ES3057335T3

ES3057335T3 - Mesothelin chimeric antigen receptor (car) and antibody against pd-l1 inhibitor for combined use in anticancer therapy

Info

Publication number: ES3057335T3
Application number: ES16825970T
Authority: ES
Inventors: Jennifer Brogdon; Hwai Chang; Boris Engels; Gordon Freeman; Gerhard Frey; Jennifer Mataraza; Reshma Singh; Arlene Sharpe
Original assignee: Novartis AG; Dana Farber Cancer Institute Inc; University of Pennsylvania Penn; Harvard University
Current assignee: Novartis AG; Dana Farber Cancer Institute Inc; University of Pennsylvania Penn; Harvard University
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2016-12-21
Publication date: 2026-02-27
Anticipated expiration: 2036-12-21
Also published as: JP7524249B2; US20250319179A1; US20190000944A1; JP2022119900A; WO2017112741A1; EP3393504B1; US12186278B2; JP7082055B2; MA44140A; CN109069597A; EP4643874A2; PT3393504T; US11413340B2; US20230000964A1; EP3393504A1; JP2018538339A; EP4643874A3

Abstract

Se proporcionan composiciones para su uso en métodos para tratar enfermedades asociadas con la expresión de mesotelina que comprenden la administración de una célula que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para mesotelina en combinación con un inhibidor de PD-L1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Receptor de antígeno quimérico de mesotelina (car) y anticuerpo contra inhibidor PD-L1 para uso combinado en terapia anticancerosa

[0003] Aplicaciones relacionadas

[0004] La presente solicitud reivindica prioridad con respecto a Serial de EE.UU No.62/270780 presentada el 22 de Diciembre de 2015.

[0005] Listado de secuencias

[0006] La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que ha sido presentado electrónicamente en formato ASCII.

[0007] Campo de la invención

[0008] La presente invención se refiere en general a células T o NK modificadas genéticamente para expresar un Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) que se direcciona a la mesotelina en combinación con inhibidores de PD-L1 para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de mesotelina.

[0009] Antecedentes de la invención

[0010] La mesotelina fue identificada originalmente por Pastan y colegas como un antígeno asociado a tumores debido a su expresión limitada por tejidos normales y su sobreexpresión en tumores. Chang K, et al., Cancer Res.

[0011] 1992;52(1):181-186 y Chang K, et al. ProcNatlAcadSciUSA. 1996;93(1):136-140. El gen de la mesotelina codifica una proteína precursora de 71 kDa que se procesa para producir la proteína de 40 kDa, la mesotelina, que se ancla a la membrana celular mediante un enlace de glucosilfosfatidilinositol (GPI) y un fragmento desprendido aminoterminal de 31 kDa, denominado factor potenciador de megacariocitos (MPF). Ambos fragmentos contienen sitios de N-glicosilación. Se ha encontrado en los sueros de pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) una variante de empalme soluble del fragmento carboxilo-terminal de 40 kDa denominada "mesotelina soluble/MPF-relacionada". Johnston, F, et al. Investigación Clínica del Cáncer. 2009;15(21):6511.La mesotelina se está explorando actualmente como objetivo terapéutico y como biomarcador de la actividad de la enfermedad y de la respuesta terapéutica. Argani P, et al. Clin Cancer Res.

[0012] 2001;7(12):3862-3868.

[0013] La mesotelina es un antígeno de diferenciación que también está presente en tejidos normales. Utilizando el anticuerpo de ratón anti-mesotelina humana K1 que fue desarrollado por el grupo de Pastan, se ha demostrado una fuerte reactividad K1 en las células mesoteliales que recubren las cavidades peritoneal, pleural y pericárdica, aunque a niveles más bajos a los observados habitualmente en los tejidos malignos. Chang K, et al., Cancer Res.1992;52(1):181-186. Se ha detectado una reactividad K1 débil en el epitelio de las trompas de Falopio, el epitelio basal traqueal y el epitelio de las amígdalas. También se ha encontrado mesotelina en todas las capas de la córnea. Jirsova K, et al. Investigación ocular experimental.2010;91(5):623-629. Sin embargo, no se ha detectado reactividad K1 en la mayoría de los tejidos normales, incluyendo el hígado, los riñones, el bazo, la médula ósea, los ganglios linfáticos, el timo, el músculo cardíaco, la lengua, el músculo esquelético, la piel, la corteza cerebral, el cerebelo, la médula espinal, el nervio periférico, la hipófisis, la glándula suprarrenal, la glándula salival, la glándula mamaria, la tiroides, la paratiroides, los testículos, la próstata, el epidídimo, el epitelio cervical, el parénquima pulmonar, el esófago, el epitelio del intestino delgado, el epitelio del colon, el epitelio de la vejiga, el epitelio de la vesícula biliar. Chang K, et al., Cancer Res.1992;52(1):181-186.

[0014] La mesotelina se sobreexpresa en la gran mayoría de los adenocarcinomas pancreáticos primarios, observándose una expresión rara y débil en el tejido pancreático benigno. Argani P, et al. Clin Cancer Res.

[0015] 2001;7(12):3862-3868. El mesotelioma pleural maligno epitelial (MPM) expresa universalmente mesotelina, mientras que el MPM sarcomatoide no expresa mesotelina. La mayoría de los carcinomas ováricos epiteliales serosos, y los carcinomas peritoneales primarios relacionados, expresan mesotelina.

[0016] La mesotelina es un objetivo de una respuesta inmunitaria natural en el cáncer de ovario, y se ha propuesto que sea un objetivo para la inmunoterapia del cáncer. Bracci L, et al. Clin Cancer Res. 2007;13(2 Pt 1):644-653; Moschella F, et al. Cancer Res.2011;71(10):3528-3539; Gross G, et al. FASEB J.1992;6(15):3370-3378; Sadelain M, et al. NatRevCancer.2003;3(1):35-45; Muul LM, et al. Blood.2003;101(7):2563-2569; Yee C, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(25):16168-16173. La presencia de CTL específicos de mesotelina en pacientes con cáncer de páncreas se correlaciona con la supervivencia global. Thomas AM, et al. J Exp Med.

[0017] 2004;200:297-306. Además, Pastan y colaboradores han utilizado fragmentos solubles de anticuerpo de un anticuerpo anti-mesotelina conjugado con inmunotoxinas para tratar a pacientes con cáncer con tumores positivos para mesotelina. Este enfoque ha demostrado una seguridad adecuada y cierta actividad clínica en el cáncer de páncreas. Hassan R, et al. Cancer Immun. 2007;7:20 y Hassan R, et al. Clin Cancer Res.

[0018] 2007;13(17):5144-5149. En el cáncer de ovario, esta estrategia terapéutica produjo una respuesta menor según los criterios RECIST y una enfermedad estable en una segunda paciente que también presentó una resolución completa de su ascitis.

[0019] Morello, et al. (Cancer Discovery, 2015: doi: 10.1158/2159-8290.cd-15-0583, páginas OF1-OF15 o 2016: 6(2), páginas133-146) es una revisión relacionada con los CAR direccionados a la mesotelina y describe el uso de la terapia CAR-T de mesotelina y de anticuerpos monoclonales contra PD-L1 como terapia combinada contra el cáncer. Tanyi, et al. (Cander Research, 2015: 75 (15) Suppl., página CT105)reporta los resultados de un estudio sobre seguridad y viabilidad de células T modificadas con receptores de antígeno quimérico dirigidas contra la mesotelina en pacientes con cánceres que expresan mesotelina.

[0020] Resumen de la invención

[0021] Los aspectos de la invención para los que se solicita protección se definen en el conjunto de reivindicaciones adjunto. La descripción puede contener información técnica adicional que, aunque no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona para situar la invención en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Las referencias en el presente documento a procedimientos de tratamiento del cuerpo humano o animal deben entenderse como referencias a medicamentos para su uso en un procedimiento de tratamiento. La presente divulgación presenta, al menos en parte, procedimientos y composiciones para tratar una enfermedad asociada con la expresión de mesotelina, por ejemplo, un cáncer, en un sujeto mediante el uso de una terapia combinada que incluye una célula, por ejemplo, una célula efectora inmunitaria, que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une específicamente a la mesotelina (también denominada en el presente documento como "célula que expresa CAR de mesotelina ") y un inhibidor del Ligando de Muerte Programada 1 (también denominado en el presente documento como "inhibidor de PD-L1"). En algunas realizaciones, el CAR que se une específicamente a la mesotelina incluye un dominio de unión al antígeno, por ejemplo, un dominio de unión a la mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el inhibidor de PD-L1 es una molécula de anticuerpo, un polipéptido, una molécula pequeña o un polinucleótido, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor. En una realización, el inhibidor de PD-L1 es una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento. Sin querer estar ligado a la teoría, se cree que el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad asociada con la expresión de mesotelina, por ejemplo, un cáncer descrito en el presente documento, con una terapia combinada que incluye una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1 resulta en una mejor inhibición o reducción de la progresión tumoral en el sujeto, por ejemplo, en comparación con el tratamiento de un sujeto que tiene la enfermedad con una célula que expresa CAR de mesotelina o un inhibidor de PD-L1 solo.

[0022] Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para tratar un sujeto que tiene una enfermedad asociada con la expresión de mesotelina por ejemplo, un cáncer como se describe en el presente documento. El procedimiento incluye administrar al sujeto una célula, por ejemplo, una población de células, que comprende, por ejemplo, expresar un CAR que se une específicamente a la mesotelina, y un inhibidor de PD-L1. En una realización, la célula que expresa CAR y el inhibidor de PD-L1 se administran secuencialmente. En una realización, el inhibidor de PD-L1 se administra antes de la administración de la célula que expresa CAR de mesotelina. En una realización, el inhibidor de PD-L1 se administra después de la administración de la célula que expresa CAR de mesotelina. En una realización, el inhibidor de PD-L1 y la célula que expresa CAR de mesotelina se administran simultáneamente o de forma concurrente.

[0023] En realizaciones, la célula que expresa CAR, por ejemplo, la célula que expresa CAR de mesotelina descrita en el presente documento, y el inhibidor de PD-L1 se administran en un intervalo de tratamiento. En una realización, el intervalo de tratamiento comprende una dosis única del inhibidor de PD-L1 y una dosis única de la célula que expresa CAR. En otra realización, el intervalo de tratamiento comprende una primera y una segunda dosis del inhibidor de PD-L1 y una dosis de la célula que expresa CAR.

[0024] En realizaciones en las que el intervalo de tratamiento comprende una dosis única del inhibidor de PD-L1 y una dosis única de la célula que expresa CAR, la dosis del inhibidor de PD-L1 se administra antes de la dosis de la célula que expresa CAR, y el intervalo de tratamiento se inicia tras la administración de la dosis del inhibidor de PD-L1 y se completa tras la administración de la dosis de la célula que expresa CAR. En una realización, el intervalo de tratamiento comprende además una o más, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5 o más, dosis posteriores del inhibidor de PD-L1. En tales realizaciones, el intervalo de tratamiento comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis o más dosis del inhibidor de PD-L1 y una dosis de la célula que expresa CAR. En una realización, la dosis de la célula que expresa CAR se administra al menos 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días o 2 semanas después de administrar una dosis de inhibidor de PD-L1. En las realizaciones en las que se administra más de una dosis de inhibidor de PD-L1, la dosis de la célula que expresa CAR se administra al menos 2 días, 3 días, 4 días, 5, días, 6 días, 7 días o 2 semanas después de la administración de la primera dosis de inhibidor de PD-L1 o después del inicio del intervalo de tratamiento. En una realización, la dosis de la célula que expresa CAR se administra aproximadamente 2 días después de la administración de la dosis del inhibidor de PD-L1. En realizaciones en las que el intervalo de tratamiento comprende una primera y segunda dosis de un inhibidor de PD-L1 y una dosis de una célula que expresa CAR, la dosis de la célula que expresa CAR se administra después de la administración de la primera dosis del inhibidor de PD-L1 pero antes de la administración de la segunda dosis del inhibidor de PD-L1. En tales realizaciones, el intervalo de tratamiento se inicia tras la administración de la primera dosis del inhibidor de PD-L1 y se completa tras la administración de la segunda dosis del inhibidor de PD-L1. En una realización, la segunda dosis del inhibidor de PD-L1 se administra al menos 5 días, 7 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas después de la administración de la primera dosis del inhibidor de PD-L1. En una realización, la dosis de la célula que expresa CAR se administra al menos 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días o 2 semanas después de la administración de la primera dosis del inhibidor de PD-L1. En una realización, la segunda dosis del inhibidor de PD-L1 se administra al menos 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas o 3 semanas después de la administración de la dosis de la célula que expresa CAR.

[0025] En una realización, cualquiera de los intervalos de tratamiento descritos en el presente documento puede repetirse una o más veces, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 veces más. En una realización, el intervalo de tratamiento se repite una vez, resultando en un régimen de tratamiento que comprende dos intervalos de tratamiento. En una realización, el intervalo de tratamiento repetido se administra al menos 1 día, por ejemplo, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días o 2 semanas, después de la finalización del primer intervalo de tratamiento o del anterior. En una realización, el intervalo de tratamiento repetido se administra al menos 3 días después de la finalización del primer intervalo de tratamiento o del anterior.

[0026] En una realización, cualquiera de los intervalos de tratamiento descritos en el presente documento puede ser seguido por uno o más, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5, intervalos de tratamiento posteriores. El uno o más intervalos de tratamiento posteriores son diferentes del primer intervalo de tratamiento o del anterior. A modo de ejemplo, a un primer intervalo de tratamiento que consiste en una dosis única de un inhibidor de PD-L1 y una dosis única de una célula que expresa CAR le sigue un segundo intervalo de tratamiento que consiste en dos dosis de un inhibidor de PD-L1 y una dosis única de una célula que expresa CAR. En una realización, el uno o más intervalos de tratamiento posteriores se administran al menos 1 día, por ejemplo, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días o 2 semanas, después de la finalización del primer intervalo de tratamiento o del anterior. En cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, se administra una o más dosis posteriores, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5 o más dosis, del inhibidor de PD-L1 después de la finalización de uno o más intervalos de tratamiento. En las realizaciones en las que se repiten los intervalos de tratamiento o se administran dos o más intervalos de tratamiento, se administran una o más dosis posteriores, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5, del inhibidor de PD-L1 después de la finalización de un intervalo de tratamiento y antes del inicio de otro intervalo de tratamiento. En una realización, se administra una dosis del inhibidor de PD-L1 cada 5 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas o 4 días después de la finalización de uno o más intervalos de tratamiento, o de cada uno de ellos.

[0027] En cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, se administran una o más, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5 o más, dosis posteriores de la célula que expresa CAR después de la finalización de uno o más intervalos de tratamiento. En las realizaciones en las que se repiten los intervalos de tratamiento o se administran dos o más intervalos de tratamiento, se administran una o más dosis posteriores, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5, o más dosis, de la célula que expresa CAR después de la finalización de un intervalo de tratamiento y antes del inicio de otro intervalo de tratamiento. En una realización, se administra una dosis de la célula que expresa CAR cada 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas o 4 días después de la finalización de uno o más intervalos de tratamiento, o de cada uno de ellos.

[0028] En una realización, el intervalo de tratamiento comprende una dosis única de un inhibidor de PD-L1 que se administra antes de una dosis única de una célula que expresa CAR. En esta realización, la dosis de la célula que expresa CAR se administra 2 días después de la administración de la dosis del inhibidor de PD-L1. El intervalo de tratamiento se repite una vez, y el segundo intervalo de tratamiento se inicia 3 días después de la finalización del primer intervalo de tratamiento, por ejemplo, después de la administración de la dosis única de la célula que expresa CAR. En una realización, el inhibidor de PD-L1 se administra cada 5 días después de la finalización del segundo intervalo de tratamiento, por ejemplo, una o más dosis del inhibidor de PD-L1 se administran cada 5 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas, después del segundo intervalo de tratamiento.

[0029] En cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, al sujeto se le administra una dosis única de una célula que expresa CAR y una dosis única de un inhibidor de PD-L1. En una realización, la dosis única de la célula que expresa CAR se administra al menos 2 días, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días o 2 semanas, después de la administración de la dosis única del inhibidor de PD-L1.

[0030] En una realización, una o más, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5, dosis posteriores de una célula que expresa CAR se administran al sujeto después de la dosis inicial de la célula que expresa CAR. En una realización, la una o más dosis posteriores de la célula que expresa CAR se administran al menos 2 días, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días o 2 semanas, después de la dosis anterior de la célula que expresa CAR. En una realización, la una o más dosis posteriores de la célula que expresa CAR se administran al menos 5 días después de la dosis anterior de la célula que expresa CAR. En una realización, al sujeto se le administran tres dosis de la célula que expresa CAR por semana o una dosis cada 2 días.

[0031] En una realización, se administran una o más, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5, dosis posteriores del inhibidor de PD-L1 después de la administración de la dosis única del inhibidor de PD-L1. En una realización, la una o más dosis posteriores del inhibidor de PD-L1 se administran al menos 5 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas después de la dosis anterior del inhibidor de PD-L1.

[0032] En una realización, la una o más dosis posteriores del inhibidor de PD-L1 se administran al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 días, después de una dosis de la célula que expresa CAR, por ejemplo, la dosis inicial de la célula que expresa CAR.

[0033] En una realización, una o más, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5, dosis del inhibidor de PD-L1 se administra antes de la primera dosis de la célula que expresa CAR.

[0034] En una realización, la administración de la una o más dosis de la célula que expresa CAR y la una o más dosis de inhibidor de PD-L1 se repite, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 veces más.

[0035] En cualquiera de los regímenes de administración o intervalos de tratamiento descritos en el presente documento, una dosis de células que expresan CAR de mesotelina comprende al menos aproximadamente 1 x 10<7>, 1.5 x 10<7>, 2 x 10<7>, 2.5 x 10<7>, 3 x 10<7>, 3.5 x 10<7>, 4 x 10<7>, 5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 1.5 x 10<8>, 2 x 10<8>, 2.5 x 10<8>, 3 x 10<8>, 3.5 x 10<8>, 4 x 10<8>, 5 x 10<8>, 1 x 10<9>, 2 x 10<9>, o 5 x 10<9>células.. En algunas realizaciones, una dosis de células que expresan CAR de mesotelina comprende al menos aproximadamente 1-3 x 10<7>a 1-3 x10<8>. En algunas realizaciones, al sujeto se le administran aproximadamente 1-3 x 10<7>células que expresan CAR de mesotelina. En otras realizaciones, al sujeto se le administran aproximadamente 1-3 x 10<8>células que expresan CAR de mesotelina.

[0036] En cualquiera de los regímenes de administración descritos en el presente documento, una dosis de un inhibidor de PD-L1, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-PD-L1 descrita en el presente documento, comprende aproximadamente 1 a 30 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 5 a 25 mg/kg, aproximadamente 10 a 20 mg/kg, aproximadamente 1 a 5 mg/kg, o aproximadamente 3 mg/kg. En una realización, la dosis es de aproximadamente 10 a 20 mg/kg. En una realización, la dosis es de aproximadamente 1 a 5 mg/kg. En una realización, la dosis es menos de 5 mg/kg, menos de 4 mg/kg, menos de 3 mg/kg, menos de 2 mg/kg o menos de 1 mg/kg.

[0037] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición (por ejemplo, una o más formulaciones de dosificación, combinaciones, o una o más composiciones farmacéuticas) que comprende una célula que expresa un CAR de mesotelina descrito en el presente documento y un inhibidor de PD-L1 descrito en el presente documento. En una realización, el CAR de mesotelina comprende un dominio de unión al antígeno de mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, como se describe en el presente documento. En una realización, el CAR de mesotelina comprende un dominio de unión al antígeno de mesotelina enumerado en la Tabla 2. En una realización, el inhibidor de PD-L1 comprende una molécula de anticuerpo, una molécula pequeña, un polipéptido,por ejemplo,una proteína de fusión, o un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNsi o ARNsh. En una realización, el inhibidor de PD-L1 comprende una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo enumerada en la Tabla 6. La célula que expresa CAR y el inhibidor de PD-L1 pueden estar en la misma o diferente formulación o composición farmacéutica.

[0038] En otro aspecto, la divulgación presenta una composición (por ejemplo, una o más formulaciones de dosificación, combinaciones, o una o más composiciones farmacéuticas) que comprende una célula que expresa un CAR de mesotelina descrito en el presente documento y un inhibidor de PD-L1 descrito en el presente documento, para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de mesotelina, por ejemplo, un cáncer descrito en el presente documento. En una realización, el CAR de mesotelina comprende un dominio de unión al antígeno de mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, como se describe en el presente documento. En una realización, el CAR de mesotelina comprende un dominio de unión al antígeno de mesotelina enumerado en la Tabla 2. En una realización, el inhibidor de PD-L1 comprende una molécula de anticuerpo, una molécula pequeña, un polipéptido,por ejemplo,una proteína de fusión, o un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNsi o ARNsh. En una realización, el inhibidor de PD-L1 comprende una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo enumerada en la Tabla 6. La célula que expresa CAR y el inhibidor de PD-L1 pueden estar en la misma o diferente formulación o composición farmacéutica.

[0039] Inhibidores de PD-L1

[0040] Se proporcionan en el presente documento inhibidores de PD-L1 para su uso en cualquiera de los procedimientos o composiciones descritos en el presente documento. En cualquiera de los procedimientos o composiciones descritos en el presente documento, el inhibidor de PD-L1 comprende una molécula de anticuerpo, una molécula pequeña, un polipéptido,por ejemplo,una proteína de fusión, o un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNsi o ARNsh.

[0041] En una realización, el inhibidor de PD-L1 se caracteriza por uno o más de los siguientes: inhibe o reduce la expresión de PD-L1, por ejemplo, la transcripción o traducción de PD-L1; inhibe o reduce la actividad de PD-L1, por ejemplo, inhibe o reduce la unión de PD-L1 a su receptor, por ejemplo, PD-1 o CD80 (B7-1) o ambos; o se une a PD-L1 o a su receptor, por ejemplo, PD-1.

[0043] En una realización, el inhibidor de PD-L1 es una molécula de anticuerpo. En una realización, el inhibidor de PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en YW243.55.S70, MPDL3280A(atezolizumab), MEDI-4736, MSB-0010718C (avelumab), MDX-1105, y cualquier molécula de anticuerpo anti-PD-L1 enumerada en la Tabla 6.

[0044] En una realización, el inhibidor de PD-L1 comprende una molécula de anticuerpo anti PD-L1 que comprende una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1), una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2), y una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de cualquier secuencia de aminoácidos de la molécula de anticuerpo de PD-L1 enumerada en la Tabla 6; y una región determinante de complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1), una región determinante de complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2), y una región determinante de complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de cualquier secuencia de aminoácidos de la molécula de anticuerpo PD-L1 enumerada en la Tabla 6. En una realización, la molécula de anticuerpo anti PD-L1 comprende una secuencia de aminoácidos HC CDR1 elegida entre SEC ID NO: 287, 290 o 195, una secuencia de aminoácidos HC CDR2 de SEC ID NO: 288, y una secuencia de aminoácidos HC CDR3 de SEC ID NO: 289; y una secuencia de aminoácidos LC CDR1 de SEC ID NO: 295, una secuencia de aminoácidos LC CDR2 de SEC ID NO: 296, y una secuencia de aminoácidos LC CDR3 de SEC ID NO: 297. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 comprende una secuencia de aminoácidos HC CDR1 elegida entre SEC ID NO: 287, 290 o 195, una secuencia de aminoácidos HC CDR2 de SEC ID NO: 291, y una secuencia de aminoácidos HC CDR3 de SEC ID NO: 292; y una secuencia de aminoácidos LC CDR1 de SEC ID NO: 298, una secuencia de aminoácidos LC CDR2 de SEC ID NO: 299, y una secuencia de aminoácidos LC CDR3 de SEC ID NO: 300.

[0045] En una realización, la molécula de anticuerpo anti PD-L1 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena pesada enumerada en la Tabla 6, por ejemplo, SEC ID NOs: 304, 316, 324, 332, 336, 340, 348, 356 o 364. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones con respecto a la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena pesada proporcionada en la Tabla 6, por ejemplo, SEC ID NOs: 304, 316, 324, 332, 336, 340, 348, 356 o 364. En una realización, la molécula de anticuerpo anti PD-L1 comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena pesada proporcionada en la Tabla 6, por ejemplo, SEC ID NOs: 304, 316, 324, 332, 336, 340, 348, 356 o 364.

[0046] En una realización, la molécula de anticuerpo anti PD-L1 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquier cadena pesada enumerada en la Tabla 6, por ejemplo, SEC ID NOs: 306, 318, 326, 334, 338, 342, 350, 358, 366, 393, 377 o 382. En una realización, la molécula de anticuerpo anti PD-L1 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones con respecto a cualquier cadena pesada enumerada en la Tabla 6, por ejemplo, SEC ID NOs: 306, 318, 326, 334, 338, 342, 350, 358, 366, 393, 377 o 382. En una realización, la molécula de anticuerpo anti PD-L1 comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de cualquier cadena pesada enumerada en la Tabla 6, por ejemplo, SEC ID NOs: 306, 318, 326, 334, 338, 342, 350, 358, 366, 393, 377 o 382.

[0048] En una realización, la molécula de anticuerpo anti PD-L1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera enumerada en la Tabla 6, por ejemplo, SEC ID NOs: 308, 312, 320, 328, 344, 352, 360, 368 o 372. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones con respecto a la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera proporcionada en la Tabla 6, por ejemplo, SEC ID NOs: 308, 312, 320, 328, 344, 352, 360, 368 o 372. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera proporcionada en la Tabla 6, por ejemplo, SEC ID NOs: 308, 312, 320, 328, 344, 352, 360, 368 o 372.

[0049] En una realización, la molécula de anticuerpo anti PD-L1 comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquier cadena ligera enumerada en la Tabla 6, por ejemplo, SEC ID NOs: 310, 314, 322, 330, 346, 354, 362, 370 o 374. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones con respecto a cualquier cadena ligera enumerada en la Tabla 6, por ejemplo, SEC ID NOs: 310, 314, 322, 330, 346, 354, 362, 370 o 374. En una realización, la molécula de anticuerpo anti PD-L1 comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de cualquier cadena ligera enumerada en la Tabla 6, por ejemplo, SEC ID NOs: 310, 314, 322, 330, 346, 354, 362, 370 o 374.

[0050] En una realización, la molécula de anticuerpo anti PD-L1 comprende:

[0051] i) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 304 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 308;

[0052] ii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 304 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 312;

[0053] iii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 304 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 372.

[0054] iv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 316 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 320;

[0055] v) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 316 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 352;

[0056] vi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 324 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 328;

[0057] vii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 324 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 360;

[0058] viii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 332 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 328;

[0059] ix) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 336 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 328;

[0060] x) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 336 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 308;

[0061] xi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 336 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 372;

[0062] xii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 340 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 344;

[0063] xiii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 340 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 372;

[0064] xiv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 348 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 352;

[0065] xv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 348 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 386;

[0066] xvi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 356 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 352; o

[0067] xvii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 78 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 368.

[0068] En una realización, la molécula de anticuerpo anti PD-L1 comprende:

[0069] i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 306 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 310;

[0070] ii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 306 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 214;

[0071] iii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 306 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 374;

[0072] iv) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 318 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 322;

[0073] v) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 318 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 354;

[0074] vi) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 326 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 330;

[0075] vii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 326 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 362;

[0076] viii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 334 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 330;

[0077] ix) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 338 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 330;

[0078] x) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 338 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 310;

[0079] xi) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 338 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 374;

[0080] xii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 342 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 346;

[0081] xiii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 342 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 374;

[0082] xiv) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 350 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 354;

[0083] xv) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 350 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 374;

[0084] xvi) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 358 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 354;

[0085] xvii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 366 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 370;

[0086] xviii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 393 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 322;

[0087] xix) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 91 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 330; o

[0088] xx) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 382 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 354.

[0089] Células que expresan CAR de mesotelina

[0090] Se proporcionan en el presente documento células, por ejemplo, células efectoras inmunitarias, que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se direcciona a, por ejemplo, se une específicamente a, la mesotelina para su uso en cualquiera de los procedimientos o composiciones descritos en el presente documento. El CAR que se une específicamente a la mesotelina también se denomina en el presente documento como "un CAR de mesotelina o un mesoCAR". El CAR de mesotelina expresado por la célula que expresa CAR de mesotelina descrita en el presente documento incluye un dominio de unión a mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador y/o un dominio de señalización primario.

[0091] En una realización, el dominio de unión a mesotelina comprende una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1), una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2), una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de cualquier secuencia de aminoácidos del dominio de unión a la cadena pesada de mesotelina enumerada en la Tabla 2; y una región determinante de complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1), una región determinante de complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2), y una región determinante de complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de cualquier secuencia de aminoácidos del dominio de unión a la cadena ligera de mesotelina enumerada en la Tabla 2. En una realización, el dominio de unión a la mesotelina comprende una HC CDR1, una HC CDR2, y una HC CDR3 de acuerdo con las secuencias de aminoácidos HC CDR de la Tabla 4, y una LC CDR1, una LC CDR2, y una LC CDR3 de acuerdo con las secuencias de aminoácidos LC CDR de la Tabla 5.

[0093] En una realización, el dominio de unión a la mesotelina comprende (por ejemplo, consiste en) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 275, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 48, SEC ID NO: 50, SEC ID NO: 51, SEC ID NO: 52, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 54, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 56, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61, o SEC ID NO: 62. En una realización, el dominio de unión a la mesotelina comprende (por ejemplo, consiste en) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo., sustituciones, por ejemplo., sustituciones conservadoras) con respecto a cualquiera de SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 275, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 48, SEC ID NO: 50, SEC ID NO: 51, SEC ID NO: 52, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 54, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 56, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61, o SEC ID NO: 62. En una realización, el dominio de unión a la mesotelina comprende (por ejemplo, consiste en) una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 275, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 48, SEC ID NO: 50, SEC ID NO: 51, SEC ID NO: 52, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 54, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 56, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61, o SEC ID NO: 62.

[0095] En una realización, el CAR de mesotelina incluye un dominio transmembrana que comprende un dominio transmembrana de una proteína, por ejemplo, una proteína descrita en el presente documento, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En una realización, el dominio transmembrana comprende la secuencia de SEC ID NO: 6. En una realización, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:6, o una secuencia con un 95-99% de identidad a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:6. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio transmembrana comprende una secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 17, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma.

[0097] En una realización, el dominio de unión a la mesotelina está conectado al dominio transmembrana por una región bisagra, por ejemplo, una región bisagra descrita en el presente documento. En una realización, la región bisagra codificada comprende SEC ID NO:2, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica la región bisagra comprende una secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 13, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma.

[0099] En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador, por ejemplo, un dominio coestimulador descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización primario. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador y un dominio de señalización primario.

[0101] En una realización, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína, por ejemplo, descrita en el presente documento, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en una molécula MHC de clase I, una proteína receptora de TNF, una proteína similar a inmunoglobulina, un receptor de citoquina, una integrina, una molécula de activación linfocítica de señalización (proteína SLAM), un receptor activador de células NK, BTLA, un receptor de ligando Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83.

[0103] En una realización, el dominio coestimulador de 4-1BB comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7. En una realización, el dominio coestimulador codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:18, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma. En otra realización, el dominio coestimulador de CD28 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:43. En una realización, el dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:43, o una secuencia con un 95-99% de identidad a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:43. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador de CD28 comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:44, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma. En otra realización, el dominio coestimulador de CD27 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:8. En una realización, el dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:8, o una secuencia con un 95-99% de identidad a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:8. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador de CD27 comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:19, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma. En otra realización, el dominio coestimulador de ICOS comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:45. En una realización, el dominio coestimulador de ICOS comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:45, o una secuencia con un 95-99% de identidad a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:45. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio coestimulador de ICOS comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:46, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma.

[0105] En algunas realizaciones, el dominio de señalización primario comprende un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En realizaciones, el dominio de señalización funcional de CD3 zeta comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9 (CD3 zeta mutante) o SEC ID NO: 10 (CD3 zeta humano de tipo salvaje), o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma.

[0107] En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En una realización, el dominio de señalización intracelular de 4-1BB comprende la secuencia de SEC ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos CD3 zeta de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7 y/o una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9 o SEC ID NO: 10, o una secuencia con un 95-99% de identidad a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7 y/o una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEC ID NO:7 y la secuencia de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:18, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma, y/o la secuencia de nucleótidos de CD3 zeta de SEC ID NO:20 o SEC ID NO:21, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma.

[0109] En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de CD27 y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En una realización, el dominio de señalización intracelular codificado de CD27 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:8 y/o la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:8 y/o una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10, o una secuencia con un 95-99% de identidad a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:8 y/o una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEC ID NO:8 y la secuencia de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular de CD27 comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:19, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma, y/o la secuencia de nucleótidos de CD3 zeta de SEC ID NO:20 o SEC ID NO:21, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma.

[0110] En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de CD28 y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En una realización, el dominio de señalización intracelular de CD28 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:43 y/o la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:43 y/o una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10, o una secuencia con un 95-99% de identidad a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:43 y/o una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEC ID NO:43 y la secuencia de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular de CD28 comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:44, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma, y/o la secuencia de nucleótidos de CD3 zeta de SEC ID NO:20 o SEC ID NO:21, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma.

[0111] En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de ICOS y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En una realización, el dominio de señalización intracelular de ICOS comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:45 y/o la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:45 y/o una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10, o una secuencia con un 95-99% de identidad a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:45 y/o una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEC ID NO:45 y la secuencia de SEC ID NO:9 o SEC ID NO:10, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular de ICOS comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:46, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma, y/o la secuencia de nucleótidos de CD3 zeta de SEC ID NO:20 o SEC ID NO:21, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma.

[0112] En una realización, el CAR de mesotelina comprende además una secuencia líder que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1.

[0113] En una realización, el CAR de mesotelina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 67; SEC ID NO: 73, SEC ID NO: 278, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 64, SEC ID NO: 65, SEC ID NO: 66, SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 70, SEC ID NO: 71, SEC ID NO: 72, SEC ID NO: 74, SEC ID NO: 75, SEC ID NO: 76, SEC ID NO: 77, SEC ID NO: 78, SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 80, SEC ID NO: 81, SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 83, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 85, o SEC ID NO: 86. En una realización, el CAR de mesotelina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones con respecto a cualquiera de SEC ID NO: 67, SEC ID NO: 73, SEC ID NO: 278, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 64, SEC ID NO: 65, SEC ID NO: 66, SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 70, SEC ID NO: 71, SEC ID NO: 72, SEC ID NO: 74, SEC ID NO: 75, SEC ID NO: 76, SEC ID NO: 77, SEC ID NO: 78, SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 80, SEC ID NO: 81, SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 83, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 85, o SEC ID NO: 86. En una realización, el CAR de mesotelina comprende una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a cualquiera de SEC ID NO: 67; SEC ID NO: 73, SEC ID NO: 278, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 64, SEC ID NO: 65, SEC ID NO: 66, SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 70, SEC ID NO: 71, SEC ID NO: 72, SEC ID NO: 74, SEC ID NO: 75, SEC ID NO: 76, SEC ID NO: 77, SEC ID NO: 78, SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 80, SEC ID NO: 81, SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 83, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 85, o SEC ID NO: 86.

[0114] En realizaciones de cualquiera de los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento, la célula que comprende un CAR comprende un ácido nucleico que codifica el CAR.

[0115] En una realización, el ácido nucleico que codifica el CAR es un vector lentiviral. En una realización, el ácido nucleico que codifica el CAR se introduce en las células mediante transducción lentiviral. En una realización, el ácido nucleico que codifica el CAR es un ARN, por ejemplo, un ARN transcrito in vitro. En una realización, el ácido nucleico que codifica el CAR se introduce en las células por electroporación.

[0116] En realizaciones de cualquiera de los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento, la célula es una célula T o una célula NK. En una realización, la célula T es una célula T autóloga o alogénica.

[0117] En una realización, el procedimiento comprende además administrar un agente terapéutico adicional para tratar una enfermedad descrita en el presente documento, por ejemplo, un agente terapéutico anticanceroso.

[0118] En realizaciones de cualquiera de los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento, la enfermedad asociada con la expresión de mesotelina es un cáncer. En una realización, el cáncer se elige entre uno o más de mesotelina, mesotelioma pleural maligno, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células escamosas o cáncer de pulmón de células grandes, cáncer de páncreas, adenocarcinoma ductal pancreático, metástasis pancreática, cáncer de ovario o cáncer colorrectal y cáncer de vejiga, o una metástasis de los mismos.

[0119] En realizaciones de cualquiera de los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un humano. En una realización, el sujeto expresa PD-L1 y/o PD-L2. En una realización, la célula cancerosa o una célula en estrecha proximidad a una célula cancerosa, por ejemplo, una célula asociada al cáncer, en el sujeto expresa PD-L1 y/o PD-L2. En una realización, la célula asociada al cáncer es una célula inmunitaria antitumoral, por ejemplo, un linfocito infiltrante tumoral (TIL).

[0120] En una realización, la célula que expresa un CAR, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina descrita en el presente documento, expresa PD-1 y/o PD-L1.

[0121] A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o prueba de la presente invención pueden utilizarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen procedimientos y materiales adecuados. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Los títulos, subtítulos o elementos numerados o con letras, por ejemplo, (a), (b), (i), etc., se presentan meramente para facilitar la lectura. El uso de títulos o elementos numerados o con letras en este documento no requiere que los pasos o elementos se realicen en orden alfabético o que los pasos o elementos sean necesariamente discretos entre sí. Otras características, objetos y ventajas de la invención se desprenderán de la descripción y de los dibujos, y de las reivindicaciones.

[0122] Breve descripción de los dibujos

[0123] La Figura 1A muestra el análisis citométrico de flujo de la expresión de PD1 en las células T CAR. Se muestra el porcentaje de células CD8+ CAR+ que expresan PD1. Se analizaron la médula ósea, el bazo y el tumor 30 días después de la transferencia adoptiva a ratones NSG portadores del tumor Panc02.03. Las células T CAR extraídas de los tumores, pero no de los otros órganos, fueron ampliamente positivas para la expresión de PD1 (más del 60%). Las CART se tiñeron con anti-CD8a (BioLegend, RPAT8), anti-PD1 (BD Bioscience, EH12.1), anti-PDL1 (BD Bioscience, M1H1), ProteínaL-Biotina y Estreptavidina-PE.

[0124] La Figura 1B muestra el análisis citométrico de flujo de la expresión de PDL1 y PDL2 en las células cancerosas Panc02.03. Se muestra la expresión de PDL1 y PDL2 por las células cancerosas Panc02.03 cuando se analizan tanto in vitro como ex vivo, a partir de los mismos tumores analizados en la Figura 1A. Las células cancerosas se tiñeron con anti-PDL1 (Biolegend, 29E.2A3) y anti-PDL2 (Biolegend, 24F.10C12).

[0125] La Figura 2 es un gráfico que muestra la progresión tumoral después de varios tratamientos combinados con CART de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, donde el inhibidor de PD-L1 se administró antes de la administración del CAR. El anticuerpo PD-L1 se administró en el punto temporal designado por #. Las células indicadas que expresan CAR se administraron en los puntos temporales designados por *. Los puntos temporales en los que se recogieron los tejidos se designan con las estrellas en el eje X. La Figura 3 es un gráfico de la progresión tumoral después de varios tratamientos combinados con CART de mesotelina e inhibidores de PD-L1, donde el inhibidor de PD-L1 se administró después de la administración de CAR. El anticuerpo PD-L1 se administró en el punto temporal designado por #. Las células indicadas que expresan CAR se administraron en los puntos temporales designados por *. La Figura 4 es una serie de imágenes del análisis inmunohistoquímico del tejido del xenoinjerto de Panc después del tratamiento con CART de mesotelina M5.

[0126] La Figura 5 es una serie de imágenes del análisis inmunohistoquímico del tejido del xenoinjerto de Panc después del tratamiento con CART de mesotelina M5.

[0127] La Figura 6 muestra que la proliferación de células T transducidas que expresan CAR se ve potenciada por dosis bajas de RAD001 en un sistema de cultivo celular. Las CART se co-cultivaron con células Nalm-6 en presencia de diferentes concentraciones de RAD001. El número de células T CD3 positivas CAR positivas (negro) y el total de células T (gris) se evaluó después de 4 días de cocultivo.

[0128] La Figura 7 muestra las mediciones del crecimiento tumoral de las células NALM6-luc con dosificación diaria de RAD001 a 0,3, 1, 3 y 10 mg/kg (mpk) o con dosificación del vehículo. Los círculos denotan el vehículo; los cuadrados denotan la dosis de 10 mg/kg de RAD001; los triángulos denotan la dosis de 3 mg/kg de RAD001; los triángulos invertidos denotan la dosis de 1 mg/kg de RAD001; y los rombos denotan la dosis de 0,3 mg/kg de RAD001.

[0129] La Figura 8, que comprende las Figuras 8A y 8B, muestra curvas farmacocinéticas que muestran la cantidad de RAD001 en la sangre de ratones NSG con tumores NALM6. FIG.8A muestra la FC del día 0 tras la primera dosis de RAD001. FIG.8B muestra la FC del Día 14 tras la dosis final de RAD001. Los rombos denotan la dosis de 10 mg/kg de RAD001; los cuadrados denotan la dosis de 1 mg/kg de RAD001; los triángulos denotan la dosis de 3 mg/kg de RAD001; y las x denotan la dosis de 10 mg/kg de RAD001.

[0130] La Figura 9, que comprende las Figuras 9A y 9B, muestra la proliferaciónin vivode células CART CD19 humanizadas con y sin dosificación de RAD001. Dosis bajas de RAD001 (0,003 mg/kg) diarias conducen a un aumento de la proliferación de células T CAR, por encima del nivel normal de proliferación huCAR19. FIG.9A muestra células T CAR CD4<+>; FIG.9B muestra células T CAR CD8<+>. Los círculos denotan PBS; los cuadrados denotan huCTL019; los triángulos denotan huCTL019 con 3 mg/kg de RAD001; los triángulos invertidos denotan huCTL019 con 0,3 mg/kg de RAD001; los rombos denotan huCTL019 con 0,03 mg/kg de RAD001; y los círculos denotan huCTL019 con 0,003 mg/kg de RAD001.

[0131] Descripción detallada

[0132] Definiciones

[0133] A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece la invención.

[0134] El término "un" y "una" se refiere a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

[0135] El término "aproximadamente" cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, y similares, se entiende que abarca variaciones de ±20% o en algunos casos ±10%, o en algunos casos ±5%, o en algunos casos ±1%, o en algunos casos ±0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los procedimientos divulgados.

[0136] Administrado "en combinación", tal como se utiliza en el presente documento, significa que dos (o más) tratamientos diferentes se suministran al sujeto durante el curso de la afección del sujeto con el trastorno, por ejemplo, los dos o más tratamientos se suministran después de que el sujeto haya sido diagnosticado con el trastorno y antes de que el trastorno haya sido curado o eliminado o el tratamiento haya cesado por otras razones. En algunas realizaciones, el suministro de un tratamiento aún está en curso cuando comienza el suministro del segundo, de modo que se produce un solapamiento en términos de administración. Esto se denomina a veces en el presente documento como "suministro simultáneo" o "suministro concurrente". En otras realizaciones, el suministro de un tratamiento finaliza antes de que comience el suministro del otro tratamiento. En algunas realizaciones de cualquiera de los casos, el tratamiento es más eficaz debido a la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más eficaz, por ejemplo, se observa un efecto equivalente con menos cantidad del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas en mayor medida de lo que se observaría si el segundo tratamiento se administrara en ausencia del primer tratamiento, o se observa una situación análoga con el primer tratamiento. En algunas realizaciones, el suministro es tal que la reducción de un síntoma u otro parámetro relacionado con el trastorno es mayor que la que se observaría con un tratamiento suministrado en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo o mayor que aditivo. El suministro puede ser tal que un efecto del primer tratamiento suministrado sea aún detectable cuando se administra el segundo.

[0137] El término "Receptor de Antígeno Quimérico" o alternativamente un "CAR" se refiere a un constructo polipeptídico recombinante que comprende al menos un dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplasmático (también denominado en el presente documento como "un dominio de señalización intracelular") que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora como se define a continuación. En algunas realizaciones, los dominios del constructo polipeptídico CAR se encuentran en la misma cadena polipeptídica, por ejemplo, comprenden una proteína de fusión quimérica. En algunas realizaciones, los dominios en el constructo polipeptídico CAR no son contiguos entre sí, por ejemplo, están en diferentes cadenas polipeptídicas, por ejemplo, como se proporciona en un RCAR como se describe en el presente documento.

[0138] En un aspecto, la molécula estimuladora es la cadena zeta asociada con el complejo receptor de células T. En un aspecto, el dominio de señalización citoplasmático comprende un dominio de señalización primario (por ejemplo, un dominio de señalización primario de CD3-zeta). En un aspecto, el dominio de señalización citoplasmático comprende además uno o más dominios de señalización funcionales derivados de al menos una molécula coestimuladora como se define a continuación. En un aspecto, la molécula coestimuladora se elige entre 4-1BB (es decir, CD137), CD27, ICOS y/o CD28. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula coestimuladora y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende dos dominios de señalización funcional derivados de una o más molécula(s) coestimuladora(s) y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende al menos dos dominios de señalización funcional derivados de una o más molécula(s) coestimuladora(s) y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una secuencia líder opcional en el amino-terminal (N-ter) de la proteína de fusión CAR. En un aspecto, el CAR comprende además una secuencia líder en el extremo N-terminal del dominio de unión a antígeno extracelular, en el que la secuencia líder se escinde opcionalmente del dominio de reconocimiento de antígeno (por ejemplo, un scFv) durante el procesamiento celular y la localización del CAR en la membrana celular.

[0140] El término "dominio de señalización" se refiere a la porción funcional de una proteína que actúa transmitiendo información dentro de la célula para regular la actividad celular a través de vías de señalización definidas generando segundos mensajeros o funcionando como efectores respondiendo a tales mensajeros. En algunos aspectos, el dominio de señalización del CAR descrito en el presente documento se deriva de una molécula estimuladora o coestimuladora descrita en el presente documento, o es un dominio de señalización sintetizado o modificado genéticamente.

[0142] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "mesotelina" se refiere a la proteína de 40-kDa, mesotelina, que está anclada en la membrana celular por un enlace de glucosilfosfatidilinositol (GPI) y un fragmento desprendido aminoterminal de 31-kDa, denominado factor potenciador de megacariocitos (MPF). Ambos fragmentos contienen sitios de N-glicosilación. El término también se refiere a una variante de empalme soluble del fragmento carboxilo-terminal de 40-kDa también llamado "mesotelina soluble/MPF-relacionada". Preferentemente, el término se refiere a una mesotelina humana del número de acceso AAH03512.1 del GenBank, y a porciones naturalmente escindidas de la misma, por ejemplo, tal como se expresa en una membrana celular, por ejemplo, la membrana de una célula cancerosa.

[0144] El término "anticuerpo" o "molécula de anticuerpo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína, o secuencia polipeptídica derivada de una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente con un antígeno. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, de cadena múltiple o única, o inmunoglobulinas intactas, y pueden derivarse de fuentes naturales o de fuentes recombinantes. Los anticuerpos pueden ser tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. En una realización, el anticuerpo o la molécula de anticuerpo comprende, por ejemplo, consiste en un fragmento de anticuerpo.

[0146] El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a al menos una porción de un anticuerpo intacto, o variantes recombinantes del mismo, y se refiere al dominio de unión a antígeno, por ejemplo, una región variable determinante antigénica de un anticuerpo intacto, que es suficiente para conferir reconocimiento y unión específica del fragmento de anticuerpo a un objetivo, tal como un antígeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')<2>, y fragmentos Fv, fragmentos de anticuerpos scFv, anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio único tal como sdAb (ya sea VL o VH), dominios VHH de camélidos, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos tales como un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra, y una CDR aislada u otros fragmentos de unión a epítopos de un anticuerpo. Un fragmento de unión a antígeno también puede incorporarse a anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, nanocuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Los fragmentos de unión a antígeno también pueden injertarse en<estructuras en base a polipéptidos tales como una fibronectina tipo III (Fn3)(véase Patente de EE.UU. No.>: 6,703,199, que describe minicuerpos polipeptídicos de fibronectina).

[0148] El término "scFv" se refiere a una proteína de fusión que comprende al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena ligera y al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena pesada, en el que las regiones variables de cadena ligera y pesada están enlazadas de manera contigua a través de un enlazador polipeptídico flexible corto, y que es capaz de expresarse como un polipéptido de cadena única, y en el que el scFv conserva la especificidad del anticuerpo intacto del que se deriva. A menos que se especifique, tal como se utiliza en el presente documento, un scFv puede tener las regiones variables VL y VH en cualquier orden, por ejemplo, con respecto a los extremos N-terminal y C-terminal del polipéptido, el scFv puede comprender VL-enlazador-VH o puede comprender VH-enlazador-VL.

[0150] El término "región determinante de complementariedad" o "CDR", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones variables de anticuerpos que confieren especificidad de antígeno y afinidad de unión. Por ejemplo, en general, hay tres CDR en cada región variable de cadena pesada (por ejemplo, HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y tres CDR en cada región variable de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3). Los límites precisos de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada pueden determinarse utilizando cualquiera de un número de esquemas bien conocidos, incluyendo los descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeración "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (esquema de numeración "Chothia"), o una combinación de los mismos. Según el esquema de numeración de Kabat, en algunas realizaciones, los residuos de aminoácidos CDR en el dominio variable de cadena pesada (VH) están numerados 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), y 95-102 (HCDR3); y los residuos de aminoácidos CDR en el dominio variable de cadena ligera (VL) están numerados 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), y 89-97 (LCDR3). Según el esquema de numeración de Chothia, en algunas realizaciones, los aminoácidos CDR en la VH están numerados 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2), y 95-102 (HCDR3); y los residuos de aminoácidos CDR en la VL están numerados 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2), y 91-96 (LCDR3). En un esquema de numeración combinado de Kabat y Chothia, en algunas realizaciones, las CDR corresponden a los residuos de aminoácidos que forman parte de una CDR de Kabat, una CDR de Chothia, o ambas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las CDR corresponden a los residuos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), y 95-102 (HCDR3) en una VH, por ejemplo, una VH de mamífero, por ejemplo, una VH humana; y a los residuos de aminoácidos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), y 89-97 (LCDR3) en una VL, por ejemplo, una VL de mamífero, por ejemplo, una VL humana.

[0152] La porción del CAR de la divulgación que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo puede existir en una variedad de formas donde el dominio de unión a antígeno se expresa como parte de una cadena polipeptídica contigua incluyendo, por ejemplo, fragmentos de anticuerpo scFv, anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio único tales como sdAb (ya sea VL o VH), dominios VHH de camélidos ,un anticuerpo humanizado, un anticuerpo biespecífico, un conjugado de anticuerpo (Harlow et al., 1999, En: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, En: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). En un aspecto, el dominio de unión a antígeno de un CAR de la divulgación comprende un fragmento de anticuerpo. En otro aspecto, el CAR comprende un fragmento de anticuerpo que comprende un scFv.

[0154] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "molécula de anticuerpo" se refiere a una proteína, por ejemplo, una cadena de inmunoglobulina o fragmento de la misma, que comprende al menos una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina. El término molécula de anticuerpo abarca anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. En una realización, una molécula de anticuerpo abarca un "dominio de unión" (también denominado en el presente documento como "dominio de unión anti-objetivo (por ejemplo, mesotelina)"). En una realización, una molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, comprende una pluralidad de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina, en la que una primera secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de la pluralidad tiene especificidad de unión para un primer epítopo y una segunda secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de la pluralidad tiene especificidad de unión para un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo multiespecífico es una molécula de anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico tiene especificidad para no más de dos antígenos. Una molécula de anticuerpo biespecífico se caracteriza por una primera secuencia de dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión para un primer epítopo y una segunda secuencia de dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión para un segundo epítopo.

[0156] El término "cadena pesada de anticuerpo," se refiere a la mayor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en las moléculas de anticuerpo en sus conformaciones naturales, y que normalmente determina la clase a la que pertenece el anticuerpo.

[0158] El término "cadena ligera de anticuerpo," se refiere a la menor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en las moléculas de anticuerpo en sus conformaciones naturales. Las cadenas ligeras kappa (κ) y lambda (λ) se refieren a los dos isotipos principales de la cadena ligera de anticuerpos.

[0160] El término "anticuerpo recombinante" se refiere a un anticuerpo que se genera utilizando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago o un sistema de expresión de levadura. El término también debe interpretarse como un anticuerpo que ha sido generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, en la que el ADN o la secuencia de aminoácidos se ha obtenido utilizando ADN recombinante o tecnología de secuencia de aminoácidos que está disponible y es bien conocida en la técnica.

[0161] El término "antígeno" o "Ag" se refiere a una molécula que provoca una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede implicar la producción de anticuerpos, la activación de células específicas inmunológicamente competentes, o ambas. El experto en la técnica entenderá que cualquier macromolécula, incluyendo prácticamente todas las proteínas o péptidos, puede servir como un antígeno. Además, los antígenos pueden derivarse de ADN recombinante o genómico. Un experto en la técnica entenderá que cualquier ADN que comprenda una secuencia de nucleótidos o una secuencia parcial de nucleótidos que codifique una proteína que provoque una respuesta inmunitaria, codifica, por lo tanto, un "antígeno" tal como se utiliza dicho término en el presente documento. Además, un experto en la técnica entenderá que un antígeno no necesita estar codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos de longitud completa de un gen. Es evidente que la presente divulgación incluye, pero no se limita a, el uso de secuencias parciales de nucleótidos de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos están dispuestas en varias combinaciones para codificar polipéptidos que provocan la respuesta inmunitaria deseada. Además, un experto en la técnica entenderá que un antígeno no necesita estar codificado en absoluto por un "gen". Es fácilmente aparente que un antígeno puede ser generado sintetizado o puede ser derivado de una muestra biológica, o podría ser macromolécula además de un polipéptido. Tal muestra biológica puede incluir, pero no se limita a, una muestra de tejido, una muestra de tumor, una célula o un fluido con otros componentes biológicos.

[0162] El término "efecto anticanceroso" se refiere a un efecto biológico que puede manifestarse por diversos medios, que incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, una disminución del volumen tumoral, una disminución del número de células cancerosas, una disminución del número de metástasis, un aumento de la esperanza de vida, una disminución de la proliferación de células cancerosas, una disminución de la supervivencia de células cancerosas, o una mejora de varios síntomas fisiológicos asociados con la afección cancerosa. Un "efecto anticancerígeno" también puede manifestarse por la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos en la prevención de la aparición del cáncer en primer lugar. El término "efecto antitumoral" se refiere a un efecto biológico que puede manifestarse por diversos medios, que incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, una disminución del volumen tumoral, una disminución del número de células tumorales, una disminución de la proliferación de células tumorales o una disminución de la supervivencia de células tumorales. El término "autólogo" se refiere a cualquier material derivado del mismo individuo al que posteriormente se le va a reintroducir al individuo.

[0163] El término "alogénico" se refiere a cualquier material derivado de un animal diferente de la misma especie que el individuo al que se introduce el material. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes de uno o más loci no son idénticos. En algunos aspectos, el material alogénico procedente de individuos de la misma especie puede ser lo suficientemente diferente genéticamente como para interactuar antigénicamente.

[0164] El término "xenogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.

[0165] El término "cáncer" se refiere a una enfermedad caracterizada por el crecimiento incontrolado de células aberrantes. El cáncer incluye todos los tipos de crecimientos cancerosos o procedimientos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos malignamente transformados, independientemente del tipo histopatológico o la etapa de invasividad. Las células cancerosas pueden propagarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Se describen en el presente documento ejemplos de diversos tipos de cáncer que incluyen, pero no se limitan a, mesotelioma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer cerebral, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y otros similares. La frase "enfermedad asociada con la expresión de mesotelina" incluye, pero no se limita a, una enfermedad asociada con la expresión de mesotelina o afección asociada con células que expresan mesotelina que incluyen, por ejemplo, enfermedades proliferativas tales como un cáncer o malignidad o una afección precancerosa tal como una hiperplasia mesotelial; o una indicación no relacionada con el cáncer asociada con células que expresan mesotelina. Ejemplos de diversos tipos de cáncer que expresan mesotelina incluyen, pero no se limitan a, mesotelioma, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas y similares. El término "modificaciones de secuencia conservadoras" se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Las modificaciones pueden introducirse en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la divulgación mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, uno o más residuos de aminoácidos dentro de un CAR de la divulgación pueden ser reemplazados con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y el CAR alterado puede probarse , por ejemplo, para determinar la capacidad de unirse a mesotelina utilizando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

[0167] El término "estimulación," se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora (por ejemplo, un complejo TCR/CD3 o CAR) con su ligando cognado (o antígeno tumoral en el caso de un CAR) mediando así un evento de transducción de señal, tal como, pero no limitado a, transducción de señal a través del complejo TCR/CD3 o transducción de señal a través del receptor NK apropiado o dominios de señalización del CAR. La estimulación puede mediar la expresión alterada de determinadas moléculas, tal como la regulación a la baja del TGF-β, y/o la reorganización de las estructuras citoesqueléticas, y similares.

[0168] El término "molécula estimuladora," se refiere a una molécula expresada por una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, una célula T, célula NK, célula B) que proporciona la(s) secuencia(s) de señalización citoplasmática que regula(n) la activación de la célula efectora inmunitaria de una manera estimuladora para al menos algún aspecto de la vía de señalización de la célula efectora inmunitaria, por ejemplo, la vía de señalización de la célula T. En un aspecto, la señal es una señal primaria que se inicia mediante, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula MHC cargada con péptido, y que conduce a la mediación de una respuesta de células T, que incluye, pero no se limita a, proliferación, activación, diferenciación, y similares. Una secuencia de señalización citoplasmática primaria (también denominada como "dominio de señalización primario") que actúa de manera estimuladora puede contener un motivo de señalización que se conoce como motivo de activación basado en tirosina del inmunorreceptor o ITAM. Ejemplos de una secuencia de señalización citoplasmática primaria que contiene ITAM que es de uso particular en la invención incluye, pero no se limita a, aquellas derivadas de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa, FcR beta (Fc épsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta , CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (también conocido como "ICOS"), FcεRI, DAP10, DAP12, y CD66d. En un CAR específico de la divulgación, el dominio de señalización intracelular en uno o más CAR de la divulgación comprende una secuencia de señalización intracelular, por ejemplo, una secuencia de señalización primaria de CD3-zeta. En un CAR específico de la divulgación, la secuencia de señalización primaria de CD3-zeta es la secuencia proporcionada como SEC ID NO: 18, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares. En un CAR específico de la divulgación, la secuencia de señalización primaria de CD3-zeta es la secuencia proporcionada en SEC ID NO:20, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares.

[0170] El término "célula presentadora de antígeno" o "APC" se refiere a una célula del sistema inmunitario tal como una célula accesoria (por ejemplo, una célula B, una célula dendrítica y similares) que muestra un antígeno extraño complejado con complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) en su superficie. Las células T pueden reconocer estos complejos utilizando sus receptores de células T (TCR). Las APC procesan los antígenos y los presentan a las células T.

[0172] Un "dominio de señalización intracelular", tal como se utiliza el término en el presente documento, se refiere a una porción intracelular de una molécula. El dominio de señalización intracelular genera una señal que promueve una función efectora inmunitaria de la célula que expresa CAR, por ejemplo, una célula CART o una célula NK que expresa CAR. Ejemplos de función efectora inmunitaria, por ejemplo, en una célula CART o célula NK que expresa CAR, se incluyen la actividad citolítica y la actividad auxiliadora, incluyendo la secreción de citoquinas. Aunque puede emplearse todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario utilizar toda la cadena. En la medida en que se utilice una porción truncada del dominio de señalización intracelular, tal porción truncada puede utilizarse en lugar de la cadena intacta siempre que transduzca la señal de función efectora. Por lo tanto, el término dominio de señalización intracelular incluye cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora.

[0174] En una realización, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio de señalización intracelular primario. Los dominios de señalización intracelular primarios ejemplares incluyen los derivados de las moléculas responsables de la estimulación primaria, o la simulación dependiente de antígeno. En una realización, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio intracelular coestimulador. Los dominios de señalización intracelular coestimuladoras ejemplares incluyen aquellos derivados de moléculas responsables de señales coestimuladoras o de estimulación independiente de antígeno. En una realización, el dominio de señalización intracelular es sintetizado o diseñado. Por ejemplo, en el caso de una célula efectora inmunitaria que expresa CAR, por ejemplo, una célula CART o una célula NK que expresa CAR, un dominio de señalización intracelular primario puede comprender una secuencia citoplasmática de un receptor de células T, un dominio de señalización intracelular primario puede comprender una secuencia citoplasmática de un receptor de células T, y un dominio de señalización intracelular coestimulador puede comprender una secuencia citoplasmática de un correceptor o molécula coestimuladora.

[0175] Un dominio de señalización intracelular primario puede comprender un motivo de señalización que se conoce como motivo de activación basado en tirosina del inmunorreceptor o ITAM. Ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplasmática primaria incluyen, pero no se limitan a, las derivadas de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 ("ICOS"), FcεRI CD66d, DAP10 y DAP12.

[0176] El término "zeta" o alternativamente "cadena zeta", "CD3-zeta" o "TCR-zeta" se define como la proteína proporcionada como GenBan Acc. No. BAG36664.1, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares, y un "dominio estimulador zeta" o alternativamente un "dominio estimulador CD3-zeta" o un "dominio estimulador TCR-zeta" se define como los residuos de aminoácidos del dominio citoplasmático de la cadena zeta que son suficientes para transmitir funcionalmente una señal inicial necesaria para la activación de células T. En un aspecto, el dominio citoplasmático de zeta comprende los residuos 52 a 164 de GenBank Acc. No. BAG36664.1 o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares, que son ortólogos funcionales del mismo. En un aspecto, el "dominio estimulador zeta" o un "dominio estimulador CD3-zeta" es la secuencia proporcionada como SEC ID NO:18. En un aspecto, el "dominio estimulador zeta" o un "dominio estimulador CD3-zeta" es la secuencia proporcionada como SEC ID NO:20. También se abarcan en el presente documento los dominios CD3 zeta que comprenden una o más mutaciones de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento, por ejemplo, SEC ID NO: 20.

[0177] El término "molécula coestimuladora" se refiere al compañero de unión cognado en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando de ese modo una respuesta coestimuladora por la célula T, tal como, pero sin limitarse a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígenos o sus ligandos que son requeridas para una respuesta inmunitaria eficaz. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, una molécula MHC de clase I, una proteína receptora de TNF, una proteína similar a la inmunoglobulina, un receptor de citoquina, una integrina, una molécula de activación linfocítica de señalización (proteína SLAM), un receptor activador de células NK, BTLA, un receptor de ligando Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83.

[0178] Un dominio de señalización intracelular coestimulador puede ser la porción intracelular de una molécula coestimuladora. El dominio de señalización intracelular puede comprender toda la porción intracelular, o todo el dominio de señalización intracelular nativo, de la molécula de la que se deriva, o un fragmento funcional de la misma.

[0179] El término "4-1BB" se refiere a un miembro de la superfamilia TNFR con una secuencia de aminoácidos proporcionada como GenBank Acc. No, AAA62478.2, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares; y un "dominio coestimulador 4-1BB" se define como los residuos de aminoácidos 214-255 de GenBank Acc. No. AAA62478.2, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares. En un aspecto, el "dominio coestimulador 4-1BB" es la secuencia proporcionada como SEC ID NO: 14 o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, simio y similares.

[0180] "Célula efectora inmunitaria", tal como se utiliza dicho término en el presente documento, se refiere a una célula que está implicada en una respuesta inmunitaria, por ejemplo, en la promoción de una respuesta efectora inmunitaria. Ejemplos de células efectoras inmunitarias incluyen células T, por ejemplo, células T alfa/beta y células T gamma/delta, células B, células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), mastocitos y fagocitos derivados de células mieloides.

[0181] "Función de efector inmunitario o respuesta de efector inmunitario", tal como se utiliza dicho término en el presente documento, se refiere a la función o respuesta, por ejemplo, de una célula efectora inmunitaria, que potencia o promueve un ataque inmunitario de una célula objetivo. Por ejemplo, una función o respuesta inmunitaria efectora se refiere a una propiedad de una célula T o NK que promueve la destrucción o la inhibición del crecimiento o proliferación de una célula objetivo. En el caso de una célula T, la estimulación primaria y la coestimulación son ejemplos de función o respuesta efectora inmunitaria.

[0182] El término "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede ser la actividad citolítica o la actividad auxiliadora, incluyendo la secreción de citoquinas.

[0183] El término "codificación" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, de servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procedimientos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de ello. Por lo tanto, un gen, ADNc o ARN, codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia del ARNm y suele proporcionarse en listados de secuencias, como la cadena no codificante, utilizada como plantilla para la transcripción de un gen o ADNc, pueden denominarse como codificantes de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

[0184] A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas unas de otras y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos de la frase que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede contener en alguna versión un intrón o intrones.

[0185] Los términos "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se utilizan indistintamente en el presente documento, y se refieren a una cantidad de un compuesto, formulación, material o composición, tal como se describe en el presente documento eficaz para lograr un resultado biológico particular.

[0186] El término "endógeno" se refiere a cualquier material procedente o producido en el interior de un organismo, célula, tejido o sistema.

[0187] El término "exógeno" se refiere a cualquier material introducido desde o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema.

[0188] El término "expresión" se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular impulsada por su promotor.

[0189] El término "vector de transferencia" se refiere a una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que puede utilizarse para suministrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. En la técnica se conocen numerosos vectores que incluyen, pero no se limitan a polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados a compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por lo tanto, el término "vector de transferencia" incluye un plásmido de replicación autónoma o un virus. El término también debe interpretarse para incluir además compuestos no plasmídicos y no virales que facilitan la transferencia de ácido nucleico a las células, tal como, por ejemplo, un compuesto de polilisina, liposoma y similares. Los ejemplos de vectores de transferencia viral incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales y similares.

[0190] El término "vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de expresión enlazadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que se va a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos que actúan en cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula hospedadora o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, incluyendo cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

[0191] El término "lentivirus" se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus por su capacidad de infectar células que no se dividen; pueden suministrar una cantidad significativa de información genética en el ADN de la célula hospedadora, por lo que son uno de los procedimientos más eficaces de un vector de suministro de genes. HIV, SIV y FIV son todos ejemplos de lentivirus.

[0192] El término "vector lentiviral" se refiere a un vector derivado de al menos una porción de un genoma de lentivirus, incluyendo especialmente un vector lentiviral autoinactivable como el proporcionado en Milone et al., Mol. Ther.

[0193] 17(8): 1453-1464 (2009). Otros ejemplos de vectores lentivirales que pueden utilizarse en la clínica incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la tecnología de suministro de genes LENTIVECTOR<®>de Oxford BioMedica, el sistema de vectores LENTIMAX<™>de Lentigen y similares. También se encuentran disponibles tipos no clínicos de vectores lentivirales que serían conocidos por una persona experta en la técnica..

[0194] El término "homólogo" o "identidad" se refiere a la identidad de secuencia de subunidad entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, tales como, dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas polipeptídicas. Cuando una posición de subunidad en las dos moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica; por ejemplo, si una posición en cada una de dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas o idénticas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son 50% homólogas; si el 90% de las posiciones (por ejemplo, 9 de 10), son coincidentes u homólogas, las dos secuencias son 90% homólogas. El término "humanizado" se refiere a aquellas formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados y los fragmentos de anticuerpos son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor o fragmento de anticuerpo) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como el ratón, la rata o el conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, un fragmento de anticuerpo/anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o marco importadas. Estas modificaciones pueden refinar y optimizar aún más el rendimiento del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo del mismo comprenderá una porción significativa de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

[0195] El término "totalmente humano" se refiere a una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, donde la molécula completa es de origen humano o consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica a una forma humana del anticuerpo o inmunoglobulina.

[0196] El término "aislado" significa alterado o apartado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido separado parcial o completamente de los materiales coexistentes de su estado natural sí está "aislado". Un ácido nucleico o una proteína aislados pueden existir en forma sustancialmente purificada, o pueden existir en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, una célula hospedadora.

[0197] En el contexto de la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaturas para las bases de ácido nucleico que se presentan comúnmente. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina y "U" se refiere a uridina.

[0198] El término "enlazado operablemente" o "control transcripcional" se refiere al enlace funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que resulta en la expresión de esta última. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico está enlazada operablemente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está enlazado operablemente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Las secuencias de ADN enlazadas operablemente pueden ser contiguas entre sí y, cuando sea necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, se encuentran en el mismo marco de lectura.

[0199] El término administración "parenteral" de una composición inmunogénica incluye, por ejemplo, técnicas de inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) o intraesternal, intratumoral o de infusión. El término "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y polímeros de los mismos en forma de cadena simple o de doble cadena. A menos que se limite específicamente, el término abarca los ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y se metabolizan de forma similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácido nucleico también abarca implícitamente variantes conservadoramente modificadas de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, SNP y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados pueden lograrse generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

[0200] Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente, y se refieren a un compuesto que comprende residuos de aminoácidos enlazados covalentemente por enlaces peptídicos. Una proteína o un péptido deben contener al menos dos aminoácidos, y no se impone ninguna limitación al número máximo de aminoácidos que pueden comprender la secuencia de una proteína o un péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Tal como se utiliza en el presente documento, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica como proteínas, de las que hay muchos tipos. "Polipéptidos" incluye, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Un polipéptido incluye un péptido natural, un péptido recombinante, un péptido recombinante o una combinación de los mismos.

[0201] El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de una secuencia de polinucleótidos.

[0202] El término "secuencia promotora/reguladora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto génico enlazado operablemente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y, en otros casos, esta secuencia puede incluir también una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede, por ejemplo, ser una que exprese el producto génico de una manera específica en un tejido.

[0203] El término promotor "constitutivo" se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando se enlaza operablemente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula en la mayoría o en todas las condiciones fisiológicas de la célula.

[0204] El término promotor "inducible" se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando se enlaza operablemente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente sólo cuando un inductor que corresponde al promotor está presente en la célula. El término promotor "específico de tejido" se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando se enlaza operablemente con un polinucleótido que codifica o especifica un gen, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente sólo si la célula es una célula del tipo de tejido correspondiente al promotor. El término "enlazador polipeptídico flexible" o "enlazador" como se utiliza en el contexto de un scFv se refiere a un enlazador peptídico que consiste en aminoácidos tales como residuos de glicina y/o serina utilizados solos o en combinación, para enlazar regiones de cadena pesada variable y cadena ligera variable juntas. En una realización, el enlazador polipeptídico flexible es un enlazador Gly/Ser y comprende la secuencia de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n, donde n es un número entero positivo igual o mayor que 1 (SEC ID NO: 609). Por ejemplo, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 y n=6, n=7, n=8, n=9 y n=10 (SEC ID NO: 606). En una realización, los enlazadores polipeptídicos flexibles incluyen, pero no se limitan a, (Gly<4>Ser)<4>(SEC ID NO: 27) o (Gly<4>Ser)<3>(SEC ID NO: 28). En otra realización, los enlazadores incluyen múltiples repeticiones de (Gly<2>Ser), (GlySer) o (Gly<3>Ser) (SEC ID NO: 29). También se incluyen dentro del alcance de la divulgación los enlazadores descritos en WO2012/138475).

[0205] Tal como se utiliza en el presente documento, una caperuza 5' (también denominada caperuza de ARN, caperuza de 7-metilguanosina de ARN o caperuza m<7>G de ARN) es un nucleótido de guanina modificado que se ha añadido al extremo "frontal" o 5' de un ARN mensajero eucariota poco después del inicio de la transcripción. La caperuza5' consiste en un grupo terminal que se enlaza al primer nucleótido transcrito. Su presencia es crítica para el reconocimiento por parte del ribosoma y la protección frente a las RNasas. La adición de caperuzas está acoplada a la transcripción y ocurre de forma co-transcripcional, de tal manera que cada una influye en la otra. Poco después del inicio de la transcripción, el extremo 5' del ARNm que se está sintetizando se une a un complejo sintetizador de caperuzas asociado a la ARN polimerasa. Este complejo enzimático cataliza las reacciones químicas que se requieren para la protección del ARNm. La síntesis se lleva a cabo como una reacción bioquímica de varios pasos. La fracción de recubrimiento puede modificarse para modular la funcionalidad del ARNm, tal como su estabilidad o la eficiencia de la traducción.

[0206] Tal como se utiliza en el presente documento, "ARN transcrito in vitro" se refiere a ARN, preferentemente ARNm, que se ha sintetizado in vitro. Generalmente, el ARN transcrito in vitro se genera a partir de un vector de transcripción in vitro. El vector de transcripción in vitro comprende una plantilla que se utiliza para generar el ARN transcrito in vitro.

[0207] Tal como se utiliza en el presente documento, un "poli(A)" es una serie de adenosinas acopladas por poliadenilación al ARNm. En la realización preferente de un constructo para expresión transitoria, el poliA está entre 50 y 5000 (SEC ID NO: 30), preferentemente mayor de 64, más preferentemente mayor de 100, más preferentemente mayor de 300 o 400. Las secuencias de poli(A) pueden modificarse químicamente o enzimáticamente para modular la funcionalidad del ARNm, tal como la localización, la estabilidad o la eficiencia de la traducción.

[0208] Tal como se utiliza en el presente documento, "poliadenilación" se refiere al enlace covalente de una fracción de poliadenilo, o su variante modificada, a una molécula de ARN mensajero. En los organismos eucariotas, la mayoría de las moléculas de ARN mensajero (ARNm) están poliadeniladas en el extremo 3'. La cola de poli(A) 3' es una larga secuencia de nucleótidos de adenina (a menudo varios cientos) que se añade al pre-ARN-m a través de la acción de una enzima, la poliadenilato polimerasa. En eucariotas superiores, la cola de poli(A) se añade a los transcritos que contienen una secuencia específica, la señal de poliadenilación. La cola de poli(A) y la proteína unida a ella ayudan a proteger el ARNm de la degradación por las exonucleasas. La poliadenilación también es importante para la terminación de la transcripción, la exportación del ARNm del núcleo y la traducción. La poliadenilación ocurre en el núcleo inmediatamente después de la transcripción del ADN en ARN, pero adicionalmente también puede ocurrir más tarde en el citoplasma. Después de que la transcripción ha sido terminada, la cadena de ARNm se escinde mediante la acción de un complejo de endonucleasas asociado a la ARN polimerasa. El sitio de escisión suele caracterizarse por la presencia de la secuencia de bases AAUAAA cerca del sitio de escisión. Después de que el ARNm ha sido escindido, se añaden residuos de adenosina al extremo 3' libre en el sitio de escisión.

[0209] Tal como se utiliza en el presente documento, "transitorio" se refiere a la expresión de un transgén no integrado durante un periodo de horas, días o semanas, en el que el periodo de tiempo de expresión es menor que el periodo de tiempo de expresión del gen si está integrado en el genoma o contenido dentro de un replicón plasmídico estable en la célula hospedadora.

[0210] Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento" y "que trata" se refieren a la reducción o mejora de la progresión, gravedad y/o duración de un trastorno proliferativo, o la mejora de uno o más síntomas (preferentemente, uno o más síntomas discernibles) de un trastorno proliferativo resultante de la administración de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos tales como un CAR de la divulgación). En realizaciones específicas, los términos "tratar", "tratamiento" y "que trata" se refieren a la mejora de al menos un parámetro físico medible de un trastorno proliferativo, tal como el crecimiento de un tumor, no necesariamente discernible por el paciente. En otras realizaciones los términos "tratar", "tratamiento" y "que trata" -se refieren a la inhibición de la progresión de un trastorno proliferativo, ya sea físicamente mediante, por ejemplo, la estabilización de un síntoma discernible, fisiológicamente mediante, por ejemplo, la estabilización de un parámetro físico, o ambos. En otras realizaciones, los términos "tratar", "tratamiento" y "que trata" se refieren a la reducción o estabilización del tamaño del tumor o del recuento de células cancerosas. El término "vía de transducción de señales" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señales que desempeñan un papel en la transmisión de una señal desde una porción de una célula a otra porción de una célula. La expresión "receptor de superficie celular" incluye moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y transmitir la señal a través de la membrana de una célula.

[0211] El término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos, humanos).

[0212] El término una célula "sustancialmente purificada" se refiere a una célula que está esencialmente libre de otros tipos celulares. Una célula sustancialmente purificada también se refiere a una célula que ha sido separada de otros tipos celulares con los que normalmente está asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, este término se refiere simplemente a las células que han sido separadas de las células con las que están asociadas de forma natural en su estado natural. En algunos aspectos, las células se cultivan in vitro. En otros aspectos, las células no se cultivan in vitro.

[0213] El término "terapéutico", tal como se utiliza en el presente documento, significa un tratamiento. Un efecto terapéutico se obtiene mediante la reducción, supresión, remisión o erradicación de un estado de enfermedad. El término "profilaxis", tal como se utiliza en el presente documento, significa la prevención o el tratamiento protector de una enfermedad o estado de enfermedad.

[0214] Los términos "antígeno asociado al cáncer" o "antígeno tumoral" se refieren indistintamente a una molécula (típicamente una proteína, carbohidrato o lípido) que se expresa en la superficie de una célula cancerosa, ya sea en su totalidad o como un fragmento (por ejemplo, MHC/péptido), y que es útil para el direccionamiento preferencial de un agente farmacológico hacia la célula cancerosa. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral es un marcador expresado tanto por células normales como por células cancerosas, por ejemplo, un marcador de linaje, por ejemplo, CD19 en células B. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral es una molécula de superficie celular que está sobreexpresada en una célula cancerosa en comparación con una célula normal, por ejemplo, sobreexpresión de 1 vez, sobreexpresión de 2 veces, sobreexpresión de 3 veces o más en comparación con una célula normal. En algunos cuerpos, un antígeno tumoral es una molécula de la superficie celular que se sintetiza de forma inapropiada en la célula cancerosa, por ejemplo, una molécula que contiene deleciones, adiciones o mutaciones en comparación con la molécula expresada en una célula normal. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral se expresará exclusivamente en la superficie celular de una célula cancerosa, en su totalidad o como un fragmento (por ejemplo, MHC/péptido), y no se sintetizará o expresará en la superficie de una célula normal. En algunas realizaciones, los CAR de la presente divulgación incluyen CAR que comprenden un dominio de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une a un péptido presentado en el MHC. Normalmente, los péptidos derivados de proteínas endógenas llenan las cavidades de las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) de clase I y son reconocidos por los receptores de células T (TCR) en los linfocitos T CD8 . Los Complejos MHC de clase I se expresan de forma constitutiva en todas las células nucleadas. En el cáncer, los complejos péptido/MHC específicos de virus y/o específicos de tumor representan una clase única de objetivos de superficie celular para la inmunoterapia. Se han descrito anticuerpos similares al TCR direccionados a péptidos derivados de antígenos víricos o tumorales en el contexto del antígeno leucocitario humano (HLA)-A1 o HLA-A2 (véase, por ejemplo, Sastry et al., J Virol..201185(5):1935-1942; Sergeeva et al, Blood, 2011117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010184(4):2156-2165; Willemsen et al, Gene Ther 20018(21) :1601-1608 ; Dao et al., Sci Transl Med 20135(176) :176ra33 ; Tassev et al., Cancer Gene Ther 201219(2):84-100). Por ejemplo, un anticuerpo similar al TCR puede identificarse a partir del cribado de una biblioteca, tal como una biblioteca de visualización de fagos scFv humanos.

[0216] El término "transfectado" o "transformado" o "transducido" se refiere a un procedimiento mediante el cual se transfiere o introduce ácido nucleico exógeno en la célula hospedadora. Una célula "transfectada" o "transformada" o "transducida" es aquella que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula sujeto primaria y su progenie.

[0218] El término "se une específicamente", se refiere a un anticuerpo, o un ligando, que reconoce y se une con una proteína compañera de unión (por ejemplo, antígeno tumoral) presente en una muestra, pero cuyo anticuerpo o ligando no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas en la muestra.

[0220] "Receptor de antígeno quimérico regulable (RCAR)", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un conjunto de polipéptidos, típicamente dos en las realizaciones más simples, que cuando están en una célula efectora inmunitaria, proporcionan a la célula especificidad para una célula objetivo, típicamente una célula cancerosa, y con generación de señal intracelular regulable. En algunas realizaciones, un RCAR comprende al menos un dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio de señalización transmembrana y citoplasmático (también denominado en el presente documento como "un dominio de señalización intracelular") que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora y/o molécula coestimuladora tal como se define en el presente documento en el contexto de una molécula CAR. En algunas realizaciones, el conjunto de polipéptidos en el RCAR no son contiguos entre sí, por ejemplo, están en diferentes cadenas polipeptídicas. En algunas realizaciones, el RCAR incluye un conmutador de dimerización que, en presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar los polipéptidos entre sí, por ejemplo, puede acoplar un dominio de unión al antígeno a un dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, el RCAR se expresa en una célula (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria) tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa RCAR (también denominada en el presente documento "célula RCARX"). En una realización, la célula RCARX es una célula T, y se denomina como célula RCART. En una realización, la célula RCARX es una célula NK, y se denomina como célula RCARN. El RCAR puede proporcionar a la célula que expresa RCAR especificidad para una célula objetivo, típicamente una célula cancerosa, y generación o proliferación de señales intracelulares regulables, lo que puede optimizar una propiedad efectora inmunitaria de la célula que expresa RCAR. En algunas realizaciones, una célula RCAR se basa, al menos en parte, en un dominio de unión al antígeno para proporcionar especificidad a una célula objetivo que comprende el antígeno unido por el dominio de unión a antígeno.

[0222] "Anclaje de membrana" o "dominio de fijación a membrana", tal como se utiliza dicho término en el presente documento, se refiere a un polipéptido o fracción, por ejemplo, un grupo miristoilo, suficiente para anclar un dominio extracelular o intracelular a la membrana plasmática.

[0224] "Dominio de conmutación", tal como se utiliza dicho término en el presente documento, por ejemplo, cuando se refiere a un RCAR, se refiere a una entidad, típicamente una entidad en base al polipéptido, que, en presencia de una molécula de dimerización, se asocia con otro dominio de conmutación. La asociación da lugar a un acoplamiento funcional de una primera entidad enlazada a, por ejemplo, fusionada a, un primer dominio de conmutación, y una segunda entidad enlazada a, por ejemplo, fusionada a, un segundo dominio de conmutación. Un primer y un segundo dominio de conmutación se denominan colectivamente conmutador de dimerización. En algunas realizaciones, el primer y el segundo dominio de conmutación son iguales entre sí, por ejemplo, son polipéptidos que tienen la misma secuencia primaria de aminoácidos, y se denominan colectivamente como conmutador de homodimerización. En algunas realizaciones, el primer y el segundo dominio de conmutación son diferentes entre sí, por ejemplo, son polipéptidos que tienen diferentes secuencias primarias de aminoácidos, y se denominan colectivamente como conmutador de heterodimerización. En algunas realizaciones, la conmutación es intracelular. En algunas realizaciones, la conmutación es extracelular. En algunas realizaciones, el dominio de conmutación es una entidad basada en un polipéptido, por ejemplo, bsada en FKBP o FRB, y la molécula de dimerización es una molécula pequeña, por ejemplo, un rapálogo. En algunas realizaciones, el dominio de conmutación es una entidad basada en un polipéptido, por ejemplo, un scFv que se une a un péptido myc, y la molécula de dimerización es un polipéptido, un fragmento del mismo, o un multímero de un polipéptido, por ejemplo, un ligando myc o multímeros de un ligando myc que se unen a uno o más scFvs myc. En algunas realizaciones, el dominio de conmutación es una entidad basada en un polipéptido, por ejemplo, el receptor myc, y la molécula de dimerización es un anticuerpo o fragmentos del mismo, por ejemplo, el anticuerpo myc.

[0225] "Molécula de dimerización", tal como se utiliza dicho término en el presente documento, por ejemplo, cuando se hace referencia a un RCAR, se refiere a una molécula que promueve la asociación de un primer dominio de conmutación con un segundo dominio de conmutación. En algunas realizaciones, la molécula de dimerización no se produce de forma natural en el sujeto, o no se produce en concentraciones que darían como resultado una dimerización significativa. En algunas realizaciones, la molécula de dimerización es una molécula pequeña, por ejemplo, rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001.

[0226] El término "bioequivalente" se refiere a una cantidad de un agente distinto del compuesto de referencia (por ejemplo, RAD001), requerida para producir un efecto equivalente al efecto producido por la dosis de referencia o la cantidad de referencia del compuesto de referencia ( por ejemplo, RAD001). En una realización, el efecto es el nivel de inhibición de mTOR, por ejemplo, medido por la inhibición de la quinasa P70 S6, por ejemplo, evaluado en un ensayo in vivo o in vitro, por ejemplo, medido por un ensayo descrito en el presente documento, por ejemplo, el ensayo de Boulay, o la medición de los niveles de S6 fosforilada mediante Westernblot. En una realización, el efecto es la alteración de la proporción de células T PD-1 positivas/PD-1 negativas, medida por clasificación celular. En una realización, una cantidad o dosis bioequivalente de un inhibidor de mTOR es la cantidad o dosis que logra el mismo nivel de inhibición de la quinasa P70 S6 que la dosis de referencia o cantidad de referencia de un compuesto de referencia. En una realización, una cantidad o dosis bioequivalente de un inhibidor de mTOR es la cantidad o dosis que logra el mismo nivel de alteración en la proporción de células T PD-1 positivas/PD-1 negativas que la dosis de referencia o cantidad de referencia de un compuesto de referencia.

[0227] El término "dosis baja, que potencia el sistema inmunitario" cuando se usa en conjunción con un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001 o rapamicina, o un inhibidor de mTOR catalítico, se refiere a una dosis de inhibidor de mTOR que inhibe parcialmente, pero no totalmente, la actividad de mTOR, por ejemplo, como se mide por la inhibición de la actividad de la quinasa P70 S6. En el presente documento se discuten procedimientos para evaluar la actividad de mTOR, por ejemplo, mediante la inhibición de la quinasa P70 S6. La dosis es insuficiente para resultar en una inmunosupresión completa, pero es suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria. En una realización, la dosis baja del inhibidor de mTOR que potencia el sistema inmunitario, , resulta en una disminución en el número de células T PD-1 positivas y/o un aumento en el número de células T PD-1 negativas, o un aumento en la proporción de células T PD-1 negativas/células T PD-1 positivas. En una realización, la dosis baja del inhibidor de mTOR que potencia el sistema inmunitario, resulta en un aumento en el número de células T vírgenes. En una realización, la dosis baja del inhibidor de mTOR que potencia el sistema inmunitario, resulta en uno o más de los siguientes: un aumento en la expresión de uno o más de los siguientes marcadores: CD62L<alta>CD127<alta>, CD27<+>, y BCL2, por ejemplo, en células T de memoria, por ejemplo, precursores de células T de memoria; una disminución en la expresión de KLRG1, por ejemplo, en células T de memoria, por ejemplo, precursores de células T de memoria; y

[0228] un aumento en el número de precursores de células T de memoria, por ejemplo, células con una cualquiera o una combinación de las siguientes características: aumento de CD62L<alto>, aumento de CD127<alto>aumento de CD27<+>, disminución de KLRG1 y aumento de BCL2;

[0229] En la que cualquiera de los cambios descritos anteriormente ocurre, por ejemplo, al menos de forma transitoria, por ejemplo, en comparación con un sujeto no tratado.

[0230] "Refractario" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una enfermedad, por ejemplo, cáncer, que no responde a un tratamiento. En algunas realizaciones, un cáncer refractario puede ser resistente a un tratamiento antes o al inicio del mismo. En otras realizaciones, el cáncer refractario puede volverse resistente durante un tratamiento. Un cáncer refractario también se denomina cáncer resistente.

[0231] "Recaída" o "recaer" tal como se utilizan en el presente documento se refieren al retorno o reaparición de una enfermedad (por ejemplo, cáncer) o los signos y síntomas de una enfermedad tal como cáncer después de un periodo de mejoría o capacidad de respuesta, por ejemplo, después de un tratamiento previo de una terapia, por ejemplo, terapia contra el cáncer. El periodo inicial de capacidad de respuesta puede implicar que el nivel de células cancerosas caiga por debajo de un determinado umbral, por ejemplo, por debajo del 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1%. La reaparición puede implicar que el nivel de células cancerosas aumente por encima de un determinado umbral, por ejemplo, por encima del 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1%. Por ejemplo, en el contexto de la B-ALL, la reaparición puede implicar, por ejemplo, una reaparición de blastos en la sangre, la médula ósea (> 5%) o cualquier sitio extramedular, después de una respuesta completa. Una respuesta completa, en este contexto, puede implicar < 5% de blastos en médula ósea. Más generalmente, en una realización, una respuesta (por ejemplo, respuesta completa o respuesta parcial) puede implicar la ausencia de MRD (enfermedad residual mínima) detectable. En una realización, el periodo inicial de capacidad respuesta dura al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 días; al menos 1, 2, 3 o 4 semanas; al menos 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 o 12 meses; o al menos 1, 2, 3, 4 o 5 años.

[0232] Intervalos: a lo largo de la presente divulgación, diversos aspectos de la invención pueden presentarse en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible en el alcance de la invención. Por consiguiente, la descripción de un intervalo debe considerarse como una divulgación específica de todos los subintervalos posibles, así como de los valores numéricos individuales dentro de dicho intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 debe considerarse como una divulgación específica de subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como de números individuales dentro de dicho intervalo, por ejemplo, 1,2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Como otro ejemplo, un intervalo tal como 95-99% de identidad, incluye algo con 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad, e incluye subintervalos tales como 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98%, y 98-99% de identidad. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

[0233] Descripción

[0234] Se proporcionan en el presente documento composiciones y procedimientos para tratar una enfermedad tal como cáncer, administrando una célula que comprende un receptor de antígeno quimérico que se direcciona a la mesotelina, por ejemplo, CAR de mesotelina, en combinación con un inhibidor de PD-L1. En el presente documento se divulgan componentes ejemplares para generar un CAR de mesotelina y una célula que expresa CAR de mesotelina. En el presente documento también se describen inhibidores de PD-L1 ejemplares. En realizaciones, la terapia de combinación de una célula que expresa CAR de mesotelina descrita en el presente documento y un inhibidor de PD-L1 descrito en el presente documento da como resultado uno o más de los siguientes: mejora o aumento de la actividad antitumoral de la célula que expresa CAR de mesotelina; aumento de la proliferación o persistencia de la célula que expresa CAR de mesotelina ; mejora o aumento de la infiltración de la célula que expresa CAR de mesotelina ; mejora de la inhibición de la progresión tumoral; retraso de la progresión tumoral; inhibición o reducción de la proliferación de células cancerosas; y/o reducción de la carga tumoral, por ejemplo, volumen o tamaño del tumor.

[0235] Como se demuestra en los ejemplos proporcionados en el presente documento, en algunas realizaciones, la administración del inhibidor de PD-L1 antes de la administración de una célula que expresa CAR de mesotelina da como resultado una mayor eficacia terapéutica, por ejemplo, mayor inhibición de la progresión y/o crecimiento tumoral, en algunos tipos de cáncer, por ejemplo, en comparación con la administración del inhibidor de PD-L1 después de la administración de una célula que expresa CAR de mesotelina o la administración del inhibidor de PD-L1 o la célula que expresa CAR de mesotelina solos.

[0236] Se sabe que PD-L1 regula a la baja la respuesta inmunitaria, por ejemplo, la respuesta inmunitaria antitumoral. PD-L1 también puede ser expresado por células cancerosas o células asociadas al cáncer, por ejemplo, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). Sin querer estar ligado a la teoría, en algunas realizaciones, un sujeto al que se le administra la terapia combinada descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, tiene más probabilidades de tener una mayor actividad antitumoral si el sujeto tiene uno o más de los siguientes: un cáncer que expresa, por ejemplo, expresa altamente PD-L1; un cáncer infiltrado por células inmunitarias antitumorales, por ejemplo, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL); y/o células asociadas al cáncer que expresan, por ejemplo, expresan altamente PD-L1, en comparación con un sujeto al que no se le administra la terapia combinada, o al que se le administra una célula que expresa CAR de mesotelina o un inhibidor de PD-L1 solos. Por ejemplo, sin querer estar ligado a la teoría, el tratamiento con un inhibidor de PD-L1 previene o reduce la regulación a la baja de la respuesta inmunitaria antitumoral, por ejemplo, el agotamiento de las células inmunitarias antitumorales, por ejemplo, TIL o células inmunitarias que expresan CAR de mesotelina, aumentando así la eficacia antitumoral.

[0237] Receptor de Antígeno Quimérico de Mesotelina (CAR)

[0238] La presente divulgación abarca células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células T o células NK) que comprenden una molécula CAR que se direcciona, por ejemplo, se une específicamente, a mesotelina (CAR de mesotelina). En una realización, las células efectoras inmunitarias están modificadas genéticamente para expresar el CAR de mesotelina. En una realización, las células efectoras inmunitarias comprenden un constructo de ácido nucleico recombinante que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican el CAR de mesotelina.

[0239] En realizaciones, el CAR de mesotelina comprende un dominio de unión al antígeno que se une específicamente a mesotelina, por ejemplo, dominio de unión a mesotelina, un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular. En una realización, la secuencia del dominio de unión a antígeno es contigua y está en el mismo marco de lectura que una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular. El dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio de señalización coestimulador y/o un dominio de señalización primario, por ejemplo, una cadena zeta. El dominio de señalización coestimuladora se refiere a una porción del CAR que comprende al menos una porción del dominio intracelular de una molécula coestimuladora.

[0241] Las secuencias de ejemplos no limitantes de diversos componentes que pueden formar parte de una molécula CAR de mesotelina descrita en el presente documento, se enumeran en la Tabla 1, donde "aa" significa aminoácidos, y "na" significa ácidos nucleicos que codifican el péptido correspondiente.

[0243] Tabla 1.Secuencias de diversos componentes de CAR (aa - secuencia de aminoácidos, na - secuencia de ácidos nucleicos)

[0246]

[0247]

[0248]

[0249]

[0250]

[0253] En un aspecto, un constructo CAR ejemplar comprende una secuencia líder opcional (por ejemplo, una secuencia líder descrita en el presente documento), un dominio de unión al antígeno extracelular (por ejemplo, un dominio de unión al antígeno descrito en el presente documento), una bisagra (por ejemplo, una región bisagra descrita en el presente documento), un dominio transmembrana (por ejemplo, un dominio transmembrana descrito en el presente documento), y un dominio estimulador intracelular (por ejemplo, un dominio estimulador intracelular descrito en el presente documento). En un aspecto, un constructo CAR ejemplar comprende una secuencia líder opcional (por ejemplo, una secuencia líder descrita en el presente documento), un dominio de unión al antígeno extracelular (por ejemplo, un dominio de unión al antígeno descrito en el presente documento), una bisagra (por ejemplo, una región bisagra descrita en el presente documento), un dominio transmembrana (por ejemplo, un dominio transmembrana descrito en el presente documento), un dominio de señalización coestimuladora intracelular (por ejemplo, un dominio de señalización coestimuladora descrito en el presente documento) y/o un dominio de señalización primario intracelular (por ejemplo, un dominio de señalización primario descrito en el presente documento).

[0254] En un aspecto, los CAR de mesotelina de la divulgación comprenden al menos un dominio de señalización intracelular seleccionado del grupo de un dominio de señalización CD137 (4-1BB), un dominio de señalización CD28, un dominio de señalización CD27, un dominio de señalización ICOS, un dominio de señalización CD3zeta, y cualquier combinación de los mismos. En un aspecto, los CAR de la divulgación comprenden al menos un dominio de señalización intracelular procedente de una o más molécula(s) costimuladora(s) seleccionada(s) de CD137 (4-1BB), CD28, CD27, o ICOS.

[0255] Dominio de unión a antígeno

[0256] En un aspecto, el CAR de la divulgación comprende un elemento de unión específico del objetivo denominado de otro modo como un dominio de unión al antígeno. En una realización, la porción del CAR que comprende el dominio de unión a antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que se direcciona, por ejemplo, se une específicamente a la mesotelina. En una realización, el dominio de unión a antígeno se orienta, por ejemplo, se une específicamente a la mesotelina humana.

[0257] El dominio de unión a antígeno puede ser cualquier dominio que se une al antígeno incluyendo pero no limitado a un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento funcional del mismo, que incluye pero no se limita a un anticuerpo de dominio único, tal como un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable (VHH) de nanoanticuerpo derivado de camélido, y a una estructura alternativa conocida en la técnica para funcionar como dominio de unión a antígeno, tal como un dominio de fibronectina recombinante, y similares. En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión a antígeno se derive de la misma especie en la que se utilizará finalmente el CAR. Por ejemplo, para su uso en humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión a antígeno del CAR comprenda residuos humanos o humanizados para el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Por lo tanto, en un aspecto, el dominio de unión a antígeno comprende un anticuerpo humano o un fragmento de anticuerpo.

[0259] En una realización, el dominio de unión a mesotelina comprende una o más (por ejemplo, las tres) regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1), regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2), y regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de un dominio de unión a mesotelina seleccionado de SEC ID NOS: 39-62 y una o más (por ejemplo, las tres) regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1), regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) y regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de un dominio de unión a mesotelina seleccionado de SEC ID NOS: 39-62. En una realización, el dominio de unión a mesotelina comprende una región variable de cadena ligera descrita en el presente documento (por ejemplo, en la Tabla 2) y/o una región variable de cadena pesada descrita en el presente documento (por ejemplo, en la Tabla 2). En una realización, el dominio de unión a mesotelina es un scFv que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2. En una realización, el dominio de unión a mesotelina (por ejemplo, un scFV) comprende: una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia con un 95-99% de identidad a una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2; y/o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia con un 95-99% de identidad a una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2.

[0261] En una realización, el dominio de unión a mesotelina comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento, por ejemplo, en la Tabla 2 o 3, se acopla a una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento, por ejemplo, en la Tabla 2 o 3, a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador descrito en el presente documento. En una realización, el dominio de unión anti-mesotelina humanizado incluye un enlazador (Gly4-Ser)n (SEC ID NO: 26), en el que n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 3 o 4. La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de cadena ligera-enlazador-región variable de cadena pesada o región variable de cadena pesada-enlazador-región variable de cadena ligera.

[0263] En otra realización, el dominio de unión a mesotelina comprende cualquier anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo conocido en la técnica que se une a la mesotelina. Ejemplos de otros anticuerpos antimesotelina o fragmento de anticuerpo de los mismos conocidos en la técnica incluyen los descritos en WO2009/120769 (por ejemplo, el anticuerpo m912, cuyas secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada son SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2 de WO2009/120769); Patente de EE.UU. No.6,083,502, Publicación de Patente de EE.UU. No. US2008/0261245, WO2009/068204, WO2010/111282, WO2014/004549, y Publicación de Patente de EE.UU. No. US2015/0274836.

[0265] En un aspecto, los anticuerpos de la divulgación pueden existir en una variedad de otras formas incluyendo, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')<2>, fragmentos Fv, fragmentos de anticuerpo scFv, Fvs enlazados por disulfuro (sdFv), un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1, anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio único, tales como sdAb (ya sea VL o VH), dominios VHH de camélidos, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos, tales como un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra, y una CDR aislada u otros fragmentos de unión a epítopos de un anticuerpo. En un aspecto, el fragmento de anticuerpo proporcionado en el presente documento es un scFv. En algunos casos, un scFv humano también puede derivarse de una biblioteca de visualización de levaduras.

[0267] En algunos casos, los scFvs pueden prepararse de acuerdo con el procedimiento conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Bird et al, (1988) Science 242:423-426 y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 85:5879-5883). Las moléculas ScFv pueden producirse enlazando las regiones VH y VL, por ejemplo, utilizando enlazadores polipeptídicos flexibles. Las moléculas scFv pueden comprender un enlazador (por ejemplo, un enlazador Ser-Gly) con una longitud y/o composición de aminoácidos optimizada. La longitud del enlazador puede afectar en gran medida la forma en que las regiones variables de un scFv se pliegan e interactúan. De hecho, si se emplea un enlazador polipeptídico corto (por ejemplo, entre 5-10 aminoácidos, se previene el plegamiento intracadena. También se requiere el plegamiento intercadena para unir las dos regiones variables y formar un sitio funcional de unión al epítopo. Para ejemplos de orientación y tamaño del enlazador véase, por ejemplo, Hollinger et al.1993 Proc Natl Acad. Sci. EE.UU.90:6444-6448, Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. Nos. 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, y Publicación PCT Nos. WO2006/020258 y WO2007/024715.

[0268] Un scFv puede comprender un enlazador de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más residuos de aminoácidos entre sus regiones VL y VH. La secuencia enlazadora puede comprender cualquier aminoácido natural. En algunas realizaciones, la secuencia enlazadora comprende los aminoácidos glicina y serina. En otra realización, la secuencia enlazadora comprende conjuntos de repeticiones de glicina y serina tales como (Gly<4>Ser)<n>, donde n es un número entero positivo igual o mayor que 1. (SEC ID NO: 135) En una realización, el enlazador puede ser (Gly<4>Ser)<4>(SEC ID NO: 27) o (Gly<4>Ser)<3>(SEC ID NO: 28). La variación de la longitud del enlazador puede retener o potenciar la actividad, dando lugar a una eficacia superior en los estudios de actividad.

[0269] Dominios de unión a antígeno de mesotelina y construcciones CAR ejemplares

[0270] Las construcciones CAR de mesotelina ejemplares divulgadas en el presente documento comprenden un scFv (por ejemplo, un scFv humano) como se divulga en la Tabla 2 o 3 del presente documento, opcionalmente precedido con una secuencia líder opcional (por ejemplo, SEC ID NO:1 y SEC ID NO:12 para secuencias líderes de aminoácidos y nucleótidos ejemplares, respectivamente). Las secuencias de los fragmentos scFv (secuencias de aminoácidos de SEC ID NOs: 39-62) se proporcionan en el presente documento en la Tabla 2. El constructo CAR de mesotelina puede incluir además un dominio bisagra opcional, por ejemplo, un dominio bisagra CD8 (por ejemplo, que incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 o codificada por una secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 13); un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana CD8 (por ejemplo, que incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6 o codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 17); un dominio intracelular, por ejemplo, un dominio intracelular 4-1BB (por ejemplo, que incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7 o codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 18; y un dominio de señalización funcional, por ejemplo, un dominio CD3 zeta (por ejemplo, que incluye la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 9 o 10, o codificada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 20 o 21). En determinadas realizaciones, los dominios son contiguos y se encuentran en el mismo marco de lectura para formar una única proteína de fusión. En otras realizaciones, el dominio se encuentra en polipéptidos separados, por ejemplo, como en una molécula RCAR como se describe en el presente documento.

[0271] En determinadas realizaciones, la molécula CAR mesotelina de longitud completa incluye la secuencia de aminoácidos de, o está codificada por la secuencia de nucleótidos de, M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, M11, M12, M13, M14, M15, M16, M17, M18, M19, M20, M21, M22, M23, M24, o ss1, proporcionada en la Tabla 2 o 3, o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, 95-99% idéntica a la misma, o hasta 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 cambios de aminoácidos) con respecto a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas.

[0272] En determinadas realizaciones, la molécula CAR de mesotelina, o el dominio de unión a antígeno de mesotelina, incluye la secuencia de aminoácidos scFv de, o está codificada por la secuencia de nucleótidos de, M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, M11, M12, M13, M14, M15, M16, M17, M18, M19, M20, M21, M22, M23, M24, o ss1, proporcionadas en la Tabla 2 o 3, o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, 95-99% idéntica a la misma, o hasta 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 cambios de aminoácidos) con respecto a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas.

[0273] En determinadas realizaciones, la molécula CAR de mesotelina, o el dominio de unión a antígeno de mesotelina, incluye la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera de M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, M11, M12, M13, M14, M15, M16, M17, M18, M19, M20, M21, M22, M23, M24, o ss1, proporcionadas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, 95-99% idéntica, o hasta 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 cambios de aminoácidos) con respecto a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas.

[0274] En determinadas realizaciones, la molécula CAR de mesotelina, o el dominio de unión a antígeno de mesotelina, incluye uno, dos o tres CDR de la región variable de cadena pesada (por ejemplo, HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3) de M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, M11, M12, M13, M14, M15, M16, M17, M18, M19, M20, M21, M22, M23, M24, o ss1, proporcionados en la Tabla 4; y/o una, dos o tres CDR de la región variable de cadena ligera (por ejemplo, LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3) de M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, M11, M12, M13, M14, M15, M16, M17, M18, M19, M20, M21, M22, M23, M24, o ss1, proporcionados en la Tabla 5; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo, 95-99% idéntica, o hasta 5, 4, 3, 2, o 1 cambios de aminoácidos) con respecto a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas.

[0275] Las secuencias de las CDR de los dominios scFv se muestran en la Tabla 4 para los dominios variables de cadena pesada y en la Tabla 5 para los dominios variables de cadena ligera.

[0276] Tabla 4. Secuencias de aminoácidos de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada (HC) de los scFv anti-mesotelina humana

[0277]

[0278] Tabla 5. Secuencias de aminoácidos de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera (LC) de los scFv anti-mesotelina humana

[0279]

[0280] Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de los dominios scFv de mesotelina y moléculas CAR de mesotelina se proporcionan en la Tabla 2 (secuencias de aminoácidos) y Tabla 3 (secuencias de ácidos nucleicos). En una realización, la molécula CAR de mesotelina incluye una secuencia líder descrita en el presente documento, por ejemplo, como se subraya en las secuencias proporcionadas en la Tabla 2. En una realización, la molécula CAR de mesotelina no incluye una secuencia líder.

[0282] Tabla 2:Secuencias de Aminoácidos de scFvs y CARs Humanos (el subrayado en negrita es la secuencia líder y el recuadro gris es una secuencia enlazadora). En el caso de los scFvs, los aminoácidos restantes son la región variable de la cadena pesada y las regiones variables de la cadena ligera, con cada una de las HC CDR (HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3) y las LC CDR (LC CDR1, LC CDR2, LCCDR3) subrayadas). En el caso de los CAR, los aminoácidos restantes son los aminoácidos restantes de los CAR).

[0284]

[0285]

[0286]

[0287]

[0288]

[0289]

[0290]

[0291] Tabla 3:Secuencias de Ácido Nucleico que codifican moléculas CAR (la secuencia líder está subrayada)

[0292]

[0293]

[0294]

[0295]

[0296]

[0297]

[0298]

[0299]

[0300]

[0301]

[0302]

[0303]

[0304]

[0307] CAR Biespecíficos

[0309] En una realización, una molécula de anticuerpo multiespecífico es una molécula de anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico tiene especificidad para no más de dos antígenos. Una molécula de anticuerpo biespecífico se caracteriza por una primera secuencia de dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión para un primer epítopo y una segunda secuencia de dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión para un segundo epítopo. En una realización, el primer y el segundo epítopos se encuentran en el mismo antígeno, por ejemplo, la misma proteína (o subunidad de una proteína multimérica). En una realización, el primer y el segundo epítopos se solapan. En una realización, el primer y el segundo epítopos no se solapan. En una realización, el primer y el segundo epítopos se encuentran en antígenos diferentes, por ejemplo, proteínas diferentes (o subunidades diferentes de una proteína multimérica). En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que tienen especificidad de unión para un primer epítopo y una secuencia de dominio variable de cadena pesada y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que tienen especificidad de unión para un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende una mitad de anticuerpo que tiene especificidad de unión para un primer epítopo y una mitad de anticuerpo que tiene especificidad de unión para un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende una mitad de anticuerpo, o fragmento del mismo, que tiene especificidad de unión para un primer epítopo y una mitad de anticuerpo, o fragmento del mismo, que tiene especificidad de unión para un segundo epítopo. En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífico comprende un scFv, o fragmento del mismo, que tiene especificidad de unión para un primer epítopo y un scFv, o fragmento del mismo, que tiene especificidad de unión para un segundo epítopo.

[0310] En determinadas realizaciones, la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, biespecífico o triespecífico). Los protocolos para generar moléculas de anticuerpos biespecíficos o heterodiméricos son conocidos en la técnica; incluyendo pero sin limitarse a, por ejemplo, el enfoque de "perilla en un agujero" descrito en,por ejemplo.,US 5731168; el emparejamiento Fc de dirección electrostática como se describe en,por ejemplo,WO 09/089004, WO 06/106905 y WO 2010/129304; Formación de heterodímeros de Dominios Modificados Genéticamente con Intercambio de Cadenas (SEED) como se describe en,por ejemplo,WO 07/110205; intercambio de brazos Fab como se describe en,por ejemplo,WO 08/119353, WO 2011/131746, y WO 2013/060867; conjugado de doble anticuerpo, por ejemplo, mediante reticulación de anticuerpos para generar una estructura biespecífica utilizando un reactivo heterobifuncional que tiene un grupo reactivo amina y un grupo reactivo sulfhidrilo como se describe en,por ejemplo,US 4433059; determinantes de anticuerpos biespecíficos generados por recombinación de medios anticuerpos (pares de cadenas pesadasligeras o Fabs) de diferentes anticuerpos a través de ciclo de reducción y oxidación de enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas, como se describe en,por ejemplo,US 4444878; anticuerpos trifuncionales, por ejemplo, tres fragmentos Fab' reticulados a través de grupos reactivos sulfhidrilo, como se describe en,por ejemplo,US5273743; proteínas de unión biosintéticas, por ejemplo,par de scFvs reticulados a través de las colas C-terminales preferentemente a través de reticulación química reactiva a disulfuro o amina, como se describe en,por ejemplo,US5534254; anticuerpos bifuncionales,por ejemplo,fragmentos Fab con diferentes especificidades de unión dimerizados a través de cremalleras de leucina (por ejemplo,c-fos y c-jun) que han reemplazado el dominio constante, como se describe en, por ejemplo, US5582996; receptores mono y oligovalentes biespecíficos y oligoespecíficos, por ejemplo, regiones VH-CH1 de dos anticuerpos (dos fragmentos Fab) enlazados a través de un espaciador polipeptídico entre la región CH1 de un anticuerpo y la región VH de otro anticuerpo típicamente con cadenas ligeras asociadas, como se describe en, por ejemplo,US5591828; conjugados de ADN-anticuerpo biespecíficos, por ejemplo., reticulación de anticuerpos o fragmentos Fab a través de una pieza de ADN de doble cadena, como se describe en, por ejemplo,US5635602; proteínas de fusión biespecíficas, por ejemplo, un constructo de expresión que contiene dos scFvs con un enlazador peptídico helicoidal hidrofílico entre ellos y una región constante completa, como se describe en, por ejemplo, US5637481; proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas, por ejemplo, dímeros de polipéptidos que tienen un primer dominio con región de unión de la región variable de la cadena pesada de Ig, y un segundo dominio con región de unión de la región variable de la cadena ligera de Ig, generalmente denominados dianticuerpos (también se abarcan estructuras de orden superior que crean moléculas biespecíficas, triespecíficas o tetraespecíficas, como se describe en, por ejemplo,US5837242; construcciones de minicuerpos con cadenas VL y VH enlazadas conectadas además con espaciadores peptídicos a una región bisagra de anticuerpo y región CH3, que pueden dimerizarse para formar moléculas biespecíficas/multivalentes, como se describe en, por ejemplo, US5837821; dominios VH y VL enlazados con un enlazador peptídico corto (por ejemplo,5 o 10 aminoácidos) o sin enlazador en absoluto en cualquier orientación, que pueden formar dímeros para formar dianticuerpos biespecíficos; trímeros y tetrámeros, como se describe en,por ejemplo,US5844094; cadenas de dominios VH (o dominios VL en miembros de la familia) conectados por enlaces peptídicos con grupos reticulables en el extremo C-terminal asociados además con dominios VL para formar una serie de FV (o scFvs), como se describe en, por ejemplo,US5864019; y polipéptidos de unión de cadena simple con un dominio VH y un dominio VL enlazados a través de un enlazador peptídico se combinan en estructuras multivalentes a través de reticulación no covalente o química para formar,por ejemplo,estructuras homobivalentes, heterobivalentes, trivalentes y tetravalentes utilizando tanto el formato de tipo scFV como el de diacuerpo, como se describe en, por ejemplo, US5869620. Moléculas multiespecíficas y biespecíficas ejemplares adicionales y procedimientos de fabricación de las mismas se encuentran, por ejemplo, en US5910573, US5932448, US5959083, US5989830, US6005079, US6239259, US6294353, US6333396, US6476198, US6511663, US6670453, US6743896, US6809185, US6833441, US7129330, US7183076, US7521056, US7527787, US7534866, US7612181, US2002004587A1, US2002076406A1, US2002103345A1, US2003207346A1, US2003211078A1, US2004219643A1, US2004220388A1, US2004242847A1, US2005003403A1, US2005004352A1, US2005069552A1, US2005079170A1, US2005100543A1, US2005136049A1, US2005136051A1, US2005163782A1, US2005266425A1, US2006083747A1, US2006120960A1, US2006204493A1, US2006263367A1, US2007004909A1, US2007087381A1, US2007128150A1, US2007141049A1, US2007154901A1, US2007274985A1, US2008050370A1, US2008069820A1, US2008152645A1, US2008171855A1, US2008241884A1, US2008254512A1, US2008260738A1, US2009130106A1, US2009148905A1, US2009155275A1, US2009162359A1, US2009162360A1, US2009175851A1, US2009175867A1, US2009232811A1, US2009234105A1, US2009263392A1, US2009274649A1, EP346087A2, WO0006605A2, WO02072635A2, WO04081051A1, WO06020258A2, WO2007044887A2, WO2007095338A2, WO2007137760A2, WO2008119353A1, WO2009021754A2, WO2009068630A1, WO9103493A1, WO9323537A1, WO9409131A1, WO9412625A2, WO9509917A1, WO9637621A2, WO9964460A1.

[0312] Dentro de cada anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, scFv) de una molécula de anticuerpo biespecífica, el VH puede estar aguas arriba o aguas abajo del VL. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aguas arriba (por ejemplo, scFv) se dispone con su VH (VH<1>) aguas arriba de su VL (VL<1>) y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aguas abajo (por ejemplo, scFv) se dispone con su VL (VL<2>) aguas arriba de su VH (VH<2>), de tal manera que la molécula de anticuerpo biespecífico global tiene la disposición VH<1>-VL<1>-VL<2>-VH<2>. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aguas arriba (por ejemplo, scFv) se dispone con su VL (VL<1>) aguas arriba de su VH (VH<1>) y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aguas abajo (por ejemplo, scFv) se dispone con su VH (VH<2>) aguas arriba de su VL (VL<2>), de tal manera que la molécula de anticuerpo biespecífico global tiene la disposición VL<1>-VH<1>-VH<2>-VL<2>. Opcionalmente, se dispone un enlazador entre los dos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, scFvs), por ejemplo, entre VL<1>y VL<2>si el constructo está dispuesto como VH<1>-VL<1>-VL<2>-VH<2>, o entre VH<1>y VH<2>si el constructo está dispuesto como VL<1>-VH<1>-VH<2>-VL<2>. El enlazador puede ser un enlazador como se describe en el presente documento, por ejemplo, un enlazador (Gly<4>-Ser)n, en el que n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 4 (SEC ID NO: 26). En general, el enlazador entre los dos scFvs debe ser lo suficientemente largo como para evitar el emparejamiento incorrecto entre los dominios de los dos scFvs. Opcionalmente, se dispone un enlazador entre la VL y la VH del primer scFv. Opcionalmente, se dispone un enlazador entre la VL y la VH del segundo scFv. En las construcciones que tienen múltiples enlazadores, dos o más de los enlazadores pueden ser iguales o diferentes. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un CAR biespecífico comprende VL, VH y opcionalmente uno o más enlazadores en una disposición como la descrita en el presente documento.

[0314] En un aspecto, la molécula de anticuerpo biespecífico se caracteriza por una primera secuencia de dominio variable de inmunoglobulina, por ejemplo, un scFv, que tiene especificidad de unión para la mesotelina, por ejemplo, comprende un scFv como se describe en el presente documento, por ejemplo, como se describe en la Tabla 2 o 3, o comprende las CDR de cadena ligera y/o las CDR de cadena pesada de un scFv de mesotelina descrito en el presente documento, y una segunda secuencia de dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión para un segundo epítopo en un antígeno diferente. En algunos aspectos, la segunda secuencia de dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión para un antígeno distinto de la mesotelina, por ejemplo, un antígeno expresado por una célula cancerosa o tumoral. En algunos aspectos, la segunda secuencia de dominio variable de inmunoglobulina tiene especificidad de unión para un antígeno seleccionado de un objetivo distinto de la mesotelina en células de estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-β, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato α, claudin6, GloboH, o proteína espermática 17, por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4, o Trop-2.

[0316] TCR quimérico

[0318] En un aspecto, los anticuerpos de mesotelina y fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación (por ejemplo, los divulgados en las Tablas 2 o 3) pueden injertarse en uno o más dominios constantes de una cadena de receptor de células T ("TCR"), por ejemplo, una cadena de TCR alfa o TCR beta, para crear un TCR quimérico que se une de forma específica a la mesotelina. Sin estar ligado a la teoría, se cree que los TCR quiméricos señalizarán a través del complejo TCR tras la unión al antígeno. Por ejemplo, un scFv de mesotelina como se divulga en el presente documento, puede injertarse en el dominio constante, por ejemplo, al menos una porción del dominio constante extracelular, el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático, de una cadena TCR, por ejemplo, la cadena TCR alfa y/o la cadena TCR beta. Como otro ejemplo, un fragmento de anticuerpo de mesotelina, por ejemplo un dominio VL como se describe en el presente documento, puede injertarse en el dominio constante de una cadena TCR alfa, y un fragmento de anticuerpo de mesotelina, por ejemplo un dominio VH como se describe en el presente documento, puede injertarse en el dominio constante de una cadena TCR beta (o alternativamente, un dominio VL puede injertarse en el dominio constante de la cadena TCR beta y un dominio VH puede injertarse en una cadena TCR alfa). Como otro ejemplo, las CDR de un anticuerpo de mesotelina o fragmento de anticuerpo, por ejemplo, las CDR de un anticuerpo de mesotelina o fragmento de anticuerpo como se describe en las Tablas 4 o 5 pueden injertarse en una cadena alfa y/o beta de TCR para crear un TCR quimérico que se une específicamente a la mesotelina. Por ejemplo, los LCDR divulgados en el presente documento pueden injertarse en el dominio variable de una cadena TCR alfa y los HCDR divulgados en el presente documento pueden injertarse en el dominio variable de una cadena TCR beta, o viceversa. Tales TCR quiméricos pueden producirse por procedimientos conocidos en la técnica (Por ejemplo, Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al, Gene Ther.2012 Apr;19(4):365-74).

[0320] Dominio transmembrana

[0322] Con respecto al dominio transmembrana, en diversas realizaciones, un CAR puede diseñarse para comprender un dominio transmembrana que está acoplado al dominio extracelular del CAR. Un dominio transmembrana puede incluir uno o más aminoácidos adicionales adyacentes a la región transmembrana, por ejemplo, uno o más aminoácidos asociados con la región extracelular de la proteína de la que se derivó la transmembrana (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 hasta 15 aminoácidos de la región extracelular) y/o uno o más aminoácidos adicionales asociados con la región intracelular de la proteína de la que deriva la proteína transmembrana (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 hasta 15 aminoácidos de la región intracelular). En un aspecto, el dominio transmembrana es uno que está asociado con uno de los otros dominios del CAR que se utiliza, por ejemplo, en una realización, el dominio transmembrana puede ser de la misma proteína de la que se deriva el dominio de señalización, el dominio coestimulador o el dominio bisagra. En otro aspecto, el dominio transmembrana no deriva de la misma proteína de la que deriva cualquier otro dominio del CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana puede seleccionarse o modificarse mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de tales dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de membrana de superficie, por ejemplo, para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. En un aspecto, el dominio transmembrana es capaz de homodimerizarse con otro CAR en la superficie celular de una célula que expresa CAR. En otro aspecto, la secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana puede modificarse o sustituirse para minimizar las interacciones con los dominios de unión del compañero de unión nativo presente en la misma célula que expresa CAR.

[0324] El dominio transmembrana puede derivarse de una fuente natural o de una recombinante. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivarse de cualquier proteína unida a la membrana o transmembrana. En un aspecto, el dominio transmembrana es capaz de señalizar al (a los) dominio(s) intracelular(es) siempre que el CAR se haya unido a un objetivo. Un dominio transmembrana de uso particular en esta invención puede incluir al menos el/los dominio(s) transmembrana de, por ejemplo, la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8 (por ejemplo, CD8 alfa, CD8 beta), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. En algunas realizaciones, un dominio transmembrana puede incluir al menos la(s) región(es) transmembrana de, por ejemplo, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R α, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D y NKG2C.

[0325] En algunos casos, el dominio transmembrana puede acoplarse a la región extracelular del CAR, por ejemplo, el dominio de unión a antígeno del CAR, a través de una bisagra, por ejemplo, una bisagra de una proteína humana. Por ejemplo, en una realización, la bisagra puede ser una bisagra Ig (inmunoglobulina) humana (por ejemplo, una bisagra IgG4, una bisagra IgD), un enlazador GS (por ejemplo, un enlazador GS descrito en el presente documento), una bisagra KIR2DS2 o una bisagra CD8a. En una realización, la bisagra o espaciador comprende (por ejemplo, consiste en) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2. En un aspecto, el dominio transmembrana comprende (por ejemplo, consiste en) un dominio transmembrana de SEC ID NO: 6.

[0326] En un aspecto, la bisagra o espaciador comprende una bisagra IgG4. Por ejemplo, en una realización, la bisagra o espaciador comprende una bisagra de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO:3.

[0327] En algunas realizaciones, la bisagra o espaciador comprende una bisagra codificada por una secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:14.

[0328] En un aspecto, la bisagra o espaciador comprende una bisagra IgD. Por ejemplo, en una realización, la bisagra o espaciador comprende una bisagra de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO:4.

[0329] En algunas realizaciones, la bisagra o espaciador comprende una bisagra codificada por una secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:15.

[0330] En un aspecto, el dominio transmembrana puede ser recombinante, en cuyo caso comprenderá residuos predominantemente hidrófobos tales como leucina y valina. En un aspecto, un triplete de fenilalanina, triptófano y valina puede encontrarse en cada extremo de un dominio transmembrana recombinante.

[0331] Opcionalmente, un enlazador oligo o polipeptídico corto, de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud puede formar el enlace entre el dominio transmembrana y la región de señalización citoplasmática del CAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un enlazador especialmente adecuado. Por ejemplo, en un aspecto, el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGS (SEC ID NO:5). En algunas realizaciones, el enlazador está codificado por una secuencia de nucleótidos de GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEC ID NO: 16).

[0332] En un aspecto, la bisagra o espaciador comprende una bisagra KIR2DS2 y porciones de la misma.

[0333] Dominio citoplasmático

[0334] El dominio o región citoplasmática del CAR incluye un dominio de señalización intracelular. Un dominio de señalización intracelular es generalmente responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se ha introducido el CAR. El término "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede ser la actividad citolítica o la actividad auxiliadora, incluyendo la secreción de citoquinas. Por lo tanto, el término "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de función efectora y dirige a la célula para que realice una función especializada. Aunque usualmente se puede emplear todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario utilizar toda la cadena. En la medida en que se utilice una porción truncada del dominio de señalización intracelular, tal porción truncada puede utilizarse en lugar de la cadena intacta siempre que transduzca la señal de función efectora. Por lo tanto, el término dominio de señalización intracelular incluye cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora.

[0335] Ejemplos de dominios de señalización intracelular para su uso en el CAR de la divulgación incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de células T (TCR) y correceptores que actúan en conjunto para iniciar la transducción de señales tras la unión del receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia recombinante que tenga la misma capacidad funcional.

[0336] Es sabido que las señales generadas únicamente a través del TCR son insuficientes para la activación completa de la célula T y que también se requiere una señal secundaria y/o coestimuladora. Por lo tanto, se puede decir que la activación de las células T está mediada por dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmática: las que inician la activación primaria dependiente del antígeno a través del TCR (dominios de señalización intracelular primaria) y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (dominio citoplasmático secundario, por ejemplo, un dominio coestimulador).

[0337] Un dominio de señalización citoplasmático primario regula la activación primaria del complejo TCR ya sea de manera estimuladora, o de manera inhibidora. Los dominios de señalización intracelular primaria que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosinas de inmunorreceptores o ITAM.

[0338] Ejemplos de ITAM que contienen dominios de señalización intracelular primaria que son de uso particular en la invención incluyen los de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa,, FcR beta (Fc Epsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta , CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (también conocido como "ICOS"), FcεRI, CD66d, DAP10, y DAP12. En una realización, un CAR de la divulgación comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primario de CD3-zeta, por ejemplo, una secuencia de CD3-zeta descrita en el presente documento.

[0339] En una realización, un dominio de señalización primario comprende un dominio ITAM modificado, por ejemplo, un dominio ITAM mutado que tiene actividad alterada (por ejemplo, aumentada o disminuida) en comparación con el dominio ITAM nativo. En una realización, un dominio de señalización primario comprende un dominio de señalización intracelular primario que contiene ITAM modificado, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario que contiene ITAM optimizado y/o truncado. En una realización, un dominio de señalización primario comprende uno, dos, tres, cuatro o más motivos ITAM.

[0340] Otros ejemplos de moléculas que contienen un dominio de señalización intracelular primario que son de uso particular en la invención incluyen las de DAP10, DAP12 y CD32.

[0341] El dominio intracelular del CAR puede comprender el dominio de señalización CD3-zeta por sí mismo o puede combinarse con cualquier otro(s) dominio(s) de señalización intracelular deseado(s) útil(es) en el contexto de un CAR de la divulgación. Por ejemplo, el dominio de señalización intracelular del CAR puede comprender una porción de cadena CD3 zeta y un dominio de señalización coestimulador. El dominio de señalización coestimuladora se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta eficaz de los linfocitos a un antígeno. Ejemplos de tales moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1 (también conocida como PD1), ICOS, antígeno asociado a la función linfocitaria-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, y un ligando que se une específicamente con CD83, y similares. Por ejemplo, se ha demostrado que la coestimulación de CD27 potencia la expansión, la función efectora y la supervivencia de las células CART humanas in vitro y aumenta la persistencia de las células T humanas y la actividad antitumoral in vivo (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706). Otros ejemplos de tales moléculas coestimuladoras incluyen una molécula MHC de clase I, una proteína receptora de TNF, una proteína similar a la inmunoglobulina, un receptor de citoquina, una integrina, una molécula de activación linfocítica de señalización (proteína SLAM), un receptor activador de células NK, BTLA, un receptor de ligando Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83. Por ejemplo, se ha demostrado que la coestimulación de CD27 potencia la expansión, la función efectora y la supervivencia de las células CART humanas in vitro y aumenta la persistencia de las células T humanas y la actividad antitumoral in vivo (Song et al. Blood.2012; 119(3):696-706).

[0342] Los dominios de señalización intracelular dentro de la porción citoplasmática del CAR de la divulgación pueden estar enlazados entre sí en un orden aleatorio o especificado. Opcionalmente, un enlazador oligo o polipeptídico corto, por ejemplo, entre 2 y 10 aminoácidos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) de longitud puede formar el enlace entre dominios de señalización intracelular. En una realización, puede utilizarse un doblete de glicina-serina como un enlazador adecuado. En una realización, un solo aminoácido, por ejemplo, una alanina, una glicina, puede ser utilizado como un enlazador adecuado.

[0343] En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más, dominios de señalización coestimuladores. En una realización, los dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más, dominios de señalización coestimuladora, están separados por una molécula enlazadora, por ejemplo, una molécula enlazadora descrita en el presente documento. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende dos dominios de señalización coestimuladora. En algunas realizaciones, la molécula enlazadora es un residuo de glicina. En algunas realizaciones, el enlazador es un residuo de alanina.

[0344] En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB. En un aspecto, el dominio de señalización de 4-1BB es un dominio de señalización de SEC ID NO: 7. En un aspecto, el dominio de señalización de CD3-zeta es un dominio de señalización de SEC ID NO: 9 (CD3-zeta mutante) o SEC ID NO: 10 (CD3-zeta humano de tipo salvaje).

[0345] En un aspecto, el intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB. En un aspecto, el dominio de señalización de 4-1BB comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7. En un aspecto, el dominio de señalización de 4-1BB está codificado por una secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 18.

[0346] En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD27. En un aspecto, el dominio de señalización de CD27 comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:8. En un aspecto, el dominio de señalización de CD27 está codificado por una secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 19.

[0347] En un aspecto, el intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En un aspecto, el dominio de señalización de CD28 comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 44. En un aspecto, el dominio de señalización de CD28 está codificado por una secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 45.

[0348] En un aspecto, el intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de ICOS. En un aspecto, el dominio de señalización de ICOS comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 42. En un aspecto, el dominio de señalización de ICOS está codificado por una secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 43.

[0349] Receptor de Células Asesinas Naturales (NKR) CARs

[0350] En una realización, la molécula CAR descrita en el presente documento comprende uno o más componentes de un receptor de células asesinas naturales (NKR), formando así un NKR-CAR. El componente NKR puede ser un dominio transmembrana, un dominio bisagra o un dominio citoplasmático de cualquiera de los siguientes receptores de células asesinas naturales: receptor similar a inmunoglobulina de células asesinas (KIR), por ejemplo, KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1, y KIR3DP1; receptor natural de citotoxicidad (NCR), por ejemplo, NKp30, NKp44, NKp46; familia de receptores de células inmunitarias de la molécula de activación linfocitaria de señalización (SLAM), por ejemplo, CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME y CD2F-10; receptores Fc (FcR), por ejemplo, CD16 y CD64; y receptores Ly49, por ejemplo, LY49A y LY49C. Las moléculas NKR-CAR descritas en el presente documento pueden interactuar con una molécula adaptadora o un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, DAP12. Configuraciones y secuencias ejemplares de moléculas CAR que comprenden componentes NKR se describen en la Publicación Internacional No. WO2014/145252.

[0351] CAR dividido

[0352] En algunas realizaciones, la célula que expresa CAR descrita en el presente documento, utiliza un CAR dividido. El enfoque CAR dividido se describe con más detalle en las publicaciones WO2014/055442 y WO2014/055657. Brevemente, un sistema CAR dividido comprende una célula que expresa un primer CAR que tiene un primer dominio de unión a antígeno y un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB), y la célula también expresa un segundo CAR que tiene un segundo dominio de unión a antígeno y un dominio de señalización intracelular (por ejemplo, CD3 zeta). Cuando la célula encuentra el primer antígeno, el dominio coestimulador se activa y la célula prolifera. Cuando la célula encuentra el segundo antígeno, se activa el dominio de señalización intracelular y comienza la actividad de destrucción celular. Por lo tanto, la célula que expresa CAR sólo se activa completamente en presencia de ambos antígenos. En realizaciones, el primer dominio de unión a antígeno reconoce el antígeno tumoral o el antígeno de células B descrito en el presente documento, por ejemplo, comprende un dominio de unión al antígeno descrito en el presente documento, y el segundo dominio de unión a antígeno reconoce un segundo antígeno, por ejemplo, un segundo antígeno tumoral o un segundo antígeno de células B descrito en el presente documento.

[0353] Coexpresión de CAR con Otras Moléculas o Agentes

[0354] Coexpresión de un Segundo CAR

[0355] En un aspecto, la célula que expresa CAR descrita en el presente documento puede comprender además un segundo CAR, por ejemplo, un segundo CAR que incluye un dominio de unión al antígeno diferente, por ejemplo, al mismo objetivo (mesotelina) o a un objetivo diferente (por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de estroma, por ejemplo, FAP; una objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-β, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato α, claudin6, GloboH, o proteína espermática 17, por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4, o Trop-2). En una realización, la célula que expresa CAR comprende un primer CAR que se direcciona a un primer antígeno e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización coestimuladora pero no un dominio de señalización primario, y un segundo CAR que se direcciona a un segundo antígeno diferente e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización primario pero no un dominio de señalización coestimulador. La colocación de un dominio de señalización coestimulador, por ejemplo, 4-1BB, CD28, CD27, OX-40 o ICOS, en el primer CAR, y el dominio de señalización primario, por ejemplo, CD3 zeta, en el segundo CAR puede limitar la actividad del CAR a las células en las que se expresan ambos objetivos. En una realización, la célula que expresa CAR comprende un primer CAR de mesotelina que incluye un dominio de unión a mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio coestimulador y un segundo CAR que se direcciona a un antígeno distinto de la mesotelina (por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-β, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato α, claudin6, GloboH, o proteína espermática 17, por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4 o Trop-2 ) e incluye un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primario. En otra realización, la célula que expresa CAR comprende un primer CAR de mesotelina que incluye un dominio de unión a mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primario y un segundo CAR que se direcciona a un antígeno distinto de la mesotelina (por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-β, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato α, claudin6, GloboH, o proteína espermática 17, por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4 o Trop-2) e incluye un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimulador.

[0357] En una realización, la célula que expresa CAR comprende un CAR de mesotelina descrito en el presente documento y un CAR inhibidor. En una realización, el CAR inhibidor comprende un dominio de unión al antígeno que se une a un antígeno que se encuentra en células normales pero no en células cancerosas, por ejemplo, células normales que también expresan mesotelina. En una realización, el CAR inhibidor comprende el dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio intracelular de una molécula inhibidora. Por ejemplo, el dominio intracelular del CAR inhibidor puede ser un dominio intracelular de PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina o TGFR beta.

[0359] En una realización, cuando la célula que expresa CAR comprende dos o más CAR diferentes, los dominios de unión a antígeno de los diferentes CAR pueden ser tales que los dominios de unión a antígeno no interactúen entre sí. Por ejemplo, una célula que expresa un primer y un segundo CAR puede tener un dominio de unión al antígeno del primer CAR, por ejemplo, como un fragmento, por ejemplo, un scFv, que no forma una asociación con el dominio de unión a antígeno del segundo CAR, por ejemplo, el dominio de unión a antígeno del segundo CAR es un VHH.

[0361] En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende moléculas de unión a antígeno de dominio único (SDAB) que incluyen moléculas cuyas regiones determinantes de complementariedad forman parte de un polipéptido de dominio único. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, dominios variables de cadena pesada, moléculas de unión naturalmente desprovistas de cadenas ligeras, dominios únicos derivados de anticuerpos convencionales de 4 cadenas, dominios modificados genéticamente y estructuras de dominio único distintas de los derivados de anticuerpos. Las moléculas SDAB pueden ser cualquiera de las de la técnica, o cualquier futura molécula de dominio único. Las moléculas SDAB pueden derivarse de cualquier especie, que incluyen, pero no se limitan a, ratón, humano, camello, llama, lamprea, pez, tiburón, cabra, conejo y bovino. Este término también incluye las moléculas de anticuerpos de dominio único de origen natural procedentes de especies distintas de los Camélidos y los tiburones.

[0363] En un aspecto, una molécula SDAB puede derivarse de una región variable de la inmunoglobulina que se encuentra en peces, tal como, por ejemplo, la que se deriva del isotipo de inmunoglobulina conocido como Receptor de Antígeno Novedoso (NAR) que se encuentra en el suero de tiburón. Procedimientos de producción de moléculas de dominio único derivadas de una región variable de NAR ("IgNARs") se describen en WO 03/014161 y Streltsov (2005) Protein Sci.14:2901-2909.

[0365] De acuerdo con otro aspecto, una molécula SDAB es una molécula de unión a antígeno de dominio único de origen natural conocida como cadena pesada desprovista de cadenas ligeras. Tales moléculas de dominio único se divulgan en WO 9404678 y Hamers-Casterman, C. et al.. (1993) Nature 363:446-448, por ejemplo. Por razones de claridad, este dominio variable derivado de una molécula de cadena pesada naturalmente desprovista de cadena ligera se conoce en el presente documento como VHH o nanocuerpo para distinguirlo del VH convencional de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Tal molécula VHH puede derivarse de especies Camelidae, por ejemplo en camello, llama, dromedario, alpaca y guanaco. Otras especies además de Camelidae pueden producir moléculas de cadena pesada naturalmente desprovistas de cadena ligera; tales VHH están dentro del alcance de la divulgación.

[0366] Las moléculas SDAB pueden ser recombinantes, CDR-injertadas, humanizadas, camelizadas, desinmunizadas y/o generadas in vitro (por ejemplo, seleccionadas por visualización de fagos).

[0367] También se ha descubierto, que las células que tienen una pluralidad de receptores quiméricos incrustados en membrana que comprenden un dominio de unión al antígeno que las interacciones entre el dominio de unión a antígeno de los receptores pueden ser indeseables, por ejemplo, porque inhibe la capacidad de uno o más de los dominios de unión a antígeno para unirse a su antígeno cognado. En consecuencia, se divulgan en el presente documento células que tienen un primer y un segundo receptor quimérico no natural incrustado en membrana que comprenden dominios de unión a antígeno que minimizan tales interacciones. También se divulgan aquí ácidos nucleicos que codifican un primer y un segundo receptor quimérico no natural incrustado en membrana que comprenden dominios de unión a antígeno que minimizan tales interacciones, así como procedimientos de fabricación y uso de tales células y ácidos nucleicos. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno del primer y del segundo receptor quimérico no natural incrustado en membrana comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón.

[0368] En algunas realizaciones, la divulgación comprende un primer y un segundo CAR, en las que el dominio de unión a antígeno de uno del primer y el segundo CAR no comprende un dominio ligero variable y un dominio pesado variable. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno del primer y del segundo CAR es un scFv, y el otro no es un scFv. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno del primer y del segundo CAR comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno del primer y del segundo CAR comprende un nanocuerpo. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno del primer y del segundo CAR comprende un dominio VHH de camélido.

[0369] En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno del primer y el segundo CAR comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno del primer y del segundo CAR comprende un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno del primer y del segundo CAR comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VHH de camélido.

[0370] En algunas realizaciones, cuando está presente en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión a antígeno del primer CAR a su antígeno cognado no se reduce sustancialmente por la presencia del segundo CAR. En algunas realizaciones, la unión del dominio de unión a antígeno del primer CAR a su antígeno cognado en presencia del segundo CAR es del 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la unión del dominio de unión a antígeno del primer CAR a su antígeno cognado en ausencia del segundo CAR.

[0371] En algunas realizaciones, cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión a antígeno del primer y del segundo CAR, se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv. En algunas realizaciones, los dominios de unión a antígeno del primer y del segundo CAR, se asocian entre sí un 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv.

[0372] Coexpresión de un Agente que Potencia la Actividad CAR

[0373] En otro aspecto, la célula que expresa CAR descrita en el presente documento puede expresar además otro agente, por ejemplo, un agente que potencia la actividad o la aptitud de una célula que expresa CAR.

[0374] Por ejemplo, en una realización, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de células T. En algunas realizaciones, la molécula que modula o regula la función de las células T es una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, PD1, pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR para montar una respuesta inmunitaria efectora. Algunos ejemplos de moléculas inhibidoras son PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina o TGFR beta.

[0375] En realizaciones, un agente, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNds, por ejemplo, un ARNsi o ARNsh; o por ejemplo, una proteína o sistema inhibidor, por ejemplo, unas repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), o una endonucleasa de dedos de zinc (ZFN), por ejemplo, como se describe en el presente documento, puede utilizarse para inhibir la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T en la célula que expresa CAR. En una realización, el agente es un ARNsh, por ejemplo, un ARNsh descrito en el presente documento. En una realización, el agente que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se inhibe dentro de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, una molécula de ARNds que inhibe la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T está enlazada al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR.

[0377] En una realización, el agente que inhibe una molécula inhibidora comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociado con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento. En una realización, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina o TGFR beta, o un fragmento de cualquiera de ellos (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de cualquiera de ellos), y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como se describe en el presente documento) y/o un dominio de señalización primario (por ejemplo, un dominio de señalización CD3 zeta descrito en el presente documento). En una realización, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento del mismo (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de PD1), y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento (por ejemplo, un dominio de señalización CD28 descrito en el presente documento y/o un dominio de señalización CD3 zeta descrito en el presente documento). PD1 es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28 que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en células B activadas, células T y células mieloides (Agata et al.1996 Int. Immunol 8:765-75). Se ha demostrado que dos ligandos de PD1, PD-L1 y PD-L2, regulan a la baja la activación de células T al unirse a PD1 (Freeman et a.

[0378] 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol<32:634-43). PD-L1 es abundante en los cánceres humanos (Dong et al.>)<2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al.>

[0379] 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). La inmunosupresión puede revertirse inhibiendo la interacción local de PD1 con PD-L1.

[0381] En una realización, el agente comprende el dominio extracelular (ECD) de una molécula inhibidora, por ejemplo, Muerte Programada 1 (PD1), que puede estar fusionada a un dominio transmembrana y a dominios de señalización intracelular tales como 4-1BB y CD3 zeta (también denominado en el presente documento como un CAR PD1). En una realización, el CAR PD1, cuando se utiliza en combinación con un CAR de mesotelina descrito en el presente documento, mejora la persistencia de la célula T. En una realización, el CAR es un CAR PD1 que comprende el dominio extracelular de PD1 indicado como subrayado en SEC ID NO: 24 y una secuencia señal en los aminoácidos 1-21 de SEC ID NO:24. En una realización, el CAR PD1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:24.

[0383] En una realización, el CAR PD1 sin la secuencia señal N-terminal comprende la secuencia de aminoácidos proporcionada de SEC ID NO:22.

[0385] En una realización, el agente comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR PD1 con la secuencia señal N-terminal, por ejemplo, el CAR PD1 descrito en el presente documento. En una realización, la secuencia de ácido nucleico para el CAR PD1 se muestra en la Tabla 1, con el ECD PD1 subrayado en SEC ID NO: 23.

[0387] En otro ejemplo, en una realización, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR puede ser una molécula coestimuladora o un ligando de molécula coestimuladora. Algunos ejemplos de moléculas coestimuladoras son la molécula MHC de clase I, BTLA y un receptor de ligando Toll, así como OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) y 4-1BB (CD137). Otros ejemplos de tales moléculas coestimuladoras incluyen CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83, por ejemplo como se describe en el presente documento. Algunos ejemplos de ligandos de moléculas coestimuladoras son CD80, CD86, CD40L, ICOSL, CD70, OX40L, 4-1BBL, GITRL y LIGHT. En algunas realizaciones, el ligando de molécula coestimuladora es un ligando para una molécula coestimuladora diferente del dominio de molécula coestimuladora del CAR. En algunas realizaciones, el ligando de molécula coestimuladora es un ligando para una molécula coestimuladora que es la misma que el dominio de molécula coestimuladora del CAR. En una realización, el ligando de la molécula coestimuladora es 4-1BBL. En una realización, el ligando coestimulador es CD80 o CD86. En una realización, el ligando de la molécula coestimuladora es CD70. En algunas realizaciones, una célula efectora inmunitaria que expresa CAR descrita en el presente documento puede modificarse genéticamente además para que exprese una o más moléculas coestimuladoras o ligandos de moléculas coestimuladoras adicionales.

[0389] Coexpresión de CAR con un Receptor de Quimiocina

[0391] En realizaciones, la célula que expresa CAR descrita en el presente documento, por ejemplo, la célula que expresa CAR de mesotelina, comprende además una molécula receptora de quimiocina. La expresión transgénica de los receptores de quimiocina CCR2b o CXCR2 en células T potencia el tráfico hacia tumores sólidos secretores de CCL2 o CXCL1, incluyendo el melanoma y el neuroblastoma (Craddock et al., J Immunother.2010 Oct; 33(8):780-8 y Kershaw et al., Hum Gene Ther.1 de noviembre de 2002; 13(16):1971-80). Por lo tanto, sin querer estar ligado a la teoría, se cree que los receptores de quimiocina expresados en las células que expresan CAR que reconocen quimiocinas secretadas por tumores, por ejemplo, tumores sólidos, pueden mejorar la migración de la célula que expresa CAR hacia el tumor, facilitar la infiltración de la célula que expresa CAR en el tumor y mejorar la eficacia antitumoral de la célula que expresa CAR. La molécula receptora de quimiocina puede comprender un receptor de quimiocina natural o recombinante o un fragmento de unión a quimiocina del mismo. Una molécula receptora de quimiocina adecuada para expresión en una célula que expresa CAR (por ejemplo, CAR-Tx) descrita en el presente documento incluye un receptor de quimiocina CXC (por ejemplo, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6 o CXCR7), un receptor de quimiocina CC (por ejemplo, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, o CCR11), un receptor de quimiocina CX3C (por ejemplo, CX3CR1), un receptor de quimiocina XC (por ejemplo, XCR1), o un fragmento de unión a quimiocina del mismo. En una realización, la molécula receptora de quimiocina que se expresará con un CAR descrito en el presente documento se selecciona en base a la(s) quimiocina(s) secretada(s) por el tumor. En una realización, la célula que expresa CAR descrita en el presente documento comprende además, por ejemplo, expresa, un receptor CCR2b o un receptor CXCR2. En una realización, el CAR descrito en el presente documento y la molécula receptora de quimiocina están en el mismo vector o están en dos vectores diferentes. En las realizaciones en las que el CAR descrito en el presente documento y la molécula receptora de quimiocina están en el mismo vector, el CAR y la molécula receptora de quimiocina están cada uno bajo el control de dos promotores diferentes o están bajo el control del mismo promotor.

[0393] Construcciones de Ácido Nucleico que Codifican un CAR

[0395] La presente divulgación proporciona transgenes CAR que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican una o más construcciones CAR de la divulgación. En un aspecto, el transgén CAR se proporciona como un transcrito de ARN mensajero. En un aspecto, el transgén CAR se proporciona como un constructo de ADN.

[0397] Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en el que el CAR comprende un dominio de unión a anti-mesotelina (por ejemplo, un dominio de unión a anti-mesotelina humana), un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulador. En una realización, el dominio de unión a antimesotelina es un dominio de unión a anti-mesotelina descrito en el presente documento, por ejemplo, un dominio de unión a anti-mesotelina que comprende una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en SEC ID NO: 87-111, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador. En una realización, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En una realización, el dominio transmembrana comprende una secuencia de SEC ID NO: 6, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma. En una realización, el dominio de unión a anti-mesotelina está conectado al dominio transmembrana por una región bisagra, por ejemplo, una bisagra descrita en el presente documento. En una realización, la región bisagra comprende SEC ID NO:2 o SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4 o SEC ID NO:5, o una secuencia con un 95-99% de identidad a las mismas. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador. En una realización, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) y 4-1BB (CD137). Otros ejemplos de tales moléculas coestimuladoras incluyen CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76 y PAG/Cbp. En una realización, el dominio coestimulador comprende una secuencia de SEC ID NO:7, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 8, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma, y la secuencia de SEC ID NO: 9 o SEC ID NO: 10, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un constructo CAR que comprende una secuencia líder de SEC ID NO: 1, un dominio scFv con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 39; SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 48, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 50, SEC ID NO: 51, SEC ID NO: 52, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 54, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 56, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61, y SEC ID NO: 62, (o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma), una región bisagra de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4 o SEC ID NO:5 (o una secuencia con un 95-99% de identidad a las mismas), un dominio transmembrana que tiene una secuencia de SEC ID NO: 6 (o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma), un dominio coestimulador 4-1BB que tiene una secuencia de SEC ID NO:7 (o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma) o un dominio coestimulador CD27 que tiene una secuencia de SEC ID NO: 8 (o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma), y un dominio estimulador CD3 zeta que tiene una secuencia de SEC ID NO:9 o SEC ID NO: 10 (o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma).

[0399] En otro aspecto, la divulgación pertenece a una molécula polipeptídica aislada codificada por la molécula de ácido nucleico. En una realización, la molécula polipeptídica aislada comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 63; SEC ID NO: 64, SEC ID NO: 65, SEC ID NO: 66, SEC ID NO: 67, SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 70, SEC ID NO: 71, SEC ID NO: 72, SEC ID NO: 73, SEC ID NO: 74, SEC ID NO: 75, SEC ID NO: 76, SEC ID NO: 77, SEC ID NO: 78, SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 80, SEC ID NO: 81, SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 83, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 85, y SEC ID NO: 86, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma.

[0401] En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a anti-mesotelina, un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulador, y en el que el ácido nucleico que codifica el dominio de unión a anti-mesotelina comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 111; SEC ID NO: 112, SEC ID NO: 113, SEC ID NO: 114, SEC ID NO: 115, SEC ID NO: 116, SEC ID NO: 117, SEC ID NO: 118, SEC ID NO: 119, SEC ID NO: 120, SEC ID NO: 121, SEC ID NO: 122, SEC ID NO: 123, SEC ID NO: 124, SEC ID NO: 125, SEC ID NO: 126, SEC ID NO: 127, SEC ID NO: 128, SEC ID NO: 129, SEC ID NO: 130, SEC ID NO: 131, SEC ID NO: 132, SEC ID NO: 133, SEC ID NO:134, o una secuencia con un 95-99% de identidad a las mismas.

[0403] En una realización, la molécula CAR codificada comprende además una secuencia que codifica un dominio coestimulador. En una realización, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) y 4-1BB (CD137). En una realización, el dominio coestimulador comprende una secuencia de SEC ID NO:7. En una realización, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En una realización, el dominio transmembrana comprende una secuencia de SEC ID NO:6. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y un dominio de señalización funcional de zeta. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEC ID NO: 7 y la secuencia de SEC ID NO: 9, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En una realización, el dominio de unión a anti-mesotelina está conectado al dominio transmembrana por una región bisagra. En una realización, la región bisagra comprende SEC ID NO:2. En una realización, la región bisagra comprende SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, o SEC ID NO: 5.

[0405] En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de CAR aislada que comprende una secuencia líder de SEC ID NO: 1, un dominio scFv con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOS: 39-62, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma, una región bisagra de SEC ID NO:2 o SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 5, un dominio transmembrana que tiene una secuencia de SEC ID NO: 6, un dominio coestimulador 4-1BB que tiene una secuencia de SEC ID NO:7 o un dominio coestimulador CD27 que tiene una secuencia de SEC ID NO: 8, y un dominio estimulador CD3 zeta que tiene una secuencia de SEC ID NO:9 o SEC ID NO: 10. En una realización, la molécula CAR codificada comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOS: 63-86, o una secuencia con un 95-99% de identidad a la misma.

[0407] La presente divulgación proporciona además vectores que comprenden transgenes CAR. En un aspecto, un vector CAR puede transducirse directamente en una célula,por ejemplo,una célula T o una célula NK. En un aspecto, el vector es un vector de clonación o de expresión,por ejemplo,un vector que incluye, pero no se limita a, uno o más plásmidos (por ejemplo, plásmidos de expresión, vectores de clonación, minicírculos, minivectores, cromosomas de doble minuto), construcciones de vectores retrovirales y lentivirales. En un aspecto, el vector es capaz de expresar el constructo CAR en células T de mamífero o células NK. En un aspecto, la célula T de mamífero es una célula T humana o una célula NK humana.

[0408] La presente divulgación también incluye un constructo de ARN codificante de CAR que puede transfectarse directamente en una célula, por ejemplo, una célula T o una célula NK. Un procedimiento para generar ARNm para su uso en transfección implica la transcripción in vitro (IVT) de una plantilla con cebadores especialmente diseñados, seguida de la adición de poliA, para producir un constructo que contenga una secuencia no traducida 3' y 5' ("UTR") , una caperuza 5' y/o un Sitio de Entrada del Ribosoma Interno (IRES), el gen a expresar y una cola de poliA, típicamente de 50-2000 bases de longitud. El ARN así producido puede transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En un aspecto, la plantilla incluye secuencias para el CAR.

[0409] En un aspecto, el transgén CAR de mesotelina está codificado por un ARN mensajero (ARNm). En un aspecto, el ARNm que codifica el transgén CAR de mesotelina se introduce en una célula T para la producción de una célula CART, o una célula NK.

[0410] Vectores

[0411] La presente divulgación también proporciona vectores en los que se inserta un ADN de la presente divulgación. Los vectores derivados de retrovirus, tales como el lentivirus, son herramientas adecuadas para lograr la transferencia de genes a largo plazo, ya que permiten la integración estable y a largo plazo de un transgén y su propagación en células hijas. Los vectores lentivirales tienen la ventaja añadida sobre los vectores derivados de oncorretrovirus, tales como los virus de la leucemia murina, de que pueden transducir células no proliferantes, tales como los hepatocitos. También tienen la ventaja añadida de su baja inmunogenicidad. En una realización, el vector que comprende el ácido nucleico que codifica el CAR deseado de la divulgación es un ADN, un ARN, un plásmido, un vector adenoviral, un vector lentiviral o un vector retroviral. Un vector retroviral también puede ser, por ejemplo, un vector gammaretroviral. Un vector gammaretroviral puede incluir, por ejemplo, un promotor, una señal de empaquetamiento (ψ), un sitio de unión del cebador (PBS), una o más (por ejemplo, dos) repeticiones terminales largas (LTR), y un transgén de interés, por ejemplo, un gen que codifica un CAR. Un vector gammaretroviral puede carecer de genes estructurales virales tales como gag, pol y env. Los vectores gammaretrovirales ejemplares incluyen el Virus de la Leucemia Murina (MLV), el Virus Formador de Foco del Bazo (SFFV) y el Virus del Sarcoma Mieloproliferativo (MPSV), y los vectores derivados de los mismos. Otros vectores gammaretrovirales se describen, por ejemplo, en Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. Junio de 2011; 3(6): 677-713.

[0412] En otra realización, el vector que comprende el ácido nucleico que codifica el CAR deseado de la divulgación es un vector adenoviral (A5/35). En otra realización, la expresión de ácidos nucleicos que codifican CAR puede lograrse utilizando transposones tales como Sleeping Beauty, CRISPR, CAS9 y nucleasas de dedos de zinc. Véase, por ejemplo, June et al.2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716.

[0413] En breve resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican CAR se logra típicamente enlazando operablemente un ácido nucleico que codifica el polipéptido CAR o porciones del mismo a un promotor, e incorporando el constructo en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración de eucariotas. Los vectores de clonación típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada.

[0414] Las construcciones de expresión de la presente divulgación también pueden utilizarse para inmunización de ácido nucleico y terapia génica, utilizando protocolos de suministro de genes estándar. Los procedimientos de administración de genes son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pat. de EE.UU Nos. 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466. En otra realización, la divulgación proporciona un vector de terapia génica.

[0415] El ácido nucleico puede clonarse en varios tipos de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico puede clonarse en un vector que incluye, pero no se limita a, un plásmido, un fagémido, un derivado de fago, un virus animal y un cósmido. Los vectores de particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación.

[0416] Además, el vector de expresión puede proporcionarse a una célula en forma de un vector viral. La tecnología de vectores virales es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING:. A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY), y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus que son útiles como vectores incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios de endonucleasas de restricción convenientes, y uno o más marcadores seleccionables, (por ejemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; y Pat. de EE.UU No.6,326,193).

[0417] Se han desarrollado varios sistemas basados en virus para la transferencia de genes a células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de suministro de genes. Un gen seleccionado puede insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales utilizando técnicas conocidas en la técnica. Luego, el virus recombinante puede aislarse y suministrarse a las células del sujeto in vivo o ex vivo. Se conocen en la técnica varios sistemas retrovirales. En algunas realizaciones, se utilizan vectores adenovirales. Se conocen en la técnica varios vectores de adenovirus. En una realización, se utilizan vectores lentivirales.

[0418] Elementos promotores adicionales, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia de iniciación transcripcional. Típicamente, estos se localizan en la región de 30-110 pb aguas arriba del sitio de inicio, aunque se ha demostrado que varios promotores también contienen elementos funcionales aguas abajo del sitio de inicio. Con frecuencia, el espaciado entre los elementos promotores es flexible, de modo que la función promotora se mantiene cuando los elementos se invierten o se mueven unos respecto a otros. En el promotor de la timidina quinasa (tk), el espaciado entre los elementos promotores puede aumentar hasta 50 pb de separación antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar de forma cooperativa o independiente para activar la transcripción. Los promotores ejemplares incluyen los promotores del gen IE CMV, EF-1α, ubiquitina C o fosfogliceroquinasa (PGK).

[0419] Un ejemplo de un promotor que es capaz de expresar un transgén CAR en una célula T de mamífero es el promotor EF1alfa (EF1a o EF1α). El promotor nativo EF1a impulsa la expresión de la subunidad alfa del complejo del factor de elongación-1, que es responsable del suministro enzimático de los aminoacil ARNt al ribosoma. El promotor EF1a se ha utilizado ampliamente en plásmidos de expresión de mamíferos y ha demostrado ser eficaz para impulsar la expresión de CAR a partir de transgenes clonados en un vector lentiviral. Véase, por ejemplo, Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). En un aspecto, el promotor EF1a comprende la secuencia proporcionada como SEC ID NO:11.

[0420] Otro ejemplo de promotor es la secuencia promotora temprana inmediata del citomegalovirus (CMV). Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte capaz de impulsar altos niveles de expresión de cualquier secuencia polinucleotídica operativamente enlazada a ella. Sin embargo, también se pueden utilizar otras secuencias promotoras constitutivas, que incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano del virus simio 40 (SV40), el virus del tumor mamario de ratón (MMTV), el promotor de la repetición terminal larga (LTR) del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), el promotor MoMuLV, un promotor del virus de la leucemia aviar, un promotor temprano inmediato del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, así como promotores de genes humanos tales como, pero sin limitarse a, el promotor de la actina, el promotor de la miosina, el promotor del factor de elongación-1α, el promotor de la hemoglobina y el promotor de la creatina quinasa. Además, la divulgación no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. Los promotores inducibles también se contemplan como parte de la divulgación. El uso de un promotor inducible proporciona un conmutador molecular capaz de activar la expresión de la secuencia polinucleotídica a la que está enlazado operativamente cuando se desea tal expresión, o de desactivar la expresión cuando no se desea. Ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, un promotor de metalotioneína, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina.

[0421] Otro ejemplo de un promotor es el promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK). En algunas realizaciones, se puede desear un promotor PGK truncado (por ejemplo, un promotor PGK con una o más deleciones de nucleótidos, por ejemplo, 1, 2, 5, 10, 100, 200, 300 o 400, en comparación con la secuencia promotora PGK de tipo silvestre). A continuación se proporcionan las secuencias nucleotídicas de promotores de PGK ejemplares.

[0422] Promotor WT PGK

[0424]

[0425] Promotores PGK truncados ejemplares:

[0426] PGK100:

[0428]

[0431] PGK300:

[0433]

[0436] Un vector también puede incluir, por ejemplo, una secuencia señal para facilitar la secreción, una señal de poliadenilación y un terminador de transcripción (por ejemplo, del gen de la Hormona de Crecimiento Bovina (BGH)), un elemento que permita la replicación episomal y la replicación en procariotas (por ejemplo, origen SV40 y ColE1 u otros conocidos en la técnica) y/o elementos que permitan la selección (por ejemplo, gen de resistencia a ampicilina y/o marcador de zeocina).

[0438] Con el fin de evaluar la expresión de un polipéptido CAR o porciones del mismo, el vector de expresión que se va a introducir en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen reportero o ambos para facilitar la identificación y selección de células expresantes de la población de células que se pretende transfectar o infectar mediante vectores virales. En otros aspectos, el marcador seleccionable puede transportarse en una pieza separada de ADN y utilizarse en un procedimiento de cotransfección. Tanto los marcadores seleccionables como los genes reporteros pueden ir flanqueados con secuencias reguladoras adecuadas para permitir su expresión en las células hospedadoras. Los marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tales como neo y similares.

[0440] Los genes reporteros se utilizan para identificar células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen reportero es un gen que no está presente ni es expresado por el organismo o tejido receptor y que codifica un polipéptido cuya expresión se manifiesta por alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, la actividad enzimática. La expresión del gen reportero se analiza en un momento adecuado después de que el ADN haya sido introducido en las células receptoras.

[0441] Genes reporteros adecuados pueden incluir genes que codifican luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína verde fluorescente (por ejemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Los sistemas de expresión adecuados son bien conocidos y pueden prepararse utilizando técnicas conocidas u obtenerse comercialmente. En general, el constructo con la región flanqueante 5' mínima que muestra el nivel más alto de expresión del gen reportero se identifica como el promotor. Estas regiones promotoras pueden enlazarse a un gen reportero y utilizarse para evaluar la capacidad de los agentes para modular la transcripción impulsada por el promotor.

[0443] En una realización, el vector puede comprender además un ácido nucleico que codifica un segundo CAR. En una realización, el segundo CAR incluye un dominio de unión al antígeno a, por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-β, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato α, claudin6, GloboH, o proteína espermática 17; por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4, o Trop-2. En una realización, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer CAR que se direcciona a un primer antígeno e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización coestimulador pero no un dominio de señalización primario, y un ácido nucleico que codifica un segundo CAR que se direcciona a un segundo antígeno diferente e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización primario pero no un dominio de señalización coestimulador. En una realización, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un primer CAR de mesotelina que incluye un dominio de unión a mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio coestimulador y un ácido nucleico que codifica un segundo CAR que se direcciona a un antígeno distinto de la mesotelina (por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-β, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato α, claudin6, GloboH, o proteína espermática 17; por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4 o Trop-2) e incluye un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primario. En otra realización, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un primer CAR de mesotelina que incluye un dominio de unión a mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primario y un ácido nucleico que codifica un segundo CAR que se direcciona a un antígeno distinto de la mesotelina (por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-β, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato α, claudin6, GloboH, o proteína espermática 17; por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4 o Trop-2) e incluye un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimulador.

[0445] En una realización, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un CAR de mesotelina descrito en el presente documento y un ácido nucleico que codifica un CAR inhibidor. En una realización, el CAR inhibidor comprende un dominio de unión al antígeno que se une a un antígeno que se encuentra en células normales pero no en células cancerosas, por ejemplo, células normales que también expresan CLL. En una realización, el CAR inhibidor comprende el dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio intracelular de una molécula inhibidora. Por ejemplo, el dominio intracelular del CAR inhibidor puede ser un dominio intracelular de PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta.

[0447] [En realizaciones, el vector puede comprender dos o más secuencias de ácido nucleico, en las que una de las secuencias de ácido nucleico codifica un CAR descrito en el presente documento, por ejemplo, un CAR de mesotelina descrito en el presente documento. En una realización, el otro ácido nucleico puede codificar un segundo CAR, por ejemplo, un CAR inhibidor o un CAR que se une específicamente a un antígeno distinto de la mesotelina (por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-β, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato α, claudin6, GloboH, o proteína espermática 17; por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4 o Trop-2), o un polipéptido que puede regular la actividad del CAR de mesotelina descrito en el presente documento. En tales realizaciones, las dos o más secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, que codifican un CAR de mesotelina descrito en el presente documento y un segundo CAR u otro polipéptido, están codificadas por una única molécula de ácido nucleico en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En una realización, los dos o más polipéptidos pueden estar separados por uno o más sitios de escisión peptídica (por ejemplo, un sitio de auto-escisión o un sustrato para una proteasa intracelular). Ejemplos de sitios de escisión peptídica incluyen los siguientes, en los que los residuos GSG son opcionales:

[0449] T2A: (GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P (SEC ID NO: 602)

[0451] P2A: (GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P (SEC ID NO: 603)

[0454] E2A: (GSG) Q C TN Y A L L K L A G D V E S N P G P (SEC ID NO: 604)

[0457] F2A: (GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P (SEC ID NO: 605)

[0459] Los procedimientos para introducir y expresar genes en una célula son conocidos en la técnica. En el contexto de un vector de expresión, el vector puede introducirse fácilmente en una célula hospedadora, por ejemplo, una célula de mamífero, de bacteria, de levadura o de insecto mediante cualquier procedimiento de la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión puede transferirse a una célula hospedadora por medios físicos, químicos o biológicos.

[0461] Los procedimientos físicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen precipitación de fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Los procedimientos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY). Un procedimiento preferente para la introducción de un polinucleótido en una célula hospedadora es la lipofección, por ejemplo, utilizando Lipofectamine (Life Technologies).

[0463] Los procedimientos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula hospedadora incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores virales, y en especial los retrovirales, se han convertido en el procedimiento más utilizado para insertar genes en células de mamíferos, por ejemplo células humanas. Otros vectores virales pueden derivarse de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple I, adenovirus y virus adenoasociados, y similares. Véase, por ejemplo, Pat. de EE.UU Nos.5,350,674 y 5,585,362.

[0465] Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal ejemplar para su uso como vehículo de suministro in vitro e in vivo es un liposoma (por ejemplo, una vesícula de membrana artificial). Otros procedimientos de administración direccionada de ácidos nucleicos conocidos en la técnica están disponibles, tales como el suministro de polinucleótidos mediante nanopartículas direccionadas u otro sistema de suministro adecuado de tamaño submicrónico.

[0467] En el caso donde se utilice un sistema de suministro no viral, un vehículo de suministro ejemplar es un liposoma. Se contempla el uso de formulaciones lipídicas para la introducción de los ácidos nucleicos en una célula hospedadora (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado con un lípido. El ácido nucleico asociado con un lípido puede estar encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, entremezclado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, acoplado a un liposoma a través una molécula de enlace que está asociada tanto al liposoma como al oligonucleótido, atrapado en un liposoma, complejado con un liposoma, disperso en una solución que contenga un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o complejado con una micela, o asociado de otro modo con un lípido. Las composiciones asociadas a lípidos, lípidos/ADN o lípidos/vectores de expresión no se limitan a ninguna estructura particular en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de bicapa, como micelas o con una estructura "colapsada". También pueden simplemente estar entremezclados en una solución, posiblemente formando agregados que no sean uniformes en tamaño o forma. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser lípidos de origen natural o sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotas grasas que se encuentran de forma natural en el citoplasma, así como la clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.

[0469] Los lípidos adecuados para su uso pueden obtenerse de fuentes comerciales. Por ejemplo, la dimiristoilfosfatidilcolina("DMPC") puede obtenerse de Sigma, St. Louis, MO; el fosfato de dicetilo ("DCP") puede obtenerse de K & K Laboratories (Plainview, NY); el colesterol ("Choi") puede obtenerse de Calbiochem-Behring; el dimiristoilfosfatidilglicerol ("DMPG") y otros lípidos pueden obtenerse de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.). Las soluciones madre de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol pueden almacenarse a aproximadamente -20°C . El cloroformo se utiliza como único disolvente, ya que se evapora más fácilmente que el metanol. "Liposoma" es un término genérico que abarca una variedad de vehículos lipídicos uni y multilamelares formados por la generación de bicapas o agregados lipídicos cerrados. Los liposomas pueden caracterizarse por tener estructuras vesiculares con una membrana de bicapa fosfolipídica y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por un medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos experimentan una autorreorganización antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Sin embargo, también se incluyen las composiciones que tienen estructuras diferentes en solución a la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden adoptar una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas lipídicas. También se contemplan los complejos de lipofectamina-ácido nucleico.

[0470] Independientemente del procedimiento utilizado para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula hospedadora o exponer de otro modo una célula al inhibidor de la presente divulgación, con el fin de confirmar la presencia de la secuencia de ADN recombinante en la célula hospedadora, pueden realizarse diversos ensayos. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos "biológicos moleculares" bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como Southern y Northern blotting, RT-PCR y PCR; ensayos "bioquímicos", tales como la detección de la presencia o ausencia de un péptido particular, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISA y Western blot) o mediante ensayos descritos en el presente documento para identificar agentes incluidos en el ámbito de la divulgación.

[0471] La presente divulgación proporciona además un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica CAR. En un aspecto, un vector CAR puede transducirse directamente en una célula,por ejemplo,una célula T o una célula NK. En un aspecto, el vector es un vector de clonación o de expresión,por ejemplo,un vector que incluye, pero no se limita a, uno o más plásmidos (por ejemplo, plásmidos de expresión, vectores de clonación, minicírculos, minivectores, cromosomas de doble minuto), construcciones de vectores retrovirales y lentivirales. En un aspecto, el vector es capaz de expresar el constructo CAR en células T de mamífero. En un aspecto, la célula T de mamífero es una célula T humana. En un aspecto, la célula de mamífero es una célula NK humana.

[0472] Transfección de ARN

[0473] Se divulgan en el presente documento procedimientos para producir un CAR de ARN transcrito in vitro. La presente divulgación también incluye un constructo de ARN que codifica CAR que puede transfectarse directamente en una célula. Un procedimiento para generar ARNm para su uso en transfección puede implicar la transcripción in vitro (IVT) de una plantilla con cebadores especialmente diseñados, seguida de la adición de poliA, para producir un constructo que contenga una secuencia no traducida 3' y 5' ("UTR") , una caperuza 5' y/o un Sitio de Entrada del Ribosoma Interno (IRES), el ácido nucleico a expresar y una cola de poliA, típicamente de 50-2000 bases de longitud (SEC ID NO:35). El ARN así producido puede transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En un aspecto, la plantilla incluye secuencias para el CAR.

[0474] En un aspecto, el CAR de mesotelina está codificado por un ARN mensajero (ARNm). En un aspecto, el ARNm que codifica el CAR de mesotelina se introduce en una célula T para la producción de una célula CART. En una realización, el CAR de ARN transcrito in vitro puede introducirse en una célula como una forma de transfección transitoria. El ARN se produce por transcripción in vitro utilizando una plantilla generada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN de interés procedente de cualquier fuente puede convertirse directamente mediante PCR en una plantilla para la síntesis in vitro de ARNm utilizando los cebadores y la ARN polimerasa apropiados. La fuente del ADN puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ADN plasmídico, ADN de fago, ADNc, secuencia sintética de ADN o cualquier otra fuente apropiada de ADN. La plantilla deseada para la transcripción in vitro es un CAR de la presente divulgación. Por ejemplo, la plantilla para el CAR de ARN comprende una región extracelular que comprende un dominio variable de cadena simple de un anticuerpo antitumoral; una región bisagra, un dominio transmembrana (por ejemplo, un dominio transmembrana de CD8a); y una región citoplasmática que incluye un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, que comprende el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB. En una realización, el ADN que se utilizará para la PCR contiene un marco de lectura abierto. El ADN puede proceder de una secuencia de ADN natural del genoma de un organismo. En una realización, el ácido nucleico puede incluir algunas o todas las regiones no traducidas 5' y/o 3 (UTR)'. El ácido nucleico puede incluir exones e intrones. En una realización, el ADN que se utilizará para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humano. En otra realización, el ADN que se utilizará para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humano que incluye las UTR 5' y 3'. Alternativamente, el ADN puede ser una secuencia de ADN artificial que no se expresa normalmente en un organismo natural. Una secuencia de ADN artificial ejemplar es aquella que contiene porciones de genes que se ligan para formar un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión. Las porciones de ADN que se ligan juntas pueden proceder de un único organismo o de más de un organismo. La PCR se utiliza para generar una plantilla para la transcripción in vitro del ARNm que se utiliza para la transfección. Los procedimientos para realizar la PCR son bien conocidos en la técnica. Los cebadores que se utilizan en la PCR están diseñados para tener regiones que son sustancialmente complementarias a regiones del ADN que se utilizará como plantilla para la PCR. El término "sustancialmente complementarias" se refiere a secuencias de nucleótidos donde la mayoría o todas las bases en la secuencia del cebador son complementarias, o una o más bases son no complementarias, o no coinciden. Las secuencias sustancialmente complementarias son capaces de anillarse o hibridarse con el objetivo de ADN previsto bajo las condiciones de anillamiento utilizadas para la PCR. Los cebadores pueden diseñarse para ser sustancialmente complementarios a cualquier porción de la plantilla de ADN. Por ejemplo, los cebadores pueden diseñarse para amplificar la parte de un ácido nucleico que normalmente se transcribe en las células (el marco de lectura abierto), incluyendo las UTR 5' y 3'. Los cebadores también pueden diseñarse para amplificar una porción de un ácido nucleico que codifica un dominio particular de interés. En una realización, los cebadores están diseñados para amplificar la región codificante de un ADNc humano, incluyendo todas o porciones de las UTR 5' y 3'. Los cebadores útiles para la PCR pueden generarse por procedimientos sintéticos bien conocidos en la técnica. Los "cebadores directos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que es sustancialmente complementaria a los nucleótidos de la plantilla de ADN que se encuentran aguas arriba de la secuencia de ADN que se va a amplificar. El término "aguas arriba" se refiere a una localización 5' a la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación con la cadena codificante. Los "cebadores inversos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que es sustancialmente complementaria a una plantilla de ADN de doble cadena que están aguas abajo de la secuencia de ADN que se va a amplificar. El término "aguas abajo" se refiere a una localización 3' a la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación con la cadena codificante.

[0475] Cualquier ADN polimerasa útil para PCR puede utilizarse en los procedimientos divulgados en el presente documento. Los reactivos y la polimerasa están disponibles comercialmente en varias fuentes.

[0476] También pueden utilizarse estructuras químicas con la capacidad de promover la estabilidad y/o la eficiencia de traducción. El ARN preferentemente tiene UTR 5' y 3'. En una realización, la UTR 5' tiene entre uno y 3000 nucleótidos de longitud. La longitud de las secuencias UTR 5' y 3' que deben añadirse a la región codificante puede alterarse por diferentes procedimientos, incluyendo, pero no limitado a, el diseño de cebadores para la PCR que se anille a diferentes regiones de las UTR. Utilizando este enfoque, una persona con conocimientos ordinarios en la técnica puede modificar las longitudes de las UTR 5' y 3' necesarias para lograr una eficiencia de traducción óptima tras la transfección del ARN transcrito.

[0477] Las UTR 5' y 3' pueden ser las UTR 5' y 3' endógenas de origen natural para el ácido nucleico de interés. Alternativamente, las secuencias UTR que no son endógenas al ácido nucleico de interés pueden añadirse incorporando las secuencias UTR en los cebadores directo e inverso o mediante cualquier otra modificación de la plantilla. El uso de secuencias UTR que no son endógenas al ácido nucleico de interés puede ser útil para modificar la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN. Por ejemplo, se sabe que los elementos ricos en AU en secuencias UTR 3' pueden disminuir la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, las UTR 3' pueden seleccionarse o diseñarse para aumentar la estabilidad del ARN transcrito en base a propiedades de las UTR bien conocidas en la técnica.

[0478] En una realización, la UTR 5' puede contener la secuencia de Kozak del ácido nucleico endógeno. Alternativamente, cuando se añade una UTR 5' que no es endógena al ácido nucleico de interés mediante PCR, como se ha descrito anteriormente, se puede rediseñar una secuencia de consenso de Kozak añadiendo la secuencia UTR 5'. Las secuencias de Kozak pueden aumentar la eficacia de la traducción de algunos transcritos de ARN, pero no parece que sean requeridas para que todos los ARN permitan una traducción eficaz. El requisito de secuencias Kozak para muchos ARNm es conocido en la técnica. En otras realizaciones, la UTR 5' puede ser la UTR 5' de un virus de ARN cuyo genoma de ARN es estable en las células. En otras realizaciones se pueden utilizar varios análogos de nucleótidos en la UTR 3' o 5' para impedir la degradación del ARNm por exonucleasas.

[0479] Para permitir la síntesis de ARN a partir de una plantilla de ADN sin necesidad de clonación de genes, se debe acoplar un promotor de la transcripción a la plantilla de ADN aguas arriba de la secuencia que se va a transcribir. Cuando una secuencia que funciona como un promotor de una ARN polimerasa se añade al extremo 5' del cebador directo, el promotor de la ARN polimerasa se incorpora al producto de PCR aguas arriba del marco de lectura abierto que se va a transcribir. En una realización preferente, el promotor es un promotor de la polimerasa T7, como se describe en el presente documento. Otros promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, los promotores de la ARN polimerasa T3 y SP6. Las secuencias de nucleótidos de consenso para los promotores T7, T3 y SP6 son conocidas en la técnica.

[0480] En una realización preferente, el ARNm tiene tanto una caperuza en el extremo 5' como una cola de poli(A) 3' que determinan la unión al ribosoma, el inicio de la traducción y la estabilidad del ARNm en la célula. En una plantilla de ADN circular, por ejemplo, ADN plasmídico, la ARN polimerasa produce un producto concatamérico largo que no es adecuado para la expresión en células eucariotas. La transcripción del ADN plasmídico linealizado en el extremo de la UTR 3' da como resultado un ARNm de tamaño normal que no es eficaz en la transfección eucariótica, incluso si se poliadenila después de la transcripción.

[0481] En una plantilla de ADN lineal, la ARN polimerasa del fago T7 puede extender el extremo 3' de la transcripción más allá de la última base de la plantilla (Schenborn y Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva y Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).

[0482] El procedimiento convencional para la integración de tramos de poliA/T en una plantilla de ADN es la clonación molecular. Sin embargo, la secuencia de poliA/T integrada en el ADN plasmídico puede causar inestabilidad plasmídica, razón por la cual las plantillas de ADN plasmídico obtenidas a partir de células bacterianas suelen estar muy contaminadas con deleciones y otras aberraciones. Esto hace que los procedimientos de clonación no sólo sean laboriosos y lleven mucho tiempo, sino que a menudo no sean fiables. Por eso, un procedimiento que permita el constructo de plantillas de ADN con el tramo 3' de poliA/T sin clonación es altamente deseable. El segmento de poliA/T de la plantilla de ADN transcripcional puede producirse durante la PCR utilizando un cebador inverso que contenga una cola poliT, tal como la cola 100T (SEC ID NO: 31) (el tamaño puede ser de 50-5000 T (SEC ID NO: 32)), o después de la PCR por cualquier otro procedimiento, incluyendo, pero no limitado a, la ligadura de ADN o la recombinación in vitro. Las colas de poli(A) también proporcionan estabilidad a los ARN y reducen su degradación. En general, la longitud de una cola de poli(A) se correlaciona positivamente con la estabilidad del ARN transcrito. En una realización, la cola de poli(A) tiene entre 100 y 5000 adenosinas (SEC ID NO: 33).

[0483] Las colas de poli(A) de los ARN pueden extenderse aún más tras la transcripción in vitro con el uso de una poli(A) polimerasa, tal como la poliA polimerasa de E. coli (E-PAP). En una realización, el aumento de la longitud de una cola de poli(A) de 100 nucleótidos a entre 300 y 400 nucleótidos (SEC ID NO: 34) da como resultado un aumento de aproximadamente el doble en la eficiencia de traducción del ARN. Además, el acoplamiento de diferentes grupos químicos al extremo 3' puede aumentar la estabilidad del ARNm. Tal acoplamiento puede contener nucleótidos modificados/artificiales, aptámeros y otros compuestos. Por ejemplo, los análogos del ATP pueden incorporarse a la cola de poli(A) utilizando la poli(A) polimerasa. Los análogos del ATP pueden aumentar aún más la estabilidad del ARN.

[0484] Las caperuzas 5' también proporcionan estabilidad a las moléculas de ARN. En una realización preferente, los ARN producidos por los procedimientos descritos en el presente documento incluyen una caperuza 5'. La caperuza 5' se proporciona utilizando técnicas conocidas en la técnica y descritas en el presente documento (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al, RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

[0485] Los ARN producidos por los procedimientos divulgados en el presente documento también pueden contener una secuencia de sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). La secuencia IRES puede ser cualquier secuencia viral, cromosómica o diseñada artificialmente que inicie la unión del ribosoma cap-independiente al ARNm y facilite el inicio de la traducción. Puede incluirse cualquier soluto adecuado para la electroporación celular, que puede contener factores que faciliten la permeabilidad y viabilidad celular, tales como azúcares, péptidos, lípidos, proteínas, antioxidantes y tensioactivos.

[0486] El ARN puede introducirse en las células objetivo utilizando cualquiera de una serie de procedimientos diferentes, por ejemplo, procedimientos disponibles comercialmente que incluyen, pero no se limitan a, electroporación (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Colonia, Alemania)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) o el Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator (Eppendort, Hamburgo, Alemania), transfección mediada por liposomas catiónicos utilizando lipofección, encapsulación polimérica, transfección mediada por péptidos, o sistemas de suministro de partículas biolísticas tales como las "pistolas de genes" (véase, por ejemplo, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001).

[0487] Procedimientos de Suministro No Virales

[0488] En algunos aspectos, pueden utilizarse procedimientos no virales para suministrar un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en el presente documento en una célula o tejido o en un sujeto. En algunas realizaciones, el procedimiento no viral incluye el uso de un transposón (también denominado elemento transponible). En algunas realizaciones, un transposón es una pieza de ADN que puede insertarse en una localización de un genoma, por ejemplo, una pieza de ADN capaz de autorreplicarse e insertar su copia en un genoma, o una pieza de ADN que puede empalmarse a partir de un ácido nucleico más largo e insertarse en otro lugar de un genoma. Por ejemplo, un transposón comprende una secuencia de ADN formada por repeticiones invertidas que flanquean genes para la transposición. Procedimientos ejemplares de suministro de ácidos nucleicos que utilizan un transposón incluyen un sistema de transposón Sleeping Beauty (SBTS) y un sistema de transposón PiggyBac (PB). Véase, por ejemplo, Aronovich et al. Hum. Mol. Genet.20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res.15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther.16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc.2.12(2007):3153-65; y Ding et al. Cell.122.3(2005):473-83.

[0489] El SBTS incluye dos componentes: 1) un transposón que contiene un transgén y 2) una fuente de enzima transposasa. La transposasa puede transponer el transposón desde un plásmido portador (u otro ADN donante) a un ADN objetivo, tal como el cromosoma/genoma de una célula hospedadora. Por ejemplo, la transposasa se une al plásmido portador/ADN donante, corta el transposón (incluyendo los transgenes) del plásmido y lo inserta en el genoma de la célula hospedadora. Véase, por ejemplo, Aronovich et al.supra.

[0490] Los transposones ejemplares incluyen un transposón basado en pT2. Véase, por ejemplo, Grabundzija et al. Nucleic Acids Res.41.3(2013):1829-47; y Singh et al. Cancer Res.68,8(2008): 2961-2971. Las transposasas ejemplares incluyen una transposasa de tipo Tc1/mariner, por ejemplo, la transposasa SB10 o la transposasa SB11 (una transposasa hiperactiva que puede expresarse, por ejemplo, a partir de un promotor de citomegalovirus). Véanse, por ejemplo, Aronovich et al.; Kebriaei et al.; y Grabundzija et al.

[0492] El uso del SBTS permite la integración y expresión eficientes de un transgén, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en el presente documento. En el presente documento se proporcionan procedimientos para generar una célula, por ejemplo, una célula T o una célula NK, que exprese de forma estable un CAR descrito en el presente documento, por ejemplo, utilizando un sistema de transposón tal como SBTS.

[0494] De acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, en algunas realizaciones, uno o más ácidos nucleicos, por ejemplo, plásmidos, que contienen los componentes SBTS se suministran a una célula (por ejemplo, célula T o NK). Por ejemplo, los ácidos nucleicos se suministran mediante procedimientos estándar de suministro de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN plasmídico), por ejemplo, procedimientos descritos en el presente documento, por ejemplo, electroporación, transfección o lipofección. En algunas realizaciones, el ácido nucleico contiene un transposón que comprende un transgén, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el ácido nucleico contiene un transposón que comprende un transgén (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un CAR descrito en el presente documento), así como una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima transposasa. En otras realizaciones, se proporciona un sistema con dos ácidos nucleicos, por ejemplo, un sistema de plásmido dual, por ejemplo, donde un primer plásmido contiene un transposón que comprende un transgén, y un segundo plásmido contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima transposasa. Por ejemplo, el primer y el segundo ácido nucleico son cosuministrados en una célula hospedadora.

[0496] En algunas realizaciones, se generan células, por ejemplo, células T o NK, que expresan un CAR descrito en el presente documento utilizando una combinación de inserción génica utilizando el SBTS y edición genética utilizando una nucleasa (por ejemplo, nucleasas de dedo de Zinc (ZFN), Nucleasas Efectoras Similares a Activador de Transcripción (TALEN), el sistema CRISPR/Cas, o endonucleasas homing remodificadas genéticamente con meganucleasas modificadas genéticamente).

[0498] En algunas realizaciones, el uso de un procedimiento de suministro no viral permite la reprogramación de células, por ejemplo, células T o NK, y la infusión directa de las células en un sujeto. Las ventajas de los vectores no virales incluyen, pero no se limitan a, la facilidad y el coste relativamente bajo de producir las cantidades suficientes requeridas para satisfacer a una población de pacientes, la estabilidad durante el almacenamiento y la falta de inmunogenicidad.

[0500] Fuentes de Células

[0502] Antes de la expansión y modificación genética, por ejemplo, para expresar un CAR descrito en el presente documento, puede obtenerse de un sujeto una fuente de células, por ejemplo, células T o células NK. El término "sujeto" pretende incluir a organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos). Ejemplos de sujetos incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. Las células T pueden obtenerse de diversas fuentes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitito de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En determinados aspectos de la presente divulgación, puede utilizarse cualquier número de líneas de células T disponibles en la técnica. En determinados aspectos de la presente divulgación, las células T pueden obtenerse a partir de una unidad de sangre recogida de un sujeto utilizando cualquier número de técnicas conocidas por el experto en la técnica, tales como la separación Ficoll<™>. En un aspecto preferente, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen por aféresis. El producto de aféresis contiene típicamente linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En un aspecto, las células recogidas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción plasmática y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En un aspecto de la divulgación, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En un aspecto alternativo, la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos cationes divalentes, sino de todos. Los pasos iniciales de activación en ausencia de calcio pueden conducir a una activación magnificada. Como aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica apreciarían fácilmente, el paso de lavado puede realizarse mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, tales como el uso de una centrifugadora semiautomatizada de "flujo continuo" (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, el Baxter CytoMate o el Haemonetics Cell Saver 5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células pueden resuspenderse en una variedad de tampones biocompatibles, tales como, por ejemplo, PBS sin Ca ni Mg, PlasmaLyte A u otra solución salina con o sin tampón. Alternativamente, se pueden eliminar los componentes indeseables de la muestra de aféresis y resuspender directamente las células en medios de cultivo.

[0503] Se reconoce que los procedimientos de la solicitud pueden utilizar condiciones de medios de cultivo que comprenden 5% o menos, por ejemplo 2%, de suero AB humano, y emplear condiciones y composiciones de medios de cultivo conocidas, por ejemplo las descritas en Smith et al, "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31.

[0505] En un aspecto, las células T se aíslan a partir de linfocitos de sangre periférica lisando los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, por centrifugación a través de un gradiente PERCOLLTM o por elutriación centrífuga a contraflujo. Una subpoblación específica de células T, tales como las células CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y CD45RO+T, puede aislarse aún más mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, en un aspecto, las células T se aíslan mediante incubación con perlas conjugadas con anti-CD3/anti-CD28 (por ejemplo, 3x28), tales como DYNABEADS<®>M-450 CD3/CD28 T, durante un periodo de tiempo suficiente para la selección positiva de las células T deseadas. En un aspecto, el periodo de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En otro aspecto, el periodo de tiempo oscila de 30 minutos a 36 horas o más y todos los valores enteros intermedios. En otro aspecto, el período de tiempo es de al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En otro aspecto preferente, el período de tiempo es de 10 a 24 horas. En un aspecto, el período de incubación es de 24 horas. Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos para aislar células T en cualquier situación en la que haya pocas células T en comparación con otros tipos celulares, tales como en el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a partir de tejido tumoral o de individuos inmunocomprometidos. Además, el uso de tiempos de incubación más largos puede aumentar la eficacia de la captura de células T CD8+. Así, simplemente acortando o alargando el tiempo que se permite a las células T unirse a las perlas CD3/CD28 y/o aumentando o disminuyendo la proporción de perlas con respecto a las células T (como se describe más adelante en el presente documento), se pueden seleccionar preferentemente subpoblaciones de células T a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros momentos durante el procedimiento. Además, al aumentar o disminuir la proporción de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, se pueden seleccionar preferentemente subpoblaciones de células T a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros momentos deseados. El experto reconocerá que también pueden utilizarse múltiples rondas de selección en el contexto de la presente divulgación. En determinados aspectos, puede ser deseable realizar el procedimiento de selección y utilizar las células "no seleccionadas" en el procedimiento de activación y expansión. Las células "no seleccionadas" también pueden someterse a nuevas rondas de selección.

[0507] El enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa puede lograrse con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas negativamente. Un procedimiento es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer las células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales incluye típicamente anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En determinados aspectos, puede ser deseable enriquecer o seleccionar positivamente las células T reguladoras que típicamente expresan CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ y FoxP3+. Alternativamente, en determinados aspectos, las células T reguladoras se agotan mediante perlas conjugadas anti-C25 u otro procedimiento de selección similar .

[0509] Los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir, por ejemplo, la selección de una subpoblación específica de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, células T, que son una población agotada de células T reguladoras, células agotadas de CD25+, utilizando, por ejemplo, una técnica de selección negativa, por ejemplo, descrita en el presente documento. Preferentemente, la población de células T reguladoras agotadas contiene menos del 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% de células CD25+.

[0510] En una realización, las células T reguladoras, por ejemplo, células T CD25+, se eliminan de la población utilizando un anticuerpo anti-CD25, o fragmento del mismo, o un ligando de unión a CD25, IL-2. En una realización, el anticuerpo anti-CD25, o fragmento del mismo, o el ligando de unión a CD25 se conjuga con un sustrato, por ejemplo, una perla, o se recubre de otro modo sobre un sustrato, por ejemplo, una perla. En una realización, el anticuerpo anti-CD25, o fragmento del mismo, se conjuga con un sustrato como se describe en el presente documento.

[0512] En una realización, las células T reguladoras, por ejemplo, células T CD25+, se eliminan de la población utilizando un reactivo de agotamiento de CD25 de Miltenyi<™>. En una realización, la proporción de células por reactivo de agotamiento de CD25 es de 1e7 células por 20 uL, o 1e7 células por 15 uL, o 1e7 células por 10 uL, o 1e7 células por 5 uL, o 1e7 células por 2,5 uL, o 1e7 células por 1,25 uL. En una realización, por ejemplo, para células T reguladoras, por ejemplo, agotamiento de CD25+, se utilizan más de 500 millones de células/ml. En otro aspecto, se utiliza una concentración de células de 600, 700, 800 o 900 millones de células/ml.

[0514] En una realización, la población de células efectoras inmunitarias a agotar incluye aproximadamente 6 x 10<9>células T CD25+. En otros aspectos, la población de células efectoras inmunitarias a agotar incluye aproximadamente 1 x 10<9>a 1x 10<10>células T CD25+, y cualquier valor entero intermedio. En una realización, la población resultante de células T reguladoras agotadas tiene 2 x 10<9>células T reguladoras, por ejemplo, células CD25+, o menos (por ejemplo, 1 x 10<9>, 5 x 10<8>, 1 x 10<8>, 5 x 10<7>, 1 x 10<7>, o menos células CD25+). En una realización, las células T reguladoras, por ejemplo, células CD25+, se eliminan de la población utilizando el sistema CliniMAC con un conjunto de tubos de agotamiento, tal como, por ejemplo, el tubo 162-01. En una realización, el sistema CliniMAC se ejecuta en una configuración de agotamiento tal como, por ejemplo, DEPLETION2.1.

[0515] Sin querer estar ligado a teoría alguna particular, disminuir el nivel de reguladores negativos de células inmunitarias (por ejemplo, disminuir el número de células inmunitarias no deseadas, por ejemplo, células T<REG>), en un sujeto antes de la aféresis o durante la fabricación de un producto celular que expresa CAR puede reducir el riesgo de recaída del sujeto. Por ejemplo, los procedimientos para agotar las células T<REG>son conocidos en la técnica. Los procedimientos para disminuir las células T<REG>incluyen, pero no se limitan a, ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR (un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento), agotamiento de CD25 y combinaciones de los mismos.

[0516] En algunas realizaciones, los procedimientos de fabricación comprenden reducir el número de (por ejemplo, agotar) células T<REG>antes de la fabricación de la célula que expresa CAR. Por ejemplo, los procedimientos de fabricación comprenden poner en contacto la muestra, por ejemplo, la muestra de aféresis, con un anticuerpo anti-GITR y/o un anticuerpo anti-CD25 (o fragmento del mismo, o un ligando de unión a CD25), por ejemplo, para agotar las células T<REG>antes de la fabricación del producto de células que expresan CAR (por ejemplo, células T, células NK).

[0517] En una realización, un sujeto se pretrata con una o más terapias que reducen las células T<REG>antes de la recogida de células para la fabricación del producto celular que expresa CAR, reduciendo así el riesgo de recaída del sujeto al tratamiento celular que expresa CAR. En una realización, los procedimientos para disminuir las células T<REG>incluyen, pero no se limitan a, la administración al sujeto de uno o más de ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR, agotamiento de CD25, o una combinación de los mismos. La administración de una o más de las siguientes: ciclofosfamida, anticuerpo anti-GITR, agotamiento de CD25, o una combinación de las mismos, puede ocurrir antes, durante o después de una infusión del producto celular que expresa CAR. En una realización, un sujeto se pretrata con ciclofosfamida antes de la recogida de células para la fabricación del producto celular que expresa CAR, reduciendo así el riesgo de recaída del sujeto al tratamiento celular que expresa CAR. En una realización, un sujeto es pretratado con un anticuerpo anti-GITR antes de la recogida de células para la fabricación del producto celular que expresa CAR, reduciendo así el riesgo de recaída del sujeto al tratamiento celular que expresa CAR.

[0518] En una realización, la población de células a eliminar no son ni las células T reguladoras ni las células tumorales, sino células que de otro modo afectan negativamente a la expansión y/o función de las células CART, por ejemplo, células que expresan CD14, CD11b, CD33, CD15 u otros marcadores expresados por células potencialmente inmunosupresoras. En una realización, se prevé que tales células se eliminen simultáneamente con las células T reguladoras y/o las células tumorales, o después de dicha eliminación, o en otro orden.

[0519] Los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir más de un paso de selección, por ejemplo, más de un paso de agotamiento. El enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa puede lograrse, por ejemplo, con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas negativamente. Un procedimiento es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer las células CD4+ por selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales puede incluir anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8.

[0520] Los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir además eliminar células de la población que expresan un antígeno tumoral, por ejemplo, un antígeno tumoral que no comprende CD25, por ejemplo, CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 o CD11b, para proporcionar de ese modo una población de células T reguladoras agotadas, por ejemplo, CD25+ agotadas, y antígeno tumoral agotado que son adecuadas para la expresión de un CAR, por ejemplo, un CAR descrito en el presente documento. En una realización, las células que expresan el antígeno tumoral se eliminan simultáneamente con las células T reguladoras, por ejemplo, las células CD25+. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD25, o fragmento del mismo, y un anticuerpo anti-antígeno tumoral, o fragmento del mismo, pueden acoplarse al mismo sustrato, por ejemplo, perla, que puede utilizarse para eliminar las células o un anticuerpo anti-CD25, o fragmento del mismo, o el anticuerpo anti-antígeno tumoral, o fragmento del mismo, pueden acoplarse a perlas separadas, una mezcla de las cuales puede utilizarse para eliminar las células. En otras realizaciones, la eliminación de las células T reguladoras, por ejemplo, las células CD25+, y la eliminación de las células que expresan el antígeno tumoral son secuenciales y pueden ocurrir, por ejemplo, en cualquier orden.

[0521] También se proporcionan procedimientos que incluyen eliminar células de la población que expresan un inhibidor de punto de control, por ejemplo, un inhibidor de punto de control descrito en el presente documento, por ejemplo, una o más de las células PD1+, células LAG3+ y células TIM3+, para proporcionar de ese modo una población de células T reguladoras agotadas, por ejemplo, células CD25+ agotadas, y células de inhibidor de punto de control agotadas, por ejemplo, células PD1+, LAG3+ y/o TIM3+ agotadas. Los inhibidores de puntos de control ejemplares incluyen B7-H1, B7-1, CD160, P1H, 2B4, PD1, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, TIGIT, CTLA-4, BTLA y LAIR1. En una realización, las células que expresan inhibidores del punto de control se eliminan simultáneamente con las células T reguladoras, por ejemplo, las células CD25+. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD25, o fragmento del mismo, y un anticuerpo inhibidor del punto de control, o fragmento del mismo, pueden acoplarse a la misma perla que puede utilizarse para eliminar las células, o un anticuerpo anti-CD25, o fragmento del mismo, y el anticuerpo inhibidor del punto de control, o fragmento del mismo, pueden acoplarse a perlas separadas, una mezcla de las cuales puede utilizarse para eliminar las células. En otras realizaciones, la eliminación de las células T reguladoras, por ejemplo, las células CD25+, y la eliminación de las células que expresan inhibidores del punto de control son secuenciales y pueden ocurrir, por ejemplo, en cualquier orden.

[0523] En una realización, puede seleccionarse una población de células T que exprese una o más de IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, granzima B y perforina, u otras moléculas apropiadas, por ejemplo, otras citoquinas. Los procedimientos para el cribado de la expresión celular pueden determinarse, por ejemplo, mediante los procedimientos descritos en Publicación PCT No: WO 2013/126712.

[0525] Para el aislamiento de una población deseada de células mediante selección positiva o negativa, puede variarse la concentración de células y la superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas). En determinados aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que las perlas y las células se mezclan (por ejemplo, aumentar la concentración de células), para asegurar el máximo contacto de células y perlas. Por ejemplo, en un aspecto, se utiliza una concentración de 2.000 millones de células/ml. En un aspecto, se utiliza una concentración de 1.000 millones de células/ml. En otro aspecto, se utilizan más de 100 millones de células/ml. En otro aspecto, se utiliza una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En todavía otro aspecto, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En otros aspectos, pueden utilizarse concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de concentraciones elevadas puede resultar en el aumento del rendimiento celular, la activación celular y la expansión celular. Además, el uso de altas concentraciones celulares permite una captura más eficaz de células que pueden expresar débilmente antígenos objetivo de interés, tales como las células T CD28 negativas, o de muestras donde hay muchas células tumorales presentes (por ejemplo, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Tales poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficaz de las células T CD8+ que normalmente tienen una expresión más débil de CD28.

[0527] En un aspecto relacionado, puede ser deseable utilizar concentraciones más bajas de células. Al diluir significativamente la mezcla de células T y superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas), se minimizan las interacciones entre las partículas y las células. De este modo, se seleccionan las células que expresan cantidades elevadas de los antígenos deseados que se unirán a las partículas. Por ejemplo, las células T CD4+ expresan niveles más altos de CD28 y son capturadas de manera más eficiente que las células T CD8+ en concentraciones diluidas. En un aspecto, la concentración de células utilizada es de 5 X 10e6/ml. En otros aspectos, la concentración utilizada puede ser de aproximadamente 1 X 10<5>/ml a 1 X 10<6>/ml, y cualquier valor entero intermedio.

[0529] En otros aspectos, las células pueden incubarse en un rotador durante periodos de tiempo variables a velocidades variables a 2-10°C o a temperatura ambiente.

[0531] Las células T para estimulación también pueden congelarse después de un paso de lavado. Sin querer estar limitados a la teoría, el paso de congelación y posterior descongelación proporciona un producto más uniforme al eliminar los granulocitos y, en cierta medida, los monocitos de la población celular. Después del paso de lavado que elimina el plasma y las plaquetas, las células pueden suspenderse en una solución de congelación. Aunque muchas soluciones y parámetros de congelación son conocidos en la técnica y serán útiles en este contexto, un procedimiento implica el uso de PBS que contiene 20% de DMSO y 8% de albúmina de suero humano, o medios de cultivo que contienen 10% de Dextrano 40 y 5% de Dextrosa, 20% de Albúmina de Suero Humano y 7,5% de DMSO, o 31,25% de Plasmalyte-A, 31,25% de Dextrosa 5%, 0,45% de NaCl, 10% de Dextrano 40 y 5% de Dextrosa, 20% de Albúmina de Suero Humano y 7,5% de DMSO u otros medios de congelación celular adecuados que contengan, por ejemplo, Hespan y PlasmaLyte A, las células se congelan entonces a -80°C a una tasa de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Pueden utilizarse otros procedimientos de congelación controlada, así como la congelación incontrolada inmediata a -20° C o en nitrógeno líquido.

[0533] En determinados aspectos, las células criopreservadas se descongelan y lavan como se describe en el presente documento y se dejan reposar durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación utilizando los procedimientos de la presente divulgación.

[0534] También se contempla en el contexto de la divulgación la recogida de muestras de sangre o producto de aféresis de un sujeto en un periodo de tiempo anterior a cuando las células expandidas como se describe en el presente documento podrían ser necesarias. Como tal, la fuente de las células a expandir puede ser recogida en cualquier momento necesario, y las células deseadas, tales como las células T, aisladas y congeladas para su uso posterior en la terapia de células T para cualquier número de enfermedades o condiciones que se beneficiarían de la terapia de células T, como las descritas en el presente documento. En un aspecto, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano. En determinados aspectos, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano que corre el riesgo de desarrollar una enfermedad, pero que aún no la ha desarrollado, y se aíslan y congelan las células de interés para su uso posterior. En determinados aspectos, las células T pueden expandirse, congelarse y utilizarse posteriormente. En determinados aspectos, las muestras se recogen de un paciente poco después del diagnóstico de una enfermedad particular como se describe en el presente documento, pero antes de cualquier tratamiento. En otro aspecto, las células se aíslan a partir de una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto antes de cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo pero no limitado a tratamiento con agentes tales como natalizumab, efalizumab, agentes antivirales, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3, cytoxan, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, e irradiación.

[0535] En otro aspecto de la presente divulgación, las células T se obtienen de un paciente directamente después de un tratamiento que deja al sujeto con células T funcionales. En este sentido, se ha observado que tras determinados tratamientos contra el cáncer, en particular tratamientos con fármacos que dañan el sistema inmunitario, poco después del tratamiento, durante el periodo en que los pacientes normalmente se estarían recuperando del tratamiento, la calidad de las células T obtenidas puede ser óptima o mejorada para su capacidad de expansión ex vivo. Asimismo, tras la manipulación ex vivo utilizando los procedimientos descritos en el presente documento, estas células pueden encontrarse en un estado preferente para mejorar el injerto y la expansión in vivo. Por lo tanto, se contempla dentro del contexto de la presente divulgación recoger células sanguíneas, incluyendo células T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Además, en determinados aspectos, la movilización (por ejemplo, movilización con GM-CSF) y los regímenes de acondicionamiento pueden utilizarse para crear una condición en un sujeto en la que se favorezca la repoblación, recirculación, regeneración y/o expansión de tipos celulares particulares, especialmente durante una ventana de tiempo definida tras la terapia. Algunos tipos celulares ilustrativos son las células T, las células B, las células dendríticas y otras células del sistema inmunitario.

[0536] En una realización, una población de células T es deficiente en diaglicerol quinasa (DGK). Las células deficientes en DGK incluyen células que no expresan ARN o proteína DGK, o que tienen una actividad DGK reducida o inhibida. Las células deficientes en DGK pueden generarse mediante enfoques genéticos, por ejemplo, administrando agentes de interferencia de ARN, por ejemplo, ARNsi, ARNsh, ARNmi, para reducir o impedir la expresión de DGK. Alternativamente, pueden generarse células deficientes en DGK mediante el tratamiento con los inhibidores de DGK descritos en el presente documento.

[0537] En una realización, una población de células T es deficiente en Ikaros. Las células deficientes en Ikaros incluyen células que no expresan el ARN o la proteína Ikaros, o que tienen una actividad reducida o inhibida de Ikaros, las células deficientes en Ikaros pueden generarse mediante enfoques genéticos, por ejemplo, administrando agentes que interfieren con el ARN, por ejemplo, ARNsi, ARNsh, ARNmi, para reducir o impedir la expresión de Ikaros. Alternativamente, pueden generarse células deficientes en Ikaros mediante tratamiento con inhibidores de Ikaros, por ejemplo, lenalidomida.

[0538] En realizaciones, una población de células T es deficiente en DGK e y deficiente en Ikaros, por ejemplo, no expresa DGK e Ikaros, o tiene actividad DGK e Ikaros reducida o inhibida. Tales células deficientes en DGK e Ikaros pueden generarse mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. En una realización, las células NK se obtienen del sujeto. En otra realización, las células NK son una línea celular NK, por ejemplo, la línea celular NK-92 (Conkwest).

[0539] Células Efectoras Inmunitarias CAR Alogénicas

[0540] En las realizaciones descritas en el presente documento, la célula efectora inmunitaria puede ser una célula efectora inmunitaria alogénica, por ejemplo, célula T o célula NK. Por ejemplo, la célula puede ser una célula T alogénica, por ejemplo, una célula T alogénica que carece de expresión de un receptor de células T (TCR) funcional y/o antígeno leucocitario humano (HLA), por ejemplo, HLA de clase I y/o HLA de clase II.

[0541] Una célula T que carece de un TCR funcional puede ser, por ejemplo, modificada genéticamente de tal manera que no expresa ningún TCR funcional en su superficie, modificada genéticamente de tal manera que no expresa una o más subunidades que comprenden un TCR funcional o modificada genéticamente de tal manera que produce muy poco TCR funcional en su superficie. Alternativamente, la célula T puede expresar un TCR sustancialmente deteriorado, por ejemplo, mediante la expresión de formas mutadas o truncadas de una o más de las subunidades del TCR. El término "TCR sustancialmente deteriorado" significa que este TCR no provocará una reacción inmunitaria adversa en una célula hospedadora.

[0542] Una célula T descrita en el presente documento puede, por ejemplo, modificarse genéticamente de tal manera que no exprese un HLA funcional en su superficie. Por ejemplo, una célula T descrita en el presente documento puede modificarse genéticamente de tal manera que la expresión de HLA en la superficie celular, por ejemplo, HLA de clase I y/o HLA de clase II, se regule a la baja.

[0543] En algunas realizaciones, la célula T puede carecer de un TCR funcional y un HLA funcional, por ejemplo, HLA de clase I y/o HLA de clase II.

[0544] Las células T modificadas que carecen de expresión de un TCR y/o HLA funcional pueden obtenerse por cualquier medio adecuado, incluyendo una eliminación (knock out) o desactivación (knock down) de una o más subunidades de TCR o HLA. Por ejemplo, la célula T puede incluir una eliminación del TCR y/o HLA utilizando ARNsi, ARNsh, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN) o endonucleasas de dedos de zinc (ZFN). En algunas realizaciones, la célula alogénica puede ser una célula que no expresa o expresa a niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, por cualquier procedimiento descrito en el presente documento. Por ejemplo, la célula puede ser una célula que no exprese o exprese a niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, que pueda disminuir la capacidad de una célula que exprese CAR para montar una respuesta inmunitaria efectora. Algunos ejemplos de moléculas inhibidoras son PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina y TGFR beta. La inhibición de una molécula inhibidora, por ejemplo, mediante inhibición a nivel de ADN, ARN o proteína, puede optimizar el rendimiento de una célula que expresa CAR. En realizaciones, se puede utilizar un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNds, por ejemplo, un ARNsi o ARNsh, unas repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), unas nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN), o una endonucleasa de dedos de zinc (ZFN), por ejemplo, tal como se describe en el presente documento.

[0545] ARNsi y ARNsh para inhibir TCR o HLA

[0546] En algunas realizaciones, la expresión de TCR y/o expresión de HLA puede inhibirse utilizando ARNsi o ARNsh que se direcciona a un ácido nucleico que codifica un TCR y/o HLA, y/o una molécula inhibidora descrita en el presente documento (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina y TGFR beta), en una célula, por ejemplo, célula T. Sistemas de expresión para ARNsi y ARNsh, y ARNsh ejemplares, se describen, por ejemplo, en los párrafos 649 y 650 de la Publicación Internacional WO2015/142675, presentada el 13 de Marzo de 2015.

[0547] CRISPR para inhibir TCR o HLA

[0548] "CRISPR" o "CRISPR para TCR y/o HLA" o "CRISPR para inhibir TCR y/o HLA" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un conjunto de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas, o un sistema que comprende tal conjunto de repeticiones. "Cas", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína asociada a CRISPR.

[0549] Un sistema "CRISPR/Cas" se refiere a un sistema derivado de CRISPR y Cas que puede utilizarse para silenciar o mutar un gen TCR y/o HLA, y/o una molécula inhibidora descrita en el presente documento (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina, y TGFR beta), en una célula, por ejemplo, célula T.

[0550] El sistema CRISPR/Cas, y los usos del mismo, se describen, por ejemplo, en los párrafos 651-658 de la Publicación Internacional WO2015/142675, presentada el 13 de Marzo de 2015.

[0551] TALEN para inhibir TCR y/o HLA

[0552] TALEN" o "TALEN para HLA y/o TCR" o "TALEN para inhibir HLA y/o TCR" se refiere a una nucleasa efectora similar a un activador de transcripción, una nucleasa artificial que puede utilizarse para editar el gen HLA y/o TCR, y/o una molécula inhibidora descrita en el presente documento (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina y TGFR beta), en una célula, por ejemplo, célula T.

[0553] Las TALEN, y los usos de las mismas, se describen, por ejemplo, en los párrafos 659-665 de la Publicación Internacional WO2015/142675, presentada el 13 de Marzo de 2015.

[0554] Nucleasa de dedos de zinc para inhibir HLA y/o TCR.

[0555] "ZFN" o "Nucleasa de Dedo de Zinc" o "ZFN para HLA y/o TCR" o "ZFN para inhibir HLA y/o TCR" se refieren a una nucleasa de dedo de zinc, una nucleasa artificial que puede utilizarse para editar el gen HLA y/o TCR, y/o una molécula inhibidora descrita en el presente documento (por ejemplo, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina y TGFR beta), en una célula, por ejemplo, célula T.

[0556] L<as ZFN, y los usos de las mismas, se describen, por ejemplo, en los párrafos 666-671 de la Publicación>Internacional WO2015/142675, presentada el 13 de Marzo de 2015.

[0557] Expresión de la telomerasa

[0558] Sin querer estar ligado a teoría alguna particular, en algunas realizaciones, una célula T terapéutica tiene persistencia a corto plazo en un paciente, debido a telómeros acortados en la célula T; en consecuencia, la transfección con un gen de telomerasa puede alargar los telómeros de la célula T y mejorar la persistencia de la célula T en el paciente. Véase Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007). Por lo tanto, en una realización, una célula efectora inmunitaria, por ejemplo, una célula T, expresa ectópicamente una subunidad de telomerasa, por ejemplo, la subunidad catalítica de la telomerasa, por ejemplo, TERT, por ejemplo, hTERT. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un procedimiento para producir una célula que expresa CAR, que comprende poner en contacto una célula con un ácido nucleico que codifica una subunidad de la telomerasa, por ejemplo, la subunidad catalítica de la telomerasa, por ejemplo, TERT, por ejemplo, hTERT. La célula puede entrar en contacto con el ácido nucleico antes, simultáneamente o después de entrar en contacto con un constructo que codifica un CAR.

[0559] En un aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para fabricar una población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células T, células NK). En una realización, el procedimiento comprende: proporcionar una población de células efectoras inmunitarias (por ejemplo, células T o células NK), poner en contacto la población de células efectoras inmunitarias con un ácido nucleico que codifica un CAR; y poner en contacto la población de células efectoras inmunitarias con un ácido nucleico que codifica una subunidad de la telomerasa, por ejemplo, hTERT, bajo condiciones que permiten la expresión de CAR y telomerasa.

[0560] En una realización, el ácido nucleico que codifica la subunidad de la telomerasa es ADN. En una realización, el ácido nucleico que codifica la subunidad de la telomerasa comprende un promotor capaz de impulsar la expresión de la subunidad la telomerasa.

[0561] En una realización, hTERT tiene la secuencia de aminoácidos de GenBank Protein ID AAC51724.1 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volumen 90, Número 4, 22 de Agosto de 1997, Páginas 785-795) tal como se establece en SEC ID NO: 110 en el presente documento.

[0562] En una realización, la hTERT tiene una secuencia al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96^, 97%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de SEC ID NO: 110. En una realización, la hTERT tiene una secuencia de SEC ID NO: 110. En una realización, la hTERT comprende una deleción (por ejemplo, de no más de 5, 10, 15, 20 o 30 aminoácidos) en el N-terminal, el C-terminal o ambos. En una realización, la hTERT comprende una secuencia transgénica de aminoácidos (por ejemplo, de no más de 5, 10, 15, 20 o 30 aminoácidos) en el N-terminal, el C-terminal, o ambos.

[0563] En una realización, la hTERT está codificada por la secuencia de ácido nucleico de GenBank No. de Acceso AF018167 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volumen 90, Número 4, 22 de Agosto de 1997, Páginas 785-795) tal como se establece en SEC ID NO: 111 en el presente documento.

[0564] En una realización, la hTERT está codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96, 97%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de SEC ID NO: 111. En una realización, la hTERT está codificada por un ácido nucleico de SEC ID NO: 111.

[0565] Activación y Expansión de Células Efectoras Inmunitarias (por ejemplo, Células T).

[0566] Las células efectoras inmunitarias, tales como células T, pueden activarse y expandirse generalmente utilizando procedimientos como los descritos, por ejemplo, en Patentes de EE.UU 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; y Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No.

[0567] 20060121005.

[0569] Generalmente, una población de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, células T puede expandirse por contacto con una superficie que tiene acoplado a la misma un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, células T. En particular, las poblaciones de células T pueden estimularse como se describe en el presente documento, por ejemplo por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de la proteína quinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se utiliza un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, bajo condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Para estimular la proliferación de células T CD4+ o células T CD8+, se utiliza un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besangon, Francia) que puede ser utilizado al igual que otros procedimientos comúnmente conocidos en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth.227(1-2):53-63, 1999).

[0571] En determinados aspectos, la señal estimuladora primaria y la señal coestimuladora para la célula T pueden proporcionarse mediante diferentes protocolos. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada señal pueden estar en solución o acoplados a una superficie. Cuando se acoplan a una superficie, los agentes pueden estar acoplados a la misma superficie (es decir, en formación "cis") o a superficies separadas (es decir, en formación "trans"). Alternativamente, un agente puede estar acoplado a una superficie y el otro agente en solución. En un aspecto, el agente que proporciona la señal coestimuladora está unido a una superficie celular y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en solución o acoplado a una superficie. En determinados aspectos, ambos agentes pueden estar en solución. En un aspecto, los agentes pueden estar en forma soluble, y luego reticulados a una superficie, tal como una célula que exprese receptores Fc o un anticuerpo u otro agente de unión que se una a los agentes. En este sentido, véanse, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. Nos. 20040101519 y 20060034810 para células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) que se contemplan para su uso en la activación y expansión de células T en la presente divulgación..

[0572] En un aspecto, los dos agentes se inmovilizan en perlas, ya sea en la misma perla, es decir, "cis", o en perlas separadas, es decir, "trans". A modo de ejemplo, el agente que proporciona la señal de activación primaria es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente que proporciona la señal coestimuladora es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y ambos agentes se coinmovilizan a la misma perla en cantidades moleculares equivalentes. En un aspecto, se utiliza una proporción 1:1 de cada anticuerpo unido a las perlas para la expansión de células T CD4+ y el crecimiento de células T. En determinados aspectos de la presente divulgación, se utiliza una proporción de anticuerpos anti CD3:CD28 unidos a las perlas tal que se observa un aumento de la expansión de células T en comparación con la expansión observada utilizando una proporción de 1:1. En un aspecto particular se observa un aumento de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces en comparación con la expansión observada utilizando una proporción de 1:1. En un aspecto, la proporción de CD3: El anticuerpo CD28 unido a las perlas oscila de 100:1 a 1:100 y todos los valores enteros intermedios. En un aspecto de la presente divulgación, se une más anticuerpo anti-CD28 a las partículas que anticuerpo anti-CD3, es decir, la proporción de CD3:CD28 es menor que uno. En determinados aspectos de la divulgación, la proporción del anticuerpo anti CD28 y el anticuerpo anti CD3 unido a las perlas es mayor que 2:1. En un aspecto particular, se utiliza una proporción de 1:100 CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas. En un aspecto, se utiliza una proporción de 1:75 CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas. En otro aspecto, se utiliza una proporción de 1:50 CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas. En un aspecto, se utiliza una proporción de 1:30 CD3:CD28 del anticuerpo unido a las perlas. En un aspecto preferente, se utiliza una proporción de 1:10 CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas. En un aspecto, se utiliza una proporción de 1:3 CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas. En otro aspecto, se utiliza una proporción de 3:1 CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas.

[0574] Para estimular las células T u otras células objetivo pueden utilizarse proporciones de partículas a células de 1:500 a 500:1 y cualquier valor entero intermedio. Como aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica apreciarían fácilmente, la proporción entre partículas y células puede depender del tamaño de las partículas en relación con la célula objetivo. Por ejemplo, las perlas de tamaño pequeño sólo podrían unir unas pocas células, mientras que las perlas más grandes podrían unir muchas. En determinados aspectos, la proporción entre células y partículas oscila de 1:100 a 100:1 y cualquier valor entero intermedio y, en otros aspectos, la proporción comprende de 1:9 a 9:1 y cualquier valor entero intermedio, también puede utilizarse para estimular las células T. La proporción de partículas acopladas a anti-CD3 y anti-CD28 con respecto a las células T que da como resultado la estimulación de células T puede variar como se ha indicado anteriormente, sin embargo determinados valores preferentes incluyen 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, y 15:1 con una proporción preferente de al menos 1:1 partículas por célula T. En un aspecto, se utiliza una proporción de partículas a células de 1:1 o menos. En un aspecto particular, una proporción partícula:célula preferente es 1:5. En otros aspectos, la proporción entre partículas y células puede variar dependiendo del día de estimulación. Por ejemplo, en un aspecto, la proporción de partículas a células es de 1:1 a 10:1 el primer día y se añaden partículas adicionales a las células cada día o cada dos días a partir de entonces durante un máximo de 10 días, en proporciones finales de 1:1 a 1:10 (en base a los recuentos celulares del día de la adición). En un aspecto particular, la proporción entre partículas y células es de 1:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:5 en el tercer y quinto día de estimulación. En un aspecto, las partículas se añaden diariamente o cada dos días hasta una proporción final de 1:1 en el primer día, y de 1:5 en el tercer y quinto día de estimulación. En un aspecto, la proporción entre partículas y células es de 2:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:10 en el tercer y quinto día de estimulación. En un aspecto, las partículas se añaden diariamente o cada dos días hasta una proporción final de 1:1 en el primer día, y de 1:10 en el tercer y quinto día de estimulación. Un experto en la técnica apreciará que una variedad de otras proporciones pueden ser adecuadas para utilizarse en la presente divulgación. En particular, las proporciones variarán dependiendo del tamaño de las partículas y del tamaño y tipo de células. En un aspecto, las proporciones de uso más típicas se sitúan en torno a 1:1, 2:1 y 3:1 en el primer día.

[0576] En aspectos adicionales de la presente divulgación, las células, tales como células T, se combinan con perlas recubiertas de agente, las perlas y las células se separan posteriormente, y luego las células se cultivan. En un aspecto alternativo, antes del cultivo, las perlas recubiertas con el agente y las células no se separan, sino que se cultivan juntas. En otro aspecto, las perlas y las células se concentran primero mediante la aplicación de una fuerza, tal como por ejemplo una fuerza magnética, que da como resultado un aumento de la ligadura de los marcadores de la superficie celular, induciendo así la estimulación celular.

[0578] A modo de ejemplo, las proteínas de la superficie celular pueden ligarse permitiendo que perlas paramagnéticas a las que se unen anti-CD3 y anti-CD28 (perlas 3x28) entren en contacto con las células T. En un aspecto, las células (por ejemplo, 10<4>a 10<9>células T) y las perlas (por ejemplo, perlas paramagnéticas DYNABEADS<®>M-450 CD3/CD28 T en una proporción de 1:1) se combinan en un tampón, por ejemplo PBS (sin cationes divalentes tales como, calcio y magnesio). De nuevo, aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica pueden apreciar fácilmente que puede utilizarse cualquier concentración celular. Por ejemplo, la célula objetivo puede ser muy rara en la muestra y comprender sólo el 0,01% de la muestra o toda la muestra (es decir, el 100%) puede comprender la célula objetivo de interés. Por consiguiente, cualquier número de célula está dentro del contexto de la presente divulgación. En determinados aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan partículas y células (es decir, aumentar la concentración de células), para garantizar el máximo contacto de células y partículas. Por ejemplo, en un aspecto, se utiliza una concentración de aproximadamente 2.000 millones de células/ml. En un aspecto, se utilizan más de 100 millones de células/ml. En otro aspecto, se utiliza una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En todavía otro aspecto, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En otros aspectos, pueden utilizarse concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de concentraciones elevadas puede resultar en el aumento del rendimiento celular, la activación celular y la expansión celular. Además, el uso de altas concentraciones celulares permite una captura más eficaz de células que pueden expresar débilmente antígenos objetivo de interés, tales como las células T CD28 negativas. Tales poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas en determinados aspectos. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficaz de las células T CD8+ que normalmente tienen una expresión más débil de CD28.

[0580] En una realización, las células transducidas con un ácido nucleico que codifica un CAR, por ejemplo, un CAR descrito en el presente documento, se expanden, por ejemplo, mediante un procedimiento descrito en el presente documento. En una realización, las células se expanden en cultivo durante un período de varias horas (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21 horas) a aproximadamente 14 días (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días). En una realización, las células se expanden durante un periodo de 4 a 9 días. En una realización, las células se expanden durante un periodo de 8 días o menos, por ejemplo, 7, 6 o 5 días. En una realización, las células, por ejemplo, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento, se expanden en cultivo durante 5 días, y las células resultantes son más potentes que las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días bajo las mismas condiciones de cultivo. La potencia puede definirse, por ejemplo, por diversas funciones de las células T, por ejemplo, la proliferación, la destrucción de células objetivo, la producción de citoquinas, la activación, la migración o combinaciones de las mismas. En una realización, las células, por ejemplo, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento, expandidas durante 5 días muestran al menos un aumento de una, dos, tres o cuatro veces en la duplicación de células tras la estimulación con antígeno en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días bajo las mismas condiciones de cultivo. En una realización, las células, por ejemplo, las células que expresan un CAR descrito en el presente documento, se expanden en cultivo durante 5 días, y las células resultantes exhiben una mayor producción de citoquinas proinflamatorias, por ejemplo, niveles de IFN-γ y/o GM-CSF, en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días bajo las mismas condiciones de cultivo. En una realización, las células, por ejemplo, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento, expandidas durante 5 días muestran al menos un aumento de uno, dos, tres, cuatro, cinco, diez veces o más en pg/ml de producción de citoquinas proinflamatorias, por ejemplo, niveles de IFN-γ y/o GM-CSF, en comparación con las mismas células expandidas en cultivo durante 9 días bajo las mismas condiciones de cultivo.

[0582] En un aspecto de la presente divulgación, la mezcla puede cultivarse durante varias horas (aproximadamente 3 horas) a aproximadamente 14 días o cualquier valor entero de horas intermedio. En un aspecto, la mezcla puede cultivarse durante 21 días. En un aspecto de la divulgación, las perlas y las células T se cultivan juntas durante aproximadamente ocho días. En un aspecto, las perlas y las células T se cultivan juntas durante 2-3 días. También pueden desearse varios ciclos de estimulación, de tal manera que el tiempo de cultivo de las células T puede ser de 60 días o más. Las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, Medio Esencial Mínimo o Medio RPMI 1640 o, X-vivo 15, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluyendo suero (por ejemplo, suero fetal bovino o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, y TNF-α o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocido por el experto en la técnica. Otros aditivos para el crecimiento de las células incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos, plasmanato y agentes reductores tales como la N-acetilcisteína y el 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea libres de suero o suplementados con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citoquina(s) suficiente para el crecimiento y expansión de las células T. Los antibióticos, por ejemplo, la penicilina y la estreptomicina, sólo se incluyen en los cultivos experimentales, no en los cultivos de células que se van a infundir a un sujeto. Las células objetivo se mantienen bajo las condiciones necesarias para favorecer el crecimiento, por ejemplo, una temperatura adecuada (por ejemplo, 37° C) y una atmósfera (por ejemplo, aire más 5% de CO<2>).

[0584] En una realización, las células se expanden en un medio apropiado (por ejemplo, medio descrito en el presente documento) que incluye una o más interleucinas que dan como resultado un aumento de al menos 200 veces (por ejemplo, 200 veces, 250 veces, 300 veces, 350 veces) en células durante un periodo de expansión de 14 días, por ejemplo, según se mide mediante un procedimiento descrito en el presente documento tal como citometría de flujo. En una realización, las células se expanden en presencia de IL-15 y/o IL-7 (por ejemplo, IL-15 e IL-7).

[0586] En realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento, por ejemplo, procedimientos de fabricación de células que expresan CAR, comprenden eliminar células T reguladoras, por ejemplo, células T CD25+, de una población celular, por ejemplo, utilizando un anticuerpo anti-CD25, o fragmento del mismo, o un ligando de unión a CD25, IL-2. En el presente documento se describen procedimientos para eliminar células T reguladoras, por ejemplo, células T CD25+, de una población celular. En algunas realizaciones, los procedimientos, por ejemplo, los procedimientos de fabricación, comprenden además poner en contacto una población celular (por ejemplo, una población celular en la que las células T reguladoras, tales como las células T CD25+, se han agotado; o una población celular que ha entrado en contacto previamente con un anticuerpo anti-CD25, fragmento del mismo, o ligando de unión a CD25) con IL-15 y/o IL-7. Por ejemplo, la población celular (por ejemplo, que se ha puesto en contacto previamente con un anticuerpo anti-CD25, fragmento del mismo o ligando de unión a CD25) se expande en presencia de IL-15 y/o IL-7.

[0588] En algunas realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido de interleucina-15 (IL-15), un polipéptido del receptor alfa de interleucina-15 (IL-15Ra), o una combinación de ambos, un polipéptido de IL-15 y un polipéptido de IL-15Ra, por ejemplo, hetIL-15, durante la fabricación de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo. En realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido IL-15 durante la fabricación de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo. En realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se pone en contacto con una composición que comprende una combinación de un polipéptido IL-15 y un polipéptido IL-15 Ra durante la fabricación de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo. En realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se pone en contacto con una composición que comprende hetIL-15 durante la fabricación de la célula que expresa CAR, por ejemplo, ex vivo.

[0590] En una realización, la célula que expresa CAR descrita en el presente documento se pone en contacto con una composición que comprende hetIL-15 durante la expansión ex vivo. En una realización, la célula que expresa CAR descrita en el presente documento se pone en contacto con una composición que comprende un polipéptido IL-15 durante la expansión ex vivo. En una realización, la célula que expresa CAR descrita en el presente documento se pone en contacto con una composición que comprende tanto un polipéptido IL-15 como un polipéptido IL-15Ra durante la expansión ex vivo. En una realización, el contacto resulta en la supervivencia y proliferación de una subpoblación de linfocitos, por ejemplo, células T CD8+.

[0592] En una realización, las células se cultivan (por ejemplo, se expanden, se simulan y/o se transducen) en medios que comprenden suero. El suero puede ser, por ejemplo, suero AB humano (hAB). En algunas realizaciones, el suero hAB está presente en aproximadamente 2%, aproximadamente 5%, aproximadamente 2-3%, aproximadamente 3-4%, aproximadamente 4-5% o aproximadamente 2-5%. El 2% y el 5% de suero son niveles adecuados que permiten una expansión múltiple de células T. Además, como se muestra en Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31, el medio que contiene un 2% de suero AB humano es adecuado para la expansiónex vivode células T.

[0593] Las células T que han sido expuestas a tiempos de estimulación variados pueden exhibir características diferentes. Por ejemplo, los productos típicos de sangre o de células mononucleares de sangre periférica por aféresis tienen una población de células T auxiliares (TH, CD4+) mayor que la población de células T citotóxicas o supresoras (TC, CD8+). La expansión ex vivo de células T mediante la estimulación de los receptores CD3 y CD28 produce una población de células T que antes de aproximadamente los días 8-9 consiste predominantemente en células TH, mientras que después de aproximadamente los días 8-9 , la población de células T comprende una población cada vez mayor de células TC. En consecuencia, dependiendo de la finalidad del tratamiento, puede ser ventajoso infundir a un sujeto una población de células T que comprende predominantemente de células TH. Del mismo modo, si se ha aislado un subconjunto de células TC específicas de antígeno, puede ser beneficioso expandir este subconjunto en mayor medida.

[0594] Además, adicionalmente de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían significativamente, pero en gran parte, de forma reproducible durante el curso del procedimiento de expansión celular. Por lo tanto, esta reproducibilidad permite adaptar un producto de células T activadas para fines específicos.

[0595] En algunas realizaciones, las células transducidas con un ácido nucleico que codifica un CAR, por ejemplo, un CAR descrito en el presente documento, pueden seleccionarse para la administración basándose en, por ejemplo, niveles de expresión proteica de uno o más de CCL20, GM-CSF, IFNγ, IL-10, IL-13, IL-17a, IL-2, IL-21, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, TNFα y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, las células transducidas con un ácido nucleico que codifica un CAR, por ejemplo, un CAR descrito en el presente documento, pueden seleccionarse para su administración basándose, por ejemplo, en los niveles de expresión proteica de CCL20, IL-17a, IL-6 y combinaciones de los mismos.

[0596] Además, adicionalmente de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían significativamente, pero en gran parte, de forma reproducible durante el curso del procedimiento de expansión celular. Por lo tanto, esta reproducibilidad permite adaptar un producto de células T activadas para fines específicos.

[0597] Una vez construido un CAR de mesotelina, se pueden utilizar diversos ensayos para evaluar la actividad de la molécula, tales como, pero no limitados a, la capacidad de expandir células T tras la estimulación con antígeno, mantener la expansión de células T en ausencia de reestimulación, y actividades anticancerosas en modelos in vitro y animales apropiados. Los ensayos para evaluar los efectos de un CAR de mesotelina se describen, por ejemplo, en los párrafos [0417] - [00423] de la Publicación Internacional WO2015/090230, presentada el 19 de Diciembre de 2014.

[0598] Poblaciones de células CAR

[0599] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una población de células que expresan CAR, por ejemplo, una población de células que expresan CAR de mesotelina. En algunas realizaciones, la población de células que expresan CAR comprende una mezcla de células que expresan diferentes CAR.

[0600] Por ejemplo, en una realización, la población de células que expresan CAR puede incluir una primera célula que expresa un CAR que tiene un dominio de unión a anti-mesotelina descrito en el presente documento, y una segunda célula que expresa un CAR que tiene un dominio de unión a anti-mesotelina diferente, por ejemplo, un dominio de unión a anti-mesotelina descrito en el presente documento que difiere del dominio de unión a anti-mesotelina en el CAR expresado por la primera célula.

[0601] Como otro ejemplo, la población de células que expresan CAR puede incluir una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión a anti mesotelina, por ejemplo, como se describe en el presente documento, y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión al antígeno a un objetivo distinto de mesotelina (por ejemplo, un objetivo distinto de mesotelina en células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de próstata, por ejemplo, receptor androgénico, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-β, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato α, claudin6, GloboH, o proteína espermática 17, por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4, o Trop-2). En una realización, la población de células que expresan CAR incluye, por ejemplo, una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización intracelular primario, y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización secundario.

[0602] En una realización, la población de células que expresan CAR puede incluir una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión a anti-mesotelina y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión al antígeno que se direcciona, por ejemplo, se une específicamente, a un antígeno expresado en células B, o un antígeno de células B. En una realización, el antígeno de células B es CD19.

[0603] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una población de células en la que al menos una célula de la población expresa un CAR que tiene un dominio de unión a anti-mesotelina descrito en el presente documento, y una segunda célula que expresa otro agente, por ejemplo, un agente que potencia la actividad o función de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, en una realización, el agente puede ser un agente que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T. En algunas realizaciones, la molécula que modula o regula la función de las células T es una molécula inhibidora, por ejemplo, un agente descrito en el presente documento. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR para montar una respuesta inmunitaria efectora. Algunos ejemplos de moléculas inhibidoras son PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina o TGFR beta. En una realización, el agente que inhibe una molécula inhibidora comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociado con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento. En una realización, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina o TGFR beta, o un fragmento de cualquiera de ellos (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de cualquiera de ellos), y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como se describe en el presente documento) y/o un dominio de señalización primario (por ejemplo, un dominio de señalización CD3 zeta descrito en el presente documento). En una realización, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento del mismo (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de PD1), y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento (por ejemplo, un dominio de señalización CD28 descrito en el presente documento y/o un dominio de señalización CD3 zeta descrito en el presente documento).

[0605] En un aspecto, la presente divulgación proporciona procedimientos que comprenden administrar una población de células que expresan CAR, por ejemplo, células CART, por ejemplo, una mezcla de células que expresan diferentes CAR, en combinación con otro agente, por ejemplo, un inhibidor de PD-L1, tal como un inhibidor de PD-L1 descrito en el presente documento. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona procedimientos que comprenden administrar una población de células en la que al menos una célula de la población expresa un CAR que tiene un dominio de unión a anti-mesotelina como se describe en el presente documento, y una segunda célula que expresa otro agente, por ejemplo, un agente que mejora la actividad o la aptitud de una célula que expresa CAR, en combinación con otro agente, por ejemplo, un inhibidor de PD-L1, tal como un inhibidor de PD-L1 descrito en el presente documento.

[0607] Inhibidores de PD-L1

[0609] El sistema inmunitario tiene la capacidad de reconocer y eliminar las células tumorales; sin embargo, los tumores pueden utilizar múltiples estrategias para evadir la inmunidad. El bloqueo de los puntos de control inmunitarios es uno de los enfoques para activar o reactivar la inmunidad antitumoral terapéutica. El Ligando de Muerte Programada 1 (PD-L1) se ha descrito como un ligando del receptor inmunoinhibitorio de Muerte Programada 1 (PD-1). La unión de PD-L1 a PD-1 conduce a la inhibición de la proliferación de linfocitos mediada por receptores de células T y de la secreción de citoquinas (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34). Por lo tanto, el bloqueo de PD-L1 puede mejorar la inmunidad antitumoral.

[0611] Varios tipos celulares expresan PD-L1. Por ejemplo, PD-L1 se expresa en células T activadas, células dendríticas (DC), células asesinas naturales (NK), macrófagos, células B, monocitos y células del endotelio vascular. PD-L1 se expresa en muchos tipos de cáncer, incluyendo los carcinomas humanos de pulmón, ovario y colon y diversos mielomas, (Iwai et al. (2002) PNAS 99:12293-7; Ohigashi et al. (2005) Clin Cancer Res 11:2947-53; Okazaki et al. (2007) Intern. Immun.19:813-24; Thompson et al. (2006) Cancer Res.66:3381-5). La expresión de PD-L1 se correlaciona fuertemente con un pronóstico desfavorable en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de riñón, de ovario, de vejiga, de mama, gástrico y de páncreas.

[0613] Muchos linfocitos T infiltrantes de tumores expresan predominantemente PD-1 en comparación con los linfocitos T de tejidos normales y los linfocitos T de sangre periférica. Esto indica que la regulación al alza de PD-1 en células T reactivas a tumores puede contribuir al deterioro de las respuestas inmunitarias antitumorales (Ahmadzadeh et al. (2009) Blood 114:1537-44). De este modo, la señalización de PD-L1 mediada por células tumorales que expresan PD-L1 que interactúan con células T que expresan PD-1 puede conducir a la atenuación de la activación de células T y la evasión de la vigilancia inmunitaria (Sharpe et al. (2002) Nat Rev Immunol. 2:116-26; Keir et al. (2008) Annu Rev Immunol. 26:677-704). El bloqueo de PD-1 puede inhibir la diseminación hematógena de células tumorales poco inmunógenas mediante un mayor reclutamiento de células T efectoras (Iwai et al. (2005) Int. Immunol.17:133-144).

[0614] La inhibición de PD-L1 puede potenciar la inmunidad de células T, por ejemplo, mediante el bloqueo tanto de sus interacciones inhibitorias con PD-1 como con B7-1. La inhibición de PD-L1 también puede permitir la regulación inmunitaria a través de PD-L2/PD-1. Tanto PD-1 como B7-1 se expresan en células T, células B, CD y macrófagos, lo que proporciona la posibilidad de interacciones bidireccionales entre B7-1 y PD-L1 en estos tipos celulares. PD-L1 en células no hematopoyéticas puede interactuar con B7-1 así como con PD-1 en células T.

[0615] El término "Ligando de Muerte Programada 1" o "PD-L1" incluye isoformas, de mamífero,por ejemplo, PD-L1 humano, homólogos de especies de PD-1 humano, y análogos que comprenden al menos un epítopo común con PD-L1. La secuencia de aminoácidos de PD-L1,por ejemplo,PD-1 humana, es conocida en la técnica, por ejemplo,Dong et al. (1999) Nat Med.5(12):1365-9; Freeman et al. (2000) J Exp Med.192(7):1027-34).

[0616] La presente divulgación proporciona procedimientos y combinaciones para tratar una enfermedad, por ejemplo, asociada con la expresión de mesotelina, que incluyen la administración de un inhibidor de PD-L1. El inhibidor de PD-L1 puede tener una o más de las siguientes propiedades: inhibe o reduce la unión de PD-L1 a un receptor,por ejemplo,PD-1 o CD80 (B7-1), o ambos; se une a PD-L1 o a un receptor de unión a PD-L1,por ejemplo,PD-1 o CD80 (B7-1), o ambos; inhibe o reduce una o más actividades de PD-L1,por ejemplo,resultar en una o más de: un aumento de los linfocitos infiltrantes del tumor, un aumento de la proliferación mediada por receptores de células T, o una disminución de la evasión inmunitaria por células cancerosas; o inhibe o reduce la expresión de PD-L1,por ejemplo,la transcripción o la traducción de PD-L1.

[0617] En realizaciones, el inhibidor de PD-L1 reduce la unión de PD-L1 a un receptor, por ejemplo, a PD-1 o CD80 (B7-1), o ambos. Por ejemplo, la unión de PD-L1 a un receptor, por ejemplo, a PD-1 o CD80 (B7-1), o ambos, se reduce en presencia del inhibidor de PD-L1 en al menos un 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en comparación con la unión en ausencia del inhibidor de PD-L1. En una realización, la unión de PD-L1 a un receptor, por ejemplo, a PD-1 o CD80 (B7-1), o ambos, es insignificante, por ejemplo, indetectable, mediante los ensayos de unión estándar conocidos en la técnica. Los ensayos de unión ligando-receptor son bien conocidos en la técnica, e incluyen ensayos de inmunoprecipitación y de Western blot.

[0618] En realizaciones, el inhibidor de PD-L1 reduce una o más actividades de PD-L1. Por ejemplo, la actividad de PD-L1 se reduce al menos en un 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en comparación con la actividad de PD-L1 en ausencia del inhibidor de PD-L1.

[0619] En realizaciones, el inhibidor de PD-L1 reduce la expresión de PD-L1, por ejemplo, reduce la transcripción o traducción de PD-L1. Por ejemplo, la transcripción de PD-L1 se reduce al menos en un 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en comparación con la transcripción de PD-L1 en ausencia del inhibidor de PD-L1. En otro ejemplo, la traducción de PD-L1 se reduce al menos en un 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en comparación con la traducción de PD-L1 en ausencia del inhibidor de PD-L1. Los ensayos para determinar la expresión de ARN de PD-L1 son conocidos en la técnica, e incluyen ensayos basados en amplificación por PCR, por ejemplo, QPCR, y ensayos basados en hibridación de ácidos nucleicos, por ejemplo, Northern blots. Los ensayos para determinar la expresión de la proteína PD-L1 son conocidos en la técnica, e incluyen el western blot y el análisis inmunohistoquímico. En tales realizaciones, la administración del inhibidor de PD-L1 da como resultado una reducción de los niveles o de la cantidad de PD-L1 expresada en una célula, o una reducción del número de células que expresan PD-L1.

[0620] En una realización, el inhibidor de PD-L1 puede ser una molécula pequeña; un polipéptido,por ejemplo,una proteína de fusión; una molécula de anticuerpo; o un ácido nucleico inhibidor;por ejemplo,un ARNsi o ARNsh. En una realización, el inhibidor de PD-L1 es una molécula pequeña. En una realización, el inhibidor de molécula pequeña se une a PD-L1. En otra realización, el inhibidor de molécula pequeña se une al receptor de PD-L1, por ejemplo, PD-1 o CD80 (B7-1), o ambos. En todavía otra realización, el inhibidor de molécula pequeña impide o reduce la unión de PD-L1 a su receptor, por ejemplo, PD-1 o CD80 (B7-1), o ambos.

[0621] En una realización, el inhibidor de PD-L1 es un polipéptido o péptido. En una realización, el polipéptido o péptido inhibidor de PD-L1 se une a PD-L1 o a su receptor, por ejemplo, PD-1 o CD80 (B7-1), o ambos. En una realización, el polipéptido o péptido impide o reduce la unión de PD-L1 a su receptor, por ejemplo, PD-1 o CD80 (B7-1), o ambos. En una realización, el polipéptido comprende una porción de PD-L1, por ejemplo, una porción de unión a receptor de PD-L1, o una porción modificada de la misma que puede exhibir mayor afinidad por PD-1 o CD80 (B7-1) en comparación con PD-L1 de tipo salvaje. En tales realizaciones, el polipéptido inhibe o reduce la actividad de PD-L1 compitiendo por la unión con el receptor.

[0622] En una realización, el inhibidor de PD-L1 es un ácido nucleico inhibidor,por ejemplo,un agente de ARN de interferencia (ARNi). El ácido nucleico inhibidor puede ser un ácido nucleico de doble cadena o de cadena simple. El ácido nucleico inhibidor puede ser un ADN, un ARN o un híbrido que comprende ADN y ARN. Un ácido nucleico inhibidor inhibe o reduce la expresión,por ejemplo,traducción, de PD-L1. Un agente de interferencia de ARN (ARNi) causa típicamente la destrucción de moléculas de ARNm objetivo para inhibir o reducir la expresión,por ejemplo, traducción, de un gen objetivo, por ejemplo, PD-L1. Algunos ejemplos de agentes de ARNi incluyen ARNds largo, ARNsi, ARNsh y microARN. Los ácidos nucleicos inhibidores descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, un aptámero, un morfolino, una ribozima y secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, plásmidos o vectores, que comprenden o codifican un ARNds largo, un ARNsi, un ARNsh o un microARN.

[0623] En una realización, el ácido nucleico inhibidor es un ARN con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% de identidad de secuencia o complementariedad con el gen PD-L1 o un fragmento del mismo.

[0624] En una realización, el ácido nucleico inhibidor es un ARNsi o ARNsh de aproximadamente 15 a aproximadamente 65, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 28 nucleótidos de longitud. En realizaciones donde el ácido nucleico inhibidor es un ARNsi, el ARNsi tiene una longitud de aproximadamente 19 a 25 nucleótidos,por ejemplo, 19, 20, 21 o 22 nucleótidos. En las realizaciones donde el ácido nucleico inhibidor es un ARNsh, el ARNsh tiene una longitud de aproximadamente 42 a aproximadamente 70 nucleótidos. En una realización, el ARNsh comprende cadenas emparejadas de ARN antisentido y sentido conectadas por un bucle de nucleótidos no emparejados. En una realización, el tallo dúplex tiene una longitud de aproximadamente 19 y 29 nucleótidos, ya sea totalmente emparejado o con desajustes internos y bucles. En una realización, el bucle comprende 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos, por ejemplo, 4 o 7 nucleótidos.

[0625] [El ácido nucleico inhibidor puede sintetizarse o expresarse,por ejemplo, a partir de un plásmido o vector. Los agentes sintéticos de ARNi pueden generarse utilizando una serie de técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la molécula de ARNsi puede sintetizarse químicamente o producirse recombinantemente utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como utilizando fosforamiditos ribonucleósidos adecuadamente protegidos y un sintetizador de ADN/ARN convencional (Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature 411:494-498; Elbashir, S. M., W. Lendeckel y T. Tuschl (2001) Genes & Development 15:188-200; Harborth, J. et al. (2001) J. Cell Science 114:4557-4565; Masters, J. R. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 98:8012-8017; y Tuschl, T. et al. (1999) Genes & Development 13:3191-3197). Alternativamente, existen varios proveedores comerciales de síntesis de ARN disponibles, que incluyen, pero no se limitan a Proligo (Hamburgo, Alemania), Dharmacon Research (Lafayette, Co., EE. UU.), Pierce Chemical (parte dePerbio Science,Rockford, Ill., EE. UU.), Glen Research (Sterling, Va., EE. UU.), ChemGenes (Ashland, Mass., EE. UU.) y Cruachem (Glasgow, Reino Unido).

[0626] Los ensayos para evaluar la expresión, por ejemplo, evaluar los niveles de ARN o proteína, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las sondas en base a las secuencias de nucleótidos de PD-L1 pueden utilizarse para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas u proteínas homólogas. En realizaciones preferentes, la sonda comprende además un grupo etiquetado acoplado a ella, por ejemplo, el grupo etiquetado puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Tales sondas se utilizan, por ejemplo, en un ensayo basado en PCR, para medir el nivel de ARNm de PD-L1. Las técnicas de Western blot son bien conocidas en la técnica y se utilizan para medir el nivel de la proteína PD-L1.

[0627] En una realización, el inhibidor de PD-L1 es una molécula de anticuerpo. En una realización, la molécula de anticuerpo se une a un PD-L1 de mamífero,por ejemplo,humano. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo se une específicamente a un epítopo,por ejemplo,lineal o conformacional, (por ejemplo,un epítopo como se describe en el presente documento) en PD-L1.

[0628] En algunas realizaciones, el inhibidor de PD-L1 se elige entre YW243.55.S70, MPDL3280A, MEDI-4736, MSB-0010718C, o MDX-1105. MEDI4736 (Medimmune) es un anticuerpo monoclonal humano que se une a PDL1, e inhibe la interacción del ligando con PD1.

[0629] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es MSB0010718C. MSB0010718C (también denominado como A09-246-2; Merck Serono o avelumab) es un anticuerpo monoclonal que se une a PD-L1. Otros anticuerpos e inhibidores anti-PD-L1 se divulgan en WO2013/079174, WO2001/014557, WO2002/086083, WO2007005874, WO2010036959, WO2010077634 y WO2011066389, y que tienen una secuencia divulgada en el presente documento (o una secuencia sustancialmente idéntica o similar a la misma,por ejemplo,una secuencia al menos 85%, 90%, 95% idéntica o superior a la secuencia especificada). Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de MSB0010718C incluyen al menos lo siguiente:

[0630] Cadena pesada (SEC ID NO: 24 como se divulga enWO2013/079174)

[0633]

[0635] Cadena ligera(SEC ID NO: 25 como se divulga enWO2013/079174)

[0636]

[0638] En una realización, el inhibidor de PD-L1 es YW243.55.S70. El anticuerpo YW243.55.S70 es un anticuerpo anti-PD-L1 descrito en WO 2010/077634 (secuencias de región variable de cadena pesada y ligera mostradas en SEC ID Nos. 20 y 21, respectivamente), y que tiene una secuencia divulgada en el mismo documento (o una secuencia sustancialmente idéntica o similar a la misma,por ejemplo,una secuencia al menos 85%, 90%, 95% idéntica o superior a la secuencia especificada).

[0639] En una realización, el inhibidor de PD-L1 es MDX-1105. MDX-1105, también conocido como BMS-936559, es un anticuerpo anti-PD-L1 descrito en WO2007/005874, y que tiene una secuencia divulgada en el mismo documento (o una secuencia sustancialmente idéntica o similar a la misma,por ejemplo,una secuencia al menos 85%, 90%, 95% idéntica o superior a la secuencia especificada).

[0640] En una realización, el inhibidor de PD-L1 es MDPL3280A (Genentech / Roche) (también conocido como atezolizumab). MDPL3280A es un anticuerpo monoclonal IgG1 humano optimizado para Fc que se une a PD-L1. MDPL3280A y otros anticuerpos monoclonales humanos frente a PD-L1 se divulgan en Patente de EE.UU No: 7,943,743 y Publicación de EE.UU No.: 20120039906.

[0641] Moléculas de anticuerpos PD-L1 ejemplares

[0642] En una realización, el inhibidor de PD-L1 comprende una molécula de anticuerpo (por ejemplo, una molécula de anticuerpo aislada o recombinante) que tiene una o más de las siguientes propiedades:

[0643] (i) se une a PD-L1,por ejemplo,PD-L1 humana, con alta afinidad,por ejemplo,con una constante de afinidad de al menos aproximadamente 10<7>M<-1>, típicamente aproximadamente de 10<8>M<-1>, y más típicamente, aproximadamente de 10<9>M<-1>a 10<10>M<-1>o más fuerte;

[0644] (ii) no se une sustancialmente a CD28, CTLA-4, ICOS o BTLA;

[0645] (iii) inhibe o reduce la unión de PD-L1 a un receptor,por ejemplo,PD-1 o CD80 (B7-1), o ambos; (iv) se une específicamente a un epítopo de PD-L1,por ejemplo,el mismo epítopo o epítopo similar al reconocido por el anticuerpo monoclonal murino BAP058 o un anticuerpo quimérico BAP058,por ejemplo, BAP058-chi;

[0646] (v) muestra la misma o similar afinidad o especificidad de unión, o ambas, que cualquiera de los BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058-hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Clone-K, BAP058-Clone-L, BAP058-Clone-M, BAP058-Clone-N o BAP058-Clone-O; (vi) muestra la misma o similar afinidad o especificidad de unión, o ambas, que una molécula de anticuerpo (por ejemplo,una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera) descrita en la Tabla 1;

[0647] (vii) muestra la misma o similar afinidad o especificidad de unión, o ambas, que una molécula de anticuerpo (por ejemplo,una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera) que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 1;

[0648] (viii) muestra la misma o similar afinidad o especificidad de unión, o ambas, que una molécula de anticuerpo (por ejemplo,una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera) codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 1;

[0649] (ix) inhibe,por ejemplo,inhibe competitivamente, la unión de una segunda molécula de anticuerpo a PD-L1, en la que la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento,por ejemplo,una molécula de anticuerpo elegida entre,por ejemplo,cualquiera de BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058-hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Clone-K, BAP058-Clone-L, BAP058-Clone-M, BAP058-Clone-N o BAP058-Clone-O; (x) se une al mismo epítopo o a un epítopo solapante con una segunda molécula de anticuerpo contra PD-1, en la que la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento,por ejemplo,una molécula de anticuerpo elegida entre,por ejemplo,cualquiera de BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058-hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Clone-K, BAP058-Clone-L, BAP058-Clone-M, BAP058-Clone-N o BAP058-Clone-O; (xi) compite por la unión, y/o se une al mismo epítopo, con una segunda molécula de anticuerpo a PD-L1, en la que la segunda molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento,por ejemplo,una molécula de anticuerpo elegida entre,por ejemplo,cualquiera de BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058-hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Clone-K, BAP058-Clone-L, BAP058-Clone-M, BAP058-Clone-N o BAP058-Clone-O; (xii) tiene una o más propiedades biológicas de una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento,por ejemplo,una molécula de anticuerpo elegida entre,por ejemplo,cualquiera de BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058-hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Clone-K, BAP058-Clone-L, BAP058-Clone-M, BAP058-Clone-N o BAP058-Clone-O; (xiii) tiene una o más propiedades farmacocinéticas de una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento,por ejemplo,una molécula de anticuerpo elegida entre,por ejemplo,cualquiera de BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058-hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Clone-K, BAP058-Clone-L, BAP058-Clone-M, BAP058-Clone-N o BAP058-Clone-O; (xiv) inhibe una o más actividades de PD-L1,por ejemplo,da como resultado una o más de: un aumento de los linfocitos infiltrantes del tumor, un aumento de la proliferación mediada por receptores de células T, o una disminución de la evasión inmunitaria por células cancerosas; o

[0650] (xv) se une a la PD-L1 humana y tiene reactividad cruzada con la PD-L1 de cynomolgus.

[0652] En una realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 incluye al menos uno o dos dominios variables de cadena pesada (incluyendo opcionalmente una región constante), al menos uno o dos dominios variables de cadena ligera (incluyendo opcionalmente una región constante), o ambos, que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058-hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Clone-K, BAP058-Clone-L, BAP058-Clone-M, BAP058-Clone-N, o BAP058-Clone-O, como se proporciona en la Tabla 6, o codificada por la secuencia de nucleótidos de la Tabla 6; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo,al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más idéntica) a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas.

[0653] En todavía otra realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 incluye al menos una, dos o tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de un anticuerpo descrito en el presente documento,por ejemplo,un anticuerpo elegido entre cualquiera de BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058-hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Clone-K, BAP058-Clone-L, BAP058-Clone-M, BAP058-Clone-N, o BAP058-Clone-O; o como se describe en la Tabla 6, o codificada por la secuencia de nucleótidos de la Tabla 6; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo,al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más idéntica) a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas.

[0654] En todavía otra realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 incluye al menos una, dos o tres CDR (o colectivamente todas las CDR) de una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 6, o codificada por una secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 6. En una realización, una o más de las CDR (o colectivamente todas las CDR) tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cambios,por ejemplo, sustituciones o deleciones de aminoácidos, en relación con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 6, o codificada por una secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 6. En todavía otra realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 incluye al menos una, dos o tres CDR (o colectivamente todas las CDR) de una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 6, o codificada por una secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 6. En una realización, una o más de las CDR (o colectivamente todas las CDR) tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cambios,por ejemplo, sustituciones o deleciones de aminoácidos, en relación con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 6, o codificada por una secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 6. En determinadas realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 incluye una sustitución en una CDR de cadena ligera,por ejemplo,una o más sustituciones en una CDR1, CDR2 y/o CDR3 de la cadena ligera. En otra realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 incluye al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR (o colectivamente todas las CDR) de una región variable de cadena pesada y ligera que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 6, o codificada por una secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 6. En una realización, una o más de las CDR (o colectivamente todas las CDR) tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más cambios,por ejemplo, sustituciones o deleciones de aminoácidos, en relación con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Tabla 6, o codificada por una secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 6.

[0655] En una realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 incluye:

[0656] (i) una región variable de cadena pesada (VH) que incluye una secuencia de aminoácidos VHCDR1 elegida entre SEC ID NO: 287, SEC ID NO: 290 o SEC ID NO: 195; una secuencia de aminoácidos VHCDR2 de SEC ID NO: 288; y una secuencia de aminoácidos VHCDR3 de SEC ID NO: 289, cada una divulgada en la Tabla 6; y

[0657] (ii) una región variable de cadena ligera (VL) que incluye una secuencia de aminoácidos VLCDR1 de SEC ID NO: 295, una secuencia de aminoácidos VLCDR2 de SEC ID NO: 296, y una secuencia de aminoácidos VLCDR3 de SEC ID NO: 297, cada una divulgada en la Tabla 6.

[0658] En otra realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 incluye:

[0659] (i) una región variable de cadena pesada (VH) que incluye una secuencia de aminoácidos VHCDR1 elegida entre SEC ID NO: 287, SEC ID NO: 290 o SEC ID NO: 195; una secuencia de aminoácidos VHCDR2 de SEC ID NO: 291, y una secuencia de aminoácidos VHCDR3 de SEC ID NO: 292, cada una divulgada en la Tabla 6; y

[0660] (ii) una región variable de cadena ligera (VL) que incluye una secuencia de aminoácidos VLCDR1 de SEC ID NO: 298, una secuencia de aminoácidos VLCDR2 de SEC ID NO: 299, y una secuencia de aminoácidos VLCDR3 de SEC ID NO: 300, cada una divulgada en la Tabla 6.

[0662] En realizaciones de las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas, el VHCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1. En otras realizaciones, el VHCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4. En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos VHCDR1 de SEC ID NO: 195.

[0663] En realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas tienen una región variable de cadena pesada que comprende al menos una región marco (FW) que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NOs: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, o 154, o una secuencia de aminoácidos al menos un 90% idéntica a la misma, o que no tenga más de dos sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NOs: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152 o 154. En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas tienen una región variable de cadena pesada que comprende al menos una región marco que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NOs: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152 o 154. En todavía otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas tienen una región variable de cadena pesada que comprende al menos dos, tres o cuatro regiones marco que comprenden las secuencias de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NOs: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152 o 154.

[0664] En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas comprenden una secuencia de aminoácidos VHFW1 de SEC ID NO: 124, 126, 128 o 130, una secuencia de aminoácidos VHFW2 de SEC ID NO: 132, 134, 136, 138, 140 o 142, y una secuencia de aminoácidos VHFW3 de SEC ID NO: 144, 146, 148, 150, o 152, y, opcionalmente, comprendiendo además una secuencia de aminoácidos VHFW4 de SEC ID NO: 154.

[0665] En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas tienen una región variable de cadena ligera que comprende al menos una región marco que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NOs: 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, o 186, o una secuencia de aminoácidos al menos un 90% idéntica a la misma, o que no tenga más de dos sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NOs: 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, o 186.

[0666] En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas tienen una región variable de cadena ligera que comprende al menos una región marco que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NOs: 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184 o 186. En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas tienen una región variable de cadena ligera que comprende al menos dos, tres o cuatro regiones marco que comprenden las secuencias de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NOs: 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184 o 186.

[0667] En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas comprenden una secuencia de aminoácidos VLFW1 de SEC ID NO: 156, 158, 160, 162, 164 o 166, una secuencia de aminoácidos VLFW2 de SEC ID NO: 168 o 170, y una secuencia de aminoácidos VLFW3 de SEC ID NO: 172, 174, 176, 178, 180, 182, o 184, y, opcionalmente, que comprendiendo además una secuencia de aminoácidos VLFW4 de SEC ID NO: 186.

[0668] En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas comprenden un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 18, 30, 38, 46, 50, 54, 62, 70 o 78, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 18, 30, 38, 46, 50, 54, 62, 70 o 78.

[0669] En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas comprenden un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 22, 26, 34, 42, 58, 66, 74, 82 u 86 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85% idéntica a cualquiera de las SEC ID NOs: 22, 26, 34, 42, 58, 66, 74, 82 o 86.

[0670] En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas se eligen entre un Fab, F(ab')2, Fv, o un fragmento Fv de cadena simple (scFv).

[0671] En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas comprenden una región constante de cadena pesada seleccionada entre IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

[0672] En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas son capaces de unirse a PD-L1 humana con una constante de disociación (K<D>) de menos de aproximadamente 0,2 nM.

[0673] En algunas realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas se unen a PD-L1 humana con un K<D>de menos de aproximadamente 0,2 nM, 0,15 nM, 0,1 nM, 0,05 nM, o 0,02 nM,por ejemplo,de aproximadamente 0,2 nM a 0,1 nM,por ejemplo,de aproximadamente 0,166 nM a 0,176 nM,por ejemplo,de aproximadamente 0,171 nM,por ejemplo,medido mediante un procedimiento Biacore.

[0674] En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas son capaces de reducir la unión de PD-1 o B7-1 a PD-L1 o a una célula que expresa PD-L1. En algunas realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas reducen (por ejemplo,bloquean) la unión de PD-L1 a una célula que expresa PD-L1 con una IC50 de menos de aproximadamente 1,5 nM, 1 nM, 0,8 nM, 0,6 nM, 0,4 nM, 0,2 nM, o 0,1 nM,por ejemplo,entre aproximadamente 0,2 nM y aproximadamente 0,1 nM,por ejemplo,aproximadamente 0,15 nM o menos,por ejemplo,aproximadamente 0,145 nM. En algunas realizaciones, los anticuerpos mencionados reducen (por ejemplo,bloquean) la unión de B7-1 a una célula que expresa PD-L1 (por ejemplo, células 300.19 humanas que expresan PD-L1) con una IC50 de menos de aproximadamente 2 nM, 1,5 nM, 1 nM, 0,5 nM, o 0,2 nM, por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 nM y aproximadamente 0,01 nM, o aproximadamente 0,2 nM o menos,por ejemplo,aproximadamente 0,1 nM.

[0675] En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas son capaces de potenciar una respuesta de células T específica de antígeno.

[0676] En algunas realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas se unen a PD-L1 con una Kd más lenta que 5×10<-4>, 1×10<-4>, 5×10<-5>, o 1×10<-5>s<-1>,por ejemplo,aproximadamente 6,33×10<-5>s<-1>,por ejemplo,medido mediante un procedimiento Biacore. En algunas realizaciones, las moléculas de anticuerpo anteriormente mencionadas se unen a PD-L1 con un Ka más rápido que 1×10<4>, 5×10<4>, 1×10<5>, o 5×10<5>M<-1>s<-1>,por ejemplo,aproximadamente 3,07×10<4>M<-1>s<-1>,por ejemplo,medido mediante un procedimiento Biacore. En realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 es una molécula de anticuerpo monoespecífica o una molécula de anticuerpo biespecífica. En realizaciones, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 tiene una primera especificidad de unión para PD-L1 y una segunda especificidad de unión para TIM-3, LAG-3, CEACAM (por ejemplo,CEACAM-1, CEACAM-3, y/o CEACAM-5), PD-1 o PD-L2. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo comprende un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, medio anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de medio anticuerpo.

[0677] Tabla 6. Secuencias de aminoácidos y nucleótidos para moléculas de anticuerpos murinos, quiméricos y humanizados. Las moléculas de anticuerpo incluyen el mAb murino BAP058, el mAb quimérico BAP058-chi y los mAbs humanizados BAP058-hum01 a BAP058-hum17 y BAP058-Clone-K a BAP058-Clone-O. Se muestran las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las CDR de las cadenas pesada y ligera, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y las cadenas pesada y ligera.

[0680]

[0681]

[0682]

[0683]

[0684]

[0685]

[0686]

[0687]

[0688]

[0689]

[0690]

[0691]

[0692]

[0693]

[0694]

[0695]

[0696]

[0697]

[0698]

[0699]

[0700]

[0701]

[0702]

[0703]

[0704]

[0705]

[0706]

[0707]

[0708]

[0709]

[0710]

[0711]

[0712]

[0713]

[0714]

[0715]

[0716]

[0717]

[0718]

[0719]

[0720]

[0721]

[0722]

[0723]

[0724]

[0725]

[0728] Aplicación Terapéutica para Enfermedades y Trastornos que Expresan Mesotelina

[0729] La presente invención proporciona composiciones para su uso en procedimientos para tratar enfermedades y trastornos asociados con la expresión de mesotelina. Un ejemplo de enfermedad o trastorno asociado con la mesotelina es el mesotelioma.

[0730] El mesotelioma maligno es un tipo de cáncer que se produce en la fina capa de células que recubren los órganos internos del cuerpo, conocida como el mesotelio. Existen tres tipos reconocidos de mesotelioma. El mesotelioma pleural (por ejemplo, mesotelioma pleural maligno o MPM) es la forma más común de la enfermedad, representando aproximadamente el 70% de los casos y se produce en el revestimiento del pulmón conocido como pleura. El mesotelioma peritoneal se produce en el revestimiento de la cavidad abdominal, conocido como peritoneo. El mesotelioma pericárdico se origina en el pericardio, que recubre el corazón. Un sujeto puede estar en riesgo de desarrollar mesotelioma si estuvo expuesto al asbesto. La exposición al asbesto y la inhalación de partículas de asbesto pueden causar mesotelioma. En la mayoría de los casos, los síntomas del mesotelioma no aparecen en un sujeto expuesto al asbesto hasta muchos años después de que se haya producido la exposición.

[0731] Los síntomas del mesotelioma pleural incluyen, por ejemplo, dolor lumbar o dolor torácico lateral y dificultad para respirar. Otros síntomas incluyen dificultad para tragar, tos persistente, fiebre, pérdida de peso o fatiga. Otros síntomas que experimentan algunos pacientes son debilidad muscular, pérdida de capacidad sensorial, tos con sangre, hinchazón facial y de brazos, y ronquera. En las etapas iniciales de la enfermedad, tales como el mesotelioma en etapa 1, los síntomas pueden ser leves. Los pacientes suelen referir dolor en una zona del tórax que nunca parece desaparecer, pérdida de peso y fiebre.

[0732] El mesotelioma peritoneal se origina en el abdomen y, como resultado, los síntomas a menudo incluyen dolor abdominal, pérdida de peso, náuseas y vómitos. También puede producirse acumulación de líquido en el abdomen como resultado del cáncer. El mesotelioma peritoneal se origina en el abdomen y con frecuencia se propaga a otros órganos de la zona incluyendo el hígado, el bazo o el intestino. El dolor abdominal intenso es la dolencia más común que experimentan los pacientes al principio. También puede haber un nivel de incomodidad con la acumulación de líquido en el abdomen también. Otros síntomas del mesotelioma peritoneal pueden ser dificultad para defecar, náuseas y vómitos, fiebre e hinchazón de pies.

[0733] El mesotelioma pericárdico es la forma menos común de mesotelioma. El mesotelioma pericárdico, como su nombre indica, afecta al corazón. Este tipo raro de cáncer de mesotelioma invade el pericardio, el saco que rodea el corazón. A medida que el cáncer progresa, el corazón no es capaz de suministrar oxígeno al organismo con la misma eficacia, lo que provoca un deterioro de la salud a un ritmo cada vez más rápido. Los síntomas más comúnmente asociados con el mesotelioma pericárdico son similares a los de un infarto de miocardio: náuseas, dolor en el pecho y dificultad para respirar.

[0734] Los sujetos que se benefician del tratamiento de acuerdo con la invención incluyen sujetos con un mesotelioma, o sujetos sospechosos de tener mesotelioma, por ejemplo, como se evidencia por la presencia de uno o más de los síntomas descritos en el presente documento y/o exposición al asbesto. En realizaciones particulares, el mesotelioma es un mesotelioma pleural (por ejemplo, un mesotelioma pleural maligno). En otros aspectos, se puede tratar al sujeto que tiene una afección precancerosa tal como, por ejemplo, placas pleurales, mesotelioma benigno o hiperplasia mesotelial.

[0735] Otro ejemplo de enfermedad o trastorno asociado con la mesotelina es el cáncer de páncreas. Los cánceres de páncreas que pueden tratarse con los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, cánceres pancreáticos exocrinos y cánceres pancreáticos endocrinos. Los cánceres de páncreas exocrinos incluyen, pero no se limitan a, adenocarcinomas, carcinomas de células acinares, carcinomas adenoescamosos, carcinomas coloides, carcinomas indiferenciados con células gigantes similares a osteoclastos, carcinomas hepatoides, neoplasias papilomucinosas intraductales, neoplasias quísticas mucinosas, pancreatoblastomas, cistadenomas serosos, carcinomas de células en anillo de sello, tumores sólidos y pseudopapilares, carcinomas ductales pancreáticos y carcinomas indiferenciados. En algunas realizaciones, el cáncer de páncreas exocrino es un carcinoma ductal pancreático. Los cánceres de páncreas endocrinos incluyen, pero no se limitan a, los insulinomas y los glucagonomas.

[0736] En algunas realizaciones, el cáncer de páncreas es cualquiera de cáncer de páncreas en estadio temprano, cáncer de páncreas no metastásico, cáncer de páncreas primario, cáncer de páncreas resecado, cáncer de páncreas avanzado, cáncer de páncreas localmente avanzado, cáncer de páncreas metastásico, cáncer de páncreas irresecable, cáncer de páncreas en remisión, cáncer de páncreas recurrente, cáncer de páncreas en un entorno adyuvante o cáncer de páncreas en un entorno neoadyuvante. En algunas realizaciones, el cáncer de páncreas es un cáncer de páncreas localmente avanzado, un cáncer de páncreas irresecable o un carcinoma ductal pancreático metastásico. En algunas realizaciones, el cáncer de páncreas es resistente a la terapia basada en gemcitabina. En algunas realizaciones, el cáncer de páncreas es refractario a la terapia basada en gemcitabina.

[0737] En otros aspectos, el trastorno asociado con la expresión de mesotelina es cáncer de ovario. El cáncer de ovario se clasifica de acuerdo con la histología del tumor. El tumor epitelio-estromal de superficie, también conocido como carcinoma epitelial de ovario, es el tipo más común de cáncer de ovario. Incluye el tumor seroso (que incluye el cistadenocarcinoma papilar seroso), el tumor endometrioide y el cistadenocarcinoma mucinoso. Los procedimientos descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar varias etapas de cáncer de ovario, por ejemplo, etapa I, etapa II, etapa III o etapa IV. La estadificación puede realizarse, por ejemplo, cuando se extirpa el cáncer de ovario. El cáncer de ovario se clasifica en las siguientes etapas: El cáncer en etapa I está confinado a uno o ambos ovarios. El cáncer está en etapa II si uno o ambos ovarios están afectados y se ha propagado al útero y/o a las trompas de Falopio o a otros sitios de la pelvis. El cáncer está en etapa III si uno o ambos ovarios están afectados y se ha propagado a los ganglios linfáticos o a otros lugares fuera de la pelvis pero aún dentro de la cavidad abdominal, tal como la superficie del intestino o el hígado. El cáncer está en etapa IV si uno o ambos ovarios están afectados y el cáncer se ha propagado fuera del abdomen o al interior del hígado.

[0738] En algunas realizaciones, el cáncer de ovario es resistente a uno o más agentes quimioterapéuticos. En algunas realizaciones, el cáncer de ovario es refractario a uno o más agentes quimioterapéuticos.

[0739] Otros cánceres que pueden tratarse con la terapia combinada descrita en el presente documento incluyen, por ejemplo, cáncer cerebral, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñón, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma de pulmón), melanoma, melanoma metastásico, mesotelioma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer renal, cáncer de piel, timoma, sarcoma, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer de útero y cualquier combinación de los mismos.

[0740] En un aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para tratar el cáncer en un sujeto. El procedimiento comprende administrar al sujeto una terapia combinada que incluye administrar una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1 de tal manera que se trate el cáncer en el sujeto. Un ejemplo de cáncer que es tratable mediante la terapia combinada descrita en el presente documento es un cáncer asociado con la expresión de mesotelina. En un aspecto, el cáncer asociado con la expresión de mesotelina se selecciona entre mesotelioma, cáncer de páncreas, cáncer de ovario y cáncer de pulmón, o una metástasis resultante de cualquiera de los cánceres anteriormente mencionados.

[0741] En una realización, la terapia combinada de una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1 descrito en el presente documento da como resultado una o más de: mejora o aumento de la actividad antitumoral de la célula que expresa CAR de mesotelina; aumento de la proliferación o persistencia de la célula que expresa CAR de mesotelina; mejora o aumento de la infiltración de la célula que expresa CAR de mesotelina; mejora de la inhibición de la progresión tumoral; retraso de la progresión tumoral; inhibición o reducción de la proliferación de células cancerosas; y/o reducción de la carga tumoral, por ejemplo, volumen o tamaño del tumor,por ejemplo,en comparación con una monoterapia de célula que expresa CAR de mesotelina o inhibidor de PD-L1 solos.

[0742] La presente divulgación proporciona procedimientos para inhibir la proliferación de o reducir una población celular que expresa mesotelina. En una realización, los procedimientos comprenden administrar una terapia combinada, por ejemplo, una combinación que comprende una célula que expresa CAR de mesotelina, o una población de células que expresan CAR de mesotelina, y un inhibidor de PD-L1. En determinadas realizaciones, la terapia combinada aquí descrita reduce la cantidad, el número, la cantidad o el porcentaje de células y/o células cancerosas en al menos un 5%, 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% en un sujeto con o modelo animal de mesotelioma u otro cáncer asociado con células que expresan mesotelina en relación con la cantidad, el número, la cantidad o el porcentaje de células y/o células cancerosas en un sujeto tratado con una célula que expresa CAR de mesotelina o un inhibidor de PD-L1 solos. En un aspecto, el sujeto es un ser humano.

[0743] La divulgación también proporciona procedimientos para prevenir, tratar y/o gestionar un trastorno asociado con células que expresan mesotelina (por ejemplo, mesotelioma), comprendiendo los procedimientos administrar a un sujeto necesitado una célula que expresa CAR de mesotelina, o una población de células que expresan CAR de mesotelina, y un inhibidor de PD-L1. En un aspecto, el sujeto es un ser humano.

[0744] Terapias Combinadas

[0745] Cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento puede utilizarse en combinación con otros agentes y terapias conocidos.

[0746] La combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, y el al menos un agente terapéutico adicional pueden administrarse simultáneamente, en la misma composición o en composiciones separadas, o secuencialmente. Para la administración secuencial, la célula que expresa CAR y/o el inhibidor de PD-L1 descritos en el presente documento pueden administrarse después del agente terapéutico adicional, o puede invertirse el orden de administración, donde el agente terapéutico adicional puede administrarse después de la célula que expresa CAR y/o el inhibidor de PD-L1 descritos en el presente documento. Alternativamente, el agente terapéutico adicional puede administrarse entre la administración de la célula que expresa CAR y el inhibidor de PD-L1.

[0747] En aspectos adicionales, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, puede utilizarse en un régimen de tratamiento en combinación con cirugía, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos, tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citoquinas e irradiación. Vacuna peptídica, tal como la descrita en Izumoto et al.2008 J Neurosurg 108:963-971.

[0748] En una realización, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, puede utilizarse en combinación con un agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos ejemplares incluyen una antraciclina (por ejemplo, doxorrubicina (por ejemplo, doxorrubicina liposomal)). un alcaloide de vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina), un agente alquilante (por ejemplo, ciclofosfamida, decarbazina, melfalán, ifosfamida, temozolomida), un anticuerpo de células inmunitarias (por ejemplo, alemtuzamab, gemtuzumab, rituximab, tositumomab), un antimetabolito (incluyendo, por ejemplo, antagonistas del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de la adenosina deaminasa (por ejemplo, fludarabina)), un inhibidor de mTOR, un agonista de la proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoides (GITR), un inhibidor del proteasoma (por ejemplo, aclacinomicina A, gliotoxina o bortezomib), un inmunomodulador como la talidomida o un derivado de la talidomida (por ejemplo, lenalidomida).

[0749] Los agentes Quimioterapéuticos generales considerados para su uso en terapias combinadas incluyen anastrozol (Arimidex<®>), bicalutamida (Casodex<®>), sulfato de bleomicina (Blenoxane<®>), busulfán (Myleran<®>), busulfán inyectable (Busulfex<®>), capecitabina (Xeloda<®>), N4-pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatino (Paraplatin<®>), carmustina (BiCNU<®>), clorambucil (Leukeran<®>), cisplatino (Platinol<®>), cladribina (Leustatin<®>), ciclofosfamida (Cytoxan<®>o Neosar<®>), citarabina, arabinósido de citosina (Cytosar-U<®>), citarabina liposomal inyectable (DepoCyt<®>), dacarbazina (DTIC-Dome<®>), dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), clorhidrato de daunorrubicina (Cerubidine<®>), inyección liposomal de citrato de daunorrubicina (DaunoXome<®>), dexametasona, docetaxel (Taxotere<®>), clorhidrato de doxorrubicina (Adriamycin<®>, Rubex<®>), etopósido (Vepesid<®>), fosfato de fludarabina (Fludara<®>), 5-fluorouracilo (Adrucil<®>, Efudex<®>), flutamida (Eulexin<®>), tezacitibina, Gemcitabina (difluorodesoxicitidina), hidroxiurea (Hydrea<®>), Idarubicina (Idamicina<®>), ifosfamida (IFEX<®>), irinotecán (Camptosar<®>), L-asparaginasa (ELSPAR<®>), leucovorina cálcica, melfalán (Alkeran<®>), 6-mercaptopurina (Purinethol<®>), metotrexato (Folex<®>), mitoxantrona (Novantrone<®>), mylotarg, paclitaxel (Taxol<®>), phoenix (Yttrium90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosan 20 con implante de carmustina (Gliadel<®>), citrato de tamoxifeno (Nolvadex<®>), tenipósido (Vumon<®>), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone<®>), clorhidrato de topotecán inyectable (Hycamptin<®>), vinblastina (Velban<®>), vincristina (Oncovin<®>) y vinorelbina (Navelbine<®>). Los agentes alquilantes ejemplares incluyen, sin limitación, mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos, nitrosoureas y triazenos): Mostaza de uracilo (Mostaza de Aminouracilo<®>, Cloretaminacilo<®>, Dietildopan<®>, Desmetildopan<®>, Hemantamina<®>, Nordopan<®>, Uracilo mostaza nitrogenada<®>, Uracillost<®>, Uracilmostaza<®>, Uramustin<®>, Uramustine<®>), clormetina (Mustargen<®>), ciclofosfamida (Cytoxan<®>, Neosar<®>, Clafen<®>, Endoxan<®>, Procytox<®>, Revimmune<™>), ifosfamida (Mitoxana<®>), melfalán (Alkeran<®>), clorambucil (Leukeran<®>), pipobromán (Amedel<®>, Vercyte<®>), trietilenemelamina (Hemel<®>, Hexalen<®>, Hexastat<®>), trietilentiofosforamina, temozolomida (Temodar<®>), tiotepa (Thioplex<®>), busulfán (Busilvex<®>, Myleran<®>), carmustina (BiCNU<®>), lomustina (CeeNU<®>), estreptozocina (Zanosar<®>) y Dacarbazina (DTIC-Dome<®>). Otros agentes alquilantes ejemplares incluyen, sin limitación, Oxaliplatino (Eloxatino<®>); Temozolomida (Temodar<®>y Temodal<®>); Dactinomicina (también conocida como actinomicina-D, Cosmegen<®>); Melfalán (también conocido como L-PAM, L-sarcolisina y mostaza de fenilalanina, Alkeran<®>); Altretamina (también conocida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen<®>); Carmustina (BiCNU<®>); Bendamustina (Treanda<®>); Busulfán (Busulfex<®>y Myleran<®>); Carboplatino (Paraplatino<®>); Lomustina (también conocida como CCNU, CeeNU<®>); Cisplatino (también conocido como CDDP, Platinol<®>y Platinol<®>-AQ); Clorambucil (Leukeran<®>); Ciclofosfamida (Cytoxan<®>y Neosar<®>); Dacarbazina (también conocida como DTIC, DIC y carboxamida de imidazol, DTIC-Dome<®>); Altretamina (también conocida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen<®>); Ifosfamida (Ifex<®>); Prednumustina; Procarbazina (Matulane<®>); Mecloretamina (también conocida como mostaza nitrogenada, mustina y clorhidrato de mecloretamina, Mustargen<®>); Estreptozocina (Zanosar<®>), Tiotepa (también conocida como tiofosfoamida, TESPA y TSPA, Tioplex<®>); Ciclofosfamida (Endoxan<®>, Cytoxan<®>, Neosar<®>, Procytox<®>, Revimmune<®>); y Bendamustina HCl (Treanda<®>).

[0750] Los inhibidores de mTOR ejemplares incluyen, por ejemplo, temsirolimus ridaforolimus (formalmente conocido como deferolimus, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23, 29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.0<4,9>] hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexil dimetilfosfinato, también conocido como AP23573 y MK8669, y descrito en Publicación PCT No. WO 03/064383); everolimus (Afinitor<®>o RAD001); rapamicina (AY22989, Sirolimus<®>); simapimod (CAS 164301-51-3); emsirolimus, (5-{2,4-Bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il}-2-metoxifenil)metanol(AZD8055); 2-Amino-8-[trans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metillpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502, CAS 1013101-36-4); yN2

-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1-benzopiran-2-il)morfolinio-4-il]metoxi]butil]-L-arginilglicil-L-α-aspartilL-serina- (SEC ID NO: 613), sal interna (SF1126, CAS 936487-67-1), y XL765.

[0751] Los inmunomoduladores ejemplares incluyen, por ejemplo, afutuzumab (disponible en Roche<®>); pegfilgrastim (Neulasta<®>); lenalidomida (CC-5013, Revlimid<®>); talidomida (Thalomid<®>), actimid (CC4047); e IRX-2 (mezcla de citoquinas humanas que incluye interleucina 1, interleucina 2 e interferón γ, CAS 951209-71-5, disponible en IRX Therapeutics).

[0752] Las antraciclinas ejemplares incluyen, por ejemplo, doxorrubicina (Adriamicina<®>y Rubex<®>); bleomicina (lenoxano<®>); daunorrubicina (clorhidrato de dauorrubicina, daunomicina y clorhidrato de rubidomicina, Cerubidine<®>); daunorrubicina liposomal (citrato de daunorrubicina liposomal, DaunoXome<®>); mitoxantrona (DHAD, Novantrone<®>); epirubicina (Ellence<™>); idarubicina (Idamicina<®>, Idamicina PFS<®>); mitomicina C (Mutamicina<®>); geldanamicina; herbimicina; ravidomicina; y desacetilravidomicina.

[0753] Los alcaloides de vinca ejemplares incluyen, por ejemplo, tartrato de vinorelbina (Navelbine<®>), Vincristina (Oncovin<®>), y Vindesina (Eldisine<®>)); vinblastina (también conocida como sulfato de vinblastina, vincaleucoblastina y VLB, Alkaban-AQ<®>y Velban<®>); y vinorelbina (Navelbine<®>).

[0754] Los inhibidores del proteosoma ejemplares incluyen bortezomib (Velcade<®>); carfilzomib (PX-171-007, (S)-4-Metil-N-((S)-1-(((S)-4-metil-1-((R)-2-metiloxiran-2-il)-1-oxopentan-2-il)amino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)-2-((S)-2-(2-morfolinoacetamido)-4-fenilbutanamido)-pentanamida); marizomib (NPI-0052); citrato de ixazomib (MLN-9708); delanzomib (CEP-18770); yO-Metil-N-[(2-metil-5-tiazolil)carbonil]-L-seril-O-metil-N-[(1S)-2-[(2R)-2-metil-2-oxiranil]-2-oxo-1-(fenilmetil)etil]- L-serinamida (ONX-0912).

[0755] En realizaciones, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, se administra a un sujeto en combinación con brentuximab. Brentuximab es un conjugado anticuerpo-fármaco de anticuerpo anti-CD30 y monometil auristatina E. En las realizaciones, el sujeto tiene linfoma de Hodgkin (HL), por ejemplo, HL en recaída o refractario. En algunas realizaciones, el sujeto comprende HL CD30+. En algunas realizaciones, el sujeto ha sido sometido a un trasplante autólogo de células madre (ASCT). En algunas realizaciones, el sujeto no ha sido sometido a un ASCT. En algunas realizaciones, brentuximab se administra a una dosificación de aproximadamente 1-3 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 o 2,5-3 mg/kg), por ejemplo, por vía intravenosa, por ejemplo, cada 3 semanas.

[0757] En realizaciones, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, se administra a un sujeto en combinación con brentuximab y dacarbazina o en combinación con brentuximab y bendamustina. La dacarbazina es un agente alquilante con un nombre químico de 5-(3,3-Dimetil-1-triazenil)imidazol-4-carboxamida. La bendamustina es un agente alquilante con un nombre químico de ácido 4-[5-[Bis(2-cloroetil)amino]-1-metilbenzimidazol-2-il]butanoico. En algunas realizaciones, el sujeto tiene linfoma de Hodgkin (HL). En algunas realizaciones, el sujeto no ha sido tratado previamente con una terapia contra el cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene al menos 60 años de edad, por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o más. En algunas realizaciones, la dacarbazina se administra en una dosificación de aproximadamente 300-450 mg/m<2>(por ejemplo, aproximadamente 300-325, 325-350, 350-375, 375-400, 400-425, o 425-450 mg/m<2>), por ejemplo, por vía intravenosa. En algunas realizaciones, la bendamustina se administra en una dosificación de aproximadamente 75-125 mg/m2 (por ejemplo, 75-100 o 100-125 mg/m<2>, por ejemplo, aproximadamente 90 mg/m<2>), por ejemplo, por vía intravenosa. En algunas realizaciones, brentuximab se administra en una dosificación de aproximadamente 1-3 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 1-1,5, 1,5-2, 2-2,5 o 2,5-3 mg/kg), por ejemplo, por vía intravenosa, por ejemplo, cada 3 semanas.

[0759] En algunas realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de CD20, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, un anticuerpo mono o biespecífico anti-CD20) o un fragmento del mismo. Los anticuerpos anti-CD20 ejemplares incluyen, pero no se limitan a, rituximab, ofatumumab, ocrelizumab, veltuzumab, obinutuzumab, TRU-015 (Trubion Pharmaceuticals), ocaratuzumab y Pro131921 (Genentech). Véase, por ejemplo, Lim et al. Haematologica.95.1(2010):135-43.

[0761] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD20 comprende rituximab. Rituximab es un anticuerpo monoclonal quimérico de ratón/humano IgG1 kappa que se une a CD20 y provoca la citólisis de una célula que expresa CD20, por ejemplo, como se describe en www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf. En algunas realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con rituximab. En algunas realizaciones, el sujeto tiene CLL o SLL.

[0763] En algunas realizaciones, rituximab se administra por vía intravenosa, por ejemplo, como una infusión intravenosa. Por ejemplo, cada infusión proporciona aproximadamente 500-2000 mg (por ejemplo, unos 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900, o 1900-2000 mg) de rituximab. En algunas realizaciones, rituximab se administra en una dosificación de 150 mg/m<2>a 750 mg/m<2>, por ejemplo, aproximadamente de 150-175 mg/m<2>, 175-200 mg/m<2>, 200-225 mg/m<2>, 225-250 mg/m<2>, 250-300 mg/m<2>, 300-325 mg/m<2>, 325-350 mg/m<2>, 350-375 mg/m<2>, 375-400 mg/m<2>, 400-425 mg/m<2>, 425-450 mg/m<2>, 450-475 mg/m<2>, 475-500 mg/m<2>, 500-525 mg/m<2>, 525-550 mg/m<2>, 550-575 mg/m<2>, 575-600 mg/m<2>, 600-625 mg/m<2>, 625-650 mg/m<2>, 650-675 mg/m<2>, o 675-700 mg/m<2>, donde m<2>indica la superficie corporal del sujeto. En algunas realizaciones, rituximab se administra en un intervalo de dosificación de al menos 4 días, por ejemplo, 4, 7, 14, 21, 28, 35 días, o más. Por ejemplo, rituximab se administra en un intervalo de dosificación de al menos 0,5 semanas, por ejemplo, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas, o más. En algunas realizaciones, rituximab se administra en una dosis e intervalo de dosificación descritos en el presente documento durante un periodo de tiempo, por ejemplo, al menos 2 semanas, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 semanas, o más. Por ejemplo, rituximab se administra en una dosis e intervalo de dosificación descritos en el presente documento para un total de al menos 4 dosis por ciclo de tratamiento (por ejemplo, al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o más dosis por ciclo de tratamiento).

[0765] En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-CD20 comprende ofatumumab. Ofatumumab es un anticuerpo monoclonal humano IgG1κ anti-CD20 con un peso molecular de aproximadamente 149 kDa. Por ejemplo, el ofatumumab se genera utilizando tecnología de hibridoma y ratón transgénico y se expresa y purifica a partir de una línea celular murina recombinante (NS0). Véase, por ejemplo, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_does/label/2009/125326lbl.pdf; y los Identificadores de Ensayos Clínicos Números NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352 y NCT01397591. En algunas realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con ofatumumab. En algunas realizaciones, el sujeto tiene CLL o SLL.

[0767] En algunas realizaciones, ofatumumab se administra como una infusión intravenosa. Por ejemplo, cada infusión proporciona aproximadamente 150-3000 mg (por ejemplo, aproximadamente150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1200, 1200-1400, 1400-1600, 1600-1800, 1800-2000, 2000-2200, 2200-2400, 2400-2600, 2600-2800, o 2800-3000 mg) de ofatumumab. En algunas realizaciones, ofatumumab se administra en una dosificación inicial de aproximadamente 300 mg, seguida de 2000 mg, por ejemplo, durante aproximadamente 11 dosis, por ejemplo, durante 24 semanas. En algunas realizaciones, ofatumumab se administra en un intervalo de dosificación de al menos 4 días, por ejemplo, 4, 7, 14, 21, 28, 35 días, o más. Por ejemplo, ofatumumab se administra en un intervalo de dosificación de al menos 1 semana, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 26, 28, 20, 22, 24, 26, 28, 30 semanas, o más. En algunas realizaciones, ofatumumab se administra en una dosis e intervalo de dosificación descritos en el presente documento durante un período de tiempo, por ejemplo, de al menos 1 semana, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60 semanas o más, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses o más, o 1, 2, 3, 4, 5, 5 años o más. Por ejemplo, ofatumumab se administra en una dosis e intervalo de dosificación descritos en el presente documento para un total de al menos 2 dosis por ciclo de tratamiento (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, o más dosis por ciclo de tratamiento).

[0768] En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende ocrelizumab. Ocrelizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD20, por ejemplo, como se describe en Identificador de Ensayo Clínico Nos. NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570 y Kappos et al. Lancet.19.378(2011):1779-87. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende veltuzumab. Veltuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado contra CD20. Véase, por ejemplo, Identificadores de Ensayos Clínicos No. NCT00547066, NCT00546793, NCT01101581, y Goldenberg et al. Leuk Lymphoma.51(5)(2010):747-55.

[0769] En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende GA101. El GA101 (también denominado obinutuzumab o RO5072759) es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado y glicoimodificado Vease, por ejemplo, Robak. Curr. Opin. Investig, Drugs. 10.6(2009):588-96; Identificadores de Ensayos Clínicos Números: NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422 y NCT01414205; y www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf.

[0770] En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende AME-133v. AME-133v (también denominado LY2469298 u ocaratuzumab) es un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado contra CD20 con mayor afinidad por el receptor FcγRIIIa y una actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mejorada en comparación con rituximab. Véase, por ejemplo, Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; y Forero-Torres et al. Clin Cancer Res.18.5(2012):1395-403.

[0771] En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende PRO131921. PRO131921 es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD20 modificado genéticamente para tener una mejor unión a FcγRIIIa y una ADCC mejorada en comparación con rituximab. Véase, por ejemplo, Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; y Casulo et al. Clin Immunol.154.1(2014):37-46; e Identificador de Ensayo Clínico No. NCT00452127.

[0772] En algunos casos, el anticuerpo anti-CD20 comprende TRU-015. TRU-015 es una proteína de fusión anti-CD20 derivada de dominios de un anticuerpo contra CD20. TRU-015 es más pequeño que los anticuerpos monoclonales, pero conserva las funciones efectoras mediadas por Fc. Véase, por ejemplo, Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25. TRU-015 contiene un fragmento variable de cadena única (scFv) anti-CD20 enlazado a los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 humana, pero carece de los dominios CH1 y CL.

[0773] En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-CD20 descrito en el presente documento está conjugado o unido de otro modo a un agente terapéutico, por ejemplo, un agente quimioterapéutico (por ejemplo, citoxan, fludarabina, inhibidor de histona deacetilasa, agente desmetilante, vacuna peptídica, antibiótico antitumoral, inhibidor de tirosina quinasa, agente alquilante, agente antimicrotúbulos o antimitótico), agente antialérgico, agente antináuseas (o antiemético), analgésico o agente citoprotector descrito en el presente documento. En realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor del linfoma de células B 2 (BCL-2) (por ejemplo, venetoclax, también denominado ABT-199 o GDC-0199;) y/o rituximab. En algunas realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con venetoclax y rituximab. Venetoclax es una molécula pequeña que inhibe la proteína antiapoptótica BCL-2. La estructura de venetoclax (4-(4-{[2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilchicloex-1-en-1-il]metil}piperazin-1-il)-N-({3-nitro-4-[(tetrahidro-2H-piran-4-ilmetil)amino]fenil}sulfonil)-2-(1H-pirrolo[2,3-b]piridin-5-iloxi)benzamida) se muestra a continuación.

[0774]

[0776] En realizaciones, el sujeto tiene CLL. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una recaída de CLL, por ejemplo, el sujeto ha recibido previamente una terapia contra el cáncer. En algunas realizaciones, venetoclax se administra en una dosificación de aproximadamente 15-600 mg (por ejemplo, 15-20, 20-50, 50-75, 75-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, o 500-600 mg), por ejemplo, diariamente. En algunas realizaciones, el rituximab se administra en una dosificación de aproximadamente 350-550 mg/m2 (por ejemplo, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475 o 475-500 mg/m2), por ejemplo, por vía intravenosa, por ejemplo, mensualmente.

[0777] En algunas realizaciones, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, se administra en combinación con un virus oncolítico. En algunas realizaciones, los virus oncolíticos son capaces de replicarse selectivamente en una célula cancerosa y provocar su muerte o ralentizar su crecimiento. En algunos casos, los virus oncolíticos no tienen ningún efecto o tienen un efecto mínimo en las células no cancerosas. Un virus oncolítico incluye, pero no se limita a, un adenovirus oncolítico, un Virus del Herpes Simple oncolítico, un retrovirus oncolítico, un parvovirus oncolítico, un virus vaccinia oncolítico, un virus Sinbis oncolítico, un virus de la influenza oncolítico o un virus ARN oncolítico (por ejemplo, reovirus oncolítico, virus de la Enfermedad de Newcastle oncolítico (NDV) , virus del sarampión oncolítico o virus de la estomatitis vesicular oncolítica (VSV) ).

[0778] En algunas realizaciones, el virus oncolítico es un virus, por ejemplo, un virus oncolítico recombinante, descrito en US2010/0178684 A1. En algunas realizaciones, un virus oncolítico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico heteróloga) que codifica un inhibidor de una respuesta inmunitaria o inflamatoria, por ejemplo, como se describe en US2010/0178684 A1. En algunas realizaciones, el virus oncolítico recombinante, por ejemplo, el NDV oncolítico, comprende una proteína proapoptótica (por ejemplo, apoptina), una citoquina (por ejemplo, GM-CSF, interferón-gamma, interleucina-2 (IL-2), factor de necrosis tumoral-alfa), una inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo contra la firbonectina ED-B), un antígeno asociado al tumor, una proteína adaptadora biespecífica (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un fragmento de anticuerpo dirigido contra la proteína HN del NDV y un receptor coestimulador de células T, tales como CD3 o CD28; o una proteína de fusión entre IL-2 humana y un anticuerpo de cadena simple dirigido contra la proteína HN del NDV). Véase, por ejemplo, Zamarin et al. Futuro Microbiol.

[0779] 7.3(2012):347-67. En algunas realizaciones, el virus oncolítico es un NDV oncolítico quimérico descrito en US 8591881 B2, US 2012/0122185 A1, o US 2014/0271677 A1.

[0780] En algunas realizaciones, el virus oncolítico comprende un adenovirus condicionalmente replicativo (CRAd), que está diseñado para replicarse exclusivamente en células cancerosas. Véase, por ejemplo, Alemany et al. Nature Biotechnol. 18(2000):723-27. En algunas realizaciones, un adenovirus oncolítico comprende uno descrito en la Tabla 1 en la página 725 de Alemany et al.

[0781] Los virus oncolíticos ejemplares incluyen, pero no se limitan, los siguientes:

[0782] Adenovirus Oncolítico del Grupo B (ColoAd1) (PsiOxus Therapeutics Ltd.) (véase, por ejemplo, Identificador de Ensayo Clínico: NCT02053220); ONCOS-102 (previamente denominado CGTG-102), que es un adenovirus que comprende el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (Oncos Therapeutics) (véase, por ejemplo, Identificador de Ensayo Clínico: NCT01598129); VCN-01, que es un adenovirus humano oncolítico modificado genéticamente que codifica la hialuronidasa humana PH20 (VCN Biosciences, S.L.) (véase, por ejemplo, Identificador de Ensayo Clínico: NCT02045602 y NCT02045589);

[0783] Adenovirus de Replicación Condicional ICOVIR-5, que es un virus derivado del adenovirus humano de tipo salvaje de serotipo 5 (Had5) que ha sido modificado para replicarse selectivamente en células cancerosas con una vía retinoblastoma/E2F desregulada (Institut Català d'Oncologia) (véase, por ejemplo, Identificador de Ensayo Clínico: NCT01864759);Celyvir, que comprende células madre mesenquimales (MSC) autólogas derivadas de médula ósea infectadas con ICOVIR5, un adenovirus oncolítico (Hospital Infantil Universitario Niño Jesús, Madrid, España/ Ramón Alemany) (véase, por ejemplo, Identificador de Ensayo Clínico: NCT01844661);CG0070, que es un adenovirus oncolítico de serotipo 5 (Ad5) de replicación condicional en el que el promotor humano E2F-1 impulsa la expresión de los genes virales esenciales E1a, restringiendo así la replicación viral y la citotoxicidad a las células tumorales defectuosas de la vía Rb (Cold Genesys, Inc.) (véase, por ejemplo, Identificador de Ensayo Clínico: NCT02143804); oDNX-2401 (anteriormente denominado Delta-24-RGD), que es un adenovirus que ha sido modificado genéticamente para replicarse selectivamente en células deficientes en la vía del retinoblastoma (Rb) y para infectar más eficazmente células que expresan determinadas integrinas de unión a RGD (Clínica Universidad de Navarra/ DNAtrix, Inc.) (véase, por ejemplo, Identificador de Ensayo Clínico: NCT01956734).

[0785] En algunas realizaciones, un virus oncolítico descrito en el presente documento se administra mediante inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intraarterial, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. En algunas realizaciones, un virus oncolítico descrito en el presente documento se administra por vía intratumoral, transdérmica, transmucosa, oral, intranasal o pulmonar. En una realización, las células que expresan un CAR descrito en el presente documento se administran a un sujeto en combinación con una molécula que disminuye la población de células Treg. Los procedimientos que disminuyen el número de células Treg (por ejemplo, las agotan) son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el agotamiento de CD25, la administración de ciclofosfamida, la modulación de la función GITR. Sin querer estar ligado a la teoría, se cree que la reducción del número de células Treg en un sujeto antes de la aféresis o antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita en el presente documento reduce el número de células inmunitarias no deseadas (por ejemplo, Tregs) en el microambiente tumoral y reduce el riesgo de recaída del sujeto.

[0787] En una realización, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, se administra a un sujeto en combinación con una molécula dirigida a GITR y/o que modula las funciones de GITR, tal como un agonista de GITR y/o un anticuerpo de GITR que agota las células T reguladoras (Tregs). En una realización, las moléculas de unión a GITR y/o las moléculas que modulan las funciones de GITR (por ejemplo, agonistas de GITR y/o anticuerpos GITR que agotan Treg) se administran antes de la célula que expresa CAR. Por ejemplo, en una realización, el agonista GITR puede administrarse antes de la aféresis de las células. En una realización, el sujeto tiene CLL. Los agonistas de GITR ejemplares incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión de GITR y anticuerpos anti-GITR (por ejemplo, anticuerpos anti-GITR bivalentes) tales como, por ejemplo, una proteína de fusión de GITR descrita en Patente de EE.UU. No: 6,111,090, Patente Europea No.: 090505B1, Patente de EE.UU No.: 8,586,023, Publicación PCT Nos.: WO 2010/003118 y 2011/090754, o un anticuerpo anti-GITR descrito, por ejemplo, en Patente de EE.UU No.: 7,025,962, Patente Europea No.: 1947183B1, Patente de EE.UU No.: 7,812,135, Patente de EE.UU No.: 8,388,967, Patente de EE.UU No.: 8,591,886, Patente Europea No.: EP 1866339, Publicación PCT No.: WO 2011/028683, Publicación PCT No,: WO 2013/039954, Publicación PCT No.: WO2005/007190, Publicación PCT No.: WO 2007/133822, Publicación PCT No.: WO2005/055808, Publicación PCT No.: WO 99/40196, Publicación PCT No.: WO 2001/03720, Publicación PCT No.: WO99/20758, Publicación PCT No.: WO2006/083289, Publicación PCT No.: WO 2005/115451, Patente de EE.UU No.: 7,618,632, y Publicación PCT No.: WO 2011/051726.

[0789] En una realización, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR descrito en el presente documento, por ejemplo, un rapálogo tal como everolimus. En una realización, el inhibidor de mTOR se administra antes de la célula que expresa CAR. Por ejemplo, en una realización, el inhibidor de mTOR puede administrarse antes de la aféresis de las células. En una realización, el sujeto tiene CLL.

[0791] En una realización, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, se administra a un sujeto en combinación con un agonista de GITR, por ejemplo, un agonista de GITR descrito en el presente documento. En una realización, el agonista de GITR se administra antes de la célula que expresa CAR. Por ejemplo, en una realización, el agonista GITR puede administrarse antes de la aféresis de las células. En una realización, el sujeto tiene CLL.

[0793] En una realización, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de proteína tirosina fosfatasa, por ejemplo, un inhibidor de proteína tirosina fosfatasa descrito en el presente documento. En una realización, el inhibidor de la proteína tirosina fosfatasa es un inhibidor de SHP-1, por ejemplo, un inhibidor de SHP-1 descrito en el presente documento, tal como, por ejemplo, estibogluconato de sodio. En una realización, el inhibidor de la proteína tirosina fosfatasa es un inhibidor de SHP-2.

[0795] En una realización, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento puede utilizarse en combinación con un inhibidor de la quinasa. En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de CDK4, por ejemplo, un inhibidor de CDK4 descrito en el presente documento, por ejemplo, un inhibidor de CDK4/6, tal como, por ejemplo, 6-Acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-(5-piperazin-1-il-piridin-2-ilamino)-8H-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona, clorhidrato (también denominado como palbociclib o PD0332991). En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de BTK, por ejemplo, un inhibidor de BTK descrito en el presente documento, tal como, por ejemplo, ibrutinib. En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR descrito en el presente documento, tal como, por ejemplo, rapamicina, un análogo de rapamicina, OSI-027. El inhibidor de mTOR puede ser, por ejemplo, un inhibidor de mTORCT1 y/o un inhibidor de mTORC2, por ejemplo, un inhibidor de mTORC1 y/o un inhibidor de mTORC2 descritos en el presente documento. En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de MNK, por ejemplo, un inhibidor de MNK descrito en el presente documento, tal como, por ejemplo, 4-amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo [3,4-d] pirimidina. El inhibidor de MNK puede ser, por ejemplo, un inhibidor de MNK1a, MNK1b, MNK2a y/o MNK2b. En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor dual PI3K/mTOR descrito en el presente documento, tal como, por ejemplo, PF-04695102.

[0797] En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de CDK4 seleccionado entre aloisina A; flavopiridol o HMR-1275, 2-(2-clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-[(3S,4R)-3-hidroxi-1-metil-4-piperidinil]-4-cromenona; crizotinib (PF-02341066; 2-(2-Clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-[(2R,3S)-2-(hidroximetil)-1-metil-3-pirrolidinil]- 4H-1-benzopiran-4-ona, clorhidrato (P276-00); 1-metil-5-[[2-[5-(trifluorometil)-1H-imidazol-2-il]-4-piridinil]oxi]-N-[4-(trifluorometil)fenil]-1H-benzimidazol-2-amina (RAF265); indisulam (E7070); roscovitina (CYC202); palbociclib (PD0332991); dinaciclib (SCH727965); N-[5-[(5-terc-butiloxazol-2-il)metil]tio]tiazol-2-il]piperidina-4-carboxamida (BMS 387032); ácido 4-[[9-cloro-7-(2,6-difluorofenil)-5H-pirimido[5,4-d][2]benzazepin-2-il]amino]-benzoico (MLN8054); 5-[3-(4,6-difluoro-1H-benzimidazol-2-il)-1H-indazol-5-il]-N-etil-4-metil-3-piridinometanamina (AG-024322); ácido 4-(2,6-diclorobenzoilamino)-1H-pirazol-3-carboxílico N-(piperidin-4-il)amida (AT7519); 4-[2-metil-1-(1-metiletil)-1H-imidazol-5-il]-N-[4-(metilsulfonil)fenil]- 2-pirimidinamina (AZD5438); y XL281 (BMS908662).

[0799] En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de CDK4, por ejemplo, palbociclib (PD0332991), y el palbociclib se administra en una dosis de aproximadamente 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (por ejemplo, 75 mg, 100 mg o 125 mg) diariamente durante un periodo de tiempo, por ejemplo, diariamente durante 14-21 días de un ciclo de 28 días, o diariamente durante 7-12 días de un ciclo de 21 días. En una realización, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de palbociclib.

[0801] En realizaciones, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) 4 o 6, por ejemplo, un inhibidor de CDK4 o un inhibidor de CDK6 descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de CDK4/6 (por ejemplo, un inhibidor direccionado tanto a CDK4 como a CDK6), por ejemplo, un inhibidor de CDK4/6 descrito en el presente documento. En una realización, el sujeto tiene MCL. El MCL es un cáncer agresivo que responde poco a las terapias actualmente disponibles, es decir, esencialmente incurable. En muchos casos de MCL, la ciclina D1 (un regulador de CDK4/6) se expresa (por ejemplo, debido a una translocación cromosómica que implica a los genes de inmunoglobulina y Ciclina D1) en las células MCL. Así, sin estar ligados a la teoría, se piensa que las células MCL son altamente sensibles a la inhibición de CDK4/6 con alta especificidad (es decir, efecto mínimo sobre las células inmunitarias normales). Los inhibidores de CDK4/6 por sí solos han tenido cierta eficacia en el tratamiento de MCL, pero sólo han logrado una remisión parcial con una alta tasa de recaídas. Un inhibidor ejemplar de CDK4/6 es LEE011 (también denominado ribociclib), cuya estructura se muestra a continuación.

[0804]

[0807] Sin estar ligado a la teoría, se cree que la administración de una célula que expresa CAR descrita en el presente documento con un inhibidor de CDK4/6 (por ejemplo, LEE011 u otro inhibidor de CDK4/6 descrito en el presente documento) puede lograr una mayor capacidad de respuesta, por ejemplo, con mayores tasas de remisión y/o menores tasas de recaída, por ejemplo, en comparación con un inhibidor de CDK4/6 solo.

[0809] En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de BTK seleccionado entre ibrutinib (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; y LFM-A13. En una realización preferente, el inhibidor de BTK no reduce ni inhibe la actividad quinasa de la quinasa inducible por interleucina-2 (ITK), y se selecciona entre GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; y LFM-A13.

[0811] En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de BTK, por ejemplo, ibrutinib (PCI-32765). En algunas realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de BTK (por ejemplo, ibrutinib). En algunas realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con ibrutinib (también denominado PCI-32765). La estructura de ibrutinib (1-[(3R)-3-[4-Amino-3-(4-fenoxifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1-ona) se muestra a continuación.

[0812]

[0814] En algunas realizaciones de los procedimientos, usos y composiciones del presente documento, el inhibidor de BTK es un inhibidor de BTK descrito en la Solicitud Internacional WO/2015/079417. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el inhibidor de BTK es un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

[0817]

[0819] en el que,

[0820] R1 es hidrógeno, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido por hidroxi;

[0821] R2 es hidrógeno o halógeno;

[0822] R3 es hidrógeno o halógeno;

[0823] R4 es hidrógeno;

[0824] R5 es hidrógeno o halógeno;

[0825] o R4 y R5 están acoplados entre sí y representan un enlace, -CH2-, -CH2-CH2- , - CH=CH-, -CH=CH-CH2-; -CH2-CH=CH-; o -CH2-CH2-CH2-;

[0826] R6 y R7 representan independientemente entre sí H,, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido por hidroxilo, cicloalquilo C3-C6 opcionalmente sustituido por halógeno o hidroxi, o halógeno;

[0827] R8, R9, R, R', R10 y R11, representan independientemente entre sí H, o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido por alcoxi C1-C6; o dos cualesquiera de R8, R9, R, R', R10 y R11, junto con el átomo de carbono al que están unidos, pueden formar un anillo carbocíclico saturado de 3 - 6 miembros;

[0828] R12 es hidrógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido por halógeno o alcoxi C1-C6;

[0829] o R12 y uno cualquiera de R8, R9, R, R', R10 o R11 junto con los átomos a los que están unidos pueden formar un anillo azaciclo de 4, 5, 6 o 7 miembros, cuyo anillo puede estar opcionalmente sustituido por halógeno, ciano, hidroxilo, alquilo C1-C6 o alcoxi C1-C6;

[0830] n es 0 o 1; y

[0831] R13 es alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido por alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6 o alquil amino N,N-di-C1-C6; alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido por alquilo C1-C6 o alcoxi C1-C6; u óxido de alquilenilo C2-C6 opcionalmente sustituido por alquilo C1-C6.

[0832] En algunas realizaciones, el inhibidor de BTK de Fórmula I se elige entre: N-(3-(5-((1-Acriloilazetidin-3-il)oxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (E)-N-(3-(6-Amino-5-((1-(but-2-enoyl)azetidin-3-il)oxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-Amino-5-((1-propioloil-lazetidin-3-il)oxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-((1-(bu-2-inoil)azetidin-3-il)oxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-((1-Acriloilpiperidin-4-il)oxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-Amino-5-(2-(N-metilacrilamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (E)-N (3-(6-Amino-5-(2-(N-metilbut-2-enamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(2-(N-metilpropiolamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (E)-N-(3-(6-Amino-5-(2-(4-metoxi-N-metilbut-2-enamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-Amino-5-(2-(N-metilbut-2-ynamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(2-((4-Amino-6-(3-(4-ciclopropil-2-fluorobenzamido)-5-fluoro-2-metilfenil)pirimidin-5-il)oxi)etil)-N-metiloxirano-2-carboxamida; N-(2-((4-Amino-6-(3-(6-ciclopropil-8-fluoro-1-oxoisoquinolin-2(1H)-il)fenil)pirimidin-5-il)oxi)etil)-N-metilacrilamida; N-(3-(5-(2-Acrilamidoetoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-Amino-5-(2-(N-etilacrilamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-amino-5-(2-(N-(2-fluoroetil)acrilamido)etoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-((1-acrilamidociclopropil)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(5-(2-Acrilamidopropoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-Amino-5-(2-(but-2-ynamido)propoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-Amino-5-(2-(N-metilacrilamido)propoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-Amino-5-(2-(N-metilbut-2-ynamido)propoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-Amino-5-(3-(N-metilacrilamido)propoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(5-((1-Acriloilpirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-amino-5-((1-(bu-2-inoil)pirrolidin-2-il)metoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-2-(3-(5-((1-Acriloilpirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-(hidroximetil)fenil)-6-ciclopropil-3,4-dihidroisoquinolin-1(2H)-ona; N-(2-((4-Amino-6-(3-(6-ciclopropil-1-oxo-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)-5-fluoro-2-(hidroximetil)fenil)pirimidin-5-il)oxi)etil)-N-metilacrilamida; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-acriloil-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-Amino-5-(((2S,4R)-1-(but-2-inoil)-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; 2-(3-(5-(((2S,4R)-1-acriloil-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-(hidroximetil)fenil)-6-ciclopropil-3,4-dihidroisoquinolin-1(2H)-ona; N-(3-(5-(((2S,4S)-1-acriloil-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-Amino-5-(((2S,4S)-1-(but-2-inoil)-4-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-acriloil-4-fluoropirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(6-Amino-5-(((2S,4R)-1-(but-2-inoil)-4-fluoropirrolidin-2-il)metoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(5-((1-Acriloazetidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-N-(3-(6-amino-5-((1-propioloylazetidin-2-il)metoxi)pirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (S)-2-(3-(5-((1-Acriloazetidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-(hidroximetil)fenil)-6-ciclopropil-3,4-dihidroisoquinolin-1(2H)-ona; (R)-N-(3-(5-((1-Acrilozetidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; (R)-N-(3-(5-((1-Acriloilpiperidin-3-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-(((2R,3S)-1-acriloil-3-metoxipirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-acriloil-4-cianopirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida; o N-(3-(5-(((2S,4S)-1-acriloil-4-cianopirrolidin-2-il)metoxi)-6-aminopirimidin-4-il)-5-fluoro-2-metilfenil)-4-ciclopropil-2-fluorobenzamida.

[0834] A menos que se indique lo contrario, los términos químicos utilizados anteriormente para describir el inhibidor de BTK de Fórmula I se utilizan de acuerdo con sus significados establecidos en la Solicitud Internacional WO/2015/079417.

[0836] En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de mTOR seleccionado entre temsirolimus; ridaforolimus (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23, 29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.0<4,9>] hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexil dimetilfosfinato, también conocido como AP23573 y MK8669; everolimus (RAD001); rapamicina (AY22989); simapimod; (5-{2,4-bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il}-2-metoxifenil)metanol(AZD8055); 2-amino-8-[trans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502); yN2

-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1-benzopiran-2-il)morfolinio-4-il]metoxi]butil]-L-arginilglicil-L-α-aspartilL-serina-(SEC ID NO: 613), sal interna (SF1126); y XL765.

[0838] En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, rapamicina, y la rapamicina se administra en una dosis de aproximadamente 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (por ejemplo, 6 mg) diariamente durante un periodo de tiempo, por ejemplo, diariamente durante un ciclo de 21 días, o diariamente durante un ciclo de 28 días. En una realización, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de rapamicina. En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, everolimus y el everolimus se administra en una dosis de aproximadamente 2 mg, 2,5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (por ejemplo, 10 mg) diariamente durante un periodo de tiempo, por ejemplo, diariamente durante un ciclo de 28 días. En una realización, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de everolimus.

[0839] En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de MNK seleccionado entre CGP052088; 4-amino-3-(p-fluorofenilamino)-pirazolo[3,4-d] pirimidina (CGP57380); cercosporamida; ETC-1780445-2; y 4-amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo [3,4-d] pirimidina.

[0841] En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor dual de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y mTOR seleccionado entre 2-Amino-8-[trans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF-04691502);N-[4-[[4-(Dimetilamino)-1-piperidinil]carbonil]fenil]-N'-[4-(4,6-di-4-morfolinil-1,3,5-triazin-2-il)fenil]urea (PF-05212384, PKI-587); 2-metil-2-{4-[3-metil-2-oxo-8-(quinolin-3-il)-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]fenil}propanonitrilo (BEZ-235); apitolisib (GDC-0980, RG7422); 2,4-Difluoro-N-{2-(metiloxi)-5-[4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3-piridinyl}bencenosulfonamida (GSK2126458); 8-(6-metoxipiridin-3-il)-3-metil-1-(4-(piperazin-1-il)-3-(trifluorometil)fenil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2(3H)-ona Ácido maleico (NVP-BGT226); 3-[4-(4-Morfolinilpirido[3',2':4,5]furo[3,2-d]pirimidin-2-il]fenol(PI-103); 5-(9-isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (VS-5584, SB2343); y N-[2-[(3,5-dimetoxifenil)amino]quinoxalin-3-il]-4-[(4-metil-3-metoxifenil)carbonil]aminofenilsulfonamida (XL765).

[0843] En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, rapamicina, y la rapamicina se administra en una dosis de aproximadamente 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (por ejemplo, 6 mg) diariamente durante un periodo de tiempo, por ejemplo, diariamente durante un ciclo de 21 días, o diariamente durante un ciclo de 28 días. En una realización, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de rapamicina. En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, everolimus y el everolimus se administra en una dosis de aproximadamente 2 mg, 2,5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (por ejemplo, 10 mg) diariamente durante un periodo de tiempo, por ejemplo, diariamente durante un ciclo de 28 días. En una realización, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de everolimus.

[0845] En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de MNK seleccionado entre CGP052088; 4-amino-3-(p-fluorofenilamino)-pirazolo[3,4-d] pirimidina (CGP57380); cercosporamida; ETC-1780445-2; y 4-amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo [3,4-d] pirimidina.

[0847] En realizaciones, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de fosfoinositida 3-quinasa (PI3K) (por ejemplo, un inhibidor de PI3K descrito en el presente documento, por ejemplo, idelalisib o duvelisib) y/o rituximab. En algunas realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con idelalisib y rituximab. En algunas realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con duvelisib y rituximab. Idelalisib (también denominado GS-1101 o CAL-101; Gilead) es una molécula pequeña que bloquea la isoforma delta de PI3K. La estructura de idelalisib (5-fluoro-3-fenil-2-[(1S)-1-(7H-purin-6-ilamino)propil]-4(3H)-quinazolinona) se muestra a continuación.

[0850]

[0853] Duvelisib (también denominado IPI-145; Infinity Pharmaceuticals y Abbvie) es una molécula pequeña que bloquea PI3K-δ,γ. La estructura de duvelisib (8-cloro-2-fenil-3-[(1S)-1-(9H-purin-6-ilamino)etil]-1(2H)-isoquinolinona) se muestra a continuación.

[0856]

[0857] En realizaciones, el sujeto tiene CLL. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una recaída de CLL , por ejemplo, se le ha administrado previamente una terapia contra el cáncer (por ejemplo, se le ha administrado previamente un anticuerpo anti-CD20 o se le ha administrado previamente ibrutinib). Por ejemplo, el sujeto tiene una deleción en el brazo corto del cromosoma 17 (del(17p), por ejemplo, en una célula leucémica). En otros ejemplos, el sujeto no tiene una del(17p). En algunas realizaciones, el sujeto comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgVH). En otras realizaciones, el sujeto no comprende una célula leucémica que comprende una mutación en el gen de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgVH). En algunas realizaciones, el sujeto tiene una deleción en el brazo largo del cromosoma 11 (del(11q)). En otras realizaciones, el sujeto no tiene una del(11q). En algunas realizaciones, idelalisib se administra en una dosificación de aproximadamente 100-400 mg (por ejemplo, 100-125, 125-150, 150-175, 175-200, 200-225, 225-250, 250-275, 275-300, 325-350, 350-375, o 375-400 mg), por ejemplo, BID. En algunas realizaciones, duvelisib se administra en una dosificación de aproximadamente 15-100 mg (por ejemplo, unos 15-25, 25-50, 50-75 o 75-100 mg), por ejemplo, dos veces al día. En algunas realizaciones, rituximab se administra en una dosificación de aproximadamente 350-550 mg/m<2>(por ejemplo, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, o 475-500 mg/m<2>), por ejemplo, por vía intravenosa.

[0859] En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor dual de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y mTOR seleccionado entre 2-Amino-8-[trans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF-04691502);N-[4-[[4-(Dimetilamino)-1-piperidinil]carbonil]fenil]-N'-[4-(4,6-di-4-morfolinil-1,3,5-triazin-2-il)fenil]urea (PF-05212384, PKI-587); 2-metil-2-{4-[3-metil-2-oxo-8-(quinolin-3-il)-2,3-dihidro-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]fenil}propanonitrilo (BEZ-235); apitolisib (GDC-0980, RG7422); 2,4-Difluoro-N-{2-(metiloxi)-5-[4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3-piridinil}bencenosulfonamida (GSK2126458); 8-(6-metoxipiridin-3-il)-3-metil-1-(4-(piperazin-1-il)-3-(trifluorometil)fenil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2(3H)-ona Ácido maleico (NVP-BGT226); 3-[4-(4-Morfolinilpirido[3',2':4,5]furo[3,2-d]pirimidin-2-il]fenol(PI-103); 5-(9-isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (VS-5584, SB2343); y N-[2-[(3,5-dimetoxifenil)amino]quinoxalin-3-il]-4-[(4-metil-3-metoxifenil)carbonil]aminofenilsulfonamida (XL765).

[0861] En realizaciones, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de la quinasa del linfoma anaplásico (ALK). Algunos ejemplos de quinasas ALK incluyen, pero no se limitan a, crizotinib (Pfizer), ceritinib (Novartis), alectinib (Chugai), brigatinib (también denominadoAP26113; Ariad), entrectinib (Ignyta), PF-06463922 (Pfizer), TSR-011 (Tesaro) (véase, por ejemplo, NCT02048488), CEP-37440 (Teva) y X-396 (Xcovery). En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer sólido, por ejemplo, un cáncer sólido descrito en el presente documento, por ejemplo, cáncer de pulmón.

[0862] El nombre químico del crizotinib es 3-[(1R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etoxi]-5-(1-piperidin-4-ilpirazol-4-il)piridin-2-amina. El nombre químico del ceritinib es 5-Cloro-N2

-[2-isopropoxy-5-metil-4-(4-piperidinil)fenil]-N4

-[2-(isopropilsulfonil)fenil]-2,4-pirimidinadiamina. El nombre químico del alectinib es 9-etil-6,6-dimetil-8-(4-morfolinopiperidin-1-il)-11-oxo-6,11-dihidro-5H-benzo[b]carbazol-3-carbonitrilo. El nombre químico del brigatinib es 5-Cloro-N<2>-{4-[4-(dimetilamino)-1-piperidinil]-2-metoxifenil}-N<4>-[2-(dimetilfosforil)fenil]-2,4-pirimidindiamina. El nombre químico del entrectinib es N-(5-(3,5-difluorobencil)-1H-indazol-3-il)-4-(4-metilpiperazin-1-il)-2-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzamida. El nombre químico del PF-06463922 es (10R)-7-Amino-12-fluoro-2,10,16-trimetil-15-oxo-10,15,16,17-tetrahidro-2H-8,4-(meteno)pirazolo[4,3-h][2,5,11]-benzoxadiazaciclotetradecina-3-carbonitrilo. La estructura química del CEP-37440 es (S)-2-((5-cloro-2-((6-(4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il)-1-metoxi-6,7,8,9-tetrahidro-5H-benzo[7]annulen-2-il)amino)pirimidin-4-il)amino)-N-metilbenzamida. El nombre químico de X-396 es (R)-6-amino-5-(1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etoxi)-N-(4-(4-metilpiperazin-1-carbonil)fenil)piridazina-3-carboxamida.

[0864] Fármacos que inhiben la fosfatasa calcineurina dependiente del calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun.

[0865] 5:763-773, 1993) también puede utilizarse. En otro aspecto, las composiciones celulares de la presente divulgación pueden administrarse a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) trasplante de médula ósea, terapia ablativa de células T utilizando agentes quimioterapéuticos tales como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida y/o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En un aspecto, las composiciones celulares de la presente divulgación se administran tras una terapia ablativa de células B, tales como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los sujetos pueden someterse a un tratamiento estándar con altas dosis de quimioterapia seguido de un trasplante de células madre de sangre periférica. En determinadas realizaciones, tras el trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente divulgación. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

[0867] En realizaciones, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO). La IDO es una enzima que cataliza la degradación del aminoácido L-triptófano a cinurenina. Muchos cánceres sobreexpresan IDO, por ejemplo, el cáncer de próstata, colorrectal, de páncreas, de cuello de útero, gástrico, de ovario, de cabeza y de pulmón. Las pDC, los macrófagos y las células dendríticas (DC) pueden expresar IDO. Sin estar ligado a la teoría, se cree que una disminución de L-triptófano (por ejemplo, catalizada por la IDO) da como resultado un medio inmunosupresor al inducir la anergia y la apoptosis de las células T. Por lo tanto , sin estar ligado a la teoría, se piensa que un inhibidor de IDO puede potenciar la eficacia de una célula que expresa CAR descrita en el presente documento, por ejemplo, disminuyendo la supresión o la muerte de una célula inmunitaria que expresa CAR. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un tumor sólido descrito en el presente documento, por ejemplo, cáncer de próstata, colorrectal, de páncreas, de cuello uterino, gástrico, de ovario, de cabeza o de pulmón. Algunos ejemplos de inhibidores de la IDO incluyen, pero no se limitan a, 1-metil-triptófano, indoximod (NewLink Genetics) (véanse, por ejemplo, los Identificadores de Ensayos Clínicos NCT01191216 y NCT01792050) y el INCB024360 (Incyte Corp.) (véanse, por ejemplo, Identificadores de Ensayos Clínicos NCT01604889 y NCT01685255).

[0869] En realizaciones, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, se administra a un sujeto en combinación con un modulador de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). Las MDSC se acumulan en la periferia y en el sitio tumoral de muchos tumores sólidos. Estas células suprimen las respuestas de las células T, obstaculizando así la eficacia de la terapia celular con expresión CAR. Sin estar ligado a la teoría, se cree que la administración de un modulador de MDSC potenica la eficacia de una célula que expresa CAR descrita en el presente documento. En una realización, el sujeto tiene un tumor sólido, por ejemplo, un tumor sólido descrito en el presente documento, por ejemplo, glioblastoma. Algunos moduladores ejemplares de las NMSC incluyen, pero no se limitan a, MCS110 y BLZ945. MCS110 es un anticuerpo monoclonal (mAb) contra el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). Véase, por ejemplo, el Identificador de Ensayo Clínico: No. NCT00757757. BLZ945 es una molécula pequeña inhibidora del receptor del factor estimulante de colonias 1 (CSF1R). Véase, por ejemplo, Pyonteck et al. Nat. Med.19(2013):1264-72. La estructura de BLZ945 se muestra a continuación.

[0872]

[0875] En realizaciones, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un agente que inhibe o reduce la actividad de células plasmáticas inmunosupresoras. Se ha demostrado que las células plasmáticas inmunosupresoras impiden la quimioterapia inmunogénica dependiente de las células T, tal como el oxaliplatino (Shalapour et al., Nature 2015, 521:94- 101). En una realización, las células plasmáticas inmunosupresoras pueden expresar una o más de IgA, interleucina (IL)-10 y PD-L1. En una realización, el agente es una célula que expresa CAR CD19 o una célula que expresa CAR BCMA .

[0877] En algunas realizaciones, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, se administra a un sujeto en combinación con un polipéptido de interleucina-15 (IL-15), un polipéptido del receptor alfa de interleucina-15 (IL-15Ra), o una combinación tanto de un polipéptido de IL-15 como de un polipéptido de IL-15Ra, por ejemplo, hetIL-15 (Admune Therapeutics, LLC). hetIL-15 es un complejo heterodimérico no covalente de IL-15 e IL-15Ra. hetIL-15 se describe en, por ejemplo, EE.UU. 8,124,084, EE.UU. 2012/0177598, EE.UU. 2009/0082299, EE.UU.

[0878] 2012/0141413, y EE.UU. 2011/0081311. En realizaciones, el het-IL-15 se administra por vía subcutánea. En realizaciones, el sujeto tiene un cáncer, por ejemplo, un cáncer sólido, por ejemplo, melanoma o cáncer de colon. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer metastásico.

[0880] En realizaciones, a un sujeto que tiene una enfermedad descrita en el presente documento se le administra una combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, en combinación con un agente, por ejemplo, agente citotóxico o quimioterapéutico, una terapia biológica (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo monoclonal, o terapia celular), o un inhibidor (por ejemplo, inhibidor de la quinasa). En realizaciones, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en el presente documento en combinación con un agente citotóxico, por ejemplo, CPX-351 (Celator Pharmaceuticals), citarabina, daunorrubicina, vosaroxina (Sunesis Pharmaceuticals), sapacitabina (Cyclacel Pharmaceuticals), idarrubicina o mitoxantrona. CPX-351 es una formulación liposomal que comprende citarabina y daunorrubicina en una proporción molar de 5:1. En realizaciones, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en el presente documento en combinación con un agente hipometilante, por ejemplo, un inhibidor de la ADN metiltransferasa, por ejemplo, azacitidina o decitabina. En realizaciones, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en el presente documento en combinación con una terapia biológica, por ejemplo, un anticuerpo o terapia celular, por ejemplo, 225Aclintuzumab (Actimab-A; Actinium Pharmaceuticals), IPH2102 (Innate Pharma/Bristol Myers Squibb), SGN-CD33A (Seattle Genetics) o gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg; Pfizer). SGN-CD33A es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) que comprende un dímero de pirrolobenzodiazepina acoplado a un anticuerpo anti-CD33. Actimab-A es un anticuerpo anti-CD33 (lintuzumab) etiquetado con actinio. IPH2102 es un anticuerpo monoclonal que se direcciona a los receptores similares a las inmunoglobulinas asesinas (KIR). En realizaciones, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en el presente documento en combinación con un inhibidor de FLT3, por ejemplo, sorafenib (Bayer), midostaurina (Novartis), quizartinib (Daiichi Sankyo), crenolanib (Arog Pharmaceuticals), PLX3397 (Daiichi Sankyo), AKN-028 (Akinion Pharmaceuticals) o ASP2215 (Astellas). En realizaciones, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en el presente documento en combinación con un inhibidor de la isocitrato deshidrogenasa (IDH), por ejemplo, AG-221 (Celgene/Agios) o AG-120 (Agios/Celgene). En realizaciones, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en el presente documento en combinación con un regulador del ciclo celular, por ejemplo, un inhibidor de la quinasa 1 similar a Polo (Plk1), por ejemplo, volasertib (Boehringer Ingelheim); o un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina 9 (Cdk9), por ejemplo, alvocidib (Tolero Pharmaceuticals/Sanofi Aventis). En realizaciones, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en el presente documento en combinación con un inhibidor de la red de señalización del receptor de células B, por ejemplo, un inihibidor del linfoma de células B 2 (Bcl-2), por ejemplo, venetoclax (Abbvie/Roche); o un inhibidor de la tirosina quinasa de Bruton (Btk), por ejemplo, ibrutinib (Pharmacyclics/Johnson & Johnson Janssen Pharmaceutical). En realizaciones, al sujeto se le administra una célula que expresa CAR descrita en el presente documento en combinación con un inhibidor de la aminopeptidasa M1, por ejemplo, tosedostat (CTI BioPharma/Vernalis); un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC), por ejemplo, pracinostat (MEI Pharma); un inhibidor multiquinasa, por ejemplo, rigosertib (Onconova Therapeutics/Baxter/SymBio); o un agonista inverso peptídico de CXCR4, por ejemplo, BL-8040 (BioLineRx).

[0882] Algunos pacientes pueden experimentar reacciones alérgicas a los compuestos de la presente divulgación y/u otro(s) agente(s) anticancerígeno(s) durante o después de la administración; por lo tanto, a menudo se administran agentes antialérgicos para minimizar el riesgo de una reacción alérgica. Los agentes antialérgicos adecuados incluyen corticosteroides, tales como dexametasona (por ejemplo, Decadron<®>), beclometasona (por ejemplo, Beclovent<®>), hidrocortisona (también conocida como cortisona, succinato sódico de hidrocortisona, fosfato sódico de hidrocortisona, y comercializada bajo los nombres comerciales Ala-Cort<®>, fosfato de hidrocortisona, Solu-Cortef<®>, Hydrocort Acetate<®>y Lanacort<®>), prednisolona (comercializada bajo los nombres Delta-Cortel<®>, Orapred<®>, Pediapred<®>y Prelone<®>), prednisona (comercializada bajo los nombres comerciales Deltasone<®>, Liquid Red<®>, Meticorten<®>y Orasone<®>), metilprednisolona (también conocida como 6-metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, succinato sódico de metilprednisolona, comercializada bajo los nombres comerciales de Duralone<®>, Medralone<®>, Medrol<®>, M-Prednisol<®>y Solu-Medrol<®>); antihistamínicos, tales como la difenhidramina (por ejemplo, Benadryl<®>), hidroxizina y ciproheptadina; y broncodilatadores, tales como los agonistas de los receptores betaadrenérgicos, albuterol (por ejemplo, Proventil<®>) y terbutalina (Brethine<®>).

[0884] Algunos pacientes pueden experimentar náuseas durante y después de la administración del compuesto de la presente divulgación y/u otro(s) agente(s) anticanceroso(s); por lo tanto, se utilizan antieméticos para prevenir las náuseas (parte superior del estómago) y los vómitos. Los antieméticos adecuados incluyen aprepitant (Emend<®>), ondansetrón (Zofran<®>), granisetrón HCl (Kytril<®>), lorazepam (Ativan<®>. dexametasona (Decadron<®>), proclorperazina (Compazine<®>), casopitant (Rezonic<®>y Zunrisa<®>), y combinaciones de los mismos.

[0886] A menudo se prescriben medicamentos para aliviar el dolor experimentado durante el periodo de tratamiento para que el paciente esté más cómodo. A menudo se utilizan analgésicos comunes de venta libre, tales como Tylenol<®>. Sin embargo, los fármacos analgésicos opioides tales como hidrocodona/paracetamol o hidrocodona/acetaminofén (por ejemplo, Vicodin<®>), morfina (por ejemplo, Astramorph<®>o Avinza<®>), oxicodona (por ejemplo, OxyContin<®>o Percocet<®>), clorhidrato de oximorfona (Opana<®>) y fentanilo (por ejemplo, Duragesic<®>) también son útiles para el dolor moderado o intenso.

[0888] En un esfuerzo por proteger las células normales de la toxicidad del tratamiento y limitar las toxicidades orgánicas, pueden utilizarse agentes citoprotectores (tales como neuroprotectores, captadores de radicales libres, cardioprotectores, neutralizadores de la extravasación de antraciclinas, nutrientes y similares) como terapia adjunta. Los gentes citoprotectores adecuados incluyen Amifostina (Ethyol<®>), glutamina, dimesna (Tavocept<®>), mesna (Mesnex<®>), dexrazoxano (Zinecard<®>o Totect<®>), xaliprodeno (Xaprila<®>) y leucovorina (también conocida como leucovorina cálcica, factor citrovorum y ácido folínico). La estructura de los compuestos activos identificados por números de código, nombres genéricos o comerciales puede tomarse de la edición actual del compendio estándar "The Merck Index" o de bases de datos, por ejemplo, Patents International (por ejemplo, IMS World Publications).

[0890] Los compuestos mencionados anteriormente, que pueden utilizarse en combinación con un compuesto de la presente divulgación, pueden prepararse y administrarse como se describe en la técnica, tal como en los documentos citados anteriormente.

[0892] En una realización, la presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de la presente divulgación (por ejemplo, un compuesto de la presente divulgación) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para su administración a un sujeto humano o animal, ya sea solo o junto con otros agentes anticancerígenos.

[0893] En una realización, la presente divulgación proporciona procedimientos para tratar sujetos humanos o animales que padecen una enfermedad proliferativa celular, tal como cáncer. La presente divulgación proporciona procedimientos para tratar a un sujeto humano o animal que necesite tal tratamiento, que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente divulgación (por ejemplo, un compuesto de la presente divulgación) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, ya sea solo o en combinación con otros agentes anticancerígenos.

[0895] En particular, las composiciones se formularán juntas como una combinación terapéutica o se administrarán por separado.

[0897] En la terapia combinada, el compuesto de la presente divulgación y otro(s) agente(s) anticancerígeno(s) pueden administrarse de forma simultánea, concurrente o secuencial sin límites de tiempo específicos, en la que tal administración proporciona niveles terapéuticamente eficaces de los dos compuestos en el cuerpo del paciente.

[0899] En una realización preferente, el compuesto de la presente divulgación y el otro u otros agente(s) anticancerígeno(s) se administran generalmente secuencialmente en cualquier orden por infusión u oralmente. El régimen de dosificación puede variar dependiendo de la etapa de la enfermedad, la condición física del paciente, los perfiles de seguridad de los fármacos individuales y la tolerancia de los fármacos individuales, así como de otros criterios bien conocidos por el médico tratante y el profesional o profesionales médicos que administran la combinación. El compuesto de la presente divulgación y otro(s) agente(s) anticancerígeno(s) pueden administrarse con minutos de diferencia, horas, días o incluso semanas de diferencia, dependiendo del ciclo concreto que se utilice para el tratamiento. Además, el ciclo podría incluir la administración de un fármaco con más frecuencia que el otro durante el ciclo de tratamiento y a diferentes dosis por administración del fármaco.

[0901] En otro aspecto de la presente divulgación, se proporcionan kits que incluyen uno o más compuestos de la presente divulgación y un compañero de combinación como se divulga en el presente documento. Los kits representativos incluyen (a) un compuesto de la presente divulgación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, (b) al menos un compañero de combinación, por ejemplo, como se ha indicado anteriormente, por lo que tal kit puede comprender un prospecto u otro etiquetado que incluya instrucciones de administración.

[0902] Un compuesto de la presente divulgación también puede utilizarse ventajosamente en combinación con procedimientos terapéuticos conocidos, por ejemplo, la administración de hormonas o especialmente radiación. Un compuesto de la presente divulgación puede utilizarse en particular como un radiosensibilizador, especialmente para el tratamiento de tumores que exhiben poca sensibilidad a la radioterapia. En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente que reduce o mejora un efecto secundario asociado con la administración de una célula que expresa CAR. Los efectos secundarios asociados a la administración de una célula que expresa CAR incluyen, pero no se limitan a, el CRS y la linfohistiocitosis hemofagocítica (HLH), también denominada Síndrome de Activación de Macrófagos (MAS). Los síntomas del CRS incluyen fiebres altas, náuseas, hipotensión transitoria, hipoxia, entre otros. El CRS puede incluir signos y síntomas clínicos constitucionales tales como fiebre, fatiga, anorexia, mialgias, artralgias, náuseas, vómitos y cefalea. El CRS puede incluir signos y síntomas clínicos cutáneos tales como erupción cutánea. El CRS puede incluir signos y síntomas gastrointestinales clínicos tales como náuseas, vómitos y diarrea. El CRS puede incluir signos y síntomas respiratorios clínicos tales como taquipnea e hipoxemia. El CRS puede incluir signos y síntomas cardiovasculares clínicos tales como taquicardia, aumento de la presión del pulso, hipotensión, aumento del gasto cardíaco (temprano) y posible disminución del gasto cardíaco (tardío). El CRS puede incluir signos y síntomas clínicos de coagulación tales como dímero d elevado, hipofibrinogenemia con o sin hemorragia. El CRS puede incluir signos y síntomas renales clínicos tales como la azotemia. El CRS puede incluir signos y síntomas hepáticos clínicos tales como transaminitis e hiperbilirrubinemia. El CRS puede incluir signos y síntomas neurológicos clínicos tales como cefalea, cambios del estado mental, confusión, delirio, dificultad para encontrar palabras o afasia franca, alucinaciones, temblor, dimetría, alteración de la marcha y convulsiones.

[0904] Por consiguiente, los procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender administrar una célula que expresa CAR descrita en el presente documento a un sujeto y administrar además uno o más agentes para gestionar niveles elevados de un factor soluble resultante del tratamiento con una célula que expresa CAR. En una realización, el factor soluble elevado en el sujeto es uno o más de IFN-y, TNFα, IL-2 e IL-6. En una realización, el factor elevado en el sujeto es uno o más de IL-1, GM-CSF, IL-10, IL-8, IL-5 y fractalquina. Por lo tanto, un agente administrado para tratar este efecto secundario puede ser un agente que neutralice uno o más de estos factores solubles. En una realización, el agente que neutraliza una o más de estas formas solubles es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. Ejemplos de tales agentes incluyen, pero no se limitan a un esteroide (por ejemplo, corticosteroide), un inhibidor de TNFα, y un inhibidor de IL-6. Un ejemplo de inhibidor de TNFα es una molécula de anticuerpo anti-TNFα, tal como infliximab, adalimumab, certolizumab pegol y golimumab. Otro ejemplo de inhibidor del TNFα es una proteína de fusión tal como el entanercept. Los inhibidores de moléculas pequeñas de TNFα incluyen, pero no se limitan a, los derivados de la xantina (por ejemplo, la pentoxifilina) y el bupropión. Un ejemplo de un inhibidor de IL-6 es una molécula de anticuerpo anti-IL-6 tal como tocilizumab (toc), sarilumab, elsilimomab, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301 y FM101. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-IL-6 es tocilizumab. Un ejemplo de un inhibidor basado en el IL-1R es la anakinra.

[0906] En alguna realización, al sujeto se le administra un corticosteroide, tal como, por ejemplo, metilprednisolona, hidrocortisona, entre otros.

[0908] En algunas realizaciones, al sujeto se le administra un vasopresor, tal como, por ejemplo, norepinefrina, dopamina, fenilefrina, epinefrina, vasopresina, o una combinación de los mismos.

[0910] En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente antipirético. En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente analgésico.

[0912] En una realización, al sujeto se le puede administrar un agente que potencia la actividad o aptitud de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, en una realización, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T. En algunas realizaciones, la molécula que modula o regula la función de las células T es una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, la Muerte Programada 1 (PD-1), pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR para montar una respuesta efectora inmuniatria. Ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC de clase I, MHC de clase II, GAL9, adenosina y TGFR beta. La inhibición de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T, por ejemplo, mediante inhibición a nivel de ADN, ARN o proteína, puede optimizar el rendimiento de una célula que expresa CAR. En realizaciones, un agente, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNds, por ejemplo, un ARNsi o ARNsh, unas repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), o una endonucleasa de dedos de zinc (ZFN), por ejemplo, como se describe en el presente documento, pueden utilizarse para inhibir la expresión de una molécula inhibidora en la célula que expresa CAR. En una realización, el inhibidor es un ARNsh.

[0914] En una realización, el agente que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de células T se inhibe dentro de una célula que expresa CAR. En estas realizaciones, una molécula de ARNds que inhibe la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T está enlazada al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. En una realización, una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T está unida operablemente a un promotor, por ejemplo, un promotor derivado de H1- o U6 de tal manera que la molécula de ARNds que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de células T se expresa, por ejemplo, se expresa dentro de una célula que expresa CAR. Véase, por ejemplo, Tiscornia G., "Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA", Capítulo 3, en Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA y RNA (eds. Friedmann y Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU., 2007; Brummelkamp TR, et al. (2002) Ciencia 296: 550-553; Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol.19: 497-500. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T está presente en el mismo vector, por ejemplo, un vector lentiviral, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. En tal realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se localiza en el vector, por ejemplo, el vector lentiviral, 5'- o 3'- al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. La molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T puede transcribirse en la misma o diferente dirección que el ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T está presente en un vector distinto del vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se expresa transitoriamente dentro de una célula que expresa CAR. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNds que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se integra de forma estable en el genoma de una célula que expresa CAR. Configuraciones de vectores ejemplares para expresar un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR con una molécula de ARNds que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de células T, se proporciona, por ejemplo, en la Figura 47 de la Publicación Internacional WO2015/090230, presentada el 19 de Diciembre de 2014.

[0915] Ejemplos de moléculas de ARNds útiles para inhibir la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de células T, en el que la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de células T es PD-1 incluyen agentes de ARNi que se direccionan a PD-1, como se describe, por ejemplo, en el párrafo [00489] y las Tablas 16 y 17 de la Publicación Internacional WO2015/090230, presentada el 19 de Diciembre de 2014..

[0917] En una realización, el agente que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de células T puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una molécula inhibidora. Por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a PD-1, PD-L1, PD-L2 o CTLA4 (por ejemplo, ipilimumab (también denominado como MDX-010 y MDX-101, y comercializado como Yervoy<®>; Bristol-Myers Squibb; Tremelimumab (anticuerpo monoclonal IgG2 disponible en Pfizer, anteriormente conocido como ticilimumab, CP-675.206). En una realización, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a TIM3. En una realización, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a LAG3.

[0918] PD-1 es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28 que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en células B activadas, células T y células mieloides (Agata et al.1996 Int. Immunol 8:765-75). Se ha demostrado que dos ligandos de PD-1, PD-L1 y PD-L2, regulan a la baja la activación de células T al unirse a PD-1 (Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al.2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 es abundante en los cánceres humanos (Dong et<al.>)<2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004>Clin Cancer Res 10:5094). La inmunosupresión puede revertirse inhibiendo la interacción local de PD-1 con PD-L1. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros inhibidores de PD-1, PD-L1 y PD-L2 están disponibles en la técnica y pueden utilizarse en combinación con un vehículo de la presente divulgación descrito en el presente documento. Por ejemplo, nivolumab (también denominado BMS-936558 o MDX1106; Bristol-Myers Squibb) es un anticuerpo monoclonal IgG4 totalmente humano que bloquea específicamente PD-1. Nivolumab (clon 5C4) y otros anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a PD-1 se divulgan en US 8,008,449 y WO2006/121168. Pidilizumab (CT-011; Cure Tech) es un anticuerpo monoclonal IgGlk humanizado que se une a PD-1. Pidilizumab y otros anticuerpos monoclonales anti-PD-1 humanizados se divulgan en WO2009/101611. Pembrolizumab (anteriormente conocido como lambrolizumab, y también denominado como MK03475; Merck) es un anticuerpo monoclonal IgG4 humanizado que se une a PD-1. Pembrolizumab y otros anticuerpos anti-PD-1 humanizados se divulgan en US 8,354,509 y WO2009/114335. AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune; por ejemplo, divulgado en WO2010/027827 y WO2011/066342), es un receptor soluble de fusión Fc de PD-L2 que bloquea la interacción entre PD-1 y B7-H1. Otros anticuerpos anti-PD-1 incluyen AMP 514 (Amplimmune), pero no se limitan a, por ejemplo, anticuerpos anti-PD-1 divulgados en US 8,609,089, US 2010028330, y/o US 20120114649.

[0920] En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 o fragmento del mismo es una molécula de anticuerpo anti-PD-1 como se describe en US 2015/0210769, titulado "Antibody Molecules to PD-1 and Uses Thereof,". En una realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-1 incluye al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR (o colectivamente todas las CDR) de una región variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo elegido de cualquiera de BAP049-hum01, BAP049-hum02, BAP049-hum03, BAP049-hum04, BAP049-hum05, BAP049-hum06, BAP049-hum07, BAP049-hum08, BAP049-hum09, BAP049-hum10, BAP049-hum11, BAP049-hum12, BAP049-hum13, BAP049-hum14, BAP049-hum15, BAP049-hum16, BAP049-Clone-A, BAP049-Clone-B, BAP049-Clone-C, BAP049-Clone-D o BAP049-Clone-E; o como se describe en la Tabla 1 de US 2015/0210769, o codificada por la secuencia de nucleótidos de la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo,al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más idéntica) a cualquiera de las secuencias mencionadas; o CDRs estrechamente relacionadas,por ejemplo,CDR que sean idénticas o que tengan al menos una alteración de aminoacidos, pero no más de dos, tres o cuatro alteraciones (por ejemplo,sustituciones, deleciones o inserciones,por ejemplo,sustituciones conservadoras).

[0922] En todavía otra realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-1 comprende al menos una, dos, tres o cuatro regiones variables de un anticuerpo descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo elegido entre cualquiera de BAP049-hum01, BAP049-hum02, BAP049-hum03, BAP049-hum04, BAP049-hum05, BAP049-hum06, BAP049-hum07, BAP049-hum08, BAP049-hum09, BAP049-hum10, BAP049-hum11, BAP049-hum12, BAP049-hum13, BAP049-hum14, BAP049-hum15, BAP049-hum16, BAP049-Clone-A, BAP049-Clone-B, BAP049-Clone-C, BAP049-Clone-D, o BAP049-Clone-E; o como se describe en la Tabla 1 de US 2015/0210769, o codificada por la secuencia de nucleótidos de la Tabla 1; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo,al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más idéntica) a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas.

[0924] TIM3 (inmunoglobulina-3 de células T) también regula negativamente la función de las células T, particularmente en las células CD4+ T auxiliadoras 1 y CD8+ T citotóxicas 1 secretoras de IFN-g, y desempeña un papel crítico en el agotamiento de las células T. La inhibición de la interacción entre TIM3 y sus ligandos, por ejemplo, galectina-9 (Gal9), fosfotidilserina (PS) y HMGB1, puede aumentar la respuesta inmunitaria. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros inhibidores de TIM3 y sus ligandos están disponibles en la técnica y pueden utilizarse en combinación con un CAR CD19 descrito en el presente documento. Por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, moléculas pequeñas o inhibidores peptídicos direccionados a TIM3 se unen al dominio IgV de TIM3 para inhibir la interacción con sus ligandos. Anticuerpos y péptidos que inhiben TIM3 se divulgan en WO2013/006490 y US20100247521. Otros anticuerpos anti-TIM3 incluyen versiones humanizadas de RMT3-23 (divulgadas en Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551), y el clon 8B.2C12 (divulgado en Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541). Los anticuerpos biespecíficos que inhiben TIM3 y PD-1 se divulgan en US20130156774.

[0926] En una realización, el anticuerpo anti-TIM3 o fragmento del mismo es una molécula de anticuerpo anti- TIM3 como se describe en US 2015/0218274, titulado "Antibody Molecules to TIM3 and Uses Thereof,". En una realización, la molécula de anticuerpo anti-TIM3 incluye al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR (o colectivamente todas las CDR) de una región variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo elegido entre cualquiera de ABTIM3, ABTIM3-hum01, ABTIM3-hum02, ABTIM3-hum03, ABTIM3-hum04, ABTIM3-hum05, ABTIM3-hum06, ABTIM3-hum07, ABTIM3-hum08, ABTIM3-hum09, ABTIM3-hum10, ABTIM3-hum11, ABTIM3-hum12, ABTIM3-hum13, ABTIM3-hum14, ABTIM3-hum15, ABTIM3-hum16, ABTIM3-hum17, ABTIM3-hum18, ABTIM3-hum19, ABTIM3-hum20, ABTIM3-hum21, ABTIM3-hum22, ABTIM3-hum23; o como se describe en las Tablas 1-4 de US 2015/0218274; o codificada por la secuencia de nucleótidos de las Tablas 1-4; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo,al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más idéntica) a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas, o CDR estrechamente relacionadas, por ejemplo, CDR que sean idénticas o que tengan al menos una alteración de aminoácido, pero no más de dos, tres o cuatro alteraciones (por ejemplo,sustituciones, deleciones o inserciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras).

[0928] En otra realización más, la molécula de anticuerpo anti-TIM3 comprende al menos una, dos, tres o cuatro regiones variables de un anticuerpo descrito en el presente documento,por ejemplo,un anticuerpo elegido de cualquiera de ABTIM3, ABTIM3-hum01, ABTIM3-hum02, ABTIM3-hum03, ABTIM3-hum04, ABTIM3-hum05, ABTIM3-hum06, ABTIM3-hum07, ABTIM3-hum08, ABTIM3-hum09, ABTIM3-hum10, ABTIM3-hum11, ABTIM3-hum12, ABTIM3-hum13, ABTIM3-hum14, ABTIM3-hum15, ABTIM3-hum16, ABTIM3-hum17, ABTIM3-hum18, ABTIM3-hum19, ABTIM3-hum20, ABTIM3-hum21, ABTIM3-hum22, ABTIM3-hum23; o como se describe en las Tablas 1-4 de US 2015/0218274; o codificada por la secuencia de nucleótidos de las Tablas 1-4; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo,al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más idéntica) a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas.

[0930] En otras realizaciones, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR es un inhibidor de CEACAM (por ejemplo,inhibidor de CEACAM-1, CEACAM-3, y/o CEACAM-5). En una realización, el inhibidor de CEACAM es una molécula de anticuerpo anti-CEACAM. Se describen anticuerpos anti-CEACAM-1 ejemplares en WO 2010/125571, WO 2013/082366 WO 2014/059251 y WO 2014/022332,por ejemplo,un anticuerpo monoclonal 34B1, 26H7, y 5F4; o una forma recombinante del mismo, como se describe en,por ejemplo,US 2004/0047858, US 7,132,255 y WO 99/052552. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM se une a CEACAM-5 como se describe en,por ejemplo,Zheng et al. PLoS One.2 de Septiembre de 2010;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146), o reacciona de forma cruzada con CEACAM-1 y CEACAM-5 como se describe en,por ejemplo,WO 2013/054331 y US 2014/0271618.

[0932] Sin querer estar ligado a la teoría, se cree que las moléculas de adhesión celular al antígeno carcinoembrionario (CEACAM), tales como CEACAM-1 y CEACAM-5, median, al menos en parte, la inhibición de una respuesta inmunitaria antitumoral (véase por ejemplo,Markel et al. J Immunol. 15 de Marzo de 2002;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 1 de Noviembre 2006;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. Febrero de 2009;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. Febrero de 2010;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. Junio de 2012;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol.1 de Junio de 2005;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2 de Septiembre de2010;5(9). pii: e12529). Por ejemplo, se ha descrito que CEACAM-1 es un ligando heterofílico para TIM-3 y que desempeña un papel en la tolerancia y el agotamiento de células T mediado por TIM-3 (véase por ejemplo, WO 2014/022332; Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848). En realizaciones, se ha demostrado que el co-bloqueo de CEACAM-1 y TIM-3 potencia una respuesta inmunitaria antitumoral en modelos de cáncer colorrectal de xenoinjerto (véase, por ejemplo, WO 2014/022332; Huang,et al.(2014),supra).En otras realizaciones, el co-bloqueo de CEACAM-1 y PD-1 reduce la tolerancia de las células T como se describe, por ejemplo, en WO 2014/059251. Por lo tanto, los inhibidores de CEACAM pueden utilizarse con los otros inmunomoduladores descritos en el presente documento (por ejemplo,inhibidores anti-PD-1 y/o anti-TIM-3) para potenciar una respuesta inmunitaria contra un cáncer,por ejemplo,un melanoma, un cáncer de pulmón (por ejemplo, NSCLC), un cáncer de vejiga, un cáncer de colon un cáncer de ovario, y otros cánceres como se describe en el presente documento.

[0934] LAG3 (gen de activación de linfocitos-3 o CD223) es una molécula de superficie celular expresada en células T y células B activadas que ha demostrado desempeñar un papel en el agotamiento de células T CD8+. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros inhibidores de LAG3 y sus ligandos están disponibles en la técnica y pueden utilizarse en combinación con un CAR CD19 descrito en el presente documento. Por ejemplo, el BMS-986016 (Bristol-Myers Squib) es un anticuerpo monoclonal que se direcciona a LAG3. IMP701 (Immutep) es un anticuerpo LAG3 antagonista e IMP731 (Immutep y GlaxoSmithKline) es un anticuerpo que agota LAG3. Otros inhibidores de LAG3 incluyen IMP321 (Immutep), que es una proteína de fusión recombinante de una porción soluble de LAG3 e Ig que se une a moléculas MHC de clase II y activa las células presentadoras de antígeno (APC). Otros anticuerpos se divulgan, por ejemplo, en WO2010/019570.

[0936] En una realización, el anticuerpo anti-LAG3 o fragmento del mismo es una molécula de anticuerpo anti-LAG3 como se describe en US 2015/0259420, titulado "Antibody Molecules to LAG3 and Uses Thereof,". En una realización, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 incluye al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR (o colectivamente todas las CDR) de una región variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo elegido entre cualquiera de BAP050-hum01, BAP050-hum02, BAP050-hum03, BAP050-hum04, BAP050-hum05, BAP050-hum06, BAP050-hum07, BAP050-hum08, BAP050-hum09, BAP050-hum10, BAP050-hum11, BAP050-hum12, BAP050-hum13, BAP050-hum14, BAP050-hum15, BAP050-hum16, BAP050-hum17, BAP050-hum18, BAP050-hum19, BAP050-hum20, huBAP050(Ser) (por ejemplo, BAP050-hum01-Ser, BAP050-hum02-Ser, BAP050-hum03-Ser, BAP050-hum04-Ser, BAP050-hum05-Ser, BAP050-hum06-Ser, BAP050-hum07-Ser, BAP050-hum08-Ser, BAP050-hum09-Ser, BAP050-hum10-Ser, BAP050-hum11-Ser, BAP050-hum12-Ser, BAP050-hum13-Ser, BAP050-hum14-Ser, BAP050-hum15-Ser, BAP050-hum18-Ser, BAP050-hum19-Ser, o BAP050-hum20-Ser), BAP050-Clone-F, BAP050-Clone-G, BAP050-Clone-H, BAP050-Clone-I, o BAP050-Clone-J; o como se describe en la Tabla 1 de US 2015/0259420; o codificada por la secuencia de nucleótidos de la Tabla 1; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo,al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más idéntica) a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas, o CDR estrechamente relacionadas, por ejemplo, CDR que sean idénticas o que tengan al menos una alteración de aminoácidos, pero no más de dos, tres o cuatro alteraciones (por ejemplo,sustituciones, deleciones o inserciones,por ejemplo,sustituciones conservadoras).

[0938] En todavía otra realización, la molécula de anticuerpo anti-LAG3 comprende al menos una, dos, tres o cuatro regiones variables de un anticuerpo descrito en el presente documento,por ejemplo, un anticuerpo elegido entre cualquiera de BAP050-hum01, BAP050-hum02, BAP050-hum03, BAP050-hum04, BAP050-hum05, BAP050-hum06, BAP050-hum07, BAP050-hum08, BAP050-hum09, BAP050-hum10, BAP050-hum11, BAP050-hum12, BAP050-hum13, BAP050-hum14, BAP050-hum15, BAP050-hum16, BAP050-hum17, BAP050-hum18, BAP050-hum19, BAP050-hum20, huBAP050(Ser) (por ejemploBAP050-hum01-Ser, BAP050-hum02-Ser, BAP050-hum03-Ser, BAP050-hum04-Ser, BAP050-hum05-Ser, BAP050-hum06-Ser, BAP050-hum07-Ser, BAP050-hum08-Ser, BAP050-hum09-Ser, BAP050-hum10-Ser, BAP050-hum11-Ser, BAP050-hum12-Ser, BAP050-hum13-Ser, BAP050-hum14-Ser, BAP050-hum15-Ser, BAP050-hum18-Ser, BAP050-hum19-Ser, o BAP050-hum20-Ser), BAP050-Clone-F, BAP050-Clone-G, BAP050-Clone-H, BAP050-Clone-I, o BAP050-Clone-J; o como se describe en la Tabla 1 de US 2015/0259420; o codificada por la secuencia de nucleótidos de las Tablas 1; o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo,al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más idéntica) a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas. En algunas realizaciones, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR puede ser, por ejemplo, una proteína de fusión que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en el que el primer dominio es una molécula inhibidora, o fragmento de la misma, y el segundo dominio es un polipéptido que está asociado con una señal positiva, por ejemplo, un polipéptido que comprende un dominio de señalización antracelular como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el polipéptido que está asociado con una señal positiva puede incluir un dominio coestimulador de CD28, CD27, ICOS, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular de CD28, CD27 y/o ICOS, y/o un dominio de señalización primario, por ejemplo, de CD3 zeta, por ejemplo, descrito en el presente documento. En una realización, la proteína de fusión es expresada por la misma célula que expresó el CAR. En otra realización, la proteína de fusión es expresada por una célula, por ejemplo, una célula T que no expresa un CAR de la presente divulgación.

[0940] En una realización, el agente que potencia la actividad de una célula que expresa CAR descrito en el presente documento es miR-17-92.

[0942] En una realización, el agente que potencia la actividad de un CAR descrito en el presente documento es una citoquina. Las citoquinas tienen importantes funciones relacionadas con la expansión, diferenciación, supervivencia y homeostasis de las células T. Las citoquinas que pueden administrarse al sujeto que recibe una célula que expresa CAR descrita en el presente documento incluyen: IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18 e IL-21, o una combinación de las mismas. En realizaciones preferentes, la citoquina administrada es IL-7, IL-15 o IL-21, o una combinación de las mismas. La citoquina puede administrarse una vez al día o más de una vez al día, por ejemplo, dos veces al día, tres veces al día o cuatro veces al día. La citoquina puede administrarse durante más de un día, por ejemplo, la citoquina se administra durante 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas. Por ejemplo, la citoquina se administra una vez al día durante 7 días.

[0944] En realizaciones, la citoquina se administra en combinación con la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1. La citoquina puede administrarse simultáneamente o concurrentemente con las células que expresan CAR, por ejemplo, administradas el mismo día. La citoquina puede prepararse en la misma composición farmacéutica que las células que expresan CAR, o puede prepararse en una composición farmacéutica separada. Alternativamente, la citoquina puede administrarse poco después de la administración de las células que expresan CAR, por ejemplo, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la administración de las células T que expresan CAR. En las realizaciones en las que la citoquina se administra en un régimen de dosificación que ocurre durante más de un día, el primer día del régimen de dosificación de citoquina puede ser el mismo día que la administración con las células que expresan CAR, o el primer día del régimen de dosificación de citoquina puede ser 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la administración de las células que expresan CAR. En una realización, el primer día, las células que expresan CAR se administran al sujeto, y el segundo día, se administra una citoquina una vez al día durante los siguientes 7 días . En una realización preferente, la citoquina que se administra en combinación con las células que expresan CAR es IL-7, IL-15 o IL-21.

[0945] En otras realizaciones, la citoquina se administra un periodo de tiempo después de la administración de células que expresan CAR, por ejemplo, al menos 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, o 1 año o más después de la administración de células que expresan CAR. En una realización, la citoquina se administra después de evaluar la respuesta del sujeto a las células que expresan CAR. Por ejemplo, al sujeto se le administran células que expresan CAR de acuerdo con la dosificación y regímenes descritos en el presente documento. La respuesta del sujeto a la terapia CART se evalúa a las 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 1 año o más después de la administración de las células que expresan CAR, utilizando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, incluyendo la inhibición del crecimiento tumoral, la reducción de las células tumorales circulantes o la regresión tumoral. A los sujetos que no exhiben una respuesta suficiente a la terapia celular con expresión CAR se les puede administrar una citoquina. La administración de la citoquina al sujeto que presenta una respuesta subóptima a la terapia celular con células que expresan CAR mejora la eficacia de las células que expresan CAR o su actividad antitumoral. En una realización preferente, la citoquina administrada después de la administración de células que expresan CAR es IL-7.

[0946] Combinación con una dosis baja de un inhibidor de mTOR

[0947] En una realización, la combinación descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula que expresa CAR de mesotelina y un inhibidor de PD-L1, se administra en combinación con una dosis baja de un inhibidor de mTOR que potencia el sistema inmunitario.

[0948] En otra realización, la administración de una dosis baja de un inhibidor de mTOR que potencia el sistema inmunitario, da como resultado una proliferación aumentada o prolongada de células que expresan CAR, por ejemplo, en cultivo o en un sujeto, por ejemplo, en comparación con células que expresan CAR no tratadas o un sujeto no tratado. En algunas realizaciones, el aumento de la proliferación se asocia con un aumento del número de células que expresan CAR. Los procedimientos para medir el aumento o la prolongación de la proliferación se describen en los Ejemplos del presente documento. En otra realización, la administración de una dosis baja de un inhibidor de mTOR que potencia el sistema inmunitario, da como resultado un aumento de la destrucción de células cancerosas por células que expresan CAR, por ejemplo, en cultivo o en un sujeto, por ejemplo, en comparación con células que expresan CAR no tratadas o un sujeto no tratado. En algunos casos, el aumento de la destrucción de células cancerosas se asocia con una disminución del volumen tumoral. En una realización, las células que expresan una molécula CAR, por ejemplo, una molécula CAR descrita en el presente documento, se administran en combinación con una dosis baja de un inhibidor de mTOR que potencia el sistema inmunitario, por ejemplo, un inhibidor de mTOR alostérico, por ejemplo, RAD001, o un inhibidor de mTOR catalítico. Por ejemplo, la administración de la dosis baja del inhibidor de mTOR que potencia el sistema inmunitario, puede iniciarse antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita en el presente documento; completarse antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita en el presente documento; iniciarse al mismo tiempo que la administración de una célula que expresa CAR descrita en el presente documento; solaparse con la administración de una célula que expresa CAR descrita en el presente documento; o continuar después de la administración de una célula que expresa CAR descrita en el presente documento.

[0949] Alternativamente o adicionalmente, la administración de una dosis baja de un inhibidor de mTOR que potencia el sistema inmunitario, puede optimizar las células efectoras inmunitarias que se van a modificar genéticamente para expresar una molécula CAR descrita en el presente documento. En tales realizaciones, la administración de una dosis baja de un inhibidor de mTOR que potencia el sistema inmunitario, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, o un inhibidor catalítico, se inicia o completa antes de la recolección de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, células T o células NK, que se modificarán genéticamente para expresar una molécula CAR descrita en el presente documento, de un sujeto.

[0950] En otra realización, las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, células T o células NK, que se van a modificar genéticamente para expresar una molécula CAR descrita en el presente documento, por ejemplo, después de la recolección de un sujeto, o las células efectoras inmunitarias que expresan CAR, por ejemplo, células T o células NK, por ejemplo, antes de la administración a un sujeto, se pueden cultivar en presencia de una dosis baja de un inhibidor de mTOR que potencia la sistema inmunitario, .

[0951] Como se utiliza en el presente documento, el término "inhibidor de mTOR" se refiere a un compuesto o ligando, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que inhibe la quinasa mTOR en una célula. En una realización, un inhibidor de mTOR es un inhibidor alostérico. En una realización, un inhibidor de mTOR es un inhibidor catalítico.

[0952] Los inhibidores alostéricos de mTOR incluyen el compuesto tricíclico neutro rapamicina (sirolimus), compuestos relacionados con rapamicina, es decir compuestos que tienen similitud estructural y funcional con rapamicina incluyendo, por ejemplo, derivados de rapamicina, análogos de rapamicina (también denominados rapálogos) y otros compuestos macrólidos que inhiben la actividad de mTOR.

[0953] La rapamicina es un antibiótico macrólido conocido producido por Streptomyces hygroscopicus que tiene la estructura que se muestra en la Fórmula A.

[0956]

.

[0957] Otros análogos de rapamicina adecuados incluyen, pero no se limitan a, RAD001, también conocido como everolimus (Afinitor<®>), tiene el nombre químico (1R,9S,128,15R,16E,18R,19R 21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-12- {(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-hidroxietoxi)-3-metoxiciclohexil]-1-metiletil}-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.04,9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraeno-2,3,10,14,20-pentaona,sirolimus (rapamicina, AY-22989), 40-[3-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato]-rapamicina (también llamado temsirolimus o CCI-779) y ridaforolimus (AP-23573/MK-8669).b Otros ejemplos de inhibidores alostéricos de mTor incluyen zotarolimus (ABT578) y umirolimus como se describe en US2005/0101624. Otros inhibidores de mTOR adecuados se describen en los párrafos 946 a 964 de la Publicación Internacional WO2015/142675, presentada el 13 de Marzo de 2015, que se incorpora por referencia en su totalidad. Dosis bajas de un inhibidor de mTOR que potencian el sistema inmunitario, , los niveles adecuados de inhibición de mTOR asociados con dosis bajas de un inhibidor de mTOR, procedimientos para detectar el nivel de inhibición de mTOR, y composiciones farmacéuticas adecuadas de los mismos se describen además en los párrafos 936 a 945 y 965 a 1003 de la Publicación Internacional WO2015/142675, presentada el 13 de Marzo de 2015.

[0958] Composiciones Farmacéuticas

[0959] Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden comprender una célula que expresa CAR, por ejemplo, una pluralidad de células que expresan CAR, como se describe en el presente documento, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente o fisiológicamente aceptables. Tales composiciones pueden comprender tampones tales como solución salina neutra tamponada, solución salina fosfatada tamponada y similares; carbohidratos tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente divulgación están en un aspecto formuladas para administración intravenosa. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse de manera apropiada a la enfermedad que se desea tratar (o prevenir). La cantidad y frecuencia de administración vendrán determinadas por tales factores como la condición del paciente y el tipo y gravedad de su enfermedad, aunque la dosificación apropiada puede determinarse mediante ensayos clínicos.

[0960] En una realización, la composición farmacéutica está sustancialmente libre de, por ejemplo, no hay niveles detectables de un contaminante, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en endotoxina, micoplasma, lentivirus competente en replicación (RCL), p24, ácido nucleico VSV-G, HIV gag, perlas recubiertas anti-CD3/anti-CD28 residuales, anticuerpos de ratón, suero humano mezclado, albúmina de suero bovino, suero bovino, componentes de medios de cultivo, componentes de células o plásmidos de empaquetamiento de vectores, una bacteria y un hongo. En una realización, la bacteria es al menos una seleccionada del grupo que consiste en Alcaligenes faecalis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia y Streptococcus pyogenes grupo A.

[0961] Procedimientos de Tratamiento

[0962] Cuando se indica "una cantidad inmunológicamente eficaz", "una dosis eficaz", "una cantidad eficaz anticancerígena", "una cantidad eficaz inhibidora del cáncer" o "cantidad terapéutica", la cantidad precisa de las composiciones de la presente divulgación a administrar puede ser determinada por un médico con consideración de las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y condición del paciente (sujeto).

[0963] La dosificación de los tratamientos anteriores que se administrarán a un sujeto variará según la naturaleza precisa de la afección que se esté tratando y el receptor del tratamiento. El escalado de las dosificaciones para la administración humana puede realizarse de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica. La dosis para CAMPATH, por ejemplo, estará generalmente en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, usualmente administrada diariamente durante un periodo de entre 1 y 30 días. La dosis diaria preferente es de 1 a 10 mg por día, aunque en algunos casos pueden utilizarse dosis mayores, de hasta 40 mg por día (descritas en Patente de EE.UU No.6,120,766).

[0964] La administración de las composiciones descritas en el presente documento puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante inhalación en aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente por vía transarterial, subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa (i.v.) o intraperitoneal. En una realización, las composiciones descritas en el presente documento, por ejemplo, que comprenden una célula que expresa CAR y/o un inhibidor de PD-L1, se administran a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En una realización, las composiciones descritas en el presente documento, por ejemplo, que comprenden una célula que expresa CAR y/o un inhibidor de PD-L1, se administran mediante inyección i.v. Las composiciones descritas en el presente documento, por ejemplo, que comprenden una célula que expresa CAR y/o un inhibidor de PD-L1, pueden inyectarse directamente en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.

[0965] En general, se puede afirmar que una composición farmacéutica que comprende las células efectoras inmunitarias descritas en el presente documento puede administrarse en una dosificación de 10<4>a 10<9>células/kg de peso corporal, en algunos casos 10<5>a 10<6>células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones de células efectoras inmunitarias también pueden administrarse varias veces a estas dosificaciones. Las células pueden administrarse utilizando técnicas de infusión comúnmente conocidas en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med.

[0966] 319:1676, 1988).

[0967] En determinados aspectos, puede desearse administrar células efectoras inmunitarias activadas a un sujeto y posteriormente volver a extraer sangre (o realizar una aféresis), activar las células de la misma de acuerdo con la presente divulgación, y reinfundir al paciente con estas células activadas y expandidas. Este procedimiento puede realizarse varias veces cada varias semanas. En determinados aspectos, las células pueden activarse a partir de extracciones de sangre de entre 10cc y 400cc. En determinados aspectos, las células se activan a partir de extracciones de sangre de 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc o 100cc.

[0968] En un aspecto ejemplar particular, los sujetos pueden someterse a leucaféresis, en la que los leucocitos se recogen, enriquecen o agotan ex vivo para seleccionar y/o aislar las células de interés,por ejemplo,células T. Estas células T aisladas pueden expandirse mediante procedimientos conocidos en la técnica y tratarse de tal manera que puedan introducirse una o más construcciones CAR de la divulgación, creando así una célula T CAR de la divulgación. Los sujetos que lo necesiten podrán someterse posteriormente a un tratamiento estándar con altas dosis de quimioterapia seguido de un trasplante de células madre de sangre periférica. En determinados aspectos, después o simultáneamente con el trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células que expresan CAR expandidas de la presente divulgación. En un aspecto adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

[0969] En una realización, el CAR se introduce en células efectoras inmunitarias, por ejemplo, utilizando transcripción in vitro, y el sujeto (por ejemplo, humano) recibe una administración inicial de células que expresan CAR de la divulgación, y una o más administraciones posteriores de las células que expresan CAR de la divulgación, en la que la una o más administraciones posteriores se administran en menos de 15 días, por ejemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, o 2 días después de la administración anterior. En una realización, se administran al sujeto (por ejemplo, un ser humano) más de una administración de las células que expresan CAR de la divulgación por semana, por ejemplo, se administran 2, 3 o 4 administraciones de las células que expresan CAR de la divulgación por semana. En una realización, el sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) recibe más de una administración de células que expresan CAR por semana (por ejemplo, 2, 3 o 4 administraciones por semana) (también denominado en el presente documento como ciclo), seguida de una semana sin administración de células que expresan CAR y, luego, al sujeto se le administra una o más administraciones adicionales de células que expresan CAR (por ejemplo, más de una administración de las células que expresan CAR por semana). En otra realización, el sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) recibe más de un ciclo de células que expresan CAR, y el tiempo entre cada ciclo es menor a 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 días. En una realización, las células que expresan CAR se administran cada dos días durante 3 administraciones por semana. En una realización, las células que expresan CAR de la divulgación se administran durante al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más semanas.

[0970] En algunas realizaciones, una dosis de células que expresan CAR descritas en el presente documento (por ejemplo, célula que expresa CAR de mesotelina) comprende aproximadamente 1 x 10<6>, 1,1 x 10<6>, 2 x 10<6>, 3,6 x 10<6>, 5 x 10<6>, 1 x 10<7>, 1,8 x 10<7>, 2 x 10<7>, 5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 2 x 10<8>, 3 x 10<8>, o 5 x 10<8>células/kg. En algunas realizaciones, una dosis de células CAR (por ejemplo, células que expresan mesotelina CAR) comprende al menos aproximadamente 1 x 10<6>, 11 x 10<6>, 2 x 10<6>, 3,6 x 10<6>, 5 x 10<6>, 1 x 10<7>, 1.8 x 10<7>, 2 x 10<7>, 5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 2 x 10<8>, 3 x 10<8>, o 5 x 10<8>células/kg. En algunas realizaciones, una dosis de células CAR (por ejemplo, célula que expresa CAR de mesotelina) comprende hasta aproximadamente 1 x 10<6>, 1,1 x 10<6>, 2 x 10<6>, 3,6 x 10<6>, 5 x 10<6>, 1 x 10<7>, 1,8 x 10<7>, 2 x 10<7>, 5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 2 x 10<8>, 3 x 10<8>, o 5 x 10<8>células/kg. En algunas realizaciones, una dosis de células CAR (por ejemplo, células que expresan CAR de mesotelina) comprende aproximadamente 1,1 x 10<6>- 1,8 x 10<7>células/kg. En algunas realizaciones, una dosis de células CAR (por ejemplo, célula que expresa CAR de mesotelina) comprende aproximadamente 1 x 10<7>, 2 x 10<7>, 5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 2 x 10<8>, 3 x 10<8>, 5 x 10<8>, 1 x 10<9>, 2 x 10<9>, o 5 x 10<9>células. En algunas realizaciones, una dosis de células CAR (por ejemplo, célula que expresa CAR de mesotelina) comprende al menos aproximadamente 1 x 10<7>, 2 x 10<7>, 5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 2 x 10<8>, 3 x 10<8>, 5 x 10<8>, 1 x 10<9>, 2 x 10<9>, o 5 x 10<9>células. En algunas realizaciones, una dosis de células CAR (por ejemplo, célula que expresa CAR de mesotelina) comprende hasta aproximadamente 1 x 10<7>, 2 x 10<7>, 5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 2 x 10<8>, 3 x 10<8>, 5 x 10<8>, 1 x 10<9>, 2 x 10<9>, o 5 x 10<9>células. En algunas realizaciones, una dosis de células CAR (por ejemplo, célula que expresa CAR de mesotelina) comprende hasta aproximadamente 1 x 10<7>, 1,5 x 10<7>, 2 x 10<7>, 2.5 x 10<7>, 3 x 10<7>, 3,5 x 10<7>, 4 x 10<7>, 5 x 10<7>, 1 x 10<8>, 1,5 x 10<8>, 2 x 10<8>, 2,5 x 10<8>, 3 x 10<8>, 3,5 x 10<8>, 4 x 10<8>, 5 x 10<8>, 1 x 10<9>, 2 x 10<9>, o 5 x 10<9>células. En algunas realizaciones, una dosis de células CAR (por ejemplo, células que expresan CAR de mesotelina) comprende hasta aproximadamente 1-3 x 10<7>a 1-3 x10<8>. En algunas realizaciones, al sujeto se le administran aproximadamente 1-3 x 10<7>de células que expresan CAR de mesotelina. En otras realizaciones, al sujeto se le administran aproximadamente 1-3 x 10<8>de células que expresan CAR de mesotelina.

[0971] En un aspecto, las células que expresan CAR de mesotelina se generan utilizando vectores virales lentivirales, tales como lentivirus. Las células que expresan CAR generadas de este modo tendrán una expresión de CAR estable.

[0972] En un aspecto, las células que expresan CAR expresan transitoriamente vectores CAR durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 días después de la transducción. La expresión transitoria de los CAR puede realizarse mediante el suministro de vectores de CAR de ARN. En un aspecto, el ARN de CAR se transduce en la célula T mediante electroporación.

[0973] Un problema potencial que puede surgir en pacientes tratados utilizando células que expresan transitoriamente CAR (particularmente con células que expresan CAR portadoras de scFv murinos) es la anafilaxia después de múltiples tratamientos.

[0974] Sin estar ligado a esta teoría, se cree que tal respuesta anafiláctica podría ser causada por un paciente que desarrolla una respuesta humoral anti-CAR, es decir, anticuerpos anti-CAR que tienen un isotipo anti-IgE. Se cree que las células productoras de anticuerpos de un paciente experimentan un cambio de clase del isotipo IgG (que no causa anafilaxia) al isotipo IgE cuando hay una pausa de diez a catorce días en la exposición al antígeno.

[0975] Si un paciente tiene un riesgo elevado de generar una respuesta de anticuerpos anti-CAR durante el curso de la terapia CAR transitoria (tal como las generadas por transducciones de ARN), las pausas de infusión de células que expresan CAR no deben durar más de diez a catorce días.

[0976] El uso de CAR con scFv humanos (en lugar de murinos) puede reducir la probabilidad y la intensidad de que un paciente tenga una respuesta anti-CAR.

[0977] La dosificación y regímenes terapéuticos del inhibidor de PD-L1, por ejemplo, molécula de anticuerpo anti-PD-L1, pueden determinarse por un experto en la técnica.

[0978] En determinadas realizaciones donde el inhibidor de PD-L1 es una molécula de anticuerpo anti-PD-L1, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 se administra mediante inyección (por ejemplo,subcutánea o intravenosa) en una dosis de aproximadamente 1 a 30 mg/kg,por ejemplo,aproximadamente 5 a 25 mg/kg, aproximadamente 10 a 20 mg/kg, aproximadamente 1 a 5 mg/kg, o aproximadamente 3 mg/kg. El esquema de dosificación puede variar desdepor ejemplo,una vez a la semana hasta una vez cada 2, 3 o 4 semanas. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 se administra en una dosis de aproximadamente 10 a 20 mg/kg cada dos semanas. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 se administra, sola o en combinación (por ejemplo,en combinación con una molécula de anticuerpo anti-LAG-3), en una dosis de menos de, o aproximadamente, 5 mg/kg; menos de, o aproximadamente, 4 mg/kg; menos de, o aproximadamente, 3 mg/kg; menos de, o aproximadamente, 2 mg/kg; menos de, o aproximadamente, 1 mg/kg, cada dos semanas. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 se administra en una dosis de 1 a 5 mg/kg cada dos semanas; 1 a 4 mg/kg cada dos semanas, 1 a 3 mg/kg cada dos semanas, o 1 a 2 mg/kg cada dos semanas. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 se administra, sola o en combinación (por ejemplo,en combinación con una molécula de anticuerpo anti-PD-L1) en una dosis de 1 a 5 mg/kg cada dos semanas; 1 a 4 mg/kg cada dos semanas, 1 a 3 mg/kg cada dos semanas, o 1 a 2 mg/kg cada dos semanas.

[0979] Las moléculas de anticuerpo pueden administrarse por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la ruta/modo de administración preferente es la inyección o infusión intravenosa. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede administrarse mediante infusión intravenosa a una tasa de más de 20 mg/min,por ejemplo,20-40 mg/min, y típicamente mayor o igual a 40 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 35 a 440 mg/m<2>, típicamente de aproximadamente 70 a 310 mg/m<2>, y más típicamente, de aproximadamente 110 a 130 mg/m<2>. En realizaciones, la tasa de infusión de aproximadamente 110 a 130 mg/m<2>logra un nivel de aproximadamente 3 mg/kg. En otras realizaciones, la molécula de anticuerpo puede administrarse mediante infusión intravenosa a una tasa menor a 10 mg/min,por ejemplo, menor o igual a 5 mg/min, para alcanzar una dosis de aproximadamente 100 mg/m<2>, por ejemplo, de aproximadamente 50 mg/m<2>, de aproximadamente 7 a 2525 mg/m<2>, o de aproximadamente 1010 mg/m<2>. En algunas realizaciones, el anticuerpo se infunde durante un periodo de aproximadamente 30 min. La molécula de anticuerpo puede administrarse mediante infusión intravenosa a una tasa menor a 10 mg/min, preferentemente menor o igual a 5 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m<2>, preferentemente de aproximadamente 5 a 50 mg/m<2>, de aproximadamente 7 a 25 mg/m<2>, y más preferentemente, de aproximadamente 10 mg/m<2>. Cabe señalar que los valores de dosificación pueden variar según el tipo y la gravedad de la afección que se desea aliviar. Debe entenderse además que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación establecidos en el presente documento son sólo ejemplares y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada.

[0980] Ejemplos

[0981] La invención se describe además en detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan sólo con fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos a menos que se especifique lo contrario. Por lo tanto, la invención no debe interpretarse de ninguna manera como limitada a los siguientes ejemplos, sino más bien, debe interpretarse para abarcar cualquier y todas las variaciones que se hacen evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en este documento.

[0982] Ejemplo 1: Eficacia de la terapia combinada de CART de MSLN e inhibidor de PD-L1 en cáncer de páncreas

[0983] La actividad antitumoral de la terapia CART de mesotelina en combinación con anticuerpos PD-L1 se evaluó en un modelo de ratón de cáncer de páncreas, PANC02.03. Estudios previos con terapia CAR de mesotelina en el modelo de ratón PANC02.03 demostraron que las células T CAR de mesotelina se expandían y se infiltraban en los tumores. El análisis de estas células T CAR infiltrantes de tumores mediante citometría de flujo reveló la expresión de PD-1 (véase la Figura 1A) y PD-L1. Además, las células cancerosas PAN02.03 expresaron PD-L1 y PD-L2 cuando se probaron tanto in vitro como in vivo (ver Figura 1B).

[0984] En un experimento posterior para probar la sinergia entre las células T CAR de mesotelina y la inhibición de PDL1, se implantaron por vía subcutánea 5x10<6>células tumorales pancreáticas PANC02.03 en el flanco de ratones NSG inmunocomprometidos. Los ratones PANC02.03 fueron tratados con terapia CART sola, terapia PD-L1 sola o la combinación de terapia CART e inhibidor PD-L1. El efecto del orden de administración de la terapia con inhibidores de PD-L1 con respecto a la terapia CART sobre la actividad antitumoral se evaluó con los experimentos descritos a continuación.

[0985] Tratamiento con Anticuerpos antes de la Terapia CART

[0986] Se modificaron genéticamente células T para expresar el constructo CAR de mesotelina (por ejemplo, SEC ID NO: 67 en la Tabla 2) mediante transducción lentiviral. Las células T CAR de control se modificaron genéticamente para expresar una CAR CD19. Los ratones se dividieron en 9 grupos y se trataron de acuerdo con la dosificación y el esquema de tratamiento que se indican a continuación. Se inyectaron por vía intravenosa dos dosis de 4x10<6>células CART los días 23 y 28 después de la implantación del tumor. El anticuerpo PD-L1 se inyectó por vía intraperitoneal el día 21 después de la implantación del tumor, es decir, 48 horas antes de la terapia CART.

[0987] Tabla 7.

[0989]

[0992] Los ratones fueron pesados y calibrados dos veces por semana antes de la dosificación con el tratamiento para monitorizar el crecimiento tumoral. Después de la dosificación, los ratones fueron calibrados dos veces por semana. Al final del estudio, se recogerá médula ósea (MO), tumor y bazo para el análisis de FAC.

[0993] Los resultados mostrados en la Figura 2 muestran que la terapia combinada de mesoCART e inhibidor de PD-L1 mostró una regresión tumoral transitoria seguida de estasis tumoral. El tratamiento combinado demostró ser más eficaz para inhibir la progresión tumoral que el tratamiento con mesoCART solo. El tratamiento con CD19 CART solo, o en combinación e inhibidor de PD-L1 no tuvo efecto sobre la progresión tumoral.

[0994] Tratamiento con Anticuerpos Después de la Terapia CART

[0995] En el siguiente experimento, se administró terapia con inhibidor de PD-L1 después de la terapia con CART de mesotelina. Se administraron 4x10<6>células CART M5 21 días después de la implantación del tumor. Los anticuerpos PD-1 o PD-L1 se administraron por vía i.v. a una dosis de 10 mg/kg semanales, administrándose la primera dosis 24 horas después de la administración de CART.

[0996] Los resultados del tratamiento sobre la progresión tumoral se muestran en la Figura 3. La combinación de la terapia CART M5 con el tratamiento con anticuerpos PD-L1 sólo mostró una actividad antitumoral mínima y transitoria.

[0997] En conjunto, los datos de los dos experimentos muestran que la administración del inhibidor de PD-L1 antes de administrar la terapia CART tiene un efecto antitumoral más robusto.

[0998] Ejemplo 2: Expresión de PD-L1 en pacientes con cáncer

[0999] Se realizaron análisis adicionales para caracterizar mejor los tumores PANC02.03 de ratones NSG que fueron tratados con 4x10<6>células T CAR positivas para mesotelina M5. Se obtuvieron muestras de tumores PANC02.03 a los 35 días de ratones tratados con CART de mesotelina M5. Se prepararon las muestras tumorales y se tiñeron secciones seriadas para analizar la expresión de mesotelina y PD-L1 en los tumores, así como la infiltración de CART y la apoptosis. Se utilizaron un anticuerpo de mesotelina, un anticuerpo anti-PD-L1 (#SP263, Ventana Medical Systems, Tuscon, AZ), un anticuerpo anti-CD3 humano (#2GV6, Vetana Medical Systems) y un anticuerpo anti-CC3 (marcador de apoptosis) (#9661, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) para la tinción inmunohistoquímica, por ejemplo, utilizando técnicas inmunohistoquímicas conocidas en la técnica. También se realizó hibdridaciónn situpara ARNm de mesotelina (#413101, ACDBio, Hayward, CA).

[1000] La Figura 4 muestra la expresión de mesotelina y la expresión de PD-L1 en el tumor. El tumor tiene regiones de alta tinción de PD-L1 que parecen estar inversamente correlacionadas con los niveles de expresión de la proteína mesotelina. La Figura 5 muestra la infiltración de células T CAR (muestra teñida con CD3, panel superior izquierdo), la apoptosis (muestra teñida con CC3, panel inferior izquierdo), la expresión de PD-L1 (panel superior derecho) y la expresión de ARNm de mesotelina (panel inferior derecho). Los resultados de este análisis de expresión muestran que la expresión de PD-L1 es alta en regiones tumorales con baja expresión de proteína mesotelina y ARNm (Fig. 4) y, sin embargo, alta infiltración de células T CAR (Fig. 5). Estas células con alta expresión de PD-L1 y baja expresión de mesotelina se caracterizan por una morfología fusiforme o mesenquimal y probablemente han surgido a través de una transformación epitelial mesenquimal. Este procedimiento está bien descrito en los tumores pancreáticos y probablemente contribuye al microambiente tumoral inmunosupresor y a la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, estos resultados sugieren que un tratamiento combinado que utilice un CART de mesotelina y un inhibidor de PD-L1 podría producir un efecto sinérgico que potencie la eficacia en los tumores que expresan mesotelina, en los que el CART de mesotelina se direcciona a las células tumorales que expresan mesotelina y las elimina, mientras que el inhibidor de PD-L1 inhibe las señales inmunosupresoras de, por ejemplo, las células cancerosas y las células del estroma tumoral.

[1001] Ejemplo 3: La dosis baja de RAD001 estimula la proliferación de CART en un modelo de cultivo celular

[1003] El efecto de dosis bajas de RAD001 sobre la proliferación de células T CAR in vitro se evaluó mediante cocultivo de células que expresan CART con células objetivo en presencia de diferentes concentraciones de RAD001. Materiales y Procedimientos

[1004] Generación de células T transducidas por CAR

[1005] Se utilizó un vector de transferencia lentiviral CAR humanizado anti-CD19 humano, (huCART19) para producir el material genómico empaquetado en partículas lentivirales pseudotipadas VSVg. La secuencia de aminoácidos y nucleótidos del CAR humanizado anti-CD19 humano (huCART19) es CAR 1, ID 104875 descrito en Publicación PCT, WO2014/153270, presentada el 15 de Marzo de 2014, y se designa SEC ID NOs..85 y 31 en la misma.

[1006] El ADN del vector de transferencia lentiviral se mezcla con los tres componentes de empaquetamiento VSVg env, gag/pol y rev en combinación con el reactivo lipofectamina para transfectar células Lenti-X 293T. El medio se cambia después de 24h y 30h después, el medio que contiene virus se recoge, se filtra y se almacena a -80°C. Los CART se generan por transducción de células T vírgenes frescas o congeladas obtenidas por selección magnética negativa de sangre de donante sano o leucopak. Las células T se activan mediante incubación con perlas anti-CD3/anti-CD28 durante 24h, después de lo cual se añade a los cultivos sobrenadante viral o virus concentrado (MOI=2 o 10, respectivamente). Las células T modificadas se dejan expandir durante aproximadamente 10 días. El porcentaje de células transducidas (que expresan CAR en la superficie celular) y el nivel de expresión de CAR (intensidad de fluorescencia relativa, Geo Mean) se determinan mediante análisis de citometría de flujo entre los días 7 y 9. La combinación de la ralentización de la tasa de crecimiento y el tamaño de las células T que se aproxima a ~350 fL determina el estado de las células T que deben criopreservarse para su posterior análisis.

[1007] Evaluación de la proliferación de CART

[1008] Para evaluar la funcionalidad de los CART, las células T se descongelan y se cuentan, y la viabilidad se evalúa mediante Cellometer. El número de células CAR-positivas en cada cultivo se normaliza utilizando células T no transducidas (UTD). El impacto de RAD001 en los CART se probó en titulaciones con RAD001, comenzando a 50nM. La línea celular objetivo utilizada en todos los experimentos de cocultivo es Nalm-6, una línea celular humana de leucemia linfoblástica aguda (ALL) de células pre-B que expresa CD19 y está transducida para expresar luciferasa.

[1009] Para medir la proliferación de los CART, se cultivan células T con células objetivo en una proporción de 1:1. El ensayo se ejecuta durante 4 días, cuando las células se tiñen para determinar la expresión de CD3, CD4, CD8 y CAR. El número de células T se evalúa mediante citometría de flujo utilizando perlas de recuento como referencia.

[1010] Resultados

[1011] La capacidad proliferativa de las células CART se probó en un ensayo de cocultivo de 4 días. Se evaluó el número de células T CD3 positivas CAR positivas (barras oscuras) y el total de células T CD3 positivas (barras claras) después de cultivar las células T transducidas y no transducidas con CAR con Nalm-6 (Fig. 6). Las células huCART19 se expandieron cuando se cultivaron en presencia de menos de 0,016 nM de RAD001, y en menor medida a concentraciones superiores del compuesto. Es importante destacar que tanto a 0,0032 como a 0,016 nM de RAD001 la proliferación fue superior a la observada sin la adición de RAD001. Las células T no transducidas (UTD) no mostraron una expansión detectable.

[1012] Ejemplo 4: Una dosis baja de RAD001 estimula la expansión de CART in vivo.

[1013] Este ejemplo evalúa la capacidad de las células huCAR19 para proliferarin vivocon diferentes concentraciones de RAD001.

[1014] Materiales y Procedimientos:

[1015] Células NALM6-luc:La línea celular NALM6 de leucemia linfoblástica aguda (ALL) humana se desarrolló a partir de sangre periférica de un paciente con ALL en recaída. Luego, las células se etiquetaron con luciferasa de luciérnaga. Estas células en suspensión crecen en RPMI suplementado con un 10% de suero fetal bovino inactivado por calor.

[1016] Ratones:Se recibieron ratones NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) de 6 semanas de edad del Laboratorío Jackson (número de stock 005557).

[1017] Implantación del tumor:Las células NALM6-luc se cultivaron y expandieronin vitroen RPMI suplementado con un 10% de suero fetal bovino inactivado por calor. Luego, las células se transfirieron a un tubo cónico de 15 ml y se lavaron dos veces con PBS estéril frío. Luego, se contaron las células NALM6-luc y se resuspendieron a una concentración de 10x10<6>células por mililitro de PBS. Las células se colocaron en hielo y se implantaron inmediatamente (en menos de una hora) en los ratones. Se inyectaron células NALM6-luc por vía intravenosa a través de la vena de la cola en un volumen de 100 µl, para un total de 1x10<6>células por ratón.

[1018] Dosificación de células T CAR:A los ratones se les administraron 5x10<6>células T CAR 7 días después de la implantación del tumor. Las células se descongelaron parcialmente en un baño de agua a 37 grados Celsius y, luego, se descongelaron completamente añadiendo 1 ml de PBS estéril frío al tubo que contenía las células. Las células descongeladas se transfirieron a un tubo falcon de 15 ml y se ajustaron a un volumen final de 10 ml con PBS. Las células se lavaron dos veces a 1000rpm durante 10 minutos cada vez y luego se contaron en un hemocitómetro. Luego, las células T se resuspendieron a una concentración de 50x10<6>células T CAR por ml de PBS frío y se mantuvieron en hielo hasta que se administró la dosis a los ratones. Los ratones fueron inyectados por vía intravenosa a través de la vena de la cola con 100 µl de las células T CAR para una dosis de 5x10<6>células T CAR por ratón. Se trataron ocho ratones por grupo con 100 µl de PBS solo (PBS) o con células T CAR CD19 humanizadas.

[1019] Dosificación de RAD001:Se formuló una microemulsión concentrada de 50 mg equivalente a 1 mg de RAD001, que luego se resuspendió en D5W (dextrosa 5% en agua) en el momento de la dosificación. A los ratones se les administró diariamente por vía oral (mediante sonda oral) 200 µl de las dosis deseadas de RAD001.Análisis PK:Los ratones recibieron dosis diarias de RAD001 a partir de 7 días después de la implantación del tumor. Los grupos de dosificación fueron los siguientes: 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg y 10 mg/kg. A los ratones se les extrajo sangre en los días 0 y 14, tras la primera y la última dosis de RAD001, en los siguientes puntos temporales para el análisis PK: 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas y 24 horas. Resultados:

[1020] Se probó la expansión y farmacocinética de RAD001 en ratones NSG con tumores NALM6-luc. La dosificación oral diaria de RAD001 sola no tuvo impacto en el crecimiento de los tumores NALM6-luc (Figura 7). El análisis farmacocinético de RAD001 muestra que es relativamente estable en la sangre de ratones portadores de tumores (Figuras 8A y 8B). Tanto los análisis PK del día 0 como el del día 14 muestran que las concentraciones de RAD001 en sangre son superiores a 10 nm incluso 24 horas después de la dosificación a la dosis más baja probada (0,3 mg/kg).

[1021] En base a estas dosis, se administraron células T CAR huCAR19 con y sin RAD001 para determinar la capacidad proliferativa de estas células. La dosis más alta utilizada fue de 3 mg/kg en base a los niveles de RAD001 en sangre 24 horas después de la dosificación. Como la concentración de RAD001 era superior a 10nM 24 horas después de la dosis final de RAD001, se utilizaron varias dosis más bajas de RAD001 en el estudioin vivocon células T CAR. Las células T CAR se administraron por vía intravenosa un día antes del inicio de la dosis oral diaria de RAD001. Los ratones fueron monitorizados mediante FACS para la expansión de células T.

[1022] Las dosis más bajas de RAD001 muestran una mayor proliferación de las células T CAR (Figuras 9A y 9B). Esta mayor proliferación es más evidente y prolongada con las células T CAR CD4<+>que con las células T CAR CD8<+>. Sin embargo, con las células T CAR CD8<+>, puede observarse una mayor proliferación en los primeros puntos temporales tras la dosis de células T CAR. En algunas realizaciones, una célula CART de ARN también puede utilizarse en combinación con inhibidores de puntos de control.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende células T o NK para su uso en combinación con un inhibidor de PD-L1 en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de mesotelina en un sujeto, en la que:

(i) las células T o NK expresan un receptor antigénico quimérico (CAR), en la que el CAR comprende un dominio de unión a mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular, y

(ii) el inhibidor de PD-L1 comprende una molécula de anticuerpo anti-PD-L1, en la que el procedimiento comprende administrar una primera dosis de la composición que comprende las células T o NK aproximadamente 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días o 2 semanas después de administrar una primera dosis del inhibidor de PD-L1.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la primera dosis de la composición que comprende las células T o NK se administra después de la administración de la primera dosis del inhibidor de PD-L1 pero antes de la administración de una segunda dosis del inhibidor de PD-L1.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la primera dosis de la composición que comprende las células T o NK:

(i) comprende al menos aproximadamente 1-3 x 10<7>a 1-3 x10<8>de las células T o NK;

(ii) es de aproximadamente 1-3 x10<7>células T o NK; o

(iii) es de aproximadamente 1-3 x10<8>células T o NK.

4. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el inhibidor de PD-L1:

i) es una molécula de anticuerpo seleccionada del grupo que consiste enYW243.55.S70, MPDL3280A (atezolizumab), MEDI-4736, MSB-0010718C (avelumab), MDX-1105, BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum010, BAP058-hum011, BAP058-hum012, BAP058-hum013, BAP058-hum014, BAP058-hum015, BAP058-hum016, BAP058-hum017, BAP058-Clone K, BAP058-Clone L, BAP058-Clone M, BAP058-Clone N y BAP058-Clone O.

5. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el inhibidor de PD-L1 comprende una molécula de anticuerpo anti-PD-L1 que comprende:

(a)

i) una secuencia de aminoácidos HC CDR1 de SEC ID NO: 287, 290 o 195, una secuencia de aminoácidos HC CDR2 de SEC ID NO: 288, y una secuencia de aminoácidos HC CDR3 de SEC ID NO: 289; y

ii) una secuencia de aminoácidos LC CDR1 de SEC ID NO: 295, una secuencia de aminoácidos LC CDR2 de SEC ID NO: 296, y una secuencia de aminoácidos LC CDR3 de SEC ID NO: 297; o (b)

i) una secuencia de aminoácidos HC CDR1 de SEC ID NO: 287, 290 o 195, una secuencia de aminoácidos HC CDR2 de SEC ID NO: 291, y una secuencia de aminoácidos HC CDR3 de SEC ID NO: 292; y

ii) una secuencia de aminoácidos LC CDR1 de SEC ID NO: 298, una secuencia de aminoácidos LC CDR2 de SEC ID NO: 299, y una secuencia de aminoácidos LC CDR3 de SEC ID NO: 300.

6.La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la molécula de anticuerpo anti-PD-L1 comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende:

i) la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 304, 316, 324, 332, 336, 340, 348, 356 y 364;

ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones, pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de

cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 304, 316, 324, 332, 336, 340, 348, 356 y 364; o

iii) una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 304, 316, 324, 332, 336, 340, 348, 356 y 364;

(b) una cadena pesada que comprende:

i) la secuencia de aminoácidos de cualquier cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 306, 318, 326, 334, 338, 342, 350, 358, 366, 393, 377 y 382;

ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones en cualquier cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 306, 318, 326, 334, 338, 342, 350, 358, 366, 393, 377 y 382; o

iii) una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de cualquier cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 306, 318, 326, 334, 338, 342, 350, 358, 366, 393, 377 y 382;

(c) una región variable de cadena ligera que comprende:

i) la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 308, 312, 320, 328, 344, 352, 360, 368 y 372;

ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones, pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 308, 312, 320, 328, 344, 352, 360, 368 y 372; o

iii) una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 308, 312, 320, 328, 344, 352, 360, 368 y 372; y/o

(d) una cadena ligera que comprende

i) la secuencia de aminoácidos de cualquier cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 310, 314, 322, 330, 346, 354, 362, 370 y 374;

ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones, pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de cualquier cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 310, 314, 322, 330, 346, 354, 362, 370 y 374; o

iii) una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de cualquier cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 310, 314, 322, 330, 346, 354, 362, 370 y 374.

7. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en la que la molécula de anticuerpo anti PD-L1 comprende:

i) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 304 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 308;

ii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 304 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 312;

iii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 304 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 372;

iv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 316 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 320;

v) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 316 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 352;

vi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 324 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 328;

vii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 324 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 360;

viii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 332 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 328;

ix) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 336 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 328;

x) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 336 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 308;

xi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 336 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 372;

xii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 340 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 344;

xiii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 340 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 372;

xiv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 348 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 352;

xv) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 348 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 386;

xvi) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 356 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 352; o

xvii) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 78 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 368.

8. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en la que la molécula de anticuerpo anti PD-L1 comprende:

i) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 306 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 310;

ii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 306 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 214;

iii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 306 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 374;

iv) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 318 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 322;

v) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 318 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 354;

vi) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 326 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 330;

vii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 326 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 362;

viii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 334 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 330;

ix) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 338 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 330;

x) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 338 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 310;

xi) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 338 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 374;

xii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 342 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 346;

xiii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 342 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 374;

xiv) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 350 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 354;

xv) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 350 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 374;

xvi) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 358 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 354;

xvii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 366 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 370;

xviii) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 393 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 322;

xix) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 91 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 330; o

xx) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 382 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 354.

9. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el dominio de unión a mesotelina comprende:

una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1), una región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2), y una región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de un scFv de una cualquiera de SEC ID NOs: 39-62; y

una región determinante de complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1), una región determinante de complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2), y una región determinante de complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de un scFv de una cualquiera de SEC ID NOs: 39-62.

10. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el dominio de unión a mesotelina comprende:

(a) una región variable de cadena pesada que comprende

i) la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena pesada de un dominio de unión a mesotelina de un scFv de una cualquiera de SEC ID NOs: 39-62;

ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena pesada de un dominio de unión a mesotelina de un scFv de una cualquiera de SEC ID NOs: 39-62; o

iii) una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena pesada de un dominio de unión a mesotelina de un scFv de una cualquiera de SEC ID NOs: 39-62; y/o

(b) una región variable de cadena ligera que comprende:

i) la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera de un dominio de unión a mesotelina de un scFv de una cualquiera de SEC ID NOs: 39-62;

ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones, pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera de un dominio de unión a mesotelina de un scFv de una cualquiera de SEC ID NOs: 39-62; o

iii) una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera de un dominio de unión a mesotelina de un scFv de una cualquiera de SEC ID NOs: 39-62.

11. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el dominio de unión a mesotelina comprende:

i) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 275, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 48, SEC ID NO: 50, SEC ID NO: 51, SEC ID NO: 52, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 54, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 56, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61, o SEC ID NO: 62;

ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones con respecto a cualquiera de SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 275, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 48, SEC ID NO: 50, SEC ID NO: 51, SEC ID NO: 52, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 54, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 56, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61, o SEC ID NO: 62; o

iii) una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 43, SEC ID NO: 49, SEC ID NO: 275, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 42, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 47, SEC ID NO: 48, SEC ID NO: 50, SEC ID NO: 51, SEC ID NO: 52, SEC ID NO: 53, SEC ID NO: 54, SEC ID NO: 55, SEC ID NO: 56, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 58, SEC ID NO: 59, SEC ID NO: 60, SEC ID NO: 61, o SEC ID NO: 62.

12. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el dominio transmembrana comprende:

(a) un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CDS, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154;

(b) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6;

(c) una secuencia de aminoácidos comprende al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:6; o

(d) una secuencia con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:6.

13. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización coestimulador, en el que el dominio coestimulador comprende:

(i) un dominio de señalización funcional obtenido a partir de una proteína seleccionada del grupo que consiste en una molécula MHC de clase I, una proteína receptora de TNF, una proteína similar a la inmunoglobulina, un receptor de citoquina, una integrina, una molécula de activación linfocítica de señalización (proteína SLAM), un receptor activador de células NK, BTLA, un receptor de ligando Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11 a, LFA-1, ITGAM, CD1 lb, ITGAX, CD11 c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83;

(ii) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7; o

(iii) una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7.

14. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el dominio de señalización intracelular comprende:

(i) un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta; (ii) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9 o SEC ID NO: 10;

(iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:7 y/o de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:9 o de la SEC ID NO: 10;

(iv) una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7 y/o la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9 o SEC ID NO: 10; o

(v) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:9 o SEC ID NO: 10, en la que las secuencias de aminoácidos que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica.

15. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el CAR comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NO: 67; SEC ID NO: 73, SEC ID NO: 278, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 64, SEC ID NO: 65, SEC ID NO: 66, SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 70, SEC ID NO: 71, SEC ID NO: 72, SEC ID NO: 74, SEC ID NO: 75, SEC ID NO: 76, SEC ID NO: 77, SEC ID NO: 78, SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 80, SEC ID NO: 81, SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 83, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 85, o SEC ID NO: 86;

(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones, pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones con respecto a cualquiera de SEC ID NO: 67, SEC ID NO: 73, SEC ID NO: 278, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 64, SEC ID NO: 65, SEC ID NO: 66, SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 70, SEC ID NO: 71, SEC ID NO: 72, SEC ID NO: 74, SEC ID NO: 75, SEC ID NO: 76, SEC ID NO: 77, SEC ID NO: 78, SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 80, SEC ID NO: 81, SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 83, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 85, o SEC ID NO: 86; o

(iii) una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad a cualquiera de SEC ID NO: 67; SEC ID NO: 73, SEC ID NO: 278, SEC ID NO: 63, SEC ID NO: 64, SEC ID NO: 65, SEC ID NO: 66, SEC ID NO: 68, SEC ID NO: 69, SEC ID NO: 70, SEC ID NO: 71, SEC ID NO: 72, SEC ID NO: 74, SEC ID NO: 75, SEC ID NO: 76, SEC ID NO: 77, SEC ID NO: 78, SEC ID NO: 79, SEC ID NO: 80, SEC ID NO: 81, SEC ID NO: 82, SEC ID NO: 83, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 85, o SEC ID NO: 86.

16. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la célula T es una célula T autóloga o alogénica.

17. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que (i) la enfermedad asociada con la expresión de mesotelina es un cáncer, opcionalmente en la que el cáncer se elige entre uno o más de los siguientes: mesotelioma, mesotelioma pleural maligno, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células escamosas o cáncer de pulmón de células grandes, cáncer de páncreas, adenocarcinoma ductal pancreático, metastásico pancreático, cáncer de ovario o cáncer colorrectal y cáncer de vejiga, o una metástasis de los mismos;

(ii) el sujeto expresa PD-L2; y/o

(iii) una célula cancerosa o una célula en estrecha proximidad a una célula cancerosa del sujeto expresa PD-L1 y/o PD-L2.