ES3055681T3 - Pneumococcal conjugate vaccine formulations - Google Patents

Pneumococcal conjugate vaccine formulations

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ES3055681T3
ES3055681T3 ES18756694T ES18756694T ES3055681T3 ES 3055681 T3 ES3055681 T3 ES 3055681T3 ES 18756694 T ES18756694 T ES 18756694T ES 18756694 T ES18756694 T ES 18756694T ES 3055681 T3 ES3055681 T3 ES 3055681T3
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William Smith
Cecilia Giovarelli
Denise Nawrocki
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Merck Sharp and Dohme LLC
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Merck Sharp and Dohme LLC
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Abstract

La presente invención proporciona formulaciones de vacunas conjugadas neumocócicas que comprenden sistemas surfactantes que incorporan polisorbato 20 o una combinación de un poloxámero y un poliol. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Formulaciones de vacuna neumocócica conjugada
[0003] Campo de la invención
[0004] La presente invención proporciona formulaciones de vacuna neumocócica conjugada que comprenden sistemas de tensioactivo que incorporan polisorbato 20.
[0005] Antecedentes de la invención
[0006] Streptococcus pneumoniae, un ejemplo de una bacteria encapsulada, es una causa importante de enfermedades graves en todo el mundo. En 1997, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) estimaron que había 3.000 casos de meningitis neumocócica, 50.000 casos de bacteriemia neumocócica, 7.000.000 casos de otitis media neumocócica y 500.000 casos de neumonía neumocócica anualmente en los Estados Unidos. Véase Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR-8):1-13. Además, las complicaciones de estas enfermedades pueden ser significativas con algunos estudios que informan hasta un 8 % de mortalidad y un 25 % de secuelas neurológicas con meningitis neumocócica. Véase Arditi et al., 1998, Pediatrics 102:1087-97.
[0007] Las vacunas de polisacáridos neumocócicos multivalentes que se han autorizado durante muchos años han demostrado ser invaluables para prevenir la enfermedad neumocócica en adultos, particularmente, los ancianos y los de alto riesgo. Sin embargo, los bebés y los niños pequeños responden mal a los polisacáridos neumocócicos no conjugados. Los polisacáridos bacterianos son inmunógenos independientes de células T, que provocan una respuesta débil o nula en bebés. La conjugación química de un inmunógeno de polisacárido bacteriano con una proteína transportadora convierte la respuesta inmunitaria en una dependiente de linfocitos T en los lactantes. Toxoide diftérico (DTx, una versión químicamente desintoxicada de DT) y CRM<197>se han descrito como proteínas portadoras para inmunógenos de polisacáridos bacterianos debido a la presencia de epítopos estimulantes de células T en sus secuencias de aminoácidos.
[0008] La vacuna neumocócica conjugada, Prevnar<®>, que contiene los 7 serotipos aislados con mayor frecuencia (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F) que causan enfermedad neumocócica invasiva en niños pequeños y bebés en ese momento, se autorizó por primera vez en los Estados Unidos en febrero de 2000. Tras el uso universal de Prevnar<®>en los Estados Unidos, ha habido una reducción significativa en la enfermedad neumocócica invasiva en niños debido a los serotipos presentes en Prevnar<®>. Véase Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54(36):893-7. Sin embargo, existen limitaciones en la cobertura de serotipos con Prevnar<®>en ciertas regiones del mundo y alguna evidencia de ciertos serotipos emergentes en los Estados Unidos (por ejemplo, 19A y otros). Véase O'Brien et al., 2004, Am J Epidemiol 159:634-44; Whitney et al., 2003, N Engl J Med 348:1737-46; Kyaw et al., 2006, N Engl J Med 354:1455-63; Hicks et al., 2007, J Infect Dis 196:1346-54; Traore et al., 2009, Clin Infect Dis 48:S181-S189.
[0009] Prevenar 13<®>es una vacuna conjugada de polisacárido-proteína neumocócica 13-valente que incluye los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F. Véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.º US 2006/0228380 A1, Prymula et al., 2006, Lancet 367:740-48 y Kieninger et al., Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers, presentado en la 48.ª reunión anual de ICAAC/ISDA , Washington DC, 25-28 de octubre de 2008. Véase, también, Dagan et al., 1998, Infect Immun. 66: 2093-2098 y Fattom, 1999, Vaccine 17:126.
[0010] Publicación de solicitud de patente china n.º CN 101590224 A describe una vacuna conjugada de polisacáridoproteína neumocócica 14-valente que incluye los serotipos 1, 2, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F. patente de EE.UU. n.º 8.192.746 describe una vacuna conjugada de polisacárido-proteína neumocócica 15-valente que tiene los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F, todos conjugados individualmente a polipéptidos de CRM<197>.
[0011] También se han descrito múltiples sistemas de proteínas portadoras. Véase, por ejemplo, Publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.º 20100209450, 20100074922, 20090017059, 20090010959 y 20090017072.
[0012] Formulaciones que comprenden S. pneumoniae se han divulgado conjugados de polisacárido-proteína y tensioactivos que incluyen polisorbato 80 (PS-80) y poloxámero 188 (P188). Véase la patente de EE.UU. n.º 8.562.999 y la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.º US20130273098, respectivamente.
[0013] Sumario de la invención
[0014] La información técnica expuesta a continuación puede ir, en algunos aspectos, más allá del alcance de la invención actualmente reivindicada, que se define por el conjunto de reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para situar la presente invención en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados.
[0015] Las referencias en el presente documento a métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía deben interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas, combinaciones y/o medicamentos para su uso en esos métodos.
[0016] La presente invención proporciona una formulación que comprende una composición de conjugado neumocócico 15-valente que consiste esencialmente en polisacárido S. pneumoniae de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23 F y 33F conjugado a CRM<197>; Histidina 20 mM pH 5,8; NaCl 150 mM; 250 µg/ml de adyuvante de fosfato de aluminio (APA); y polisorbato 20 al 0,2 % p/v; formulado como una forma de dosificación que contiene 4 µg/ml de cada sacárido, excepto para 6B a 8 µg/ml; y 64 µg/ml de proteína portadora de CRM<197>; en donde los conjugados de proteína de polisacárido de los serotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F y 23F se preparan en condiciones de DMSO y los conjugados de proteína de polisacárido de los serotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F y 33F y se preparan usando condiciones acuosas.
[0017] También se describe una formulación que comprende (i) uno o más conjugados de polisacárido-proteína; (ii) una solución salina tamponada de pH que tiene un pH en el intervalo de 5,0 a 7,5; (iii) una sal de aluminio; y (iv) un sistema tensioactivo seleccionado de a) polisorbato 20 y (b) un poloxámero que tiene un peso molecular en el intervalo de 1100 Da a 17.400 Da y un poliol seleccionado de propilenglicol (PG) y polietilenglicol (PEG) 400.
[0018] Uno o más de los conjugados de polisacárido-proteína se preparan en un disolvente aprótico, p. ej. dimetilsulfóxido (DMSO). En ciertos aspectos de esta realización, el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % o más de los conjugados (sobre una base de proteína total) se preparan en un disolvente aprótico tal como DMSO. Como alternativa, 10-100 %, 24 %-100 % o 24-80 % de los conjugados (sobre una base de proteína total) se preparan en un disolvente aprótico, por ejemplo, DMSO. En ciertos casos, el sistema tensioactivo es polisorbato 20 o una combinación de poloxámero/poliol como se ha descrito anteriormente.
[0019] En ciertos casos, el sistema tensioactivo comprende un poloxámero que tiene un peso molecular en el intervalo de 1100 Da a 17.400 Da, 7.500 Da a 15.000 Da o 7.500 Da a 10.000 Da. El poloxámero puede ser el poloxámero 188 o el poloxámero 407. En ciertos aspectos, la concentración final del poloxámero es del 0,001 % al 5 % p/v, del 0,025 % al 1 % p/v. En un aspecto específico, el poliol es propilenglicol y está en una concentración final del 1 % al 20 % p/v. En otro aspecto específico, el poliol es polietilenglicol 400 y está en una concentración final del 1 % al 20 % p/v. El sistema tensioactivo comprende polisorbato 20. La concentración final del polisorbato 20 está en el intervalo de 0,001 % a 10 % p/v, o de 0,025 % a 2,5 % p/v, o de 0,025 % a 0,1 % p/v. En ciertos casos en los que el sistema tensioactivo comprende PS-20, la formulación comprende además un poliol seleccionado de propilenglicol y polietilenglicol. El polietilenglicol o propilenglicol puede estar a una concentración final del 6 % al 20 % p/v. En ciertos casos, el polietilenglicol es polietilenglicol 400.
[0020] La solución salina tamponada de pH tiene un pH en el intervalo de 5,0 a 7,0. El tampón se puede seleccionar del grupo que consiste en fosfato, succinato, L-histidina, MES, MOPS, HEPES, acetato o citrato. El tampón es histidina a una concentración final de 5 mM a 50 mM. En algunos casos, el tampón puede ser succinato a una concentración final de 1 mM a 10 mM. La histidina está a una concentración final de 20 mM ± 2 mM. La sal en la solución salina de pH tamponado puede ser cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio o una combinación de los mismos. La solución salina tamponada de pH es cloruro de sodio. La solución salina puede estar presente a una concentración de 20 mM a 170 mM. El cloruro de sodio está presente en concentraciones de 150 mM.
[0021] En ciertos casos, los conjugados de polisacárido-proteína comprenden uno o más polisacáridos neumocócicos conjugados con una proteína portadora. En ciertos casos, la proteína portadora se selecciona de CRM<197>, fragmento B de toxina diftérica (DTFB), DTFB C8, toxoide diftérico (DT), toxoide tetánico (TT), fragmento C de TT, toxoide de tos ferina, toxoide de cólera, E. coli LT (enterotoxina termolábil), E. coli ST (enterotoxina termoestable), exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, y combinaciones de los mismos. En un caso específico, uno o más de los conjugados de polisacárido-proteína se conjugan a CRM<197>. En ciertos casos, uno o más de los conjugados de proteína de polisacárido se preparan usando aminación reductora en el disolvente no acuoso DMSO. En este caso, los conjugados de proteína de polisacárido de los serotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F y 23F se pueden preparar usando aminación reductora en DMSO, y los conjugados de proteína de polisacárido de los serotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F y 33F se pueden preparar usando aminación reductora en solución acuosa. En ciertos casos, cada dosis se formula para contener: 4 µg/mL u 8 µg/mL de cada sacárido, excepto para 6B a 8 µg/mL o 16 µg/mL; y aproximadamente 64 µg/mL o 128 µg/mL proteína portadora de CRM<197>.
[0022] Breve descripción de los dibujos
[0023] Figuras 1A-D: Análisis SDS-PAGE de intermedios de proceso DTFB en condiciones no reductoras. R: Las muestras mostradas son: Estándares de peso molecular (carril 1 desde la izquierda); producto eluyente de tres ejecuciones de cromatografía de intercambio aniónico multimodal replicadas (MM AEX1, MM AEX2, MM AEX3, carriles 2-4); producto de eluyente agrupado de ejecuciones de cromatografía de intercambio aniónico multimodal (MM AEX Pool, carril 5); retenido diafiltrado (UF-DR, carril 6); y el intermedio a granel final después de una filtración de 0,2 micrómetros (FBI, carril 7). PÁGINA DE FDS: NuPAGE gel de Bis-Tris al 4-12 %; 5 µg/carril; Tinción de gel de proteína SYPRO Ruby. B: Análisis de SDS-PAGE (NuPAGE 4-12 % Bis-Tris gel; carriles 2, 4, 8, 10: 5 µg/carril; carril 6: 2 µg/carril; Tinción de gel de proteína SYPRO Ruby) de intermedios de proceso de DTFB en condiciones reductoras. Las muestras mostradas son: estándares Mark-12 (carriles 1 y 12); CRM<197>purificada utilizada para generar DTFB (CRM<197>, carriles 2 y 10); CRM<197>escindida proteolíticamente después de la etapa de digestión con tripsina, cargada en resina de cromatografía de intercambio catiónico multimodal (alimentación MM CEX, carril 4); producto de cromatografía de intercambio catiónico multimodal (producto MM CEX, carril 6); y el intermedio a granel final después de una filtración de 0,2 micrómetros (DTFB-FBI, carril 8). C: Las muestras mostradas son: marcadores de peso molecular (carril 1 desde la izquierda); retenido concentrado inicial después de cromatografía de intercambio catiónico multimodal (ICR, carril 2); retenido diafiltrado (UF-DR, carril 3); retenido concentrado después de diafiltración (UF-OCR, carril 4); lavado de membrana para recuperación de producto (UF-W, carril 5); retenido agrupado final más lavado (UF-FR, carril 6); y el intermedio a granel final después de una filtración de 0,2 micrómetros (FBI, carril 6). SDS-PAGE: gel de Trisglicina al 14 %; 8,3-8,4 µg/carril; Tinción de gel de proteína GelCode Blue. D: Análisis SDS-PAGE (NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel; tinción de gel de proteína SYPRO Ruby) de intermedios de proceso DTFB ejecutados en condiciones reductoras. Las muestras mostradas son: estándares Mark-12 (carriles 1 y 12); CRM<197>escindida proteolíticamente después de la etapa de digestión con tripsina, cargada en resina de cromatografía de intercambio catiónico multimodal (alimentación MM CEX, carril 2); CRM<197>purificada utilizada para generar DTFB (CRM<197>, carril 3); flujo a través durante la carga de la columna (flujo a través de MM CEX, carril 4); lavado de columna después de la carga (lavado MM CEX, carril 5); producto recogido después de la etapa de elución de cromatografía de intercambio catiónico multimodal (producto MM CEX, carril 7; producto MM CEX diluido 10 veces, carril 9); y el producto de elución tardía recogido después de la etapa de elución de la cromatografía de intercambio catiónico multimodal (producto MM CEX de elución tardía, carril 11).
[0024] Figura 2: concentración de proteína DTFB en fosfato de potasio (KPi) 100 mM en función del pH y la concentración de cloruro de sodio (NaCl). Las soluciones se mantuvieron durante la noche a temperatura ambiente y luego se centrifugaron. Sobrenadantes analizados por cromatografía de exclusión por tamaño con detección de absorbancia UV280.
[0025] Figura 3: Concentración de proteína DTFB en soluciones de fosfato de potasio (KPi) en función de la concentración de polisorbato 20 (PS-20). Las soluciones se agitaron durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego se centrifugaron. Sobrenadantes analizados por cromatografía de exclusión por tamaño con detección de absorbancia UV280.
[0026] Figura 4: Títulos de anticuerpos ELISA para ratones inmunizados con polisacárido S. pneumoniae de serotipo 3 conjugado con proteína portadora de CRM<197>o DTFB y formulada con adyuvante de fosfato de aluminio (APA). Los ratones se inmunizaron con uno de los dos lotes conjugados de CRM<197>de 3-serotipos independientes (lotes 1 y 2).
[0027] Figura 5: Curvas de supervivencia para ratones inmunizados con polisacárido capsular S. pneumoniae de serotipo 3 conjugado a proteína portadora de CRM<197>o DTFB y formulada con adyuvante de fosfato de aluminio (APA). Los ratones se inmunizaron con uno de los dos lotes conjugados de CRM<197>de 3-serotipos independientes (lotes 1 y 2). Las formulaciones de APA o solución salina únicamente también se incluyeron en el estudio como controles. Después de la inmunización, los ratones se expusieron posteriormente por vía intraperitoneal a bacterias del serotipo 3.
[0028] Figura 6: Estudio de agitación a escala de laboratorio para evaluar el impacto del tiempo y la agitación en la distribución del tamaño de partícula de una formulación conjugada de polisacárido neumocócico (PnPs) 15-valente medida por dispersión de luz estática (SLS). Los 15 serotipos de polisacáridos neumocócicos se conjugaron con CRM<197>usando aminación reductora en solución acuosa. Los conjugados se formularon en L-histidina 20 mM, pH 5,8, NaCl 150 mM y 0,25 mg/ml (p/v Al<+3>) APA para el estudio de agitación.
[0029] Figura 7: Estudio de agitación a escala de laboratorio para evaluar el impacto del tiempo y la agitación en la distribución del tamaño de partícula de las formulaciones de conjugado de polisacárido neumocócico 15-valente según lo medido por SLS. Los 15 serotipos de polisacáridos neumocócicos se conjugaron con CRM<197>usando aminación reductora en solución acuosa. Los conjugados se formularon para el estudio de agitación en L-histidina 20 mM, pH 5,8, NaCl 150 mM y 0,25 mg/ml (p/v Al<+3>) APA con poloxámero 188 al 0,08 % p/v o al 0,24 % p/v (P188).
[0030] Figura 8A-B: Estudio de envío y manipulación simulado a escala de laboratorio de formulaciones de conjugado de polisacárido neumocócico 15-valente en jeringas. Los 15 serotipos de polisacáridos neumocócicos se conjugaron con CRM<197>usando aminación reductora en solución acuosa. Los conjugados se formularon en L-histidina 20 mM, pH 5,8, NaCl 150 mM y 0,25 mg/ml (p/v Al<+3>) APA sin P188 o con 0,2 % p/v de P188. Se muestra la distribución del tamaño de partícula medida por SLS antes y después de 24 horas de rotación horizontal (A) y la evaluación visual de las jeringas después de 24 horas de rotación horizontal (B).
[0031] Figura 9: Distribuciones de tamaño de partícula (expresadas como una distribución ponderada por volumen o D[4,3] medida por SLS) de dos formulaciones de conjugado de polisacárido neumocócico 15-valente con L-histidina 20 mM, pH 5,8, NaCl 150 mM, 0,25 mg/mL (p/v Al<+3>) APA y 0,2 % p/v de P188. Formulación PCV15<ac>estaba compuesto de conjugados de polisacárido neumocócico-CRM<197>, generados por aminación reductora en solución acuosa. Formulación PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>usó una combinación de 15 conjugados de polisacáridos neumocócicos, algunos generados por aminación reductora en solución acuosa y otros por aminación reductora en solución no acuosa; todos los serotipos de polisacáridos neumocócicos en PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>se conjugaron a CRM<197>excepto para el serotipo 3 (ST3), que se conjugó a DTFB. Las formulaciones se llenaron en jeringas y se agitaron horizontalmente durante hasta 24 horas a 4 °C antes de la evaluación de SLS.
[0032] Figuras 10A-B: Valores de D[4,3] medidos por SLS de PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>formulaciones que contienen P188 (A), PS-80 (B) y PS-20 (A, B) después de agitar y hasta 24 horas de rotación horizontal en jeringas HyPak de 1,5 ml.
[0033] Figura 11: Concentraciones de IgG específicas del serotipo 3 neumocócico de monos Rhesus infantiles (IRM) inmunizados con formulaciones de conjugado de polisacárido neumocócico 15-valente con adyuvante de fosfato de aluminio (APA). Todas las formulaciones contenían polisacárido capsular S. pneumoniae de serotipo 3 (ST3) conjugado a CRM<197>o DTFB. Formulación PCV15<Aq/No-Aq>usó una combinación de 15 conjugados de polisacáridos neumocócicos-CRM<197>, algunos generados por aminación reductora en solución acuosa y otros por aminación reductora en solución no acuosa. Las formulaciones de PCV15 contenían 0,2 % p/v de P188 o 0,1 % p/v de PS-20 como se indica en la figura.
[0034] Figura 12: Títulos de OPA de serotipo 3 (OPK) para monos Rhesus lactantes inmunizados con dos vacunas conjugadas de polisacáridos neumocócicos 15-valentes formuladas con adyuvante de fosfato de aluminio (APA) y P188 al 0,2 % p/v. Las formulaciones contenían polisacárido capsular S. pneumoniae de serotipo 3 (ST3) conjugado a CRM<197>(PCV15<ac>) o DTFB (PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>).
[0035] Figura 13: Distribución del tamaño de partícula medida por SLS de PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>formulaciones después de 1 hora de agitación y hasta 24 horas de rotación horizontal. Las formulaciones contenían poloxámero 188 al 0,2 % p/v y diversas concentraciones de propilenglicol (PG) o polietilenglicol 400 (PEG<400>) como se indica en la figura.
[0036] Figuras 14A-B: Estudio de comparación de inmunogenicidad en monos Rhesus infantiles para PCV15<Aq/Non-AQ/ST3-DTFB>formulaciones que contienen 0,2 % p/v de P188 con 15 % p/v de PG o 0,1 % p/v de PS-20 como se describe en el Ejemplo 12. Ocho animales por grupo recibieron una inyección intramuscular con cualquiera de las dos formulaciones a T=0 (Dosis 1), 1 mes (Dosis 2) y 2 meses (Dosis 3) de edad. El suero se recogió antes de la dosis 1 y 2 semanas después de la dosis 1, 2 y 3. Las concentraciones de IgG específicas de serotipo (IgG GMC) de las muestras de suero preinmunes, posteriores a la dosis 1, posteriores a la dosis 2 y posteriores a la dosis 3 se midieron como se describe en el Ejemplo 10. El panel A muestra resultados de inmunogenicidad para los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F y 9V. El panel B muestra resultados de inmunogenicidad para el serotipo 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F.
[0037] Figuras 15A-E: Valores de D[4,3] medidos por SLS de PCV<Aq/No-Aq>formulaciones como se describe en el Ejemplo 13, que tienen diferentes porcentajes de serotipos elaborados en DMSO (panel A: 24%; panel B: 50%; panel C: 62%; panel D: 79%; y panel E: 100 %) que contiene 0,05 % p/v de PS-80, 0,05 % p/v de PS-20 y 0,2 % p/v de PS-20 después de agitar y hasta 24 horas de rotación horizontal en jeringas HyPak de 1,5 ml.
[0038] Figura 16: Resultados de inmunogenicidad en conejos blancos de Nueva Zelanda para una formulación de conjugado neumocócico 15-valente en histidina 20 mM pH 5,8, NaCl 150 mM, APA 250 µg/ml, PS-20 al 0,2 % p/v que tiene S. pneumoniae polisacáridos de los serotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F y 23F conjugados a CRM<197>usando aminación reductora en DMSO y S. pneumoniae polisacáridos de los serotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F y 33F conjugados a CRM<197>usando aminación reductora en solución acuosa formulada como una forma de dosificación que contiene 4 µg/ml de cada sacárido, excepto 6B a 8 µg/ml; y aproximadamente 64 µg/ml de proteína portadora de CRM<197>.
[0040] Descripción detallada de la invención
[0042] La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que el tensioactivo específico en las formulaciones de vacunas conjugadas multivalentes puede afectar la estabilidad de los conjugados y su tendencia a agregarse, particularmente cuando uno o más de los conjugados se elaboran en un disolvente aprótico tal como DMSO. Adicionalmente, algunos tensioactivos requieren la adición de un poliol para obtener la estabilidad requerida.
[0044] Como se usa en el presente documento, un "disolvente prótico" es un disolvente que tiene un átomo de hidrógeno unido a un oxígeno (como en un grupo hidroxilo) o un nitrógeno (como en un grupo amina). En términos generales, cualquier disolvente que contenga un H+ lábil se denomina disolvente prótico.
[0046] Como se usa en el presente documento, un "disolvente aprótico" se refiere a un disolvente aprótico polar. Dichos disolventes carecen de hidrógeno ácido y no pueden donar hidrógeno. Los ejemplos de disolventes apróticos polares incluyen, pero sin limitación, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF) y hexametilfosforamida (HMPA). Una solución o disolvente no acuoso se usa indistintamente con disolvente aprótico. El disolvente aprótico puede tener algo de agua presente, por ejemplo, hasta 1 %, 2 %, 5 %, 10 % o 20 %.
[0048] Como se usa en el presente documento, el término "polisacárido" (Ps) pretende incluir cualquier elemento sacárido antigénico (o unidad antigénica) comúnmente usado en las técnicas de vacunas inmunológicas y bacterianas, incluyendo, pero sin limitación, un "sacárido", un "oligosacárido ", un "polisacárido", un "liposacárido", un "lipooligosacárido (LOS)", un "lipopolisacárido (LPS)", un "glicosilato", un "glicoconjugado" y similares.
[0050] Como se usa en el presente documento, el término "comprende" cuando se usa con la composición inmunogénica de la invención se refiere a la inclusión de cualquier otro componente (sujeto a limitaciones del lenguaje "que consiste en" para la mezcla de antígenos), tales como adyuvantes y excipientes. El término "que consiste en" cuando se usa con la mezcla conjugada polisacárido-proteína multivalente se refiere a una mezcla que tiene esos particulares S. pneumoniae conjugados de proteína de polisacárido y ningún otro S. pneumoniae conjugados de proteína de polisacárido de un serotipo diferente.
[0051] Como se define en el presente documento, los términos "precipitación", "precipitado", "formación de partículas", "enturbiamiento" y "agregación" pueden usarse indistintamente y pretenden referirse a cualquier interacción física o reacción química que dé como resultado la aglomeración de un conjugado de polisacárido-proteína. El proceso de agregación (por ejemplo, agregación de proteínas) puede ser inducido por numerosas tensiones fisicoquímicas, que incluyen calor, presión, pH, agitación, fuerzas de cizalla, congelación-descongelación, deshidratación, metales pesados, compuestos fenólicos, aceite de silicio, desnaturalizantes y similares.
[0052] Como se define en el presente documento, un "tensioactivo" de la presente invención es cualquier molécula o compuesto que reduzca la tensión superficial de una formulación de composición inmunogénica. Un "sistema de tensioactivo" comprende un tensioactivo pero puede permitir la inclusión de excipientes adicionales tales como polioles que aumentan los efectos del tensioactivo.
[0053] Una composición inmunogénica es una composición multivalente que contiene uno o más antígenos conjugados con una o más proteínas portadoras. El antígeno es un sacárido de una bacteria encapsulada. En tales vacunas, los sacáridos están compuestos por largas cadenas de moléculas de azúcar que se asemejan a la superficie de ciertos tipos de bacterias. Las bacterias encapsuladas incluyen, pero sin limitación, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitides y Haemophilus influenzae tipo b. Los antígenos pueden ser del mismo organismo o pueden ser de diferentes organismos. Los antígenos son Streptococcus pneumoniae polisacáridos capsulares.
[0054] En los casos en los que se usan dos proteínas transportadoras, cada polisacárido capsular no conjugado con la primera proteína transportadora se conjuga con la misma segunda proteína transportadora (por ejemplo, estando cada molécula de polisacárido capsular conjugada con una única proteína transportadora). En otro caso, los polisacáridos capsulares no conjugados a la primera proteína transportadora se conjugan a dos o más proteínas transportadoras (cada molécula de polisacárido capsular se conjuga a una única proteína transportadora). En tales casos, cada polisacárido capsular del mismo serotipo se conjuga típicamente con la misma proteína transportadora. La toxina diftérica, una exotoxina secretada por Corynebacterium diphtheriae, es una toxina AB clásica compuesta por dos subunidades (fragmentos) unidas por puentes disulfuro y que tiene tres dominios. El fragmento A (DTFA) contiene el dominio C catalítico de ADP-ribosa, mientras que el fragmento B (DTFB) contiene el dominio T de translocación central y un dominio R de unión al receptor carboxi terminal. DTFB es el resto no tóxico que constituye aproximadamente el 60 % de la secuencia de aminoácidos total de DT. Véase, por ejemplo, Gill, DM y Dinius, LL, J. Biol. Chem., 246, 1485-1491 (1971), Gill, DM y Pappenheimer, Jr., AM, J. Biol. Chem., 246, 1492-1495 (1971), Collier, RJ y Kandel, J., J. Biol. Chem., 246, 1496-1503 (1971); y Drazin, R., Kandel, J. y Collier, RJ, J. Biol. Chem., 246, 1504-1510 (1971).
[0055] Se ha publicado la secuencia de aminoácidos completa de la toxina diftérica. Véase Greenfield, L., Bjorn, MJ, Horn, G., Fong, D., Buck, GA, Collier, RJ y Kaplan, DA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6853-6857 (1983). Específicamente, DTFB comprende los residuos de aminoácido 194 a 535 de DT.
[0056] La proteína portadora de CRM<197>es una forma mutante de DT que se vuelve no tóxica mediante una sustitución de un solo aminoácido en el Fragmento A en el residuo 52. CRM<197>y DT comparten una homología de secuencia completa en el Fragmento B. Los epítopos de células T principales se encontraron predominantemente en el fragmento B de la secuencia de aminoácidos de DT. Véase Bixler et al., Adv Exp Med Biol. (1989) 251:175-80; Raju et al., Eur. J. Immunol. (1995) 25: 3207-3214; Diethelm-Okita et al., J Infect Dis (2000) 181:1001-9; y McCool et al., Infect. e Immun.67 (septiembre de 1999), pág. 4862-4869.
[0057] El uso de DTFB como se describe en el presente documento incluye deleciones de toxina diftérica del dominio de actividad de ribosilación de ADP. El uso de DTFB también incluye variantes que tienen al menos 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia que incluye deleciones, sustituciones y adiciones. Un ejemplo de una variante es una deleción o mutación de la cisteína 201. DTFB (C8) significa toxina diftérica delecionada del dominio de activación de ADP-ribosilatina, y con cisteína 201 eliminada o mutada. El uso de DTFB también incluye fragmentos que cubren la secuencia 265-450 de DT, que incluye los epítopos de células T publicados (véase Bixler et al., Adv Exp Med Biol. (1989) 251:175-80; Raju et al., Eur. J. Immunol. (1995) 25: 3207-3214). DTFB también incluye estados de monómero, dímero u oligómeros. El uso de DTFB también incluye cualquier complejo de proteínas (excluyendo DT de longitud completa o CRM<197>), proteínas híbridas o proteínas conjugadas que contienen el DTFB o fragmentos. El uso de DTFB también incluye DTFB o fragmentos modificados químicamente (es decir, pegilación, modificación de aminoácidos no naturales).
[0058] En ciertos casos, el DTFB se produce a partir de la digestión enzimática y la reducción del DT nativo o la CRM<197>mutante con posterior purificación por cromatografía de adsorción. Por lo tanto, se prevé que un DTFB purificado, con o sin una mutación en el residuo de DT C201, podría prepararse de manera similar a partir de DT nativo de longitud completa o mutado en C201 o CRM<197>, o de variantes de los mismos en las que el fragmento A está truncado. Se sabe específicamente que las resinas multimodales comercializadas como Capto<™>Adherir y Capto<™>Las concentraciones de MMC y Tris superiores a 50 mM durante el ciclo de cromatografía proporcionan modos excepcionales de purificar el DTFB nativo escindido.
[0060] En ciertos casos, la preparación de DTFB incluye hasta 10 mM de DTT. DTT evita la dimerización provocada por la formación de enlaces disulfuro entre los monómeros de DTFB debido a la cisteína libre en la posición de residuo 201. En tales casos, no se añade níquel a la mezcla de reacción de conjugación. Sin embargo, la reacción de conjugación procede por el mismo método de lo contrario. Si no se usa DTT, el DTFB dimerizado puede conjugarse a Ps en presencia de níquel para mejorar el grado de conjugación secuestrando el cianuro inhibidor residual.
[0062] Se espera que la eliminación de cisteína libre (mutación del DT C201) en el DTFB proporcione un comportamiento similar en las resinas multimodales. Se espera que la eliminación de la cisteína libre elimine la necesidad de DTT ya que la dimerización mediante la formación de enlaces disulfuro entre la cisteína libre no sería factible. Se ha demostrado que el aumento de la concentración de tampón Tris y la concentración de tampón de elución de cloruro de sodio mejora la recuperación de la proteína DTFB de la resina de cromatografía Capto MMC. Se espera que la purificación de DTFB se pueda lograr usando otras resinas multimodales.
[0064] En ciertos casos, el DTFB se expresa de forma recombinante con o sin la mutación del residuo de DT C201 y posteriormente se purifica mediante diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia.
[0066] En la presente invención, CRM<197>se utiliza como proteína portadora. CRM<197>es una variante no tóxica (es decir, toxoide) de la toxina diftérica. En una realización, se aísla de cultivos de Corynebacterium difteria cepa C7 (β197) cultivada en casaminoácidos y medio a base de extracto de levadura. En otra realización, CRM<197>se prepara de forma recombinante de acuerdo con los métodos descritos en la patente de EE.UU. N.º 5.614.382. Típicamente, CRM<197>se purifica a través de una combinación de ultrafiltración, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico. En algunas realizaciones, CRM<197>se prepara en Pseudomonas fluorescens utilizando la tecnología de expresión Pfenex<™>(Pfenex Inc., San Diego, CA).
[0068] DTFB y variantes del mismo pueden usarse como una proteína portadora para antígenos, incluyendo proteínas (péptidos) y sacáridos. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen toxinas bacterianas inactivadas adicionales tales como DT (toxoide diftérico), TT (toxoide tetánico) o fragmento C de TT, toxoide de tos ferina, toxoide de cólera (por ejemplo, como se describe en la publicación de solicitud de patente internacional n. documento WO 2004/083251), E. coli LT, E. coli ST y exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Proteínas de membrana externa bacterianas tales como complejo de membrana externa c (OMPC), porinas, proteínas de unión a transferrina, proteína de superficie neumocócica A (PspA; véase la publicación de patente de solicitud internacional n. documento WO 02/091998), proteína adhesina neumocócica (PsaA), peptidasa C5a del estreptococo del Grupo A o del Grupo B, o Haemophilus influenzae proteína D, neumolisina neumocócica (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13) que incluye capas destoxificadas de alguna manera, por ejemplo, dPLY-GMBS (véase la publicación de solicitud de patente internacional n. documento WO 04/081515) o dPLY-formol, PhtX, incluyendo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE y fusiones de proteínas Pht, por ejemplo, fusiones PhtDE, fusiones PhtBE (véanse las publicaciones de solicitud de patente internacional n. documento WO 01/98334 y documento WO 03/54007), también se puede utilizar. Otras proteínas, tales como ovoalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA) o derivado proteico purificado de la tuberculina (PPD), PorB (de N. meningitidis), DP (Haemophilus influenzae proteína D; véase, por ejemplo, la patente europea n.º EP 0594 610 B), o equivalentes inmunológicamente funcionales de los mismos, péptidos sintéticos (véanse las patentes europeas n. EP0378881 y EP0427347), proteínas de choque térmico (véanse las publicaciones de solicitud de patente internacional n. documento WO 93/17712 y documento WO 94/03208), proteínas de la tos ferina (véase la publicación de solicitud de patente internacional n.º documento WO 98/58668 y la patente europea n. EP0471177), citocinas, linfocinas, factores de crecimiento u hormonas (véase la publicación de solicitud de patente internacional n.º documento WO 91/01146), proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de células T CD4+ humanas de diversos antígenos derivados de patógenos (véase Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824) tal como la proteína N19 (véase Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:4884-7), proteínas de captación de hierro (véase la publicación de solicitud de patente internacional n.º documento WO 01/72337), la toxina A o B de C. difícil (Véase la Publicación de Patente Internacional N.º documento WO 00/61761) y flagelina (véase Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64:9) también se pueden usar como proteínas transportadoras.
[0070] Se pueden usar otros mutantes de DT como la segunda proteína portadora, tal como CRM<176>, CRM<228>, CRM<45>(Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844); CRM<9>, CRM<45>, CRM<102>, CRM<103>y CRM<107>y otras mutaciones descritas por Nicholls y Youle en Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleción o mutación de Glu-148 a Asp, Gln o Ser y/o Ala 158 a Gly y otras mutaciones desveladas en la patente de EE.UU. n.º 4.709.017 o la patente de EE.UU. n.º 4.950.740; mutación de al menos uno o más residuos Lys 516, Lys 526, Phe 530 y/o Lys 534 y otras mutaciones desveladas en la patente de EE.UU. n.º 5.917.017 o la patente de EE.UU. n.º 6.455.673; o fragmento divulgado en la patente de EE.UU. N.º 5.843.711. Tales mutantes de DT también se pueden usar para hacer variantes de DTFB donde las variantes comprenden el fragmento B que contiene las regiones de epítopo.
[0071] En un caso, la presente divulgación proporciona una composición inmunogénica que comprende conjugados de polisacárido-proteína que comprenden polisacáridos capsulares de al menos uno de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8 , 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31 , 33F, 34, 35A, 35B, 35F y 38 de Streptococcus pneumoniae conjugado a una o más proteínas portadoras, y un portador farmacéuticamente aceptable. En ciertos casos, la composición inmunogénica comprende, consiste esencialmente en, o consiste en polisacáridos capsulares de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 , 43 o 44 serotipos conjugados individualmente a CRM<197>. En ciertos aspectos de la invención, CRM<197>es la única proteína portadora utilizada.
[0072] En ciertos casos, las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente comprenden opcionalmente además polisacáridos capsulares de un S. pneumoniae serotipo seleccionado de al menos uno de 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C , 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F y 38 conjugados a una segunda portadora proteína (que es distinta en al menos un aminoácido de la primera proteína portadora). Preferentemente, los sacáridos de un serotipo particular no se conjugan con más de una proteína portadora.
[0073] En ciertos casos, la composición inmunogénica de la divulgación comprende además polisacáridos capsulares de al menos un serotipo adicional conjugado con una segunda proteína portadora. En estos casos, la composición inmunogénica comprende, consiste esencialmente en, o consiste en polisacáridos capsulares de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 o 44 serotipos conjugados individualmente a una segunda proteína portadora que no es CRM<197>.
[0074] En ciertos casos, la composición inmugénica comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, polisacáridos capsulares de N serotipos donde N es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 , 40, 41, 42, 43 o 44; y los polisacáridos capsulares de cada uno de los N serotipos se conjugan con el primer portador de proteína que es CRM<197>. En otros casos, los polisacáridos capsulares de los serotipos 1, 2, 3... o N-1 se conjugan con el primer portador de proteína, y los polisacáridos capsulares de los serotipos N-1, N-2, N-3... 1 serotipos se conjugan con la segunda proteína portadora que es diferente de CRM<197>.
[0075] La presente invención proporciona una composición inmunogénica 15-valente que consiste esencialmente en polisacáridos capsulares de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F conjugados a CRM<197>.
[0076] Polisacáridos capsulares de Steptococcus pneumoniae puede prepararse mediante técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, los polisacáridos pueden aislarse de bacterias y pueden dimensionarse hasta cierto punto mediante métodos conocidos (véanse, por ejemplo, las patentes europeas n. EP497524 y EP497525); y preferentemente por microfluidización lograda usando un homogeneizador o por hidrólisis química. En un caso, S. pneumoniae las cepas correspondientes a cada serotipo de polisacárido se cultivan en un medio a base de soja. Los polisacáridos individuales se purifican a continuación a través de etapas estándar que incluyen centrifugación, precipitación y ultrafiltración. Véase, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.º 2008/0286838 y la patente de EE.UU. N.º 5.847.112. Los polisacáridos pueden dimensionarse con el fin de reducir la viscosidad y/o mejorar la filtrabilidad de productos conjugados posteriores. En la presente divulgación, los polisacáridos capsulares se preparan a partir de uno o más de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F, y 38.
[0077] Los polisacáridos purificados se activan químicamente para introducir funcionalidades capaces de reaccionar con la proteína portadora. Una vez activado, cada polisacárido capsular se conjuga por separado a una proteína transportadora para formar un glicoconjugado. Los conjugados de polisacáridos pueden prepararse mediante técnicas de acoplamiento conocidas.
[0078] En un caso, la activación química de los polisacáridos y la posterior conjugación a la proteína portadora se logran por los medios descritos en la patente de EE.UU. n.º 4.365.170, 4.673.574 y 4.902.506. Brevemente, el polisacárido neumocócico se hace reaccionar con un agente oxidante basado en peryodato tal como peryodato de sodio, peryodato de potasio o ácido peryódico dando como resultado una escisión oxidativa aleatoria de grupos hidroxilo vecinales para generar grupos aldehído reactivos.
[0079] El acoplamiento aminativo directo del polisacárido oxidado a grupos amina primaria en el portador de proteína (principalmente residuos de lisina) puede lograrse mediante aminación reductora. Por ejemplo, la conjugación se lleva a cabo haciendo reaccionar una mezcla del polisacárido activado y la proteína portadora con un agente reductor tal como cianoborohidruro de sodio en presencia de níquel. La reacción de conjugación puede llevarse a cabo en solución acuosa o en un disolvente orgánico tal como DMSO. Véase, por ejemplo, US2015/0231270 A1, documento EP 0471 177 B1, y US2011/0195086 A1. Al final de la reacción de conjugación, los aldehídos sin reaccionar se rematan mediante la adición de un agente reductor fuerte, tal como borohidruro de sodio.
[0080] En un caso, antes de la formulación, cada antígeno de polisacárido capsular neumocócico se purifica individualmente a partir de S. pneumoniae, activado para formar aldehídos reactivos, y luego conjugado covalentemente usando aminación reductora con cianoboroidruro de sodio en presencia de níquel a la primera o segunda proteína portadora. Complejos de níquel con cianuro inhibitorio residual del agente reductor de cianoborohidruro de sodio utilizado para la aminación reductora.
[0081] En ciertos casos, la reacción de conjugación se realiza mediante aminación reductora en la que se usa níquel para una mayor eficiencia de la reacción de conjugación y para ayudar en la eliminación de cianuro libre. Se sabe que los metales de transición forman complejos estables con cianuro y se sabe que mejoran la metilación reductora de los grupos amino de proteínas y el formaldehído con cianoborohidruro de sodio (Gidley et al., 1982, Biochem J. 203: 331-334; Jentoft et al., 1980, Anal Biochem. 106: 186-190). Al complejar el cianuro inhibidor residual, la adición de níquel aumenta el consumo de proteína durante la conjugación y conduce a la formación de conjugados más grandes y potencialmente más inmunógenos.
[0082] La variabilidad en los niveles de cianuro libre en lotes comerciales de reactivos de cianoborohidruro de sodio puede conducir a un rendimiento de conjugación inconsistente, lo que da como resultado atributos de conjugado variables, incluida la masa molecular y la relación polisacárido-proteína. La adición de níquel a la reacción de conjugación reduce el nivel de cianuro libre y, por lo tanto, mejora el grado de consistencia del conjugado loto-lote.
[0083] En otro caso, el método de conjugación puede emplear la activación de polisacárido con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridinio (CDAP) para formar un éster de cianato. El sacárido activado puede acoplarse directamente a un grupo amino en la proteína portadora.
[0084] En otro caso, puede introducirse un grupo homobifuncional o heterobifuncional reactivo en el polisacárido activado haciendo reaccionar el éster de cianato con cualquiera de varias modalidades disponibles. Por ejemplo, se puede usar cistamina o cisteamina para preparar un polisacárido tiolado que podría acoplarse al portador a través de un enlace tioéter obtenido después de la reacción con una proteína portadora activada por maleimida (por ejemplo, usando GMBS) o una proteína portadora haloacetilada (por ejemplo, usando yodoacetimida [por ejemplo, yodoacetimida de etilo HCl] o bromoacetato de N-succinimidilo o SIAB, o SIA o SBAP). En otro caso, el éster de cianato se hace reaccionar con hexanodiamina o dihidrazida de ácido adípico (ADH) y el sacárido derivatizado con amino resultante se conjuga con un grupo carboxi libre en la proteína portadora usando química de carbodiimida (por ejemplo, EDAC o EDC). Dichos conjugados se describen en las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional Nos. documento WO 93/15760, documento WO 95/08348 y documento WO 96/29094; y Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40:245-256.
[0085] Otros métodos de conjugación adecuados usan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido pnitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S--NHS, EDC y TSTU. Muchas se describen en la Publicación de solicitud de patente internacional N.º WO 98/42721. La conjugación puede implicar un enlazador carbonilo que puede formarse por reacción de un grupo hidroxilo libre del sacárido con CDI (véase Bethell et al., 1979, J. Biol. química 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509-18) seguido de reacción con proteína portadora para formar un enlace carbamato. Esta química consiste en la reducción del extremo anomérico de un carbohidrato para formar un grupo hidroxilo primario seguido de la reacción del hidroxilo primario con CDI para formar un carbamato intermedio y el posterior acoplamiento a grupos amino portadores de proteína. La reacción puede requerir protección/desprotección opcional de otros grupos hidroxilo primarios en el sacárido.
[0086] Después de la conjugación, los conjugados de polisacárido-proteína se purifican para eliminar el exceso de reactivos de conjugación, así como la proteína libre residual y el polisacárido libre mediante una o más de cualquier técnica bien conocida por el experto en la materia, incluidas las operaciones de concentración/diafiltración, ultrafiltración, precipitación/elución, cromatografía en columna y filtración profunda. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.º 6.146.902.
[0087] Después de que se purifican los glicoconjugados individuales, se combinan para formular la composición inmunogénica de la presente invención. Estos conjugados neumocócicos se preparan mediante procesos separados y se formulan en masa en una formulación de dosificación única.
[0088] Composiciones farmacéuticas/de vacuna
[0089] La presente divulgación proporciona adicionalmente composiciones, que incluyen composiciones farmacéuticas, inmunogénicas y de vacunas, que comprenden, que consisten esencialmente en, o como alternativa, que consisten en cualquiera de las combinaciones de serotipos de polisacáridos descritas anteriormente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable y un adyuvante. En un caso, las composiciones comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en 2 a 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 o 44 conjugados de polisacárido-proteína distintos, en donde cada uno de los conjugados contiene un polisacárido capsular diferente conjugado a cualquiera de la primera proteína transportadora o la segunda proteína transportadora, y en donde los polisacáridos capsulares de al menos uno de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V , 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34 , 35A, 35B, 35F y 38 de Streptococcus pneumoniae se conjugan con una primera proteína portadora seleccionada de CRM<197>y, opcionalmente, tener adicional S. pneumoniae serotipos seleccionados de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F y 38 que están conjugadas a una segunda proteína portadora (que es distinta en al menos un aminoácido de la primera proteína portadora) junto con un portador farmacéuticamente aceptable y un adyuvante.
[0091] La formulación de los conjugados polisacárido-proteína de la presente invención se puede lograr usando métodos reconocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden formular 15 conjugados neumocócicos individuales con un vehículo fisiológicamente aceptable para preparar la composición. Los ejemplos de tales vehículos incluyen, pero sin limitación, agua, solución salina tamponada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y soluciones de dextrosa.
[0093] De acuerdo con la invención, la composición de vacuna se formula en tampón de L-histidina con cloruro de sodio.
[0094] Como se define en el presente documento, un "adyuvante" es una sustancia que sirve para potenciar la inmunogenicidad de una composición inmunogénica de la invención. Un adyuvante inmunitario puede potenciar una respuesta inmunitaria a un antígeno que es débilmente inmunogénico cuando se administra solo, por ejemplo, induciendo títulos de anticuerpos nulos o débiles o respuesta inmunitaria mediada por células, aumentar los títulos de anticuerpos contra el antígeno y/o disminuir la dosis del antígeno eficaz para lograr una respuesta inmunitaria en el individuo. Por lo tanto, a menudo se administran adyuvantes para potenciar la respuesta inmunitaria y son bien conocidos por el experto en la materia. Los adyuvantes adecuados para mejorar la eficacia de la composición incluyen, pero sin limitación:
[0096] (1) sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de muramilo (definidos a continuación) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo, (a) MF59 (publicación de solicitud de patente internacional n. documento WO 90/14837), que contiene 5 % de escualeno, 0,5 % de Tween 80 y 0,5 % de Span 85 (que contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE) formuladas en partículas submicrónicas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene escualeno al 10 %, Tween 80 al 0,4 %, polímero bloqueado plurónico al 5 % L121 y thr-MDP microfluidizado en una emulsión submicrónica o agitado en vórtex para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande, (c) Ribi<™>sistema adyuvante (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforilípido A 3-O-desailado (MPL<™>) descrito en la patente de EE.UU. n.º 4.912.094, dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS), preferentemente MPL+CWS (Detox<™>); y (d) un Montanide ISA;
[0097] (3) adyuvantes de saponina, tales como Quil A o STIMULON<™>QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n.º 5.057.540) o partículas generadas a partir de los mismos, tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes formados por la combinación de colesterol, saponina, fosfolípidos y proteínas anfipáticas) e Iscomatrix<®>(que tiene esencialmente la misma estructura que un ISCOM pero sin la proteína); (4) lipopolisacáridos bacterianos, análogos de lípido A sintéticos tales como compuestos de fosfato de aminoalquil glucosamina (AGP), o derivados o análogos de los mismos, que están disponibles de Corixa, y que se describen en la patente de EE.UU. n.º 6.113.918; uno de tales AGP es 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etilo 2-Desoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3--tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-bD-glucopiranósido, que también se conoce como 529 (anteriormente conocido como RC529), que se formula como una forma acuosa o como una emulsión estable;
[0098] (5) polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen motivo(s) CpG (la patente de EE.UU. n.º 6.207.646);
[0099] (6) citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.) , interferones (por ejemplo, interferón gamma), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), moléculas coestimuladoras B7-1 y B7-2, etc.; y
[0100] (7) complemento, tal como un trímero del componente de complemento C3d.
[0102] En otro caso, el adyuvante es una mezcla de 2, 3 o más de los adyuvantes anteriores, p. ej.,. SBAS2 (una emulsión de aceite en agua que también contiene monofosforil lípido A 3-desacilado y QS21).
[0104] Los péptidos de muramilo incluyen, pero sin limitación, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) y N-acetil-normuramil-L-alanina-2-(1'-2' dipalmitoil- sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
[0106] El adyuvante es una sal de aluminio. El adyuvante de sal de aluminio es APA. Ejemplos de otras sales de aluminio incluyen vacuna precipitada con alumbre o una vacuna adsorbida con alumbre. Los adyuvantes de sal de aluminio son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Harlow, E. y D. Lane (1988; Antibodies: un manual de laboratorio laboratorio de Cold Spring Harbor) y Nicklas, W. (1992; Aluminium salts. Research in Immunology 143:489-493). La sal de aluminio incluye, pero sin limitación, alúmina hidratada, hidrato de alúmina, trihidrato de alúmina (ATH), hidrato de aluminio, trihidrato de aluminio, Alhydrogel<®>, Superfos, Ampogel<®>, hidróxido de aluminio (III), sulfato de hidroxifosfato de aluminio (adyuvante de fosfato de aluminio (APA)), alúmina amorfa, alúmina trihidratada o trihidroxialuminio.
[0107] APA es una suspensión acuosa de hidroxifosfato de aluminio. APA se fabrica combinando cloruro de aluminio y fosfato de sodio en una relación volumétrica de 1:1 para precipitar hidroxifosfato de aluminio. Después del proceso de mezcla, el material se reduce de tamaño con un mezclador de alto cizallamiento para lograr una distribución de tamaño de partícula monodispersa. A continuación, el producto se diafiltra contra una solución salina fisiológica y se esteriliza con vapor.
[0108] En ciertos casos, un Al(OH) comercialmente disponible<3>(por ejemplo, Alhydrogel<®>o Superfos de Dinamarca/Accurate Chemical and Scientific Co., Westbury, NY) para adsorber proteínas en una proporción de 50 -200 g de proteína/mg de hidróxido de aluminio. La adsorción de proteína depende, en otra realización, del pI (pH isoeléctrico) de la proteína y del pH del medio. Una proteína con un pI más bajo adsorbe al ion aluminio cargado positivamente con más fuerza que una proteína con un pI más alto. Las sales de aluminio pueden establecer un depósito de Ag que se libera lentamente durante un período de 2-3 semanas, estar implicadas en la activación no específica de macrófagos y activación del complemento, y/o estimular el mecanismo inmunitario innato (posiblemente a través de la estimulación del ácido úrico). Véase, por ejemplo, Lambrecht et al., 2009, Curr Opin Immunol 21:23.
[0109] Los conjugados acuosos monovalentes en masa normalmente se combinan entre sí y se diluyen. Una vez diluido, el lote se filtra en condiciones estériles. El adyuvante de fosfato de aluminio se añade asépticamente para alcanzar una concentración final de 4 µg/ml para todos los serotipos excepto el 6B, que se diluye para alcanzar el objetivo de 8 µg/ml, y una concentración final de aluminio de 250 µg/ml. El lote formulado y adyuvado se cargará en viales o jeringas.
[0110] En ciertos casos, el adyuvante es una secuencia de nucleótidos que contiene CpG, por ejemplo, un oligonucleótido que contiene CpG, en particular, un oligodesoxinucleótido que contiene CpG (CpG ODN). En otro caso, el adyuvante es ODN 1826, que puede adquirirse de Coley Pharmaceutical Group.
[0111] "Nucleótido que contiene CpG", "oligonucleótido que contiene CpG", "oligonucleótido CpG" y términos similares se refieren a una molécula de nucleótido de 6-50 nucleótidos de longitud que contiene un resto CpG no metilado. Véase, por ejemplo, Wang et al., 2003, Vaccine 21:4297. En otro caso, se pretende cualquier otra definición aceptada en la técnica de los términos. Los oligonucleótidos que contienen CpG incluyen oligonucleótidos modificados que usan cualquier enlace internucleósido sintético, base modificada y/o azúcar modificado.
[0112] Los métodos para el uso de oligonucleótidos CpG son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sur et al., 1999, J Immunol. 162:6284-93; Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127:139-58; y Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110.
[0113] Administración/dosificación
[0114] Las composiciones y formulaciones de la presente invención se pueden usar para proteger o tratar a un ser humano susceptible a una infección, por ejemplo, una infección neumocócica, mediante la administración de la vacuna a través de una vía sistémica o mucosa. En un caso, la presente divulgación proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria a un S. pneumoniae conjugado de polisacárido capsular, que comprende administrar a un ser humano una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición inmunogénica de la presente divulgación. En otro caso, la presente divulgación proporciona un método para vacunar a un ser humano contra una infección neumocócica, que comprende la etapa de administrar al ser humano una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición inmunogénica.
[0115] Las cantidades óptimas de los componentes de una vacuna particular pueden determinarse mediante estudios convencionales que implican la observación de respuestas inmunitarias apropiadas en sujetos. Por ejemplo, en otro caso, la dosificación para vacunación humana se determina por extrapolación de estudios en animales a datos humanos. En otro caso, la dosificación se determina empíricamente. Los datos de animales de mono Rhesus infantil proporcionados en los ejemplos demuestran que la vacuna es inmunogénica.
[0116] "Cantidad eficaz" de una composición se refiere a una dosis requerida para provocar anticuerpos que reducen significativamente la probabilidad o gravedad de la infectividad de un microbio, por ejemplo, S. pneumoniae, durante un desafío posterior.
[0117] Los métodos de la divulgación pueden usarse para la prevención y/o reducción de síndromes clínicos primarios causados por microbios, por ejemplo, S. pneumoniae, incluyendo tanto infecciones invasivas (meningitis, neumonía y bacteriemia) como infecciones no invasivas (otitis media aguda y sinusitis).
[0118] La administración de las composiciones puede incluir una o más de: inyección a través de las rutas intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o mediante administración mucosal a los tractos oral/alimentario, respiratorio o genitourinario. En un caso, la administración intranasal se usa para el tratamiento de neumonía u otitis media (ya que el transporte nasofaríngeo de neumococos se puede prevenir de manera más eficaz, atenuando así la infección en su etapa más temprana).
[0119] La cantidad de conjugado en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induzca una respuesta inmunoprotectora sin efectos adversos significativos. Dicha cantidad puede variar dependiendo del serotipo neumocócico. En general, para conjugados basados en polisacáridos, cada dosis comprenderá de 0,1 a 100 µg de cada polisacárido, particularmente de 0,1 a 10 µg, y más particularmente de 1 a 5 µg. Por ejemplo, cada dosis puede comprender 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o 750 ng o 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 µg.
[0120] Las cantidades óptimas de los componentes de una vacuna particular pueden determinarse mediante estudios convencionales que implican la observación de respuestas inmunitarias apropiadas en sujetos. Por ejemplo, en otro caso, la dosificación para vacunación humana se determina por extrapolación de estudios en animales a datos humanos. En otro caso, la dosificación se determina empíricamente.
[0121] En un caso, la dosis de la sal de aluminio es 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500 o 700 µg, o 1, 1,2, 1,5, 2, 3, 5 mg o más. En otro caso más, la dosis de sal de aluminio descrita anteriormente es por µg de proteína recombinante.
[0122] En un caso particular de la presente divulgación, la vacuna PCV15 es una formulación líquida estéril de polisacáridos capsulares neumocócicos de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F conjugado individualmente a CRM<197>. En un caso, cada dosis se formula para contener: 4 µg/mL u 8 µg/mL de cada sacárido, excepto para 6B a 8 µg/mL o 16 µg/mL; y aproximadamente 64 µg/mL o 128 µg/mL de proteína portadora de CRM<197>. En un aspecto, cada dosis de 0,5 ml se formula para contener: 2 µg de cada sacárido, excepto 6B a 4 µg; aproximadamente 32 µg de proteína portadora de CRM<197>(por ejemplo, 32 µg ± 5 µg, ± 3 µg, ± 2 µg o ± 1 µg), 0,125 mg de adyuvante de aluminio elemental (0,5 mg de fosfato de aluminio); y tampón de cloruro de sodio y L-histidina. La concentración de cloruro de sodio es de aproximadamente 150 mM (por ejemplo, 150 mM ± 25 mM, ± 20 mM, ± 15 mM, ± 10 mM o ± 5 mM) y aproximadamente 20 mM (por ejemplo, 20 mM ± 5 mM, ± 2,5 mM, ± 2 mM, ± 1 mM o ± 0,5 mM) tampón de L-histidina.
[0123] De acuerdo con cualquiera de los métodos de la presente divulgación y en un caso, el sujeto es humano. En ciertos casos, el sujeto humano es un bebé (menos de 1 año de edad), un niño pequeño (aproximadamente de 12 a 24 meses) o un niño pequeño (aproximadamente de 2 a 5 años). En otros casos, el sujeto humano es un paciente anciano (> 65 años). Las composiciones de esta invención también son adecuadas para su uso con niños mayores, adolescentes y adultos (por ejemplo, de 18 a 45 años o de 18 a 65 años).
[0124] En un caso de los métodos de la presente divulgación, una composición de la presente divulgación se administra como una única inoculación. En otro caso, la vacuna se administra dos veces, tres veces o cuatro veces o más, separadas adecuadamente. Por ejemplo, la composición puede administrarse a intervalos de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses o cualquier combinación de los mismos. Se puede seguir el calendario de inmunización designado para vacunas neumocócicas. Por ejemplo, el programa de rutina para bebés y niños pequeños contra enfermedades invasivas causadas por S. pneumoniae tiene 2, 4, 6 y 12-15 meses de edad. Por lo tanto, en otro caso, la composición se administra como una serie de 4 dosis a los 2, 4, 6 y 12-15 meses de edad.
[0125] Las composiciones de esta divulgación también pueden incluir una o más proteínas de S. pneumoniae. Los ejemplos de proteínas de S. pneumoniae adecuadas para su inclusión incluyen aquellas identificadas en las Publicaciones de solicitud de patentes internacional N.º WO 02/083855 y WO 02/053761.
[0126] Formulaciones
[0127] Las composiciones pueden administrarse a un sujeto mediante uno o más métodos conocidos por un experto en la materia, tal como por vía parenteral, transmucosa, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intranasal, subcutánea, intraperitoneal, y formuladas en consecuencia.
[0128] En un caso, las composiciones se administran mediante inyección epidérmica, inyección intramuscular, inyección intravenosa, intraarterial, subcutánea o inyección mucosal intrarrespiratoria de una preparación líquida. Las formulaciones líquidas para inyección incluyen soluciones y similares.
[0129] La composición de la invención se puede formular como viales de dosis única, viales multidosis o como jeringas precargadas.
[0130] En otro caso, las composiciones se administran por vía oral y, por lo tanto, se formulan en una forma adecuada para la administración oral, es decir, como una preparación sólida o líquida. Las formulaciones orales sólidas incluyen comprimidos, cápsulas, píldoras, gránulos, gránulos y similares. Las formulaciones orales líquidas incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares.
[0131] Los vehículos farmacéuticamente aceptables para formulaciones líquidas son soluciones, suspensiones, emulsiones o aceites acuosos o no acuosos. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados. Ejemplos de aceites son los de origen animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de hígado de pescado, otro aceite marino o un lípido de leche o huevos.
[0132] La composición farmacéutica puede ser isotónica, hipotónica o hipertónica. Sin embargo, a menudo se prefiere que una composición farmacéutica para infusión o inyección sea esencialmente isotónica, cuando se administra. Por lo tanto, para el almacenamiento, la composición farmacéutica puede ser preferentemente isotónica o hipertónica. Si la composición farmacéutica es hipertónica para su almacenamiento, puede diluirse para convertirse en una solución isotónica antes de la administración.
[0133] El agente isotónico puede ser un agente isotónico iónico tal como una sal o un agente isotónico no iónico tal como un hidrato de carbono. Los ejemplos de agentes isotónicos iónicos incluyen, entre otros, NaCl, CaCl<2>, KCl y MgCl<2>. Los ejemplos de agentes isotónicos no iónicos incluyen, pero sin limitación, manitol, sorbitol y glicerol.
[0134] También se prefiere que al menos un aditivo farmacéuticamente aceptable sea un tampón. Para algunos fines, por ejemplo, cuando la composición farmacéutica está destinada a infusión o inyección, a menudo es deseable que la composición comprenda un tampón, que sea capaz de tamponar una solución a un pH en el intervalo de 4 a 10, tal como 5 a 9, por ejemplo 6 a 8.
[0135] El tampón puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en tampón Tris, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartrato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, L-histidina, glicina, succinato y trietanolamina.
[0136] El tampón puede seleccionarse además, por ejemplo, de tampones compatibles con la USP para uso parenteral, en particular, cuando la formulación farmacéutica es para uso parenteral. Por ejemplo, el tampón puede seleccionarse del grupo que consiste en ácidos monobásicos tales como acético, benzoico, glucónico, glicérico y láctico; ácidos dibásicos tales como ácidos aconítico, adípico, ascórbico, carbónico, glutámico, málico, succínico y tartárico, ácidos polibásicos tales como cítrico y fosfórico; y bases tales como amoníaco, dietanolamina, glicina, trietanolamina y Tris. Los vehículos parenterales (para inyección subcutánea, intravenosa, intraarterial o intramuscular) incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactato y aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. Los ejemplos son líquidos estériles tales como agua y aceites, con o sin la adición de un tensioactivo y otros adyuvantes farmacéuticamente aceptables. En general, los vehículos líquidos preferidos son agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas, glicoles tales como propilenglicoles o polietilenglicol, polisorbato 80 (PS-80), polisorbato 20 (PS-20) y poloxámero 188 (P188), particularmente para soluciones inyectables. Ejemplos de aceites son los de origen animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de hígado de pescado, otro aceite marino o un lípido de leche o huevos.
[0137] Las formulaciones de la divulgación también contienen un tensioactivo. Los tensioactivos preferidos incluyen, pero sin limitación: los tensioactivos de ésteres de polioxietilensorbitán (comúnmente denominados Tweens), especialmente PS-20 y PS-80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) y/u óxido de butileno (BO), vendidos bajo la DOWFAX<™>nombre comercial, tal como copolímeros de bloque EO/PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) repetitivos, siendo de particular interés el octoxinol-9 (Triton X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol); (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, tales como el Tergitol<™>serie NP; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurílico, cetílico, estearílico y oleílico (conocidos como tensioactivos Brij), tales como trietilenglicol monolauril éter (Brij 30); y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como SPAN), tales como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán.
[0138] Se pueden usar mezclas de tensioactivos, p. ej. mezclas de PS-80/Span 85. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietilensorbitano tal como monooleato de polioxietilensorbitano (PS-80) y un octoxinol tal como toctilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de polioxietilensorbitano y/o un octoxinol.
[0139] Las cantidades preferidas de tensioactivos son: ésteres de polioxietilensorbitán (tales como PS-80) del 0,01 al 1 % p/v, en particular, aproximadamente el 0,1 % p/v; octil- o nonilfenoxi polioxietanoles (tales como Triton X-100 u otros detergentes de la serie Triton) del 0,001 al 0,1 % p/v, en particular del 0,005 al 0,02 % p/v; éteres de polioxietileno (tales como laureth 9) 0,1 a 20 % p/v, preferentemente 0,1 a 10 % p/v y en particular 0,1 a 1 % p/v o aproximadamente 0,5 % p/v.
[0140] La composición consiste esencialmente en histidina (20 mM), solución salina (150 mM) y PS-20 al 0,2 % p/v a un pH de 5,8 con 250 ug/ml de APA (adyuvante de fosfato de aluminio). PS-20 puede variar de 0,005 a 0,3 % p/v con la presencia de PS-20 en la formulación que controla la agregación durante la fabricación simulada y en el envío usando embalaje primario. El proceso consiste en combinar una mezcla de hasta 44 serotipos en histidina, cloruro de sodio y PS-20 y luego combinar este material mezclado con APA y cloruro de sodio con o sin conservantes antimicrobianos.
[0141] Como se demuestra en el presente documento, puede ser necesario optimizar la elección del tensioactivo para diferentes productos farmacológicos y sustancias farmacológicas. Para vacunas multivalentes que contienen 15 o más serotipos, se prefieren PS-20 y P188. Se cree que la elección de la química utilizada para preparar el conjugado es un factor significativo que influye en la estabilización de la formulación. En particular, como se ejemplifica a continuación, los conjugados de polisacárido-proteína neumocócica preparados en disolvente acuoso o DMSO y combinados en una composición multivalente muestran diferencias significativas en la estabilidad dependiendo de los sistemas tensioactivos particulares usados para la formulación. Como se ha descrito, se observó una estabilidad mejorada con polisorbato 20 solo o con poloxámero 188 en combinación con un poliol, particularmente cuando se prepararon uno o más conjugados de polisacárido-proteína en un disolvente aprótico tal como DMSO.
[0142] La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que el uso de polisorbato 20 en formulaciones que contienen conjugados de polisacárido-proteína preparados usando aminación reductora, algunos de los cuales se preparan en condiciones acuosas y otros de los cuales se preparan en condiciones de DMSO, ayuda en el control de la inestabilidad fisicoquímica inducida por el estrés de fabricación y envío de las composiciones inmunogénicas y proporciona propiedades inesperadamente superiores sobre otros tensioactivos y estabilizadores. El mecanismo exacto de cómo un detergente específico protege un producto bioterapéutico es poco conocido y no se puede predecir a priori. Los posibles mecanismos de estabilización incluyen hidratación preferencial, exclusión preferencial, competencia de interfaz aire/líquido entre bioterapéutico y superficie, tensión superficial y/o asociación directa del detergente con el bioterapéutico para enmascarar parches hidrófobos que sirven como semillas para la agregación. La presente invención aborda una necesidad actual en la técnica de mejorar la estabilidad e inhibir la formación de partículas (por ejemplo, agregación, precipitación) de composiciones inmunogénicas que comprenden conjugados de polisacárido-proteína. Se cree que las formulaciones de la invención proporcionan ventajas significativas en el control de la agregación inducida por fabricación, envío y manipulación de tensioactivos bioterapéuticos complejos sobre los tensioactivos utilizados anteriormente, incluidos el poloxómero 188 y el polisorbato 80.
[0143] Se cree que el componente de proteína en el conjugado de polisacárido-proteína desempeña un papel importante para la agregación. Esto se demuestra en diferentes fenómenos de agregación de productos farmacéuticos que usan conjugados de la misma composición de serotipo pero diferentes disolventes de conjugación. El disolvente aprótico usado en la preparación de un conjugado de polisacárido altera la estructura de la proteína y puede mostrar una tendencia diferente a agregarse en presencia de adyuvante de APA. Cuando se usan dos o más proteínas portadoras, se puede calcular el porcentaje en peso.
[0144] Por lo tanto, en ciertos casos, la presente divulgación proporciona una formulación que comprende (i) uno o más conjugados de polisacárido-proteína; (ii) una solución salina tamponada de pH que tiene un pH en el intervalo de 5,0 a 7,5; (ii) una sal de aluminio; y (iv) un sistema tensioactivo seleccionado de (a) polisorbato 20 y (b) un poloxámero que tiene un peso molecular en el intervalo de 1100 Da a 17.400 Da y un poliol seleccionado de propilenglicol y polietilenglicol 400. En ciertos casos, se preparan uno o más conjugados de polisacárido-proteína en un disolvente aprótico tal como DMSO. Se puede preparar y conjugar un intervalo de aproximadamente 10-100 %, 24 %-100 % o 24-80 % de la masa total de proteína en un disolvente aprótico, tal como DMSO.
[0145] El sistema tensioactivo comprende polisorbato 20 (nombre IUPAC: monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán; PS-20) es un tensioactivo disponible comercialmente, comúnmente denominado Tween<®>20. La concentración final del polisorbato 20 en las formulaciones de la invención está en el intervalo de 0,001 % a 10 % p/v, de 0,025 % a 2,5 % p/v, o de 0,025 % a 0,3 % p/v. Un sistema tensioactivo que comprende polisorbato 20 puede comprender además un poliol. El poliol puede seleccionarse de propilenglicol y polietilenglicol. En ciertos aspectos, el polietilenglicol o propilenglicol está a una concentración final del 6 % al 20 % p/v. En ciertos aspectos, el polietilenglicol es polietilenglicol 400.
[0146] En ciertos casos, el sistema tensioactivo comprende un poloxámero que tiene un peso molecular en el intervalo de 1100 Da a 17.400 Da y un poliol seleccionado de propilenglicol y polietilenglicol 400.
[0147] Un poloxámero es un copolímero tribloque no iónico compuesto por una cadena hidrófoba central de polioxipropileno (poli(óxido de propileno)) flanqueada por dos cadenas hidrófilas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)). Los poloxámeros también se conocen con el nombre comercial Pluronic<®>. Debido a que las longitudes de los bloques de polímero se pueden personalizar, existen muchos poloxámeros diferentes que tienen propiedades ligeramente diferentes. Para el término genérico "poloxámero", estos copolímeros se denominan comúnmente con la letra "P" (para poloxámero) seguida de tres dígitos, los dos primeros dígitos x 100 dan la masa molecular aproximada del núcleo de polioxipropileno y el último dígito x 10 da el porcentaje de contenido de polioxietileno (por ejemplo, P407 = poloxámero con una masa molecular de polioxipropileno de 4.000 g/mol y un contenido de polioxietileno del 70 %). Para el Plurónico<®>nombre comercial, la codificación de estos copolímeros comienza con una letra para definir su forma física a temperatura ambiente (L = líquido, P = pasta, F = escamas (sólido)) seguido de dos o tres dígitos. El primer dígito (dos dígitos en un número de tres dígitos) en la designación numérica, multiplicado por 300, indica el peso molecular aproximado del hidrófobo; y el último dígito x 10 da el porcentaje de contenido de polioxietileno (por ejemplo, L61 = Pluronic<®>con una masa molecular de polioxipropileno de 1.800 g/mol y un contenido de polioxietileno del 10 %). Véase la patente de EE.UU. N.º 3.740.421.
[0148] Los ejemplos de poloxámeros tienen la fórmula general:
[0149] HO(C<2>H<4>O)<a>(C<3>H<6>O)<b>(C<2>H<4>O)<a>H
[0150] en donde los bloques a y b tienen los siguientes valores:
[0151] Pluronic<®>Poloxámero a b Peso molecular
[0152] L31 2 16 1100 (promedio)
[0153] L35 1900 (promedio)
[0154] L44NF 124 12 20 2090 a 2360
[0155] L64 2900 (promedio)
[0156] L81 2800 (promedio)
[0157] L121 4400 (promedio)
[0158] P 123 20 70 5750 (promedio)
[0159] F68NF 188 80 27 7680 a 9510
[0160] F87NF 237 64 37 6840 a 8830
[0161] F108NF 338 141 44 12700 a 17400
[0162] F127NF 407 101 56 9840 a 14600
[0163] Las unidades de peso molecular, como se usan en el presente documento, están en Dalton (Da) o g/mol.
[0164] Para las formulaciones, un poloxámero generalmente tiene un peso molecular en el intervalo de 1100 Da a 17.400 Da, de 7.500 Da a 15.000 Da, o de 7.500 Da a 10.000 Da. El poloxámero puede seleccionarse de poloxámero 188 o poloxámero 407. La concentración final del poloxámero en las formulaciones de la divulgación es del 0,001 al 5 % p/v, o del 0,025 al 1 % p/v. Un sistema tensioactivo que comprende un poloxámero debe comprender además un poliol. En ciertos aspectos, el poliol es propilenglicol y está en una concentración final de 1 a 20 % p/v. En ciertos aspectos, el poliol es polietilenglicol 400 y está en una concentración final de 1 a 20 % p/v.
[0165] Los polioles adecuados para las formulaciones son polioles poliméricos, particularmente poliéter dioles que incluyen, pero sin limitación, propilenglicol y polietilenglicol, polietilenglicol monometil éteres. El propilenglicol está disponible en un intervalo de pesos moleculares del monómero de ~425 a ~2700. El polietilenglicol y el polietilenglicol monometil éter también están disponibles en un intervalo de pesos moleculares que van desde ~200 a ~35000, incluidos, entre otros, PEG200, PEG300, PEG400, PEG1000 PEG MME 550, PEG MME 600, PEG MME 2000, PEG MME 3350 y PEG MME 4000. Otro polietilenglicol es el polietilenglicol 400. La concentración final del poliol en las formulaciones de la divulgación puede ser del 1 al 20 % p/v o del 6 al 20 % p/v.
[0166] La formulación también contiene una solución salina de pH tamponado. El tampón puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en Tris, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartrato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, L-histidina, glicina, succinato, HEPES (4-(2-hidroxietilo ácido )-1-piperazinaetanosulfónico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), MES (2-(N-ácido morfolino)etanosulfónico) y tampón de trietanolamina. El tampón es capaz de tamponar una solución a un pH en el intervalo de 4 a 10, de 5,2 a 7,5 o de 5,8 a 7,0. En cierto aspecto de la divulgación, el tampón seleccionado del grupo que consiste en fosfato, succinato, L-histidina, MES, MOPS, HEPES, acetato o citrato. Además, el tampón puede seleccionarse, por ejemplo, de tampones compatibles con la USP para uso parenteral, en particular, cuando la formulación farmacéutica es para uso parenteral. Las concentraciones de tampón variarán de 1 mM a 50 mM o de 5 mM a 50 mM. En ciertos aspectos, el tampón es L-histidina a una concentración final de 5 mM a 50 mM, o succinato a una concentración final de 1 mM a 10 mM. En ciertos aspectos, la L-histidina está a una concentración final de 20 mM ± 2 mM.
[0167] Si bien se prefiere la solución salina (es decir, una solución que contiene NaCl), otras sales adecuadas para la formulación incluyen, pero sin limitación, CaCl<2>, KCl y MgCl<2>y combinaciones de los mismos. Pueden usarse agentes isotónicos no iónicos incluyendo, pero sin limitación, sacarosa, trehalosa, manitol, sorbitol y glicerol en lugar de una sal. Los intervalos de sal adecuados incluyen, pero no se limitan a 25 mM a 500 mM o 40 mM a 170 mM. En un aspecto, la solución salina es NaCl, opcionalmente presente a una concentración de 20 mM a 170 mM.
[0168] En una realización preferida, las formulaciones comprenden un tampón de L-histidina con cloruro de sodio.
[0169] En ciertos casos de las formulaciones descritas en el presente documento, los conjugados de polisacárido-proteína comprenden uno o más polisacáridos neumocócicos conjugados con una proteína portadora. La proteína portadora se puede seleccionar de CRM<197>, fragmento B de toxina diftérica (DTFB), DTFBC8, toxoide diftérico (DT), toxoide tetánico (TT), fragmento C de TT, toxoide de tos ferina, toxoide de cólera, E. coli LT, E. coli ST, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, y combinaciones de los mismos. En ciertos aspectos, uno o más de los conjugados de polisacárido-proteína se conjugan con DTFB. En un aspecto, todos los conjugados de polisacárido-proteína se preparan usando química acuosa. Como ejemplo, la formulación de conjugado de polisacárido-proteína puede ser una formulación de conjugado neumocócico 15-valente (15vPnC) que consiste esencialmente en polisacárido S. pneumoniae de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F conjugado a un polipéptido de CRM<197>. En otro aspecto, uno o más de los conjugados de proteína de polisacárido se preparan usando química de DMSO. Como ejemplo, la formulación de conjugado de polisacárido-proteína puede ser una formulación de conjugado de neumococo 15-valente (15vPnC) en donde los conjugados de proteína de polisacárido de los serotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F y 23F se preparan usando química de DMSO y proteína de polisacárido los conjugados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F y 33F se preparan usando química acuosa.
[0170] En otro caso, la composición farmacéutica se administra en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, el agente puede administrarse usando infusión intravenosa, un parche transdérmico, liposomas u otros modos de administración. En otro caso, se usan materiales poliméricos; por ejemplo en microesferas en o un implante.
[0171] Las composiciones también pueden incluir una o más proteínas de S. pneumoniae. Los ejemplos de proteínas de S. pneumoniae adecuadas para su inclusión incluyen aquellas identificadas en las Publicaciones de solicitud de patentes internacional N.º WO 02/083855 y WO 02/053761.
[0172] Los siguientes ejemplos ilustran, pero no limitan la invención.
[0173] Ejemplos
[0174] EJEMPLO 1: Preparación de proteína portadora de DTFB (ejemplo comparativo)
[0175] Uso de cromatografía de intercambio aniónico multimodal para la preparación de DTFB
[0176] CRM<197>purificada, obtenida a través de la expresión en Pseudomonas fluorescens como se ha descrito anteriormente (véase la publicación de solicitud de patente internacional n.º documento WO 2012/173876 A1), se digirió con tripsina recombinante usando una relación molar de 1:500 de tripsina a CRM<197>durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 22 °C en Tris 50 mM, pH 8,0. A continuación, se añadió ditioteritol (DTT) en Tris 50 mM, pH 8 a una concentración final de 5 mM durante 30 minutos a aproximadamente 22 °C para reducir el enlace disulfuro entre los fragmentos A y B de la CRM<197>escindida proteolíticamente.
[0177] A continuación, la reacción de digestión se cargó en una columna de cromatografía de intercambio aniónico multimodal (Capto<™>Adhere, GE Healthcare) equilibrado con Tris 50 mM, pH 8. La columna se lavó con Tris 50 mM, pH 8, y el producto de DTFB se eluyó con un gradiente de cloruro de sodio de 0,45 M a 0,65 M en Tris 50 mM, pH 8. El producto se concentró y se diafiltró contra fosfato de potasio 10 mM, pH 8 usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de corte de peso molecular nominal (NMWCO) de 5 kDa. El producto de DTFB que contenía el retenido se filtró a 0,2 micrómetros y se almacenó a 2-8 °C. La concentración del producto se determinó por absorbancia a 280 nm y la pureza se evaluó por SDS-PAGE en condiciones no reductoras.
[0178] Los resultados muestran que el eluyente de cromatografía de intercambio aniónico multimodal contenía DTFB relativamente puro, presente principalmente como un monómero con una pequeña fracción de dímero. Véase la Figura 1A. La formación de dímeros se atribuyó a la formación de enlaces disulfuro entre los monómeros de DTFB. Como se ejemplifica en las siguientes secciones, se ha usado DTT en las etapas de cromatografía y ultrafiltración para minimizar el potencial de formación de dímeros.
[0179] Uso de cromatografía de intercambio catiónico multimodal para la preparación de DTFB
[0180] Debido a la presencia de dímeros de DTFB, se investigó un método de purificación alternativo. CRM<197>purificada, obtenida a través de la expresión en Pseudomonas fluorescens como se ha descrito anteriormente, se diluyó a una concentración de proteína de aproximadamente 1 mg/ml usando Tris 300 mM, pH 7,5. Se añadió tripsina a la solución de proteína usando una relación molar de tripsina a CRM<197>de aproximadamente 1:3250. La solución se incubó durante aproximadamente 20 horas a temperatura ambiente. A continuación, se añadió DTT en Tris 300 mM, pH 7,5 a una concentración final de DTT 10 mM para reducir el enlace disulfuro entre el CRM<197>escindida proteolíticamente, separando los fragmentos A y B.
[0181] Después de aproximadamente 75 minutos, la solución de proteína reducida se cargó en una columna de cromatografía de intercambio catiónico multimodal (Capto<™>MMC, GE Healthcare). La columna se equilibró a 2-8 ºC con Tris 300 mM, DTT 10 mM, pH 7,5 antes de cargar la solución de proteína. Después de la carga, la columna se lavó a 2-8 °C con Tris 300 mM, pH 7,5 que contenía cloruro de sodio 200 mM y DTT 10 mM, y el producto se eluyó a 2-8 °C con cloruro de sodio 1 M en cloruro de sodio 300 mM Tris, pH 8,5. Se añadió aproximadamente 0,002 % p/v de PS-20 al lote antes de la concentración a 2-8 °C usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de NMWCO de 5 kDa. Después de la concentración, se añadió PS-20 adicional al lote a una concentración de 0,02 % p/v de PS-20, y el lote se diafiltró frente a fosfato potásico 100 mM, DTT 10 mM, pH 8. El lote se concentró adicionalmente usando filtración de flujo tangencial con una membrana de 5 kDa. El retenido final se filtró a 0,2 micrómetros y se almacenó congelado o a 2-8 °C antes de la conjugación.
[0182] Las muestras de DTFB se analizaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras (Figuras 1B y 1C). El análisis densitométrico del gel muestra que el intermedio a granel final después de la filtración de 0,2 micrómetros (FBI) tiene una pureza de> 98%.
[0183] El intermedio a granel final (FBI) que se muestra en la Figura 1C se analizó mediante cromatografía líquida con espectrometría de masas (LC-MS) para medir la masa de proteína intacta. El análisis de LC-MS se realizó en muestras después de la reducción con DTT. La desconvolución de los datos sin procesar del pico principal dio como resultado una masa medida de 37.194,2 Da. Esta medición de masa es consistente con la masa teórica de 37.194,4 Da para el DTFB, lo que confirma la secuencia de aminoácidos esperada.
[0184] Se obtuvo un mapa de péptidos a partir de una combinación de digestiones con tripsina, endoproteinasa Asp-N y endoproteinasa Glu-C. La muestra se sometió a alquilación reductora con yodoacetamida en presencia de guanidina-HCl 6 M, y se digirió durante aproximadamente 16-17 horas a 37°C con cada enzima por separado. Las digestiones se extinguieron mediante la adición de ácido fórmico. Los péptidos se separaron y analizaron por LC-MS. Usando una combinación de los péptidos identificados por las digestiones separadas, la cobertura de la secuencia de aminoácidos fue de aproximadamente el 98%. Los péptidos encontrados eran consistentes con la secuencia de DTFB predicha.
[0185] Proceso de cromatografía de intercambio catiónico multimodal alternativo para la purificación de DTFB CRM<197>purificada, obtenida a través de la expresión en Pseudomonas fluorescens como se ha descrito anteriormente, se diluyó a una concentración de proteína de aproximadamente 5 mg/ml usando Tris 300 mM, pH 7,5. Se añadió tripsina a la solución de proteína usando una relación molar de tripsina a CRM<197>de aproximadamente 1:3000. La solución se incubó durante aproximadamente 15-20 horas a aproximadamente 22 °C. A continuación, se añadió DTT en Tris 300 mM, pH 7,5 a una concentración final de ≥ 10 mM de DTT para reducir el enlace disulfuro entre el CRM<197>escindida proteolíticamente, separando los fragmentos A y B.
[0186] La solución de proteína reducida se cargó en una columna de cromatografía de intercambio catiónico multimodal (Capto<™>MMC, GE Healthcare) a aproximadamente 25 g de proteína por L de resina. La columna se equilibró a aproximadamente 22 °C con Tris 300 mM, DTT 10 mM, pH 7,5 antes de cargar la solución de proteína. Después de la carga, la columna se lavó a aproximadamente 22 °C con Tris 300 mM, pH 7,5 que contenía cloruro de sodio 200 mM y DTT 10 mM, y el producto se eluyó a continuación a 22 °C con cloruro de sodio 1 M en Tris 300 mM, pH 8.5. El producto de DTFB de la cromatografía de intercambio catiónico multimodal puede diafiltrarse y concentrarse usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de NMWCO de 5 kDa y filtrarse a 0,2 micrómetros como se ha descrito anteriormente.
[0187] Las muestras de DTFB del proceso de intercambio catiónico multimodal se analizaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras (Figura 1D). El análisis densitométrico del gel muestra que el producto de proteína DTFB eluido de la columna de intercambio catiónico multimodal está altamente purificado.
[0188] Efectos del pH del tampón, la fuerza iónica y la concentración de tensioactivo PS-20 en la estabilidad de DTFB durante la ultrafiltración
[0189] Se realizaron estudios de pH de tampón, fuerza iónica y tensioactivo PS-20 para abordar la formación de partículas de proteína observada durante el desarrollo de la etapa de ultrafiltración de DTFB. El DTFB se ajustó a fosfato de potasio 100 mM a pH 7, 7,5 o pH 8 con cloruro de sodio 0, 200 o 500 mM. Se usó calorimetría diferencial de barrido para evaluar la estabilidad (temperatura de fusión, Tm) de las soluciones de DTFB en función del pH y la concentración de cloruro de sodio. Como se muestra en la Tabla 1, aumentar el pH de 7 a 8 aumentó la Tm de DTFB en aproximadamente 3 °C. El cloruro de sodio en el intervalo de 0 a 500 mM de cloruro de sodio no impactó significativamente en la Tm a los valores de pH investigados.
[0190] Tabla 1: Estabilidad de las soluciones de DTFB en función del pH del tampón y la concentración de cloruro de sodio medida or calorimetría diferencial de barrido.
[0193]
[0194] n in i n
[0197]
[0199] En un estudio separado, el DTFB purificado se ajustó a pH 6,0, pH 7,0 y pH 8,5 en fosfato de potasio 100 mM con cloruro de sodio 0, 150, 500 y 1000 mM. Las soluciones se mantuvieron durante la noche a temperatura ambiente y luego se centrifugaron para eliminar la proteína precipitada. Se ensayó la concentración de proteína de los sobrenadantes mediante cromatografía de exclusión por tamaño con detección de absorbancia UV280 (Figura 2). La concentración de proteína sobrenadante en este estudio no se vio afectada por el pH de la solución a 0 y 150 mM de cloruro de sodio. Sin embargo, a concentraciones de cloruro de sodio más altas (500 y 1000 mM), los resultados muestran una disminución pronunciada en la concentración de proteína sobrenadante, indicativa de una estabilidad de DTFB reducida, a medida que el pH del tampón disminuyó de pH 7,0 u 8,5 a 6,0.
[0200] El efecto de la concentración de PS-20 sobre la estabilidad de DTFB se estudió añadiendo cantidades crecientes de PS-20 a soluciones de DTFB en soluciones de fosfato de potasio 50 y 100 mM, pH 8 y en fosfato de potasio 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 8. Las soluciones se agitaron en vórtex durante 5 minutos y luego se centrifugaron. Se ensayó la concentración de proteína de los sobrenadantes mediante cromatografía de exclusión por tamaño con detección de absorbancia UV280 (Figura 3). Se observó una pérdida de proteína inducida por vórtice significativa en muestras que no contenían PS-20. La recuperación de DTFB mejoró notablemente en muestras que contenían ≥ 0,01 % p/v de PS-20.
[0201] EJEMPLO 2: Preparación de polisacáridos capsulares de S. pneumoniae
[0202] Son bien conocidos en la técnica métodos de cultivo de neumococos. Véase, por ejemplo, Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52. También son conocidos en la técnica métodos para preparar polisacáridos capsulares neumocócicos. Véase, por ejemplo, la patente europea n.º EP0497524. Los aislados de subtipos neumocócicos están disponibles en la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las bacterias se identifican como diplococos encapsulados, no móviles, grampositivos, en forma de lanceta que son alfa-hemolíticos en agar sangre. Los subtipos se pueden diferenciar sobre la base de la reacción de Quelling usando antisueros específicos. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.º 5.847.112.
[0203] Los bancos de células que representan cada uno de los S. pneumoniae los serotipos de interés se obtuvieron de Merck Culture Collection (Rahway, NJ) en un vial congelado. Se transfirió un cultivo de semillas descongelado al fermentador de semillas que contenía un medio de crecimiento preesterilizado apropiado para S. pneumoniae. El cultivo se hizo crecer en el fermentador de semillas con control de temperatura y pH. Todo el volumen del fermentador de semillas se transfirió a un fermentador de producción que contenía medios de crecimiento preesterilizados. La fermentación de producción fue la etapa final de crecimiento celular del proceso. Se controlaron la temperatura, el pH y la velocidad de agitación.
[0204] El proceso de fermentación se terminó mediante la adición de un agente inactivante. Después de la inactivación, el lote se transfirió al tanque de inactivación donde se mantuvo a temperatura y agitación controladas. Los restos celulares se eliminaron usando una combinación de centrifugación y filtración. El lote se ultrafiltró y diafiltró. A continuación, el lote se sometió a fraccionamientos basados en disolventes que eliminan las impurezas y recuperan el polisacárido. EJEMPLO 3: Conjugación de polisacáridos a proteína portadora de DTFB usando
[0205] Aminación en solución acuosa (ejemplo comparativo)
[0206] Preparación del conjugado de serotipo 3-DTFB (ST3-DTFB) para estudios de inmunogenicidad en ratones
[0207] El polisacárido de serotipo 3 purificado obtenido como se describe en el Ejemplo 2 se disolvió en agua. La reducción de tamaño de Ps a un peso molecular promedio de aproximadamente 200 kDa se realizó utilizando un sonicador de sonda con la muestra enfriada en hielo. La muestra sonicada se filtró a 0,2 micrómetros y se almacenó a 2-8 °C. La solución de polisacárido se concentró por diafiltración contra una membrana de filtración de flujo tangencial de 30 kDa NMWCO.
[0208] El polisacárido se preparó para la conjugación usando oxidación con metaperiodato de sodio (véase Anderson et al., 1986, J. Immunol. 137:1181-1186; y la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.º US20110195086). Se añadió una solución de metaperiodato de sodio 100 mM a la solución de polisacárido en acetato de sodio 50 mM. La muestra se mezcló durante 14-18 horas a 19-25 °C protegida de la luz. Se añadió etilenglicol (exceso molar de 100:1 sobre las unidades repetidas de polisacárido) y se mezcló durante 16-18 horas adicionales a 19-25 °C para extinguir el metaperyodato de sodio residual y detener la reacción de oxidación. La solución resultante se diafiltró contra 10 volúmenes de agua. La solución de polisacárido oxidado se almacenó en alícuotas a -70 °C.
[0209] El polisacárido oxidado con peryodato se mezcló con DTFB preparado como se describe en el Ejemplo 1 (usando cromatografía de intercambio aniónico multimodal) en una relación de masa de polisacárido a proteína de 0,6:1. Se añadieron fosfato de potasio, pH 6,4 y cloruro de níquel a concentraciones finales de 145 mM y 2,2 mM, respectivamente. A continuación, se añadió cianoborohidruro de sodio hasta aproximadamente 1-2 equivalentes molares. La reacción se protegió de la luz y se llevó a cabo durante un período de 120 horas a 2-8°C.
[0210] A continuación, la mezcla se dializó frente a 2 cambios de tampón de fosfato de potasio 25 mM, pH 6,4, cloruro de sodio 0,3 M a 2-8 ºC durante un total de 14 - 18 horas. Los materiales insolubles se eliminaron mediante una centrifugación breve y el conjugado se pulió mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para reducir el polisacárido y la proteína libres. El conjugado pulido por SEC se concentró en un concentrador centrífugo de 30 kD NMWCO.
[0211] Preparación de conjugado de serotipo 3-DTFB para estudio de inmunogenicidad de mono Rhesus infantil
[0212] El polvo de polisacárido capsular neumocócico de serotipo 3 purificado se disolvió en agua y se filtró a 0,45 micrómetros. El lote se homogeneizó para reducir la masa molecular del P y se filtró a 0,22 micrómetros. Reducción de tamaño de Streptococcus pneumoniae polisacárido, antes de la conjugación, se ha descrito anteriormente como medio para generar polisacárido con propiedades físicas más específicas, reproducibles y manejables (Marburg et al., 1997, Patente de Estados Unidos 5.623.057). Como se describe por Marburg et al., se sabe que la reducción del tamaño del polisacárido aumenta la solubilidad y la filtrabilidad y reduce la polidispersidad y la viscosidad, mejorando de este modo la consistencia de la conjugación y la facilidad de conjugación. Reducción de tamaño de polisacárido del polisacárido de serotipo 19F de S. pneumoniae usando homogeneización se ha descrito anteriormente (Lander et al., 2000, Biotechnol. Prog.2000, 16, 80-85). El polisacárido de tamaño reducido se concentró a continuación y se diafiltró contra agua usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de NMWCO de 10 kDa.
[0213] A continuación, se añadió acetato de sodio 50 mM y se inició la activación del polisacárido con la adición de una solución de metaperiodato de sodio 100 mM para formar aldehídos reactivos en el polisacárido. El lote se incubó a aproximadamente 22 °C durante aproximadamente 12 horas. El lote se diafiltró contra fosfato de potasio 10 mM, pH 6,4 usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de NMWCO de 10 kDa a ≤ 8 °C y se concentró el retenido rico en producto.
[0214] La solución de polisacárido activado se mezcló con agua y fosfato de potasio 1,5 M, pH 7,0. El DTFB purificado se filtró a 0,2 micrómetros y luego se combinó con la solución de polisacárido ajustada en tampón en una relación de masa de polisacárido a proteína de 1,3:1. A continuación, la solución se filtró a 0,2 micrómetros. Se añadió cloruro de níquel al lote hasta una concentración final de aproximadamente 2 mM usando una solución madre de cloruro de níquel 100 mM. A continuación, se añadió cianoborohidruro de sodio (2 moles por mol de unidad repetitiva de polisacárido). El lote se dejó reaccionar durante aproximadamente 120 horas a aproximadamente 10 °C para maximizar el consumo de polisacárido y proteína.
[0215] Después de la reacción de conjugación, el lote se diluyó a una concentración de polisacárido de aproximadamente 3,5 g/l, se enfrió a 2-8 °C, se filtró a 1,2 micrómetros y se diafiltró contra fosfato de potasio 100 mM, pH 7,0 a 2-8 °C usando un Membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de 100 kDa NMWCO. El lote, recuperado en el retenido, se diluyó a continuación a aproximadamente 2,0 g de polisacárido/L y se ajustó el pH con la adición de bicarbonato de sodio 1,2 M, pH 9,4. Se añadió borohidruro de sodio (1 mol por mol de unidad repetitiva de polisacárido). Posteriormente se añadió fosfato de potasio 1,5 M, pH 6,0.
[0216] A continuación, el lote se concentró y se diafiltró contra L-histidina 10 mM en cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0 a 2-8 °C usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de 300 kDa NMWCO. El retenido se filtró a 0,2 micrómetros y se ajustó a una concentración de polisacárido de 1,0 g/l con L-histidina 10 mM adicional en cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0. El lote se distribuyó en alícuotas y se congeló a ≤ -60 °C.
[0217] EJEMPLO 4: Conjugación de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F a CRM<197>usando aminación reductora en solución acuosa
[0218] Los diferentes polisacáridos de serotipo se conjugaron individualmente a proteína portadora de CRM<197>purificada usando un flujo de proceso común. El polisacárido se disolvió, se redujo de tamaño, se activó químicamente y se intercambió tampón por ultrafiltración. CRM<197>purificada luego se conjugó al polisacárido activado utilizando NiCl<2>(2 mM) en la mezcla de reacción, y el conjugado resultante se purificó por ultrafiltración antes de una filtración final de 0,2 micrómetros. Varios parámetros de proceso dentro de cada etapa, tales como pH, temperatura, concentración y tiempo se controlaron a valores específicos de serotipo en la sección a continuación.
[0219] Reducción del tamaño de los polisacáridos y oxidación
[0220] El polvo de polisacárido capsular neumocócico purificado se disolvió en agua y todos los serotipos, excepto el serotipo 19A, se filtraron a 0,45 micrómetros. Los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F se homogeneizaron para reducir la masa molecular del polisacárido. Se redujo el tamaño del serotipo 18C mediante homogeneización o hidrólisis ácida a ≥ 90 °C. El serotipo 19A no se redujo en tamaño debido a su tamaño inicial relativamente bajo. La presión de homogeneización y el número de pasadas a través del homogeneizador se controlaron para objetivos específicos de serotipo (150-1000 bar; 4-7 pasadas) para lograr una masa molecular específica de serotipo. El polisacárido de tamaño reducido se filtró a 0,2 micrómetros y luego se concentró y diafiltró contra agua usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Se usó una membrana de NMWCO de 5 kDa para el serotipo 18C hidrolizado con ácido.
[0221] La solución de polisacárido se ajustó a continuación a una temperatura específica de serotipo (4-22 °C) y pH (4-5) con un tampón de acetato de sodio para minimizar la reducción de tamaño de polisacárido debido a la activación. Para todos los serotipos (excepto el serotipo 4), la activación de polisacáridos se inició con la adición de una solución de metaperiodato de sodio 100 mM. La cantidad de metaperyodato de sodio añadida fue específica de serotipo, variando de aproximadamente 0,1 a 0,5 moles de metaperyodato de sodio por mol de unidad repetitiva de polisacárido. La carga específica de serotipo de metaperiodato de sodio fue para lograr un nivel objetivo de activación de polisacárido (moles de aldehído por mol de unidad de repetición de polisacárido). Para el serotipo 4, antes de la adición de metaperiodato de sodio, el lote se incubó a aproximadamente 50 °C y pH 4,1 para descetalizar parcialmente el polisacárido.
[0222] Para todos los serotipos, con la excepción de los serotipos 5 y 7F, el producto activado se diafiltró contra fosfato de potasio 10 mM, pH 6,4 usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Se usó una membrana de NMWCO de 5 kDa para el serotipo 18C hidrolizado con ácido. Los serotipos 5 y 7F se diafiltraron frente a acetato de sodio 10 mM. La ultrafiltración para todos los serotipos se realizó a 2-8 °C.
[0223] Conjugación de polisacáridos con CRM<197>
[0224] La solución de polisacárido oxidado se mezcló con agua y fosfato de potasio 1,5 M, pH 6,0 o pH 7,0, dependiendo del serotipo. El pH del tampón seleccionado fue para mejorar la estabilidad del polisacárido activado durante la reacción de conjugación. CRM<197>purificada, obtenida a través de la expresión en Pseudomonas fluorescens como se ha descrito anteriormente (véase la publicación de solicitud de patente internacional n.º documento WO 2012/173876 A1), se filtró 0,2 micras y se combinó con la solución de polisacárido tamponado en una relación de masa de polisacárido a CRM<197>que varía de 0,4 a 1,0 p/p dependiendo del serotipo. La relación de masa se seleccionó para controlar la relación de polisacárido con respecto a CRM<197>en el conjugado resultante. Las concentraciones de polisacárido y fosfato fueron específicas de serotipo, variando de 3,6 a 10,0 g/l y de 100 a 150 mM, respectivamente, dependiendo del serotipo. La concentración de polisacárido específica de serotipo se seleccionó para controlar el tamaño del conjugado resultante. A continuación, la solución se filtró a 0,2 micrómetros. Se añadió cloruro de níquel a aproximadamente 2 mM usando una solución de cloruro de níquel 100 mM. Se añadió cianoborohidruro de sodio (2 moles por mol de unidad repetitiva de polisacárido). La conjugación continuó durante una duración específica de serotipo (72 a 120 horas) para maximizar el consumo de polisacárido y proteína.
[0225] El serotipo 18C hidrolizado con ácido se conjugó a 37 °C en fosfato potásico 100 mM a aproximadamente pH 8 con cianoborohidruro de sodio usando concentraciones de polisacárido y proteína de aproximadamente 12,0 g/l y 6,0 g/l, respectivamente.
[0226] Reducción con borohidruro de sodio
[0227] Después de la reacción de conjugación, el lote se diluyó a una concentración de polisacárido de aproximadamente 3,5 g/l, se enfrió a 2-8 ºC y se filtró a 1,2 micrómetros. Todos los serotipos (excepto el serotipo 5) se diafiltraron frente a fosfato potásico 100 mM, pH 7,0 a 2-8 °C usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de NMWCO de 100 kDa. El lote, recuperado en el retenido, se diluyó a continuación a aproximadamente 2,0 g de polisacárido/L y se ajustó el pH con la adición de bicarbonato de sodio 1,2 M, pH 9,4. Se añadió borohidruro de sodio (1 mol por mol de unidad repetitiva de polisacárido). Posteriormente se añadió fosfato de potasio 1,5 M, pH 6,0. El serotipo 5 se diafiltró contra fosfato de potasio 300 mM usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de 100 kDa NMWCO.
[0228] Filtración final y almacenamiento de producto
[0229] A continuación, el lote se concentró y se diafiltró contra L-histidina 10 mM en cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0 a 4 °C usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de 300 kDa NMWCO. El lote de retenido se filtró a 0,2 micrómetros.
[0230] El serotipo 19F se incubó durante aproximadamente 7 días a 22 °C, se diafiltró contra L-histidina 10 mM en cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0 a 4°C usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de NMWCO de 100 kDa y se filtró a 0,2 micras.
[0231] El lote se ajustó a una concentración de polisacárido de 1,0 g/l con L-histidina 10 mM adicional en cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0. El lote se distribuyó en alícuotas y se congeló a ≤ -60 °C.
[0232] EJEMPLO 5: Métodos para la conjugación de los serotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F y 23F a CRM<197>usando aminación reductiva en dimetilsulfóxido
[0233] Los diferentes polisacáridos de serotipo se conjugaron individualmente a proteína portadora de CRM<197>purificada usando un flujo de proceso común. El polisacárido se disolvió, se clasificó a una masa molecular objetivo, se activó químicamente y se intercambió tampón por ultrafiltración. Polisacárido activado y CRM<197>purificada se liofilizaron individualmente y se redisolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO). A continuación, se combinaron y conjugaron las soluciones disueltas de nuevo de polisacárido y CRM<197>como se describe a continuación. El conjugado resultante se purificó mediante ultrafiltración antes de una filtración final de 0,2 micrómetros. Varios parámetros de proceso dentro de cada etapa, tales como pH, temperatura, concentración y tiempo se controlaron a valores específicos de serotipo en la sección a continuación.
[0234] Reducción del tamaño de los polisacáridos y oxidación
[0235] El polvo de polisacárido capsular neumocócico purificado se disolvió en agua y todos los serotipos, excepto el serotipo 19A, se filtraron a 0,45 micrómetros. Todos los serotipos, excepto los serotipos 18C y 19A, se homogeneizaron para reducir la masa molecular del polisacárido. La presión de homogeneización y el número de pasadas a través del homogeneizador se controlaron para objetivos específicos de serotipo (150-1000 bar; 4-7 pasadas). El serotipo 18C se redujo de tamaño por hidrólisis ácida a ≥ 90 °C. El serotipo 19A no se redujo en tamaño.
[0236] El polisacárido de tamaño reducido se filtró a 0,2 micrómetros y luego se concentró y diafiltró contra agua usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Se usó una membrana de NMWCO de 5 kDa para el serotipo 18C.
[0237] La solución de polisacárido se ajustó a continuación a una temperatura específica de serotipo (4-22 °C) y pH (4-5) con un tampón de acetato de sodio. La activación del polisacárido se inició con la adición de una solución de metaperyodato de sodio. La cantidad de metaperyodato de sodio añadida fue específica de serotipo, variando de aproximadamente 0,1 a 0,5 moles de metaperyodato de sodio por mol de unidad repetitiva de polisacárido.
[0238] Para todos los serotipos, el producto activado se diafiltró contra fosfato de potasio 10 mM, pH 6,4 usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Se usó una membrana de NMWCO de 5 kDa para el serotipo 18C. La ultrafiltración para todos los serotipos se realizó a 2-8 °C.
[0239] Conjugación de polisacáridos con CRM<197>
[0240] CRM<197>purificada, obtenida a través de la expresión en Pseudomonas fluorescens como se ha descrito anteriormente (véase la publicación de solicitud de patente internacional n.º documento WO 2012/173876 A1), se diafiltró contra fosfato 2 mM, tampón de pH 7 usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de NMWCO de 5 kDa y se filtró a 0,2 micrómetros.
[0241] La solución de polisacárido oxidado se formuló con agua y sacarosa en preparación para la liofilización. La solución de proteína se formuló con agua, tampón de fosfato y sacarosa en preparación para la liofilización. Las concentraciones de sacarosa variaron del 1 al 5 % para lograr una redisolución óptima en DMSO después de la liofilización.
[0242] Soluciones de polisacárido formulado y CRM<197>se liofilizaron individualmente. Los materiales de polisacárido liofilizado y CRM<197>se redisolvieron en DMSO y se combinaron usando un mezclador en T. Se añadió cianoborohidruro de sodio (1 mol por mol de unidad repetitiva de polisacárido), y la conjugación continuó durante una duración específica de serotipo (1 a 48 horas) para lograr un tamaño de conjugado objetivo.
[0243] Reducción con borohidruro de sodio
[0244] Se añadió borohidruro de sodio (2 moles por mol de unidad repetitiva de polisacárido) después de la reacción de conjugación. El lote se diluyó en cloruro de sodio 150 mM a aproximadamente 4 °C. A continuación, se añadió tampón de fosfato de potasio para neutralizar el pH. El lote se concentró y se diafiltró a aproximadamente 4 °C frente a cloruro de sodio 150 mM usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Filtración final y almacenamiento de producto
[0245] A continuación, cada lote se concentró y diaftiltó contra L-histidina 10 mM en cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0 a 4 °C usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de 300 kDa NMWCO. El lote de retenido se filtró a 0,2 micrómetros.
[0246] El serotipo 19F se incubó durante aproximadamente 5 días, se diafiltró contra L-histidina 10 mM en cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0 a aproximadamente 4 °C usando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial de 300 kDa NMWCO, y se filtró a 0,2 micrómetros.
[0247] El lote se diluyó con L-histidina 10 mM adicional en cloruro de sodio 150 mM, pH 7,0 y se distribuyó en alícuotas y se congeló a ≤ -60 °C.
[0248] EJEMPLO 6: Estudio de inmunogenicidad en ratón usando formulación de conjugado monovalente de ST3-DTFB (ejemplo comparativo)
[0249] La inmunogenicidad de ST3-DTFB en comparación con ST3-CRM<197>se evaluó en un modelo de ratón. Las formulaciones con adyuvante para su administración a ratones se prepararon mezclando 24 µL de conjugado filtrado estéril (1:10 en solución salina - 0,1258 mg de DTFB o CRM<197>-polisacárido conjugado por ml) con 62 µl de APA y 3,664 ml de solución salina estéril para una dosis de 0,08 µg de polisacárido y 5 µg de aluminio por 100 µl. Las vacunas formuladas se almacenaron en viales individuales con tapón de borosilicato a 2-8 °C para soportar las inmunizaciones individuales.
[0250] ST3-DTFB se evaluó en ratones Balb/C hembra de 6-8 semanas de edad (n=10/grupo). Los ratones se inmunizaron con ST3-DTFB/APA y dos ST3-CRM<197>/lotes APA hechos usando preparaciones de conjugados ST3-DTFB y ST3-CRM<197>únicas preparadas como se describe en los Ejemplos 3 y 4. La concentración de ST3 PnPs fue de 0,08 µg por dosis en un volumen de 0,1 ml, con 5 µg de APA, administrados por vía intraperitoneal los días 0, 14 y 28. Los sueros se recogieron antes del inicio del estudio (pre) y el día 39, después de la dosis 3 (PD3) y se analizaron en un ELISA ST3 de la OMS [según los protocolos estandarizados de la Organización Mundial de la Salud (OMS)], así como en un ELISA transportador de proteínas (CRM<197>y DTFB). Los ratones se expusieron intraperitonealmente a S. pneumoniae serotipo 3 (207 CFU/0,5 ml) el día 49.
[0251] Los resultados de ELISA de la OMS (Figura 4) mostraron ratones inmunizados tanto con ST3-DTFB/APA como con ST3-CRM<197>/APA tenía títulos de PD3 PnPs 3 similares. Los ratones inmunizados con ST3-DTFB/APA y ST3-CRM197/APA tenían ≥ 90 % de protección contra una exposición al serotipo 3, que era significativamente mayor en relación con los ratones inmunizados con solución salina y APA de control negativo (Figura 5).
[0252] EJEMPLO 7: Formulación de una vacuna neumocócica conjugada 15-valente con diferentes tensioactivos y estabilizadores
[0253] Los conjugados de polisacárido-proteína neumocócica preparados como se ha descrito anteriormente se usaron para la formulación de una vacuna conjugada neumocócica 15-valente (PCV15) que tiene los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F , 22F, 23F y 33F. Las formulaciones se prepararon usando conjugados neumocócicosde polisacárido-CRM<197>generados por aminación reductora en soluciones acuosas (Ejemplo 4) o en DMSO (Ejemplo 5). Los conjugados de ST3-DTFB se prepararon según el Ejemplo 3. Los volúmenes requeridos de conjugados a granel necesarios para obtener la concentración final objetivo del serotipo individual se calcularon basándose en el volumen del lote y las concentraciones de polisacáridos a granel. Los 15 conjugados se combinaron con los excipientes seleccionados de cloruro de sodio, L-histidina, tampón de pH 5,8 con PS-20, PS-80 o P188.
[0254] El producto a granel formulado estéril se mezcló suavemente durante y después de su mezcla con adyuvante de fosfato de aluminio (APA) a granel con o sin propilenglicol (PG) y polietilenglicol 400 (PEG<400>). Se estudiaron dos concentraciones de conjugados y APA en las diversas formulaciones. Uno contenía 8 µg/ml de polisacárido de serotipo 6B, 4 µg/ml de polisacárido para todos los demás serotipos y 250 µg/ml de APA. El otro contenía 16 µg/ml de polisacárido de serotipo 6B, 8 µg/ml de polisacárido para todos los demás serotipos y 500 µg/ml de APA. Las vacunas formuladas se almacenaron a 2 - 8 °C.
[0255] EJEMPLO 8: Impacto de los excipientes en la estabilidad de una formulación de vacuna neumocócica conjugada que contiene conjugados generados por aminación reductora en solución acuosa
[0256] La estabilidad de una vacuna neumocócica conjugada 15-valente (PCV15), preparada como se describe en el Ejemplo 7, se evaluó para diversas condiciones de excipiente después de estudios de agitación, recirculación y agitación rotacional para simular las tensiones de fabricación y envío que podrían producirse. PCV15 se preparó con L-histidina 20 mM, pH 5,8, cloruro de sodio 150 mM y cualquiera de las dos concentraciones de conjugados y APA enumeradas en el Ejemplo 7. Dado que los resultados fueron muy similares entre las dos formulaciones a diferentes concentraciones de conjugados y APA, en este ejemplo solo se mostraron resultados para la formulación de PCV15 que contenía concentraciones más bajas de conjugados y APA. Para los estudios de agitación, las formulaciones de PCV15 se mezclaron usando una barra de agitación magnética en un recipiente de vidrio. Para los estudios de recirculación y cizallamiento, las formulaciones de PCV15 se recircularon en un bucle de tubería. Para los estudios de rotación, se preparó la formulación base de PCV15 (L-histidina, pH 5,8 y cloruro de sodio) y se añadieron tensioactivos o estabilizadores como se describe en el Ejemplo 7 y la Tabla 2. Los estudios de agitación se diseñaron usando agitación lateral rotacional durante hasta 24 horas a 4 °C. Se usó una evaluación visual para evaluar las formulaciones. Una trayectoria de un haz de luz que pasa a través del recipiente permitió la detección de partículas. Además, el impacto de las tensiones de fabricación y envío y manipulación en la distribución del tamaño de partícula se evaluó utilizando dispersión de luz estática (SLS). La dispersión de luz estática de un producto farmacéutico basado en suspensión permite la detección más sensible de agregación como se indica por la distribución del tamaño de partícula. Una distribución de tamaño de partícula monodispersa (monomodal) de un producto farmacéutico de PCV15 es indicativa de un producto farmacéutico no agregado. Sin embargo, una distribución de tamaño de partícula polidispersa y polimodal es indicativa de agregación.
[0257] Estabilidad de PCV15 en el estudio de agitación
[0258] Formulaciones de PCV15 que utilizan sustancias farmacológicas de polisacárido neumocócico conjugadas usando aminación reductora en condiciones acuosas a CRM<197>(denominado PCV15<ac>), como se describe en el Ejemplo 4, se cribaron usando una configuración experimental de mezcla a escala de laboratorio, como anteriormente (vaso de precipitados y barra de agitación magnética). PCV15<ac>contiene polisacárido de S. pneumoniae serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33F conjugados a CRM<197>usando aminación reductora en condiciones acuosas. Se preparó PCV15 en L-histidina 20 mM, NaCl 150 mM con APA en una preparación por lotes a escala de laboratorio de 100 ml usando un vaso de precipitados y una barra de agitación magnética. En ausencia de un tensioactivo, el PCV15<ac>las formulaciones eran propensas a daños inducidos por la fabricación (agitación) que resultaban en la agregación del producto farmacéutico de vacuna durante la agitación para garantizar la homogeneidad del producto farmacéutico de vacuna.
[0259] Se descubrió que una clase de copolímeros tribloque no iónicos proporciona una estabilidad robusta durante los estudios de selección de diversos excipientes. Se seleccionó el poloxámero 188 (P188) para controlar la agregación y proporcionar una formulación de producto farmacológico de vacuna robusta y estable. PCV15<ac>las formulaciones se prepararon con L-histidina 20 mM, pH 5,8, NaCl 150 mM, APA y sin P188, P188 al 0,08 % p/v o P188 al 0,24 % p/v. El impacto del tiempo bajo agitación constante usando una barra de agitación magnética se evaluó usando dispersión de luz estática (Figuras 6-7). La distribución del tamaño de partícula se evaluó usando un Malvern Mastesizer 2000. Se ejecutó un estándar de tamaño de partícula NIST de 5 µm y produjo la distribución de tamaño esperada. Para todas las formulaciones (con y sin poloxámero 188), se observó un perfil de histograma monodisperso después de la adición de los conjugados a APA (T = 0 h de agitación). En tan solo 7 horas (T = 7 h de agitación) de mezcla continua, la formulación sin P188 dio como resultado la aparición de una mayor distribución y agregación del tamaño de partícula (Figura 6). Sin embargo, las formulaciones que contenían P188 en cualquiera de las concentraciones no mostraron apariencia de tamaño de partícula aumentado o agregación tras la mezcla continua hasta 24 horas (T = 24 h de agitación) (Figura 7).
[0260] Estabilidad de PCV15 en el estudio de agitación horizontal
[0261] PCV15 adicional<ac>se prepararon formulaciones en L-histidina 20 mM, pH 5,8, NaCl 150 mM y APA y con o sin P188 al 0,2 % p/v en una preparación por lotes a escala de laboratorio de 100 ml como se describe en el Ejemplo 7. Para simular el envío y la manipulación y evaluar el impacto en la estabilidad del producto farmacéutico de vacuna, se utilizó un estudio de agitación horizontal. El estudio representa una agitación directa del PCV15<ac>formulación a través de interacciones con las superficies en un sistema de cierre de recipiente (jeringa o vial) y exposición de la formulación a los componentes finales del recipiente y una interfaz de aire. se dispensaron 0,64 ml en jeringas y se taparon. Estas jeringas se rotaron horizontalmente a 2-8 °C durante 24 horas y se evaluó la distribución del tamaño de partícula usando SLS (Figura 8A). También se realizó una evaluación visual (Figura 8B). El PCV15<ac>la formulación en ausencia de P188 y sometida a estrés de envío y manipulación simulado da como resultado un aumento en la distribución del tamaño de partícula del producto farmacéutico y signos visibles de aglomeración y agregación con un sistema de cierre de recipiente tal como una jeringa. La formulación de PCV15 con P188 no mostró un aumento en la distribución del tamaño de partícula o signos visuales de aglomeración y agregación. EJEMPLO 9: Impacto de los excipientes en la estabilización de un producto farmacológico de vacuna conjugada neumocócica preparado usando una mezcla de conjugados generados por aminación reductora en soluciones acuosas y de DMSO (el ejemplo relacionado con los conjugados de DTFB es solo por razones comparativas) Se evaluaron múltiples formulaciones 15-valentes (PCV15) con APA en L-histidina 20 mM, pH 5,8, NaCl 150 mM usando estudios de envío simulados a escala de laboratorio para garantizar una formulación de producto farmacológico de vacuna robusta, fabricable y comercialmente viable. Formulación PCV15<ac>contenía conjugados neumocócico de polisacárido-CRM<197>generados por aminación reductora en solución acuosa. Formulación PCV15<Aq/No-Aq>contenían conjugados de serotipo 6A, 6B, 7F, 19A, 19F y 23F preparados usando aminación reductora en DMSO y conjugados de serotipo 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 18C, 22F y 33F preparados usando aminación reductora en solución acuosa, donde todos los polisacáridos se conjugaron a CRM<197>. Formulación PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>era similar a PCVI5<Aq/No-Aq>excepto que el serotipo 3 se conjugó a la proteína DTFB, no a CRM<197>. Dado que los resultados fueron muy similares entre las dos formulaciones a diferentes concentraciones de conjugados y APA enumerados en el Ejemplo 7, solo se mostraron en este Ejemplo los resultados para la formulación de PCV15 que contenía concentraciones más bajas de conjugados y APA, a menos que se especifique lo contrario. Prevenar 13<®>se usó como otro ejemplo de una formulación multivalente para probar la idoneidad de PS-80 en un producto de vacuna neumocócica conjugada diferente. Contiene polisacáridos de Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F conjugados con proteína portadora de CRM<197>, polisorbato 80, tampón succinato y adyuvante de fosfato de aluminio. Los conjugados se preparan usando aminación reductora usando DMSO o en condiciones acuosas.
[0262] Para evaluar el impacto en la estabilidad de las formulaciones de vacunas, se utilizó un estudio de agitación horizontal. El estudio representa una agitación directa de las formulaciones a través de interacciones con las superficies en un sistema de cierre de recipiente (jeringa o vial) y la exposición de la formulación a los componentes finales del recipiente y una interfaz de aire. Las formulaciones se dispensaron como relleno de 0,64 ml en jeringas y se taparon. Estas jeringas se rotaron horizontalmente a 2-8 °C durante hasta 8 h. El impacto del tiempo bajo agitación horizontal se evaluó para la distribución del tamaño de partícula usando dispersión de luz estática (SLS). El tamaño y la distribución de las partículas se evaluaron usando un Malvern Mastesizer 2000. Se ejecutó un estándar de tamaño de partícula NIST de 5 µm y produjo la distribución de tamaño esperada. Como se muestra en la Figura 9, P188 no fue un estabilizador eficaz para controlar la agregación para el PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>formulación a pesar de ser un estabilizador robusto para el PCV15<ac>formulación. Se observó un aumento en la distribución del tamaño de partícula y signos visibles de aglomeración y agregación en el PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>formulación con P188.
[0263] Debido al sorprendente descubrimiento de que P188 no proporcionó una estabilidad robusta a la formulación de PCV15 que contenía conjugados generados por aminación reductora en DMSO, se seleccionaron estabilizadores y excipientes adicionales. PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>las formulaciones (con APA en L-histidina 20 mM, pH 5,8, NaCl 150 mM y diversos estabilizadores) se dispensaron en jeringas y se tamizaron usando agitación horizontal. El impacto del tiempo bajo rotación horizontal constante se evaluó usando una evaluación visual (Tabla 2).
[0264] Tabla 2: Observación visual de PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>formulaciones que contienen 64 µg PnPs/mL y 250 µg/mL APA sin tensioactivo, con P188, con PS-80 o con PS-20 después de 1 hora de agitación y hasta 24 horas de rotación horizontal en jeringas. Fanning se refiere a la deposición de la formulación del producto farmacéutico en la superficie del sistema de cierre del recipiente (por ejemplo, jeringa o vial) y es indicativo de la precipitación superficial de la formulación.
[0266]
[0268] Evaluación visual de PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>las formulaciones no indicaron signos de agregación a concentraciones más altas de P188 y PS-20 (Tabla 2). Sin embargo, estudios de mayor resolución para evaluar la distribución de tamaño de partícula subvisible de PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>las formulaciones que contenían P188 (0,05 % p/v a 1,0 % p/v) o PS-20 (0,005 % p/v - 0,1 % p/v) se realizaron usando SLS. Estas formulaciones se rotaron horizontalmente durante hasta 24 horas en jeringas HyPak de 1,5 ml (Becton-Dickinson). Los valores D[4,3] medidos por SLS se muestran en la Figura 10A-B. Los resultados D[4,3] muestran que concentraciones más altas de PS-20 mejoraron significativamente la estabilidad fisicoquímica de la formulación, mientras que P188 en todas las concentraciones no fue eficaz. Como se muestra en la Figura 10B, la agitación horizontal de Prevnar 13<®>durante hasta 24 horas mostró un aumento en los valores de D[4,3] y la evidencia de partículas indica que la formulación no estaba suficientemente protegida contra la agregación inducida por envío simulado y similar a nuestras propias experiencias usando PS-80 en nuestras formulaciones
[0269] Basándose en nuestros datos con PS-20 y PS-80, se esperaría una mejora en la estabilidad con otros conjugados de polisacárido-proteína neumocócica que contienen uno o más conjugados producidos en un disolvente aprótico. EJEMPLO 10: Estudio de inmunogenicidad de mono Rhesus infantil (IRM) usando ST3-DTFB
[0270] Conjugado formulado en PCV15 (ejemplo comparativo)
[0271] El DTFB preparado como se describe en el Ejemplo 1 (cromatografía de intercambio catiónico multimodal) se usó para preparar el conjugado ST3-DTFB como se describe en el Ejemplo 3. Las formulaciones de PCV15 se prepararon como en el Ejemplo 7. Los IRM (monos Rhesus infantiles, n = 8/grupo) se inmunizaron por vía intramuscular (brazos 1-4) con 100 µl de vacuna, como se describe en la Tabla 3 a continuación en los días 0, 28 y 56. Los sueros se recogieron antes del inicio del estudio (pre) y en los días 14, 28, 42, 56 y 70. Los IRM fueron observados dos veces al día por personal capacitado en el cuidado de animales para detectar cualquier signo de enfermedad o angustia. Se consideró que las formulaciones de vacuna en los MRI eran seguras y bien toleradas, ya que no se observaron eventos adversos relacionados con la vacuna.
[0272] Tabla 3: Formulaciones de estudio de mono Rhesus infantil
[0274]
[0276] Los estudios en ratones descritos en el Ejemplo 6 se completaron usando conjugados monovalentes con un único ELISA de la OMS de serotipo 3 de PnPs completado para evaluar las respuestas de IgG. Para evaluar las respuestas de IgG específicas de serotipo en una vacuna 15-valente, se desarrolló un ensayo de electroquimioluminiscencia multiplexada (ECL) para su uso con suero de mono rhesus basado en el ensayo humano descrito por Marchese et al. usando tecnología MSD (MSD es una marca comercial de MesoScale Discovery, una división de MesoScale Diagnostics, LLC., Gaithersburg, MD, EE. UU.) que utiliza un SULFO-TAG<™>etiqueta que emite luz tras la estimulación electroquímica. Se usaron reactivos y patrones de anticuerpos humanos al analizar las muestras de monos bebés. Los resultados de monos rhesus bebés se expresaron como concentraciones medias geométricas leídas de una curva estándar usando las concentraciones de IgG específicas de serotipo asignadas al estándar de referencia humano (007sp).
[0277] Las respuestas de IgG post-dosis 3 (PD3) del serotipo 3 (Figura 11) no mostraron ninguna diferencia estadística entre los grupos inmunizados. Anticuerpo funcional, evaluado en ensayos de OPA usando S. pneumoniae el serotipo 3 (Figura 12), no mostró ninguna diferencia estadística entre los grupos inmunizados.
[0278] EJEMPLO 11: Optimización de la formulación de PCV15 (ejemplo comparativo)
[0279] Dado que los resultados fueron muy similares entre las dos formulaciones a diferentes concentraciones de conjugados y APA enumerados en el Ejemplo 7, solo se mostraron en este Ejemplo los resultados para la formulación de PCV15 que contenía concentraciones más bajas de conjugados y APA, a menos que se especifique lo contrario.
[0280] Se usa una línea de recirculación en el proceso de formulación de PCV15 para suministrar el producto farmacéutico de vacuna a la máquina de llenado de jeringas y viales. La recirculación durante el llenado de rutina imparte cizalla y tensión adicionales en los productos farmacéuticos bioterapéuticos y, por lo tanto, es una etapa de procesamiento importante para evaluar. Se realizaron estudios para evaluar el impacto de la recirculación en el PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>y formulaciones (en L-histidina 20 mM, pH 5,8, NaCl 150 mM, con 64 µg/ml de polisacárido total y 250 µg/ml de APA) que contienen 0,2 % p/v de P188 y 0,1 % p/v de PS-20. Las formulaciones se recircularon durante 24 horas desde un recipiente de alimentación a través de un tubo a un caudal de 180 ml/min usando una bomba peristáltica. El recipiente de alimentación se mezcló continuamente usando una barra de agitación magnética y se tomaron muestras periódicamente para su observación visual. Las formulaciones que contenían P188 mostraron la apariencia de aglomeración o agregación visual (Tabla 4), mientras que las formulaciones que contenían PS-20 no mostraron signos de agregación visible.
[0282] Tabla 4: Evaluación visual de formulaciones de PCV15 que contienen 0,2 % p/v de P188 o 0,1 % p/v de PS-20 durante 24 horas de mezcla recirculación continuas
[0284]
[0287] Se realizaron estudios de recirculación adicionales usando PCV15<Aq/No-Aq>y PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>formulaciones con hasta 500 µg/mL (p/v Al<+3>) APA y con P188 o PS-20. Después de 24 horas de recirculación con mezcla constante, las formulaciones se dispensaron en jeringas y se agitaron horizontalmente durante hasta 24 horas. Se inspeccionaron las formulaciones y en la Tabla 5 se muestra un resumen de la evaluación visual de las jeringas. Estos resultados indican que PS-20 proporciona una solución robusta a la inestabilidad física o agregación que puede ocurrir durante la fabricación y el envío y la manipulación rutinarios. P188 no pudo proporcionar un perfil de estabilidad adecuado para este PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>formulación a pesar de su éxito en la estabilización de PCV15<ac>formulaciones (Figuras 7-9).
[0289] Tabla 5: Evaluación visual de formulaciones de PCV15 con PS-20 al 0,1 % p/v o P188 al 0,2 % p/v después de 24 h r m z l r ir l i n h 24 h r r i n h riz n l n rin H P k 1 ml
[0291]
[0294] Se realizó un estudio adicional en un PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>formulación mediante la cual se preparó ST18C usando aminación reductora en DMSO (PCV15<Aq/Non-Aq/ST3-DTFB/ST18C-Non-Aq)>. El PCV15<Aq/Non-Aq/ST3-DTFB/ST18C-Non-Aq>la formulación se preparó en L-histidina 20 mM, pH 5,8, NaCl 150 mM, con 64 µg/ml de polisacárido total, 250 µg/ml de APA y PS-20 al 0,2 % p/v. Después de la PCV15<Aq/Non-Aq/ST3-DTFB/ST18C-Non-Aq>la formulación se recirculó durante hasta 6 h con mezcla constante, la formulación se dispensó en jeringas y se agitó horizontalmente durante hasta 24 horas. Se inspeccionó la formulación y en la Tabla 6 se muestra un resumen de la evaluación visual de las jeringas. Estos resultados indican que PS-20 proporciona una solución robusta a la inestabilidad física o agregación que puede ocurrir durante la fabricación y envío y manipulación de rutina con una formulación que comprende una formulación de PCV15 preparada en L-histidina 20 mM, pH 5,8, NaCl 150 mM, con 250 µg/mL de APA y PS-20 al 0,2 % p/v y que contienen conjugados de los serotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F y 23F de polisacárido neumocócico preparados usando aminación reductora en DMSO y serotipo 1, 3, 4, 5, 9V , 14, 22F y 33F conjugados preparados usando aminación reductora en solución acuosa, donde todos los polisacáridos se conjugaron a CRM<197>.
[0295] Tabla 6: Evaluación visual de formulaciones de PCV15 con PS-20 al 0,2 % p/v después de 24 horas de mezcla y r ir l i n h 24 h r r i n h riz n l n rin H P k 1 ml
[0297]
[0300] Como se muestra en la Figura 10 y las Tablas 4-5, P188 solo proporcionó un beneficio mínimo en la prevención de la agregación de formulaciones de PCV15 basadas en suspensión compuestas de conjugados generados usando aminación reductora en DMSO y/o conjugado ST3-DTFB. Se realizaron estudios adicionales de mezcla y rotación horizontal con formulaciones que contenían 0,2 % p/v de P188 y PEG<400>(PEG) o estabilizadores de propilenglicol (PG). PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>las formulaciones se prepararon a una escala de 500 ml como se describe en el Ejemplo 7. CLAVIJA<400>o se añadió PG al APA y, a continuación, se añadieron los conjugados. La concentración final de PEG<400>o PG estaba entre el 0 % p/v y el 15 % p/v en la formulación que contenía 64 µg de PnPs/ml, 250 µg/ml de APA y 0,2 % p/v de P188. Las formulaciones se mezclaron continuamente durante 1 hora con una barra de agitación magnética y se dispensaron en jeringas. Las jeringas se agitaron horizontalmente durante un máximo de 24 horas. Las formulaciones se muestrearon periódicamente para evaluación visual y para mediciones de distribución de tamaño de partícula por SLS. Los resultados de la evaluación visual de las jeringas se muestran en las Tablas 7-8. Los resultados de distribución de tamaño de partícula se muestran en la Figura 13. Cuando se añadió solo, P188 no controló la agregación en la formulación. Sorprendentemente, PEG<400>o PG proporcionó una estabilidad adecuada cuando se combinó con P188.
[0302] Tabla 7: Evaluación visual de formulaciones de PCV15 con P188 al 0,2 % p/v y diversos PEG<400>concentraciones 1 h r m z l h 24 h r r i n h riz n l n rin H P k 1 ml
[0304]
[0307] Tabla 8: Evaluación visual de formulaciones de PCV15 con P188 al 0,2 % p/v y diversas concentraciones de PG 1 h r m z l h 24 h r r i n h riz n l n rin H P k 1 ml
[0309]
[0312] Ejemplo 12: Inmunogenicidad de las formulaciones estabilizadoras de la vacuna neumocócica conjugada (ejemplo comparativo)
[0314] Se evaluó el impacto de las formulaciones que contienen PCV15 que se habían optimizado para controlar la inestabilidad inducida por la fabricación y el envío en la inmunogenicidad de los monos Rhesus lactantes. Ocho animales por grupo recibieron una inyección intramuscular con 0,1 ml de PCV15<Aq/No-Aq/ST3-DTFB>formulación que contiene 64 µg PnPs/ml, L-histidina 20 mM, pH 5,8, cloruro de sodio 150 mM, APA 250 µg/ml y P188 al 0,2 % p/v, PG al 15 % p/v o PS al 0,1 % p/v -20 como se describe en el Ejemplo 11. Las inyecciones se administraron a T=0 (Dosis 1), 1 mes (Dosis 2) y 2 meses (Dosis 3) de edad. El suero se recogió antes de la dosis 1 y 2 semanas después de la dosis 1, 2 y 3. Los niveles de IgG en suero de las muestras de suero preinmunes, posteriores a la dosis 1, posteriores a la dosis 2 y posteriores a la dosis 3 se determinaron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 10. Los resultados mostrados en la Figura 14 indican que las formulaciones de PCV15 con PS-20 o una combinación de P188 y PG eran inmunogénicas.
[0316] EJEMPLO 13: Impacto del polisorbato 20 y el polisorbato 80 en la estabilización de un producto farmacológico de vacuna conjugada neumocócica preparado usando diferentes mezclas de conjugados generados por aminación reductora en soluciones próticas (acuosas) y apróticas (DMSO)
[0318] Los resultados prometedores observados con las formulaciones de PCV15 en los ejemplos anteriores justificaron la exploración de los límites inferior y superior de la relación de niveles de proteína en glicoconjugados elaborados en DMSO frente a condiciones acuosas. Múltiples formulaciones de PCV polivalentes que tienen diferentes proporciones de glicoconjugados contenían conjugados neumocócicos de polisacárido-CRM<197>generados por aminación reductora en una solución acuosa o en DMSO. Cada formulación se normalizó a la cantidad de proteína y contenía una concentración total de polisacárido (Ps) de 64 µg/ml (p/v de Ps) con 250 µg/ml de APA en L-histidina 20 mM, pH 5,8, NaCl 150 mM. Se añadió PS-80 o PS-20 a cada formulación para lograr una concentración final de PS-80 (0,05 % p/v) o PS-20 (0,05 % p/v) o PS-20 (0,2 % p/v). v). Las formulaciones se dispensaron en jeringas precargadas BD HyPAK y se evaluaron utilizando estudios de envío simulados a escala de laboratorio para garantizar una formulación de producto farmacológico de vacuna sólida, fabricable y comercialmente viable.
[0320] Para lograr el intervalo deseado de porcentajes de glicoconjugados preparados usando DMSO, se prepararon las siguientes formulaciones donde todos los polisacáridos se conjugaron a CRM<197>usando aminación reductora:
[0322] Formulación PCV<24%>contenían conjugados de los serotipos 6A, 6B y 23F preparados en DMSO, y conjugados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F y 33F preparados en una solución acuosa. La proteína total en esta formulación fue de 56 µg/ml con 13 µg/ml o ~24 % de la proteína total que consiste en CRM<197>conjugado a polisacárido usando aminación reductora en DMSO.
[0323] Formulación PCV<50%>contenían los serotipos 6A, 6B, 7F, 19A, 19F y 23F conjugados preparados en DMSO, y los serotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 18C, 22F y 33F conjugados preparados en una solución acuosa. La proteína total en esta formulación fue de 62 µg/ml con 31 µg/ml o el 50 % de la proteína total que consiste en CRM<197>conjugado a polisacárido usando aminación reductora en DMSO.
[0324] Formulación PCV<62%>contenían los serotipos 6A, 6B, 7F, 19A, 19F y 23F conjugados preparados en DMSO, y los serotipos 1, 5, 9V, 14, 18C, 22F y 33F conjugados preparados en una solución acuosa. La proteína total en esta formulación fue de 61 µg/ml con 38 µg/ml o ~62 % de la proteína total que consiste en CRM<197>conjugado a polisacárido usando aminación reductora en DMSO.
[0325] Formulación PCV<79%>contenían los serotipos 6A, 6B, 7F, 19A, 19F y 23F conjugados preparados en DMSO, y los serotipos 1, 5, 18C y 33F conjugados preparados en una solución acuosa. La proteína total en esta formulación fue de 63 µg/mL con 50 µg/mL o ~79 % de la proteína total que consiste en CRM<197>conjugado a polisacárido usando aminación reductora en DMSO.
[0326] Formulación PCV<100 %>contenían los serotipos 6A, 6B, 7F, 19A, 19F y 23F conjugados preparados usando aminación reductora en DMSO. La proteína total en esta formulación fue de 65 µg/ml con 65 µg/ml o el 100 % de la proteína total que consiste en CRM<197>conjugado a polisacárido en DMSO.
[0328] Se utilizó un estudio de agitación horizontal para evaluar el impacto en la estabilidad del producto de la relación de proteína conjugada con polisacárido en DMSO a la proteína total. El estudio representa una agitación directa de las formulaciones a través de interacciones con las superficies en un sistema de cierre de recipiente (jeringa o vial) y la exposición de la formulación a los componentes finales del recipiente y una interfaz de aire. Las formulaciones se dispensaron como relleno de 0,64 ml en jeringas y se taparon. Estas jeringas se rotaron horizontalmente a 2-8 °C durante hasta 24 h. El impacto del tiempo bajo agitación horizontal se evaluó para la distribución del tamaño de partícula usando dispersión de luz estática (SLS). El tamaño y la distribución de las partículas se evaluaron usando un Malvern Mastesizer 2000. Se ejecutó un estándar de tamaño de partícula NIST de 5 µm y produjo la distribución de tamaño esperada. Como se muestra en las Figuras 15A-E, el PS-80 no fue un estabilizador eficaz para controlar la agregación de todos los productos farmacológicos que contienen PCV (PCV<24%>a PCV<100 %>). Se observó un aumento en la distribución del tamaño de partícula y signos visibles de aglomeración (apariencia de partículas) y agregación para todas las formulaciones con PS-80.
[0330] Sorprendentemente, el PS-20 a una concentración comparable a la utilizada para el PS-80 proporcionó un perfil de estabilidad mejorado en todo el intervalo de porcentajes de conjugado de DMSO probados. La adición de PS-20 para lograr una concentración de PS-20 al 0,2 % en el tampón de formulación dio como resultado una estabilidad superior en comparación con el PS-20 al 0,05 % en todo el intervalo de porcentajes de conjugado de DMSO probados. Ejemplo 14: Inmunogenicidad de las formulaciones estabilizadoras de la vacuna conjugada neumocócica en conejos blancos de Nueva Zelanda (ejemplo comparativo)
[0332] Se evaluó el impacto de las formulaciones que contienen PCV15 que se habían optimizado para controlar la inestabilidad inducida por la fabricación y el envío en la inmunogenicidad del conejo blanco de Nueva Zelanda. Ocho animales por grupo recibieron una inyección intramuscular con 0,1 ml de formulación de PCV15Aq/Non-Aq que contenía 64 mg de PnPs/ml, L-histidina 20 mM, pH 5,8, cloruro de sodio 150 mM, APA 250 µg/ml y 0,2 % p/ v PS-20 como se describe en el Ejemplo 11. Las inyecciones se administraron los días 0 y 14. El suero se recogió antes de la vacunación los días 0 y 14 y también el día 28. Los niveles de IgG en suero de las muestras de suero preinmunes, posteriores a la dosis 1 y posteriores a la dosis 2 se determinaron mediante análisis de ECL.
[0334] Los resultados mostrados en la Figura 16 indican que una formulación de conjugado neumocócico 15-valente en histidina 20 mM pH 5,8, NaCl 150 mM, APA 250 µg/ml, PS-20 al 0,2 % p/v que tiene S. pneumoniae polisacáridos de los serotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F y 23F conjugados a CRM<197>usando aminación reductora en DMSO y S. pneumoniae polisacáridos de los serotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F y 33F conjugados a CRM<197>usando aminación reductora en solución acuosa formulada como una forma de dosificación que contiene 4 µg/ml de cada sacárido, excepto 6B a 8 µg/ml; y aproximadamente 64 µg/ml de proteína portadora de CRM<197>, es inmunogénica.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES
1. Una formulación que comprende una composición de conjugado neumocócico 15-valente que consiste esencialmente en polisacárido S. pneumoniae de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23 F y 33F conjugado a CRM<197>; Histidina 20 mM pH 5,8; NaCl 150 mM; 250 µg/ml de adyuvante de fosfato de aluminio (APA) y polisorbato 20 al 0,2 % p/v; formulado como una forma de dosificación que contiene 4 µg/ml de cada sacárido, excepto para 6B a 8 µg/ml; y 64 µg/ml de proteína portadora de CRM<197>; en donde los conjugados de proteína de polisacárido de los serotipos 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F y 23F se preparan en condiciones de DMSO y los conjugados de proteína de polisacárido de los serotipos 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F y 33F se preparan usando condiciones acuosas.
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