RS67606B1

RS67606B1 - Modifikovani lipidovani peptidi b-lanca relaksina i njihova terapeutska upotreba

Info

Publication number: RS67606B1
Application number: RS20260005A
Authority: RS
Inventors: Olivier Duclos; Stéphane Illiano; Sergio Mallart; Claire Minoletti-Hochepied; Elisabetta Bianchi; Raffaele Ingenito; Paola Magotti; Alessia Santoprete
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2026-01-30
Also published as: IL276170B1; WO2019149782A1; KR102755938B1; UY38069A; IL316406A; JP7295871B2; ES3058633T3; BR112020014834A2; US20190233494A1; CN111770934B; TW201940505A; KR20200116085A; US10961295B2; IL276170B2; TWI763972B; DK3746467T3; SI3746467T1; AU2019214358B2; PT3746467T; SG11202006903WA

Description

[0001] Opis

[0002] OBLAST PRONALASKA

[0003] Predmetni pronalazak se odnosi na peptidne analoge B-lanca relaksina-2 koji su sposobni da aktiviraju RXFP1 receptor.

[0005] Posebno, predmetni pronalazak se odnosi na lipidovane peptidne analoge B-lanca relaksina-2 koji mogu da aktiviraju RXFP1 receptor.

[0007] Štaviše, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju najmanje navedene peptide, kao i peptid ili njegovu farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku za upotrebu kao lek, a posebno za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji različitih bolesti ili stanja koja uključuju RXFP1 receptor, preciznije bolest ili stanje odabrano iz:

[0008] • grupe koju čine fibroza; fibrozne bolesti, posebno sistemska skleroza, skleroderma i fibromijalgija; idiopatska plućna fibroza; bolesti bubrega koje uključuju fibrozu; plućna hipertenzija i preeklampsija;

[0009] • grupe koju čine srčane i vaskularne bolesti, posebno iz grupe koju čine akutna ili hronična srčana insuficijencija, sistolna ili dijastolna srčana insuficijencija, bolest koronarnih arterija, ateroskleroza, mikrovaskularna angina i kardiovaskularne komplikacije dijabetesa; i/ili

[0010] • grupe koju čine otkazivanja bubrega, posebno disfunkcija bubrega kod ciroze;

[0011] hronična bolest bubrega i akutna povreda bubrega.

[0013] OSNOVA PRONALASKA

[0014] Humani relaksin-2 (H2 relaksin) je peptidni hormon od 6-kDa koji se sastoji od 53 aminokiseline. Njegova struktura se sastoji od dva odvojena polipeptidna lanca, tj. H2 relaksin lanca A (SEQ ID NO: 100) i H2 relaksin lanca B (SEQ ID NO: 101) koji su poprečno povezani pomoću dve disulfidne (S-S) veze, sa trećom S-S vezom unutar lanca koja se nalazi u lancu A na sledeći način:

[0015] H2 relaksin lanac A : H-Gln-Leu-Tyr-Ser-Ala-Leu-Ala-Asn-Lys-Cys*-Cys**-His-Val-Gly-Cys*-Thr-Lys-Arg-Ser-Leu-Ala-Arg-Phe-Cys***-OH (SEQ ID NO: 100)

[0016] H2 Relaksin lanac B : H-Asp-Ser-Trp-Met-Glu-Glu-Val-Ile-Lys-Leu-Cys**-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Gln-Ile-Ala-Ile-Cys***-Gly-Met-Ser-Thr-Trp-Ser-OH (SEQ ID NO: 101) gde Cys*, Cys** i Cys*** označavaju disulfidne veze između cisteina sa istom oznakom.

[0018] Relaksin-2 je prirodni peptidni hormon koji proizvodi corpus luteum sa vršnom koncentracijom u cirkulaciji tokom prvog trimestra trudnoće žene. Relaksin-2 pripada porodici peptida sličnih insulinu čiji članovi ostvaruju brojne efekte nakon vezivanja za različite vrste receptora, klasifikovanih kao receptori peptida porodice relaksina (RXFP) (RXFP1, RXFP2, RXFP3 i RXFP4).

[0020] RXFP1 je glavni receptor za relaksin. RXFP1 sadrži veliki ekstracelularni domen sa jednim modulom lipoproteina niske gustine klase A (LDLa) na amino-terminusu i 10 ponavljajućih domena bogatih leucinom (LRR), nakon čega sledi 7 transmembranskih (7TM) helikalnih domena. LDLa modul RXFP1 je povezan sa LRR domenom preko linkera od 32 ostatka.

[0022] Aktivacija RXFP1 je složen proces u više koraka. Prethodne studije su pokazale da se Arg13, Arg17 i Ile20 iz argininske kasete (RxxxRxxI/V, gde je x bilo koji ostatak) B-lanca H2 relaksina vezuju za Asp231, Asp279, Glu233 i Glu277 koji se nalaze na LRR4-8 LRR domena RXFP1. Samo vezivanje liganda nije dovoljno za aktivaciju receptora. Skraćivanje ili supstitucija LDLa modula rezultira neaktivnim receptorom uprkos vezivanju za ekstracelularni domen. Studija (Bruell, S. et al., Front. Endocrinol. (Lausanne) 4, 171 (2013)), zamenom LDLa modula RXFP1 i RXFP2 istakla je ulogu linkera u aktivaciji receptora. LRR (mesto visokog afiniteta) i prve egzopetlje (mesta niskog afiniteta) transmembranskih domena učestvuju u vezivanju relaksina, dok je LDLa modul neophodan za aktivaciju receptora koja uključuje egzopetlju 2 (Sethi A. et al. Nature Communications (2016)).

[0024] [0008] Kod nekih vrsta, relaksin takođe može da aktivira RXFP2, izvorni GPCR koji sadrži ponavljanja bogata leucinom za peptid 3 sličan insulinu (INSL3). Ovo ukazuje na to da bi potencijalna unakrsna reaktivnost mogla biti povezana sa različitim biološkim aktivnostima relaksina, iako trenutno nema dokaza o fiziološkoj ulozi relaksina koji deluje isključivo putem RXFP2.

[0026] Nedavno objavljeni podaci pokazali su da postoje međuvrsne razlike u kapacitetu agonista da aktiviraju RXFP1, sa specifičnom razlikom u ECL3 domenu između ljudi i glodara (Huang et al. Frontiers in Endocrinology 2015 Aug 17;6:128). U paraleli, opisana je aktivnost pristrasnog agonista za neke mimetike sa jednim lancem izvedene iz relaksina (Hossain et al. Chem. Sci., 2016, 7, 3805). Međutim, na osnovu IUPHAR nomenklature, RXFP1 je receptor spregnut sa Gs proteinom i glavni signalni put RXFP1 vodi do akumulacije cAMP-a (cikličnog adenozin-monofosfata).

[0028] Relaksin je prvo identifikovan kao trudnički hormon uključen ne samo u remodelovanje materice i implantaciju embriona, već i u hemodinamsku adaptaciju trudnica. Ovo uključuje smanjenje vaskularnog otpora, povećanje minutnog volumena srca i povećanje GFR-a, što je kombinacija efekata koja ima za cilj poboljšanje srčanog naknadnog opterećenja. Ova svojstva su dovela do upotrebe rekombinantnog humanog relaksina-2 u nekoliko kliničkih ispitivanja u kontekstu akutne srčane insuficijencije.

[0030] Korisni kardiovaskularni efekti relaksina, koji se pripisuju promenama u bubrežnoj i sistemskoj vaskulaturi, takođe su demonstrirani kod pacijenata sa kongestivnom i akutnom srčanom insuficijencijom u pretkliničkim studijama i kliničkim ispitivanjima faze II. Kod svesnih normotenzivnih i hipertenzivnih mužjaka i ženki pacova, akutna intravenska i hronična supkutana administracija relaksina povećava minutni volumen srca i globalnu arterijsku komplijansu i smanjuje sistemski vaskularni otpor, bez uticaja na srednji arterijski pritisak.

[0032] Takođe je pokazano da relaksin smanjuje srednji arterijski pritisak u modelima hipertenzije kod pacova. Vaskularno delovanje relaksina se proteže na modifikaciju pasivne komplijanse zida. Hronična supkutana infuzija relaksina kod pacova i miševa povećava arterijsku komplijansu u malim bubrežnim, mezenteričnim, materičnim i karotidnim arterijama. Pored toga, relaksin ima anti-fibrotična svojstva u životinjskom modelu fibroze srca i bubrega.

[0034] [0013] Dakle, relaksin bi mogao biti od koristi pacijentima sa hroničnom srčanom insuficijencijom smanjenjem naknadnog opterećenja i rasterećenjem srčane aktivnosti, kao i pacijentima sa plućnom hipertenzijom, sa srčanom insuficijencijom sa smanjenom ili očuvanom ejekcionom frakcijom i pacijentima sa fibroznim bolestima uključujući sistemsku sklerozu, idiopatsku plućnu fibrozu i bilo koju bolest bubrega koja uključuje fibrozu.

[0036] Relaksin-2 je, stoga, jasno od visokog terapeutskog interesa.

[0038] Ipak, kompleksna heterodimerna struktura H2-relaksina otežava njegovu hemijsku sintezu i prečišćavanje, što dovodi do niskih prinosa finalnog proizvoda (Curr. Opin. Chem. Biol. 2014, 22, 47-55).

[0040] Shodno tome, postoji interes za dobijanje stabilnih peptida relaksina koji poseduju sposobnost relaksina da aktiviraju RXFP1 receptore, a posebno peptida koji zadržavaju biološku aktivnost relaksina, dok su strukturno jednostavniji od nativnog relaksina.

[0042] Peptidi sa jednostavnijim strukturama mogli bi zahtevati manje kompleksne i efikasnije sinteze od H2-relaksina. Time bi se smanjili troškovi lečenja povezani sa sintezom H2-relaksina.

[0044] Štaviše, zbog njihove jednostavnije i manje strukture, takvi peptidi mogu pokazati poboljšano preuzimanje u poređenju sa nativnim relaksinom, što vodi do poboljšane in vivo terapeutske aktivnosti.

[0046] Nekoliko pojednostavljenih H2-relaksin analoga opisano je u literaturi. M.A. Hossain et al. (J. Biol. Chem. (2011), 43, 3755) identifikovali su minimalnu strukturu H2-relaksina pokazujući da njegov B-lanac može biti skraćen za do 6 ili 7 aminokiselina na N-terminusu uz minimalan gubitak potentnosti. Strukture opisane u ovoj publikaciji su dvolančani analozi relaksina koje je i dalje teško sintetisati i ne nude prednost u poređenju sa nativnim H2-relaksinom.

[0048] [0020] Učinjeni su dalji pokušaji da se pojednostave peptidi porodice relaksina. Nedavno su M.A. Hossain et al. u Chem. Sci. Sci. (2016),7, 3805-3819 i WO2015/157829 predložili RXFP1 agonist peptide koji obuhvataju samo H2-relaksin B-lanac. Međutim, kao što je ilustrovano u predmetnom tekstu, peptidi iz WO2015/157829 pokazuju nedovoljan kapacitet za aktivaciju RXFP1 receptora.

[0050] Postoji, dakle, potreba za novim peptidnim analozima B-lanca relaksina-2 koji su sposobni da aktiviraju RXFP1 receptor, posebno onima koji imaju poboljšanu sposobnost aktivacije RXFP1 receptora.

[0052] Takođe postoji potreba za novim modifikovanim peptidima relaksina koji imaju jednostavnu strukturu, posebno jednostavniju strukturu od već poznatih peptida relaksina, i koji poseduju poboljšanu sposobnost aktivacije RXFP1 receptora.

[0054] SAŽETAK PRONALASKA

[0055] Predmetni pronalazak ima za cilj da zadovolji gore navedene potrebe.

[0057] Pronalazači su zaista obezbedili nove modifikovane peptide relaksina, a posebno lipidovane peptide, koji pokazuju značajno poboljšan kapacitet za aktivaciju RXFP1 receptora u poređenju sa prvim pojednostavljenim peptidima porodice relaksina predloženim u prethodnom stanju tehnike, kao što je prikazano u sledećim primerima.

[0059] Kao što je opisano u daljem tekstu, pronalazači su izvršili nekoliko delecija i modifikacija na aminokiselinskoj sekvenci B-lanca nativnog relaksina, što je dovelo do kraćih peptida koji imaju poboljšana svojstva u poređenju sa nativnim relaksinom i peptidima relaksina koji su već predloženi u prethodnom stanju tehnike. Posebno, priloženi eksperimenti pokazuju da dok peptid B7-33 C11.23S (SEQ ID NO: 102) i analogni peptid iz WO2015/157829, AcB7-33 C11.23S (SEQ ID NO: 103) i KKKK(AcB7-29 C11.23S) (SEQ ID NO: 104) imaju 50% aktivacionu koncentraciju (EC<50>) RXFP1 od 1641 nM, 929 nM i 206 nM redom, u ćelijskom testu korišćenom za odabir peptida ovog pronalaska, EC<50>vrednosti dobijene sa lipidovanim peptidima prema pronalasku kreću se od 36,4 nM naniže do 0,07 nM. Štaviše, većina testiranih peptida pronalaska ima EC<50>vrednost manju ili jednaku 5 nM.

[0061] Pored toga, dok je prethodno stanje tehnike u nastavku sugerisalo da se B-lanac relaksina ne može skratiti za više od 7 aminokiselina (J. Biol. Chem. (2011), 43, 3755;

[0062] WO2015/157829) bez značajnog smanjenja potentnosti, peptidi ovog pronalaska su skraćeni za 9 aminokiselina na N-terminusu (Nter) i dalje pokazuju visoku aktivnost na RXFP1 receptoru.

[0064] U poređenju sa RXFP1 agonist peptidima iz WO2015/157829, peptidi pronalaska pokazuju poboljšanu rastvorljivost na pH 4,5 ili pH 7,5, poboljšanu stabilnost u plazmi ili krvi pacova i ljudi, kao i poboljšana in vivo poluvremena eliminacije.

[0066] Ova svojstva će omogućiti formulisanje peptida predmetnog pronalaska u širokim opsezima koncentracija za upotrebu kao lek koji će zadržati svoju in vivo efikasnost tokom dužeg vremenskog perioda, dozvoljavajući, na primer, administraciju jednom dnevno intravenskim ili supkutanim putem.

[0068] Shodno tome, predmetno obelodanjivanje opisuje, ali ne polaže pravo na peptid koji ima sledeću formulu (I):

[0070] N<ter>-Ac-X<10>-E-G-R-E-X<15>-V-R-X<18>-X<19>-I-X<21>-X<22>-E-G-X<25>-S-X<27>-X<28>-X<29>-X<30>-X<31>-X<32>-X<33>-NH<2>-C<ter>

[0072] gde:

[0073] N<ter>predstavlja N-terminalni kraj peptida;

[0074] C<ter>predstavlja C-terminalni kraj peptida;

[0075] AC predstavlja acetil grupu;

[0076] X<10>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine leucin, 2-amino-izobuterna kiselina (Aib), Nε-acetil-lizin (K(Ac)) i α-metil-leucin (Mel);

[0077] E predstavlja glutaminsku kiselinu (Glu);

[0078] G predstavlja glicin (Gly);

[0079] R predstavlja arginin (Arg);

[0080] X<15>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin (Lys), arginin (Arg), homolizin (Hly), homoarginin (Har), ornitin (Orn), glutamin (Gln), fenilalanin (Phe) i leucin (Leu);

[0081] V predstavlja valin (Val);

[0082] X<18>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine alanin (Ala), 2-amino-izobuterna kiselina (Aib), leucin (Leu), Nε-acetil-lizin (K(Ac)) i glutamin (Gln);

[0083] X<19>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin (Lys), Nε-acetil-lizin (K(Ac)), citrulin (CIT), glutamin (Gln), alanin (Ala) i 2-amino-izobuterna kiselina (Aib); I predstavlja izoleucin (Ile);

[0084] X<21>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina (Aib) i alanin (Ala);

[0085] X<22>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina (Aib) i izoleucin (Ile);

[0086] X<25>predstavlja sledeću strukturu:

[0088]

[0090] u kojoj:

[0091] • * predstavlja kovalentnu vezu sa glicinom koji prethodi X<25>u formuli (I);

[0092] • ◆ predstavlja kovalentnu vezu sa serinom koji sledi nakon X<25>u formuli (I); i Z predstavlja grupu formule (II):

[0094] -[(PEGxx)(gE)<c>C<d>],

[0096] b i c nezavisno predstavljaju 1, 2, 3, 4 ili 5;

[0097] PEGxx nezavisno predstavlja derivat polietilen glikola odabran iz grupe koju čine PEG<2>, PEG<2>DGA i TDS;

[0098] gE predstavlja gama-glutaminsku kiselinu; i

[0099] C<d>predstavlja linearnu zasićenu C<12>-C<22>acil grupu;

[0100] S predstavlja serin (Ser);

[0101] X<27>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine treonin (Thr), lizin (Lys), arginin (Arg) i glutamin (Gln);

[0102] X<28>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine triptofan (Trp), fenilalanin (Phe), 5-fluoro-triptofan (Trp(5F)), 5-hloro-triptofan (Trp(5Cl)), 5-metoksi-triptofan (Trp(5OMe)), tirozin (Tyr), 4-fluoro-fenilalanin (Pfp), 1-naftilalanin (1-Nal), 2-naftilalanin (2-Nal), α-metiltriptofan (Mtr), α-metil-fenilalanin (Mph) i 5-hidroksi-triptofan (Wox);

[0103] X<29>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine serin (Ser), D-serin (Dser), 2-amino-izobuterna kiselina (Aib), treonin (Thr), α-metil-serin (MSE), Nε-acetil-lizin (K(Ac)) i valin (Val);

[0104] X<30>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina (Aib), α-metil-lizin (Mly), D-lizin (Dlys), lizin (Lys), homolizin (Hly), ornitin (Orn), arginin (Arg) i α-metil-arginin (Mar);

[0105] X<31>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine arginin (Arg), Nω-metil-arginin (Rme), alanin (Ala), Nω,Nω'-dimetil-arginin (Rds, simetrični dimetil arginin) i citrulin (Cit); X<32>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin (Lys), alanin (Ala), arginin (Arg), Nε-acetil-lizin (K(Ac)) i Nε, Nε-Nε-tri-metil-lizin (Tml); i

[0106] X<33>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin (Lys), Nε-acetil-lizin (K(Ac)), leucin (Leu), arginin (Arg) i alanin (Ala);

[0107] ili njihova so ili solvat.

[0109] Predmetni pronalazak se odnosi na peptid sposoban da aktivira RXFP1 receptor koji ima sledeću formulu (I):

[0111] N<ter>-Ac-X<10>-E-G-R-E-X<15>-V-R-X<18>-X<19>-I-X<21>-X<22>-E-G-X<25>-S-X<27>-X<28>-X<29>-X<30>-X<31>-X<32>-X<33>-NH<2>-C<ter>

[0113] gde:

[0114] N<ter>predstavlja N-terminalni kraj peptida;

[0115] C<ter>predstavlja C-terminalni kraj peptida;

[0116] AC predstavlja acetil grupu;

[0117] X<10>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine leucin, 2-amino-izobuterna kiselina, Nε-acetil-lizin i α-metil-leucin;

[0118] E predstavlja glutaminsku kiselinu;

[0119] G predstavlja glicin;

[0120] R predstavlja arginin;

[0121] X<15>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, arginin, homolizin, homoarginin, ornitin, glutamin, fenilalanin i leucin;

[0122] V predstavlja valin;

[0123] X<18>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine alanin, 2-amino-izobuterna kiselina, leucin, Nε-acetil-lizin i glutamin;

[0124] X<19>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, Nε-acetil-lizin, citrulin, glutamin, alanin i 2-amino-izobuterna kiselina;

[0125] I predstavlja izoleucin;

[0126] X<21>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina i alanin;

[0127] X<22>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina i izoleucin;

[0128] X<25>predstavlja sledeću strukturu:

[0130]

[0132] u kojoj:

[0133] • * predstavlja kovalentnu vezu sa glicinom koji prethodi X<25>u formuli (I);

[0134] • ◆ predstavlja kovalentnu vezu sa serinom koji sledi nakon X<25>u formuli (I); i Z predstavlja grupu formule (II):

[0136] -[(PEGxx)(gE)<c>C<d>],

[0138] b i c nezavisno predstavljaju 1, 2, 3, 4 ili 5; ili b predstavlja 2, 3, 4 ili 5 i

[0139] c predstavlja 2, 3 ili 4;

[0140] PEGxx nezavisno predstavlja derivat polietilen glikola odabran iz grupe koju čine PEG<2>, PEG<2>DGA i TDS;

[0141] gE predstavlja gama-glutaminsku kiselinu; i

[0142] C<d>predstavlja linearnu zasićenu C<12>-C<22>acil grupu;

[0143] S predstavlja serin;

[0144] X<27>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine treonin, lizin, arginin i glutamin; X<28>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine triptofan, fenilalanin, 5-fluorotriptofan, 5-hloro-triptofan, 5-metoksi-triptofan, tirozin, 4-fluoro-fenilalanin, 1-naftilalanin, 2-naftilalanin, α-metil-triptofan, α-metil-fenilalanin i 5-hidroksi-triptofan;

[0145] X<29>odabranu iz grupe koju čine serin, D-serin, 2-amino-izobuterna kiselina, treonin, α-metilserin, Nε-acetil-lizin i valin;

[0146] X<30>odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina, α-metil-lizin, D-lizin, lizin, homolizin, ornitin, arginin i α-metil-arginin;

[0147] X<31>predstavlja arginin

[0148] X<32>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, alanin, arginin, Nε-acetillizin i Nε,Nε,Nε-tri-metil-lizin; i

[0149] X<33>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, Nε-acetil-lizin, leucin, arginin i alanin;

[0150] ili njihova so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača.

[0152] Peptid koji ima formulu (I) ili farmaceutski prihvatljiva so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača sposoban je da aktivira RXFP1 receptor.

[0154] Drugi predmet predmetnog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja obuhvata najmanje jedan peptid prema pronalasku, ili farmaceutski prihvatljivu so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0156] Dalji predmet predmetnog pronalaska odnosi se na peptid prema pronalasku, farmaceutski prihvatljivu so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku, za njegovu upotrebu kao lek.

[0158] Shodno tome, predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid prema pronalasku, farmaceutski prihvatljivu so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, ili njihovu farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku, za njegovu upotrebu u lečenju i/ili prevenciji različitih bolesti ili stanja koja uključuju RXFP1 receptor, preciznije bolesti ili stanja odabranog iz:

[0159] • grupe koju čine fibroza; fibrozne bolesti, posebno sistemska skleroza, skleroderma i fibromijalgija; idiopatska plućna fibroza; bolesti bubrega koje uključuju fibrozu; plućna hipertenzija i preeklampsija;

[0160] • grupe koju čine srčane i vaskularne bolesti, posebno iz grupe koju čine akutna ili hronična srčana insuficijencija, sistolna ili dijastolna srčana insuficijencija, bolest koronarnih arterija, ateroskleroza, mikrovaskularna angina i kardiovaskularne komplikacije dijabetesa; i/ili

[0161] • grupe koju čine otkazivanja bubrega, posebno disfunkcija bubrega kod ciroze; hronična bolest bubrega i akutna povreda bubrega.

[0163] U jednom otelotvorenju, navedena bolest ili stanje može biti odabrano iz grupe koju čine srčane i vaskularne bolesti, posebno iz grupe koju čine akutna ili hronična srčana insuficijencija, sistolna ili dijastolna srčana insuficijencija, bolest koronarnih arterija, ateroskleroza, mikrovaskularna angina i kardiovaskularne komplikacije dijabetesa.

[0165] DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0166] Definicije

[0167] Kao što se ovde koristi:

[0168] • „X<y>“ korišćeno u formulama pronalaska, gde y ima različite vrednosti, predstavlja aminokiselinu kao što je definisano u definiciji navedenih formula. y ukazuje na poziciju navedene aminokiseline u nativnom B-lancu relaksina-2. Na primer, X<10>predstavlja aminokiselinu na poziciji 10 aminokiselinske sekvence nativnog B-lanca relaksina-2.

[0169] • „Farmaceutski prihvatljiv nosač“ je namenjen za tečnost, posebno tečnost koja obuhvata peptid prema pronalasku, takvu da je farmaceutska kompozicija fiziološki podnošljiva, tj. može se administrirati pojedinačnom telu bez toksičnosti ili nepotrebne nelagodnosti.

[0170] • „Biološki aktivan“ peptid prema pronalasku je peptid sposoban da aktivira RXFP1 receptor.

[0171] • Kada je primenljivo, aminokiseline u peptidima prema pronalasku mogu svaka nezavisno biti L-aminokiseline ili D-aminokiseline. U određenom otelotvorenju, aminokiseline prema predmetnom pronalasku su L-aminokiseline. U predmetnom tekstu, ukoliko nisu navedene informacije u vezi sa L- ili D- oblikom date aminokiseline, tada je ta aminokiselina L-aminokiselina.

[0172] • N<ter>i C<ter>su konvencionalne oznake koje se koriste da ukažu na N-terminalni, odnosno C-terminalni kraj peptida pronalaska.

[0173] • „Peptid“ ili „peptid relaksina“ prema pronalasku je modifikovani lipidovani peptid B-lanca relaksina u skladu sa predmetnim pronalaskom. Posebno, takav „peptid“ ili „peptid relaksina“ označava peptid koji je biološki aktivan, tj. koji pokazuje biološku aktivnost tipično povezanu sa relaksinom, a posebno koji je, kao što je gore navedeno, sposoban da aktivira RXFP1 receptor. Nivo takve biološke aktivnosti relaksina koju pokazuju modifikovani peptidi prema pronalasku može biti ekvivalentan ili prednosno poboljšan u poređenju sa aktivnošću prirodnog ili nativnog relaksina, ili čak u poređenju sa već obelodanjenim peptidima relaksina koji se razlikuju od onog iz predmetnog pronalaska.

[0174] • Termin „nativni“, kako se koristi u predmetnom tekstu u vezi sa relaksinom, odnosi se na prirodne molekule ili molekule divljeg tipa.

[0175] • „Prevencija“ ima za cilj da označi smanjenje rizika od ispoljavanja fenomena koji se razmatra. Ovo smanjenje može biti potpuno ili delimično, tj. rezultira stepenom rizika koji je niži od onog koji je postojao pre upotrebe prema pronalasku.

[0176] • „Lečenje“ ima za cilj da označi smanjenje ili čak eliminisanje nepoželjnog stanja ili bolesti koja se razmatra.

[0177] • „Pojedinac“ ili „pacijent“ je termin namenjen za čoveka ili nehumanog sisara koji je pogođen ili će verovatno biti pogođen stanjem koje se razmatra prema pronalasku. • Navedeni pojedinac je posebno ljudsko biće.

[0179] Predmetni pronalazači su dizajnirali nove modifikovane peptide, posebno lipidovane peptide.

[0181] Pronalazači su ovde neočekivano otkrili da kraći i značajno izmenjeni peptid prema pronalasku, tj. sekvenca aminokiselina prema pronalasku, ima superiornu biološku aktivnost, posebno superiorni kapacitet da aktivira RXFP1 receptor u poređenju sa relaksinom sa jednim B-lancem koji je poznat u stanju tehnike.

[0183] Peptidi pronalaska

[0184] Peptidi prema pronalasku su karakterisani time što imaju formulu (I):

[0186] N<ter>-Ac-X<10>-E-G-R-E-X<15>-V-R-X<18>-X<19>-I-X<21>-X<22>-E-G-X<25>-S-X<27>-X<28>-X<29>-X<30>-X<31>-X<32>-X<33>-NH<2>-C<ter>

[0188] gde:

[0189] N<ter>predstavlja N-terminalni kraj peptida;

[0190] C<ter>predstavlja C-terminalni kraj peptida;

[0191] AC predstavlja acetil grupu;

[0192] X<10>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine leucin, 2-amino-izobuterna kiselina, Nε-acetil-lizin i α-metil-leucin;

[0193] E predstavlja glutaminsku kiselinu;

[0194] G predstavlja glicin;

[0195] R predstavlja arginin;

[0196] X<15>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, arginin, homolizin, homoarginin, ornitin, glutamin, fenilalanin i leucin;

[0197] V predstavlja valin;

[0198] X<18>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine alanin, 2-amino-izobuterna kiselina, leucin, Nε-acetil-lizin i glutamin;

[0199] X<19>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, Nε-acetil-lizin, citrulin, glutamin, alanin i 2-amino-izobuterna kiselina;

[0200] I predstavlja izoleucin;

[0201] X<21>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina i alanin;

[0202] X<22>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina i izoleucin;

[0203] X<25>predstavlja sledeću strukturu:

[0205]

[0207] u kojoj:

[0208] • * predstavlja kovalentnu vezu sa glicinom koji prethodi X<25>u formuli (I);

[0209] • ◆ predstavlja kovalentnu vezu sa serinom koji sledi nakon X<25>u formuli (I); i Z predstavlja grupu formule (II):

[0211] -[(PEGxx)(gE)<c>C<d>],

[0213] b i c nezavisno predstavljaju 1, 2, 3, 4 ili 5; ili b predstavlja 2, 3, 4 ili 5 i

[0214] c predstavlja 2, 3 ili 4;

[0215] PEGxx nezavisno predstavlja derivat polietilen glikola odabran iz grupe koju čine PEG<2>, PEG<2>DGA i TDS;

[0216] gE predstavlja gama-glutaminsku kiselinu; i

[0217] C<d>predstavlja linearnu zasićenu C<12>-C<22>acil grupu;

[0218] S predstavlja serin;

[0219] X<27>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine treonin, lizin, arginin i glutamin; X<28>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine triptofan, fenilalanin, 5-fluorotriptofan, 5-hloro-triptofan, 5-metoksi-triptofan, tirozin, 4-fluoro-fenilalanin, 1-naftilalanin, 2-naftilalanin, α-metil-triptofan, α-metil-fenilalanin i 5-hidroksi-triptofan;

[0220] X<29>odabranu iz grupe koju čine serin, D-serin, 2-amino-izobuterna kiselina, treonin, α-metilserin, Nε-acetil-lizin i valin;

[0221] X<30>odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina, α-metil-lizin, D-lizin, lizin, homolizin, ornitin, arginin i α-metil-arginin;

[0222] X<31>predstavlja arginin;

[0223] X<32>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, alanin, arginin, Nε-acetillizin i Nε,Nε,Nε-tri-metil-lizin;

[0224] X<33>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, Nε-acetil-lizin, leucin, arginin i alanin;

[0225] ili njihova so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulom rastvarača.

[0227] Predmetni pronalazak takođe obuhvata soli peptida formula (I) ili (Ia) definisanih u ovom dokumentu, u jednom otelotvorenju farmaceutski prihvatljive soli, na primer soli kao kiselinske adukte sa neorganskim kiselinama kao što su hlorovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, bromovodonična kiselina, fosforna kiselina, perhlorna kiselina, tiocijanska kiselina i borna kiselina; ili sa organskim kiselinama kao što su mravlja kiselina, sirćetna kiselina, trifluorosirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, limunska kiselina, vinska kiselina, sukcinska kiselina, glukonska kiselina, mlečna kiselina, malonska kiselina, fumarna kiselina, antranilna kiselina, benzojeva kiselina, cimetna kiselina, benzensulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, naftalensulfonska kiselina i sulfanilna kiselina; i soli sa metalima kao što su alkalni metali, npr. natrijum, kalijum, litijum, cink i aluminijum.

[0229] [0041] U jednom otelotvorenju, soli peptida su farmaceutski prihvatljive soli, na primer kiselinski adukti sa hlorovodoničnom kiselinom, sumpornom kiselinom, fosfornom kiselinom, mravljom kiselinom, sirćetnom kiselinom, propionskom kiselinom, glikolnom kiselinom, limunskom kiselinom, vinskom kiselinom, sukcinskom kiselinom, glukonskom kiselinom, mlečnom kiselinom, malonskom kiselinom, fumarnom kiselinom, antranilnom kiselinom, benzojevom kiselinom, cimetnom kiselinom, benzensulfonskom kiselinom, ptoluensulfonskom kiselinom, naftalensulfonskom kiselinom i sulfanilnom kiselinom; i soli sa metalima kao što su alkalni metali, npr. natrijum, kalijum, litijum i cink.

[0231] Obelodanjivanje takođe obuhvata solvate, u jednom otelotvorenju farmaceutski prihvatljive solvate, peptida gore navedenih formula (I) ili (Ia).

[0233] Pod solvatima se podrazumevaju kompleksi jedinjenja prema pronalasku ili njihovih soli sa molekulima rastvarača, npr. molekulima organskog rastvarača i/ili vodom.

[0235] Predmetni pronalazak obuhvata komplekse navedenih peptida ili njihovih soli sa molekulima rastvarača.

[0237] U skladu sa jednim otelotvorenjem, obelodanjivanje takođe obuhvata farmaceutski prihvatljivu so ili solvat peptida prema pronalasku.

[0239] U skladu sa jednim otelotvorenjem, obelodanjivanje takođe obuhvata farmaceutski prihvatljive soli ili komplekse navedenog peptida ili njegovih soli sa molekulima rastvarača.

[0241] Kao što je ilustrovano, peptid prema pronalasku je aminokiselinska sekvenca.

[0243] U skladu sa standardnom polipeptidnom nomenklaturom (J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969)) skraćenice za ostatke α-aminokiselina korišćene u predmetnom pronalasku su sledeće:

[0246]

[0247]

[0249] Za nenativne ili modifikovane aminokiseline koriste se sledeće skraćenice: Aib 2-amino-izobuterna kiselina

[0250]

[0251]

[0253] U svim formulama prema pronalasku, gde je aminokiselinska sekvenca predstavljena korišćenjem gore pomenutih skraćenica i X<y>prikaza, kao što je na primer X<18>, orijentacija levo i desno je u konvencionalnom smeru od amino-terminusa ka karboksi-terminusu.

[0254] Shodno tome, na primer, sa X<28>koji predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine triptofan, 5-fluoro-triptofan, 5-hloro-triptofan, 5-metoksi-triptofan, tirozin, fenilalanin, 4-fluoro-fenilalanin, 1-naftilalanin, 2-naftilalanin, α-metil-triptofan, α-metil-fenilalanin i 5-hidroksi-triptofan, N-terminus ili amino grupa navedene aminokiseline je povezana sa aminokiselinom koju predstavlja X<27>, a C-terminus ili karboksilna grupa navedene aminokiseline je povezana sa aminokiselinom koju predstavlja X<29>.

[0256] Na svom N-terminalnom (N<ter>) kraju, peptid pronalaska je supstituisan acetil grupom (Ac) : CH<3>C(O)-.

[0258] Na svom C-terminalnom (C<ter>) kraju, peptid pronalaska je supstituisan -NH<2>grupom.

[0260] Na svojoj poziciji X<25>, peptid pronalaska obuhvata sledeću strukturu:

[0262]

[0265] Ova struktura odgovara aminokiselini lizin u kojoj je:

[0266] • alfa (α) atom azota (*) vezan za prethodni deo peptida, tj. sa grupom na N<ter>strani od X<25>na osnovu N<ter>-C<ter>orijentacije predstavljene u formulama prema pronalasku, putem kovalentne veze, posebno putem peptidne veze, tj. sa glicinom na poziciji 24 (X<24>);

[0267] • atom ugljenika karboksilne grupe (+) vezan je za deo peptida koji sledi nakon pozicije X<25>, tj. sa grupom na C<ter>strani od X<25>na osnovu N<ter>-C<ter>orijentacije predstavljene u formulama prema pronalasku, putem kovalentne veze, posebno putem peptidne veze, tj. sa serinom na poziciji 26 (X<26>); i

[0268] • atom azota njegovog bočnog lanca vezan je za Z grupu.

[0270] Ova Z grupa je definisana kao grupa formule (II):

[0271] -[(PEGxx)(gE)<c>C<d>],

[0273] U formuli (II), znak - predstavlja kovalentnu vezu sa atomom azota bočnog lanca strukture lizina na poziciji X<25>.

[0275] b i c nezavisno predstavljaju 1, 2, 3, 4 ili 5, posebno 2, 3, 4 ili 5.

[0277] U određenom otelotvorenju, b predstavlja 2, 3, 4 ili 5.

[0279] U određenom otelotvorenju, c predstavlja 2, 3 ili 4.

[0281] U poželjnom otelotvorenju, b predstavlja 2, 3, 4 ili 5, a c nezavisno predstavlja 2, 3 ili 4.

[0283] PEGxx u formulama pronalaska nezavisno predstavlja derivat polietilen glikola odabran iz grupe koju čine PEG<2>, PEG<2>DGA i TDS.

[0285] Navedene grupe su definisane na sledeći način:

[0287]

[0290] U kojoj, u (PEGxx)formule (II), △ predstavlja kovalentnu vezu sa (gE)<c>grupom i predstavlja kovalentnu vezu koja povezuje grupu formule (II) sa atomom azota bočnog lanca strukture lizina na poziciji X<25.>

[0291] U određenom otelotvorenju, (PEGxx)predstavlja derivat polietilen glikola odabran iz grupe koju čine (TTDS)<2>, (TTDS)<3>, (PEG<2>DGA)<3>, (PEG<2>)<3>, (PEG<2>)<4>i (PEG<2>)<5>.

[0293] Kao što je prethodno navedeno, gE, koji takođe može biti predstavljen kao γE, gGlu ili γGlu, predstavlja gama-glutaminsku kiselinu. Ova aminokiselina ima sledeću strukturu:

[0295]

[0297] u kojoj, kada je predstavljena u formuli (II) kao (gE)<c>, △ predstavlja kovalentnu vezu sa C<d>i predstavlja kovalentnu vezu sa (PEGxx)b grupom.

[0299] C<d>predstavlja linearnu zasićenu C<12>-C<22>acil grupu, posebno linearnu zasićenu acil grupu odabranu iz grupe koju čine C<12>(Lau), C<14>(Myr), C<15>(Penta), C<16>(Palm), C<17>(Hepta), C<18>(Stea), C<20>(Eico) i C<22>(Doco) acil grupa. U jednom otelotvorenju, C<k>predstavlja linearnu zasićenu acil grupu odabranu iz grupe koju čine C<12>(Lau), C<14>(Myr), C<15>(Penta), C<16>(Palm), C<17>(Hepta) ili C<18>(Stea) acil grupu, posebno linearnu zasićenu C<14>, C<16>ili C<18>acil grupu, a još više posebno linearnu C<16>ili C<18>acil grupu.

[0301] U određenom otelotvorenju, C<d>predstavlja linearnu zasićenu C<12>acil grupu. Linearna zasićena C<12>acil grupa prema pronalasku je lauroil grupa (takođe predstavljena kao „Lau” u predmetnom tekstu).

[0303] U određenom otelotvorenju, C<d>predstavlja linearnu zasićenu C<14>acil grupu. Linearna zasićena C<14>acil grupa prema pronalasku je miristoil grupa (takođe predstavljena kao „Myr” u predmetnom tekstu).

[0305] U određenom otelotvorenju, C<d>predstavlja linearnu zasićenu C<15>acil grupu. Linearna zasićena C<15>acil grupa prema pronalasku je pentadekanoil grupa (takođe predstavljena kao „Penta” u predmetnom tekstu).

[0307] [0071] U određenom otelotvorenju, C<d>predstavlja linearnu zasićenu C<16>acil grupu. Linearna zasićena C<16>acil grupa prema pronalasku je palmitoil grupa (takođe predstavljena kao „Palm” u predmetnom tekstu).

[0309] U određenom otelotvorenju, C<d>predstavlja linearnu zasićenu C<17>acil grupu. Linearna zasićena C<17>acil grupa prema pronalasku je heptadekanoil grupa (takođe predstavljena kao „Hepta” u predmetnom tekstu).

[0311] U drugom određenom otelotvorenju, C<d>predstavlja linearnu zasićenu C<18>acil grupu. Linearna zasićena C<18>grupa prema pronalasku je stearoil grupa (takođe predstavljena kao „Stea” u predmetnom tekstu).

[0313] U drugom određenom otelotvorenju, C<d>predstavlja linearnu zasićenu C<20>acil grupu. Linearna zasićena C<20>acil grupa prema pronalasku je eikozanoil grupa (takođe predstavljena kao „Eico” u predmetnom tekstu).

[0315] U drugom određenom otelotvorenju, C<d>predstavlja linearnu zasićenu C<22>acil grupu. Linearna zasićena C<22>acil grupa prema pronalasku je dokozanoil grupa (takođe predstavljena kao „Doco” u predmetnom tekstu).

[0317] U određenom otelotvorenju, Z je odabran iz grupe koju čine -(TTDS)<2>-(gamaglutaminska kiselina)<3>-palmitoil (-(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm), -(TTDS)<3>-(gama-glutaminska kiselina)<3>-palmitoil (-(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm), -(PEG<2>DGA)<3>-(gama-glutaminska kiselina)<3>-palmitoil (-(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm), -(PEG<2>)<4>-(gama-glutaminska kiselina)<3>-palmitoil (-(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Palm), -(TTDS)<2>-(gama-glutaminska kiselina)<2>-palmitoil (-(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm), -(TTDS)<2>-(gama-glutaminska kiselina)<3>-stearoil (-(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea), -(TTDS)<3>-(gama-glutaminska kiselina)<3>-stearoil (-(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea), -(PEG<2>DGA)<3>-(gamaglutaminska kiselina)<3>-stearoil (-(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Stea), -(PEG<2>DGA)<3>-(gama-glutaminska kiselina)<4>-stearoil (-(PEG2DGA)<3>-(gE)<4>-Stea), -(PEG<2>)<3>-(gama-glutaminska kiselina)<3>-palmitoil (-(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm), -(PEG<2>)<4>-(gama-glutaminska kiselina)<3>-stearoil (-(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea), -(PEG<2>)<5>-(gama-glutaminska kiselina)<3>-palmitoil (-(PEG<2>)<5>-(gE)<3>-Palm), -(PEG<2>)<5>-(gama-glutaminska kiselina)<4>-palmitoil (-(PEG<2>)<5>-(gE)<4>-Palm), -(TTDS)<3>-(gamaglutaminska kiselina)<4>-stearoil (-(TTDS)<3>-(gE)<4>-Stea), -(TTDS)<2>-(gama-glutaminska kiselina)<4>-palmitoil (-(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm), -(TTDS)<3>-(gama-glutaminska kiselina)<2>-stearoil (-(TTDS)<3>-(gE)<2>-Stea) i -(TTDS)<2>-(gama-glutaminska kiselina)<4>-stearoil (-(TTDS)<2>-(gE)<4>Stea), u još određenijem otelotvorenju, Z je odabran iz grupe koju čine -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea i -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, u posebnom otelotvorenju, Z je odabran iz grupe koju čine -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea i -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, na primer -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm i -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea.

[0319] U svim ovim Z grupama, prvi simbol - predstavlja kovalentnu vezu između Z grupe i atoma azota bočnog lanca strukture lizina na poziciji X<25>.

[0321] Shodno tome, kada je Z grupa na primer predstavljena kao -(TTDS)<2>-(gamaglutaminska kiselina)<3>-palmitoil (takođe predstavljena kao -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm), prva TTDS grupa je vezana za atom azota bočnog lanca strukture na poziciji X<25>. Kovalentna veza takođe povezuje prvu TTDS grupu sa drugom TTDS grupom, dok druga kovalentna veza povezuje ovu drugu TTDS grupu sa prvom gama-glutaminskom kiselinom (gE). Ova prva gama-glutaminska kiselina (gE) je i sama povezana putem kovalentne veze sa drugom gamaglutaminskom kiselinom (gE), ova druga gama-glutaminska kiselina (gE) je povezana putem druge kovalentne veze sa trećom gama-glutaminskom kiselinom (gE), a ova treća gamaglutaminska kiselina (gE) je dalje povezana kovalentnom vezom sa palmitoil (Palm) grupom.

[0323] Štaviše, iz predmetne prijave se mora razumeti da bi Z grupa prema pronalasku predstavljena na primer kao -(TTDS)<2>-(gama-glutaminska kiselina)<3>-palmitoil (takođe predstavljena kao -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm) takođe mogla biti predstavljena kao -TTDS-TTDS-gE-gE-gE-Palm.

[0325] Isto važi mutatis mutandis za ostale predstavljene Z grupe prema pronalasku.

[0327] U skladu sa određenim otelotvorenjem, peptid prema pronalasku je formule (Ia):

[0329] N<ter>-Ac-L-E-G-R-E-X<15>-V-R-X<18>-X<19>-I-Aib-Aib-E-G-X<25>-S-T-X<28>-X<29>-X<30>-R-X<32>-X<33>-NH<2>-C<ter>

[0331] gde:

[0332] N<ter>predstavlja N-terminalni kraj peptida;

[0333] C<ter>predstavlja C-terminalni kraj peptida;

[0334] AC predstavlja acetil grupu;

[0335] L predstavlja leucin;

[0336] E predstavlja glutaminsku kiselinu;

[0337] G predstavlja glicin;

[0338] R predstavlja arginin;

[0339] X<15>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, arginin, homolizin, glutamin, fenilalanin i leucin;

[0340] V predstavlja valin;

[0341] X<18>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine alanin i 2-amino-izobuterna kiselina;

[0342] X<19>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, Nε-acetil-lizin, glutamin i citrulin;

[0343] I predstavlja izoleucin;

[0344] Aib predstavlja 2-amino-izobuternu kiselinu;

[0345] X<25>predstavlja sledeću strukturu:

[0347]

[0349] u kojoj:

[0350] • * predstavlja kovalentnu vezu sa glicinom koji prethodi poziciji X<25>u formuli (Ia); • ◆ predstavlja kovalentnu vezu sa serinom koji sledi nakon pozicije X<25>u formuli (Ia);

[0351] i

[0352] Z je odabran iz grupe koju čine

[0353] -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<4>-Stea, -(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<5>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<5>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<2>-Stea i -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Stea, pri čemu

[0354] gE predstavlja gama-glutaminsku kiselinu;

[0355] Palm predstavlja palmitoil; i

[0356] Stea predstavlja steroil;

[0357] S predstavlja serin;

[0358] T predstavlja treonin;

[0359] X<28>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine triptofan i fenilalanin;

[0360] X<29>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine serin, D-serin i 2-aminoizobuterna kiselina;

[0361] X<30>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina, αmetil-lizin, D-lizin i lizin;

[0362] X<32>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, alanin i arginin; i

[0363] X<33>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin i Nε-acetil-lizin;

[0364] ili njihova so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača.

[0366] U određenom otelotvorenju, peptid prema pronalasku ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine aminokiselinske sekvence referentnih SEQ ID NO: 1-97.

[0367] Posebno, peptid prema pronalasku ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine aminokiselinske sekvence referentnih SEQ ID NO: 1-32, 34-37, 39, 42, 44, 45, 47-49, 51 i 54-97.

[0369] U određenom otelotvorenju, peptid koji ima sledeću formulu (Ia) kao što je gore opisano:

[0370] X<19>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine Nε-acetil-lizin i citrulin;

[0371] X<25>predstavlja sledeću strukturu:

[0373]

[0375] u kojoj:

[0376] • * predstavlja kovalentnu vezu sa glicinom koji prethodi poziciji X<25>u formuli (Ia); • ◆ predstavlja kovalentnu vezu sa serinom koji sledi nakon pozicije X<25>u formuli (Ia);

[0377] i

[0378] Z je odabran iz grupe koju čine

[0379] -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea i -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, pri čemu

[0380] gE predstavlja gama-glutaminsku kiselinu;

[0381] Palm predstavlja palmitoil; i

[0382] Stea predstavlja steroil;

[0383] X<32>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin i alanin; i

[0384] X<33>predstavlja Nε-acetil-lizin;

[0385] ili njihova so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača.

[0387] Prema drugom otelotvorenju, peptid prema pronalasku ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine aminokiselinske sekvence referentnih SEQ ID NO: 1-30.

[0389] U određenom otelotvorenju, peptid prema pronalasku formule (Ia) je takav da:

[0390] N<ter>predstavlja N-terminalni kraj peptida;

[0391] C<ter>predstavlja C-terminalni kraj peptida;

[0392] AC predstavlja acetil grupu;

[0393] L predstavlja leucin;

[0394] E predstavlja glutaminsku kiselinu;

[0395] G predstavlja glicin;

[0396] R predstavlja arginin;

[0397] X<15>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin i homolizin; V predstavlja valin;

[0398] X<18>predstavlja alanin;

[0399] X<19>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine Nε-acetil-lizin i citrulin;

[0400] I predstavlja izoleucin;

[0401] Aib predstavlja 2-amino-izobuternu kiselinu;

[0402] X<25>predstavlja sledeću strukturu:

[0404]

[0406] u kojoj:

[0407] • * predstavlja kovalentnu vezu sa glicinom koji prethodi poziciji X<25>u formuli (Ia); • ◆ predstavlja kovalentnu vezu sa serinom koji sledi nakon pozicije X<25>u formuli (Ia);

[0408] i

[0409] Z je odabran iz grupe koju čine -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea i -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea, pri čemu

[0410] gE predstavlja gama-glutaminsku kiselinu;

[0411] Palm predstavlja palmitoil; i

[0412] Stea predstavlja steroil;

[0413] S predstavlja serin;

[0414] T predstavlja treonin;

[0415] X<28>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine triptofan i fenilalanin;

[0416] X<29>predstavlja serin;

[0417] X<30>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuternu kiselinu i αmetil-lizin;

[0418] X<32>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, alanin i arginin; i

[0419] X<33>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin i Nε-acetil-lizin;

[0420] ili njihova so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača.

[0422] U posebnom otelotvorenju, peptid prema pronalasku formule (Ia) je takav da:

[0423] N<ter>predstavlja N-terminalni kraj peptida;

[0424] C<ter>predstavlja C-terminalni kraj peptida;

[0425] AC predstavlja acetil grupu;

[0426] L predstavlja leucin;

[0427] E predstavlja glutaminsku kiselinu;

[0428] G predstavlja glicin;

[0429] R predstavlja arginin;

[0430] X<15>predstavlja lizin;

[0431] V predstavlja valin;

[0432] X<18>predstavlja alanin;

[0433] X<19>predstavlja Nε-acetil-lizin;

[0434] I predstavlja izoleucin;

[0435] Aib predstavlja 2-amino-izobuternu kiselinu;

[0436] X<25>predstavlja sledeću strukturu:

[0438]

[0440] u kojoj:

[0441] • * predstavlja kovalentnu vezu sa glicinom koji prethodi poziciji X<25>u formuli (Ia); • ◆ predstavlja kovalentnu vezu sa serinom koji sledi nakon pozicije X<25>u formuli (Ia);

[0442] i

[0443] Z je odabran iz grupe koju čine -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea i -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea, pri čemu

[0444] gE predstavlja gama-glutaminsku kiselinu;

[0445] Palm predstavlja palmitoil; i

[0446] Stea predstavlja steroil;

[0447] S predstavlja serin;

[0448] T predstavlja treonin;

[0449] X<28>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine triptofan i fenilalanin;

[0450] X<29>predstavlja serin;

[0451] X<30>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuternu kiselinu i αmetil-lizin;

[0452] X<32>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, alanin i arginin; i

[0453] X<33>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin i Nε-acetil-lizin;

[0454] ili njihova so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača.

[0456] U skladu sa određenim otelotvorenjem, peptid prema pronalasku je formule (Ib):

[0458] N<ter>-Ac-X<10>-E-G-R-E-X<15>-V-R-X<18>-X<19>-I-X<21>-X<22>-E-G-X<25>-S-X<27>-X<28>-X<29>-X<30>-R-X<32>-X<33>-NH<2>-C<ter>

[0460] gde:

[0461] N<ter>predstavlja N-terminalni kraj peptida;

[0462] C<ter>predstavlja C-terminalni kraj peptida;

[0463] AC predstavlja acetil grupu;

[0464] X<10>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine leucin, Nε-acetil-lizin i 2-aminoizobuterna kiselina;

[0465] E predstavlja glutaminsku kiselinu;

[0466] G predstavlja glicin;

[0467] R predstavlja arginin;

[0468] X<15>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, arginin, homolizin, glutamin, fenilalanin i leucin;

[0469] V predstavlja valin;

[0470] X<18>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine alanin, 2-amino-izobuternu kiselinu i Nε-acetil-lizin;

[0471] X<19>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, Nε-acetil-lizin, glutamin i citrulin;

[0472] I predstavlja izoleucin;

[0473] X<21>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina i alanin;

[0474] X<22>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina i izoleucin;

[0475] X<25>predstavlja sledeću strukturu:

[0477]

[0479] u kojoj:

[0480] • * predstavlja kovalentnu vezu sa glicinom koji prethodi poziciji X<25>u formuli (Ia); • ◆ predstavlja kovalentnu vezu sa serinom koji sledi nakon pozicije X<25>u formuli (Ia);

[0481] i

[0482] Z je odabran iz grupe koju čine -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<4>-Stea, -(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<5>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<5>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<2>-Stea, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<4>-(gE)<3>-Stea, (TTDS)<3>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Myr i -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Myr, pri čemu

[0483] gE predstavlja gama-glutaminsku kiselinu;

[0484] Palm predstavlja palmitoil; i

[0485] Stea predstavlja steroil;

[0486] S predstavlja serin;

[0487] X<27>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine treonin, glutamin, arginin i lizin; X<28>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine triptofan, fenilalanin, 5-hlorotriptofan, α-metil-fenilanin, 4-fluoro-fenilalanin i 5-fluorotriptofan;

[0488] X<29>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine serin, D-serin, 2-amino-izobuterna kiselina, Nε-acetil-lizin, treonin i valin;

[0489] X<30>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina, αmetil-lizin, D-lizin, lizin, homolizin i arginin;

[0490] X<32>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, alanin, arginin i Nε-acetillizin; i

[0491] X<33>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, Nε-acetil-lizin i arginin; ili njihova so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača.

[0493] Posebno, Z može biti odabran iz grupe koju čine -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG2DGA)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<2>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>DGA)<3>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<3>-(gE)<3>-Palm, -(PEG<2>)<4>-(gE)<3>-Stea, -(PEG<2>)<5>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<2>-(gE)<4>-Stea, -(TTDS)<4>-(gE)<3>-Stea, -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Palm, -(TTDS)<4>-(gE)<3>-Palm, -(TTDS)<3>-(gE)<3>-Myr i -(TTDS)<3>-(gE)<4>-Myr.

[0495] U određenom otelotvorenju pronalaska, peptid pronalaska ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 3, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 20, 21, 22, 26, 28 i 30.

[0497] U određenom otelotvorenju pronalaska, peptid pronalaska ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 3, 6, 7, 9-12, 20-22, 26, 28, 30-34, 45, 47-49, 51, 54-62, 64, 67-69, 71-93, 96 i 97. Kao što je gore navedeno i ilustrovano u priloženim primerima, ovi peptidi su posebno povoljni jer svi imaju EC<50>niži ili jednak 1 nM.

[0498] U određenom otelotvorenju, peptid pronalaska ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 3, 6, 7, 13, 20, 26 i 30.

[0500] U određenom otelotvorenju, peptid pronalaska ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 3, 6, 7, 20, 26, 30-34, 45, 48, 49, 51, 54-61, 67, 71, 73, 75-79, 81, 83-92 i 97. Kao što je ilustrovano u priloženim primerima, peptidi prema ovom otelotvorenju su posebno povoljni jer svi imaju EC<50>niži ili jednak 0,5 nM.

[0502] U određenom otelotvorenju, peptid pronalaska ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine aminokiselinske sekvence referentnih SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 20, a posebno ima aminokiselinsku sekvencu referentne SEQ ID NO: 3.

[0504] Peptid pronalaska se može proizvesti bilo kojom tehnikom poznatom po sebi u struci, kao što su, bez ograničenja, bilo koja hemijska, biološka, genetička ili enzimska tehnika, bilo pojedinačno ili u kombinaciji. Poznavajući aminokiselinsku sekvencu željene sekvence, lice vešto u struci može lako proizvesti navedene polipeptide standardnim tehnikama za proizvodnju polipeptida, čak i ako se koriste neprirodne aminokiseline ili prema metodama koje su ovde opisane.

[0506] Na primer, peptidi pronalaska mogu se sintetisati korišćenjem dobro poznate metode čvrste faze, posebno korišćenjem komercijalno dostupnih aparata za sintezu peptida (kao što su oni koje proizvode Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija; Gyros Protein technologies, Tucson, Arizona ili CEM corporation, Matthews, Severna Karolina) i prateći uputstva proizvođača.

[0508] Primeri odgovarajućih metoda su ilustrovani u priloženim primerima.

[0510] Peptid pronalaska može biti obeležen sa najmanje jednim detektabilnim molekulom ili supstancom, posebno odabranom iz grupe koju čine enzimi, prostetične grupe, fluorescentni materijali, luminiscentni materijali, bioluminiscentni materijali i radioaktivni materijali.

[0512] [0098] Međutim, važno je da navedeno obeležje ne menja niti sprečava navedeni peptid da ima svoju biološku aktivnost od interesa kao što je prethodno definisano, tj. da ne sprečava niti menja sposobnost peptida da se veže i aktivira RXFP1 receptor.

[0514] Poželjni detektabilni molekuli ili supstance za nanomaterijalni nosač su oni koji se mogu detektovati eksterno na neinvazivan način nakon in vivo primene.

[0516] Detektabilni molekuli ili supstance su dobro poznati čoveku veštom u struci.

[0518] Takav obeleženi peptid pronalaska može se koristiti u metodi dijagnoze i/ili snimanja.

[0520] Pronalazači su štaviše primetili da je poluvreme eliminacije, a posebno in vivo poluvreme eliminacije peptida pronalaska, značajno superiornije u odnosu na poluvreme eliminacije relaksina.

[0522] Zaista, relaksin se brzo čisti preko bubrega i ne može se koristiti u hroničnim uslovima. Rekombinantni hormon ima veoma kratko in vivo poluvreme eliminacije (kao što je ilustrovano kod majmuna i ljudi u B.L. Ferraiolo et al. Pharm.Res. (1991), 8, 1032 i u S.A. Chen et al. Pharm. Res. (1993), 10, 834) i zahteva intravensku primenu. Poluvreme eliminacije relaksina je zaista toliko kratko da bi mogla biti potrebna kontinuirana infuzija tokom nekoliko sati u bolničkom okruženju radi njegove primene pojedincu kojem je to potrebno, posebno pojedincu koji pati od akutne bolesti ili poremećaja, kao što je na primer akutna srčana insuficijencija. Zamena relaksina u ovom tretmanu relaksin-peptidima koji imaju poboljšano in vivo poluvreme eliminacije prednosno omogućava zamenu ovog ograničavajućeg tretmana jednostavnijim, kao što je primena jednom dnevno, na primer, intravenskim ili supkutanim putem.

[0524] Shodno tome, relaksin peptidi pronalaska, koji poseduju sposobnost relaksina da aktiviraju RXFP1, a posebno peptidi koji su dugodelujući agonisti RXFP1, imaju potencijal za šire terapeutske primene uključujući akutnu ili hroničnu srčanu insuficijenciju.

[0526] Kompozicije i lekovi

[0527] [0105] Predmetna prijava se takođe odnosi na lek ili farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata najmanje jedan peptid pronalaska kao što je gore opisano, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0529] Najmanje jedan peptid pronalaska prisutan je u leku ili farmaceutskoj kompoziciji pronalaska kao aktivni princip.

[0531] Kompozicija ili lek pronalaska je u obliku pogodnom za primenu kod sisara.

[0533] Kompozicija ili lek pronalaska može se primeniti, na primer, oralno, parenteralno, intravenski, rektalno, transdermalno, lokalno ili inhalacijom. Posebno, kompozicija prema pronalasku se primenjuje intravenskim ili supkutanim putem.

[0535] U određenom otelotvorenju, farmaceutski prihvatljiv nosač kompozicije pronalaska je na odgovarajući način odabran iz grupe koju čine tečni nosač za injekcije kao što je sterilna voda za injekcije; i vodeni rastvor kao što je fiziološki rastvor.

[0537] Kompozicija ili lek pronalaska može da obuhvata sadržaj peptida pronalaska obuhvaćen između 0,01 mg/ml i 30 mg/ml, posebno između 0,3 mg/ml i 3 mg/ml.

[0539] Lek ili farmaceutska kompozicija pronalaska može da obuhvata najmanje jedan peptid pronalaska kao aktivni princip ili takođe može da obuhvata najmanje jedan drugi aktivni princip, sve dok navedeni drugi aktivni princip ne sprečava biološku aktivnost peptida prema pronalasku.

[0541] Farmaceutska kompozicija ili lek prema pronalasku može dalje da obuhvata najmanje jedan antioksidans, disperzant, emulgator, sredstvo protiv penušanja, aromu, konzervans, solubilizator i/ili boju, sve dok ove dodatne supstance ne sprečavaju biološka svojstva peptida prema pronalasku.

[0543] [0113] Sterilne kompozicije pronalaska za parenteralnu primenu mogu posebno biti vodeni ili ne-vodeni rastvori, suspenzije ili emulzije. Rastvarači ili vehikulumi koji se mogu koristiti uključuju vodu, propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja, posebno maslinovo ulje, injektabilne organske estre, na primer etil oleat, ili druge odgovarajuće organske rastvarače. Ove kompozicije takođe mogu da obuhvataju adjuvanse, posebno sredstva za vlaženje, sredstva za toničnost, emulgatore, disperzante i stabilizatore. Sterilizacija se može izvršiti na nekoliko načina, na primer aseptičnom filtracijom, ugradnjom sredstava za sterilizaciju u kompoziciju, zračenjem ili zagrevanjem. One se takođe mogu pripremiti u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje se mogu rastvoriti u trenutku upotrebe u sterilnoj vodi ili bilo kom drugom injektabilnom sterilnom medijumu.

[0545] Kompozicije za lokalnu primenu mogu biti, na primer, kapi za nos ili aerosoli.

[0547] Za supkutanu, intramuskularnu ili intravensku primenu, peptidi pronalaska koji se koriste se konvertuju, ako se želi, sa supstancama uobičajenim za ovu svrhu, kao što su solubilizatori, emulgatori ili drugi ekscipijensi, u rastvor, suspenziju ili emulziju. Primeri pogodnih rastvarača su: voda, fiziološki rastvor ili alkoholi, npr. etanol, propanol, glicerol, kao i rastvori šećera kao što su rastvori glukoze ili manitola, ili pak smeša različitih navedenih rastvarača.

[0549] U određenom otelotvorenju, kompozicija pronalaska, lek pronalaska, ili peptid pronalaska, ili jedna od njegovih farmaceutski prihvatljivih soli ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, primenjuje se pojedincu parenteralnim putem, a posebno transdermalno, intravenski, supkutano ili intramuskularno, posebno intravenski ili supkutano primenjeno.

[0551] Metode za pripremu parenteralno primenljivih kompozicija su očigledne onima veštim u struci, i na primer su detaljnije opisane u Remington's Pharmaceutical Science, 15. izd., Mack Publishing Company, Easton, Pa.

[0553] Primena kompozicije pronalaska ili peptida pronalaska pojedincu može biti sistemska primena ili primena lokalizovana na tkivo, organ i/ili mesto u organizmu pojedinca gde je prisustvo, na primer fibroze, poznato, očekuje se ili ga treba utvrditi.

[0555] Upotreba peptida i kompozicija

[0556] Predmetni pronalazak se odnosi na peptid prema pronalasku, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, prema pronalasku, za njegovu upotrebu kao leka.

[0557] Štaviše, pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku za njenu upotrebu kao leka.

[0559] Nadalje, predmetni pronalazak se odnosi na peptid prema pronalasku, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, ili na farmaceutsku kompoziciju pronalaska za njenu upotrebu u tretmanu i/ili prevenciji različitih bolesti ili stanja koja uključuju RXFP1 receptor, preciznije u tretmanu i/ili prevenciji bolesti ili stanja odabranih iz:

[0560] • grupe koju čine fibroza; fibrozne bolesti, posebno sistemska skleroza, skleroderma i fibromijalgija; idiopatska plućna fibroza; bolesti bubrega koje uključuju fibrozu; plućna hipertenzija i preeklampsija;

[0561] • grupe koju čine srčane i vaskularne bolesti, posebno iz grupe koju čine akutna ili hronična srčana insuficijencija, sistolna ili dijastolna srčana insuficijencija, bolest koronarnih arterija, ateroskleroza, mikrovaskularna angina i kardiovaskularne komplikacije dijabetesa; i/ili

[0562] • grupe koju čine otkazivanja bubrega, posebno disfunkcija bubrega kod ciroze;

[0563] hronična bolest bubrega i akutna povreda bubrega.

[0565] U jednom aspektu, takav peptid, farmaceutski prihvatljiva so ili kompleks navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku, primenjuje se jednom dnevno, posebno intravenskim ili supkutanim putem.

[0567] Doziranje peptida, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili kompleksa navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, koji se primenjuje, kao i učestalost primene, zavise od željenog efekta, jačine i trajanja dejstva korišćenih jedinjenja; dodatno takođe i od prirode i ozbiljnosti bolesti ili stanja koje se leči, kao i od pola, starosti, težine i individualne reakcije sisara koji se leči. Uopšteno, lekar će odrediti odgovarajuće doziranje u zavisnosti od starosti i težine i svih ostalih faktora specifičnih za pojedinca koji se leči.

[0569] [0124] Takođe je opisana metoda za prevenciju i/ili tretman kod pojedinca bolesti ili stanja koje uključuje relaksin receptor RXFP1, koji obuhvata primenu navedenom pojedincu najmanje jednog peptida pronalaska, farmaceutski prihvatljive soli ili kompleksa navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, ili farmaceutske kompozicije pronalaska koja obuhvata najmanje jedan peptid prema pronalasku, ili terapeutski efikasne količine najmanje jednog peptida pronalaska, farmaceutski prihvatljive soli ili kompleksa navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, ili farmaceutske kompozicije pronalaska koja obuhvata najmanje jedan peptid prema pronalasku.

[0571] Kao što je prethodno navedeno, navedena bolest ili stanje je posebno odabrano iz:

[0572] • grupe koju čine fibroza; fibrotične bolesti, posebno sistemska skleroza, skleroderma i fibromijalgija; idiopatska plućna fibroza; bolesti bubrega koje uključuju fibrozu; plućna hipertenzija i preeklampsija; - grupe koju čine srčane i vaskularne bolesti, posebno iz grupe koju čine akutna ili hronična srčana insuficijencija, sistolna ili dijastolna srčana insuficijencija, bolest koronarnih arterija, ateroskleroza, mikrovaskularna angina i kardiovaskularne komplikacije dijabetesa; i/ili

[0573] • grupe koju čine otkazivanja bubrega, posebno disfunkcija bubrega kod ciroze;

[0574] hronična bolest bubrega i akutna povreda bubrega.

[0576] Dalje je opisana metoda upotrebe najmanje jednog peptida prema pronalasku, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili kompleksa navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, ili farmaceutske kompozicije pronalaska koja obuhvata najmanje jedan peptid prema pronalasku, ili terapeutski efikasne količine najmanje jednog peptida prema pronalasku, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili kompleksa navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, ili farmaceutske kompozicije pronalaska koja obuhvata najmanje jedan peptid prema pronalasku, za proizvodnju leka za prevenciju i/ili tretman kod pojedinca bolesti ili stanja koje uključuje relaksin receptor RXFP1.

[0578] Dalje je opisana upotreba najmanje jednog peptida prema pronalasku, njegove farmaceutski prihvatljive soli ili kompleksa navedenog peptida ili njegove soli sa molekulima rastvarača, ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku za tretiranje i/ili sprečavanje bolesti ili stanja odabranog iz:

[0579] • grupe koju čine fibroza; fibrozne bolesti, posebno sistemska skleroza, skleroderma i fibromijalgija; idiopatska plućna fibroza; bolesti bubrega koje uključuju fibrozu; plućna hipertenzija i preeklampsija;

[0580] • grupe koju čine srčane i vaskularne bolesti, posebno iz grupe koju čine akutna ili hronična srčana insuficijencija, sistolna ili dijastolna srčana insuficijencija, bolest koronarnih arterija, ateroskleroza, mikrovaskularna angina i kardiovaskularne komplikacije dijabetesa; i/ili

[0581] • grupe koju čine otkazivanja bubrega, posebno disfunkcija bubrega kod ciroze;

[0582] hronična bolest bubrega i akutna povreda bubrega.

[0584] Predmetni pronalazak je ilustrovan sledećim primerima, datim isključivo u ilustrativne svrhe.

[0586] PRIMERI

[0587] Primer 1: sinteza peptida prema pronalasku

[0588] Korišćeni materijal

[0589] Za sintezu peptida prema pronalasku sa C-terminalnim amidom korišćene su različite Rink-amidne smole:

[0590] • 4-(2',4'-dimetoksifenil-Fmoc-aminometil)fenoksi smola, prodavca Chem-Impex; ili • 4-(2',4'-dimetoksifenil-Fmoc-aminometil)fenoksi acetamido metil smola, prodavca Millipore Merck.

[0592] Smole su bile nanete u opsegu od 0,2 do 0,4 mmol/g.

[0594] Fmoc (fluorenilmetiloksikarbonil) zaštićene prirodne aminokiseline su kupljene od različitih dobavljača, tj. Protein Technologies Inc., Merck Biosciences, Novabiochem, Iris Biotech, Bachem, Chem-Impex International ili MATRIX Innovation.

[0596] Sledeće standardne aminokiseline su korišćene tokom sinteza: Fmoc-L-Ala-OH, Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-L-Gln(Trt)-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-L-Glu-OtBu, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L-Ile-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Lys(Boc)-OH, Fmoc-L-Met-OH, Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc-L-Ser(tBu)-OH, Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH i Fmoc-L-Val-OH.

[0598] Pored toga, od istih gorenavedenih dobavljača kupljene su sledeće specijalne aminokiseline: Fmoc-L-hArg(Pbf)-OH, Fmoc-L-Cit-OH, Fmoc-L-Arg(Me,Pbf)-OH, Fmoc-L-hLys(Boc)-OH, Fmoc-L-Orn(Boc)-OH, Fmoc-L-Lys(Dde)-OH, Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH, Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH, Fmoc-L-Lys(aloc)-OH, Fmoc-L-Lys(Ac)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-L-α-Me-Ser(tBu)-OH, Fmoc-L-α-Me-Lys(Boc)-OH, Fmoc-L-α-Me-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Lα-Me-Leu-OH, Fmoc-L-Nle-OH i Fmoc-L-1-Nal-OH, Fmoc-L-2-Nal-OH Fmoc-5-Wox-OH, Fmoc-Pfp-OH, Fmoc-L-α-Me-Trp-OH, Fmoc-L-α-Me-Phe-OH.

[0599]

[0601] HATU (2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilaminijum heksafluorofosfat)

[0603]

[0604]

[0607] Za sintezu C-terminalno lipidovanih peptida pronalaska, korišćen je ortogonalno zaštićeni lizin kao što je navedeno u daljem tekstu.

[0609] 1. A. Opšta metoda korišćena za sintezu peptida prema pronalasku

[0610] Peptidi prema pronalasku sekvenci SEQ ID NO: 1-97 sintetisani su na osnovu metode predstavljene na slikama 1 i 2.

[0612] 0,2 mmol Rink-amidne AM smole postavljeno je u CEM Liberty blue mikrotalasni sintetizator peptida kako bi se sastavila puna sekvenca peptida. (videti sliku 1).

[0614] Celokupna sinteza je izvedena koristeći DMF kao rastvarač. Peptid je sintetisan korišćenjem standardne protokola zagrevanja za skalu od 0,1 do 0,2 mmol:

[0615] Standardni protokol zagrevanja: ozračivanje na 170 W, 75°C, 15 sekundi; zatim ozračivanje na 30 W, 90°C, 120 sekundi.

[0617] Deprotekcija je izvršena sa 20% v/v piperidina u DMF-u, nakon čega su usledila 3 koraka pranja sa DMF-om.

[0618] Protokol zagrevanja za deprotekciju: ozračivanje na 170 W, 75°C, 15 sekundi; zatim ozračivanje na 30 W, 90°C, 50 sekundi.

[0620] Kuplovanja aminokiselina su izvršena korišćenjem 5 ekvivalenata (ekv.) Fmoc-AA kao 0,2 M rastvora u DMF-u koristeći 5 ekv. N,N'-diizopropilkarbodiimida (DIC) 0,5 M i 5 ekv. Oksima (etil 2-cijano-2-(hidroksimino)acetata (oxyma pure<™>)) 1M kao reagenasa za kuplovanje.

[0622] Za bolji finalni prinos, svaka aminokiselina je zahtevala dvostruka kuplovanja na 90°C tokom 120 sekundi. Za 2-aminoizobuternu kiselinu na pozicijama X<21>i X<22>i serin na poziciji X<29>formule (I) prema pronalasku, korišćeno je trostruko kuplovanje na 90°C tokom 2 minuta.

[0624] U slučaju skupih derivata aminokiselina, npr. Fmoc-α-metil-lizin(Boc)-OH, može biti korisno izvršiti manuelno kuplovanje koristeći 3 ekv. aminokiseline i 3 ekv. agensa za kuplovanje kao što su HATU ili HCTU na sobnoj temperaturi tokom 1 do 18 sati ili koristeći DIC i Oxyma Pure<™>sa mikrotalasnim zagrevanjem tokom 120 sekundi.

[0626] Na poziciji X<25>, korišćen je derivat Fmoc-lizina-OH koji na azotu bočnog lanca nosi ortogonalnu zaštitnu grupu. Selektivna deprotekcija je omogućila modifikaciju bočnog lanca ove aminokiseline.

[0628] Na kraju sinteze, Fmoc deprotekcija je izvršena manuelno sa 20% v/v piperidina u DMF-u dva puta po 30 minuta na sobnoj temperaturi.

[0630] Acetilacija je izvršena na N-terminusu tretmanom sa 5-10 ekv. anhidrida sirćetne kiseline i 5-10 ekv. DIEA (DIPEA) u DMF-u tokom 15 minuta. Zatim je smola koja sadrži potpuno zaštićeni peptid isprana sa DCM/DMF/DCM, 3 puta svakim, i osušena pod vakuumom.

[0632] Zatim je Nε-zaštitna grupa lizina na poziciji X<25>(Dde, ivDde, Aloc ili Mtt) uklonjena korišćenjem razblaženog hidrazina u DMF-u (za Dde, ivDde), fenilsilana ili dimetil amino borana u prisustvu paladijum(0) katalizatora u DCM (za aloc) ili 1% TFA u DCM (za Mtt).

[0633] Zatim su Z grupe vezane na azot bočnog lanca lizina na poziciji X<25>na čvrstom nosaču prema sledećim koracima:

[0634] Kada je lizin na poziciji X<25>bio zaštićen na svom bočnom lancu grupom Dde ili ivDde, smola-peptid je prebačena u polipropilenski špric od 50 ml.80 ml rastvora hidrazina 5% u DMF-u je proceđeno kroz smolu, nakon čega je usledilo pranje DMF-om (3 puta). Reakcija je praćena Kejzerovim testom.

[0636] Kada je lizin na poziciji X<25>bio zaštićen na svom bočnom lancu alil-oksi-karbonil grupom (aloc), smola-peptid je prebačena u polipropilenski špric od 50 ml, ostavljena da nabubri u dihlorometanu i tretirana sa 20 ekv. fenilsilana (PhSiH3) (ili kompleksa borandimetilamina ((CH<3>)<2>NH.BH<3>) i piperidina) i 10 % (mol/mol) tetrakis-(trifenilfosfin)paladijuma (Pd(PPh<3>)<4>) tokom 2 sata pod argonom. Ovaj tretman je ponavljan sve dok se UPLC/MS analizom, nakon odvajanja alikvota sa smole, više nije mogao detektovati polazni peptid zaštićen aloc grupom.

[0638] Kada je reakcija završena, smola je isprana dihlorometanom, 1% DIEA u DMF-u, 5% dietil-ditio-karbamatom u DMF-u, DMF-om, 10% DIEA u DMF-u, DMF-om i dihlorometanom (3 puta svakim).

[0640] Kada je lizin na poziciji X<25>bio zaštićen na svom bočnom lancu metil-tritil grupom (Mtt), smola-peptid je prebačena u polipropilenski špric od 50 ml, ostavljena da nabubri u dihlorometanu i tretirana sa 10 ml smeše DCM/TIS/TFA (88/5/2). Nakon 1 sata mućkanja, rastvarač je ispušten, smola isprana sa DCM, mućkana sa 10 ml smeše DCM/DIEA (90/10) i isprana nekoliko puta sa DCM.

[0642] PEGxx grupa(e) Z grupe je/su uvedena(e), ako je primenljivo za dati peptid pronalaska, pojedinačnom acilacijom sa 3 ekv. Fmoc-PEGxx-OH tokom 18 sati sa 3 ekv. DIC i 3 ekv. HOAt, uz praćenje reakcija ninhidrinskim (Kejzerovim) testom. Zatim je smola tretirana sa 20% v/v piperidina u DMF-u radi uklanjanja Fmoc zaštitne grupe (2 x 30 minuta) i isprana 3 puta sa DMF-om. Koraci kuplovanja Fmoc-PEGxx-OH, uklanjanja Fmoc grupe i pranja ponovljeni su x puta (x = 0-5).

[0644] [0152] Zatim je Fmoc-Glu-OtBu ((4S)-5-terc-butoksi-4-(9H-fluoren-9-il metoksi karbonil amino)-5-oksopentanska kiselina), ako je gE prisutan u Z grupi peptida prema pronalasku, uveden izvođenjem pojedinačnog kuplovanja sa 3 ekv. aminokiseline tokom 18 sati sa 3 ekv. DIC i 3 ekv. HOAt, uz praćenje reakcija Kejzerovim testom.

[0646] Zatim je smola tretirana sa 20% v/v piperidina u DMF-u kako bi se uklonila Fmoc zaštitna grupa (2 x 30 minuta) i isprana 3 puta sa DMF-om. Koraci uklanjanja Fmoc grupe i kuplovanja Fmoc-Glu-OtBu ponovljeni su y puta (y = 1-5).

[0648] Zatim je bočni lanac lipidovan korišćenjem 3 ekv. Ck laurinske kiseline (C<12>), miristinske kiseline(C<14>), pentadekanske kiseline (C<15>), palmitinske kiseline (C<16>), heptadekanske kiseline (C<17>), stearinske kiseline (C<18>), eikozanske kiseline (C<20>) ili dokozanske kiseline (C<22>) koristeći 3 ekv. DIC i 3 ekv. HOAt u NMP-u, upotrebom odgovarajućih acil-hlorida i DIEA kao baze u dihlorometanu ili upotrebom odgovarajućih N-sukcinimidil estara i DIEA kao baze u DMF-u.

[0650] Reakcija je praćena Kejzerovim testom i ostavljena preko noći.

[0652] Zatim je smola koja sadrži potpuno zaštićeni peptid isprana sa DCM/DMF/DCM, 3 puta svakim, i osušena pod vakuumom.

[0654] 1.B. Odvajanje peptida sa smole

[0655] Nakon završetka sinteze na čvrstom nosaču, peptid je odvojen sa čvrstog nosača tretmanom reagensom za odvajanje B: TFA/fenol/H<2>O/TIPS (87,5%/5%/5%/2,5%/ 25 ml) tokom 3 sata (TIPS označava triizopropilsilan)

[0657] U određenim slučajevima, dodavanje ditiola kao što su 1,2-etanditiol ili DODT (2,2'-(etilendioksi)dietantiol) može biti korisno (npr. reagens za odvajanje K). TFA rastvor koji sadrži peptid je filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom na T < 30°C.

[0659] Željeni proizvod je istaložen pomoću ledeno hladnog MTBE-a (metil-terc-butil etra) ili dietil-etra i centrifugiran na 3000 obrtaja u minuti tokom 30 minuta. Centrifugirani talog je zatim ispran ledeno hladnim dietil-etrom i ponovo centrifugiran. Ovaj postupak je ponovljen tri puta.

[0660] U nekim slučajevima može biti neophodno obraditi sirovi peptid kako bi se uklonili neželjeni nusproizvodi kao što su TFA estri, CO<2>adukt na indolnom azotu triptofana (karbaminska kiselina) i 2-terc-butil-sulfaniletil adukt na ostacima metionina.

[0662] Za uklanjanje CO<2>adukta na indolnom azotu triptofana, sirovi peptid je rastvoren u vodi koja sadrži 10-20% CH<3>CN, 5mg/ml i liofilizovan.

[0664] Za uklanjanje 2-terc-butil-sulfaniletil adukta na Met, sirovi peptid je rastvoren (2 mg/ml) u rastvoru H<2>O/CH<3>CN (50:50 v/v) koji sadrži 0,1% mravlje kiseline.

[0666] Smeša je nežno mućkana na 37°C preko noći.

[0668] Za uklanjanje TFA estara, sirovi peptid je rastvoren (2 mg/ml) u rastvoru H<2>O/CH<3>CN (50:50 v/v) koji sadrži 0,1% mravlje kiseline. Smeša je nežno mućkana na 37°C tokom 1-4 sata.

[0670] U oba slučaja, tako dobijeni rastvor sirovog peptida je delimično koncentrovan pod sniženim pritiskom na T < 30°C i liofilizovan.

[0672] 1.C. Korak prečišćavanja

[0673] Nakon bilo koje od gore navedenih metoda indikovanih za sintezu peptida prema pronalasku, navedeni peptid je prečišćen pre upotrebe.

[0675] 80 mg peptida je rastvoreno u 1,5 ml DMSO-a i prečišćeno tečnom hromatografijom visoke efikasnosti na reverznim fazama (RP-HPLC). RP-HPLC je opisana u nastavku.

[0677] Korišćen je sistem GX271 Liquid Handler, pumpe 333/334 i UV/VIS 151 Gilson sistem.

[0679] Dva različita sistema su korišćena za prečišćavanje navedenih peptida:

[0680] Sistem A

[0681]

[0682] • Kolona Waters Delta-Pack C415µm 300Å. 250x20 mm;

[0683] • Rastvor A: 0,1% trifluoroacetatna kiselina (TFA) u H<2>O;

[0684] • Rastvor B: 0,1% TFA u acetonitrilu;

[0685] • Gradijent: 15% B tokom 5 minuta; 15% B do 50% B tokom 20 minuta;

[0686] • Brzina protoka: 80ml/min

[0688] Sistem B

[0689]

[0690] • Kolona Waters CSH C185 µm 250x50 mm, ili Waters Sunfire C1810 µM 250x50 mm;

[0691] • Rastvor A = 0,1% TFA u vodi;

[0692] • Rastvor B = 0,1% TFA u acetonitrilu;

[0693] • Gradijent: od 1% B do 18% B tokom 5 minuta; od 18% B do 28% B tokom 10 minuta; 28% B tokom 15 minuta; od 28% B do 48% B tokom 10 minuta; zatim pranje kolone sa 48% B do 90% B tokom 10 minuta.

[0694] • Brzina protoka: 150 ml/min

[0696] Peptid od interesa je eluiran u vremenskom prozoru od 35-40 minuta.

[0698] Gradijent je blago prilagođen prema polarnosti svakog peptida, koja je okarakterisana njegovim retencionim vremenom na analitičkom UHPLC sistemu.

[0700] Frakcije koje sadrže čist peptid su zatim delimično koncentrovane pod sniženim pritiskom na T < 35°C i liofilizovane do konstantne težine.

[0702] Za određene upotrebe (npr. in vivo testiranje), bilo je korisno zameniti TFA so acetatnom soli. Tri odgovarajuće metode su korišćene i opisane su u nastavku u delu 1.D.

[0704] 1.D. Zamena acetata

[0705] (i) Zamena acetata pomoću TOYOPEARL<®>DEAE 650 C (Tosh Corporation)

[0706] Jonska izmena je izvršena korišćenjem TOYOPEARL<®>DEAE 650 C smole (slaba anjonska izmenjivačka smola).

[0708] [0177] 120 ml smole je sekvencijalno isprano sa 15 zapremina 1M NaOH, 5 zapremina H<2>O, 5 zapremina 1,6 M sirćetne kiseline, 5 zapremina 0,16 M sirćetne kiseline i na kraju sa 5 zapremina H<2>O.

[0710] 41,8 mg peptida je zatim rastvoreno u 4 ml destilovane vode, naneto na smolu i nežno mešano tokom 2 sata.

[0712] Na kraju je peptid prikupljen elucijom, ispran vodom i liofilizovan.

[0714] Prinos peptida: 35 mg (kao acetatna so prema F19 NMR (400 MHz) ns 1028).

[0716] (ii) Zamena acetata pomoću Sepharose HiTrap Q HP kolone (jaka anjonska izmenjivačka kolona)

[0717] U ovoj drugoj metodi, jonska izmena je izvršena korišćenjem HiTrap Q HP kolone.

[0719] Kolona (zapremina sloja 5 ml) je povezana na peristaltičku pumpu podešenu na 48 (4,5 ml/minuta) i pre nanošenja peptida je isprana sa 50 ml (10 zapremina kolone) H<2>O, 100 ml (20 zapremina kolone) 1 M rastvora natrijum-acetata, 150 ml (30 zapremina kolone) H<2>O i sa 50 ml (10 zapremina kolone) 0,16 M sirćetne kiseline.

[0721] Čist peptid je rastvoren u 0,16 M rastvoru sirćetne kiseline u koncentraciji od 2 mg/ml, polako nanet na kolonu i eluiran brzinom od 4,5 ml/minuta.

[0723] Prikupljeni rastvor je liofilizovan.

[0725] Efikasnost jonske izmene je potvrđena putem F19 NMR (400 MHz) ns 1028.

[0727] (iii) Zamena acetata pomoću BIO RAD AG1X4<®>anjonske izmenjivačke smole [0186] U reaktor od 125 ml opremljen sinterovanim staklom na dnu stavljeno je 6,2 g BIO RAD AG1X4<®>anjonske izmenjivačke smole, veličine čestica 100-200 mesh (OH- oblik).

[0729] Smola je mućkana sa 3 x 100 ml 1,6 M vodene sirćetne kiseline (10% v/v) i sa 3 x 50 ml 0,16 M vodene sirćetne kiseline (1% v/v) na magnetnoj mešalici po 20 minuta za svaki korak.

[0730] Prečišćeni peptid u obliku TFA soli (100 mg) rastvoren je u 50 ml destilovane vode, sipan na izmenjivačku smolu i mućkan na magnetnoj mešalici tokom 120 minuta.

[0732] Vodeni rastvor je ispušten u okrugli balon od 100 ml, a smola je isprana sa 2 x 15 ml 0,16 M vodene sirćetne kiseline (1% v/v).

[0734] Sakupljeni rastvori koji sadrže peptid u obliku acetatne soli su liofilizovani do konstantne težine. Prinos = 80 mg peptida u obliku acetatne soli.

[0736] Efikasnost jonske izmene je potvrđena putem F19 NMR (400 MHz), ns 1028 i/ili jonske hromatografije.

[0738] Primer 2: Ilustrativna sinteza specifičnih peptida prema pronalasku

[0739] 2.A Nanošenje Fmoc-Lys(Ac)-OH na Rink-amidnu smolu

[0740] U reaktoru od 100 ml opremljenom sinterovanim staklom na dnu, 6 g Novabiochem ili ChemImpex Rink-amidne AM smole (nisko opterećenje 0,47 mmol/g) ostavljeno je da nabubri u 40 ml DMF-a. Rastvarač je ispušten i dodato je 30 ml rastvora 20% piperidina u DMF-u. Nakon 15 minuta mućkanja, rastvarač je ispušten. Ovo je ponovljeno dva puta kako bi se osiguralo potpuno uklanjanje Fmoc zaštitne grupe. Smola je isprana sa 5 x 30 ml DMF-a.

[0742] U odvojenom balonu pripremljen je rastvor koji sadrži Fmoc-Lys(Ac)-OH (3,5 g, 8 mmol, 3 ekv.) HOBT.H<2>0 (1,3 g 8,5 mmol) u 30 ml DMF-a. Diizopropilkarbodiimid (DIC) (1 g, 8,5 mmol) je dodat ovom rastvoru i nakon 5 minuta dobijena smeša je dodata smoli.

[0743] Suspenzija je mućkana na magnetnoj mešalici tokom 4 sata ili do završetka reakcije, što je procenjeno Kejzerovim testom (ninhidrinskim testom) na alikvotu smole.

[0745] Rastvarač je zatim ispušten, a smola isprana 3 puta sa 30 ml DMF-a. Smola sa nanesenim Fmoc-Lys(Ac)-NH<2>korišćena je odmah za naredne korake ili je čuvana vlažna na 4°C do upotrebe.

[0747] 2.B. Sinteza peptida koji ima sekvencu SEQ ID NO: 3

[0748] Sledeća sinteza je izvedena koristeći 5 puta veću količinu smole dobijene u koraku 2.A, što odgovara količini od po 0,2 mmol Fmoc-Lys(Ac)-NH<2>. Sinteze su izvođene odvojeno na svakoj pojedinačnoj seriji koristeći CEM Liberty Blue mikrotalasni sintetizator peptida kako bi se sastavio drugi i treći ostatak peptidne sekvence (počevši od C-terminusa).

[0750] Sinteza peptida je izvedena koristeći 0,5 M DIC / 1 M oksima u DMF-u.

[0752] Sve aminokiseline su uvedene dvostrukim kuplovanjima koristeći standardni protokol zagrevanja.

[0754] Smola je izvađena iz sintetizatora i Fmoc-α-metil-lizin(Boc)-OH (3 ekv.) je kuplovan manuelno koristeći 3 ekv. Oxyma<™>i 3 ekv. DIC uz mikrotalasno zagrevanje (15 sekundi na 75°C i 110 sekundi na 90°C). Završetak reakcije je kontrolisan Kejzerovim testom. Ukoliko je test bio pozitivan, dodata su još 3 ekv. DIC-a, nakon čega je usledilo mikrotalasno zagrevanje kao što je gore opisano.

[0756] Kada je kuplovanje Fmoc-α-metil-lizin(Boc)-OH završeno, ostatak peptidne sekvence je sastavljen koristeći CEM Liberty Blue mikrotalasni sintetizator peptida.

[0758] Sve aminokiseline su uvedene dvostrukim kuplovanjima na 90°C kao što je gore navedeno, sa izuzetkom amino-izobuterne kiseline na poziciji 21 i serina na poziciji 29, za koje je izvedeno trostruko kuplovanje na 90°C tokom 2 minuta. Fmoc-Lys(Dde)-OH je korišćen na poziciji 25.

[0760] Na kraju tih 5 sinteza, 5 serija smole je sjedinjeno i prebačeno u polipropilenski špric od 50 ml, a peptid je acetilovan na N-terminusu pomoću anhidrida sirćetne kiseline (944 µl, 10 mmol) u DMF-u (30 ml) tokom 20 minuta, ponavljajući ciklus dva puta.

[0762] Zatim je Dde zaštitna grupa na bočnom lancu lizina 25 uklonjena proceđivanjem 50 ml rastvora hidrazina 5% w/v u DMF-u, nakon čega je usledilo pranje DMF-om (5 x 20 ml). Reakcija je praćena Kejzerovim testom, odvajanjem alikvota smole i UPLC/MS analizom.

[0764] [0203] Tri TTDS spejser jedinice su uvedene pojedinačnim kuplovanjem, izvodeći tri puta sledeći postupak: Smoli je dodat rastvor Fmoc-TTDS-OH (1,62 g, 3 mmol) u 30 ml DMF-a, nakon čega je dodat HOAt (5 ml rastvora 0,6 M u DMF-u, 3 mmol) i DIC (1 ml, 6 mmol). Špric je mućkan na orbitalnoj mućkalici tokom 18 sati. Reakcija je praćena Kejzerovim testom. Smola je isprana sa DMF-om (2 x 30 ml). Zatim je smoli dodato 30 ml 20% v/v piperidina u DMF-u. Špric je mućkan na orbitalnoj mućkalici tokom 20 minuta. Ovaj postupak deprotekcije je ponovljen drugi put, a smola je isprana sa DMF-om (2 x 30 ml) i dihlorometanom (3 x 30 ml).

[0766] Tri gama-glutaminske kiseline kao spejser jedinice su uvedene izvođenjem dvostrukog kuplovanja svake Fmoc-Glu-OtercBu jedinice. Tako je sledeći postupak primenjen tri puta: Smoli je dodat rastvor (4S)-5-terc-butoksi-4-(9H-fluoren-9-il metoksikarbonilamino)-5-oksopentanske kiseline (Fmoc-Glu-OtercBu) (1,275 g, 3 mmol) u 30 ml DMF-a, nakon čega je dodat HOAt (5 ml rastvora 0,6 M u DMF-u, 3 mmol) i DIC (1 ml, 6 mmol). Špric je mućkan na orbitalnoj mućkalici tokom 4 sata. Smola je isprana sa DMF-om (2 x 20 ml) i kuplovanje je ponovljeno drugi put. Reakcija je praćena Kejzerovim testom. Smola je isprana sa DMF-om (2 x 30 ml). Zatim je smoli dodato 30 ml 20% v/v piperidina u DMF-u. Špric je mućkan na orbitalnoj mućkalici tokom 20 minuta. Ovaj postupak deprotekcije je ponovljen drugi put, a smola je isprana sa DMF-om (3 x 30 ml) i dihlorometanom (3 x 30 ml).

[0768] Konačno, peptid je acilovan palmitinskom kiselinom (768 mg, 3 mmol), HOAt (5 ml rastvora 0,6 M u DMF-u, 3 mmol) i DIC (1 ml, 6 mmol) aktivacijom u DMF-u (30 ml) tokom 2,5 sati. Smola je isprana sa DMF-om (2 x 30 ml) i dihlorometanom (3 x 30 ml) i osušena pod vakuumom.

[0770] Odvajanje peptida sa smole je izvršeno korišćenjem rastvora fenola (6,25 g), vode (6,25 ml) i TIPS (3 ml) u TFA (QSP 125 ml) tokom 2,5 sata na sobnoj temperaturi. Smola je odfiltrirana i isprana sa 2 x 30 ml TFA. Sjedinjeni filtrati su prebačeni u okrugli balon od 250 ml i delimično koncentrovani pod vakuumom na T < 30°C, a peptid je istaložen dodavanjem 100 ml ledeno hladnog MTBE-a i centrifugiran na 3600 obrtaja u minuti tokom 30 minuta.

[0772] Centrifugirani talog je zatim ispran ledeno hladnim dietil-etrom i ponovo centrifugiran. Ovaj postupak je ponovljen tri puta. Dobijeno je 4,3 g sirovog peptida. Sirovi peptid je rastvoren (10 mg/ml) u rastvoru H<2>O/CH<3>CN (50:50 v/v) koji sadrži 0,1% mravlje kiseline i smeša je nežno mućkana na 37°C tokom 1 sata, delimično koncentrovana i liofilizovana.

[0773] Prečišćavanje je izvršeno korišćenjem sistema za prečišćavanje A u 10 injekcija od po 350 mg, a frakcije koje sadrže čist željeni peptid su liofilizovane. Peptid u obliku soli trifluoroacetata dobijen je kao bela čvrsta supstanca.

[0774] m = 428 mg (17,5%)

[0775] UPLC/MS :

[0776] RT : 4,98 min. (analitički uslov A), čistoća 99% (UV)

[0777] Uočena masa m/z (tip jona): 1454,5 (M+3H) ; 1091,1 (M+4H) ; 873,1 (M+5H).

[0779] 2.C. Sinteza peptida koji ima sekvencu SEQ ID NO: 7

[0780] Dve serije smole dobijene u koraku 2.A, što odgovara količini od po 0,2 mmol Fmoc-Lys(Ac)-NH2 (ukupno 0,4 mmol), obrađene su paralelno prateći istu proceduru kao za primer 2.B. Nakon kuplovanja treće (4S)-5-terc-butoksi-4-(9H-fluoren-9-il metoksikarbonilamino)-5-oksopentanske kiseline (Fmoc-Glu-OtercBu), sjedinjene serije smole težine 2,6 g prebačene su u polipropilenski špric od 50 ml.

[0782] Zatim je smoli dodato 30 ml 20% v/v piperidina u DMF-u. Špric je mućkan na orbitalnoj mućkalici tokom 20 minuta. Ovaj postupak deprotekcije je ponovljen drugi put, a smola je isprana sa DMF-om (3 x 30 ml) i dihlorometanom (3 x 30 ml).

[0784] Peptid je acilovan dodavanjem rastvora stearoil-hlorida (362 mg, 1,2 mmol) i DIPEA (0,255 ml, 1,5 mmol) u 20 ml DCM-a tokom 2,5 sata. Smola je isprana sa DMF-om (2 x 30 ml) i dihlorometanom (3 x 30 ml) i osušena pod vakuumom.

[0786] Odvajanje peptida sa smole je izvršeno korišćenjem rastvora fenola (1,5 g), vode (1,5 ml) i TIPS (0,6 ml) u TFA (ukupna zapremina QSP 30 ml) tokom 2,5 sata na sobnoj temperaturi. Smola je odfiltrirana i isprana sa 2 x 10 ml TFA. Sjedinjeni filtrati su prebačeni u tikvicu sa okruglim dnom od 250 ml i delimično koncentrovani pod vakuumom na T < 30°C, a peptid je istaložen dodavanjem 100 ml ledeno hladnog MTBE-a i centrifugiran na 3600 obrtaja u minuti tokom 30 minuta.

[0788] Centrifugirani talog je zatim ispran ledeno hladnim dietil-etrom i ponovo centrifugiran. Ovaj postupak je ponovljen tri puta. Dobijeno je 720 mg sirovog peptida.

[0789] Prečišćavanje je izvršeno korišćenjem sistema za prečišćavanje B u 3 injekcije od po 240 mg.

[0790] Frakcije koje sadrže čist željeni peptid su liofilizovane. Peptid u obliku soli trifluoroacetata dobijen je kao bela čvrsta supstanca.

[0791] m = 72 mg (3,6 %)

[0792] UPLC/MS :

[0793] RT : 5,86 min. (analitički uslov A), čistoća 98% (UV)

[0794] Uočena masa m/z (tip jona): 1463,9 (M+3H) ; 1098,2 (M+4H) ; 878,7 (M+5H).

[0796] 2.D. Sinteza peptida koji ima sekvencu SEQ ID NO: 6

[0797] Serija smole dobijena u koraku 2.A, što odgovara količini od 0,1 mmol Fmoc-Lys(Ac)-NH2, stavljena je u reaktor CEM Liberty Blue mikrotalasnog peptidnog sintetizatora. Sinteza peptida je izvedena koristeći 0,5 M DIC / 1 M oksima u DMF-u.

[0799] Sve aminokiseline su uvedene dvostrukim kuplovanjima na 90°C kao što je gore navedeno, sa izuzetkom amino-izobuterne kiseline na poziciji 21 i serina na poziciji 29, za koje je izvedeno trostruko kuplovanje na 90°C tokom 2 minuta. Fmoc-Lys(ivDde)-OH je korišćen na poziciji 25.

[0801] Na kraju sklapanja peptida, smola je prebačena u polipropilenski špric od 20 ml i peptid je acetilovan na N-terminusu pomoću anhidrida sirćetne kiseline (95 µl, 1 mmol) i DIPEA (174 µl, 1 mmol) u DMF-u (10 ml) tokom 20 minuta, ponavljajući ciklus dva puta.

[0803] Zatim je ivDde zaštitna grupa na bočnom lancu lizina 25 uklonjena mešanjem sa 10 ml rastvora hidrazina 5% w/v u DMF-u tokom 20 minuta, onoliko puta koliko je potrebno dok se ne prestane sa detekcijom polaznog materijala nakon odvajanja alikvota sa smole i UPLC/MS analize. Kada je procenjeno da je deprotekcija završena, smola je isprana DMF-om (5 x 10 ml).

[0805] [0218] Dve TTDS spejser jedinice su uvedene pojedinačnim kuplovanjem, izvodeći dva puta sledeći postupak: Smoli je dodat rastvor Fmoc-TTDS-OH (163 mg, 0,3 mmol), HOAt (42 mg, 0,3 mmol) i DIC (77 µl, 0,5 mmol) u 7 ml DMF-a. Špric je mućkan na orbitalnoj mućkalici tokom 18 sati. Reakcija je praćena Kejzerovim testom. Kada je bilo potrebno, izvedeno je dvostruko kuplovanje. Smola je isprana DMF-om (2 x 10 ml). Zatim je smoli dodato 10 ml 20% v/v piperidina u DMF-u. Špric je mućkan na orbitalnoj mućkalici tokom 20 minuta. Ovaj postupak deprotekcije je ponovljen drugi put, a smola je isprana DMF-om (2 x 10 ml) i dihlorometanom (3 x 10 ml).

[0807] Tri gama-glutaminske kiseline kao spejser jedinice su uvedene izvođenjem dvostrukog kuplovanja svake Fmoc-Glu-OtercBu jedinice. Tako je sledeći postupak primenjen tri puta: Smoli je dodat rastvor (4S)-5-terc-butoksi-4-(9H-fluoren-9-il metoksikarbonilamino)-5-oksopentanske kiseline (Fmoc-Glu-OtercBu) (127 mg, 0,3 mmol), HOAt (42 mg, 0,3 mmol) i DIC (77 µl, 0,5 mmol) u 7 ml DMF-a. Špric je mućkan na orbitalnoj mućkalici tokom 18 sati. Reakcija je praćena Kejzerovim testom. Smola je isprana DMF-om (2 x 10 ml). Zatim je smoli dodato 10 ml 20% v/v piperidina u DMF-u. Špric je mućkan na orbitalnoj mućkalici tokom 20 minuta. Ovaj postupak deprotekcije je ponovljen drugi put, a smola je isprana sa DMF-om (3 x 10 ml) i dihlorometanom (3 x 30 ml).

[0809] Konačno, peptid je acilovan stearoil-hloridom (62 mg, 0,2 mmol) i DIPEA-om (54 µl, 0,3 mmol) u 5 ml DCM-a tokom 2,5 sati. Smola je isprana sa DMF-om (2 x 30 ml) i dihlorometanom (3 x 30 ml) i osušena pod vakuumom.

[0811] Odvajanje peptida sa smole je izvršeno korišćenjem rastvora fenola (0,5 g), vode (0,5 ml) i TIPS-a (0,2 ml) u TFA (ukupna zapremina QSP 10 ml) tokom 2,5 sata na sobnoj temperaturi. Smola je odfiltrirana i isprana sa 2 x 4 ml TFA. Sjedinjeni filtrati su prebačeni u tikvicu sa okruglim dnom od 100 ml i delimično koncentrovani pod vakuumom na T < 30°C, a peptid je istaložen dodavanjem 50 ml ledeno hladnog MTBE-a i centrifugiran na 3600 obrtaja u minuti tokom 30 minuta.

[0813] Centrifugirani talog je zatim ispran ledeno hladnim dietil-etrom i ponovo centrifugiran. Ovaj postupak je ponovljen tri puta. Dobijeno je 240 mg sirovog peptida.

[0814] Prečišćavanje je izvršeno korišćenjem sistema za prečišćavanje B, a frakcije koje sadrže čist željeni peptid su liofilizovane. Peptid u obliku soli trifluoroacetata dobijen je kao bela čvrsta supstanca.

[0815] m = 38 mg (8 %)

[0816] UPLC/MS :

[0817] RT : 5,40 min. (analitički uslov A), čistoća 97% (UV)

[0818] Uočena masa m/z (tip jona): 1376,1 (M+3H) ; 1032,0 (M+4H) ; 826,0 (M+5H).

[0819] 2.E. Sinteza peptida koji ima sekvencu SEQ ID NO: 20

[0820] Ovo jedinjenje je dobijeno prateći istu proceduru kao onu koja je korišćena u primeru 2.D, osim što su uvedene tri TTDS spejser jedinice na bočni lanac lizina 25.

[0822] Tako je od 250 mg smole dobijene u koraku 2.A, što odgovara količini od 0,1 mmol Fmoc-Lys(Ac)-NH2, dobijena bela čvrsta supstanca.

[0823] m = 20 mg (4,5%)

[0824] UPLC/MS :

[0825] RT : 5,44 min. (analitički uslov A), čistoća 99% (UV)

[0826] Uočena masa m/z (tip jona): 2215,0 (M+2H) ; 1476,8 (M+3H) ; 1107,9 (M+4H) ; 886,7 (M+5H).

[0828] 2.F. Sinteza peptida koji ima sekvencu SEQ ID NO: 22

[0829] Ovo jedinjenje je dobijeno prateći istu proceduru kao onu koja je korišćena u primeru 2.B, osim što je Fmoc-Lys(Aloc)-OH korišćen na poziciji 25 (X<25>) umesto Fmoc-Lys(Dde)-OH.

[0831] Tako je 250 mg smole dobijene u koraku 2.A, što odgovara količini od 0,1 mmol Fmoc-Lys(Ac)-NH2, obrađivano kao u primeru 2.B sve do koraka N-terminalne acetilacije.

[0833] Aloc zaštitna grupa na bočnom lancu Lys25 uklonjena je dodavanjem smoli, u atmosferi argona, rastvora od 1 ml (8,33 mmol) fenilsilana u 2 ml degaziranog DCM-a i rastvora od 10 mg (25,96 µmola) tetrakis-(trifenilfosfin) paladijuma u 4 ml DCM-a. Smola je mućkana na orbitalnoj mućkalici tokom 60 minuta, a reakcioni medijum je zamenjen svežim reagensima dva puta i mućkan po 60 minuta svaki put.

[0835] Kada je reakcija završena, smola je isprana dihlorometanom, 1% DIEA u DMF-u, 5% dietil-ditio-karbamatom u DMF-u, DMF-om, 10% DIEA u DMF-u, DMF-om i dihlorometanom (3 puta svakim).

[0837] [0229] Tri PEG<2>DGA spejser jedinice su uvedene pojedinačnim kuplovanjem, izvodeći tri puta sledeći postupak: Smoli je dodat rastvor Fmoc-PEG<2>DGA-OH (170 mg, 0,3 mmol) u 8 ml DCM-a, nakon čega je dodat HOAt (0,5 ml rastvora 0,6 M u DMF-u, 0,3 mmol) i DIC (100 µl, 0,642 mmol). Špric je mućkan na orbitalnoj mućkalici tokom 18 sati. Reakcija je praćena Kejzerovim testom. Smola je isprana DMF-om (2 x 10 ml). Zatim je smoli dodato 10 ml 20% v/v piperidina u DMF-u. Špric je mućkan na orbitalnoj mućkalici tokom 20 minuta. Ovaj postupak deprotekcije je ponovljen drugi put, a smola je isprana sa DMF-om (2 x 30 ml) i dihlorometanom (3 x 30 ml).

[0839] Tri gama-glutaminske kiseline kao spejser jedinice su uvedene izvođenjem dvostrukog kuplovanja svake Fmoc-Glu-OtercBu jedinice. Tako je sledeći postupak primenjen tri puta:

[0841] Smoli je dodat rastvor (4S)-5-terc-butoksi-4-(9H-fluoren-9-il metoksikarbonilamino)-5-oksopentanske kiseline (Fmoc-Glu-OtercBu) (0,13 g, 0,3 mmol) u 8 ml DMF-a, nakon čega je dodat HOAt (0,5 ml rastvora 0,6 M u DMF-u, 0,3 mmol) i DIC (0,1 ml, 0,6 mmol). Špric je mućkan na orbitalnoj mućkalici tokom 4 sata. Smola je isprana sa DMF-om (2 x 20 ml) i kuplovanje je ponovljeno drugi put. Reakcija je praćena Kejzerovim testom. Smola je isprana DMF-om (2 x 10 ml). Zatim je smoli dodato 10 ml 20% v/v piperidina u DMF-u. Špric je mućkan na orbitalnoj mućkalici tokom 20 minuta. Ovaj postupak deprotekcije je ponovljen drugi put, a smola je isprana sa DMF-om (3 x 30 ml) i dihlorometanom (3 x 30 ml).

[0843] Konačno, peptid je acilovan palmitinskom kiselinom (80 mg, 0,3 mmol), HOAt (0,5 ml rastvora 0,6 M u DMF-u, 0,3 mmol) i DIC (0,1 ml, 0,6 mmol) aktivacijom u DMF-u (10 ml) tokom 2,5 sata. Smola je isprana sa DMF-om (2x30 ml) i dihlorometanom (3x30 ml) i osušena pod vakuumom.

[0845] Odvajanje peptida sa smole je izvršeno korišćenjem rastvora fenola (0,5 g), vode (0,5 ml) i TIPS-a (0,25 ml) u TFA (ukupna zapremina QSP 10 ml) tokom 2,5 sata na sobnoj temperaturi. Smola je odfiltrirana i isprana sa 2 x 5 ml TFA. Sjedinjeni filtrati su prebačeni u okrugli balon od 250 ml i delimično koncentrovani pod vakuumom na T < 30°C, a peptid je istaložen dodavanjem 100 ml ledeno hladnog MTBE-a i centrifugiran na 3600 obrtaja u minuti tokom 30 minuta.

[0847] Centrifugirani talog je zatim ispran ledeno hladnim dietil-etrom i ponovo centrifugiran. Ovaj postupak je ponovljen tri puta. Dobijeno je 220 mg sirovog peptida.

[0849] [0235] Prečišćavanje je izvršeno korišćenjem sistema za prečišćavanje B. Frakcije koje sadrže čist željeni peptid su liofilizovane. Peptid u obliku soli trifluoroacetata dobijen je kao bela čvrsta supstanca.

[0850] m = 37 mg (8 %)

[0851] UPLC/MS :

[0852] RT : 4,99 min. (analitički uslov A), čistoća 99% (UV)

[0853] Uočena masa m/z (tip jona): 2205,2 (M+2H) ; 1470,5 (M+3H) ; 1103,1 (M+4H) ; 882,7 (M+5H).

[0855] 2.G. Rezultati

[0856] Rezultati dobijeni sa peptidima prema pronalasku sa SEQ ID NO: 1-32, 34-37, 39, 44, 45, 47-49, 51 i 54-97 navedeni su u sledećoj tabeli 1.

[0858] Tabela 1

[0860]

[0861] SEQ ID UPLC vreme retencije u Uočena masa Monoizotopska

[0862]

[0863] SEQ ID UPLC vreme retencije u Uočena masa Monoizotopska

[0864]

[0865] SEQ ID UPLC vreme retencije u Uočena masa Monoizotopska

[0866]

[0867] SEQ ID UPLC vreme retencije u Uočena masa Monoizotopska

[0869]

[0872] Uslov A je sledeći:

[0873] • Kolona: Acquity Peptide CSH, C18, 130 Å, 2,1 x 100 mm, 1,7 µm

[0874] • Temperatura kolone: 50°C; Protok = 0,6ml/min;

[0875] • Rastvarač A: 0,1% TFA u H<2>O;

[0876] • Rastvarač B: 0,1% TFA u CH<3>CN;

[0877] • Gradijent: od 0 do 1 minut B = 2%, od 1 do 7 minuta B = 2% do 70%, od 7 do 8 minuta B = 70% do 100%

[0878] • UV detektor: talasna dužina: 220 nm; MS akvizicija: ESI+ 200 do 3000 uma.

[0880] Uslov B je sledeći:

[0881] • Kolona: Acquity BEH C18, 130 Å, 2,1 x 50 mm, 1,7 µm

[0882] • Temperatura kolone: 60°C; Protok = 0,6 ml/min

[0883] • Rastvarač A: 0,05% TFA u H2O

[0884] • Rastvarač B: 0,05 % TFA u CH<3>CN

[0885] Gradijent: od 0 do 1 minut B = 2%, od 1 do 16 minuta B = 2% do 100%, od 16 do 17 minuta B = 100%

[0886] UV detektor: talasna dužina: 220 nm; MS akvizicija: ESI+ 200 do 3000 uma

[0888] Uslov C je sledeći:

[0889] • Kolona: ACQUITY BEH C4, 130 Å, 2,1 x 50 mm, 1,7 µm

[0890] • Temperatura kolone: 45°C; Protok: 0,4ml/min;

[0891] • Rastvarač A: 0,1% TFA u H<2>O;

[0892] • Rastvarač B: 0,05 % TFA u CH<3>CN

[0893] Gradijent: od 0 do 1 minut B = 30%, od 1 do 5 minuta B = 30% do 50%, od 5 do 6 minuta B = 80%

[0894] UV detektor: talasna dužina: 220 nm; MS akvizicija: ESI+ 200 do 3000 uma

[0896] Uslov D je sledeći:

[0897] • Kolona: Acquity Peptide CSH, C18, 130 Å, 2,1 x 150 mm, 1,7 µm.

[0898] • Temperatura kolone: 60°C; Protok = 0,4 ml/min;

[0899] • Rastvarač A: 0,1% TFA u H<2>O;

[0900] • Rastvarač B: 0,1% TFA u CH<3>CN;

[0901] • Gradijent: od 0 do 1 minut B = 2%, od 1 do 14 minuta B = 2% do 70%, od 14 do 16 minuta B = 70% do 100%.

[0902] • UV detektor: talasna dužina: 220 nm; MS akvizicija: ESI+ 200 do 3000 uma.

[0903] Sledeći peptidi prema pronalasku mogu se pripremiti respektivno kao što je gore opisano: SEQ ID BR.33, 38, 40, 41, 43, 46, 50, 52 i 53.

[0905] Primer 3: In vitro analiza peptida prema pronalasku na RXFP1 receptorima (OVCAR5 cAMP test)

[0906] A. Metoda

[0907] OVCAR5 ćelije koje eksprimiraju endogeni RXFP1 korišćene su za ispitivanje RXFP1 agonističkih svojstava peptida prema pronalasku, a posebno peptida sekvenci SEQ ID NO: 1-97.

[0909] Pošto je RXFP1 GPCR tipa Gs, cAMP je korišćen kao parametar za očitavanje aktivacije RXFP1.

[0911] Izobutil-metil-ksantin (IBMX) je korišćen za inhibiciju aktivnosti fosfodiesteraze, čime je olakšano merenje nivoa cAMP-a. HTRF (homogena vremenski razlučena fluorescencija) tehnologija je korišćena za detekciju cAMP-a zbog njene velike osetljivosti.

[0913] Ukratko, OVCAR5 ćelije su uzgajane u standardnom medijumu (RPMI) koji sadrži 10% fetalnog telećeg seruma (FCS) i 1% antibiotika (penicilin/streptomicin).

[0914] Pre eksperimenata, ćelije su odvojene pomoću akutanze i inkubirane tokom 40 minuta na 37°C sa 1 mM (3-izobutil-1-metilksantina) IBMX.

[0916] Ćelije su zatim raspoređene u crne ploče sa 384 bunarčića koje sadrže rastuće koncentracije različitih peptida u fiksnoj zapremini medijuma (bez FCS-a).

[0918] Nakon inkubacije od 30 minuta na 37°C u vlažnom inkubatoru u atmosferi 5% CO<2>, reakcija je zaustavljena dodavanjem fiksne zapremine rastvora koji sadrži pufer za lizu i cAMP-D2 (cAMP obeležen bojom d2) i anti-cAMP antitelo vezano za europijum, koji se koriste za detekciju cAMP-a.

[0920] Očitavanje eksperimenta je izvršeno na fluorimetru koji omogućava HTRF merenje. Krive aktivacije su generisane crtanjem intracelularne vrednosti cAMP-a u odnosu na log10 koncentracije jedinjenja.

[0922] Koncentracija koja izaziva 50% maksimalne aktivacije (EC<50>) izračunata je nelinearnom regresijom koristeći jednačinu sigmoidalnog odgovora na dozu (promenljivi nagib) pomoću softvera Prism 5.

[0924] Emax % je određen kao maksimalna intracelularna vrednost cAMP-a za ispitivano jedinjenje (gornja granica krive cAMP-a u odnosu na koncentraciju) podeljena sa maksimalnom intracelularnom vrednošću cAMP-a za H2-relaksin određenu u istom testu, pomnoženo sa 100.

[0926] B. Rezultati

[0927] Rezultati dobijeni sa peptidima prema pronalasku predstavljeni su u sledećoj tabeli 2.

[0928] Tabela 2

[0930]

[0931]

[0932]

[0933]

[0934]

[0937] Čini se da peptidi prema pronalasku poseduju veoma interesantna RXFP1 agonistička svojstva i da su veoma efikasni u vezivanju i aktivaciji RXFP1.

[0939] Oni su, štaviše, svi značajno i neočekivano superiorni u odnosu na peptide iz prethodnog stanja tehnike kada je u pitanju aktivacija RXFP1 receptora.

[0941] Isti eksperiment je izveden sa peptidima iz prethodnog stanja tehnike (WO2015/157829) poznatim pod nazivima B7-33 C11.23S, AcB7-33 C11.23S i KKKK(AcB7-29 C11.23S).

[0942] Sledeći EC<50>rezultati su dobijeni za ova tri peptida.

[0944] Tabela 3

[0947]

[0950] Kao što je gore pokazano, peptidi prema pronalasku poseduju veoma interesantna RXFP1 agonistička svojstva i veoma su efikasni u aktivaciji RXFP1. Oni su, štaviše, svi značajno i neočekivano superiorni u odnosu na peptide iz prethodnog stanja tehnike.

[0952] Primer 4: Ispitivanje rastvorljivosti peptida prema pronalasku u puferu

[0953] A. Metoda

[0954] Pre ispitivanja rastvorljivosti serije peptida, određena je njena čistoća (HPLC-UV).

[0956] Medijumi za ispitivanje:

[0957]

[0958] Fosfatni pufer 50 mM pH 6,5: 15,9 ml Na<2>HPO<4>0,1 M (Carlo Erba 480087) 34,1 ml NaH<2>PO<4>0,1 M (Carlo Erba 480141) H<2>O MilliQ QSP 100 ml

[0959] Fosfatni pufer 50 mM pH 7,4: 40,5 ml Na<2>HPO<4>0,1 M (Carlo Erba 480087) 9,5 ml NaH<2>PO<4>0,1 M (Carlo Erba 480141) H<2>O MilliQ QSP 100 ml

[0960] Acetatni pufer 50 mM pH 4,5 : 0,75g C<2>H<3>CO<2>Na, 3H<2>O (Sigma S7545) 0,35ml CH<3>CO<2>H 100% rastvora rastvorenog u Millipore vodi, podešeno na pH sa razblaženim (1:1) CH<3>CO<2>H i dopunjeno do 250 ml sa Millipore vodom.

[0962] [0259] U Ependorf bočicu od 4 ml, precizno odmeren uzorak jedinjenja razblažen je u medijumu za ispitivanje kako bi se dobila ciljna koncentracija od 2, 6 ili 10 mg/ml čistog jedinjenja. Bočice sa uzorkom su mućkane (na „rock 'roll” mućkalici) tokom približno 19 sati. Alikvoti od 300 µl su filtrirani kroz Millipore „Solvinert” ploču (0,45 µm - PTFE hidrofilna). Rastvorljivost je zatim određena upoređivanjem injekcije od 0,2 µl filtrata sa površinama UV pikova dobijenih sa osnovnim rastvorom peptida koncentracije 1,2 mg/ml u DMSO-u (na osnovu % čistoće), ubrizgavanjem različitih zapremina u rasponu od 0,2 do 2 µl.

[0964] Analiza:

[0965]

[0966] pH je meren mikro-elektrodom

[0967] HPLC uslovi:

[0968] Waters Acquity UPLC sistem sa DAD detektorom

[0969] Kolona: Waters Peptide Column CSH C18 (130 Å; 1,7 µm; 50 x 2,1 mm) Temperatura kolone: 60°C

[0970] Protok: 0,3 ml/min

[0971] Puna petlja (oko 5 µl) - faktor prepunjavanja 5.

[0972] Slabo i jako pranje: H2O/ACN (75/25; V/V) ; pranje zaptivke: H2O/IsOH (95/5; V/V). Mobilna faza:

[0973] Rastvarač A: 0,05% TFA u H2O; Rastvarač B: 0,035% TFA u CH3CN

[0974] Gradijent: od 0 do 12 minuta B = 2% do 60%, od 12 do 14 minuta B = 60% do 100%. Ispiranje kolone 100% B tokom 1 minuta, ekvilibracija kolone 2% B tokom 2,5 minuta. UV detektor: talasna dužina: 220 nm.

[0976] B. Rezultati

[0977] Dobijeni rezultati rastvorljivosti predstavljeni su u sledećoj tabeli 4.

[0979] Tabela 4: * Ciljna rastvorljivost: 10,0 mg/ml

[0980] SEQ ID NO Rastvorljivost u acetatnom puferu Rastvorljivost u fosfatnom puferu pH

[0982]

[0983] SEQ ID NO Rastvorljivost u acetatnom puferu Rastvorljivost u fosfatnom puferu pH

[0986]

[0989] Isti eksperiment je izveden sa peptidima iz prethodnog stanja tehnike (WO2015/157829) poznatim pod nazivima B7-33 C11.23S, AcB7-33 C11.23S i KKK(AcB7-29 C11.23S).

[0990] Sledeći rezultati rastvorljivosti su dobijeni za ova tri peptida.

[0991] Tabela 5

[0993]

[0996] Peptidi prema pronalasku pokazuju poboljšanu rastvorljivost u poređenju sa jedinjenjima iz prethodnog stanja tehnike. Ovo svojstvo bi omogućilo širi opseg koncentracija pri pripremi rastvora za injekcije, čime se proširuju opsezi doziranja in-vivo.

[0998] Primer 5: Ispitivanje stabilnosti peptida u plazmi ili krvi pacova ili ljudi

[0999] A. Metoda

[1000] Pre ispitivanja stabilnosti serije peptida u plazmi (ili krvi), određena je njena čistoća (HPLC-UV).

[1002] Medijumi za ispitivanje:

[1003]

[1004] Plazma pacova i ljudi: antikoagulans natrijum ili litijum heparin.

[1005] Krv pacova i ljudi: antikoagulans natrijum ili litijum heparin.

[1007] Osnovni rastvor:

[1008] Rastvor ispitivanog jedinjenja koncentracije 100 µM u 50 mM fosfatnom puferu pH 7,4.

[1010] 950 µL plazme (ili krvi) je prethodno inkubirano tokom 5 minuta na 37°C. Dodato je 50 µL osnovnog rastvora jedinjenja. Finalna koncentracija jedinjenja = 5 µM. Sadržaj je vorteksovan i po 150 µL plazme (ili krvi) je prebačeno u Ependorf bočice za svaku vremensku tačku. Vremenske tačke 0 - 1 i 4 sata su izvedene u duplikatu za svaku vrstu.

[1011] Nakon inkubacije, 150 µL plazme (ili krvi) je ekstrahovano sa 600 µL acetonitrila koji sadrži 1% TFA. Navedena smeša je zatim vorteksovana i centrifugirana 10 minuta na 14600 obrtaja u minuti. 200 µL supernatanta je osušeno pod strujom N<2>. Uzorak je zatim rekonstituisan u 200 µL H<2>O/CH<3>CN 98/2 0,1% FA 50 ng/ml labetalola i analiziran korišćenjem analitičkog sistema koji se koristi u studijama rastvorljivosti i stabilnosti.

[1013] Za određivanje količine preostalog peptida, upoređene su površine pikova ciljnog jedinjenja u trenutku t0 i u svakoj vremenskoj tački, što rezultira „% preostalog peptida“, prema jednačini:

[1014] % preostalog peptida = [(površina pika peptida u vremenu) x 100]/površina pika peptida t0. Stabilnost je izražena kao „% preostalog peptida“.

[1016] Kriterijumi prihvatljivosti: Ispitivana jedinjenja su smatrana stabilnim ako je preciznost bila ~ 15%, a prinos u opsegu od 85 - 115%.

[1018] B. Rezultati

[1019] Dobijeni rezultati stabilnosti u plazmi i krvi predstavljeni su u sledećoj tabeli 6.

[1021] Tabela 6: * Stabilnost u krvi

[1024]

[1025] Stabilnost u ljudsk Stabilnost u plazmi pacova

[1026] SEQ ID NO % preostalog % preostalog

[1028] 1h T=0 1h

[1030]

100

[1032] Isti eksperiment je izveden sa peptidima iz prethodnog stanja tehnike (WO2015/157829) poznatim pod nazivima B7-33 C11.23S, AcB7-33 i KKKK(AcB7-29 C11.23S).

[1034] Sledeći rezultati stabilnosti u plazmi su dobijeni za ova tri peptida.

[1036] Tabela 7

[1038]

[1041] Čini se da su peptidi prema pronalasku stabilniji u plazmi i/ili krvi od jedinjenja iz prethodnog stanja tehnike.

[1043] Primer 6: Farmakokinetičko (PK) određivanje peptida nakon in vivo primene kod pacova.

[1044] A. Metoda:

[1045] Pre ispitivanja serije peptida, određena je njena čistoća (HPLC-UV). Doza je korigovana s obzirom na prisustvo soli, rastvarača i čistoću.

[1047] Bioanalitička skrining metoda za kvantifikaciju peptida kod pacova:

[1048] Sprague Dawley pacovima je dat ispitivani peptid u dozi od 1 mg/kg intravenozno (i.v.) ili 3 mg/kg supkutano (s.c.) u obliku rastvora u PBS-u (0,2 mg/ml, odnosno 0,6 mg/ml).

[1050] Uzorci krvi su prikupljeni nakon: 0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48 i 72 sata (i.v. put) i 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48 i 72 sata (s.c. put) nakon primene.

[1052] Uzorci plazme su analizirani nakon precipitacije proteina putem tečne hromatografije sa masenom spektrometrijom (LC/MS).

[1054] PK parametri i poluvreme eliminacije izračunati su korišćenjem softvera Phoenix 64 (WinNonlin 6.4) - Pharsight (CertaraTM) (nekompartmentalni model). Vrednosti ispod granice kvantifikacije (BLQ) zamenjene su nulom za naknadne proračune i PK analizu.

[1056] B. Rezultati:

[1057] Dobijeni PK parametri predstavljeni su u sledećoj tabeli 8.

[1059] Korišćene su sledeće skraćenice:

[1060] T½ : in-vivo poluvreme eliminacije, vreme potrebno da se koncentracija ispitivanog jedinjenja u plazmi smanji na polovinu tokom PK eksperimenta.

[1061] C0 : ekstrapolirana koncentracija ispitivanog jedinjenja u plazmi u vremenskoj tački t = 0 (i.v. put).

[1062] Cmax: maksimalna koncentracija ispitivanog jedinjenja u plazmi u navedenoj vremenskoj tački (s.c. put).

[1063] Tmax: vremenska tačka u kojoj je dostignuta Cmax.

[1064] F% : s.c. naspram i.v. bioraspoloživost, površina ispod krive korigovana dozom (AUC) za s.c. put podeljena sa AUC za i.v. put.

[1066] Tabela 8

[1069]

[1070] SEQ ID NO PK kod pacova, 1 mg/kg i.v. PK kod pacova, 3 mg/kg s.c.

[1072] T½ (h C0 (µ Cmax (µM) T F%

[1073] 6 5.59 5.17 2.71 8 72

[1074] 7 6.34 4.16 1.53 10 61

[1076] 20

5.13

3.09 1.99 10 80

[1078] 55 4.89 4.91

2.07

6

65

[1079] Isti eksperiment je izveden sa H2-relaksinom.

[1081] Tabela 9

[1083]

[1086] U poređenju sa H2-relaksinom, odabrani peptidi prema pronalasku pokazuju poboljšane farmakokinetičke parametre. Posebno njihovo in-vivo poluvreme eliminacije kod pacova kreće se u rasponu od 4 sata do 9 sati. Takvi peptidi bi tada mogli da zadrže svoju efikasnost tokom dužeg vremenskog perioda, omogućavajući primenu jednom dnevno intravenoznim ili supkutanim putem.

[1087] Lista sekvenci [0283]

[1088] SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 13

[1089]

[1090] SEQ ID NO: 26

[1091]

[1092]

[1093] SEQ ID NO: 52

[1094]

[1095]

[1096]

[1097] SEQ ID NO: 91

[1098]

[1100] *primeri za poređenje

Claims

1. Patentni zahtevi

1. Peptid sposoban da aktivira RXFP1 receptor, koji ima sledeću formulu (I):

N<ter>-Ac-X<10>-E-G-R-E-X<15>-V-R-X<18>-X<19>-I-X<21>-X<22>-E-G-X<25>-S-X<27>-X<28>-X<29>-X<30>-X<31>-X<32>-X<33>-NH<2>-C<ter>

gde:

N<ter>predstavlja N-terminalni kraj peptida;

C<ter>predstavlja C-terminalni kraj peptida;

AC predstavlja acetil grupu;

X<10>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine leucin, 2-amino-izobuterna kiselina, Nε-acetil-lizin i α-metil-leucin;

E predstavlja glutaminsku kiselinu;

G predstavlja glicin;

R predstavlja arginin;

X<15>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, arginin, homolizin, homoarginin, ornitin, glutamin, fenilalanin i leucin;

V predstavlja valin;

X<18>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine alanin, 2-amino-izobuterna kiselina, leucin, Nε-acetil-lizin i glutamin;

X<19>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine lizin, Nε-acetil-lizin, citrulin, glutamin, alanin i 2-amino-izobuterna kiselina;

I predstavlja izoleucin;

X<21>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina i alanin;

X<22>predstavlja aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine 2-amino-izobuterna kiselina i izoleucin;