ES3058033T3 - Long-acting adrenomedullin derivatives - Google Patents

Long-acting adrenomedullin derivatives

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ES3058033T3
ES3058033T3 ES15765038T ES15765038T ES3058033T3 ES 3058033 T3 ES3058033 T3 ES 3058033T3 ES 15765038 T ES15765038 T ES 15765038T ES 15765038 T ES15765038 T ES 15765038T ES 3058033 T3 ES3058033 T3 ES 3058033T3
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Kazuo Kitamura
Johji Kato
Keishi Kubo
Kenji Kuwasako
Shigeru Kubo
Kumiko Kumagaye
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University of Miyazaki NUC
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Abstract

Se proporciona un nuevo derivado de adrenomedulina capaz de actuar de forma persistente durante un período más prolongado que la adrenomedulina natural. La presente invención se refiere a un compuesto representado por la fórmula (I): A-Ln-B (I) (en la fórmula, A es un grupo modificador seleccionado del grupo que consiste en un grupo palmitoílo y un grupo polietilenglicol, L es un grupo de enlace divalente, n es un número entero de 0 o 1, y B es una porción peptídica derivada de adrenomedulina o una forma modificada de la misma con actividad adrenomedulina, donde la porción peptídica B está unida, a través de su grupo amino N-terminal, al grupo de enlace L o al grupo modificador A), o una sal del mismo, o un hidrato de estos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Derivados de adrenomedulina de acción prolongada
[0003] Campo técnico
[0004] La invención se refiere a derivados de adrenomedulina de acción prolongada.
[0005] Técnica anterior
[0006] La adrenomedulina, en lo sucesivo en el presente documento también denominada "AM", es un péptido bioactivo que se aisló y se identificó a partir de un feocromocitoma en 1993 (Bibliografía no relacionada con patentes 1). Al inicio del descubrimiento, se encontró que la AM ejercía un potente efecto vasodilatador e hipotensor. Por ejemplo, la Bibliografía no relacionada con patentes 1 describe un péptido que tiene efecto hipotensor que comprende la secuencia de aminoácidos de la AM humana.
[0007] Estudios posteriores revelaron que la AM ejerce diversos efectos farmacológicos, tales como un efecto de protección cardiovascular, un efecto antiinflamatorio, un efecto angiogénico y un efecto promotor de la reparación tisular. Con el fin de aplicar los efectos farmacológicos de la AM al tratamiento de enfermedades, se ha intentado la administración de AM a pacientes con diferentes enfermedades. Se espera que la AM sea útil como agente terapéutico para enfermedades inflamatorias intestinales, hipertensión pulmonar, vasculopatías periféricas o infarto agudo de miocardio, entre otras.
[0008] Por ejemplo, la Bibliografía de patente 2 describe un agente para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias intestinales no bacterianas, en donde el agente comprende, como principio activo, adrenomedulina o un derivado de la misma con actividad para suprimir la inflamación no bacteriana, o una sal de la misma con actividad para suprimir la inflamación no bacteriana.
[0009] La Bibliografía de patente 3 describe un método para prevenir o tratar una enfermedad inflamatoria intestinal para la cual el uso de una formulación de esteroides, un inmunosupresor o una formulación biológica resulta difícil o insuficientemente eficaz en un paciente que necesita la prevención o el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad eficaz de adrenomedulina, una forma modificada de la misma con actividad para suprimir la inflamación, o una sal de la adrenomedulina o la forma modificada con actividad para suprimir la inflamación.
[0010] Los estudios de la relación estructura-actividad de la AM han avanzado en la identificación de secuencias esenciales que pueden contribuir a la bioactividad de la AM (Bibliografías no relacionadas con patentes 2 a 9).
[0011] Lista de citas
[0012] Bibliografía de patentes
[0013] Bibliografía de patente 1: Patente JP N.º 2774769
[0014] Bibliografía de patente 2: Patente JP N.º 4830093
[0015] Bibliografía de patente 3: WO 2012/096411
[0016] Bibliografía no relacionada con patentes
[0017] Bibliografía no relacionada con patentes 1: Kitamura K, Kangawa K, Kawamoto M, Ichiki Y, Nakamura S, Matsuo H, Eto T. Adrenomedullin: a novel hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma. Biochem Biophys Res Commun, 30 de abril de 1993, Volumen 192, Edición 2, págs. 553-560
[0018] Bibliografía no relacionada con patentes 2: Belloni, A.S. et al., Structure-activity relationships of adrenomedullin in the adrenal gland. Endocr Res, 1998, Volumen 24, Edición 3-4, págs. 729-30.
[0019] Bibliografía no relacionada con patentes 3: Champion, H.C. et al., Catecholamine release mediates pressor effects of adrenomedullin-(15-22) in the rat. Hypertension, 1996, Volumen 28, Edición 6, pág. 10416.
[0020] Bibliografía no relacionada con patentes 4: Champion, H.C., G.G. Nussdorfer y P.J. Kadowitz, Structureactivity relationships of adrenomedullin in the circulation and adrenal gland. Regul Pept, 1999, Volumen 85, Edición 1, págs. 1-8.
[0021] Bibliografía no relacionada con patentes 5: Eguchi, S. et al., Structure-activity relationship of adrenomedullin, a novel vasodilatory peptide, in cultured rat vascular smooth muscle cells. Endocrinology, 1994, Volumen 135, Edición 6, págs. 2454-8.
[0022] Bibliografía no relacionada con patentes 6: Garcia, M.A, et al., Synthesis, biological evaluation, and threedimensional quantitative structure-activity relationship study of small-molecule positive modulators of adrenomedullin. J Med Chem, 2005, Volumen 48, Edición 12, págs. 4068-75.
[0023] Bibliografía no relacionada con patentes 7: Mitsuda, Y. et al., Large-scale production of functional human adrenomedullin: expression, cleavage, amidation, and purification. Protein Expr Purif, 2002, Volumen 25, Edición 3, págs. 448-55.
[0024] Bibliografía no relacionada con patentes 8: Roldos, V. et al., Small-molecule negative modulators of adrenomedullin: design, synthesis, and 3D-QSAR study. ChemMedChem, 2008, Volumen 3, Edición 9, págs.1345-55.
[0025] Bibliografía no relacionada con patentes 9: Watanabe, T.X. et al., Vasopressor activities of N-terminal fragments of adrenomedullin in anesthetized rat. Biochem Biophys Res Commun, 1996, Volumen 219, Edición 1, págs.59-63. Sumario de la invención
[0026] Problema técnico
[0027] La adrenomedulina es un compuesto con diversos efectos farmacológicos. Se espera que un medicamento que comprenda adrenomedulina como principio activo se aplique a la prevención o el tratamiento de diversas enfermedades. Sin embargo, la adrenomedulina es un péptido. Generalmente, se sabe que los péptidos tienen una semivida corta debido a su metabolismo en seres vivos, tal como en la sangre. Esto puede provocar una duración de acción muy corta del medicamento que comprende adrenomedulina como principio activo en los sujetos, por ejemplo, pacientes humanos. Por lo tanto, existe margen para futuras mejoras en el uso de la adrenomedulina como medicamento.
[0028] La invención, por lo tanto, pretende proporcionar un derivado de adrenomedulina novedoso capaz de actuar de forma sostenida durante un período más prolongado que la adrenomedulina natural.
[0029] Solución al problema
[0030] Los presentes inventores han encontrado, como resultado de diversas investigaciones para resolver los problemas descritos anteriormente, que la modificación química del grupo amino del extremo N de la adrenomedulina natural con un grupo modificador específico puede prolongar la semivida sanguínea de la adrenomedulina modificada en comparación con la adrenomedulina natural, conservando al mismo tiempo la bioactividad de la adrenomedulina natural. Los presentes inventores han logrado la invención basándose en el hallazgo descrito anteriormente.
[0031] Es decir, un resumen de la invención es el siguiente:
[0032] (1) Un compuesto representado por la fórmula (I):
[0033] A-L<n>-B (I)
[0034] en donde
[0035] A es un grupo modificador que es un grupo polietilenglicol,
[0036] L es un grupo de unión divalente,
[0037] n es un número entero de 0 o 1, y
[0038] B es un resto peptídico procedente de la adrenomedulina o una forma modificada de la misma con la actividad de la adrenomedulina,
[0039] en donde el resto peptídico B está unido al grupo modificador A o el grupo de unión L a través del grupo amino del extremo N del resto peptídico B o una sal del mismo, o un hidrato del mismo,
[0040] en donde la adrenomedulina o la forma modificada de la misma es un péptido seleccionado del grupo que consiste en:
[0041] (a) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y que tiene un enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína en las posiciones 16 y 21;
[0042] (b) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y que tiene un enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína en las posiciones 16 y 21;
[0043] (c) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y que tiene un enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína en las posiciones 16 y 21;
[0044] (d) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y que tiene un enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína en las posiciones 16 y 21;
[0045] (g) un péptido en donde el enlace disulfuro en cualquiera de los péptidos de (a) a (d) está sustituido por un grupo etileno;
[0046] (h) un péptido en donde de 1 a 15 aminoácidos en cualquiera de los péptidos de (a) a (d) y (g) se eliminan, se sustituyen o se añaden; y
[0047] (i) un péptido en donde el extremo C de cualquiera de los péptidos de (a) a (d), (g) y (h).
[0048] (2) El compuesto de acuerdo con el punto (1), en donde el grupo amino del extremo N del resto peptídico es un grupo α-amino de un residuo de aminoácido del extremo N del resto peptídico B.
[0049] (3) Un método para producir el compuesto de acuerdo con el punto (1) o (2), que comprende una etapa de unión para unir un precursor del resto peptídico B procedente de adrenomedulina o una forma modificada de la misma, un precursor del grupo modificador A que es un grupo polietilenglicol, y un precursor del grupo divalente L<n>para formar el compuesto representado por la fórmula (I).
[0050] (4) Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con el punto (1) o (2) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.
[0051] (5) La composición farmacéutica de acuerdo con el punto (4) para su uso en la prevención o el tratamiento de una vasculopatía, una enfermedad inflamatoria o una vasculopatía periférica.
[0052] (6) El compuesto de acuerdo con el punto (1) o (2), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección, enfermedad y/o trastorno.
[0053] (7) El compuesto de acuerdo con el punto (6), en donde la afección, enfermedad y/o trastorno es una vasculopatía, una enfermedad inflamatoria o una vasculopatía periférica.
[0054] Efectos ventajosos de la invención
[0055] La invención puede proporcionar un derivado de adrenomedulina novedoso capaz de actuar de forma sostenible durante un período más prolongado que la adrenomedulina natural.
[0056] La presente memoria descriptiva incluye el contenido descrito en la memoria descriptiva y/o los dibujos de la Solicitud de Patente Japonesa N.º 2014-058225, sobre la que la presente solicitud reivindica prioridad.
[0057] Breve descripción de los dibujos
[0058] La figura 1 muestra las curvas de respuesta a la dosis de la concentración de Pal-h.AM (1-52), PEG5000-h.AM (1-52) o h.AM (1-52) frente al aumento de la concentración de cAMP.
[0059] La figura 2 muestra la relación entre el tiempo transcurrido desde el inicio de la administración de h.AM (1-52) y la concentración plasmática de AM.
[0060] La figura 3 muestra la relación entre el tiempo transcurrido desde el inicio de la administración de Pal-h.AM (1-52) y la concentración plasmática de AM.
[0061] La figura 4 muestra la relación entre el tiempo transcurrido desde el inicio de la administración de PEG5000-h.AM (1-5.2) y la concentración plasmática de AM.
[0062] La figura 5 muestra la relación entre el tiempo transcurrido desde el inicio de la administración de h.AM (1-52), Palh.AM (1-52) o PEG5000-h.AM (1-52) y la presión arterial promedio.
[0063] La figura 6 muestra las concentraciones plasmáticas de AM en el grupo control y en los grupos de administración de 0,02, 0,1 y 0,5 nmol/kg/h de PEG5000-h.AM (1-52).
[0064] La figura 7 muestra la relación entre el tiempo transcurrido desde el inicio de la administración de PEG5000 h.AM (1-52) y las puntuaciones totales en el grupo control y en cada grupo de administración.
[0065] La figura 8 muestra las longitudes del tubo intestinal en el grupo control y en los grupos de administración de 0,02, 0,1 y 0,5 nmol/kg/h de PEG5000-h.AM (1-52).
[0066] Descripción de realizaciones
[0067] <1. Derivado de adrenomedulina>
[0068] La invención se refiere a un compuesto representado por la fórmula (I):
[0069] A-L<n>-B (I)
[0070] una sal del mismo, o un hidrato del mismo. En la presente memoria descriptiva, el compuesto representado por la fórmula (I) puede describirse como "derivado de adrenomedulina".
[0071] En la invención, la adrenomedulina (AM) puede ser no solo un péptido procedente de ser humano, aislado e identificado a partir de un feocromocitoma humano. (SEQ ID NO: 1, Bibliografía no relacionada con patentes 1), sino también un péptido procedente de otros mamíferos no humanos, tales como animales de sangre caliente, que es un ortólogo, incluyendo, por ejemplo, cerdo (SEQ ID NO: 3), perro (SEQ ID NO: 5) o ganado vacuno (SEQ ID NO: 7). En un organismo vivo, cada uno de estos péptidos tiene un enlace disulfuro formado por dos residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos y está amidado en el extremo C del mismo. En la presente memoria descriptiva, el péptido que tiene un enlace disulfuro y un grupo amida del extremo C puede describirse como "adrenomedulina natural" o simplemente "adrenomedulina". La invención se puede aplicar a cualquiera de los péptidos descritos anteriormente. En la presente memoria descriptiva, "amidación en el extremo C" se refiere a un aspecto de la modificación postraduccional de un péptido en un organismo vivo, y específicamente se refiere a una reacción en la que el grupo carboxilo de la cadena principal del aminoácido del extremo C del péptido se convierte en un grupo amida. En la presente memoria descriptiva, "formación de un enlace disulfuro entre residuos de cisteína" o "formación de un enlace disulfuro por residuos de cisteína" se refiere a un aspecto de la modificación postraduccional del péptido en un organismo vivo, y específicamente se refiere a una reacción en la que dos residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos del péptido forman un enlace disulfuro (-S-S-). Muchos péptidos bioactivos producidos en un organismo vivo se biosintetizan inicialmente como una proteína precursora de mayor peso molecular. La proteína precursora experimenta modificaciones postraduccionales, tales como amidación en el extremo C y/o la formación de un enlace disulfuro por residuos de cisteína, durante el proceso de transporte intracelular para obtener un péptido bioactivo maduro. La amidación en el extremo C típicamente tiene lugar mediante una enzima de amidación del extremo C que actúa sobre la proteína precursora. Para un péptido bioactivo que tiene un grupo amida del extremo C, la proteína precursora tiene un residuo de Gly unido al grupo carboxilo del extremo C a amidar, y el residuo de Gly se convierte en el grupo amida del extremo C mediante la enzima de amidación del extremo C. El propéptido del extremo C de la proteína precursora presenta una secuencia repetida que comprende una combinación de residuos de aminoácidos básicos, tales como Lys-Arg o Arg-Arg (Mizuno, Journal of Japanese Biochemical Society, 61(12): 1435-1461 (1989)). La formación de enlaces disulfuro por residuos de cisteína puede tener lugar en condiciones oxidativas. En un organismo vivo, la formación de enlaces disulfuro por residuos de cisteína típicamente tiene lugar mediante una proteína disulfuro isomerasa que actúa sobre la proteína precursora.
[0072] La adrenomedulina, una sustancia bioactiva conocida, es un péptido. Esto puede provocar que un medicamento que comprenda adrenomedulina como principio activo actúe eficazmente en organismos vivos, en sujetos tales como pacientes humanos, solo durante un período de tiempo muy corto. La adrenomedulina también tiene un fuerte efecto vasodilatador. Este fuerte efecto vasodilatador puede causar reacciones secundarias no deseadas, tales como una disminución excesiva de la presión arterial, taquicardia asociada con un aumento de la actividad refleja del nervio simpático y/o un aumento de la actividad de la renina, cuando se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de adrenomedulina en una sola dosis. Para evitar generar los problemas descritos anteriormente, es necesario administrar un medicamento que comprenda adrenomedulina como principio activo a los sujetos mediante infusión intravenosa continua. Tal modo de administración puede suponer una carga excesiva para los sujetos.
[0073] Los presentes inventores han encontrado que un compuesto representado por la fórmula (I), un derivado de adrenomedulina, puede prolongar significativamente la semivida sanguínea en comparación con la adrenomedulina natural, manteniendo al mismo tiempo una bioactividad sustancialmente equivalente aproximadamente a la de la adrenomedulina natural. El compuesto de la invención representado por la fórmula (I), por lo tanto, se puede aplicar a una afección, enfermedad y/o trastorno que se pueda prevenir o tratar con adrenomedulina para prevenir o tratar de forma sostenible la afección, enfermedad y/o trastorno.
[0074] En la fórmula (I), B debe ser un resto peptídico procedente de la adrenomedulina o una forma modificada de la misma con la actividad de la adrenomedulina. En la invención, "una forma modificada de adrenomedulina" significa un péptido modificado químicamente a partir de la adrenomedulina natural, como se ha descrito anteriormente. En la invención, "actividad de la adrenomedulina" significa la bioactividad que posee la adrenomedulina. La actividad de la adrenomedulina puede incluir lo siguiente:
[0075] (1) Cardiovascular: un efecto vasodilatador, un efecto hipotensor, un efecto de aumento del gasto cardíaco o mejora de la insuficiencia cardíaca, un efecto de mejora de la hipertensión pulmonar, un efecto angiogénico, un efecto linfangiogénico, un efecto de mejora de la función endotelial vascular, un efecto antiarteriosclerótico, un efecto de protección miocárdica, tal como un efecto de protección miocárdica en el trastorno de reperfusión isquémica o la inflamación, un efecto de prevención del remodelado posmiocárdico, un efecto de supresión de la hipertrofia cardíaca y un efecto de supresión de la enzima convertidora de angiotensina.
[0076] (2) Riñón y sistema hidroelectrolítico: un efecto diurético, un efecto natriurético, un efecto de supresión de la hormona antidiurética, un efecto reductor de la aldosterona, un efecto renoprotector, tal como un efecto de protección miocárdica en la presión arterial alta o el trastorno de reperfusión isquémica, un efecto de supresión de la conducta relacionada con el consumo de alcohol, y un efecto de supresión de los requisitos de sal.
[0077] (3) Cerebro y sistema nervioso: un efecto neuroprotector y preventivo de la encefalopatía, un efecto antiinflamatorio, un efecto de supresión de la apoptosis, tal como un efecto de supresión de la apoptosis en el trastorno de reperfusión isquémica o la inflamación, un efecto de mantener la capacidad autorreguladora, y un efecto supresor del estrés oxidativo.
[0078] (4) Urogenital: un efecto de mejora de la erección, un efecto de mejora del flujo sanguíneo y un efecto promotor de la implantación.
[0079] (5) Sistema gastrointestinal: un efecto antiulceroso, un efecto de reparación tisular, un efecto de neogénesis de la membrana mucosa, un efecto de mejora del flujo sanguíneo, un efecto antiinflamatorio, y un efecto mejora de la función hepática.
[0080] (6) Ortopedia: un efecto de estimulación de los osteoblastos y un efecto de mejora de la artritis.
[0081] (7) Sistema metabólico endocrino: un efecto diferenciador de adipocitos, un efecto regulador de la lipólisis, un efecto de mejora de la sensibilidad a la insulina y un efecto de control de la secreción de insulina.
[0082] (8) Otros: un efecto de mejora de la circulación, un efecto antiinflamatorio, un efecto modulador de citocinas, un efecto protector orgánico, un efecto de supresión del estrés oxidativo, un efecto de reparación tisular, tal como un efecto antiescaras, un efecto mejora del choque séptico, un efecto supresor de la insuficiencia multiorgánica, y un efecto supresor de enfermedades autoinmunitarias.
[0083] El efecto hipotensor es preferentemente un efecto hipotensor vasodilatador. El efecto antiinflamatorio en el sistema gastrointestinal es preferentemente preventivo o terapéutico de enfermedades inflamatorias intestinales, incluyendo enfermedades inflamatorias intestinales resistentes o dependientes de esteroides, tales como colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn o enfermedad de Behçet del tubo intestinal. La actividad de la adrenomedulina se ejercerá mediante una mayor concentración de cAMP intracelular. Por lo tanto, el aumento de la concentración de cAMP intracelular se puede considerar un índice de la actividad de la adrenomedulina. El resto peptídico B procedente de adrenomedulina o una forma modificada de la misma que tiene la bioactividad descrita anteriormente, permite que el compuesto de la invención, representado por la fórmula (I), ejerza una bioactividad sustancialmente equivalente a la de la adrenomedulina natural, es decir, la actividad de la adrenomedulina.
[0084] La adrenomedulina, o una forma modificada de la misma, es un péptido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y que tiene un enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína en las posiciones 16 y 21;
[0085] (b) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3 y que tiene un enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína en las posiciones 16 y 21;
[0086] (c) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y que tiene un enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína en las posiciones 16 y 21;
[0087] (d) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y que tiene un enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína en las posiciones 16 y 21;
[0088] (g) un péptido en donde el enlace disulfuro de cualquiera de los péptidos de (a) a (d) está sustituido por un grupo etileno;
[0089] (h) un péptido en donde de 1 a 15 aminoácidos de cualquiera de los péptidos de (a) a (d) y (g) se eliminan, se sustituyen o se añaden; y
[0090] (i) un péptido en donde el extremo C de cualquiera de los péptidos de (a) a (d), (g) y (h) está amidado.
[0091] En el péptido de (h), el número de residuos de aminoácidos eliminados, sustituidos o añadidos varía preferentemente de 1 a 12, más preferentemente de 1 a 10, preferentemente además de 1 a 8, en especial, preferentemente de 1 a 5, y lo más preferentemente de 1 a 3. Un péptido adecuado de (h) es un péptido en donde los aminoácidos en las posiciones 1 a 15, las posiciones 1 a 12, las posiciones 1 a 10, las posiciones 1 a 8, las posiciones 1 a 5 o las posiciones 1 a 3 del extremo N de cualquiera de los péptidos de (a) a (g) se eliminan, y que tiene actividad de adrenomedulina. El péptido adecuado puede tener además una deleción, sustitución o adición de uno o más, por ejemplo, de 1 a 5, de 1 a 3 o de 1 o 2 aminoácidos. El péptido de (h) se puede usar para lograr una actividad de adrenomedulina de un compuesto representado por la fórmula (I) sustancialmente equivalente aproximadamente a la de la adrenomedulina natural. Además, el péptido de (h) se puede usar para ejercer de forma sostenible la actividad de adrenomedulina de un compuesto representado por la fórmula (I) en un organismo vivo.
[0092] En la fórmula (I), A debe ser un grupo modificador. Generalmente, un grupo modificador se selecciona del grupo que consiste en palmitoílo, polietilenglicol, miristoílo, azúcar y grupos peptídicos. De acuerdo con la presente invención, el grupo modificador es un grupo polietilenglicol.
[0093] El grupo polietilenglicol tiene preferentemente un peso molecular promedio que varía de 200 a 40.000, más preferentemente de 500 a 20.000 y más preferentemente además de 500 a 10.000. Un compuesto representado por la fórmula (I) puede ejercer la actividad de la adrenomedulina de forma sostenible durante un largo período de tiempo en un organismo vivo cuando el peso molecular promedio del grupo polietilenglicol es igual o superior a 200. El grupo amino del extremo N de la adrenomedulina, o una forma modificada de la misma, se modifica químicamente con el grupo modificador A para obtener una actividad de la adrenomedulina del compuesto representado por la fórmula (I) sustancialmente equivalente aproximadamente a la de la adrenomedulina natural. Un compuesto representado por la fórmula (I) también puede ejercer la actividad de la adrenomedulina de forma sostenible en un organismo vivo. En la fórmula (I), L debe ser un grupo de unión divalente. El grupo de unión divalente L es preferentemente un grupo hidrocarburo divalente sustituido o sin sustituir, más preferentemente un grupo hidrocarburo alifático divalente sustituido o sin sustituir, un grupo cicloalifático divalente sustituido o sin sustituir, o un grupo aromático divalente sustituido o sin sustituir, y además preferentemente un grupo alquileno C<1>-C<10>, un grupo alquenileno C<2>-C<10>o un grupo alquinileno C<2>-C<10>. Los grupos comprenden preferentemente uno o más heteroátomos y, más preferentemente, comprenden un grupo divalente que comprende uno o más heteroátomos, tales como oxo (carbonilo), tiocarbonilo, carbamato o carbonimidoílo. El grupo divalente que comprende uno o más heteroátomos se sitúa preferentemente en uno o ambos extremos del grupo de unión divalente L, y se sitúa más preferentemente en el extremo que está unido al resto peptídico B. En este caso, un compuesto representado por la fórmula (I) se puede escindir en el grupo de unión divalente L mediante un metabolismo, tal como la hidrólisis en un organismo vivo para liberar adrenomedulina, o una forma modificada de la misma, con actividad de adrenomedulina. Un grupo de unión divalente L adecuado en particular es 1-oxo-1,6-hexanodiilo. Un compuesto de la invención representado por la fórmula (J) que tiene el grupo de unión divalente L que comprende las propiedades descritas anteriormente puede ejercer de forma sostenible la actividad de adrenomedulina en un organismo vivo.
[0094] En la fórmula (I), n debe ser un número entero de 0 o 1. Cuando n es 0, el compuesto de la invención representado por la fórmula (I) es un compuesto representado por la fórmula (Ia):
[0095] A-B (Ia).
[0096] En la fórmula (Ia), A y B tienen los mismos significados respectivos que se definen en la fórmula (I).
[0097] En la fórmula (I), el resto peptídico B debe estar unido al grupo modificador A o el grupo de unión L a través de un grupo en la región cercana al extremo N del resto peptídico B. El resto peptídico B está unido preferentemente al grupo modificador A o el grupo de unión L a través del grupo amino del extremo N del resto peptídico B. En la invención, "un grupo en la región cercana al extremo N" del resto peptídico B se refiere a un determinado grupo de un residuo de aminoácidos contenido en la región de 13 residuos de aminoácidos del residuo de aminoácido del extremo N del resto peptídico B, tal como un grupo α-amino del residuo de aminoácido del extremo N o un grupo de cadena lateral amino, carboxilo, hidroxilo, imidazol o guanidilo de cada residuo de aminoácido, y un grupo modificador unido al residuo de aminoácido.
[0098] En la invención, "el grupo amino del extremo N del resto peptídico B" se refiere al grupo α-amino del residuo de aminoácido del extremo N del resto peptídico B. La forma de unión descrita anteriormente permite que un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) ejerza de forma sostenible la actividad de la adrenomedulina en el organismo vivo.
[0099] En la invención, los compuestos representados por la fórmula (I) incluyen no solo los compuestos en sí, sino también sales de los mismos. Cuando los compuestos representados por la fórmula (I) están en forma de sal, son preferentemente sales farmacéuticamente aceptables. Los contraiones en las sales de los compuestos de la invención incluyen preferentemente, pero sin limitación, por ejemplo, cationes, tales como ion sodio, potasio, calcio, magnesio o amonio sustituido o sin sustituir, o aniones, tales como un ion cloruro, bromuro, yoduro, fosfato, nitrato, sulfato, carbonato, bicarbonato, perclorato, formiato, acetato, trifluoroacetato, propionato, lactato, maleato, hidroximaleato, metilmaleato, fumarato, adipato, benzoato, 2-acetoxibenzoato, p-aminobenzoato, nicotinato, cinamato, ascorbato, pamoato, succinato, salicilato, bismetilensalicilato, oxalato, tartrato, malato, citrato, gluconato, aspartato, estearato, palmitato, itaconato, glicolato, glutamato, bencenosulfonato, ciclohexilsulfamato, metanosulfonato, etanosulfonato, isetionato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato o naftalenosulfonato. Cuando los compuestos representados por la fórmula (I) están en forma de sal con cualquiera de los contraiones, la actividad de la adrenomedulina de los compuestos puede ser sustancialmente equivalente aproximadamente a la de la adrenomedulina natural.
[0100] Los compuestos representados por la fórmula (I) incluyen no solo los propios compuestos, sino también los solvatos de los compuestos o sales de los mismos. Cuando los compuestos representados por la fórmula (I) o sales de los mismos están en forma de solvato, son preferentemente solvatos farmacéuticamente aceptables. Los disolventes que pueden formar solvatos con los compuestos o sales de los mismos incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, agua o disolventes orgánicos, tales como metanol, etanol, 2-propanol (alcohol isopropílico), dimetilsulfóxido (DMSO), ácido acético, etanolamina, acetonitrilo o acetato de etilo. Cuando los compuestos representados por la fórmula (I) o sales de los mismos están en forma de solvato con cualquiera de los disolventes descritos anteriormente, la actividad de la adrenomedulina de los compuestos puede ser sustancialmente equivalente aproximadamente a la de la adrenomedulina natural.
[0101] Los compuestos representados por la fórmula (I) incluyen no solo los propios compuestos descritos anteriormente o posteriormente, sino también las formas protegidas de los mismos. En la presente memoria descriptiva, una "forma protegida" se refiere a una forma en la que se introduce cualquier grupo protector adecuado en uno o más grupos funcionales del compuesto, tal como un grupo amino de cadena lateral de un residuo de lisina. En la presente memoria descriptiva, un "grupo protector" se refiere a un grupo que se introduce en un grupo funcional específico para evitar cualquier reacción no deseada, que se eliminará cuantitativamente en una condición de reacción específica y que es prácticamente estable o inactivo, en cualquier condición de reacción distinta a la condición de reacción específica. Los grupos protectores que pueden formar formas protegidas de los compuestos incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, t-butoxicarbonilo (Boc), 2-bromobenciloxicarbonilo (BrZ), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), p-toluenosulfonilo (Tos), bencilo (Bzl), 4-metilbencilo (4-MeBzl), 2-clorobenciloxicarbonilo (ClZ), ciclohexilo (cHex) y fenacilo (Pac); otros grupos protectores de grupos amino incluyen benciloxicarbonilo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, pnitrobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, benzhidriloxicarbonilo, 2-(p-bifenil)isopropiloxicarbonilo, 2-(3,5-dimetoxifenil)isopropiloxicarbonilo, p-fenilazobenciloxicarbonilo, trifenilfosfonoetiloxicarbonilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo, t-amiloxioxicarbonilo, diisopropilmetiloxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etiloxicarbonilo, aliloxicarbonilo, 2-metilsulfoniletiloxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetiloxicarbonilo, ciclopentiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, bencenosulfonilo, mesitilensulfonilo, metoxitrimetilfenilsulfonilo, 2-nitrobencenosulfonilo, 2-nitrobencenosulfenilo, 4-nitrobencenosulfonilo y 4-nitrobencenosulfenilo; otros grupos protectores de grupos carboxilo incluyen ésteres metílicos, ésteres etílicos, ésteres t-butílicos, ésteres de p-metoxibencilo y ésteres de p-nitrobencilo; otros grupos protectores de cadena lateral de Arg incluyen 2,2,4,6,7-pentametil-2,3-dihidrobenzofuran-5-sulfonilo, 4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo y 2-metoxibencenosulfonilo; otros grupos protectores de Tyr incluyen 2,6-diclorobencilo, t-butilo y ciclohexilo; otros grupos protectores de Cys incluyen 4-metoxibencilo, t-butilo, tritilo, acetamidometilo y 3-nitro-2-piridinsulfenilo; otros grupos protectores de His incluyen benciloximetilo, p-metoxibenciloximetilo, t-butoximetilo, tritilo y 2,4-dinitrofenilo; y otros grupos protectores de Ser y Thr incluyen t-butilo. Cuando un compuesto representado por la fórmula (I) está en una forma protegida con cualquiera de los grupos protectores descritos anteriormente, la actividad de la adrenomedulina del compuesto puede ser sustancialmente equivalente aproximadamente a la de la adrenomedulina natural.
[0103] Los compuestos representados por la fórmula (I) incluyen enantiómeros individuales y diastereómeros, así como mezclas de estereoisómeros de los compuestos, tales como los racematos.
[0105] Las propiedades descritas anteriormente permiten que el compuesto representado por la fórmula (I) ejerza de forma sostenible la actividad de la adrenomedulina en un organismo vivo sin disminuir sustancialmente la actividad de la adrenomedulina.
[0107] <2. Uso farmacéutico de derivados de la adrenomedulina>
[0109] Un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) puede ejercer de forma sostenible una bioactividad sustancialmente equivalente aproximadamente a la de la adrenomedulina, que es la molécula original del compuesto, es decir, la actividad de la adrenomedulina, en un organismo vivo. Por lo tanto, la invención se refiere a un medicamento que comprende un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) como principio activo.
[0110] Un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) puede usarse solo o junto con uno o más componentes farmacéuticamente aceptables cuando el compuesto se aplica a un uso farmacéutico. Un medicamento de la invención se puede formular en diversas formas farmacéuticas comúnmente usadas en la técnica, dependiendo del modo de administración deseado. Por lo tanto, el medicamento de la invención también se puede proporcionar en forma de una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender, además de los componentes descritos anteriormente, uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes, aglutinantes, vehículos, adyuvantes de disolución, conservantes, estabilizantes, agentes de carga, lubricantes, tensioactivos, líquidos oleosos, agentes tamponantes, agentes calmantes, antioxidantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, etc.
[0112] Las formas farmacéuticas de los medicamentos que comprenden un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) como principio activo no se limitan particularmente y pueden ser formulaciones para administración parenteral u oral. Las formas farmacéuticas de los medicamentos de la invención también pueden ser formulaciones en forma farmacéutica unitaria o en forma farmacéutica múltiple. Las formulaciones para su uso en administración parenteral incluyen, por ejemplo, inyecciones, tales como soluciones o suspensiones estériles en agua o cualquier otro líquido farmacéuticamente aceptable. Los agentes aditivos que se pueden mezclar con las inyecciones incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, vehículos tales como una solución salina fisiológica y soluciones isotónicas que comprenden glucosa u otros adyuvantes, por ejemplo, D-sorbitol, D-manitol o cloruro de sodio; auxiliares de disolución, tales como alcoholes, por ejemplo, etanol o alcohol bencílico; ésteres, por ejemplo, benzoato de bencilo y polialcoholes, por ejemplo, propilenglicol o polietilenglicol; tensioactivos no iónicos, tales como polisorbato 80 o aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado; líquidos oleosos, tales como aceite de sésamo o aceite de soja; agentes tamponantes, tales como tampón de fosfato o tampón de acetato de sodio; agentes calmantes, tales como cloruro de benzalconio o clorhidrato de procaína; estabilizantes, tales como seroalbúmina humana o polietilenglicol; conservantes; y antioxidantes. La inyección preparada se envasará generalmente en cualquier vial adecuado, por ejemplo, una ampolla, y se conservará en un ambiente adecuado hasta su uso.
[0114] Las formulaciones para su uso en administración oral incluyen, por ejemplo, un comprimido recubierto opcionalmente con un recubrimiento de azúcar o una película soluble, una cápsula, un elixir, una microcápsula, un comprimido, un jarabe y una suspensión. Los agentes aditivos que pueden mezclarse en comprimidos o cápsulas, etc., incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, aglutinantes, tales como gelatina, almidón de maíz, goma tragacanto y goma arábiga; excipientes, tales como celulosa cristalina; agentes de carga, tales como almidón de maíz, gelatina y alginato; lubricantes, tales como estearato de magnesio; agentes edulcorantes, tales como sacarosa, lactosa o sacarina; y agentes aromatizantes, tales como menta, aceite de Gaultheria adenothrix o cereza. Una formulación puede incluir además portadores líquidos, tales como aceites/grasas, cuando la formulación está en forma de cápsula.
[0115] El compuesto de la invención representado por la fórmula (I) puede ejercer de forma sostenible una actividad de adrenomedulina sustancialmente equivalente aproximadamente a la de la adrenomedulina, que es la molécula original del compuesto, en un organismo vivo. Por lo tanto, un medicamento que comprende un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) como principio activo se puede formular en una formulación de depósito. En este caso, el medicamento de la invención en la forma farmacéutica de la formulación de depósito puede implantarse, por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular, o administrarse mediante inyección intramuscular. La formulación de depósito del medicamento de la invención permite que el compuesto de la invención representado por la fórmula (I) ejerza de forma sostenible la actividad de la adrenomedulina durante un largo período de tiempo.
[0116] El medicamento que comprende un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) como principio activo se puede combinar con uno o más fármacos diferentes útiles como medicamentos. En este caso, el medicamento de la invención puede proporcionarse en forma de un único medicamento que comprende el compuesto de la invención representado por la fórmula (I) y uno o más fármacos diferentes, o puede proporcionarse en forma de una combinación o kit de medicamentos que comprende una pluralidad de formulaciones en las que el compuesto de la invención representado por la fórmula (I) y uno o más fármacos se formulan por separado. En el caso de la combinación o kit de medicamentos, cada formulación se puede administrar simultáneamente o por separado, tal como secuencialmente. Para la aplicación de los compuestos de la invención representados por la fórmula (I) al uso farmacéutico, los compuestos representados por la fórmula (I) incluyen no solo los propios compuestos, sino también sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención representados por la fórmula (I) y solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen preferentemente, pero sin limitación, por ejemplo, las sales o solvatos ilustrados anteriormente. Cuando los compuestos representados por la fórmula (I) están en forma de cualquiera de las sales o solvatos descritos anteriormente, los compuestos se pueden aplicar al uso farmacéutico deseado.
[0117] Un medicamento que comprende un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) como principio activo puede prevenir o tratar diversas afecciones, enfermedades y/o trastornos que se pueden prevenir o tratar con adrenomedulina. Las condiciones, enfermedades y/o trastornos incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, los siguientes:
[0118] (1) Vasculopatías: insuficiencia cardiaca, hipertensión pulmonar, arteriosclerosis obliterante, enfermedad de Buerger, infarto de miocardio, linfedema, enfermedad de Kawasaki, miocarditis, hipertensión arterial, disfunciones orgánicas debidas a la hipertensión arterial y arteriosclerosis.
[0119] (2) Trastornos renales y del sistema hidroelectrolítico: insuficiencia renal y nefritis.
[0120] (3) Enfermedades cerebrales y del sistema nervioso: infarto cerebral y encefalitis.
[0121] (4) Enfermedades urogenitales: disfunción eréctil (DE).
[0122] (5) Enfermedades gastrointestinales: enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad ulcerosa, enfermedad de Behçet intestinal e insuficiencia hepática.
[0123] (6) Enfermedad ortopédica: artritis,
[0124] (7) Enfermedad endocrinometabólica: diabetes y disfunciones orgánicas debidas a la diabetes.
[0125] (8) Otros: choque séptico, enfermedad autoinmunitaria, insuficiencia multiorgánica y úlceras por presión.
[0126] La enfermedad cardiovascular es preferentemente cualquiera de infarto de miocardio, hipertensión pulmonar e insuficiencia cardíaca. La enfermedad gastrointestinal es preferentemente cualquier enfermedad inflamatoria, incluyendo una enfermedad inflamatoria intestinal, resistente o dependiente de esteroides, tal como colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn o enfermedad de Behçet del tubo intestinal.
[0127] Un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) tiene una estructura en la que la adrenomedulina, que es un péptido bioactivo natural, está unida a un grupo modificador. Esta estructura permite que el compuesto de la invención representado por la fórmula (I) sea seguro y presente baja toxicidad. Por lo tanto, el medicamento que comprende el compuesto de la invención representado por la fórmula (I) como principio activo se puede aplicar a diversos sujetos que necesitan la prevención o el tratamiento de la afección, enfermedad y/o trastorno. Los sujetos son preferentemente mamíferos humanos o no humanos, o pacientes, tales como animales de sangre caliente, incluyendo un cerdo, perro, ganado vacuno, rata, ratón, cobaya, conejo, pollo, oveja, gato, mono, babuino hamadryas o chimpancé. El medicamento de la invención se puede administrar a los sujetos para prevenir o tratar diversas afecciones, enfermedades y/o trastornos que se pueden prevenir o tratar con adrenomedulina.
[0128] En la presente memoria descriptiva, "prevención" significa que la aparición (desarrollo o aparición) de una afección, enfermedad y/o trastorno se evitará sustancialmente. Por otro lado, en la presente memoria descriptiva, "tratamiento" significa supresión, tal como la supresión de la progresión, remisión, restablecimiento y/o cura de una afección, enfermedad y/o trastorno que haya aparecido (que se haya desarrollado o presentado).
[0130] El compuesto de la invención representado por la fórmula (I) se puede usar para prevenir o tratar la afección, enfermedad y/o trastorno descrito anteriormente, tal como una vasculopatía, una vasculopatía periférica o una enfermedad inflamatoria en sujetos con la afección, enfermedad y/o trastorno. Por lo tanto, el medicamento de la invención es preferentemente un medicamento para su uso en la prevención o el tratamiento de la afección, enfermedad y/o trastorno descrito anteriormente, y más preferentemente es un medicamento para su uso en la prevención o el tratamiento de una vasculopatía, una enfermedad inflamatoria o una vasculopatía periférica. La invención también se refiere a un agente para prevenir o tratar una vasculopatía, una enfermedad inflamatoria o una vasculopatía periférica que comprende un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) como principio activo. El compuesto de la invención representado por la fórmula (I) se puede usar para prevenir o tratar la afección, enfermedad y/o trastorno descrito anteriormente, con el fin de prevenir o tratar de forma sostenible la afección, enfermedad y/o trastorno.
[0132] Los compuestos de la invención representados por la fórmula (I) se pueden usar para prevenir o tratar la afección, enfermedad y/o trastorno descrito anteriormente, tal como una vasculopatía, una vasculopatía periférica o una enfermedad inflamatoria en sujetos con la afección, enfermedad y/o trastorno. Por lo tanto, una realización de la invención es un método para prevenir o tratar la enfermedad o afección descrita anteriormente, que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo, a un sujeto que necesite la prevención o tratamiento de la afección, enfermedad y/o trastorno descrito anteriormente. La afección, enfermedad y/o trastorno es preferentemente cualquiera de vasculopatías, vasculopatías periféricas y enfermedades inflamatorias. Los compuestos de la invención representados por la fórmula (I) se pueden administrar a sujetos que necesitan la prevención o el tratamiento de la afección, enfermedad y/o trastorno para prevenir o tratar la afección, enfermedad y/o trastorno.
[0134] Otra realización de la invención es un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la prevención o el tratamiento de la afección, enfermedad y/o trastorno descrito anteriormente. Una realización alternativa de la invención es el uso de un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la afección, enfermedad y/o trastorno descrito anteriormente. La afección, enfermedad y/o trastorno es preferentemente cualquiera de vasculopatías, enfermedades inflamatorias y vasculopatías periféricas. El medicamento de la invención se puede usar para prevenir o tratar la afección, enfermedad y/o trastorno descrito anteriormente, con el fin de prevenir o tratar de forma sostenible la afección, enfermedad y/o trastorno.
[0136] Cuando un medicamento que comprende un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) como principio activo se administra a un sujeto, en particular un paciente humano, la cantidad precisa y el número de dosis se determinarán considerando diversos factores, incluyendo la edad y el sexo del sujeto, el estado preciso, tal como la gravedad, de la afección, enfermedad y/o trastorno a prevenir o tratar, y la vía de administración. La cantidad y el número de dosis terapéuticamente eficaces deberán determinarse en última instancia por el médico tratante. Por lo tanto, el compuesto representado por la fórmula (I), que es un principio activo del medicamento de la invención, se administrará al sujeto en la cantidad y el número de dosis terapéuticamente eficaces. Por ejemplo, cuando el medicamento de la invención se administra a un paciente humano, una cantidad del compuesto representado por la fórmula (I), que es un principio activo, normalmente variará de 0,01 a 100 mg por 60 kg de peso corporal al día y típicamente de 0,01 a 10 mg por 60 kg de peso corporal al día.
[0138] La vía de administración y el número de dosis de un medicamento que comprende un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) como principio activo no están particularmente limitados, y el medicamento puede administrarse por vía oral o parenteral en una sola dosis o en múltiples dosis. El medicamento de la invención se administra preferentemente por vía parenteral, tal como por vía intravenosa, por infusión intestinal, por vía subcutánea, intramuscular o intraperitoneal, y más preferentemente por vía intravenosa o subcutánea. El medicamento de la invención también se administra preferentemente en una sola dosis. El medicamento de la invención se usa en particular preferentemente en administración intravenosa o subcutánea en una sola dosis. La adrenomedulina, que es la molécula original de los compuestos de la invención representados por la fórmula (I), posee un potente efecto vasodilatador. Este potente efecto vasodilatador puede causar reacciones secundarias no deseadas, tales como una disminución excesiva de la presión arterial, taquicardia asociada con un aumento de la actividad refleja del nervio simpático y/o un aumento de la actividad de la renina, cuando se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de adrenomedulina en una sola dosis. Por otro lado, los compuestos de la invención representados por la fórmula (I) pueden prolongar significativamente la semivida sanguínea en comparación con la adrenomedulina natural, manteniendo al mismo tiempo una actividad de la adrenomedulina sustancialmente equivalente aproximadamente a la de la adrenomedulina natural. Por lo tanto, la administración intravenosa del medicamento que comprende un compuesto de la invención representado por la fórmula (I) como principio activo a un sujeto en una sola dosis permite que el medicamento prevenga o trate de forma sostenible una afección, enfermedad y/o trastorno en el sujeto, a la vez que suprime las reacciones secundarias no deseadas debidas al efecto vasodilatador de la adrenomedulina. <3. Método para producir derivados de adrenomedulina>
[0139] La invención también se refiere a un método para producir un compuesto de la invención representado por la fórmula (I).
[0140] [3-1. Etapa de preparación de precursores]
[0141] El método de la invención puede comprender preparar al menos cualquiera de un precursor el resto peptídico B procedente de adrenomedulina o una forma modificada de la misma, un precursor del grupo modificador que es un grupo polietilenglicol, y un precursor del grupo divalente L<n>.
[0142] En la invención, "un precursor del resto peptídico B procedente de la adrenomedulina o una forma modificada de la misma", "un precursor del grupo modificador A que es un grupo polietilenglicol" y "un precursor del grupo divalente L<n>" se refieren, respectivamente, a adrenomedulina o una forma modificada de la misma, polietilenglicol y H-L<n>-H o, como alternativa, se refieren a derivados del resto peptídico B, el grupo modificador A y el grupo divalente L<n>que se han modificado o activado adecuadamente de modo que el resto peptídico B, el grupo modificador A y el grupo divalente L<n>se unen entre sí en uno o ambos de sus extremos mediante reacciones de condensación en la etapa de unión, como se describe a continuación. El precursor o resto peptídico B es preferentemente adrenomedulina, ya sea en una forma modificada de la misma, o una forma protegida de la misma. El precursor del grupo modificador A es el propio polietilenglicol, un derivado activado del mismo o una forma protegida del mismo.
[0143] El precursor del grupo divalente L<n>es preferentemente una forma hidrogenada del propio grupo divalente L<n>, H-L<n>-H, un derivado activado del mismo o una forma protegida del mismo. Cuando el grupo divalente L<n>es 1-oxo-1,6-hexanodiilo, en donde n es 1, el precursor del grupo divalente L<n>es preferentemente un éster activo, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida éster del ácido 6-clorohexanoico. El precursor tiene preferentemente cualquier grupo protector descrito anteriormente cuando se encuentra en una forma protegida. La preparación de precursores con las propiedades descritas anteriormente en esta etapa permite reacciones de alto rendimiento para la unión de cada precursor en la etapa de unión descrita a continuación.
[0144] En esta etapa, el precursor o resto peptídico B procedente de la adrenomedulina o una forma modificada de la misma se puede preparar mediante cualquier método comúnmente usado en la técnica. El medio puede ser, por ejemplo, un método de síntesis de péptidos en un sistema de fase sólida o en un sistema de fase líquida, o un método para purificar péptidos naturales a partir de tejidos o células de mamíferos humanos o no humanos que pueden de producir adrenomedulina, cuando el precursor del resto peptídico B es adrenomedulina o una forma modificada de la misma. Como alternativa, el medio puede ser un método para la sobreexpresión de una proteína recombinante usando ADN que codifica adrenomedulina en mamíferos humanos o no humanos que pueden producir adrenomedulina, tales como las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 o 12, en un sistema de transformación, tal como Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae. Como alternativa, los péptidos ya producidos también pueden adquirirse. En cualquier caso, los péptidos se incluirán en la realización de esta etapa.
[0145] Un precursor con un enlace disulfuro formado por dos residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos del precursor del resto peptídico B preparado mediante los medios descritos anteriormente, se puede obtener mediante la formación de un enlace disulfuro entre los grupos tiol de dos residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos. Un precursor en el que el enlace disulfuro formado entre dos residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos del precursor del resto peptídico B, preparado por los medios descritos anteriormente, se ha sustituido por un grupo etileno, se puede obtener mediante la sustitución del enlace disulfuro por un grupo etileno. La reacción de formación de un enlace disulfuro y la reacción de sustitución con un grupo etileno se pueden realizar basándose en cualquier condición usada comúnmente en la técnica. La reacción de formación de un enlace disulfuro y la reacción de sustitución con un grupo etileno pueden realizarse en esta etapa o en la etapa de unión descrita a continuación. En cualquier caso, los precursores se incluirán en la realización de la etapa.
[0146] Cuando al menos cualquiera del precursor del resto peptídico B, el precursor del grupo modificador A y el precursor del grupo divalente L<n>se encuentra en forma protegida, la etapa de protección, en la que se introducen uno o más grupos protectores en al menos cualquiera del precursor del resto peptídico B, el precursor del grupo modificador A y el precursor del grupo divalente L<n>, y/o la etapa de desprotección, en la que se desprotegen al menos cualquiera de uno o más grupos protectores en las formas protegidas del precursor del resto peptídico B, el precursor del grupo modificador A y el precursor del grupo divalente L<n>, puede realizarse en esta etapa, según se desee. Las etapas de protección y desprotección se pueden realizar con cualquier reacción de protección y desprotección usada comúnmente en la técnica. Las etapas de protección y desprotección pueden realizarse en esta etapa o en la etapa de unión que se describe a continuación. Cualquier caso descrito anteriormente se incluirá en la realización de esta etapa.
[0147] [3-2. Etapa de unión]
[0148] Se requiere el método de la invención para comprender una etapa de unión para unir el precursor del resto peptídico B procedente de la adrenomedulina o una forma modificada de la misma, el precursor del grupo modificador A, seleccionado del grupo que consiste en un grupo palmitoílo no incluido en la presente invención y un grupo polietilenglicol, y el precursor del grupo divalente L<n>para dar un compuesto representado por la fórmula (I).
[0149] Cuando n es 0 en la fórmula (I), esta etapa se realiza mediante la unión del precursor del resto peptídico B y el precursor del grupo modificador A. Cuando n es 1 en la fórmula (I), esta etapa se realizará mediante la unión del precursor del resto peptídico B, el precursor del grupo modificador A y el precursor del grupo divalente L<n>.
[0150] En esta etapa, el medio para unir el precursor del resto peptídico B, el precursor del grupo modificador A y el precursor del grupo divalente L<n>no está particularmente limitado. El medio puede ser una reacción de formación de enlaces peptídicos usando cualquier precursor usado comúnmente en la técnica, tal como un haluro de ácido, por ejemplo, un cloruro de ácido o un éster activo, por ejemplo, N-hidroxisuccinimida éster.
[0151] Cuando n es 1 en la fórmula (I), el orden de unión del precursor del resto peptídico B con el precursor del grupo modificador A y el precursor del grupo divalente L<n>no está particularmente limitado. Por ejemplo, el precursor del grupo modificador A y el precursor del grupo divalente L<n>pueden unirse primero antes de unir los precursores unidos y el precursor del resto peptídico B. Como alternativa, el precursor del resto peptídico B y el precursor del grupo divalente L<n>pueden unirse primero antes de unir adicionalmente los precursores unidos y el precursor del grupo modificador A. Cualquier caso descrito anteriormente se incluirá en la realización de la etapa.
[0152] Ejemplos
[0153] En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, el alcance técnico de la presente invención no pretende limitarse a estos Ejemplos. <I. Preparación del compuesto>
[0154] Un precursor del grupo B procedente de adrenomedulina (AM) se sintetizó de acuerdo con el esquema proporcionado a continuación. Un péptido correspondiente a los residuos de aminoácidos 1 a 52 de adrenomedulina humana (h.AM(1-52)) se dividió en 6 segmentos (Seg-1 a Seg-6). Después de la síntesis de cada segmento, estos segmentos se condensaron para sintetizar un péptido precursor del grupo B. A continuación, un grupo palmitoílo (Pal) no incluido en la presente invención o un grupo polietilenglicol (PEG) se unió al péptido precursor del grupo B para sintetizar un derivado de adrenomedulina.
[0157]
[0158]
[0161] [I-1: Síntesis del segmento 1]
[0162] Boc-Gln-Gly-OPac
[0163] Se disolvió Boc-Gly-OPac (88,0 g) en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (65,5 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Gln-OH (81,3 g) y 1-hidroxibenzotriazol (48,7 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (65,9 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La N,N-dimetilformamida se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió acetato de etilo, y la solución obtenida se diluyó. Esta solución se lavó con una solución acuosa al 5 % de bicarbonato de sodio, una solución acuosa 0,5 N de ácido clorhídrico y una solución salina saturada. La capa orgánica se secó sobre MgSO<4>y, a continuación, el acetato de etilo se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en una solución mixta de cloroformo/metanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico.
[0164] El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 56 g del producto de interés.
[0165] Boc-Phe-Gln-Gly-OPac
[0166] Boc-Gln-Gly-OPac (54,8 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (28 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Phe-OH (35,2 g) y 1-hidroxibenzotriazol (19,3 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (26,2 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en una solución mixta de cloroformo/metanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida, Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 68,7 g del producto de interés.
[0167] Boc-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac
[0168] Boc-Phe-Gln-Gly-OPac (67,9 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (26 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Asn-OH (30,5 g) y 1-hidroxibenzotriazol (19,4 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (21,8 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en N,N-dimetilformamida. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 81 g del producto de interés. Boc-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac
[0169] Boc-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac (81 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (26 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de N,N-dimetilformamida/1,3-dimetil-2-imidazolidinona. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Asn-OH (28,9 g) y 1-hidroxibenzotriazol (19,2 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (26,0 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua, acetonitrilo y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 74 g del producto de interés.
[0170] Boc-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac
[0171] Boc-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac (50,0 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (13,7 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de N,N-dimetilformamida/1-metil-2-pirrolidona/1,3-dimetil-2-imidazoIidinona. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Met-OH (16,4 g) y 1-hidroxibenzotriazol (9,4 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (12,6 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua, acetonitrilo y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 54 g del producto de interés.
[0172] Boc-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac
[0173] Boc-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac (53,0 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (12,5 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de 1-metil-2-pirrolidona/1,3-dimetil-2-imidazolidinona. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Ser(Bzl)-OH (17,7 g) y 1-hidroxibenzotriazol (8,5 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (11,5 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua, acetonitrilo y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 56,5 g del producto de interés. Boc-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac
[0174] Boc-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac (30,0 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (5,9 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de dimetilsulfóxido/1-metil-2-pirrolidona/1,3-dimetil-2-imidazolidinona. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Gln-OH (7,3 g) y 1-hidroxibenzotriazol (5,5 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (7,5 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua, acetonitrilo y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 24,0 g del producto de interés. Boc-Arg(Tos)-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac
[0175] Boc-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac (16,2 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (2,9 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de dimetilsulfóxido/1-metil-2-pirrolidona. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Arg(Tos)-OH (7,4 g) y 1-hidroxibenzotriazol (2,1 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (2,9 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua, acetonitrilo y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 12,5 g del producto de interés.
[0176] Boc-Tyr(BrZ)-Arg(Tos)-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac
[0177] Boc-Arg(Tos)-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac (12,5 g) se disolvió en ácido trifluoroacético, La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (1,7 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de dimetilsulfóxido/1-metil-2-pirrolidona. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Tyr(BrZ)-OH (4,4 g) y 1-hidroxibenzotriazol (1,5 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (1,7 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió acetonitrilo. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con acetonitrilo y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 11 g del producto de interés.
[0178] Boc-Tyr(BrZ)-Arg(Tos)-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OH (segmento 1)
[0179] Boc-Arg(Tos)-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OPac (6,0 g) se disolvió en dimetilsulfóxido. A la solución obtenida se le añadieron una solución acuosa de formiato de amonio (10 mmol/l) (15,6 ml), ácido acético (18,7 ml) y polvo de cinc (10,2 g) a 30 °C. Después de 1 hora, el polvo de cinc se eliminó por filtración de la solución de reacción, y el filtrado se lavó con dimetilsulfóxido. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua, acetonitrilo y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 5,5 g del producto de interés.
[0180] [I-2: Síntesis del segmento 2]
[0181] Boc-Phe-Gly-OPac
[0182] Se disolvió Boc-Gly-OPac (44 g) en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (33 ml).
[0183] A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en cloruro de metileno. A la solución obtenida se le añadió Boc-Phe-OH (36,6 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (27,5 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. La solución de reacción se lavó con una solución acuosa 0,5 N de ácido clorhídrico y solución salina saturada. La capa orgánica se secó sobre MgSO<4>y, a continuación el cloruro de metileno se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en cloroformo. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 38 g del producto de interés.
[0184] Boc-Ser(Bzl)-Phe-Gly-OPac
[0185] Boc-Phe-Gly-OPac (8,8 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (4,5 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Ser(Bzl)-OH (6,2 g) y 1-hidroxibenzotriazol (2,8 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (3,8 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua, Los cristales obtenidos se disolvieron en una solución mixta de cloroformo/metanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 11,5 g del producto de interés. Boc-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-OPac
[0186] Boc-Ser(Bzl)-Phe-Gly-OPac (11,4 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (4,8 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Arg(Tos)-OH (10 g) y 1-hidroxibenzotriazol (2,8 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (4 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución acuosa al 5 % de bicarbonato de sodio, una solución acuosa 0,5 N de ácido clorhídrico y una solución salina saturada. La capa orgánica se secó sobre MgSO<4>y, a continuación, el acetato de etilo se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en acetato de etilo. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 15,8 g del producto de interés.
[0187] Boc-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-OPac
[0188] Boc-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-OPac (15,7 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (4 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Leu-OH·H<2>O (4,6 g) y 1-hidroxibenzotrialo (2,6 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (3,6 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua. Los cristales obtenidos se disolvieron en una solución mixta de cloroformo/metanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 17,6 g del producto de interés.
[0189] Boc-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-OH
[0190] Boc-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-OPac (17,6 g) se disolvió en ácido acético. A la solución obtenida se le añadió polvo de cinc (55,2 g) a 40 °C. Después de 2 horas, el polvo de cinc se eliminó por filtración de la solución de reacción, y el filtrado se lavó con ácido acético. El ácido acético se eliminó por destilación a presión reducida y, a continuación, el residuo se diluyó con acetato de etilo. La solución obtenida se lavó con una solución acuosa 0,1 N de ácido clorhídrico y solución salina saturada. La capa orgánica se secó sobre MgSO<4>y, a continuación, el acetato de etilo se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en cloroformo. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida, Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 13,9 g del producto de interés.
[0191] Boc-Arg(Tos)-Phe-Gly-OPac
[0192] Boc-Phe-Gly-OPac (8,8 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 1,0 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (4,0 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Arg(Tos)-OH (10,3 g) y 1-hidroxibenzotriazol (2,8 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (3,8 ml) con enfriamiento, La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. La solución se diluyó con acetato de etilo. La solución obtenida se lavó con una solución acuosa al 5 % de bicarbonato de sodio, una solución acuosa 0,5 N de ácido clorhídrico y una solución salina saturada. La capa orgánica se secó sobre MgSO<4>y, a continuación, el acetato de etilo se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en acetato de etilo. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 14,7 g del producto de interés.
[0193] Boc-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-OPac
[0194] Boc-Arg(Tos)-Phe-Gly-OPac (14,5 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (3,9 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Cys(4-MeBzl)-OH (6,9 g) y 1-hidroxibenzotriazol (2,8 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (3,8 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por nitración y se lavó con agua y n-hexano. Los cristales obtenidos se disolvieron en una solución mixta de cloroformo/metanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida.
[0195] Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico.
[0196] Estos procedimientos produjeron 17,2 g del producto de interés.
[0197] Boc-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-OPac
[0198] Boc-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-OPac (9,1 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (1,9 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-OH (9,2 g) y 1-hidroxibenzotriazol (1,4 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (1,8 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en N,N-dimetilformamida. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió acetonitrilo. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con acetonitrilo y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 16,2 g del producto de interés.
[0199] Boc-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-OH (segmento 2)
[0200] Boc-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-OPac (7,1 g) se disolvió en una solución mixta de 1-metil-2-pirrolidona/N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron una solución acuosa de formiato de amonio (10 mmol/l) (12 ml), ácido acético (7,2 ml) y polvo de cinc (7,8 g) a 40 °C. Después de 1 hora, el polvo de cinc se eliminó por filtración de la solución de reacción, y el filtrado se lavó con N,N-dimetilformamida. La N,N-dimetilformamida se eliminó por destilación a presión reducida, y al residuo se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en N,N-dimetilformamida. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 6 g del producto de interés.
[0201] [I-3: Síntesis del segmento 3]
[0202] Boc-Leu-Ala-OPac
[0203] Boc-Ala-OPac (33,8 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (25 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en cloruro de metileno. A la solución obtenida se le añadió Boc-Leu-OH·H<2>O (24,9 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (19,2 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución de reacción se lavó con una solución acuosa 0,5 N de ácido clorhídrico y solución salina saturada. El cloruro de metileno se eliminó por destilación a presión reducida, y al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en cloroformo. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 30,1 g del producto de interés.
[0204] Boc-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OPac
[0205] Boc-Leu-Ala-OPac (29,4 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (16,5 ml). A la mezcla obtenida se le añadió diisopropil éter. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con diisopropil éter. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Lys(ClZ)-OH (30,5 g) y 1-hidroxibenzotriazol (10,2 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (13,8 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se diluyó con acetato de etilo. Esta solución se lavó con una solución acuosa 0,5 N de ácido clorhídrico y solución salina saturada. El acetato de etilo se eliminó por destilación a presión reducida, y al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en una solución mixta de cloroformo/metanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 47,5 g del producto de interés.
[0206] Boc-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OPac
[0207] Boc-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OPac (47,3 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (15,6 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Gln-OH (17,6 g) y 1-hidroxibenzotriazol (9,8 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (13,3 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua, metanol y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 54,5 g del producto de interés.
[0208] Boc-VaI-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OPac
[0209] Boc-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OPac (54,1 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (15 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Val-OH (14,6 g) y 1-hidroxibenzotriazol (9,1 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (13,3 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua, metanol y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 59,2 g del producto de interés.
[0210] Boc-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OPac
[0211] Boc-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OPac (58,6 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (15 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Thr(Bzl)-OH (14,6 g) y 1-hidroxibenzotriazol (8,8 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (11,9 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua, metanol, éter dietílico, acetonitrilo y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 70,2 g del producto de interés.
[0212] Boc-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OPac
[0213] Boc-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OPac (34,1 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (7,1 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en 1-metil-2-pirrolidona. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Cys(4-MeBzl)-OH (10,5 g) y 1-hidroxibenzotriazol (4,5 g), A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (6,0 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua, metanol, éter dietílico, acetonitrilo y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 38,4 g del producto de interés.
[0214] Boc-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OPac
[0215] Boc-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OPac (37,6 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (6,5 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de dimetilsulfóxido/1-metil-2-pirrolidona/1,3-dimetil-2-imidazolidinona. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Thr(Bzl)-OH (9,3 g) y 1-hidroxibenzotriazol (4,2 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (5,6 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua, metanol, éter dietílico, acetonitrilo y éter dietílico. El residuo se disolvió en una solución mixta de cloroformo/2,2,2-trifluoroetanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 42,0 g del producto de interés.
[0216] Boc-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OH (segmento 3)
[0217] Boc-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OPac (15,3 g) se disolvió en una solución mixta de cloruro de metileno/2,2,2-trifluoroetanol. A la solución obtenida se le añadieron una solución acuosa de formiato de amonio (10 mmol/l) (10 ml), ácido acético (6 ml) y polvo de cinc (32 g) a 30 °C. Después de 30 minutos, el polvo de cinc se eliminó por filtración de la solución de reacción, y el filtrado se lavó con una solución mixta de cloruro de metileno/2,2,2-trifluoroetanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida, y al residuo se le añadió una solución acuosa de ácido clorhídrico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en N,N-dimetilformamida. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 14,1 g del producto de interés.
[0218] [I-4: Síntesis del segmento 4]
[0219] Boc-Tyr(BrZ)-Gln-OPac
[0220] Boc-Gln-OPac (36,5 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (20 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se añadió a N,N-dimetilformamida. A la mezcla obtenida se le añadieron Boc-Tyr(BrZ)-OH (54 g) y 1-hidroxibenzotriazol (14,8 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (20 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo. Esta solución se lavó con una solución acuosa al 5 % de bicarbonato de sodio, una solución acuosa 0,5 N de ácido clorhídrico y una solución salina saturada. La capa orgánica se secó sobre MgSO<4>y, a continuación, el acetato de etilo se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Los cristales obtenidos se añadieron a una solución mixta de acetato de etilo/metanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 29,8 g del producto de interés.
[0221] Boc-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-OPac
[0222] Boc-Tyr(BrZ)-Gln-OPac (29 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (9 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se añadió a N,N-dimetilformamida. A la mezcla se le añadieron Boc-Ile-OH-1/2 H<2>O (10,5 g) y 1-hidroxibenzotriazol (5,9 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (8 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió acetonitrilo. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con acetonitrilo y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 32,0 g del producto de interés. Boc-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-OPac
[0223] Boc-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-OPac (25,5 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (7 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se añadió a N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Gln-OH (7,7 g) y 1-hidroxibenzotriazol (4,5 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (6 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió acetonitrilo. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con acetonitrilo y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 27,3 g del producto de interés.
[0224] Boc-His-Gln-Ile-Tyr( BrZ)-Gln-OPac
[0225] Boc-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-OPac (19,6 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (5 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se añadió a N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-His(Tos)-OH (9,0 g) y 1-hidroxibenzotriazol (3,0 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (4 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió acetonitrilo. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con acetonitrilo y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 18,3 g del producto de interés.
[0226] Boc-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-OH (segmento 4)
[0228] Boc-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gly-OPac (15,0 g) se disolvió en una solución mixta de cloruro de metileno/2,2,2-trifluoroetanol/ácido acético. A la solución obtenida se le añadió polvo de cinc (43,9 g) a 40 °C. Después de 30 minutos, el polvo de cinc se eliminó por filtración de la solución de reacción, y el filtrado se lavó con una solución mixta de cloruro de metileno/2,2,2-trifluoroetanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida, y al residuo se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua, una solución acuosa de ácido clorhídrico, agua, éter dietílico, acetonitrilo y éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en N,N-dimetilformamida. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 9,5 g del producto de interés.
[0230] [I-5: Síntesis del segmento 5] Boc-Ala-Pro-OPac
[0232] Boc-Ala-OH (95 g), Pro-OBzl·HCl (127 g) y 1-hidroxibenzotriazol (7 g) se añadieron a cloruro de metileno. A la solución obtenida se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (96 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. El cloruro de metileno se eliminó por destilación a presión reducida, y el residuo se diluyó con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con una solución acuosa al 5 % de bicarbonato de sodio, una solución acuosa 0,5 N de ácido clorhídrico y una solución salina saturada. El acetato de etilo se eliminó por destilación a presión reducida, y al residuo se le añadió n-hexano. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con n-hexano. Estos procedimientos produjeron 158 g de cristales.27,1 g de los cristales se disolvieron en metanol. A la solución obtenida se le añadió Pd al 5 %-C (5 g). A la solución de reacción se le añadió hidrógeno gaseoso. Una vez completada la reacción, el Pd al 5 %-C se eliminó por filtración. El metanol se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 19,7 g de cristales. 19,7 g de los cristales se disolvieron en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron bromuro de fenacilo (14,4 g) y trietilamina (10,1 ml). La solución de reacción se agitó durante 1 hora. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo. La solución obtenida se lavó con una solución acuosa al 5 % de bicarbonato de sodio, una solución acuosa 0,5 N de ácido clorhídrico y una solución salina saturada. La capa orgánica se secó sobre MgSO<4>y, a continuación, el acetato de etilo se eliminó por destilación a presión reducida, Al residuo se le añadió n-hexano. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con n-hexano. Estos procedimientos produjeron 25,2 g del producto de interés.
[0234] Boc-Val-Ala-Pro-OPac
[0236] Boc-Ala-Pro-OPac (25,8 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (14,7 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se añadió a N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Val-OH (14,5 g) y 1-hidroxibenzotriazol (9,5 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (12,8 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo. La solución obtenida se lavó con una solución acuosa al 5 % de bicarbonato de sodio, una solución acuosa 0,5 N de ácido clorhídrico y una solución salina saturada. La capa orgánica se secó sobre MgSO<4>y, a continuación, el acetato de etilo se eliminó por destilación a presión reducida, Al residuo se le añadió n-hexano. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con n-hexano. Los cristales obtenidos se disolvieron en acetato de etilo. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 24,4 g del producto de interés.
[0238] Boc-Asn-Val-Ala-Pro-OPac
[0240] Boc-Val-Ala-Pro-OPac (24,4 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (11,2 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se añadió a N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Asn-OH (11,8 g) y 1-hidroxibenzotriazol (7,2 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (9,8 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo. La solución obtenida se lavó con una solución acuosa al 5 % de bicarbonato de sodio, una solución acuosa 0,5 N de ácido clorhídrico y una solución salina saturada. La capa orgánica se secó sobre MgSO<4>y, a continuación, el acetato de etilo se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en cloroformo. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 26,5 g del producto de interés.
[0241] Boc-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OPac
[0242] Boc-Asn-VaLAla-Pro-OPac (26,5 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (10 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se añadió a N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Asp(OcHex)-OH (14,2 g) y 1-hidroxibenzotriazol (6,4 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (8,6 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo. La solución obtenida se lavó con una solución acuosa al 5 % de bicarbonato de sodio, una solución acuosa 0,5 N de ácido clorhídrico y una solución salina saturada. La capa orgánica se secó sobre MgSO<4>y, a continuación, el acetato de etilo se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 33,8 g del producto de interés.
[0243] Boc-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-ValAla-Pro-OPac
[0244] Boc-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OPac (33,8 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (9,6 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se añadió a N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Lys(ClZ)-OH (18,0 g) y 1-hidroxibenzotriazol (6,2 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (8,4 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo. La solución obtenida se lavó con una solución acuosa al 5 % de bicarbonato de sodio, una solución acuosa 0,5 N de ácido clorhídrico y una solución salina saturada. La capa orgánica se secó sobre MgSO<4>y, a continuación, el acetato de etilo se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Los cristales obtenidos se disolvieron en cloroformo. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 46,0 g del producto de interés.
[0245] Boc-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OPac
[0246] Boc-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OPac (45,8 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (9,5 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de 1-metil-2-pirrolidona/N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Asp(OcHex)-OH (12,2 g) y 1-hidroxibenzotriazol (5,5 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (7,4 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua. El residuo se disolvió en cloroformo, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 50,3 g del producto de interés.
[0247] Boc-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OPac
[0248] Boc-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OPac (23,6 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (4,2 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de 1-metil-2-pirrolidona/N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Lys(ClZ)-OH (7,4 g) y 1-hidroxibenzotriazol (2,5 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (3,4 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. El residuo se disolvió en una solución mixta de cloroformo/metanol, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 24,2 g del producto de interés.
[0249] Boc-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OPac
[0250] Boc-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OPac (24,0 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (3,4 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de 1-metil-2-pirrolidona/N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Asp(OcHex)-OH (4,9 g) y 1-hidroxibenzotriazol (2,2 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (3,0 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. El residuo se disolvió en una solución mixta de cloroformo/2,2,2-trifluoroetanol, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 27,1 g del producto de interés. Boc-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OPac
[0251] Boc-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OPac (27,1 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (3,4 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de 1-metil-2-pirrolidona/N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Thr(Bzl)-OH (4,6 g) y 1-hidroxibenzotriazol (2,1 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (2,9 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. El residuo se disolvió en una solución mixta de cloroformo/2,2,2-trifluoroetanol, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 26,0 g del producto de interés.
[0252] Boc-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OPac
[0253] Boc-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OPac (24,0 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (2,8 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de 1-metil-2-pirrolidona/N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Phe-OH (3,4 g) y 1-hidroxibenzotriazol (1,8 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (2,4 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. El residuo se disolvió en una solución mixta de N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadió acetonitrilo. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 24,3 g del producto de interés.
[0254] Boc-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OH (segmento 5) Boc-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OPac (24,3 g) se disolvió en ácido acético. A la solución obtenida se le añadió polvo de cinc (36,9 g) a 40 °C. Después de 2 horas, el polvo de cinc se eliminó por filtración de la solución de reacción, y el filtrado se lavó con ácido acético. El ácido acético se eliminó por destilación a presión reducida, y al residuo se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. El residuo se añadió a una solución mixta de N,N-dimetilformamida, y a la mezcla se le añadió acetonitrilo. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 21,0 g del producto de interés.
[0255] [I-6: Síntesis del segmento 6]
[0256] Boc-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>
[0257] Boc-Tyr(Br-Z)-NH<2>(49,3 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (21,8 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Gly-OH (18,0 g) y 1-hidroxibenzotriazol (14,9 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (20,1 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio.
[0258] El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua. El residuo se disolvió en una solución mixta de cloroformo/metanol, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 55 g del producto de interés.
[0259] Boc-Gln-Gly-Tyr( Br-Z)-NH<2>
[0260] Boc-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(55 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano ( 5,5 mol/l) (21,8 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Gln-OH (27 g) y 1-hidroxibenzotriazol (14,9 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (20,1 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua. El residuo se disolvió en una solución mixta de cloroformo/metanol, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 59 g del producto de interés.
[0261] Boc-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>
[0262] Boc-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(59 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (19,0 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Pro-OH (19,3 g) y 1-hidroxibenzotriazol (12,9 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (17,5 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua. El residuo se disolvió en una solución mixta de cloroformo/metanol, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 60,6 g del producto de interés.
[0263] Boc-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>
[0264] Boc-Pro-Gln-Gly-TyrCBr-Z)-NH<2>(60,6 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (15,4 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Ser(Bzl)-OH (24,3 g) y 1-hidroxibenzotriazol (11,6 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (15,8 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. La N,N-dimetilformamida se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción. Al residuo se le añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. El residuo se disolvió en una solución mixta de cloroformo/metanol, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 17 g del producto de interés.
[0265] Boc-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>
[0266] Boc-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(16,7 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (4,2 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-De-OH-1/2 H<2>O (4,8 g) y 1-hidroxibenzotriazol (2,9 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (3,9 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 17 g del producto de interés.
[0267] Boc-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>
[0268] Boc-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(17,9 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (4,0 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Lys(ClZ)-OH (8,0 g) y 1-hidroxibenzotriazol (2,7 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (3,7 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y metanol. Estos procedimientos produjeron 22,0 g del producto de interés.
[0269] Boc-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)NH<2>
[0270] Boc-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(22,0 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (3,8 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Ser(Bzl)-OH (5,4 g) y 1-hidroxibenzotriazol (2,6 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (3,5 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y metanol. Estos procedimientos produjeron 20,2 g del producto de interés.
[0271] Boc-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(segmento 6)
[0272] Boc-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(22,2 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (3,0 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Arg(Tos)-OH (7,3 g) y 1-hidroxibenzotriazol (2,1 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (2,8 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y metanol. Estos procedimientos produjeron 23,1 g del producto de interés.
[0273] [I-7: Condensación del segmento de h.AM protegida - (1)]
[0274] Boc-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzr)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>
[0275] Boc-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(1,9 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (0,22 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de 1-metil-2-pirrolidona/N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-OH (2,0 g) y 1-hidroxibenzotriazol (0,15 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,20 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. El residuo se disolvió en N,N-dimetilformamida. La N,N-dimetilformamida se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción obtenida, y al residuo se le añadió acetato de etilo. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con acetato de etilo. Estos procedimientos produjeron 3,3 g del producto de interés.
[0276] [I-8: Condensación del segmento de h.AM protegida - (2)] Boc-His-Gln-He-Tyr(BrZ)-Gln-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>
[0277] Boc-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(3,3 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (0,19 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en 1-metil-2-pirrolidona. A la solución obtenida se le añadieron Boc-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-OH (0,9 g) y 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (0,13 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,18 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. El residuo se disolvió en N,N-dimetilformamida. La N,N-dimetilformamida se eliminó por destilación a presión reducida de la solución obtenida, y al residuo se le añadió acetonitrilo. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con acetonitrilo. Estos procedimientos produjeron 3,0 g del producto de interés.
[0278] [I-9: Condensación del segmento de h.AM protegida - (3)]
[0279] Boc-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>
[0280] Boc-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(2,5 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (0,23 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de 1-metil-2-pirrolidona/N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-OH (0,78 g) y 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (0,077 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,10 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. El residuo se disolvió en una solución mixta de cloroformo/2,2,2-trifluoroetanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida de la solución obtenida, y al residuo se le añadió acetato de etilo. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con acetato de etilo. Estos procedimientos produjeron 2,1 g del producto de interés.
[0281] [I-10: Condensación del segmento de h.AM protegida - (4)]
[0282] Boc-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>
[0283] Boc-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH2 (2,0 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (0,15 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de dimetilsulfóxido/1-metil-2-pirrolidona/N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-OH (0,56 g) y 1-hidroxibenzotriazol (0,091 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,12 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. El residuo se disolvió en una solución mixta de cloroformo/2,2,2-trifluoroetanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida de la solución obtenida, y al residuo se le añadió acetonitrilo. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con acetonitrilo. Estos procedimientos produjeron 1,8 g del producto de interés.
[0284] [I-11: Condensación del segmento de h.AM protegida - (5)]
[0285] Boc-Tyr(BrZ)-Arg(Tos)-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-Cys(4-MeBz])-Arg(Tos)-Phe-Gly-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(h.AM (1-52) protegida con Boc)
[0286] Boc-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(1,5 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (0,09 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en dimetilsulfóxido. A la solución obtenida se le añadieron Boc-Tyr(BrZ)-Arg(Tos)-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-OH (0,40 g) y 1-hidroxibenzotriazol (0,081 g). A la mezcla se le añadió gota a gota 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,11 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió una solución acuosa de bicarbonato de sodio. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y éter dietílico. El residuo se disolvió en una solución mixta de cloroformo/2,2,2-trifluoroetanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida de la solución obtenida, y al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 1,6 g del producto de interés.
[0287] [I-12: Síntesis de palmitoil-h.AM - (1)] (no incluido en la presente invención) Pal-Tyr(BrZ)-Arg(Tos)-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-VaLGln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr(BlZ)-Gln-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>
[0288] Boc-Tyr(BrZ)-Arg(Tos)-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg(Ros)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzr)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(0,23 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (0,02 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de cloroformo/2,2,2-trifluoroetanol, Una solución se cloruro de palmitoílo (0,015 g), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (0,015 g) y diisopropiletilamina (0 011 ml) añadida a tetrahidrofurano, y diisopropiletilamina (0,004 ml) se añadieron gota a gota a la solución obtenida con enfriamiento. La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió acetonitrilo. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con acetonitrilo. Estos procedimientos produjeron 0,24 g del producto de interés.
[0289] [I-13: Síntesis de palmitoil-h.AM - (2)] (no incluido en la presente invención)
[0290] Trifluoroacetato de Pal-h.AM(1-52)
[0291] Pal-Tyr(BrZ)-Arg(Tos)-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzr)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(238 mg) se complementó con p-cresol (1,5 ml) y metionina (37 mg). A la solución obtenida se le añadió hidrogenofluoruro anhidro (6 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se trató a razón de -2 a -5 °C durante 60 minutos. El hidrogenofluoruro anhidro se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración. El péptido en bruto obtenido se disolvió en una solución acuosa al 50 % de ácido acético. A la solución obtenida se le añadió una solución 0,1 M de yodo en metanol (0,24 ml). Después de 1 minuto, a la solución se le añadió ácido ascórbico 1 M en agua (0,24 ml). El producto de interés se purificó por HPLC de fase inversa de la solución obtenida. El producto de interés se liofilizó y a continuación se obtuvo en forma de 38 mg de polvo de color blanco.
[0292] [I-14: Síntesis de palmitoil-h.AM - (3)] (no incluido en la presente invención)
[0293] Acetato de Pal-h.AM (1-52)
[0294] Se disolvió trifluoroacetato de Pal-h.AM(1-52) (38 mg) en una solución acuosa al 5 % de ácido acético. La solución obtenida se aplicó a una columna Muromac 1 x 2 (tipo ácido acético) (3 ml), seguido de elución con una solución acuosa al 5 % de ácido acético. El eluido se liofilizó. El producto de interés se liofilizó y a continuación se obtuvo en forma de 32 mg de polvo de color blanco.
[0295] [I-15: Síntesis de palmitoil-h.AM - (4)] (no incluido en la presente invención) Envasado de acetato de Pal-h.AM(1-52) en viales
[0296] Se disolvió acetato de Pal-h.AM (1-52) (16,5 mg) en agua Milli Q (18,3 ml). La solución obtenida se dispensó a razón de 0,30 ml para cada vial y se liofilizó. Tres de los productos liofilizados obtenidos en los viales se hidrolizaron con una solución acuosa 6 M de ácido clorhídrico. Los hidrolizados obtenidos se sometieron a análisis de aminoácidos. El contenido se cuantificó mediante el análisis de aminoácidos. Rendimiento: 38 nmol x 57 viales.
[0297] [I-16: Síntesis de PEG5000-h.AM - (1)]
[0298] Fmoc-Tyr(BrZ)-Arg(Tos)-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-AIa-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>
[0299] Boc-Tyr(BrZ)-Arg(Tos)-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-AIa-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(0,9 g) se disolvió en ácido trifluoroacético. La solución obtenida se agitó durante 10 minutos con enfriamiento y a continuación a temperatura ambiente durante 50 minutos. El ácido trifluoroacético se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió una solución de hidrogenocloruro en dioxano (5,5 mol/l) (0,05 ml). A la mezcla obtenida se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. La sal clorhidrato obtenida se disolvió en una solución mixta de dimetilsulfóxido/N,N-dimetilformamida. A la solución obtenida se le añadieron carbonate de 9-fluorenilmetil succinimidilo (0,34 g) y diisopropiletilamina (0,05 ml).
[0300] La solución de reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente. A la solución de reacción se le añadió agua. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con agua y acetonitrilo. El precipitado se disolvió en una solución mixta de cloroformo/2,2,2-trifluoroetanol. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida, y al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración y se lavó con éter dietílico. Estos procedimientos produjeron 0,76 g del producto de interés.
[0301] [I-17: Síntesis de PEG5000-h.AM - (2)]
[0302] Fmoc-Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH<2>(forma de puente disulfuro de Cys16-Cys21)
[0303] Fmoc-Tyr(BrZ)-Arg(Tos)-Gln-Ser(Bzl)-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Phe-Gly-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Phe-Gly-Thr(Bzl)-Cys(4-MeBzl)-Thr(Bzl)-Val-Gln-Lys(ClZ)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr(BrZ)-Gln-Phe-Thr(Bzl)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Lys(ClZ)-Asp(OcHex)-Asn-Val-Ala-Pro-Arg(Tos)-Ser(Bzl)-Lys(ClZ)-Ile-Ser(Bzl)-Pro-Gln-Gly-Tyr(Br-Z)-NH<2>(740 mg) se complementó con p-cresol (6,0 ml) y metionina (122 mg). A la solución obtenida se le añadió hidrogenofluoruro anhidro (24 ml) con enfriamiento. La solución de reacción se trató a razón de -2 a -5 °C durante 60 minutos. El hidrogenofluoruro anhidro se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción, y al residuo se le añadió éter dietílico. El precipitado depositado se recogió por filtración. El péptido en bruto obtenido se disolvió en una solución acuosa al 50 % de ácido acético. A la solución obtenida se le añadió una solución 0,1 M de yodo en metanol (0,8 ml). Después de 30 segundos, a la solución se le añadió ácido ascórbico 1 M en agua (0,8 ml). El producto de interés se purificó por HPLC de fase inversa de la solución obtenida. El producto de interés se liofilizó y a continuación se obtuvo en forma de 134 mg de polvo de color blanco.
[0304] [I-18: Síntesis de PEG5000-h.AM - (3)]
[0305] Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys(Boc)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys(Boc)-Asp-Lys(Boc)-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys(Boc)-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH<2>(forma de puente disulfuro de Cys16-Cys21)
[0306] Fmoc-Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH<2>(forma de puente disulfuro de Cys16-Cys21) (184 mg) se disolvió en dimetilsulfóxido (18 ml). A la solución obtenida se le añadieron carbonato de t-butil succinimidilo (87 mg) y diisopropiletilamina (0,06 ml). La solución de reacción se agitó durante 5 horas. A la solución se reacción se le añadió una solución acuosa de ácido acético y, a continuación, la mezcla se liofilizó. El residuo se disolvió en dimetilsulfóxido (20 ml). A la solución obtenida se le añadió dietilamina (2 ml). La solución obtenida se agitó durante 70 minutos. La solución de reacción se diluyó mediante la adición de una solución acuosa de ácido acético. El producto de interés se purificó por HPLC de fase inversa de la solución obtenida. El producto de interés se liofilizó y a continuación se obtuvo en forma de 116 mg de polvo de color blanco.
[0307] [I-19: Síntesis de PEG5000-h.AM - (4)]
[0308] PEG5000-Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys(Boc)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys(Boc)-Asp-Lys(Boc)-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys(Boc)-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH<2>(forma de puente disulfuro de Cys16-Cys21)
[0309] Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-GlnGly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys(Boc)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys(Boc)-Asp-Lys(Boc)-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys(Boc)-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH<2>(forma de puente disulfuro de Cys16-Cys21) (40 mg) se disolvió en dimetilsulfóxido (4 ml). A la solución obtenida se le añadieron PEG5000-NHS (205 mg) y diisopropiletilamina (0,001 ml). PEG5000-NHS es un compuesto formado a partir de PEG que tiene un peso molecular promedio de 5000 y N-hidroxisuccinimida éster del ácido 6-clorohexanoico. Este compuesto tiene una estructura en la que el PEG que tiene un peso molecular promedio de 5000 y la N-hidroxisuccinimida están unidos a través de 1-oxo-1,6-hexanodiilo. La solución de reacción se agitó durante una noche. El producto de interés se purificó por HPLC de fase inversa de la solución de reacción. El producto de interés se liofilizó y a continuación se obtuvo en forma de 35 mg de polvo de color blanco.
[0310] [I-20: Síntesis de PEG5000-h.AM - (5)]
[0311] Trifluoroacetato de PEG5000-h.AM(1-52)
[0312] PEG5000-Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys(Boc)-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys(Boc)-Asp-Lys(Boc)-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys(Boc)-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH<2>(forma de puente disulfuro de Cys16-Cys21) (34 mg) se complementó con una solución acuosa al 95% de ácido trifluoroacético (5 ml) en enfriamiento con hielo para disolver el péptido en bruto. La mezcla obtenida se hizo reaccionar durante 40 minutos en enfriamiento con hielo. El disolvente se eliminó por destilación a presión reducida de la solución de reacción. El residuo se disolvió en agua Milli Q. El producto de interés se purificó por HPLC de fase inversa de la solución obtenida. El producto de interés se liofilizó y a continuación se obtuvo en forma de 30 mg de polvo de color blanco.
[0313] [I-21: Síntesis de PEG5000-h.AM (6)]
[0314] Envasado de acetato de PEG50-h.AM (1-52) en viales
[0315] El trifluoroacetato de PEG5000-h.AM(1-52) (30 mg) se disolvió en una solución acuosa al 3 % de ácido acético. La solución obtenida se aplicó a una columna Muromac 1 x 2 (tipo ácido acético) (2 ml), seguido de elución con una solución acuosa al 3 % de ácido acético. El eluido se liofilizó. La totalidad del producto liofilizado se disolvió en agua Milli Q (18,3 ml). La solución obtenida se dispensó a razón de 0,30 ml para cada vial y se liofilizó. Tres de los productos liofilizados obtenidos en los viales se hidrolizaron con una solución acuosa 6 M de ácido clorhídrico. Los hidrolizados obtenidos se sometieron a análisis de aminoácidos. El contenido se cuantificó mediante el análisis de aminoácidos. Rendimiento: 37 nmol x 56 viales.
[0316] <II: Ejemplos de uso>
[0317] [II-1: Efecto del derivado de adrenomedulina en el aumento de la concentración de cAMP intracelular]
[0318] La administración de adrenomedulina (AM) aumenta la concentración de cAMP intracelular. Por lo tanto, se considera que el efecto de la AM se ejerce mediante el aumento de la concentración de cAMP intracelular. Por consiguiente, se añadieron Pal-h.AM (1-52) (no incluido en la presente invención), PEG5000-h.AM (1-52) o h.AM (1-52) en una estirpe celular cultivada (estirpe celular HEK293) para inducir la expresión de un receptor de AM, y se midió la cantidad de cAMP intracelular producida. Se añadieron de 10<-11>a 10<-6>mol/l de Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención), PEG5000-h.AM(1-52) o h.AM(1-52) a células HEK293 confluentes (número de células: 5 x 10<4>) en presencia de IBMX 0,5 mM y se incubaron durante 15 minutos. A continuación, la concentración de cAMP intracelular en las células HEK293 de cada muestra de prueba se midió usando un kit ELISA para la medición de cAMP (GE Healthcare Japan Corp., n.º RPN2251). La curva de respuesta a la dosis entre la concentración de Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención), PEG5000-h.AM(1-52) o h.AM(1-52) y el aumento de la concentración de cAMP se muestra en la figura 1. En la figura, el eje longitudinal indica el valor relativo (%) del aumento de la concentración de cAMP de cada muestra de prueba con respecto al valor máximo de respuesta del aumento de la concentración de cAMP causado por h.AM(1-52).
[0319] Como se muestra en la figura 1, la administración de Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención) o PEG5000-h.AM(1-52) aumentó la concentración de cAMP intracelular en las células HEK293 que expresan el receptor de AM. Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención) y PEG5000-h.AM(1-52), en comparación con h.AM(1-52), mostraron valores de respuesta máxima y pCE50 sustancialmente equivalentes (h.AM(1-52): 8,59 ± 0,90; Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención): 8,49 ± 0,12; PEG5000-h.AM(1-52): 8,19 ± 0,10). Estos resultados demuestran que Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención) y PEG5000-h.AM(1-52) ejercen una actividad de aumento de la concentración de cAMP sustancialmente equivalente aproximadamente a la de h.AM(1-52) en células cultivadas.
[0320] [II-2: Semivida media en sangre del derivado de adrenomedulina]
[0321] Se administró una dosis única de Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención), PEG5000-h.AM(1-52) o h.AM(1-52) en la vena de cada rata bajo anestesia, y se observó un cambio en función del tiempo en la concentración sanguínea del derivado de adrenomedulina. Cada rata Wistar macho de 11 a 14 semanas de edad fue anestesiada mediante inhalación de isoflurano. Tras la traqueotomía, se controló la anestesia inhalatoria con una concentración de isoflurano del 1,5 al 2,5 % y un caudal de 0,6 a 0,8 l/min. Se aisló la vena yugular derecha de la rata y se insertó en la misma un catéter correspondiente a 26 G. A continuación, se aisló la arteria carótida izquierda de la rata tratada de este modo y se insertó en la misma un catéter correspondiente a 23 G. Se administraron Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención), PEG5000-h.AM(1-52) o h.AM(1-52) disueltos en solución salina fisiológica a través del catéter de la vena yugular derecha. Del catéter insertado en la arteria carótida, se extrajeron 300 μg de sangre en el tiempo desde el inicio de la administración. Inmediatamente, se añadieron EDTA-2Na (300 μg) y aprotinina (21 μg) a la muestra de sangre obtenida, y la mezcla se centrifugó adicionalmente a 3000 rpm durante 10 minutos para obtener el plasma. La concentración plasmática de AM de cada muestra se midió mediante inmunoensayo enzimático quimioluminiscente. Las semividas en sangre de la primera y segunda fases se calcularon a partir de los resultados de la medición de la concentración de AM en plasma usando un modelo bicompartimental. La relación entre el tiempo transcurrido desde el inicio de la administración de h.AM(1-52), Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención) o PEG5000-h.AM(1-52) y la concentración de AM en plasma se muestra en las figuras 2 a 4.
[0322] Como se muestra en las figuras 3 y 4, las semividas de la primera fase de Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención) y PEG5000-h.AM(1-52) fueron de 3,51 y 6,18 minutos, respectivamente, y las semividas de la segunda fase fueron de 123 y 133 minutos, respectivamente. Por el contrario, como se muestra en la figura 2, la semivida de la primera fase de h.AM(1-52) fue de 0,61 minutos, y la semivida de la segunda fase fue de 18,9 minutos. En resumen, Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención) y PEG5000-h.AM(1-52), en comparación con h.AM(1-52), prolongaron significativamente la semivida en sangre. Estos resultados han demostrado que una molécula de adrenomedulina modificada químicamente con ácido palmítico o polietilenglicol prolonga significativamente la semivida en sangre, en comparación con la molécula original, la adrenomedulina.
[0323] [II-3: Efecto hipotensor del derivado de adrenomedulina]
[0324] Se administró una dosis única de Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención), PEG5000-h.AM(1-52) o h.AM(1-52) en la vena de cada rata bajo anestesia, y se observó un cambio en la presión arterial de la rata. Cada rata Wistar macho de 11 a 14 semanas de edad fue anestesiada mediante inhalación de isoflurano. Tras la traqueotomía, se controló la anestesia inhalatoria con una concentración de isoflurano del 1,5 al 2,5 % y un caudal de 0,6 a 0,8 l/min. Se aisló la vena yugular derecha de la rata y se insertó en la misma un catéter correspondiente a 26 G. A continuación, se aisló la arteria carótida izquierda de la rata tratada de este modo y se insertó en la misma un catéter correspondiente a 23 G. Se administraron Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención), PEG5000-h.AM(1-52) o h.AM(1-52) disueltos en solución salina fisiológica a través del catéter de la vena yugular derecha. Desde el catéter de la vena yugular derecha, se infundió una solución salina fisiológica-heparina (solución salina fisiológica: 100 ml; heparina: 1000 unidades) a 2,4 ml/h. Desde este catéter, se administraron 10 nmol/kg de Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención), PEG5000-h.AM(1-52) o h.AM(1-52) de forma disuelta en solución salina fisiológica. El catéter insertado en la arteria carótida se conectó a un transductor de presión. La presión arterial antes de la administración de Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención), PEG5000-h.AM(1-52) o h.AM(1-52) y la presión arterial después de la administración de los mismos se midió a lo largo del tiempo. La relación entre el tiempo transcurrido desde el inicio de la administración de h.AM(1-52), Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención) o PEG5000-h.AM(1-52) y la presión arterial promedio se muestra en la figura 5. En la figura, el eje longitudinal indica la diferencia obtenida al restar la presión arterial promedio antes de la administración de cada fármaco de la presión arterial promedio en el momento de la administración de cada fármaco.
[0325] Como se muestra en la figura 5, la dosis única intravenosa de Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención), PEG5000-h.AM(1-52) o h.AM(1-52) a 10 nmol/kg redujo la presión arterial de la rata. En el caso de h.AM(1-52), la máxima caída de presión se observó 2 minutos después de la administración, y la presión arterial previa a la administración se restableció 30 minutos después de la administración. Por el contrario, el valor máximo de caída de presión provocado por la administración de Pal-h.AM(1-52) (no incluido en la presente invención) o PEG5000-h.AM(1-52) fue inferior al valor de h.AM(1-52). En el caso de estos derivados, el efecto hipotensor se mantuvo incluso 90 minutos después de la administración. Estos resultados han demostrado que los efectos hipotensores de Palh.AM(1-52) (no incluido en la presente invención) y PEG5000-h.AM(1-52) se mantienen de forma gradual y prolongada. El efecto hipotensor del derivado de adrenomedulina, demostrado en esta prueba, fue coherente con la prolongada semivida en sangre demostrada en la prueba anterior.
[0326] [II-4: Efecto terapéutico del derivado de adrenomedulina en un modelo de enfermedad inflamatoria intestinal] II-4-1: Preparación del modelo
[0327] Se realizó una incisión en la piel del lomo de cada ratón C57BL/6J Jcl (de 6 semanas de edad) bajo anestesia inhalatoria con isoflurano (2 %). Se implantó por vía subcutánea una bomba osmótica (minibomba osmótica Alzet® modelo 1002) llena de una solución de administración, y se suturó la piel con un hilo de sutura. Se afeitó y desinfectó la piel del lomo en el sitio donde se implantó la bomba osmótica. Al ratón tratado de este modo se le permitió ingerir el 3 % en masa/volumen de sulfato de dextrano sódico (DSS) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) como agua de bebida durante 7 días para preparar un modelo de enfermedad inflamatoria intestinal. La enteritis inducida por DSS se usa ampliamente como modelo de enfermedad inflamatoria intestinal.
[0328] Desde la fecha de inicio de la ingestión de DSS, el derivado de adrenomedulina (PEG5000-h.AM(1-52)) se administró de forma continua por vía subcutánea mediante una bomba osmótica. La dosis se fijó en 0,02, 0,1 o 0,5 nmol/kg/h, y la velocidad de dosificación en 0,2 μl/h. La fecha de inicio de la ingestión de DSS se definió como la fecha de inicio de la administración del derivado de adrenomedulina (día 0). La administración se realizó durante 14 días en las condiciones descritas anteriormente. Se administró solución salina fisiológica a un grupo control de la misma manera que anteriormente. 14 días después del inicio de la administración, se extrajo sangre heparinizada de la cava abdominal bajo anestesia inhalatoria con isoflurano (2 %). Se realizó una incisión en la aorta abdominal y la cava abdominal para sacrificar al animal por desangrado. A continuación, se recogió el tubo intestinal desde el ano hasta el íleon-ciego.
[0329] II-4-2: Medición
[0330] (1) Concentración de AM
[0331] La sangre heparinizada, obtenida de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente, se centrifugó a 4 °C, 1800 x g y durante 10 minutos para obtener plasma. La concentración de AM en el plasma obtenido de cada muestra se midió mediante inmunoensayo enzimático quimioluminiscente.
[0332] (2) Peso corporal
[0333] El peso corporal del ratón en cuestión se midió 3, 5, 7, 10 y 14 días después del inicio de la administración.
[0334] (3) Puntuación
[0335] El peso corporal del ratón en cuestión y la forma de sus heces se evaluaron 3, 5, 7, 10 y 14 días después del inicio de la administración, según los criterios de puntuación que se indican a continuación. Las puntuaciones obtenidas se sumaron para calcular la puntuación total de cada muestra.
[0336] Tabla 1.
[0338]
[0339]
[0341] (4) Longitud del tubo intestinal
[0342] El tubo intestinal extirpado por anatomía se abrió a lo largo de su eje longitudinal y se extrajo el tejido graso, tras lo cual se lavó con solución salina fisiológica. A continuación, se midió la longitud del tubo intestinal.
[0343] II-4-3; Resultados
[0344] (1) Concentración de AM
[0345] La concentración plasmática de AM, medida mediante los procedimientos descritos anteriormente, se indica mediante la media ± desviación estándar. Las concentraciones plasmáticas de AM en el grupo control y en los grupos de administración de 0,02, 0,1 y 0,5 nmol/kg/h de PEG5000-h.AM(1-52) fueron de 0,091 ± 0,036, 1,430 ± 0,242, 3,289 ± 0,525 y 12,96 ± 2,432 fmol/ml, respectivamente. Las
[0346] concentraciones plasmáticas de AM del grupo de control y de los grupos de administración de 0,02, 0,1 y 0,5 nmol/kg/h de PEG5000-h.AM(1-52) se muestra en la figura 6.
[0347] (2) Evaluación de la puntuación
[0348] La puntuación total evaluada mediante los procedimientos descritos anteriormente se indica mediante un valor de la mediana [media ± desviación estándar]. Las puntuaciones totales del grupo control obtenidas 3, 5, 7, 10 y 14 días después del inicio de la administración fueron 0,0 [0,6 ± 0,3], 4,0 [3,7 ± 0,4], 6,0 [5,4 ± 0,5], 3,5 [4,1 ± 0,4] y 0,0 [0,0 ± 0,0], respectivamente. Las puntuaciones totales del grupo de administración de 0,02 nmol/kg/h de PEG5000-h.AM(152) obtenidas 3, 5, 7, 10 y 14 días después del inicio de la administración fueron 1,0 [0,8 ± 0,2], 2,5 [2,8 ± 0,5], 5,5 [5,7 ± 0,4], 2,5 [3,1 ± 0,8] y 0,0 [0,0 ± 0,0], respectivamente. Las puntuaciones totales del grupo de administración de 0,1 nmol/kg/h de PEG5000-h.AM(1-52) obtenidas 3, 5, 7, 10 y 14 días después del inicio de la administración fueron 0,0 [0,7 ± 0,3], 1,5 [1,9 ± 0,5], 5,0 [4,1 ± 0,4], 2,0 [2,0 ± 0,5] y 0,0 [0,0 ± 0,0], respectivamente. Las puntuaciones totales del grupo de administración de 0,5 nmol/kg/h de PEG5000-h. AM(1-52) obtenidas 3, 5, 7, 10 y 14 días después del inicio de la administración fueron 1,0 [1,3 ± 0,3], 1,5 [1,1 ± 0,3], 3,0 [3,0 ± 0,3], 2,0 [2,1 ± 0,4] y 0,0 [0,0 ± 0,0], respectivamente. La relación entre el tiempo transcurrido desde el inicio de la administración de PEG5000-h.AM(1-52) y las puntuaciones totales del grupo control y de cada grupo de administración se muestra en la figura 7. Como se muestra en la figura 7, las puntuaciones totales obtenidas 10 días después del inicio de la administración en el grupo de administración de 0,1 nmol/kg/h de PEG5000-h.AM(1-52), y las puntuaciones totales obtenidas 5, 7 y 10 días después del inicio de la administración en el grupo de administración de 0,5 nmol/kg/h PEG5000-h.AM(1-52), en comparación con las puntuaciones totales del grupo control, mostraron una disminución significativa (prueba de comparación múltiple de Steel, p <0,05 o P <0,01).
[0350] (3) Longitud del tubo intestinal
[0352] La longitud del tubo intestinal, medida mediante los procedimientos descritos anteriormente, se indica mediante la media ± desviación estándar. La longitud del tubo intestinal del grupo control y de los grupos de administración de 0,02, 0,1 y 0,5 nmol/kg/h de PEG5000-h.AM(1-52) fue de 65,0 ± 1,3 mm, 69,4 ± 1,5 mm, 71,4 ± 0,9 mm y 72,4 ± 0,9 mm, respectivamente. La longitud del tubo intestinal del grupo control y de los grupos de administración de 0,02, 0,1 y 0,5 nmol/kg/h de PEG5000-h.AM(1-52) se muestra en la figura 8. Como se muestra en la figura 8, se confirmó que la longitud del tubo intestinal de todos los grupos de administración de PEG5000-h.AM(1-52) tratados a las concentraciones fueron significativamente diferentes de la longitud del tubo intestinal del grupo control (prueba de comparación múltiple de Dunnett, P <0,05 o P <0,01).

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES
1. Un compuesto representado por la fórmula (I):
A-L<n>-B (I),
en donde
A es un grupo modificador que es un grupo polietilenglicol,
L es un grupo de unión divalente,
n es un número entero de 0 o 1, y
B es un resto peptídico procedente de la adrenomedulina o una forma modificada de la misma con la actividad de la adrenomedulina,
en donde el resto peptídico B está unido al grupo modificador A o al grupo de unión L a través del grupo amino del extremo N del resto peptídico B o una sal del mismo, o un hidrato del mismo,
en donde la adrenomedulina o la forma modificada de la misma con actividad de adrenomedulina es un péptido seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y que tiene un enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína en las posiciones 16 y 21;
(b) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y que tiene un enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína en las posiciones 16 y 21;
(c) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y que tiene un enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína en las posiciones 16 y 21;
(d) un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y que tiene un enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína en las posiciones 16 y 21;
(g) un péptido en donde el enlace disulfuro en cualquiera de los péptidos de (a) a (d) está sustituido por un grupo etileno;
(h) un péptido en donde de 1 a 5 aminoácidos en cualquiera de los péptidos de (a) a (d) y (g) se eliminan, se sustituyen o se añaden; y
(i) un péptido en donde el extremo C de cualquiera de los péptidos de (a) a (d), (g) y (h) está amidado.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el grupo amino del extremo N del resto peptídico B es un grupo α-amino de un residuo de aminoácido del extremo N del resto peptídico B.
3. Un método para producir el compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que comprende una etapa de unión para unir un precursor del resto peptídico B procedente de adrenomedulina o una forma modificada de la misma, un precursor del grupo modificador A, que es un grupo polietilenglicol, y un precursor del grupo divalente L<n>para formar el compuesto representado por la fórmula (I).
4. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.
5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4 para su uso en la prevención o el tratamiento de una vasculopatía, una enfermedad inflamatoria o una vasculopatía periférica.
6. El compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección, enfermedad y/o trastorno.
7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la afección, la enfermedad y/o el trastorno son una vasculopatía, una enfermedad inflamatoria o una vasculopatía periférica.
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