RS67443B1 - Anti-pd-1 antitela za upotrebu u lečenju kancera - Google Patents

Anti-pd-1 antitela za upotrebu u lečenju kancera

Info

Publication number
RS67443B1
RS67443B1 RS20251199A RSP20251199A RS67443B1 RS 67443 B1 RS67443 B1 RS 67443B1 RS 20251199 A RS20251199 A RS 20251199A RS P20251199 A RSP20251199 A RS P20251199A RS 67443 B1 RS67443 B1 RS 67443B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
antibodies
cancer
cells
binding
Prior art date
Application number
RS20251199A
Other languages
English (en)
Inventor
Weidong Jiang
pei-hua Lin
Chi-Ling Tseng
Original Assignee
Shanghai Henlius Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Henlius Biotech Inc filed Critical Shanghai Henlius Biotech Inc
Publication of RS67443B1 publication Critical patent/RS67443B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

[0001] Opis
[0003] UNAKRSNO POVEZIVANJE SA SRODNIM PRIJAVAMA
[0005] Ova PCT međunarodna prijava zahteva benefit i pravo prvenstva prema S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi br. 62/395,832, koja je podneta 16. septembra 2016. godine. Ova PCT međunarodna prijava takođe zahteva benefit i pravo prvenstva prema S.A.D. privremenoj patentnoj prijavi br.62/519,590, koja je podneta 14. juna 2017. godine.
[0007] OBLAST PRONALASKA
[0009] Pronalazak se generalno odnosi na anti-PD-1 antitela, i postupke njihove upotrebe, u lečenju humanih kancera.
[0011] POZADINA PRONALASKA
[0013] [0003] Programirana smrt-1 (PD-1) je ključni receptor imunske kontrolne tačke koji eksprimiraju aktivirane T i B ćelije i posreduje u imunosupresiji. PD-1 je član CD28 porodice receptora, koja uključuje CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1, i BTLA. Identifikovana su dva liganda glikoproteina na površini ćelija za PD-1, ligand programirane smrti-1 (PD-L1) i ligand programirane smrti-2 (PD-L2), koji se eksprimiraju na antigen-prezentujućim ćelijama, kao i na mnogim humanim kancerima i pokazano je da smanjuju aktivaciju T ćelija i sekreciju citokina nakon vezivanja za PD-1 (Freeman et al., 2000; Latchman et al., 2001). Za razliku od CTLA‑4, PD‑1 prvenstveno funkcioniše u perifernim tkivima gde aktivirane T ćelije mogu da se susretnu sa imunosupresivnim PD-L1 (B7-H1) i PD-L2 (B7-DC) ligandima koje eksprimiraju tumorske i/ili stromalne ćelije (Flies et al., 2011; Topalian et al., 2012a). Inhibicija PD‑1/PD-L1 interakcije posreduje u potentnoj antitumorskoj aktivnosti u prekliničkim modelima (S.A.D. patenti br. 8,008,449 i 7,943,743), i upotreba Ab inhibitora PD‑1/PD-L1 interakcije za lečenje kancera ušla je u klinička ispitivanja (Brahmer et al., 2010; Flies et al., 2011; Topalian et al., 2012b; Brahmer et al., 2012). WO 2016/077397 opisuje antitela koja se selektivno vezuju za PD‑1 i njegove izoforme i homologe, i kompozicije koje sadrže antitela. US 2016/0159905 opisuje antagonizujuća antitela koja se vezuju za protein programirane ćelijske smrti 1 (PD‑1) i postupke upotrebe. Hassan, I. et al. (2021) Structural basis of HLX10 PD-1 receptor recognition, a promising anti-PD-1 antibody clinical candidate for cancer immunotherapy. PLOS ONE, vol. 16, br. 12, e0257972, DOI: 10.1371/journal.pone.0257972 je kasnije objavljeni naučni rad istih autora/pronalazača koji objavljuje antitelo iz ove prijave.
[0014] Postoji potreba za razvojem antikancerskih terapeutika usmerenih prema PD-1. Predmetni pronalazak zadovoljava ovu i druge potrebe.
[0016] SAŽETAK PRONALASKA
[0018] Pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitelo kao što je zahtevano u patentnom zahtevu 1 za upotrebu u lečenju kancera kao što je definisano patentnim zahtevima. Anti-PD-1 antitelo iz pronalaska sadrži sekvencu varijabilnog domena (VL) lakog lanca (LC) koja sadrži (1) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KASQDVTTAVA (SEQ ID NO:9); (2) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu WASTRHT (SEQ ID NO:10); i (3) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QQHYTIPWT (SEQ ID NO:11), i sekvencu varijabilnog domena (VH) teškog lanca (HC) koja sadrži (1) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12); (2) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13); i (3) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VSYYYGIDF (SEQ ID NO:14); pri čemu se anti-PD-1 antitelo primenjuje intravenskim, intramuskularnim ili subkutanim putem, i pri čemu antitelo sadrži sekvencu Fc humanog IgG4.
[0019] Ovde su takođe opisana antitela sazrelog afiniteta prema humanizovanom h1G4 anti-PD-1 antitelu. Ovde je takođe opisano, sazrelo anti-PD-1 antitelo (npr. anti-PD-1 antitelo, 33B) koje sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (LC) koja sadrži (1) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KASTDVTTAVA (SEQ ID NO:15); (2) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu WASLRHT (SEQ ID NO:16); i (3) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QQHYGIPWT (SEQ ID NO:17), i sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (HC) koja sadrži (1) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu FRFSNYGMS (SEQ ID NO:18); (2) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu TISGGGSNAY (SEQ ID NO:19); i (3) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu TSYYYGIDF (SEQ ID NO:20).
[0020] [0007] Ovde je takođe opisano sazrelo anti-PD‑1 antitelo (npr. anti-PD‑1 antitelo, 66E) koje sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (LC) koja sadrži (1) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KAKQDVTTAVA (SEQ ID NO:21); (2) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu WASTRHT (SEQ ID NO:10); i (3) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QQHYWIPWT (SEQ ID NO:22), i sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (HC) koja sadrži (1) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12); (2) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13); i (3) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VSYYYGIDL (SEQ ID NO:23).
[0021] Ovde je takođe opisano sazrelo anti-PD‑1 antitelo (npr. anti-PD‑1 antitelo, 711D) koje sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (LC) koja sadrži (1) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KASQDVTNAVA (SEQ ID NO:24); (2) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu WASTRHT (SEQ ID NO:10); i (3) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QQHYTIPWT (SEQ ID NO:11), i sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (HC) koja sadrži (1) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12); (2) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13); i (3) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SSYYYGIDL (SEQ ID NO:25).
[0022] Sekvence CDR koje su ovde pomenute obezbeđene su u Tabeli 1 u nastavku.
[0025] TABELA 1
[0027]
[0030] [0010] Ovde je takođe opisano anti-PD-1 antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (LC) koja sadrži (1) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9, 21 i 24; (2) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili 16; (3) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 11, 17, 22, i sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (HC) koja sadrži (1) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 ili 18; (2) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 ili 19; i (3) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 20, 23, i 25.
[0031] Pronalaskom je takođe obezbeđeno anti-PD-1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca koja je izneta u (SEQ ID NO:4) i sekvencu lakog lanca koja je izneta u SEQ ID NO:2).
[0032] Pronalaskom je takođe obezbeđeno humanizovano anti-PD-1 antitelo koje sadrži sekvencu koja je izneta u (SEQ ID NO:8) i sekvencu lakog lanca koja je izneta u SEQ ID NO:6).
[0033] U skladu sa predmetnim pronalaskom, antitelo sadrži sekvencu Fc humanog IgG4. Ovde je takođe opisano, da je antigen-vezujući fragment antitela odabran iz grupe koja se sastoji od Fab, Fab’, F(ab)’2, jednolančanog Fv (scFv), Fv fragmenta, dijatela, i linearnog antitela. U nekim primerima izvođenja u skladu sa bilo kojim (ili kao što se primenjuje na bilo koji) od prethodno navedenih primera izvođenja, antitelo kao što je definisano patentnim zahtevima je multispecifično antitelo.
[0034] U nekim primerima izvođenja u skladu sa bilo kojim (ili kao što se primenjuje na bilo koji) od prethodno navedenih primera izvođenja, anti-PD‑1 antitelo kao što je definisano patentnim zahtevima je konjugovano za terapijski agens. U nekim primerima izvođenja u skladu sa bilo kojim (ili kao što se primenjuje na bilo koji) od prethodno navedenih primera izvođenja, anti-PD‑1 antitelo kao što je definisano patentnim zahtevima je konjugovano za obeleživač. U nekim primerima izvođenja u skladu sa bilo kojim (ili kao što se primenjuje na bilo koji) od prethodno navedenih primera izvođenja, obeleživač je odabran iz grupe koja se sastoji od radioizotopa, fluorescentne boje, i enzima.
[0035] [0015] Takođe je opisan izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-PD‑1 antitelo u skladu sa bilo kojim (ili kao što se primenjuje na bilo koji) od prethodno navedenih primera izvođenja. Takođe je opisan ekspresioni vektor koji kodira molekul nukleinske kiseline u skladu sa bilo kojim (ili kao što se primenjuje na bilo koji) od prethodno navedenih primera izvođenja. Ćelije koje sadrže ekspresioni vektor u skladu sa bilo kojim (ili kao što se primenjuje na bilo koji) od prethodno navedenih primera izvođenja takođe su opisane. Dodatno je opisan postupak proizvodnje antitela koji sadrži kultivaciju ćelije i izdvajanje njenog antitela iz ćelijske kulture. Ćelija može biti ćelija sisara. Ćelija sisara može biti CHO ćelija. Ćelija može biti stabilna ćelijska linija sisara. Stabilna ćelijska linija sisara može biti CHO ćelijska linija.
[0036] Takođe je opisana kompozicija koja sadrži ovde opisano anti-PD-1 antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0037] Takođe je opisan postupak detektovanja PD‑1 proteina u uzorku koji je dobijen od pacijenta dovođenjem u kontakt anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano sa uzorkom i detektovanja anti-PD‑1 antitela koje je vezano za PD‑1 protein. Anti-PD‑1 antitelo može se upotrebljavati u imunohistohemijskom testu (IHC) ili u ELISA testu.
[0038] Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži anti-PD-1 antitelo u skladu sa patentnim zahtevima za upotrebu u lečenju kancera kao što je definisano u patentnim zahtevima. Kancer može biti odabran od melanoma, kancera glave i vrata, urotelnog kancera, kancera dojke (npr. trostruko negativni kancer dojke, TNBC), kancera želuca, klasičnog Hočkinovog (Hodgkin’s) limfoma (cHL), ne-Hočkinovog limfoma, primarnog medijastinalnog B-ćelijskog limfoma (NHL PMBCL), mezotelioma, kancera jajnika, kancera pluća (npr. sitnoćelijski kancer pluća i nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancera jednjaka, nazofaringealnog karcinoma (NPC), kancera bilijarnog trakta, kolorektalnog kancera, kancera grlića materice, kancera štitne žlezde, i kancera pljuvačnih žlezda. Subjektu se može dodatno primeniti terapijski agens koji je odabran iz grupe koja se sastoji od antineoplastičnog agensa, hemioterapijskog agensa, agensa za inhibiciju rasta i citotoksičnog agensa. Subjektu se može dodatno primeniti radioterapija. Subjektu se može dodatno primeniti terapijsko antitelo prema VEGF, VEGFR2, ili EGFR.
[0040] KRATAK OPIS CRTEŽA
[0042]
[0044] Slike 1A‑1B. Vezivanje c1G4 za PD‑1 rekombinantni protein. SL. 1A pokazuje rezultate ELISA testova koji su izvedeni kako bi se uporedilo vezivanje anti-PD‑1 antitela c1G4 i referentnog anti-PD‑1 za PD‑1-His. SL. 1B pokazuje rezultate drugog seta ELISA testova koji su izvedeni kako bi se uporedilo vezivanje anti-PD‑1 antitela c1G4 i referentnog anti-PD‑1 za PD‑1-AP. Podaci ukazuju da su c1G4 i referentno anti-PD‑1 sposobna da se vežu i za PD‑1-His i za PD‑1-AP.
[0045] Slike 2A‑2B. Blokiranje i kompeticija vezivanja za PD‑1 ligand c1G4. SL.2A pokazuje rezultate ELISA testova koji su izvedeni kako bi se uporedila sposobnost anti-PD‑1 antitela c1G4 i referentnog anti-PD‑1 da blokiraju vezivanje PD-L1 i PD‑1. Pronađeno je da i c1G4 i referentno anti-PD‑1 blokiraju vezivanje PD-L1 za PD‑1. SL. 2B pokazuje rezultate ELISA testova koji su izvedeni kako bi se odredila sposobnost anti-PD‑1 antitela c1G4 da bude u kompeticiji sa referentnim anti-PD‑1 za vezivanje za PD‑1-His. Podaci ukazuju da su i c1G4 i referentno anti-PD‑1 sposobna da blokiraju vezivanje PD-L1 za PD‑1, a c1G4 je sposobno da bude u kompeticiji sa anti-PD‑1 ref za vezivanje za PD‑1-His.
[0047] Slike 3A‑3B. Vezivanje c1G4 za PD‑1 eksprimirajuće CHO-S ćelije. Vezivanje c1G4 antitela za CHO-S ćelije (SL. 3A) i PD‑1 transfektovane CHO-S ćelije (SL. 3B) testirano je pomoću protočne citometrije. Referentna anti-PD‑1 i anti-PD-L1 antitela upotrebljena su kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno. Podaci ukazuju da se c1G4 vezalo za CHO ćelije transfektovane sa humanim PD‑1, ali ne i za netransfektovane CHO ćelije.
[0049] Slika 4. Blokiranje vezivanja liganda za PD‑1 odabranim c1G4 antitelom. Anti-PD‑1 c1G4 je testirano na sposobnost blokiranja vezivanja liganda PD-L1 za PD‑1 eksprimirajuće CHO-S ćelije upotrebom testa protočne citometrije. Referentna anti-PD‑1 i anti-PD-L1 antitela upotrebljena su kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno. Anti-PD‑1 monoklonsko antitelo c1G4 blokiralo je vezivanje PD-L1 za PD‑1 transfektovane CHO-S ćelije, kao što je izmereno pomoću srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) bojenja. Ovi podaci demonstriraju da anti-PD‑1 c1G4 blokira vezivanje PD-L1 liganda za PD‑1 na površini ćelija.
[0051] Slike 5A‑5B. Efekat anti-PD‑1 c1G4 na proizvodnju citokina u reakciji mešovitih leukocita (MLR). Monoklonsko antitelo c1G4 prema humanom PD‑1 promoviše sekreciju IFN-γ i sekreciju IL‑2 u testu reakcije mešovitih leukocita. Referentno anti-PD‑1 i Avastin (anti-VEGF) upotrebljeni su kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno. SL. 5A ilustruje bar grafikon koji pokazuje sekreciju IL‑2 zavisnu od koncentracije; SL. 5B ilustruje bar grafikon koji pokazuje sekreciju IFN-γ zavisnu od koncentracije.
[0052] Slika 6. Efekat anti-PD‑1 c1G4 na proliferaciju T ćelija u reakciji mešovitih leukocita (MLR). Monoklonsko antitelo c1G4 prema humanom PD‑1 promoviše proliferaciju CD4<+>i CD8<+>T ćelija u testu reakcije mešovitih leukocita. Referentno anti-PD‑1 i Avastin (anti-VEGF) upotrebljeni su kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno. SL. 6A ilustruje bar grafikon koji pokazuje proliferaciju CD4<+>T ćelija pri različitim koncentracijama antitela; SL. 6B ilustruje bar grafikon koji pokazuje proliferaciju CD8<+>T ćelija pri različitim koncentracijama antitela.
[0054] Slika 7. Aktivnost inhibicije rasta tumora c1G4 antitela. Miševima (n=4/grupi) je subkutano graftovana smeša ćelijske linije HT29 humanog kancera kolona i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC = 2:1). Anti-PD‑1 antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno od dana 1. Krive rasta tumora pokazane su na SL. 7A. Podaci o zapremini pojedinačnog tumora na dan 28 predstavljeni su na SL.7B. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM.
[0056] Slika 8. Poravnanje sekvenci za c1G4 i h1G4. SL. 8A pokazuje poravnanje aminokiselinskih sekvenci lakih lanaca c1G4, humanizovanog h1G4, varijabilnog regiona lakog lanca IGKV1‑39*01 humane germinativne linije, i Nivolumaba (NIV). SL. 8B pokazuje poravnanje aminokiselinskih sekvenci teških lanaca c1G4, humanizovanog h1G4, varijabilnog regiona teškog lanca IGHV3‑11*04 humane germinativne linije, i Nivolumaba (NIV). CDR (regioni koji određuju komplementarnost) graftovani iz c1G4 za humanizaciju označeni su masnim i podvučenim tekstom.
[0058] Slika 9. Vezivanje humanizovanog anti-PD‑1 antitela za PD‑1 eksprimirajuće CHO-S ćelije. Vezivanje humanizovanog h1G4 i originalnog c1G4 antitela za PD‑1 na površini ćelija testirano je pomoću protočne citometrije. Referentna anti-PD‑1 i anti-PD-L1 antitela upotrebljena su kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno.
[0060] Slika 10. Blokiranje vezivanja liganda za PD‑1 humanizovanim h1G4 antitelom. Humanizovano anti-PD‑1 h1G4 je testirano na sposobnost blokiranja vezivanja liganda PD-L1 za PD‑1 eksprimirajuće CHO-S ćelije upotrebom testa protočne citometrije. Referentna anti-PD‑1 i anti-PD-L1 antitela upotrebljena su kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno. I c1G4 i h1G4 su blokirala vezivanje PD-L1 za PD‑1 transfektovane CHO-S ćelije, kao što je izmereno pomoću srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) bojenja.
[0062] Slike 11A‑11D ilustruju unakrsnu reaktivnost između vrsta h1G4 sa humanim (Sl.
[0063] 11A), cinomolgus majmunskim (Sl. 11B), mišjim (Sl. 11C), i pacovskim (Sl. 11D) PD‑1 proteinima. Sve tačke podataka su prosek triplikata ± SD.
[0065] Slika 12. Vezivanje humanizovanog anti-PD‑1 antitela za aktivirane humane T ćelije. Vezivanje humanizovanog h1G4 za humane T ćelije testirano je pomoću protočne citometrije. Referentno anti-PD‑1 antitelo i Avastin (anti-VEGF) upotrebljeni su kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno.
[0067] Slika 13. Efekat h1G4 na proizvodnju citokina u reakciji mešovitih leukocita (MLR). Humanizovano antitelo h1G4 prema humanom PD‑1 promoviše sekreciju IFN-γ i sekreciju IL‑2 u testu reakcije mešovitih leukocita. Referentno anti-PD‑1 antitelo i Avastin (anti-VEGF) upotrebljeni su kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno. SL. 13A ilustruje bar grafikon koji pokazuje sekreciju IL‑2 zavisnu od koncentracije; SL. 13B ilustruje bar grafikon koji pokazuje sekreciju IFN-γ zavisnu od koncentracije.
[0069] Slika 14. Efekat h1G4 na proliferaciju T ćelija u reakciji mešovitih leukocita (MLR). Humanizovano antitelo h1G4 prema humanom PD‑1 promoviše proliferaciju CD4<+>i CD8<+>T ćelija u testu reakcije mešovitih leukocita. Referentno anti-PD‑1 antitelo i Avastin (anti-VEGF) upotrebljeni su kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno. SL. 14A ilustruje bar grafikon koji pokazuje proliferaciju CD4<+>T ćelija pri različitim koncentracijama antitela; Slika 14B ilustruje bar grafikon koji pokazuje proliferaciju CD8<+>T ćelija pri različitim koncentracijama antitela.
[0071] Slika 15. Aktivnost inhibicije rasta tumora h1G4 antitela u HT29/PBMC ksenograft modelu. Miševima (n=4/grupi) je subkutano graftovana smeša ćelijske linije HT29 humanog kancera kolona i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC = 3:1). Anti-PD‑1 antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno od dana 1. Krive rasta tumora pokazane su na SL. 15A. Podaci o zapremini pojedinačnog tumora na dan 21 predstavljeni su na SL. 15B. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM.
[0073] Slika 16. Aktivnost inhibicije rasta tumora h1G4 antitela u NCI-H292/PBMC ksenograft modelu. Miševima (n=4/grupi) je subkutano graftovana smeša ćelijske linije NCI-H292 humanog NSCLC i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC = 3:1). Anti-PD‑1 antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno od dana 1. Krive rasta tumora pokazane su na SL. 16A. Podaci o zapremini pojedinačnog tumora na dan 25 predstavljeni su na SL. 16B. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM.
[0075] Slika 17. Aktivnost inhibicije rasta tumora h1G4 antitela kod hPD1 KI miševa. Genetički projektovanim (knock-in) miševima sa humanim PD‑1 (hPD1 KI) (n=4/grupi) subkutano su graftovane ćelije MC38-huPD-L1 (MC38 transfektovane sa humanim PD-L1). Tretmani antitelima su započeti kada su zapremine tumora dostigle približno 75 mm<3>. Anti-PD‑1 antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SD.
[0077] Slika 18. Studija efikasnosti h1G4 u ksenograft modelu ćelijske linije trostruko negativnog kancera dojke (TNBC) kod humanizovanih NSG miševa. Humanizovani NSG miševi (n=9/grupi) subkutano su inokulisani sa MDA-MB‑231 ćelijama. Tretmani antitelima su započeti kada su zapremine tumora dostigle približno 60‑150 mm<3>. Dani doziranja su označeni strelicama. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM.
[0079] Slika 19. Efekat humanih anti-PD‑1 antitela na proizvodnju citokina u reakciji mešovitih leukocita (MLR). Humana monoklonska antitela prema humanom PD‑1 promovišu sekreciju IFN-γ i sekreciju IL‑2 u testu reakcije mešovitih leukocita. Referentno anti-PD‑1 antitelo i Avastin (anti-VEGF) upotrebljeni su kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno. SL.19A ilustruje bar grafikon koji pokazuje sekreciju IL‑2 zavisnu od koncentracije; SL. 19B ilustruje bar grafikon koji pokazuje sekreciju IFN-γ zavisnu od koncentracije.
[0081] Slika 20. Aktivnost inhibicije rasta tumora humanih anti-PD‑1 antitela u HT29/PBMC ksenograft modelu. Miševima (n=4/grupi) je subkutano graftovana smeša ćelijske linije
[0084] 1
[0085] HT29 humanog kancera kolona i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC = 3:1). Anti-PD‑1 antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno od dana 1. Zapremina tumora je merena dva puta nedeljno. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM.
[0087] Slika 21. Kombinacija monoklonskog antitela anti-PD‑1 i anti-VEGF u HT29/PBMC ksenograft modelu. Miševima (n=4/grupi) je subkutano graftovana smeša ćelijske linije HT29 humanog kancera kolona i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC = 3:1). Anti-PD‑1 mAb, anti-VEGF mAb (HLX04), ili anti-PD‑1 mAb plus anti-VEGF mAb su intraperitonealno injektirana miševima. Dani doziranja su označeni strelicama. Zapremina tumora je merena dva puta nedeljno. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM.
[0089] Slika 22. Aktivnost inhibicije rasta tumora anti-PD‑1 mAb plus anti-VEGF mAb u mišjem modelu NSCLC ksenografta. Miševima (n=4/grupi) je subkutano graftovana smeša ćelija NCI-H292 humanog NSCLC i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC = 3:1). Anti-PD‑1 (h1G4), i anti-VEGF (HLX04) antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno od dana 1. Krive rasta tumora pokazane su na Slici 22A. Podaci o zapremini pojedinačnog tumora na dan 21 predstavljeni su na Slici 22B. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM.
[0091] Slika 23. Aktivnost inhibicije rasta tumora anti-PD‑1 mAb plus anti-VEGFR2 mAb u mišjem modelu NSCLC ksenografta. Miševima (n=4/grupi) je subkutano graftovana smeša ćelija NCI-H292 humanog NSCLC i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC = 3:1). Anti-PD‑1 (h1G4), i anti-VEGFR2 (HLX06) antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno od dana 1. Krive rasta tumora pokazane su na Slici 23A. Podaci o zapremini pojedinačnog tumora na dan 21 predstavljeni su na Slici 23B. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM.
[0093] Slika 24. Aktivnost inhibicije rasta tumora anti-PD‑1 mAb plus anti-EGFR mAb u mišjem modelu NSCLC ksenografta. Miševima (n=4/grupi) je subkutano graftovana smeša ćelija NCI-H292 humanog NSCLC i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC=3:1). Anti-PD‑1 (HLX10), i anti-EGFR (HLX07) antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno od dana 1. Krive rasta tumora pokazane su na Slici 24A. Podaci o zapremini pojedinačnog tumora na dan 21 predstavljeni su na Slici 24B. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM.
[0095] Slika 25. Aktivnost inhibicije rasta tumora anti-PD‑1 mAb plus anti-EGFR mAb u mišjem modelu HT‑29 (KRAS<WT>, BRAF<V600E>) ksenografta. Miševima (n=5/grupi) je subkutano graftovana smeša ćelija HT‑29 humanog kancera kolona i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC=3:1). Anti-PD‑1 (HLX10), i anti-EGFR (HLX07) antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno od dana 1. Krive rasta tumora pokazane su na Slici 25A. Podaci o zapremini pojedinačnog tumora na dan 21 predstavljeni su na Slici 25B. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM.
[0097] DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0099] Predmetni pronalazak obezbeđuje nova anti-PD-1 antitela za upotrebu u lečenju kancera kao što je definisano u patentnim zahtevima. Pronalazači su iznenađujuće pronašli da anti-PD-1 antitela, npr. himerna c1G4 i humanizovana h1G4 antitela koja su ovde opisana, kao i njihova antitela sazrelog afiniteta, npr. 33B, 66E, i 711D, poboljšavaju sekreciju IL-2 i IFNγ od strane T ćelija i proliferaciju CD4<+>i CD8<+>T ćelija. Anti-PD-1 antitela koja su ovde opisana takođe pokazuju poboljšanu efikasnost i/ili antitumorsku aktivnost u poređenju sa OPDIVO<®>(Nivolumab), humanizovanim IgG4 anti-PD-1 monoklonskim antitelom koje je odobrila FDA i koje se upotrebljava za lečenje kancera.
[0100] Takođe su opisani imunokonjugati, nukleinske kiseline koje kodiraju nova anti-PD-1 antitela koja su ovde opisana, i kompozicije (kao što su farmaceutske kompozicije) i postupci upotrebe novih anti-PD-1 antitela za detekciju PD-1 u uzorku (kao što je in vivo ili ex vivo uzorak), i kompozicije koje sadrže takva antitela za upotrebu u lečenju kancera.
[0102] Definicije
[0104] [0022] Kao što se ovde upotrebljava, „lečenje“ ili „lečiti“ je pristup za dobijanje korisnih ili željenih rezultata, uključujući kliničke rezultate. Korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, jedno ili više od sledećeg: ublažavanje jednog ili više simptoma koji su rezultat bolesti, smanjenje obima bolesti, stabilizacija bolesti (npr. sprečavanje ili odlaganje pogoršanja bolesti), sprečavanje ili odlaganje širenja (npr. metastaza) bolesti, sprečavanje ili odlaganje recidiva bolesti, odlaganje ili usporavanje progresije bolesti, ublažavanje bolesnog stanja, obezbeđivanje remisije (delimične ili potpune) bolesti, smanjenje doze jednog ili više drugih medikamenata koji su potrebni za lečenje bolesti, odlaganje progresije bolesti, povećanje ili poboljšanje kvaliteta života, povećanje dobitka telesne težine, i/ili produženje preživljavanja. Pod „lečenjem“ se takođe podrazumeva redukovanje patoloških posledica kancera (kao što je, na primer, zapremina tumora). Postupci koji su ovde opisani razmatraju jedan ili više ovih aspekata lečenja.
[0105] Termini „recidiv“, „relaps“ ili „relapsiralo“ označavaju povratak kancera ili bolesti posle kliničke procene nestanka bolesti. Dijagnoza udaljenih metastaza ili lokalnog recidiva može se smatrati relapsom.
[0106] Termin „refraktoran“ ili „rezistentan“ označava kancer, ili bolest, koji nije reagovao na lečenje.
[0107] Termin „adjuvansna terapija“ označava lečenje koje se daje posle primarne terapije, obično hirurške intervencije. Adjuvansna terapija za kancer ili bolest može da uključuje imunoterapiju, hemioterapiju, radioterapiju, ili hormonsku terapiju.
[0108] Termin „održavajuća terapija“ označava planirano ponovno lečenje koje se daje kako bi se održali efekti prethodnog lečenja. Održavajuća terapija se često daje kako bi se kancer održao u remisiji ili produžio odgovor na određenu terapiju bez obzira na progresiju bolesti.
[0109] Termin „invazivni kancer“ označava kancer koji se proširio izvan sloja tkiva u kome je nastao u normalna okolna tkiva. Invazivni kanceri mogu, ali i ne moraju biti metastatski.
[0110] Termin „neinvazivni kancer“ označava veoma rani kancer ili kancer koji se nije proširio izvan tkiva porekla.
[0111] Termin „preživljavanje bez progresije“ u onkologiji označava vremenski period tokom i posle lečenja tokom kog kancer ne raste. Preživljavanje bez progresije uključuje količinu vremena u kom su pacijenti doživeli potpuni odgovor ili delimičan odgovor, kao i količinu vremena u kom su pacijenti doživeli stabilnu bolest.
[0112] Termin „progresivna bolest“ u onkologiji može da označava rast tumora veći od 20 procenata od početka lečenja – bilo usled povećanja mase ili širenja tumora.
[0113] „Poremećaj“ je bilo koje stanje koje bi imalo koristi od lečenja sa antitelom. Na primer, sisari koji pate od, ili im je potrebna profilaksa, prema abnormalnoj aktivnosti PD-1. Ovo uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući i ona patološka stanja koja predisponiraju sisara za dotični poremećaj. Neograničavajući primeri poremećaja koji se ovde leče uključuju kancer (kao što su kancer glave i vrata, kancer grla, kolorektalni kancer, kancer pluća, itd.).
[0116] 1
[0117] „Tumor“, kao što se ovde upotrebljava, označava sav rast i proliferaciju neoplastičnih ćelija, bilo malignih ili benignih, i sve prekancerozne i kancerozne ćelije i tkiva.
[0118] Termin „antitelo“ se upotrebljava u najširem smislu i specifično pokriva, na primer, pojedinačna monoklonska antitela (uključujući agoniste, antagoniste, i neutrališuća antitela), kompozicije antitela sa poliepitopskom specifičnošću, poliklonalna antitela, jednolančana anti-antitela, i fragmente antitela (videti u nastavku) sve dok se specifično vezuju za nativni polipeptid i/ili pokazuju biološku aktivnost ili imunološku aktivnost iz ovog pronalaska. Antitelo se može vezati za oligomerni oblik ciljnog proteina, npr. trimerni oblik. Antitelo se može specifično vezati za protein, čije vezivanje može biti inhibirano monoklonskim antitelom (npr. deponovanim antitelom, itd.). Fraza „funkcionalni fragment ili analog“ antitela je jedinjenje koje ima zajedničku kvalitativnu biološku aktivnost sa antitelom na koje se poziva. Na primer, funkcionalni fragment ili analog antitela iz ovog pronalaska kao što je definisano u patentnim zahtevima, može biti onaj koji se može specifično vezati za PD-1. Antitelo može sprečiti ili suštinski redukovati sposobnost PD-1 da indukuje proliferaciju ćelija.
[0119] „Izolovano antitelo“ je ono koje je identifikovano i odvojeno i/ili izdvojeno iz komponente njegovog prirodnog okruženja. Kontaminirajuće komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi mogli da interferiraju sa dijagnostičkim ili terapijskim upotrebama za antitelo, i mogu uključivati enzime, hormone, i druge proteinske ili neproteinske rastvorke. Antitelo može biti prečišćeno (1) do više od 95% po težini antitela kao što je određeno pomoću Lorijevog (Lowry) postupka, a najpoželjnije više od 99% po težini, (2) do stepena koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminusne ili interne aminokiselinske sekvence upotrebom sekvenatora sa rotirajućom šoljom, ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod redukujućim ili neredukujućim uslovima upotrebom Kumasi (Coomassie) plave ili, poželjno, srebrne boje. Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantnih ćelija pošto najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Međutim, obično se izolovano antitelo priprema najmanje jednim korakom prečišćavanja.
[0120] [0035] Osnovna jedinica antitela sa 4 lanca je heterotetramerni glikoprotein sastavljen od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca (IgM antitelo se sastoji od 5 osnovnih heterotetramernih jedinica zajedno sa dodatnim polipeptidom koji se naziva J lanac, i prema tome sadrži 10 antigen-vezujućih mesta, dok sekretovana IgA antitela mogu polimerisati i formirati polivalentne sklopove koji sadrže 2‑5 osnovnih jedinica sa 4 lanca zajedno sa J lancem). U slučaju IgG, jedinica sa 4 lanca je generalno oko 150.000 daltona. Svaki L lanac je povezan sa H lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca međusobno povezana jednom ili sa više disulfidnih veza u zavisnosti od izotipa H lanca. Svaki H i L lanac takođe ima pravilno raspoređene intralančane disulfidne mostove. Svaki H lanac ima na N-terminusu varijabilni domen (VH), nakon koga slede tri konstantna domena (C<H>) za svaki od α i γ lanaca i četiri C<H>domena za µ i ε izotipove. Svaki L lanac ima na N-terminusu varijabilni domen (V<L>), nakon koga sledi konstantni domen (C<L>) na njegovom drugom kraju. VL je poravnat sa VH, a CL je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca (C<H>1). Veruje se da određeni aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog lanca i teškog lanca. Sparivanje VH i VL zajedno formira jedno antigen-vezujuće mesto. Za strukturu i svojstva različitih klasa antitela, videti, npr. Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, strana 71 i poglavlje 6.
[0121] L lanac bilo koje vrste vertebrata može se pripisati jednom od dva jasno različita tipa, koji su nazvani kapa i lambda, na osnovu aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca (C<H>), imunoglobulini se mogu pripisati različitim klasama ili izotipovima. Postoji pet klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, koji imaju teške lance koji su označeni kao α, δ, γ, ε, i µ, respektivno. Klase γ i α su dodatno podeljene na podklase na osnovu relativno manjih razlika u C<H>sekvenci i funkciji, npr. ljudi eksprimiraju sledeće podklase: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2.
[0122] Termin „varijabilni“ označava činjenicu da se određeni segmenti varijabilnih domena značajno razlikuju u sekvenci među antitelima. V domen posreduje u vezivanju antigena i definiše specifičnost određenog antitela za njegov određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena po rasponu od 110 aminokiselina varijabilnih domena. Umesto toga, V regioni se sastoje od relativno nevarijabilnih nizova koji su nazvani regioni okvira (FR) od 15-30 aminokiselina razdvojenih kraćim regionima ekstremne varijabilnosti nazvanim „hipervarijabilni regioni“ koji su dužine 9-12 aminokiselina svaki. Varijabilni domeni nativnih teških i lakih lanaca sadrže svaki po četiri FR, uglavnom usvajajući konfiguraciju beta-ploče, povezana sa tri hipervarijabilna regiona, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima formiraju deo, strukture beta-ploče. Hipervarijabilni regioni u svakom lancu drže se zajedno u neposrednoj blizini pomoću FR i, sa hipervarijabilnim regionima iz drugog lanca, doprinose formiranju antigen-vezujućeg mesta antitela (videti Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Konstantni domeni nisu direktno
[0125] 1
[0126] uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC).
[0127] Kao što se ovde upotrebljava, termin „CDR“ ili „region koji određuje komplementarnost“ namenjen je da označava nesusedna mesta za kombinovanje antigena koja se nalaze unutar varijabilnog regiona polipeptida i teškog i lakog lanca. Ove posebne regione opisali su Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609‑6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, „Sequences of proteins of imunological interest“ (1991); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901‑917 (1987); i MacCallum et al., J. Mol. Biol.
[0128] 262:732‑745 (1996), gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka kada se upoređuju jedni sa drugima. Ipak, primena bilo koje definicije za pozivanje na CDR antitela ili graftovanih antitela ili njihovih varijanti namenjena je da bude unutar obima termina kao što je ovde definisano i upotrebljeno. Aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR kao što je definisano u svakoj od prethodno citiranih referenci, izneti su u nastavku u Tabeli 2 kao poređenje.
[0130] Tabela 2
[0132] Kabat<1>Chothia<2>MacCallum<3>
[0133] V<H>CDR1 31-35 26-32 30-35
[0134] V<H>CDR2 50-65 53-55 47-58
[0135] V<H>CDR3 95-102 96-101 93-101
[0136] V<L>CDR1 24-34 26-32 30-36
[0137] V<L>CDR2 50-56 50-52 46-55
[0138] V<L>CDR3 89-97 91-96 89-96
[0140] Termin „monoklonsko antitelo“ kao što se ovde upotrebljava označava antitelo koje je dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična, osim mogućih mutacija koje se javljaju u prirodi koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena prema jednom antigenskom mestu. Štaviše, za razliku od preparata poliklonalnih antitela koji uključuju različita antitela usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo je usmereno prema jednoj determinanti na antigenu. Pored svoje specifičnosti, monoklonska antitela imaju prednost u tome što se mogu sintetisati
[0143] 1
[0144] nekontaminirana drugim antitelima. Modifikator „monoklonsko“ ne treba tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja su korisna u predmetnom pronalasku mogu se pripremiti metodologijom hibridoma koju su prvi put opisali Kohler et al. Nature.256:495 (1975), ili se mogu napraviti upotrebom postupaka rekombinantne DNK u bakterijskim, eukariotskim životinjskim ili biljnim ćelijama (videti, npr. S.A.D. patent br. 4,816,567). „Monoklonska antitela“ se takođe mogu izolovati iz biblioteka faga antitela upotrebom tehnika koje su opisane u Clackson et al., Nature, 352:624‑628 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581‑597 (1991), i Primerima u nastavku, na primer.
[0145] Monoklonska antitela ovde uključuju „himerna“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima koja su izvedena iz određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca (aca) identičan ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima koja su izvedena iz druge vrste ili koja pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok pokazuju biološku aktivnost (videti S.A.D. patent br. 4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Himerna antitela od interesa ovde uključuju „primatizovana“ antitela koja sadrže antigen-vezujuće sekvence varijabilnog domena koje su izvedene iz ne-humanog primata (npr. majmun Starog sveta, čovekoliki majmun itd.), i sekvence humanog konstantnog regiona.
[0146] „Intaktno“ antitelo je ono koje sadrži antigen-vezujuće mesto kao i CL i najmanje konstantne domene teškog lanca, C<H>1, C<H>2 i C<H>3. Konstantni domeni mogu biti konstantni domeni nativne sekvence (npr. konstantni domeni humane nativne sekvence) ili varijante njihove aminokiselinske sekvence. Poželjno, intaktno antitelo ima jednu ili više efektorskih funkcija.
[0147] „Fragmenti antitela“ sadrže deo intaktnog antitela, poželjno antigen-vezujući ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab’, F(ab’)2, i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela (videti S.A.D. patent br.5,641,870, Primer 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057‑1062 [1995]); molekule jednolančanih antitela; i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Termin „linearna antitela“ generalno označava antitela koja su opisana u Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057‑1062 (1995). Ukratko, ova antitela sadrže par tandemskih Fd segmenata (VH-CH1-VH-CH1) koji, zajedno sa komplementarnim polipeptidima lakog lanca, formiraju par antigen-vezujućih regiona. Linearna antitela mogu biti bispecifična ili monospecifična.
[0150] 1
[0151] Papainska digestija antitela proizvodi dva identična antigen-vezujuća fragmenta, koji su nazvani „Fab“ fragmenti, i rezidualni „Fc“ fragment, oznaka koja odražava sposobnost lake kristalizacije. Fab fragment se sastoji od celog L lanca zajedno sa domenom varijabilnog regiona H lanca (V<H>) i prvim konstantnim domenom jednog teškog lanca (C<H>1). Svaki Fab fragment je monovalentan u pogledu vezivanja antigena, tj. ima jedno antigen-vezujuće mesto. Pepsinski tretman antitela daje jedan veliki F(ab’)<2>fragment koji otprilike odgovara dvama disulfidno povezanim Fab fragmentima koji imaju dvovalentnu antigen-vezujuću aktivnost i još je sposoban za unakrsno povezivanje sa antigenom. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po tome što imaju dodatnih nekoliko ostataka na karboksi terminusu CH1 domena uključujući jedan ili više cisteina iz regiona zgloba antitela. Fab’-SH je ovde oznaka za Fab’ u kome cisteinski ostatak(ci) konstantnih domena nosi(e) slobodnu tiolnu grupu. F(ab’)<2>fragmenti antitela su prvobitno proizvedeni kao parovi Fab’ fragmenata koji imaju cisteine zgloba između sebe. Poznata su i druga hemijska kuplovanja fragmenata antitela.
[0152] Fc fragment sadrži karboksi-terminusne delove oba H lanca koje zajedno drže disulfidi. Efektorske funkcije antitela određene su sekvencama u Fc regionu, koji je takođe deo koji prepoznaju Fc receptori (FcR) koji se nalaze na određenim tipovima ćelija.
[0153] „Varijantni Fc region“ sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od Fc regiona nativne sekvence na osnovu najmanje jedne „aminokiselinske modifikacije“ kao što je ovde definisano. Poželjno, varijantni Fc region ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u poređenju sa Fc regionom nativne sekvence ili sa Fc regionom roditeljskog polipeptida, npr. od oko jedne do oko deset aminokiselinskih supstitucija, a poželjno od oko jedne do oko pet aminokiselinskih supstitucija u Fc regionu nativne sekvence ili u Fc regionu roditeljskog polipeptida. Varijantni Fc region ovde može posedovati najmanje oko 80% homologije, najmanje oko 85% homologije, najmanje oko 90% homologije, najmanje oko 95% homologije ili najmanje oko 99% homologije sa Fc regionom nativne sekvence. Varijantni Fc region ovde može posedovati najmanje oko 80% homologije, najmanje oko 85% homologije, najmanje oko 90% homologije, najmanje oko 95% homologije ili najmanje oko 99% homologije sa Fc regionom roditeljskog polipeptida.
[0154] Termin „polipeptid koji sadrži Fc region“ označava polipeptid, kao što je antitelo ili imunoadhezin (videti definicije na drugim mestima ovde), koji sadrži Fc region. C-terminusni lizin (ostatak 447 u skladu sa EU sistemom numeracije) Fc regiona može se ukloniti, na primer, tokom prečišćavanja polipeptida ili rekombinantnim projektovanjem nukleinske kiseline koja kodira polipeptid. U skladu sa tim, kompozicija koja sadrži polipeptide, uključujući antitela, koji imaju Fc region u skladu sa ovim pronalaskom može da sadrži
[0157] 1
[0158] populacije polipeptida sa uklonjenim svim K447 ostacima, populacije polipeptida bez uklonjenih K447 ostataka ili populacije polipeptida koje imaju mešavinu polipeptida sa i bez K447 ostatka.
[0159] „Efektorske funkcije“ antitela označavaju one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu (Fc region nativne sekvence ili Fc region varijantne aminokiselinske sekvence) antitela i variraju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa; vezivanje Fc receptora; ćelijama posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; smanjenje ekspresije receptora na površini ćelija; i aktivaciju B ćelija. „Fc region nativne sekvence“ sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je identična aminokiselinskoj sekvenci Fc regiona koji se nalazi u prirodi. Primeri sekvenci Fc opisani su, na primer, ali ne ograničavaju se na, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).
[0160] „Fv“ je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno antigen-prepoznajuće i -vezujuće mesto. Ovaj fragment se sastoji od dimera jednog domena varijabilnog regiona teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. Iz savijanja ova dva domena nastaje šest hipervarijabilnih petlji (po 3 petlje iz H i L lanca) koje doprinose aminokiselinskim ostacima za vezivanje antigena i daju antigen-vezujuću specifičnost antitelu.
[0161] Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koji sadrži samo tri CDR specifična za antigen) ima sposobnost da prepozna i vezuje antigen, iako sa nižim afinitetom nego celokupno vezujuće mesto.
[0162] „Jednolančani Fv“, takođe skraćeno kao „sFv“ ili „scFv“, su fragmenti antitela koji sadrže VH i VL domene antitela povezane u jedan polipeptidni lanac. Poželjno, sFv polipeptid dodatno sadrži polipeptidni linker između V<H>i V<L>domena koji omogućava da sFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregledni prikaz sFv, videti Pluckthun u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.
[0163] Termin „dijatela“ označava male fragmente antitela koji su pripremljeni konstruisanjem sFv fragmenata (videti prethodni paragraf) sa kratkim linkerima (oko 5-10 ostataka) između V<H>i V<L>domena tako da se postiže interlančano, ali ne i intralančano sparivanje V domena, što rezultuje bivalentnim fragmentom, tj. fragmentom koji ima dva antigen-vezujuća mesta. Bispecifična dijatela su heterodimeri dva „ukrštena“ sFv fragmenta u kojima su VH i VL domeni dva antitela prisutni na različitim polipeptidnim lancima. Dijatela
[0166] 1
[0167] su detaljnije opisana, na primer, u EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 90:6444-6448 (1993).
[0168] „Humanizovani“ oblici ne-humanih (npr. glodarskih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu koja je izvedena iz ne-humanog antitela. Uglavnom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primaoca) u kojima su ostaci iz hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima iz hipervarijabilnog regiona nehumane vrste (donorsko antitelo) kao što su miš, pacov, zec ili ne-humani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet, i sposobnost antitela. U nekim slučajevima, ostaci regiona okvira (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ne-humanim ostacima.
[0169] Štaviše, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaoca ili u antitelu donora. Ove modifikacije se vrše radi dodatnog usavršavanja performansi antitela. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati suštinski sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima ne-humanog imunoglobulina i svi ili suštinski svi FR su oni iz sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će opciono takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onog iz humanog imunoglobulina. Za više detalja, videti Jones et al., Nature 321:522‑525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323‑329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593‑596 (1992).
[0170] „Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence“ ili „homologija“ u odnosu na polipeptidne i sekvence antitela koje su ovde identifikovane definiše se kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u polipeptidu sa kojim se upoređuje, posle poravnanja sekvenci uzimajući u obzir sve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnanje u svrhu određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su unutar znanja osobe sa iskustvom u struci, na primer, upotrebom javno dostupnog računarskog softvera kao što su BLAST, BLAST‑2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Osobe sa iskustvom u struci mogu odrediti odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja duž cele dužine sekvenci koje se upoređuju. Međutim, za potrebe ovde, vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence generišu se upotrebom računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN‑2. Kompanija Genentech, Inc. je autor računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN‑2, a izvorni kôd je podnet sa korisničkom dokumentacijom u Kancelariji za autorska prava S.A.D., Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod brojem S.A.D. registracije autorskih prava TXU510087. Program ALIGN‑2 je javno dostupan preko
[0173] 2
[0174] kompanije Genentech, Inc., South San Francisco, California. Program ALIGN‑2 treba da bude kompajliran za upotrebu na UNIX operativnom sistemu, poželjno digitalnom UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci podešava program ALIGN‑2 i oni ne variraju.
[0175] Termini „Fc receptor“ ili „FcR“ se upotrebljavaju za opisivanje receptora koji se vezuje za Fc region antitela. FcR, kao što je ovde opisano, može biti onaj koji se vezuje za IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore FcγRI, FcγRII, i FcγRIII podklasa, uključujući alelne varijante i alternativno splajsovane oblike ovih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA („aktivirajući receptor“) i FcγRIIB („inhibitorni receptor“), koji imaju slične aminokiselinske sekvence koje se prvenstveno razlikuju u svojim citoplazmatskim domenima. Aktivirajući receptor FcγRIIA sadrži imunoreceptor koji ima motiv aktivacije zasnovan na tirozinu (ITAM) u svom citoplazmatskom domenu. Inhibitorni receptor FcγRIIB sadrži imunoreceptor koji ima motiv inhibicije zasnovan na tirozinu (ITIM) u svom citoplazmatskom domenu (videti pregledni rad M. Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203‑234 (1997)). Termin uključuje alotipove, kao što su alotipovi FcγRIIIA: FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIIA‑Val158, FcγRIIA-R131 i/ili FcγRIIA-H131. FcR su pregledno prikazani u Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457‑92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25‑34 (1994); i de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330‑41 (1995). Drugi FcR, uključujući i one koji će biti identifikovani u budućnosti, obuhvaćeni su terminom „FcR“ ovde. Termin takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenos majčinih IgG na fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
[0176] Termin „FcRn“ označava neonatalni Fc receptor (FcRn). FcRn je strukturno sličan glavnom kompleksu histokompatibilnosti (MHC) i sastoji se od α-lanca nekovalentno vezanog za β2-mikroglobulin. Višestruke funkcije neonatalnog Fc receptora FcRn pregledno su prikazane u Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739‑766. FcRn igra ulogu u pasivnoj isporuci imunoglobulina IgG od majke do mladunca i regulaciji nivoa serumskog IgG. FcRn može delovati kao receptor za spasavanje, vezujući i transportujući pinocitozirane IgG u intaktnom obliku kako unutar tako i kroz ćelije, i spasavajući ih od podrazumevanog puta degradacije.
[0177] „CH1 domen“ Fc regiona humanog IgG (takođe se označava kao „C1“ domena „H1“) uobičajeno se proteže od oko aminokiseline 118 do oko aminokiseline 215 (EU sistem numeracije).
[0178] [0058] „Region zgloba“ se generalno definiše kao deo koji se proteže od Glu216 do Pro230 humanog IgG1 (Burton, Molec. Immunol.22:161‑206 (1985)). Regioni zgloba drugih izotipova IgG mogu se poravnati sa sekvencom IgG1 postavljanjem na iste pozicije prvog i poslednjeg cisteinskog ostatka koji formiraju S-S veze između teških lanaca.
[0179] „Donji region zgloba“ Fc regiona se normalno definiše kao niz ostataka neposredno C-terminusno do regiona zgloba, tj. ostaci 233 do 239 Fc regiona. U prethodnim objavama, vezivanje FcR je generalno pripisivano aminokiselinskim ostacima u donjem regionu zgloba Fc regiona IgG.
[0180] „CH2 domen“ Fc regiona humanog IgG (takođe se označava kao „C2“ domena „H2“) uobičajeno se proteže od oko aminokiseline 231 do oko aminokiseline 340. CH2 domen je jedinstven po tome što nije usko sparen sa drugim domenom. Umesto toga, dva N-povezana razgranata ugljenohidratna lanca postavljena su između dva CH2 domena intaktnog nativnog IgG molekula. Pretpostavlja se da ugljeni hidrat može da obezbedi zamenu za domen-domen sparivanje i da pomogne u stabilizaciji CH2 domena. Burton, Molec Immunol. 22:161‑206 (1985).
[0181] „CH3 domen“ (takođe se označava kao „C2“ ili „H3“ domen) sadrži niz ostataka C-terminusno do CH2 domena u Fc regionu (tj. od oko aminokiselinskog ostatka 341 do C-terminusnog kraja sekvence antitela, tipično na aminokiselinskom ostatku 446 ili 447 iz IgG).
[0182] „Funkcionalni Fc region“ poseduje „efektorsku funkciju“ Fc regiona nativne sekvence. Primeri „efektorskih funkcija“ uključuju vezivanje C1q; citotoksičnost zavisnu od komplementa; vezivanje Fc receptora; ćelijama posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; smanjenje ekspresije receptora na površini ćelija (npr. B ćelijski receptor; BCR), itd. Takve efektorske funkcije generalno zahtevaju da Fc region bude kombinovan sa vezujućim domenom (npr. varijabilnim domenom antitela) i mogu se proceniti upotrebom različitih testova kao što je ovde objavljeno, na primer.
[0183] „C1q“ je polipeptid koji uključuje vezujuće mesto za Fc region imunoglobulina. C1q zajedno sa dve serinske proteaze, C1r i C1s, formira kompleks C1, prvu komponentu puta citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC). Humani C1q se može komercijalno kupiti, npr. od Quidel, San Diego, CA.
[0184] Termin „vezujući domen“ označava region polipeptida koji se vezuje za drugi molekul. U slučaju FcR, vezujući domen može da sadrži deo njegovog polipeptidnog lanca (npr. njegov alfa lanac) koji je odgovoran za vezivanje Fc regiona. Jedan koristan vezujući domen je vanćelijski domen alfa lanca FcR.
[0185] [0065] Antitelo sa varijantnim IgG Fc sa „izmenjenim“ afinitetom vezivanja za FcR ili aktivnošću ADCC je ono koje ima bilo poboljšanu ili smanjenu aktivnost vezivanja za FcR (npr. FcγR ili FcRn) i/ili aktivnost ADCC u poređenju sa roditeljskim polipeptidom ili sa polipeptidom koji sadrži Fc region nativne sekvence. Varijantni Fc koji „pokazuje povećano vezivanje“ za FcR, vezuje se za najmanje jedan FcR sa većim afinitetom (npr. nižom vrednošću prividne Kd ili IC50) nego roditeljski polipeptid ili nativna sekvenca IgG Fc. Poboljšanje vezivanja u poređenju sa roditeljskim polipeptidom može biti oko 3-struko, poželjno oko 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200, do 500-struko, ili oko 25% do 1000% poboljšanja vezivanja. Varijanta polipeptida koja „pokazuje smanjeno vezivanje“ za FcR, vezuje se za najmanje jedan FcR sa nižim afinitetom (npr. višom prividnom Kd ili višom vrednošću IC50) nego roditeljski polipeptid. Smanjenje vezivanja u poređenju sa roditeljskim polipeptidom može biti oko 40% ili više smanjenja vezivanja.
[0186] „Ćelijama posredovana citotoksičnost zavisna od antitela“ ili „ADCC“ označava oblik citotoksičnosti u kom sekretovani Ig koji je vezan za Fc receptore (FcR) koji su prisutni na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili, i makrofagi) omogućavaju ovim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vežu za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i potom ubiju ciljnu ćeliju citotoksinima. Antitela „naoružavaju“ citotoksične ćelije i apsolutno su neophodna za takvo ubijanje. Primarne ćelije za posredovanje u ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama sažeta je u Tabeli 3 na strani 464 naučnog rada Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457‑92 (1991). Kako bi se procenila aktivnost ADCC molekula od interesa, može se izvesti in vitro ADCC test, kao što je onaj koji je opisan u S.A.D. patentu br. 5,500,362 ili 5,821,337 ili u primerima koji su navedeni u nastavku. Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononukleusne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, aktivnost ADCC molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr. na životinjskom modelu kao što je onaj koji je objavljen u Clynes et al. PNAS (USA) 95:652‑656 (1998).
[0187] Polipeptid koji sadrži varijantni Fc region koji „pokazuje povećanu ADCC“ ili koji posreduje u ćelijama posredovanoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) u prisustvu humanih efektorskih ćelija efikasnije od polipeptida koji ima IgG Fc divljeg tipa ili roditeljski polipeptid je onaj koji je in vitro ili in vivo znatno efikasniji u posredovanju u ADCC, kada su količine polipeptida sa varijantnim Fc regionom i polipeptida sa Fc regionom divljeg tipa (ili roditeljskog polipeptida) u testu suštinski iste. Generalno, takve varijante će biti identifikovane upotrebom bilo kog in vitro ADCC testa koji je poznat u struci, kao što su testovi ili postupci za određivanje aktivnosti ADCC, npr. u životinjskom modelu itd. Poželjna varijanta može biti od oko 5-struko do oko 100-struko, npr. od oko 25 do oko 50-struko, efikasnija u posredovanju u ADCC od Fc divljeg tipa (ili roditeljskog polipeptida).
[0190] 2
[0191] „Citotoksičnost zavisna od komplementa“ ili
označava lizu ciljne ćelije u prisustvu komplementa. Aktivacija klasičnog puta komplementa pokreće se vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) za antitela (odgovarajuće podklase) koja su vezana za njihov srodni antigen. Kako bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvesti CDC test, npr. kao što je opisano u Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Varijante polipeptida sa izmenjenim aminokiselinskim sekvencama Fc regiona i povećanom ili smanjenom sposobnošću vezivanja C1q opisane su u S.A.D. patentu br. 6,194,551B1 i WO99/51642. Videti, takođe, Idusogie et al. J. Immunol.164: 4178‑4184 (2000).
[0192] „Efikasna količina“ anti-PD‑1 antitela (ili njegovog fragmenta) ili kompozicije, kao što je ovde objavljeno, je količina koja je dovoljna za sprovođenje specifično navedene svrhe. „Efikasna količina“ se može odrediti empirijski i poznatim postupcima koji se odnose na navedenu svrhu. Termin „terapijski efikasna količina“ označava količinu anti-PD‑1 antitela (ili njegovog fragmenta) ili kompozicije, kao što je ovde objavljeno, efikasnu za „lečenje“ bolesti ili poremećaja kod sisara (tj. pacijenta). U slučaju kancera, terapijski efikasna količina anti-PD‑1 antitela (ili njegovog fragmenta) ili kompozicije, kao što je ovde objavljeno, može redukovati broj ćelija kancera; redukovati veličinu ili težinu tumora; inhibirati (tj. usporiti do izvesne mere i poželjno zaustaviti) infiltraciju ćelija kancera u periferne organe; inhibirati (tj. usporiti do izvesne mere i poželjno zaustaviti) metastaze tumora; inhibirati, do izvesne mere, rast tumora; i/ili ublažiti do izvesne mere jedan ili više simptoma koji su povezani sa kancerom. U meri u kojoj anti-PD‑1 antitelo (ili njegov fragment) ili kompozicija, kao što je ovde objavljeno, mogu sprečiti rast i/ili ubiti postojeće ćelije kancera, mogu biti citostatski i/ili citotoksični. Terapijski efikasna količina može biti količina koja inhibira rast. Terapijski efikasna količina može biti količina koja produžava preživljavanje pacijenta. Terapijski efikasna količina može biti količina koja poboljšava preživljavanje pacijenta bez progresije bolesti.
[0193] „Količina koja inhibira rast“ anti-PD‑1 antitela (ili njegovog fragmenta) ili kompozicije, kao što je ovde objavljeno, iz ovog pronalaska, je količina koja je sposobna da inhibira rast ćelije, naročito tumora, npr. ćelije kancera, bilo in vitro ili in vivo. „Količina koja inhibira rast“ antitela iz ovog pronalaska u svrhu inhibiranja rasta neoplastičnih ćelija može se odrediti empirijski i poznatim postupcima ili primerima koji su ovde obezbeđeni.
[0194] „Citotoksična količina“ anti-PD‑1 antitela iz ovog pronalaska je količina koja je sposobna da uzrokuje uništavanje ćelije, naročito tumora, npr. ćelije kancera, bilo in vitro ili in vivo. „Citotoksična količina“ anti-PD‑1 antitela iz ovog pronalaska u svrhu inhibiranja rasta neoplastičnih ćelija može se odrediti empirijski i postupcima koji su poznati u struci.
[0195] „Količina koja inhibira rast“ anti-PD‑1 antitela iz ovog pronalaska je količina koja je sposobna da inhibira rast ćelije, naročito tumora, npr. ćelije kancera, bilo in vitro ili in vivo. „Količina koja inhibira rast“ anti-PD‑1 antitela iz ovog pronalaska u svrhu inhibiranja rasta neoplastičnih ćelija može se odrediti empirijski i poznatim postupcima ili primerima koji su ovde obezbeđeni.
[0196] Kao što se ovde upotrebljava, pod „farmaceutski prihvatljivim“ ili „farmakološki kompatibilnim“ podrazumeva se materijal koji nije biološki ili na drugi način nepoželjan, npr. materijal se može inkorporisati u farmaceutsku kompoziciju koja se primenjuje pacijentu bez uzrokovanja bilo kakvih značajnih nepoželjnih bioloških efekata ili interagovanja na štetan način sa bilo kojom drugom komponentom iz kompozicije u kojoj je sadržan. Farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijensi su poželjno ispunili potrebne standarde toksikoloških i proizvodnih ispitivanja i/ili su uključeni u Vodič za neaktivne sastojke koji je pripremila Američka agencija za hranu i lekove.
[0197] Termin „detektovanje“ je namenjen da uključi određivanje prisustva ili odsustva supstance ili kvantifikaciju količine supstance (kao što je PD‑1). Termin stoga označava upotrebu materijala, kompozicija, i postupaka iz predmetne objave za kvalitativna i kvantitativna određivanja. Generalno, posebna tehnika koja se upotrebljava za detekciju nije kritična za praksu iz objave.
[0198] Na primer, „detektovanje“ može da uključuje: posmatranje prisustva ili odsustva PD‑1 genskog proizvoda, molekula iRNK, ili PD‑1 polipeptida; promenu nivoa PD‑1 polipeptida ili količine koja je vezana za cilj; promenu biološke funkcije/aktivnosti PD‑1 polipeptida. „Detektovanje“ može da uključuje detektovanje nivoa PD‑1 divljeg tipa (npr. nivoa iRNK ili polipeptida). Detektovanje može da uključuje kvantifikaciju promene (povećanja ili smanjenja) bilo koje vrednosti između 10% i 90%, ili bilo koje vrednosti između 30% i 60%, ili preko 100%, u poređenju sa kontrolom. Detektovanje može da uključuje kvantifikaciju promene bilo koje vrednosti između 2-struko do 10-struko, uključujući i te brojeve, ili više, npr. 100-struko.
[0199] Reč „obeleživač“, kada se ovde upotrebljava, označava detektabilno jedinjenje ili kompoziciju koje su direktno ili indirektno konjugovane za antitelo. Obeleživač može sam po sebi biti detektabilan (npr. radioizotopski obeleživači ili fluorescentni obeleživači) ili, u slučaju enzimskog obeleživača, može katalizovati hemijsku izmenu jedinjenja ili kompozicije supstrata koja je detektabilna.
[0200] Pozivanje na „oko“ vrednosti ili parametra ovde označava uobičajeni opseg greške za odgovarajuću vrednost koja je lako poznata osobi sa iskustvom u ovoj tehničkoj oblasti.
[0203] 2
[0204] Pozivanje na „oko“ vrednosti ili parametra ovde uključuje (i opisuje) aspekte koji su usmereni na tu vrednost ili parametar kao takav. Na primer, opis koji se odnosi na „oko X“ uključuje opis „X“.
[0205] Podrazumeva se da primeri izvođenja pronalaska koji su ovde opisani uključuju „koji sadrži“, „koji se sastoji“ i „koji se suštinski sastoji od“ primere izvođenja.
[0207] Anti-PD‑1 antitela
[0209] Predmetni pronalazak je zasnovan na identifikaciji novih antitela koja sa vezuju za PD-1 receptor (PD-1). Anti-PD-1 antitela mogu se upotrebljavati u različitim terapijskim i dijagnostičkim postupcima. Na primer, anti-PD-1 antitela mogu se upotrebljavati sama ili u kombinaciji sa drugim agensima u lečenju bolesti koju karakteriše abnormalna ekspresija PD-1 ili abnormalna aktivnost PD-1, uključujući, npr. melanom, NSCLC, kancer glave i vrata, urotelni kancer, kancer dojke (npr. trostruko negativni kancer dojke, TNBC), kancer želuca, klasični Hočkinov limfom (cHL), ne-Hočkinov limfom, primarni medijastinalni B-ćelijski limfom (NHL PMBCL), mezoteliom, kancer jajnika, kancer pluća (npr. sitnoćelijski kancer pluća), kancer jednjaka, nazofaringealni karcinom (NPC), kancer bilijarnog trakta, kolorektalni kancer, kancer grlića materice, kancer štitne žlezde. Antitela koja su ovde opisana mogu se takođe upotrebljavati za detektovanje PD‑1 proteina kod pacijenata ili uzoraka pacijenata primenom anti-PD‑1 antitela pacijentima i detektovanjem anti-PD‑1 antitela koje je vezano za PD‑1 protein u uzorku pacijenta (npr. in vivo ili ex vivo) ili dovođenjem u kontakt anti-PD‑1 antitela sa uzorcima pacijenata i kvalitativnim ili kvantitativnim detektovanjem anti-PD‑1 antitela koje je vezano za PD‑1 protein.
[0210] Protein programirane ćelijske smrti 1 (takođe poznat kao PD‑1 i CD279 (klaster diferencijacije 279)), je protein koji je kod ljudi kodiran genom PDCD1. PD‑1 je receptor na površini ćelija koji pripada superporodici imunoglobulina i eksprimira se na T ćelijama i pro-B ćelijama. PD‑1 vezuje dva liganda, PD-L1 i PD-L2. PD‑1, funkcionišući kao imunska kontrolna tačka, igra važnu ulogu u smanjenju regulacije imunskog sistema sprečavanjem aktivacije T ćelija, što zauzvrat redukuje autoimunost i promoviše samotoleranciju. Inhibitorni efekat PD‑1 se postiže preko dvostrukog mehanizma, promovisanja apoptoze (programirane ćelijske smrti) u antigen-specifičnim T ćelijama u limfnim čvorovima, uz istovremeno redukovanje apoptoze u regulatornim T ćelijama (supresorskim T ćelijama).
[0211] Anti-PD‑1 antitelo je antitelo koje se vezuje za PD‑1 sa dovoljnim afinitetom i specifičnošću. Poželjno, anti-PD‑1 antitelo koje je ovde opisano (ili njegov antigen-vezujući
[0214] 2
[0215] fragment) može se upotrebljavati kao terapijski agens u ciljnom delovanju i interferiranju sa bolestima ili stanjima u kojima je uključena aktivnost PD‑1. Anti-PD‑1 antitelo se uobičajeno neće vezivati za drugu superporodicu imunoglobulina. Poželjno, anti-PD‑1 antitelo je rekombinantno humanizovano anti-PD‑1 monoklonsko antitelo.
[0216] U skladu sa predmetnim pronalaskom, anti-PD-1 antitelo sadrži CDR, varijabilni region teškog lanca, i/ili varijabilni region lakog lanca kao što je definisano u patentnim zahtevima.
[0217] U određenim primerima izvođenja, anti-PD-1 antitelo iz pronalaska je himerno anti-PD-1 antitelo c1G4 i/ili humanizovano anti-PD-1 h1G4, koje sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (LC) koja sadrži (1) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KASQDVTTAVA (SEQ ID NO:9); (2) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu WASTRHT (SEQ ID NO:10); i (3) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QQHYTIPWT (SEQ ID NO:11), i sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (HC) koja sadrži (1) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12); (2) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13); i (3) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VSYYYGIDF (SEQ ID NO:14).
[0218] Aminokiselinske i nukleotidne sekvence pune dužine lakih i teških lanaca iz c1G4 i h1G4 i njihove CDR sekvence obezbeđene su u Listi sekvenci u nastavku.
[0219] Pronalaskom je takođe obezbeđeno anti-PD-1 antitelo kao što je definisano u patentnim zahtevima, koje sadrži sekvencu teškog lanca koja je izneta u (SEQ ID NO:4) i sekvencu lakog lanca koja je izneta u (SEQ ID NO:2) za upotrebu kao što je definisano u patentnim zahtevima.
[0220] Pronalaskom je takođe obezbeđeno humanizovano anti-PD-1 antitelo kao što je definisano u patentnim zahtevima, koje sadrži sekvencu teškog lanca koja je izneta u (SEQ ID NO:8) i sekvencu lakog lanca koja je izneta u SEQ ID NO:6) za upotrebu kao što je definisano u patentnim zahtevima.
[0221] Predmetna objava takođe opisuje antitela sazrelog afiniteta prema humanizovanom h1G4 anti-PD-1 antitelu. Ovde je opisano sazrelo anti-PD-1 antitelo (npr. anti-PD-1 antitelo, 33B) koje sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (LC) koja sadrži (1) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KASTDVTTAVA (SEQ ID NO:15); (2) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu WASLRHT (SEQ ID NO:16); i (3) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QQHYGIPWT (SEQ ID NO:17), i sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (HC) koja sadrži (1) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu FRFSNYGMS (SEQ ID NO:18); (2) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
[0224] 2
[0225] TISGGGSNAY (SEQ ID NO:19); i (3) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu TSYYYGIDF (SEQ ID NO:20).
[0226] Ovde je opisano sazrelo anti-PD‑1 antitelo (npr. anti-PD‑1 antitelo, 66E) koje sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (LC) koja sadrži (1) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KAKQDVTTAVA (SEQ ID NO:21); (2) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu WASTRHT (SEQ ID NO:10); i (3) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QQHYWIPWT (SEQ ID NO:22), i sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (HC) koja sadrži (1) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12); (2) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13); i (3) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VSYYYGIDL (SEQ ID NO:23).
[0227] Ovde je opisano sazrelo anti-PD‑1 antitelo (npr. anti-PD‑1 antitelo, 711D) koje sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (LC) koja sadrži (1) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KASQDVTNAVA (SEQ ID NO:24); (2) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu WASTRHT (SEQ ID NO:10); i (3) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QQHYTIPWT (SEQ ID NO:11), i sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (HC) koja sadrži (1) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu FTFSNYGMS (SEQ ID NO:12); (2) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu TISGGGSNIY (SEQ ID NO:13); i (3) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SSYYYGIDL (SEQ ID NO:25).
[0228] Aminokiselinska(e) supstitucija(e) može(gu) biti konzervativna(e) aminokiselinska(e) supstitucija(e). Aminokiselinske supstitucije ne moraju suštinski redukovati sposobnost antitela da se vezuje za antigen. Na primer, mogu se napraviti konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što je ovde obezbeđeno) koje ne redukuju suštinski afinitet vezivanja za PD‑1. Afinitet vezivanja varijanti anti-PD‑1 antitela može se proceniti upotrebom postupaka koji su opisani u Primerima u nastavku.
[0229] Konzervativne supstitucije su pokazane u Tabeli 3 pod naslovom „konzervativne supstitucije“. Značajnije promene obezbeđene su u Tabeli 3 pod naslovom „primeri supstitucija“, i kao što je dodatno opisano u nastavku u vezi sa klasama bočnih lanaca aminokiselina. Aminokiselinske supstitucije mogu se introdukovati u antitelo od interesa, a proizvodi se pregledati na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje za PD‑1, smanjena imunogenost, ili poboljšana ADCC ili CDC.
[0232] 2
[0233] TABELA 3: KONZERVATIVNE SUPSTITUCIJE
[0235]
[0238] Nekonzervativne supstitucije podrazumevaće zamenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu. Primer supstitucione varijante je antitelo sazrelog afiniteta, koje se može pogodno generisati, npr. upotrebom tehnika sazrevanja afiniteta zasnovanih na prikazivanju faga, kao što su ona koja su ovde opisana. Ukratko, jedan ili više ostataka CDR su mutirani i varijantna antitela se prikazuju na fagu i pregledaju se na određenu biološku aktivnost (npr.
[0241] 2
[0242] afinitet vezivanja). Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR, npr. kako bi se poboljšao afinitet antitela. Takve izmene mogu se napraviti u HVR „vrućim tačkama“, tj. ostacima koji su kodirani kodonima koji podležu mutacijama sa visokom učestalošću tokom postupka somatskog sazrevanja (videti npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179‑196 (2008)), i/ili SDR (a-CDR), pri čemu se rezultujuća varijanta VH ili VL testira na afinitet vezivanja. Sazrevanje afiniteta konstruisanjem i ponovnim odabirom iz sekundarnih biblioteka opisano je, npr. u Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).
[0243] U nekim objavama sazrevanja afiniteta, raznovrsnost se introdukuje u varijabilne gene koji su odabrani za sazrevanje bilo kojim od različitih postupaka (npr. greškama sklona PCR, mešanje lanca, ili oligonukleotidima usmerena mutageneza). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pregleda kako bi se identifikovale sve varijante antitela sa željenim afinitetom. Sledeći postupak za introdukovanje raznovrsnosti uključuje HVR-usmerene pristupe, u kojima se nekoliko HVR ostataka (npr. 4‑6 ostataka istovremeno) randomizuje. HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu se specifično identifikovati, npr. upotrebom mutageneze ili modeliranja skeniranjem alanina. Posebno se često ciljaju CDR-H3 i CDR-L3.
[0244] Kao što je ovde opisano, anti-PD-1 antitelo može da sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (V<L>) koja sadrži (1) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9, 21 i 24; (2) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10 ili 16; (3) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 11, 17, 22, i sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (V<H>) koja sadrži (1) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 ili 18; (2) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 ili 19; i (3) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 20, 23, i 25.
[0245] Varijabilni domeni teškog i lakog lanca mogu se kombinovati u svim mogućim parnim kombinacijama kako bi se generisala brojna anti-PD‑1 antitela.
[0246] Anti-PD‑1 antitelu može nedostajati motiv N-glikozilacije u varijabilnom regionu teškog lanca ili lakog lanca što može prouzrokovati razlike unutar serije antitela što rezultuje izmenjenom funkcijom, imunogenošću, ili stabilnošću. Postupci analize glikozilacije antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, npr. hromatografiju (kao što je katjonska izmenjivačka hromatografija (CEX) ili tečna hromatografija), masenu spektrometriju (kao što je masena spektrometrija sa elektrosprej jonizacijom), i kapilarnu elektroforezu - natrijum dodecil sulfat.
[0247] Takvi postupci su opisani u, npr. Jung et al. (2011) Curr Op Biotechnol. 22(6):858-67; Cummings RD, Etzler ME. Antibodies and Lectins in Glycan Analysis. U: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 45; Mulloy B, Hart GW, Stanley P. Structural Analysis of Glycans. U: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 47; Leymarie, et al. (2012) Anal Chem. 84(7): 3040-3048; Fernandez (2005) European Biopharmaceutical Review. pp 106-110; i Raju, T. (2013) Methods Mol Biol.988: 169-180.
[0248] Anti-PD‑1 antitelo može imati jači afinitet vezivanja za PD-1 nego što ima za homolog tog PD-1. Normalno, anti-PD‑1 antitelo se „specifično vezuje“ za PD-1 (tj. ima vrednost afiniteta vezivanja (Kd) ne veću od oko 1 x 10<-7>M, poželjno ne veću od oko 1 x 10<-8>i najpoželjnije ne veću od oko 1 x 10<-9>M), ali ima afinitet vezivanja za člana PD-1 porodice koji je najmanje oko 50-struko, ili najmanje oko 500-struko, ili najmanje oko 1000-struko slabiji od njegovog afiniteta vezivanja za PD-1. Anti-PD‑1 antitelo koje se specifično vezuje za PD-1 može biti bilo koje od različitih tipova antitela kao što je prethodno definisano, ali poželjno je humanizovano ili humano antitelo.
[0249] Stepen vezivanja anti-PD‑1 antitela za protein koji nije cilj može biti manji od oko 10% vezivanja antitela za PD‑1 kao što je određeno pomoću postupaka koji su poznati u struci, kao što su ELISA, fluorescencijom aktivirano sortiranje ćelija (FACS), ili radioimunoprecipitacija (RIA). Specifično vezivanje može se izmeriti, na primer, određivanjem vezivanja molekula u poređenju sa vezivanjem kontrolnog molekula, koji je generalno molekul slične strukture koji nema aktivnost vezivanja. Na primer, specifično vezivanje može se odrediti kompeticijom sa kontrolnim molekulom koji je sličan cilju, na primer, pomoću viška neobeleženog cilja. U ovom slučaju, specifično vezivanje je naznačeno ukoliko je vezivanje obeleženog cilja za probu kompetitivno inhibirano viškom neobeleženog cilja. Termin „specifično vezivanje“ ili „specifično se vezuje za“ ili je „specifično za“ određeni polipeptid ili epitop na određenom polipeptidnom cilju, kao što se ovde upotrebljava, može se pokazati, na primer, molekulom koji ima Kd za cilj od najmanje oko 10 M, alternativno najmanje oko 10 M, alternativno najmanje oko 10<‑6>M, alternativno najmanje oko 10<‑7>M, alternativno najmanje oko 10<‑8>M, alternativno najmanje oko 10<‑9>M, alternativno najmanje oko 10<‑10>M, alternativno najmanje oko 10<‑11>M, alternativno najmanje oko 10<‑12>M, ili više. Termin „specifično vezivanje“ može označavati vezivanje gde se molekul vezuje za
[0252] 1
[0253] određeni polipeptid ili epitop na određenom polipeptidu bez suštinskog vezivanja za bilo koji drugi polipeptid ili epitop polipeptida.
[0254] Ćelijama posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) je mehanizam delovanja terapijskih antitela prema ćelijama tumora. ADCC je ćelijama posredovana imunska odbrana pri čemu efektorska ćelija imunskog sistema aktivno lizira ciljnu ćeliju (npr. ćeliju kancera), čiji su membranski površinski antigeni vezani specifičnim antitelima (npr. kao što je anti-PD-1 antitelo koje je ovde opisano). Anti-PD-1 antitelo može pokazivati sličnu efektorsku funkciju ćelijama posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) kao OPDIVO<®>ili Nivolumab, kao što je pokazano, npr. testovima koji su opisani u Primeru.
[0255] Na primer, aktivnost efektorske funkcije ADCC anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može biti najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, najmanje oko 100%, ili više od 100% (npr. oko 105%, oko 106%, oko 107%, oko 108%, oko 109%, oko 110%, oko 111%, oko 112%, oko 113%, oko 114%, oko 115%, oko 116%, oko 117%, oko 118%, oko 119%, oko 120%, oko 121%, oko 122%, oko 123%, oko 124%, oko 125%, ili oko 130%) aktivnosti efektorske funkcije ADCC OPDIVO<®>(Nivolumab), uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti.
[0256] Anti-PD‑1 antitelo može pokazati sličan afinitet vezivanja za PD-1 kao OPDIVO<®>. Vezivanje za PD-1 može se demonstrirati ELISA testom, kao što je opisano u Primerima. Na primer, afinitet vezivanja anti-PD‑1 za PD‑1 je oko 1%, oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, oko 100%, ili više od 100% veći (npr. oko 105%, oko 106%, oko 107%, oko 108%, oko 109%, oko 110%, oko 111%, oko 112%, oko 113%, oko 114%, oko 115%, oko 116%, oko 117%, oko 118%, oko 119%, oko 120%, oko 121%, oko 122%, oko 123%, oko 124%, oko 125%, ili više od oko 125%) od afiniteta vezivanja OPDIVO<®>(Nivolumab) za PD‑1.
[0257] Anti-PD‑1 antitelo može da se veže za humani PD-1 sa Kd između oko 0,1 pM i 200 pM (0,2 nM), npr. oko 0,1 pM, oko 0,25 pM, oko 0,5 pM, oko 0,75 pM, oko 1 pM, oko 5 pM, oko 10 pM, oko 20 pM, oko 30 pM, oko 40 pM, oko 50 pM, oko 60 pM, oko 70 pM, oko 80 pM, oko 90 pM, oko 100 pM, oko 110 pM, oko 120 pM, oko 130 pM, oko 140 pM, oko 150 pM, oko 160 pM, oko 170 pM, oko 180 pM, oko 190 pM, ili više od oko 190 pM, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Afinitet vezivanja anti-PD‑1 antitela za PD‑1 može biti oko 1%, oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko
[0260] 2
[0261] 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, oko 100%, ili više od oko 100% veći (npr. oko 105%, oko 110%, oko 120%, ili oko 130%) veći od afiniteta vezivanja OPDIVO<®>(Nivolumab) za PD‑1. Afinitet vezivanja anti-PD‑1 za PD‑1 može biti oko 1,1-struko, oko 1,2-struko, oko 1,3-struko, oko 1,4-struko, oko 1,5-struko, oko 1,6-struko, oko 1,7-struko, oko 1,8-struko, oko 1,9-struko, oko 2-struko, oko 2,25-struko, oko 2,5-struko, oko 2,75-struko, oko 3-struko, oko 3,25-struko, oko 3,5-struko, oko 3,75-struko, oko 4-struko, oko 4,25-struko, oko 4,5-struko, oko 4,75-struko, ili više od oko 4,75-struko veći od afiniteta vezivanja OPDIVO<®>(Nivolumab) za PD‑1, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti.
[0262] Anti-PD-1 antitela koja su ovde opisana mogu imati produženi poluživot in vivo u poređenju sa OPDIVO<®>. Poluživot in vivo anti-PD-1 antitela koje je ovde opisano ne sme biti kraći od poluživota OPDIVO<®>in vivo.
[0263] Anti-PD‑1 antitela koja su ovde opisana mogu pokazivati farmakokinetička svojstva koja su slična onima od OPDIVO® (Nivolumab) ili njegovog biosimilarnog leka. Anti-PD‑1 antitela koja su ovde opisana mogu pokazivati AUC (površinu ispod krive) koja je oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, ili veća od 95% (kao što je oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99%) profila koncentracije u serumu u odnosu na vreme OPDIVO<®>(Nivolumab) ili njegovog biosimilarnog leka, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti.
[0264] U kontekstu predmetnog pronalaska, antitelo sadrži sekvencu Fc humanog IgG4. Sekvenca Fc je mogla biti izmenjena ili na drugi način promenjena tako da joj nedostaje efektorska funkcija ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), često povezana sa njihovim vezivanjem za Fc receptore (FcR). Postoji mnogo primera promena ili mutacija sekvenci Fc koje mogu izmeniti efektorsku funkciju. Na primer, WO 00/42072 i Shields et al. J Biol. Chem. 9(2): 6591‑6604 (2001) opisuju varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. Antitelo može biti u obliku Fab, Fab’, F(ab)’2, jednolančanog Fv (scFv), Fv fragmenta; dijatela i linearnog antitela. Takođe, antitelo može biti multispecifično antitelo koje se vezuje za PD‑1, ali se takođe vezuje za jedan ili više drugih ciljeva i inhibira njihovu funkciju. Antitelo može biti konjugovano za terapijski agens (npr. citotoksični agens, radioizotop i hemioterapijski agens) ili obeleživač za detektovanje PD‑1 u uzorcima pacijenta ili in vivo pomoću snimanja (npr. radioizotop, fluorescentna boja i enzim). Druge modifikacije uključuju konjugaciju toksina za anti-PD‑1 antitela koja su ovde opisana.
[0265] [0106] Takođe se razmatraju molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju anti-PD-1 antitela, ekspresioni vektori koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju anti-PD-1 antitela koja su ovde opisana, i ćelije koje sadrže molekule nukleinske kiseline. Ova antitela se mogu upotrebljavati u terapijama koje su ovde opisane i za detekciju PD-1 proteina u uzorcima pacijenta (npr. putem FACS, imunohistohemije (IHC), ELISA testova) ili kod pacijenata.
[0267] Monoklonska antitela
[0269] Monoklonska antitela mogu se pripremiti, npr. upotrebom postupaka hibridoma, kao što su oni koje su opisali Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975) ili se mogu napraviti postupcima rekombinantne DNK (S.A.D. patent br. 4,816,567) ili se mogu proizvesti postupcima koji su ovde opisani u Primerima u nastavku. U postupku hibridoma, hrčak, miš, ili druga odgovarajuća životinja domaćin se tipično imunizuje sa imunizacionim agensom kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezati za imunizacioni agens. Alternativno, limfociti se mogu imunizovati in vitro.
[0270] Imunizujući agens će tipično uključivati polipeptid ili fuzioni protein proteina od interesa ili kompoziciju koja sadrži protein. Generalno, upotrebljavaju se ili limfociti periferne krvi („PBL“) ukoliko se žele ćelije humanog porekla, ili se upotrebljavaju ćelije slezine ili ćelije limfnih čvorova ukoliko se žele izvori ne-humanih sisara. Limfociti se zatim fuzionišu sa imortalizovanom ćelijskom linijom upotrebom pogodnog agensa za fuziju, kao što je polietilen glikol, kako bi se formirala ćelija hibridoma (Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, New York: Academic Press, 1986, pp.
[0271] 59-103). Imortalizovane ćelijske linije su uobičajeno transformisane ćelije sisara, posebno ćelije mijeloma glodarskog, goveđeg, i humanog porekla. Uobičajeno, koriste se ćelijske linije mijeloma pacova ili miša. Ćelije hibridoma mogu se kultivisati u pogodnom medijumu za kulturu koji poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih, imortalizovanih ćelija. Na primer, ukoliko roditeljskim ćelijama nedostaje enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), medijum za kulturu hibridoma će tipično uključivati hipoksantin, aminopterin, i timidin („HAT medijum“), koje supstance sprečavaju rast ćelija sa nedostatkom HGPRT.
[0272] Poželjne imortalizovane ćelijske linije su one koje se efikasno fuzionišu, podržavaju stabilnu ekspresiju antitela na visokom nivou od strane odabranih ćelija koje proizvode antitela, i osetljive su na medijum kao što je HAT medijum. Poželjnije imortalizovane ćelijske linije su linije murinskog mijeloma, koje se mogu dobiti, na primer, od Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California i American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma takođe su
[0275] 4
[0276] opisane za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al. MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987, pp.51-63).
[0277] Medijum za kulturu u kome se kultivišu ćelije hibridoma može se zatim testirati na prisustvo monoklonskih antitela usmerenih prema polipeptidu. Specifičnost vezivanja monoklonskih antitela koje proizvode ćelije hibridoma može se odrediti imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što su radioimunološki test (RIA) ili enzimski imunoapsorbentni test (ELISA). Takve tehnike i testovi su poznati u struci. Afinitet vezivanja monoklonskog antitela može se, na primer, odrediti Skačard (Scatchard) analizom prema Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
[0278] Pošto se željene ćelije hibridoma identifikuju, klonovi se mogu subklonirati procedurama graničnog razblaženja i uzgajati standardnim postupcima. Goding, supra. Pogodni medijumi za kulturu u ovu svrhu uključuju, na primer, Dulbekov modifikovani Iglov medijum (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) i RPMI-1640 medijum. Alternativno, ćelije hibridoma se mogu uzgajati in vivo kao ascites kod sisara.
[0279] Monoklonska antitela koja sekretuju subklonovi mogu se izolovati ili prečistiti iz medijuma za kulturu ili ascitne tečnosti konvencionalnim procedurama prečišćavanja imunoglobulina kao što su, na primer, protein A-sefaroza, hidroksilapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza, ili afinitetna hromatografija.
[0280] [0113] Monoklonska antitela se takođe mogu napraviti postupcima rekombinantne DNK, kao što su oni koji su opisani u S.A.D. patentu br. 4,816,567. DNK koja kodira monoklonska antitela koja su ovde opisana može se lako izolovati i sekvencirati upotrebom konvencionalnih procedura (npr. upotrebom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance murinskih antitela). Ćelije hibridoma koje su ovde opisane služe kao poželjni izvor takve DNK. Jednom izolovana, DNK se može staviti u ekspresione vektore, koji se zatim transfektuju u ćelije domaćina kao što su COS ćelije simijana, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulin, kako bi se dobila sinteza monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. DNK se takođe može modifikovati, na primer, supstitucijom kodirajuće sekvence za konstantne domene humanog teškog i lakog lanca umesto homologih murinskih sekvenci (S.A.D. patent br.4,816,567; Morrison et al., supra) ili kovalentnim spajanjem cele ili dela kodirajuće sekvence za polipeptid neimunoglobulin sa kodirajućom sekvencom imunoglobulina. Takav polipeptid neimunoglobulin može biti supstituisan konstantnim domenima antitela koje je ovde opisano, ili može biti supstituisan varijabilnim domenima jednog antigen-kombinujućeg mesta antitela koje je ovde opisano kako bi se stvorilo himerno bivalentno antitelo.
[0281] Anti-PD‑1 antitelo koje je ovde opisano može biti eksprimirano u stabilnoj ćelijskoj liniji sisara. Anti-PD‑1 antitelo koje je ovde opisano može biti eksprimirano iz stabilne ćelijske linije sisara pri titru od oko 2,0 grama/litru, oko 2,5 grama/litru, oko 3,0 grama/litru, oko 3,5 grama/litru, oko 4,0 grama/litru, oko 4,5 grama/litru, oko 5,0 grama/litru, oko 5,5 grama/litru, oko 6 grama/litru, oko 6,5 grama/litru, oko 7,0 grama/litru, ili više od oko 7,0 grama/litru, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. U određenim primerima izvođenja, stabilna ćelijska linija sisara iz koje se eksprimira anti-PD‑1 antitelo koje je obezbeđeno pronalaskom je CHO ćelijska linija.
[0282] Antitela mogu biti monovalentna antitela. Postupci za pripremu monovalentnih antitela su poznati u struci. Na primer, jedan postupak uključuje rekombinantnu ekspresiju lakog lanca i modifikovanog teškog lanca imunoglobulina. Teški lanac je generalno skraćen na bilo kojoj tački u Fc regionu kako bi se sprečilo umrežavanje teškog lanca. Alternativno, relevantni cisteinski ostaci su supstituisani sa drugim aminokiselinskim ostatkom ili su deletirani kako bi se sprečilo umrežavanje.
[0283] In vitro postupci su takođe pogodni za pripremu monovalentnih antitela. Digestija antitela kako bi se proizveli njihovi fragmenti, posebno Fab fragmenti, može se obaviti upotrebom, ali ne ograničavajući se na, tehnike koje su poznate u struci.
[0285] Humana i humanizovana antitela
[0287] Antitela mogu biti humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovani oblici nehumanih (npr. murinskih) antitela su himerni imunoglobulini, lanci imunoglobulina, ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab’, F(ab’)<2>ili druge antigen-vezujuće podsekvence antitela) koji tipično sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju humane imunoglobuline (antitelo primaoca) u kojima su ostaci iz CDR primaoca zamenjeni ostacima iz CDR ne-humane vrste (antitelo donora) kao što su miš, pacov, ili zec, koji imaju željenu specifičnost, afinitet, i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci Fv regiona okvira humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ne-humanim ostacima. Humanizovana antitela takođe mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze ni u antitelu primaoca ni u importovanim CDR ili sekvencama regiona okvira. Generalno, humanizovano antitelo može da sadrži suštinski sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju regionima nehumanog imunoglobulina, a svi ili suštinski svi FR regioni su regioni konsenzusne sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će poželjno takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično regiona humanog imunoglobulina. Jones et al. Nature, 321: 522‑525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323‑329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593‑596 (1992).
[0288] Generalno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka koji su introdukovani u njega iz izvora koji nije humani. Ovi ne-humani aminokiselinski ostaci se često označavaju kao „importovani“ ostaci, koji se uobičajeno uzimaju iz „importovanog“ varijabilnog domena. Humanizacija se suštinski može izvesti prateći postupak iz Winter i saradnici (Jones et al. Nature, 321: 522‑525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332: 323‑327 (1988); Verhoeyen et al. Science, 239: 1534‑1536 (1988)), zamenom glodarskih CDR ili CDR sekvenci za odgovarajuće sekvence humanog antitela. U skladu sa tim, takva „humanizovana“ antitela su antitela (S.A.D. patent br. 4,816,567), pri čemu je znatno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućom sekvencom iz nehumane vrste. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki ostaci CDR, a moguće i neki ostaci FR, supstituisani ostacima sa analognih mesta u glodarskim antitelima.
[0289] Kao alternativa humanizaciji, mogu se generisati humana antitela. Na primer, sada je moguće proizvesti transgene životinje (npr. miševe) koje su sposobne, nakon imunizacije, da proizvode pun repertoar humanih antitela u odsustvu proizvodnje endogenih imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena spajajućeg regiona teškog lanca antitela (JH) kod himerne i germinativne linije mutantnih miševa rezultuje potpunom inhibicijom proizvodnje endogenih antitela. Transfer niza gena imunoglobulina humane germinativne linije u takvu germinativnu liniju mutantnih miševa rezultovaće proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja antigena. Videti, npr. Jakobovits et al. PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255‑258 (1993); Bruggemann et al. Year in Immunol., 7:33 (1993); S.A.D. patenti br.5,545,806, 5,569,825, 5,591,669; 5,545,807; i WO 97/17852.
[0290] [0120] Alternativno, humana antitela mogu se napraviti introdukovanjem lokusa humanih imunoglobulina u transgene životinje, npr. miševe kod kojih su geni endogenih imunoglobulina delimično ili potpuno inaktivirani. Nakon izazivanja, uočava se proizvodnja humanih antitela koja su u svim aspektima veoma slična onim koja se vide kod ljudi, uključujući rearanžman gena, asembliranje, i repertoar antitela. Ovaj pristup je opisan, na primer, u S.A.D. patentima br. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016, i Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al. Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).
[0291] Alternativno, tehnologija prikazivanja faga (McCafferty et al., Nature 348:552‑553, 1990) može se upotrebljavati za proizvodnju humanih antitela i fragmenata antitela in vitro, iz repertoara gena varijabilnog (V) domena imunoglobulina iz neimunizovanih donora. U skladu sa ovom tehnikom, sekvence V domena antitela se kloniraju u okviru gena bilo glavnog ili sporednog proteina omotača filamentoznog bakteriofaga, kao što su M13 ili fd, i prikazuju se kao funkcionalni fragmenti antitela na površini čestice faga. Prikazivanje faga može se izvoditi u različitim formatima, npr. kao što je opisano u nastavku u odeljku Primeri ili kao što je pregledno prikazano u, npr. Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564‑571 (1993). Nekoliko izvora segmenata V gena može se upotrebljavati za prikazivanje faga. Clackson et al., Nature, 352:624‑628 (1991) izolovali su raznovrstan niz anti-oksazolon antitela iz male nasumične kombinatorne biblioteke V gena izvedenih iz slezina imunizovanih miševa. Može se konstruisati repertoar V gena iz neimunizovanih humanih donora i mogu se izolovati antitela na raznovrstan niz antigena (uključujući i autoantigene) suštinski prateći tehnike koje su opisali Marks et al., J. Mol. Biol.
[0292] 222:581‑597 (1991), ili Griffith et al., EMBO J. 12:725‑734 (1993). Videti, takođe, S.A.D. patente br.5,565,332 i 5,573,905.
[0293] Kao što je prethodno razmatrano, humana antitela mogu takođe biti generisana od strane in vitro aktiviranih B ćelija (videti S.A.D. patente 5,567,610 i 5,229,275).
[0294] Humana antitela se takođe mogu proizvesti upotrebom različitih tehnika koje su poznate u struci, uključujući biblioteke prikaznih faga. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Tehnike Cole et al. i Boerner et al. su takođe dostupne za pripremu humanih monoklonskih antitela. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985) i Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86‑95 (1991).
[0296] Multispecifična antitela
[0298] [0124] Multispecifična antitela su monoklonska, poželjno humana ili humanizovana, antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za dva ili više različitih antigena (npr. bispecifična antitela imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva antigena). Na primer, jedna od specifičnosti vezivanja može biti za protein a5~1, druga može biti za bilo koji drugi antigen. Poželjno, drugi antigen može biti protein na površini ćelija ili receptor ili podjedinica receptora. Na primer, protein na površini ćelija može biti receptor ćelija prirodnih ubica (NK). Stoga, bispecifično antitelo koje je ovde opisano može se vezati i za PD-1 i, npr. za drugi receptor na površini ćelija.
[0299] Pogodni postupci za pravljenje bispecifičnih antitela su dobro poznati u struci. Na primer, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela zasniva se na koekspresiji dva para teškog lanca/lakog lanca imunoglobulina, gde dva teška lanca imaju različite specifičnosti. Milstein and Cuello, Nature, 305: 537‑539 (1983). Zbog nasumičnog rasporeda teških i lakih lanaca imunoglobulina, ovi hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu mešavinu od deset različitih molekula antitela, od kojih samo jedan ima ispravnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje ispravnog molekula se uobičajeno postiže koracima afinitetne hromatografije. Slične procedure su objavljene u WO 93/08829 i u Traunecker et al., EMBO, 10: 3655‑3659 (1991).
[0300] Varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (mesta antiteloantigen kombinovanja) mogu se fuzionisati za sekvence konstantnog domena imunoglobulina. Fuzija je poželjno sa konstantnim domenom teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži najmanje deo regiona zgloba, CH2, i CH3 regione. Poželjno je da prvi konstantni region teškog lanca (CH1) koji sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca bude prisutan u najmanje jednoj od fuzija. DNK koje kodiraju fuzije teškog lanca imunoglobulina i, ukoliko se želi, laki lanac imunoglobulina, insertuju se u odvojene ekspresione vektore, i kotransfektuju u pogodni organizam domaćina. Za dodatne detalje o generisanju bispecifičnih antitela, videti, na primer, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
[0301] [0127] Takođe su opisane različite tehnike za pravljenje i izolovanje fragmenata bispecifičnih antitela direktno iz rekombinantne ćelijske kulture. Na primer, bispecifična antitela su proizvedena upotrebom leucinskih patent zatvarača (zippers). Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547‑1553 (1992). Peptidi leucinskih patentnih zatvarača iz Fos i Jun proteina su povezani sa Fab’ delovima dva različita antitela fuzijom gena. Homodimeri antitela su redukovani u regionu zgloba kako bi se formirali monomeri, a zatim ponovo oksidovani kako bi se formirali heterodimeri antitela. Ovaj postupak se takođe može koristiti za proizvodnju homodimera antitela. Tehnologija „dijatela“ koju su opisali Hollinger et al., PNAS USA, 90:6444‑6448 (1993) obezbedila je alternativni mehanizam za pravljenje fragmenata bispecifičnih antitela. Fragmenti sadrže VH povezan sa VL pomoću linkera koji je prekratak kako bi omogućio sparivanje između dva domena na istom lancu. U skladu sa tim, VH i VL domeni jednog fragmenta su primorani da se spare sa komplementarnim VL i VH domenima drugog fragmenta, čime se formiraju dva antigen-vezujuća mesta. Takođe je objavljena druga strategija za pravljenje fragmenata bispecifičnih antitela upotrebom jednolančanih Fv (sFv) dimera. Videti Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
[0302] Razmatrana su antitela sa više od dve valence. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela. Tutt et al. J. Immunol.147: 60 (1991).
[0304] Heterokonjugatna antitela
[0306] Heterokonjugatna antitela se sastoje od dva kovalentno spojena antitela. Takva antitela su, na primer, predložena za usmereno delovanje ćelija imunskog sistema na neželjene ćelije (S.A.D. patent br. 4,676,980), i za lečenje HIV infekcije. WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089. Razmatra se da se antitela mogu pripremiti in vitro upotrebom postupaka koji su poznati u sintetičkoj hemiji proteina, uključujući one koji uključuju agense za umrežavanje. Na primer, imunotoksini se mogu konstruisati upotrebom reakcije razmene disulfida ili formiranjem tioetarske veze. Primeri pogodnih reagenasa za ovu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat i one koji su objavljeni, na primer, u S.A.D. patentu br.
[0307] 4,676,980.
[0309] Projektovanje efektorske funkcije
[0311] Može biti poželjno modifikovati antitelo koje je ovde opisano u pogledu efektorske funkcije, kako bi se poboljšala, npr. efikasnost antitela u lečenju kancera. Na primer, cisteinski ostatak(ci) može(gu) se introdukovati u Fc region, čime se omogućava formiranje interlančanih disulfidnih veza u ovom regionu. Tako generisano homodimerno antitelo može imati poboljšanu sposobnost internalizacije i/ili povećano komplementom posredovano ubijanje ćelija i ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Videti, Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191‑1195 (1992) i Shapes, J. Immunol., 148: 2918‑2922 (1992). Homodimerna antitela sa poboljšanom antitumorskom aktivnošću takođe se mogu pripremiti upotrebom heterobifunkcionalnih unakrsnih linkera kao što je opisano u Wolff et al., Cancer Research, 53: 2560‑2565 (1993). Alternativno, može se projektovati antitelo koje ima dvostruke Fc regione i time može imati poboljšane sposobnosti lize komplementa i ADCC. Videti, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219‑230 (1989).
[0312] Mutacije ili izmene u sekvencama Fc regiona mogu se napraviti kako bi se poboljšalo vezivanje za FcR (npr. FcγR, FcRn). Antitelo koje je ovde opisano može imati najmanje
[0315] 4
[0316] jednu izmenjenu efektorsku funkciju odabranu iz grupe koja se sastoji od ADCC, CDC, i poboljšanog vezivanja za FcRn u poređenju sa nativnim IgG ili roditeljskim antitelom. Primeri nekoliko korisnih specifičnih mutacija opisani su u, npr. Shields, RL et al. (2001) JBC 276(6)6591‑6604; Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487‑490; i WO 00/42072.
[0317] Mutacija Fc receptora može biti supstitucija najmanje jedne pozicije odabrane iz grupe koja se sastoji od: 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ili 439 Fc regiona, pri čemu je numeracija ostataka u Fc regionu u skladu sa EU sistemom numeracije. Mutacija Fc receptora može biti D265A supstitucija. Mutacija Fc receptora može biti N297A supstitucija. Dodatne pogodne mutacije su iznete u S.A.D. patentu br.7,332,581.
[0319] Imunokonjugati
[0321] Pronalazak se takođe odnosi na imunokonjugate koji sadrže antitelo konjugovano za citotoksični agens kao što je hemioterapijski agens, toksin (npr. enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog, ili životinjskog porekla, ili njegovi fragmenti), ili radioaktivni izotop (tj. radiokonjugat).
[0322] Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu upotrebljavati uključuju A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine diantina, proteine Phytolaca americana (PAPI, PAPII, i PAP-S), inhibitor Momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor Sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin, i trikotecene. Različiti radionuklidi su dostupni za proizvodnju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju<212>Bi,<131>I,<131>In,<90>Y, i<186>Re. Primeri hemioterapijskih agenasa koji su korisni u generisanju takvih imunokonjugata uključuju one koji su ovde opisani na drugom mestu.
[0323] Anti-PD‑1 antitelo koje je ovde opisano može biti konjugovano za majtanzin, majtanzinoid, ili kaliheamicin. Anti-PD‑1 antitelo koje je ovde opisano može biti konjugovano za majtanzinoid DM1.
[0324] [0136] Konjugati antitela i citotoksičnog agensa se prave upotrebom različitih bifunkcionalnih protein-kuplujućih agenasa kao što su N-sukcinimidil‑3‑(2-piridilditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(p-azidobenzoil) heksandiamin), bisdiazonijumski derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)‑etilendiamin), diizocijanati (kao što je tolijen 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro‑2,4‑dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin se može pripremiti kao što je opisano u Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987).
[0325] 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) obeležena ugljenikom-14 je primer helirajućeg agensa za konjugaciju radionukleotida za antitelo. Videti, WO94/11026.
[0326] Antitelo može biti konjugovano za „receptor“ (kao što je streptavidin) radi korišćenja u pre-ciljnom delovanju na tumor, pri čemu se konjugat antitelo-receptor primenjuje pacijentu, nakon čega sledi uklanjanje nevezanog konjugata iz cirkulacije upotrebom agensa za čišćenje, a zatim primena „liganda“ (npr. avidina) koji je konjugovan za citotoksični agens (npr. radionukleotid).
[0328] Kovalentne modifikacije
[0330] Kovalentne modifikacije anti-PD‑1 antitela su uključene unutar obima ovog pronalaska. Jedan tip kovalentne modifikacije uključuje reakciju ciljanih aminokiselinskih ostataka polipeptida sa organskim derivatizujućim agensom koji je sposoban da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili N‑ ili C‑terminusnim ostacima polipeptida. Derivatizacija sa bifunkcionalnim agensima je korisna, na primer, za umrežavanje polipeptida sa vodonerastvorljivim nosećim matriksom ili površinom za upotrebu u postupku za prečišćavanje antitela, i obrnuto. Uobičajeno korišćeni agensi za umrežavanje uključuju, npr.
[0331] 1,1-bis(diazoacetil)‑2‑feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidne estre, na primer, estre sa 4‑azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalne imidoestre, uključujući disukcinimidil estre kao što je 3,3’‑ditiobis(sukcinimidil-propionat), bifunkcionalne maleimide kao što je bis-N-maleimido‑1,8‑oktan i agense kao što je metil‑3‑[(p-azidofenil)‑ditio] propioimidat.
[0332] Druge modifikacije uključuju deamidaciju glutaminil i asparaginil ostataka do odgovarajućih glutamil i aspartil ostataka, respektivno, hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa seril ili treonil ostataka, metilaciju α-amino grupa lizinskih, argininskih, i histidinskih bočnih lanaca (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilaciju N-terminusnog amina, i amidaciju bilo koje C-terminusne karboksilne grupe.
[0333] Sledeći tip kovalentne modifikacije polipeptida sadrži povezivanje polipeptida sa jednim od različitih neproteinskih polimera, npr. polietilen glikolom (PEG), polipropilen glikolom, ili polioksialkilenima, na način koji je iznet u S.A.D. patentima br. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337.
[0335] Himerni molekuli
[0337] Anti-PD‑1 antitelo iz predmetnog pronalaska za upotrebu kao što je definisano u patentnim zahtevima može se takođe modifikovati, ukoliko je to korisno, na način da se formira himerni molekul koji sadrži polipeptid fuzionisan za drugi, heterologi polipeptid ili aminokiselinsku sekvencu (npr. imunoadhezini ili peptitela).
[0338] Takav himerni molekul može da sadrži fuziju polipeptida sa domenom za transdukciju proteina koji cilja polipeptid za isporuku u različita tkiva i posebno preko krvno-moždane barijere, upotrebom, na primer, domena za transdukciju proteina TAT proteina virusa humane imunodeficijencije (Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569‑72).
[0339] Takav himerni molekul može da sadrži fuziju polipeptida sa polipeptidnom oznakom koja obezbeđuje epitop za koji se anti-oznaka antitelo može selektivno vezati. Epitopska oznaka se generalno postavlja na amino- ili karboksi-terminus polipeptida. Prisustvo takvih epitop-označenih oblika polipeptida može se detektovati upotrebom antitela prema polipeptidnoj oznaci. Takođe, obezbeđivanje epitopske oznake omogućava da se polipeptid lako prečisti afinitetnim prečišćavanjem upotrebom anti-oznaka antitela ili druge vrste afinitetnog matriksa koji se vezuje za epitopsku oznaku. Različite polipeptidne oznake i njihova odgovarajuća antitela su poznati u struci. Primeri uključuju polihistidinske (poli-His) ili polihistidin-glicinske (poli-His-gly) oznake; polipeptidnu oznaku HA virusa gripa i njeno antitelo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159‑2165 (1988)]; c-myc oznaku i njena antitela 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 i 9E10 (Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610‑3616 (1985)]; i glikoprotein D (gD) oznaku virusa herpes simpleksa i njeno antitelo (Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547‑553 (1990)]. Druge polipeptidne oznake uključuju Flag-peptid (Hopp et al., BioTechnology, 6:1204‑1210 (1988)]; epitop peptida KT3 (Martin et al., Science, 255:192‑194 (1992)]; epitop peptida α-tubulina (Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163‑15166 (1991)]; i peptidnu oznaku proteina gena 10 T7 (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393‑6397 (1990)).
[0340] Alternativno, himerni molekul može da sadrži fuziju polipeptida sa imunoglobulinom ili određenim regionom imunoglobulina. Za dvovalentni oblik himernog molekula (npr.
[0343] 4
[0344] „imunoadhezin“), takva fuzija može biti za Fc region IgG molekula. Ig fuzije koje su ovde opisane uključuju polipeptide koji sadrže približno ili samo ostatke 94‑243, ostatke 33‑53 ili ostatke 33‑52 humanog umesto najmanje jednog varijabilnog regiona unutar Ig molekula. Posebno poželjno, fuzija imunoglobulina može da uključuje regione zgloba, CH2 i CH3, ili regione zgloba, CH1, CH2 i CH3 IgG1 molekula. Za proizvodnju fuzija imunoglobulina videti takođe, S.A.D. patent br.5,428,130 koji je izdat 27. juna 1995. godine.
[0346] Imunolipozomi
[0348] Antitela koja su ovde objavljena mogu se takođe formulisati kao imunolipozomi. Lipozomi koji sadrže antitelo se pripremaju postupcima koji su poznati u struci, kao što je opisano u Epstein et al., PNAS USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., PNAS USA, 77: 4030 (1980); i S.A.D. patentima br. 4,485,045 i 4,544,545. Lipozomi sa poboljšanim vremenom u cirkulaciji objavljeni su u S.A.D. patentu br.5,013,556.
[0349] Posebno korisni lipozomi mogu se generisati postupkom evaporacije reverzne faze sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidilholin, holesterol, i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se ekstrudiraju kroz filtere definisane veličine pora kako bi se dobili lipozomi željenog prečnika. Fab’ fragmenti antitela mogu se konjugovati za lipozome kao što je opisano u Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286‑288 (1982) putem reakcije disulfidne razmene. Antineoplastični agens, agens za inhibiciju rasta, ili hemioterapijski agens (kao što je doksorubicin) su opciono takođe sadržani unutar lipozoma. Videti, Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989).
[0351] Lečenje upotrebom anti-PD‑1 antitela
[0353] [0147] Anti-PD-1 antitela i/ili kompozicije koje su ovde opisane mogu se primenjivati subjektima (npr. sisarima kao što su ljudi) za lečenje bolesti i poremećaja koji uključuju abnormalnu aktivnost PD-1, uključujući, na primer, kancer (kao što su kancer glave i vrata, kancer grla, kolorektalni kancer, kancer pluća, itd.). Pronalazak obezbeđuje anti-PD-1 antitela kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u lečenju kancera kao što je definisano u patentnim zahtevima (kao što su melanom, NSCLC, kancer glave i vrata, urotelni kancer, kancer dojke (npr. trostruko negativni kancer dojke, TNBC), kancer želuca, klasični Hočkinov limfom (cHL), ne-Hočkinov limfom, primarni medijastinalni B-ćelijski limfom (NHL PMBCL), mezoteliom, kancer jajnika, kancer pluća (npr. sitnoćelijski kancer pluća), kancer jednjaka, nazofaringealni karcinom (NPC), kancer bilijarnog trakta, kolorektalni kancer, kancer grlića materice, kancer štitne žlezde) kod subjekta.
[0354] Takođe su ovde opisane farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-PD-1 antitelo koje je ovde opisano za upotrebu u lečenju kancera (melanom, NSCLC, kancer glave i vrata, urotelni kancer, kancer dojke (npr. trostruko negativni kancer dojke, TNBC), kancer želuca, klasični Hočkinov limfom (cHL), ne-Hočkinov limfom, primarni medijastinalni B-ćelijski limfom (NHL PMBCL), mezoteliom, kancer jajnika, kancer pluća (npr. sitnoćelijski kancer pluća), kancer jednjaka, nazofaringealni karcinom (NPC), kancer bilijarnog trakta, kolorektalni kancer, kancer grlića materice, kancer štitne žlezde) kod subjekta. Subjekt koji se leči može biti sisar (npr. čovek, ne-humani primat, pacov, miš, krava, konj, svinja, ovca, koza, pas, mačka, itd.). Subjekt može biti čovek. Subjekt može biti klinički pacijent, volonter u kliničkom ispitivanju, eksperimentalna životinja, itd. Može se sumnjati da subjekt ima ili da je u riziku da ima kancer (kao što su melanom, NSCLC, kancer glave i vrata, urotelni kancer, kancer dojke (npr. trostruko negativni kancer dojke, TNBC), kancer želuca, klasični Hočkinov limfom (cHL), ne-Hočkinov limfom, primarni medijastinalni B-ćelijski limfom (NHL PMBCL), mezoteliom, kancer jajnika, kancer pluća (npr. sitnoćelijski kancer pluća), kancer jednjaka, nazofaringealni karcinom (NPC), kancer bilijarnog trakta, kolorektalni kancer, kancer grlića materice, kancer štitne žlezde) ili mu se može dijagnostikovati kancer ili bilo koja druga bolest koja ima abnormalnu ekspresiju ili aktivnost PD-1.
[0355] U struci su poznate mnogi dijagnostički postupci za kancer (kao što su melanom, NSCLC, kancer glave i vrata, urotelni kancer, kancer dojke (npr. trostruko negativni kancer dojke, TNBC), kancer želuca, klasični Hočkinov limfom (cHL), ne-Hočkinov limfom, primarni medijastinalni B-ćelijski limfom (NHL PMBCL), mezoteliom, kancer jajnika, kancer pluća (npr. sitnoćelijski kancer pluća), kancer jednjaka, nazofaringealni karcinom (NPC), kancer bilijarnog trakta, kolorektalni kancer, kancer grlića materice, kancer štitne žlezde) ili bilo koju drugu bolest koja pokazuje abnormalnu aktivnost PD-1 i kliničku delineaciju tih bolesti. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, npr. imunohistohemiju, PCR, fluorescentnu in situ hibridizaciju (FISH). Dodatni detalji u vezi sa dijagnostičkim postupcima za abnormalnu aktivnost ili ekspresiju PD-1 opisani su u, npr. Gupta et al. (2009) Mod Pathol.22(1): 128-133; Lopez-Rios et al. (2013) J Clin Pathol.66(5): 381-385; Ellison et al. (2013) J Clin Pathol 66(2): 79-89; i Guha et al. (2013) PLoS ONE 8(6): e67782.
[0356] Primena može biti bilo kojim pogodnim putem, uključujući, npr. intravenski, intramuskularno, ili subkutano. Anti-PD-1 antitela i/ili kompozicije koje su ovde opisane
[0359] 4
[0360] mogu se primenjivati u kombinaciji sa drugim, trećim, ili četvrtim agensom (uključujući, npr. antineoplastični agens, agens za inhibiciju rasta, citotoksični agens, ili hemioterapijski agens) za lečenje bolesti ili poremećaja koji uključuju abnormalnu aktivnost PD-1. Takvi agensi uključuju, npr. docetaksel, gefitinib, FOLFIRI (irinotekan, 5-fluorouracil, i leukovorin), irinotekan, cisplatin, karboplatin, paklitaksel, bevacizumab (anti-VEGF antitelo), FOLFOX‑4, infuzioni fluorouracil, leukovorin, i oksaliplatin, afatinib, gemcitabin, kapecitabin, pemetreksed, tivantinib, everolimus, CpG-ODN, rapamicin, lenalidomid, vemurafenib, endostatin, lapatinib, PX‑866, Imprime PGG, i irlotinib. Anti-PD‑1 antitela mogu biti konjugovana za dodatni agens.
[0361] Anti-PD‑1 antitela koja su ovde opisana mogu se primenjivati u kombinaciji sa jednom ili više dodatnih terapija, kao što su radioterapija, hirurška intervencija, hemioterapija, i/ili ciljana terapija. Anti-PD‑1 antitela koja su ovde opisana mogu se primenjivati u kombinaciji sa radioterapijom. Kombinacija anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano i radioterapije može se upotrebljavati za lečenje kancera koji je odabran iz grupe koja se sastoji od melanoma, NSCLC, kancera glave i vrata, urotelnog kancera, kancera dojke (npr. trostruko negativni kancer dojke, TNBC), kancera želuca, klasičnog Hočkinovog limfoma (cHL), ne-Hočkinovog limfoma, primarnog medijastinalnog B-ćelijskog limfoma (NHL PMBCL), mezotelioma, kancera jajnika, kancera pluća (npr. sitnoćelijski kancer pluća), kancera jednjaka, nazofaringealnog karcinoma (NPC), kancera bilijarnog trakta, kolorektalnog kancera, kancera grlića materice, i kancera štitne žlezde.
[0362] U zavisnosti od indikacije koja se leči i faktora relevantnih za doziranje sa kojima bi lekar sa iskustvom u ovoj oblasti bio upoznat, anti-PD-1 antitela koja su ovde opisana će se primenjivati u dozi koja je efikasna za lečenje te indikacije, uz minimalizovanje toksičnosti i sporednih efekata. Za lečenje kancera (kao što su melanom, NSCLC, kancer glave i vrata, urotelni kancer, kancer dojke (npr. trostruko negativni kancer dojke, TNBC), kancer želuca, klasični Hočkinov limfom (cHL), ne-Hočkinov limfom, primarni medijastinalni B-ćelijski limfom (NHL PMBCL), mezoteliom, kancer jajnika, kancer pluća (npr. sitnoćelijski kancer pluća), kancer jednjaka, nazofaringealni karcinom (NPC), kancer bilijarnog trakta, kolorektalni kancer, kancer grlića materice, kancer štitne žlezde), tipična doza može biti, na primer, u opsegu od 0,001 do 1000 µg; međutim, doze ispod ili iznad ovog primera opsega su unutar obima pronalaska. Dnevna doza može biti oko 0,1 µg/kg do oko 100 mg/kg ukupne telesne težine (npr. oko 5 µg/kg, oko 10 µg/kg, oko 100 µg/kg, oko 500 µg/kg, oko 1 mg/kg, oko 50 mg/kg, ili opseg koji je definisan pomoću bilo koje dve od prethodno navedenih vrednosti), poželjno od oko 0,3 µg/kg do oko 10 mg/kg ukupne telesne težine (npr. oko 0,5
[0365] 4
[0366] µg/kg, oko 1 µg/kg, oko 50 µg/kg, oko 150 µg/kg, oko 300 µg/kg, oko 750 µg/kg, oko 1,5 mg/kg, oko 5 mg/kg, ili opseg koji je definisan pomoću bilo koje dve od prethodno navedenih vrednosti), poželjnije od oko 1 µg/kg do 1 mg/kg ukupne telesne težine (npr. oko 3 µg/kg, oko 15 µg/kg, oko 75 µg/kg, oko 300 µg/kg, oko 900 µg/kg, ili opseg koji je definisan pomoću bilo koje dve od prethodno navedenih vrednosti), a još poželjnije od oko 0,5 do 10 mg/kg telesne težine dnevno (npr. oko 2 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 9 mg/kg, ili opseg koji je definisan pomoću bilo koje dve od prethodno navedenih vrednosti, uključujući bilo koji opseg između prethodno navedenih vrednosti). Kao što je prethodno navedeno, terapijska ili profilaktička efikasnost može se pratiti periodičnom procenom lečenih pacijenata. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje se ponavlja dok se ne postigne željena supresija simptoma bolesti. Međutim, drugi dozni režimi mogu biti korisni i spadaju unutar obima pronalaska. Željena doza se može isporučiti jednokratnom bolusnom primenom kompozicije, višestrukim bolusnim primenama kompozicije, ili kontinuiranom infuzijskom primenom kompozicije.
[0367] Farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-PD-1 antitelo može se primenjivati jednom, dva, tri, ili četiri puta dnevno. Kompozicije se takođe mogu primenjivati ređe nego dnevno, na primer, šest puta nedeljno, pet puta nedeljno, četiri puta nedeljno, tri puta nedeljno, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom mesečno, jednom svaka dva meseca, jednom svaka tri meseca, ili jednom svakih šest meseci. Kompozicije se takođe mogu primenjivati u formulaciji sa produženim oslobađanjem, kao što je implantat koji postepeno oslobađa kompoziciju za upotrebu tokom određenog vremenskog perioda, i koja omogućava da se kompozicija primenjuje ređe, kao što je jednom mesečno, jednom svakih 2-6 meseci, jednom godišnje, ili čak jednokratna primena. Uređaji sa produženim oslobađanjem (kao što su peleti, nanočestice, mikročestice, nanosfere, mikrosfere, i slično) mogu se primenjivati injekcijom.
[0368] Antitelo se može primenjivati u jednoj dnevnoj dozi, ili se ukupna dnevna doza može primenjivati u podeljenim dozama od dva, tri, ili četiri puta dnevno. Kompozicije se takođe mogu primenjivati ređe nego dnevno, na primer, šest puta nedeljno, pet puta nedeljno, četiri puta nedeljno, tri puta nedeljno, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom mesečno, jednom svaka dva meseca, jednom svaka tri meseca, ili jednom svakih šest meseci. Antitelo se takođe može primenjivati u formulaciji sa produženim oslobađanjem, kao što je implantat koji postepeno oslobađa kompoziciju za upotrebu tokom određenog vremenskog perioda, i koja omogućava da se kompozicija primenjuje ređe, kao što je jednom mesečno, jednom svakih 2-6 meseci, jednom godišnje, ili
[0371] 4
[0372] čak jednokratna primena. Uređaji sa produženim oslobađanjem (kao što su peleti, nanočestice, mikročestice, nanosfere, mikrosfere, i slično) mogu se primenjivati injekcijom ili hirurški implantirati na različitim lokacijama.
[0373] Lečenje kancera može se proceniti pomoću, npr. ali ne ograničavajući se na regresiju tumora, smanjenje težine ili veličine tumora, vreme do progresije, trajanje preživljavanja, preživljavanje bez progresije, ukupnu stopu odgovora, trajanje odgovora, kvalitet života, ekspresiju i/ili aktivnost proteina. Mogu se koristiti pristupi za određivanje efikasnosti terapije, uključujući na primer, merenje odgovora putem radiološkog snimanja.
[0374] Efikasnost lečenja može se izmeriti kao procenat inhibicije rasta tumora (% TGI), izračunato upotrebom jednačine 100-(T/C x 100), gde je T srednja vrednost relativne zapremine tumora lečenog tumora, a C je srednja vrednost relativne zapremine tumora nelečenog tumora. % TGI može biti oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, ili više od 95%. % TGI anti-PD‑1 može biti isti ili veći od % TGI OPDIVO<®>, kao što je oko 1,1-struko, oko 1,2-struko, oko 1,3-struko, oko 1,4-struko, oko 1,5-struko, oko 1,6-struko, oko 1,7-struko, oko 1,8-struko, oko 1,9-struko, oko 2-struko, oko 2,1-struko, oko 2,2-struko, oko 2,3-struko, oko 2,4-struko, oko 2,5-struko, oko 2,6-struko, oko 2,7-struko, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti, ili više od oko 2,7-struko veći od % TGI OPDIVO<®>.
[0376] Farmaceutske formulacije
[0378] Anti-PD‑1 antitela mogu se formulisati sa pogodnim nosačima ili ekscipijensima tako da budu pogodna za primenu. Pogodne formulacije antitela dobijaju se mešanjem antitela (ili njegovog fragmenta) željenog stepena čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi, ili stabilizatori su netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat, i druge organske kiseline; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što su metil ili propilparaben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što su olivinilpirolidon; aminokiseline kao što su
[0381] 4
[0382] glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu, ili dekstrine; helirajuće agense kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji formiraju soli kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. Zn-proteinski kompleksi); i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG). Primeri formulacija antitela opisani su u WO98/56418. Liofilizovane formulacije prilagođene za subkutanu primenu opisane su u WO97/04801. Takve liofilizovane formulacije mogu se rekonstituisati odgovarajućim razblaživačem do visoke koncentracije proteina, a rekonstituisana formulacija može se primeniti subkutano sisaru koji se ovde leči.
[0383] Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja kao što je potrebno za određenu indikaciju koja se leči, poželjno ona sa komplementarnim aktivnostima koja ne utiču negativno jedno na drugo. Na primer, može biti poželjno dodatno obezbediti antineoplastični agens, agens za inhibiciju rasta, citotoksični agens, ili hemioterapijski agens. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za svrhu za koju su namenjeni. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela koje je prisutno u formulaciji, tipa bolesti ili poremećaja ili lečenja, i drugih faktora o kojima se prethodno razmatralo. Ovi agensi se generalno upotrebljavaju u istim dozama i načinima primene kao što je ovde opisano ili oko 1 do 99% do sada korišćenih doza. Aktivni sastojci takođe mogu biti zarobljeni u mikrokapsulama koje su pripremljene, na primer, tehnikama koacervacije ili međupovršinskom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozne ili želatinske mikrokapsule i poli-(metilmetacilatne) mikrokapsule, respektivno, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrikse od čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antagonist, a koji su matriksi u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmova, ili mikrokapsula. Primeri matriksa sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (S.A.D. patent br.
[0384] 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil, razgradive kopolimere mlečne kiseline i glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT™ (injektabilne mikrosfere sačinjene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksibuternu kiselinu.
[0387] 4
[0388] Lipofektini ili lipozomi se mogu upotrebljavati za isporuku polipeptida i antitela (ili njihovih fragmenata) ili kompozicija iz ovog pronalaska u ćelije. Tamo gde se upotrebljavaju fragmenti antitela, poželjan je najmanji inhibitorni fragment koji se specifično vezuje za vezujući domen ciljnog proteina. Na primer, na osnovu sekvenci varijabilnog regiona antitela, mogu se dizajnirati molekuli peptida koji zadržavaju sposobnost vezivanja za sekvencu ciljnog proteina. Takvi peptidi se mogu hemijski sintetisati i/ili proizvesti tehnologijom rekombinantne DNK. Videti, npr. Marasco et al., PNAS USA, 90: 7889‑7893 (1993).
[0389] Aktivni sastojci takođe mogu biti zarobljeni u mikrokapsulama koje su pripremljene, na primer, tehnikama koacervacije ili međupovršinskom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozne ili želatinske mikrokapsule i poli-(metilmetacilatne) mikrokapsule, respektivno, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice, i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington’s PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra.
[0390] Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrikse od čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo (ili njegov fragment), a koji su matriksi u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmova, ili mikrokapsula. Primeri matriksa sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (S.A.D. patent br. 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradive kopolimere mlečne kiseline i glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT™ (injektabilne mikrosfere sačinjene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksibuternu kiselinu. Dok polimeri kao što su etilen-vinil acetat i mlečna kiselinaglikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula tokom više od 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine tokom kraćih vremenskih perioda. Kada inkapsulirana antitela ostanu u telu tokom dužeg vremena, mogu se denaturisati ili agregirati kao rezultat izlaganja vlazi na 37 °C, što rezultuje gubitkom biološke aktivnosti i mogućim promenama u imunogenosti. Racionalne strategije mogu se osmisliti za stabilizaciju u zavisnosti od uključenog mehanizma. Na primer, ukoliko se otkrije da je mehanizam agregacije intermoleksko formiranje S-S veze preko tio-disulfidne razmene, stabilizacija se može postići modifikacijom sulfhidrilnih ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolom sadržaja vlage, upotrebom odgovarajućih aditiva, i razvojem specifičnih kompozicija polimernog matriksa.
[0391] Formulacija može da sadrži anti-PD-1 antitelo koje je ovde opisano u koncentraciji koja je veća od oko 0,5 mg/ml, koja je veća od oko 1 mg/ml, koja je veća od oko 2 mg/ml, koja je veća od oko 3 mg/ml, koja je veća od oko 4 mg/ml, koja je veća od oko 5 mg/ml, koja je veća od oko 6 mg/ml, koja je veća od oko 7 mg/ml, koja je veća od oko 8 mg/ml, koja je veća od oko 9 mg/ml, koja je veća od oko 10 mg/ml, koja je veća od oko 11 mg/ml, koja je veća od oko 12 mg/ml, koja je veća od oko 13 mg/ml, koja je veća od oko 14 mg/ml, koja je veća od oko 15 mg/ml, koja je veća od oko 16 mg/ml, koja je veća od oko 17 mg/ml, koja je veća od oko 18 mg/ml, koja je veća od oko 19 mg/ml, koja je veća od oko 20 mg/ml, koja je veća od oko 21 mg/ml, koja je veća od oko 22 mg/ml, koja je veća od oko 23 mg/ml, koja je veća od oko 24 mg/ml, koja je veća od oko 25 mg/ml, koja je veća od oko 26 mg/ml, koja je veća od oko 27 mg/ml, koja je veća od oko 28 mg/ml, koja je veća od oko 29 mg/ml, ili koja je veća od oko 30 mg/ml, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti.
[0392] Anti-PD-1 antitelo može biti formulisano (npr. u koncentraciji koja je veća od oko 0,5 mg/ml, koja je veća od oko 1 mg/ml, koja je veća od oko 5 mg/ml, koja je veća od oko 10 mg/ml, koja je veća od oko 15 mg/ml, koja je veća od oko 20 mg/ml, ili koja je veća od oko 25 mg/ml, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti) u puferu koji sadrži citrat, NaCl, acetat, sukcinat, glicin, polisorbat 80 (Tween 80), ili bilo koju kombinaciju prethodno navedenih. Anti-PD‑1 antitelo može biti formulisano (npr. u koncentraciji koja je veća od oko 0,5 mg/ml, koja je veća od oko 1 mg/ml, koja je veća od oko 5 mg/ml, koja je veća od oko 10 mg/ml, koja je veća od oko 15 mg/ml, koja je veća od oko 20 mg/ml, ili koja je veća od oko 25 mg/ml, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti) u puferu koji sadrži oko 100 mM do oko 150 mM glicina. Anti-PD‑1 antitelo može biti formulisano u puferu koji sadrži oko 50 mM do oko 100 mM NaCl. Anti-PD‑1 antitelo može biti formulisano (npr. u koncentraciji koja je veća od oko mg/ml, koja je veća od oko 1 mg/ml, koja je veća od oko 5 mg/ml, koja je veća od oko 10 mg/ml, koja je veća od oko 15 mg/ml, koja je veća od oko 20 mg/ml, ili koja je veća od oko 25 mg/ml, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti) u puferu koji sadrži oko 10 mM do oko 50 mM acetata. Anti-PD‑1 antitelo može biti formulisano u puferu koji sadrži oko 10 mM do oko 50 mM sukcinata. Anti-PD‑1 antitelo može biti formulisano (npr. u koncentraciji koja je veća od oko 0,5 mg/ml, koja je veća od oko 1 mg/ml, koja je veća od oko 5 mg/ml, koja je veća od oko 10 mg/ml, koja je veća od oko 15 mg/ml, koja je veća od oko 20 mg/ml, ili koja je veća od oko 25 mg/ml, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti) u puferu koji sadrži oko 0,005% do oko 0,02% polisorbata 80. Anti-PD‑1 antitelo može biti formulisano u puferu koji ima pH između oko 5,1 i 5,6. Anti-
[0395] 1
[0396] PD‑1 antitelo može biti formulisano u puferu koji sadrži 10 mM citrata, 100 mM NaCl, 100 mM glicina, i 0,01% polisorbata 80, pri čemu je formulacija na pH = 5,5.
[0397] Formulacija (kao što je formulacija koja sadrži pufer koji sadrži 10 mM citrata, 100 mM NaCl, 100 mM glicina, i 0,01% polisorbata 80, pri čemu je formulacija na pH=5,5) koja sadrži PD-1 antitelo koje je ovde opisano (npr. u koncentraciji koja je veća od oko 0,5 mg/ml, koja je veća od oko 1 mg/ml, koja je veća od oko 5 mg/ml, koja je veća od oko 10 mg/ml, koja je veća od oko 15 mg/ml, koja je veća od oko 20 mg/ml, ili koja je veća od oko 25 mg/ml, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti) može biti stabilna na sobnoj temperaturi (kao što je na oko 20‑25 °C tokom oko 0,5 nedelje, 1,0 nedelje, 1,5 nedelje, 2,0 nedelje, 2,5 nedelje, 3,5 nedelje, 4,0 nedelje, 4,5 nedelje, ili 5,0 nedelja, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Formulacija (kao što je formulacija koja sadrži pufer koji sadrži 10 mM citrata, 100 mM NaCl, 100 mM glicina, i 0,01% polisorbata 80, pri čemu je formulacija na pH=5,5) koji sadrži PD-1 antitelo koje je opisano ovde (npr. u koncentraciji koja je veća od oko 0,5 mg/ml, koja je veća od oko 1 mg/ml, koja je veća od oko 5 mg/ml, koja je veća od oko 10 mg/ml, koja je veća od oko 15 mg/ml, koja je veća od oko 20 mg/ml, ili koja je veća od oko 25 mg/ml, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti) može biti stabilna pod ubrzanim uslovima (kao što je skladištenje na oko 37 °C) tokom oko 0,5 nedelje, 1,0 nedelje, 1,5 nedelje, 2,0 nedelje, 2,5 nedelje, 3,5 nedelje, 4,0 nedelje, 4,5 nedelje, ili 5,0 nedelja, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti.
[0398] Ekskluziona hromatografija (SEC) je dobro poznat i široko upotrebljavan postupak koji se upotrebljava u studijama stabilnosti proteina kako bi se detektovale potencijalne fragmentacije i agregacije, što odgovara fizičkim i hemijskim nestabilnostima. Formulacija koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može pokazati manje od oko 1,6%, 1,4%, 1,2%, 1,0%, 0,8%, 0,6%, 0,4%, 0,2%, ili 0,1% povećanja vrsta velike molekulske težine (HMWS) posle 1 nedelje na 37 °C, u odnosu na inicijalni % vrsta velike molekulske težine, kao što je izmereno upotrebom SEC, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Formulacija koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može pokazati manje od oko 2,0%, 1,8%, 1,6%, 1,4%, 1,2%, 1,0%, 0,8%, 0,6%, 0,4%, 0,2%, ili 0,1% povećanja vrsta velike molekulske težine posle 2 nedelje na 37 °C, u odnosu na inicijalni % vrsta velike molekulske težine, kao što je izmereno upotrebom SEC, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Formulacija koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-EFGR antitela koje je ovde opisano može pokazati manje od oko 3,3%, 3,2%, 3,1%, 3,0%, 2,9%, 2,8%, 2,7%, 2,6%, 2,5%, 2,4%, 2,2%, 2,0%, 1,8%, 1,6%,
[0401] 2
[0402] 1,4%, 1,2%, 1,0%, 0,8%, 0,6%, 0,4%, 0,2%, ili 0,1% povećanja vrsta velike molekulske težine posle 4 nedelje na 37 °C, u odnosu na inicijalni % vrsta velike molekulske težine, kao što je izmereno upotrebom SEC, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti.
[0403] Formulacija koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može pokazati manje od oko 1,6%, 1,4%, 1,2%, 1,0%, 0,8%, 0,6%, 0,4%, 0,2%, ili 0,1% povećanja vrsta male molekulske težine (LMWS) posle 1 nedelje na 37 °C, u odnosu na inicijalni % vrsta male molekulske težine, kao što je izmereno upotrebom SEC, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Formulacija koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može pokazati manje od oko 2,0%, 1,8%, 1,6%, 1,4%, 1,2%, 1,0%, 0,8%, %, 0,4%, 0,2%, ili 0,1% povećanja vrsta male molekulske težine posle 2 nedelje na 37 °C, u odnosu na inicijalni % vrsta male molekulske težine, kao što je izmereno upotrebom SEC, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Formulacija koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može pokazati manje od oko 2,4%, 2,2%, 2,0%, 1,8%, 1,6%, 1,4%, 1,2%, 1,0%, 0,8%, 0,6%, 0,4%, 0,2%, ili 0,1% povećanja vrsta male molekulske težine posle 4 nedelje na 37 °C, u odnosu na inicijalni % vrsta male molekulske težine, kao što je izmereno upotrebom SEC, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti.
[0404] [0167] Formulacija koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može pokazati smanjenje monomera ne veće od oko 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3,0%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4%, ili 3,5% posle 1 nedelje na 37 °C, u odnosu na inicijalni % monomera, kao što je izmereno upotrebom SEC, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Formulacija koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može pokazati smanjenje monomera ne veće od oko 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3,0%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4%, ili 3,5% posle 2 nedelje na 37 °C, u odnosu na inicijalni % monomera, kao što je izmereno upotrebom SEC, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Formulacija koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-EFGR antitela koje je ovde opisano može pokazati smanjenje monomera ne veće od oko 0,2%, 0,4%, 0,6%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3,0%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4%, ili 3,5% posle 2 nedelje na 37 °C, u odnosu na inicijalni % monomera, kao što je izmereno upotrebom SEC, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti.
[0405] Katjonska izmenjivačka hromatografija (CEX) je dobro poznat i široko upotrebljavan alat kako bi se detektovali događaji degradacije proteina kao što su deamidacija ili oksidacija (Moorhouse et al. (1997) J. Pharm. Biomed. Anal. 16, 593‑603). Proizvodi degradacije se tipično označavaju kao kisele ili bazne vrste u poređenju sa gnts sa višim prividnim pI. Kisele vrste su varijante koje eluiraju ranije od glavnog pika iz CEX, dok su bazne vrste varijante koje eluiraju kasnije od glavnog pika iz CEX. Frakcija kiselog pika formulacije koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može biti ne više od oko 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, ili 15% ukupnog proteina posle 1 nedelje na 37°C, kao što je izmereno upotrebom CEX, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Frakcija kiselog pika formulacije koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može biti ne više od oko 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, ili 18% ukupnog proteina posle 2 nedelje na 37 °C, kao što je izmereno upotrebom CEX, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Frakcija kiselog pika formulacije koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-EFGR antitela koje je ovde opisano može biti ne više od oko 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, ili 27% ukupnog proteina posle 2 nedelje na 37 °C, kao što je izmereno upotrebom CEX, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti.
[0406] Frakcija baznog pika formulacije koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može biti ne više od oko 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, ili 46% ukupnog proteina posle 1 nedelje na 37 °C, kao što je izmereno upotrebom CEX, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Frakcija baznog pika formulacije koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može biti ne više od oko 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, ili 46% ukupnog proteina posle 2 nedelje na 37 °C, kao što je izmereno upotrebom CEX, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Frakcija baznog pika formulacije koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može biti ne više od oko 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, ili 46% ukupnog proteina posle 4 nedelje na 37 °C, kao što je izmereno upotrebom CEX, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti.
[0407] Frakcija glavnog pika formulacije koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD-1 antitela koje je ovde opisano može biti ne manje od oko 32%,
[0410] 4
[0411] 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, ili 46% ukupnog proteina posle 1 nedelje na 37 °C, kao što je izmereno upotrebom CEX, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Frakcija baznog pika formulacije koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može biti ne manje od oko 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, ili 46% ukupnog proteina posle 2 nedelje na 37 °C, kao što je izmereno upotrebom CEX, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti. Frakcija baznog pika formulacije koja sadrži 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, ili 25 mg/ml anti-PD‑1 antitela koje je ovde opisano može biti ne manje od oko 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, ili 46% ukupnog proteina posle 4 nedelje na 37 °C, kao što je izmereno upotrebom CEX, uključujući bilo koji opseg između ovih vrednosti.
[0412] Formulacije koje se upotrebljavaju za in vivo primenu moraju biti sterilne. To se lako postiže, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
[0414] Postupci dijagnoze i snimanja upotrebom anti-PD‑1 antitela
[0416] Obeležena anti-PD‑1 antitela, njihovi fragmenti, i njihovi derivati i analozi, koji se specifično vezuju za PD‑1 polipeptid mogu se upotrebljavati u dijagnostičke svrhe kako bi se detektovale, dijagnostikovale, ili pratile bolesti i/ili poremećaji koji su povezani sa ekspresijom, aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću PD‑1. Na primer, anti-PD‑1 antitela koja su ovde opisana mogu se upotrebljavati u dijagnostičkim testovima ili testovima snimanja in situ, in vivo, ex vivo, i in vitro. Postupci za detektovanje ekspresije PD‑1 polipeptida sadrže (a) testiranje ekspresije polipeptida u ćelijama (npr. tkivu) ili telesnoj tečnosti dobijenim od pojedinca upotrebom jednog ili više antitela iz ovog pronalaska i (b) poređenje nivoa ekspresije gena sa standardnim nivoom ekspresije gena, pri čemu je povećanje ili smanjenje testiranog nivoa ekspresije gena u poređenju sa standardnim nivoom ekspresije indikativno za aberantnu ekspresiju.
[0417] [0173] Ovde je takođe opisan postupak dijagnostikovanja bolesti ili poremećaja koji je povezan sa ekspresijom ili aberantnom ekspresijom PD-1 kod životinje (npr. sisara kao što je čovek). Postupci sadrže detektovanje PD-1 molekula kod sisara. Dijagnoza može sadržati: (a) primenu efikasne količine obeleženog anti-PD-1 antitela sisaru (b) čekanje tokom vremenskog intervala nakon primene kako bi se omogućilo da se obeleženo anti-PD-1 antitelo preferencijalno koncentriše na mestima kod subjekta gde se PD-1 molekul eksprimira (i da se nevezani obeleženi molekul ukloni do nivoa pozadine); (c) određivanje nivoa pozadine; i (d) detektovanje obeleženog molekula kod subjekta, tako da detekcija obeleženog molekula iznad nivoa pozadine ukazuje na to da subjekt ima određenu bolest ili poremećaj koji je povezan sa ekspresijom ili aberantnom ekspresijom PD-1. Nivo pozadine može se odrediti različitim postupcima, uključujući poređenje količine detektovanog obeleženog molekula sa standardnom vrednošću prethodno određenom za određeni sistem.
[0418] Anti-PD‑1 antitela koja su ovde opisana mogu se upotrebljavati za testiranje nivoa proteina u biološkom uzorku upotrebom klasičnih imunohistoloških postupaka koji su poznati onima sa iskustvom u struci (npr. videti Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976‑985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087‑3096 (1987)). Druge metode zasnovane na antitelima korisne za detektovanje ekspresije gena proteina uključuju imunotestove, kao što su enzimski imunosorbentni test (ELISA) i radioimunološki test (RIA). Pogodni obeleživači za analizu antitela su poznati u struci i uključuju enzimske obeleživače, kao što je glukoza oksidaza; radioizotope, kao što su jod (<131>I,<125>I,<123>I,<121>I), ugljenik (<14>C), sumpor (<35>S), tricijum (<3>H), indijum (<115m>In,<113m>In,<112>In,<111>In) i tehnecijum (<99>Tc,<99m>Tc), talijum (<201>Ti), galijum (<68>Ga,<67>Ga), paladijum (<103>Pd), molibden (<99>Mo), ksenon (<133>Xe), fluor (<18>F),<153>Sm,<177>Lu,<159>Gd,<149>Pm,<140>La,<175>Yb,<166>Ho,<90>Y,<47>Sc,<186>Re,<188>Re,<142>Pr,<105>Rh,<97>Ru; luminol; i fluorescentne obeleživače, kao što su fluorescein i rodamin, i biotin.
[0419] Tehnike koje su poznate u struci mogu se primeniti na obeležena antitela koja su ovde opisana. Takve tehnike uključuju, ali nisu ograničene na, upotrebu bifunkcionalnih konjugujućih agenasa (videti npr. S.A.D. patente br. 5,756,065; 5,714,631; 5,696,239; 5,652,361; 5,505,931; 5,489,425; 5,435,990; 5,428,139; 5,342,604; 5,274,119; 4,994,560; i 5,808,003).
[0420] Alternativno, ili dodatno, mogu se izmeriti nivoi nukleinske kiseline ili iRNK koja kodira PD‑1 polipeptid u ćeliji, npr. putem fluorescentne in situ hibridizacije upotrebom probe zasnovane na nukleinskoj kiselini koja odgovara PD‑1 kodirajućoj nukleinskoj kiselini ili njenom komplementu; (FISH; videti WO98/45479 koji je objavljen u oktobru 1998. godine), Southern blotting, Northern blotting, ili tehnike lančane reakcije polimeraze (PCR), kao što je kvantitativna PCR u realnom vremenu (RT-PCR). Prekomerna ekspresija PD-1 može se proučavati i merenjem otpuštenog antigena u biološkoj tečnosti kao što je serum, npr. upotrebom testova koji su zasnovani na antitelima (videti takođe, npr. S.A.D. patent br.
[0421] 4,933,294 koji je izdat 12. juna 1990; WO91/05264 koji je objavljen 18. aprila 1991; S.A.D. patent 5,401,638 koji je izdat 28. marta 1995; i Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73‑80 (1990)). Pored prethodno navedenih testova, osobi sa iskustvom su dostupni različiti in vivo i ex vivo testovi. Na primer, ćelije u telu sisara mogu se izložiti antitelu koje je opciono obeleženo detektabilnim obeleživačem, npr. radioaktivnim izotopom, a vezivanje antitela može se proceniti, npr. spoljašnjim skeniranjem radioaktivnosti ili analizom uzorka (npr. biopsije ili drugog biološkog uzorka) koji je uzet od sisara koji je prethodno bio izložen antitelu.
[0423] Proizvodni artikli i kompleti
[0425] Ovde je takođe opisan proizvodni artikal koji sadrži materijale koji su korisni za lečenje kancera, kao što su melanom, NSCLC, kancer glave i vrata, urotelni kancer, kancer dojke (npr. trostruko negativni kancer dojke, TNBC), kancer želuca, klasični Hočkinov limfom (cHL), ne-Hočkinov limfom, primarni medijastinalni B-ćelijski limfom (NHL PMBCL), mezoteliom, kancer jajnika, kancer pluća (npr. sitnoćelijski kancer pluća), kancer jednjaka, nazofaringealni karcinom (NPC), kancer bilijarnog trakta, kolorektalni kancer, kancer grlića materice, kancer štitne žlezde, i kancer pljuvačnih žlezda. Proizvodni artikal može da sadrži kontejner i etiketu ili uputstvo za lek na ili povezano sa kontejnerom. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, itd. Kontejneri mogu biti formirani od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Generalno, kontejner sadrži kompoziciju koja je efikasna za lečenje stanja i može imati sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probušiti iglom za hipodermalnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je anti-PD‑1 antitelo (ili njegov fragment) koje je ovde opisano. Etiketa ili uputstvo za lek ukazuju na to da se kompozicija upotrebljava za lečenje određenog stanja. Etiketa ili uputstvo za lek će dodatno sadržati uputstva za primenu kompozicije antitela pacijentu. Takođe se razmatraju proizvodni artikli i kompleti koji sadrže kombinatorne terapije koje su ovde opisane.
[0426] Uputstvo za lek označava uputstva koja se po običaju nalaze u komercijalnim pakovanjima terapijskih proizvoda, a koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapijskih proizvoda. Uputstvo za lek može naznačiti da se kompozicija upotrebljava za lečenje kancera (kao što su kancer glave i vrata, kancer pluća, ili kolorektalni kancer).
[0427] Pored toga, proizvodni artikal može dodatno da sadrži drugi kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fosfatom puferisani fiziološki rastvor, Ringerov (Ringer’s) rastvor i rastvor dekstroze. Dodatno može uključivati i druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, i špriceve.
[0428] Takođe su opisani kompleti koji su korisni za različite svrhe, npr. za izolaciju ili detekciju PD‑1 kod pacijenata, opciono u kombinaciji sa proizvodnim artiklima. Za izolaciju i prečišćavanje PD‑1, komplet može da sadrži anti-PD‑1 antitelo (ili njegov fragment) koje je ovde opisano povezano sa perlama (npr. SEPHAROSE™ perlama). Kompleti mogu da sadrže antitela za detekciju i kvantifikaciju PD‑1 in vitro, npr. u ELISA ili Western blot testu. Kao i kod proizvodnog artikla, komplet sadrži kontejner i etiketu ili uputstvo za lek na ili povezano sa kontejnerom. Na primer, kontejner sadrži kompoziciju koja sadrži najmanje jedno anti-PD‑1 antitelo koje je ovde opisano. Mogu biti uključeni dodatni kontejneri koji sadrže, npr. razblaživače i pufere, kontrolna antitela. Etiketa ili uputstvo za lek mogu obezbediti opis kompozicije kao i uputstva za namenjenu in vitro ili dijagnostičku upotrebu.
[0430] PRIMERI
[0432] PRIMER 1
[0434] Razvoj anti-PD1 antitela
[0436] Razvoj anti-PD‑1 antitela je sumiran kao što sledi. Klonovi pozitivni na anti-PD‑1 antitela identifikovani su pregledom Fab biblioteke faga generisane iz hibridoma koji su konstruisani od PD‑1 (prečišćeni rekombinantni 6xHis-označeni PD‑1_ECD antigenski imunizovani miševi). In vitro funkcionalni testovi, detaljnije opisani u nastavku, izvedeni su kako bi se okarakterisali klonovi.
[0437] Ukratko, serijska razblaženja klonova hibridoma inkubirana su sa pločama obloženim PD1-His proteinom tokom jednog sata na sobnoj temperaturi, a aktivnost vezivanja PD1 praćena je na 450 nm. Ploče su blokirane sa 5% mleka u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru (PBS) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i isprane su sa PBS-tween 20 (PBST) pre dodavanja razblaženja hibridoma. Posle inkubacije sa klonovima hibridoma, ploče su isprane sa PBST, inkubirane sa 1:4000 anti-mišjim IGG-HRP na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, isprane sa PBST, razvijene sa tetrametilbenzidinom (TMB), i na kraju je upotrebljena H<2>SO<4>za zaustavljanje reakcije, a apsorbanca je izmerena na 450 nm.
[0438] [0183] Protočna citometrija je pokazala da klonovi sa identifikacionim brojevima 11, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 27, i 28 mogu da vezuju PD‑1. Uslovi protočne citometrije za procenu vezivanja PD‑1 uključivali su sledeće korake: 1) 4E+05 CHO-S ćelija koje eksprimiraju PD‑1 isprane su sa PBS (2% FBS) dva puta; 2) Dodat je supernatant hibridoma, inkubirano je na 4 °C tokom 30 min; 3) Ćelije su centrifugirane tokom 5 min na 500 x g; 4) Isprane su sa PBS (2% FBS) dva puta; 5) Dodat je 1:150 razblaženi kozji anti-humani IgG-FITC, inkubacija 30 min na 4 °C; 6) Ćelije su isprane sa PBS (2% FBS) dva puta; i 7) Ćelije su suspendovane u 50 µl 1x PBS, analiza pomoću protočne citometrije.
[0439] Protočna citometrija je upotrebljena za procenu sposobnosti supernatanata hibridoma da blokiraju vezivanje između PD-L1 i PD1. Rezultati su otkrili da je klon #11 blokirao vezivanje ekvivalentno referentnom anti-PD‑1 antitelu, npr. Nivolumab. Sprovedeni test vezivanja pomoću protočne citometrije uključivao je sledeće korake: 1) 4E+05 ćelija po uzorku isprano je sa PBS (2% FBS) dva puta; 2) Pomešano je 8 ug/ml biotin-PDL1 i supernatanta hibridoma, odnos zapremina je bio 1:1; 3) Dodato je 60 ul smeše iz koraka 2 ćelijama i inkubirano je tokom 30 min na 4 °C; 4) Ćelije su isprane dva puta sa PBS (2% FBS); 5) Ćelije su inkubirane sa avidin-FITC (razblaženje 1:65) tokom 30 min na 4 °C; i 6) Ćelije su isprane dva puta sa PBS (2% FBS).
[0440] Jedna pozitivna PD‑1 kolonija (c1G4) je identifikovana u kompetentnim ćelijama SS320. Karakteristike i sekvence c1G4 klona su obezbeđene u nastavku.
[0442] PRIMER 2
[0444] Generisanje humanizovanog anti-PD‑1 antitela 1G4 (h1G4)
[0446] Humanizovano anti-PD‑1 antitelo 1G4 (h1G4) je generisano upotrebom varijabilnog regiona lakog lanca IGKV1‑39*01 humane germinativne linije i varijabilnog regiona teškog lanca IGHV3‑11*04 humane germinativne linije. Ukratko, humanizacija je izvršena graftovanjem ostataka CDR iz lakog lanca i teškog lanca himernog c1G4 na slične regione okvira lakog lanca i teškog lanca humanog imunoglobulina. Biblioteke humanizovanog antitela sa graftovanim CDR mogu se generisati za dodatno in vitro sazrevanje afiniteta zasnovano na prikazivanju faga kako bi se poboljšao afinitet za njegov antigen.
[0447] [0187] Poravnanje sekvenci za c1G4 i h1G4 pokazano je na Slikama 8A i 8B. SL. 8A pokazuje poravnanje aminokiselinske sekvence lakih lanaca himernog c1G4, humanizovanog h1G4, varijabilnog regiona lakog lanca IGKV1‑39*01 humane germinativne linije, i Nivolumaba (NIV). SL. 8B pokazuje poravnanje aminokiselinske sekvence teških lanaca himernog c1G4, humanizovanog h1G4, varijabilnog regiona teškog lanca IGHV3‑11*04 humane germinativne linije, i Nivolumaba (NIV). CDR (regioni koji određuju komplementarnost) koji su graftovani iz c1G4 za humanizaciju označeni su masnim i podvučenim tekstom.
[0449] PRIMER 3
[0451] Određivanje ravnotežne konstante disocijacije (KD) c1G4 i h1G4
[0453] Afinitet vezivanja i kinetika izmereni su upotrebom rezonance površinskog plazmona (SPR). Anti-humani IgG Fc je prvo imobilisan na senzorskom čipu i zatim je zarobljeno referentno anti-PD‑1 antitelo, c1G4, i h1G4 sa Rmax ~ 150 RU. Eksperimenti su sprovedeni na 25 °C, a merenja su vršena sa serijskim razblaženjima PD‑1-His od 58,8 nM do 7,35 nM, koja su propuštana preko zarobljenih antitela u HBS-P+ puferu suplementovanom sa 0,1% (tež./zapr.) BSA. Svi podaci su analizirani pomoću softvera za procenu i krive su fitovane pomoću 1:1 Langmuir modela vezivanja.
[0454] Kinetika asocijacije i disocijacije, zajedno sa izračunatim afinitetom (KD), izmerena je rezonancom površinskog plazmona (SPR). Poboljšanje afiniteta za c1G4 i h1G4 u poređenju sa anti-PD‑1 ref takođe je pokazano u sledećoj Tabeli 4. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta koji su izvedeni u duplikatu.
[0456] Tabela 4
[0458]
[0461] PRIMER 4
[0463] Karakteristike vezivanja himernog c1G4 i humanizovanog h1G4 antitela
[0465] Vezivanje c1G4 za PD‑1 rekombinantni protein
[0466] ELISA testovi su izvedeni kako bi se procenilo vezivanje himernog c1G4 i referentnog anti-PD‑1 antitela za PD‑1. Serijska razblaženja himernog c1G4 i referentnog anti-PD‑1 antitela zarobljena su sa PD‑1-His u bunarićima mikrotitarske posude. Količina zarobljenog antitela u svakom bunariću je kvantifikovana upotrebom anti-humanog IgG Fc-HRP-konjugovanog sekundarnog antitela. HRP-konjugovano sekundarno antitelo dodato je u bunariće i, nakon inkubacije, višak sekundarnog antitela je ispran. TMB je dodat u bunariće i, nakon inkubacije, reakcija je zaustavljena, a HRP aktivnost je izmerena praćenjem povećanja apsorbance na 450 nm. Rezultati ELISA testova koji su izvedeni kako bi se uporedilo vezivanje anti-PD‑1 antitela himernog c1G4 i referentnog anti-PD‑1 antitela za PD‑1-His pokazani su na SL.1A.
[0467] SL. 1B pokazuje rezultate drugog skupa ELISA testova koji su izvedeni kako bi se uporedilo vezivanje anti-PD‑1 antitela himernog c1G4 i referentnog anti-PD‑1 antitela za PD‑1-AP. Serijska razblaženja himernog c1G4 i referentnog anti-PD‑1 antitela zarobljena su sa anti-humanim IgG Fc antitelom u bunarićima mikrotitarske posude. Količina zarobljenog antitela u svakom bunariću je kvantifikovana upotrebom AP-konjugovanog PD‑1. Nakon inkubacije, višak PD‑1-AP je ispran. Supstrat alkalne fosfataze je dodat u bunariće, i nakon inkubacije, reakcija je zaustavljena, a aktivnost AP je izmerena praćenjem povećanja apsorbance na 405 nm.
[0468] Rezultati ukazuju na to da himerno c1G4 i referentno anti-PD‑1 antitelo mogu da se vežu i za PD‑1-His i za PD‑1-AP.
[0470] Blokiranje i kompeticija vezivanja za PD‑1 ligand c1G4
[0472] Serijska razblaženja himernog c1G4 i referentnog anti-PD‑1 antitela inkubirana su sa PD-L1-AP na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Svaka smeša antitelo:antigen dodata je u bunariće mikrotitarske posude obložene sa PD‑1-His. Nakon inkubacije i ispiranja, pNPP je dodat u bunariće i inkubiran tokom 1 sata radi detekcije vezanog PD-L1-AP. Aktivnost AP je izmerena praćenjem povećanja apsorbance na 405 nm. SL. 2A pokazuje rezultate ELISA testova koji su izvedeni kako bi se uporedila sposobnost anti-PD‑1 antitela himernog c1G4 i referentnog anti-PD‑1 antitela da blokiraju vezivanje PD-L1 i PD‑1. Pronađeno je da i himerno c1G4 i referentno anti-PD‑1 antitelo blokiraju vezivanje PD-L1 za PD‑1.
[0473] SL. 2B pokazuje rezultate ELISA testova koji su izvedeni kako bi se odredila sposobnost anti-PD‑1 antitela himernog c1G4 da bude u kompeticiji sa referentnim anti-PD‑1 antitelom za vezivanje za PD‑1-His. Serijska razblaženja himernog c1G4 i referentnog anti-
[0476] 1
[0477] PD‑1 antitela prethodno su pomešana sa fiksnom koncentracijom PD‑1-His (0,1 µg/ml) na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, a zatim su vezana za ploču obloženu fiksnom koncentracijom referentnog anti-PD‑1 (4 µg/ml). Količina vezanog PD‑1-His u svakom bunariću je kvantifikovana upotrebom anti-His-HRP-konjugovanog sekundarnog antitela. Nakon inkubacije, višak sekundarnog antitela je ispran. TMB je dodat u bunariće, i nakon inkubacije reakcija je zaustavljena, a aktivnost HRP je izmerena praćenjem povećanja apsorbance na 450 nm. Fiksna koncentracija PD‑1-His (0,1 µg/ml) dodata je u ploču obloženu fiksnom koncentracijom NIV (4 µg/ml) i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, a serijska razblaženja himernog c1G4 i referentnog anti-PD‑1 antitela su zatim dodata u bunariće. Nakon inkubacije i ispiranja, količina vezanog PD‑1-His u svakom bunariću je kvantifikovana upotrebom anti-His-HRP-konjugovanog sekundarnog antitela.
[0478] Ovi podaci ukazuju da i himerno c1G4 i referentno anti-PD‑1 antitelo mogu da blokiraju vezivanje PD-L1 za PD‑1, a himerno c1G4 može da bude u kompeticiji sa anti-PD‑1 ref za vezivanje za PD‑1-His.
[0480] Vezivanje c1G4 i h1G4 za PD‑1 eksprimirajuće CHO-S ćelije
[0482] Ćelijske linije jajnika kineskog hrčka (CHO) koje eksprimiraju rekombinantni humani PD‑1 na površini ćelija razvijene su i upotrebljene za određivanje specifičnosti humanih monoklonskih antitela prema PD‑1 pomoću protočne citometrije. CHO ćelije su transfektovane ekspresionim plazmidima koji sadrže cDNA pune dužine koja kodira transmembranske oblike PD‑1. Vezivanje c1G4 i h1G4 anti-PD‑1 monoklonskih antitela procenjeno je inkubacijom transfektovanih ćelija sa serijski razblaženim anti-PD‑1 monoklonskim antitelima u FACS puferu (PBS sa 1% FBS). Ćelije su isprane protočnim puferom, a vezivanje je detektovano sa biotinom obeleženim zečjim anti-humanim IgG Fcγ Ab i streptavidin-PE. Analize pomoću protočne citometrije su izvedene upotrebom Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc.).
[0483] Slike 3A i 3B obezbeđuju vezivanje c1G4 antitela za CHO-S ćelije (SL. 3A) i PD‑1 transfektovane CHO-S ćelije (SL. 3B) pomoću protočne citometrije. Referentna anti-PD‑1 i anti-PD-L1 antitela upotrebljena su kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno. Rezultati ukazuju da se c1G4 vezalo za CHO ćelije transfektovane sa PD‑1 ali ne i za CHO ćelije koje nisu transfektovane sa humanim PD‑1.
[0484] Karakteristike vezivanja humanizovanog h1G4 i originalnog c1G4 antitela za PD‑1 na površini ćelija pokazane su na Slici 9.
[0487] 2
[0488] Blokiranje vezivanja liganda za PD‑1 odabranim c1G4 i h1G4 antitelima
[0490] Anti-PD‑1 c1G4 i h1G4 su testirana na sposobnost blokiranja vezivanja liganda PD-L1 za PD‑1 eksprimirajuće CHO-S ćelije upotrebom testa protočne citometrije. Anti-PD‑1 i anti-PD-L1 antitela su upotrebljena kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno. PD‑1 eksprimirajuće CHO-S ćelije su suspendovane u FACS puferu (PBS sa 1% FBS). Različite koncentracije c1G4 i h1G4 anti-PD‑1 antitela, referentnih anti-PD‑1 i anti-PD-L1 antitela dodate su u ćelijsku suspenziju i inkubirano je na 4 °C tokom 30 minuta. Nevezano antitelo je isprano i dodat je biotinom obeležen fuzioni protein PD-L1-Fc i inkubirano je na 4 °C tokom 30 minuta. Ćelije su isprane, a zatim obojene sa streptavidin-PE na 4 °C tokom 30 minuta. Analize pomoću protočne citometrije su izvedene upotrebom Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc.).
[0491] Anti-PD‑1 monoklonsko antitelo c1G4 blokiralo je vezivanje PD-L1 za PD‑1 transfektovane CHO-S ćelije, kao što je izmereno pomoću srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) bojenja. Ovi podaci demonstriraju da su i c1G4 i h1G4 blokirala vezivanje PD-L1 za PD‑1 transfektovane CHO-S ćelije, kao što je izmereno pomoću srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) bojenja (Slike 4 i 10).
[0493] Vezivanje humanizovanog anti-PD‑1 antitela za aktivirane humane T ćelije
[0495] Humane T ćelije su izolovane iz PBMC upotrebom MagniSort™ kompleta za obogaćivanje humanih T ćelija (eBioscience). Izolovane T ćelije su aktivirane sa 5 µg/ml fitohemaglutinina (PHA) tokom 3 dana kako bi se stimulisala ekspresija PD‑1. Aktivirane T ćelije su sakupljene i inkubirane u FACS puferu (PBS sa 2% FBS) sa blokatorom humanog Fc (eBioscience) tokom 20 minuta na 4 °C.
[0496] Vezivanje anti-PD‑1 monoklonskog antitela procenjeno je inkubacijom aktiviranih T ćelija sa serijski razblaženim anti-PD‑1 monoklonskim antitelima u FACS puferu. Ćelije su isprane sa protočnim puferom i vezivanje je detektovano pomoću FITC-obeleženog zečjeg anti-humanog IgG Fcy Ab. Analize pomoću protočne citometrije su izvedene upotrebom Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc.). Referentno anti-PD‑1 antitelo i Avastin (anti-VEGF) upotrebljeni su kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno.
[0497] Rezultati vezivanja humanizovanog anti-PD‑1 antitela h1G4 za aktivirane humane T ćelije pokazani su na Slici 12.
[0498] PRIMER 5
[0500] Efekat anti-PD‑1 c1G4 i h1G4 na proizvodnju citokina u reakciji mešovitih leukocita (MLR)
[0502] Reakcija mešovitih leukocita korišćena je kako bi se demonstrirao efekat blokiranja PD‑1 puta do limfocitnih efektorskih ćelija. T ćelije u testu su testirane na proliferaciju, sekreciju IFN-gama i sekreciju IL‑2 u prisustvu ili odsustvu anti-PD‑1 antitela.
[0503] Humane T ćelije su prečišćene iz PBMC upotrebom Lympho-kwik T (One Lamda, Inc.). Izolovane T ćelije su suspendovane u PBS i obeležene sa 1 µM CFSE na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Posle ispiranja ćelija kompletnim medijumom (RPMI‑1640 sa 10% FBS), CFSE-obeležene T ćelije su suspendovane u kompletnom medijumu u koncentraciji od 1E6/ćelija.
[0504] Alogene dendritske ćelije su generisane iz PBMC. Izolovane PBMC su inkubirane sa 200 U/ml rekombinantnog humanog IL-3 (eBioscience) preko noći kako bi se omogućilo populaciji monocita/makrofaga da se prikači za ploče. Neadherentne ćelije su uklonjene, a ploče su isprane dva puta sa kompletnim medijumom. Ćelije na pločama su zatim kultivisane u kompletnom medijumu koji je sadržao 200 U/ml humanog IL-4 (eBioscience) i 200 U/ml humanog GM-CSF (eBioscience) tokom 6 dana. Dendritske ćelije izvedene iz monocita su sazrele dodavanjem TNF-alfa (100 U/ml) u kulturu na dan 6 i inkubiranjem preko noći. Sazrele dendritske ćelije su tripsinizovane, sakupljene, i suspendovane u kompletnom medijumu u koncentraciji od 1E5/ćelija.
[0505] Svaka reakcija je sadržala 10<5>CFSE-obeleženih T ćelija i 10<4>alogenih dendritskih ćelija u ukupnoj zapremini od 200 µl. Anti-PD‑1 monoklonska antitela c1G4 ili h1G4 dodata su svakoj kulturi u različitim koncentracijama antitela. Bilo bez antitela ili sa anti-VEGF antitelom (Avastin) upotrebljeno je kao negativna kontrola. Referentno anti-PD‑1 antitelo upotrebljeno je kao pozitivna kontrola. Ćelije su kultivisane tokom 5 dana na 37 °C. Posle dana 5, iz svake kulture je uzeto 100 µl medijuma za merenje citokina. Nivoi citokina su izmereni upotrebom humanog IFN-γ ili IL‑2 ELISA MAX™ Deluxe kompleta (BioLegend). Ćelije su sakupljene i analizirane na proliferaciju T ćelija pomoću protočne citometrije.
[0506] Slika 5A ilustruje sekreciju IL-2 zavisnu od koncentracije koju promoviše monoklonsko antitelo c1G4 prema humanom PD-1, a Slika 5B ilustruje sekreciju IFN-γ zavisnu od koncentracije koju promoviše monoklonsko antitelo c1G4 prema humanom PD-1.
[0509] 4
[0510] Slika 13A ilustruje sekreciju IL-2 zavisnu od koncentracije koju promoviše monoklonsko antitelo h1G4 prema humanom PD-1, a Slika 13B ilustruje sekreciju IFN-γ zavisnu od koncentracije koju promoviše monoklonsko antitelo h1G4 prema humanom PD-1.
[0511] Monoklonsko antitelo c1G4 prema humanom PD‑1 promoviše proliferaciju CD4+ i CD8+ T ćelija u testu reakcije mešovitih leukocita. Slika 6A ilustruje proliferaciju CD4+ T ćelija pri različitim koncentracijama c1G4 antitela, a Slika 6B ilustruje proliferaciju CD8+ T ćelija pri različitim koncentracijama c1G4 antitela. Slika 14A ilustruje proliferaciju CD4+ T ćelija pri različitim koncentracijama h1G4 antitela, a Slika 14B ilustruje proliferaciju CD8+ T ćelija pri različitim koncentracijama h1G4 antitela.
[0512] Sažeto, ovi rezultati ukazuju da anti-PD‑1 monoklonska antitela c1G4 i h1G4 promovišu proliferaciju T ćelija, sekreciju IFN-gama i sekreciju IL‑2. Nasuprot tome, kulture koje sadrže antitelo negativnu kontrolu nisu pokazale povećanje proliferacije T ćelija, sekrecije IFN-gama ili IL‑2.
[0514] PRIMER 6
[0516] Aktivnost inhibicije rasta tumora c1G4 i h1G4 antitela
[0518] In vivo aktivnost anti-humanih PD‑1 antitela istraživana je na mišjim modelima ksenografta upotrebom imunokompromitovanih NOD/SCID (negojaznih dijabetičkih/sa teškom kombinovanom imunodeficijencijom) miševa. Ćelije kancera i izolovane humane PBMC su pomešane neposredno pre subkutane primene u naznačenom efektor-cilj (E:T) odnosu. Svaki miš je bilateralno inokulisan sa smešama ćelija kancera i humanih PBMC. Četiri miša su dodeljena svakoj eksperimentalnoj grupi. Prva doza testnog artikla primenjena je intraperitonealno 1 dan posle graftovanja ćelija kancera/efektorskih ćelija. Miševi su primali doze testnog artikla dva puta nedeljno tokom 3‑4 nedelje. Formiranje tumora je posmatrano kod svake životinje dva puta nedeljno. Tumori su mereni kaliperom, a zapremine tumora (V) su izračunate pomoću sledeće formule: V(mm<3>) = 0,5×(dužina(mm)ךirina(mm)ךirina(mm)/2).
[0519] [0213] Krive rasta tumora sa c1G4 ili h1G4 antitelima u HT29/PBMC ksenograft modelu pokazane su na Slikama 7A i 15A, respektivno. Podaci o zapremini pojedinačnog tumora na dan 28 sa c1G4 ili dan 21 sa h1G4 HT29/PBMC ksenograft modelom predstavljeni su na Slikama 7B i 15B, respektivno. Štaviše, krive rasta tumora sa h1G4 antitelom u NCI-H292/PBMC pokazane su na Slici 16A. Podaci o zapremini pojedinačnog tumora na dan 25 sa h1G4 antitelom predstavljeni su na Slici 16B. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM.
[0520] Štaviše, proučavana je i kombinovana terapija sa anti-PD‑1 i anti-VEGF monoklonskim antitelima u HT29/PBMC ksenograft modelu. Podaci koji ukazuju na poboljšanu inhibiciju tumora sa kombinacijom anti-PD‑1 i anti-VEGF prikazani su na Slici 21.
[0522] PRIMER 7
[0524] Unakrsna reaktivnost između vrsta h1G4
[0526] Rekombinantni humani, pacovski, mišji, i cinomolgus majmunski PD‑1 fuzioni proteini kupljeni su od Sino Biological Inc. PD‑1/Fc (9 ng po bunariću) su imobilisani na test ploči sa 96 bunarića inkubacijom preko noći na 4 °C. Mesta nespecifičnog vezivanja su blokirana upotrebom 5% obranog mleka u PBS tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Posle tri ispiranja ploča sa PBST, naznačene koncentracije h1G4, referentnog anti-PD‑1 (pozitivna kontrola), i HLX01 (negativna kontrola) inkubirane su sa imobilisanim proteinima tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta sa PBST, a zatim inkubirane tokom jednog sata na sobnoj temperaturi sa peroksidazom obeleženim kozjim antihumanim IgG F(ab)'<2>(Jackson ImmunoResearch Laboratories) razblaženim 1/10.000 u PBS. Posle ispiranja, ploče su razvijene upotrebom TMB (eBioscience). Apsorbanca je očitana na talasnoj dužini od 450 nm pomoću Vmax čitača mikroploča (Molecular Devices).
[0527] Slike 11A‑11D pokazuju unakrsnu reaktivnost između vrsta h1G4 sa humanim (Sl.
[0528] 11A), cinomolgus majmunskim (Sl. 11B), mišjim (Sl. 11C), i pacovskim (Sl. 11D) PD‑1 proteinima.
[0530] PRIMER 8
[0532] Aktivnost inhibicije rasta tumora h1G4 antitela
[0534] Aktivnost inhibicije rasta tumora h1G4 antitela kod hPD1 KI miševa
[0536] [0217] In vivo aktivnost anti-humanih PD‑1 antitela istraživana je kod C57BL/6 miševa genetički projektovanih sa humanim PD‑1 (hPD1 KI miševi). Miševi su subkutano inokulisani sa humanim PD-L1 transfektovanim mišjim ćelijama kancera kolona (1E6 ćelija po mišu). Tretmani antitelima su započeti kada su zapremine tumora dostigle približno 75 mm<3>(dan 9). Četiri životinje su dodeljene svakoj eksperimentalnoj grupi pre tretmana. Životinje su primale doze anti-PD‑1 antitela dva puta nedeljno tokom 3‑4 nedelje. Formiranje tumora je posmatrano kod svake životinje dva puta nedeljno. Tumori su mereni kaliperom, a zapremine tumora (V) su izračunate pomoću sledeće formule: V(mm<3>) = 0,5×(dužina(mm)ךirina(mm)ךirina(mm)/2). Aktivnost inhibicije rasta tumora h1G4 antitela kod hPD1 KI miševa pokazana je na Slici 17.
[0538] Studija efikasnosti h1G4 u ksenograft modelu ćelijske linije trostruko negativnog kancera dojke (TNBC) kod humanizovanih NSG miševa
[0540] Humanizovani NSG miševi (NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ) su subkutano inokulisani sa MDA-MB‑231 (ćelijska linija humanog trostruko negativnog kancera dojke). Miševi su nasumično podeljeni u 3 grupe (n=9/grupi) na osnovu zapremine tumora u skladu sa tabelom kada zapremine tumora dostignu ~ 60‑150 mm<3>. Miševi su dozirani intraperitonealno sa h1G4 jednom na svakih 7 dana na dane studije 0, 7, 14, 21, i 28. Keytruda (anti-PD‑1) je intraperitonealno injektirano jednom na svakih 5 dana na dane studije 0, 5, 10, 15, i 20. Formiranje tumora je posmatrano kod svake životinje na svaka 3‑4 dana. Tumori su mereni kaliperom, a zapremine tumora (V) su izračunate pomoću sledeće formule: V(mm<3>) = 0,5×(dužina(mm)ךirina(mm)ךirina(mm)/2). Slika 18 ilustruje studiju efikasnosti h1G4 u ksenograft modelu ćelijske linije trostruko negativnog kancera dojke (TNBC) kod humanizovanih NSG miševa.
[0542] PRIMER 9
[0544] Određivanje ravnotežne konstante disocijacije (KD) anti-PD‑1 antitela sazrelog afiniteta 33B, 66E, i 711D
[0546] [0219] Humanizovano anti-PD‑1 antitelo h1G4 upotrebljeno je u eksperimentima in vitro sazrevanja afiniteta zasnovanog na prikazivanju faga kako bi se generisali klonovi sa poboljšanim performansama vezivanja. I CDR-L1/CDR-L3/CDR-H3 (sa fokusom na 3 CDR) i CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3 (sa fokusom na 6 CDR) biblioteke nukleinskih kiselina h1G4 generisane su putem PCR, klonirane u vektor za prikazivanje faga, i transformisane u E. coli TG1 ili SS320 ćelije kako bi se proizvela biblioteka faga. Posle tri kruga selekcije (panning) sa biotinilisanim PD‑1-His kuplovanim za streptavidinom obložene magnetne Dynabeads<®>M‑280 (Thermo Fisher Scientific #11205D) za obe biblioteke, tri Fab klona, tj.33B, 66E i 711D, pregledana su putem ELISA testa. Dodatne karakteristike kinetike izmerene su rezonancom površinskog plazmona (SPR) (videti isti SPR postupak kao što je prethodno opisano za Sliku 9) upotrebom IgG pune dužine 33B, 66E i 711D i pronađeno je da imaju performanse vezivanja koje su ekvivalentne sa ili bolje od referentnog anti-PD‑1 antitela.
[0547] Tabela 5 pokazuje aminokiselinske sekvence CDR 33B, 66E, i 711D koje su pregledane iz sazrevanja afiniteta zasnovanog na prikazivanju faga u poređenju sa h1G4.
[0549] Tabela 5
[0551]
[0552] Tabela 6 pokazuje kinetike asocijacije i disocijacije, zajedno sa izračunatim afinitetom (KD) 33B, 66E, i 711D izmereno rezonancom površinskog plazmona (SPR). Poboljšanje afiniteta anti-PD‑1 antitela u poređenju sa referentnim anti-PD‑1 antitelom takođe je pokazano u Tabeli 6. Podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta koji su izvedeni u duplikatu.
[0555]
[0559]
[0562] PRIMER 10
[0564] Funkcije antitela sazrelog afiniteta
[0566] Efekat humanih anti-PD‑1 antitela (33B, 66E i 711D) na proizvodnju citokina u reakciji mešovitih leukocita (MLR)
[0568] Prateći isti postupak kao što je prethodno opisano, ova studija pokazuje da humana monoklonska antitela prema humanom PD‑1, kao što su 66E i 711D, promovišu sekreciju IFN-γ i sekreciju IL‑2 u testu reakcije mešovitih leukocita. Referentno anti-PD‑1 antitelo i Avastin (anti-VEGF) upotrebljeni su kao pozitivna kontrola i negativna kontrola, respektivno. Slika 19A ilustruje sekreciju IL‑2 zavisnu od koncentracije pomoću antitela sazrelog afiniteta, a Slika 19B ilustruje sekreciju IFN-γ zavisnu od koncentracije pomoću antitela sazrelog afiniteta.
[0569] Aktivnost inhibicije rasta tumora humanih anti-PD‑1 antitela u HT29/PBMC ksenograft modelu
[0571] Prateći isti postupak kao što je prethodno opisano, miševima (n=4/grupi) je subkutano graftovana smeša ćelijske linije HT29 humanog kancera kolona i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC = 3:1). Anti-PD-1 antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno od dana 1. Zapremina tumora je merena dva puta nedeljno. Aktivnost inhibicije rasta tumora humanih anti-PD-1 antitela sazrelog afiniteta u HT29/PBMC ksenograft modelu pokazana je na Slici 20. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM.
[0573] PRIMER 11
[0575] PD-1 kombinovane terapije
[0577] In vivo aktivnost kombinovane terapije sa anti-PD‑1 i drugim terapijskim antitelima istraživana je na mišjim modelima ksenografta upotrebom imunokompromitovanih NOD/SCID (negojaznih dijabetičkih/sa teškom kombinovanom imunodeficijencijom) miševa. Ćelije kancera i izolovane humane PBMC su pomešane neposredno pre subkutane primene u naznačenom efektor-cilj (E:T) odnosu. Svaki miš je bilateralno inokulisan sa smešama ćelija kancera i humanih PBMC. Četiri ili pet životinja su dodeljene svakoj eksperimentalnoj grupi. Prva doza testnog artikla primenjena je intraperitonealno 1 dan posle graftovanja ćelija kancera/efektorskih ćelija. Životinje su primale doze testnog artikla dva puta nedeljno tokom 3‑4 nedelje. Formiranje tumora je posmatrano kod svake životinje dva puta nedeljno. Tumori su mereni kaliperom, a zapremine tumora (V) su izračunate pomoću sledeće formule:
[0580]
[0583] Aktivnost inhibicije rasta tumora anti-PD‑1 mAb plus anti-VEGF mAb u mišjem modelu NSCLC ksenografta
[0584] U ovim studijama, miševima (n=4/grupi) je subkutano graftovana smeša ćelija NCI-H292 humanog NSCLC i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC = 3:1). Anti-PD‑1 (h1G4), i anti-VEGF (HLX04) antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno od dana 1. Krive rasta tumora pokazane su na Slici 22A. Podaci o zapremini pojedinačnog tumora na dan 21 predstavljeni su na Slici 22B. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM. Ovi podaci ilustruju da anti-PD‑1 mAb, h1G4, u kombinaciji sa anti-VEGF mAb, HLX04, suprimira rast tumora NCI-H292 ksenografta efikasnije nego bilo koji od agenasa upotrebljen sam.
[0585] U drugim studijama, miševima (n=4/grupi) je subkutano graftovana smeša humanih NSCLC ćelija NCI-H292 i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC = 3:1). Anti-PD‑1 (h1G4), i anti-VEGFR2 (HLX06) antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno od dana 1. Krive rasta tumora su pokazane na Slici 23A. Podaci o zapremini pojedinačnog tumora na dan 21 predstavljeni su na Slici 23B. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM. Ovi podaci ilustruju da anti-PD‑1 mAb, h1G4, u kombinaciji sa anti-VEGFR2 mAb, HLX06, suprimira rast tumora NCI-H292 ksenografta efikasnije nego bilo koji od agenasa upotrebljen sam.
[0587] Aktivnost inhibicije rasta tumora anti-PD‑1 mAb plus anti-EGFR mAb u mišjem modelu NSCLC ksenografta
[0589] Prateći isti postupak kao što je prethodno opisano, miševima (n=4/grupi) je subkutano graftovana smeša ćelija NCI-H292 humanog NSCLC i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC=3:1). Anti-PD‑1 (HLX10), i anti-EGFR (HLX07) antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno od dana 1. Krive rasta tumora su pokazane na Slici 24A. Podaci o zapremini pojedinačnog tumora na dan 21 predstavljeni su na Slici 24B. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM. Ovi podaci ukazuju da anti-PD‑1 mAb, HLX10 (h1G4), u kombinaciji sa anti-EGFR mAb, HLX07, suprimira rast tumora NCI-H292 ksenografta efikasnije nego bilo koji od agenasa upotrebljen sam.
[0590] Dodatno, miševima (n=5/grupi) je subkutano graftovana smeša ćelija HT‑29 humanog kancera kolona i sveže izolovanih humanih PBMC (ćelije kancera: PBMC = 3:1). Anti-PD‑1 (HLX10), i anti-EGFR (HLX07) antitela su intraperitonealno injektirana miševima dva puta nedeljno od dana 1. Krive rasta tumora su pokazane na Slici 25A. Podaci o zapremini pojedinačnog tumora na dan 21 predstavljeni su na Slici 25B. Sve tačke podataka su srednje vrednosti ± SEM.
[0593] 1
[0594] Ovi podaci ukazuju na to da anti-PD‑1 mAb, HLX10 (h1G4), u kombinaciji sa anti-EGFR mAb, HLX07, efikasnije suprimira rast tumora BRAF mutantnih HT‑29 ksenografta nego HLX10 kada se upotrebljava samo. Tretman sa HLX10 plus HLX07 proizvodi nešto veću inhibiciju rasta tumora nego tretman sa HLX07 samim. Prosečna stopa inhibicije rasta tumora kod tretmana sa HLX10 plus HLX07 i tretmana sa HLX07 samim bila je 47% i 28%, respektivno.
[0595] Prethodni Primeri su ponuđeni samo u ilustrativne svrhe.
[0597] Lista sekvenci
[0599]
[0601] SEQ ID NO:1 (c1G4_LC nukleotidna sekvenca)
[0603]
[0606] SEQ ID NO:2 (c1G4_LC aminokiselinska sekvenca, podvučeno: Kabat definisani CDR, videti SL. 8A)
[0608]
[0611] SEQ ID NO:3 (c1G4_HC nukleotidna sekvenca)
[0614] 2
[0615]
[0617] SEQ ID NO:4 (c1G4_HC aminokiselinska sekvenca, podvučeno: Kabat definisani CDR, videti SL.8B)
[0618]
[0620] SEQ ID NO:5 (h1G4_LC nukleotidna sekvenca)
[0621]
[0623] SEQ ID NO:6 (h1G4_LC aminokiselinska sekvenca, podvučeno: Kabat definisani CDR, videti SL.8A)
[0624]
[0627] 4
[0628]
[0631] SEQ ID NO:8 (h1G4_HC aminokiselinska sekvenca, podvučeno: Kabat definisani CDR, videti SL.8B)
[0633]
[0636] SEQ ID NO:9 (c1G4 i h1G4 CDR-L1): KASQDVTTAVA
[0637] SEQ ID NO:10 (c1G4 i h1G4 CDR-L2): WASTRHT
[0638] SEQ ID NO:11 (c1G4 i h1G4 CDR-L3): QQHYTIPWT
[0639] SEQ ID NO:12 (c1G4 i h1G4 CDR-H1): FTFSNYGMS
[0640] SEQ ID NO:13 (c1G4 i h1G4 CDR-H2): TISGGGSNIY
[0641] SEQ ID NO:14 (c1G4 i h1G4 CDR-H3): VSYYYGIDF
[0642] SEQ ID NO:15 (33B CDR-L1): KASTDVTTAVA
[0643] SEQ ID NO: 16 (33B CDR-L2): WASLRHT:
[0645] SEQ ID NO: 17 (33B CDR-L3): QQHYGIPWT
[0646] SEQ ID NO: 18 (33B CDR-H1): FRFSNYGMS
[0647] SEQ ID NO: 19 (33B CDR-H2): TISGGGSNAY
[0648] SEQ ID NO: 20 (33B CDR-H3): TSYYYGIDF
[0649] SEQ ID NO: 21 (66E CDR-L1): KAKQDVTTAVA
[0650] SEQ ID NO: 22 (66E CDR-L3): QQHYWIPWT
[0651] SEQ ID NO: 23 (66E CDR-H3): VSYYYGIDL
[0652] SEQ ID NO: 24 (711D CDR-L1): KASQDVTNAVA SEQ ID NO: 25 (711D CDR-H3): SSYYYGIDL

Claims (6)

1. Patentni zahtevi
1. Anti-PD-1 antitelo za upotrebu u lečenju kancera, naznačeno time što anti-PD-1 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (VL) koja sadrži (1) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu KASQDVTTAVA (SEQ ID NO: 9); (2) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu WASTRHT (SEQ ID NO: 10); i (3) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu QQHYTIPWT (SEQ ID NO: 11), i sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja sadrži (1) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu FTFSNYGMS (SEQ ID NO: 12); (2) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu TISGGGSNIY (SEQ ID NO: 13); i (3) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VSYYYGIDF (SEQ ID NO: 14); pri čemu se anti-PD-1 antitelo primenjuje intravenskim, intramuskularnim ili subkutanim putem, i pri čemu antitelo sadrži sekvencu Fc humanog IgG4.
2. Anti-PD-1 antitelo za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što anti-PD-1 antitelo sadrži laki lanac SEQ ID NO: 6, i teški lanac SEQ ID NO: 8.
3. Anti-PD‑1 antitelo za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1‑2, naznačeno time što je antitelo multispecifično antitelo.
4. Anti-PD‑1 antitelo za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1‑3, konjugovano za terapijski agens ili obeleživač.
5. Anti-PD‑1 antitelo za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačeno time što je obeleživač odabran iz grupe koja se sastoji od radioizotopa, fluorescentne boje, i enzima.
6. Anti-PD‑1 antitelo za upotrebu u skladu sa bilo kojim prethodnim patentnim zahtevom, naznačeno time što se antitelo eksprimira od strane stabilne ćelijske linije sisara, i pri čemu je stabilna ćelijska linija sisara CHO ćelijska linija.
RS20251199A 2016-09-16 2017-09-09 Anti-pd-1 antitela za upotrebu u lečenju kancera RS67443B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662395832P 2016-09-16 2016-09-16
US201762519590P 2017-06-14 2017-06-14
EP24150762.3A EP4339615B1 (en) 2016-09-16 2017-09-09 Anti-pd-1 antibodies for use in the treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67443B1 true RS67443B1 (sr) 2025-12-31

Family

ID=61620151

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20251199A RS67443B1 (sr) 2016-09-16 2017-09-09 Anti-pd-1 antitela za upotrebu u lečenju kancera

Country Status (28)

Country Link
US (2) US11028173B2 (sr)
EP (3) EP3512885B1 (sr)
JP (1) JP7072576B2 (sr)
KR (1) KR102391338B1 (sr)
CN (1) CN109923126B (sr)
AU (1) AU2017327828B2 (sr)
BR (1) BR112019005129A2 (sr)
CA (1) CA3037144A1 (sr)
DK (1) DK4339615T3 (sr)
ES (2) ES3055536T3 (sr)
FI (2) FI4339615T3 (sr)
FR (1) FR25C1022I2 (sr)
HR (1) HRP20251501T1 (sr)
HU (2) HUE067813T2 (sr)
LT (2) LT4339615T (sr)
MY (1) MY199683A (sr)
NL (1) NL301362I2 (sr)
NO (1) NO2026007I1 (sr)
PH (1) PH12019500571A1 (sr)
PL (1) PL4339615T3 (sr)
PT (1) PT4339615T (sr)
RS (1) RS67443B1 (sr)
RU (1) RU2752832C2 (sr)
SI (1) SI4339615T1 (sr)
SM (1) SMT202500445T1 (sr)
TW (1) TWI772326B (sr)
WO (1) WO2018052818A1 (sr)
ZA (1) ZA201901865B (sr)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019382505B2 (en) * 2018-11-19 2026-02-05 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-PD-1 antibodies and uses thereof
MY204342A (en) 2019-03-25 2024-08-24 Alteogen Inc Pharmaceutical composition, comprising human hyaluronidase ph20 variant and drug, for subcutaneous injection
TWI869398B (zh) * 2019-05-10 2025-01-11 英商拜西克爾德有限公司 治療癌症之方法
WO2021006199A1 (ja) 2019-07-05 2021-01-14 小野薬品工業株式会社 Ｐｄ－１／ｃｄ３二重特異性タンパク質による血液がん治療
CN112300279A (zh) * 2019-07-26 2021-02-02 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 针对抗cd73抗体和变体的方法和组合物
EP4011918A4 (en) 2019-08-08 2023-08-23 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. DUAL SPECIFIC PROTEIN
WO2021037007A1 (zh) 2019-08-29 2021-03-04 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 抗pd-l1抗体及其应用
CN110787292B (zh) * 2020-01-06 2020-04-24 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 一种细胞程序性死亡受体1抗体制剂及其用途
WO2021139780A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-tigit antibodies, multispecific antibodies comprising the same and methods of using the same
KR20220131279A (ko) 2020-01-21 2022-09-27 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크. 항lag3단일 클론 항체 및 그 제조 방법과 응용
CN113336847B (zh) * 2021-02-03 2022-08-23 上海莱馥医疗科技有限公司 一种抗pd-1抗体
EP4293046A4 (en) * 2021-02-10 2025-03-05 Shanghai Jemincare Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-pd-1 antibody and use thereof
EP4562048A1 (en) * 2022-07-28 2025-06-04 Merck Sharp & Dohme LLC Pharmaceutical compositions of programmed death receptor 1 (pd-1) antibodies and ph20 variants or fragments thereof
KR20250054235A (ko) * 2022-07-28 2025-04-22 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 프로그램화된 사멸 수용체 1 (PD-1) 항체 및 rHuPH20 또는 그의 변이체 또는 단편의 제약 조성물
WO2025140467A1 (zh) * 2023-12-29 2025-07-03 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 稳定的高浓度抗pd-1抗体药物制剂

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
ATE97498T1 (de) 1984-01-30 1993-12-15 Imp Cancer Res Tech Verbesserungen an wachstumsfaktoren.
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5401638A (en) 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US4994560A (en) 1987-06-24 1991-02-19 The Dow Chemical Company Functionalized polyamine chelants and radioactive rhodium complexes thereof for conjugation to antibodies
US5489425A (en) 1987-06-24 1996-02-06 The Dow Chemical Company Functionalized polyamine chelants
ZA894792B (en) 1988-06-24 1991-04-24 Dow Chemical Co Macrocyclic bifunctional chelants,complexes thereof and their antibody conjugates
WO1989012631A1 (en) 1988-06-24 1989-12-28 The Dow Chemical Company Macrocyclic bifunctional chelants, complexes thereof and their antibody conjugates
US5756065A (en) 1988-06-24 1998-05-26 The Dow Chemical Company Macrocyclic tetraazacyclododecane conjugates and their use as diagnostic and therapeutic agents
US5274119A (en) 1988-07-01 1993-12-28 The Dow Chemical Company Vicinal diols
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5696239A (en) 1988-10-31 1997-12-09 The Dow Chemical Company Conjugates possessing ortho ligating functionality and complexes thereof
US5342604A (en) 1988-10-31 1994-08-30 The Dow Chemical Company Complexes possessing ortho ligating functionality
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5808003A (en) 1989-05-26 1998-09-15 Perimmune Holdings, Inc. Polyaminocarboxylate chelators
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ES2096590T3 (es) 1989-06-29 1997-03-16 Medarex Inc Reactivos biespecificos para la terapia del sida.
DE68926248T2 (de) 1989-09-29 1996-12-19 Oncogene Science Inc p100 "neu" menschlisches Protein and Verwendung dieses Proteins zum Nachweis von preneoplasmatischen- oder neoplasmatischen beim Menschen
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69232137T2 (de) 1991-11-25 2002-05-29 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5505931A (en) 1993-03-04 1996-04-09 The Dow Chemical Company Acid cleavable compounds, their preparation and use as bifunctional acid-labile crosslinking agents
MD1367C2 (ro) 1992-11-13 2000-11-30 Idec Pharmaceuticals Corporation Metode de tratament al limfomului celulelor B, anticorpi anti-CD20, hibridom.
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
CA2226575C (en) 1995-07-27 2011-10-18 Genentech, Inc. Stabile isotonic lyophilized protein formulation
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
EP0918858A1 (en) * 1996-05-10 1999-06-02 Biogen, Inc. Common gamma chain blocking agents
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
EP0999853B1 (en) 1997-06-13 2003-01-02 Genentech, Inc. Stabilized antibody formulation
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2292236T3 (es) 1998-04-02 2008-03-01 Genentech, Inc. Variantes de anticuerpos y sus fragmentos.
HU230769B1 (hu) 1999-01-15 2018-03-28 Genentech Inc. Módosított effektor-funkciójú polipeptid-változatok
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
RU2494107C2 (ru) 2005-05-09 2013-09-27 Оно Фармасьютикал Ко., Лтд. Моноклональные антитела человека к белку программируемой смерти 1 (pd-1) и способы лечения рака с использованием анти-pd-1-антител самостоятельно или в комбинации с другими иммунотерапевтическими средствами
CN104356236B (zh) 2005-07-01 2020-07-03 E.R.施贵宝&圣斯有限责任公司 抗程序性死亡配体1(pd-l1)的人单克隆抗体
MX2011000970A (es) * 2008-08-29 2011-03-15 Symphogen As Anticuerpos anti-cd5.
BR112014009962A2 (pt) 2011-10-27 2019-09-24 Nkt Therapeutics Inc anticorpos humanizados para inkt
HK1208470A1 (en) * 2012-03-29 2016-03-04 Biogen Ma Inc. Biomarkers for use in integrin therapy applications
EP3218409A2 (en) 2014-11-11 2017-09-20 Sutro Biopharma, Inc. Anti-pd-1 antibodies, compositions comprising anti-pd-1 antibodies and methods of using anti-pd-1 antibodies
TWI595006B (zh) * 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
US20160200815A1 (en) * 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
CR20180151A (es) * 2015-10-02 2018-05-25 Hoffmann La Roche Antcuierpos anti-pd1 y métodos de uso

Also Published As

Publication number Publication date
HUE067813T2 (hu) 2024-11-28
EP3512885A4 (en) 2020-04-15
LT4339615T (lt) 2025-12-10
EP4339615B1 (en) 2025-11-05
TW201815823A (zh) 2018-05-01
FIC20260002I1 (fi) 2026-01-19
ES2977137T3 (es) 2024-08-19
US20210277122A1 (en) 2021-09-09
FI4339615T3 (sv) 2025-12-12
FR25C1022I2 (fr) 2026-04-03
MY199683A (en) 2023-11-16
KR102391338B1 (ko) 2022-04-26
JP2020501598A (ja) 2020-01-23
EP4696785A2 (en) 2026-02-18
BR112019005129A2 (pt) 2019-06-04
SMT202500445T1 (it) 2026-01-12
US11028173B2 (en) 2021-06-08
EP4339615A3 (en) 2024-05-22
DK4339615T3 (da) 2025-12-22
US11685783B2 (en) 2023-06-27
HRP20251501T1 (hr) 2026-02-13
US20190218295A1 (en) 2019-07-18
CA3037144A1 (en) 2018-03-22
JP7072576B2 (ja) 2022-05-20
NL301362I2 (nl) 2026-02-10
EP3512885A1 (en) 2019-07-24
ZA201901865B (en) 2020-12-23
KR20190051037A (ko) 2019-05-14
NO2026007I1 (no) 2026-01-22
SI4339615T1 (sl) 2026-01-30
RU2019107134A (ru) 2020-09-14
CN109923126A (zh) 2019-06-21
FR25C1022I1 (fr) 2025-08-01
CN109923126B (zh) 2022-06-03
TWI772326B (zh) 2022-08-01
PL4339615T3 (pl) 2026-02-23
ES3055536T3 (en) 2026-02-12
EP3512885B1 (en) 2024-02-21
WO2018052818A1 (en) 2018-03-22
PT4339615T (pt) 2025-12-03
RU2019107134A3 (sr) 2020-10-16
PH12019500571A1 (en) 2019-08-19
LTPA2026505I1 (sr) 2026-02-10
EP4339615A2 (en) 2024-03-20
AU2017327828B2 (en) 2023-11-16
AU2017327828A1 (en) 2019-04-04
RU2752832C2 (ru) 2021-08-09
HUS2500024I1 (hu) 2025-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11618786B2 (en) Anti-PD-L1 antibodies and variants
US11685783B2 (en) Anti-PD-1 antibodies
JP2017521054A (ja) 抗上皮増殖因子受容体（ｅｇｆｒ）抗体
US20180193456A1 (en) Anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 (vegfr2) antibodies
HK40109110A (en) Anti-pd-1 antibodies
HK40103517A (zh) 抗-pd-l1抗体及变异体
HK40011908B (en) Anti-pd-1 antibodies
HK40011908A (en) Anti-pd-1 antibodies