el día 21 se presentó en la figura 25B. Todos los puntos de datos son las medias ± EEM.

[0411] Estos datos indican que el AcM anti-PD-1, HLX10 (h1G4), en combinación con el AcM anti-EGFR, HLX07, suprimen el crecimiento tumoral de xenoinjertos de HT-29 con mutación de BRAF más eficazmente que HLX10 usado solo. El tratamiento con HLX10 más HLX07 produce una inhibición de crecimiento tumoral ligeramente superior al tratamiento con HLX07 solo. La tasa de inhibición de crecimiento tumoral promedio del tratamiento con HLX10 más HLX07 y del tratamiento con HLX07 solo fue del 47 % y del 28 %, respectivamente. Los ejemplos anteriores se ofrecen únicamente con propósitos ilustrativos.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo anti-PD-1 para su uso en el tratamiento de cáncer, en el que el anticuerpo anti-PD-1 comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera (V<L>) que comprende (1) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos KASQDVTTAVA (SEQ ID NO: 9); (2) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos WASTRHT (SEQ ID NO: 10); y (3) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQHYTIPWT (SEQ ID NO: 11), y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (V<H>) que comprende (1) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos FTFSNYGMS (SEQ ID NO: 12); (2) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos TISGGGSNIY (SEQ ID NO: 13); y (3) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos VSYYYGIDF (SEQ ID NO: 14); en el que el anticuerpo anti-PD-1 se administra por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea, y en el que el anticuerpo comprende una secuencia de Fc de una IgG4 humana.

2. Anticuerpo anti-PD-1 para su uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-PD-1 comprende una cadena ligera de SEQ ID NO: 6 y una cadena pesada de SEQ ID NO: 8.

3. Anticuerpo anti-PD-1 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico.

4. Anticuerpo anti-PD-1 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 conjugado con un agente terapéutico o un marcador.

5. Anticuerpo anti-PD-1 para su uso según la reivindicación 4, en el que el marcador se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, un colorante fluorescente, y una enzima.

6. Anticuerpo anti-PD-1 para su uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el anticuerpo se expresa por una línea celular mamífera estable, y en el que la línea celular mamífera estable es una línea celular CHO.