ES3058633T3

ES3058633T3 - Modified lipidated relaxin b chain peptides and their therapeutic use

Info

Publication number: ES3058633T3
Application number: ES19702593T
Authority: ES
Inventors: Olivier Duclos; Stéphane Illiano; Sergio Mallart; Claire Minoletti-Hochepied; Elisabetta Bianchi; Raffaele Ingenito; Paola Magotti; Alessia Santoprete
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2026-03-12
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: PT3746467T; JP7295871B2; PL3746467T3; EP3746467B1; IL276170B1; HRP20260016T1; US20210292387A1; JP2021512099A; LT3746467T; CA3089657A1; WO2019149782A1; US20240218042A1; MY199821A; CO2020008308A2; KR102755938B1; MX2020008096A; RS67606B1; BR112020014834A2; AR114325A1; TWI763972B

Abstract

La presente invención se refiere a un péptido de relaxina monocatenario biológicamente activo con la siguiente fórmula (I): Nter-Ac-X10-EGRE-X15-VR-X18-X19-I-X21-X22-EG-X25-S-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-NH2-Cter, o una sal o solvato del mismo. También se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un péptido de la invención, y al péptido o la composición farmacéutica para su uso como medicamento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Péptidos de la cadena B de la relaxina lipidados modificados y su uso terapéutico

[0003] CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0004] La presente invención se refiere a análogos peptídicos de la cadena B de la relaxina-2 capaces de activar el receptor RXFP1.

[0005] En particular, la presente invención se refiere a análogos peptídicos lipidados de la cadena B de la relaxina-2 capaces de activar el receptor RXFP1.

[0006] Además, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos dichos péptidos, y un péptido o composición farmacéutica de los mismos de acuerdo con la invención para su uso como medicamento, y en particular para su uso en el tratamiento y/o la prevención de diversas enfermedades o afecciones que implican el receptor RXFP1, más particularmente una enfermedad o afección seleccionada de:

[0007] • el grupo que consiste en fibrosis; enfermedades fibróticas, en particular esclerosis sistémica, esclerodermia y fibromialgia; fibrosis pulmonar idiopática; enfermedades renales que implican fibrosis; hipertensión pulmonar y preeclampsia;

[0008] • el grupo que consiste en enfermedades cardíacas y vasculares, en particular del grupo que consiste en insuficiencia cardíaca aguda o crónica, insuficiencia cardíaca sistólica o diastólica, arteriopatía coronaria, aterosclerosis, angina microvascular y complicación cardiovascular de la diabetes; y/o

[0009] • el grupo que consiste en insuficiencias renales, en particular disfunción renal en la cirrosis; nefropatía crónica y lesión renal aguda.

[0010] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0011] La relaxina-2 humana (relaxina H2) es una hormona peptídica de 6 kDa de 53 aminoácidos. Su estructura consiste en dos cadenas polipeptídicas separadas, es decir, la cadena A de la relaxina H2 (SEQ ID NO: 100) y la cadena B de la relaxina H2 (SEQ ID NO: 101) reticuladas por dos enlaces disulfuro (S-S), con un tercer enlace intracatenario S-S ubicado en la cadena A de la siguiente manera:

[0012] Cadena A de la relaxina H2: H-Gln-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys*-Cys**-His-Val-Gly-Cys*-Thr-Lys-Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys***-OH (SEQ ID NO: 100)

[0013] Cadena B de la relaxina H2: H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys**-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys***-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH (SEQ ID NO: 101)

[0014] en donde Cys*, Cys** y Cys*** indican los enlaces disulfuro entre cisteínas con el mismo marcador.

[0015] La relaxina-2 es una hormona peptídica natural producida por el cuerpo lúteo con un pico en la circulación durante el primer trimestre del embarazo de una mujer. La relaxina-2 pertenece a la familia de péptidos similares a la insulina cuyos miembros ejercen numerosos efectos después de unirse a diferentes tipos de receptores, clasificados como receptores (RXFP) de péptidos de la familia de la relaxina (RXFP1, RXFP2, RXFP3 y RXFP4).

[0016] RXFP1 es el principal receptor para relaxina. RXFP1 contiene un dominio extracelular grande con un único módulo de lipoproteína de baja densidad de clase A (LDLa) en el extremo amino y 10 dominios de repetición ricos en leucina extracelular (LRR), seguidos de 7 dominios helicoidales transmembrana (7TM). El módulo LDLa de RXFP1 se une al dominio LRR mediante un enlazador de 32 residuos.

[0017] La activación de RXFP1 es un proceso multietapa complejo. Estudios previos han demostrado que Arg13, Arg17 e Ile20, del casete de arginina (RxxxRxxI/V, donde x es cualquier residuo) de la cadena B de relaxina H2 se unen a Asp231, Asp279, Glu233 y Glu277 ubicados en LRR4-8 del dominio LRR de RXFP1. La unión del ligando por sí sola no es suficiente para activar el receptor. El truncamiento o sustitución del módulo LDLa da como resultado un receptor inactivo a pesar de la unión al dominio extracelular. Un estudio (Bruell, S. et al., Front. Endocrinol. (Lausanne) 4, 171 (2013)), el intercambio de los módulos de LDLa de RXFP1 y RXFP2 destacó el papel del enlazador en la activación del receptor. Los LRR (sitio de alta afinidad) y los primeros exobucles (sitios de baja afinidad) de los dominios transmembrana participan en la unión a la relaxina, mientras que el módulo LDLa es necesario para la activación del receptor que implica el exobucle 2 (Sethi A. et al. Nature Communications (2016)).

[0018] En algunas especies, la relaxina también puede activar RXFP2, la repetición rica en leucina nativa que contiene GPCR para el péptido similar a la insulina 3 (INSL3). Esto sugiere que una posible reactividad cruzada podría estar asociada con diversas actividades biológicas de la relaxina, aunque actualmente no hay evidencia de un papel fisiológico para la relaxina que actúe únicamente a través de RXFP2.

[0019] Datos publicados recientes mostraron que existen diferencias entre especies en la capacidad de los agonistas para activar RXFP1 con una diferencia específica en el dominio ECL3 entre ser humano y roedor (Huang et al. Frontiers in Endocrinology 17 de agosto de 2015;6:128). En paralelo, se describió actividad agonista sesgada para algunos miméticos monocatenarios derivados de la relaxina (Hossain et al. Chem. Sci., 2016, 7, 3805). Sin embargo, basándose en la nomenclatura IUPHAR, RXFP1 es un receptor acoplado a Gs y la ruta de señalización principal de RXFP1 conduce a la acumulación de AMPc (adenosina monofosfato cíclico).

[0020] La relaxina se ha identificado primero como una hormona del embarazo implicada no solo en el remodelado del útero y la implantación de embriones, sino también en la adaptación hemodinámica de las mujeres embarazadas. Esto incluye disminuir la resistencia vascular, aumentar el gasto cardíaco y aumentar la GFR, una combinación de efectos que tiene como objetivo mejorar la poscarga cardíaca. Estas propiedades han llevado al uso de la relaxina 2 humana recombinante en varios ensayos clínicos en el contexto de la insuficiencia cardíaca aguda.

[0021] Los efectos cardiovasculares beneficiosos de la relaxina, que se atribuyen a alteraciones en la vasculatura renal y sistémica, también se han demostrado en pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva y aguda en ensayos preclínicos y ensayos clínicos de fase II. En ratas macho y hembra normotensas e hipertensas conscientes, la administración subcutánea aguda intravenosa y crónica de relaxina aumenta el gasto cardíaco y la distensibilidad arterial global y reduce la resistencia vascular sistémica, sin afectar a la presión arterial media.

[0022] También se ha demostrado que la relaxina reduce la presión arterial media en modelos de hipertensión en ratas. Las acciones vasculares de la relaxina se extienden a la modificación de la distensibilidad de la pared pasiva. La infusión subcutánea crónica de relaxina en ratas y ratones aumenta la distensibilidad arterial en las arterias pequeñas renales, mesentéricas, uterinas y carótidas. Además, la relaxina tiene propiedades antifibróticas en un modelo animal de fibrosis cardíaca y renal.

[0023] Por tanto, la relaxina podría beneficiar a los pacientes con insuficiencia cardíaca crónica al disminuir la poscarga y aliviar la actividad cardíaca, así como a los pacientes con hipertensión pulmonar, con insuficiencia cardíaca con fracción de expulsión reducida o conservada y a los pacientes con enfermedades fibróticas, incluyendo esclerosis sistémica, fibrosis pulmonar idiopática y cualquier nefropatía que implique fibrosis.

[0024] Por lo tanto, la relaxina-2 es claramente de alto interés terapéutico.

[0025] Sin embargo, la estructura heterodimérica del complejo de relaxina H2 dificulta su síntesis química y purificación, lo que da lugar a bajos rendimientos del producto final (Curr. Opin. Chem. Biol.2014, 22, 47-55).

[0026] Por consiguiente, existe un interés en obtener péptidos de relaxina estables que posean la capacidad de la relaxina para activar los receptores RXFP1, y más particularmente péptidos que conservan la actividad biológica de la relaxina, a la vez que son estructuralmente más sencillos que la relaxina nativa.

[0027] Los péptidos con estructuras más sencillas podrían requerir síntesis menos complejas y más eficientes que la relaxina H2. De este modo se reducen los costes del tratamiento ligados a la síntesis de relaxina H2.

[0028] Además, debido a su estructura más sencilla y más pequeña, dichos péptidos pueden presentar una captación mejorada en comparación con la relaxina nativa, lo que da lugar a una actividad terapéuticain vivomejorada.

[0029] En la literatura se han descrito varios análogos simplificados de relaxina H2. M. A. Hossain et al (J. Biol. Chem. (2011), 43, 3755) identificaron la estructura mínima de relaxina H2 que muestra que su cadena B podría truncarse en hasta 6 o 7 aminoácidos en el extremo N con una pérdida mínima de potencia. Las estructuras descritas en esta publicación son análogos de relaxina bicatenarios que todavía son difíciles de sintetizar y no ofrecen ninguna ventaja en comparación con la relaxina H2 nativa.

[0030] Se realizaron otros intentos para simplificar los péptidos de la familia de la relaxina. Recientemente, M. A. Hossain et al. en Chem. Sci. (2016),7, 3805-3819 y el documento WO2015/157829 propusieron péptidos agonistas de RXFP1 que comprenden solo la cadena B de la relaxina H2. Sin embargo, como se ilustra en el presente texto, los péptidos del documento WO2015/157829 presentan una capacidad insuficiente para activar el receptor RXFP1.

[0031] Por tanto, existe una necesidad de nuevos análogos de péptidos de la cadena B de la relaxina-2 capaces de activar el receptor RXFP1, en particular que tengan una capacidad mejorada para activar el receptor RXFP1.

[0032] También existe una necesidad de nuevos péptidos de Relaxina modificados que tengan una estructura sencilla, en particular una estructura más sencilla que los péptidos de relaxina ya conocidos, y que posean una capacidad mejorada para activar el receptor RXFP1.

[0033] SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0034] La presente invención tiene como objetivo satisfacer las necesidades indicadas anteriormente en el presente documento.

[0035] De hecho, los inventores proporcionan nuevos péptidos de relaxina modificados, y en particular péptidos lipidados, que demuestran una capacidad significativamente mejorada para activar el receptor RXFP1 en comparación con los primeros péptidos de la familia de relaxina simplificados propuestos en la técnica anterior, como se demuestra en los siguientes ejemplos.

[0036] Como se describe a continuación en el presente documento, los inventores han llevado varias deleciones y modificaciones a la secuencia de aminoácidos de la cadena B de la relaxina nativa, lo que da lugar a péptidos más cortos que tienen propiedades mejoradas en comparación con la relaxina nativa y los péptidos de relaxina ya propuestos en la técnica anterior En particular, los experimentos adjuntos demuestran que mientras que el péptido B7-33 C11.23S (SEQ ID NO: 102) y el péptido análogo del documento WO2015/157829, AcB7-33 C11.23S (SEQ ID NO: 103) y KKKK(AcB7-29 C11.23S) (SEQ ID NO: 104) tienen una concentración de activación del 50 % (EC<50>) de RXFP1 de 1641 nM, 929 nM y 206 nM respectivamente, en el ensayo celular utilizado para seleccionar los péptidos de esta invención, los valores de EC<50>obtenidos con los péptidos lipidados de acuerdo con la invención van de 36,4 nM a 0,07 nM. Además, la mayoría de los péptidos evaluados de la invención tienen un valor de EC<50>inferior o igual a 5 nM. Además, aunque la técnica anterior a continuación sugirió que la cadena B de la relaxina no se podía truncar en más de 7 aminoácidos (J. Biol. Chem. (2011), 43, 3755; documento WO2015/157829) sin una reducción significativa en la potencia, los péptidos de esta invención se truncan en 9 aminoácidos en el extremo N (NTER) y todavía muestran una alta actividad sobre el receptor RXFP1.

[0037] En comparación con los péptidos agonistas de RXFP1 del documento WO2015/157829, los péptidos de la invención presentan solubilidad mejorada a pH 4,5 o pH 7,5, estabilidad en sangre o plasma de rata y humano y semividasin vivomejoradas.

[0038] Estas propiedades permitirán formular los péptidos de esta invención en amplios intervalos de concentración para su uso como medicamento que conservará su eficaciain vivodurante un periodo de tiempo más largo, permitiendo, por ejemplo, la administración una vez al día por vía intravenosa o subcutánea.

[0039] Por consiguiente, la presente divulgación describe, pero no reivindica, un péptido que tiene la siguiente fórmula (I):

[0040] N<ter>-Ac-X<10>-E-G-R-E-X<15>-V-R-X<18>-X<19>-I-X<21>-X<22>-E-G-X<25>-S-X<27>-X<28>-X<29>-X<30>-X<31>-X<32>-X<33>-NH<2>-C<ter>en donde:

[0041] N<ter>representa el extremo N-terminal del péptido;

[0042] C<ter>representa el extremo C-terminal del péptido;

[0043] Ac representa un grupo acetilo;

[0044] X<10>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, ácido 2-amino-isobutírico (Aib), Nεacetil-lisina (K(Ac)) y α-metil-leucina (Mel);

[0045] E representa ácido glutámico (Glu);

[0046] G representa glicina (Gly);

[0047] R representa arginina (Arg);

[0048] X<15>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina (Lys), arginina (Arg), homolisina (Hly), homoarginina (Har), ornitina (Orn), glutamina (Gln), fenilalanina (Phe) y leucina (Leu);

[0049] V representa valina (Val);

[0050] X<18>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina (Ala), ácido 2-amino-isobutírico (Aib), leucina (Leu), Nε-acetil-lisina (K(Ac)) y glutamina (Gln);

[0051] X<19>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina (Lys), Nε-acetil-lisina (K(Ac)), citrulina (Cit), glutamina (Gln), alanina (Ala) y ácido 2-amino-isobutírico (Aib);

[0052] I representa isoleucina (Ile);

[0053] X<21>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico (Aib) y alanina (Ala); X<22>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico (Aib) e isoleucina (Ile); X<25>representa la siguiente estructura:

[0056]

[0058] en la que:

[0059] • * representa un enlace covalente con la glicina que precede a X<25>en la fórmula (I);

[0060] • ◆ representa un enlace covalente con la serina que sigue a X<25>en la fórmula (I); y

[0061] Z representa un grupo de fórmula (II):

[0063] -[(PEGxx)(gE)<c>C<d>],

[0065] b y c representan independientemente 1, 2, 3, 4 o 5;

[0066] PEGxx representa independientemente un derivado de polietilenglicol seleccionado del grupo que consiste en PEG<2>, PEG<2>DGA y TTDS;

[0067] gE representa ácido gamma-glutámico; y

[0068] C<d>representa un grupo acilo C<12>-C<22>saturado lineal;

[0069] S representa serina (Ser);

[0070] X<27>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en treonina (Thr), lisina (Lys), arginina (Arg) y glutamina (Gln);

[0071] X<28>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en triptófano (Trp), fenilalanina (Phe), 5-fluorotriptófano (Trp(5F)), 5-cloro-triptófano (Trp(5Cl)), 5-metoxi-triptófano (Trp(5OMe)), tirosina (Tyr), 4-fluoro-fenilalanina (Pfp), 1-naftilalanina (1-Nal), 2-naftilalanina (2-Nal), α-metil-triptófano (Mtr), α-metil-fenilalanina (Mph) y 5-hidroxitriptófano (Wox);

[0072] X<29>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina (Ser), D-serina (Dser), ácido 2-aminoisobutírico (Aib), treonina (Thr), α-metil-serina (Mse), Nε-acetil-lisina (K(Ac)) y valina (Val);

[0073] X<30>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico (Aib), α-metil-lisina (Mly), D-lisina (Dlys), lisina, homolisina (Hly), ornitina (Orn), arginina (Arg) y α-metil-arginina (Mar);

[0074] X<31>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en arginina (Arg), Nω-metil-arginina (Rme), alanina (Ala), Nω,Nω'-dimetil-arginina (Rds, dimetilarginina simétrica) y citrulina (Cit);

[0075] X<32>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina (Lys), alanina (Ala), arginina (Arg), Nεacetil-lisina (K(Ac)) y Nε,Nε,Nε-tri-metil-lisina (Tml); y

[0076] X<33>representa un aminoácido seleccionado entre lisina (Lys), Nε-acetil-lisina (K(Ac)), leucina (Leu), arginina (Arg) y alanina (Ala);

[0077] o una sal o solvato del mismo.

[0079] La presente invención se refiere a un péptido capaz de activar el receptor RXFP1 que tiene la siguiente fórmula (I):

[0081] N<ter>-Ac-X<10>-E-G-R-E-X<15>-V-R-X<18>-X<19>-I-X<21>-X<22>-E-G-X<25>-S-X<27>-X<28>-X<29>-X<30>-X<31>-X<32>-X<33>-NH<2>-C<ter>

[0082] en donde:

[0083] N<ter>representa el extremo N-terminal del péptido;

[0084] C<ter>representa el extremo C-terminal del péptido;

[0085] Ac representa un grupo acetilo;

[0086] X<10>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, ácido 2-amino-isobutírico, Nε-acetillisina y α-metil-leucina;

[0087] E representa ácido glutámico;

[0088] G representa glicina;

[0089] R representa arginina;

[0090] X<15>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, arginina, homolisina, homoarginina, ornitina, glutamina, fenilalanina y leucina;

[0091] V representa valina;

[0092] X<18>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina, ácido 2-amino-isobutírico, leucina, Nεacetil-lisina y glutamina;

[0093] X<19>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, Nε-acetil-lisina, citrulina, glutamina, alanina y ácido 2-amino-isobutírico;

[0094] I representa isoleucina;

[0095] X<21>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico y alanina;

[0096] X<22>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico e isoleucina;

[0097] X<25>representa la siguiente estructura:

[0100]

[0103] en la que:

[0104] • * representa un enlace covalente con la glicina que precede a X<25>en la fórmula (I);

[0105] • ◆ representa un enlace covalente con la serina que sigue a X<25>en la fórmula (I); y

[0106] Z representa un grupo de fórmula (II):

[0107] -[(PEGxx)(gE)<c>C<d>],

[0108] b y c representan independientemente 1, 2, 3, 4 o 5; o b representa 2, 3, 4 o 5 y

[0109] c representa 2, 3 o 4;

[0110] PEGxx representa independientemente un derivado de polietilenglicol seleccionado del grupo que consiste en PEG<2>, PEG<2>DGA y TTDS;

[0111] gE representa ácido gamma-glutámico; y

[0112] C<d>representa un grupo acilo C<12>-C<22>saturado lineal;

[0113] S representa serina;

[0114] X<27>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en treonina, lisina, arginina y glutamina;

[0115] X<28>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en triptófano, fenilalanina, 5-fluoro-triptófano, 5-cloro-triptófano, 5-metoxi-triptófano, tirosina, 4-fluoro-fenilalanina, 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, α-metil-triptófano, αmetil-fenilalanina y 5-hidroxi-triptófano;

[0116] X<29>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina, D-serina, ácido 2-amino-isobutírico, treonina, α-metil-serina, Nε-acetil-lisina y valina;

[0117] X<30>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico, α-metil-lisina, D-lisina, lisina, homolisina, ornitina, arginina y α-metil-arginina;

[0118] X<31>representa arginina

[0119] X<32>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, alanina, arginina, Nε-acetil-lisina y Nε,Nε,Nε-tri-metil-lisina; y

[0120] X<33>representa un aminoácido seleccionado de lisina, Nε-acetil-lisina, leucina, arginina y alanina;

[0121] o una sal del mismo o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente.

[0122] Un péptido que tiene la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente es capaz de activar el receptor RXFP1.

[0123] Otro objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende al menos un péptido de acuerdo con la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente, junto con al menos un portador farmacéuticamente aceptable.

[0124] Un objeto adicional de la presente invención se refiere a un péptido de la invención, una sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente, o una composición farmacéutica del mismo de acuerdo con la invención, para su uso como medicamento.

[0125] Por consiguiente, la presente invención se refiere, además, a un péptido de la invención, una sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente o una composición farmacéutica del mismo de acuerdo con la invención, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de diversas enfermedades o afecciones que implican el receptor RXFP1, más particularmente en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o afecciones seleccionadas de:

[0126] • el grupo que consiste en fibrosis; enfermedades fibróticas, en particular esclerosis sistémica, esclerodermia y fibromialgia; fibrosis pulmonar idiopática; enfermedades renales que implican fibrosis; hipertensión pulmonar y preeclampsia;

[0127] • el grupo que consiste en enfermedades cardíacas y vasculares, en particular del grupo que consiste en insuficiencia cardíaca aguda o crónica, insuficiencia cardíaca sistólica o diastólica, arteriopatía coronaria, aterosclerosis, angina microvascular y complicación cardiovascular de la diabetes; y/o

[0128] • el grupo que consiste en insuficiencias renales, en particular disfunción renal en la cirrosis, nefropatía crónica y lesión renal aguda.

[0129] •

[0130] En una realización, dicha enfermedad o afección se puede seleccionar del grupo que consiste en enfermedades cardíacas y vasculares, en particular del grupo que consiste en insuficiencia cardíaca aguda o crónica, insuficiencia cardíaca sistólica o diastólica, arteriopatía coronaria, aterosclerosis, angina microvascular y complicación cardiovascular de la diabetes.

[0131] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0132] Definiciones

[0133] Como se usa en el presente documento:

[0134] • "X<y>" usado en las fórmulas de la invención con y que tiene diferentes valores representa un aminoácido como se define en la definición de dichas fórmulas. y indica la posición de dicho aminoácido en la cadena B nativa de la relaxina-2. Por ejemplo, X<10>representa el aminoácido en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la cadena B nativa de la relaxina-2.

[0135] • "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un fluido, especialmente un líquido que comprende un péptido de la invención, de modo que la composición farmacéutica es fisiológicamente tolerable, es decir, se puede administrar al cuerpo individual sin toxicidad ni molestias indebidas.

[0136] • un péptido "biológicamente activo" de acuerdo con la invención es un péptido capaz de activar el receptor RXFP1.

[0137] • Cuando proceda, los aminoácidos en los péptidos de la invención pueden ser cada uno independientemente L-aminoácidos o D-aminoácidos. En una realización particular, los aminoácidos de acuerdo con la presente invención son L-aminoácidos. En el presente texto, si no se indica información con respecto a la forma L o D de un aminoácido dado, entonces este aminoácido es un aminoácido L.

[0138] • N<ter>y C<ter>son marcadores convencionales utilizados para indicar, respectivamente, el extremo N-terminal del péptido y el extremo C-terminal del péptido de la invención.

[0139] • Un "péptido" o "péptido de relaxina" de acuerdo con la invención es un péptido de la cadena B de la relaxina lipidado modificado de acuerdo con la presente invención. En particular, dicho "péptido" o "péptido de relaxina" significa un péptido que es biológicamente activo, es decir, que muestra una actividad biológica típicamente asociada con la relaxina y, en particular, que es, como se ha indicado anteriormente en el presente documento, capaz de activar el receptor RXFP1. El nivel de dicha actividad biológica de la relaxina mostrado por los péptidos modificados de acuerdo con la invención puede ser equivalente o potenciado ventajosamente cuando se compara con la actividad de una relaxina natural o nativa, o incluso cuando se compara con péptidos de relaxina ya divulgados diferentes del de la presente invención.

[0140] • El término "nativa", como se usa en el presente texto en relación con la relaxina, se refiere a moléculas naturales o de tipo silvestre.

[0141] • "Prevenir" pretende significar reducir el riesgo de manifestación del fenómeno en cuestión. Esta reducción puede ser total o parcial, es decir, da como resultado un grado de riesgo que es menor que el preexistente del uso de acuerdo con la invención.

[0142] • "Tratar" pretende significar reducir o incluso eliminar la afección o enfermedad indeseables en cuestión. • "individuo" o "paciente" se refiere a un mamífero humano o no humano afectado o que es probable que se vea afectado por una afección considerada de acuerdo con la invención. Dicho individuo es en particular un ser humano.

[0143] •

[0144] Los presentes inventores han diseñado nuevos péptidos modificados, en particular péptidos lipidados.

[0146] Los inventores han descubierto inesperadamente en el presente documento que un péptido más corto y fuertemente modificado de acuerdo con la invención, es decir, una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la invención, tiene una actividad biológica superior, en particular una capacidad superior para activar el receptor RXFP1 en comparación con la relaxina de cadena B única conocida en la técnica

[0147] Péptidos de la invención

[0149] Los péptidos de acuerdo con la invención se caracterizan por que son de fórmula (I):

[0151] N<ter>-Ac-X<10>-E-G-R-E-X<15>-V-R-X<18>-X<19>-I-X<21>-X<22>-E-G-X<25>-S-X<27>-X<28>-X<29>-X<30>-X<31>-X<32>-X<33>-NH<2>-C<ter>

[0152] en donde:

[0153] N<ter>representa el extremo N-terminal del péptido;

[0154] C<ter>representa el extremo C-terminal del péptido;

[0155] Ac representa un grupo acetilo;

[0156] X<10>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, ácido 2-amino-isobutírico, Nε-acetillisina y α-metil-leucina;

[0157] E representa ácido glutámico;

[0158] G representa glicina;

[0159] R representa arginina;

[0160] X<15>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, arginina, homolisina, homoarginina, ornitina, glutamina, fenilalanina y leucina;

[0161] V representa valina;

[0162] X<18>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina, ácido 2-amino-isobutírico, leucina, Nεacetil-lisina y glutamina;

[0163] X<19>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, Nε-acetil-lisina, citrulina, glutamina, alanina y ácido 2-amino-isobutírico;

[0164] I representa isoleucina;

[0165] X<21>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico y alanina;

[0166] X<22>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico e isoleucina;

[0167] X<25>representa la siguiente estructura:

[0168]

[0170] en la que:

[0171] • * representa un enlace covalente con la glicina que precede a X<25>en la fórmula (I);

[0172] • ◆ representa un enlace covalente con la serina que sigue a X<25>en la fórmula (I); y

[0173] Z representa un grupo de fórmula (II):

[0174] -[(PEGxx)(gE)<c>C<d>],

[0175] b y c representan independientemente 1, 2, 3, 4 o 5; o b representa 2, 3, 4 o 5 y

[0176] c representa 2, 3 o 4;

[0177] PEGxx representa independientemente un derivado de polietilenglicol seleccionado del grupo que consiste en PEG<2>, PEG<2>DGA y TTDS;

[0178] gE representa ácido gamma-glutámico; y

[0179] C<d>representa un grupo acilo C<12>-C<22>saturado lineal;

[0180] S representa serina;

[0181] X<27>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en treonina, lisina, arginina y glutamina;

[0182] X<28>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en triptófano, fenilalanina, 5-fluoro-triptófano, 5-cloro-triptófano, 5-metoxi-triptófano, tirosina, 4-fluoro-fenilalanina, 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, α-metil-triptófano, αmetil-fenilalanina y 5-hidroxi-triptófano;

[0183] X<29>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina, D-serina, ácido 2-amino-isobutírico, treonina, α-metil-serina, Nε-acetil-lisina y valina;

[0184] X<30>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico, α-metil-lisina, D-lisina, lisina, homolisina, ornitina, arginina y α-metil-arginina;

[0185] X<31>representa arginina;

[0186] X<32>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, alanina, arginina, Nε-acetil-lisina y Nε,Nε,Nε-tri-metil-lisina;

[0187] X<33>representa un aminoácido seleccionado de lisina, Nε-acetil-lisina, leucina, arginina y alanina;

[0188] o una sal del mismo o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con una molécula de disolvente.

[0189] La presente invención también incluye sales de los péptidos de las fórmulas (I) o (Ia) definidas en el presente documento, en una realización, sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales como aducto de ácido con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido perclórico, ácido tiociánico y ácido bórico; o con un ácido orgánico tal como ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido glucónico, ácido láctico, ácido malónico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido naftalenosulfónico y ácido sulfanílico; y sales con metales tales como un metal alcalino, por ejemplo, sodio, potasio, litio, zinc y aluminio.

[0190] En una realización, las sales de los péptidos son sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, aductos de ácido con ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido glucónico, ácido láctico, ácido malónico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido naftalenosulfónico y ácido sulfanílico; y sales con metales tales como un metal alcalino, por ejemplo, sodio, potasio, litio y zinc.

[0191] La divulgación también incluye solvatos, en una realización solvatos farmacéuticamente aceptables, de los péptidos de las fórmulas anteriores (I) o (Ia).

[0192] Los solvatos significan complejos de los compuestos de la invención o sus sales con moléculas de disolvente, por ejemplo moléculas de disolvente orgánico y/o agua.

[0193] La presente invención incluye complejos de dicho péptido o sales del mismo con moléculas de disolvente

[0194] De acuerdo con una realización, la divulgación también incluye una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de los péptidos de la invención.

[0195] De acuerdo con una realización, la invención también incluye sales o complejos farmacéuticamente aceptables de dicho péptido o sales del mismo con moléculas de disolvente.

[0197] Como se ilustra, un péptido de acuerdo con la invención es una secuencia de aminoácidos.

[0199] De acuerdocon la nomenclatura polipeptídica estándar (J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969)) las abreviaturas para residuos de aminoácidos α utilizadas en la presente invención son las siguientes:

[0201]

[0204] Para aminoácidos no naturales o modificados se usan las siguientes abreviaturas:

[0206]

[0207]

[0209] En todas las fórmulas de acuerdo con la invención, donde la secuencia de aminoácidos se representa usando las abreviaturas mencionadas anteriormente y representaciones de X<y>tales como X<18>, por ejemplo, la orientación izquierda y derecha está en la dirección convencional del extremo amino al extremo carboxilo.

[0210] Por consiguiente, por ejemplo, representando X<28>un aminoácido seleccionado del grupo de triptófano, 5-fluorotriptófano, 5-cloro-triptófano, 5-metoxi-triptófano, tirosina, fenilalanina, 4-fluoro-fenilalanina, 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, α-metil-triptófano, α-metil-fenilalanina y 5-hidroxi-triptofano, el extremo N-terminal o grupo amina de dicho aminoácido está unido al aminoácido representado por X<27>y el extremo C-terminal o grupo carboxilo de dicho aminoácido está unido al aminoácido representado por X<29>.

[0211] En su extremo N-terminal (N<ter>), un péptido de la invención está sustituido con un grupo acetilo (Ac): CH<3>C(O)-. En su extremo C-terminal (C<ter>), un péptido de la invención está sustituido con un grupo -NH<2>.

[0212] En su posición X<25>, un péptido de la invención comprende la siguiente estructura:

[0215]

[0217] Esta estructura corresponde a un aminoácido de lisina en donde:

[0218] • el átomo de nitrógeno alfa (α) (*) está unido a la parte previa del péptido, es decir, con el grupo en N<ter>de X<25>basándose en la orientación N<ter>-C<ter>representada en las fórmulas de acuerdo con la invención, a través de un enlace covalente, en particular a través de un enlace peptídico, es decir, con la glicina en la posición 24 (X<24>);

[0219] • el átomo de carbono del grupo carboxilo (+) está unido a la parte del péptido después de la posición X<25>, es decir, con el grupo en C<ter>de X<25>basándose en la orientación N<ter>-C<ter>representada en las fórmulas de acuerdo con la invención, a través de un enlace covalente, en particular a través de un enlace peptídico, es decir, con la serina en la posición 26 (X<26>); y

[0220] • el átomo de nitrógeno de su cadena lateral está unido a un grupo Z.

[0221] •

[0222] Este grupo Z se define como siendo de fórmula (II):

[0223] -[(PEGxx)(gE)<c>C<d>],

[0224] En la fórmula (II), el - representa un enlace covalente con el átomo de nitrógeno de la cadena lateral de la estructura de lisina en X<25>.

[0225] b y c representan independientemente 1, 2, 3, 4 o 5, en particular 2, 3, 4 o 5.

[0226] En una realización particular, b representa 2, 3, 4 o 5.

[0227] En una realización particular, c representa 2, 3 o 4.

[0228] En una realización preferida, b representa 2, 3, 4 o 5 y c representa independientemente 2, 3 o 4.

[0229] PEGxx en las fórmulas de la invención representa independientemente un derivado de polietilenglicol seleccionado del grupo que consiste en PEG<2>, PEG<2>DGA y TTDS;

[0230] Dichos grupos se definen de la siguiente manera:

[0232]

[0234] En los que, en (PEGxx)de fórmula (II), △ representa un enlace covalente con el grupo (gE)<c>y □ representa un enlace covalente que une el grupo de fórmula (II) con el átomo de nitrógeno de la cadena lateral de la estructura de lisina en X<25.>

[0235] En una realización particular, (PEGxx)representa un derivado de polietilenglicol seleccionado del grupo que consiste en (TTDS)<2>, (TTDS)<3>, (PEG<2>DGA)<3>, (PEG<2>)<3>, (PEG<2>)<4>y (PEG<2>)<5>.

[0236] Como se ha indicado anteriormente, gE, que también puede representarse como γE, gGlu o γGlu, representa un ácido gamma-glutámico. Este aminoácido tiene la siguiente estructura:

[0239]

[0241] En la que, cuando se representa en la fórmula (II) como (gE)<c>, △ representa un enlace covalente con C<d>y □ representa un enlace covalente con el grupo (PEGxx)b.

[0242] C<d>representa un grupo acilo C<12>-C<22>saturado lineal, en particular un grupo acilo saturado lineal seleccionado del grupo que consiste en un grupo acilo C<12>(Lau), C<14>(Myr), C<15>(Penta), C<16>(Palm), C<17>(Hepta), C<18>(Stea), C<20>(Eico) y C<22>(Doco). En una realización, C<k>representa un grupo acilo saturado lineal seleccionado del grupo que consiste en un grupo acilo C<12>(Lau), C<14>(Myr), C<15>(Penta), C<16>(Palm), C<17>(Hepta) o C<18>(Stea), en particular un grupo acilo C<14>, C<16>o C<18>saturado lineal, e incluso más particularmente un grupo acilo C<16>o C<18>lineal.

[0243] En una realización particular, C<d>representa un grupo acilo C<12>saturado lineal. Un grupo acilo C<12>saturado lineal de la invención es un grupo lauroílo (también representado como "Lau" en el presente texto).

[0244] En una realización particular, C<d>representa un grupo acilo C<14>saturado lineal. Un grupo acilo de C<14>saturado lineal de la invención es un grupo miristoílo (también representado como "Myr" en el presente texto).

[0245] En una realización particular, C<d>representa un grupo acilo C<15>saturado lineal. Un grupo acilo C<15>saturado lineal de la invención es un grupo pentadecanoílo (también representado como "Penta" en el presente texto).

[0246] En una realización particular, C<d>representa un grupo acilo C<16>saturado lineal. Un grupo acilo C<16>saturado lineal de la invención es un grupo palmitoílo (también representado como "Palm" en el presente texto).

[0247] En una realización particular, C<d>representa un grupo acilo C<17>saturado lineal. Un grupo acilo C<17>saturado lineal de la invención es un grupo heptadecanoílo (también representado como "Hepta" en el presente texto).

[0248] En otra realización particular, C<d>representa un grupo acilo C<18>saturado lineal. Un grupo acilo C<18>saturado lineal de la invención es un grupo estearoílo (también representado como "Stea" en el presente texto).

[0249] En otra realización particular, C<d>representa un grupo acilo C<20>saturado lineal. Un grupo acilo C<20>saturado lineal de la invención es un grupo eicosanoilo (también representado como "Eico" en el presente texto).

[0250] En otra realización particular, C<d>representa un grupo acilo C<22>saturado lineal. Un grupo acilo C<22>saturado lineal de la invención es un grupo docosanoílo (también representado como "Doco" en el presente texto).

[0251] En una realización particular, Z se selecciona del grupo que consiste en -(TTDS)<2>-(ácido gamma glutámico)<3>-palmitoílo (-(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm), -(TTDS)<3>-(ácido gamma glutámico)<3>-palmitoílo (-(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm), -(PEG<2>DGA)<3>-(ácido gamma glutámico)<3>-palmitoílo (-(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm), -(PEG<2>)<4>-(ácido gamma glutámico)<3>-palmitoílo (-(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Palm), -(TTDS)<2>-(ácido gamma glutámico)<2>-palmitoílo (-(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm), -(TTDS)<2>-(ácido gamma glutámico)<3>- (-(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea), -(TTDS)<3>-(ácido gamma glutámico)<3>-estearoílo (-(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea), -(PEG<2>DGA)<3>-(ácido gamma glutámico)<3>-estearoílo (-(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Stea), -(PEG<2>DGA)<3>-(ácido gamma glutámico)<4>-estearoílo (-(PEG2DGA)<3>-(gE)<4>-Stea), -(PEG<2>)<3>-(ácido gamma glutámico)<3>-palmitoílo (-(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm), -(PEG<2>)<4>-(ácido gamma glutámico)<3>-estearoílo (-(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea), -(PEG<2>)<5>-(ácido gamma glutámico)<3>-palmitoílo (-(PEG<2>)<5>-(gE)<3>-Palm), -(PEG<2>)<5>-(ácido gamma glutámico)<4>-palmitoílo (-(PEG<2>)<5>-(gE)<4>-Palm), -(TTDS)<3>-(ácido gamma glutámico)<4>-estearoílo (-(TTDS)<3>-(gE)<4>-Stea), -(TTDS)<2>-(ácido gamma glutámico)<4>-palmitoílo (-(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm), -(TTDS)<3>-(ácido gamma glutámico)<2>-estearoílo (-(TTDS)<3>-(gE)<2>-Stea) y -(TTDS)<2>-(ácido gamma glutámico)<4>-estearoílo (-(TTDS)<2>-(gE)<4>-Stea), en una realización más particular Z se selecciona del grupo que consiste en -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea y -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, en una realización especial Z se selecciona del grupo que consiste en -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea y -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, por ejemplo -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm y -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea.

[0252] En todos estos grupos Z, el primer símbolo - representa el enlace covalente entre el grupo Z y el átomo de nitrógeno de la cadena lateral de la estructura de lisina X<25>.

[0253] Por consiguiente, cuando el grupo Z se representa, por ejemplo, como -(TTDS)<2>-(ácido gamma glutámico)<3>-palmitoílo (también representado como -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm), el primer grupo TTDS se une al átomo de nitrógeno de la cadena lateral de la estructura X<25>. Un enlace covalente también se une al segundo grupo TTDS mientras que otro enlace covalente une este segundo grupo TTDS al primer ácido gamma-glutámico (gE). Este primer ácido gamma-glutámico (gE) está, a su vez, unido a través de un enlace covalente al segundo ácido gamma-glutámico (gE), este segundo ácido gamma-glutámico (gE) está unido a través de otro enlace covalente al tercer ácido gamma-glutámico (gE) y este tercer grupo de ácido gamma-glutámico (gE) está unido además por un enlace covalente a un grupo palmitoílo (Palm). Además, debe entenderse a partir de la presente solicitud que un grupo Z de acuerdo con la invención representado, por ejemplo, como -(TTDS)<2>-(ácido gamma glutámico)<3>-palmitoílo (también representado como -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm) también podría haber sido representado -TTDS-TTDS-gE-gE-gE-gE-Palm.

[0254] Lo mismo se aplicamutatis mutandispara los otros grupos Z representados de acuerdo con la invención.

[0255] De acuerdo con una realización particular, un péptido de acuerdo con la invención es de fórmula (Ia):

[0256] N<ter>-Ac-L-E-G-R-E-X<15>-V-R-X<18>-X<19>-I-Aib-Aib-E-G-X<25>-S-T-X<28>-X<29>-X<30>-R-X<32>-X<33>-NH<2>-C<ter>en donde:

[0257] N<ter>representa el extremo N-terminal del péptido;

[0258] C<ter>representa el extremo C-terminal del péptido;

[0259] Ac representa un grupo acetilo;

[0260] L representa leucina;

[0261] E representa ácido glutámico;

[0262] G representa glicina;

[0263] R representa arginina;

[0264] X<15>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, arginina, homolisina, glutamina, fenilalanina y leucina;

[0265] V representa valina;

[0266] X<18>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina y ácido 2-amino-isobutírico;

[0267] X<19>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, Nε-acetil-lisina, glutamina y citrulina; I representa isoleucina;

[0268] Aib representa ácido 2-amino-isobutírico;

[0269] X<25>representa la siguiente estructura:

[0272]

[0275] en la que:

[0276] • * representa un enlace covalente con la glicina que precede a X<25>en la fórmula (Ia);

[0277] • ◆ representa un enlace covalente con la serina que sigue a X<25>en la fórmula (Ia); y

[0278] Z se selecciona del grupo que consiste

[0279] en un -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<4>-Stea, -(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<5>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<5>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<2>-Stea y -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Stea, en donde

[0280] gE representa ácido gamma-glutámico

[0281] Palm representa palmitoílo y

[0282] Stea representa estearoílo;

[0283] S representa serina;

[0284] T representa treonina;

[0285] X<28>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en triptófano y fenilalanina;

[0286] X<29>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina, D-serina y ácido 2-amino-isobutírico; X<30>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico, α-metil-lisina, D-lisina y lisina;

[0287] X<32>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, alanina y arginina; y

[0288] X<33>representa un aminoácido seleccionado de lisina y Nε-acetil-lisina;

[0289] o una sal del mismo o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente.

[0291] De acuerdo con una realización particular, un péptido de acuerdo con la invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 1-97. En particular, un péptido de acuerdo con la invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 1-32, 34-37, 39, 42, 44, 45, 47-49, 51 y 54-97.

[0293] En una realización particular para un péptido que tiene la siguiente fórmula (Ia) como se ha descrito anteriormente: X<19>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Nε-acetil-lisina y citrulina;

[0294] X<25>representa la siguiente estructura:

[0297]

[0300] en la que:

[0301] • * representa un enlace covalente con la glicina que precede a X<25>en la fórmula (Ia);

[0302] • ◆ representa un enlace covalente con la serina que sigue a X<25>en la fórmula (Ia); y

[0303] Z se selecciona del grupo que consiste

[0304] en un -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea y -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, en donde

[0305] gE representa ácido gamma-glutámico

[0306] Palm representa palmitoílo y

[0307] Stea representa estearoílo;

[0308] X<32>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina y alanina; y

[0309] X<33>representa Nε-acetil-lisina

[0310] o una sal del mismo o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente.

[0312] De acuerdo con otra realización, un péptido de acuerdo con la invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 1-30.

[0314] En una realización particular, un péptido de acuerdo con la invención de fórmula (Ia) es tal que:

[0315] N<ter>representa el extremo N-terminal del péptido;

[0316] C<ter>representa el extremo C-terminal del péptido;

[0317] Ac representa un grupo acetilo;

[0318] L representa leucina;

[0319] E representa ácido glutámico;

[0320] G representa glicina;

[0321] R representa arginina;

[0322] X<15>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina y homolisina; V representa valina; X<18>representa alanina;

[0323] X<19>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Nε-acetil-lisina y citrulina;

[0324] I representa isoleucina;

[0325] Aib representa ácido 2-amino-isobutírico;

[0326] X<25>representa la siguiente estructura:

[0329]

[0332] en la que:

[0333] • * representa un enlace covalente con la glicina que precede a X<25>en la fórmula (Ia);

[0334] • ◆ representa un enlace covalente con la serina que sigue a X<25>en la fórmula (Ia); y

[0335] Z se selecciona del grupo que consiste en -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea y -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea, en donde gE representa ácido gamma-glutámico

[0336] Palm representa palmitoílo y

[0337] Stea representa estearoílo;

[0338] S representa serina;

[0339] T representa treonina;

[0340] X<28>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en triptófano y fenilalanina;

[0341] X<29>representa serina;

[0342] X<30>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico y α-metil-lisina; X<32>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, alanina y arginina; y

[0343] X<33>representa un aminoácido seleccionado de lisina y Nε-acetil-lisina;

[0344] o una sal o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente.

[0346] En una realización especial, un péptido de acuerdo con la invención de fórmula (Ia) es tal que:

[0347] N<ter>representa el extremo N-terminal del péptido;

[0348] C<ter>representa el extremo C-terminal del péptido;

[0349] Ac representa un grupo acetilo;

[0350] L representa leucina;

[0351] E representa ácido glutámico;

[0352] G representa glicina;

[0353] R representa arginina;

[0354] X<15>representa lisina;

[0355] V representa valina;

[0356] X<18>representa alanina;

[0357] X<19>representa Nε-acetil-lisina;

[0358] I representa isoleucina;

[0359] Aib representa ácido 2-amino-isobutírico;

[0360] X<25>representa la siguiente estructura:

[0363]

[0366] en la que:

[0367] • * representa un enlace covalente con la glicina que precede a X<25>en la fórmula (Ia);

[0368] • ◆ representa un enlace covalente con la serina que sigue a X<25>en la fórmula (Ia); y

[0369] Z se selecciona del grupo que consiste en -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea y -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea, en donde

[0370] gE representa ácido gamma-glutámico

[0371] Palm representa palmitoílo y

[0372] Stea representa estearoílo;

[0373] S representa serina;

[0374] T representa treonina;

[0375] X<28>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en triptófano y fenilalanina;

[0376] X<29>representa serina;

[0377] X<30>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico y α-metil-lisina; X<32>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, alanina y arginina; y

[0378] X<33>representa un aminoácido seleccionado de lisina y Nε-acetil-lisina;

[0379] o una sal o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente.

[0381] De acuerdo con una realización particular, un péptido de acuerdo con la invención es de fórmula (Ib):

[0383] N<ter>-Ac-X<10>-E-G-R-E-X<15>-V-R-X<18>-X<19>-I-X<21>-X<22>-E-G-X<25>-S-X<27>-X<28>-X<29>-X<30>-R-X<32>-X<33>-NH<2>-C<ter>

[0384] en donde:

[0385] N<ter>representa el extremo N-terminal del péptido;

[0386] C<ter>representa el extremo C-terminal del péptido;

[0387] Ac representa un grupo acetilo;

[0388] X<10>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, Nε-acetil-lisina y ácido 2-aminoisobutírico;

[0389] E representa ácido glutámico;

[0390] G representa glicina;

[0391] R representa arginina;

[0392] X<15>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, arginina, homolisina, glutamina, fenilalanina y leucina;

[0393] V representa valina;

[0394] X<18>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina, ácido 2-amino-isobutírico y Nε-acetillisina;

[0395] X<19>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, Nε-acetil-lisina, glutamina y citrulina; I representa isoleucina;

[0396] X<21>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico y alanina;

[0397] X<22>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico e isoleucina;

[0398] X<25>representa la siguiente estructura:

[0399]

[0401] en la que:

[0402] • * representa un enlace covalente con la glicina que precede a X<25>en la fórmula (Ia);

[0403] • ◆ representa un enlace covalente con la serina que sigue a X<25>en la fórmula (Ia); y

[0404] Z se selecciona del grupo que consiste en un -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<4>-Stea, -(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<5>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<5>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<2>-Stea, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<4>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Myr y -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Myr en donde

[0405] gE representa ácido gamma-glutámico

[0406] Palm representa palmitoílo y

[0407] Stea representa estearoílo;

[0408] S representa serina;

[0409] X<27>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en treonina, glutamina, arginina y lisina;

[0410] X<28>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en triptófano, fenilalanina, 5-clorotriptófano, αmetil-fenilalanina, 4-fluoro-fenilalanina y 5-fluorotriptófano;

[0411] X<29>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina, D-serina, ácido 2-amino-isobutírico, Nεacetil-lisina, treonina y valina;

[0412] X<30>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico, α-metil-lisina, D-lisina, lisina, homolisina y arginina;

[0413] X<32>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, alanina, arginina y Nε-acetil-lisina; y X<33>representa un aminoácido seleccionado de lisina, Nε-acetil-lisina y arginina;

[0414] o una sal o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente.

[0415] En particular, Z se puede seleccionar del grupo que consiste en un -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>DGA)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<5>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<4>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Myr y -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Myr.

[0416] En una realización particular de la invención, un péptido de la invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 20, 21, 22, 26, 28 y 30.

[0417] En una realización particular de la invención, un péptido de la invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 6, 7, 9-12, 20-22, 26, 28, 30-34, 45, 47-49, 51, 54-62, 64, 67-69, 71-93, 96 y 97. Como se ha indicado anteriormente en el presente documento y se ilustra en los ejemplos adjuntos, estos péptidos son particularmente ventajosos ya que todos tienen una EC<50>inferior o igual a 1 nM.

[0418] En particular, un péptido de la invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 6, 7, 13, 20, 26 y 30.

[0419] En particular, un péptido de la invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 6, 7, 20, 26, 30-34, 45, 48, 49, 51, 54-61, 67, 71, 73, 75-79, 81, 83-92 y 97. Como se ilustra en los ejemplos adjuntos, los péptidos de acuerdo con esta realización son particularmente ventajosos ya que todos tienen una EC<50>inferior o igual a 0,5 nM.

[0420] En una realización particular, un péptido de la invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 20, y particularmente tiene la secuencia de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 3.

[0421] Un péptido de la invención se puede producir mediante cualquier técnica conocidaper seen la técnica, tal como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, ya sea sola o en combinación. Conociendo la secuencia de aminoácidos de la secuencia deseada, un experto en la técnica puede producir fácilmente dichos polipéptidos, mediante técnicas estándar para la producción de polipéptidos, incluso si se usan aminoácidos no naturales o de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento.

[0422] Por ejemplo, los péptidos de la invención se pueden sintetizar usando un método de fase sólida bien conocido, en particular usando un aparato de síntesis de péptidos disponible en el mercado (tal como el producido por Applied Biosystems, Foster City, California, Gyros Protein Technologies, Tucson, Arizona o CEM Corporation, Matthews, Carolina del Norte) y siguiendo las instrucciones del fabricante.

[0423] En los ejemplos adjuntos se ilustran ejemplos de métodos apropiados.

[0424] Un péptido de la invención puede marcarse con al menos una molécula o sustancia detectable, en particular seleccionada del grupo que consiste en enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos.

[0425] Sin embargo, es importante que dicho marcador no altere o impida que dicho péptido tenga su actividad biológica de interés tal como se definió previamente, es decir, no impida o altere la capacidad peptídica para unirse a y activar el receptor RXFP1.

[0426] Las moléculas o sustancias detectables preferidas para el soporte nanomaterial son aquellas que se pueden detectar externamente de una manera no invasiva después de la administraciónin vivo.

[0427] Las moléculas o sustancias detectables son bien conocidas por el experto en la técnica

[0428] Dicho péptido marcado de la invención se puede usar en un método de diagnóstico y/o formación de imágenes. Los inventores han observado además que la semivida, y en particular la semividain vivode los péptidos de la invención es significativamente superior a la de la relaxina.

[0429] De hecho, la relaxina es rápidamente eliminada por el riñón y no puede ser utilizada en un entorno crónico. La hormona recombinante tiene una semividain vivomuy corta (como se ilustra en el mono y el ser humano en B.L. Ferraiolo et al. Pharm.Res. (1991), 8, 1032 y en S.A. Chen et al. Pharm. Res. (1993), 10, 834) y requiere administración intravenosa. La semivida de la relaxina es, de hecho, tan corta que podría ser necesaria una infusión continua durante varias horas en un entorno hospitalario para su administración a un individuo que lo necesite, en particular un individuo que padece una enfermedad o trastorno agudo, tal como, por ejemplo, una insuficiencia cardíaca aguda. El reemplazo de la relaxina en este tratamiento por péptidos de relaxina que tienen una semividain vivomejorada permite ventajosamente el reemplazo de este tratamiento restrictivo por uno más sencillo, tal como una única administración diaria, por ejemplo, por vía intravenosa o subcutánea.

[0430] Por consiguiente, los péptidos de relaxina de la invención, que poseen la capacidad de la relaxina para activar RXFP1, y más particularmente péptidos que son agonistas de larga duración de RXFP1, tienen el potencial de aplicaciones terapéuticas más amplias que incluyen insuficiencia cardíaca aguda o crónica.

[0431] Composiciones y medicamentos

[0432] La presente solicitud también se refiere a un medicamento o una composición farmacéutica que comprende al menos un péptido de la invención como se ha descrito anteriormente, o uno de su sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente, y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.

[0433] Al menos un péptido de la invención está presente en un medicamento o composición farmacéutica de la invención como principio activo.

[0434] Una composición o un medicamento de la invención está en una forma adecuada para la administración a mamíferos. Una composición o un medicamento de la invención se puede administrar, por ejemplo, por vía oral, parenteral, intravenosa, rectal, transdérmica, tópica o por inhalación. En particular, una composición de acuerdo con la invención se administra por vía intravenosa o subcutánea.

[0435] De acuerdo con una realización particular, el portador farmacéuticamente aceptable de una composición de la invención se selecciona adecuadamente del grupo que consiste en un líquido portador inyectable tal como agua estéril para inyección; y una solución acuosa tal como solución salina.

[0436] Una composición o un medicamento de la invención puede comprender un contenido de péptidos de la invención comprendido entre 0,01 mg/ml y 30 mg/ml, en particular entre 0,3 mg/ml y 3 mg/ml.

[0437] Un medicamento o una composición farmacéutica de la invención puede comprender al menos un péptido de la invención como único principio activo o también puede comprender al menos otro principio activo, siempre que dicho otro principio activo no impida la actividad biológica del péptido de acuerdo con la invención.

[0438] Una composición farmacéutica o un medicamento de acuerdo con la invención puede comprender además al menos un antioxidante, dispersante, emulsionante, antiespumante, saborizante, conservante, solubilizante y/o color, siempre que esta o estas sustancias adicionales no impidan las propiedades biológicas de los péptidos de acuerdo con la invención.

[0439] Las composiciones estériles de la invención para administración parenteral pueden ser, en particular, soluciones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas. Los disolventes o vehículos que se pueden usar incluyen agua, propilenglicol, un polietilenglicol, aceites vegetales, en particular aceite de oliva, ésteres orgánicos inyectables, por ejemplo oleato de etilo, u otros disolventes orgánicos adecuados. Estas composiciones también pueden comprender adyuvantes, en particular agentes humectantes, agentes de tonicidad, emulsionantes, dispersantes y estabilizantes. La esterilización se puede realizar de varias maneras, por ejemplo, mediante filtración aséptica, incorporando agentes esterilizantes en la composición, mediante irradiación o mediante calentamiento. También se pueden preparar en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en el momento de su uso en agua estéril o cualquier otro medio estéril inyectable.

[0440] Las composiciones para administración tópica pueden ser, por ejemplo, gotas nasales o aerosoles.

[0441] Para la administración subcutánea, intramuscular o intravenosa, los péptidos de la invención utilizados se convierten, si se desea con las sustancias habituales para este fin, tales como solubilizantes, emulsionantes u otros excipientes, en una solución, suspensión o emulsión. Ejemplos de disolventes adecuados son: agua, solución salina fisiológica o alcoholes, por ejemplo, etanol, propanol, glicerol, así como soluciones de azúcar tales como soluciones de glucosa o manitol, o también una mezcla de los diversos disolventes mencionados.

[0442] En una realización particular, una composición de la invención, un medicamento de la invención, o un péptido de la invención, o uno de su sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente, se administra a un individuo por vía parenteral y, en particular, se administra por vía transdérmica, intravenosa, subcutánea o intramuscular, en particular por vía intravenosa o subcutánea.

[0443] Los métodos para preparar composiciones administrables por vía parenteral son evidentes para los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, con más detalle en Remington's Pharmaceutical Science, 15.a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.

[0444] La administración de una composición de la invención o de un péptido de la invención a un individuo puede ser una administración sistémica o una administración localizada en un tejido, órgano y/o sitio del organismo individual donde se conoce, se espera o se necesita determinar la presencia de, por ejemplo, una fibrosis.

[0445] Uso de los péptidos y composiciones

[0446] La presente invención se refiere a un péptido de acuerdo con la invención, su sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente, de acuerdo con la invención, para su uso como medicamento.

[0447] Además, la invención también se refiere a una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para uso como medicamento.

[0448] Además, la presente invención se refiere a un péptido de la invención, su sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente o una composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de diversas enfermedades o afecciones que implican el receptor RXFP1, más particularmente en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o afecciones seleccionadas de:

[0449] • el grupo que consiste en fibrosis; enfermedades fibróticas, en particular esclerosis sistémica, esclerodermia y fibromialgia; fibrosis pulmonar idiopática; enfermedades renales que implican fibrosis; hipertensión pulmonar y preeclampsia;

[0450] • el grupo que consiste en enfermedades cardíacas y vasculares, en particular del grupo que consiste en insuficiencia cardíaca aguda o crónica, insuficiencia cardíaca sistólica o diastólica, arteriopatía coronaria, aterosclerosis, angina microvascular y complicación cardiovascular de la diabetes; y/o

[0451] • el grupo que consiste en insuficiencias renales, en particular disfunción renal en la cirrosis; nefropatía crónica y lesión renal aguda.

[0452] •

[0453] En un aspecto, dicho péptido, sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente o composición farmacéutica de acuerdo con la invención, se administra una vez al día, en particular por vía intravenosa o subcutánea.

[0454] La posología del péptido, o de su sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente, que se va a administrar, y la frecuencia de administración, dependen del efecto deseado, la potencia y la duración de la acción de los compuestos utilizados; adicionalmente también de la naturaleza y gravedad de la enfermedad o afección a tratar y del sexo, edad, peso y capacidad de respuesta individual del mamífero a tratar. En general, el médico determinará la posología apropiada en función de la edad y el peso y todos los demás factores específicos del individuo a tratar.

[0455] También se describe un método para la prevención y/o el tratamiento en un individuo de una enfermedad o afección que implica el receptor de relaxina RXFP1 que comprende administrar a dicho individuo al menos un péptido de la invención, una sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente o una composición farmacéutica de la invención que comprende al menos un péptido de acuerdo con la invención o una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un péptido de la invención, una sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente o una composición farmacéutica de la invención que comprende al menos un péptido de acuerdo con la invención.

[0456] Como se ha indicado previamente, dicha enfermedad o afección se selecciona, en particular, de:

[0457] • el grupo que consiste en fibrosis; enfermedades fibróticas, en particular esclerosis sistémica, esclerodermia y fibromialgia; fibrosis pulmonar idiopática; enfermedades renales que implican fibrosis; hipertensión pulmonar y preeclampsia; - el grupo que consiste en enfermedades cardíacas y vasculares, en particular del grupo que consiste en insuficiencia cardíaca aguda o crónica, insuficiencia cardíaca sistólica o diastólica, arteriopatía coronaria, aterosclerosis, angina microvascular y complicación cardiovascular de la diabetes; y/o • el grupo que consiste en insuficiencias renales, en particular disfunción renal en la cirrosis; nefropatía crónica y lesión renal aguda.

[0458] •

[0459] Se describe además el uso de al menos un péptido de la invención, una sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente o una composición farmacéutica de la invención que comprende al menos un péptido de acuerdo con la invención o una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un péptido de la invención, una sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente o una composición farmacéutica de la invención que comprende al menos un péptido de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento en un individuo de una enfermedad o afección que implica el receptor de relaxina RXFP1.

[0460] Se describe además el uso de al menos un péptido de acuerdo con la invención, su sal farmacéuticamente aceptable o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente, o de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para tratar y/o prevenir una enfermedad o afección seleccionada de:

[0461] • el grupo que consiste en fibrosis; enfermedades fibróticas, en particular esclerosis sistémica, esclerodermia y fibromialgia; fibrosis pulmonar idiopática; enfermedades renales que implican fibrosis; hipertensión pulmonar y preeclampsia;

[0462] • el grupo que consiste en enfermedades cardíacas y vasculares, en particular del grupo que consiste en insuficiencia cardíaca aguda o crónica, insuficiencia cardíaca sistólica o diastólica, arteriopatía coronaria, aterosclerosis, angina microvascular y complicación cardiovascular de la diabetes; y/o

[0463] • el grupo que consiste en insuficiencias renales, en particular disfunción renal en la cirrosis; nefropatía crónica y lesión renal aguda.

[0464] •

[0465] La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos, dados puramente con fines ilustrativos.

[0466] EJEMPLOS

[0467] Ejemplo 1: síntesis de los péptidos de la invención

[0468] Material utilizado

[0469] Se utilizaron diversas resinas de amida de Rink para la síntesis de péptidos de amidas C-terminales de la invención:

[0470] • Resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxi, vendida por Chem-Impex; o

[0471] • Resina de 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)fenoxi acetamido metilo, vendida por Millipore Merck; •

[0472] Se cargaron en el intervalo de 0,2 a 0,4 mmol.g.

[0473] Los aminoácidos naturales protegidos por Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo) se adquirieron de diferentes fuentes, es decir, Protein Technologies Inc., Merck Biosciences, Novabiochem, Iris Biotech, Bachem, Chem-Impex International o MATRIX Innovation.

[0474] Se usaron los siguientes aminoácidos estándar a lo largo de las síntesis: Fmoc-L-Ala-OH, Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-L-Gln(Trt)-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-L-Glu-OtBu, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L-Ile-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Lys(Boc)-OH, Fmoc-L-Met-OH, Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc-L-Ser(tBu)-OH, Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH y Fmoc-L-Val-OH.

[0475] Además, se adquirieron los siguientes aminoácidos especiales de los mismos proveedores que anteriormente: Fmoc-L-hArg(Pbf)-OH, Fmoc-L-Cit-OH, Fmoc-L-Arg(Me,Pbf)-OH, Fmoc-L-hLys(Boc)-OH, Fmoc-L-Orn(Boc)-OH, Fmoc-L-Lys(Dde)-OH, Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH, Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-L-Lys(aloc)-OH, Fmoc-L-Lys(Ac)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-L-α-Me-Ser(tBu)-OH, Fmoc-L-α-Me-Lys(Boc)-OH, Fmoc-L-α-Me-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-L-α-Me-Leu-OH, Fmoc-L-Nle-OH y Fmoc-L-1-Nal-OH, Fmoc-L-2-Nal-OH Fmoc-5-Wox-OH, Fmoc-Pfp-OH, Fmoc-L-α-Me-Trp-OH, Fmoc-L-α-Me-Phe-OH.

[0477]

[0480] Para sintetizar los péptidos lipidados C-terminales de la invención, se usó lisina protegida ortogonalmente como se indica a continuación en el presente documento.

[0481] 1. A. Método general utilizado para sintetizar los péptidos de la invención

[0482] Los péptidos de acuerdo con la invención de secuencia SEQ ID NO: 1-97 se han sintetizado basándose en el método representado en las figuras 1 y 2.

[0483] Se colocaron 0,2 mmol de resina Rink amida AM en un sintetizador peptídico de microondas CEM Liberty Blue para ensamblar la secuencia peptídica completa. (véase la figura 1).

[0484] Toda la síntesis se realizó en DMF como disolvente. El péptido se sintetizó usando el protocolo de calentamiento estándar para una escala de 0,1 a 0,2 mmol:

[0485] Protocolo de calefacción estándar: irradiación a 170 vatios, 75 °C, 15 s, a continuación irradiación a 30 vatios, 90 °C, 120 s.

[0486] La desprotección se realizó con piperidina al 20 % v/v en DMF, seguido de 3 etapas de lavado con DMF.

[0487] Protocolo de calentamiento para la desprotección: irradiación a 170 vatios, 75 °C, 15 s, a continuación irradiación a 30 vatios, 90 °C, 50 s.

[0488] Los acoplamientos de aminoácidos se realizaron usando 5 eq. de Fmoc-AA como soluciones 0,2 M en DMF usando 5 eq. de N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) 0,5 M y 5 eq. de oxima (2-ciano-2-(hidroximino)acetato de etilo (Oxyma Pure<™>)) 1 M como reactivos de acoplamiento.

[0489] Para un mejor rendimiento final, cada aminoácido requirió acoplamientos dobles a 90 °C durante 120 segundos. Para el ácido 2-aminoisobutírico en las posiciones X<21>y X<22>y la serina en la posición X<29>de la fórmula (I) de acuerdo con la invención, se usó un triple acoplamiento a 90 °C durante 2 minutos.

[0490] En el caso de derivados de aminoácidos caros, por ejemplo, Fmoc-α-Metil lisina(Boc)-OH, puede ser ventajoso realizar un acoplamiento manual usando 3 eq. de aminoácido y 3 eq. de agente de acoplamiento tal como HATU o HCTU a temperatura ambiente durante de 1 a 18 h o usando DIC y Oxyma Pure<™>con calentamiento por microondas durante 120 s.

[0491] En la posición X<25>, se usó un derivado de Fmoc-lisina-OH que portaba nitrógeno en la cadena lateral un grupo protector ortogonal. La desprotección selectiva permitió la modificación de esta cadena lateral de aminoácidos.

[0492] Al final de la síntesis, la desprotección de Fmoc se realizó manualmente con piperidina al 20 % v/v en DMF dos veces 30 minutos a temperatura ambiente.

[0493] La acetilación se realizó en el extremo N mediante tratamiento con 5-10 eq. de anhídrido acético y 5-10 eq. de DIEA en DMF durante 15 minutos. A continuación, la resina que contenía el péptido completamente protegido se lavó con DCM/DMF/DCM, 3 veces cada uno y se secó al vacío.

[0494] A continuación, se eliminó el grupo protector de Nε de lisina en la posición X<25>(Dde, ivDde, Aloc o Mtt) usando hidrazina diluida en DMF (Dde, ivDde), fenilsilano o dimetil amino borano en presencia de catalizador de paladio (0) en DCM (aloc) o TFA al 1 % en DCM (Mtt).

[0495] A continuación, los grupos Z se unieron al nitrógeno de la cadena lateral de la lisina X<25>sobre soporte sólido de acuerdo con las siguientes etapas:

[0496] Cuando la lisina en la posición X<25>estaba protegida en su cadena lateral mediante Dde o iv-Dde, se transfirió el resinapéptido a una jeringa de polipropileno de 50 ml. Se percolaron 80 ml de una solución de hidrazina al 5 % en DMF a través de la resina seguido de lavado con DMF (3 veces). La reacción se monitorizó mediante la prueba de Kaiser. Cuando la lisina en la posición X<25>estaba protegida en su cadena lateral por el grupo alil-oxi-carbonilo (aloc), el resinapéptido se transfirió a una jeringa de polipropileno de 50 ml y se hinchó en diclorometano y se trató con 20 eq. de fenilsilano (PhSiH3) (o complejo de borano dimetilamina ((CH<3>)<2>NH.BH<3>) y piperidina) y tetrakis-(trifenilfosfina)paladio (Pd(PPh<3>)<4>) al 10 % (mol/mol) durante 2 h bajo argón. Este tratamiento se repitió hasta que no se pudo detectar péptido protegido con aloc de partida mediante análisis por UPLC/MS después de la escisión de una parte alícuota de la resina. Cuando la reacción se completó, la resina se lavó con diclorometano, DIEA al 1 % en DMF, dietil-ditio-carbamato al 5 % en DMF, DMF, DIEA al 10 % en DMF, DMF y diclorometano (3 veces cada uno).

[0497] Cuando la lisina en la posición X<25>estaba protegida en su cadena lateral por el grupo metil-tritilo (Mtt), el resina-péptido se transfirió a una jeringa de polipropileno de 50 ml y se hinchó en diclorometano y se trató con 10 ml de mezcla de DCM/TIS/TFA (88/5/2). Después de 1 h de agitación, el disolvente se drenó, la resina se lavó con DCM, se agitó con 10 ml de mezcla de DCM/DIEA (90/10) y se lavó varias veces con DCM.

[0498] El o los grupos PEGxx del grupo Z se introdujeron, si procede para un péptido dado de la invención, mediante acilación única con 3 eq. de Fmoc-PEGxx-OH durante 18 h con 3 eq. de DIC y 3 eq de HOAt monitorizando las reacciones mediante la prueba de ninhidrina (Kaiser). A continuación, la resina se trató con piperidina al 20 % v/v en DMF para eliminar el grupo protector Fmoc (2 x 30 min) y se lavó 3 veces con DMF. Las etapas de acoplamiento de Fmoc-PEGxx-OH, eliminación de Fmoc y lavado se repitieron x veces (x = 0 - 5).

[0499] A continuación, se introdujo Fmoc-Glu-OtBu (ácido (4S)-5-terc-butoxi-4-(9H-fluoren-9-il metoxi carbonil amino)-5-oxopentanoico), si gE estaba presente en el grupo Z del péptido de la invención, realizando un acoplamiento único con 3 eq. de aminoácido durante 18 h con 3 eq. de DIC y 3 eq. de HOAt monitorizando las reacciones mediante la prueba de Kaiser.

[0500] A continuación, la resina se trató con piperidina al 20 % v/v en DMF para eliminar el grupo protector Fmoc (2 x 30 min) y se lavó 3 veces con DMF. Las etapas de eliminación de Fmoc y acoplamiento de Fmoc-Glu-OtBu se repitieron y veces (y = 1 - 5).

[0501] A continuación, la cadena lateral se lipidó usando 3 eq. de ácido láurico Ck (C<12>), ácido mirístico (C<14>), ácido pentadecanoico (C<15>), ácido palmítico (C<16>), ácido heptadecanoico (C<17>), ácido esteárico (C<18>), ácido eicosanoico (C<20>) o ácido docosanoico (C<22>) usando 3 eq. de DIC y 3 eq. de HOAt en NMP, usando los cloruros de acilo correspondientes y DIEA como base en diclorometano o usando los ésteres de N-succinimidilo correspondientes y DIEA como base en DMF.

[0502] La reacción se monitorizó mediante la prueba de Kaiser y se dejó reposar durante la noche.

[0503] A continuación, la resina que contenía el péptido completamente protegido se lavó con DCM/DMF/DCM, 3 veces cada uno y se secó al vacío.

[0504] 1.B. Escisión de péptido-resina

[0505] Una vez completada la síntesis en fase sólida, el péptido se escindió del soporte sólido mediante tratamiento con el reactivo de escisión B: TFA/fenol/H<2>O/TIPS (87,5 %/5 %/5 %/2,5 %/ 25 ml) durante 3 h. (TIPS significa triisopropilsilano)

[0506] En ciertos casos, la adición de un ditiol tal como 1,2-etano ditiol o DODT (2,2'-(etilenodioxi)dietanotiol) puede ser ventajosa (por ejemplo, reactivo de escisión K). La solución de TFA que contenía el péptido se filtró y se concentró a presión reducida a T < 30 °C.

[0507] El producto deseado se precipitó con MTBE (metil terc-butil éter) enfriado con hielo o éter dietílico y se centrifugó a 3000 rpm durante 30 minutos. A continuación, el sedimento centrifugado se lavó con éter dietílico enfriado con hielo y se centrifugó. Este proceso se repitió tres veces.

[0508] En algunos casos, puede ser necesario procesar el péptido en bruto para eliminar subproductos no deseados tales como ésteres de TFA, aducto de CO<2>en nitrógeno del indol de triptófano (ácido carbámico) y aducto de 2-t-butilsulfaniletilo en residuos de metionina.

[0509] Para eliminar el aducto de CO<2>en nitrógeno del indol de triptófano, el péptido en bruto se recogió en agua que contenía un 10-20 % de CH<3>CN, 5 mg/ml y se liofilizó.

[0510] Para eliminar el aducto de 2-t-butil-sulfaniletilo en Met, el péptido en bruto se disolvió (2 mg/ml) en una solución de H<2>O/CH<3>CN (50:50 v/v) que contenía ácido fórmico al 0,1 %.

[0511] La mezcla se agitó suavemente a 37 °C durante la noche.

[0512] Para eliminar los ésteres de TFA, el péptido en bruto se disolvió (2 mg/ml) en una solución de H<2>O/CH<3>CN (50:50 v/v) que contenía ácido fórmico al 0,1 %. La mezcla se agitó suavemente a 37 °C durante 1-4 h.

[0513] En ambos casos, la solución de péptido en bruto así obtenida se concentró parcialmente a presión reducida y a T<30 °C y se liofilizó.

[0514] 1.C. Etapa de purificación

[0515] Siguiendo cualquiera de los métodos indicados anteriormente para sintetizar un péptido de la invención, dicho péptido se purificó antes de usarse.

[0516] Se disolvieron 80 mg de péptido en 1,5 ml de DMSO y se purificaron mediante cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC). La RP-HPLC se describió a continuación en el presente documento.

[0517] Se usó un manipulador de líquidos GX271, bombas 333/334 y un sistema UV/VIS 151 Gilson.

[0518] Se usaron dos sistemas diferentes para purificar dichos péptidos:

[0519] Sistema A

[0520] • Columna Waters Delta-Pack C415 µm 300 Å.250x20 mm;

[0521] • Solución A: Ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 % en H<2>O;

[0522] • Solución B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo;

[0523] • Gradiente: un 15 % de B durante 5 minutos; de un 15 % de B a un 50 % de B en 20 minutos;

[0524] • Caudal: 80 ml/min.

[0525] Sistema B

[0527] • Columna Waters CSH C185 µm 250x50 mm, o Waters Sunfire C1810 µm 250x50 mm;

[0528] • Solución A = TFA al 0,1 % en agua;

[0529] • Solución B = TFA al 0,1 % en acetonitrilo;

[0530] • Gradiente: De un 1 % de B a un 18 % de B en 5 minutos; de un 18 % de B a un 28 % de B en 10 minutos; un 28 % de B durante 15 minutos; de un 28 % de B a un 48 % de B en 10 minutos; a continuación, se lavó la columna de un 48 % de B a un 90 % de B en 10 minutos;

[0531] • Caudal: 150 ml/min.

[0532] •

[0533] El péptido de interés se eluyó en la ventana de tiempo de 35-40 minutos.

[0534] El gradiente se ajustó ligeramente de acuerdo con la polaridad de cada péptido tal como se caracteriza por su tiempo de retención en un sistema de UHPLC analítico.

[0535] Las fracciones que contenían el péptido puro se concentraron a continuación parcialmente a presión reducida a T<35 °C y se liofilizaron hasta un peso constante.

[0536] Para ciertos usos (por ejemplo, pruebasin vivo), era ventajoso intercambiar la sal de TFA por la sal acetato. Se usaron tres métodos correspondientes y se describen en la siguiente parte 1.D.

[0537] 1.D. Intercambio de acetato

[0538] (i) Intercambio de acetato con TOYOPEARL® DEAE 650 C (Tosoh Corporation)

[0539] El intercambio iónico se realizó usando una resina de calidad TOYOPEARL<®>DEAE 650 C (una resina de intercambio aniónico débil).

[0540] Se lavaron 120 ml de resina secuencialmente con 15 volúmenes de NaOH 1 M, 5 volúmenes de H<2>O, 5 volúmenes de ácido acético 1,6 M, 5 volúmenes de ácido acético 0,16 M y finalmente 5 volúmenes de H<2>O.

[0541] A continuación, se disolvieron 41,8 mg de péptido en 4 ml de agua destilada, se descargaron en la resina y se mezclaron suavemente durante 2 h.

[0542] Finalmente, el péptido se recogió por elución y se lavó con agua y se liofilizó.

[0543] Recuperación de péptidos: 35 mg (como sal acetato mediante RMN de F19 (400 MHz) ns 1028).

[0544] (ii) Intercambio de acetato con columna Sepharose HiTrap Q HP (columna de intercambio aniónico fuerte)En este segundo método, el intercambio iónico se realizó usando una HiTrap Q HP.

[0545] La columna (volumen de lecho de 5 ml) se conectó a una bomba peristáltica ajustada a 48 (4,5 ml/min) y antes de cargar el péptido se lavó con 50 ml (10 volúmenes de columna) de H<2>O, 100 ml (20 volúmenes de columna) de una solución 1 M de acetato de sodio, 150 ml

[0546] (30 volúmenes de columna) de H<2>O y con 50 ml (10 volúmenes de columna) de solución 0,16 M de ácido acético. El péptido puro se disolvió en una solución 0,16 M de ácido acético a 2 mg/ml, se cargó lentamente en la columna y se eluyó a 4,5 ml/min.

[0547] La solución recogida se liofilizó.

[0548] La eficacia del intercambio iónico se demostró mediante RMN de F19 (400 MHz) ns 1028.

[0549] (iii) Intercambio de acetato con resina de intercambio aniónico BIO RAD AG1X4®

[0550] En un reactor de 125 ml equipado con vidrio sinterizado en la parte inferior se cargaron 6,2 g de resina de intercambio aniónico BIO RAD AG1X4<®>, tamaño de malla seca 100-200 (forma OH).

[0551] La resina se agitó con 3 x 100 ml de ácido acético acuoso 1,6 M (10 % v/v) y con 3 x 50 ml de ácido acético acuoso 0,16 M (1 % v/v) en una placa agitada durante 20 minutos cada uno.

[0552] El péptido purificado como sal de TFA (100 mg) se disolvió en 50 ml de agua destilada y se vertió sobre la resina de intercambio y se agitó en una placa agitada durante 120 minutos.

[0553] La solución acuosa se drenó en un matraz de fondo redondo de 100 ml y la resina se lavó con 2x15 ml de ácido acético acuoso 0,16 M (1 % v/v).

[0554] Las soluciones combinadas que contenían el péptido como sal acetato se liofilizaron hasta un peso constante. Rendimiento = 80 mg de péptido como sal acetato.

[0555] La eficacia del intercambio iónico se demostró mediante RMN de F19 (400 MHz, ns 1028) y/o cromatografía iónica.

[0556] Ejemplo 2: Síntesis ilustrativa de péptidos específicos de la invención

[0557] 2.A Carga de Fmoc-Lys(AC)-OH en resina de amida de Rink

[0558] En un reactor de 100 ml equipado con un vidrio sinterizado en la parte inferior, se hincharon 6 g de resina AM de amida de Rink Novabiochem o ChemImpex (Baja Carga 0,47 mmol/g) en 40 ml de DMF. El disolvente se drenó y se añadieron 30 ml de piperidina al 20 % en solución de DMF. Después de 15 minutos de agitación, el disolvente se drenó. Esto se repitió dos veces para garantizar la eliminación completa del grupo protector Fmoc. La resina se lavó con 5 x 30 ml de DMF.

[0559] En un matraz separado, se preparó una solución que contenía Fmoc-Lys(Ac)-OH (3,5 g , 8 mmol, 3 eq.) HOBT.H<2>0 (1,3 g 8,5 mmol) en 30 ml de DMF. Se añadió diisopropilcarbodiimida (DIC) (1 g, 8,5 mmol) a esta solución y después de 5 minutos se añadió la mezcla resultante a la resina. La suspensión se agitó sobre una placa agitada durante 4 h o hasta que se completó la reacción, según se juzgó mediante la prueba de Kaiser (prueba de Ninhidrina) en una parte alícuota de la resina.

[0560] A continuación, el disolvente se drenó y la resina se lavó 3 veces con 30 ml de DMF. La resina cargada con Fmoc-Lys(Ac)-NH<2>se usó inmediatamente para las etapas posteriores o se almacenó húmeda a 4 °C hasta que fue necesario.

[0561] 2.B. Síntesis de péptido que tiene la SEQ ID NO: 3

[0562] La siguiente síntesis se realizó usando 5 veces una cantidad de resina obtenida en la etapa 2.A. correspondiente a 0,2 mmol de Fmoc-Lys(Ac)-NH<2>cada una. Las síntesis se realizaron por separado en cada lote individual usando un sintetizador de péptidos por microondas CEM Liberty Blue para ensamblar el segundo y tercer residuo de la secuencia peptídica (partiendo del extremo C).

[0563] La síntesis de péptidos se realizó usando DIC 0,5 M /Oxima 1 M en DMF.

[0564] Todos los aminoácidos se introdujeron con acoplamientos dobles usando un protocolo de calentamiento estándar. La resina se retiró del sintetizador y Fmoc-α-metil-lisina(Boc)-OH (3 eq.) se acopló manualmente usando 3 eq. de Oxyma<™>y 3 eq. de DIC con calentamiento por microondas (75 °C 15 s y 90 °C 110 s). La finalización de la reacción se controló mediante la prueba de Kaiser. Si es positiva, se añadió DIC, 3 eq., seguido de calentamiento por microondas como anteriormente.

[0565] Cuando se completó el acoplamiento de Fmoc-α-metil-lisina(Boc)-OH, el resto de la secuencia peptídica se ensambló usando un sintetizador de péptidos por microondas CEM Liberty Blue.

[0566] Todos los aminoácidos se introdujeron con acoplamientos dobles a 90 °C como anteriormente, con la excepción del ácido amino-isobutírico en la posición 21 y serina en la posición 29 para la cual se realizó un acoplamiento triple a 90 ° durante 2 minutos. Se usó Fmoc-Lys(Dde)-OH en la posición 25.

[0567] Al final de las 5 síntesis, los 5 lotes de resina se combinaron y se transfirieron a una jeringa de polipropileno de 50 ml y el péptido se acetiló en el extremo N con anhídrido acético (944 µl, 10 mmol) en DMF (30 ml) durante 20 minutos, repitiendo el ciclo dos veces.

[0568] A continuación, se eliminó el grupo protector de Dde en la cadena lateral de lisina 25 percolando 50 ml de una solución de hidrazina al 5 % p/v en DMF, seguido de lavados con DMF (5x20 ml). La reacción se monitorizó mediante la prueba de Kaiser y la escisión de una parte alícuota de la resina y análisis por UPLC/MS.

[0569] Se introdujeron tres unidades espaciadoras TTDS mediante acoplamiento único realizando tres veces el siguiente procedimiento: A la resina se añadió una solución de Fmoc-TTDS-OH (1,62 g, 3 mmol) en 30 ml de DMF seguido de HOAt (5 ml de una solución de 0,6 ml en DMF, 3 mmol) y DIC (1 ml, 6 mmol). La jeringa se agitó en una mesa orbital durante 18 h. La reacción se monitorizó mediante la prueba de Kaiser. La resina se lavó con DMF (2x30 ml). A continuación, a la resina, se le añadieron 30 ml de piperidina al 20 % v/v en DMF. La jeringa se agitó en una mesa orbital durante 20 minutos. Este procedimiento de desprotección se repitió una segunda vez y la resina se lavó con DMF (2x30 ml) y diclorometano (3x30 ml).

[0570] Los tres espaciadores de ácidos gamma-glutámicos se introdujeron realizando un doble acoplamiento de cada Fmoc-Glu-OtBu. De este modo, se aplicó tres veces el siguiente procedimiento:

[0571] A la resina se le añadió una solución de ácido (4S)-5-terc-butoxi-4-(9H-fluoren-9-il metoxi carbonilamino)-5-oxopentanoico (Fmoc-Glu-OtBu) (1,275 g, 3 mmol) en 30 ml de DMF seguida de HOAt (5 ml de una solución de 0,6 ml en DMF 3 mmol) y DIC (1 ml, 6 mmol). La jeringa se agitó en una mesa orbital durante 4 h. La resina se lavó con DMF (2x20 ml) y el acoplamiento se repitió una segunda vez. La reacción se monitorizó mediante la prueba de Kaiser. La resina se lavó con DMF (2x30 ml). A continuación, a la resina, se le añadieron 30 ml de piperidina al 20 % v/v en DMF. La jeringa se agitó en una mesa orbital durante 20 minutos. Este procedimiento de desprotección se repitió una segunda vez y la resina se lavó con DMF (3x30 ml) y diclorometano (3x30 ml).

[0572] Finalmente, el péptido se aciló con ácido palmítico (768 mg, 3 mmol), HOAt (5 ml de una solución 0,6 M en DMF, 3 mmol) y activación de DIC (1 ml, 6 mmol) en DMF (30 ml) durante 2,5 h. La resina se lavó con DMF (2x30 ml) y diclorometano (3x30 ml) y se secó al vacío.

[0573] La escisión del péptido de la resina se realizó usando una solución de fenol (6,25 g), agua (6,25 ml) y TIPS (3 ml) en TFA (CSP 125 ml) durante 2,5 horas a temperatura ambiente. La resina se separó por filtración y se lavó con 2x 30 ml de TFA. Los filtrados combinados se transfirieron a un matraz de fondo redondo de 250 ml y se concentraron parcialmente al vacío a T<30 °C y el péptido se precipitó mediante la adición de 100 ml de MTBE enfriado con hielo y se centrifugó a 3600 rpm durante 30 minutos.

[0574] A continuación, el sedimento centrifugado se lavó con éter dietílico enfriado con hielo y se centrifugó. Este proceso se repitió tres veces. Se obtuvieron 4,3 g de péptido en bruto. El péptido en bruto se disolvió (10 mg/ml) en una solución de H<2>O/CH<3>CN (50:50 v/v) que contenía ácido fórmico al 0,1 % y la mezcla se agitó suavemente a 37 ° durante 1 h, se concentró parcialmente y se liofilizó.

[0575] La purificación se llevó a cabo utilizando el sistema de purificación A en 10 inyecciones de 350 mg cada una y las fracciones que contenían el péptido deseado puro se liofilizaron. El péptido como sal trifluoroacetato se obtuvo como un sólido blanco.

[0576] m = 428 mg (17,5 %)

[0577] UPLC/MS:

[0578] TR: 4,98 minutos. (Condición analítica A), pureza del 99 % (UV)

[0579] Masa observada m/z (tipo iónico): 1454,5 (M+3H); 1091,1 (M+4H); 873,1 (M+5H).

[0580] 2.C. Síntesis de péptido que tiene la SEQ ID NO: 7

[0581] 2 lotes de resina obtenida en 2.A. correspondientes a 0,2 mmol de Fmoc-Lys(Ac)-NH2 cada uno (0,4 mmol en total) se procesaron en paralelo siguiendo el mismo procedimiento que para el ejemplo 2.B. Después de acoplar el tercer ácido (4S)-5-terc-butoxi-4-(9H-fluoren-9-il metoxi carbonilamino)-5-oxopentanoico (Fmoc-Glu-OtBu), los lotes de resina combinados que pesaban 2,6 g se transfirieron a una jeringa de polipropileno de 50 ml.

[0582] A continuación, a la resina, se le añadieron 30 ml de piperidina al 20 % v/v en DMF. La jeringa se agitó en una mesa orbital durante 20 minutos. Este procedimiento de desprotección se repitió una segunda vez y la resina se lavó con DMF (3x30 ml) y diclorometano (3x30 ml).

[0583] El péptido se aciló añadiendo una solución de cloruro de estearoílo (362 mg, 1,2 mmol) y DIPEA (0,255 ml, 1,5 mmol) en 20 ml de DCM durante 2,5 h. La resina se lavó con DMF (2x30 ml) y diclorometano (3x30 ml) y se secó al vacío. La escisión del péptido de la resina se realizó usando una solución de fenol (1,5 g), agua (1,5 ml) y TIPS (0,6 ml) en TFA (CSP 30 ml) durante 2,5 horas a temperatura ambiente. La resina se separó por filtración y se lavó con 2 x 10 ml de TFA. Los filtrados combinados se transfirieron a un matraz de fondo redondo de 250 ml y se concentraron parcialmente al vacío a T<30 °C, el péptido se precipitó mediante la adición de 100 ml de MTBE enfriado con hielo y se centrifugó a 3600 rpm durante 30 minutos.

[0584] A continuación, el sedimento centrifugado se lavó con éter dietílico enfriado con hielo y se centrifugó. Este proceso se repitió tres veces. Se obtuvieron 720 mg de péptido en bruto. La purificación se realizó usando el sistema de purificación B en 3 inyecciones de 240 mg cada una. Las fracciones que contenían el péptido deseado puro se liofilizaron. El péptido como sal trifluoroacetato se obtuvo como un sólido blanco.

[0585] m = 72 mg (3,6 %)

[0586] UPLC/MS:

[0587] TR: 5,86 minutos. (Condición analítica A), pureza del 98 % (UV)

[0588] Masa observada m/z (tipo iónico): 1463,9 (M+3H); 1098,2 (M+4H); 878,7 (M+5H).

[0589] 2.D. Síntesis de péptido que tiene la SEQ ID NO: 6

[0590] Un lote de resina obtenida en 2.A. correspondiente a 0,1 mmol de Fmoc-Lys(Ac)-NH2 se colocaron en el reactor de un sintetizador de péptidos por microondas CEM Liberty Blue. La síntesis de péptidos se realizó usando DIC 0,5 M /Oxima 1 M en DMF.

[0591] Todos los aminoácidos se introdujeron con acoplamientos dobles a 90 °C como anteriormente, con la excepción del ácido amino-isobutírico en la posición 21 y serina en la posición 29 para la cual se realizó un acoplamiento triple a 90 ° durante 2 minutos. Se usó Fmoc-Lys(ivDde)-OH en la posición 25.

[0592] Al final del ensamblaje peptídico, la resina se transfirió a una jeringa de polipropileno de 20 ml y el péptido se acetiló en el extremo N con anhídrido acético (95 µl, 1 mmol) y DIPEA (174 µl, 1 mmol) en DMF (10 ml) durante 20 minutos, repitiendo el ciclo dos veces.

[0593] A continuación, se eliminó el grupo protector ivDde en la cadena lateral de lisina 25 agitando con 10 ml de una solución de hidrazina al 5 % p/v en DMF durante 20 minutos tantas veces como fuera necesario hasta que no se pudo detectar material de partida después de la escisión de una parte alícuota de la resina y análisis por UPLC/MS. Cuando se consideró que la desprotección había finalizado, la resina se lavó con DMF (5x10 ml).

[0594] Se introdujeron dos unidades espaciadoras TTDS mediante acoplamiento único realizando dos veces el siguiente procedimiento: A la resina se le añadió una solución de Fmoc-TTDS-OH (163 mg, 0,3 mmol) HOAt (42 mg, 0,3 mmol) y DIC (77 µl, 0,5 mmol) 7 ml de DMF. La jeringa se agitó en una mesa orbital durante 18 h. La reacción se monitorizó mediante la prueba de Kaiser. Cuando fue necesario, se realizó un doble acoplamiento. La resina se lavó con DMF (2x10 ml). A continuación, a la resina, se le añadieron 10 ml de piperidina al 20 % v/v en DMF. La jeringa se agitó en una mesa orbital durante 20 minutos. Este procedimiento de desprotección se repitió una segunda vez y la resina se lavó con DMF (2x10 ml) y diclorometano (3x10 ml).

[0595] Los tres espaciadores de ácidos gamma-glutámicos se introdujeron realizando un doble acoplamiento de cada Fmoc-Glu-OtBu. De este modo, se aplicó tres veces el siguiente procedimiento:

[0596] A la resina una solución de ácido (4S)-5-terc-butoxi-4-(9H-fluoren-9-il metoxi carbonilamino)-5-oxopentanoico (Fmoc-Glu-OtBu) (127 mg, 0,3 mmol), HOAt (42 mg, 0,3 mmol) y DIC (77 µl, 0,5 mmol) en 7 ml de DMF. La jeringa se agitó en una mesa orbital durante 18 h. La reacción se monitorizó mediante la prueba de Kaiser. La resina se lavó con DMF (2x10 ml). A continuación, a la resina, se le añadieron 10 ml de piperidina al 20 % v/v en DMF. La jeringa se agitó en una mesa orbital durante 20 minutos. Este procedimiento de desprotección se repitió una segunda vez y la resina se lavó con DMF (3x10 ml) y diclorometano (3x30 ml).

[0597] Finalmente, el péptido se aciló con cloruro de estearoílo (62 mg, 0,2 mmol) y DIPEA (54 µl, 0,3 mmol) en 5 ml de DCM durante 2,5 h. La resina se lavó con DMF (2x30 ml) y diclorometano (3x30 ml) y se secó al vacío.

[0598] La escisión del péptido de la resina se realizó usando una solución de fenol (0,5 g), agua (0,5 ml) y TIPS (0,2 ml) en TFA (CSP 10 ml) durante 2,5 horas a temperatura ambiente. La resina se separó por filtración y se lavó con 2 x 4 ml de TFA. Los filtrados combinados se transfirieron a un matraz de fondo redondo de 100 ml y se concentraron parcialmente al vacío a T<30 °C y el péptido se precipitó mediante la adición de 50 ml de MTBE enfriado con hielo y se centrifugó a 3600 rpm durante 30 minutos.

[0599] A continuación, el sedimento centrifugado se lavó con éter dietílico enfriado con hielo y se centrifugó. Este proceso se repitió tres veces. Se obtuvieron 240 g de péptido en bruto. La purificación se realizó usando el sistema de purificación B y las fracciones que contenían el péptido deseado puro se liofilizaron. El péptido como sal trifluoroacetato se obtuvo como un sólido blanco.

[0600] m = 38 mg (8 %)

[0601] UPLC/MS:

[0602] TR: 5,40 minutos. (Condición analítica A), pureza del 97 % (UV)

[0603] Masa observada m/z (tipo iónico): 1376,1 (M+3H); 1032,0 (M+4H); 826,0 (M+5H).

[0604] 2.E. Síntesis de péptido que tiene la SEQ ID NO: 20

[0605] Este compuesto se obtuvo siguiendo el mismo procedimiento que el utilizado en el ejemplo 2.D excepto que se introdujeron tres TTDS en la cadena lateral de lisina 25.

[0606] Por tanto, a partir de 250 mg de resina obtenida en 2.A. correspondiente a 0,1 mmol de Fmoc-Lys(Ac)-NH2, se obtuvo un sólido blanco.

[0607] m = 20 mg (4,5 %)

[0608] UPLC/MS:

[0609] TR: 5,44 minutos. (Condición analítica A), pureza del 99 % (UV)

[0610] Masa observada m/z (tipo iónico): 2215,0 (M+2H); 1476,8 (M+3H); 1107,9 (M+4H); 886,7 (M+5H).

[0611] 2.F. Síntesis de péptido que tiene la SEQ ID NO: 22

[0612] Este compuesto se obtuvo siguiendo el mismo procedimiento que el utilizado en el ejemplo 2.B. con la excepción de que se usó Fmoc-Lys(Aloc)-OH en la posición 25 (X<25>) en lugar de Fmoc-Lys(Dde)-OH.

[0613] Por tanto, 250 mg de resina obtenida en 2.A. correspondiente a 0,1 mmol de Fmoc-Lys(Ac)-NH2 se procesó como en 2.B. hasta la etapa de acetilación N-terminal.

[0614] El grupo Aloc en la cadena lateral de Lys25 se eliminó añadiendo a la resina, en atmósfera de argón, una solución de 1 ml (8,33 mmol) de fenil silano en 2 ml de DCM desgasificado y una solución de 10 mg (25,96 µmoles) de tetrakis-(trifenilfosfina)paladio en 4 ml de DCM. La resina se agitó sobre una mesa orbital durante 60 minutos y el medio de reacción se reemplazó con reactivos frescos dos veces y se agitó 60 minutos cada vez.

[0615] Cuando la reacción se completó, la resina se lavó con diclorometano, DIEA al 1 % en DMF, dietil-ditio-carbamato al 5 % en DMF, DMF, DIEA al 10 % en DMF, DMF y diclorometano (3 veces cada uno).

[0616] Se introdujeron tres unidades espaciadoras PEG<2>DGA mediante acoplamiento único realizando tres veces el siguiente procedimiento: A la resina se añadió una solución de Fmoc-PEG<2>DGA-OH (170 mg, 0,3 mmol) en 8 ml de DCM seguido de HOAt (0,5 ml de una solución de 0,6 ml en DMF, 0,3 mmol) y DIC (100 µl, 0,642 mmol). La jeringa se agitó en una mesa orbital durante 18 h. La reacción se monitorizó mediante la prueba de Kaiser. La resina se lavó con DMF (2x10 ml). A continuación, a la resina, se le añadieron 10 ml de piperidina al 20 % v/v en DMF. La jeringa se agitó en una mesa orbital durante 20 minutos. Este procedimiento de desprotección se repitió una segunda vez y la resina se lavó con DMF (2x30 ml) y diclorometano (3x30 ml).

[0617] Los tres espaciadores de ácidos gamma-glutámicos se introdujeron realizando un doble acoplamiento de cada Fmoc-Glu-OtBu. De este modo, se aplicó tres veces el siguiente procedimiento:

[0618] A la resina se le añadió una solución de ácido (4S)-5-terc-butoxi-4-(9H-fluoren-9-il metoxi carbonilamino)-5-oxopentanoico (Fmoc-Glu-OtBu) (0,13 g, 0,3 mmol) en 8 ml de DMF seguida de HOAt (0,5 ml de una solución de 0,6 ml en DMF 0,3 mmol) y DIC (0,1 ml, 0,6 mmol). La jeringa se agitó en una mesa orbital durante 4 h. La resina se lavó con DMF (2x20 ml) y el acoplamiento se repitió una segunda vez. La reacción se monitorizó mediante la prueba de Kaiser. La resina se lavó con DMF (2x10 ml). A continuación, a la resina, se le añadieron 10 ml de piperidina al 20 % v/v en DMF. La jeringa se agitó en una mesa orbital durante 20 minutos. Este procedimiento de desprotección se repitió una segunda vez y la resina se lavó con DMF (3x30 ml) y diclorometano (3x30 ml).

[0619] Finalmente, el péptido se aciló con ácido palmítico (80 mg, 0,3 mmol), HOAt (0,5 ml de una solución 0,6 M en DMF, 3 mmol) y activación de DIC (0,1 ml, 6 mmol) en DMF (10 ml) durante 2,5 h. La resina se lavó con DMF (2x30 ml) y diclorometano (3x30 ml) y se secó al vacío.

[0620] La escisión del péptido de la resina se realizó usando una solución de fenol (0,5 g), agua (0,5 ml) y TIPS (0,25 ml) en TFA (CSP 10 ml) durante 2,5 horas a temperatura ambiente. La resina se separó por filtración y se lavó con 2x 5 ml de TFA. Los filtrados combinados se transfirieron a un matraz de fondo redondo de 250 ml y se concentraron parcialmente al vacío a T<30 °C y el péptido se precipitó mediante la adición de 100 ml de MTBE enfriado con hielo y se centrifugó a 3600 rpm durante 30 minutos.

[0621] A continuación, el sedimento centrifugado se lavó con éter dietílico enfriado con hielo y se centrifugó. Este proceso se repitió tres veces. Se obtuvieron 220 mg de péptido en bruto.

[0622] La purificación se llevó a cabo usando el sistema de purificación B. Las fracciones que contenían el péptido deseado puro se liofilizaron. El péptido como sal trifluoroacetato se obtuvo como un sólido blanco.

[0623] m = 37 mg (8 %)

[0624] UPLC/MS:

[0625] TR: 4,99 minutos. (Condición analítica A), pureza del 99 % (UV)

[0626] Masa observada m/z (tipo iónico): 2205,2 (M+2H); 1470,5 (M+3H); 1103,1 (M+4H); 882,7 (M+5H).

[0627] 2.G. Resultados

[0628] Los resultados obtenidos con péptidos de la invención de SEQ ID NO: 1-32, 34-37, 39, 44, 45, 47-49, 51 y 54-97 se indicaron en la siguiente tabla 1.

[0629] Tabla 1

[0630]

[0631]

[0632]

[0635] La condición A es la siguiente:

[0636] • Columna: Acquity Peptide CSH, C18, 130 Å, 2,1x100 mm, 1,7 um;

[0637] • Temperatura de la columna: 50 °C; Flujo = 0,6 ml/min;

[0638] • Disolvente A: TFA al 0,1 % en H<2>O;

[0639] • Disolvente B: TFA al 0,1 % en CH<3>CN;

[0640] • Gradiente: de 0 a 1 minuto B = 2 %, de 1 a 7 minutos B = del 2 % al 70 %, de 7 a 8 minutos B = del 70 % al 100 %;

[0641] • Detector UV: longitud de onda: 220 nm; adquisición de MS: ESI+ 200 a 3000 uma.

[0642] •

[0643] La condición B es la siguiente:

[0644] • Columna: Acquity BEH C18, 130 Å, 2,1x50 mm, 1,7 µm

[0645] • Temperatura de la columna 60 °C; Flujo 0,6 ml/mn

[0646] • Disolvente A: TFA al 0,05 % en H2O

[0647] • Disolvente B: TFA al 0,05 % en CH<3>CN

[0648] Gradiente: de 0 a 1 minuto B = 2 %, de 1 a 16 minutos B = del 2 % al 100 %, de 16 a 17 minutos B = 100 %;

[0649] Detector UV: longitud de onda: 220 nm; adquisición de MS: ESI+ 200 a 3000 uma

[0651] La condición C es la siguiente:

[0652] • Columna: ACQUITY BEH C4, 130 Å, 2,1x50 mm, 1,7 µm;

[0653] • Temperatura de la columna 45 °C; Caudal: 0,4 ml/min;

[0654] • Disolvente A: TFA al 0,1 % en H<2>O;

[0655] • Disolvente B: TFA al 0,05 % en CH<3>CN

[0656] Gradiente : de 0 a 1 minuto B = 30 %, de 1 a 5 minutos B = del 30 % al 50 %, de 5 a 6 minutos B = 80 % Detector UV: longitud de onda: 220 nm; adquisición de MS: ESI+ 200 a 3000 uma

[0658] La condición D es la siguiente:

[0659] • Columna: Acquity Peptide CSH, C18, 130 Å, 2,1x150 mm, 1,7 um;

[0660] • Temperatura de la columna: 60 °C; Flujo = 0,4 ml/min;

[0661] • Disolvente A: TFA al 0,1 % en H<2>O;

[0662] • Disolvente B: TFA al 0,1 % en CH<3>CN;

[0663] • Gradiente: de 0 a 1 minuto B = 2 %, de 1 a 14 minutos B = del 2 % al 70 %, de 14 a 16 minutos B = del 70 % al 100 %;

[0664] • Detector UV: longitud de onda: 220 nm; adquisición de MS: ESI+ 200 a 3000 uma.

[0665] Los siguientes péptidos de acuerdo con la invención se pueden preparar respectivamente como se ha descrito anteriormente: SEQ ID NO 33, 38, 40, 41, 43, 46, 50, 52 y 53.

[0666] emp o : n ss n v tro e p p os e a nvenc n en recep ores ensayo e c en

[0667] A. Método

[0668] Se usaron células OVCAR5 que expresaban RXFP1 endógeno para evaluar las propiedades agonistas de RXP1 de los péptidos de la invención y, en particular, de los péptidos de secuencia SEQ ID NO: 1-97.

[0669] Dado que RXFP1 es un GPCR acoplado a Gs, se usó AMPc como lectura de la activación de RXFP1.

[0670] Se usó isobutil metil xantina (IBMX) para inhibir la actividad fosfodiesterasa facilitando las mediciones de AMPc. Se usó la tecnología HTRF (fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo) para detectar AMPc debido a su gran sensibilidad.

[0671] En resumen, se cultivaron OVCAR5 en medio regular (RPMI) que contenía un 10 % de suero fetal de ternera (FCS) y un 1 % de antibióticos (penicilina/estreptomicina).

[0672] Antes de los experimentos, las células se desprendieron con Accutase y se incubaron durante 40 minutos a 37 °C con IBMX (3-isobutil-1-metilxantina) 1 mM.

[0673] A continuación, las células se distribuyeron en placas de 384 pocillos negros que contenían concentraciones crecientes de los diferentes péptidos en un volumen fijo de medio (sin FCS).

[0674] Después de una incubación de 30 minutos a 37 °C en una incubadora húmeda en CO<2>al 5 %, la reacción se detuvo añadiendo un volumen fijo de una solución que contenía un tampón de lisis y AMPc-D2 (marcado con el colorante d2) y el anticuerpo anti AMPc unido a Europio y utilizado para la detección de AMPc.

[0675] La lectura del experimento se realizó en un fluorímetro que permite la medición de HTRF. Las curvas de activación se generaron representando el valor intracelular de AMPc frente al log10 de la concentración del compuesto.

[0676] La concentración de activación del 50 % (EC<50>) se calculó mediante regresión no lineal usando la ecuación de dosisrespuesta sigmoidal (pendiente variable) con el software Prism 5.

[0677] El Emáx % se determinó como el valor intracelular máximo de AMPc para el compuesto de ensayo (límite superior de AMPc frente a la curva de concentración) dividido por el valor intracelular máximo de AMPc para Relaxina H2 determinado en la misma ocasión de ensayo multiplicado por 100.

[0679] B. Resultados

[0680] Los resultados obtenidos con péptidos de la invención se representan en la siguiente tabla 2.

[0681] Tabla 2

[0683]

[0684]

[0685]

[0688] Parece que los péptidos de acuerdo con la invención poseen propiedades agonistas de RXP1 muy interesantes y son muy eficaces para unirse a y activar RXFP1.

[0690] Además, todos son significativamente e inesperadamente superiores a los péptidos de la técnica anterior cuando se trata de activar el receptor RXFP1.

[0691] Se ha realizado el mismo experimento con péptidos de la técnica anterior (documento WO2015/157829) conocidos con los nombres B7-33 C11.23S, AcB7-33 C11.23S y KKKK(AcB7-29 C11.23S).

[0692] Se han obtenido los siguientes resultados de EC<50>para estos tres péptidos.

[0693] Tabla 3

[0695]

[0697] Como se ha demostrado anteriormente, los péptidos de acuerdo con la invención poseen propiedades agonistas de RXFP1 muy interesantes y son muy eficaces para activar RXFP1. Además, todos son significativamente e inesperadamente superiores a los péptidos de la técnica anterior

[0698] Ejemplo 4: Ensayo de solubilidad de péptidos de la invención en tampón

[0699] A. Método

[0700] Antes de la prueba de la solubilidad de un lote peptídico, se determinó su pureza (HPLC-UV).

[0701] Medios de estudio:

[0703] Tampón fosfato 50 mM pH 6,5: 15,9 ml de Na<2>HPO<4>0,1 M (Carlo Erba 480087) 34,1 ml de NaH<2>PO<4>0,1 M (Carlo Erba 480141) H<2>O MilliQ CSP 100 ml

[0704] Tampón fosfato 50 mM pH 7,4: 40,5 ml de Na<2>HPO<4>0,1 M (Carlo Erba 480087) 9,5 ml de NaH<2>PO<4>0,1 M (Carlo Erba 480141) H<2>O MilliQ CSP 100 ml

[0705] Tampón acetato 50 mM pH 4,5: 0,75 g de C<2>H<3>CO<2>Na,3H<2>O (Sigma S7545) 0,35 ml de solución de CH<3>CO<2>H al 100 % disuelta en agua Millipore, ajustada a pH con (1:1) CH<3>CO<2>H diluido, y diluida a 250 ml con agua Millipore. En un vial de Ependorph de 4 ml, se diluyó una muestra pesada con precisión del compuesto en medios de estudio para obtener una concentración objetivo de 2, 6 o 10 mg/ml de compuesto puro. Los viales de muestra se agitaron (agitador de balanceo y rotación) durante ~19 h. Se filtraron alícuotas de 300 µl a través de una placa Millipore "Solvinert" (0,45 µm - PTFE hidrófilo). A continuación, la solubilidad se determinó mediante la comparación de una inyección de 0,2 pl del filtrado con las áreas de pico UV obtenidas con una solución madre del péptido a una concentración de 1,2 mg/ml en DMSO (basada en el % de pureza), inyectando diversos volúmenes que variaban de 0,2 -2 pl.

[0706] Análisis:

[0708] El pH se midió con un microelectrodo

[0709] Condiciones de HPLC:

[0710] Sistema UPLC Acquity de Waters con detector DAD

[0711] Columna: Waters Peptide Column CSH C18 (130 Å; 1,7 µm; 50*2,1 mm)

[0712] Temperatura de la columna: 60 °C

[0713] Flujo: 0.3 ml/min

[0714] Bucle completo (aproximadamente 5 µl) - Factor de sobrelleno 5

[0715] Lavado débil y fuerte: H2O/ACN (75/25; V/V); Lavado de sellos: H2O/IsOH (95/5; V/V). Fase móvil:

[0716] Disolvente A: TFA al 0,05 % en H2O; Disolvente B: TFA al 0,035 % en CH3CN

[0717] Gradiente : de 0 a 12 minutos B = del 2 % al 60 %, de 12 a 14 minutos B = del 60 % al 100 %. Lavado de columna B al 100 % 1 minuto, equilibrado de la columna B al 2 % 2,5 minutos.

[0718] Detector UV: longitud de onda: 220 nm.

[0719] B. Resultados

[0720] Los resultados de solubilidad obtenidos se representan en la siguiente tabla 4.

[0721] Tabla 4: * Solubilidad objetivo: 10,0 mg/ml

[0723]

[0724]

[0726] Se ha realizado el mismo experimento con péptidos de la técnica anterior (documento WO2015/157829) conocidos con los nombres B7-33 C11.23S, AcB7-33 C11.23S y KKK(AcB7-29 C11.23S).

[0727] Se han obtenido los siguientes resultados de solubilidad para estos tres péptidos.

[0728] Tabla 5

[0730]

[0732] Los péptidos de la invención presentan una solubilidad mejorada en comparación con los compuestos de la técnica anterior Esta propiedad permitiría un mayor intervalo de concentración cuando se preparan soluciones inyectables, expandiendo de este modo los intervalos de dosificaciónin vivo.

[0733] Ejemplo 5: Prueba de estabilidad de péptidos en plasma o sangre de rata o ser humano

[0734] A. Método

[0735] Antes del ensayo de la estabilidad en plasma (o sangre) de un lote peptídico, se determinó su pureza (HPLC-UV).

[0736] Medios de estudio:

[0738] Plasma de rata y humano: Heparina de sodio o litio anticoagulante.

[0739] Sangre de rata y humana: Heparina de sodio o litio anticoagulante.

[0740] Solución madre:

[0741] 100 µM de solución del compuesto de estudio en tampón fosfato 50 mM pH 7,4.

[0742] Se preincubaron 950 µl de plasma (o sangre) durante 5 minutos a 37 °C. Se añadieron 50 µl de solución madre del compuesto. Concentración final del compuesto = 5 µM. Agitar en vórtice y transferir 150 µl de plasma (o sangre) a un Eppendorf para cada punto temporal. Los puntos temporales 0 - 1 y - 4 h se llevaron a cabo por duplicado para cada especie.

[0743] Después de la incubación, se extrajeron 150 µl de plasma (o sangre) con 600 µl de acetonitrilo que contenía TFA al 1 %. A continuación, dicha mezcla se agitó en vórtice y se centrifugó 10 minutos a 14600 rpm. Se secaron 200 µl de sobrenadante en N<2>. A continuación, la muestra se reconstituyó en 200 µl de H<2>O/CH<3>CN 98/2 FA al 0,1 % 50 ng/ml de Labetalol y se analizó usando el sistema analítico utilizado en estudios de solubilidad y estabilidad.

[0744] Para la determinación de la cantidad del péptido restante, se compararon las áreas de pico del compuesto diana a t0 y cada día de punto temporal, dando como resultado el "% de péptido restante", siguiendo la ecuación:

[0745] % de péptido restante = [(tiempo del péptido del área del pico) x 100]/péptido del área del pico t0. La estabilidad se expresó como "% de péptido restante".

[0746] Criterios de aceptación: Los compuestos de ensayo se consideraron estables si la precisión era ~ 15 % y la recuperación estaba dentro del intervalo de 85 - 115 %.

[0747] B. Resultados

[0748] Los resultados de estabilidad en plasma y en sangre obtenidos se representan en la siguiente tabla 6.

[0749] Tabla 6: * Estabilidad en sangre

[0751]

[0753] Se ha realizado el mismo experimento con péptidos de la técnica anterior (documento WO2015/157829) conocidos con los nombres B7-33 C11.23S, AcB7-33 y KKKK(AcB7-29 C11.23S).

[0754] Se han obtenido los siguientes resultados de estabilidad en plasma para estos tres péptidos.

[0755] Tabla 7

[0757]

[0759] Los péptidos de la invención parecen ser más estables en plasma y/o sangre que los compuestos de la técnica anteriorEjemplo 6: Determinación farmacocinética (PK) de péptidos después de la administración in vivo a ratas. A. Método:

[0760] Antes de la prueba de un lote peptídico, se determinó su pureza (HPLC-UV). La dosis se corrigió para determinar la presencia de sales, disolvente y pureza.

[0761] Método de cribado bioanalítico para la cuantificación de péptidos en rata:

[0762] A ratas Sprague Dawley se les administró un péptido de estudio a una dosis de 1 mg/kg por vía intravenosa (i.v.) o 3 mg/kg por vía subcutánea (s.c.) como una solución en PBS (0,2 mg/ml y 0,6 mg/ml respectivamente).

[0763] Se recogieron muestras de sangre después de: 0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48 y 72 h (vía i.v.) y 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48 y 72 h (vía s.c) después de la aplicación.

[0764] Las muestras de plasma se analizaron después de la precipitación de proteínas mediante cromatografía de líquidos, espectrometría de masas (LC/MS).

[0765] Los parámetros PK y la semivida se calcularon usando Phoenix 64 (WinNonlin 6,4) - Pharsight (CertaraTM) (modelo no compartimental). Los valores por debajo del límite de cuantificación (BLQ) se reemplazaron por cero para cálculos posteriores y análisis PK.

[0766] B. Resultados:

[0767] Los parámetros PK obtenidos se representan en la siguiente tabla 8.

[0768] Se usan las siguientes abreviaturas:

[0769] T½ : semivida in vivo, tiempo requerido para que la concentración en plasma del compuesto de ensayo se divida por dos durante el experimento PK.

[0770] C0: Concentración plasmática del compuesto de ensayo extrapolada en el punto temporal t=0 (vía i.v.).

[0771] Cmáx: concentración plasmática máxima del compuesto de ensayo en el punto temporal indicado (vía s.c.).

[0772] Tmáx: Punto temporal donde se alcanzó la Cmáx.

[0773] % de F: Biodisponibilidad s.c. Frente a i.v., área de dosis corregida bajo curva (AUC), vía s.c., dividida por AUC i.v.

[0774] Tabla 8

[0776]

[0778] El mismo experimento se ha realizado con relaxina H2.

[0779] Tabla 9

[0781]

[0783] En comparación con relaxina H2, los péptidos de la invención seleccionados presentan parámetros farmacocinéticos mejorados. En particular, su semividain vivoen rata, varía de 4 h a 9 h. Dichos péptidos podrían entonces conservar su eficacia durante un periodo de tiempo más largo permitiendo la administración una vez al día por vía intravenosa o subcutánea.

[0785]

[0789] 37

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un péptido capaz de activar el receptor RXFP1 que tiene la siguiente fórmula (I):

N<ter>-Ac-X<10>-E-G-R-E-X<15>-V-R-X<18>-X<19>-I-X<21>-X<22>-E-G-X<25>-S-X<27>-X<28>-X<29>-X<30>-X<31>-X<32>-X<33>-NH<2>-C<ter>

en donde:

N<ter>representa el extremo N-terminal del péptido;

C<ter>representa el extremo C-terminal del péptido;

Ac representa un grupo acetilo;

X<10>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, ácido 2-amino-isobutírico, Nε-acetillisina y α-metil-leucina;

E representa ácido glutámico;

G representa glicina;

R representa arginina;

X<15>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, arginina, homolisina, homoarginina, ornitina, glutamina, fenilalanina y leucina;

V representa valina;

X<18>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina, ácido 2-amino-isobutírico, leucina, Nεacetil-lisina y glutamina;

X<19>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, Nε-acetil-lisina, citrulina, glutamina, alanina y ácido 2-amino-isobutírico;

I representa isoleucina;

X<21>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico y alanina;

X<22>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico e isoleucina;

X<25>representa la siguiente estructura:

en la que:

- * representa un enlace covalente con la glicina que precede a X<25>en la fórmula (I);

- ◆ representa un enlace covalente con la serina que sigue a X<25>en la fórmula (I); y

Z representa un grupo de fórmula (II):

-[(PEGxx)(gE)<c>C<d>],

b y c representan independientemente 1, 2, 3, 4 o 5; o b representa 2, 3, 4 o 5 y c representa 2, 3 o 4;

PEGxx representa independientemente un derivado de polietilenglicol seleccionado del grupo que consiste en PEG<2>, PEG<2>DGA y TTDS;

gE representa ácido gamma-glutámico; y

C<d>representa un grupo acilo C<12>-C<22>saturado lineal;

S representa serina;

X<27>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en treonina, lisina, arginina y glutamina;

X<28>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en triptófano, fenilalanina, 5-fluoro-triptófano, 5-cloro-triptófano, 5-metoxi-triptófano, tirosina, 4-fluoro-fenilalanina, 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, α-metil-triptófano, αmetil-fenilalanina y 5-hidroxi-triptófano;

X<29>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina, D-serina, ácido 2-amino-isobutírico, treonina, α-metil-serina, Nε-acetil-lisina y valina;

X<30>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico, α-metil-lisina, D-lisina, lisina, homolisina, ornitina, arginina y α-metil-arginina;

X<31>representa arginina

X<32>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, alanina, arginina, Nε-acetil-lisina y Nε,Nε,Nε-tri-metil-lisina; y

X<33>representa un aminoácido seleccionado de lisina, Nε-acetil-lisina, leucina, arginina y alanina;

o una sal del mismo o un complejo de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente.

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde C<d>representa un grupo acilo saturado lineal seleccionado del grupo que consiste en un grupo acilo C<12>(Lau), C<14>(Myr), C<15>(Penta), C<16>(Palm), C<17>(Hepta), C<18>(Stea), C<20>(Eico) y C<22>(Doco), en particular un grupo acilo saturado lineal seleccionado del grupo que consiste en un grupo acilo C<12>(Lau), C<14>(Myr), C<15>(Penta), C<16>(Palm), C<17>(Hepta) o C<18>(Stea), y particularmente un grupo acilo C<16>o C<18>lineal.

3. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 que tiene la siguiente fórmula (Ib):

N<ter>-Ac-X<10>-E-G-R-E-X<15>-V-R-X<18>-X<19>-I-X<21>-X<22>-E-G-X<25>-S-X<27>-X<28>-X<29>-X<30>-R-X<32>-X<33>-NH<2>-C<ter>

en donde:

N<ter>representa el extremo N-terminal del péptido;

C<ter>representa el extremo C-terminal del péptido;

Ac representa un grupo acetilo;

X<10>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, Nε-acetil-lisina y ácido 2-aminoisobutírico;

E representa ácido glutámico;

G representa glicina;

R representa arginina;

X<15>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, arginina, homolisina, glutamina, fenilalanina y leucina;

V representa valina;

X<18>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina, ácido 2-amino-isobutírico y Nε-acetillisina;

X<19>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, Nε-acetil-lisina, glutamina y citrulina; I representa isoleucina;

X<25>representa la siguiente estructura:

en la que:

- * representa un enlace covalente con la glicina que precede a X<25>en la fórmula (Ia);

- ◆ representa un enlace covalente con la serina que sigue a X<25>en la fórmula (Ia); y

Z se selecciona del grupo que consiste en un -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>DGA)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>DGA)<3>-(gE)<4>-Stea, -(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<5>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<5>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<2>-Stea, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<4>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Myr y -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Myr en donde

gE representa ácido gamma-glutámico

Palm representa palmitoílo y

Stea representa estearoílo;

S representa serina;

X<27>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en treonina, glutamina, arginina y lisina;

X<28>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en triptófano, fenilalanina, 5-clorotriptófano, αmetil-fenilalanina, 4-fluoro-fenilalanina y 5-fluorotriptófano;

X<29>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en serina, D-serina, ácido 2-amino-isobutírico, Nεacetil-lisina, treonina y valina;

X<30>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido 2-amino-isobutírico, α-metil-lisina, D-lisina, lisina, homolisina y arginina;

X<32>representa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en lisina, alanina, arginina y Nε-acetil-lisina; y X<33>representa un aminoácido seleccionado de lisina, Nε-acetil-lisina y arginina;

4. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 1 a 97.

5. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 de fórmula (Ib), en donde Z se selecciona del grupo que consiste en un -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>DGA)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<5>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<4>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Myr y -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Myr.

6. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 6, 7, 9-12, 20-22, 26, 28, 30-34, 45, 47-49, 51, 54-62, 64, 67-69, 71-86, 91, 93 y 96.

7. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 6, 7, 20, 26, 30-34, 45, 48, 49, 51, 54-61, 67, 71, 73, 75-79, 81, 83-92 y 97.

8. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 20.

9. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde tiene la secuencia de aminoácidos de referencia SEQ ID NO: 3.

10. Una composición farmacéutica que comprende al menos un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o un complejo farmacéuticamente aceptable de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente, junto con al menos un portador farmacéuticamente aceptable.

11. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, la sal farmacéuticamente aceptable del mismo o el complejo farmacéuticamente aceptable de dicho péptido o la sal del mismo con moléculas de disolvente, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, para su uso como un medicamento.

12. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, la sal farmacéuticamente aceptable del mismo o el complejo farmacéuticamente aceptable de dicho péptido o la sal del mismo con moléculas de disolvente, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de diversas enfermedades o afecciones que implican el receptor RXFP1.

13. El péptido, sal farmacéuticamente aceptable del mismo o el complejo farmacéuticamente aceptable de dicho péptido o la sal del mismo con moléculas de disolvente, o composición farmacéutica, para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde las enfermedades o afecciones se seleccionan del grupo que consiste en fibrosis; enfermedades fibróticas, en particular esclerosis sistémica, esclerodermia y fibromialgia; fibrosis pulmonar idiopática; enfermedades renales que implican fibrosis; hipertensión pulmonar y preeclampsia.

14. El péptido, sal farmacéuticamente aceptable del mismo o un complejo farmacéuticamente aceptable de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente, o composición farmacéutica, para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde las enfermedades o afecciones se seleccionan del grupo que consiste en enfermedades cardíacas y vasculares, en particular del grupo que consiste en insuficiencia cardíaca aguda o crónica, insuficiencia cardíaca sistólica o diastólica, arteriopatía coronaria, aterosclerosis, angina microvascular y complicación cardiovascular de la diabetes.

15. El péptido, sal farmacéuticamente aceptable del mismo o un complejo farmacéuticamente aceptable de dicho péptido o una sal del mismo con moléculas de disolvente, o composición farmacéutica, para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde las enfermedades o afecciones se seleccionan del grupo que consiste en insuficiencias renales, en particular disfunción renal en cirrosis; nefropatía crónica y lesión renal aguda.