ES3058646T3 - A modified mglur6 promoter and methods of use - Google Patents

Abstract

La invención proporciona ácidos nucleicos y vectores de expresión de ácidos nucleicos que contienen promotores mGluR6 optimizados para la expresión de transgenes en la retina. Las composiciones y métodos de la invención son útiles para la expresión de productos génicos con el fin de preservar, mejorar o restaurar la fototransducción o la visión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Promotor de mGluR6 modificado y métodos de uso

[0003] Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

[0004] Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional USSN 61/951.360, presentada el 11 de marzo de 2014.

[0005] Apoyo gubernamental

[0006] Esta invención se realizó con apoyo del gobierno de los Estados Unidos bajo la concesión del Instituto Nacional de Salud/Instituto Nacional del Ojo NIH EY 17130. El gobierno tiene determinados derechos en la invención.

[0007] Campo de la invención

[0008] Esta invención se refiere en general al campo de la biología molecular. La invención presenta promotores del receptor metabotrópico de glutamato 6 (mGluR6) modificados para la expresión aumentada en la retina. Los promotores de mGluR6 modificados descritos en el presente documento son útiles en terapia génica ocular para la mejora y/o restablecimiento de la visión. La invención se define por las reivindicaciones.

[0009] Antecedentes de la invención

[0010] La terapia génica es un enfoque prometedor para mejorar y restablecer la visión. Particularmente, recientemente se ha demostrado que la inserción de genes, tales como proteínas fotosensibles, a retinas enfermas o dañadas en ratones mejora y restablece la fotosensibilidad y las señales visuales. Sin embargo, siguen existiendo desafíos para la dirección y expresión eficientes de tales genes en neuronas retinianas internas específicas para la terapia génica ocular. Por consiguiente, existe una necesidad apremiante de elementos reguladores y vectores de expresión mejorados para la administración y expresión de transgenes para terapia génica ocular.

[0011] Sumario de la invención

[0012] La invención proporciona una solución para la necesidad sentida desde hace tiempo de promotores y vectores de expresión de ácido nucleico mejorados para la administración y expresión de transgenes al ojo. Específicamente, los promotores y vectores descritos en el presente documento comprenden o consisten esencialmente en un promotor del receptor metabotrópico de glutamato 6 modificado (mGluR6) que contiene secuencias de elementos reguladores que dirigen la expresión de la proteína mGluR6 a células bipolares ON, o células bipolares de bastones retinianos por lo que las características específicas se describen en las reivindicaciones.

[0013] La presente invención presenta una molécula de ácido nucleico aislado o un vector de expresión de ácido nucleico que comprende un potenciador de mGluR6 o una variante del mismo y un promotor de mGluR6 o una variante del mismo. La molécula de ácido nucleico comprende además el intrón 3 del gen de mGluR6 o una variante del mismo. La molécula de ácido nucleico comprende además el intrón 4 del gen de mGluR6 o una variante del mismo, todo tal como se describe adicionalmente en las reivindicaciones.

[0014] La presente invención presenta una molécula de ácido nucleico aislado o un vector de expresión de ácido nucleico que comprende un potenciador de mGluR6 o una variante del mismo, un promotor de mGluR6 o una variante del mismo, un intrón 3 del gen de mGluR6 o una variante del mismo, y un intrón 4 del gen de mGluR6 o una variante del mismo tal como se describe adicionalmente en las reivindicaciones.

[0015] Un vector de expresión de ácido nucleico de la presente invención puede ser un vector viral, preferiblemente un vector de virus adenoasociado o un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV). En otras realizaciones, los vectores de AAV usados con la presente invención, por ejemplo, un vector de empaquetamiento, comprenden una proteína de cápside.

[0016] La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más de los vectores de expresión de ácido nucleico descritos en el presente documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, los vectores de AAV de más de un serotipo pueden combinarse en una única composición para la administración, o pueden administrarse secuencialmente durante periodos de tiempo adecuados.

[0017] La presente invención proporciona además un método para expresar un transgén en el ojo que comprende introducir en el ojo el vector de expresión de ácido nucleico descrito en el presente documento. El vector de expresión de ácido nucleico puede introducirse en el ojo mediante inyección subretiniana, intraocular, o intravítrea. Los métodos descritos en el presente documento pueden ser útiles para aumentar la sensibilidad a la luz, aumentar la detección de luz, aumentar la fotosensibilidad, aumentar el potencial evocado visual, o mejorar o restablecer la visión en una retina de un sujeto. Por ejemplo, el sujeto padece un trastorno o enfermedad ocular asociada con la degeneración de fotorreceptores.

[0018] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales a modo de ejemplo no limitativos adecuados. En casos de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos descritos en el presente documento son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

[0019] Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de y están englobadas por la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

[0020] Breve descripción de las figuras

[0021] La figura 1 muestra un diagrama esquemático de un vector genómico de rAAV2.

[0022] La figura 2 muestra un diagrama esquemático de un vector de empaquetamiento de rAAV2, con una mutación en el gen de la cápside viral (Y444F).

[0023] La figura 3 muestra un diagrama esquemático de un constructo promotor optimizado I4 que comprende un potenciador de mGluR6 de 200 pb y un fragmento de 500 pb del promotor de mGluR6 en el sentido de 5’ de un transgén (mCherry).

[0024] La figura 4 muestra un diagrama esquemático de un constructo promotor optimizado I1a que comprende un intrón 4 de mGluR6, un intrón 3 de mGluR6, un potenciador de mGluR6 de 200 pb y un fragmento de 500 pb del promotor de mGluR6 en el sentido de 5’ de un transgén (mCherry).

[0025] La figura 5 es una serie de imágenes de inmunofluorescencia que demuestran la expresión mediada por rAAV del transgén (mCherry) por dos constructos promotores de mGluR6 optimizados (I4 e I1a). (A, D) Se tomaron imágenes en la capa de células ganglionares en montajes completos retinianos para visualizar los extremos axonales de las células bipolares de bastones. (B, E) Se tomaron imágenes en la capa nuclear interna en montajes completos retinianos para visualizar los patrones de células bipolares de bastones. (C, F) La expresión del transgén (mCherry) en células bipolares de bastones se representa en secciones verticales retinianas.

[0026] La figura 6 es una serie de imágenes de inmunofluorescencia que demuestran la expresión de un transgén dirigido a células bipolares de bastones. La expresión mediada por rAAV2/2 (Y444F) de mCherry dirigida por un promotor optimizado mChluR6 se representa en montaje completo retiniano (A) y en sección vertical retiniana (D). La cotinción de mCherry con anti-PKC (un marcador de células bipolares de bastones) también se muestra en montajes completos de retina (A-C) y secciones verticales (D-F).

[0027] Descripción detallada

[0028] El receptor metabotrópico de glutamato (mGluR6, también conocido como Grm6) media la transmisión sináptica en el sistema nervioso y media la respuesta ON en la ruta ON de la retina de vertebrado. La expresión de mGluR6 se encuentra en células bipolares retinianas de tipo ON, que ha hecho que la región promotora de mGluR6 sea un buen candidato para la expresión dirigida por promotor específico de célula en células bipolares (Uedaet al., Journal Neurosci., 1997).

[0029] Promotores de mGluR6 modificados

[0030] Estudios previos han utilizado un promotor basal de SV40 con una secuencia potenciadora de mGluR6 (por ejemplo, 200 pb) para la dirección y expresión mediada por AAV en el ojo (Doroudchiet al., Mol. Ther., 2011, 19:1220-1229).). Sin embargo, la expresión transgénica por estos constructos fue débil, y no completamente selectiva. La invención descrita en el presente documento se basa en el sorprendente descubrimiento de que el uso de un fragmento de la región promotora de mGluR6 (por ejemplo, aproximadamente 1 kb o 500 pb) da como resultado una expresión aumentada en comparación con constructos basadas en SV40 y, de manera importante, una expresión más selectiva en poblaciones celulares específicas.

[0031] La presente invención presenta promotores de mGluR6 modificados, entre otros, con mayor eficacia y que dirigen la expresión transgénica a células bipolares, por lo que las características adicionales se definen en las reivindicaciones. Los promotores descritos en el presente documento se descubrieron construyendo diversos constructos con diferentes combinaciones de elementos reguladores presentes en el gen de mGluR6 o que se predijo que estaban presentes. Se identificó un promotor de mGluR6 modificado útil para lograr la expresión selectiva mediada por AAV y altamente eficiente en células bipolares retinianas. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “promotor de mGluR6 modificado” se refiere a la combinación de elementos reguladores descritos en el presente documento que incluye al menos una secuencia potenciadora de mGluR6 de 200 pb y al menos un fragmento de la región promotora del gen de mGluR6 (por ejemplo, un fragmento de aproximadamente 1 kb o de 500 pb). Opcionalmente, el promotor de mGluR6 modificado también incluye las secuencias de intrones del gen de mGluR6, por ejemplo,el intrón 3 y el intrón 4. En las figuras 3 y 4 se muestran constructos de mGluR6 modificados a modo de ejemplo.

[0033] La presente invención proporciona un promotor de mGluR6 modificado que comprende, entre otros, un potenciador de mGluR6 de 200 pb. Una secuencia de ácido nucleico preferida para el potenciador de mGluR6 murino de 200 pb se proporciona a continuación: (SEQ ID NO: 1)

[0035]

[0038] Una secuencia de ácido nucleico preferida para el potenciador de mGluR6 humano de 198 pb (correspondiente al potenciador de 200 pb de ratón) se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 2:

[0040]

[0043] El promotor de mGluR6 modificado comprende además al menos un fragmento de la región promotora de mGluR6. Un ejemplo preferido de esta secuencia de región promotora consiste en 11023 nucleótidos (n.º de registro de GenBank BC041684). El estudio original de Uedaet al.empleó un promotor de 10 kb, pero la longitud real del promotor y la secuencia que comprende los elementos de control de mGluR6 pueden ajustarse aumentando o disminuyendo la longitud del fragmento. Por ejemplo, un fragmento del promotor de aproximadamente 1 kb de longitud puede usarse como una secuencia promotora de mGluR6. El análisis del promotor puede usarse para identificar fragmentos y derivados funcionales del promotor (McGowenet al.Mol. Vision 1998, 4:2; Booksteinet al.PNAS 1990, 87 (19) 7762-66).

[0045] Por ejemplo, la secuencia promotora de mGluR6 usada en el presente documento es un fragmento de 1095 pb de la región promotora de mGluR6. Una secuencia de ácido nucleico del fragmento de 1095 pb (aproximadamente 1 kb) de la región promotora de mGluR6 murina se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 3:

[0047]

[0050] Una secuencia de ácido nucleico preferida del fragmento del promotor 1784 humano (correspondiente al promotor de 1095 pb de mGluR de ratón) de la región del promotor de mGluR6 humano proporcionada a continuación en la SEQ ID NO: 4:

[0051]

[0052] Preferiblemente, la secuencia promotora de mGluR6 usada en el presente documento es un fragmento de 500 pb de la región promotora de mGluR6. El fragmento de 500 pb descrito en la SEQ ID NO: 5 está abarcado por el fragmento de 1095 pb descrito anteriormente (SEQ ID NO: 3). Se prefiere el fragmento de 500 pb porque da como resultado una expresión mayor que el fragmento de 1095 pb. Una secuencia de ácido nucleico del promotor de mGluR6 murino de 500 pb se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 5:

[0054]

[0056] Una secuencia de ácido nucleico preferida del promotor de mGluR6 humano de 547 pb, está abarcada por el fragmento de 1784 pb descrito anteriormente (SEQ ID NO: 4), y se proporciona a continuación en SEQ ID NO: 6:

[0058]

[0060] Los promotores de mGluR6 modificados descritos en el presente documento también pueden incluir secuencias de intrones del gen de mGluR6. Preferiblemente, se incluyen los intrones 3 y 4. La secuencia de ácido nucleico del intrón 4 del gen de mGluR6 murino se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 7:

[0062]

[0064] La secuencia de ácido nucleico del intrón 4 del gen de mGluR6 humano (correspondiente al intrón 4 de ratón) se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 8:

[0066]

[0068] La secuencia de ácido nucleico del intrón 3 del gen de mGluR6 se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 9:

[0070]

[0072] La secuencia de ácido nucleico del intrón 3 del gen de mGluR6 humano (correspondiente al intrón 3 de ratón) se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 10:

[0074]

[0076] Las variantes de los elementos reguladores abarcados por los promotores de mGluR6 descritos en el presente documento también están englobadas por la presente invención. Por ejemplo, una variante puede tener el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, o el 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento. El término “% de identidad”, en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipéptido, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para máxima correspondencia, según se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Por ejemplo, el % de identidad es con respecto a la longitud completa de las regiones codificantes de las secuencias que se comparan.

[0077] Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parámetros de programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros de programa designados. El porcentaje de identidad se determina usando algoritmos de búsqueda tales como BLAST y PSI-BLAST (Altschulet al., 1990, J. Mol. Biol.215:3, 403-410; 25:17, 3389-402, Altschulet al., 1997).

[0078] Por ejemplo, el potenciador de mGluR6 es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, o el 95 % idéntico a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. La variante del promotor de mGluR6 es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, o el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6. El intrón 4 de la variante del gen de mGluR6 es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % idéntico a la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8. El intrón 3 de la variante del gen de mGluR6 es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % o el 95 % idéntico a la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.

[0079] En una realización, el potenciador de mGluR6 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El promotor de mGluR6 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6. El intrón 4 del gen de mGluR6 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El intrón 3 del gen de mGluR6 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10.

[0080] El intrón 4 del gen de mGluR6 está localizado en el sentido de 5’ del intrón 3 del gen de mGluR6 en la presente invención. El intrón 3 del gen de mGluR6 está localizado en el sentido de 5’ del potenciador de mGluR6 en la presente invención. El potenciador de mGluR6 se localiza en el sentido de 5’ del promotor de mGluR6 en la presente invención.

[0081] Por ejemplo, el potenciador de mGluR6 es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, o el 95 % idéntico a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. La variante del promotor de mGluR6 es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el90 %, o el 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6. El intrón 4 de la variante del gen de mGluR6 es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, o el 95 % idéntico a la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8. El intrón 3 de la variante del gen de mGluR6 es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, o el 95 % idéntico a la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10.

[0082] En una realización, el potenciador de mGluR6 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El promotor de mGluR6 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6. El intrón 4 del gen de mGluR6 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El intrón 3 del gen de mGluR6 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10.

[0083] El intrón 4 del gen de mGluR6 está localizado en el sentido de 5’ del intrón 3 del gen de mGluR6 en la presente invención. El intrón 3 del gen de mGluR6 está localizado en el sentido de 5’ del potenciador de mGluR6 en la presente invención. El potenciador de mGluR6 se localiza en el sentido de 5’ del promotor de mGluR6 en la presente invención.

[0084] El potenciador de mGluR6 de 200 pb se localiza en el sentido de 5’ de la secuencia de la región promotora de mGluR6. El intrón 4 del gen de mGluR6 está en el sentido de 5’ del intrón 3 del gen de mGluR6, el intrón 3 del gen de mGluR6 está en el sentido de 5’ del potenciador de mGluR6, y el potenciador de mGluR6 está en el sentido de 5’ del promotor de mGluR6. El promotor de mGluR6 modificado completo (por ejemplo, que incluye el potenciador de mGluR6, el promotor de mGluR6, y las secuencias de intrones mGluR6) se localiza en el sentido de 5’ de un transgén particular de interés para dirigir su expresión.

[0085] La presente invención proporciona además casetes de expresión que comprenden los promotores de mGluR6 modificados descritos en el presente documento.

[0086] Transgenes

[0087] La expresión de transgenes en las retinas dañadas o enfermas puede ser útil para mejorar o restablecer la visión. Los transgenes de particular interés para el restablecimiento de la fotosensibilidad o visión incluyen proteínas fotosensibles, tales como genes de opsina o genes de rodopsina. Tal como se usa en el presente documento, “transgén” se refiere a un polinucleótido que codifica para un polipéptido de interés, en donde el polinucleótido está encapsidado en un vector viral (por ejemplo, rAAV).

[0088] La familia de genes de opsina incluye opsinas de vertebrados (animales) e invertebrados. Las opsinas animales son receptores acoplados a proteína G (GPCR) con hélices 7-transmembrana que regulan la actividad de los canales iónicos. Las rodopsinas de invertebrados no son habitualmente GPCR, sino que son bombas de iones sensibles a la luz o activadas por la luz o canales iónicos.

[0089] Tal como se hace referencia en el presente documento, un gen de opsina o proteína sensible a la luz incluye canalrodopsinas (por ejemplo,ChR1, ChR2, vChR1 deVolvox carteri,vChR2, y otras variantes identificadas de cualquier vertebrado, invertebrado, o microbio), halorodopsinas (NpHR), melanopsinas, opsinas pineales, bacteriorodopsina, y variantes funcionales, fragmentos de unión activos, o quimeras de los mismos. Una proteína sensible a la luz de esta invención puede encontrarse de forma natural en células vegetales, animales, arqueobacterianas, de algas, o bacterianas, o puede crearse alternativamente a través de técnicas de laboratorio. Los ejemplos de genes de opsina se analizan con más detalle a continuación.

[0090] Los ejemplos de canalrodopsinas como transgenes en la presente invención incluyen canalrodopsinas Chop1 (también conocida como ChR1) (número de registro de GenBank AB058890/AF385748) y Chop2 (también conocida como ChR2) (número de registro de GenBank AB058891/AF461397), así como híbridos/quimeras mutantes ChR2C128A, ChR2C128S, ChR2C128T, ChR1-ChR2, y variantes de los mismos.

[0091] Chop1 y Chop2 son dos rodopsinas del alga verdeChlamydomonas reinhardtii(Nagel, 2002; Nagel, 2003). Ambos son canales sensibles a la luz que, cuando se expresan y activan en tejido neuronal, permiten que una célula se despolarice cuando se estimula con luz (Boyden, 2005). La secuencia de aminoácidos de longitud completa de Chop1 se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 11:

[0093]

[0095] La secuencia de aminoácidos de longitud completa de Chop2 se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 12:

[0097]

[0099] Se ha demostrado que un fragmento Chop2 (315 aminoácidos) aumenta eficazmente la fotosensibilidad y la visión en modelos murinos de degeneración de fotorreceptores (Biet al., Neuron, 2006, y la patente estadounidense 8.470.790). La secuencia de aminoácidos de este fragmento se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 13:

[0101]

[0103] Mutantes y variantes de Chop2 tal como se describe en la publicación PCT WO 2013/134295 puede expresarse también usando los promotores descritos en el presente documento. Cualquier ChR u opsinas microbianas, u otros sensores o conmutadores de luz codificados genéticamente, actualmente conocidos o todavía no recuperados, son útiles para generar las composiciones y poner en práctica los métodos de la invención.

[0104] Otros transgenes adecuados incluyen canalrodopsinas deVolvox carteri(por ejemplo, vChR1 y vChR2). La secuencia de aminoácidos de vChR1, n.º de registro de GenBank. El documento EU285658.1 se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 14:

[0105]

[0107] La secuencia de aminoácidos de vChR2 se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 15:

[0109]

[0111] NpHR (halorodopsina) (número de registro de GenBank EF474018) es del arqueón haloalcalífiloNatronomonas pharaonis.La secuencia de aminoácidos de NpHR se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 16:

[0113]

[0115] En determinadas realizaciones, pueden crearse variantes de NpHR. En realizaciones específicas, las mutaciones puntuales únicas o múltiples en la proteína NpHR pueden dar como resultado variantes de NpHR. En realizaciones específicas, puede usarse una versión con codones optimizados de mamífero de NpHR. En una realización se usan variantes de NpHR. En una realización específica, se usa eNpHR (NpHR potenciado). La adición de los aminoácidos FCYENEV (SEQ ID NO: 38) al extremo C-terminal de NpHR junto con el péptido señal de una subunidad β del receptor nicotínico de acetilcolina al extremo N-terminal de NpHR da como resultado la construcción de eNpHR. La melanopsina (número de registro de GenBank 6693702) es un fotopigmento encontrado en células ganglionares fotosensibles especializadas de la retina que están implicadas en la regulación de ritmos circadianos, reflejo de la luz pupilar, y otras respuestas no visuales a la luz. En la estructura, la melanopsina es una opsina, una variedad de proteína de retinilideno de receptor acoplado a proteína G. La melanopsina se asemeja a las opsinas de invertebrados en muchos aspectos, incluyendo su secuencia de aminoácidos y cascada de señalización en el sentido de 3’. Al igual que las opsinas de invertebrados, la melanopsina parece ser un fotopigmento biestable, con actividad intrínseca de fotoisomerasa. En determinadas realizaciones, pueden crearse y usar variantes de melanopsina en la invención. En realizaciones específicas, mutaciones puntuales únicas o múltiples en la proteína melanopsina pueden dar como resultado variantes de melanopsina. La secuencia de aminoácidos deMus musculusLa melanopsina (número de registro de GenBank 6693702) se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 17:

[0117] La secuencia de aminoácidos de melanopsina deHomo sapiens(número de registro de GenBank BC113558.1) se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 18:

[0119]

[0121] Otras proteínas canal adecuadas de la invención incluyen ChD, ChEF, ChF, ChIEF, y variantes de las mismas. Las proteínas sensibles a la luz también pueden incluir proteínas que son al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, o al menos aproximadamente el 99 % idénticas a cualquiera de las proteínas sensibles a la luz descritas en el presente documento (por ejemplo,ChR1, ChR2, vChR1, vChR2, NpHR y melanopsina). Las proteínas sensibles a la luz de la presente invención también pueden incluir proteínas que tienen al menos una mutación. La mutación puede ser una mutación puntual.

[0122] En algunas realizaciones, las proteínas sensibles a la luz pueden modular la señalización dentro de los circuitos neurales y controlar bidireccionalmente el comportamiento de la conductancia iónica al nivel de una única neurona. En algunas realizaciones, la neurona es una neurona retiniana, una célula bipolar retiniana (por ejemplo, células bipolares retinianas ON u OFF; células bipolares de bastones y conos), una célula ganglionar retiniana, una célula fotorreceptora, o una célula amacrina retiniana.

[0123] En algunas realizaciones, una cola de poliA puede insertarse en el sentido de 3’ del transgén en un casete de expresión o vector de expresión de ácido nucleico de la presente invención. Las colas de poliA adecuadas se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, cola de poli A de la hormona del crecimiento humana (hGHpA), cola de poliA de la hormona del crecimiento bovina (bGHpA), poliA bovina, poliA de SV40 y AV40pA. La secuencia de ácido nucleico de hGHpA se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 19:

[0125]

[0127] Vectores

[0128] Las secuencias promotoras de mGluR6 modificadas pueden insertarse en diversos vectores de expresión de ácidos nucleicos diferentes. Los vectores para su uso en la presente invención pueden incluir diversos vectores virales, tales como plásmidos y virus recombinantes, por ejemplo, virus adenoasociado recombinante (rAAV), adenovirus recombinantes, retrovirus recombinantes, lentivirus recombinantes, y otros virus conocidos en la técnica.

[0129] Los virus adenoasociados son virus de ADN monocatenario pequeños que requieren virus auxiliar para facilitar la replicación eficaz. El genoma de 4,7 kb de AAV se caracteriza por dos repeticiones terminales invertidas (ITR) y dos marcos de lectura abiertos que codifican para las proteínas Rep y las proteínas Cap, respectivamente. El marco de lectura Rep codifica para cuatro proteínas de peso molecular 78 kD, 68 kD, 52 kD y 40 kD. Estas proteínas funcionan principalmente regulando la replicación del AAV y rescatando e integrando el AAV en los cromosomas de una célula huésped. El marco de lectura de Cap codifica para tres proteínas estructurales de 85 kD (VP1), 72 kD (VP2) y 61 kD (VP3) (Berns, citado anteriormente) que forman la cápside del virión. Más del 80 % de las proteínas totales en el virión AAV comprenden VP3.

[0130] El genoma de rAAV generalmente comprende: (1) un ITR de virus adenoasociado en 5’, (2) una secuencia codificante (por ejemplo, transgén) para el producto génico deseado (por ejemplo, una proteína sensible a la luz) operativamente unido a una secuencia que regula su expresión en una célula (por ejemplo, una secuencia promotora de mGluR6 modificada), y (3) una repetición terminal invertida de virus adenoasociado en 3’. Además, el vector de rAAV puede contener preferiblemente una secuencia de poliadenilación.

[0131] Generalmente, los vectores de rAAV tienen una copia de la ITR de AAV en cada extremo del transgén o gen de interés, con el fin de permitir la replicación, empaquetamiento e integración eficiente en cromosomas celulares. La ITR consiste en los nucleótidos 1 a 145 en el extremo 5’ del genoma de ADN de AAV, y los nucleótidos 4681 a 4536 (por ejemplo, la misma secuencia) en el extremo 3’ del genoma de ADN de AAV. El vector de rAAV también puede incluir al menos 10 nucleótidos después del final de la ITR (por ejemplo, una porción de la “región D”).

[0132] La secuencia transgénica (por ejemplo, el polinucleótido que codifica para una proteína sensible a la luz) puede tener de aproximadamente 2 a 5 kb de longitud (o alternativamente, el transgén puede contener adicionalmente una secuencia de “relleno” para llevar el tamaño total de la secuencia de ácido nucleico entre las dos ITR a de entre 2 y 5 kb). Alternativamente, el transgén puede estar compuesto por copias repetidas de la misma secuencia heteróloga o similar varias veces (por ejemplo, dos moléculas de ácido nucleico que codifican para una o más proteínas sensibles a la luz separadas por una lectura de ribosoma, o alternativamente, por un sitio de entrada de ribosoma interno o “IRES”), o varias secuencias heterólogas diferentes.

[0133] En una realización, el vector comprende un AAV recombinante de un serotipo particular, o bien que se produce de manera natural o bien modificado por ingeniería. Se han encontrado virus adenoasociados en muchas especies animales, incluyendo primates, caninos, aves y humanos. Actualmente, hay 12 serotipos conocidos diferentes, por ejemplo,AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, y AAV12, todos los cuales son apropiados para su uso en la presente invención. Los vectores de AAV recombinantes de la presente invención pueden generarse a partir de una variedad de virus adenoasociados, incluyendo, por ejemplo, cualquiera de los serotipos 1 a 12, tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se espera que las ITR de cualquier serotipo de AAV tengan estructuras y funciones similares con respecto a los mecanismos de replicación, integración, escisión, y transcripción.

[0134] Por ejemplo, el vector de expresión de ácido nucleico de la presente invención es un vector de virus adenoasociado o un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV). En realizaciones preferidas, el vector es un vector recombinante AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, o AAV12. En determinadas realizaciones, el vector de AAV es de un serotipo o variante de tipo salvaje de cualquiera de AAV1-AAV12, o un mutante, híbrido, o fragmento del mismo. En otras realizaciones, el vector de AAV es de un serotipo natural o variante/mutante del mismo que aún no se ha descubierto.

[0135] Las partículas virales y similares a virus contempladas por la invención pueden prepararse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, así como los desarrollados en el futuro. Las líneas celulares productoras de virus y las líneas celulares productoras de partículas similares a virus que tienen la capacidad de producir cantidades suficientemente grandes de virus se transfectan con los vectores de la invención. Los métodos de producción preferidos incluyen, pero no se limitan a, el sistema de vector de expresión de baculovirus/células de insecto y células huésped HEK 293. Otros métodos y células huésped son adecuados, tales como los descritos en la técnica. Véase, por ejemplo, Vicente, T. “Virus production for clinical gene therapy”, Methods Mol. Biol., vol. 542:447-70 (2009).

[0136] El vector de rAAV también puede contener secuencias adicionales, por ejemplo, de un adenovirus, que ayudan a efectuar una función deseada para el vector. Tales secuencias incluyen, por ejemplo, aquellas que ayudan en el empaquetamiento del vector de rAAV en partículas de virus. Las líneas celulares de empaquetamiento adecuadas para producir vectores virales adenoasociados pueden conseguirse dadas las técnicas disponibles (patente estadounidense 5.872.005). Los métodos para construir y empaquetar vectores rAA7I se describen, por ejemplo, en el documento WO 00/54813.

[0137] En otras realizaciones, los vectores de AAV usados con la presente invención, por ejemplo, un vector de empaquetamiento, comprenden una proteína de cápside. Las proteínas de cápside adecuadas incluyen, pero no se limitan a:

[0138] una proteína de cápside de AAV1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23:

[0139]

[0140] una proteína de cápside de AAV2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24:

[0141]

[0142] una proteína de cápside de AAV3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25:

[0143]

[0144] una proteína de cápside de AAV4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26:

[0145]

[0146] una proteína de cápside de AAV5 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27:

[0147]

[0148] una proteína de cápside de AAV6 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28:

[0149]

[0150] una proteína de cápside de AAV7 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29:

[0151]

[0152] una proteína de cápside de AAV8 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30:

[0153] una proteína de cápside de AAV9 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31:

[0154]

[0155] una proteína de cápside de AAV10 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32:

[0156]

[0157] una proteína de cápside de AAV11 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33:

[0160] una proteína de cápside de AAV12 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34:

[0162]

[0165] La proteína de la cápside puede tener al menos una mutación, por ejemplo, una sustitución de aminoácidos. En algunos casos, un vector viral adenoasociado recombinante (rAAV) comprende una proteína de cápside con un residuo de tirosina mutado que permite que el vector tenga una eficiencia de transducción mejorada de una célula diana, por ejemplo, una célula bipolar retiniana (por ejemplo, células bipolares retinianas ON u OFF; células bipolares de conos y bastones). En algunos casos, el rAAV comprende además un promotor (por ejemplo, mGluR6, o fragmento del mismo) capaz de dirigir la expresión de una proteína de interés en la célula diana.

[0167] En una realización, puede realizarse una mutación en uno cualquiera o más de los residuos de tirosina de la proteína de la cápside de AAV 1-12 o AAV híbridos. En realizaciones específicas, estos son residuos de tirosina expuestos en la superficie. En una realización relacionada, los residuos de tirosina son parte de la proteína de cápside VP1, VP2, o VP3. En realizaciones a modo de ejemplo, la mutación puede realizarse en uno o más de los siguientes residuos de aminoácidos de una proteína de cápside de AAV-VP3: Tyr252, Tyr272, Tyr444, Tyr500, Tyr700, Tyr704, Tyr730; Tyr275, Tyr281, Tyr508, Tyr576, Tyr612, Tyr673 o Tyr720. Las mutaciones a modo de ejemplo son mutaciones de tirosina a fenilalanina que incluyen, pero no se limitan a, Y252F, Y272F, Y444F, Y500F, Y700F, Y704F, Y730F, Y275F, Y281F, Y508F, Y576F, Y612G, Y673F e Y720F. En una realización específica, estas mutaciones se realizan en el serotipo AAV2. En algunos casos, un serotipo de AAV2 comprende una mutación Y444F y/o un serotipo de AAV8 comprende una mutación Y733F, en donde 444 y 733 indican la ubicación de una mutación puntual de tirosina de la cápside viral. En realizaciones adicionales, tales serotipos mutados de AAV2 y AAV8 codifican para una proteína sensible a la luz y también comprenden un promotor de mGluR6 modificado para dirigir la expresión de tal proteína sensible a la luz. Tales vectores de AAV se describen, por ejemplo, en Petrs-Silvaet al., Mol. Ther., 201119:293-301).

[0169] En realizaciones preferidas, la mutación de aminoácidos es de uno o más de los residuos de tirosina de superficie (por ejemplo, Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704, e Y730 de una proteína de cápside de AAV2), residuos de treonina de superficie (por ejemplo,T251, T329, T330, T454, T455, T503, T550, T592, T581, T597, T491, T671, T659, T660, T701, T713, y T716 de una proteína de cápside de AAV2), residuos de serina de superficie (por ejemplo, S261, S264, S267, S276, S384, S458, S468, S492, S498, S578, S658, S662, S668, S707, S721 de una proteína de cápside de AAV2), y/o residuos de lisina de superficie (por ejemplo, 258, K321, K459, K490, K507, K527, K572, K532, K544, K549, K556, K649, K655, K665, K706 de una proteína de cápside de AAV2). Estos residuos están altamente conservados entre cápsides de AAV1-AAV12, por lo que las realizaciones que utilizan AAV1-AAV12 están incluidas en la presente memoria y podrían ser desarrolladas fácilmente por los expertos en la técnica que ven la presente descripción. Los mutantes de cápside preferidos de la invención aumentan la eficacia de transducción en comparación con las proteínas de cápside de tipo natural.

[0170] En un aspecto, la mutación es una tirosina (Y) a fenilalanina (F) en uno o más de Y252, Y272, Y444, Y500, Y700, Y704, e Y730 de una proteína de cápside de AAV2 o un residuo conservado equivalente de AAV1 o AAV3-12. En una realización preferida, la mutación Y a F está en la posición 444 y/o la posición 730 de aminoácidos de una proteína de cápside de AAV2 o un residuo conservado equivalente de AAV1 o AAV3-12. En otra realización preferida, el mutante es un mutante cuádruple con mutaciones Y a F en Y272, Y444, Y500, e Y730. Petrs-Silva, H.et al., “Novel Properties of Tyrosine-mutant AAV2 Vectors in the Mouse Retina”, Mol. Ther., vol. 19(2): 293-301 (2011).

[0171] En otro aspecto, la mutación es una treonina (T) a valina (V) en uno o más de T251, T329, T330, T454, T455, T503, T550, T592, T581, T597, T491, T671, T659, T660, T701, T713, y T716 de una proteína de cápside de AAV2 o un residuo conservado equivalente de AAV1 o AAV3-12. En una realización preferida, la mutación T a V está en la posición 491 de aminoácido de una proteína de cápside de AAV2 o un residuo conservado equivalente de AAV1 o AAV3-12. En aún otra realización, la cápside mutante comprende mutaciones Y a F en Y272, Y444, Y500, e Y730, así como una mutación T a V está en la posición 491 de aminoácido de una proteína de cápside de AAV2 o un residuo conservado equivalente de AAV1 o AAV3-12. Kay, C. N.et al., “Targeting Fotorreceptors via Intravitreal Delivery Using Novel, Capside-Mutated AAV Vectors,” PLoS One, vol.8(4): e62097 (2013).

[0172] En otra realización, la proteína de la cápside se modifica por ingeniería para incluir el inserto del péptido 7m8 en AAV2<588>, SEQ ID NO: 35: LGETTRP. Dalkara, D.et al., In Vivo-Directed Evolution of a New Adeno-Associated Virus for Therapeutic Outter Retinal Gene Delivery from the Vitreous, Sci. Transl. Med.5(189):ra76 (2013).

[0173] En otra realización, la proteína de la cápside se modifica por ingeniería para incluir un tramo de 9 aminoácidos de una región conformacionalmente variable de la proteína de la cápside de AAV8 entre las posiciones 585 y 593. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside comprende la SEQ ID NO: 36, PERTAMSLP. En realizaciones preferidas, la SEQ ID NO: 36 se inserta entre las posiciones 585 y 593 de una proteína de cápside de AAV2 o los residuos conservados equivalentes de AAV1 o AAV3-12. Las proteínas de la cápside que comprenden esta secuencia transducen eficazmente células oculares, preferiblemente células bipolares y ganglionares. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside comprende la SEQ ID NO: 37, SFSRAVLCD. En realizaciones preferidas, la SEQ ID NO: 37 se inserta entre las posiciones 585 y 593 de una proteína de cápside de AAV2 o los residuos conservados equivalentes de AAV1 o AAV3-12. Las proteínas de la cápside que comprenden esta secuencia transducen eficazmente células oculares, preferiblemente células bipolares ON. Cronin, T.et al., “Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capside and promoter”, EMBO Mol. Med., vol.6(9): 1175-1190 (2014).

[0174] En cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aislado o vectores de expresión de ácido nucleico descritos en el presente documento, el promotor de mGluR6 modificado está en el sentido de 5’ de un transgén que va a expresarse en el ojo. Preferiblemente, el transgén codifica un producto génico que aumenta la sensibilidad a la luz, aumenta la detección de luz, aumenta la fotosensibilidad, aumenta el potencial evocado visual o restablece la visión en una retina. Más preferiblemente, el transgén es un gen de opsina. Los ejemplos de genes de opsina incluyen, pero no se limitan a, canalrodopsinas (por ejemplo, canalrodopsina-1, canalrodopsina-2, y canalrodopsinas 1 ó 2 deVolvox carteri), melanopsina, opsina pineal, fotopsinas, halorodopsina, bacteriorodopsina, proteorodopsina, o cualquier variante funcional o fragmento de la misma. Las variantes de opsina adecuadas pueden ser el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 % el 98 % o el 99 % idénticas a la opsina. Preferiblemente, la variante de opsina tiene al menos el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96%, el 97%, el 98%, o el 99% de la actividad funcional de la opsina. La actividad funcional puede medirse por cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, por electrorretinografía.

[0175] Preferiblemente, la mutación en la proteína de la cápside es una tirosina a fenilalanina en la posición de aminoácido 444. El experto en la técnica podría diseñar fácilmente secuencias de ácido nucleico que codifiquen para dicha proteína de cápside mutada. Una secuencia de ácido nucleico para tal proteína de cápside ejemplar se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 20:

[0176]

[0179] En algunas realizaciones, pueden usarse vectores de AAV autocomplementarios en la presente invención. Estos vectores presentan un genoma de repetición invertida que puede plegarse en ADN bicatenario (ADNbc) sin el requisito de síntesis de ADN o apareamiento de bases entre múltiples genomas de vector. Los vectores autocomplementarios son particularmente eficaces para la transducción, ya que los vectores se hibridan para el cebado de la transcripción, evitando de ese modo eficazmente la etapa de convertir ADN monocatenario (ADNmc en ADNbc). Los vectores autocomplementarios y los métodos para su uso se describen en McCartyet al., Mol. Ther., 2008, 16:1648-1656.

[0181] Los vectores de uso particular para la presente invención se muestran en las figuras 1 y 2. El experto en la técnica puede realizar fácilmente modificaciones usando técnicas recombinantes de ADN convencionales.

[0183] La secuencia de ácido nucleico del vector V-032-pFB-AAV-CMV-SV40pA (representado en la figura 1) se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 21:

[0184]

[0187] 

[0188]

[0190] La secuencia de ácido nucleico para el vector V117-pFB-inCap2-Y444F-inRepOpt-Kan (representado en la figura 2) se proporciona a continuación en la SEQ ID NO: 22:

[0191]

[0192]

[0193]

[0194]

[0195] Cualquiera de una variedad de otros vectores adaptados para la expresión de cualquier proteína sensible a la luz en una célula del ojo, particularmente dentro de una célula retiniana, más particularmente dentro de una célula no fotorreceptora (por ejemplo, células amacrinas, células ganglionares retinianas, células bipolares retinianas, (células bipolares retinianas de cono ON u OFF; células bipolares de bastones)), están dentro del alcance de la presente invención. Los vectores de inserción de genes pueden ser virales (por ejemplo, derivados de o que contienen secuencias de ADN o ARN viral, preferiblemente empaquetados dentro de una partícula viral) o no virales (por ejemplo, no empaquetados dentro de una partícula viral, incluyendo polinucleótidos desnudos, ácido nucleico asociado con una partícula portadora tal como un liposoma o molécula de direccionamiento, y similares).

[0196] Usos terapéuticos

[0197] Las ventajas de usar elementos reguladores génicos, tales como los abarcados por la presente invención, que dirigen la expresión a un subconjunto específico de ojos retinianos es recapitular con precisión las señales de procesamiento visual de las rutas ON y OFF para mejorar o restablecer la fotosensibilidad, y mejorar o restablecer de ese modo la visión.

[0198] La información visual se procesa a través de la retina a través de dos rutas: una ruta ON que señala la luz ON, y una ruta OFF que señala la luz OFF. La existencia de la ruta ON y OFF es importante para la mejora de la sensibilidad de contraste. La señal visual en la ruta ON es la retransmisión de las células bipolares del cono ON a las células ganglionares ON. Tanto las células bipolares del cono ON como las células del ganglio ON se despolarizan en respuesta a la luz. Por otro lado, la señal visual en la ruta OFF se transporta desde las células bipolares del cono OFF hasta las células ganglionares OFF. Tanto las células bipolares del cono OFF como las células ganglionares OFF son hipopolarizadas en respuesta a la luz. Las células bipolares de bastones, que son responsables de la capacidad de ver en luz tenue (visión escotópica), son células bipolares ON (despolarizadas en respuesta a la luz). Las células bipolares de bastones retransmiten la señal de visión a través de células amacrinas AII (células retinianas de tipo ON) a células bipolares de cono ON y OFF.

[0199] Por consiguiente, puede usarse un sistema de rodopsina doble para recapitular las rutas ON y OFF integrales con el procesamiento visual y la agudeza. En resumen, una proteína ChR2 o Chop2 puede dirigirse específicamente a neuronas retinianas de tipo ON (por ejemplo, las células ganglionares de tipo ON y/o las células bipolares de tipo ON), mientras que un sensor de luz hipopolarizante (por ejemplo, la halorodopsina u otra bomba de cloruro o bomba de protones, preferiblemente Arch, ArchT, Jaws conocida en la técnica, así como variantes conocidas en la técnica o aún por identificar) pueden dirigirse a neuronas retinianas de tipo OFF (por ejemplo, células ganglionares de tipo OFF y/o células bipolares de tipo OFF) para crear rutas ON y OFF. Se logra un enfoque alternativo para restablecer las rutas ON y OFF en la retina expresando un sensor de luz despolarizante, tal como ChR2, para células bipolares de bastones o amacrina AII. En este enfoque, la despolarización de las células bipolares de bastones o de las células amacrinas AII puede conducir a las respuestas ON y OFF a los niveles de las células bipolares cónicas y de las células ganglionares retinianas en el sentido de 3’. Por tanto, las rutas ON y OFF que son inherentes en la retina se restablecen o mantienen.

[0200] La presente invención puede usarse en métodos para aumentar la fotosensibilidad, aumentar la fototransducción, aumentar el potencial evocado visual (VEP) o mejorar o restablecer la visión. Se conocen en la técnica pruebas para cuantificar la fotosensibilidad y el potencial evocado visual, incluyendo el análisis de electrorretinografía (ERG).

[0201] Pueden usarse pruebas visuales y de comportamiento para determinar mejoras o restablecimientos de la visión. Las pruebas de comportamiento incluyen pruebas de laberinto y la prueba de natación. Se usan pruebas visuales, tales como el diagrama de Snellen y la prueba de campo visual, para determinar la visión mejorada o restablecida. Tales pruebas pueden ser realizadas fácilmente por un profesional clínico. Tal como se usa en el presente documento, “aumentar” significa en referencia a antes del tratamiento o en comparación con uno que no ha experimentado tratamiento, por ejemplo, terapia génica ocular.

[0202] La presente invención puede formularse para dar una composición farmacéutica o medicamento adecuado para la administración en un sujeto o paciente. Las vías de administración adecuadas incluyen, por ejemplo, inyección intravítrea, intraocular, o subretiniana. Preferiblemente, la vía de administración es por inyección intravítrea. Todas las neuronas retinianas, incluyendo las células ganglionares retinianas, las células bipolares, las células horizontales, las células amacrinas, y las células fotorreceptoras se sabe que son razonablemente bien accesibles a la inyección intravítrea tal como se describe en la presente descripción. La inyección intravítrea y/o subretiniana puede proporcionar el acceso necesario a las células bipolares, especialmente en circunstancias en las que la capa de células fotorreceptoras está ausente debido a la degeneración.

[0203] Tales formulaciones comprenden un vehículo, diluyente, portador, o excipiente farmacéutica y/o fisiológicamente aceptable, tal como solución salina tamponada u otros tampones, por ejemplo, HEPES, para mantener el pH fisiológico. Para una descripción de tales componentes y su formulación, véase, generalmente, Gennaro, A.E., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins Publishers; 2003 o última edición). Véase también, el documento WO00/15822. Si la preparación se ha de almacenar durante largos periodos, puede congelarse, por ejemplo, en presencia de glicerol.

[0204] En una realización, los constructos o vectores de expresión de ácido nucleico descritos en el presente documento se empaquetan en vectores adenovirales para la administración transgénica. Una cantidad eficaz de viriones de rAAV que portan un transgén bajo el control del promotor de mGluR6 modificado está preferiblemente en el intervalo de entre aproximadamente 10<10>hasta aproximadamente 10<13>unidades infecciosas de rAAV en un volumen de entre aproximadamente 150 y aproximadamente 800 μl por inyección. Las unidades infecciosas de rAAV pueden medirse según McLaughlin, SKet al., 1988, J. Virol. 62:1963. Más preferiblemente, la cantidad eficaz está entre aproximadamente 10<10>y aproximadamente 10<12>unidades infecciosas de rAAV y el volumen de inyección está preferiblemente entre aproximadamente 250 y aproximadamente 500 μl. El profesional que trata puede seleccionar otras dosificaciones y volúmenes, preferiblemente dentro de estos intervalos, pero posiblemente fuera de ellos, teniendo en cuenta el estado físico del sujeto (preferiblemente un humano), que está tratándose, incluyendo, edad, peso, salud general y la naturaleza y gravedad del trastorno ocular particular.

[0205] También puede ser deseable administrar dosis adicionales (“reforzadores”) de las presentes composiciones de ácido nucleico (s) o rAAV. Por ejemplo, dependiendo de la duración de la expresión transgénica dentro de la célula diana ocular, puede administrarse un segundo tratamiento después de 6 meses o anualmente, y puede repetirse de manera similar. No se espera que se generen anticuerpos neutralizantes para AAV en vista de las rutas y dosis usadas, permitiendo de ese modo rondas repetidas de tratamiento.

[0206] La necesidad de tales dosis adicionales puede monitorizarla el profesional que trata usando, por ejemplo, pruebas electrofisiológicas y otras pruebas de función retiniana y visual bien conocidas y pruebas de comportamiento visual. El profesional que trata podrá seleccionar las pruebas apropiadas aplicando una experiencia rutinaria en la técnica. Puede ser deseable inyectar mayores volúmenes de la composición en dosis únicas o múltiples para mejorar adicionalmente los parámetros de resultado relevantes.

[0207] Trastornos oculares

[0208] El término tratamiento incluye, pero no se limita a, detener, inhibir, o revertir la progresión de una enfermedad o trastorno ocular. Los indicadores preferidos de tratamiento exitoso son la conservación de la visión existente o la mejora de la visión en comparación con la visión antes del tratamiento.

[0209] Los trastornos oculares para los que se pretenden y pueden usarse los presentes ácidos nucleicos y vectores para mejorar uno o más parámetros de visión incluyen, pero no se limitan a, anomalías de desarrollo que afectan tanto a segmentos anteriores como posteriores del ojo. Los trastornos del segmento anterior incluyen glaucoma, cataratas, distrofia corneal, y queratocono. Los trastornos del segmento posterior incluyen trastornos ciegos provocados por mal funcionamiento y/o muerte de los fotorreceptores provocados por distrofias y degeneraciones retinianas.

[0210] Una lista no limitativa de enfermedades oculares que pueden beneficiarse de los métodos descritos en el presente documento incluye, pero no se limitan a, retinoblastoma, melanoma ocular, retinopatía diabética, retinopatía hipertensiva, cualquier inflamación de los tejidos oculares (es decir, inflamación coriorretinal, escleritis, queratitis, uveítis, etc.) o infección (es decir, bacteriana o viral). Las enfermedades oculares relacionadas con la angiogénesis incluyen, pero no se limitan a degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, enfermedades neovascularizantes corneales, proliferación angiomatosa retiniana, vasculopatía coroidea polipoidal, retinopatía neovascularizante inducida por isquemia, miopía extrema o alta, y retinopatía del prematuro.

[0211] Los trastornos retinianos incluyen ceguera nocturna estacionaria congénita, degeneración macular, degeneración macular relacionada con la edad, distrofias cónicas congénitas y un gran grupo de trastornos relacionados con retinitis-pigmentosa (RP). Estos trastornos incluyen muerte preestablecida genéticamente de bastones y conos de células fotorreceptoras en la retina que se producen a diversas edades. Entre ellas se encuentran las retinopatías graves, tales como los subtipos de RP en sí que progresa con la edad y provoca ceguera en la niñez y en la edad adulta temprana y las enfermedades asociadas a RP, tales como los subtipos genéticos de la amaurosis congénita de Leber (LCA), que frecuentemente da como resultado la pérdida de visión durante la niñez, tan pronto como el primer año de vida. Los últimos trastornos se caracterizan generalmente por una reducción grave y, a menudo, una pérdida completa de células fotorreceptoras, bastones y conos. (Trabulsi, EI, ed., Genetic Diseases of the Eye, Oxford University Press, NY, 1998).

[0212] La neovascularización ocular es una causa extendida de pérdida de visión que también puede tratarse usando los potenciadores, promotores, y vectores optimizados de la presente invención. Puede producirse en varias enfermedades retinianas proliferativas incluyendo, pero sin limitarse a, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) seca (atrófica) y húmeda (neovascular o exudativa), oclusión de la arteria o vena retiniana, glaucoma, y otras degeneraciones retinianas hereditarias, uveítis, desprendimiento de retina, y cánceres oculares (melanoma ocular y retinoblastoma), y retinopatía de premadurez (ROP).

[0213] En particular, los potenciadores, promotores, y vectores optimizados de la presente invención útiles para expresar transgenes para el tratamiento y/o restablecimiento de al menos visión parcial a sujetos que han perdido visión debido a trastornos oculares, tales como retinopatías asociadas con RPE, que se caracterizan por una conservación a largo plazo de la estructura del tejido ocular a pesar de la pérdida de función y por la asociación entre la pérdida de función y el defecto o ausencia de un gen normal en las células oculares del sujeto. Se conocen una variedad de tales trastornos oculares, tales como enfermedades de cegado de inicio infantil, retinitis pigmentosa, degeneración macular y retinopatía diabética, así como enfermedades de cegado ocular conocidas en la técnica. Se anticipa que estos otros trastornos, así como trastornos enmascaradores de la causa desconocida en la actualidad que posteriormente se caracterizan por la misma descripción que anteriormente, también pueden tratarse con éxito por los transgenes expresados por los ácidos nucleicos y vectores de la presente invención.

[0214] Por tanto, el trastorno ocular particular tratado por la presente invención puede incluir los trastornos mencionados anteriormente y varias enfermedades que aún no se han caracterizado de este modo.

[0215] Ejemplos

[0216] Ejemplo 1: Generación de constructos de promotor de mGluR6 optimizados

[0217] Se construyó una serie de casetes de expresión de AAV2 con la combinación de secuencias del promotor de mGluR6, el potenciador de mGluR6 de 200 pb, y secuencias de intrones del gen de mGluR6, que porta un transgén. El transgén era mCherry indicador o canalrodopsina-2 fusionada con GFP (GFP-ChR2), ChR2 sola.

[0218] Se muestran dos constructos promotores de mGluR6 optimizados en la figura 3 (I4) y la figura 4 (I1a) para dirigir la expresión de un transgén. El transgén es, por ejemplo, un gen indicador, mCherry. El constructo I4 comprende un promotor optimizado con la secuencia potenciadora de mGluR6 de 200 pb localizada en el sentido de 5’ de un fragmento de 500 pb del promotor de mGluR6. El constructo I1a comprende un promotor optimizado con el intrón 4 del gen de mGluR6 localizado en el sentido de 5’ del intrón 3 del gen de mGluR6, el intrón 3 del gen de mGluR6 localizado en el sentido de 5’ de la secuencia potenciadora de mGluR6 de 200 pb, y la secuencia potenciadora de mGluR6 localizada en el sentido de 5’ de un fragmento de 500 pb del promotor de mGluR6.

[0219] Los vectores de serotipo 2 de AAV2 con una mutación de cápside Y444F se empaquetaron y se purificaron por afinidad en Virovek (Hayward, CA).

[0220] Ejemplo 2: Expresión en la retinain vivo

[0221] La expresión mediada por AAV recombinante de un transgén por los dos promotores optimizados de mGluR6 mostrados en las figuras 3 y 4 se sometieron a prueba en ratones.

[0222] Brevemente, se anestesiaron ratones C57BL/6J de 1 mes de edad mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de 120 mg/kg de ketamina y 15 mg/kg de xilazina. Bajo un microscopio de disección, se realizó una pequeña perforación en la región de la esclerótica temporal con una aguja. Se inyectó un total de 1 μl de disolución de vector viral a la concentración de 1 x 10<13>vg/ml en el espacio intravítreo a través del orificio con una jeringa Hamilton. Un mes después de la inyección, los ratones se sacrificaron para examinar los patrones de expresión del transgén. Se bloquearon montajes completos retinianos o secciones verticales durante 1 h en una disolución que contenía Chemiblocker al 5 % (agente bloqueante de membrana; Chemicon, Brica, MA, EE. UU.), Triton X-100 al 0,5 % y azida de sodio al 0,05 % (Sigma). Los anticuerpos primarios se diluyeron en la misma disolución y se aplicaron durante la noche, seguido de incubación (1 h) en los anticuerpos secundarios, que se conjugaron con Alexa 594 (1:600, fluorescencia roja, Molecular Probes), Alexa 488 (1:600, fluorescencia verde, Molecular Probes). En este estudio se usaron los siguientes anticuerpos: anti-mCherry de conejo (1:500, 632496, Clontech); anti-PKC de conejo (1:20000, 2056, Cell Signal).

[0223] Todas las imágenes se hicieron usando un microscopio Zeiss Axioplan 2 con la rejilla oscilante Apotome para reducir la luz parásita fuera del foco. Se capturaron imágenes de pila en Z y se hicieron proyecciones de imagen colapsando pilas en Z individuales de secciones ópticas en un único plano. Para crear las imágenes fusionadas para doble marcaje, se combinaron los canales rojo y verde o azul para cada sección óptica individual y las secciones ópticas z fusionadas se colapsaron en un único plano. El brillo y el contraste se ajustaron usando Adobe Photoshop CS4. En la figura 5 se muestran montajes completos retinianos de ratones inyectados con viriones que contienen I4 e I1a. La expresión de mCherry en los extremos axónicos de las células bipolares se detectó en la capa de células ganglionares (figuras 5A y 5D), así como la expresión en los cuerpos celulares bipolares en la capa nuclear interna (figuras 5B y 5D). Las figuras 5C y 5F demuestran la tinción con mCherry vista desde secciones verticales retinianas. Por tanto, la figura 5 muestra que ambos constructos promotores de mGluR6 optimizados expresaban eficaz y selectivamente el transgén en células bipolares en las retinas de ratones. Además, se demostró que el nivel de expresión de I1a era de dos a tres veces mayor que el de I4.

[0224] Ejemplo 3: Direccionamiento de la expresión transgénica

[0225] El análisis de inmunotinción adicional demostró el direccionamiento de la expresión transgénica por los promotores optimizados de mGluR6. Específicamente, las secciones retinianas de montaje completo obtenidas tal como se describe en el ejemplo 2 se cotiñeron con anti-PKC. La tinción de mCherry y PKC en el montaje completo retiniano se muestran en las figuras 6A y 6B, respectivamente, mientras que la tinción en secciones verticales se muestra en las figuras 6D y 6E, respectivamente. Las imágenes combinadas en las figuras 6C y 6F muestran que el comarcaje entre las células que expresan mCherry impulsadas por mGluR6 y las células que expresan PKC en hasta el 58 % de las células bipolares de bastones. Estos resultados indican que el mGluR6 optimizado es capaz de dirigir la expresión transgénica a células bipolares de bastones después de la inyección intravítrea.

[0226] Otras realizaciones

[0227] Aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

[0228] La patente y la bibliografía científica a la que se hace referencia en el presente documento establecen el conocimiento que está disponible para los expertos en la técnica.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

1. Molécula de ácido nucleico aislado que comprende

a. el intrón 4 del gen del receptor metabotrópico de glutamato 6 modificado (mGluR6) o una variante del mismo al menos el 70 % idéntica a SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8

b. el intrón 3 del gen de mGluR6 o una variante del mismo al menos el 70 % idéntica a SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10;

c. potenciador de mGluR6 o una variante del mismo al menos el 70 % idéntica a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y

d. un promotor de mGluR6 o una variante del mismo al menos el 70 % idéntica a SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6;

en donde el intrón 4 del gen de mGluR6 está en el sentido de 5’ del intrón 3;

en donde el intrón 3 del mGluR6 está en el sentido de 5’ del potenciador de mGluR6;

y en donde el potenciador de mGluR6 está en el sentido de 5’ del promotor de mGluR6.

2. Molécula de ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, en donde dicho potenciador de mGluR6 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, en donde dicho promotor de mGluR6 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6, en donde dicho intrón 4 del gen de mGluR6 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, y en donde dicho intrón 3 del gen de mGluR6 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10.

3. Vector de expresión de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2 operativamente unida a al menos un transgén.

4. Vector de expresión de ácido nucleico según la reivindicación 3, en donde el vector es un vector de virus adenoasociado o un vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV).

5. Vector de expresión de ácido nucleico según la reivindicación 4, en donde el vector es un vector recombinante AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, o AAV12.

6. Vector de expresión de ácido nucleico según la reivindicación 5, en donde el vector comprende una proteína de cápside que comprende al menos una mutación.

7. Vector de expresión de ácido nucleico según la reivindicación 6, en donde dicha al menos una mutación se selecciona del grupo que consiste en:

una tirosina (Y) a fenilalanina (F) en la posición de aminoácido 444;

una tirosina (Y) a fenilalanina (F) en la posición de aminoácido 730;

una tirosina (Y) a fenilalanina (F) en las posiciones de aminoácidos 272, 444, 500, y 730;

una treonina (T) a valina (V) en la posición 491 de aminoácido; y

una tirosina (Y) a fenilalanina (F) en las posiciones de aminoácidos 272, 444, 500, 730, y una treonina (T) a valina (V) en la posición de aminoácido 491

en donde las posiciones de aminoácidos corresponden a posiciones de aminoácidos de la proteína de cápside de AAV.

8. Vector de expresión de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en donde la proteína de la cápside comprende un inserto peptídico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, y SEQ ID NO: 37.

9. Vector de expresión de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde el al menos un transgén es un gen de opsina.

10. Vector de expresión de ácido nucleico según la reivindicación 9, en donde dicho gen de opsina se

selecciona del grupo que consiste en canalrodopsina, melanopsina, opsina pineal, fotopsinas, halorodopsina, bacteriorodopsina, proteorodopsina, o cualquier variante funcional o fragmento de las mismas.

11. Vector de expresión de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4-10, en donde el transgén codifica para un producto génico que aumenta la sensibilidad a la luz, aumenta la detección de luz, aumenta la fotosensibilidad, aumenta el potencial evocado visual, o restablece la visión en una retina.

12. Composición farmacéutica que comprende el vector de expresión de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4-11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. Vector de expresión de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4-11, para su uso en un método para mejorar o restablecer la visión en un sujeto.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, para su uso en un método para mejorar o restablecer la visión en un sujeto.