RS67586B1 - Formulacije pneumokoknih konjugovanih vakcina - Google Patents

Formulacije pneumokoknih konjugovanih vakcina

Info

Publication number
RS67586B1
RS67586B1 RS20251318A RSP20251318A RS67586B1 RS 67586 B1 RS67586 B1 RS 67586B1 RS 20251318 A RS20251318 A RS 20251318A RS P20251318 A RSP20251318 A RS P20251318A RS 67586 B1 RS67586 B1 RS 67586B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
polysaccharide
protein
dtfb
crm
formulations
Prior art date
Application number
RS20251318A
Other languages
English (en)
Inventor
William J Smith
Cecilia Giovarelli
Denise K Nawrocki
Original Assignee
Merck Sharp & Dohme Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Sharp & Dohme Llc filed Critical Merck Sharp & Dohme Llc
Publication of RS67586B1 publication Critical patent/RS67586B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0087—Galenical forms not covered by A61K9/02 - A61K9/7023
    • A61K9/0095—Drinks; Beverages; Syrups; Compositions for reconstitution thereof, e.g. powders or tablets to be dispersed in a glass of water; Veterinary drenches
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C07K14/3156—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci from Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

[0001] Opis
[0003] OBLAST TEHNIKE
[0005] Predmetni pronalazak obezbeđuje formulacije pneumokoknih konjugovanih vakcina koje sadrže surfaktantne sisteme koji uključuju polisorbat 20.
[0007] STANJE TEHNIKE
[0009] Streptokoka pneumonije, jedan primer značajan je uzrok ozbiljnih bolesti širom sveta. Godine 1997, Centri za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) procenili su da je godišnje u Sjedinjenim Državama bilo 3.000 slučajeva pneumokoknog meningitisa, 50.000 slučajeva pneumokokne bakterijemije, 7.000.000 slučajeva pneumokoknog otitisa medija i 500.000 slučajeva pneumokokne pneumonije. Videti Centri za kontrolu i prevenciju bolesti, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR-8):1-13. Štaviše, komplikacije ovih bolesti mogu biti značajne, a neke studije izveštavaju o smrtnosti do 8% i neurološkim posledicama od 25% kod pneumokoknog meningitisa. Videti Arditi i sar., 1998, Pediatrics 102:1087-97.
[0010] Multivalentne pneumokokne polisaharidne vakcine koje su licencirane već dugi niz godina pokazale su se neprocenjivim u sprečavanju pneumokoknih bolesti kod odraslih, posebno starijih osoba i onih sa visokim rizikom. Međutim, odojčad i mala deca slabo reaguju na nekonjugovane pneumokokne polisaharide. Bakterijski polisaharidi su imunogeni nezavisni od T-ćelija, što izaziva slab ili nikakav odgovor kod odojčadi. Hemijska konjugacija bakterijskog polisaharidnog imunogena sa proteinskim nosačem pretvara imuni odgovor u odgovor zavisan od T-ćelija kod odojčadi. Difterijski toksoid (DTx, hemijski detoksikovana verzija DT) i CRM<197>su opisani kao nosači proteina za bakterijske polisaharidne imunogene zbog prisustva epitopa koji stimulišu T-ćelije u njihovim aminokiselinskim sekvencama.
[0011] [0004] Pneumokokna konjugovana vakcina, Prevnar<®>, koja sadrži 7 najčešće izolovanih serotipova (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F i 23F) koji su u to vreme izazivali invazivne pneumokokne bolesti kod male dece i odojčadi, prvi put je licencirana u Sjedinjenim Državama u februaru 2000. godine. Nakon univerzalne upotrebe Prevnar<®>u Sjedinjenim Državama, došlo je do značajnog smanjenja invazivnih pneumokoknih bolesti kod dece zbog serotipova prisutnih u Prevnar<®>. Videti Centri za kontrolu i prevenciju bolesti, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54(36):893-7. Međutim, postoje ograničenja u pokrivenosti serotipova sa Prevnar<®>u određenim regionima sveta i neki dokazi o određenim novim serotipovima u Sjedinjenim Državama (na primer, 19A i drugi). See O'Brien i sar., 2004, Am J Epidemiol 159:634-44; Whitney i sar., 2003, N Engl J Med 348:1737-46; Kyaw i sar., 2006, N Engl J Med 354:1455-63; Hicks i sar., 2007, J Infect Dis 196:1346-54; Traore i sar., 2009, Clin Infect Dis 48:S181-S189.
[0012] Prevnar 13<®>je 13-valentna pneumokokna vakcina konjugovana polisaharidom i proteinom, koja uključuje serotipove 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F i 23F. Videti, npr. objavljenu američku patentnu prijavu br. US 2006/0228380 A1, Prymula i sar., 2006, Lancet 367:740-48 i Kieninger i sar., Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers, predstavljeno na 48. godišnjem sastanku ICAAC/ISDA, Vašington, 25-28. oktobar 2008. godine. Videti takođe, Dagan i sar., 1998, Infect Immun. 66: 2093-2098 i Fattom, 1999, Vaccine 17:126.
[0013] Kineska patentna prijava br. CN 101590224 A opisuje 14-valentnu pneumokoknu konjugovanu vakcinu polisaharid-protein koja uključuje serotipove 1, 2, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F i 23F.
[0014] Američki patent br. 8,192,746 opisuje 15-valentnu pneumokoknu konjugovanu vakcinu polisaharid-protein koja ima serotipove 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F i 33F, sve pojedinačno konjugovane sa CRM<197>polipeptidima.
[0015] Takođe je opisano više sistema proteinskih nosača. Videti npr., američke patentne prijave br. 20100209450, 20100074922, 20090017059, 20090010959 i 20090017072.
[0016] Obelodanjene su formulacije koje sadrže konjugate polisaharida i proteina S. pneumoniae i surfaktante, uključujući polisorbat 80 (PS-80) i poloksamer 188 (P188). Videti američki patent br.
[0017] 8,562,999 i ovjavljenu američku patentnu prijavu br. US20130273098, respektivno.
[0019] SUŠTINA PRONALASKA
[0021] Tehničke informacije navedene u nastavku mogu u nekim aspektima prevazići obim ovog pronalaska koji se zahteva, a koji je definisan priloženim skupom patentnih zahteva. Dodatne tehničke informacije su date kako bi se stvarni pronalazak smestio u širi tehnički kontekst i ilustrovali mogući povezani tehnički razvoji.
[0022] Pozivi ovde na postupke lečenja terapijom ili hirurškim zahvatom treba tumačiti kao reference na jedinjenja, farmaceutske kompozicije, kombinacije i/ili lekove za primenu u tim postupcima.
[0023] Predmetni pronalazak pruža formulaciju koja sadrži 15-valentnu pneumokoknu konjugovanu kompoziciju koja se u suštini sadrži polisaharide S. pneumoniae iz serotipova 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23 F i 33F konjugovane sa CRM<197>; 20 mM histidina pH 5,8; 150 mM NaCl; 250 µg/mL adjuvansa aluminijum fosfata (APA); i 0,2% tež/v polisorbata 20; formulisanog kao dozni oblik koji sadrži 4 µg/mL svakog saharida, osim za 6B sa 8 µg/mL; i 64 µg/ml CRM<197>proteinskog nosača; pri čemu se konjugati polisaharidnih proteina iz serotipova 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F, i 23F pripremaju pod DMSO uslovima, a konjugati polisaharidnih proteina iz serotipova 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F, i 33F se pripremaju korišćenjem vodenih uslova.
[0024] Takođe je opisana formulacija koja sadrži (i) jedan ili više konjugata polisaharid-protein; (ii) puferovani rastvor soli sa pH vrednosti u opsegu od 5,0 do 7,5; (iii) aluminijumsku so; i (iv) sistem surfaktanta izabran iz a) polisorbata 20 i (b) poloksamera koji ima molekulsku težinu u opsegu od 1100 Da do 17.400 Da i poliola izabranog iz propilen glikola (PG) i polietilen glikola (PEG) 400.
[0025] Jedan ili više konjugata polisaharida i proteina se prave u aprotičnom rastvaraču, npr. dimetilsulfoksidu (DMSO). U određenim aspektima ovog otelotvorenja, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% ili više konjugata (na bazi ukupnih proteina) se pripremaju u aprotičnom rastvaraču kao što je DMSO. Alternativno, 10-100%, 24%-100% ili 24-80% konjugata (na bazi ukupnih proteina) se pripremaju u aprotičnom rastvaraču, npr. DMSO. U određenim slučajevima, sistem surfaktanta je polisorbat 20 ili kombinacija poloksamera/poliola kao što je gore opisano.
[0026] [0015] U određenim slučajevima, sistem surfaktanta sadrži poloksamer koji ima molekulsku težinu u opsegu od 1100 Da do 17.400 Da, 7.500 Da do 15.000 Da ili 7.500 Da do 10.000 Da. Poloksamer može biti poloksamer 188 ili poloksamer 407. U određenim aspektima, konačna koncentracija poloksamera je od 0,001% do 5% tež/v, od 0,025% do 1% tež/v. U specifičnom aspektu, poliol je propilen glikol i njegova konačna koncentracija je od 1% do 20% tež/v. U drugom specifičnom aspektu, poliol je polietilen glikol 400 i njegova konačna koncentracija je od 1% do 20% tež/v. Sistem surfaktanta sadrži polisorbat 20. Konačna koncentracija polisorbata 20 je u opsegu od 0,001% do 10% tež/v, ili od 0,025% do 2,5% tež/v, ili od 0,025% do 0,1% tež/v. U određenim slučajevima kada sistem surfaktanta sadrži PS-20, formulacija dalje sadrži poliol izabran iz propilen glikola i polietilen glikola. Polietilen glikol ili propilen glikol mogu biti u konačnoj koncentraciji od 6% do 20% tež/v. U određenim slučajevima, polietilen glikol je polietilen glikol 400.
[0027] pH puferovani fiziološki rastvor ima pH u opsegu od 5,0 do 7,0. Pufer se može izabrati iz grupe koja se sastoji od fosfata, sukcinata, L-histidina, MES, MOPS, HEPES, acetata ili citrata. Pufer je histidin u konačnoj koncentraciji od 5 mM do 50 mM. U nekim slučajevima, pufer može biti sukcinat u konačnoj koncentraciji od 1 mM do 10 mM. Histidin je u konačnoj koncentraciji od 20 mM ± 2 mM. So u pH puferovanom fiziološkom rastvoru može biti magnezijum hlorid, kalijum hlorid, natrijum hlorid ili njihova kombinacija. pH puferovani fiziološki rastvor je natrijum hlorid. Fiziološki rastvor može biti prisutan u koncentraciji od 20 mM do 170 mM. Natrijum hlorid je prisutan u koncentraciji od 150 mM.
[0028] U određenim slučajevima, konjugati polisaharida i proteina sadrže jedan ili više pneumokoknih polisaharida konjugovanih sa proteinskim nosačem. U određenim slučajevima, proteinski nosač je izabran iz CRM<197>, fragmenta B difterijskog toksina (DTFB), DTFB C8, toksoida difterije (DT), toksoida tetanusa (TT), fragmenta C TT, toksoida velikog kašlja, toksoida kolere, E. coli LT (termolabilni enterotoksin), E. coli ST (termostabilni enterotoksin), egzotoksina A iz Pseudomonas aeruginosa, i njihovih kombinacija. U jednom specifičnom slučaju, jedan ili više konjugata polisaharida i proteina su konjugovani sa CRM<197>. U određenim slučajevima, jedan ili više konjugata polisaharidnih proteina se pripremaju korišćenjem reduktivne aminacije u nevodenom rastvaraču DMSO. U ovom slučaju, konjugati polisaharidnih proteina iz serotipova 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F, i 23F mogu se pripremiti reduktivnom aminacijom u DMSO, a konjugati polisaharidnih proteina iz serotipova 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F, i 33F mogu se pripremiti reduktivnom aminacijom u vodenom rastvoru. U određenim slučajevima, svaka doza je formulisana tako da sadrži: 4 µg/mL ili 8 µg/mL svakog saharida, osim za 6B sa 8 µg/mL ili 16 µg/mL; i oko 64 µg/mL ili 128 µg/mL CRM<197>proteinkog nosača.
[0030] KRTAK OPIS CRTEŽA
[0032]
[0033] Slike 1A-D: SDS-PAGE analiza intermedijera DTFB procesa pod neredukujućim uslovima. A: Prikazani uzorci su: Standardi molekulske težine (traka 1 s leva); eluentni proizvod iz tri ponovljena ciklusa multimodalne anjonske hromatografije (MM AEX1, MM AEX2, MM AEX3, trake 2-4); objedinjeni eluentni proizvod iz multimodalne anjonske hromatografije (MM AEX Pool, traka 5); dijafiltrirani retentat (UF-DR, traka 6); i konačni intermedijer nakon filtracije od 0,2 mikrona (FBI, traka 7). SDS PAGE: NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel; 5 µg/ltraka; SYPRO Ruby proteinska gel boja. B: SDS-PAGE analiza (NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel; trake 2, 4, 8, 10: 5 µg/traka; traka 6: 2 µg/traka; SYPRO Ruby proteinska gel boja) intermedijera DTFB procesa, izvedenih pod redukujućim uslovima. Prikazani uzorci su: Mark-12 standardi (trake 1 i 12); prečišćeni CRM<197>korišćen za generisanje DTFB (CRM<197>, trake 2 i 10); proteolitički razdvojeni CRM<197>nakon koraka varenja tripsinom, napunjen na multimodalnu katjonsku izmenjivačku hromatografsku smolu (MM CEX dovod, traka 4); proizvod iz multimodalne katjonske izmenjivačke hromatografije (MM CEX proizvod, traka 6); i konačni intermedijer nakon 0,2-mikronske filtracije (DTFB-FBI, traka 8). C: Prikazani uzorci su: markeri molekulske težine (traka 1 s leva); početni koncentrovani retentat nakon multimodalne katjonske izmenjivačke hromatografije (ICR, traka 2); dijafiltrirani retentat (UF-DR, traka 3); koncentrovani retentat nakon dijafiltracije (UF-OCR, traka 4); ispiranje membrane za oporavak proizvoda (UF-W, traka 5); konačni objedinjeni retentat plus ispiranje (UF-FR, traka 6); i konačni međuproizvod nakon 0,2-mikronske filtracije (FBI, traka 6). SDS-PAGE: 14% Tris-Glycine gel; 8,3-8,4 µg/traka; GelCode Blue proteinska gel boja. D: SDS-PAGE analiza (NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel; SYPRO Ruby proteinska gel boja) intermedijera DTFB procesa, izvedena pod redukcionim uslovima. Prikazani uzorci su: Mark-12 standardi (trake 1 i 12); proteolitički razdvojeni CRM<197>nakon koraka varenja tripsinom, napunjen na multimodalnu katjonsku hromatografsku smolu za izmenu (MM CEX dovod, traka 2); prečišćeni CRM<197>korišćen za generisanje DTFB (CRM<197>, traka 3); protok tokom punjenja kolone (protok kroz MM CEX, traka 4); ispiranje kolone nakon punjenja (ispiranje MM CEX, traka 5); proizvod sakupljen nakon stepenaste elucije iz multimodalne katjonske izmenjivačke hromatografije (MM CEX proizvod, traka 7; 10-puta razblaženi MM CEX proizvod, traka 9); i proizvod sa kasnim eluiranjem sakupljen nakon stepenaste elucije iz multimodalne katjonske izmenjivačke hromatografije (MM CEX proizvod sa kasnim eluiranjem, traka 11).
[0034] Slika 2: Koncentracija DTFB proteina u 100 mM kalijum fosfatu (KPi) kao funkcija pH i koncentracije natrijum hlorida (NaCl). Rastvori su držani preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim centrifugirani. Supernatanti su analizirani hromatografijom isključivanja veličine sa UV280 detekcijom apsorbancije.
[0035] Slika 3: Koncentracija DTFB proteina u rastvorima kalijum fosfata (KPi) kao funkcija koncentracije polisorbata 20 (PS-20 Rastvori su mešani 5 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim centrifugirani. Supernatanti su analizirani hromatografijom isključivanja veličine sa UV280 detekcijom apsorbancije.
[0036] Slika 4: Titri antitela ELISA testa za miševe imunizovane polisaharidom S. pneumoniae erotipa 3 konjugovanim sa CRM<197>ili DTFB proteinskim nosačem i formulisanim sa adjuvansom aluminijum fosfata (APA). Miševi su imunizovani jednom od dve nezavisne serije konjugata serotipa 3-CRM<197>(serije 1i 2).
[0037] Slika 5: Krive preživljavanja za miševe imunizovane kapsularnim polisaharidom S. pneumoniae serotipa 3 konjugovanim sa CRM<197>ili DTFB proteinskim nosačem i formulisanim sa adjuvansom aluminijum fosfata (APA). Miševi su imunizovani jednom od dve nezavisne serije konjugata serotipa 3-CRM<197>(serije 1 i 2). Formulacije samo APA ili fiziološkog rastvora su takođe bile uključene u studiju kao kontrole. Nakon imunizacije, miševi su naknadno intraperitonealno izloženi bakterijama serotipa 3.
[0038] Slika 6: Studija mešanja u laboratorijskim razmerama radi procene uticaja vremena i mešanja na raspodelu veličine čestica formulacije konjugata 15-valentnog pneumokoknog polisaharida (PnPs), mereno statičkim rasejanjem svetlosti (SLS). Svih 15 serotipova pneumokoknih polisaharida je konjugovano sa CRM<197>korišćenjem reduktivne aminacije u vodenom rastvoru. Konjugati su formulisani u 20 mM L-histidinu, pH 5,8, 150 mM NaCl i 0,25 mg/mL (tež/v Al+3) APA za studiju mešanja.
[0039] Slika 7: Studija mešanja u laboratorijskim razmerama radi procene uticaja vremena i mešanja na raspodelu veličine čestica formulacija konjugata 15-valentnog pneumokoknog polisaharida, mereno SLS. Svih 15 serotipova pneumokoknih polisaharida je konjugovano sa CRM<197>korišćenjem reduktivne aminacije u vodenom rastvoru. Konjugati su formulisani za studiju mešanja u 20 mM L-histidinu, pH 5,8, 150 mM NaCl i 0,25 mg/mL (tež/v Al+3) APA sa 0,08% tež/v ili 0,24% tež/v poloksamera 188 (P188).
[0040] Slika 8A-B: Studija simulacije transporta i rukovanja u laboratorijskim razmerama formulacija konjugata 15-valentnih pneumokoknih polisaharida u špricevima. Svih 15 pneumokoknih polisaharidnih serotipova konjugovano je sa CRM<197>korišćenjem reduktivne aminacije u vodenom rastvoru. Konjugati su formulisani u 20 mM L-histidinu, pH 5,8, 150 mM NaCl i 0,25 mg/mL (tež/v Al+3) APA bez P188 ili sa 0,2% tež/v P188. Prikazana je raspodela veličine čestica merena SLS-om pre i posle 24 sata horizontalne rotacije (A) i vizuelna procena špriceva nakon 24 sata horizontalne rotacije (B).
[0041] Slika 9: Distribucija veličine čestica (izražena kao zapreminski ponderisana distribucija ili D[4,3] mereno SLS metodom) dve formulacije 15-valentnih pneumokoknih polisaharidnih konjugata sa 20 mM L-histidina, pH 5,8, 150 mM NaCl, 0,25 mg/mL (tež/v Al+3) APA i 0,2% tež/v P188. Formulacija PCV15<Aq>je sadržala pneumokokni polisaharidni konjugat -CRM<197>, generisani reduktivnom aminacijom u vodenom rastvoru. Formulacija PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>koristila je kombinaciju 15 pneumokoknih polisaharidnih konjugata, neki generisani reduktivnom aminacijom u vodenom rastvoru, a drugi reduktivnom aminacijom u nevodenom rastvoru; Svi pneumokokni polisaharidni serotipovi u PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>su konjugovani sa CRM<197>osim serotipa 3 (ST3), koji je konjugovan sa DTFB. Formulacije su punjene u špriceve i horizontalno mešane do 24 sata na 4°C pre SLS evaluacije.
[0042] Slike 10A-B: Vrednosti D[4,3] merene SLS metodom PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>formulacija koje sadrže P188 (A), PS-80 (B) i PS-20 (A, B) nakon mešanja i do 24 sata horizontalne rotacije u HyPak špricevima od 1.5 mL.
[0043] Slika 11: Koncentracije IgG specifičnih za pneumokokni serotip 3 kod mladunaca rezus majmuna (IRM) imunizovanih 15-valentnim formulacijama konjugata pneumokoknog polisaharida sa adjuvansom aluminijum fosfata (APA). Sve formulacije su sadržale kapsularni polisaharid (ST3) S. pneumoniae serotip 3 konjugovan sa CRM<197>ili DTFB. Formulacija PCV15<Vod/Ne-vod>je koristila kombinaciju 15 konjugata pneumokoknog polisaharida i CRM<197>, od kojih su neki generisani reduktivnom aminacijom u vodenom rastvoru, a drugi reduktivnom aminacijom u nevodenom rastvoru. Formulacije PCV15 su sadržale 0,2% tež/v P188 ili 0,1% tež/v PS-20 kao što je navedeno na slici.
[0044] Slika 12: Titri serotipa 3 OPA (OPK) za mladunce rezus majmuna imunizovane sa dve 15-valentne pneumokokne polisaharidne konjugovane vakcine formulisane sa adjuvansom aluminijum fosfata (APA) i 0,2% w/v P188. Formulacije su sadržale kapsularni polisaharid (ST3) serotipa S. pneumoniae serotipa 3 konjugovan sa either CRM<197>(PCV15<Aq>) ili DTFB (PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>).
[0045] Slika 13: Raspodela veličine čestica merena SLS PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>formulacija nakon 1 sata mešanja i do 24 sata horizontalne rotacije. Formulacije su sadržale 0,2% tež/v poloksamera 188 i različite koncentracije propilen glikola (PG) ili polietilen gliko la 400 (PEG<400>) kao što je prikazano na slici.
[0046] Slike 14A-B: Studija poređenja imunogenosti kod mladunaca rezus majmuna za PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>formulacije koje sadrže ili 0,2% tež/v P188 sa 15% tež/v PG ili 0,1% tež/v PS-20 kao što je opisano u Primeru 12. Osam životinja po grupi je primilo intramuskularnu injekciju bilo koje od dve formulacije u uzrastu od T=0 (Doza 1), 1 mesec (Doza 2) i 2 meseca (Doza 3). Serum je prikupljen pre prve doze i 2 nedelje nakon prve, druge i treće doze. Koncentracije IgG specifične za serotip (IgG GMC) iz uzoraka seruma pre imunizacije, posle prve doze, posle druge doze i posle treće doze merene su kao što je opisano u Primeru 10. Panel A prikazuje rezultate imunogenosti za serotipove 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F i 9V. Panel B prikazuje rezultate imunogenosti za serotipove 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, i 33F.
[0047] Slike 15A-E: Vrednosti D[4,3] merene SLS metodom PCV<Vod/Ne-vod>formulacija kao što je opisano u Primeru 13, sa različitim procentima serotipova napravljenih u DMSO (panel A: 24%; panel B: 50%; panel C: 62%; panel D: 79%; i panel E: 100%) koje sadrže 0,05% tež/v PS-80, 0,05% tež/v PS-20 i 0,2% tež/v PS-20 nakon mešanja i do 24 sata horizontalne rotacije u HyPak špricevima od 1,5 mL.
[0048] Slika 16: Rezultati imunogenosti kod novozelandskih belih zečeva za formulaciju 15-valentnog pneumokoknog konjugata u 20 mM histidina pH 5,8, 150 mM NaCl, 250 µg/mL APA, 0,2% tež/v PS-20 koja sadrži polisaharide S. pneumoniae iz serotipova 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F i 23F konjugovane sa CRM<197>korišćenjem reduktivne aminacije u DMSO i polisaharide S. pneumoniae iz serotipova 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F i 33F konjugovane sa CRM<197>korišćenjem reduktivne aminacije u vodenom rastvoru formulisanom kao dozni oblik koji sadrži 4 µg/mL svakog saharida, osim za 6B sa 8 µg/mL; i oko 64 µg/mL proteinskog nosača CRM<197>.
[0050] DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0052] Predmetni pronalazak se delimično zasniva na obelodanjenju da specifični surfaktant u formulacijama multivalentnih konjugovanih vakcina može uticati na stabilnost konjugata i njihovu sklonost ka agregaciji, posebno kada se jedan ili više konjugata pravi u aprotičnom rastvaraču kao što je DMSO. Pored toga, neki surfaktanti zahtevaju dodavanje poliola da bi se postigla potrebna stabilnost.
[0053] Kako se ovde koristi "protični rastvarač" je rastvarač koji ima atom vodonika vezan za kiseonik (kao u hidroksilnoj grupi) ili azot (kao u aminskoj grupi). Generalno, svaki rastvarač koji sadrži labilni H+ naziva se protični rastvarač.
[0054] Kako se ovde koristi "aprotični rastvarač" se odnosi na polarni aprotični rastvarač. Takvim rastvaračima nedostaje kiseli vodonik i ne mogu da doniraju vodonik. Primeri polarnih aprotičnih rastvarača uključuju, ali nisu ograničeni na, dimetilsulfoksid (DMSO), dimetilformamid (DMF) i heksametilfosforamid (HMPA). Nevodeni rastvor ili rastvarač se koristi naizmenično sa aprotičnim rastvaračem. Aprotični rastvarač može da sadrži malo vode, na primer, do 1%, 2%, 5%, 10% ili 20%.
[0055] Kako se ovde koristi, termin "polisaharid" (Ps) treba da obuhvati bilo koji antigeni saharidni element (ili antigenu jedinicu) koji se obično koristi u imunološkim i bakterijskim vakcinama, uključujući, ali ne ograničavajući se na "saharid", "oligosaharid", "polisaharid", "liposaharid", "lipo-oligosaharid (LOS)", "lipopolisaharid (LPS)", "glikozilat", "glikokonjugat" i slično.
[0056] Kako se ovde koristi, termin "sadrži" kada se koristi sa imunogenim sastavom pronalaska odnosi se na uključivanje bilo kojih drugih komponenti (uz ograničenja izraza "sastoji se od" za antigensku smešu), kao što su adjuvansi i ekscipijenti. Termin "sastoji se od" kada se koristi sa multivalentnom smešom polisaharid-protein konjugata odnosi se na smešu koja ima te posebne konjugate polisaharidnih proteina S. pneumoniae i nijedan drugi konjugat polisaharidnih proteina S. pneumoniae iz drugog serotipa.
[0057] [0024] Kako se ovde koriste, termini "taloženje", "talog", "formiranje čestica", "zamućenje", i "agregacija" mogu se koristiti naizmenično i odnose se na bilo koju fizičku interakciju ili hemijsku reakciju koja rezultira aglomeracijom konjugata polisaharida i proteina. Proces agregacije (npr. agregacija proteina) može biti indukovan brojnim fizičko-hemijskim stresom, uključujući toplotu, pritisak, pH, mešanje, sile smicanja, smrzavanje-odmrzavanje, dehidraciju, teške metale, fenolna jedinjenja, silicijumsko ulje, denaturanse i slično.
[0058] Kako se ovde koristi, "surfaktant" ovog pronalaska je bilo koji molekul ili jedinjenje koje smanjuje površinski napon imunogene formulacije sastava. "Sistem surfaktanta" sadrži surfaktant, ali može dozvoliti uključivanje dodatnih ekscipijenata kao što su polioli koji povećavaju efekte surfaktanta.
[0059] Imunogena kompozicija je multivalentna kompozicija koji sadrži jedan ili više antigena konjugovanih sa jednim ili više proteinskih nosača. Antigen je saharid iz inkapsulirane bakterije. U takvim vakcinama, saharidi su sastavljeni od dugih lanaca molekula šećera koji podsećaju na površinu određenih vrsta bakterija. Inkapsulirane bakterije uključuju, ali nisu ograničene na, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitides i Haemophilus influenzae tip b. Antigeni mogu biti iz istog organizma ili mogu biti iz različitih organizama. Antigeni su kapsularni polisaharidi Streptococcus pneumoniae.
[0060] U slučajevima kada se koriste dva proteinska nosača, svaki kapsularni polisaharid koji nije konjugovan sa prvim proteinskim nosačem je konjugovan sa istim drugim proteinskim nosačem (npr. svaki molekul kapsularnog polisaharida je konjugovan sa jednim proteinskim nosačem). U drugom slučaju, kapsularni polisaharidi koji nisu konjugovani sa prvim proteinskim nosačem su konjugovani sa dva ili više proteinskih nosača (svaki molekul kapsularnog polisaharida je konjugovan sa jednim proteinskim nosačem). U takvim slučajevima, svaki kapsularni polisaharid istog serotipa je tipično konjugovan sa istim proteinskim nosačem.
[0061] Difterijski toksin, egzotoksin koji luči Corynebacterium diphtheriae, je klasični A-B toksin koji se sastoji od dve podjedinice (fragmenta) povezane disulfidnim mostovima i koji ima tri domena. Fragment A (DTFA) sadrži ADP-ribozni katalitički C domen, dok fragment B (DTFB) sadrži centralni translokacioni T domen i R domen koji se vezuje za karboksi terminalni receptor. DTFB je netoksični deo koji čini približno 60% ukupne aminokiselinske sekvence DT. Videti npr. Gill, D. M. i Dinius, L. L., J. Biol. Chem., 246, 1485-1491 (1971), Gill, D. M. i Pappenheimer, Jr., A. M., J. Biol. Chem., 246, 1492-1495 (1971), Collier, R. J. i Kandel, J., J. Biol. Chem., 246, 1496-1503 (1971); i Drazin, R., Kandel, J., i Collier, R. J., J. Biol. Chem., 246, 1504-1510 (1971).
[0062] Kompletna aminokiselinska sekvenca difterijskog toksina je objavljena. Videt Greenfield, L., Bjorn, M.J., Horn, G., Fong, D., Buck, G.A., Collier, R.J. i Kaplan, D.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6853-6857 (1983). Konkretno, DTFB sadrži aminokiselinske ostatke od 194 do 535 DT.
[0063] Proteinski nosač CRM<197>je mutantni oblik DT koji je učinjen netoksičnim zamenom jedne aminokiseline u Fragmentu A na ostatku 52. CRM<197>i DT dele potpunu homologiju sekvence u Fragmentu B. Glavni T-ćelijski epitopi su pronađeni pretežno u B fragmentu aminokiselinske sekvence DT. Videti Bixler i sar., Adv Exp Med Biol. (1989) 251:175-80; Raju i sar., Eur. J. Immunol. (1995) 25: 3207-3214; Diethelm-Okita et al., J Infect Dis (2000) 181:1001-9; i McCool i sar., Infect. and Immun.67 (Sept.1999), p.4862-4869.
[0064] Primena DTFB, kako je ovde opisano, uključuje delecije difterijskog toksina iz domena aktivnosti ADP-ribozilacije. Primena DTFB takođe uključuje varijante koje imaju najmanje 90%, 95% ili 99% identiteta sekvence, uključujući delecije, supstitucije i adicije. Primer varijante je delecija ili mutacija cisteina 201. DTFB (C8) znači da je difterijski toksin obrisan iz domena aktivacije ADP-ribozilatina, a cistein 201 je uklonjen ili mutiran. Primena DTFB takođe uključuje fragmente koji pokrivaju sekvencu 265-450 DT, što uključuje objavljene epitope T-ćelija (videti Bixler i sar., Adv Exp Med Biol. (1989) 251:175-80; Raju i sar., Eur. J. Immunol. (1995) 25: 3207-3214). DTFB takođe uključuje stanja monomera, dimera ili oligomera. Primena DTFB takođe uključuje bilo koji proteinski kompleks (isključujući DT pune dužine ili CRM<197>), hibridne proteine ili konjugovane proteine koji sadrže DTFB oili fragmente. Primena DTFB takođe uključuje hemijski modifikovani DTFB ili fragmente (tj. pegilacija, modifikacija neprirodnih aminokiselina).
[0065] U određenim slučajevima, DTFB se proizvodi enzimskom digestijom i redukcijom nativnog DT ili mutantnog CRM<197>sa naknadnim prečišćavanjem adsorptivnom hromatografijom. Stoga se zamišlja da se prečišćeni DTFB, sa ili bez mutacije na ostatku DT C201, može slično pripremiti od nativnog ili C201-mutiranog DT ili CRM<197>, pune dužine, ili od njihovih varijanti u kojima je A-fragment skraćen. Posebno je poznato da multimodalne smole koje se prodaju kao Capto<™>Adhere i Capto<™>MMC i Tris koncentracije veće od 50 mM tokom ciklusa hromatografije pružaju izuzetne načine prečišćavanja razdvojenog nativnog DTFB.
[0066] [0033] U određenim slučajevima, priprema DTFB uključuje do 10 mM DTT. DTT sprečava dimerizaciju uzrokovanu formiranjem disulfidnih veza između DTFB monomera zbog slobodnog cisteina na poziciji ostatka 201. U takvim slučajevima, nikl se ne dodaje u reakcionu smešu za konjugaciju. Međutim, reakcija konjugacije se inače odvija istim metodom. Ako se DTT ne koristi, dimerizovani DTFB može biti konjugovan sa Ps u prisustvu nikla kako bi se poboljšao stepen konjugacije sekvestracijom rezidualnog, inhibitornog cijanida.
[0067] Očekuje se da će uklanjanje slobodnog cisteina (mutacija DT C201) u DTFB dati slično ponašanje u multimodalnim smolama. Očekuje se da će uklanjanje slobodnog cisteina eliminisati potrebu za DTT, jer dimerizacija formiranjem disulfidnih veza između slobodnog cisteina ne bi bila izvodljiva. Povećanje koncentracije Tris pufera i koncentracije eluirajućeg pufera natrijum hlorida pokazalo se kao efikasno poboljšanje oporavka DTFB proteina iz Capto MMC hromatografske smole. Očekuje se da se prečišćavanje DTFB može postići korišćenjem drugih multimodalnih smola.
[0068] U određenim slučajevima, DTFB se ekspresuje rekombinantno sa ili bez mutacije DT C201 ostatka, a zatim se prečišćava različitim tehnikama poznatim stručnjacima u stanju tehnike.
[0069] U ovom pronalasku, CRM<197>se koristi kao proteinski nosač. CRM<197>je netoksična varijanta (tj. toksoid) difterijskog toksina. U jednom tehničkom rešenju, zolovan je iz kultura Corynebacterium diphtheria soja C7 (β197) uzgajanih u medijumu na bazi kazaminokiselina i ekstrakta kvasca. U drugom tehničkom rešenju, CRM<197>se priprema rekombinantno u skladu sa postupcima opisanim u američkom patentu br. 5,614,382. Tipično, CRM<197>se prečišćava kombinacijom ultrafiltracije, taloženja amonijum sulfatom i jonoizmenjivačke hromatografije. U nekim tehničkim rešenjima, CRM<197>se priprema u Pseudomonas fluorescens korišćenjem Pfenex Expression Technology<™>(Pfenex Inc., San Dijego, Kalifornija).
[0070] [0037] DTFB i njegove varijante mogu se koristiti kao proteinski nosač za antigene, uključujući proteine (peptide) i saharide. Drugi pogodni proteinski nosači uključuju dodatne inaktivirane bakterijske toksine kao što su DT (difterijski toksoid), TT (tetanus toksid) ili fragment C TT, pertusisni toksoid, kolerni toksoid (npr., kao što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi sa objavom br. WO 2004/083251), E. coli LT, E. coli ST, i egzotoksin A iz Pseudomonas aeruginosa. Proteini spoljašnje membrane bakterija kao što su kompleks spoljašnje membrane c (OMPC), porini, proteini koji vezuju transferin, pneumokokni površinski protein A (PspA; videti međunarodnu patentu prijavu sa objavom br. WO 02/091998), pneumokokni adhezinski protein (PsaA), C5a peptidaza iz grupe A ili grupe B streptokoka, ili Haemophilus influenzae protein D, pneumokokni pneumolizin (Kuo i sar., 1995, Infect Immun 63; 2706-13) uključujući ply detoksikovan na neki način, na primer dPLY-GMBS (videti međunarodnu patentu prijavu sa objavom br. WO 04/081515) ili dPLY-formol, PhtX, uključujući PhtA, PhtB, PhtD, PhtE i fuzije Pht proteina, na primer PhtDE fuzije, PhtBE fuzije (videti međunarodnu patentu prijavu sa objavom br. WO 01/98334 i WO 03/54007), takođe se može koristiti. Drugi proteini, kao što su ovalbumin, hemocijanin iz ključaonice (KLH), goveđi serumski albumin (BSA) ili prečišćeni proteinski derivat tuberkulina (PPD), PorB (iz N. meningitidis), PD (Haemophilus influenzae protein D; videti npr. Evropski patent br. EP 0 594 610 B), ili njihovi imunološki funkcionalni ekvivalenti, sintetički peptidi (videti evropske patente br. EP0378881 i EP0427347), proteini toplotnog šoka (videti međunarodne patentne prijave br. WO 93/17712 i WO 94/03208), proteini pertusisa (videti međunarodnu patentu prijavu sa objavom br. WO 98/58668 i evropski patent br. EP0471177), citokini, limfokini, faktori rasta ili hormoni (videti međunarodnu patentu prijavu sa objavom br. WO 91/01146), veštački proteini koji sadrže višestruke epitope ljudskih CD4+ T ćelija iz različitih antigena izvedenih iz patogena (videti Falugi i sar., 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824) kao što je N19 protein (videti Baraldoi i sar., 2004, Infect Immun 72:4884-7), proteini usvajanja gvožđa (videti međunarodnu patentu prijavu sa objavom br. WO 01/72337), toksin A ili B C. difficile (videti međunarodnu patentu prijavu sa objavom br. WO 00/61761), i flagelin (videti Ben-Yedidia i sar., 1998, Immunol Lett 64:9) takođe se mogu koristiti kao proteinski nosači.
[0071] Drugi DT mutanti mogu se koristiti kao drugi proteinski nosači, kao što su CRM<176>, CRM<228>, CRM<45>(Uchida i sar., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844); CRM<9>, CRM<45>, CRM<102>, CRM<103>i CRM<107>druge mutacije koje su opisali Nicholls i Youle u knjizi Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; delecija ili mutacija Glu-148 u Asp, Gln ili Ser i/ili Ala 158 u Gly i druge mutacije obelodanjene u američkom patentu br. 4,709,017 ili američkom patentu br. 4,950,740; mutacija najmanje jednog ili više ostataka Lys 516, Lys 526, Phe 530 i/ili Lys 534 i druge mutacije obelodanjene u američkom patentu br.5,917,017 ili američkom patentu br. 6,455,673; ili fragment obelodanjenim u američkom patentu br.5,843,711. Takvi DT mutanti se takođe mogu koristiti za pravljenje DTFB varijanti gde varijante sadrže B fragment koji sadrži epitopske regione.
[0072] [0039] U jednom slučaju, predmetno obelodanjenje obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži konjugate polisaharida i proteina koji sadrže kapsularne polisaharide iz najmanje jednog od serotipova 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F, i 38 Streptococcus pneumoniae conjugated konjugovane sa jednim ili više nosača. proteine i farmaceutski prihvatljiv nosač. U određenim slučajevima, imunogeni sastav sadrži, sastoji se u suštini od ili se sastoji od kapsularnih polisaharida iz 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, ili 44 serotipova pojedinačno konjugovanih sa CRM<197>. U određenim aspektima pronalaska, CRM<197>je jedini protein nosač koji se koristi.
[0073] U određenim slučajevima, imunogene kompozicije opisane gore opciono dodatno sadrže kapsularne polisaharide iz jednog dodatnog serotipa S. pneumoniae serotype izabranog iz najmanje jednog od 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F, i 38 konjugovane sa drugim proteinskim nosačem (koji se razlikuje po najmanje jedna aminokiselina iz prvog proteinskog nosača). Poželjno je da saharidi iz određenog serotipa nisu konjugovani sa više od jednog proteinskog nosača.
[0074] U određenim slučajevima, imunogeni sastav ovog obelodanjenja dodatno sadrži kapsularne polisaharide iz najmanje jednog dodatnog serotipa konjugovane sa drugim proteinskim nosačem. U ovim slučajevima, imunogena kompozicija sadrži, sastoji se u suštini od ili se sastoji od kapsularnih polisaharida iz 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, ili 44 serotipova pojedinačno konjugovanih sa drugim nosačem proteina koji nije CRM<197>.
[0075] U određenim slučajevima, imunogena kompozicija sadrži, sastoji se u suštini od ili se sastoji od kapsularnih polisaharida iz N serotipova gde je 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, ili 44; i kapsularni polisaharidi iz svakog od N serotipova su konjugovani sa prvim proteinskim nosačem koji je CRM<197>. U drugim slučajevima, kapsularni polisaharidi iz serotipova 1, 2, 3 ... ili N-1 su konjugovani sa prvim proteinskim nosačem, a kapsularni polisaharidi iz serotipova N-1, N-2, N-3 ... 1 su konjugovani sa drugim proteinskim nosačem koji je različit od CRM<197>.
[0076] Predmetni pronalazak obezbeđuje 15-valentnu imunogenu kompoziciju koji se u suštini sastoji od kapsularnih polisaharida iz serotipova 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, i 33F konjugovanih sa CRM<197>.
[0077] Kapsularni polisaharidi iz Steptococcus pneumoniae mogu se pripremiti standardnim tehnikama poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, polisaharidi se mogu izolovati iz bakterija i mogu se donekle odrediti po veličini poznatim postupcima (videti, npr. Evropske patente br. EP497524 i EP497525); i poželjno mikrofluidizacijom koja se izvodi pomoću homogenizatora ili hemijskom hidrolizom. U jednom slučaju, S. pneumoniae sojevi koji odgovaraju svakom serotipu polisaharida gaje se u medijumu na bazi soje. Pojedinačni polisaharidi se zatim prečišćavaju standardnim koracima, uključujući centrifugiranje, taloženje i ultrafiltraciju. Videti, npr. objavljenu američku patentnu prijavu br. 2008/0286838 i američki patent br.
[0078] 5,847,112. Polisaharidi se mogu odrediti po veličini kako bi se smanjila viskoznost i/ili poboljšala filtrabilnost naknadnih konjugovanih proizvoda. U ovom otkriću, kapsularni polisaharidi se pripremaju od jednog ili više serotipova 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F, i 38.
[0079] Prečišćeni polisaharidi se hemijski aktiviraju da bi se uvele funkcionalnosti sposobne da reaguju sa proteinskim nosačem. Nakon aktiviranja, svaki kapsularni polisaharid se posebno konjuguje sa proteinskim nosačem da bi se formirao glikokonjugat. Polisaharidni konjugati mogu se pripremiti poznatim tehnikama spajanja.
[0080] U jednom slučaju, hemijska aktivacija polisaharida i naknadna konjugacija sa proteinskim nosačem postižu se na način opisan u američkim patentima br.4,365,170, 4,673,574 i 4,902,506. Ukratko, pneumokokni polisaharid reaguje sa oksidacionim sredstvom na bazi periodata, kao što je natrijum perjodat, kalijum perjodat ili periodna kiselina, što rezultira slučajnim oksidativnim cepanjem vicinalnih hidroksilnih grupa da bi se generisale reaktivne aldehidne grupe.
[0081] [0047] Direktno aminativno kuplovanje oksidovanog polisaharida sa primarnim aminskim grupama na proteinskom nosaču (uglavnom ostacima lizina) može se postići reduktivnom aminacijom. Na primer, konjugacija se vrši reakcijom smeše aktiviranog polisaharida i proteinskog nosača sa redukcionim sredstvom kao što je natrijum cijanoborohidrid u prisustvu nikla. Reakcija konjugacije može se izvesti u vodenom rastvoru ili u organskom rastvaraču kao što je DMSO. Videti, npr. US2015/0231270 A1, EP 0471 177 B1, i US2011/0195086 A1. Na kraju reakcije konjugacije, nereagovani aldehidi se blokiraju dodatkom jakog redukcionog sredstva, kao što je natrijum borohidrid.
[0082] U jednom slučaju, pre formulacije, svaki pneumokokni kapsularni polisaharidni antigen se pojedinačno prečišćava iz S. pneumoniae, aktivira da bi se formirali reaktivni aldehidi, a zatim kovalentno konjuguje korišćenjem reduktivne aminacije sa natrijum cijanoborohidridom u prisustvu nikla na prvi ili drugi proteinski nosač. Nikl se kompleksuje sa rezidualnim, inhibitornim cijanidom iz natrijum cijanoborohidrida, redukcionog sredstva koje se koristi za reduktivnu aminaciju.
[0083] U određenim slučajevima, reakcija konjugacije se izvodi reduktivnom aminacijom, gde se nikl koristi za veću efikasnost reakcije konjugacije i za pomoć u uklanjanju slobodnog cijanida. Poznato je da prelazni metali formiraju stabilne komplekse sa cijanidom i da poboljšavaju reduktivnu metilaciju amino grupa proteina i formaldehida sa natrijum cijanoborohidridom (Gidley i sar., 1982, Biochem J.203: 331-334; Jentoft i sar., 1980, Anal Biochem.106: 186-190). Kompleksiranjem rezidualnog, inhibitornog cijanida, dodavanje nikla povećava potrošnju proteina tokom konjugacije i dovodi do formiranja većih, potencijalno imunogenijih konjugata.
[0084] Varijabilnost nivoa slobodnog cijanida u komercijalnim serijama reagensa natrijum cijanoborohidrida može dovesti do nedoslednih performansi konjugacije, što dovodi do promenljivih atributa konjugata, uključujući molekulsku masu i odnos polisaharida i proteina. Dodavanje nikla u reakciju konjugacije smanjuje nivo slobodnog cijanida i tako poboljšava stepen konzistentnosti konjugata od serije do serije.
[0085] U drugom slučaju, postupak konjugacije može koristiti aktivaciju polisaharida sa 1-cijano-4-dimetilamino piridinijum tetrafluoroboratom (CDAP) da bi se formirao cijanatni estar. Aktivirani saharid može biti direktno povezan sa amino grupom na proteinskom nosaču.
[0086] [0052] U drugom slučaju, reaktivna homobifunkcionalna ili heterobifunkcionalna grupa može biti uvedena na aktivirani polisaharid reakcijom cijanatnog estra sa bilo kojim od nekoliko dostupnih modaliteta. Na primer, cistamin ili cisteamin mogu se koristiti za pripremu tioliranog polisaharida koji bi mogao biti povezan sa nosačem preko tioetarske veze dobijene nakon reakcije sa proteinom nosačem aktiviranim maleimidom (na primer korišćenjem GMBS) ili haloacetiliranim proteinom nosačem (na primer korišćenjem jodoacetimida [npr. etil jodoacetimid HCl] ili N-sukcinimidil bromoacetata ili SIAB, ili SIA, ili SBAP). U drugom slučaju, cijanatni estar reaguje sa heksandiaminom ili dihidrazidom adipinske kiseline (ADH) i rezultujući amino-derivatizovani saharid se konjuguje sa slobodnom karboksi grupom na proteinu nosaču korišćenjem karbodiimidne (npr. EDAC ili EDC) hemije. Takvi konjugati su opisani u objavljenim međunarodnim patentnim prijavama br. WO 93/15760, WO 95/08348 i WO 96/29094; i Chu i sar., 1983, Infect. Immunity 40:245-256.
[0087] Druge pogodne metode konjugacije koriste karbodiimide, hidrazide, aktivne estre, norboran, p-nitrobenzoevu kiselinu, N-hidroksisukcinimid, S--NHS, EDC i TSTU. Mnogi su opisani u videti međunarodnu patentu prijavu sa objavom br. WO 98/42721. Konjugacija može uključivati karbonilni linker koji se može formirati reakcijom slobodne hidroksilne grupe saharida sa CDI (videti Bethell i sar., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn i sar., 1981, J. Chromatogr.
[0088] 218:509-18), nakon čega sledi reakcija sa proteinskim nosačem da bi se formirala karbamatna veza. Ova hemija se sastoji od redukcije anomernog terminala ugljenih hidrata da bi se formirala primarna hidroksilna grupa, nakon čega sledi reakcija primarne hidroksilne grupe sa CDI da bi se formirao karbamatni intermedijer i naknadno kuplovanje sa amino grupama proteinskog nosača. Reakcija može zahtevati opcionu zaštitu/deprotekciju drugih primarnih hidroksilnih grupa na saharidu.
[0089] Nakon konjugacije, konjugati polisaharida i proteina se prečišćavaju da bi se uklonio višak reagensa za konjugaciju, kao i rezidualni slobodni protein i slobodni polisaharid, jednom ili više tehnika dobro poznatih stručnjaku, uključujući operacije koncentracije/dijafiltracije, ultrafiltracije, taloženja/elucije, kolonske hromatografije i dubinske filtracije. Videti, npr. američki patent br.
[0090] 6,146,902.
[0091] Nakon što se pojedinačni glikokonjugati prečiste, oni se kombinuju da bi se formulisao imunogeni sastav ovog pronalaska. Ovi pneumokokni konjugati se pripremaju odvojenim postupcima i formulišu se u jednokratnoj doznoj formulaciji.
[0093] Farmaceutske kompozicije/kompozicije vakcine
[0095] [0056] Predmetno obelodanjenje dalje obezbeđuje kompozicije, uključujući farmaceutske, imunogene i vakcinske kompozicije, koje sadrže, sastoje se u suštini od, ili alternativno, sastoje se od bilo koje od gore opisanih kombinacija polisaharidnih serotipova zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i adjuvansom. U jednom slučaju, kompozicije sadrže, sastoje se u suštini od ili se sastoje od 2 do 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, ili 44 različitih konjugata polisaharida i proteina, pri čemu svaki od konjugata sadrži različiti kapsularni polisaharid konjugovan ili sa prvim proteinom nosačem ili sa drugim proteinom nosačem, i pri čemu kapsularni polisaharidi potiču iz najmanje jednog od serotipova 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F i 38 Streptococcus pneumoniae su konjugovani sa prvim proteinskim nosačem izabranim iz CRM<197>, i opciono imaju dodatne serotipove S. pneumoniae serotypes izabrane iz serotipova 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F, i 38 koji su konjugovani sa drugim proteinskim nosačem (koji se razlikuje od prvog proteinskog nosača u najmanje jednoj aminokiselini) zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i adjuvansom.
[0096] Formulacija konjugata polisaharida i proteina predmetnog pronalaska može se postići korišćenjem postupaka koji su poznati u stanju tehnike. Na primer, 15 pojedinačnih pneumokoknih konjugata može se formulisati sa fiziološki prihvatljivim vehikulumu za pripremu kompozicije. Primeri takvih vehikuluma uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, puferovani fiziološki rastvor, poliole (npr. glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol) i rastvore dekstroze.
[0097] Prema pronalasku, kompozicija vakcine je formulisan u L-histidinskom puferu sa natrijum hloridom.
[0098] Kao što je ovde definisano, "adjuvans" je supstanca koja služi za poboljšanje imunogenosti imunogene kompozicije predmetnog pronalaska. Imuno adjuvans može pojačati imuni odgovor na antigen koji je slabo imunogen kada se primenjuje sam, npr. indukovanjem slabih ili nikakvih titara antitela ili ćelijski posredovan imuni odgovor, povećanjem titra antitela na antigen i/ili smanjenjem doze antigena efikasne za postizanje imunog odgovora kod pojedinca. Stoga se adjuvansi često daju radi pojačavanja imunog odgovora i dobro su poznati stručnjaku. Pogodni adjuvansi za poboljšanje efikasnosti kompozicije uključuju, ali nisu ograničeni na:
[0100] (1) soli aluminijuma (alum), kao što su aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat, aluminijum sulfat, itd.;
[0101] (2) formulacije emulzije ulje-u-vodi (sa ili bez drugih specifičnih imunostimulirajućih sredstava kao što su muramil peptidi (definisani u nastavku) ili komponente ćelijskog zida bakterija), kao što su, na primer, (a) MF59 (međunarodna patentna prijava sa objavom br. WO 90/14837), koji sadrži 5% skvalena, 0,5% Tween 80, i 0,5% Span 85 (opciono sadrži različite količine MTP-PE) formulisane u submikronske čestice korišćenjem mikrofluidizatora kao što je mikrofluidizator Model 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, koji sadrži 10% skvalena, 0,4% Tween 80, 5% pluronikom blokiranog polimera L121, i thr-MDP ili mikrofluidizovan u submikronsku emulziju ili vorteksovan da bi se generisala emulzija veće veličine čestica, (c) Ribi<™>adjuvansni sistem (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) koji sadrži 2% skvalena, 0,2% Tween 80, i jedna ili više komponenti ćelijskog zida bakterija iz grupe koja se sastoji od 3-O-deailisanog monofosforilipida (MPL<™>) opisanog u američkom patentu br. 4,912,094, trehaloza dimikolata (TDM), i skeleta ćelijskog zida (CWS), poželjno MPL+CWS (Detox<™>); i (d) Montanide ISA;
[0102] (3) saponinske adjuvanse, mogu se koristiti kao što su Quil A ili STIMULON<™>QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (videti npr. američki patent br.5,057,540) ili čestice koje su od njih generisane kao što su ISCOM (imunostimulišući kompleksi formirani kombinacijom holesterola, saponina, fosfolipida i amfipatskih proteina) i Iscomatrix<®>(koji ima u suštini istu strukturu kao ISCOM, ali bez proteina);
[0103] (4) bakterijske lipopolisaharide, sintetičke analoge lipida A kao što su jedinjenja aminoalkil glukozamin fosfata (AGP), ili njihovi derivati ili analozi, koji su dostupni od Corixa, a koji su opisani u američkom patentu br. 6,113,918; jedan takav AGP je 2-[(R)-3-tetradekanoiloksitetradekanoilamino]etil 2-deoksi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradekanoiloksitetradekanoil]-2-[(R)-3-- tetradekanoiloksitetradekanoilamino]-b-D-glukopiranozid, koji je takođe poznat kao 529 (ranije poznat kao RC529), koji je formulisan kao vodeni oblik ili kao stabilna emulzija;
[0104] (5) sintetičke polinukleotide kao što su oligonukleotidi koji sadrže CpG motiv(e) (američki patent br.6,207,646);
[0105] (6) citokine, kao što su interleukini (npr. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, itd.), interferoni (npr. gama interferon), faktor stimulacije kolonija granulocita i makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonija makrofaga (M-CSF), faktor nekroze tumora (TNF), kostimulatorni molekuli B7-1 i B7-2, itd; i
[0106] (7) komplement, kao što je trimer komponente komplementa C3d.
[0107] U drugom slučaju, adjuvans je smeša 2, 3 ili više gore navedenih adjuvanasa, npr. SBAS2 (emulzija ulja u vodi koja takođe sadrži 3-deacilovani monofosforil lipid A i QS21).
[0108] Muramil peptidi uključuju, ali nisu ograničeni na, N-acetil-muramil-L-treonil-D-izoglutamin (thr-MDP), i N-acetil-normuramil-L-alanin-2-(1'-2' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroksifosforiloksi)-etilamin (MTP-PE), itd.
[0109] Adjuvans je aluminijumska so. Adjuvans aluminijumske soli je APA. Primeri drugih aluminijumskih soli uključuju alum-precipitovanu vakcinu ili alum-adsorbovanu vakcinu. Adjuvansi na bazi aluminijumskih soli su dobro poznati u stanju tehnike i opisani su na primer u Harlow, E. and D. Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) i Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493). Aluminijumska so uključuje, ali nije ograničena na, hidratisani aluminijum oksid, aluminijum hidrat, aluminijum trihidrat (ATH), aluminijum hidrat, aluminijum trihidrat, Alhydrogel<®>, Superfos, Amphogel<®>, aluminijum (III) hidroksid, aluminijum hidroksifosfat sulfat (aluminijum fosfatni adjuvans (APA)), amorfni aluminijum oksid, trihidratisani aluminijum oksid ili trihidroksialuminijum.
[0110] APA je vodena suspenzija aluminijum hidroksifosfata. APA se proizvodi mešanjem aluminijum hlorida i natrijum fosfata u zapreminskom odnosu 1:1 da bi se istaložio aluminijum hidroksifosfat. Nakon procesa mešanja, materijal se smanjuje veličinom pomoću mešalice sa visokim smicanjem kako bi se postigla monodisperzna raspodela veličine čestica. Proizvod se zatim dijafiltrira u odnosu na fiziološki rastvor i steriliše parom.
[0111] U određenim slučajevima, komercijalno dostupan Al(OH)<3>(npr. Alhydrogel<®>ili Superfos iz Danske/Accurate Chemical and Scientific Co., Westbury, NY) se koristi za adsorpciju proteina u odnosu od 50-200 g proteina/mg aluminijum hidroksida. Adsorpcija proteina zavisi, u drugom tehničkom rešenju, od pI (izoelektričnog pH) proteina i pH medijuma. Protein sa nižim pI se jače adsorbuje na pozitivno naelektrisani jon aluminijuma nego protein sa višim pI. Aluminijumske soli mogu uspostaviti depo Ag koji se polako oslobađa tokom perioda od 2-3 nedelje, biti uključen u nespecifičnu aktivaciju makrofaga i aktivaciju komplementa i/ili stimulisati urođeni imuni mehanizam (moguće kroz stimulaciju mokraćne kiseline). Videti, npr. Lambrecht i sar., 2009, Curr Opin Immunol 21:23.
[0112] [0065] Monovalentni vodeni konjugati se obično mešaju i razblažuju. Nakon razblaživanja, serija se sterilno filtrira. Aluminijum fosfatni adjuvans se dodaje aseptično da bi se postigla konačna koncentracija od 4 µg/mL za sve serotipove osim 6B, koji se razblažuje do ciljanih 8µg/mL, i konačna koncentracija aluminijuma od 250 µg/mL. Formulisana serija sa adjuvansom biće punjena u bočice ili špriceve.
[0113] U određenim slučajevima, adjuvans je nukleotidna sekvenca koja sadrži CpG, na primer, oligonukleotid koji sadrži CpG, posebno, oligodezoksinukleotid koji sadrži CpG (CpG ODN). U drugom slučaju, adjuvans je ODN 1826, koji se može nabaviti od Coley Pharmaceutical Group.
[0114] "Nukleotid koji sadrži CpG," "oligonukleotid koji sadrži CpG," "CpG oligonukleotid," i slični termini odnose se na molekul nukleotida dužine 6-50 nukleotida koji sadrži nemetilovani CpG deo. Videti, npr. Wang i sar., 2003, Vaccine 21:4297. U drugom slučaju, podrazumeva se bilo koja druga definicija termina prihvaćena u stanju tehnike. Oligonukleotidi koji sadrže CpG uključuju modifikovane oligonukleotide korišćenjem bilo kojih sintetičkih internukleozidnih veza, modifikovane baze i/ili modifikovanog šećera.
[0115] Postupci za primenu CpG oligonukleotida su dobro poznate u stanju tehnike i opisane su, na primer, u Sur i sar., 1999, J Immunol. 162:6284-93; Verthelyi, 2006, Methods Mol Med.
[0116] 127:139-58; i Yasuda i sar., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.23:89-110.
[0118] Administriranje/Doziranje
[0120] Kompozicije i formulacije predmetnog pronalaska mogu se primeniti za zaštitu ili lečenje ljudi podložnih infekciji, npr. pneumokoknoj infekciji, primenom vakcine sistemskim ili mukoznim putem. U jednom slučaju, predmetno oblodanjenje obezbeđuje postupak indukovanja imunog odgovora na kapsularni polisaharidni konjugat S. pneumoniae, koji obuhvata administriranje čoveku imunološki efikasne količine imunogene kompozicije predmetnog obelodanjenja. U drugom slučaju, predmetno oblodanjenje obezbeđuje postupak vakcinacije čoveka protiv pneumokokne infekcije, koji obuhvata korak administracije čoveku imunološki efikasne količine imunogene kompozicije.
[0121] Optimalne količine komponenti za određenu vakcinu mogu se utvrditi standardnim studijama koje uključuju posmatranje odgovarajućih imunih odgovora kod ispitanika. Na primer, u drugom slučaju, doza za vakcinaciju ljudi se određuje ekstrapolacijom iz studija na životinjama na podatke o ljudima. U drugom slučaju, doza se određuje empirijski. Podaci o mladuncima rezus majmuna dati u primerima pokazuju da je vakcina imunogena.
[0122] "Efikasna količina" kompozicije se odnosi na dozu potrebnu za izazivanje antitela koja značajno smanjuju verovatnoću ili težinu infektivnosti mikroba, npr. S. pneumoniae, tokom naknadne infekcije.
[0123] Postupci prema ovom obelodanjenju mogu se primeniti za prevenciju i/ili smanjenje primarnih kliničkih sindroma izazvanih mikrobima, npr. S. pneumoniae, uključujući i invazivne infekcije (meningitis, pneumonija i bakterijemija) i neinvazivne infekcije (akutni otitis medija i sinusitis).
[0124] Administracija kompozicija može da uključi jedno ili više od sledećeg: injekcija putem intramuskularnog, intraperitonealnog, intradermalnog ili potkožnog puta; ili putem mukozne primene u oralni/dijestivni, respiratorni ili genitourinarni trakt. U jednom slučaju, intranazalna administracija se koristi za lečenje upale pluća ili otitisa medija (jer se nazofaringealno prenošenje pneumokoka može efikasnije sprečiti, čime se infekcija ublažava u najranijoj fazi).
[0125] Količina konjugata u svakoj dozi vakcine je odabrana kao količina koja indukuje imunoprotektivni odgovor bez značajnih, neželjenih efekata. Takva količina može da varira u zavisnosti od serotipa pneumokoka. Uopšteno, za konjugate na bazi polisaharida, svaka doza će sadržati 0,1 do 100 µg svakog polisaharida, posebno 0,1 do 10 µg, i još konkretnije 1 do 5 µg. Na primer, svaka doza može da sadrži 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, ili 750 ng ili 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100 µg.
[0126] Optimalne količine komponenti za određenu vakcinu mogu se utvrditi standardnim studijama koje uključuju posmatranje odgovarajućih imunih odgovora kod subjekata. Na primer, u drugom slučaju, doza za vakcinaciju ljudi se određuje ekstrapolacijom iz studija na životinjama na podatke o ljudima. U drugom slučaju, doza se određuje empirijski.
[0127] U jednom slučaju, doza aluminijumske soli je 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500, ili 700 µg, ili 1, 1.2, 1.5, 2, 3, 5 mg ili više. U još jednom slučaju, doza aluminijumske soli opisana gore je po µg rekombinantnog proteina.
[0128] [0077] U posebnom slučaju predmetnog obelodanjenja, PCV15 vakcina je sterilna tečna formulacija pneumokoknih kapsularnih polisaharida serotipova 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F i 33F pojedinačno konjugovanih sa CRM<197>. U drugom slučaju, svaka doza je formulisana da sadrži: 4 µg/mL ili 8 µg/mL svakog saharida, osim za 6B sa 8 µg/mL ili 16 µg/mL; i oko 64 µg/mL ili 128 µg/mL CRM<197>proteinskog nosača. U jednom aspektu, svaka 0.5 mL doza je formulisana da sadrži: 2 µg svakog saharida, osim za 6B sa 4 µg; oko 32 µg CRM<197>proteinskog nosača (npr. 32 µg ± 5 µg, ± 3 µg, ± 2 µg, ili ± 1 µg), 0,125 mg elementarnog aluminijuma (0,5 mg aluminijum fosfata) kao adjuvansa; i natrijum hlorid i L- histidin pufer. Koncentracija natrijum hlorida je oko 150 mM (npr.150 mM ± 25 mM, ± 20 mM, ± 15 mM, ± 10 mM, ili ± 5 mM) i oko 20 mM (npr.20 mM ± 5 mM, ± 2,5 mM, ± 2 mM, ± 1 mM, ili ± 0,5 mM) L- histidinskog pufera.
[0129] Prema bilo kom od postupaka predmetnog obelodanjenja i u jednom slučaju, subjekt je čovek. U određenim slučajevima, ljudski subjekt je odojče (mlađe od 1 godine), malo dete (približno 12 do 24 meseca) ili malo dete (približno 2 do 5 godina). U drugim slučajevima, ljudski subjekt je stariji pacijent (> 65 godina). Kompozicije predmetnog pronalaska su takođe pogodne za primenu kod starije dece, adolescenata i odraslih (npr. uzrasta od 18 do 45 godina ili od 18 do 65 godina).
[0130] U jednom slučaju postupak predmetnog obelodanjenja, kompozicija predmetnog obelodanjenja se primenjuje kao jedna inokulacija. U drugom slučaju, vakcina se administrira dva, tri ili četiri puta ili više puta, u odgovarajućim razmacima. Na primer, kompozicija se može administrirati u intervalima od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 meseci ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji. Raspored imunizacije može pratiti onaj koji je određen za pneumokokne vakcine. Na primer, rutinski raspored za odojčad i malu decu protiv invazivne bolesti izazvane S. pneumoniae je uzrast 2, 4, 6 i 12-15 meseci. Dakle, u drugom slučaju, kompozicija se primenjuje kao serija od 4 doze u 2, 4, 6 i 12-15 meseci starosti.
[0131] Kompozicije ovog obelodanjenja mogu takođe uključiti jedan ili više proteina iz S. pneumoniae. Primeri S. pneumoniae proteina pogodnih za uključivanje obuhvataju one identifikovane u međunarodnim patentnim prijavama sa objavama br. WO 02/083855 i WO 02/053761.
[0133] Formulacije
[0135] Kompozicije se mogu administrirati subjektu jednom ili više postupaka poznatih stručnjaku u stanju tehnike, kao što su parenteralno, transmukozno, transdermalno, intramuskularno, intravenozno, intradermalno, intranazalno, potkožno, intraperitonealno, i formulisati u skladu sa tim.
[0136] U jednom slučaju, kompozicije se administrira putem epidermalne injekcije, intramuskularne injekcije, intravenozne, intraarterijske, potkožne injekcije ili intrarespiratorne mukozne injekcije tečnog preparata. Tečne formulacije za injekcije uključuju rastvore i slično.
[0137] Kompozicija pronalaska može biti formulisana kao bočice za jednu dozu, bočice za više doza ili kao prethodno napunjeni špricevi.
[0138] U drugom slučaju, kompozicije se administriraju oralno, i stoga su formulisani u obliku pogodnom za oralnu administraciju, tj. kao čvrsti ili tečni preparat. Čvrste oralne formulacije uključuju tablete, kapsule, pilule, granule, pelete i slično. Tečne oralne formulacije uključuju rastvore, suspenzije, disperzije, emulzije, ulja i slično.
[0139] Farmaceutski prihvatljivi nosači za tečne formulacije su vodeni ili nevodeni rastvori, suspenzije, emulzije ili ulja. Primeri nevodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol i organski estri za injekcije, kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferovane medijume. Primeri ulja su ona životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, na primer, ulje kikirikija, sojino ulje, maslinovo ulje, suncokretovo ulje, ulje riblje jetre, drugo morsko ulje ili lipid iz mleka ili jaja.
[0140] Farmaceutska kompozicija može biti izotonična, hipotonična ili hipertonična. Međutim, često je poželjno da farmaceutska kompozicija za infuziju ili injekciju bude u suštini izotonična kada se administrira. Stoga, za skladištenje farmaceutska kompozicija može poželjno biti izotonična ili hipertonična. Ako je farmaceutska kompozicija hipertonična za skladištenje, može se razblažiti da bi postala izotoničan rastvor pre administracije.
[0141] Izotonično sredstvo može biti jonsko izotonično sredstvo kao što je so ili nejonsko izotonično sredstvo kao što je ugljeni hidrat. Primeri jonskih izotoničnih sredstava uključuju, ali nisu ograničeni na NaCl, CaCl<2>, KCl i MgCl<2>. Primeri nejonskih izotoničnih sredstava uključuju, ali nisu ograničeni na, manitol, sorbitol i glicerol.
[0142] Takođe je poželjno da barem jedan farmaceutski prihvatljiv aditiv bude pufer. Za neke svrhe, na primer, kada je farmaceutska kompozicija namenjena za infuziju ili injekciju, često je poželjno da kompozicija sadrži pufer koji je sposoban da puferuje rastvor do pH vrednosti u opsegu od 4 do 10, kao što je 5 do 9, na primer 6 do 8.
[0143] Pufer može, na primer, biti izabran iz grupe koja se sastoji od Tris, acetata, glutamata, laktata, maleata, tartarata, fosfata, citrata, karbonata, glicinata, L-histidina, glicina, sukcinata i trietanolamina.
[0144] [0090] Pufer se dalje može, na primer, izabrati iz USP kompatibilnih pufera za parenteralnu primenu, posebno kada je farmaceutska formulacija za parenteralnu primenu. Na primer, pufer može biti izabran iz grupe koja se sastoji od monobaznih kiselina kao što su sirćetna, benzoeva, glukonska, glicerinska i mlečna; dibazne kiseline kao što su akonitna, adipinska, askorbinska, ugljena, glutaminska, jabučna, ćilibarna i vinska, polibazne kiseline kao što su limunska i fosforna; i baze kao što su amonijak, dietanolamin, glicin, trietanolamin i Tris.
[0145] Parenteralni vehikulumi (za subkutanu, intravensku, intraarterijsku ili intramuskularnu injekciju) uključuju rastvor natrijum hlorida, Ringerov rastvor dekstroze, dekstrozu i natrijum hlorid, Ringerov rastvor sa laktatom i fiksna ulja. Intravenski nosači uključuju nadoknađivače tečnosti i hranljivih materija, nadoknađivače elektrolita kao što su oni na bazi Ringerovog rastvora dekstroze i slično. Primeri su sterilne tečnosti kao što su voda i ulja, sa ili bez dodatka surfaktanta i drugih farmaceutski prihvatljivih adjuvanata. Generalno, voda, fiziološki rastvor, vodeni rastvor dekstroze i srodnih rastvora šećera, glikoli kao što su propilen glikoli ili polietilen glikol, polisorbat 80 (PS-80), polisorbat 20 (PS-20) i poloksamer 188 (P188) su poželjni tečni nosači, posebno za rastvore za injekcije. Primeri ulja su ona životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, na primer, ulje od kikirikija, sojino ulje, maslinovo ulje, suncokretovo ulje, ulje riblje jetre, drugo morsko ulje ili lipid iz mleka ili jaja.
[0146] Formulacije predmetnog obelodanjenja takođe sadrže surfaktant. Poželjni surfaktanti uključuju, ali nisu ograničeni na: surfaktante polioksietilen sorbitan estre (obično nazivane Tweens), posebno PS-20 i PS-80; kopolimere etilen oksida (EO), propilen oksid (PO), i/ili butilen oksid (BO), koji se prodaju pod trgovačkim nazivom DOWFAX<™>kao što su linearni EO/PO blok kopolimeri; oktoksinole, koji mogu da variraju u broju ponavljajućih etoksi (oksi-1,2-etandiil) grupa, pri čemu je oktoksinol-9 (Triton X-100, ili t-oktilfenoksipolietoksijatanol) od posebnog interesa; (oktilfenoksi)polietoksijatanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipide kao što je fosfatidilholin (lecitin); nonilfenol etoksilate, kao što je Tergitol<™>NP serija; polioksietilen masni etri izvedeni iz laurila, cetila, stearila i oleil alkohola (poznatih kao Brij surfaktanti), kao što je trietilenglikol monolauril etar (Brij 30); i sorbitanski estri (obično poznati kao SPAN), kao što su sorbitan trioleat (Span 85) i sorbitan monolaurat.
[0147] Mogu se koristiti smeše surfaktanta, npr. smeše PS-80/Span 85. Takođe je pogodna kombinacija polioksietilen sorbitanskog estra kao što je polioksietilen sorbitan monooleat (PS-80) i oktoksinola kao što je t-oktilfenoksipolietoksijatanol (Triton X-100). Još jedna korisna kombinacija sadrži lauret 9 plus polioksietilen sorbitanski estar i/ili oktoksinol.
[0148] [0094] Poželjne količine surfaktanata su: polioksietilen sorbitanski estri (kao što je PS-80) 0,01 do 1% tež/v, posebno oko 0,1% tež/v; oktil- ili nonilfenoksi polioksietanoli (kao što je Triton X-100, ili drugi deterdženti iz Triton serije) 0,001 do 0,1% tež/v, posebno 0,005 do 0,02% tež/v; polioksietilen etri (kao što je lauret 9) 0,1 do 20% tež/v, poželjno 0,1 do 10% tež/v i posebno 0,1 do 1% tež/v ili oko 0,5% tež/v.
[0149] Kompozicija se u suštini sastoji od histidina (20 mM), fiziološkog rastvora (150 mM) i 0,2% tež/v PS-20 pri pH od 5,8 sa 250 ug/mL APA (aluminijum fosfatni adjuvans). PS-20 može biti u opsegu od 0,005 do 0,3% tež/v u prisustvu PS-20 u formulaciji koje kontroliše agregaciju tokom simulirane proizvodnje i transporta koristeći primarno pakovanje. Proces se sastoji od kombinovanja mešavine do 44 serotipa u histidinu, natrijum hloridu i PS-20, a zatim kombinovanja ovog mešanog materijala sa APA i natrijum hloridom sa ili bez antimikrobnih konzervansa.
[0150] Kao što je ovde pokazano, izbor surfaktanta može zahtevati optimizaciju za različite lekove i lekovite supstance. Za multivalentne vakcine koje sadrže 15 ili više serotipova, poželjni su PS-20 i P188. Veruje se da je izbor hemije koja se koristi za pripremu konjugata značajan faktor koji utiče na stabilizaciju formulacije. Posebno, kao što je prikazano u nastavku, pneumokokni konjugati polisaharida i proteina pripremljeni u vodenom ili DMSO rastvaraču i kombinovani u multivalentnoj kompoziciji pokazuju značajne razlike u stabilnosti u zavisnosti od određenih sistema surfaktanta koji se koriste za formulaciju. Kao što je opisano, poboljšana stabilnost je primećena sa polisorbatom 20 samim ili sa poloksamerom 188 u kombinaciji sa poliolom, posebno kada su jedan ili više konjugata polisaharida i proteina pripremljeni u aprotičnom rastvaraču kao što je DMSO.
[0151] [0097] Predmetni pronalazak se delimično zasniva na obelodanjenju da upotreba polisorbata 20 u formulacijama koje sadrže konjugate polisaharida i proteina pripremljene reduktivnom aminacijom, od kojih su neki pripremljeni u vodenim uslovima, a drugi u DMSO uslovima, pomaže u kontroli fizičko-hemijske nestabilnosti imunogenih kompozicija izazvane stresom tokom proizvodnje i transporta i pruža neočekivano superiorna svojstva u odnosu na druge surfaktante i stabilizatore. Tačan mehanizam kako određeni deterdžent štiti bioterapeutsko sredstvo je slabo shvaćen i ne može se predvideti apriori. Mogući mehanizmi stabilizacije uključuju preferencijalnu hidrataciju, preferencijalno isključivanje, konkurenciju na interfejsu vazduh/tečnost između bioterapeutika i površine, površinski napon i/ili direktno povezivanje deterdženta sa bioterapeutskim sredstvom radi maskiranja hidrofobnih zakrpa koje služe kao seme za agregaciju. Predmetni pronalazak se bavi stalnom potrebom u struci da se poboljša stabilnost i inhibira formiranje čestica (npr. agregacija, taloženje) imunogenih kompozicija koje sadrže konjugate polisaharida i proteina. Veruje se da formulacije ovog pronalaska obezbeđuju značajne prednosti u kontroli agregacije izazvane proizvodnjom, transportom i rukovanjem složenih bioterapeutskih sredstava u odnosu na ranije korišćene surfaktante, uključujući poloksamer 188 i polisorbat 80.
[0152] Veruje se da proteinska komponenta u konjugatu polisaharida i proteina igra važnu ulogu u agregaciji. Ovo je pokazano u različitim fenomenima agregacije lekova koji koriste konjugate iste kompozicije serotipa, ali različite rastvarače za konjugaciju. Aprotonski rastvarač koji se koristi u pripremi konjugata polisaharida menja strukturu proteina i može pokazati drugačiju tendenciju ka agregaciji u prisustvu APA adjuvansa. Kada se koriste dva ili više proteinskih nosača, može se izračunati težinski procenat.
[0153] Dakle, u određenim slučajevima, predmetno obelodanjenje obezbeđuje formulaciju koja sadrži (i) jedan ili više konjugata polisaharida i proteina; (ii) pH puferovani fiziološki rastvor koji ima pH u opsegu od 5,0 do 7,5; (ii) aluminijumsku so; i (iv) sistem surfaktanta izabran iz (a) polisorbata 20 i (b) poloksamera koji ima molekulsku težinu u opsegu od 1100 Da do 17.400 Da i poliola izabranog iz propilen glikola i polietilen glikola 400. U određenim slučajevima, jedan ili više konjugata polisaharida i proteina se pripremaju u aprotičnom rastvaraču kao što je DMSO. Opseg od približno 10-100%, 24%-100% ili 24-80% ukupne mase proteina može se pripremiti i konjugovati u aprotičnom rastvaraču, kao što je DMSO.
[0154] Sistem surfaktanta koji sadrži polisorbat 20 (IUPAC naziv: polioksietilen (20) sorbitan monolaurat; PS-20) je komercijalno dostupan surfaktant, obično nazvan Tween<®>20. Konačna koncentracija polisorbata 20 u formulacijama pronalaska je u opsegu od 0,001% do 10% tež/v, od 0,025% do 2.5% tež/v, ili 0,025% do 0,3% tež/v. Sistem surfaktanta koji sadrži polisorbat 20 može dalje da sadrži poliol. Poliol može biti izabran iz propilen glikola i polietilen glikola. U određenim aspektima, polietilen glikol ili propilen glikol je u konačnoj koncentraciji od 6% do 20% tež/v. U određenim aspektima, polietilen glikol je polietilen glikol 400.
[0155] U određenim slučajevima, sistem surfaktanta sadrži poloksamer molekulske težine u opsegu od 1100 Da do 17.400 Da i poliol izabran iz propilen glikola i polietilen glikola 400.
[0156] [0102] Poloksamer je nejonski triblok kopolimer sastavljen od centralnog hidrofobnog lanca polioksipropilena (poli(propilen oksida)) okruženog sa dva hidrofilna lanca polioksietilena (poli(etilen oksida)). Poloksameri su takođe poznati pod trgovačkim nazivom Pluronic<®>. Pošto se dužine polimernih blokova mogu prilagoditi, postoji mnogo različitih poloksamera koji imaju malo drugačija svojstva. Za generički termin "poloksamer", ovi kopolimeri se obično nazivaju slovom "P" (za poloksamer) nakon čega slede tri cifre, prve dve cifre x 100 daju približnu molekulsku masu polioksipropilenskog jezgra, a poslednja cifra x 10 daje procenat sadržaja polioksietilena (npr. P407 = poloksamer sa molekulskom masom polioksipropilena od 4.000 g/mol i 70% sadržaja polioksietilena). Za trgovački naziv Pluronic<®>, kodiranje ovih kopolimera počinje slovom kojim se definiše njihov fizički oblik na sobnoj temperaturi (L = tečnost, P = pasta, F = ljuspice (čvrsto)) praćeno dvema ili tri ciframa. Prva cifra (dve cifre u trocifrenom broju) u numeričkoj oznaci, pomnožena sa 300, označava približnu molekulsku masu hidrofoba; i poslednja cifra x 10 daje procenat sadržaja polioksietilena (npr. L61 = Pluronic<®>sa molekulskom masom polioksipropilena od 1.800 g/mol i sadržajem polioksietilena od 10%). Videti američki patent br.3,740,421.
[0157] Primeri poloksamera imaju opštu formulu:
[0159] HO(C<2>H<4>O)<a>(C<3>H<6>O)<b>(C<2>H<4>O)<a>H
[0161] pri čemu blokovi a i b imaju sledeće vrednosti:
[0164]
[0165]
[0167] Jedinice molekulske težine, kako se ovde koriste, su u daltonima (Da) ili g/mol.
[0168] Za formulacije, poloksamer generalno ima molekulsku težinu u opsegu od 1100 Da do 17.400 Da, od 7.500 Da do 15.000 Da ili od 7.500 Da do 10.000 Da. Poloksamer može biti izabran iz poloksamera 188 ili poloksamera 407. Konačna koncentracija poloksamera u formulacijama opredmetnog obelodanjenja je od 0,001 do 5% tež/v, ili 0,025 do 1% tež/v. Sistem surfaktanta koji sadrži poloksamer mora dalje da sadrži poliol. U određenim aspektima, poliol je propilen glikol i ima konačnu koncentraciju od 1 do 20% tež/v. U određenim aspektima, poliol je polietilen glikol 400 i ima konačnu koncentraciju od 1 do 20% tež/v.
[0169] Pogodni polioli za formulacije su polimerni polioli, posebno polietar dioli, uključujući, ali nisu ograničeni na, propilen glikol i polietilen glikol, polietilen glikol monometil etre. Propilen glikol je dostupan u rasponu molekulskih težina monomera od ~425 do ~2700. Polietilen glikol i polietilen glikol monometil etar su takođe dostupni u rasponu molekulskih težina od ~200 do ~35000, uključujući, ali nisu ograničeni na PEG200, PEG300, PEG400, PEG1000 PEG MME 550, PEG MME 600, PEG MME 2000, PEG MME 3350 i PEG MME 4000. Još jedan polietilen glikol je polietilen glikol 400. Konačna koncentracija poliola u formulacijama ovog otkrića može biti 1 do 20% tež/v ili 6 do 20% tež/v.
[0170] [0106] Formulacija takođe sadrži pH-puferovani fiziološki rastvor. Pufer može, na primer, biti izabran iz grupe koja se sastoji od Tris-a, acetata, glutamata, laktata, maleata, tartarata, fosfata, citrata, karbonata, glicinata, L-histidina, glicina, sukcinata, HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonske kiseline), MOPS (3-(N-morfolino)propansulfonske kiseline), MES (2-(N-morfolino)etansulfonske kiseline) i trietanolamin pufera. Pufer je sposoban da puferuje rastvor do pH vrednosti u opsegu od 4 do 10, 5,2 do 7,5 ili 5,8 do 7,0. U određenom aspektu ovog otkrića, pufer je izabran iz grupe koja se sastoji od fosfata, sukcinata, L-histidina, MES, MOPS, HEPES, acetata ili citrata. Pufer može dalje, na primer, biti izabran iz pufera kompatibilnih sa USP za parenteralnu upotrebu, posebno kada je farmaceutska formulacija za parenteralnu primenu. Koncentracije pufera će se kretati od 1 mM do 50 mM ili 5 mM do 50 mM. U određenim aspektima, pufer je L-histidin u konačnoj koncentraciji od 5 mM do 50 mM, ili sukcinat u konačnoj koncentraciji od 1 mM do 10 mM. U određenim aspektima, L-histidin je u konačnoj koncentraciji od 20 mM ± 2 mM.
[0171] Iako je fiziološki rastvor (tj. rastvor koji sadrži NaCl) poželjan, druge soli pogodne za formulaciju uključuju, ali nisu ograničene na, CaCl<2>, KCl i MgCl<2>i njihove kombinacije. Nejonski izotonični agensi, uključujući, ali nisu ograničeni na, saharozu, trehalozu, manitol, sorbitol i glicerol, mogu se koristiti umesto soli. Pogodni opsezi soli uključuju, ali nisu ograničeni na 25 mM do 500 mM ili 40 mM do 170 mM. U jednom aspektu, fiziološki rastvor je NaCl, opciono prisutan u koncentraciji od 20 mM do 170 mM.
[0172] U poželjnom tehničkom rešenju, formulacije sadrže L-histidinski pufer sa natrijum hloridom.
[0173] U određenim slučajevima formulacija opisanih ovde, konjugati polisaharida i proteina sadrže jedan ili više pneumokoknih polisaharida konjugovanih sa proteinskim nosačem. Proteinski nosač može biti izabran iz CRM<197>, fragmenta B difterijskog toksina (DTFB), DTFBC8, toksoida difterije (DT), toksoida tetanusa (TT), fragmenta C TT, toksoida velikog kašlja, toksoida kolere, E. coli LT, E. coli ST, egzotoksina A iz Pseudomonas aeruginosa, i njihovih kombinacija. U određenim aspektima, jedan ili više konjugata polisaharida i proteina su konjugovani sa DTFB. U jednom aspektu, svi konjugati polisaharida i proteina se pripremaju korišćenjem vodene hemije. Na primer, formulacija konjugata polisaharida i proteina može biti formulacija 15-valentnog pneumokoknog konjugata (15vPnC) koja se u suštini sastoji od polisaharida S. pneumoniae iz serotipova 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F i 33F konjugovanog sa CRM<197>polipeptidom. U drugom aspektu, jedan ili više polisaharidnih proteinskih konjugata se priprema korišćenjem DMSO hemije. Na primer, formulacija konjugata polisaharida i proteina može biti formulacija 15-valentnog pneumokoknog konjugata (15vPnC) gde se polisaharidni proteinski konjugati iz serotipova 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F, i 23F pripremaju korišćenjem DMSO hemije, a polisaharidni proteinski konjugati iz serotipova 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F, i 33F pripremaju korišćenjem vodene hemije.
[0174] U drugom slučaju, farmaceutska kompozicija se isporučuje u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. Na primer, sredstvo se može administrirati intravenskom infuzijom, transdermalnim flasterom, lipozomima ili drugim načinima administracije. U drugom slučaju, koriste se polimerni materijali; npr. u mikrosferama u ili implantatu.
[0175] Kompozicije takođe mogu da sadrže jedan ili više proteina iz S. pneumoniae. Primeri S. pneumoniae proteina pogodnih za uključivanje obuhvataju one identifikovane u međunarodnim patentnim prijavama sa objavama br. WO 02/083855 i WO 02/053761.
[0176] Sledeći primeri ilustruju, ali ne ograničavaju pronalazak.
[0178] PRIMERI
[0180] PRIMERI 1: Priprema DTFB proteinskog nosača (uporedni primer)
[0182] Primena multimodalne anjonske hromatografije za pripremu DTFB-a
[0184] Prečišćeni CRM<197>, dobijen ekspresijom u Pseudomonas fluorescens kao što je prethodno opisano (videti međunarodnu patentnu prijavu sa objavom br. WO 2012/173876 A1), digestiran je rekombinantnim tripsinom koristeći molarni odnos tripsina i CRM<197>od 1:500 tokom približno 1 sata na približno 22°C u 50 mM Tris, pH 8,0. Zatim je dodat ditioteritol (DTT) u 50 mM Tris, pH 8 do konačne koncentracije od 5 mM tokom 30 minuta na približno 22°C da bi se smanjila disulfidna veza između A i B fragmenata proteolitički razdvojenog CRM<197>.
[0185] Reakcija digestije je zatim stavljena u kolonu za multimodalnu anjonsko-izmenjivačku hromatografiju (Capto<™>Adhere, GE Healthcare) uravnoteženu sa 50 mM Tris, pH 8. Kolona je isprana sa 50 mM Tris, pH 8, i DTFB proizvod je eluiran gradijentom od 0,45 M do 0,65 M natrijum hlorida u 50 mM Tris, pH 8. Proizvod je koncentrovan i dijafiltriran prema 10 mM kalijum fosfatu, pH 8, koristeći tangencijalnu ultrafiltracionu membranu sa graničnom vrednostom nominalne molekulske težine od (NMWCO). Retentat koji sadrži DTFB proizvod je filtriran kroz 0,2 mikrona i čuvan na 2-8°C. Koncentracija proizvoda je određena apsorbancijom na 280 nm, a čistoća je procenjena SDS-PAGE elektroforezom pod neredukujućim uslovima.
[0186] Rezultati pokazuju da je eluent multimodalne anjonske hromatografije sadržao relativno čist DTFB, prisutan prvenstveno kao monomer sa malim udelom dimera. Videti Sliku 1A. Formiranje dimera pripisano je formiranju disulfidnih veza između DTFB monomera. Kao što je prikazano u sledećim odeljcima, DTT je korišćen u koracima hromatografije i ultrafiltracije kako bi se minimizirao potencijal za formiranje dimera.
[0187] Primena multimodalne katjonske hromatografije za pripremu DTFB
[0189] Zbog prisustva DTFB dimera, ispitan je alternativni postupak prečišćavanja. Prečišćeni CRM<197>, dobijen ekspresijom u Pseudomonas fluorescens kao što je gore opisano, razblažen je do koncentracije proteina od približno 1 mg/mL korišćenjem 300 mM Tris, pH 7,5. Tripsin je dodat u rastvor proteina koristeći molarni odnos tripsina i CRM<197>od približno 1:3250. Rastvor je inkubiran približno 20 sati na sobnoj temperaturi. DTT u 300 mM Tris, pH 7,5, zatim je dodat do konačne koncentracije od 10 mM DTT da bi se smanjila disulfidna veza između proteolitički razdvojenog CRM<197>, razdvajajući A i B fragmente.
[0190] Nakon približno 75 minuta, redukovani proteinski rastvor je stavljen na kolonu za multimodalnu katjonsko-izmenjivačku hromatografiju (Capto<™>MMC, GE Healthcare). Kolona je uravnotežena na 2-8°C sa 300 mM Tris, 10 mM DTT, pH 7,5 pre stavljanja proteinskog rastvora. Nakon stavljanja, kolona je isprana na 2-8°C sa 300 mM Tris, pH 7,5 koji sadrži 200 mM natrijum hlorida i 10 mM DTT, a proizvod je zatim eluiran na 2-8°C sa 1 M natrijum hlorida u 300 mM Tris, pH 8,5. Približno 0,002% tež/v PS-20 je dodato u šaržu pre koncentrovanja na 2-8°C korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 5 kDa. Nakon koncentrovanja, dodatni PS-20 je dodat u seriju do koncentracije od 0,02% tež/v PS-20, a serija je dijafiltrirana prema 100 mM kalijum fosfatu, 10 mM DTT, pH 8. Serija je dalje koncentrovana korišćenjem tangencijalne protočne filtracije sa membranom od 5 kDa. Konačni retentat je filtriran kroz 0,2 mikrona i čuvan zamrznut ili na 2-8°C pre konjugacije.
[0191] Uzorci DTFB su analizirani pomoću SDS-PAGE pod redukcionim uslovima (Slike 1B i 1C). Densitometrijska analiza gela pokazuje da konačni međuproizvod nakon filtracije od 0,2 mikrona (FBI) ima čistoću > 98%.
[0192] Konačni međuproizvod (FBI) prikazan na Slici 1C analiziran je tečnom hromatografijom sa masenom spektrometrijom (LC-MS) radi merenja mase intaktnog proteina. LC-MS analiza je sprovedena na uzorcima nakon redukcije sa DTT. Dekonvolucija sirovih podataka iz glavnog pika rezultirala je izmerenom masom od 37.194,2 Da. Ovo merenje mase je u skladu sa teorijskom masom od 37.194,4 Da za DTFB, potvrđujući očekivanu sekvencu aminokiselina.
[0193] [0120] Peptidna mapa je dobijena kombinacijom digestije tripsinom, endoproteinazom Asp-N i endoproteinazom Glu-C. Uzorak je podvrgnut reduktivnoj alkilaciji sa jodoacetamidom u prisustvu 6 M gvanidin-HCl i digestovan je približno 16-17 sati na 37°C sa svakim enzimom posebno. Digestija je prekinuta dodatkom mravlje kiseline. Peptidi su razdvojeni i analizirani LC MS metodom. Koristeći kombinaciju peptida identifikovanih odvojenom digestijom, pokrivenost aminokiselinskih sekvenci bila je približno 98%. Pronađeni peptidi su bili u skladu sa predviđenom DTFB sekvencom.
[0195] Alternativni postupak multimodalne katjonske hromatografije za prečišćavanje DTFB
[0196] Prečišćeni CRM<197>, dobijen ekspresijom u Pseudomonas fluorescens kao što je gore opisano, razblažen je do koncentracije proteina od približno 5 mg/ml korišćenjem 300 mM Tris, pH 7,5. Tripsin je dodat u rastvor proteina koristeći molarni odnos tripsina i CRM<197>od približno 1:3000. Rastvor je inkubiran približno 15-20 sati na približno 22°C. DTT u 300 mM Tris, pH 7,5, zatim je dodat do konačne koncentracije od ≥ 10 mM DTT da bi se smanjila disulfidna veza između proteolitički razdvojenog CRM197, razdvajajući A i B fragmente.
[0197] Redukovani proteinski rastvor je nanesen na kolonu za multimodalnu katjonsku izmensku hromatografiju (Capto<™>MMC, GE Healthcare) sa približno 25 g proteina po L smole. Kolona je uravnotežena na približno 22°C sa 300 mM Tris, 10 mM DTT, pH 7,5 pre nanošenja proteinskog rastvora. Nakon nanošenja, kolona je isprana na približno 22°C sa 300 mM Tris, pH 7,5 koji sadrži 200 mM natrijum hlorida i 10 mM DTT, a proizvod je zatim eluiran na 22°C sa 1 M natrijum hlorida u 300 mM Tris, pH 8,5. DTFB proizvod iz multimodalne katjonske izmenske hromatografije može se dijafiltrirati i koncentrovati korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 5 kDa i filtrirati kroz 0,2 mikrona kao što je gore opisano.
[0198] DTFB uzorci iz multimodalnog procesa katjonske izmene su analizirani pomoću SDS-PAGE pod redukcionim uslovima (Slika 1D). Densitometrijska analiza gela pokazuje da je DTFB proteinski proizvod eluiran iz multimodalne katjonske izmenjivačke kolone visoko prečišćen.
[0199] Uticaj pH vrednosti pufera, jonske jačine i koncentracije PS-20 surfaktanta na stabilnost DTFB tokom ultrafiltracije
[0201] Ispitivanja pH pufera, jonske jačine i PS-20 surfaktanta su sprovedena kako bi se odgovorilo na formiranje proteinskih čestica primećeno tokom razvoja koraka ultrafiltracije DTFB-a. DTFB je podešen na 100 mM kalijum fosfata pri pH 7, 7,5 ili pH 8 sa 0, 200 ili 500 mM natrijum hlorida. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija je korišćena za procenu stabilnosti (temperature topljenja, Tm) DTFB rastvora kao funkcije pH i koncentracije natrijum hlorida. Kao što je prikazano u Tabeli 1, povećanje pH sa 7 na 8 povećalo je DTFB Tm za približno 3°C.
[0202] Natrijum hlorid u opsegu od 0 do 500 mM natrijum hlorida nije značajno uticao na Tm pri ispitivanim pH vrednostima.
[0204] Tabela 1: Stabilnost DTFB rastvora kao funkcija pH pufera i koncentracije natrijum hlorida mereno diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom.
[0206] pH kalijum fosfatnog Koncentracija natrijum hlorida Temperatura topljenja, Tm
[0208]
[0211] U posebnoj studiji, prečišćeni DTFB je podešen na pH 6,0, pH 7,0 i pH 8,5 u 100 mM kalijum fosfatu sa 0, 150, 500 i 1000 mM natrijum hlorida. Rastvori su držani preko noći na sobnoj temperaturi, a zatim centrifugirani da bi se uklonio istaloženi protein. Supernatanti su testirani na koncentraciju proteina pomoću hromatografije isključivanja po veličini sa UV280 detekcijom apsorbancije (Slika 2). Koncentracija proteina supernatanta u ovoj studiji nije bila pod uticajem pH rastvora pri 0 i 150 mM natrijum hlorida. Međutim, pri višim koncentracijama natrijum hlorida (500 i 1000 mM), rezultati pokazuju izraženo smanjenje koncentracije proteina u supernatantu, što ukazuje na smanjenu stabilnost DTFB, kako se pH pufera smanjuje sa pH 7,0 ili 8,5 na 6,0.
[0212] [0126] Uticaj koncentracije PS-20 na stabilnost DTFB-a proučavan je dodavanjem sve većih količina PS-20 u rastvore DTFB-a u rastvorima kalijum fosfata od 50 i 100 mM, pH 8 i u rastvorima kalijum fosfata od 50 mM, 150 mM natrijum hlorida, pH 8. Rastvori su mešani u vorteksu 5 minuta, a zatim centrifugirani. Supernatanti su testirani na koncentraciju proteina pomoću hromatografije isključivanja po veličini sa UV280 detekcijom apsorbancije (Slika 3). Značajan gubitak proteina izazvan mešanjem u vorteksu primećen je u uzorcima koji nisu sadržali PS-20. Oporavak DTFB-a je značajno poboljšan u uzorcima koji sadrže ≥ 0,01% tež/v PS-20.
[0214] PRIMER 2: Priprema kapsularnih polisaharida S. pneumoniae
[0216] Postupci kultivacije pneumokoka su dobro poznati u stanju tehnike. Videti, npr. Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52. Postupci pripreme pneumokoknih kapsularnih polisaharida su takođe dobro poznate u stanju tehnike. Videti, npr. evropski patent br. EP0497524. Izolati pneumokoknih podtipova su dostupni iz Američke kolekcije tipova kultura (Manassas, VA). Bakterije su identifikovane kao inkapsulirane, nepokretne, gram-pozitivne, lancetaste diplokoke koje su alfa-hemolitičke na krvnom agaru. Podtipovi se mogu razlikovati na osnovu Kvelingove reakcije korišćenjem specifičnih antiseruma. Videti, npr. američki patent br.
[0217] 5,847,112.
[0218] Banke ćelija koje predstavljaju svaki iz serotipova S. pneumoniae serotypes od interesa dobijene su iz Merck Culture Collection (Rahway, NJ) u zamrznutoj bočici. Odmrznuta kultura semena je preneta u fermentor semena koji sadrži prethodno sterilisan medijum za rast pogodan za S. pneumoniae. Kultura je uzgajana u fermentoru semena uz kontrolu temperature i pH vrednosti. Celokupna zapremina fermentora semena je preneta u proizvodni fermentor koji sadrži prethodno sterilisan medijum za rast. Proizvodna fermentacija je bila poslednja faza rasta ćelija u procesu. Kontrolisani su temperatura, pH vrednost i brzina mešanja.
[0219] Proces fermentacije je završen dodatkom inaktivirajućeg sredstva. Nakon inaktivacije, serija je prebačena u rezervoar za inaktivaciju gde je držana na kontrolisanoj temperaturi i uz mešanje. Ćelijski ostaci su uklonjeni kombinacijom centrifugiranja i filtracije. Serija je ultrafiltrirana i dijafiltrirana. Serija je zatim podvrgnuta frakcionisanju na bazi rastvarača koje uklanja nečistoće i vraća polisaharid. PRIMER 3: Konjugacija polisaharida sa DTFB nosačkim proteinom korišćenjem reduktivne
[0221] Aminacije u vodenom rastvoru (uporedni primer)
[0223] Priprema konjugata serotipa 3-DTFB (ST3-DTFB) za studije imunogenosti miševa
[0224] Prečišćeni polisaharid serotipa 3 dobijen kao što je opisano u Primeru 2 rastvoren je u vodi. Smanjenje veličine Ps na prosečnu molekulsku težinu približno 200 kDa izvršeno je korišćenjem sonikatora za sonde, a uzorak je ohlađen u ledu. Sonikirani uzorak je filtriran kroz 0,2 mikrona i čuvan na 2-8°C. Rastvor polisaharida je koncentrovan dijafiltracijom preko tangencijalne membrane za filtraciju NMWCO od 30 kDa.
[0225] Polisaharid je pripremljen za konjugaciju korišćenjem oksidacije natrijum metaperiodatom (videti Anderson i sar., 1986, J. Immunol.137:1181-1186; i objavljenu američku patentnu prijavu br. US20110195086). Rastvor natrijum metaperiodata od 100 mM dodat je rastvoru polisaharida u 50 mM natrijum acetatu. Uzorak je mešan 14-18 sati na 19-25°C, zaštićen od svetlosti. Dodat je etilen glikol (molarni višak 100:1 u odnosu na ponavljajuće jedinice polisaharida) i mešano dodatnih 16-18 sati na 19-25°C da bi se ugasio preostali natrijum metaperiodat i zaustavila reakcija oksidacije. Dobijeni rastvor je dijafiltriran u odnosu na 10 zapremina vode. Oksidovani rastvor polisaharida je čuvan u alikvotima na -70°C.
[0226] Polisaharid oksidovan periodatom je pomešan sa DTFB pripremljenim kao što je opisano u Primeru 1 (korišćenjem multimodalne anjono-izmenjivačke hromatografije) pri masenom odnosu polisaharida i proteina od 0,6:1. Dodati su kalijum-fosfat, pH 6,4 i nikl-hlorid do konačnih koncentracija od 145 mM i 2,2 mM, respektivno. Zatim je dodat natrijum-cijanoborohidrid do približno 1-2 molarna ekvivalenta. Reakcija je zaštićena od svetlosti i sprovedena tokom perioda od 120 sati na 2-8°C.
[0227] Smeša je zatim dijalizovana uz 2 izmene 25 mM kalijum fosfatnog pufera, pH 6,4, 0,3 M natrijum hlorida na 2-8°C tokom ukupno 14-18 sati. Nerastvorljivi materijali su uklonjeni kratkim centrifugiranjem, a konjugat je poliran hromatografijom isključivanja po veličini (SEC) kako bi se smanjili slobodni polisaharidi i proteini. SEC-polirani konjugat je koncentrovan preko centrifugalnog koncentratora NMWCO od 30 kD.
[0229] Priprema konjugata serotipa 3-DTFB za studiju imunogenosti kod infantilnih rezus majmuna
[0231] [0134] Prečišćeni prah kapsularnog polisaharida pneumokoknog serotipa 3 rastvoren je u vodi i filtriran kroz 0,45 mikrona. Serija je homogenizovana da bi se smanjila molekulska masa Ps i filtrirana kroz 0,22 mikrona. Smanjenje veličine polisaharida Streptococcus pneumoniae pre konjugacije, ranije je opisano kao sredstvo za generisanje polisaharida sa specifičnijim, reproducibilnijim i lakšim fizičkim svojstvima (Marburg i sar., 1997, patent US 5,623,057). Kako su opisali Marburg i sar., poznato je da smanjenje veličine polisaharida povećava rastvorljivost i filtrabilnost i smanjuje polidisperziju i viskoznost, čime se poboljšava konzistentnost konjugacije i lakoća konjugacije. Smanjenje veličine polisaharida polisaharida serotipa 19F iz S. pneumoniae korišćenjem homogenizacije ranije je opisano (Lander i sar., 2000, Biotechnol. Prog.
[0232] 2000, 16, 80-85). Polisaharid smanjene veličine je zatim koncentrovan i dijafiltriran prema vodi korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 10 kDa.
[0233] Zatim je dodato 50 mM natrijum acetata, i aktivacija polisaharida je započeta dodatkom 100 mM rastvora natrijum metaperjodata da bi se formirali reaktivni aldehidi na polisaharidu. Serija je inkubirana na približno 22°C tokom približno 12 sati. Serija je dijafiltrirana prema 10 mM kalijum fosfatu, pH 6,4 korišćenjem 10 kDa NMWCO tangencijalne ultrafiltracione membrane na ≤ 8°C i retentat bogat proizvodom je koncentrovan.
[0234] Aktivirani rastvor polisaharida je pomešan sa vodom i 1,5 M kalijum fosfatom, pH 7,0. Prečišćeni DTFB je filtriran kroz 0,2 mikrona, a zatim kombinovan sa rastvorom polisaharida sa puferskim podešavanjem u odnosu mase polisaharida i proteina od 1,3:1. Rastvor je zatim filtriran kroz 0,2 mikrona. Nikl hlorid je dodat u seriju do konačne koncentracije približno 2 mM koristeći osnovni rastvor nikl hlorida od 100 mM. Zatim je dodat natrijum cijanoborohidrid (2 mola po molu ponavljajuće jedinice polisaharida). Serija je ostavljena da reaguje približno 120 sati na približno 10°C kako bi se maksimizirala potrošnja polisaharida i proteina.
[0235] Nakon reakcije konjugacije, serija je razblažena do koncentracije polisaharida približno 3,5 g/L, ohlađena na 2-8°C, filtrirana kroz 1,2 mikrona i dijafiltrirana prema 100 mM kalijum fosfatu, pH 7,0 na 2-8°C korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 100 kDa. Serija, regenerisana u retentatu, zatim je razblažena do približno 2,0 g polisaharida/L i pH vrednost je podešena dodatkom 1,2 M natrijum bikarbonata, pH 9,4. Dodat je natrijum borohidrid (1 mol po molu ponavljajuće jedinice polisaharida). Kasnije je dodat 1,5 M kalijum fosfat, pH 6,0.
[0236] Serija je zatim koncentrovana i dijafiltrirana prema 10 mM L-histidinu u 150 mM natrijum hloridu, pH 7,0 na 2-8°C korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 300 kDa. Retentat je filtriran kroz 0,2 mikrona i podešen na koncentraciju polisaharida od 1,0 g/L sa dodatnih 10 mM L-histidina u 150 mM natrijum hloridu, pH 7,0. Serija je raspoređena u alikvote i zamrznuta na ≤ -60°C.
[0237] PRIMER 4: Konjugacija serotipova 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F i 33F sa CRM<197>korišćenjem reduktivne aminacije u vodenom rastvoru
[0239] Različiti serotipski polisaharidi su pojedinačno konjugovani sa prečišćenim proteinskim nosačem CRM<197>korišćenjem uobičajenog toka procesa. Polisaharid je rastvoren, veličina mu je smanjena, hemijski aktiviran i pufer je zamenjen ultrafiltracijom. Prečišćeni CRM<197>je zatim konjugovan sa aktiviranim polisaharidom korišćenjem NiCl<2>(2 mM) u reakcionoj smeši, a dobijeni konjugat je prečišćen ultrafiltracijom pre konačne filtracije od 0,2 mikrona. Nekoliko parametara procesa u svakom koraku, kao što su pH, temperatura, koncentracija i vreme, kontrolisani su na vrednosti specifične za serotip u odeljku ispod.
[0241] Smanjenje veličine i oksidacija polisaharida
[0243] Prečišćeni prah pneumokoknog kapsularnog polisaharida rastvoren je u vodi, a svi serotipovi, osim serotipa 19A, filtrirani su kroz 0,45 mikrona. Serotipovi 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 19A, 19F, 22F, 23F i 33F su homogenizovani da bi se smanjila molekulska masa polisaharida. Serotip 18C je smanjen po veličini homogenizacijom ili kiselinskom hidrolizom na ≥ 90°C. Serotip 19A nije smanjen po veličini zbog svoje relativno male početne veličine. Pritisak homogenizacije i broj prolaza kroz homogenizator kontrolisani su do ciljeva specifičnih za serotip (150-1000 bara; 4-7 prolaza) da bi se postigla molekulska masa specifična za serotip. Polisaharid smanjene veličine je filtriran kroz 0,2 mikrona, a zatim koncentrovan i dijafiltriran prema vodi korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 10 kDa. Za serotip 18C hidrolizovan kiselinom korišćena je NMWCO membrana od 5 kDa.
[0244] Rastvor polisaharida je zatim podešen na serotip-specifičnu temperaturu (4-22°C) i pH (4-5) pomoću natrijum-acetatnog pufera kako bi se minimiziralo smanjenje veličine polisaharida usled aktivacije. Za sve serotipove (osim serotipa 4), aktivacija polisaharida je započeta dodatkom 100 mM rastvora natrijum-metaperjodata. Količina dodatog natrijum-metaperjodata bila je serotipski specifična, u rasponu od približno 0,1 do 0,5 mola natrijum-metaperjodata po molu polisaharidne ponavljajuće jedinice. Serotipski specifično punjenje natrijum-metaperjodata trebalo je da se postigne ciljani nivo aktivacije polisaharida (moli aldehida po molu polisaharidne ponavljajuće jedinice). Za serotip 4, pre dodavanja natrijum-metaperjodata, serija je inkubirana na približno 50°C i pH 4,1 kako bi se delimično deketalizovao polisaharid.
[0245] Za sve serotipove, sa izuzetkom serotipova 5 i 7F, aktivirani proizvod je dijafiltriran prema 10 mM kalijum fosfatu, pH 6,4 korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane od 10 kDa NMWCO. NMWCO membrana od 5 kDa je korišćena za kiselinski hidrolizovani serotip 18C. Serotipovi 5 i 7F su dijafiltriran prema 10 mM natrijum acetata. Ultrafiltracija za sve serotipove je sprovedena na 2-8°C.
[0247] Konjugacija polisaharida sa CRM<197>
[0249] Oksidovani rastvor polisaharida je pomešan sa vodom i 1,5 M kalijum fosfatom, pH 6,0 ili pH 7,0, u zavisnosti od serotipa. Odabrani pH pufera je trebalo da poboljša stabilnost aktiviranog polisaharida tokom reakcije konjugacije. Prečišćeni CRM<197>, dobijen ekspresijom u Pseudomonas fluorescens kao što je prethodno opisano (videti međunarodnu patentnu prijavu sa objavom br. WO 2012/173876 A1), je filtriran kroz 0,2 mikrona i kombinovan sa puferovanim rastvorom polisaharida pri masenom odnosu polisaharida i CRM<197>u opsegu od 0,4 do 1,0 tež/tež u zavisnosti od serotipa. Maseni odnos je odabran da bi se kontrolisao odnos polisaharida i CRM<197>u rezultujućem konjugatu. Koncentracije polisaharida i fosfata bile su specifične za serotip, u rasponu od 3,6 do 10,0 g/L i 100 do 150 mM, respektivno, u zavisnosti od serotipa. Koncentracija polisaharida specifična za serotip je odabrana da bi se kontrolisala veličina rezultujućeg konjugata. Rastvor je zatim filtriran kroz 0,2 mikrona. Dodat je nikl hlorid do približno 2 mM koristeći rastvor nikl hlorida od 100 mM. Dodat je natrijum cijanoborohidrid (2 mola po molu ponavljajuće jedinice polisaharida). Konjugacija je nastavljena u trajanju specifičnom za serotip (72 do 120 sati) kako bi se maksimizirala potrošnja polisaharida i proteina.
[0250] Kiselinom hidrolizovani serotip 18C je konjugovan na 37°C u 100 mM kalijum fosfatu pri približno pH 8 sa natrijum cijanoborohidridom koristeći koncentracije polisaharida i proteina od približno 12,0 g/L i 6,0 g/L, respektivno.
[0252] Redukcija sa natrijum borohidrido
[0254] [0145] Nakon reakcije konjugacije, serija je razblažena do koncentracije polisaharida od približno 3,5 g/L, ohlađena na 2-8°C i filtrirana kroz 1,2 mikrona. Svi serotipovi (osim serotipa 5) su dijafiltrirani prema 100 mM kalijum fosfatu, pH 7,0 na 2-8°C korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 100 kDa. Serža, regenerisana u retentatu, je zatim razblažena na približno 2,0 g polisaharida/L i pH je podešen dodatkom 1,2 M natrijum bikarbonata, pH 9,4. Dodat je natrijum borhidrid (1 mol po molu ponavljajuće jedinice polisaharida). Kasnije je dodato 1,5 M kalijum fosfata, pH 6,0. Serotip 5 je dijafiltriran prema 300 mM kalijum fosfatu korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 100 kDa.
[0256] Završna filtracija i skladištenje proizvoda
[0258] Serija je zatim koncentrovana i diaftiltrirana prema 10 mM L-histidinu u 150 mM natrijum hloridu, pH 7,0 na 4°C korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 300 kDa. Retentat je filtriran kroz 0,2 mikrona.
[0259] Serotip 19F je inkubiran približno 7 dana na 22°C, dijafiltriran prema 10 mM L-histidinu u 150 mM natrijum hloridu, pH 7,0 na 4°C korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 100 kDa i filtriran kroz 0,2 mikrona.
[0260] Serija je podešena na koncentraciju polisaharida od 1,0 g/L sa dodatnih 10 mM L-histidina u 150 mM natrijum hloridu, pH 7,0. Serija je raspoređena u alikvote i zamrznuta na ≤ -60°C.
[0261] PRIMER 5: Postupci za konjugaciju serotipova 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F i 23F sa CRM<197>korišćenjem reduktivne aminacije u dimetilsulfoksidu
[0263] Različiti serotipski polisaharidi su pojedinačno konjugovani sa prečišćenim proteinskim nosačem CRM<197>korišćenjem uobičajenog toka procesa. Polisaharid je rastvoren, veličina mu je određena do ciljne molekulske mase, hemijski aktiviran i pufer je izmenjen ultrafiltracijom. Aktivirani polisaharid i prečišćeni CRM<197>su pojedinačno liofilizovani i ponovo rastvoreni u dimetilsulfoksidu (DMSO). Ponovo rastvoreni rastvori polisaharida i CRM<197>su zatim kombinovani i konjugovani kao što je opisano u nastavku. Dobijeni konjugat je prečišćen ultrafiltracijom pre konačne filtracije od 0,2 mikrona. Nekoliko parametara procesa u svakom koraku, kao što su pH, temperatura, koncentracija i vreme, kontrolisani su na vrednosti specifične za serotip u odeljku ispod.
[0265] Smanjenje veličine i oksidacija polisaharida
[0267] [0150] Prečišćeni prah kapsularnog polisaharida pneumokoknog porekla rastvoren je u vodi, a svi serotipovi, osim serotipa 19A, filtrirani su kroz 0,45 mikrona. Svi serotipovi, osim serotipova 18C i 19A, homogenizovani su da bi se smanjila molekulska masa polisaharida. Pritisak homogenizacije i broj prolaza kroz homogenizator kontrolisani su do ciljeva specifičnih za serotip (150-1000 bara; 4-7 prolaza). Serotip 18C je smanjen po veličini kiselom hidrolizom na ≥ 90°C. Serotip 19A nije smanjen po veličini.
[0268] Polisaharid smanjene veličine je filtriran kroz 0,2 mikrona, a zatim koncentrovan i dijafiltriran prema vodi korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 10 kDa. Za serotip 18C je korišćena NMWCO membrana od 5 kDa.
[0269] Rastvor polisaharida je zatim podešen na specifičnu temperaturu (4-22°C) i pH (4-5) pomoću natrijum acetatnog pufera. Aktivacija polisaharida je započeta dodatkom rastvora natrijum metaperjodata. Količina dodatog natrijum metaperjodata bila je specifična za serotip, u rasponu od približno 0,1 do 0,5 mola natrijum metaperjodata po molu ponavljajuće jedinice polisaharida.
[0270] Za sve serotipove, aktivirani proizvod je dijafiltriran prema 10 mM kalijum fosfatu, pH 6,4 korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 10 kDa. Za serotip 18C korišćena je NMWCO membrana od 5 kDa. Ultrafiltracija za sve serotipove sprovedena je na 2-8°C.
[0272] Konjugacija polisaharida sa CRM<197>
[0274] Prečišćeni CRM<197>, dobijen ekspresijom u Pseudomonas fluorescens kao što je prethodno opisano (videti međunarodnu patentnu prijavu sa objavom br. WO 2012/173876 A1), je dijafiltriran prema 2 mM fosfatnom puferu, pH 7, koristeći 5 kDa NMWCO ultrafiltracionu membranu sa tangencijalnim protokom i filtriran kroz 0,2 mikrona.
[0275] Oksidovani rastvor polisaharida je formulisan sa vodom i saharozom u pripremi za liofilizaciju. Rastvor proteina je formulisan sa vodom, fosfatnim puferom i saharozom u pripremi za liofilizaciju. Koncentracije saharoze su se kretale od 1 do 5% da bi se postiglo optimalno ponovno rastvaranje u DMSO nakon liofilizacije.
[0276] Formulisani rastvori polisaharida i CRM<197>su pojedinačno liofilizovani. Liofilizovani polisaharidni i CRM<197>materijali su ponovo rastvoreni u DMSO i kombinovani pomoću T-miksera. Dodat je natrijum cijanoborohidrid (1 mol po molu ponavljajuće jedinice polisaharida), a konjugacija je nastavljena tokom trajanja specifičnog za serotip (1 do 48 sati) da bi se postigla ciljana veličina konjugata.
[0277] Redukcija natrijum borohidridom
[0279] Nakon reakcije konjugacije dodat je natrijum borhidrid (2 mola po molu ponavljajuće jedinice polisaharida). Serija je razblažena u 150 mM natrijum hloridu na približno 4°C. Zatim je dodat kalijum fosfatni pufer da bi se neutralisala pH vrednost. Serija je koncentrovana i dijafiltrirana na približno 4°C prema 150 mM natrijum hloridu korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 10 kDa.
[0281] Konačna filtracija i skladištenje proizvoda
[0283] Svaka serija je zatim koncentrovana i diaftiltrirana prema 10 mM L-histidinu u 150 mM natrijum hloridu, pH 7,0 na 4°C korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 300 kDa. Retentat je filtriran kroz 0,2 mikrona.
[0284] Serotip 19F je inkubiran približno 5 dana, dijafiltriran prema 10 mM L-histidinu u 150 mM natrijum hloridu, pH 7,0 na približno 4°C korišćenjem tangencijalne ultrafiltracione membrane NMWCO od 300 kDa i filtriran kroz 0,2 mikrona.
[0285] Serija je razblažena sa dodatnih 10 mM L-histidina u 150 mM natrijum hloridu, pH 7,0, zatim raspoređena u alikvote i zamrznuta na ≤ -60°C.
[0287] PRIMER 6: Studija imunogenosti kod miševa korišćenjem ST3-DTFB monovalentne formulacije konjugata (uporedni primer)
[0289] Imunogenost ST3-DTFB u poređenju sa ST3-CRM<197>procenjena je na modelu miševa. Adjuvansne formulacije za primenu miševima pripremljene su mešanjem 24 µL sterilno filtriranog konjugata (1:10 u fiziološkom rastvoru - 0,1258 mg DTFB ili CRM<197>-konjugovanog polisaharida po mL) sa 62 µL APA i 3,664 ml sterilnog fiziološkog rastvora za dozu od 0,08 µg polisaharida i 5 µg aluminijuma na 100 µL. Formulisane vakcine su čuvane u pojedinačnim bočicama sa borosilikatnim zatvaračem na 2-8°C radi podrške pojedinačnim imunizacijama.
[0290] ST3-DTFB je procenjen kod ženki miševa Balb/C starih 6-8 nedelja (n=10/grupa). Miševi su imunizovani sa ST3-DTFB/APA i dve ST3-CRM<197>/APA serije napravljene korišćenjem jedinstvenih preparata konjugata ST3-DTFB i ST3-CRM<197>pripremljenih kao što je opisano u Primerima 3 i 4. Koncentracija ST3 PnPs bila je 0,08 µg po dozi u zapremini od 0,1 ml, sa 5 µg APA, datih intraperitonealno 0., 14. i 28. dana. Serumi su sakupljeni pre početka studije (pre) i 39.
[0291] dana, posle 3. doze (PD3) i testirani u ST3 WHO ELISA [prema standardizovanim protokolima Svetske zdravstvene organizacije (WHO)], kao i u ELISA testu sa proteinskim nosačem (CRM<197>i DTFB). Miševi su intraperitonealno inficirani sa S. pneumoniae serotip 3 (207 CFU/0,5 ml) 49. dana.
[0292] Rezultati WHO ELISA testa (Slika 4) pokazali su da su miševi imunizovani sa ST3-DTFB/APA i ST3-CRM<197>/APA imali slične titre PD3 PnPs 3. Miševi imunizovani sa ST3-DTFB/APA i ST3-CRM197/APA imali su ≥ 90% zaštite od izlaganja serotipu 3, što je bilo značajno više u odnosu na miševe imunizovane negativnom kontrolom fiziološkim rastvorom i APA (Slika 5).
[0294] PRIMER 7: Formulacija 15-valentne pneumokokne konjugovane vakcine sa različitim surfaktantima i stabilizatorima
[0296] Pneumokokni konjugati polisaharida i proteina pripremljeni kao što je gore opisano korišćeni su za formulaciju 15-valentne pneumokokne konjugovane vakcine (PCV15) koja ima serotipove 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F i 33F. Formulacije su pripremljene korišćenjem pneumokoknih konjugata polisaharid-CRM<197>generisanih reduktivnom aminacijom u vodenim rastvorima (Primer 4) ili u DMSO (Primer 5). ST3-DTFB konjugati su pripremljeni kao u Primeru 3. Potrebne zapremine konjugata u rasutom stanju potrebne za dobijanje ciljne konačne koncentracije pojedinačnog serotipa izračunate su na osnovu zapremine serije i koncentracija polisaharida u rasutom stanju. 15 konjugata je kombinovano sa ekscipijensima odabranim iz natrijum hlorida, L-histidina, pufera pH 5,8 sa PS-20, PS-80 ili P188.
[0297] Sterilno formulisana rasuta masa je pažljivo mešana tokom i nakon mešanja sa rasutim adjuvansom aluminijum fosfata (APA) sa ili bez propilen glikola (PG) i polietilen glikola 400 (PEG<400>). Dve koncentracije konjugata i APA su proučavane u različitim formulacijama. Jedna je sadržala 8 µg/mL polisaharida serotipa 6B, 4 µg/mL polisaharida za sve ostale serotipove i 250 µg/mL APA. Druga je sadržala 16 µg/mL polisaharida serotipa 6B, 8 µg/mL polisaharida za sve ostale serotipove i 500 µg/mL APA. Formulisane vakcine su čuvane na 2-8°C.
[0299] PRIMER 8: Uticaj ekscipijenasa na stabilnost formulacije pneumokokne konjugovane vakcine koja sadrži konjugate generisane reduktivnom aminacijom u vodenom rastvoru
[0300] Stabilnost 15-valentne pneumokokne konjugovane vakcine (PCV15), pripremljene kao što je opisano u Primeru 7, procenjena je za različite uslove ekscipijensa nakon studija mešanja, recirkulacije i rotacionog mešanja kako bi se simulirali napori tokom proizvodnje i transporta koji bi se mogli javiti. PCV15 je pripremljen sa 20 mM L-histidina, pH 5,8, 150 mM natrijum hlorida i jednom od dve koncentracije konjugata i APA navedene u Primeru 7. Pošto su rezultati bili veoma slični između dve formulacije pri različitim koncentracijama konjugata i APA, u ovom Primeru su prikazani samo rezultati za PCV15 formulaciju koja sadrži niže koncentracije konjugata i APA. Za studije mešanja, PCV15 formulacije su mešane pomoću magnetne mešalice u staklenoj posudi. Za studije recirkulacije i smicanja, PCV15 formulacije su recirkulisane u cevnoj petlji. Za rotacione studije, pripremljena je osnovna formulacija PCV15 (L-histidin, pH 5,8 i natrijum hlorid) i dodati su surfaktanti ili stabilizatori kao što je navedeno u Primeru 7 i Tabeli 2. Studije mešanja su osmišljene korišćenjem rotacionog bočnog mešanja do 24 sata na 4°C. Vizuelna procena je korišćena za procenu formulacija. Putanja snopa svetlosti koji prolazi kroz posudu omogućila je detekciju čestica. Štaviše, uticaj naprezanja tokom proizvodnje, transporta i rukovanja na raspodelu veličine čestica procenjen je korišćenjem statičkog rasejanja svetlosti (SLS). Statičko rasejanje svetlosti leka na bazi suspenzije omogućava osetljiviju detekciju agregacije, što je naznačeno raspodelom veličine čestica. Monodisperzna (monomodalna) raspodela veličine čestica leka PCV15 ukazuje na neagregirani lek. Međutim, polidisperzna, polimodalna raspodela veličine čestica ukazuje na agregaciju.
[0302] Stabilnost PCV15 u studiji mešanja
[0304] Formulacije PCV15 koje koriste pneumokokne polisaharidne lekovite supstance konjugovane reduktivnom aminacijom u vodenim uslovima sa CRM<197>(koji se naziva PCV15<Vod>), kso što je opisano u Primeru 4, testirane su korišćenjem eksperimentalne postavke za mešanje u laboratorijskim razmerama, kao gore (čaša i magnetna mešalica). PCV15<Vod>sadrži polisaharid S. pneumoniae iz serotipova 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F i 33F konjugovan sa CRM<197>reduktivnom aminacijom u vodenim uslovima. PCV15 u 20 mM L-histidinu, 150 mM NaCl sa APA je pripremljen u laboratorijskoj seriji od 100 mL korišćenjem čaše i magnetne mešalice. U odsustvu surfaktanta, formulacije PCV15<Vod>bile su sklone oštećenjima izazvanim proizvodnjom (mešanjem) što je rezultiralo agregacijom vakcine tokom mešanja kako bi se osigurala homogenost vakcine.
[0305] Utvrđeno je da klasa nejonskih triblok kopolimera pruža robusnu stabilnost tokom skrining studija različitih ekscipijenata. Poloksamer 188 (P188) je odabran da kontroliše agregaciju i obezbedi robusnu i stabilnu formulaciju vakcinskog leka. Formulacije PCV15<Vod>su pripremljene sa 20 mM L-histidina, pH 5,8, 150 mM NaCl, APA i ili bez P188, 0,08% tež/v P188 ili 0,24% tež/v P188. Uticaj vremena uz konstantno mešanje pomoću magnetne mešalice procenjen je korišćenjem statičkog rasejanja svetlosti (Slike 6-7). Raspodela veličine čestica procenjena je pomoću Malvern Mastesizer 2000. NIST standard veličine čestica od 5 µm je testiran i dao je očekivanu raspodelu veličine. Za sve formulacije (sa i bez Poloksamera 188), primećen je monodisperzni histogramski profil nakon dodavanja konjugata u APA (T = 0 sati mešanja). Za samo 7 sati (T = 7 sati mešanja) kontinuiranog mešanja, formulacija bez P188 je rezultirala pojavom povećane raspodele veličine čestica i agregacije (Slika 6). Međutim, formulacije koje sadrže P188 ni u jednoj koncentraciji nisu pokazale povećanu veličinu čestica ili agregaciju nakon kontinuiranog mešanja do 24 sata (T = 24 sati mešanja) (Slika 7).
[0307] Stabilnost PCV15 u studiji horizontalne agitacije
[0309] Dodatne PCV15<Vod>formulacije u 20 mM L-histidinu, pH 5,8, 150 mM NaCl, i APA i sa ili bez 0,2% tež/v P188 su pripremljene u laboratorijskoj seriji od 100 mL kao što je opisano u Primeru 7. Da bi se simuliralo transportovanje i rukovanje i procenio uticaj na stabilnost vakcine, korišćena je studija horizontalne agitacije. Studija predstavlja direktno agitiranje PCV15<Vod>formulacije kroz interakcije sa površinama u sistemu zatvaranja posude (špric ili bočica) i izlaganje formulacije konačnim komponentama posude i vazdušnom interfejsu.0,64 mL je sipano u špriceve i zatvoreno. Ovi špricevi su horizontalno rotirani na 2-8°C tokom 24 sata i procenjena im je raspodela veličine čestica pomoću SLS (Slika 8A). Takođe je izvršena vizuelna procena (Slika 8B). Formulacija PCV15<Vod>u odsustvu P188 i podvrgnuta simuliranom naprezanju prilikom transporta i rukovanja rezultira povećanjem raspodele veličine čestica leka i vidljivim znacima aglomeracije i agregacije sa sistemom zatvaranja posude kao što je špric. Formulacija PCV15 sa P188 nije pokazala povećanje raspodele veličine čestica ili vizuelne znake aglomeracije i agregacije.
[0311] PRIMER 9: Uticaj ekscipijenata na stabilizaciju pneumokoknog konjugovanog vakcinskog proizvoda pripremljenog korišćenjem smeše konjugata generisanih reduktivnom aminacijom u vodenim i DMSO rastvorima (primer koji se odnosi na DTFB konjugate je samo u svrhu poređenja)
[0313] Višestruke 15-valentne (PCV15) formulacije sa APA u 20 mM L-histidinu, pH 5,8, 150 mM NaCl su procenjene korišćenjem simuliranih studija isporuke u laboratorijskim razmerama kako bi se osigurala robusna proizvodna i komercijalno održiva formulacija vakcinskog leka. Formulacija PCV15<Vod>sadržala je konjugate pneumokoknog polisaharida-CRM<197>generisane reduktivnom aminacijom u vodenom rastvoru. Formulacija PCV15<Vod/Ne-vod>sadržala je konjugate serotipova 6A, 6B, 7F, 19A, 19F i 23F pripremljene reduktivnom aminacijom u DMSO i konjugate serotipova 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 18C, 22F i 33F pripremljene reduktivnom aminacijom u vodenom rastvoru, gde su svi polisaharidi konjugovani sa CRM<197>. Formulacija PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>bila je slična PCVI5<Vod/Ne-vod>, osim što je serotip 3 bio konjugovan sa DTFB proteinom, ne sa CRM<197>. Pošto su rezultati bili veoma slični između dve formulacije pri različitim koncentracijama konjugata i APA navedenih u Primeru 7, u ovom Primeru su prikazani samo rezultati za PCV15 formulaciju koja sadrži niže koncentracije konjugata i APA, osim ako nije drugačije naznačeno. Prevnar 13<®>je korišćen kao još jedan primer multivalentne formulacije za testiranje pogodnosti PS-80 u drugom pneumokoknom konjugovanom vakcinskom proizvodu. Sadrži Streptococcus pneumoniae serotipove 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F polisaharide konjugovane sa CRM<197>proteinskim nosačem, polisorbat 80, sukcinatni pufer i adjuvans aluminijum fosfat. Konjugati se pripremaju reduktivnom aminacijom koristeći ili DMSO ili u vodenim uslovima.
[0314] Da bi se procenio uticaj na stabilnost formulacija vakcina, korišćena je studija horizontalne agitacije. Studija predstavlja direktno mešanje formulacija kroz interakcije sa površinama u sistemu zatvaranja posude (špric ili bočica) i izlaganje formulacije konačnim komponentama posude i vazdušnom interfejsu. Formulacije su raspoređene kao punjenje od 0,64 mL u špriceve i zatvorene. Ovi špricevi su horizontalno rotirani na 2-8°C do 8 sati. Uticaj vremena pod horizontalnim mešanjem procenjen je na raspodelu veličine čestica korišćenjem statičkog rasejanja svetlosti (SLS). Veličina i raspodela čestica procenjene su korišćenjem Malvern Mastesizer 2000. NIST standard veličine čestica od 5 µm je korišćen i dao je očekivanu raspodelu veličine. Kao što je prikazano na Slici 9, P188 nije bio efikasan stabilizator za kontrolu agregacije za PCV15<Vod/Ne->
[0315] <vod/ST3-DTFB>formulaciju uprkos tome što je robustan stabilizator za PCV15<Vod>formulaciju.
[0316] Povećanje raspodele veličine čestica i vidljivi znaci aglomeracije i agregacije primećeni su u formulaciji PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>sa P188.
[0317] Zbog iznenađujućeg obelodanjenja da P188 nije obezbedio robusnu stabilnost PCV15 formulaciji koja sadrži konjugate generisane reduktivnom aminacijom u DMSO, ispitani su dodatni stabilizatori i ekscipijensi. PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>formulacije (sa APA u 20 mM L-histidinu, pH 5,8, 150 mM NaCl i različitim stabilizatorima) su sipane u špriceve i ispitane horizontalnim mućenjem. Uticaj vremena pod konstantnom horizontalnom rotacijom je procenjen vizuelnom procenom (Tabela 2).
[0319] Tabela 2: Vizuelno posmatranje formulacija PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>koje sadrže 64 µg PnPs/mL i 250 µg/mL APA bez surfaktanata, sa P188, sa PS-80 ili sa PS-20 nakon 1 sata mešanja i do 24 sata horizontalne rotacije u špricevima. Taloženje se odnosi na taloženje formulacije leka na površini sistema za zatvaranje posude (npr. šprica ili bočice) i ukazuje na površinsko taloženje formulacije.
[0321] PCV15
Bez
1 sat 3 sata 6 sata 8,5 sati 24 sata
[0322] formulacija rotacije rotacije
rotacije
rotacije
rotacije
rotacije Bez Bez Neznatno
[0323] Raslojavanje Raslojavanje Raslojavanje Čestice surfaktanta agregacije raslojavanje
[0324]
[0326] Bez
[0327] Raslojavanje Raslojavanje Raslojavanje
[0328] agregacije<Nije testrirano zbog>raslojavanja u ranijim Bez Blago
Blago
Blago
[0329] vremenskim tačkama agregacije raslojavanje raslojavanje raslojavanje
[0330] Bez Bez Bez Bez Bez
Bez agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije Bez Bez Bez Bez Bez Bez agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije Bez Bez Bez Bez Bez Bez
[0332]
agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije PCV15 Bez 1 sat 3 sata 6 sata 8,5 sati 24 sata formulacija rotacije rotacije
rotacije
rotacije
rotacije
rotacije 0,005% Bez
[0333] Raslojavanje Raslojavanje Raslojavanje
[0334] tež/v PS-80 agregacije
[0336]
[0337] 0,01% tež/v Bez
[0338] Raslojavanje Raslojavanje Raslojavanje
[0339] PS-80 agregacije Nije testirano zbog
[0340]
[0341] 0,05% tež/v Bez raslojavanja ili prisustva Raslojavanje Raslojavanje Raslojavanje
[0342] PS-80 agregacije čestica u ranijim 0,005% Bez Raslojavanje Raslojavanje vremenskim tačkama Raslojavanje
[0343] tež/v PS-20 agregacije i male čestice i male čestice
[0344] 0,01% tež/v Bez Raslojavanje
[0345] Raslojavanje Raslojavanje
[0346] PS-20 agregacije i male čestice ,
[0347] estice PS-20 agregacije agregacije agregacije raslojavanje raslojavanje
[0348] 0,07% tež/v Bez
Bez
Bez Bez Bez Bez PS-20 agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije 0,1% tež/v Bez
Bez Bez Bez Bez Bez PS-20 agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije
[0350] Vizuelna procena formulacija PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>nije pokazala znake agregacije pri višim koncentracijama P188 i PS-20 (Tabela 2). Međutim, studije veće rezolucije za procenu raspodele veličine čestica ispod vidljive površine formulacija PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>koje sadrže P188 (0,05% tež/v do 1,0% tež/v) ili PS-20 (0,005% tež/v - 0,1% tež/v) sprovedene su korišćenjem SLS-a. Ove formulacije su horizontalno rotirane do 24 sata u špricevima HyPak od 1,5 mL (Becton-Dickinson). Vrednosti D[4,3] merene SLS-om prikazane su na Slici 10A-B. Rezultati D[4,3] pokazuju da su veće koncentracije PS-20 značajno poboljšale fizičko-hemijsku stabilnost formulacije, dok P188 pri svim koncentracijama nije bio efikasan. Kao što je prikazano na slici 10B, horizontalno mešanje Prevnar 13<®>do 24 sata pokazalo je povećanje vrednosti D[4,3] i dokaze o česticama što ukazuje na to da formulacija nije bila dovoljno zaštićena od simulirane agregacije izazvane transportom, a slično je našim iskustvima sa korišćenjem PS-80 u našim formulacijama
[0351] Na osnovu naših podataka sa PS-20 i PS-80, očekivalo bi se poboljšanje stabilnosti sa drugim pneumokoknim konjugatima polisaharida i proteina koji sadrže jedan ili više konjugata proizvedenih u aprotičnom rastvaraču.
[0353] PRIMER 10: Studija imunogenosti mladunaca rezus majmuna (IRM) korišćenjem ST3-DTFB
[0355] Konjugat formulisan u PCV15 (uporedni primer)
[0357] DTFB pripremljen kao što je opisano u Primeru 1 (multimodalna katjonska izmenjivačka hromatografija) korišćen je za pripremu ST3-DTFB konjugata kao što je opisano u Primeru 3. PCV15 formulacije su pripremljene kao u Primeru 7. IRM (mladi rezus majmuni, n=8/grupa) su intramuskularno imunizovani (grupe 1-4) sa 100 µL vakcine, kao što je opisano u Tabeli 3 ispod, 0., 28. i 56. dana. Serumi su sakupljeni pre početka studije (pre) i 14., 28., 42., 56. i 70. dana. IRM su posmatrani dva puta dnevno od strane obučenog osoblja za negu životinja na bilo kakve znake bolesti ili patnje. Formulacije vakcina u IRM su smatrane bezbednim i dobro podnošljivim, jer nisu primećeni neželjeni efekti povezani sa vakcinom.
[0359] Tabela 3: Formulacije za studiju mladunaca rezus majmuna
[0360] Proteinski nosač R k F rm l i D z PnP Pr k n i
[0363]
[0364] Proteinski nosač Ruka Formulaci a Doza PnPs Proces kon u aci e
[0367]
[0370] Studije na miševima opisane u Primeru 6 su završene korišćenjem monovalentnih konjugata sa jednim PnPs serotip 3 WHO ELISA testom za procenu IgG odgovora. Da bi se procenili serotip-specifični IgG odgovori u 15-valentnoj vakcini, razvijen je multipleksni elektrohemiluminiscencijski (ECL) test za upotrebu sa serumom rezus majmuna na osnovu ljudskog testa koji su opisali Markeze i sar. koristeći MSD tehnologiju (MSD je zaštitni znak MesoScale Discovery, odeljenja MesoScale Diagnostics, LLC., Gejtersburg, Merilend, SAD) koja koristi SULFO-TAG<™>oznaku koja emituje svetlost nakon elektrohemijske stimulacije. Reagensi i standardi ljudskih antitela korišćeni su pri testiranju uzoraka mladunaca majmuna. Rezultati mladunaca rezus majmuna su izraženi kao geometrijske srednje koncentracije očitane sa standardne krive korišćenjem serotip-specifičnih IgG koncentracija dodeljenih ljudskom referentnom standardu (007sp).
[0371] Odgovori IgG serotipa 3 nakon treće doze (Slika 11) nisu pokazali nikakve statističke razlike među imunizovanim grupama. Funkcionalna antitela, procenjena u OPA testovima koristeći S. pneumoniae serotip 3 (Slika 12), nisu pokazala nikakve statističke razlike među imunizovanim grupama.
[0373] PRIMER 11: Optimizacija PCV15 formulacije (uporedni primer)
[0374] Pošto su rezultati bili veoma slični između dve formulacije pri različitim koncentracijama konjugata i APA navedenih u Primeru 7, u ovom Primeru su prikazani samo rezultati za PCV15 formulaciju koja sadrži niže koncentracije konjugata i APA, osim ako nije drugačije naznačeno.
[0375] Linija za recirkulaciju se koristi u procesu formulacije PCV15 za dovod leka vakcine do mašine za punjenje špriceva i bočica. Recirkulacija tokom rutinskog punjenja dovodi do dodatnog smicanja i naprezanja na bioterapeutske lekove i stoga je važan korak u procesu koji treba proceniti. Studije su sprovedene radi procene uticaja recirkulacije na PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>i formulacije (u 20 mM L-histidinu, pH 5,8, 150 mM NaCl, sa 64 µg/mL ukupnog polisaharida i 250 µg/mL APA) koje sadrže 0,2% tež/v P188 i 0,1% tež/v PS-20. Formulacije su recirkulisane 24 sata iz posude za dovod kroz cev pri brzini protoka od 180 mL/min korišćenjem peristaltičke pumpe. Posuda za dovod je kontinuirano mešana pomoću magnetne mešalice, a uzorci su periodično uzimani za vizuelno posmatranje. Formulacije koje sadrže P188 pokazale su pojavu grudvica ili vizuelne agregacije (Tabela 4), dok formulacije koje sadrže PS-20 nisu pokazivale znake vidljive agregacije.
[0377] Tabela 4: Vizuelna procena PCV15 formulacija koje sadrže 0,2% tež/v P188 ili 0,1% tež/v PS-20 tokom 24 sata kontinuiranog mešanja i recirkulacije
[0380]
Vreme recirkulacije
[0381] 0 sati 0,5 sati 1 sat 3 sata 6 sati 8 sati 12 sati 24 sata
[0384]
[0386] Ne = Bez agregacije; Da = Agregacija je primećena u boci za recirkulaciju
[0388] [0180] Dodatne studije recirkulacije sprovedene su korišćenjem formulacija PCV15<Vod/Ne-vod>i PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>sa do 500 µg/mL (tež/v Al<+3>) APA i sa P188 ili PS-20. Nakon 24 sata recirkulacije uz konstantno mešanje, formulacije su sipane u špriceve i horizontalno mešane do 24 sata. Formulacije su pregledane, a rezime vizuelne procene špriceva prikazan je u Tabeli 5. Ovi rezultati ukazuju da PS-20 pruža robusno rešenje za fizičku nestabilnost ili agregaciju koja se može javiti tokom rutinske proizvodnje, transporta i rukovanja. P188 nije bio u stanju da obezbedi adekvatan profil stabilnosti za ovu formulaciju PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>uprkos svom uspehu u stabilizaciji formulacija PCV15<Vod>(Slike 7-9).
[0390] Tabela 5: Vizuelna procena PCV15 formulacija sa 0,1% tež/v PS-20 ili 0,2% tež/v P188 nakon 24 sata mešanja i recirkulacije i do 24 sata horizontalne rotacije u HyPak špricevima od 1,5 mL Vreme horizontalne rotacije nakon 24 sata recirkulacije
[0393]
[0395] <DTFB>sa 0,2% tež/v
[0396] agregati agregati agregati agregati agregati potpuno P188
[0397] istaloženi PCV15<Vod/Ne-vod/ST3->
[0398] Bez<DTFB>sa 0,1% tež/v
[0399] agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije PS-20
[0400] PCV15<Vod/Ne-vod>sa
Bez
Bez
Bez
Bez
Bez
Bez 0,1% tež/v PS-20 agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije
[0401]
Bez 0,2% tež/v PS-20 agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije agregacije
[0403] [0181] Dodatna studija je sprovedena na formulaciji PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>gde je ST18C pripremljen korišćenjem reduktivne aminacije u DMSO (PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB/ST18C-Ne-vod)>. Formulacija PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB/ST18C-Ne-vod>je pripremljena u 20 mM L-histidinu, pH 5,8, 150 mM NaCl, sa 64 µg/mL ukupnog polisaharida, 250 µg/mL APA i 0,2% tež/v PS-20. Nakon što je formulacija PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB/ST18C-Ne-vod>recirkulisana do 6 sati uz konstantno mešanje, formulacija je sipana u špriceve i horizontalno mešana do 24 sata. Formulacija je pregledana, a rezime vizuelne procene špriceva prikazan je u Tabeli 6. Ovi rezultati ukazuju da PS-20 pruža robusno rešenje za fizičku nestabilnost ili agregaciju koja se može javiti tokom rutinske proizvodnje, transporta i rukovanja, sa formulacijom koja sadrži PCV15 formulaciju pripremljenu u 20 mM L-histidinu, pH 5,8, 150 mM NaCl, sa 250 µg/mL APA i 0,2% tež/v PS-20 i koja sadrži pneumokokne polisaharidne konjugate serotipova 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F i 23F pripremljene reduktivnom aminacijom u DMSO i konjugate serotipova 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F i 33F pripremljene reduktivnom aminacijom u vodenom rastvoru, gde su svi polisaharidi konjugovani sa CRM<197>.
[0405] Tabela 6: Vizuelna procena PCV15 formulacija sa 0,2% tež/v PS-20 nakon 24 sata mešanja i recirkulacije i do 24 sata horizontalne rotacije u HyPak špricevima od 1,5 mL
[0407]
[0409] Kao što je prikazano na Slici 10 i u Tabelama 4-5, sam P188 je pružio minimalnu korist u sprečavanju agregacije PCV15 formulacija na bazi suspenzije, sastavljenih od konjugata generisanih reduktivnom aminacijom u DMSO i/ili ST3-DTFB konjugatu. Dodatne studije mešanja i horizontalne rotacije sprovedene su sa formulacijama koje sadrže 0,2% tež/v P188 i stabilizatore PEG<400>(PEG) ili propilen glikol (PG). Formulacije PCV15<Vod/Ne-vod/ST3-DTFB>su pripremljene u razmeri od 500 mL kao što je opisano u Primeru 7. PEG<400>ili PG su dodati u APA, a zatim su dodati konjugati. Konačna koncentracija PEG<400>ili PG bila je između 0% tež/v do 15% tež/v u formulaciji koja sadrži 64 µg PnPs/mL, 250 µg/mL APA i 0,2% tež/v P188. Formulacije su kontinuirano mešane 1 sat magnetnom mešalicom i sipane su u špriceve. Špricevi su horizontalno mešani do 24 sata. Formulacije su periodično uzorkovane radi vizuelne procene i merenja raspodele veličine čestica pomoću SLS. Rezultati vizuelne procene špriceva prikazani su u Tabelama 7-8. Rezultati raspodele veličine čestica prikazani su na Slici 13. Kada je dodat sam, P188 nije kontrolisao agregaciju u formulaciji. Iznenađujuće, PEG<400>ili PG su obezbedili adekvatnu stabilnost kada su kombinovani sa P188.
[0411] Tabela 7: Vizuelna procena PCV15 formulacija sa 0,2% tež/v P188 i različitim koncentracijama PEG<400>nakon 1 sata mešanja i do 24 sata horizontalne rotacije u HyPak špricevima od 1,5 mL
[0412]
[0414] Tabela 8: Vizuelna procena PCV15 formulacija sa 0,2% tež/v P188 i različitim koncentracijama PG nakon 1 sata mešanja i do 24 sata horizontalne rotacije u 1,5 mL HyPak špricevima
[0415]
[0416]
[0418] Primer 12: Imunogenost stabilizacionih formulacija pneumokokne konjugovane vakcine (uporedni primer)
[0420] Procenjen je uticaj formulacija koje sadrže PCV15, a koje su optimizovane za kontrolu nestabilnosti izazvane proizvodnjom i isporukom, na imunogenost mladunaca rezus majmuna. Osam životinja po grupi primilo je intramuskularnu injekciju sa 0,1 mLPCV15<Vod/Ne-vod/ST3->
[0421] <DTFB>formulacije koja sadrži 64 µg PnPs/mL, 20 mM L-histidina, pH 5,8, 150 mM natrijum hlorida, 250 µg/mL APA i ili 0,2% tež/v P188, 15% tež/v PG ili 0,1% tež/v PS-20 kao što je opisano u Primeru 11. Injekcije su date u uzrastu T=0 (Doza 1), 1 mesec (Doza 2) i 2 meseca (Doza 3). Serum je sakupljen pre prve doze i 2 nedelje nakon prve, druge i treće doze. Nivoi serumskog IgG iz uzoraka seruma pre imunizacije, posle prve doze, posle druge doze i posle treće doze određeni su kao što je gore opisano u Primeru 10. Rezultati prikazani na Slici 14 ukazuju da su PCV15 formulacije sa PS-20 ili kombinacijom P188 i PG bile imunogene.
[0423] PRIMER 13: Uticaj polisorbata 20 i polisorbata 80 na stabilizaciju leka u obliku pneumokokne konjugatne vakcine pripremljene korišćenjem različitih smeša konjugata generisanih reduktivnom aminacijom u protičnim (vodenim) i aprotičnim (DMSO) rastvorima
[0425] [0184] Obećavajući rezultati primećeni sa PCV15 formulacijama u gore navedenim primerima opravdali su istraživanje donje i gornje granice odnosa nivoa proteina u glikokonjugatima napravljenim u DMSO u odnosu na vodene uslove. Višestruke polivalentne PCV formulacije sa različitim odnosima glikokonjugata sadržale su pneumokokne konjugate polisaharida-CRM<197>generisane reduktivnom aminacijom u vodenom rastvoru ili u DMSO. Svaka formulacija je normalizovana na količinu proteina i sadržala je ukupnu koncentraciju polisaharida (Ps) od 64 µg/mL (tež/v Ps) sa 250 µg/mL APA u 20 mM L-histidinu, pH 5,8, 150 mM NaCl. U svaku formulaciju je dodat PS-80 ili PS-20 da bi se postigla konačna koncentracija PS-80 (0,05% tež/v) ili PS-20 (0,05% tež/v) ili PS-20 (0,2% tež/v). Formulacije su isporučene u BD HyPAK prethodno napunjene špriceve i procenjene korišćenjem simuliranih studija isporuke u laboratorijskim razmerama kako bi se osigurala robusna proizvodna i komercijalno održiva formulacija vakcine.
[0426] Da bi se postigao željeni raspon procenata glikokonjugata pripremljenih korišćenjem DMSO, pripremljene su sledeće formulacije gde su svi polisaharidi konjugovani sa CRM<197>korišćenjem reduktivne aminacije:
[0428] Formulacija PCV<24%>sadržala je konjugate serotipova 6A, 6B i 23F pripremljene u DMSO, i konjugate serotipova 1, 3, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F i 33F pripremljene u vodenom rastvoru. Ukupan protein u ovoj formulaciji bio je 56 µg/mL sa 13 µg/mL ili ~24% ukupnog proteina koji se sastojao od CRM<197>konjugovanog sa polisaharidom korišćenjem reduktivne aminacije u DMSO.
[0429] Formulacija PCV<50%>sadržala je konjugate serotipova 6A, 6B, 7F, 19A, 19F i 23F pripremljene u DMSO, i konjugate serotipova 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 18C, 22F i 33F pripremljene u vodenom rastvoru. Ukupan protein u ovoj formulaciji bio je 62 µg/mL, sa 31 µg/mL ili 50% ukupnog proteina koji se sastojao od CRM<197>konjugovanog sa polisaharidom korišćenjem reduktivne aminacije u DMSO.
[0430] Formulacija PCV<62%>sadržala je konjugate serotipova 6A, 6B, 7F, 19A, 19F i 23F pripremljene u DMSO, i konjugate serotipova 1, 5, 9V, 14, 18C, 22F i 33F pripremljene u vodenom rastvoru. Ukupan protein u ovoj formulaciji bio je 61 µg/ml, sa 38 µg/ml ili ~62% ukupnog proteina koji se sastojao od CRM<197>konjugovanog sa polisaharidom korišćenjem reduktivne aminacije u DMSO.
[0431] Formulacija PCV<79%>sadržala je konjugate serotipova 6A, 6B, 7F, 19A, 19F i 23F pripremljene u DMSO, i konjugate serotipova 1, 5, 18C i 33F pripremljene u vodenom rastvoru. Ukupan protein u ovoj formulaciji bio je 63 µg/ml, sa 50 µg/ml ili ~79% ukupnog proteina koji se sastojao od CRM<197>konjugovanog sa polisaharidom korišćenjem reduktivne aminacije u DMSO.
[0432] Formulacija PCV<100%>sadržala je konjugate serotipova 6A, 6B, 7F, 19A, 19F i 23F pripremljene korišćenjem reduktivne aminacije u DMSO. Ukupni protein u ovoj formulaciji bio je 65 µg/ml, pri čemu je 65 µg/ml ili 100% ukupnog proteina se sastojalo od CRM<197>konjugovanog sa polisaharidom u DMSO.
[0434] Studija horizontalne agitacije korišćena je za procenu uticaja na stabilnost proizvoda odnosa proteina konjugovanog sa polisaharidom u DMSO prema ukupnom proteinu. Studija predstavlja direktno mešanje formulacija kroz interakcije sa površinama u sistemu zatvaranja posude (špric ili bočica) i izlaganje formulacije konačnim komponentama posude i vazdušnom interfejsu. Formulacije su sipane u špriceve od 0,64 ml i zatvorene. Ovi špricevi su horizontalno rotirani na 2-8°C do 24 sata. Uticaj vremena pod horizontalnim mešanjem procenjen je na raspodelu veličine čestica korišćenjem statičkog rasejanja svetlosti (SLS). Veličina i raspodela čestica procenjene su korišćenjem Malvern Mastesizer 2000. Korišćen je NIST standard veličine čestica od 5 µm i dao je očekivanu raspodelu veličine. Kao što je prikazano na Slikama 15A-E, PS-80 nije bio efikasan stabilizator za kontrolu agregacije za sve lekove koji sadrže PCV (PCV<24%>do PCV<100%).>Povećanje raspodele veličine čestica i vidljivi znaci aglomeracije (pojava čestica) i agregacije primećeni su za sve formulacije sa PS-80.
[0435] Iznenađujuće, PS-20 u koncentraciji uporedivoj sa onom koja je korišćena za PS-80 pružio je poboljšani profil stabilnosti u opsegu testiranih procenata DMSO konjugata. Dodavanje PS-20 da bi se postigla koncentracija od 0,2% PS-20 u puferu za formulaciju rezultiralo je superiornom stabilnošću u poređenju sa 0,05% PS-20 u opsegu testiranih procenata DMSO konjugata. Primer 14: Imunogenost stabilizujućih formulacija pneumokokne konjugovane vakcine kod novozelandskih belih zečeva (uporedni primer)
[0436] Procenjen je uticaj formulacija koje sadrže PCV15, a koje su optimizovane za kontrolu nestabilnosti izazvane proizvodnjom i transportom, na imunogenost novozelandskog belog zeca. Osam životinja po grupi primilo je intramuskularnu injekciju sa 0,1 mL PCV15<Vod/Ne-vod>formulacije koja sadrži 64 mg PnPs/mL, 20 mM L-histidina, pH 5,8, 150 mM natrijum hlorida, 250 µg/mL APA i 0,2% tež/v PS-20 kao što je opisano u Primeru 11. Injekcije su date 0. i 14. dana. Serum je sakupljen pre vakcinacije 0. i 14. dana, a takođe i 28. dana. Nivoi serumskog IgG iz uzoraka seruma pre imunizacije, posle prve doze i posle druge doze određeni su ECL analizom.
[0437] [0189] Rezultati prikazani na Slici 16 ukazuju da je imunogena formulacija 15-valentnog pneumokoknog konjugata u 20 mM histidinu pH 5,8, 150 mM NaCl, 250 µg/mL APA, 0,2% tež/v PS-20 koja sadrži polisaharide S. pneumoniae iz serotipova 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F i 23F konjugovane sa CRM<197>korišćenjem reduktivne aminacije u DMSO i polisaharide S. pneumoniae iz serotipova 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F i 33F konjugovane sa CRM<197>korišćenjem reduktivne aminacije u vodenom rastvoru formulisanom kao dozni oblik koji sadrži 4 µg/mL svakog saharida, osim za 6B sa 8 µg/mL; i oko 64 µg/mL nosačkog proteina CRM197.

Claims (1)

1. Patentni zahtevi
1. Formulacija koja sadrži 15-valentnu pneumokoknu konjugovanu kompoziciju, koja se u suštini sastoji od S. pneumoniae polisaharida iz serotipova 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23 F i 33F konjugovanog sa CRM<197>; 20 mM histidina pH 5,8; 150 mM NaCl; 250 µg/mL adjuvansa aluminijum fosfata (APA) i 0,2% tež/v polisorbata 20; formulisana kao dozni oblik koji sadrži 4 µg/mL svakog saharida, osim za 6B sa 8 µg/mL; i 64 µg/ml CRM<197>proteinskog nosača; pri čemu se konjugati polisaharida i proteina iz serotipova 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F, i 23F pripremaju pod DMSO uslovima, a konjugati polisaharida i proteina iz serotipova 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F, i 33F se pripremaju korišćenjem vodenih uslova.
RS20251318A 2017-02-24 2018-02-20 Formulacije pneumokoknih konjugovanih vakcina RS67586B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762463220P 2017-02-24 2017-02-24
EP18756694.8A EP3585803B1 (en) 2017-02-24 2018-02-20 Pneumococcal conjugate vaccine formulations
PCT/US2018/018659 WO2018156468A1 (en) 2017-02-24 2018-02-20 Pneumococcal conjugate vaccine formulations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67586B1 true RS67586B1 (sr) 2026-01-30

Family

ID=63253028

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20251318A RS67586B1 (sr) 2017-02-24 2018-02-20 Formulacije pneumokoknih konjugovanih vakcina

Country Status (19)

Country Link
US (3) US20200054740A1 (sr)
EP (2) EP3585803B1 (sr)
JP (3) JP7254707B2 (sr)
KR (1) KR102701633B1 (sr)
CN (1) CN110392690B (sr)
AU (1) AU2018225083B2 (sr)
BR (1) BR112019017390A2 (sr)
CA (1) CA3049985A1 (sr)
DK (1) DK3585803T3 (sr)
ES (1) ES3055681T3 (sr)
FI (1) FI3585803T3 (sr)
HR (1) HRP20251619T1 (sr)
LT (1) LT3585803T (sr)
MX (1) MX2019009869A (sr)
PL (1) PL3585803T3 (sr)
PT (1) PT3585803T (sr)
RS (1) RS67586B1 (sr)
SI (1) SI3585803T1 (sr)
WO (1) WO2018156468A1 (sr)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108367063A (zh) * 2015-07-21 2018-08-03 辉瑞公司 包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其试剂盒和用途
ES3024474T3 (en) 2016-12-30 2025-06-04 Vaxcyte Inc Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
ES3048958T3 (en) 2017-01-31 2025-12-12 Merck Sharp & Dohme Llc Methods for production of capsular polysaccharide protein conjugates from streptococcus pneumoniae serotype 19f
CN110225764A (zh) 2017-01-31 2019-09-10 默沙东公司 制备多糖-蛋白缀合物的方法
CA3050120A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Enhancing immunogenicity of streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates
US11400162B2 (en) 2017-02-24 2022-08-02 Merck Sharp & Dohme Llc Processes for the formulation of pneumococcal polysaccharides for conjugation to a carrier protein
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
EP3678655A4 (en) 2017-09-07 2021-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. PNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDES AND THEIR USE IN IMMUNOGENIC POLYSACCHARIDE CARRIER PROTEIN CONJUGATES
WO2019050813A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTI-PNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDES AND THEIR USE IN IMMUNOGENIC CONJUGATES POLYSACCHARIDE-PROTEIN CARRIER
CN111065387B (zh) 2017-09-07 2023-08-25 默沙东有限责任公司 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途
US11524076B2 (en) 2017-09-07 2022-12-13 Merck Sharp & Dohme Llc Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
AU2018328040B2 (en) 2017-09-07 2025-01-16 Merck Sharp & Dohme Llc Processes for the formulation of pneumococcal polysaccharides for conjugation to a carrier protein
TWI725359B (zh) 2017-12-06 2021-04-21 美商默沙東藥廠 包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白結合物之組合物及其使用方法
US12144855B2 (en) 2018-04-30 2024-11-19 Merck Sharp & Dohme Llc Methods for producing streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide carrier protein conjugates from lyospheres
JP7397000B2 (ja) 2018-04-30 2023-12-12 メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー 凍結乾燥変異ジフテリア毒素のジメチルスルホキシド中均一溶液を提供する方法
EP3787673A4 (en) 2018-04-30 2022-04-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for producing streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide carrier protein conjugates
GEAP202415690A (en) 2018-12-19 2024-01-10 Merck Sharp & Dohme Llc Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
CN115960962A (zh) * 2021-10-09 2023-04-14 江苏金斯瑞蓬勃生物科技有限公司 一种用于加强慢病毒载体稳定性的保护剂及其用途
AU2022391752A1 (en) * 2021-11-18 2024-06-13 Matrivax, Inc. Immunogenic fusion protein compositions and methods of use thereof

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3740421A (en) 1966-09-19 1973-06-19 Basf Wyandotte Corp Polyoxyethylene-polyoxypropylene aqueous gels
DE3071552D1 (en) 1979-09-21 1986-05-22 Hitachi Ltd Semiconductor switch
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4902506A (en) 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
US4950740A (en) 1987-03-17 1990-08-21 Cetus Corporation Recombinant diphtheria vaccines
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
EP0378881B1 (en) 1989-01-17 1993-06-09 ENIRICERCHE S.p.A. Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
WO1991001146A1 (en) 1989-07-14 1991-02-07 Praxis Biologics, Inc. Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
IL98715A0 (en) 1990-08-13 1992-07-15 American Cyanamid Co Filamentous hemaglutinin of bodetella pertussis as a carrier molecule for conjugate vaccines
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
AU685047B2 (en) 1992-02-11 1998-01-15 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Dual carrier immunogenic construct
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
EP0643559B1 (en) 1992-05-06 1999-04-14 The President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin receptor-binding region
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
DK0616034T3 (da) 1993-03-05 2005-02-21 Wyeth Corp Plasmid til fremstilling af CRM-protein og diphtheria toxin
NZ274376A (en) 1993-09-22 1997-11-24 Jackson H M Found Military Med Activating soluble carbohydrate using cyanylating reagents for the production of immunogenic constructs
US6455673B1 (en) 1994-06-08 2002-09-24 President And Fellows Of Harvard College Multi-mutant diphtheria toxin vaccines
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
NZ304715A (en) 1995-03-22 1999-07-29 Jackson H M Found Military Med Production of immunogenic constructs using organic cyanylating reagents to activate carbohydrates and then coupling the carbohydrate to a protein, peptide or hapten
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
US6146902A (en) 1998-12-29 2000-11-14 Aventis Pasteur, Inc. Purification of polysaccharide-protein conjugate vaccines by ultrafiltration with ammonium sulfate solutions
WO2000061761A2 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Techlab, Inc. Recombinant clostridium toxin a protein carrier for polysaccharide conjugate vaccines
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
AU2001270381B2 (en) 2000-06-20 2007-05-24 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
ES2359625T3 (es) 2000-12-28 2011-05-25 Wyeth Llc Proteina protectora recombinante de.
WO2002083855A2 (en) 2001-04-16 2002-10-24 Wyeth Holdings Corporation Novel streptococcus pneumoniae open reading frames encoding polypeptide antigens and uses thereof
AU2002309706A1 (en) 2001-05-11 2002-11-25 Aventis Pasteur, Inc. Novel meningitis conjugate vaccine
EP1456231A2 (en) 2001-12-20 2004-09-15 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
KR101052996B1 (ko) 2003-03-13 2011-07-29 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 박테리아 세포용해소에 대한 정제 공정
US20060251675A1 (en) 2003-03-17 2006-11-09 Michael Hagen Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
CN1320924C (zh) * 2005-01-07 2007-06-13 邢为藩 一种自乳化疫苗佐剂及其制备方法
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CA2604363C (en) 2005-04-08 2015-06-16 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
PL1973564T3 (pl) 2005-12-22 2017-04-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Szczepionki zawierające koniugaty polisacharydu otoczkowego streptococcus pneumoniae
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
PT2129693T (pt) 2007-03-23 2017-02-14 Wyeth Llc Processo de purificação abreviado para a produção de polissacáridos capsulares de streptococcus pneumoniae
SI2167121T1 (sl) 2007-06-26 2015-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Cepivo, ki obsega kapsularne polisaharidne konjugate Streptococcusa pneumoniae
CN101590224A (zh) 2009-06-30 2009-12-02 广州精达医学科技有限公司 高效14价肺炎球菌结合疫苗
TW201136603A (en) 2010-02-09 2011-11-01 Merck Sharp & Amp Dohme Corp 15-valent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine composition
AR084158A1 (es) * 2010-12-10 2013-04-24 Merck Sharp & Dohme Formulaciones que mitigan la agregacion inducida por agitacion de composiciones inmunogenicas
GB201103836D0 (en) * 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
WO2012173876A1 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods of purification of native or mutant forms of diphtheria toxin
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
JP6494527B2 (ja) * 2013-02-07 2019-04-03 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 肺炎球菌のコロニー形成および／または疾患からの保護を提供するタンパク質抗原
IL312327B2 (en) 2014-01-21 2026-02-01 Pfizer Immunogenic preparations comprising conjugated capsular saccharide antigens and their uses
CN120718167A (zh) * 2014-01-21 2025-09-30 辉瑞大药厂 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物
PE20220774A1 (es) * 2015-05-04 2022-05-16 Pfizer Conjugados proteina-polisacarido de estreptococo grupo b, metodos para producir conjugados, composiciones inmunogenas que comprenden conjugados y sus usos
PE20180460A1 (es) * 2015-06-08 2018-03-06 Serum Inst Of India Private Ltd Metodos para mejorar la adsorcion de conjugados de polisacarido-proteina y una formulacion de vacuna multivalente obtenida con los mismos

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018225083B2 (en) 2023-06-01
JP2020509002A (ja) 2020-03-26
US20230201338A1 (en) 2023-06-29
ES3055681T3 (en) 2026-02-13
PL3585803T3 (pl) 2026-02-16
RU2019129502A3 (sr) 2021-07-07
WO2018156468A1 (en) 2018-08-30
AU2018225083A1 (en) 2019-07-25
JP7771122B2 (ja) 2025-11-17
EP3585803B1 (en) 2025-09-24
JP2025131718A (ja) 2025-09-09
CA3049985A1 (en) 2018-08-30
US12280107B2 (en) 2025-04-22
PT3585803T (pt) 2025-12-22
BR112019017390A2 (pt) 2020-03-31
KR20190119108A (ko) 2019-10-21
DK3585803T3 (da) 2025-12-15
CN110392690A (zh) 2019-10-29
CN110392690B (zh) 2024-01-30
US20200054740A1 (en) 2020-02-20
RU2019129502A (ru) 2021-03-24
FI3585803T3 (fi) 2025-12-19
EP3585803A1 (en) 2020-01-01
EP3585803A4 (en) 2020-11-11
KR102701633B1 (ko) 2024-09-02
JP7254707B2 (ja) 2023-04-10
EP4656650A3 (en) 2026-02-18
MX2019009869A (es) 2019-10-02
JP2023082099A (ja) 2023-06-13
EP4656650A2 (en) 2025-12-03
SI3585803T1 (sl) 2026-02-27
LT3585803T (lt) 2026-01-12
US20220031837A1 (en) 2022-02-03
HRP20251619T1 (hr) 2026-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12280107B2 (en) Pneumococcal conjugate vaccine formulations
US11219680B2 (en) Polysaccharide-protein conjugates utilizing diphtheria toxin fragment B as a carrier
JP7369123B2 (ja) 肺炎球菌多糖類－タンパク質コンジュゲートを含む組成物およびその使用方法
AU2018225099B2 (en) Enhancing immunogenicity of Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates
US20220105169A1 (en) Pneumococcal conjugate vaccine formulations
JP2020533439A (ja) 肺炎球菌多糖体および免疫原性多糖体−キャリアタンパク質コンジュゲートでのその使用
JP2020533299A (ja) キャリアタンパク質へのコンジュゲーションのための肺炎球菌多糖の製剤方法
KR20220017996A (ko) 면역원성 혈청형 35b 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체 및 그를 제조하기 위한 접합 방법
KR20220016964A (ko) 에스. 뉴모니아에 혈청형 29에 대해 보호하는 면역원성 조성물을 사용하여 환자를 치료하는 방법
RU2789546C2 (ru) Состав пневмококковой конъюгатной вакцины
RU2774891C2 (ru) Повышение иммуногенности конъюгатов полисахарид streptococcus pneumoniae-белок