ES3058841T3

ES3058841T3 - Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy

Info

Publication number: ES3058841T3
Application number: ES19187938T
Authority: ES
Inventors: Michael C Milone; Enxiu Wang
Original assignee: Novartis AG; University of Pennsylvania Penn
Current assignee: Novartis AG; University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-15
Publication date: 2026-03-13
Anticipated expiration: 2034-03-15
Also published as: EP3623380A1; US20180022795A1; US20140322183A1; US9745368B2; EP2970426B1; US11919946B2; EP4696718A2; EP2970426A2; EP3623380B1; US20240343783A1; US20210079073A1; ES2769574T3; WO2014145252A3; US10640553B2; WO2014145252A2

Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para regular la especificidad y la actividad de las células T. En una realización, la invención proporciona un tipo de receptor de antígeno quimérico (CAR), denominado "KIR-CAR", que comprende un componente de un receptor presente de forma natural en las células asesinas naturales (NK). En una realización, el receptor NK incluye, entre otros, un receptor activador e inhibidor natural de las células NK, conocido como receptor tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Direccionamiento de células citotóxicas con receptores quiméricos para inmunoterapia adoptiva ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] Con el uso de tecnologías de transferencia génica, los linfocitos T pueden modificarse genéticamente para expresar de manera estable dominios de unión a anticuerpos en su superficie que dotan a los linfocitos T de especificidades que son independientes de las restricciones impuestas por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Los receptores quiméricos para el antígeno (CAR) representan proteínas sintéticas expresadas en linfocitos T (linfocitos T-CAR) que fusionan un fragmento de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, un scFv o fragmento de región variable monocatenaria) con un dominio intracelular de la cadena CD3-zeta. Tras la interacción con una célula diana que expresa el antígeno afín de scFv, los CAR expresados en linfocitos T pueden desencadenar la activación de linfocitos T que conduce a la destrucción de células diana (también denominada lisis de células diana). Cuando se combinan con señales coestimuladoras adicionales tales como el dominio intracelular de CD137 o CD28, estos receptores también son capaces de generar proliferación. Sin embargo, parte de esta proliferación parece ser independiente del antígeno, a diferencia de las respuestas normales del receptor de linfocitos T (TCR) (Milone et al., 2009, Mol Ther 17(8):1453-64). Los receptores artificiales no reproducen completamente la transducción de señales intracelulares producida por la unión de TCR natural al péptido antigénico complejado con moléculas de MHC (Brocker, 2000, Blood 96(5):1999-2001). Los defectos de señalización pueden limitar la supervivencia a largo plazo de los linfocitos T-CAR tras la transferencia adoptiva en ausencia de altos niveles de citocinas como IL-2 (Lo et al., 2010, Clin Cancer Res 16(10):2769-80). También tienen una regulación alterada que podría ser beneficiosa en algunas aplicaciones antineoplásicas (Loskog et al., 2006, Leukemia 20(10):1819-28), pero estos defectos reguladores también conducen a desafíos potenciales para controlar su actividad "fuera de la diana" contra tejidos normales que también expresan antígeno, incluso a niveles extremadamente bajos. Estos efectos "fuera de la diana" son una limitación grave de los agentes terapéuticos basados en CAR, y han dado como resultado muertes probables durante la evaluación temprana de la fase I de linfocitos T modificados con CAR (Morgan et al., 2010, Mol Ther 18(4):843-51).

[0004] Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de enfoques alternativos para construir CAR que superen las limitaciones a los agentes terapéuticos basados en CAR actuales. La presente invención aborda esta necesidad insatisfecha en la técnica.

[0005] Zhang et al., J. Immunol. 2012; 189:2290-2299 informa que un receptor antigénico quimérico basado en NKp30 promueve funciones efectoras celulares y eficacia antitumoral in vivo. Vivier et al., International Immunology 1992; 4:1313-1323 divulga la función de señalización de las isoformas del complejo del receptor CD16:ζ:γ. Biassoni et al., 2008; Capítulo 4 en: "Multichain Immune Recognition Receptor Signaling", vol.640, pág.35-52, se refiere a receptores de linfocitos citolíticos naturales. Varla-Leftherioti et al., Tissue Antigens, 2007; 69:297-393 aborda si el intercambio de alelo HLA entre parejas o el repertorio de receptores similares a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos (KIR) maternos está asociado con el aborto espontáneo recurrente (AER) y el fracaso de la implantación repetida después de la fecundación in vitro (FIV)/transferencia de embriones. Borszcz et al., Eur J. Immunol.2003; 33:1084-1093 informa que el enriquecimiento de KIR en la interfase célula efectora-diana es más sensible que la señalización a la fuerza de unión del ligando.

[0006] SUMARIO

[0007] La presente invención proporciona un receptor quimérico para el antígeno del receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos inhibidores (CAR-KIRinh) purificado, o de origen no natural, que comprende: (i) un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de una molécula de anticuerpo o que comprende un armazón no de anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a un antígeno diana en una célula; (ii) un dominio transmembranario; y (iii) un dominio citoplasmático que contiene ITIM.

[0008] La presente invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh de la invención. También se proporciona una célula citotóxica que comprende un ácido nucleico de la invención. La presente invención también proporciona un método de preparación de la célula citotóxica de la invención, que comprende: (i) introducir en una célula citotóxica un ácido nucleico de la invención; o (ii) formar en una célula citotóxica un CAR-KIRinh de la invención.

[0009] También se proporciona una célula citotóxica de la invención, en donde la célula comprende además un receptor quimérico para el antígeno del receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos activadores (CAR-KIRact), para su uso en: (i) terapia; o (ii) un método de tratamiento de un sujeto. Además, se proporciona una célula citotóxica de la invención para su uso en un método de tratamiento del cáncer, en donde la célula comprende además un CAR-KIRact, y en donde: (i) el CAR-KIRact se dirige a un primer antígeno que se expresa por el cáncer; y (ii) el CAR-KIRinh se dirige a un segundo antígeno que no se expresa por el cáncer o un antígeno que se expresa más altamente en una célula no cancerosa, con respecto a una célula cancerosa del mismo tipo que la célula no cancerosa.

[0010] DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0011] La información técnica que se expone a continuación puede ir en algunos aspectos más allá del alcance de la invención, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier referencia a aspectos o realizaciones que no estén comprendidos en el alcance de las reivindicaciones tiene únicamente fines ilustrativos.

[0012] La información técnica adicional se proporciona para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Además, no se debe interpretar que referencias secundarias a métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y los métodos de diagnóstico realizados en el cuerpo humano o animal constituyen una reivindicación de protección para dicho método tal cual, sino que deben ser consideradas como una referencia a productos, en particular sustancias o composiciones, para su uso en cualquiera de estos métodos.

[0013] La divulgación se refiere en general a un CAR-NKR purificado, o de origen no natural, que comprende uno, dos o todos de un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembranario, por ejemplo, un dominio transmembranario de NKR, y un dominio citoplasmático, por ejemplo, un dominio citoplasmático de NKR.

[0014] Un CAR-NKR puede comprender un dominio de unión a antígeno extracelular; un dominio transmembranario y un dominio citoplasmático de NKR. Un CAR-NKR puede comprender un CAR-KIR, por ejemplo, un CAR-KIRact o CAR-KIRinh, un CAR-NCR, por ejemplo, un CAR-NCRact, un CAR-SLAMF, por ejemplo, un CAR-SLAMFinh, un CAR-FcR, por ejemplo, CAR-CD16, por ejemplo, un CAR-CD16act o CAR-CD64, por ejemplo, un CAR-CD64act, o un CAR-Ly49, por ejemplo, un CAR-Ly49act o CAR-Ly49inh. La invención se refiere a un CAR-NKR purificado, o de origen no natural, que es un receptor quimérico para el antígeno del receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos inhibidores (CAR-KIRinh). Un CAR-NKR puede comprender un dominio transmembranario y un dominio de unión a antígeno extracelular, y que comprende además un dominio bisagra dispuesto entre dicho dominio transmembranario y dicho dominio de unión a antígeno extracelular. La invención se refiere a un CAR-KIRinh purificado, o de origen no natural, que comprende (i) un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de una molécula de anticuerpo o que comprende un armazón no de anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a un antígeno diana en una célula; (ii) un dominio transmembranario; y (iii) un dominio citoplasmático que contiene ITIM.

[0015] La divulgación también se refiere a un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico purificado o de origen no natural, por ejemplo, un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN o ARN, por ejemplo, un ARNm, que comprende una secuencia que codifica un CAR-NKR descrito en el presente documento. El ácido nucleico de la invención comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, el ácido nucleico comprende además una secuencia que codifica una molécula adaptadora o dominio de señalización intracelular que interactúa con dicho CAR-NKR.

[0016] La divulgación incluye una célula citotóxica, por ejemplo, una línea de linfocitos T, células NK de origen natural o no natural o de linfocitos T citotóxicos o células NK que comprende un CAR-NKR descrito en el presente documento. La célula citotóxica de la invención comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, la célula citotóxica comprende además una molécula adaptadora o dominio de señalización intracelular que interactúa con dicho CAR-NKR.

[0017] La divulgación también proporciona un método de preparación de una célula citotóxica, por ejemplo, una línea de linfocitos T, células NK de origen natural o no natural o de linfocitos T citotóxicos o células NK que comprende un CAR-NKR, descrito en el presente documento, que comprende introducir en una célula citotóxica un ácido nucleico, por ejemplo, un ARNm, que comprende una secuencia que codifica un CAR-NKR, descrito en el presente documento. El método puede comprender además preparar un CAR-NKR, descrito en el presente documento, en la célula citotóxica. En un método de la invención, el método comprende (i) introducir en una célula citotóxica un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones adjuntas; o (ii) formar en una célula citotóxica, un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0018] También se divulga tratar a un sujeto, por ejemplo, proporcionar una inmunidad antitumoral en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula citotóxica, por ejemplo, una línea de linfocitos T, células NK de origen natural o no natural o de linfocitos T citotóxicos o células NK que comprende un CAR-NKR descrito en el presente documento. Por ejemplo, la invención proporciona una célula citotóxica de la invención, en donde la célula comprende además un receptor quimérico para el antígeno del receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos activadores (CAR-KIRact), para su uso en: (i) terapia; o (ii) un método de tratamiento de un sujeto.

[0019] La divulgación presenta un CAR-KIR purificado, o de origen no natural, que comprende un dominio de unión a antígeno extracelular y un dominio transmembranario, por ejemplo, un dominio transmembranario de KIR, o dominio citoplasmático, por ejemplo, un dominio citoplasmático que contiene ITIM o un dominio citoplasmático de KIR. En un caso, el CAR-KIR comprende un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembranario y un dominio citoplasmático que contiene ITIM, o un dominio citoplasmático KIR. La invención proporciona un receptor quimérico para el antígeno del receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos inhibidores purificado, o de origen no natural, (CAR-KIRinh) que comprende (i) un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de una molécula de anticuerpo o que comprende un armazón no de anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a un antígeno diana en una célula; (ii) un dominio transmembranario; y (iii) un dominio citoplasmático que contiene ITIM.

[0020] En una realización, dicho dominio transmembranario puede interactuar con, por ejemplo, unirse a, el dominio transmembranario de DAP12. En una realización, dicho dominio transmembranario comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo aminoacídico que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, cadena lateral. En una realización, dicho dominio transmembranario comprende un dominio transmembranario de KIR. En una realización, dicho CAR-KIR comprende un dominio transmembranario de KIR. En la invención, dicho CAR-KIR es un CAR-KIR inhibidor. En una realización, dicho CAR-KIR comprende un dominio citoplasmático de KIR. En una realización, dicho CAR-KIR comprende un dominio de unión a antígeno extracelular y un dominio transmembranario, por ejemplo, un dominio transmembranario que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo aminoacídico que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, cadena lateral o un dominio transmembranario de KIR.

[0021] En una realización, un CAR-KIR descrito en el presente documento comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un scFv. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno comprende un nanocuerpo. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno comprende un dominio VHH de camélido. La invención proporciona un receptor quimérico para el antígeno del receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos inhibidores purificado, o de origen no natural, (CAR-KIRinh) que comprende (i) un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de una molécula de anticuerpo o que comprende un armazón no de anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a un antígeno diana en una célula; (ii) un dominio transmembranario; y (iii) un dominio citoplasmático que contiene ITIM.

[0022] En una realización, un CAR-KIR descrito en el presente documento comprende un dominio bisagra extracelular. En una realización, el dominio bisagra extracelular es distinto de un dominio bisagra de KIR, por ejemplo, distinto de un dominio bisagra de KIR2DS2. En una realización, el dominio bisagra extracelular deriva de una molécula natural. En una realización, el dominio bisagra extracelular deriva de una molécula natural distinta de un KIR. En una realización, el dominio bisagra extracelular comprende una secuencia polipeptídica de origen no natural. En una realización, el dominio bisagra extracelular comprende la bisagra extracelular de CD8-alfa humano. En una realización, el dominio bisagra extracelular comprende una bisagra extracelular sintética. En una realización, el dominio bisagra extracelular tiene menos de 50, 20 o 10 aminoácidos de longitud. En una realización, el dominio bisagra extracelular tiene menos aminoácidos que un dominio bisagra KIR2DS2.

[0023] Algunas realizaciones de la invención usan un CAR-KIR que es un CAR-KIRact. Por ejemplo, una célula citotóxica de la invención puede comprender además un CAR-KIRact. En una realización, dicho CAR-KIRact comprende un dominio transmembranario que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, un residuo aminoacídico que comprende un resto cargado positivamente, por ejemplo, una cadena lateral cargada positivamente o un dominio transmembranario de KIRact. En una realización, dicho CAR-KIRact puede interactuar la señalización de un polipéptido que contiene ITAM o molécula adaptadora y promoverla. En una realización, dicho CAR-KIRact puede interactuar con la señalización a partir de un polipéptido DAP12 y promoverla. En una realización, dicho CAR-KIRact comprende un dominio D de KIR. En una realización, dicho CAR-KIRact comprende un dominio D1 de KIR. En una realización, dicho CAR-KIRact comprende un dominio D2 de KIR. En una realización, dicho CAR-KIRact no comprende un dominio D de KIR. En una realización, dicho CAR-KIRact comprende un dominio transmembranario KIR2DS2. En una realización, dicho CAR-KIRact comprende además un dominio citoplasmático KIR2DS2. En una realización, dicho CAR-KIRact no comprende un dominio D de KIR.

[0024] En una realización, el dominio de unión a antígeno de un CAR-KIR descrito en el presente documento se une a un antígeno presente en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno se une a un antígeno que está más expresado en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa, que una célula no diana, por ejemplo, una célula no cancerosa, por ejemplo, una célula no cancerosa del mismo tipo que la célula diana. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno se une a un antígeno descrito en el presente documento.

[0025] En una realización, la invención proporciona un CAR-KIR purificado o de origen no natural que es un CAR-KIRinh. En una realización, el CAR-KIRinh comprende un dominio transmembranario de KIRinh. El CAR-KIRinh de la invención comprende un dominio citoplasmático que contiene ITIM, por ejemplo, un dominio citoplasmático de KIRinh, por ejemplo, un dominio citoplasmático KIR2DL o KIR3DL. En una realización, el CAR-KIRinh comprende un dominio transmembranario distinto de un dominio transmembranario de KIR, por ejemplo, un dominio transmembranario de receptores PD-1, CTLA4 o que contienen ITIM de las familias de genes ILT (CD85), Siglec, LMIR (CD300) y/o SLAM de receptores. En una realización, el CAR-KIRinh comprende un dominio citoplasmático de un receptor inhibidor distinto de un KIR, por ejemplo, de receptores PD-1, CTLA4 o que contienen ITIM de las familias de genes ILT (CD85), Siglec, LMIR (CD300) y/o SLAM de receptores. En una realización, el CAR-KIRinh comprende un dominio transmembranario y citoplasmático de un receptor inhibidor distinto de un KIR, por ejemplo, dominio transmembranario y citoplasmático, independientemente, por ejemplo, de receptores PD-1, CTLA4 o que contienen ITIM de las familias de genes ILT (CD85), Siglec, LMIR (CD300) y/o SLAM de receptores. En una realización, dicho dominio citoplasmático comprende un ITIM. En una realización, el CAR-KIRinh comprende un dominio D de KIR. En una realización, el CAR-KIRinh comprende un dominio D0 de KIR. En una realización, el CAR-KIRinh comprende un dominio D1 de KIR. En una realización, el CAR-KIRinh comprende un dominio D2 de KIR. En una realización, el CAR-KIRinh no comprende un dominio D de KIR.

[0026] En una realización, el dominio de unión a antígeno de los CAR-KIRinh descritos en el presente documento se une a un antígeno no presente en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno se une a un antígeno que se expresa más altamente en una célula no diana, por ejemplo, una célula no cancerosa, que una célula diana, por ejemplo, célula cancerosa, por ejemplo, una célula cancerosa del mismo tipo que la célula diana. En una realización, dicho dominio de unión a antígeno se une a desmogleína 1/3 (DSG1/3). En un caso, se proporciona un CARinh, por ejemplo, un TCARinh o CAR-NKRinh, por ejemplo, un CAR-KIRinh, y un CARact, por ejemplo, un TCARact o CAR-NKRact, por ejemplo, un CAR-KIRact, en el que el CARinh comprende un dominio de unión a antígeno que se dirige a desmogleína 1/3 (DSG1/3) y el CARact comprende un dominio de unión a antígeno que se dirige a un antígeno distinto de DSG1/3, por ejemplo, EGFR. Algunas realizaciones de la invención utilizan una célula citotóxica que comprende un ácido nucleico que codifica un CAR-KIRinh de la invención, y que comprende un CAR-KIRact. En una realización, este par se usa para tratar un cáncer que expresa EGFR, por ejemplo, un adenocarcinoma de pulmón o colon. En una realización, las células cancerosas expresan menos DSG1/3 que las células no cancerosas. En una realización, esta combinación puede minimizar el ataque mediado por CAR de células de la piel o células escamosas del tubo GI (es decir, mucosa oral). En una realización, dicho dominio de unión a antígeno se une a un receptor de efrina o una claudina.

[0027] En otro aspecto, la divulgación presenta un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico purificado o de origen no natural, por ejemplo, un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN o ARN, por ejemplo, un ARNm, que comprende (a) una secuencia que codifica un CAR-KIR, por ejemplo, un primer CAR-KIR descrito en el presente documento. En una realización, dicho CAR-KIR, por ejemplo, dicho primer CAR-KIR, es un CAR-KIRinh, por ejemplo, un CAR-KIRinh descrito en el presente documento. El ácido nucleico de la invención comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, dicho ácido nucleico comprende una secuencia de ADN. En una realización, dicho ácido nucleico comprende una secuencia de ARN, por ejemplo, una secuencia de ARNm.

[0028] En un caso, dicho ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un CAR-KIR, por ejemplo, un CAR-KIRact, y la secuencia que codifica una molécula inhibidora que comprende: un dominio citoplasmático de KIRinh; un dominio transmembranario, por ejemplo, un dominio transmembranario de KIR; y un dominio citoplasmático inhibidor, por ejemplo, un dominio ITIM, por ejemplo, un dominio ITIM de KIRinh. El ácido nucleico de la invención comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, la molécula inhibidora es un KIRinh de origen natural o una secuencia que comparte al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 o 99 % de homología con, o que no difiere en más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 residuos de, un KIRinh de origen natural.

[0029] En una realización, dicho ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un CAR-KIR, por ejemplo, un CAR-KIRact, y la secuencia que codifica una molécula inhibidora que comprende: un dominio citoplasmático de la familia SLAM; un dominio transmembranario, por ejemplo, un dominio transmembranario de la familia SLAM; y un dominio citoplasmático inhibidor, por ejemplo, un dominio de la familia SLAM, por ejemplo, un dominio ITIM de la familia SLAM. En una realización, la molécula inhibidora es un miembro de la familia SLAM de origen natural o una secuencia que comparte al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 o 99 % de homología con, o que no difiere en más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 residuos de, un miembro de la familia SLAM de origen natural.

[0030] En una realización, dicho ácido nucleico descrito en el presente documento comprende además (b) una secuencia que codifica un segundo CAR-KIR descrito en el presente documento, por ejemplo, un segundo CAR-KIR que es diferente de dicho primer CAR-KIR. En una realización, (a) y (b) se disponen en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo, el mismo vector, por ejemplo, el mismo vector vírico, por ejemplo, un vector lentivírico. En una realización, uno de (a) y (b) está dispuesto en una primera molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un primer vector, por ejemplo, un vector vírico, por ejemplo, un vector lentivírico, y el otro está dispuesto en una segunda molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un segundo vector, por ejemplo, un vector vírico, por ejemplo, un vector lentivírico. En una realización, dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un CAR-KIRinh. En una realización, una de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un CAR-KIRact, y el otro es un CAR-KIRinh. En una realización, dicho CAR-KIRact es un CAR-KIRact descrito en el presente documento. En un caso, dicho CAR-KIRinh es un CAR-KIRinh descrito en el presente documento. En un caso, el ácido nucleico descrito en el presente documento comprende un CAR-KIRact descrito en el presente documento y un CAR-KIRinh descrito en el presente documento. La invención se refiere a un CAR-KIRinh como se describe en las reivindicaciones adjuntas.

[0031] En una realización, el ácido nucleico comprende además (c) secuencia que codifica un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, una molécula adaptadora, que puede producir una señal activadora. En una realización, dicho dominio de señalización intracelular comprende un motivo ITAM. En una realización, dicha secuencia codifica un polipéptido DAP 12 que comprende un dominio de señalización intracelular DAP 12. En una realización, dicho polipéptido DAP 12 comprende además un dominio transmembranario. En una realización, dicho polipéptido DAP 12 comprende además un dominio extracelular. En una realización, cada uno de (a),

[0032] (b) y (c) están presentes en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector, por ejemplo, un vector vírico, por ejemplo, un vector lentivírico. En una realización, uno de (a), (b) y (c) está codificado en una primera molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector, por ejemplo, un vector vírico, por ejemplo, un vector lentivírico y un segundo y tercero de (a), (b) y (c) están codificados en una segunda molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector, por ejemplo, un vector vírico, por ejemplo, un vector lentivírico. En una realización (a) está presente en una primera molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector, por ejemplo, un vector vírico, por ejemplo, un vector lentivírico y (b) y (c) están presentes en una segunda molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector, por ejemplo, un vector vírico, por ejemplo, un vector lentivírico. En otra realización, (b) está presente en una primera molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector, por ejemplo, un vector vírico, por ejemplo, un vector lentivírico y (a) y (c) están presentes en una segunda molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector, por ejemplo, un vector vírico, por ejemplo, un vector lentivírico. En una realización, (c) está presente en una primera molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector, por ejemplo, un vector vírico, por ejemplo, un vector lentivírico y (b) y (a) están presentes en una segunda molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un vector, por ejemplo, un vector vírico, por ejemplo, un vector lentivírico. En una realización, cada uno de (a), (b) y (c) está presente en diferentes moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, diferentes vectores, por ejemplo, vectores víricos, por ejemplo, vectores lentivíricos.

[0034] En una realización, (i) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR no comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, (ii) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un scFv, y el otro es distinto de un scFv, (iii) cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión a antígeno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv, (iv) donde, cuando están presentes en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer CAR-KIR a su antígeno afín no se reduce sustancialmente por la presencia de dicho segundo CAR-KIR, (v) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III, (vi) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III, (vii) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo, o (viii) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un scFv, y el otro comprende un dominio VHH de camélido.

[0036] En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR no comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un scFv, y el otro es distinto de un scFv.

[0038] En una realización, cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión a antígenos de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv. En una realización, cuando están presentes en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer CAR-KIR a su antígeno afín no se ve reducida de manera sustancial por la presencia de dicho segundo CAR-KIR. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un scFv, y el otro comprende un dominio VHH de camélido.

[0040] En una realización, el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un TCAR. En una realización, dicho TCAR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio citoplasmático activador del complejo de receptor de linfocitos T con CD3, por ejemplo, cadena zeta de CD3, cadena épsilon de CD3, cadena gamma de CD3, cadena delta de CD3. En una realización, dicho TCAR comprende un dominio coestimulador del receptor coestimulador, por ejemplo, CD28, CD137, CD27, ICOS u OX40.

[0041] En una realización, (i) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho CAR-KIR y dicho TCAR no comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, (ii) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho CAR-KIR y dicho TCAR es un scFv, y el otro es distinto de un scFv, (iii) cuando están presente en la superficie de una célula, los dominios de unión a antígeno de dicho CAR-KIR y dicho TCAR se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv, (iv) cuando están presentes en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho CAR-KIR a su antígeno afín no se reduce sustancialmente por la presencia de dicho segundo TCAR, (v) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho CAR-KIR y dicho TCAR comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III, (vi) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho CAR-KIR y dicho TCAR es un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III, (vii) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho CAR-KIR y dicho TCAR es un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo, o (viii) en donde el dominio de unión a antígeno de uno de dicho CAR-KIR y dicho TCAR es un scFv, y el otro comprende un dominio VHH de camélido. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho CAR-KIR y dicho TCAR no comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada.

[0043] En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho CAR-KIR y dicho TCAR es un scFv, y el otro es distinto de un scFv. En una realización, cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión a antígenos de dicho CAR-KIR y dicho TCAR se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv. En una realización, cuando están presentes en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho CAR-KIR a su antígeno afín no se ve reducida de manera sustancial por la presencia de dicho segundo TCAR. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho CAR-KIR y dicho TCAR comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho CAR-KIR y dicho TCAR es un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho CAR-KIR y dicho TCAR es un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho CAR-KIR y dicho TCAR es un scFv, y el otro comprende un dominio VHH de camélido.

[0045] En otro aspecto, la divulgación presenta una célula citotóxica, por ejemplo, una línea de linfocitos T, células NK de origen natural o no natural o de linfocitos T citotóxicos o célula de una línea de células NK, por ejemplo, NK92, que comprende (a) un primer CAR-KIR descrito en el presente documento. En una realización, dicha célula citotóxica es un linfocito T. En una realización, dicha célula citotóxica es una célula NK. En una realización, dicha célula citotóxica es de una línea de células NK, por ejemplo, una célula NK92. En un caso, dicho primer CAR-KIR es un CAR-KIRact descrito en el presente documento. En un caso, dicho primer CAR-KIR es un CAR-KIRinh descrito en el presente documento. Una célula citotóxica de la invención comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0047] En un caso, dicha célula citotóxica comprende un CAR-KIR, por ejemplo, un CAR-KIRact, y una molécula inhibidora que comprende: un dominio citoplasmático de KIRinh; un dominio transmembranario, por ejemplo, un dominio transmembranario de KIR; y un dominio citoplasmático inhibidor, por ejemplo, un dominio ITIM, por ejemplo, un dominio ITIM de KIRinh. Una célula citotóxica de la invención comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones adjuntas, que comprende un dominio citoplasmático que contiene ITIM. En una realización, la molécula inhibidora es un KIRinh de origen natural o una secuencia que comparte al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 o 99 % de homología con, o que no difiere en más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 residuos de, un KIRinh de origen natural.

[0049] En un caso, dicha célula citotóxica comprende un CAR-KIR, por ejemplo, un CAR-KIRact, y una molécula inhibidora que comprende: un dominio citoplasmático de la familia SLAM; un dominio transmembranario, por ejemplo, un dominio transmembranario de la familia SLAM; y un dominio citoplasmático inhibidor, por ejemplo, un dominio de la familia SLAM, por ejemplo, un dominio ITIM de la familia SLAM. En una realización, la molécula inhibidora es un miembro de la familia SLAM de origen natural o una secuencia que comparte al menos un 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 o 99 % de homología con, o que no difiere en más de 1, 2, 3, 4, 5. Una célula citotóxica de la invención comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0051] En una realización, la célula citotóxica comprende además (b) un segundo CAR-KIR descrito en el presente documento, por ejemplo, un segundo CAR-KIR que es diferente de dicho primer CAR-KIR. En una realización, uno de dicho CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un CAR-KIRact y el otro es un CAR-KIRinh. En una realización, dicho CAR-KIRact es un CAR-KIRact descrito en el presente documento. En un caso, uno de dicho CAR-KIRinh es un CAR-KIRinh descrito en el presente documento. En una realización, la célula citotóxica descrita en el presente documento comprende CAR-KIRact descrito en el presente documento y un CAR-KIRinh descrito en el presente documento. Una célula citotóxica de la invención comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones adjuntas. En algunas realizaciones, la célula citotóxica comprende además un CAR-KIRact.

[0053] En una realización, la célula citotóxica comprende además un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, una molécula adaptadora, que puede producir una señal activadora, por ejemplo, que es exógena a dicha célula, que puede producir una señal activadora. En una realización, dicho dominio de señalización intracelular comprende un motivo ITAM. En una realización, dicho dominio de señalización intracelular comprende un polipéptido DAP 12 que comprende un dominio de señalización intracelular DAP 12. En una realización, dicho polipéptido DAP 12 comprende además un dominio transmembranario. En una realización, dicho polipéptido DAP 12 comprende además un dominio extracelular.

[0055] En una realización, una célula citotóxica comprende un primer y segundo CAR-KIR descritos en el presente documento en donde (i) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR no comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, (ii) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un scFv, y el otro es distinto de un scFv, (iii) cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión a antígeno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv, (iv) cuando están presentes en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer CAR-KIR a su antígeno afín no se reduce sustancialmente por la presencia de dicho segundo CAR-KIR, (v) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III, (vi) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III, (vii) en donde el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo, o (viii) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VHH de camélido.

[0057] En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR no comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un scFv, y el otro es distinto de un scFv. En una realización, cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión a antígenos de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv. En una realización, cuando están presentes en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer CAR-KIR a su antígeno afín no se ve reducida de manera sustancial por la presencia de dicho segundo CAR-KIR. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VHH de camélido.

[0059] En una realización, una célula citotóxica comprende CAR-KIR como se describen en el presente documento y comprende además un TCAR. En una realización, dicho TCAR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio de estimulación primaria. En una realización, dicho TCAR comprende un dominio de coestimulación.

[0061] En un caso, la célula citotóxica, por ejemplo, una línea de linfocitos T, células NK de origen natural o no natural o de linfocitos T citotóxicos o células NK, por ejemplo, una célula NK92, comprende un ácido nucleico como se describe en el presente documento; o un CAR-KIR codificado por un ácido nucleico descrito en el presente documento. Una célula citotóxica de la invención comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, dicha célula citotóxica es un linfocito T. En una realización, dicha célula citotóxica es una célula NK. En una realización, dicha célula citotóxica es de una línea de células NK, por ejemplo, NK92.

[0063] En otro aspecto, la divulgación presenta métodos de preparación de una célula descrita en el presente documento que comprenden introducir en una célula citotóxica un ácido nucleico descrito en el presente documento en dicha célula. En un caso, dicho método comprende formar en una célula citotóxica un CAR-KIR como se describe en el presente documento. Un método de la invención comprende: (i) introducir en una célula citotóxica un ácido nucleico como se define en las reivindicaciones adjuntas; o (ii) formar en una célula citotóxica un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0065] En otro aspecto, la divulgación se refiere a tratar a un sujeto, por ejemplo, proporcionar una inmunidad antitumoral en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula descrita en el presente documento. La invención presenta una célula citotóxica que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones adjuntas, en donde la célula comprende además un CAR-KIRact, para su uso en (i) terapia; o (ii) un método de tratamiento de un sujeto. En una realización, dicha célula es autóloga. En una realización, dicha célula es alógena. En una realización, la célula es un linfocito T, por ejemplo, un linfocito T autólogo. En una realización, la célula es un linfocito T alógeno. En una realización, la célula es una célula NK, por ejemplo, una célula NK autóloga. En una realización, la célula es un linfocito T alógeno. En una realización, la célula es una célula de una línea de células NK, por ejemplo, NK92. En una realización, dicho mamífero es un ser humano. En una realización, el método comprende además evaluar dicho mamífero, por ejemplo, ser humano, para un efecto secundario de dicho tratamiento. En una realización, dicho efecto secundario comprende síndrome de dificultad respiratoria aguda, neutropenia febril, hipotensión, encefalopatía, transaminitis hepática, convulsiones, o síndrome de activación de macrófagos. En una realización, el método comprende además tratar dicho ser humano que tiene un efecto secundario con un agente anti-citocina, por ejemplo, un antagonista del factor de necrosis tumoral, por ejemplo, una fusión de TNF-Ig, por ejemplo, etanercept, un antagonista de IL-6, por ejemplo, un antagonista del receptor de IL-6, por ejemplo, un anticuerpo anti-receptor de IL6, por ejemplo, tocilizumab, o un corticosteroide. En una realización, el tratamiento comprende administrar un anticuerpo anti-receptor de IL6 a dicho ser humano. En una realización, el método comprende tratar a un mamífero, por ejemplo, un ser humano, que tiene una enfermedad asociada con la expresión de mesotelina o CD19. En una realización, el método comprende tratar a un mamífero, por ejemplo, un ser humano, que tiene un trastorno asociado con la proliferación celular no deseada, por ejemplo, cáncer. En una realización, dicho trastorno es carcinoma pancreático, mesotelioma, carcinoma pulmonar, carcinoma ovárico, leucemia o linfoma.

[0067] En otro aspecto, la divulgación se refiere a una célula que comprende, por ejemplo, una célula citotóxica que comprende un primer receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural que comprende un dominio de unión a antígeno y un segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural que comprende un dominio de unión a antígeno, en donde (i) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural no comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio de cadena pesada, (ii) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural comprende un scFv, y el otro es distinto de un scFv, (iii) cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión a antígeno de dicho primer y dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv, (iv) cuando están presentes en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural a su antígeno afín no se reduce sustancialmente por la presencia de dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural, (v) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina de tipo III, (vi) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina de tipo III, (vii) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural comprende un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo, y (viii) el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural integrado comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VHH de camélido. En un caso, dicha célula es un linfocito T. En un caso, dicha célula es una célula NK. En un caso, dicha célula es una línea de células NK, por ejemplo, NK92. En un caso, uno de dicho primer y dicho segundo receptores quiméricos integrados en membrana de origen no natural es un TCAR. En un caso, tanto dicho primer como dicho segundo receptores quiméricos integrados en membrana de origen no natural es un TCAR. En un caso, uno de dicho primer y dicho segundo receptores quiméricos integrados en membrana de origen no natural es un CAR-NKR, por ejemplo, un CAR-KIR. En una realización, tanto dicho primer como dicho segundo receptores quiméricos integrados en membrana de origen no natural es un CAR-NKR, por ejemplo, un CAR-KIR. En un caso, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural no comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada. En un caso, cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión al antígeno de dicho primer y dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv. En un caso, cuando están presentes en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural a su antígeno afín no se ve reducida de manera sustancial por la presencia de dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural. En un caso, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina tipo III. En un caso, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo receptores quiméricos integrados en la membrana no naturales comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, por ejemplo, una molécula similar al anticuerpo de fibronectina de tipo III. En un caso, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural comprende un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo. En un caso, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VHH de camélido. En un caso, la divulgación comprende un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico purificado o de origen no natural, que comprende una secuencia que codifica un primer y segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural que comprende un dominio de unión a antígeno descrito en el presente documento. En un caso, la divulgación comprende un método de preparación de una célula descrita en el presente documento que comprende introducir en una célula el ácido nucleico descrito en el presente documento. En un caso, la divulgación comprende un método de preparación de una célula descrita en el presente documento, que comprende formar en una célula citotóxica un primer y dicho segundo receptor quimérico integrado en membrana de origen no natural descrito en el presente documento. En un caso, la divulgación se comprende un método de tratamiento de un sujeto por ejemplo, un método de proporcionar una inmunidad antitumoral en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula descrita en el presente documento.

[0069] En otro aspecto, la divulgación presenta un kit que comprende una célula o ácido nucleico descrito en el presente documento.

[0071] En otro aspecto, la divulgación se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un CAR-KIR (receptor quimérico para el antígeno similar al receptor de inmunoglobulina de linfocitos citolíticos), en donde la secuencia de ácido nucleico aislada comprende la secuencia de ácido nucleico de un dominio de unión a antígeno y un KIR o fragmento del mismo. En un caso, el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo murino, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico y un fragmento del mismo. En un caso, el fragmento es un Fab o un scFv. En una realización, el KIR se selecciona del grupo que consiste en un KIR activador, un KIR inhibidor y cualquier combinación de los mismos. La invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh como se define en las reivindicaciones. En un caso, se ha eliminado al menos una región bisagra del KIR del KIR activador.

[0073] En otro aspecto, la divulgación se refiere a un CAR-KIR aislado (receptor quimérico para el antígeno del receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos) que comprende un dominio de unión a antígeno y un KIR o fragmento del mismo. En un caso, el dominio de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo murino, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico y un fragmento del mismo. En una realización, el fragmento es un Fab o un scFv. En un caso, el KIR se selecciona del grupo que consiste en un KIR activador, un KIR inhibidor y cualquier combinación de los mismos. En un caso, se ha eliminado al menos una región bisagra del KIR del KIR activador.

[0075] En otro aspecto, la divulgación se refiere a una composición que comprende al menos dos CAR-KIR, en donde el primer CAR-KIR comprende un dominio de unión a antígeno y un KIR activador o fragmento del mismo y el segundo CAR-KIR comprende un dominio de unión a antígeno y un KIR inhibidor o fragmento del mismo. En un caso, el dominio de unión a antígeno en el primer CAR-KIR es específico para un antígeno presente en un tumor y el dominio de unión a antígeno en el segundo CAR-KIR es específico para un antígeno presente en una célula normal.

[0077] En otro aspecto, la divulgación incluye un linfocito T modificado genéticamente que comprende al menos dos CAR-KIR, en donde el primer CAR-KIR comprende un dominio de unión a antígeno y un KIR activador o fragmento del mismo y el segundo CAR-KIR comprende un dominio de unión a antígeno y un KIR inhibidor o fragmento del mismo. En un caso, el dominio de unión a antígeno en el primer CAR-KIR es específico para un antígeno presente en un tumor y el dominio de unión a antígeno en el segundo CAR-KIR es específico para un antígeno presente en una célula normal. En un caso, la célula es un linfocito T.

[0079] En otro aspecto, se refiere proporcionar una inmunidad antitumoral en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula que comprende al menos dos CAR-KIR, en donde el primer CAR-KIR comprende un dominio de unión a antígeno y un KIR activador o fragmento del mismo y el segundo CAR-KIR comprende un dominio de unión a antígeno y un KIR inhibidor o fragmento del mismo. En un caso, el dominio de unión a antígeno en el primer CAR-KIR es específico para un antígeno presente en un tumor y el dominio de unión a antígeno en el segundo CAR-KIR es específico para un antígeno presente en una célula normal, controlando de este modo la actividad fuera de la diana de la célula. En un caso, la célula es un linfocito T.

[0080] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0082] La siguiente descripción detallada de los ejemplos preferidos de la divulgación se entenderá mejor cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. Con el fin de ilustrar la invención, en los dibujos se muestran ejemplos que actualmente son los preferidos. Se debe entender, sin embargo, que la divulgación no se limita a las disposiciones e instrumentalidades precisas de los ejemplos mostrados en los dibujos. La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. La Figura 1, que comprende las Figuras 1A y 1B, es una serie de esquemas que muestran la estructura de los KIR inhibidores y activadores de origen natural (Figura 1A) y un CAR-KIR activador basado en scFv (Figura 1B).

[0083] La Figura 2 es una representación esquemática del vector lentivírico usado para suministrar un CAR basado en KIR activador en combinación con la molécula de señalización DAP12.

[0084] La Figura 3 es una imagen que muestra que un CAR-KIRact específico para mesotelina se puede expresar de manera eficiente en la superficie de linfocitos T humanos primarios. Los linfocitos T humanos se estimularon con microperlas anti-CD3/anti-CD28 y se transdujeron con el CAR indicado o simulado transducido y expandido ex vivo. La expresión se detectó usando una IgG policlonal específico de cabra anti-F(ab)2 de ratón biotinilado (Jackson Immunologics) seguida de tinción con estreptavidina-PE.

[0085] La Figura 4 es una imagen que muestra que los linfocitos T que expresan el CAR-KIRact SS1 presentaron actividad citotóxica hacia células K562 diana modificadas para expresar el ligando de mesotelina (KT-meso). Los linfocitos T humanos se estimularon con microperlas anti-CD3/anti-CD28, se transdujeron con el CAR indicado o se transdujeron y expandieron de forma simulada ex vivo. Se incubaron 10<5>células K562 marcadas con CFSE que expresan mesotelina (KT-meso) o K562 de control naturales con relaciones variables de linfocitos T que expresan CAR durante 16 horas a 37 °C, 5 % de CO<2>. A continuación, las células diana K562 se enumeraron mediante citometría de flujo usando perlas Countbright y una tinción de viabilidad (7AAD). El porcentaje de células K562 lisadas (porcentaje de lisis) se calculó restando el número de células diana viables restantes después de la incubación con linfocitos T efectores del número de K562 viables restantes después del cultivo durante la noche sin linfocitos T efectores, y después dividiendo por el número de K562 viables restantes después del cultivo durante la noche sin linfocitos T efectores.

[0086] La Figura 5, que comprende la Figura 5A y 5B, es una serie de esquemas que muestran un CAR-KIR activador en el que se retiró la bisagra KIR2DS2 (CAR KIR2S). Basándose en el modelo de segregación cinética de activación de TCR representado en la Figura 5A, se cree que el CAR-KIR SS1 específico para mesotelina tiene una bisagra que es demasiado larga para permitir una segregación apropiada. Por lo tanto, se cree que hacer que la bisagra de CAR-KIR específica para mesotelina sea más corta mejora la función. La Figura 5B es un esquema que muestra que el scFv SS1 se fusionó al dominio transmembranario de KIR sin los dos dominios similares a Ig de KIR2DS2 como bisagra. La Figura 6, que comprende las Figuras 6A y 6B, es una serie de imágenes que muestran que el CAR KIRS2 basado en scFv SS1 presenta una actividad citolítica mejorada hacia células diana que expresan mesotelina en comparación con el CAR formado por fusión del scFv SS1 en KIR2DS2 natural de longitud completa. Los linfocitos T humanos primarios se estimularon con microperlas CD3/28 seguida de transducción lentivírica con CAR-KIR activador SS1-KIR2DS2, CAR-KIR activador SS1-KIRS2 o CAR SS1-zeta. Se usaron linfocitos T simulados no transducidos (NTD) como control. Los linfocitos T se expandieron hasta el final del crecimiento de la fase logarítmica. La expresión en superficie de los CAR específicos para SS1 se determinó mediante citometría de flujo usando un anticuerpo policlonal específico de cabra anti-F(ab)2 de ratón biotinilado seguida de detección de estreptavidina-PE como se muestra en la Figura 6A. En la Figura 6B, células K562 diana con o sin mesotelina y teñidas con CFSE se mezclaron con los linfocitos T efectores caracterizados en la Figura 6A como se indica usando relaciones variables de linfocitos T efectores respecto a diana que variaban de 10:1 a 1:1. La lisis de células K562 diana se evaluó usando citometría de flujo para determinar el % de células CFSE+ viables, como se describe para la Figura 4. Los datos mostrados son el % calculado de lisis de células diana en comparación con células diana sin células efectoras.

[0087] La Figura 7, que comprende las Figuras 7A y 7B, es una serie de imágenes que muestran la coexpresión del CAR-KIRact CD19 y el CAR-KIRinh SS1. Se transdujeron células indicadoras Jurkat NFAT-GFP con el CAR-KIR indicado o no transducidas (NDT) y se mezclaron 1:1 con células diana con o sin los antígenos CD19 y mesotelina como se indica. Los resultados muestran la expresión de GFP a las 24 horas después de mezclar células Jurkat y diana (Figura 7A). La Figura 7B muestra la expresión en superficie de los idiotipos mesotelina y CD19 según se determina mediante tinción con una proteína de fusión mesotelina-Fc y un anticuerpo monoclonal específico para el idiotipo scFv FMC63 anti-CD19.

[0088] La Figura 8, que comprende las Figuras 8A a 8C, es una serie de imágenes que muestran la coexpresión de PD-1 natural con tanto un CAR basado en KIR activador como CAR basado en TCR-zeta dirigido a mesotelina. Los linfocitos T humanos primarios se estimularon con microperlas CD3/28 seguida de transducción lentivírica con CAR-KIR activador SS1-KIRS2 o CAR SS1-zeta. Se usaron células simuladas no transducidas (NTD) como control negativo. Los linfocitos T se expandieron durante 9 días y la expresión de CAR superficial se determinó mediante tinción con mesotelina-Fc seguida de un anticuerpo específico de cabra anti-Fc humano conjugado con PE (Figura 8A). Se tiñeron líneas celulares K562 (de origen natural [wt], que expresan mesotelina [meso] o que coexpresan mesotelina y PD-L1 [meso-PDL1]) usando el anticuerpo monoclonal específico anti-mesotelina CAK1 para confirmar la expresión de mesotelina en las dianas (Figura 8B). Los linfocitos T humanos primarios transducidos como se muestra en la Figura 8A se sometieron a electroporación con 10 ug de ARN transcrito in vitro que codifica PD1 natural usando un electroporador BTX ECM830 (PD1+) o se transfectado de forma simulada (PD1-). La expresión en superficie de PD-1 se expresó usando un monoclonal anti-PD1 conjugado con APC (Figura 8C).

[0089] La Figura 9 es una imagen que muestra que la combinación de la coexpresión de PD-1 natural con tanto un CAR basado en KIR activador como un CAR basado en TCR-zeta dirigido a mesotelina condujo a la inhibición dependiente del ligando 1 de PD-1 (PDL-1) de la citotoxicidad de CAR-KIR activador específica de mesotelina. Los linfocitos T humanos primarios se estimularon con microperlas CD3/28 seguida de transducción lentivírica con el CAR-KIR activador SS1-KIRS2, el CAR SS1-zeta o se transdujeron de forma simulada (NTD). Los linfocitos T se expandieron durante 9 días seguida de electroporación de 5×10<6>linfocitos T con 10 ug de ARN transcrito in vitro que codifica PD1 natural usando un electroporador BTX ECM830 (PD1+) o se transdujeron de forma simulada (PD1-). La expresión superficial del CAR específico para SS1 y PD-1 se determinó como se muestra en la Figura 8. Las células diana K562 sin mesotelina o que expresan mesotelina con o sin PDL-1 se mezclaron con las diferentes condiciones de linfocitos T como se indica usando relaciones variables de linfocitos T efectoras respecto a diana de 30:1 a 1:1 como se muestra. Se evaluó la lisis de células K562 diana usando un método de colorante de calceína AM para cuantificar las células viables restantes después de 4 horas de incubación. Los datos mostrados se calculan en % de lisis de células diana en comparación con células diana sin células efectoras.

[0090] La Figura 10 es una imagen que demuestra la producción de interferón-gamma (IFN-y) por parte de linfocitos T de dos donantes diferentes que expresan un CAR basado en KIR activador específico de mesotelina (SS1-KIR2DS2 o SS1-KIRS2) o CAR basado en TCR-zeta con o sin un dominio coestimulador (SS1-z, SS1-28z o SS1-BBZ). Los linfocitos T humanos primarios se estimularon con microperlas CD3/28 seguida de transducción lentivírica con el CAR-KIR activador indicado o CAR basado en TCR-zeta. Se usaron células simuladas no transducidas (NTD) como control negativo. Las células diana K562 sin mesotelina (K562) o que expresaban mesotelina (K562-meso) se mezclaron con las diferentes condiciones de linfocitos T como se indica con una relación de 2:1 de linfocitos T efectores respecto a células diana. Después de 16 horas de incubación, se midió IFN-y en los sobrenadantes de cultivo usando un ensayo ELISA específico de IFN-gamma humano (R&D Systems).

[0091] La Figura 11 es una imagen que demuestra la producción de interleucina-2 (IL-2) por parte de linfocitos T que expresan un CAR basado en KIR activador específico para mesotelina (SS1-KIR2DS2 o SS1-KIRS2) o CAR basado en TCR-zeta con o sin un dominio coestimulador (SS1-z, SS1-28z o SS1-BBZ). Los linfocitos T humanos primarios se estimularon con microperlas CD3/28 seguida de transducción lentivírica con el CAR-KIR activador indicado o CAR basado en TCR-zeta. Se usaron células simuladas no transducidas (NTD) como control negativo. Las células diana K562 sin mesotelina (K562) o que expresaban mesotelina (K562-meso) se mezclaron con las diferentes condiciones de linfocitos T como se indica con una relación de 2:1 de linfocitos T efectores respecto a células diana. Después de 16 horas de incubación, se midió IL-2 en los sobrenadantes del cultivo usando un ensayo ELISA específico para IL-2 humana (R&D systems).

[0092] La Figura 12, que comprende las Figuras 12A-12B, representa la construcción de un linfocito T manipulado con receptor quimérico para el antígeno basado en KIR (CAR-KIR) específico para mesotelina con una actividad citotóxica robusta. Los linfocitos T humanos primarios se estimularon con microperlas CD3/28 seguida de transducción con un vector lentivírico que expresa GFP y dsRed (control) o DAP12 y dsRed (DAP12). Las células se expandieron ex vivo hasta el final del crecimiento de la fase logarítmica. Se electroporaron 5×10<6>linfocitos T de cada población transducida con 10 ug de ARN transcrito in vitro que codifica SS1-KIRS2 usando un electroporador BTX ECM830. La expresión de dsRed y SS1-KIRS2 se evaluó mediante citometría de flujo con SS1-KIRS2 detectado usando un anticuerpo policlonal específico de cabra anti-F(ab)2 de ratón biotinilado seguida de estreptavidina-PE. El panel superior de la Figura 12A muestra la estrategia de selección para la identificación de linfocitos T que expresan dsRed, que luego se analizaron para la expresión de SS1-KIRS2 como se muestra en la parte inferior del panel. La Figura 12B muestra la capacidad de las células caracterizadas en la Figura 12A para mediar la citotoxicidad contra células K562 naturales (K562-wt) o células K562 que expresan mesotelina (K562-mesotelina) como se evalúa usando un ensayo de liberación de<51>Cr de 4 h.

[0093] La Figura 13 muestra que la expresión de un TCR endógeno no se ve afectada por la expresión de SS1-KIRS2 y DAP12. Se electroporaron 5×10<6>linfocitos T humanos primarios con 10 ug de ARN transcrito in vitro que codifica SS1-KIRS2 o se transfectaron de forma simulada usando un electroporador BTX ECM830. Después de incubación durante la noche, los linfocitos T transfectados se tiñeron para la expresión de SS1-KIRS2 usando un anticuerpo policlonal específico de cabra anti-F(ab)2 de ratón biotinilado seguida de estreptavidina-PE. La expresión de Vβ13.1 se evaluó usando un anticuerpo monoclonal conjugado con PE específico para esta cadena Vβ del TCR.

[0094] La Figura 14 ilustra la capacidad de un CAR basado en KIR específico para mesotelina (SS1-KIRS2) para estimular la proliferación de linfocitos T que es dependiente del antígeno pero independiente de la coestimulación de CD28 adicional. Los linfocitos T humanos primarios se estimularon con microperlas CD3/28 seguida de transducción lentivírica de SS1-KIRS2 y DAP12 o el CAR TCR-zeta específico para mesotelina (SS1-zeta). Se usaron células simuladas no transducidas (NTD) como control negativo. Las células diana K562 sin mesotelina (K562 WT) o que expresaban mesotelina (K562-mesotelina) se mezclaron con las diferentes condiciones de linfocitos T como se indica con una relación de 2:1 de linfocitos T efectores respecto a células diana. Los linfocitos T estimulados con K562-mesotelina se dividieron adicionalmente en una condición con o sin un anticuerpo agonista anti-CD28 monoclonal (clon 9.3) a 1 ug/ml. El número de linfocitos T viables se enumeró mediante citometría de flujo usando recuento basado en perlas en los momentos de tiempo indicados para calcular el número de duplicaciones de población después de la estimulación con antígeno.

[0095] La Figura 15, que comprende las Figuras 15A-15C, muestra que los linfocitos T modificados con CAR-KIR específicos para mesotelina muestran una actividad antitumoral mejoradain vivoen comparación con CAR basados en TCR-ζ de segunda generación que portan dominios coestimuladores CD28 o CD137 (4-1BB). La Figura 15A muestra un experimento en el que se implantaron ratones NOD-SCID-γ<c>-/-

(NSG) por vía subcutánea con una célula derivada de mesotelioma que expresa mesotelina (células EM-meso).20 días después del implante tumoral, a cada animal se le inyectó por vía intravenosa 7 millones de linfocitos T que se estimularon con perlas estimuladoras anti-CD3/anti-CD28 seguida de transducción lentivírica con una serie de CAR basado en CD3ζ con o sin un dominio coestimulador (SS1-ζ, SS1-BBζ y SS1-28ζ) o los CAR basados en KIR específicos de mesotelina, SS1-KIRS2 con DAP12. Se usaron linfocitos T transducidos de forma simulada (NTD) como control. El volumen tumoral se evaluó mediante medición de calibre. Se analizaron 8 animales para cada condición de linfocitos T. La Figura 15B muestra que la actividadin vivodel CAR-KIR es independiente del injerto de linfocitos T en sangre, bazo o tumor. La frecuencia de linfocitos T CD45+ humanos se evaluó al final del experimento mediante citometría de flujo, y los datos se expresan como un porcentaje de células viables totales en la sangre, bazo y tumor digerido. La Figura 15C muestra que los linfocitos T modificados con DAP12 requieren el CAR basado en KIR específico para mesotelina para la erradicación tumoral. Se usó el mismo modelo que el mostrado en la Figura 15A. Se inyectaron por vía intravenosa 4 millones de linfocitos T que expresaban DAP12 y DsRed (DAP12), SS1-28z o SS1-KIRS2 y DAP12 (SS1-KIRS2) el día 20, y el volumen tumoral se evaluó a lo largo del tiempo mediante medición de calibre.

[0096] La Figura 16, que comprende las Figuras 16A-16B, muestra que un CAR basado en KIR con especificidad para CD19 puede desencadenar citotoxicidad de células diana específica para antígeno. Después de la activación de perlas anti-CD3/anti-CD28, se transdujeron linfocitos T con un vector lentivírico bicistrónico que expresa DAP12 junto con un CAR basado en KIR específico para CD19 en el que el scFv derivado de FMC63 se fusiona con KIR2DS2 de longitud completa (CD19-KIR2DS2) o un CAR basado en KIR generado fusionando el scFv de FMC63 con el dominio transmembranario y citoplasmático de KIR2DS2 a través de un conector corto [Gly]<4>-Ser (CD19-KIRS2). Los linfocitos T transducidos se cultivaron hasta el final del crecimiento de la fase logarítmica, y la expresión del CAR basado en KIR específico para CD19 se evaluó mediante citometría de flujo usando un anticuerpo policlonal de cabra anti-F(ab)<2>de ratón biotinilado seguida de SA-PE. Las células diana K562 marcadas con<51>Cr con (K562-CD19) o sin (K562-wt) expresión de CD19 se mezclaron en proporciones variables con linfocitos T respecto a células diana (relación E:T). La citotoxicidad se determinó midiendo la fracción de<51>Cr liberada en el sobrenadante a las 4 horas. Los linfocitos T de control que se transdujeron de forma simulada (NTD) o se transdujeron con un CAR basado en CD3ζ específico para CD19 (CD19-z) también se incluyeron como controles negativos y positivos, respectivamente.

[0097] La Figura 17, que comprende las Figuras 17A-17B, muestra la actividadin vivode CD19-KIRS2. Se injertaron ratones NOD-SCID-γ<c>-/-

(NSG) por vía intravenosa mediante inyección en la vena de la cola el día 0 de 1 millón de células tumorales NALM-6 CBG, una línea celular leucémica que expresa CD19. Los linfocitos T se estimularon con perlas estimuladoras anti-CD3/anti-CD28 seguida de transducción lentivírica el día 1 con una serie de CAR basado en CD3ζ específico para CD19 con o sin un dominio coestimulador (CD19z, 19BBz) o los CAR basados en KIR específicos para CD19, CD19-KIRS2 con DAP12 (19KIRS2). Se usaron linfocitos T simulados no transducidos (NTD) como control. Los linfocitos T se expandieron hasta el final del crecimiento en fase logarítmica ex vivo y se inyectaron por vía intravenosa el día 5 después de la inyección de la línea celular leucémica con 2 millones de linfocitos T-CAR por ratón. La carga tumoral se evaluó mediante obtención de imágenes bioluminiscentes. Se analizaron 5 animales para cada condición de linfocitos T. La Figura 17A muestra el flujo de fotones bioluminiscentes individual para animales individuales el día 5 (valor basal antes de la inyección de linfocitos T) y el día 15 después del injerto de células leucémicas. La Figura 17B muestra la mediana del flujo total para cada grupo de tratamiento a lo largo del tiempo. La Figura 18 muestra que un CAR NCR basado en NKp46 con especificidad para mesotelina desencadena la citotoxicidad específica del antígeno. Después de la activación de perlas anti-CD3/anti-CD28, se transdujeron linfocitos T con un vector lentivírico bicistrónico que expresa DAP12 y SS1-KIRS2 (control), o FcεRγ y un CAR basado en NKp46 específico para mesotelina (SS1-NKp46) o FcεRγ y un CAR NKp46 específico para mesotelina en el que el dominio extracelular de NKp46 natural se truncó (SS1-TNKp46). La expresión de los CAR específicos para mesotelina se evaluó mediante citometría de flujo usando un anticuerpo policlonal de cabra anti-F(ab)2 de ratón biotinilado seguida de SA-PE como se muestra en la Figura 18A. Los linfocitos T se mezclaron con células diana K562 marcadas con<51>Cr que expresaban mesotelina en proporciones variables de linfocitos T efectores respecto a células K562 diana (relación E:T). La citotoxicidad se determinó midiendo la fracción de<51>Cr liberada en el sobrenadante a las 4 horas en comparación con la liberación espontánea como se muestra en la Figura 18B.

[0098] La Figura 19 muestra una representación gráfica de los receptores usados en los Experimentos mostrados en las Figuras 21-23.

[0099] La Figura 20 muestra la generación y caracterización de una línea celular K562-meso que expresa el ligando HLA-Cw de KIR2DL3. Se transdujeron células K562 (K562) o células K562 que expresaban mesotelina (K562-meso) con el alelo HLA-Cw3 seguida de clasificación celular activada por fluorescencia para obtener células K562 que expresaban HLA-Cw con (K562-meso-HLACw) o sin (K562-HLACw) expresión de mesotelina. La expresión de HLA-Cw3 se evaluó mediante citometría de flujo usando un anticuerpo monoclonal conjugado con APC que reconoce los alelos HLA-A, B y C (clon W6/32).

[0100] La Figura 21 muestra la coexpresión de SS1-KIRS2 y KIR2DL3 en linfocitos T humanos primarios. Los linfocitos T humanos primarios se estimularon con microperlas CD3/28 seguida de transducción lentivírica con SS1-KIRS2 y DAP12 (SS1-KIRS2) o se transdujeron de forma simulada (NTD) en combinación con KIR2DL3 natural. Los linfocitos T se expandieron hasta el final del crecimiento de la fase logarítmica. La expresión en superficie del CAR específico para mesotelina y KIR2DL3 se determinó mediante tinción con mesotelina-Fc seguida de anticuerpo de cabra anti-Fc humano conjugado con PE y un anticuerpo monoclonal contra el ectodominio KIR2DL3.

[0101] La Figura 22 muestra que KIR2DL3 coexpresado con un CAR-KIR puede suprimir la citotoxicidad específica de antígeno en presencia de HLA-Cw en las células diana. Los linfocitos T que se generaron y caracterizaron como se describe en la Figura 21 se mezclaron con células K562 diana marcadas con 51-Cr que se generaron y caracterizaron como se describe en la Figura 22. La citotoxicidad se determinó midiendo la fracción de<51>Cr liberado en el sobrenadante a las 4 horas en comparación con las células diana sin células efectoras.

[0102] La Figura 23 muestra una representación gráfica de los receptores usados en los Experimentos mostrados en la Figuras 24.

[0103] La Figura 24 muestra la incapacidad de coexpresar dos receptores quiméricos basados en scFv en la superficie del linfocito T mientras se conserva la especificidad de unión respectiva de cada receptor. Los linfocitos T Jurkat se transdujeron usando un vector lentivírico que codifica SS1-KIR2DL3. Estas células se transdujeron posteriormente con un segundo vector lentivírico que codifica CD19-KIR2DS2 en diluciones variables del vector. La expresión del scFv específico para SS1 se evaluó usando mesotelina-Fc seguida de cabra-anti-Fc humano conjugado con PE. La expresión de scFv específica para CD19 se evaluó usando un anticuerpo monoclonal conjugado con PE específico para el idiotipo FMC63.

[0104] La Figura 25 es una imagen que muestra que la expresión de un CAR específico para CD19 también redujo la expresión de sitios de unión a mesotelina en la superficie de células que coexpresan un CAR de fusión SS1-zetamCherry. Los linfocitos T humanos primarios se estimularon con microperlas CD3/28 seguida de transducción lentivírica con un scFv zeta CAR SS1 que portaba una fusión de mCherry carboxiterminal (SS1z-mCh) o el CAR 41BB-zeta específico para CD19 derivado de FMC63 (19bbz) solo o combinación. Se usaron células transducidas de forma simulada como control. Los linfocitos T se expandieron hasta el final del crecimiento de la fase logarítmica, y se determinó la expresión de dsRed así como de CAR de superficie mediante citometría de flujo después de la tinción con mesotelina-Fc seguida de un anticuerpo policlonal específico de cabra-anti-Fc humano conjugado con FITC. La Figura 26 es una imagen que muestra que la expresión mutuamente excluyente de sitios de unión para el scFv SS1 no es exclusiva para el scFv de FMC63. Los linfocitos T humanos primarios se estimularon con microperlas CD3/28 seguida de transducción lentivírica con un CAR de scFv zeta SS1 o varios CAR 41BB-zeta específicos para CD19 (19BBz [FMC63 scFv, 214d scFv o los CAR de scFv BL22 con orientaciones VH y VL alternativas [H2L y L2H]). NTD representa células transducidas de forma simulada usadas como control de tinción. Además, se cotransdujeron un conjunto separado de linfocitos T con el CAR de scFv zeta SS1 y los diferentes CAR específicos para CD19 como anteriormente. Los linfocitos T se expandieron hasta el final del crecimiento de la fase logarítmica, y la expresión de CAR en superficie se determinó mediante tinción con proteína L biotinilada (reconoce la cadena ligera kappa) seguida de estreptavidina APC simultáneamente con mesotelina-Fc seguida de un anticuerpo policlonal específico de cabra anti-Fc humano conjugado con PE. Las células cotransducidas mostraron que la expresión mutuamente excluyente observada con el CAR basado en FMC63 también se observa con otros scFv-CAR.

[0105] La Figura 27, que comprende las Figuras 27A-27B, representa el posible mecanismo para la pérdida de la unión de scFv cuando dos moléculas scFv se coexpresan en la superficie celular (Figura 27A) y la supuesta evitación de esta interacción cuando un CAR basado en un dominio VHH único de camélido se expresa en una superficie de linfocitos T en combinación con un CAR basado en scFv.

[0106] La Figura 28 muestra que un CAR basado en un dominio VHH único de camélido se puede expresar en una superficie de linfocitos T en combinación con un CAR basado en scFv sin interacción apreciable con el receptor. Se transdujeron linfocitos T Jurkat que expresan GFP bajo un promotor dependiente de NFAT (NF-GFP) con un CAR activante específico para mesotelina (SS1-CAR), un CAR activante específico para CD19 (19-CAR) o un CAR generado usando un dominio VHH de camélido específico para EGFR (VHH-CAR). Después de la transducción con el CAR activante, las células se transdujeron con un CAR inhibidor adicional que reconoce CD19 (19-PD1) para generar células que coexpresan tanto el CAR activante como el inhibidor (SS1+19PD1, 19+19PD1 o VHH+19PD1). Los linfocitos T Jurkat transducidos se cocultivaron durante 24 horas con diferentes líneas celulares que están 1) desprovistas de todos los antígenos diana (K562), 2) expresan mesotelina (K-meso), CD19 (K-19) o EGFR (A431) únicamente, 3) expresan una combinación de EGFR y mesotelina (A431-mesotelina) o CD19 (A431-CD19) o 4) expresan una combinación de CD19 y mesotelina (K-19/meso). Condiciones adicionales que incluyen células sin estimulador (sin estim.) o K562 con 1 ug/ml de OKT3 (OKT3) también se incluyeron como controles negativos y positivos para la activación de NFAT, respectivamente. La expresión de GFP, como marcador de la activación de NFAT, se evaluó mediante citometría de flujo.

[0107] La Figura 29 muestra una anotación de secuencia de KIR2DS2.

[0108] La Figura 30 muestra una anotación de secuencia de KIR2DL3.

[0109] La Figura 31 muestra una anotación de secuencia de NKp46.

[0110] La Figura 32 muestra una anotación de secuencia SS1-KIRS2.

[0111] La Figura 33 muestra una anotación de secuencia SS1-KIR2DS2.

[0112] La Figura 34 muestra una anotación de secuencia SS1-tNKp46.

[0113] La Figura 35 muestra una anotación de secuencia SS1-KIRL3.

[0115] DESCRIPCIÓN DETALLADA ADICIONAL

[0117] En un aspecto, la presente divulgación se refiere a composiciones y métodos de regulación de la especificidad y actividad de linfocitos T, u otras células citotóxicas, por ejemplo, células NK. En un caso, en el presente documento se describe un receptor quimérico para el antígeno (un CAR), por ejemplo, un CAR del receptor de células NK (un CAR-NKR) basado en un receptor de células NK (un NKR), por ejemplo, un CAR-KIR, un CAR-NCR, un CAR-SLAMF, un CAR-FcR o un CAR-Ly49. La divulgación se refiere a un tipo de receptor quimérico para el antígeno (CAR) en donde el CAR se denomina un NKR, por ejemplo, un "CAR-KIR", que es un diseño de CAR que comprende un componente de un receptor encontrado en linfocitos citolíticos naturales (NK). En un caso, el receptor NK incluye, pero sin limitación, un receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos (KIR). Los KIR pueden funcionar como un KIR activador o como un KIR inhibidor.

[0119] Una ventaja de los CAR-NKR, por ejemplo, CAR-KIR, de la divulgación es que un CAR-NKR, por ejemplo, un CAR-KIR proporciona un método de regulación de la especificidad de células citotóxicas, por ejemplo, linfocitos T, para controlar la actividad fuera de la diana del linfocito T manipulado. En algunos casos, los CAR-KIR de la divulgación no requieren una coestimulación para proliferar.

[0120] Los CAR-NKR pueden suministrar una señal a través de una proteína adaptadora, por ejemplo, una proteína adaptadora que contiene ITAM. Los CAR-KIR divulgados en el presente documento y para su uso en algunas realizaciones de la invención pueden comprender un KIR activador que suministra su señal a través de una interacción con la proteína de membrana que contiene motivo de activación basado en inmunotirosina (ITAM), DAP12, que está mediada por residuos dentro de los dominios transmembranarios de estas proteínas.

[0122] Un CAR-NKR puede suministrar una señal inhibidora por medio de un motivo inhibidor. En una realización, los CAR-KIR de la invención comprenden un KIR inhibidor que suministra su señal a través de una interacción con los motivos inhibidores basados en inmunotirosina (ITIM). Por consiguiente, un CAR-KIRinh purificado, o de origen no natural, de la invención comprende un dominio citoplasmático que contiene ITIM. Los KIR que portan dominios citoplasmáticos que contienen ITIM suprimen la señal activadora que conduce a la inhibición de la actividad citolítica de NK y productora de citocinas. Sin embargo, la divulgación no debe limitarse a los KIR inhibidores. En su lugar, cualquier proteína inhibidora que tenga un dominio citoplasmático que esté asociado con una señal inhibidora puede usarse en la construcción de los CAR de la divulgación.

[0124] Por consiguiente, la divulgación proporciona una composición que comprende un CAR-NKR, por ejemplo, un CAR-KIR, vectores que comprenden los mismos, composiciones que comprenden un CAR-NKR, por ejemplo, un CAR-KIR, vectores encapsidados en partículas víricas, y linfocitos T recombinantes u otras células citotóxicas que comprenden un CAR-NKR, por ejemplo, un CAR-KIR. La divulgación también incluye métodos de preparación de un linfocito T modificado genéticamente u otra célula citotóxica, por ejemplo, una célula NK o una célula NK cultivado, por ejemplo, una célula NK92, que expresa un CAR-NKR, por ejemplo, un CAR-KIR (CAR-KIRT), en donde el CAR-NKR expresado, por ejemplo, un CAR-KIR, comprende un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico con una molécula de señalización intracelular de un NKR, por ejemplo, un KIR. Por ejemplo, en algunos casos, la molécula de señalización intracelular incluye, pero sin limitación, un KIR ITAM, un KIR ITIM y similares. La invención proporciona un receptor quimérico para el antígeno del receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos inhibidores purificado, o de origen no natural, (CAR-KIRinh) que comprende (i) un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de una molécula de anticuerpo o que comprende un armazón no de anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a un antígeno diana en una célula; (ii) un dominio transmembranario; y (iii) un dominio citoplasmático que contiene ITIM.

[0126] Por consiguiente, la divulgación proporciona composiciones y métodos de regulación de la especificidad y actividad de linfocitos T u otras células citotóxicas modificadas para expresar un CAR-NKR, por ejemplo, un CAR-KIR. La presente divulgación también proporciona células que comprenden una pluralidad de tipos de CAR-NKR, por ejemplo, CAR-KIR (por ejemplo, CAR-NKR activadores, por ejemplo, CAR-KIR y CAR-NKR inhibidores, por ejemplo, un CAR-KIR), en donde la pluralidad de tipos de CAR-NKR, por ejemplo, CAR-KIR, participan en la señalización para regular la activación de linfocitos T. En este aspecto, es beneficioso controlar y regular eficazmente las células citotóxicas CAR-NKR, por ejemplo, linfocitos T-CAR-KIR, de modo que destruyan células tumorales sin afectar a células espectadoras normales. Por lo tanto, en una realización, la presente invención también proporciona métodos de destrucción de células cancerosas mientras se minimiza el agotamiento de células no cancerosas normales, mejorando de este modo la especificidad de una terapia CAR-NKR, por ejemplo, una terapia CAR-KIR. En algunas realizaciones, la invención utiliza una célula citotóxica que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh de la invención, y que comprende un CAR-KIRact.

[0128] El enfoque de CAR-NKR, por ejemplo, CAR-KIR, puede incluir la separación física de una pluralidad de tipos de CAR expresados en una célula, en donde la unión de una pluralidad de tipos de CAR-NKR, por ejemplo, CAR-KIR a su antígeno diana es necesaria para la activación de la célula citotóxica de CAR-NKR, por ejemplo, linfocito T-CAR-KIR. Por ejemplo, en la estrategia CAR-KIR, cada CAR-KIR de la pluralidad de tipos de CAR-KIR tiene un dominio de señalización intracelular diferente. Por ejemplo, cuando se usa una pluralidad de tipos de CAR-KIR para inducir la activación de linfocitos T-CAR-KIR, el primer tipo de CAR-KIR solo puede comprender un dominio intracelular de un KIR activador y el segundo tipo de CAR solo puede comprender un dominio intracelular de un KIR inhibidor. De esta manera, la activación condicional de los linfocitos T se genera mediante el acoplamiento del CAR-KIR activador (CAR-KIRact) a un antígeno en una célula maligna de interés. Un CAR-KIR inhibidor (CAR-KIRinh) que porta un resto de unión a antígeno dirigido contra un antígeno que está presente en una célula normal, pero no maligna, proporciona amortiguación de los efectos activadores del CAR-KIRact cuando el linfocito T encuentra células normales.

[0130] En un caso, la presente divulgación proporciona un linfocito T u otra célula citotóxica diseñada para expresar al menos dos CAR-NKR, por ejemplo, al menos dos CAR-KIR, en donde el primer CAR-NKR, por ejemplo, un CAR-KIR es un CAR-NKRact, por ejemplo, un CAR-KIRact, y el segundo CAR-NKR, por ejemplo, un CAR-KIR, es un CAR-NKRinh, por ejemplo, un CAR-KIRinh. En algunas realizaciones, la invención utiliza una célula citotóxica que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh de la invención, y que comprende un CAR-KIRact. En una realización, la invención proporciona un CAR-NKRinh, por ejemplo, un CAR-KIRinh, en donde la unión del CAR-NKRinh, por ejemplo, un CAR-KIRinh, a una célula normal da como resultado la inhibición de la célula citotóxica, por ejemplo, la inhibición de la actividad de linfocitos T-CAR-KIR. En una realización, la unión del CAR-NKRinh, por ejemplo, un CAR-KIRinh, a un antígeno asociado con una célula no cancerosa da como resultado la muerte de la célula citotóxica CAR-NKR, por ejemplo, un linfocito T-CAR-KIR.

[0131] En una realización, un CAR-NKRinh de la invención se puede usar en combinación con CAR existentes con el fin de regular la actividad de los CAR. Se han descrito CAR a modo de ejemplo en el documento de patente PCT/US11/64191. También se ha descubierto que, en células que tienen una pluralidad de receptores quiméricos integrados en membrana (CMER) que comprenden un dominio de unión a antígeno, las interacciones entre el dominio de unión a antígeno de los CMER pueden ser no deseables, por ejemplo, debido a que la interacción inhibe la capacidad de uno o más de los dominios de unión a antígeno para unirse a su antígeno afín, o podría generar sitios de unión novedosos con antígeno afín desconocido. En consecuencia, en el presente documento se divulgan células que tienen un primer y un segundo CMER de origen no natural, en donde los dominios de unión a antígeno minimizan dichas interacciones. También se divulgan en el presente documento ácidos nucleicos que codifican un primer y un segundo CMER de origen no natural, así como métodos de preparación y uso de dichas células y ácidos nucleicos. En un caso, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer y dicho segundo CMER de origen no natural comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo.

[0132] DEFINICIONES

[0133] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la técnica a la que se refiere la invención. Aunque en la práctica y/o prueba de la presente invención se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, en el presente documento se describen los materiales y métodos preferidos. Al describir y reivindicar la presente divulgación, se usará la siguiente terminología de acuerdo con cómo se define, donde se proporciona una definición.

[0134] También se debe entender que la terminología usada en el presente documento es únicamente con el fin de describir casos particulares, y no pretende ser limitante.

[0135] Los artículos "un" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del sujeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento. "Aproximadamente", como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, y similares, pretende englobar variaciones de ±20 % o ±10 %, en algunos casos ±5 %, en algunos casos ±1 %, y en algunos casos ±0.1 % del valor especificado, y que dichas variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados.

[0136] La molécula adaptadora, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un polipéptido con una secuencia que permite la interacción con dos o más moléculas y, en realizaciones, promueve la activación o inactivación de una célula citotóxica. Por ejemplo, en el caso de DAP12, esta comprende interacciones con un KIR activador mediante interacciones de carga dentro del dominio transmembranario e interacciones con moléculas de señalización como ZAP70 o Syk a través de una secuencia de ITAM fosforilada dentro del dominio citoplasmático. El término "antígeno" o "Ag", como se usa en el presente documento, se define como una molécula que provoca una respuesta inmune. Esta respuesta inmune puede implicar la producción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes específicas, o ambas. El experto comprenderá que cualquier macromolécula, incluidas prácticamente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígeno. Además, los antígenos pueden derivar de ADN recombinante o genómico. Un técnico experto entenderá que cualquier ADN que comprenda una secuencia de nucleótidos o una secuencia parcial de nucleótidos que codifique una proteína que provoca una respuesta inmunitaria, codifica por lo tanto un "antígeno" como se usa ese término en el presente documento. Además, un experto en la técnica comprenderá que un antígeno no necesita estar codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos de - longitud completa de un gen. Es fácilmente evidente que la presente divulgación incluye, pero sin limitación, el uso de secuencias de nucleótidos parciales de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos están dispuestas en diversas combinaciones para codificar polipéptidos que provocan la respuesta inmunitaria deseada. Además, un experto entenderá que un antígeno no necesita ser codificado por un "gen" en absoluto. Es fácilmente evidente que un antígeno puede generarse, sintetizarse o derivarse de una muestra biológica. Dicha muestra biológica puede incluir, pero no se limita a, una muestra tisular, una muestra tumoral, una célula o un fluido biológico.

[0137] La expresión "efecto antitumoral", como se usa en el presente documento, se refiere a un efecto biológico que puede manifestarse por una disminución en el volumen del tumor, una disminución en el número de células tumorales, una disminución en el número de metástasis, un aumento de la esperanza de vida, o una mejora de diversos síntomas fisiológicos asociados con la afección cancerosa. Un "efecto antitumoral" también puede manifestarse por la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos de la invención en la prevención de la aparición de un tumor en el primer lugar.

[0138] El término "autoantígeno" significa, de acuerdo con la presente divulgación, cualquier autoantígeno que el sistema inmunitario reconozca como extraño. Los autoantígenos comprenden, pero sin limitación, proteínas celulares, fosfoproteínas, proteínas de la superficie celular, lípidos celulares, ácidos nucleicos, glucoproteínas, incluidos los receptores de la superficie celular.

[0139] La expresión "enfermedad autoinmune", como se usa en el presente documento, se define como un trastorno resultante de una respuesta autoinmune. Una enfermedad autoinmune es el resultado de una respuesta inapropiada y excesiva a un autoantígeno. Los ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen, pero sin limitación, enfermedad de Addison, alopecia areata, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, enfermedad de Crohn, diabetes (tipo I), epidermólisis ampollosa distrófica, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo vulgar, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjögren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitiligo, mixedema, anemia perniciosa, colitis ulcerosa, entre otras.

[0140] Como se usa en el presente documento, el término "autólogo" se refiere a cualquier material derivado del mismo individuo al que posteriormente se reintroducirá en el individuo.

[0141] "Alógeno" se refiere a un injerto derivado de un animal diferente de la misma especie.

[0142] CAR, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un polipéptido quimérico que comparte propiedades estructurales y funcionales con un receptor de la función inmunitaria celular o molécula adaptadora, de por ejemplo, un linfocito T o una célula NK. Los CAR incluyen TCAR y CAR-NKR. Tras la unión al antígeno afín, un CAR puede activar o inactivar la célula citotóxica en la que está dispuesto, o modular la actividad antitumoral de la célula o modular de otro modo la respuesta inmunitaria de las células.

[0143] El término "cáncer", como se usa en el presente documento, se define como una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido e incontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas se pueden diseminar localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Ejemplos de diversos cánceres incluyen, pero sin limitación, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer cerebral, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, glioma y similares.

[0144] Como se usa en el presente documento, el término "modificaciones de secuencia conservadora" se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la invención mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son aquellas en las que el residuo aminoacídico se reemplaza con un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. Los familias de residuos aminoacídico que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, por ejemplo, uno o más residuos aminoacídicos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo pueden reemplazarse por otros residuos aminoacídicos de la misma familia de cadenas laterales y el anticuerpo alterado puede analizarse para su capacidad para unirse a FRβ usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

[0145] Un promotor "constitutivo" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está vinculada operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula en la mayoría o en todas las condiciones fisiológicas de la célula.

[0146] Citoplasmático e intracelular, como se aplica a moléculas adaptadoras y dominios de señalización, se usan indistintamente en el presente documento.

[0147] "Codificar" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tales como un gen, un ADNc o un ARNm, de servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de ellas. Así, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia del ARNm y que normalmente se proporciona en los listados de secuencias, como la cadena no codificante, utilizada como plantilla para la transcripción de un gen o ADNc, pueden considerarse como codificantes de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

[0148] A menos que se especifique otra cosa, una «secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos» incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y ARN pueden incluir intrones. "Cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una cantidad de un compuesto, formulación, material o composición, como se describe en el presente documento, eficaz para lograr un resultado biológico particular. Dichos resultados pueden incluir, pero sin limitación, la inhibición de la infección por virus determinada por cualquier medio adecuado en la técnica.

[0149] Como se usa en el presente documento, "endógeno" se refiere a cualquier material procedente o producido dentro de un organismo, célula, tejido o sistema.

[0150] Como se usa en el presente documento, el término "exógeno" se refiere a cualquier material introducido o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema.

[0151] El término "expresión", como se usa en el presente documento, se define como la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular impulsada por su promotor.

[0152] "Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión operativamente unidas a una secuencia de nucleótidos a expresar. Un vector de expresión comprende elementos que actúan en cis suficientes para la expresión; otros elementos para la expresión se pueden suministrar por la célula hospedadora o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos aquellos conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

[0153] CAR-FcR, como se usa en el presente documento, se refiere a un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con un FcR.

[0154] "Totalmente humana" se refiere a una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo, en la que la molécula completa es de origen humano o consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica a una forma humana del anticuerpo.

[0155] "Homólogo", como se usa en el presente documento, se refiere a la identidad de la secuencia de subunidades entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, tales como dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas de polipéptidos. Cuando una posición de subunidad en ambas moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica; por ejemplo si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son homólogas el 50 %, si el 90 % de las posiciones (por ejemplo, 9 de 10) son coincidentes u homólogas, las dos secuencias son homólogas el 90 %.

[0156] Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión al antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), como ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región estructural Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por restos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR ni estructurales importadas. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en el que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

[0157] "Dominio de señalización intracelular", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia polipeptídica que es un componente de una proteína de membrana integral más grande. Esta secuencia polipeptídica, a través de interacciones reguladas con otras proteínas celulares, es capaz de estimular o inhibir la función celular inmunitaria tal como liberación de gránulos líticos, producción o proliferación de citocinas.

[0158] Como se usa en el presente documento, un "material instructivo" incluye una publicación, una grabación, un diagrama o cualquier otro medio de expresión que pueda usarse para comunicar la utilidad de las composiciones y los métodos de la invención. El material instructivo del kit de la invención puede, por ejemplo, fijarse a un recipiente que contiene el ácido nucleico, péptido y/o composición de la invención, o enviarse junto con un recipiente que contiene el ácido nucleico, péptido y/o composición. Alternativamente, el material instructivo puede enviarse por separado del recipiente con la intención de que el destinatario use el material instructivo y el compuesto en cooperación.

[0159] "Aislado" significa alterado o eliminado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido separado parcial o completamente de los materiales coexistentes de su estado natural sí está "aislado". Un ácido nucleico o proteína aislado puede existir en forma sustancialmente purificada o puede existir en un entorno no nativo como, por ejemplo, una célula huésped.

[0160] En el contexto de la presente invención, se usan las siguientes abreviaturas para las bases de ácidos nucleicos que aparecen comúnmente. "A" se refiere a adenosina, "C" se refiere a citosina, "G" se refiere a guanosina, "T" se refiere a timidina y "U" se refiere a uridina.

[0161] A menos que se especifique otra cosa, una «secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos» incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La frase secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones en la medida en que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede en alguna versión contener un intrón(es).

[0162] CAR-KIR, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con un KIR.

[0163] Un "lentivirus", como se usa en el presente documento, se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus porque pueden infectar células que no se dividen; pueden suministrar una cantidad significativa de información genética al ADN de la célula huésped, por lo que son uno de los métodos más eficientes de vector de suministro de genes. VIH, VIS y VIF son ejemplos de lentivirus. Los vectores derivados de lentivirus ofrecen los medios para lograr niveles significativos de transferencia génica in vivo.

[0164] CAR-Ly49, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con un Ly49.

[0165] CAR-NCR, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con un NCR.

[0166] El receptor de función inmunitaria de células NK (o NKR), como se usa ese término en el presente documento, se refiere a una proteína transmembranaria de origen natural endógena expresada en células NK, que puede acoplarse con un ligando en una célula presentadora de antígeno y modular una respuesta de función inmunitaria de células NK, por ejemplo, puede modular la actividad citolítica o la secreción de citocinas de la célula NK. El NKR puede contribuir a la activación (un NKR activador, o NKRact), o inhibición (un NKR inhibidor, o NKRinh). Normalmente, un NKR comprende un dominio de unión a ligando extracelular (ECD), un dominio transmembranario (TM) y un dominio citoplasmático intracelular (ICD). Los NKR incluyen la familia del receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos (KIR) de receptores tales como KIR2DS2, la familia de receptores del receptor de células NK (NCR) de receptores tales como NKp46 (NCR1), la familia de receptores de activación de linfocitos de señalización (SLAM) (SLAMF) de receptores tales como 2B4, y los receptores de unión a Fc tales como el receptor de unión a IgG, CD16 (FcyRIII). Los ejemplos de respuestas de la función inmunitaria de células NK moduladas por NKR comprenden la destrucción de células diana (a menudo denominada citotoxicidad o citólisis), la secreción y/o la proliferación de citocinas. Normalmente, un NKR adecuada para su uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento es un NKR humano (o NKRh). En un caso, también se incluye la familia de receptores Ly49 en Mus musculus, que surgió por evolución convergente para proporcionar la misma función que un KIR en células NK y linfocitos T murinos.

[0167] CAR-NKR, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con un NKR o molécula adaptadora de una célula NK.

[0168] La expresión "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que da como resultado la expresión de esta última. Una primera secuencia del ácido nucleico está unida operativamente a una segunda secuencia del ácido nucleico cuando la primera secuencia del ácido nucleico se pone en una relación funcional con una segunda secuencia del ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. En general, las secuencias de ADN unidas operativamente son contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, en el mismo marco de lectura.

[0169] La "administración parenteral" de una composición inmunogénica incluye, por ejemplo, inyección subcutánea (sc), intravenosa (iv), intramuscular (im) o intraesternal, o técnicas de infusión.

[0170] El término "polinucleótido", como se usa en el presente documento, se define como una cadena de nucleótidos. Además, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Por lo tanto, los ácidos nucleicos y los polinucleótidos, como se usan en el presente documento, son intercambiables. Un experto en la técnica tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, que pueden hidrolizarse en los "nucleótidos" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos pueden hidrolizarse en nucleósidos. Como se usa en el presente documento, los polinucleótidos incluyen, pero sin limitación, todas las secuencias de ácido nucleico que se obtienen por cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, sin limitación, medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácido nucleico de una biblioteca recombinante o un genoma celular, usando tecnología de clonación ordinaria y PCR<™>, y similares, y por medios sintéticos.

[0171] Como se usa en el presente documento, los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente, y se refieren a un compuesto que comprende residuos aminoacídicos enlazados covalentemente mediante enlaces peptídicos. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se establece ninguna limitación en el número máximo de aminoácidos que pueden comprender la secuencia de una proteína o péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Como se usa en el presente documento, el término se refiere tanto a cadenas cortas, a las que también se hace referencia comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, a las que generalmente se hace referencia en la técnica como proteínas, de las que hay muchos tipos. Los "polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos naturales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos, o una combinación de los mismos.

[0172] El término "promotor", como se usa en el presente documento, se define como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de una secuencia polinucleotídica.

[0173] Como se usa en el presente documento, el término "secuencia promotora/reguladora" significa una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto genético unido operativamente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y, en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores necesarios para la expresión del producto genético. La secuencia promotora/reguladora puede, por ejemplo, ser una que exprese el producto genético de una manera específica del tejido.

[0174] Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está enlazada operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente sólo cuando un inductor que corresponde al promotor está presente en la célula.

[0175] TCAR, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con un receptor de la función inmunitaria celular o molécula adaptadora de un linfocito T.

[0176] Un promotor "específico de tejido" es una secuencia de nucleótidos que, cuando está vinculada operativamente con un polinucleótido codificado o especificado por un gen, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente sólo si la célula es una célula del tipo de tejido.

[0177] Una "vía de transducción de señales" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señales que desempeñan un papel en la transmisión de una señal de una porción de una célula a otra porción de una célula. La expresión "receptor de la superficie celular" incluye moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y transmitir la señal a través de la membrana de una célula.

[0178] El término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos).

[0179] Como se usa en el presente documento, una célula "sustancialmente purificada" es una célula que está esencialmente libre de otros tipos de células. Una célula sustancialmente purificada también se refiere a una célula que se ha separado de otros tipos celulares con los que normalmente está asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, este término se refiere simplemente a células que han sido separadas de las células con las que están naturalmente asociadas en su estado natural. En algunas realizaciones, las células se cultivanin vitro. En otras realizaciones, las células no se cultivanin vitro.

[0180] Como se usa en el presente documento, una caperuza 5' (también denominada caperuza de ARN, una caperuza de ARN 7-metilguanosina o una caperuza de ARN m7G) es un nucleótido de guanina modificado que se ha añadido al extremo "delantero" o 5' de un ARN mensajero eucariota poco después del inicio de la transcripción. La caperuza 5' consiste en un grupo terminal que está unido al primer nucleótido transcrito. Su presencia es crítica para el reconocimiento por parte del ribosoma y la protección de RNasas. La adición de la caperuza está acoplada a la transcripción, y se produce cotranscripcionalmente, de modo que cada una influye en la otra. Poco después del inicio de la transcripción, el extremo 5' del ARNm que se está sintetizando se une a un complejo sintetizador de caperuza asociado con la ARN polimerasa. Este complejo enzimático cataliza las reacciones químicas necesarias para la protección del ARNm. La síntesis se desarrolla como una reacción bioquímica de varias etapas. La fracción de protección se puede modificar para modular la funcionalidad del ARNm, como su estabilidad o eficiencia de traducción. Como se usa en el presente documento, el "ARN transcrito in vitro" se refiere a ARN, preferiblemente ARNm, que se ha sintetizado in vitro. Generalmente, el ARN transcritoin vitrose genera a partir de un vector de transcripciónin vitro. El vector de transcripciónin vitrocomprende una plantilla que se usa para generar el ARN transcritoin vitro.

[0181] Como se usa en el presente documento, una "poli(A)" es una serie de adenosinas unidas mediante poliadenilación al ARNm. En la realización preferida de una construcción para la expresión transitoria, la poliA está entre 50 y 5000, preferiblemente mayor de 64, más preferiblemente mayor de 100, lo más preferiblemente mayor de 300 o 400. Las secuencias de poli(A) pueden modificarse química o enzimáticamente para modular la funcionalidad del ARNm, tal como la localización, estabilidad o eficacia de la traducción.

[0182] Como se usa en el presente documento, "poliadenilación" se refiere al enlace covalente de un resto de poliadenililo, o su variante modificada, a una molécula de ARN mensajero. En organismos eucariotas, la mayoría de las moléculas de ARN mensajero (ARNm) están poliadeniladas en el extremo 3'. La cola 3' de poli(A) es una larga secuencia de nucleótidos de adenina (frecuentemente varios cientos) añadidos al pre-ARNm a través de la acción de una enzima, poliadenilato polimerasa. En los eucariotas superiores, la cola poli(A) se añade a las transcripciones que contienen una secuencia específica, la señal de poliadenilación. La cola de poli(A) y la proteína unida a ella ayudan a proteger el ARNm de la degradación por exonucleasas. La poliadenilación también es importante para la terminación de la transcripción, la exportación de ARNm desde el núcleo y la traducción. La poliadenilación ocurre en el núcleo inmediatamente después de la transcripción del ADN en ARN, pero también puede ocurrir más tarde en el citoplasma. Una vez finalizada la transcripción, la cadena de ARNm se escinde mediante la acción de un complejo de endonucleasa asociado con ARN polimerasa. El sitio de escisión se caracteriza generalmente por la presencia de la secuencia de bases AAUAAA cerca del sitio de escisión. Una vez escindido el ARNm, se añaden residuos de adenosina al extremo 3' libre en el sitio de escisión.

[0183] Como se usa en el presente documento, "transitorio" se refiere a la expresión de un transgén no integrado durante un periodo de horas, días o semanas, en donde el periodo de tiempo de expresión es menor que el periodo de tiempo para la expresión del gen si está integrado en el genoma o contenido dentro de un replicón plasmídico estable en la célula hospedadora.

[0184] Como se usa en el presente documento, el término "TCAR" comprende un dominio de antígeno, un dominio de señalización intracelular y opcionalmente uno o más dominios coestimuladores.

[0185] El término "terapéutico", como se usa en el presente documento, significa un tratamiento y/o profilaxis. Un efecto terapéutico se obtiene mediante la supresión, remisión o erradicación de un estado patológico.

[0186] El término "transfectado", "transformado" o "transducido", como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso mediante el cual el ácido nucleico exógeno se transfiere o se introduce en la célula hospedadora. Una célula "transfectada" o "transformada" o "transducida" es una que se ha transfectado, transformado o transducido con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula objeto primaria y su descendencia.

[0187] La expresión "bajo control transcripcional" o "unido operativamente", como se usa en el presente documento, significa que el promotor está en la ubicación y orientación correctas en relación con un polinucleótido para controlar el inicio de la transcripción por ARN polimerasa y la expresión del polinucleótido.

[0188] Un "vector" es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que se puede usar para administrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Se conocen numerosos vectores en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Así, el término "vector" incluye un plásmido que se replica autónomamente o un virus. También se debe interpretar que el término incluye compuestos no plasmídicos y no virales, que facilitan la transferencia de ácido nucleico en células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas y similares. Los ejemplos de vectores víricos incluyen, pero sin limitación, vectores adenovíricos, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos y similares.

[0189] La expresión "se une específicamente", como se usa en el presente documento, significa un anticuerpo, o un ligando, que reconoce y se une a una proteína compañera de unión afín presente en una muestra, pero cuyo anticuerpo o ligando no reconoce sustancialmente ni se une a otras moléculas en la muestra.

[0190] Por el término "estimulación" se entiende una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora con su ligando afín, mediando así un evento de transducción de señales, tal como, pero sin limitación, la transducción de señales a través del receptor NK apropiado.

[0191] "Xenógeno" se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.

[0192] Intervalos: a lo largo de esta divulgación, se pueden presentar en un formato de intervalo diversos aspectos de la invención. Se debe entender que la descripción en el formato de intervalo es simplemente por comodidad y brevedad y no se debe interpretar como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo ha desvelado específicamente todos los posibles subintervalos, así como valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo, tal como desde 1 hasta 6, se debe considerar que ha desvelado específicamente subintervalos, tales como desde 1 hasta 3, desde 1 hasta 4, desde 1 hasta 5, desde 2 hasta 4, desde 2 hasta 6, desde 3 hasta 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo. CAR-NKR

[0193] En el presente documento se divulgan composiciones y métodos de regulación de la especificidad y actividad de células citotóxicas, por ejemplo, linfocitos T o células NK, por ejemplo, con un receptor quimérico para el antígeno (CAR) de origen no natural. En un caso, el CAR es un CAR-NKR. Un CAR-NKR es un CAR que comparte propiedades funcionales y estructurales con un receptor de función inmunitaria de células NK (o NKR). Los NKR y CAR-NKR se describen en el presente documento, por ejemplo, en la sección que figura a continuación. Como se analiza más adelante, una variedad de NKR puede servir como base para un CAR-NKR.

[0194] RECEPTORES DE FUNCIÓN INMUNITARIA DE CÉLULAS NK (NKR) Y CÉLULAS NK

[0195] Como se aborda en el presente documento, el receptor de función inmunitaria de células NK (o NKR) se refiere a una proteína transmembranaria de origen natural endógena expresada en células NK, que puede acoplarse con un ligando en una célula presentadora de antígeno y modular una respuesta de función inmunitaria de células NK, por ejemplo, puede modular la actividad citolítica o la secreción de citocinas de la célula NK.

[0196] Las células NK son células mononucleares que se desarrollan en la médula ósea a partir de progenitores linfoides, y las características morfológicas y las propiedades biológicas incluyen normalmente la expresión de los determinantes de grupo (CD) CD16, CD56 y/o CD57; la ausencia del complejo TCR alfa/beta o gamma/delta en la superficie celular; la capacidad de unirse y destruir células diana que no expresan proteínas del "auto" complejo principal de histocompatibilidad (MHC)/antígeno leucocitario humano (HLA); y la capacidad de destruir células tumorales u otras células enfermas que expresan ligandos para activar los receptores NK. Las células NK se caracterizan por su capacidad para unirse y destruir varios tipos de líneas celulares tumorales sin la necesidad de inmunización o activación previa. Las células NK también pueden liberar proteínas solubles y citocinas que ejercen un efecto regulador sobre el sistema inmunitario; y pueden experimentar múltiples rondas de división celular y producir células hijas con propiedades biológicas similares a las de la célula progenitora. Tras la activación por interferones y/o citocinas, las células NK median en la lisis de las células tumorales y de las células infectadas con patógenos intracelulares mediante mecanismos que requieren contactos físicos directos entre la célula NK y la célula diana. La lisis de células diana implica la liberación de gránulos citotóxicos de la célula NK en la superficie de la diana unida, y proteínas efectoras tales como perforina y granzima B que penetran en la membrana plasmática diana e inducen apoptosis o muerte celular programada. Las células normales y sanas están protegidas de la lisis por las células NK. La actividad de las células NK está regulada por un mecanismo complejo que implica señales tanto estimulantes como inhibidoras. Brevemente, la actividad lítica de las células NK está regulada por diversos receptores de la superficie celular que transducen señales intracelulares positivas o negativas tras la interacción con ligandos en la célula diana. El equilibrio entre las señales positivas y negativas transmitidas a través de estos receptores determina si una célula diana es lisada (muerta) o no por una célula NK. Las señales estimuladoras de células NK pueden estar mediadas por receptores de citotoxicidad natural (NCR) tales como NKp30, NKp44 y NKp46; así como receptores NKG2C, receptores NKG2D, ciertos receptores similares a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos (KIR) activadores y otros receptores NK activadores (Lanier, Annual Review of Immunology 2005; 23:225-74). Las señales inhibidoras de células NK pueden estar mediadas por receptores como Ly49, CD94/NKG2A, así como ciertos KIR inhibidores, que reconocen moléculas de clase I del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) (Karre et al., Nature 1986; 319:675-8; Ohlen et al, Science 1989; 246:666-8).

[0197] Estos receptores inhibidores se unen a determinantes polimórficos de moléculas MHC de clase I (incluyendo HLA de clase I) presentes en otras células e inhiben la lisis mediada por células NK.

[0198] CAR-KIR

[0199] En el presente documento se divulga una molécula de receptor quimérico para el antígeno (CAR) que comprende un resto de unión a antígeno y un receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos (CAR-KIR). En una realización, el CAR-KIR de la invención se expresa en la superficie de un linfocito T.

[0200] CAR-NK BASADOS EN CAR-KIR

[0201] Los KIR, denominados receptores similares a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos, se han caracterizado en seres humanos y primates no humanos, y son moléculas transmembranarias polimórficas de tipo 1 presentes en ciertos subconjuntos de linfocitos, incluyendo células NK y algunos linfocitos T. Los KIR interactúan con determinantes en los dominios alfa 1 y 2 de las moléculas MHC de clase I y, como se describe en otra parte en el presente documento, los KIR distintos son estimulantes o inhibidores para las células NK.

[0202] Los CAR-NK descritos en el presente documento incluyen CAR-KIR, que comparten propiedades funcionales y estructurales con KIR.

[0203] Los KIR son una familia de proteínas de la superficie celular que se encuentran en las células NK. Regulan la función de destrucción de estas células interactuando con moléculas MHC de clase I, que se expresan en todos los tipos de células. Esta interacción les permite detectar células infectadas víricamente o células tumorales. La mayoría de los KIR son inhibidores, lo que significa que su reconocimiento de MHC suprime la actividad citotóxica de la célula NK que los expresa. Solo un número limitado de KIR tiene la capacidad de activar las células.

[0204] La familia de genes KIR tiene al menos 15 loci génicos (KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3 y dos pseudogenes, KIR2DP1 y KIR3DP1) codificados dentro de una región de 100-200 Kb del complejo receptor de leucocitos (LRC) ubicado en el cromosoma 19 (19q13.4). El LRC constituye un grupo grande, de 1 Mb y denso de genes inmunitarios en rápida evolución que contiene genes que codifican otras moléculas de superficie celular con dominios extracelulares similares a Ig distintivos. Además, el LRC extendido contiene genes que codifican las moléculas adaptadoras transmembranarias DAP10 y DAP12.

[0205] Los genes KIR varían en longitud de 4 a 16 Kb (secuencia genómica completa) y pueden contener de cuatro a nueve exones. Los genes KIR se clasifican como pertenecientes a uno de los tres grupos según sus características estructurales: (1) genes KIR2D de tipo I que codifican dos proteínas de dominio extracelular con una conformación D1 y D2; (2) genes KIR2D de tipo II estructuralmente divergentes que codifican dos proteínas de dominio extracelular con una conformación D0 y D2; y finalmente (3) genes KIR3D que codifican proteínas con tres dominios extracelulares similares a Ig (D0, D1 y D2).

[0206] Los genes KIR2D de tipo I, que incluyen el pseudogén KIR2DP1, así como los genes KIR2DL1-3 y KIR2DS1-5, poseen ocho exones, así como una secuencia de pseudoexón 3. Este pseudoexón se inactiva en KIR2D de tipo I. En algunos casos, esto se debe a una sustitución de nucleótidos ubicada en el sitio de corte y empalme del intrón 2-exón 3 donde su secuencia de nucleótidos presenta un alto grado de identidad con las secuencias del exón 3 de KIR3D y posee una deleción característica de tres pares de bases. En otros casos, un codón de parada prematuro inicia el corte y empalme diferencial del exón 3. Dentro del grupo de genes KIR2D de tipo I, KIR2DL1 y KIR2DL2 comparten una deleción común en el exón 7 que los distingue de todas las otras KIR en este exón, lo que da como resultado una secuencia del exón 7 más corta. De manera similar, dentro de KIR2D de tipo I, KIR2DL1-3 difiere de KIR2DS1-5 solo en la longitud de su región codificante de la cola citoplasmática en el exón 9. La estructura del pseudogén KIR2DP1 difiere de la de KIR2DL1-3 en que la primera tiene una secuencia del exón 4 más corta, debido a una deleción de un solo par de bases.

[0207] Los genes KIR2D de tipo II incluyen KIR2DL4 y KIR2DL5. A diferencia de KIR3D y KIR2D de tipo I, KIR2D de tipo II ha eliminado característicamente la región correspondiente al exón 4 en todos los demos KIR. Además, los genes KIR2D de tipo II difieren de los genes KIR2D de tipo I en que los primeros poseen un exón 3 traducido, mientras que los genes KIR2D de tipo I tienen una secuencia de pseudoexón 3 no traducida en su lugar. Dentro de los genes KIR2D de tipo II, KIR2DL4 se diferencia además de KIR2DL5 (así como de otros genes KIR) por la longitud de su secuencia del exón 1. En KIR2DL4, se descubrió que el exón 1 era seis nucleótidos más largo y poseía un codón de iniciación diferente de los presentes en los otros genes KIR. Este codón de iniciación concuerda mejor con la 'secuencia consenso de inicio de la transcripción de Kozak' que el segundo codón de iniciación potencial en KIR2DL4 que corresponde al codón de iniciación presente en otros genes KIR.

[0208] Los genes KIR3D poseen nueve exones e incluyen los genes KIR3DL1, KIR3DS1, KIR3DL2 y KIR3DL3 estructuralmente relacionados. Las secuencias de nucleótidos de KIR3DL2 son las más largas de todos los genes KIR y abarcan 16,256 pb en secuencias genómicas completas y 1,368 pb en ADNc. Dentro del grupo KIR3D, los cuatro genes KIR difieren en la longitud de la región que codifica la cola citoplasmática en el exón 9. La longitud de la cola citoplasmática de las proteínas KIR puede variar de 14 residuos aminoacídicos de longitud (en algunos alelos KIR3DS1) a 108 residuos aminoacídicos de longitud (en proteínas KIR2DL4). Además, KIR3DS1 difiere de KIR3DL1 o KIR3DL2 en que el primero tiene una secuencia del exón 8 más corta. KIR3DL3 difiere de otras secuencias de KIR en que carece completamente del exón 6. La diferencia más extrema en la estructura del gen KIR observada fue la de KIR3DP1. Este fragmento génico carece completamente de los exones 6 a 9, y ocasionalmente también del exón 2. Las porciones restantes del gen que están presentes (exones 1, 3, 4 y 5) comparten un alto nivel de identidad de secuencia con otras secuencias de KIR3D, en particular con las secuencias de KIR3DL3.

[0210] Las proteínas KIR poseen dominios similares a Ig característicos en sus regiones extracelulares, que en algunas proteínas KIR están implicadas en la unión del ligando de clase I de HLA. También poseen regiones transmembranarias y citoplasmáticas que son funcionalmente relevantes ya que definen el tipo de señal que se transduce a la célula NK. Las proteínas KIR pueden tener dos o tres dominios similares a Ig (por lo tanto, KIR2D o KIR3D) así como colas citoplasmáticas cortas o largas (representadas como KIR2DS o KIR2DL). Dos proteínas KIR de dominio se subdividen en dos grupos dependiendo del origen de los dominios similares a Ig distales de membrana presentes. Las proteínas KIR2D de tipo I (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4 y KIR2DS5) poseen un dominio similar a Ig distal de membrana similar en origen al dominio similar a Ig D1 de KIR3D, pero carecen de un dominio D0. Este dominio similar a Ig D1 está codificado principalmente por el cuarto exón de los genes KIR correspondientes. Las proteínas KIR2D de tipo II, KIR2DL4 y KIR2DL5, poseen un dominio similar a Ig distal de membrana de secuencia similar al dominio D0 presente en las proteínas KIR3D, sin embargo, KIR2D de tipo II carece de un dominio D1. Las colas citoplasmáticas largas suelen contener dos motivos inhibidores inmunitarios basados en tirosina (ITIM) que transducen señales inhibidoras a la célula NK. Las colas citoplasmáticas cortas poseen un residuo aminoacídico cargado positivamente en su región transmembrana que les permite asociarse con una molécula de señalización DAP12 capaz de generar una señal de activación. Excepciones a esto es KIR2DL4, que contiene solo un ITIM aminoterminal. Además, KIR2DL4 también posee un residuo cargado (arginina) en su dominio transmembranario, una característica que permite a este receptor provocar señales tanto inhibidoras como activadoras. Los KIR controlan la respuesta de células NK humanas suministrando señales inhibidoras o activadoras tras el reconocimiento de ligandos MHC de clase I en la superficie de células diana potenciales.

[0212] Las proteínas KIR varían en longitud de 306 a 456 residuos aminoacídicos. Aunque las diferencias en la longitud de la proteína son principalmente la consecuencia del número de dominios similares a Ig presentes, la diversidad de la longitud de la región citoplasmática también es un factor influyente. El péptido conductor de la mayoría de las proteínas KIR tiene 21 residuos aminoacídicos de longitud. Sin embargo, la presencia de un codón de iniciación diferente genera un péptido conductor correspondiente más largo en las proteínas KIR2DL4.

[0214] El dominio similar a Ig D0 presente en las proteínas KIR2D de tipo II y las proteínas KIR3D tiene aproximadamente 96 residuos aminoacídicos de longitud. El dominio D1 de KIR2D de tipo I y de las proteínas KIR3D tiene una longitud de 102 residuos aminoacídicos, mientras que el dominio D2 de todas las proteínas KIR tiene 98 residuos aminoacídicos de longitud. La longitud de la región de tallo varía de los 24 residuos aminoacídicos presentes en la mayoría de las proteínas KIR, a solo siete residuos aminoacídicos en la proteína KIR3DL3 divergente. La región transmembranaria tiene 20 residuos aminoacídicos de longitud para la mayoría de las proteínas KIR, pero un residuo más corto en las proteínas KIR2DL1 y KIR2DL2 como resultado de una deleción de tres pares de bases en el exón 7. Finalmente, la región citoplasmática de las proteínas KIR presenta variaciones de longitud mayores, que varían de 23 residuos aminoacídicos en algunos alelos KIR3DS1 a los 96 residuos aminoacídicos presentes en las proteínas KIR3DL2.

[0215] Las secuencias de aminoácidos para polipéptidos KIR humanos (Homo sapiens) están disponibles en la base de datos NCBI, véase, por ejemplo, el número de acceso NP_037421.2 (GI:134268644), NP_703144.2 (GI:46488946), NP_001229796.1 (GI:338968852), NP_001229796.1 (GI:338968852), NP_006728.2 (GI:134268642), NP_065396.1 (GI: 11968154), NP_001018091.1 (GI:66267727), NP_001077008.1 (GI:134133244), NP_036444.1 (GI:6912472), NP_055327.1 (GI:7657277), NP_056952.2 (GI:71143139), NP_036446.3 (GI:116517309), NP_001074239.1 (GI:124107610), NP_002246.5 (GI: 124107606), NP_001074241.1 (GI: 124107604), NP_036445.1 (GI:6912474).

[0216] La nomenclatura para KIR se basa en el número de dominios extracelulares (KIR2D y KIR3D que tienen dos y tres dominios Ig extracelulares, respectivamente) y si la cola citoplasmática es larga (KIR2DL o KIR3DL) o corta (KIR2DS o KIR3DS). La presencia o ausencia de un KIR dado es variable de una célula NK a otra dentro de la población NK presente en un solo individuo. Entre los seres humanos, también hay un nivel relativamente alto de polimorfismo de los genes KIR, con ciertos genes KIR presentes en algunos, pero no en todos los individuos. La expresión de alelos KIR en células NK está regulada estocásticamente, lo que significa que, en un individuo dado, un linfocito dado puede expresar uno, dos o más KIR diferentes, dependiendo del genotipo del individuo. Las células NK de un solo individuo normalmente expresan diferentes combinaciones de KIR, proporcionando un repertorio de células NK con diferentes especificidades para moléculas MHC de clase I.

[0218] Ciertos productos génicos KIR provocan la estimulación de la actividad de los linfocitos cuando se unen a un ligando apropiado. Todos los KIR activadores tienen una cola citoplasmática corta con un residuo transmembranario cargado que se asocia con una molécula adaptadora que tiene motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM) que transducen señales estimuladoras a la célula NK. Por el contrario, los KIR inhibidores tienen una cola citoplasmática larga que contiene un motivo inhibidor del inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM), que transduce señales inhibidoras a la célula NK tras el acoplamiento de sus ligandos de clase I de MHC. Los KIR inhibidores conocidos incluyen miembros de las subfamilias KIR2DL y KIR3DL. Los KIR inhibidores que tienen dos dominios de Ig (KIR2DL) reconocen alotipos de HLA-C: KIR2DL2 (anteriormente designado p58.2) y el producto génico alélico estrechamente relacionado KIR2DL3 reconocen ambos alotipos HLA-C del "grupo 1" (incluyendo HLA-Cw1, -3, -7 y 8), mientras que KIR2DL1 (p58.1) reconoce los alotipos HLA-C del "grupo 2" (tales como HLA-Cw2, -4, - 5 y -6). El reconocimiento por KIR2DL1 viene impuesto por la presencia de un residuo de Lys en la posición 80 de alelos de HLA-C. El reconocimiento de KIR2DL2 y KIR2DL3 viene impuesto por la presencia de un residuo de Asn en la posición 80 en HLA-C. De manera importante, la gran mayoría de los alelos de HLA-C tienen un residuo de Asn o de Lys en la posición 80. Por lo tanto, KIR2DL1, -2 y -3 reconocen colectivamente esencialmente todos los alotipos de HLA-C encontrados en seres humanos. Un KIR con tres dominios de Ig, KIR3DL1 (p70), reconoce un epítopo compartido por alelos HLA-BW4. Finalmente, KIR3DL2 (p140), un homodímero de moléculas con tres dominios de Ig, reconoce HLA-A3 y -A11.

[0219] Sin embargo, la divulgación no debe limitarse a KIR inhibidores que comprenden una cola citoplasmática que contiene ITIM. En su lugar, cualquier proteína inhibidora que tenga un dominio citoplasmático que esté asociado con una señal inhibidora puede usarse en la construcción de los CAR de la divulgación. Los ejemplos no limitativos de una proteína inhibidora incluyen, pero sin limitación, CTLA-4, PD-1 y similares. Se sabe que estas proteínas inhiben la activación de linfocitos T.

[0220] Por consiguiente, la divulgación proporciona un CAR-KIR que comprende un dominio extracelular que comprende un elemento de unión específico de la diana al que se hace referencia de otro modo como un dominio de unión a antígeno fusionado a un KIR o fragmento del mismo. En un caso, el KIR es un KIR activador que comprende una cola citoplasmática corta que se asocia con una molécula adaptadora que tiene motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM) que transducen señales estimuladoras a la célula NK (denominada en otra parte en el presente documento CAR-KIRact). En un caso, el KIR es un KIR inhibidor que comprende una cola citoplasmática larga que contiene un motivo inhibidor del inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) que transduce señales inhibidoras (denominadas en otra parte en el presente documento CAR-KIRinh). En algunos casos, es deseable eliminar la región bisagra para los KIR activadores cuando se construye un CAR-KIRact. Esto se debe a que la divulgación se basa en parte en el descubrimiento de que un CAR-KIR activador en el que se retiró la bisagra KIR2DS2 para generar el CAR KIR2S, este CAR KIRS2 mostró una actividad citolítica mejorada en comparación con un CAR-KIRact que comprende un KIR2DS2 natural de longitud completa.

[0221] Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas de la invención se pueden obtener usando métodos recombinantes conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cribando bibliotecas de células que expresan el gen, obteniendo el gen de un vector que se sabe que la incluye o aislando directamente de células y tejidos que la contienen, usando técnicas convencionales. Alternativamente, el gen de interés puede producirse sintéticamente, en lugar de clonarse.

[0222] La presente divulgación incluye construcciones de vectores retrovíricos y lentivíricos que expresan un CAR-KIR que puede transducirse directamente en una célula. La presente divulgación también incluye una construcción de ARN que se puede transfectar directamente en una célula. Un método de generación de ARNm para uso en la transfección implica la transcripción in vitro (IVT) de una plantilla con cebadores especialmente diseñados, seguida de la adición de poliA, para producir una construcción que contiene una secuencia no traducida ("UTR") 3' y 5', una secuencia de caperuza 5' y/o sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), el gen que se ha de expresar, y una cola poliA, normalmente de 50-2000 bases de longitud. El ARN producido de este modo puede transfectar eficientemente diferentes clases de células. En una realización, la plantilla incluye secuencias para el CAR-KIR.

[0223] En un caso, un CAR-KIR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio transmembranario de KIR. En un caso, un CAR-KIR comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio intracelular de KIR, por ejemplo, un dominio intracelular de KIRinh. La invención proporciona un CAR-KIRinh purificado, o de origen no natural, que es un CAR-KIRinh que comprende (i) un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de una molécula de anticuerpo o que comprende un armazón no de anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a un antígeno diana en una célula; (ii) un dominio transmembranario; y (iii) un dominio citoplasmático que contiene ITIM.

[0224] El dominio D de KIR, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio D0, D1 o D2 de un KIR.

[0225] El dominio D de KIR, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio D de un KIR.

[0226] El dominio D0 de KIR, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio D0 de un KIR. En una realización, el dominio D0 de KIR de un CAR-KIR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o un 99 % de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio D0 de KIR de origen natural o un dominio D0 de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio D0 de KIR de un CAR-KIR difiere en no más de un 15, 10, 5, 2 o un 1 % de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio D0 de KIR de origen natural o un dominio D0 de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio D0 de KIR de un CAR-KIR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio D0 de KIR de origen natural o un dominio D0 de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio D0 de KIR de un CAR-KIR no difiere de, o comparte un 100 % de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio D0 de KIR de origen natural o un dominio D0 de KIR descrito en el presente documento.

[0227] El dominio D1 de KIR, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio D1 de un KIR. En una realización, el dominio D1 de KIR de un CAR-KIR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o un 99 % de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio D1 de KIR de origen natural o un dominio D1 de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio D1 de KIR de un CAR-KIR difiere en no más de un 15, 10, 5, 2 o un 1 % de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio D1 de KIR de origen natural o un dominio D1 de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio D1 de KIR de un CAR-KIR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio D0 de KIR de origen natural o un dominio D1 de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio D1 de KIR de un CAR-KIR no difiere de, o comparte un 100 % de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio D1 de KIR de origen natural o un dominio D1 de KIR descrito en el presente documento.

[0229] El dominio D2 de KIR, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio D2 de un KIR. En una realización, el dominio D2 de KIR de un CAR-KIR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o un 99 % de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio D2 de KIR de origen natural o un dominio D2 de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio D2 de KIR de un CAR-KIR difiere en no más de un 15, 10, 5, 2 o un 1 % de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio D2 de KIR de origen natural o un dominio D2 de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio D2 de KIR de un CAR-KIR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio D2 de KIR de origen natural o un dominio D2 de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio D2 de KIR de un CAR-KIR no difiere de, o comparte un 100 % de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio D2 de KIR de origen natural o un dominio D0 de KIR descrito en el presente documento.

[0231] El dominio bisagra o de tallo de KIR, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio bisagra o de tallo de un KIR. En una realización, el dominio bisagra o de tallo de KIR de un CAR-KIR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o un 99 % de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio bisagra o de tallo de KIR de origen natural o un dominio bisagra o de tallo de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio bisagra o de tallo de KIR de un CAR-KIR difiere en no más de un 15, 10, 5, 2 o un 1 % de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio bisagra o de tallo de KIR de origen natural o un el dominio bisagra o de tallo de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio bisagra o de tallo de KIR de un CAR-KIR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio bisagra o de tallo de KIR de origen natural o un dominio bisagra o de tallo de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio bisagra o de tallo de KIR de un CAR-KIR no difiere de, o comparte un 100 % de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio bisagra o de tallo de KIR de origen natural o un dominio bisagra o de tallo de KIR descrito en el presente documento.

[0233] El dominio transmembranario de KIR, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio transmembranario de un KIR. En una realización, el dominio transmembranario de KIR de un CAR-KIR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o un 99 % de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembranario de KIR de origen natural o un dominio transmembranario de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembranario de KIR de un CAR-KIR difiere en no más de un 15, 10, 5, 2 o un 1 % de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembranario de KIR de origen natural o un dominio transmembranario de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembranario de KIR de un CAR-KIR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembranario de KIR de origen natural o un dominio transmembranario de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio transmembranario de KIR de un CAR-KIR no difiere de, o comparte un 100 % de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio transmembranario de KIR de origen natural o un dominio transmembranario de KIR descrito en el presente documento.

[0235] El dominio intracelular de KIR, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio intracelular de un KIR. Los dominios intracelulares de KIR comprenden dominios intracelulares de KIR inhibidores (denominados en el presente documento dominios intracelulares de KIRinh) y dominios intracelulares de KIR activadores (denominados en la presente dominios intracelulares de KIRact). En una realización, el dominio intracelular de KIRinh comprende una secuencia ITIM. En una realización, el dominio intracelular de KIR de un CAR-KIR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o un 99 % de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular de KIR de origen natural o un dominio intracelular de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular de KIR de un CAR-KIR difiere en no más de un 15, 10, 5, 2 o un 1 % de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular de KIR de origen natural o un dominio intracelular de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular de KIR de un CAR-KIR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular de KIR de origen natural o un dominio intracelular de KIR descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio intracelular de KIR de un CAR-KIR no difiere de, o comparte un 100 % de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio intracelular de KIR de origen natural o un dominio intracelular de KIR descrito en el presente documento.

[0236] NCR

[0237] Los CAR-NCR comparten propiedades funcionales y estructurales con NCR.

[0238] Las linfocitos citolíticos naturales (NK) son células linfoides citotóxicas especializadas en destruir tumores y células infectadas por virus. A diferencia de los linfocitos T citotóxicos, los células NK no expresan receptores específicos para antígeno. El reconocimiento de células transformadas se produce mediante la asociación de una multitud de receptores de la superficie celular con marcadores de superficie en la célula diana. Los receptores de la superficie de las células NK se pueden distinguir de acuerdo con si activan o inhiben la citotoxicidad mediada por células NK. Numerosas interacciones entre diferentes receptores parecen conducir a la formación de sinapsis entre células NK y diana. La integración de señales activadoras e inhibidoras en la sinapsis dicta si las células NK ejercen o no su función citolítica sobre la célula diana. Entre los receptores activadores, la familia de moléculas similares a Ig se denomina receptores de citotoxicidad naturales (NCR). Estos receptores de citotoxicidad naturales incluyen moléculas NKp30, NKp44 y NKp46. Los NCR son receptores activadores clave para células NK en el reconocimiento de células tumorales. Los tres NCR están implicados en la eliminación de células infectadas tanto por tumores como por virus. En estas últimas, la actividad antívirica se inicia por la interacción de NKp44 con la hemaglutinina del virus de la gripe o del virus Sendai. NKp46 se dirige a células infectadas por virus mediante la unión a hemaglutinina del virus de la gripe o hemaglutinina-neuraminidasa del virus Sendai. Por el contrario, se ha demostrado que la citotoxicidad mediada por células NK se inhibe mediante la unión de NKp30 a la proteína citomegalovírica humana pp65 (véase, por ejemplo, Arnon, et. Al., Nat. Immunol. (2005) 6:515-523).

[0239] Las secuencias de aminoácidos para polipéptidos NCR humanos (Homo sapiens) están disponibles en la base de datos NCBI, véanse, por ejemplo, el número de acceso NP_004819.2 (GI:153945782), 014931.1 (GI:47605770), O95944.2 (GI:251757303), 076036.1 (GI:47605775), NP_001138939.1 (GI:224586865) y/o NP_001138938.1 (GI:224586860).

[0240] Receptores SLAM

[0241] Los CAR-SLAMF comparten propiedades funcionales y estructurales con SLAMF.

[0242] La familia de moléculas de activación de linfocitos de señalización (SLAM) de receptores de células inmunitarias está estrechamente relacionada con la familia CD2 de la superfamilia de moléculas de inmunoglobulina (Ig). La familia SLAM (SLAMF) actualmente incluye nueve miembros llamados SLAM, CD48, CD229, 2B4, CD84, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME y CD2F-10. En general, las moléculas de SLAM poseen de dos a cuatro dominios de Ig extracelulares, un segmento transmembranario y una región rica en tirosina intracelular. Las moléculas se expresan diferencialmente en una variedad de tipos de células inmunitarias. Varios son autoligandos y SLAM ha sido identificado como el receptor del virus del sarampión humano. Se sabe que varias proteínas adaptadoras que contienen SH2 pequeñas se asocian con los dominios intracelulares de miembros de la familia SLAM y modulan la señalización del receptor incluyendo SH2D1A (también conocida como proteína asociada a SLAM [SAP]) y SH2D1B (también conocida como EAT2). Por ejemplo, en los linfocitos T y las células NK, los receptores de la familia SLAM activados se fosforilan con tirosina y reclutan la SAP adaptadora y posteriormente la cinasa Src Fyn. La cascada de transducción de señales subsiguiente influye en el resultado de las interacciones linfocitos T-célula presentadora de antígenos y célula NK-célula diana. Las secuencias de aminoácidos para los polipéptidos del receptor de SLAM humano (Homo sapiens) están disponibles en la base de datos del NCBI, véanse, por ejemplo, el número de acceso NP_057466.1 (GI: 7706529), NP_067004.3 (GI: 19923572), NP_003028.1 (GI:4506969), NP_001171808.1 (GI: 296434285), NP_001171643.1 (GI:296040491), NP_001769.2 (GI:21361571), NP_254273.2 (GI: 226342990), NP_064510.1 (GI: 9910342) y/o NP_002339.2 (GI: 55925578)

[0243] Receptores de unión a Fc

[0244] Los CAR-NK incluyen CAR basados en los receptores de Fc, CAR-FcR, por ejemplo, CAR-CD16 y CAR-CD64, que comparten propiedades funcionales y estructurales con CD16 y CD64.

[0245] Tras la activación, las células NK producen citocinas y quimiocinas abundantemente y al mismo tiempo presentan una potente actividad citolítica. La activación de células NK puede producirse a través de la unión directa de receptores de células NK a ligandos en la célula diana, como se observa con la destrucción directa de células tumorales, o a través de la reticulación del receptor Fc (CD 16; FcγRIII) mediante la unión a la porción Fc de anticuerpos unidos a una célula portadora de antígeno. Este acoplamiento de CD16 (reticulación de CD16) inicia respuestas de células NK a través de señales intracelulares que se generan a través de una, o ambas, de las cadenas adaptadoras asociadas a CD16, FcRγ o CD3ζ. La activación de CD16 conduce a la fosforilación de la cadena γ o ζ, que a su vez recluta tirosina cinasas, syk y ZAP-70, iniciando una cascada de transducción de señales que conduce a funciones efectoras rápidas y potentes. La función efectora más conocida es la liberación de gránulos citoplasmáticos que portan proteínas tóxicas para destruir células diana cercanas a través del proceso de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La reticulación de CD16 también da como resultado la producción de citocinas y quimiocinas que, a su vez, activan y orquestan una serie de respuestas inmunitarias.

[0246] Sin embargo, a diferencia de los linfocitos T y B, se cree que las células NK tienen solo una capacidad limitada para el reconocimiento de la diana usando receptores de activación codificados por la línea germinal (Bottino et al., Curr Top Microbiol Immunol.298:175-182 (2006); Stewart et al., Curr Top Microbiol Immunol.298:1-21 (2006)). Las células NK expresan el receptor de Fc activador CD16, que reconoce las células diana recubiertas con IgG, ampliando de este modo el reconocimiento de la diana (Ravetch y Bolland, Annu Rev Immunol. 19:275-290 (2001); Lanier Nat. Immunol.9(5):495-502 (2008); Bryceson & Long, Curr Opin Immunol.20(3):344-352 (2008)).

[0247] La actividad de expresión y transducción de señales de varios receptores de activación de células NK requiere adaptadores físicamente asociados, que transduzcan señales a través de motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM). Entre estos adaptadores, las cadenas FcRγ y CD3ζ pueden asociarse con CD16 y receptores de citotoxicidad natural (NCR) como homodímeros unidos a disulfuro o heterodímeros, y se ha pensado que estas cadenas se expresan por todas las células NK maduras.

[0248] La secuencia de aminoácidos para CD16 (Homo sapiens) está disponible en la base de datos NCBI, véanse, por ejemplo, el número de acceso NP_000560.5 (GI: 50726979), NP_001231682.1 (GI: 348041254)

[0249] Ly49 y receptores similares a lectina de linfocitos citolíticos relacionados

[0250] Los CAR-Ly49 comparten propiedades funcionales y estructurales con Ly49.

[0251] Los receptores Ly49 derivan de al menos 23 genes identificados (Ly49A-W) en ratones. Estos receptores comparten muchas de las mismas funciones en las células NK y los linfocitos T de ratón que las que desempeñan los KIR en humanos a pesar de su estructura diferente (proteínas integrales de membrana de tipo II de la superfamilia de lectinas de tipo C), y también contienen un grado considerable de variación genética como los KIR humanos. La notable similitud funcional entre los receptores Ly49 y KIR sugiere que estos grupos de receptores han evolucionado de forma independiente, pero convergente, para realizar las mismas funcionales fisiológicas en las células NK y los linfocitos T. Al igual que los KIR en humanos, diferentes receptores Ly49 reconocen diferentes alelos de MHC de clase I y se expresan diferencialmente en subconjuntos de células NK. Los receptores Ly49 prototípicos originales, Ly49A y Ly49C, poseen un dominio citoplasmático que porta dos motivos inhibidores basados en inmunotirosina (ITIM) similares a los KIR inhibidores, tales como KIR2DL3. Se ha identificado que estos dominios reclutan la fosfatasa, SHP-1, y al igual que los KIR inhibidores, sirven para limitar la activación de las células NK y los linfocitos T. Además de las moléculas inhibidoras de Ly49, varios miembros de la familia tales como Ly49D y Ly49H han perdido los dominios que contienen ITIM, y en su lugar han adquirido la capacidad de interactuar con la molécula adaptadora de señalización, DAP12, similar a los KIR activadores, tales como KIR2DS2 en humanos.

[0252] La secuencia de aminoácidos para los miembros de la familia Ly49 está disponible en la base de datos del NCBI, véanse, por ejemplo, los números de acceso AAF82184.1 (GI: 9230810), AAF99547.1 (GI: 9801837), NP_034778.2 (GI: 133922593), NP_034779.1 (GI: 6754462), NP_001095090.1 (GI: 197333718), NP_034776.1 (GI: 21327665), AAK11559.1 (GI: 13021834) y/o NP_038822.3 (GI: 9256549).

[0253] Dominios de señalización intracelular o moléculas adaptadoras, por ejemplo, DAP12

[0254] Algunos CAR-NKR interactúan con otras moléculas, por ejemplo, moléculas que comprenden un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un ITAM. En una realización, un dominio de señalización intracelular es DAP12. DAP12 se denomina así debido a sus características estructurales, y a su presunta función. Ciertos receptores de la superficie celular carecen de funcionalidad intrínseca, que hipotéticamente pueden interactuar con otro compañero proteico, que se sugiere que es una proteína de 12 kD. El mecanismo de señalización puede implicar una señal ITAM. DAP12 se identificó a partir de bases de datos de secuencias basándose en una relación hipotética con CD3 (véase Olcese, et al. (1997) J. Immunol.158:5083-5086), la presencia de una secuencia de ITAM (véase Thomas (1995) J. Exp. Med.181:1953-1956), ciertas predicciones de tamaño (véase Olcese; y Takase, et al. (1997) J. Immunol.159:741-747, y otras características. En particular, se planteó la hipótesis de que el dominio transmembranario contenía un residuo cargado, lo que permitiría un puente salino con los segmentos transmembranarios correspondientes de sus presuntos compañeros receptores, la proteína KIR CD94 y posiblemente otras proteínas similares. Véase Daeron, et al. (1995) Immunity 3:635-646.

[0255] De hecho, muchas de las moléculas conocidas del receptor KIR, MIR, ILT y CD94/NKG2 pueden funcionar realmente con una proteína accesoria que es parte del complejo funcional del receptor. Véanse Olcese, et al. (1997) J. Immunol.

[0256] 158:5083-5086; y Takase, et al. (1997) J. Immunol.159:741-747.

[0257] Un dominio DAP 12, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio citoplasmático de un DAP 12, y normalmente incluirá un dominio ITAM. En una realización, un dominio DAP 12 de un CAR-KIR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o un 99 % de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, una DAP 12 de origen natural o una DAP 12 descrita en el presente documento. En realizaciones, el dominio DAP 12 de un CAR-KIR difiere en no más de un 15, 10, 5, 2 o un 1 % de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, una DAP 12 de origen natural o una DAP 12 descrita en el presente documento. En realizaciones, el dominio DAP 12 de un CAR-KIR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, una DAP 12 de origen natural o una DAP 12 descrita en el presente documento. En realizaciones, el dominio DAP 12 de un CAR-KIR no difiere de, o comparte un 100 % de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, una DAP 12 de origen natural o una DAP 12 descrita en el presente documento.

[0258] DAP10 se identificó en parte por su homología con la DAP12, y otras características. En particular, a diferencia de DAP12, que presenta un motivo de activación de ITAM, DAP 10 presenta un motivo inhibidor ITIM. MDL-1 se identificó por su asociación funcional con DAP12.

[0259] La interacción funcional entre, por ejemplo, DAP12 o DAP10, y su receptor accesorio puede permitir el uso de la combinación estructural en receptores que normalmente no se encuentran en una forma de receptor truncado. Por lo tanto, el mecanismo de señalización a través de proteínas accesorias tales como DAP12 y DAP10 permite una modificación interesante de otros complejos de receptores similares a KIR, por ejemplo, con KIR, MIR, ILT, y receptores de tipo NKG2 CD94. Pueden construirse formas truncadas de receptores intactos que interactúan con DAP12 o DAP 10 para formar un complejo de señalización funcional.

[0260] La secuencia de nucleótidos de primate de DAP12 corresponde a SEQ ID NO: 6; la secuencia de aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 7. La secuencia señal parece ir de Met(-26) a gln(-1) o ala1; la proteína madura debe ir desde aproximadamente ala1 (o gln2), el dominio extracelular desde aproximadamente ala1 hasta pro14; el dominio extracelular contiene dos cisteínas en 7 y 9, que probablemente permiten enlaces disulfuro a proteínas accesorias homotípicas o heterotípicas adicionales; la región transmembranaria va desde aproximadamente gly15 o val16 hasta aproximadamente gly39; y un motivo ITAM desde tyr65 hasta leu79 (YxxL-6/8x-YxxL). Se identificó EST LVA03A y se usó para extraer otras secuencias solapantes. Véanse también las EST humanas de Genbank que son parte de DAP12 humana; algunas, pero no todas, incluidas Genbank n.º de acceso AA481924; H39980; W60940; N41026; R49793; W60864; W92376; H12338; T52100; AA480109; H12392; W74783; y T55959.

[0261] CAR-NKR INHIBIDORES

[0262] La presente divulgación proporciona composiciones y métodos de limitación del agotamiento de células no cancerosas mediante un tipo de terapia con linfocitos T-CAR. Como se divulga en el presente documento, un tipo de terapia con linfocitos T-CAR comprende el uso de receptores NK que incluyen, pero sin limitación, receptores activadores e inhibidores de células NK conocidos como receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos (KIR). Por consiguiente, la divulgación proporciona composiciones y métodos de uso de un CAR-NKR, por ejemplo, un CAR-KIR, incluyendo, pero sin limitación, un CAR-NKR activador (CAR-NKRact), por ejemplo, un CAR-KIR activador (CAR-KIRact) y un CAR-NKR inhibidor (CAR-NKRinh), por ejemplo, un CAR-KIR inhibidor (CAR-KIRinh).

[0263] En algunos casos, el KIR de un CAR-KIRinh es un KIR inhibidor que comprende una cola citoplasmática larga que contiene un motivo inhibidor del inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM), que transduce señales inhibidoras (denominadas en otra parte en el presente documento CAR-KIRinh). La invención proporciona un CAR-KIRinh que comprende (i) un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de una molécula de anticuerpo o que comprende un armazón no de anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a un antígeno diana en una célula; (ii) un dominio transmembranario; y (iii) un dominio citoplasmático que contiene ITIM.

[0264] En algunas realizaciones, un CAR-KIRinh comprende un dominio citoplasmático de una molécula inhibidora distinta de KIR. Las moléculas inhibidoras pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula de organizar una respuesta efectora inmunitaria. Los dominios citoplasmáticos de moléculas inhibidoras pueden acoplarse, por ejemplo, mediante fusión, a dominios transmembranarios de KIR. Las moléculas inhibidoras ilustrativas se muestran en la Tabla 1:

[0266]

[0267]

[0270] En algunas realizaciones, un CAR-KIRinh comprende un dominio citoplasmático PD1. Un dominio citoplasmático de PD1, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio citoplasmático de un PD1. En una realización, el dominio citoplasmático de PD1 de un CAR-KIR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o un 99 % de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático de PD1 de origen natural o un dominio citoplasmático de PD1 descrito en la presente (SEQ ID NO: 14). En realizaciones, el dominio citoplasmático de PD1 de un CAR-KIR difiere en no más de un 15, 10, 5, 2 o un 1 % de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático de PD1 de origen natural o un dominio citoplasmático de PD1 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio citoplasmático de PD1 de un CAR-KIR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático de PD1 de origen natural o un dominio citoplasmático de PD1 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio citoplasmático de PD1 de un CAR-KIR no difiere de, o comparte un 100 % de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático de PD1 de origen natural o un dominio citoplasmático de PD1 descrito en el presente documento.

[0272] En algunas realizaciones, un CAR-KIRinh comprende un dominio citoplasmático de CTLA-4. Un dominio citoplasmático de CTLA-4, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a un dominio polipeptídico que tiene propiedades estructurales y funcionales de un dominio citoplasmático de un CTLA-4. En una realización, el dominio citoplasmático de CTLA-4 de un CAR-KIR tiene al menos un 70, 80, 85, 90, 95 o un 99 % de homología con una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático de CTLA-4 de origen natural o un dominio citoplasmático de CTLA-4 descrito en la presente (SEQ ID NO: 15). En realizaciones, el dominio citoplasmático de CTLA-4 de un CAR-KIR difiere en no más de un 15, 10, 5, 2 o un 1 % de sus residuos de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático de CTLA-4 de origen natural o un dominio citoplasmático de CTLA-4 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio citoplasmático de CTLA-4 de un CAR-KIR difiere en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático de CTLA-4 de origen natural o un dominio citoplasmático de CTLA-4 descrito en el presente documento. En realizaciones, el dominio citoplasmático de CTLA-4 de un CAR-KIR no difiere de, o comparte un 100 % de homología con, una secuencia de referencia, por ejemplo, un dominio citoplasmático de CTLA-4 de origen natural o un dominio citoplasmático de CTLA-4 descrito en el presente documento.

[0274] En una realización, un CAR-NKRinh, por ejemplo, un CAR-KIRinh, tras el acoplamiento con un antígeno en una célula no diana o espectadora, inactiva la célula citotóxica que comprende el CAR-NKRinh. Aunque gran parte de la descripción a continuación se refiere a CAR-KIRinh, la divulgación incluye la aplicación análoga de otros CAR-NKRinh.

[0275] Los linfocitos T que expresan el CAR-KIRact pueden presentar una propiedad antitumoral cuando se unen a su diana, mientras que los linfocitos T que expresan un CAR-KIRinh pueden dar como resultado la inhibición de la actividad celular cuando el CAR-KIRinh está unido a su diana.

[0277] Independientemente del tipo de CAR-KIR, los CAR-KIR se modifican para que comprendan un dominio extracelular que tiene un dominio de unión a antígeno fusionado a un dominio citoplasmático. En un caso, los CAR-KIR, cuando se expresan en un linfocito T, son capaces de redirigir el reconocimiento del antígeno basándose en la especificidad del antígeno. Un antígeno a modo de ejemplo es CD19, debido a que este antígeno se expresa en el linfoma de linfocitos B. Sin embargo, CD19 también se expresa en linfocitos B normales y, por lo tanto, los CAR que comprenden un dominio anti-CD19 pueden dar como resultado el agotamiento de linfocitos B normales. El agotamiento de los linfocitos B normales puede hacer que un sujeto tratado sea susceptible a la infección, ya que los linfocitos B normalmente ayudan a los linfocitos T en el control de la infección. La presente invención proporciona composiciones y métodos de limitación del agotamiento de tejido normal durante la terapia con linfocitos T-CAR-KIR. En una realización, la presente invención proporciona métodos de tratamiento del cáncer y otros trastornos usando terapia con linfocitos T-CAR-KIR, a la vez que limita el agotamiento de células espectadoras sanas.

[0279] En un caso, la divulgación comprende controlar o regular la actividad de linfocitos T-CAR-KIR. En un caso, la divulgación comprende composiciones y métodos relacionados con la modificación genética de linfocitos T para expresar una pluralidad de tipos de CAR-KIR, donde la activación de linfocitos T-CAR-KIR depende de la unión de una pluralidad de tipos de CAR-KIR a su receptor diana. La dependencia de la unión de una pluralidad de tipos de CAR-KIR mejora la especificidad de la actividad lítica del linfocito T-CAR-KIR, reduciendo de este modo el potencial de agotar el tejido sano normal.

[0280] En otro caso, la divulgación comprende composiciones y métodos relacionados con la modificación de linfocitos T con un CAR-KIR inhibidor. En una realización, el CAR-KIR inhibidor comprende un dominio de unión a antígeno extracelular que reconoce un antígeno asociado con una célula normal, no cancerosa, y un dominio citoplasmático inhibidor.

[0281] En una realización, la invención utiliza un CAR-KIR dual donde un linfocito T se modifica para expresar un CAR-KIRinh y un CAR-KIRact. En una realización, la unión del CAR-KIRinh a una célula normal no cancerosa da como resultado la inhibición del linfocito T-CAR-KIR dual. Por ejemplo, en una realización, la unión del CAR-KIRinh a una célula normal no cancerosa da como resultado la muerte del linfocito T-CAR-KIR dual. En otra realización, la unión del CAR-KIRinh a una célula normal no cancerosa da como resultado la inhibición de la transducción de señales del CAR-KIRact. En otra realización más, la unión del CAR-KIRinh a una célula normal no cancerosa da como resultado la inducción de una señal de transducción de señales que evita que el linfocitos T-CAR-KIRact presente su actividad antitumoral. Por consiguiente, el CAR-KIR dual que comprende al menos un CAR-KIRinh y al menos un CAR-KIRact de la invención proporciona un mecanismo para regular la actividad del linfocito T-CAR-KIR dual.

[0282] En una realización, la presente invención se refiere al tratamiento del cáncer y otros trastornos usando terapias con linfocitos T-CAR-KIR a la vez que se minimiza el agotamiento del tejido sano normal. El cáncer puede ser una neoplasia hematológica maligna, un tumor sólido, un tumor primario o un tumor metastásico. Otras enfermedades tratables usando las composiciones y métodos de la invención incluyen infecciones víricas, bacterianas y parasitarias, así como enfermedades autoinmunes.

[0283] DOMINIO BISAGRA EXTRACELULAR

[0284] El dominio bisagra extracelular, como se usa ese término en el presente documento, se refiere a una secuencia polipeptídica de un CAR-NK dispuesto entre el dominio transmembranario y el dominio de unión a antígeno. En una realización, el dominio bisagra extracelular permite una distancia suficiente de la superficie externa de la célula y el dominio de unión a antígeno, así como flexibilidad para minimizar el impedimento estérico entre la célula y el dominio de unión a antígeno. En una realización, el dominio bisagra extracelular es suficientemente corto o flexible para que no interfiera con el acoplamiento de la célula que incluye el CAR-NK con una célula portadora de antígeno, por ejemplo, una célula diana. En una realización, el dominio bisagra extracelular tiene de 2 a 20, 5 a 15, 7 a 12 u 8 a 10 aminoácidos de longitud. En una realización, el dominio bisagra incluye al menos 50, 20 o 10 residuos. En realizaciones, la bisagra tiene de 10 a 300, 10 a 250 o 10 a 200 residuos de longitud. En una realización, la distancia a partir de la cual se extiende la bisagra desde la célula es lo suficientemente corta para que la bisagra no impida el acoplamiento con la superficie de una célula diana. En una realización, la bisagra se extiende menos de 20, 15 o 10 nanómetros desde la superficie de la célula citotóxica. Por lo tanto, la idoneidad para una bisagra puede verse influida tanto por la longitud lineal, el número de residuos aminoacídicos, como por la flexibilidad de la bisagra. Una bisagra de IgG4 puede tener hasta 200 aminoácidos de longitud, pero la distancia que se extiende desde la superficie de la célula citotóxica es menor debido al plegamiento del dominio Ig. Una bisagra de CD8alfa, que es ~43 aminoácidos, es bastante lineal a ~ 8 nm de longitud. Por el contrario, la bisagra C2 y C3 de IgG4 tiene ~200 aminoácidos de longitud, pero tiene una distancia desde la superficie de la célula citotóxica comparable a la de la bisagra de CD8-alfa. Si bien no se desea ceñirse a la teoría, la similitud en la extensión está influenciada por la flexibilidad.

[0285] En algunos casos, el dominio bisagra extracelular es, por ejemplo, una bisagra de una proteína humana, un fragmento de la misma o un conector oligo o polipeptídico corto.

[0286] En algunas realizaciones, la bisagra es una secuencia artificial. En una realización, la bisagra es un conector oligopeptídico corto que comprende un doblete glicina-serina.

[0287] En algunas realizaciones, la bisagra es una secuencia de origen natural. En algunas realizaciones, la bisagra puede ser una bisagra de Ig (inmunoglobulina) humana, o un fragmento de la misma. En una realización, por ejemplo, la bisagra comprende (por ejemplo, consiste en) la secuencia de aminoácidos de la bisagra de IgG4 (SEQ ID NO:49). En una realización, por ejemplo, la bisagra comprende (por ejemplo, consiste en) la secuencia de aminoácidos de la bisagra de IgD (SEQ ID NO:50). En algunas realizaciones, la bisagra puede ser una bisagra de CD8 humano, o un fragmento de la misma. En una realización, por ejemplo, la bisagra comprende (por ejemplo, consiste en) la secuencia de aminoácidos de la bisagra de CD8 (SEQ ID NO:51).

[0288] TCAR

[0289] La terapia con células CAR de la presente divulgación puede comprender CAR-NKR en combinación con un TCAR. En una realización, un TCAR comprende un dominio de unión a antígeno fusionado a un dominio intracelular. En realizaciones, un dominio de señalización intracelular produce una señal intracelular cuando un dominio extracelular, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, al que está fusionado, se une a un contraligando. Los dominios de señalización intracelular pueden incluir dominios de señalización intracelular primarios y dominios de señalización coestimuladores. En una realización, una molécula de TCAR se puede construir para la expresión en una célula inmunitaria, por ejemplo, un linfocito T, de modo que la molécula de TCAR comprende un dominio, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, dominio de señalización coestimulador, dominios inhibidores, etc., que se deriva de un polipéptido que se asocia normalmente con la célula inmunitaria. Por ejemplo, un TCAR para la expresión en un linfocito T puede comprender un dominio 41BB y un dominio CD3 zeta. En este caso, tanto los dominios 41BB como CD3 zeta derivan de polipéptidos asociados con el linfocito T. En otra realización, se puede construir una molécula de TCAR para la expresión en una célula inmunitaria, por ejemplo, un linfocito T, de modo que la molécula de TCAR comprende un dominio que deriva de un polipéptido que no está asociado normalmente con la célula inmunitaria. Como alternativa, un TCAR para la expresión en una célula NK puede comprender un dominio 41BB y un dominio CD3 zeta derivado de un linfocito T (véase, por ejemplo, el documento de patente WO2013/033626). DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR PRIMARIO

[0290] En algunas realizaciones, un dominio de señalización intracelular primario produce una señal intracelular cuando un dominio extracelular, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, al que está fusionado, se une al antígeno afín. Deriva de una molécula estimuladora primaria, por ejemplo, comprende una secuencia intracelular de una molécula estimuladora primaria. Comprende suficiente secuencia de molécula estimuladora primaria para producir una señal intracelular, por ejemplo, cuando un dominio de unión a antígeno al que está fusionado se une al antígeno afín. Una molécula estimuladora primaria es una molécula que, tras unirse al ligando afín, media una respuesta efectora inmunitaria, por ejemplo, en la célula en la que se expresa. Normalmente, genera una señal intracelular que depende de la unión a un ligando afín que comprende antígeno. El complejo TCR/CD3 es una molécula estimuladora primaria a modo de ejemplo; genera una señal intracelular tras la unión al ligando afín, por ejemplo, una molécula MHC cargada con un péptido. Normalmente, por ejemplo, en el caso de la molécula estimuladora primaria de TCR/CD3, la generación de una señal intracelular mediante un dominio de señalización intracelular primario depende de la unión de la molécula estimuladora primaria al antígeno.

[0291] La estimulación puede mediar en la expresión alterada de ciertas moléculas, tales como regulación por disminución de TGF-β, y/o reorganización de estructuras citoesqueléticas, y similares. La estimulación puede, por ejemplo, en presencia de coestimulación, dar como resultado una optimización, por ejemplo, un aumento, en una función efectora inmunitaria del linfocito T. La estimulación, por ejemplo, en el contexto de un linfocito T, puede mediar en una respuesta de linfocitos T, por ejemplo, proliferación, activación, diferenciación, y similares.

[0292] En una realización, el dominio de señalización intracelular primario comprende un motivo de señalización, por ejemplo, un motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina o ITAM. Un dominio de señalización intracelular primario puede comprender secuencias de señalización citoplasmáticas que contienen ITAM de TCR zeta (CD3 zeta), FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (también conocido como "ICOS") y CD66d.

[0293] En la Tabla 2 se proporcionan dominios de señalización intracelular primarios a modo de ejemplo.

[0295]

[0297] Un dominio de señalización intracelular primario comprende un fragmento funcional, o análogo, de una molécula estimuladora primaria (por ejemplo, CD3 zeta - Acc de GenBank. n.º BAG36664.1). Puede comprender toda la región intracelular o un fragmento de la región intracelular que es suficiente para la generación de una señal intracelular cuando un dominio de unión a antígeno al que está fusionado, o acoplado por un interruptor de dimerización, se une al antígeno afín. En realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario tiene al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o un 99 % de identidad de secuencia con una molécula estimuladora primaria de origen natural, por ejemplo, un ser humano (Acc. de GenBank n.º BAG3664.1) u otro mamífero, por ejemplo, una especie no humana, por ejemplo, molécula estimuladora primaria intracelular de roedor, mono, simio o murina. En realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario tiene al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 13.

[0298] En realizaciones, el dominio de señalización intracelular primario tiene al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o un 99 % de identidad con, o difiere en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos aminoacídicos de los residuos correspondientes de una molécula estimuladora primaria humana de origen natural, por ejemplo, una molécula estimuladora primaria humana de origen natural divulgada en el presente documento.

[0299] DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN COESTIMULADOR

[0300] En una realización, un dominio de señalización coestimulador produce una señal intracelular cuando un dominio extracelular, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno al que está fusionado o acoplado por un interruptor de dimerización, se une al ligando afín. Deriva de una molécula coestimuladora. Comprende suficiente secuencia de molécula coestimuladora primaria para producir una señal intracelular, por ejemplo, cuando un dominio extracelular, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno, al que está fusionado o acoplado por un interruptor de dimerización, se une al ligando afín.

[0301] Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígenos o sus ligandos que contribuyen a una respuesta inmunitaria eficiente. En algunos casos, son necesarios para una respuesta inmunitaria eficaz o mejorada. Normalmente, una molécula coestimuladora genera una señal intracelular que depende de la unión a un ligando afín que es, en realizaciones, distinto de un antígeno, por ejemplo, el antígeno reconocido por un dominio de unión a antígeno de un linfocito T. Normalmente, la señalización de una molécula estimuladora primaria y una molécula coestimuladora contribuye a una respuesta efectora inmunitaria y, en algunos casos, ambas son necesarias para la generación eficaz o potenciada de una respuesta efectora inmunitaria.

[0302] Un dominio coestimulador comprende un fragmento funcional, o análogo, de una molécula coestimuladora (por ejemplo, 4-1BB). Puede comprender toda la región intracelular o un fragmento de la región intracelular que es suficiente para la generación de una señal intracelular, por ejemplo, cuando un dominio de unión a antígeno al que está fusionado, o acoplado por un interruptor de dimerización, se une al antígeno afín. En realizaciones, el dominio coestimulador tiene al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o un 99 % de identidad de secuencia con una molécula coestimuladora de origen natural, por ejemplo, un ser humano u otro mamífero, por ejemplo, una especie no humana, por ejemplo, una molécula coestimuladora intracelular de roedor, mono, simio o murina. En realizaciones, el dominio coestimulador tiene al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 12. En la Tabla 3 se proporcionan dominios de señalización coestimuladores a modo de ejemplo (dominios de señalización intracelular).

[0304]

[0306] En realizaciones, el dominio de señalización coestimulador tiene al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o un 99 % de identidad con, o difiere en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos aminoacídicos de los residuos correspondientes de una molécula estimuladora primaria humana de origen natural, por ejemplo, una molécula coestimuladora humana de origen natural divulgada en el presente documento.

[0307] DOMINIO DE UNIÓN A ANTÍGENO

[0309] Los CAR descritos en el presente documento, por ejemplo, los CAR-KIR descritos en el presente documento, incluyen un dominio de unión a antígeno en la región extracelular. Un "dominio de unión a antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que tiene afinidad por un antígeno diana, normalmente un antígeno en una célula diana, por ejemplo, una célula cancerosa. Un dominio de unión a antígeno a modo de ejemplo comprende un polipéptido, por ejemplo, una molécula de anticuerpo (que incluye un anticuerpo, y fragmentos de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, una inmunoglobulina, un anticuerpo de dominio único (sdAb) y un scFv), o un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina y similares. En realizaciones, el dominio de unión a antígeno es un único polipéptido. En realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende uno, dos o más polipéptidos. Un CAR-KIRinh de la invención comprende un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de una molécula de anticuerpo o comprende un armazón no de anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a un antígeno diana en una célula.

[0311] La elección del elemento de unión puede depender del tipo y número de ligandos o receptores que definen la superficie de una célula diana. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno se puede elegir para reconocer un ligando o receptor que actúa como marcador de la superficie celular sobre células diana asociadas a un estado patológico particular. Los ejemplos de marcadores de la superficie celular que pueden actuar como ligandos o receptores incluyen un marcador de la superficie celular asociado con un estado patológico particular, por ejemplo, marcadores de la superficie celular para enfermedades víricas, enfermedades bacterianas, infecciones parasitarias, enfermedades autoinmunes y trastornos asociados con la proliferación celular no deseada, por ejemplo, un cáncer, por ejemplo, un cáncer descrito en el presente documento.

[0313] En el contexto de la presente divulgación, "antígeno tumoral" o "antígeno de trastorno proliferativo" o "antígeno asociado con un trastorno proliferativo" se refiere a antígenos que son comunes a trastornos proliferativos específicos. En ciertos aspectos, los antígenos del trastorno proliferativo de la presente divulgación derivan de cánceres que incluyen, pero sin limitación, melanoma primario o metastásico, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón (por ejemplo, NSCLC o SCLC), cáncer de hígado, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Hodgkin, leucemias, mieloma múltiple, glioblastoma, neuroblastoma, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer renal, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y adenocarcinomas, tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de colon y similares. En algunas realizaciones, el cáncer es leucemia linfoide aguda de linfocitos B ("BALL"), leucemia linfoide aguda de linfocitos T ("TALL"), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML); una o más leucemias crónicas que incluyen, pero sin limitación, leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL); cánceres hematológicos o afecciones hematológicas adicionales que incluyen, pero sin limitación, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, neoplasia blástica de células dendríticas plasmacitoides, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular de células pequeñas o células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia y síndrome mielodisplásico, linfoma no hodgkiniano, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides, macroglobulinemia de Waldenstrom,

[0314] En una realización, el antígeno tumoral comprende uno o más epítopos de cáncer antigénicos reconocidos inmunológicamente por linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) derivados de un tumor canceroso de un mamífero.

[0315] Los antígenos de tumor son proteínas que se producen por células tumorales que provocan una respuesta inmunitaria, particularmente respuestas inmunitarias de linfocitos T. La selección del dominio de unión a antígeno de la invención dependerá del tipo particular de cáncer que se va a tratar. Los antígenos tumorales son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, un antígeno asociado a glioma, antígeno carcinoembrionario (CEA), EGFRvIII, IL-11Ra, IL-13Ra, EGFR, B7H3, Kit, CA-IX, CS-1, MUC1, BCMA, bcr-abl, HER2, gonadotropina coriónica β-humana, alfafetoproteína (AFP), ALK, CD19, CD123, ciclina B1, AFP reactiva con lectina, antígeno 1 relacionado con Fos, ADRB3, tiroglobulina, EphA2, RAGE-1, RU1, RU2, SSX2, AKAP-4, LCK, OY-TES1, PAX5, SART3, CLL-1, fucosil GM1, GloboH, MN-CA IX, EPCAM, EVT6-AML, TGS5, transcriptasa inversa de telomerasa humana, ácido polisiálico, PLAC1, RU1, RU2 (AS), carboxil esterasa intestinal, lewisY, sLe, LY6K, mut hsp70-2, M-CSF, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, prostasa, antígeno prostático específico (PSA), PAX3, PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, LMP2, NCAM, p53, mutante de p53, mutante de Ras, gp100, prosteína OR51E2, PANX3, PSMA, PSCA, Her2/neu, hTERT, HMWMAA, HAVCR1, VEGFR2, PDGFR-beta, legumaína, VPH E6,E7, survivina y telomerasa, proteína espermática 17, SSEA-4, tirosinasa, TARP, WT1, antígeno tumoral de carcinoma de próstata-1 (PCTA-1), ML-IAP, MAGE-A1, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Melan-A/MART1, XAGE1, ELF2M, ERG (gen de fusión de ETS TMPRSS2), NA17, elastasa de neutrófilos, puntos de rotura de la translocación de sarcoma, NY-BR-1, efrina B2, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD97, CD171, CD179a, receptor androgénico, factor de crecimiento de insulina (IGF)-I, IGF-II, receptor de IGF-I, GD2, oacetil-GD2, GD3, GM3, GPRC5D, GPR20, CXORF61, receptor de folato (FRa), receptor de folato beta, ROR1, Flt3, TAG72, TN Ag, Tie 2, TEM1, TEM7R, CLDN6, TSHR, UPK2 y mesotelina. En una realización preferida, el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en el receptor de folato (FRa), mesotelina, EGFRvIII, IL-13Ra, CD123, CD19, CD33, BCMA, GD2, CLL-1, CA-IX, MUC1, HER2 y cualquier combinación de los mismos.

[0317] En una realización, el antígeno de tumor comprende uno o más epítopes antigénicos de cáncer asociados a un tumor maligno. Los tumores malignos expresan varias proteínas que pueden servir de antígenos diana para un ataque inmunitario. Estas moléculas incluyen, pero sin limitación, antígenos específicos de tejido tales como MART-1, tirosinasa y GP 100 en melanoma y fosfatasa ácida prostática (PAP) y antígeno específico de próstata (PSA) en cáncer de próstata. Otros antígenos diana incluyen moléculas relacionadas con la transformación, tales como el oncogén HER-2/Neu/ErbB-2. Otro grupo más de antígenos diana son los antígenos oncofetales, tales como el antígeno carcinoembrionario (CEA). En el linfoma de linfocitos B, la inmunoglobulina de idiotipo específico de tumor constituye verdaderamente un antígeno de inmunoglobulina específico de tumor que es único para el tumor individual. Los antígenos de diferenciación de linfocitos B tales como CD19, CD20 y CD37 son otros candidatos para antígenos diana en el linfoma de linfocitos B.

[0318] Los ejemplos no limitativos de antígenos tumorales incluyen los siguientes: antígenos de diferenciación tales como MART-1/MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2 y antígenos multilinaje específicos de tumor tales como MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; antígenos embrionarios expresados en exceso tales como CEA; oncogenes expresados en exceso y genes supresores de tumores mutados tales como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos de tumor únicos resultantes de translocaciones cromosómicas; tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MIL-RAR; y antígenos víricos, tales como los antígenos del virus de Epstein Barr EBVA y los antígenos del virus del papiloma humano (VPH) E6 y E7. Otros antígenos grandes basados en proteína incluyen TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-catenina, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoproteína, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90\proteína de unión a Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C, TAAL6, TAG72, TLP y TPS.

[0319] Dependiendo del antígeno deseado que se va a dirigir, el CAR de la invención puede modificarse para incluir el dominio de unión a antígeno apropiado que es específico para la diana de antígeno deseada.

[0320] Dominios de unión a antígeno derivados de una molécula de anticuerpo

[0321] El dominio de unión a antígeno puede derivar de una molécula de anticuerpo, por ejemplo, uno o más de anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de un solo dominio, por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable (VHH) de, por ejemplo, origen humano o de camélido. En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión a antígeno derive de la misma especie en la que se usará finalmente el CAR, por ejemplo, para su uso en seres humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión a antígeno del CAR, por ejemplo, el CAR-KIR, por ejemplo, descrito en el presente documento, comprenda un dominio de unión a antígeno humano o humanizado. Los anticuerpos pueden obtenerse usando técnicas conocidas en la técnica.

[0322] El término "anticuerpo", como se usa en este documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente con un antígeno diana. Un anticuerpo puede ser una inmunoglobulina intacta derivada de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y puede ser una porción inmunorreactiva de inmunoglobulina intacta. Los anticuerpos son normalmente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. La molécula de anticuerpo descrita en el presente documento puede existir en una variedad de formas en las que la porción de unión a antígeno del anticuerpo se expresa como parte de una cadena polipeptídica contigua que incluye, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de dominio único (sdAb), un anticuerpo monocatenario (scFv) y un anticuerpo humano o humanizado, por ejemplo, como se describe en el presente documento.

[0323] La expresión "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables determinantes antigénicas de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero sin limitación, un anticuerpo de una sola cadena (sdAb), fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos scFv, un anticuerpo lineal, anticuerpo de dominio único, tal como un sdAb (ya sea VL o VH), un dominio VHH de camélido y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

[0324] Una "cadena pesada de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a la más grande de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en todas las moléculas de anticuerpo en sus conformaciones de origen natural.

[0325] Una "cadena ligera de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a la más pequeña de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en todas las moléculas de anticuerpo en sus conformaciones de origen natural. Las cadenas ligeras κ y λ se refieren a los dos isotipos principales de la cadena ligera del anticuerpo.

[0326] Por la expresión "anticuerpo sintético", como se usa en el presente documento, se entiende una molécula de anticuerpo que se genera usando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, una molécula de anticuerpo expresada por un bacteriófago, como se describe en el presente documento. El término también debe interpretarse en el sentido de que significa una molécula de anticuerpo que ha sido generado por la síntesis de una molécula de ADN que codifica la molécula de anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, en el que la secuencia de ADN o de aminoácidos se ha obtenido usando tecnología de secuencia de ADN o de aminoácidos sintética que está disponible y es bien conocida en la técnica.

[0327] En realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende un fragmento de un anticuerpo que es suficiente para conferir reconocimiento y unión específica al antígeno diana. Ejemplos de un fragmento de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, un fragmento Fab, Fab', F(ab')<2>o Fv, un fragmento de anticuerpo scFv, un anticuerpo lineal, un anticuerpos de dominio único, tal como un sdAb (ya sea VL o VH), un dominio VHH de camélido y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

[0328] En una realización, el dominio de unión a antígeno es un "scFv", que puede comprender una proteína de fusión que comprende una cadena VL y una cadena VH de un anticuerpo, donde VH y VL están, por ejemplo, unidas a través de un conector polipeptídico flexible corto, por ejemplo, un conector descrito en el presente documento. El scFv es capaz de expresarse como un polipéptido monocatenario y conserva la especificidad del anticuerpo intacto del que deriva. Además, las cadenas variables VL y VH pueden unirse en cualquier orden, por ejemplo, con respecto a los extremos aminoterminal y carboxiterminal del polipéptido, el scFv puede comprender VL-conector-VH o puede comprender VH-conector-VL. Un scFv que puede prepararse según un método conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883).

[0329] Como se describe anteriormente y en cualquier parte, las moléculas scFv se pueden producir uniendo las cadenas VH y VL entre sí usando conectores polipeptídicos flexibles. En algunas realizaciones, las moléculas de scFv comprenden un conector polipeptídico flexible con una longitud y/o composición de aminoácidos optimizada. La longitud del conector polipeptídico flexible puede afectar en gran medida cómo se pliegan e interactúan las regiones variables de un scFv. De hecho, si se emplea un conector polipeptídico corto (por ejemplo, entre 5-10 aminoácidos), se evita el plegamiento intercatenario. Para ejemplos de la orientación y tamaño de conectores, véanse, por ejemplo, Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.º 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, y publicaciones PCT n.º WO2006/020258 y WO2007/024715. En una realización, el conector polipeptídico del scFv consiste en aminoácidos tales como residuos de glicina y/o serina usados solos o en combinación, para unir juntas regiones variables de cadena pesada y variables de cadena ligera. En una realización, el conector polipeptídico flexible es un conector Gly/Ser y, por ejemplo, comprende la secuencia de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n, en donde n es un número entero positivo igual a o mayor que 1. Por ejemplo, n = 1, n = 2, n = 3, n = 4, n = 5 y n = 6, n = 7, n = 8, n = 9 y n = 10. En una realización, los conectores polipeptídicos flexibles incluyen, pero sin limitación, (Gly4Ser)4 o (Gly4Ser)3. En otra realización, los conectores incluyen múltiples repeticiones de (Gly2Ser), (GlySer) o (Gly3Ser).

[0330] En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno es una molécula de unión a antígeno de un solo dominio (SDAB). Una molécula SDAB incluye moléculas cuyas regiones determinantes complementarias forman parte de un polipéptido de un solo dominio. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, dominios variables de cadena pesada, moléculas de unión naturalmente desprovistas de cadenas ligeras, dominios únicos derivados de anticuerpos de 4 cadenas convencionales, dominios modificados por ingeniería genética y armazones de dominio único diferentes a los derivados de anticuerpos (por ejemplo, descrito a continuación con mayor detalle). Las moléculas SDAB pueden ser cualquiera de la técnica, o cualquier molécula futura de dominio único. Las moléculas SDAB pueden derivar de cualquier especie, incluyendo, pero no se limitan a, ratones, humanos, camellos, llamas, peces, tiburones, cabras, conejos y bovinos. Este término también incluye moléculas de anticuerpos de dominio único que se producen naturalmente de especies distintas deCamelidaey tiburones.

[0331] En un aspecto, una molécula SDAB puede derivar de una región variable de la inmunoglobulina que se encuentra en el pez, tal como, por ejemplo, la que procede del isotipo de inmunoglobulina conocido como receptor de antígeno nuevo (NAR) que se encuentra en el suero de tiburón. Los métodos de producción de moléculas de dominio único derivadas de una región variable de NAR ("IgNAR") se describen en el documento de patente WO 03/014161 y en Streltsov (2005) Protein Sci.14:2901-2909.

[0332] Según otro aspecto, una molécula SDAB es una molécula de unión al antígeno de dominio único de origen natural conocida como a cadena pesada desprovista de cadenas ligeras. Dichas moléculas de dominio único se divulgan en el documento de patente WO 9404678 y en Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448, por ejemplo. Por razones de claridad, este dominio variable derivado de una molécula de cadena pesada desprovista de forma natural de cadena ligera se conoce en el presente documento como VHH o nanocuerpo para distinguirla del VH convencional de inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Dicha molécula VHH puede derivar de especies deCamelidae, por ejemplo, de camello, llama, dromedario, alpaca y guanaco. Otras especies además deCamelidaepueden producir moléculas de cadena pesada desprovistas de forma natural de la cadena ligera; dichas VHH están dentro del alcance de la invención.

[0333] En ciertas realizaciones, la molécula SDAB es un polipéptido de fusión monocatenario que comprende una o más moléculas de dominio único (por ejemplo, nanocuerpos), desprovisto de un dominio variable complementario o una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, Fc, que se une a uno o más antígenos diana.

[0334] Las moléculas SDAB pueden ser recombinantes, injertadas con CDR, humanizadas, camelizadas, desinmunizadas y/o generadas in vitro (por ejemplo, seleccionadas mediante presentación en fagos).

[0336] En una realización, la parte del dominio de unión a antígeno comprende un anticuerpo humano o un fragmento del mismo.

[0338] En algunos aspectos, un anticuerpo no humano se humaniza, en el que se modifican secuencias o regiones específicas del anticuerpo para aumentar la similitud con un anticuerpo producido naturalmente en un ser humano. En una realización, el dominio de unión a antígeno está humanizado.

[0340] Los anticuerpos no humanos pueden humanizarse usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, injerto de CDR (véase, por ejemplo, la patente europea n.º EP 239,400; publicación internacional n.º WO 91/09967; y las patentes de EE. UU. n.º 5,225,539, 5,530,101 y 5,585,089), inactivación o acondicionamiento superficial (véanse, por ejemplo, las patentes europeas n.º EP 592,106 y EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973), barajado de cadenas (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 5,565,332) y técnicas divulgadas en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.º US2005/0042664, publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.º US2005/0048617, patente de EE. UU. n.º 6,407,213, patente de EE. UU. n.º 5,766,886, publicación internacional n.º WO 9317105, Tan et al., 2002, J. Immunol., 169:1119-25; Caldas et al., 2000, Protein Eng., 13(5):353-60; Morea et al., 2000, Methods, 20:267-79; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem., 272:10678-84; Roguska et al., 1996, Protein Eng., 9(10):895-904; Couto et al., 1995, Cancer Res., 55:5973s-5977; Couto et al., 1995, Cancer Res., 55(8):1717-22; Sandhu 1994 Gene, 150(2):409-10; y Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol., 235(3):959-73. A menudo, los residuos estructurales en las regiones estructurales se sustituirán con el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, por ejemplo, mejorar, la unión del antígeno. Estas sustituciones estructurales se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de la CDR y los residuos estructurales para identificar residuos estructurales importantes para la unión del antígeno y la comparación de secuencias para identificar residuos estructurales inusuales en posiciones particulares. (Véanse, por ejemplo, Queen et al., patente de EE.UU. n.º 5,585,089; y Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323). En realizaciones preferidas, la molécula de anticuerpo humanizado comprende una secuencia descrita en el presente documento, por ejemplo, una cadena ligera variable y/o una cadena pesada variable descrita en el presente documento, por ejemplo, una cadena ligera variable humanizada y/o cadena pesada variable descrita en la Tabla 4.

[0341] Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoacídicos introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoacídicos no humanos a menudo se denominan residuos "de importación", que normalmente se toman de un dominio variable de "importación". Por lo tanto, los anticuerpos humanizados comprenden una o más CDR de moléculas de inmunoglobulina no humana y regiones estructurales del ser humano. En la técnica se conoce bien la humanización de anticuerpos y se pueden realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo CDR de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano, es decir, injerto de CDR (documento de patente EP 239,400; publicación PCT n.º WO 91/09967; y patentes de EE. UU. n.º 4,816,567; 6,331,415; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 6,548,640). En dichos anticuerpos quiméricos humanizados, sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos estructurales (FR) se sustituyen con residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La humanización de anticuerpos también puede lograrse mediante inactivación o acondicionamiento superficial (documentos de patente EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); y Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) o barajado de cadenas (patente de EE. UU. n.º 5,565,332).

[0343] En algunas realizaciones, el anticuerpo de la invención se prepara además usando un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL que se muestran en el presente documento como material de partida para manipular un anticuerpo modificado, pudiendo tener dicho anticuerpo modificado propiedades alteradas en comparación con el anticuerpo de partida. En diversas realizaciones, el anticuerpo se manipula modificando uno o más aminoácidos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo, dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones estructurales.

[0345] En otro aspecto, el dominio de unión a antígeno es un receptor de linfocitos T ("TCR"), o un fragmento del mismo, por ejemplo, un TCR monocatenario (TCRmc). Se conocen en la técnica métodos de preparación de dichos TCR. Véanse, por ejemplo, Willemsen RA et al., Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther.19(4):365-74 (2012). Por ejemplo, se puede modificar por un TCRmc que contenga los genes Vα y Vβ de un clon de linfocito T unido por un conector (por ejemplo, un péptido flexible). Este enfoque es muy útil para la diana asociada al cáncer que en sí misma es intracelular, sin embargo, el MHC presenta un fragmento de dicho antígeno (péptido) en la superficie de las células cancerosas.

[0346] Tabla 4: Dominios de unión a antígeno a modo de ejemplo

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[0351] Armazones no de anticuerpo

[0352] En las realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende un armazón no de anticuerpo, por ejemplo, una fibronectina, anquirina, anticuerpo de dominio, lipocalina, inmunofármaco modular pequeño, maxicuerpo, Proteína A o afilina. El armazón no de anticuerpo tiene la capacidad de unirse al antígeno diana en una célula. En las realizaciones, el dominio de unión a antígeno es un polipéptido o fragmento de este de una proteína de origen natural expresada en una célula. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende un armazón no de anticuerpo. Puede emplearse una amplia diversidad de armazones no de anticuerpo, siempre que el polipéptido resultante incluya al menos una región de unión que se una específicamente al antígeno diana en una célula diana.

[0353] Los armazones no de anticuerpo incluyen: fibronectina (Novartis, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zúrich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd., Cambridge, MA y Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), inmunofármacos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxicuerpos (Avidia, Inc., Mountain View, CA), Proteína A (Affibody AG, Suecia) y afilina (gamma-cristalina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania).

[0354] Los armazones de fibronectina pueden basarse en el dominio de fibronectina tipo III (por ejemplo, el décimo módulo de la fibronectina tipo III (dominio<10>Fn3)). El dominio de fibronectina de tipo III tiene 7 u 8 cadenas beta que se distribuyen entre dos láminas beta, que se compactan entre sí para formar el núcleo de la proteína, y además contienen bucles (análogos a las CDR) que conectan las cadenas beta entre sí. y están expuestos a disolventes. Hay al menos tres de estos bucles en cada borde del sándwich de lámina beta, en los que el borde es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las cadenas beta (véase US 6,818,418). Debido a esta estructura, este armazón no de anticuerpo imita propiedades de unión a antígeno que son de naturaleza y afinidad similar a las de los anticuerpos. Estos armazones se pueden usar en una estrategia de aleatorización de bucle y entremezclado aleatorio in vitro que es similar al proceso de maduración por afinidad de anticuerpos in vivo.

[0355] La tecnología de anquirina se basa en el uso de proteínas con módulos repetidos derivados de anquirina como armazones para portar regiones variables que se pueden usar para unirse a diferentes dianas. El módulo de repetición de anquirina es un polipéptido de 33 aminoácidos que consiste en dos hélices α antiparalelas y un giro β. La unión de las regiones variables se optimiza principalmente usando la presentación de ribosomas.

[0356] Los avímeros derivan de proteínas que contienen un dominio A natural, tal como HER3. Estos dominios se usan, por su naturaleza, para interacciones proteína-proteína, y en seres humanos más de 250 proteínas se basan estructuralmente en dominios A. Los avímeros consisten en un determinado número de monómeros de "dominio A" diferentes (2-10) unidos a través de conectores aminoacídicos. Pueden crearse avímeros que se pueden unir al antígeno diana usando la metodología descrita, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. n.º 20040175756; 20050053973; 20050048512; y 20060008844.

[0357] Los ligandos de afinidad de Affibody son proteínas pequeñas y sencillas compuestas por un haz de tres hélices basado en el armazón de uno de los dominios de unión a IgG de la Proteína A. La Proteína A es una proteína de superficie de la bacteria Staphylococcus aureus. Este dominio de armazón consiste en 58 aminoácidos, 13 de los cuales se aleatorizan para generar bibliotecas de Affibody con una gran cantidad de variantes de ligando (véase, por ejemplo, el documento de patente US 5,831,012). Las moléculas de Affibody imitan a los anticuerpos, tienen un peso molecular de 6 kDa, en comparación con el peso molecular de los anticuerpos, que es de 150 kDa. A pesar de su pequeño tamaño, el sitio de unión de las moléculas de Affibody es similar al de un anticuerpo.

[0358] Los miméticos de epítopos de proteínas (PEM) son moléculas cíclicas de tamaño mediano, similares a péptidos (peso molecular 1-2 kDa) que imitan las estructuras secundarias de horquilla beta de las proteínas, la principal estructura secundaria involucrada en las interacciones proteína-proteína.

[0359] DOMINIOS DE UNIÓN A ANTÍGENO

[0360] Se ha descubierto que cada una de las células que tiene una pluralidad de receptores quiméricos integrados en membrana comprende un dominio de unión a antígeno (CMER), que las interacciones entre el dominio de unión a antígeno del CMER pueden ser no deseables, por ejemplo, debido a que inhibe la capacidad de uno o más de los dominios de unión al antígeno para unirse a su antígeno afín. Por consiguiente, en la presente se divulgan un primer y un segundo CMER de origen no natural que comprenden dominios de unión a antígeno que minimizan dichas interacciones cuando se expresan en la misma célula. En un caso, una pluralidad de CMER comprende dos TCAR. En un caso, una pluralidad de CMER comprende un TCAR y otro CMER. En un caso, una pluralidad de CMER comprende dos CAR-NKR. En un caso, una pluralidad de CMER comprende un CAR-NKR y otro CMER. En un caso, una pluralidad de CMER comprende un TCAR y un CAR-NKR.

[0361] En algunos casos, la divulgación comprende un primer y un segundo CMER, en donde el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CMER y dicho segundo CMER no comprende un dominio ligero variable y un dominio pesado variable. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CMER y dicho segundo CMER es un scFV, y el otro no es un scFv. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CMER y dicho segundo CMER comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CMER y dicho segundo CMER comprende un nanocuerpo. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CMER y dicho segundo CMER comprende un dominio VHH de camélido.

[0362] En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CMER y dicho segundo CMER comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer único y dicho segundo único comprende un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno del primer CMER y dicho segundo CMER comprende un scFV, y el otro comprende un dominio VHH de camélido.

[0363] En algunos casos, cuando están presentes en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer CMER a su antígeno afín no se ve reducida de manera sustancial por la presencia de dicho segundo CMER. En algunos casos, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer CMER a su antígeno afín en presencia de dicho segundo CMER es un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer CMER a su antígeno afín en ausencia de dicho segundo CMER.

[0364] En algunas realizaciones, cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión al antígeno de dicho primer CMER y dicho segundo CMER se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión al antígeno scFv. En algunos casos, los dominios de unión a antígeno de dicho primer CMER y dicho segundo CMER se asocian entre sí un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv.

[0365] En algunos casos, la divulgación comprende un primer y un segundo CAR-KIR, en donde el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR no comprende un dominio ligero variable y un dominio pesado variable. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un scFv, y el otro no es un scFv. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un nanocuerpo. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un dominio VHH de camélido.

[0366] En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR es un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VHH de camélido.

[0367] En algunos casos, cuando está presente en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer CAR-KIR a su antígeno afín no se ve reducida de manera sustancial por la presencia de dicho segundo CAR-KIR. En algunos casos, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer CAR-KIR a su antígeno afín en presencia de dicho segundo CAR-KIR es un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer CAR-KIR a su antígeno afín en ausencia de dicho segundo CAR-KIR.

[0368] En algunas realizaciones, cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión a antígenos de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv. En algunos casos, los dominios de unión a antígeno de dicho primer CAR-KIR y dicho segundo CAR-KIR se asocian entre sí un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv.

[0369] En algunos casos, la divulgación comprende un primer y un segundo TCAR, en donde el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer TCAR y dicho segundo TCAR no comprende un dominio ligero variable y un dominio pesado variable. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer TCAR y dicho segundo TCAR es un scFV, y el otro no es un scFv. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno de uno de dicho primer TCAR y dicho segundo TCAR comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón, o un armazón no de anticuerpo. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer TCAR y dicho segundo TCAR comprende un nanocuerpo. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer TCAR y dicho segundo TCAR comprende un dominio VHH de camélido.

[0370] En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer TCAR y dicho segundo TCAR comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno de dicho primer TCAR y dicho segundo TCAR comprende un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno de uno del primer TCAR y dicho segundo TCAR comprende un scFV, y el otro comprende un dominio VHH de camélido.

[0371] En algunos casos, cuando están presentes en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer TCAR a su antígeno afín no se ve reducida de manera sustancial por la presencia de dicho segundo TCAR. En algunos casos, la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer TCAR a su antígeno afín en presencia de dicho segundo TCAR es un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de la unión del dominio de unión a antígeno de dicho primer TCAR a su antígeno afín en ausencia de dicho segundo TCAR.

[0372] En algunos casos, cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión al antígeno de dicho primer TCAR y dicho segundo TCAR se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión al antígeno scFv. En algunos casos, los dominios de unión a antígeno de dicho primer TCAR y dicho segundo TCAR se asocian entre sí un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv.

[0373] VECTORES

[0374] La presente divulgación también proporciona vectores en los que se inserta un ADN de la presente divulgación. Los vectores derivados de retrovirus, tales como el lentivirus, son herramientas adecuadas para conseguir la transferencia de genes a largo plazo, ya que permiten la integración estable a largo plazo de un transgén y su propagación en células hijas. Los vectores lentivíricos tienen la ventaja añadida frente a los vectores derivados de oncorretrovirus, tales como los virus de la leucemia murina, de que pueden transducir células no proliferantes, tales como los hepatocitos. También tienen la ventaja añadida de una baja inmunogenicidad. En un breve resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican CAR se logra normalmente uniendo operativamente un ácido nucleico que codifica el polipéptido CAR o porciones del mismo a un promotor e incorporando la construcción en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para replicación e integración en eucariotas. Los vectores de clonación típicos contienen terminadores de la transcripción y de la traducción, secuencias de iniciación, y promotores útiles para la regulación de la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada.

[0375] El ácido nucleico se puede clonar en varios tipos de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico se puede clonar en un vector, que incluye, pero sin limitación, un plásmido, un fago, un derivado de fago, un virus animal y un cósmido. Vectores de particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación.

[0376] Además, el vector de expresión puede proporcionarse a una célula en forma de un vector vírico. La tecnología de vectores víricos es muy conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY), y en otros manuales de virología y biología molecular. Virus que son útiles como vectores incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios de endonucleasa de restricción convenientes y uno o más marcadores de selección (por ejemplo, los documentos de patente WO 01/96584; WO 01/29058; y la patente de EE. UU. n.º 6,326,193).

[0377] Elementos promotores adicionales, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia del inicio de la transcripción. Normalmente, estos están ubicados en la región 30-110 pb aguas arriba del sitio de inicio, aunque recientemente se ha demostrado que una serie de promotores también contienen elementos funcionales aguas abajo del sitio de inicio. El espaciado entre elementos promotores suele ser flexible, de modo que la función promotora se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven respectivamente. En el promotor de timidina cinasa (tk), el espaciado entre elementos promotores puede aumentar a 50 pb de distancia antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar de manera cooperativa o independiente para activar la transcripción.

[0378] Un ejemplo de un promotor es la secuencia promotora del citomegalovirus (CMV) temprano inmediato. Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte capaz de impulsar altos niveles de expresión de cualquier secuencia polinucleotídica unida operativamente a ella. Sin embargo, también se pueden usar otras secuencias promotoras constitutivas, que incluye, pero sin limitación, el promotor temprano del virus de simios 40 (SV40), el promotor del virus del tumor mamario del ratón (MMTV), el promotor de repetición terminal larga (LTR) del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el promotor MoMuLV, un promotor del virus de la leucemia aviar, un promotor temprano inmediato del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor del factor de elongación-1α, así como promotores de genes humanos tales como, pero no se limitan a, el promotor de actina, el promotor de miosina, el promotor de hemoglobina y el promotor de la creatina cinasa. Además, la divulgación no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. Promotores inducibles también se contemplan como parte de la divulgación. El uso de un promotor inducible proporciona un interruptor molecular capaz de conectar la expresión de la secuencia polinucleotídica a la que está unida operativamente cuando se desea una expresión de este tipo, o desconectar la expresión cuando no se desea la expresión. Ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, un promotor de metalotioneína, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina.

[0379] En un caso, el vector es un vector de lentivirus. En una realización, el vector comprende, además, un promotor. En un caso, el promotor es un promotor EF-1.

[0380] En un caso, el vector es un vector transcrito in vitro, por ejemplo, un vector que transcribe ARN de una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento. En un caso, la secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además una cola de poli(A), por ejemplo, una cola de poli A descrita en el presente documento, por ejemplo, que comprende aproximadamente 150 bases de adenosina. En un caso, la secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además, una UTR 3'.

[0381] Para evaluar la expresión de un polipéptido CAR o porciones del mismo, el vector de expresión que se va a introducir en una célula también puede contener un gen marcador de selección o un gen indicador o ambos para facilitar la identificación y selección de células expresoras de la población de células que se busca transfectar o infectar a través de vectores víricos. En otros aspectos, el marcador de selección puede transportarse en un trozo separado de ADN y usarse en un procedimiento de cotransfección. Tanto los marcadores de selección como los genes indicadores pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras apropiadas para permitir la expresión en las células hospedadoras. Marcadores de selección útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tales como neo y similares. Se usan genes indicadores para identificar células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen indicador es un gen que no está presente ni es expresado por el organismo o tejido receptor y que codifica un polipéptido cuya expresión se manifiesta por alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, actividad enzimática. La expresión del gen indicador se analiza en un momento adecuado después de que el ADN se haya introducido en las células receptoras. Los genes indicadores adecuados pueden incluir genes que codifican luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína fluorescente verde (por ejemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Los sistemas de expresión adecuados son bien conocidos y pueden prepararse usando técnicas conocidas u obtenerse comercialmente. En general, la construcción con la región flanqueante 5' mínima que muestra el mayor nivel de expresión del gen indicador se identifica como el promotor. Dichas regiones promotoras pueden estar vinculadas a un gen indicador y usarse para evaluar la capacidad de los agentes para modular la transcripción impulsada por el promotor.

[0382] Se conocen en la técnica métodos de introducción y expresión de genes en una célula. En el contexto de un vector de expresión, el vector se puede introducir fácilmente en una célula huésped, por ejemplo, una célula de mamífero, bacteriana, de levadura o de insecto, mediante cualquier método de la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión se puede transferir a una célula hospedadora por medios físicos, químicos o biológicos.

[0383] Los polinucleótidos se puede introducir en células diana usando cualquiera de varios métodos diferentes, por ejemplo, métodos comercializados que incluyen, pero no se limitan a, electroporación (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Colonia, Alemania)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) o Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator (Eppendorf, Hamburgo Alemania), la transfección mediada por liposomas catiónicos usando lipofección, encapsulación polimérica, transfección mediada por péptidos o sistemas de suministro biolístico de partículas, tales como "pistolas génicas" (véase, por ejemplo, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001).

[0384] Los métodos físicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen precipitación con fosfato de calcio, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY).

[0385] Los métodos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula hospedadora incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores víricos, y especialmente los vectores retrovíricos, se han convertido en el método más usado para insertar genes en células de mamíferos, por ejemplo, humanas. Otros vectores víricos pueden proceder de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple I, adenovirus y virus adenoasociados, y similares. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.º 5,350,674 y 5,585,362.

[0386] Medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula hospedadora incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal ejemplar para uso como vehículo de administración in vitro e in vivo es un liposoma (por ejemplo, una vesícula de membrana artificial). En el presente documento se divulgan métodos de producción de un CAR-NK para ARN transcrito in vitro. La presente divulgación también incluye un ARN que codifica un CAR-NK que se puede transfectar directamente en una célula. Un método de generación de ARNm para uso en la transfección puede implicar la transcripción in vitro (IVT) de una plantilla con cebadores especialmente diseñados, seguida de la adición de poliA, para producir una construcción que contiene una secuencia no traducida ("UTR") 3' y 5', una secuencia de caperuza 5' y/o sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), el ácido nucleico a expresar y una cola poliA, normalmente de 50-2000 bases de longitud. El ARN así producido puede transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En un aspecto, la plantilla incluye secuencias para el CAR-NK.

[0387] En un aspecto, el CAR-NK está codificado por un ARN mensajero (ARNm). En un aspecto, el ARNm que codifica el CAR-NK se introduce en un linfocito T para la producción de una célula CAR-NK.

[0388] En un caso, el CAR-NK del ARN transcrito in vitro puede introducirse en una célula como una forma de transfección transitoria. El ARN se produce mediante transcripción in vitro usando una plantilla generada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN de interés de cualquier fuente se puede convertir directamente mediante PCR en una plantilla para la síntesis de ARNmin vitrousando cebadores y ARN polimerasa adecuados. La fuente del ADN puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ADN plasmídico, ADN de fago, ADNc, secuencia de ADN sintético o cualquier otra fuente apropiada de ADN. En un caso, la plantilla deseada para la transcripción in vitro es un CAR-NK de la presente divulgación. Por ejemplo, la plantilla para el CAR-NK de ARN comprende una región extracelular que comprende un dominio variable monocatenario de un anticuerpo antitumoral; una región bisagra, un dominio transmembranario (por ejemplo, un dominio transmembranario de KIR). En un caso, la plantilla deseada para la transcripción in vitro comprende CAR-KIR y DAP12 en plantillas separadas. En un caso, la plantilla deseada para la transcripción in vitro comprende CAR-KIR y DAP12 en la misma plantilla. La plantilla para DAP12 comprende un dominio transmembranario y una región intracelular.

[0389] En un caso, el ADN que se va a usar para la PCR contiene un marco de lectura abierto. El ADN puede ser de una secuencia de ADN de origen natural del genoma de un organismo. En un caso, el ácido nucleico puede incluir algunas o todas las regiones no traducidas (UTR) 5‘ y/o 3’. El ácido nucleico puede incluir exones e intrones. En un caso, el ADN que se va a usar para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humano. En otro caso, el ADN que se va a usar para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humano que incluye las UTR 5' y 3'. El ADN puede ser alternativamente una secuencia de ADN artificial que normalmente no se expresa en un organismo de origen natural. Una secuencia de ADN artificial a modo de ejemplo es aquella que contiene porciones de genes que están ligados entre sí para formar un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión. Las porciones de ADN que están ligadas entre sí pueden ser de un solo organismo o de más de un organismo.

[0390] La PCR se usa para generar una plantilla para la transcripción in vitro del ARNm que se usa para la transfección. Los métodos para realizar la PCR son bien conocidos en la técnica. Los cebadores para uso en la PCR están diseñados para tener regiones que sean sustancialmente complementarias a las regiones del ADN que se usarán como plantilla para la PCR. "Sustancialmente complementario", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de nucleótidos donde la mayoría o la totalidad de las bases en la secuencia del cebador son complementarias, o una o más bases no son complementarias o no coinciden. Las secuencias sustancialmente complementarias pueden aparearse o hibridarse con la diana de ADN previsto en las condiciones de apareamiento usadas para la PCR. Los cebadores pueden diseñarse para ser sustancialmente complementarios a cualquier porción de la plantilla de ADN. Por ejemplo, los cebadores pueden diseñarse para amplificar la porción de un ácido nucleico que normalmente se transcribe en las células (el marco de lectura abierto), incluidos las UTR 5' y 3'. Los cebadores también pueden diseñarse para amplificar una porción de un ácido nucleico que codifica un dominio particular de interés. En una realización, los cebadores están diseñados para amplificar la región codificante de un ADNc humano, incluyendo la totalidad o porciones de las UTR 5' y 3'. Los cebadores útiles para PCR se pueden generar mediante métodos sintéticos que son bien conocidos en la técnica. Los "cebadores directos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a los nucleótidos de la plantilla de ADN que se encuentran aguas arriba de la secuencia de ADN que se va a amplificar. "Aguas arriba" se usa en la presente para referirse a una ubicación 5 con respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar con respecto a la cadena codificante. Los "cebadores inversos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a una plantilla de ADN de doble cadena que se encuentran aguas abajo de la secuencia de ADN que se va a amplificar. "Aguas abajo" se usa en el presente documento para referirse a una ubicación 3' con respecto a la secuencia de ADN que se va a amplificar con respecto a la cadena codificante.

[0391] Cualquier ADN polimerasa útil para PCR se puede usar en los métodos divulgados en este documento. Los reactivos y la polimerasa están disponibles comercialmente en varias fuentes.

[0392] También se pueden usar estructuras químicas con la capacidad de promover la estabilidad y/o la eficiencia de la traducción. El ARN tiene preferentemente UTR 5' y 3'. En una realización, la UTR 5' tiene entre uno y 3000 nucleótidos de longitud. La longitud de las secuencias de UTR 5' y 3' que se añadirán a la región codificante se puede alterar mediante diferentes métodos, que incluyen, pero no se limitan a, el diseño de cebadores para PCR que se hibriden a diferentes regiones de las UTR. Usando este enfoque, un experto en la técnica puede modificar las longitudes de UTR 5' y 3' necesarias para lograr una eficiencia de traducción óptima después de la transfección del ARN transcrito. Las UTR 5' y 3' pueden ser las UTR 5' y 3' endógenas naturales del ácido nucleico de interés. Alternativamente, se pueden añadir secuencias de UTR que no sean endógenas al ácido nucleico de interés incorporando las secuencias de UTR en los cebadores directos e inversos o mediante cualquier otra modificación de la plantilla. El uso de secuencias de UTR que no sean endógenas al ácido nucleico de interés puede ser útil para modificar la estabilidad y/o la eficiencia de la traducción del ARN. Por ejemplo, se sabe que los elementos ricos en AU en secuencias de UTR 3' pueden disminuir la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, las UTR 3' se pueden seleccionar o diseñar para aumentar la estabilidad del ARN transcrito basándose en las propiedades de los UTR que son bien conocidas en la técnica. En un caso, la UTR 5' puede contener la secuencia Kozak del ácido nucleico endógeno. Alternativamente, cuando se añade una UTR 5' que no es endógena al ácido nucleico de interés mediante PCR como se describió anteriormente, se puede rediseñar una secuencia Kozak de consenso añadiendo la secuencia de UTR 5'. Las secuencias Kozak pueden aumentar la eficiencia de la traducción de algunos transcritos de ARN, pero no parece ser necesario para todos los ARN para permitir una traducción eficiente. El requisito de secuencias Kozak para muchos ARNm es conocido en la técnica. En otro caso, la UTR 5' puede ser la UTR 5' de un virus de ARN, cuyo genoma de ARN es estable en las células. En otros casos, se pueden utilizar diversos análogos de nucleótidos en la UTR 3' o 5' para impedir la degradación por exonucleasa del ARNm.

[0393] Para permitir la síntesis de ARN a partir de una plantilla de ADN sin la necesidad de clonación génica, se debe unir un promotor de la transcripción a la plantilla de ADN aguas arriba respecto a la secuencia que se va a transcribir. Cuando se añade una secuencia que funciona como un promotor para una ARN polimerasa al extremo 5' del cebador directo, el promotor de ARN polimerasa se incorpora al producto de PCR aguas arriba del marco de lectura abierto a transcribir. En un caso preferido, el promotor es un promotor de la polimerasa T7 tal como se describe en otra parte de esta memoria. Otros promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, los promotores de la ARN polimerasa T3 y SP6. Las secuencias nucleotídicas de consenso para promotores T7, T3 y SP6 se conocen en la técnica.

[0394] En un caso preferido, el ARNm tiene tanto una caperuza en el extremo 5' como una cola poli(A) 3' que determina la unión del ribosoma, el inicio de la traducción y la estabilidad del ARNm en la célula. En una plantilla de ADN circular, por ejemplo el ADN plasmídico, la ARN polimerasa produce un producto concatámero largo que no es adecuado para expresión en células eucariotas. La transcripción de ADN plasmídico linealizado en el extremo de la UTR 3' da lugar a un ARNm de tamaño normal que no es efectivo en transfección eucariota, incluso si está poliadenilado tras la transcripción.

[0395] En una plantilla de ADN lineal, la ARN polimerasa del fago T7 puede extender el extremo 3' del transcrito más allá de la última base de la plantilla (Schenborn y Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva y Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).

[0396] El método convencional de integración de tramos poliA/T en una plantilla de ADN es la clonación molecular. Sin embargo, la secuencia poliA/T integrada en el ADN plasmídico puede causar inestabilidad del plásmido, por lo que las plantillas de ADN plasmídico obtenidas a partir de células bacterianas están frecuentemente contaminadas con deleciones y otras aberraciones. Esto hace que los procedimientos de clonación no solo sean laboriosos y largos, sino que a menudo no sean fiables. Es por este motivo que es muy deseable un método que permita la construcción de plantillas de ADN con estiramiento poliA/T 3' sin clonación.

[0397] El segmento poliA/T de la plantilla de ADN transcripcional se puede producir durante la PCR usando un cebador inverso que contiene una cola poliT, tal como una cola 100T (el tamaño puede ser de 50-5000 T (SEQ ID NO: 111)), o después de la PCR mediante cualquier otro método, que incluye, pero no se limita a, ligamiento de ADN o recombinaciónin vitro. Las colas de poli(A) también proporcionan estabilidad a los ARN y reducir su degradación. Generalmente, la longitud de una cola de poli(A) se correlaciona positivamente con la estabilidad del ARN transcrito. En una realización, la cola de poli(A) tiene entre 100 y 5000 adenosinas.

[0398] Las colas poli(A) de los ARN se pueden extender aún más después de la transcripción in vitro con el uso de una polimerasa poli(A), como la polimerasa poliA de E. coli (E-PAP). En una realización, aumentar la longitud de una cola de poli(A) de 100 nucleótidos a entre 300 y 400 nucleótidos da como resultado un aumento de aproximadamente el doble en la eficiencia de traducción del ARN. Adicionalmente, la unión de diferentes grupos químicos al extremo 3' puede aumentar la estabilidad del ARNm. Una fijación de este tipo puede contener nucleótidos modificados/artificiales, aptámeros y otros compuestos. Por ejemplo, los análogos de ATP se pueden incorporar en la cola de poli(A) usando una poli(A) polimerasa. Los análogos de ATP pueden aumentar además la estabilidad del ARN.

[0399] Las caperuzas en 5' también proporcionan estabilidad a las moléculas de ARN. En una realización preferida, los ARN producidos por los métodos descritos en el presente documento incluyen una caperuza en 5'. La caperuza en 5' se proporciona usando técnicas conocidas en la técnica y descritas en el presente documento (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

[0400] Los ARN producidos mediante los métodos divulgados en el presente documento también pueden contener una secuencia del sitio de entrada al ribosoma interno (IRES). La secuencia de IRES puede ser cualquier secuencia vírica, cromosómica o diseñada artificialmente que inicia la unión del ribosoma al ARNm independiente de la caperuza y facilita la iniciación de la traducción. Se puede incluir cualquier soluto adecuado para electroporación celular que pueda contener factores que faciliten la permeabilidad celular, tales como azúcares, péptidos, lípidos, proteínas, antioxidantes y tensioactivos. En el caso de que se utilice un sistema de suministro no vírico, un vehículo de administración a modo de ejemplo es un liposoma. Se contempla el uso de formulaciones lipídicas para la introducción de los ácidos nucleicos en una célula hospedadora (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado con un lípido. El ácido nucleico asociado con un lípido puede estar encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, intercalado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, unido a un liposoma a través de una molécula de enlace que está asociada tanto con el liposoma como con el oligonucleótido, atrapado en un liposoma, complejado con un liposoma, dispersado en una disolución que contiene un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o complejado con una micela, o asociado de otro modo con un lípido. Las composiciones asociadas a lípidos, lípidos/ADN o lípidos/vectores de expresión no se limitan a ninguna estructura particular en disolución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura bicapa, como micelas, o con una estructura "colapsada". También pueden estar simplemente intercaladas en una disolución, posiblemente formado agregados que no son uniforme en tamaño o forma. Los lípidos son sustancias grasas que se pueden producir naturalmente o son lípidos sintéticos. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotas de grasa que se producen naturalmente en el citoplasma, así como la clase de compuestos que contiene hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como ácidos grasos, alcoholes, aminas, aminoalcoholes y aldehídos.

[0402] Se pueden obtener lípidos adecuados para su uso de fuentes comerciales. Por ejemplo, la dimiristil fosfatidilcolina ("DMPC") se puede obtener de Sigma, St. Louis, MO; el fosfato de dicetilo ("DCP") se puede obtener de K & K Laboratories (Plainview, NY); el colesterol ("Choi") se puede obtener de Calbiochem-Behring; el dimiristil fosfatidilglicerol ("DMPG") y otros lípidos se pueden obtener de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.). Disoluciones madre de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol se pueden almacenar a aproximadamente -20 °C. El cloroformo se usa como el único disolvente, ya que se evapora más fácilmente que el metanol. "Liposoma" es un término genérico que abarca una variedad de vehículos lipídicos monolaminares y multilaminares formados por la generación de bicapas o agregados lipídicos cerrados. Los liposomas se pueden caracterizar por tener estructuras vesiculares con una membrana bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilaminares tienen múltiples capas de lípidos separadas por un medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de disolución acuosa. Los componentes lipídicos experimentan una autorreorganización antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Sin embargo, también están englobadas las composiciones que tienen diferentes estructuras en disolución a la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden adoptar una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas lipídicas. También se contemplan complejos lipofectamina-ácido nucleico.

[0404] FUENTES DE LINFOCITOS T

[0406] Antes de la expansión y modificación genética, se obtiene una fuente de linfocitos T de un sujeto. El término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos). Ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de estos. Los linfocitos T se pueden obtener de varias fuentes, que incluyen células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglio linfático, sangre del cordón, tejido de timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En ciertas realizaciones de la presente invención, se puede usar cualquier número de líneas de linfocitos T disponibles en la técnica. En ciertas realizaciones de la presente invención, los linfocitos T se pueden obtener de una unidad de sangre extraída de un sujeto usando cualquier número de técnicas conocidas por el experto en la materia, tal como la separación de Ficoll<™>. En una realización preferida, se obtienen células de la sangre circulante de un individuo por aféresis. El producto de aféresis contiene normalmente linfocitos, que incluyen linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En una realización, las células recogidas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para las etapas de procesamiento posteriores. En una realización de la invención, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En una realización alternativa, la disolución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos, si no todos, los cationes divalentes. De nuevo, de manera sorprendente, las etapas de activación inicial en ausencia de calcio conducen a una activación amplificada. Como los expertos apreciarán fácilmente, se puede realizar una etapa de lavado mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como usando una centrífuga de "flujo continuo" semiautomatizada (por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991, el Baxter CytoMate o el Haemonetics Cell Saver 5) según las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células pueden resuspenderse en una variedad de tampones biocompatibles, tales como, por ejemplo, PBS sin Ca, sin Mg, PlasmaLyte A u otra solución salina con o sin tampón. Alternativamente, se pueden eliminar los componentes no deseables de la muestra de aféresis y resuspender las células directamente en el medio de cultivo.

[0408] En otra realización, los linfocitos T se aíslan de linfocitos de sangre periférica mediante lisis de glóbulos rojos y reducción de monocitos, por ejemplo mediante centrifugación a través de un gradiente de PERCOLL<™>o mediante elutriación centrífuga en contraflujo. Una subpoblación específica de linfocitos T, tal como los linfocitos T CD3<+>, CD28<+>, CD4<+>, CD8<+>, CD45RA<+>y CD45RO<+>, puede aislarse adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, en una realización, los linfocitos T se aíslan mediante incubación con perlas conjugadas con anti-CD3/anti-CD28 (es decir, 3x28), tales como DYNABEADS<®>M-450 CD3/CD28 T, durante un periodo de tiempo suficiente para una selección positiva de los linfocitos T deseados. En una realización, el periodo de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En una realización adicional, el periodo de tiempo varía de 30 minutos a 36 horas o más y todos los valores enteros intermedios. En una realización adicional, el periodo de tiempo es al menos de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. En otro aspecto preferido más, el periodo de tiempo es de 10 a 24 horas. En una realización preferida, el periodo de tiempo de incubación es de 24 horas. Para el aislamiento de linfocitos T de pacientes con leucemia, el uso de tiempos de incubación más largos, tales como 24 horas, puede aumentar el rendimiento celular. Se pueden usar tiempos de incubación más largos para aislar linfocitos T en cualquier situación en la que haya pocos linfocitos T en comparación con otros tipos de células, tal como en el aislamiento de linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) del tejido tumoral o de individuos inmunocomprometidos. Además, el uso de tiempos de incubación más largos puede aumentar la eficiencia de captura de linfocitos T CD8+. Por lo tanto, mediante un simple acortamiento o prolongación del tiempo que se permite que los linfocitos T se unan a las perlas CD3/CD28 y/o mediante aumento o disminución de la relación de perlas respecto a linfocitos T (como se describe adicionalmente en el presente documento), las subpoblaciones de linfocitos T se pueden seleccionar preferentemente a favor o en contra del inicio del cultivo o en otros puntos de tiempo durante el proceso. Adicionalmente, mediante un aumento o disminución de la relación de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, las subpoblaciones de linfocitos T se pueden seleccionar preferentemente a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros puntos temporales deseados. El experto reconocería que también se pueden usar múltiples rondas de selección en el contexto de esta invención. En ciertas realizaciones, puede ser deseable realizar el procedimiento de selección y usar las células "no seleccionadas" en el proceso de activación y expansión. Las células "no seleccionadas" también se pueden someter a rondas adicionales de selección.

[0410] El enriquecimiento de una población de linfocitos T mediante selección negativa se puede lograr con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores superficiales únicos para las células seleccionadas de manera negativa. Un método es la clasificación y/o selección de células mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que usa una mezcla de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer las células CD4<+>mediante selección negativa, una mezcla de anticuerpos monoclonales incluye normalmente anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En ciertos aspectos, puede ser deseable enriquecer o seleccionar positivamente linfocitos T reguladores que expresan normalmente CD4<+>, CD25<+>, CD62L<Alto>GITR<+>y FoxP3<+>. Alternativamente, en ciertas realizaciones, los linfocitos T reguladores se reducen mediante perlas conjugadas anti-C25 u otro método similar de selección.

[0412] Para aislar una población deseada de células mediante selección positiva o negativa, se puede variar la concentración de células y superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas). En ciertas realizaciones, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan las perlas y las células (es decir, aumentar la concentración de células), para asegurar el máximo contacto de las células y las perlas. Por ejemplo, en una realización, se usa una concentración de 2 billones de células/ml. En una realización, se usa una concentración de mil millones de células/ml. En una realización adicional, se usan más de 100 millones de células/ml. En una realización adicional, se usa una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En aún otra realización, se usa una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En realizaciones adicionales, se pueden usar concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de altas concentraciones puede resultar en un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Además, el uso de altas concentraciones de células permite una captura más eficiente de células que pueden expresar débilmente antígenos diana de interés, tales como linfocitos T CD28-negativos, o de muestras en las que hay muchas células tumorales presentes (decir, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Dichas poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de una concentración elevada de células permite una selección más eficaz de linfocitos T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

[0414] En una realización relacionada, puede ser deseable usar concentraciones más bajas de células. Al diluir significativamente la mezcla de linfocitos T y la superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas), se minimizan las interacciones entre las partículas y las células. Esto selecciona células que expresan elevadas cantidades de antígenos deseados para que se unan a las partículas. Por ejemplo, los linfocitos T CD4<+>expresan niveles más altos de CD28 y se capturan más eficientemente que los linfocitos T CD8+ en concentraciones diluidas. En una realización, la concentración de células usada es de 5 × 10<6>/ml. En otras realizaciones, la concentración usada puede ser de aproximadamente 1 × 10<5>/ml a 1 × 10<6>/ml, y cualquier valor entero intermedio.

[0416] En otras realizaciones, las células pueden incubarse en un agitador rotacional durante distintos períodos de tiempo y a distintas velocidades, ya sea a 2-10 °C o a temperatura ambiente.

[0418] Los linfocitos T para estimulación también se pueden congelar después de una etapa de lavado. Sin desear quedar ligado a teoría, la etapa de congelación y posterior descongelación proporciona un producto más uniforme al eliminar los granulocitos y, en cierta medida, los monocitos de la población celular. Después de la etapa de lavado que elimina el plasma y las plaquetas, las células pueden suspenderse en una disolución de congelación. Si bien se conocen en la técnica muchas soluciones y parámetros de congelación que serán útiles en este contexto, un método implica el uso de PBS que contiene 20 % de DMSO y 8 % de albúmina sérica humana, o medios de cultivo que contienen 10 % de dextrano 40 y 5 % de dextrosa, 20 % de albúmina sérica humana y 7.5 % de DMSO, o 31.25 % de Plasmalyte-A, 31.25 % de dextrosa al 5 %, 0.45 % de NaCl, 10 % de dextrano 40 y 5 % de dextrosa, 20 % de albúmina sérica humana y 7.5 % de DMSO u otros medios de congelación de células adecuados que contienen, por ejemplo, Hespan y PlasmaLyte A; luego, las células se congelan a -80 °C a una velocidad de 1 ° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Se pueden usar otros métodos de congelación controlada además de la congelación no controlada inmediatamente a -20 °C o en nitrógeno líquido.

[0420] En ciertas realizaciones, las células crioconservadas se descongelan y se lavan como se describe en el presente documento y se dejan reposar durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación usando los métodos de la presente invención.

[0422] También se contempla en el contexto de la divulgación la extracción de muestras de sangre o producto de aféresis de un sujeto en un período de tiempo anterior a cuando las células expandidas como se describe en este documento podrían ser necesarias. Como tal, la fuente de las células que se va a expandir se puede recoger en cualquier punto de tiempo necesario y las células deseadas, tales como los linfocitos T, se pueden aislar y congelar para su uso posterior en la terapia con linfocitos T para cualquiera de un cierto número de enfermedades o afecciones que se beneficiarían de la terapia con linfocitos T, tales como las descritas en el presente documento. Se puede extraer una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano. Se puede extraer una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano que está en riesgo de desarrollar una enfermedad, pero que aún no ha desarrollado una enfermedad, y las células de interés se aíslan y se congelan para su uso posterior. Los linfocitos T pueden expandirse, congelarse y usarse en un momento posterior. Se pueden extraer muestras de un paciente poco después del diagnóstico de una enfermedad particular como se describe en el presente documento, pero antes de cualquier tratamiento. Las células pueden aislarse de una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto antes de cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen, pero no se limitan a, el tratamiento con agentes tales como natalizumab, efalizumab, agentes antivíricos, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3, citoxano, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, e irradiación. Estos fármacos inhiben la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun.5:763-773, 1993). Las células pueden aislarse de un paciente y congelarse para su uso posterior junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) un trasplante de médula ósea, terapia ablativa de linfocitos T usando agentes de quimioterapia tales como fludarabina, terapia con radiación de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. Las células pueden aislarse previamente y pueden congelarse para su uso posterior para el tratamiento después de la terapia ablativa de linfocitos B, tales como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan.

[0424] Los linfocitos T pueden obtenerse de un paciente directamente después del tratamiento. En este sentido, se ha observado que después de ciertos tratamientos contra el cáncer, en particular tratamientos con fármacos que dañan el sistema inmunitario, poco después del tratamiento durante el período en el que los pacientes normalmente se estarían recuperando del tratamiento, la calidad de los linfocitos T obtenidos puede ser óptima o mejorada por su capacidad de expandirseex vivo. Asimismo, después de la manipulaciónex vivousando los métodos descritos en el presente documento, estas células pueden estar en un estado preferido para un mejor injerto y expansiónin vivo. Por lo tanto, se contempla dentro del contexto de la presente divulgación recoger corpúsculos sanguíneos, incluidos linfocitos T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Se pueden usar pautas de movilización (por ejemplo, la movilización con GM-CSF) y acondicionamiento para crear una condición en un sujeto en donde se favorezca la repoblación, la recirculación, la regeneración y/o la expansión de tipos de células particulares, especialmente durante una ventana de tiempo definida después de la terapia. Los tipos de células ilustrativos incluyen linfocitos T, linfocitos B, células dendríticas, y otras células del sistema inmunitario.

[0426] ACTIVACIÓN Y EXPANSIÓN DE LINFOCITOS T

[0428] Los linfocitos T se activan y expanden generalmente usando métodos como los descritos, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.º 20060121005.

[0430] Generalmente, los linfocitos T usados en la invención se expanden por contacto con una superficie que tiene fijado un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3/TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de los linfocitos T. En particular, las poblaciones de linfocitos T se pueden estimular como se describe en el presente documento, tal como mediante contacto con un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o mediante el contacto con un activador de proteína cinasa C (ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria sobre la superficie de los linfocitos T, se usa un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de linfocitos T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de los linfocitos T. Para estimular la proliferación de linfocitos T CD4<+>o linfocitos T CD8<+>, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besançon, Francia) pueden usarse al igual que otros métodos comúnmente conocidos en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med.

[0431] 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth.227(1-2): 53-63, 1999).

[0433] La señal estimuladora primaria y la señal coestimuladora para el linfocito T pueden proporcionarse mediante protocolos diferentes. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada una de las señales pueden estar en disolución o acoplados a una superficie. Cuando se acoplan a una superficie, los agentes pueden estar acoplados a la misma superficie (por ejemplo, en formación "cis") o a superficies separadas (por ejemplo, en formación "trans"). Alternativamente, un agente puede estar acoplado a una superficie y el otro agente en disolución. El agente que proporciona la señal coestimuladora puede estar unido a la superficie de una célula y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en disolución o acoplado a la superficie. Ambos agentes pueden estar en disolución. Los agentes pueden estar en forma soluble y luego reticularse a una superficie, tal como una célula que expresa receptores Fc o un anticuerpo u otro agente de unión que se unirá a los agentes. A este respecto, véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitudes de patente de EE. UU. n.º 20040101519 y 20060034810 para células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC) que se contemplan para su uso en la activación y expansión de los linfocitos T usados en la presente invención.

[0435] Los dos agentes pueden inmovilizarse en perlas, ya sea en la misma perla, es decir, "cis", o en perlas separadas, es decir, "trans". A modo de ejemplo, el agente que proporciona la señal de activación primaria es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión al antígeno del mismo y el agente que proporciona la señal coestimuladora es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión al antígeno del mismo; y ambos agentes están coinmovilizados en la misma perla en cantidades moleculares equivalentes. En un caso, se usa una relación de 1:1 de cada anticuerpo unido a las perlas para la expansión de linfocitos T CD4<+>y el crecimiento de linfocitos T. En ciertos aspectos de la presente divulgación, se usa una relación de anticuerpos anti CD3:CD28 unidos a las perlas de modo que se observa un aumento en la expansión de linfocitos T en comparación con la expansión observada usando una relación de 1:1. En caso particular, se observa un aumento de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 veces en comparación con la expansión observada usando una relación de 1:1. En un caso, la relación de anticuerpos CD3:CD28 unidos a las perlas varía de 100:1 a 1:100 y todos los valores enteros intermedios. En un aspecto de la presente divulgación, más anticuerpo anti-CD28 está unido a las partículas que anticuerpo anti-CD3, es decir, la relación CD3:CD28 es menor que uno. En ciertos casos, la proporción de anticuerpo anti-CD28 a anticuerpo anti-CD3 unido a las perlas es mayor que 2:1. En caso particular, se usa una relación de 1:100 de anticuerpo contra CD3:CD28 unido a perlas. En otro caso, se usa una relación de 1:75 de anticuerpo contra CD3:CD28 unido a perlas. En un caso adicional, se usa una relación de 1:50 de anticuerpo contra CD3:CD28 unido a perlas. En otro caso, se usa una relación de 1:30 de anticuerpo contra CD3:CD28 unido a perlas. En un caso preferido, se usa una relación de 1:10 de anticuerpo contra CD3:CD28 unido a perlas. En otro caso, se usa una relación de 1:3 de anticuerpo contra CD3:CD28 unido a las perlas. En otro caso más, se usa una relación de 3:1 de anticuerpo contra CD3:CD28 unido a las perlas.

[0437] Se pueden usar relaciones de partículas con respecto a células de 1:500 a 500:1 y cualquier valor entero intermedio para estimular los linfocitos T u otras células diana. Como aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica pueden apreciar fácilmente, la relación entre partículas y células puede depender del tamaño de partícula con respecto a la célula diana. Por ejemplo, las perlas de tamaño pequeño solo podrían unir unas pocas células, mientras que las perlas de tamaño más grande podrían unir muchas. En ciertos casos, la relación de células con respecto a partículas varía de 1:100 a 100:1 y cualquier valor entero intermedio y, en realizaciones adicionales, la relación comprende de 1:9 a 9:1 y cualquier valor entero intermedio; también se puede usar para estimular los linfocitos T. La relación de partículas acopladas anti-CD3 y anti-CD28 con respecto a linfocitos T que dan lugar a la estimulación de linfocitos T puede variar como se indicó anteriormente, sin embargo, ciertos valores preferidos incluyen 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 y 15:1, siendo una relación preferidos al menos 1:1 de partículas por linfocito T. En un caso, se usa una relación de partículas con respecto a células de 1:1 o menos. En un caso particular, una relación de partículas:células preferida es 1:5. En casos adicionales, la relación de partículas con respecto a células puede variar dependiendo del día de estimulación. Por ejemplo, en un caso, la relación de partículas con respecto a células es de 1:1 a 10:1 el primer día y se añaden partículas adicionales a las células todos los días o cada dos días a partir de entonces durante hasta 10 días, en relaciones finales de 1:1 a 1:10 (basándose en los recuentos de células el día de la adición). En un caso particular, la relación de partículas con respecto a células es de 1:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:5 el tercer y quinto día de estimulación. En otro caso, las partículas se añaden diariamente o cada dos días hasta una relación final de 1:1 el primer día y 1:5 el tercer y quinto día de estimulación. En otro caso, la relación de partículas con respecto a células es de 2:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:10 el tercer y quinto día de estimulación. En otro caso, las partículas se añaden diariamente o cada dos días hasta una proporción final de 1:1 el primer día y 1:10 el tercer y quinto día de estimulación. Un experto en la técnica apreciará que una variedad de otras relaciones pueden ser adecuadas para su uso en la presente divulgación. En particular, las relaciones variarán dependiendo del tamaño de las partículas y del tamaño y tipo de célula.

[0439] En casos adicionales de la presente divulgación, las células, tales como linfocitos T, se combinan con perlas revestidas de agente, las perlas y las células se separan posteriormente y luego se cultivan las células. En un caso alternativo, antes del cultivo, las perlas revestidas de agente y las células no se separan, sino que se cultivan juntas. En un caso adicional, las perlas y las células se concentran primero mediante la aplicación de una fuerza, tal como una fuerza magnética, lo que da como resultado una mayor ligadura de los marcadores de la superficie celular, induciendo así la estimulación celular.

[0440] A modo de ejemplo, las proteínas de la superficie celular se pueden ligar permitiendo que perlas paramagnéticas a las que están unidos anti-CD3 y anti-CD28 (perlas 3x28) entren en contacto con los linfocitos T. En un caso, las células (por ejemplo, 10<4>a 10<9>linfocitos T) y las perlas (por ejemplo, perlas paramagnéticas M-450 CD3/CD28 T DYNABEADS<®>en una relación de 1:1) se combinan en un tampón, por ejemplo PBS (sin cationes divalentes, tales como calcio y magnesio). Nuevamente, aquellos con conocimientos ordinarios en la técnica pueden apreciar fácilmente que se puede usar cualquier concentración celular. Por ejemplo, la célula diana puede ser muy rara en la muestra y comprender solo 0.01 % de la muestra o la muestra entera (es decir, el 100 %) puede comprender la célula diana de interés. Por consiguiente, cualquier número de células está dentro del contexto de la presente divulgación. En ciertos casos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan las partículas y las células (es decir, aumentar la concentración de células), para asegurar el máximo contacto de las células y las partículas. Por ejemplo, en un caso, se usa una concentración de aproximadamente 2 mil millones de células/ml. En otro caso, se usa más de 100 millones de células/ml. En una realización adicional, se usa una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En aún otro caso, se usa una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En casos adicionales, se pueden usar concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de altas concentraciones puede resultar en un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Además, el uso de altas concentraciones de células permite una captura más eficiente de células que pueden expresar débilmente antígenos de interés, tales como los linfocitos T CD28-negativos. Dichas poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas en ciertos casos. Por ejemplo, el uso de una concentración elevada de células permite una selección más eficaz de linfocitos T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.

[0441] En un caso de la presente divulgación, la mezcla se puede cultivar durante de varias horas (aproximadamente 3 horas) a aproximadamente 14 días o cualquier valor entero por hora entre ellos. En otro caso, la mezcla se puede cultivar durante 21 días. En un caso de la divulgación, las perlas y los linfocitos T se cultivan juntos durante aproximadamente ocho días. En otro caso, las perlas y los linfocitos T se cultivan juntos durante 2-3 días. También pueden desearse varios ciclos de estimulación de modo que el tiempo de cultivo de los linfocitos T pueda ser de 60 días o más.

[0442] Las condiciones apropiados para el cultivo de linfocitos T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, medio esencial mínimo o medio RPMI 1640 o X-vivo 15 (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, que incluye suero (por ejemplo, suero bovino fetal o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ y TNF-α, o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocidas por el experto. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero no se limitan a, tensioactivo, plasmanato y agentes reductores, tales como N-acetil-cisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sean sin suero o complementadas con una cantidad apropiada de suero (o plasma), o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de linfocitos T. Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que son para ser infundidos en un sujeto. Las células diana se mantienen en condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura apropiada (por ejemplo, 37 °C) y atmósfera (por ejemplo, aire más 5 % de CO<2>).

[0443] Los linfocitos T que se han expuesto a tiempos de estimulación variados pueden presentar diferentes características. Por ejemplo, los productos típicos de sangre o de células mononucleares de sangre periférica de aféresis tienen una población de linfocitos T auxiliares (T<H>, CD4<+>) que es mayor que la población de linfocitos T citotóxicos o supresores (Tc, CD8<+>). La expansiónex vivode linfocitos T mediante la estimulación de los receptores de CD3 y CD28 produce una población de linfocitos T que antes de aproximadamente los días 8-9 consiste predominantemente en células T<H>, mientras que después de aproximadamente los días 8-9, la población de linfocitos T comprende una población cada vez mayor de células Tc. En consecuencia, dependiendo del propósito del tratamiento, puede ser ventajoso infundir a un sujeto una población de linfocitos T que comprende predominantemente células T<H>. De manera similar, si se ha aislado un subconjunto de células Tc específicas de antígeno, puede ser beneficioso ampliar este subconjunto en mayor grado.

[0444] Además, además de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían significativamente, pero en gran parte, de manera reproducible durante el curso del proceso de expansión celular. Por lo tanto, dicha reproducibilidad permite adaptar un producto de linfocitos T activados para propósitos específicos.

[0445] APLICACIONES TERAPÉUTICAS

[0446] La presente divulgación abarca una célula (por ejemplo, linfocito T) modificada para expresar una pluralidad de tipos de CAR-KIR, en donde cada CAR-KIR combina un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico con un componente de un KIR.

[0447] En un caso, los CAR-KIR de la invención comprenden un KIR activador que suministra su señal a través de una interacción con la proteína de membrana que contiene motivo de activación basado en inmunotirosina (ITAM), DAP12, que está mediada por residuos dentro de los dominios transmembranarios de estas proteínas.

[0448] En un caso, los CAR-KIR de la invención comprenden un KIR inhibidor que suministra su señal a través de uno o más motivos inhibidores basados en inmunotirosina (ITIM) que interactúan directa o indirectamente con proteínas de señalización citoplasmáticas, tales como la familia de proteínas SHP-1, SHP-2 y Vav. Los KIR que portan dominios citoplasmáticos que contienen (ITIM ) suprimen la señal activadora que conduce a la inhibición de la actividad citolítica de NK y productora de citocinas. En algunos casos, el linfocito T modificado que expresa un CAR-KIR de la invención puede provocar una respuesta de linfocitos T mediada por CAR-KIR. La invención proporciona un CAR-KIRinh que comprende (i) un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de una molécula de anticuerpo o que comprende un armazón no de anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a un antígeno diana en una célula; (ii) un dominio transmembranario; y (iii) un dominio citoplasmático que contiene ITIM. Una célula citotóxica de la invención comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh de la invención. La célula citotóxica puede comprender además un CAR-KIRact y usarse en (i) terapia; o (ii) un método de tratamiento de un sujeto. En una realización, la dependencia de la unión a más de un tipo de antígeno permite que el linfocito T modificado presente una especificidad aumentada para provocar una respuesta tras la unión de una célula tumoral en lugar de una célula espectadora normal.

[0449] La divulgación proporciona el uso de una pluralidad de tipos de CAR-KIR para redirigir la especificidad de un linfocito T primario a un antígeno tumoral. Por lo tanto, la presente divulgación también proporciona un método de estimulación de una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T a una población de células o tejido diana en un mamífero que comprende la etapa de administrar al mamífero un linfocito T que expresa una pluralidad de tipos de CAR-KIR, en donde cada tipo de CAR-KIR comprende un resto de unión que interactúa específicamente con una diana predeterminada. En un caso, la célula comprende un primer CAR-KIR que comprende un KIR activador (CAR-KIRact) y un segundo CAR-KIR que comprende un KIR inhibidor (CAR-KIRinh).

[0450] Sin desear estar ligado a teoría particular alguna, la respuesta de inmunidad antitumoral provocada por los linfocitos T modificados con CAR-KIR puede ser una respuesta inmunitaria activa o pasiva. Además, la respuesta inmunitaria mediada por CAR-KIR puede ser parte de una estrategia de inmunoterapia adoptiva en la que los linfocitos T modificados con CAR-KIR inducen una respuesta inmunitaria específica para el dominio de unión a antígeno en el CAR KIR.

[0451] Los cánceres que se pueden tratar en el contexto de la presente invención incluyen tumores que no están vascularizados, o aún no sustancialmente vascularizados, así como tumores vascularizados. Los cánceres pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, por ejemplo, leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores sólidos. Los tipos de cánceres a tratar con los CAR de la invención incluyen, pero sin limitación, carcinoma, blastoma y sarcoma, y ciertas leucemia o neoplasias linfoides, tumores benignos y malignos y neoplasias malignas, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. También se incluyen tumores/cánceres en adultos y tumores/cánceres pediátricos.

[0452] Los cánceres hematológicos son cánceres de la sangre o de la médula ósea. Los ejemplos de cánceres hematológicos (o hematógenos) incluyen leucemias, incluyendo leucemias agudas (tales como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (tales como leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano (formas de escasa malignidad y de gran malignidad), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenström, enfermedad de la cadena pesada, síndrome mielodisplásico, leucemia de células peludas y mielodisplasia.

[0453] Los tumores sólidos son masas anormales de tejido que no suelen contener quistes ni áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. Diferentes tipos de tumores sólidos se nombran por el tipo de células que los forman (tales como sarcomas, carcinomas y linfomas). Los ejemplos de tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, neoplasia linfoide maligna, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cánceres de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, feocromocitomas carcinoma de la glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga, melanoma y tumores del SNC (tales como un glioma (tal como glioma del tronco encefálico y gliomas mixtos), glioblastoma (también conocido como glioblastoma multiforme) astrocitoma, linfoma del SNC, germinoma, meduloblastoma, schwannoma, craneofariogioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma y metástasis cerebrales).

[0454] En un caso, la porción del resto de unión a antígeno de los linfocitos T-CAR-KIR de la invención está diseñada para tratar un cáncer particular. En un caso, los linfocitos T-CAR-KIR de la invención se modifican para expresar un primer CAR-KIRact dirigido a un primer antígeno y un segundo CAR-KIRinh dirigido a un segundo antígeno, donde el primer antígeno se expresa en un tumor o cáncer particular y el segundo antígeno no se expresa en un tumor o cáncer particular. De esta manera, la activación condicional de los linfocitos T se genera mediante el acoplamiento de CAR-KIRact (o CAR TCR-zeta estándar que porta un scFv a un antígeno en la célula maligna de interés) y el CAR-KIRinh que porta, por ejemplo, un scFv dirigido contra un antígeno que está presente en tejido normal, pero no maligno, proporciona inhibición de la señal activadora del CAR-KIRact cuando el linfocito T-CAR encuentra células normales. Los ejemplos de antígenos que sirven como dianas útiles para CAR inhibidores incluyen los receptores de efrina (Pasquale, 2010, Nat Rev Cancer 10(3):165-80) y claudinas (Singh et al., 2010, J Oncol, 2010:541957), que se expresan por células epiteliales de tejidos normales, pero a menudo se pierden selectivamente por cánceres (por ejemplo, EPHA7).

[0455] Con respecto a la inmunizaciónex vivo, ocurre al menos una de las siguientesin vitroantes de la administración de la célula a un mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico que codifica un CAR-KIR a las células o iii) crioconservación de las células.

[0456] Los procedimientosex vivoson bien conocidos en la técnica y se analizan con más detalle más adelante. En resumen, las células se aíslan de un mamífero (por ejemplo, un ser humano) y se modifican genéticamente (es decir, se transducen o transfectan in vitro) con un vector que expresa un CAR-KIR divulgado en el presente documento. La célula modificada con un CAR-KIR se puede administrar a un receptor mamífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El receptor mamífero puede ser un ser humano y la célula modificada con un CAR-KIR puede ser autóloga con respecto al receptor. Como alternativa, las células pueden ser alógenas, singénicas o xenógenas con respecto al receptor.

[0457] El procedimiento para la expansiónex vivode células madre y progenitoras hematopoyéticas se describe en la patente de EE. UU. n.º 5,199,942, se puede aplicar a las células de la presente invención. En la técnica se conocen otros métodos adecuados, por lo tanto, la presente divulgación no se limita a método particular alguno de expansiónex vivode las células. En resumen, el cultivo y la expansiónex vivode linfocitos T comprende: (1) recolectar células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34+ de un mamífero a partir de sangre periférica o explantes de médula ósea; y (2) expandir dichas célulasex vivo.Además de los factores de crecimiento celular descritos en la patente de EE. UU. n.º 5,199,942, se pueden usar otros factores tales como flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando c-kit para el cultivo y la expansión de las células.

[0458] Además de usar una vacuna basada en células en lo que se refiere a la inmunizaciónex vivo, la presente divulgación también proporciona composiciones y métodos para la inmunizaciónin vivopara inducir una respuesta inmunitaria dirigida contra un antígeno en un paciente.

[0459] Generalmente, las células activadas y expandidas como se describe en el presente documento pueden utilizarse en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en personas que están inmunodeprimidos. En particular, los linfocitos T modificados con CAR-KIR de la invención se usan en el tratamiento del cáncer. En ciertas realizaciones, las células de la invención se usan en el tratamiento de pacientes en riesgo de desarrollar cáncer. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona el tratamiento o la prevención del cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de los linfocitos T modificados con CAR-KIR de la invención.

[0460] Los linfocitos T modificadas con CAR-KIR de la presente invención pueden administrarse solos o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes, tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares. Brevemente, las composiciones farmacéuticas para su uso en la presente invención pueden comprender una población de células diana como se describe en el presente documento, en combinación con uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender tampones, tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; hidratos de carbono, tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos, tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes, tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones para su uso en la presente invención se formulan preferentemente para administración intravenosa.

[0461] Las composiciones farmacéuticas para su uso en la presente invención se pueden administrar de una manera apropiada para la enfermedad a tratar (o prevenir). La cantidad y frecuencia de administración estarán determinadas por factores como la condición del paciente y el tipo y gravedad de su enfermedad, aunque las dosis apropiadas podrán determinarse mediante ensayos clínicos.

[0462] Cuando se indica "una cantidad inmunológicamente eficaz", "una cantidad antitumoral eficaz", "una cantidad eficaz inhibidora del cáncer" o "cantidad terapéutica", la cantidad precisa de las composiciones para su uso en la presente invención a administrar puede ser determinada por un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y el estado del paciente (sujeto). En general, se puede establecer que una composición farmacéutica que comprende los linfocitos T descritos en el presente documento se puede administrar a una dosis de 10<4>a 10<9>células/kg de peso corporal, preferiblemente de 10<5>a 10<6>células/kg de peso corporal, que incluye todos los valores de número entero dentro de los intervalos. También se puede administrar composiciones de linfocitos T múltiples veces a estas dosis. Las células se pueden administrar usando técnicas de infusión que son comúnmente conocidas en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med.

[0463] 319:1676, 1988). La dosis y pauta de tratamiento óptima para un paciente particular pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica de la medicina monitorizando el paciente para signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.

[0464] Puede desearse extraer sangre (o realizar una aféresis), activar y modificar genéticamente los linfocitos T de la misma para su uso en la presente invención, y reinfundir al paciente con estos linfocitos T modificados genéticamente activados y expandidos. Este proceso se puede llevar a cabo múltiples veces a las pocas semanas. En ciertas realizaciones, los linfocitos T pueden activarse a partir de extracciones de sangre de 10 ml a 400 ml. En ciertas realizaciones, los linfocitos T se activan a partir de extracciones de sangre de 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml o 100 ml. Sin desear estar ligado a teoría alguna, el uso de este protocolo de extracción de sangre múltiple/reinfusión múltiple puede servir para seleccionar ciertas poblaciones de linfocitos T.

[0465] La administración de las composiciones objeto puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implante o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa (i.v.) o por vía intraperitoneal. En una realización, las composiciones de linfocitos T de la presente invención se administran a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea. En otra realización, las composiciones de linfocitos T para su uso en la presente invención se administran preferiblemente por inyección i.v. Las composiciones de linfocitos T pueden inyectarse directamente en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.

[0466] En ciertas realizaciones de la presente invención, las células activadas y expandidas usando los métodos descritos en el presente documento, u otros métodos conocidos en la técnica en los que los linfocitos T se expanden a niveles terapéuticos, se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes que incluyen, pero sin limitación, tratamiento con agentes tales como terapia antivírica, tratamiento con cidofovir e interleucina-2, citarabina (también conocida como ARA-C) o natalizumab para pacientes con EM o tratamiento con efalizumab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con LMP. En realizaciones adicionales, los linfocitos T para su uso en la invención se pueden usar en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citotoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben la fosfatasa calcineurina dependiente de calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun.73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). En una realización adicional, las composiciones celulares para su uso en la presente invención se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) un trasplante de médula ósea, terapia ablativa de linfocitos T usando agentes quimioterapéuticos tales como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En otra realización, las composiciones celulares de la presente invención se administran después de una terapia ablativa de linfocitos B, tales como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los sujetos pueden someterse a un tratamiento convencional con quimioterapia de dosis alta seguida de un trasplante de células madre de sangre periférica. En ciertas realizaciones, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas para su uso en la presente invención. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

[0467] La dosis de los tratamientos anteriores que se administrarán a un paciente variará según la naturaleza precisa de la afección que se esté tratando y el receptor del tratamiento. El escalado de dosis para administración humana se puede realizar de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica. Se han discutido estrategias para la dosificación y programación de linfocitos T-CAR (Ertl et al., 2011, Cancer Res, 71:3175-81; Junghans, 2010, Journal of Translational Medicine, 8:55).

[0468] EJEMPLOS EXPERIMENTALES

[0469] La divulgación se describe con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan únicamente a título ilustrativo y no pretenden ser limitativos, a menos que se especifique lo contrario. Por tanto, la divulgación no debe interpretarse en modo alguno como limitada a los siguientes ejemplos. Sin una descripción adicional, se cree que un experto en la técnica puede, usando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, preparar y utilizar los compuestos de la presente divulgación y poner en práctica los métodos reivindicados. Por lo tanto, los siguientes ejemplos de trabajo señalan específicamente los casos preferidos de la presente divulgación, y no deben interpretarse en modo alguno como limitantes del resto de la divulgación.

[0470] Ejemplo 1: Receptores NK quiméricos

[0472] Los resultados presentados en el presente documento demuestran una estrategia alternativa para construir CAR para linfocitos T que se puede regular con mayor precisión en comparación con los diseños de CAR actuales. Los experimentos se diseñaron para desarrollar un sistema de CAR regulado novedoso que comprende al menos dos o tres proteínas de fusión quiméricas. Las señales activadoras y las señales inhibidoras de linfocitos T primarios se basan en receptores activadores e inhibidores de origen natural de células NK conocidos como receptores similares a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos (KIR).

[0474] Los KIR existen como formas tanto activadoras como inhibidoras que dependen del dominio intracelular del receptor. Los KIR activadores suministran sus señales a través de una interacción con la proteína de membrana que contiene motivo de activación basado en inmunotirosina (ITAM), DAP12, que es reclutada por residuos dentro de los dominios transmembranarios de estas proteínas. Los KIR inhibidores portan un dominio citoplasmático que contiene motivos inhibidores basados en inmunotirosina (ITIM), que suprimen la señal activadora que conduce a la inhibición de la actividad citolítica de NK y productora de citocinas. De manera similar a los TCR, los KIR pertenecen a la familia de inmunoglobulinas de receptores proteicos, y muchos se unen a MHC invariante y ligandos similares a MHC. Sin desear ceñirse a teoría particular alguna, se cree que estas interacciones se utilizan para distinguir de forma natural las células normales (que normalmente expresan MHC de clase I de alta densidad) de las células malignas o infectadas por virus (a menudo con MHC de clase I bajo o ausente).

[0476] Se han construido receptores quiméricos para el antígeno similares a KIR (CAR-KIR) que fusionan un scfv con un antígeno diana de interés con KIR activadores e inhibidores como se muestra en la Figura 1. La activación condicional de los linfocitos T se genera mediante el acoplamiento de un CAR-KIR activador (CAR-KIRact) o CAR TCR-zeta estándar que porta un scfv a un antígeno en la célula maligna de interés. Un CAR inhibidor (CARinh) que porta un scfv dirigido contra un antígeno que está presente en tejido normal, pero no maligno, proporcionaría amortiguación de la señal primaria del CAR activador cuando el linfocito T encuentra células normales. Los ejemplos de antígenos que sirven como dianas útiles para CAR inhibidores incluyen los receptores de efrina (Pasquale, 2010, Nat Rev Cancer 10(3):165-80) y claudinas (Singh et al., 2010, J Oncol, 2010:541957), que se expresan por células epiteliales de tejidos normales, pero a menudo se pierden selectivamente por cánceres (por ejemplo, EPHA7).

[0478] Ejemplo 2: Construcción y actividad de CAR-KIR activador

[0480] Los experimentos se diseñaron para construir CAR-KIR activadores basándose en la fusión del scFv anti-CD19 o antimesotelina (SS-1) que se incorporaron previamente en CAR basándose en el dominio citoplasmático de TCR-zeta que se encuentran actualmente en ensayos clínicos. Se eligió el receptor KIR activador KIR2DS2 humano como el receptor base inicial para el CAR-KIRact. Con el fin de suministrar señales activadoras, los CAR-KIRact requirieron la coexpresión de DAP12, que no se expresa normalmente en linfocitos T. Por lo tanto, se construyó un vector lentivírico que expresa tanto el CAR-KIRact con DAP12 humana usando un casete génico "bicistrónico" basado en el péptido de salto ribosómico 2A. En la Figura 2 se ilustra un diagrama del vector lentivírico. Los estudios iniciales demostraron que los CAR-KIRact se expresaron de manera eficiente en linfocitos T humanos primarios y el CAR-KIRact SS1 se unió a mesotelina (Figura 3). Similar al CAR SS1 scFv CD3 zeta (SS1-ζ) desarrollado y publicado previamente (Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106(9):3360-5), los linfocitos T que expresan el CAR-KIRact SS1 demostraron actividad citotóxica hacia células K562 diana modificadas para expresar el ligando de mesotelina (KT-meso) como se muestra en la Figura 4. Ninguno de los receptores presenta la destrucción de K562 natural que carece de la diana de mesotelina.

[0482] Dado que la actividad citotóxica del CAR-KIR SS1 hacia células diana positivas para mesotelina fue menor que el CAR basado en TCRzeta convencional que se dirige al mismo antígeno con una expresión en la superficie de CAR comparable, se cree que el CAR de mesotelina puede tener una bisagra extracelular (basada en KIR2DS2 natural) que no es óptima para la segregación de CD45 debido a su longitud. Se cree que la segregación cinética de los receptores basados en ITAM activadores de CD45 es un mecanismo clave para la activación de TCR, y depende de una escala de longitud entre las membranas de linfocitos T y células diana de ~14-15 nm (Choudhuri et al., 2005, Nature 436(7050):578-82). Se estima que el KIR-CAR SS1 basado en KIR2DS2 tiene una escala de longitud superior a 20 nm, según la estructura cristalina parcial de la mesotelina, lo que demuestra que el epítopo SS1 se encuentra probablemente a una distancia de ~10 nm de la membrana celular diana (Ma et al., 2012, J Biol Chem 287(40): 33123-31) y el CAR, que se estima en ~ 10 nm, suponiendo que cada dominio similar a la Ig es de ~3.5 nm en la bisagra KIR2DS2, además del scFv. Por lo tanto, se construyó un CAR-KIR activador en el que se retiró la bisagra KIR2DS2 (CAR KIRS2) como se muestra esquemáticamente en la Figura 5. Se demostró que un CAR KIRS2 basado en scFv SS1 presentó actividad citolítica potenciada hacia células diana que expresan mesotelina en comparación con el CAR formado por fusión del scFv SS1 en KIR2DS2 natural de longitud completa (Figura 6). Este CAR KIRS2 optimizado también mostró una actividad mejorada sobre el CAR TCRzeta basado en scFv SS1 que tiene una bisagra extracelular CD8 alfa.

[0483] Ejemplo 3: Construcción y actividad de CAR-KIRinh

[0484] Se construyó un CAR-KIR inhibidor basándose en la fusión del scFv SS1 anti-mesotelina con la base del receptor de KIR2DL3 inhibidor. Los estudios iniciales demostraron que los CAR-KIRinh se expresaban de manera eficiente en linfocitos T humanos primarios.

[0485] El CAR-KIRact CD19, el CAR-KIRact SS1 y el CAR-KIRinh SS1, solos o combinados, se han introducido en linfocitos T Jurkat que portan un indicador dsGFP bajo el control de un promotor dirigido por NFAT para monitorizar la activación de esta ruta de señalización de linfocitos T críticos. Aunque los linfocitos T Jurkat que expresan el CAR-KIRact CD19 o CAR-KIRact SS1 solos se activan eficazmente por K562 que expresan tanto CD19 como mesotelina (KT-meso/CD19), los linfocitos T Jurkat que coexpresan el CAR-KIRact CD19 y el CAR-KIRinh SS1 mostraron una activación notablemente reducida por las mismas células diana KT-meso/CD19 (Figura 7A); sin embargo, el análisis de la expresión superficial de la unión de CD19 y mesotelina scFv usando reactivos específicos de idiotipo demostró sorprendentemente que la expresión de las diferentes especificidades de la diana scFv eran mutuamente excluyentes (Figura 7B).

[0486] Ejemplo 4: Sensibilidad de los diseños de CAR-KIR activadores a los sistemas receptores inhibidores naturales Dado que la coexpresión de dos CAR scFv es limitada, se siguió una estrategia para evaluar la sensibilidad de los CAR activadores basados en KIR a las señales inhibidoras derivadas del receptor PD-1. PD-1 es un receptor natural en linfocitos T que usa un ITIM en el dominio citoplasmático similar a los KIR inhibidores para reclutar fosfatasas que regulan negativamente la señalización de TCR. En la Figura 19 se muestra una representación esquemática. Los resultados presentados en el presente documento demuestran que PD-1 natural puede sobreexpresarse tanto con un CAR basado en KIR activador como con un CAR basado en TCR-zeta dirigido a mesotelina (Figuras 8A y 8C). Los resultados también muestran que esta combinación condujo a la inhibición dependiente del ligando de PD-1 (PDL-1) de la citotoxicidad de CAR-KIR activador específico para mesotelina (Figura 9). En el contexto de la expresión normal de PD-1 por los linfocitos T (es decir, linfocitos T sin transfección con PD-1), el CAR-KIR presenta menos inhibición cuando se encuentra con células diana que sobreexpresan PD-L1 en comparación con el CAR basado en TCR-zeta. Sin desear ceñirse a teoría particular alguna, se cree que esto puede ser una ventaja de los CAR-KIR cuando se encuentran con tumores que expresan comúnmente ligandos receptores inhibidores.

[0487] Ejemplo 5: Activación dependiente de la coestimulación de CAR KIR

[0488] Se diseñaron experimentos para evaluar los efectos de los receptores coestimuladores quiméricos (CCR) en el sistema CAR-KIR en comparación con los descritos con CAR convencionales por Kloss et al. (Kloss et al., 2013, Nat Biotechnol 31(1):71-5). También se han diseñado experimentos para evaluar los requisitos de activación dependiente de la coestimulación para los KIR mediante el acoplamiento del receptor CD28 endógeno en linfocitos T usando el anticuerpo agonista, clon 9.3. Como se muestra en la Figura 14, el CAR KIRS2 mostró una proliferación robusta en respuesta a dianas positivas para mesotelina en ausencia de coestimulación con CD28. Esta proliferación es superior a la observada con un CAR TCR-zeta donde se ha demostrado que la coestimulación es crítica para la proliferación. Estos datos sugieren que el CAR basado en KIR puede no tener los mismos requisitos de coestimulación que los CAR TCR-zeta para la proliferación específica de antígeno (Milone et al., 2009, Mol Ther 17(8):1453-64; Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106(9):3360-5), y esta independencia de coestimulación puede ser una ventaja significativa de los CAR basados en KIR para los actuales CAR basados en TCR-zeta. Se han diseñado experimentos para evaluar los CAR basados en KIR en ratones humanizados para probar el CAR basado en KIR contra CAR con y sin dominios coestimuladores en un entorno preclínico in vivo (los datos y experimentos en el Ejemplo 5 también se presentan en el Ejemplo 6).

[0489] Ejemplo 6: Los receptores quiméricos para el antígeno (CAR) basados en receptores similares a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos (KIR) desencadenan una actividad citotóxica robusta en tumores sólidos

[0490] Los receptores quiméricos para el antígeno (CAR) que portan un dominio de unión a antígeno ligado encisa los dominios citoplasmáticos de CD3-ζ y receptores coestimuladores proporcionan un método potente para modificar la citotoxicidad de linfocitos T hacia tumores (Grupp et al., The New England Journal of Medicine, 368(16):1509-18, 2013; Brentjens et al., Science Translational Medicine, 5(177):177ra38, 2013; Porter et al., The New England Journal of Medicine, 365(8):725-33, 2011). En el presente documento se describe un receptor quimérico alternativo en el que se fusionó un fragmento variable monocatenario (scFv) que se dirige a mesotelina (SS1) al dominio transmembranario y citoplasmático de KIR2DS2, un receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos (KIR) estimulante normalmente expresado por linfocitos citolíticos naturales (NK). Este CAR basado en KIR SS1-KIRS2 desencadena una actividad citotóxica específica para antígeno robusta, secreción y proliferación de citocinas cuando se suministra a linfocitos T en combinación con la molécula adaptadora DAP12. De manera importante, usando un modelo de xenoinjerto de mesotelioma que es resistente a linfocitos T modificados con CAR basados en CD3ζ que portan los dominios citoplasmáticos de los receptores coestimuladores, CD28 o 4-1BB, los linfocitos T modificados con SS1-KIRS2/DAP12 presentan una actividad antitumoral superior, lo que sugiere que el CAR basado en KIR puede superar señales inhibidoras dentro de tumores que limitan los CAR basados en CD3ζ de segunda y tercera generación. Los datos presentados en el presente documento apoyan la evaluación clínica futura de un CAR basado en KIR en tumores sólidos.

[0491] Los CAR de "primera generación" se diseñaron mediante la incorporación de un dominio citoplasmático que contenía el motivo de activación basado en inmunotirosina (ITAM) en un único receptor quimérico que usa un fragmento variable monocatenario (scFv) de un anticuerpo para la selección de dianas específicas para el antígeno (Sadelain et al., Cancer Discovery, 3(4):388-98, 2013). Posteriormente se incorporaron en tándem varios dominios de señalización adicionales diferentes de receptores coestimuladores tales como CD28, ICOS, 4-1BB y OX-40 en estos receptores para potenciar la proliferación y la función efectora de los CAR (Finney HM et al. J Immunol.1998;161:2791-2797; Maher J. et al. NAT Biotech 2002; 20:70-75; Finney HM et al. J Immunol.2004; 18:676-684; Milone et al., 2009, Mol Ther 17(8):1453-64; Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106(9):3360-5). Estos CAR de "segunda generación" (un dominio coestimulador) y "tercera generación" (2 dominios coestimuladores) demuestran una función significativamente mejorada en modelos animales preclínicos de cáncer, y estos CAR potenciados en coestimulación se encuentran actualmente en ensayos clínicos en humanos para neoplasias hematológicas y tumores sólidos (revisados en Barrett DM et al., Ann Rev Med 2014; 65:333-347).

[0493] Aunque los CAR monocatenarios desencadenan una robusta actividad citotóxica específica de antígeno, los receptores naturales que utilizan los dominios ITAM altamente conservados se estructuran generalmente en complejos multicatenarios compuestos por cadenas de unión a ligando separadas y cadenas de señalización que contienen ITAM, tales como el complejo receptor de linfocitos T (TCR)-CD3, el complejo receptor de linfocitos B (BCR)-Igα/β y el complejo receptor de Fc (FcR). Se ha propuesto que los beneficios de un complejo inmunorreceptor multicatenario incluyen: 1) mayor diversidad de señales disponibles a través de las interacciones de cadena múltiple, 2) el uso de un dominio de señalización para múltiples receptores de unión a ligando, y 3) señalización sostenida por la cadena que contiene ITAM que se puede separar de la internalización de la cadena de unión a ligando (Sigalov et al., Advances in experimental medicine and biology, 640:ix-xi, 2008). Las consecuencias de combinar varios componentes de receptores homólogos que normalmente se encuentran en diferentes receptores en un único CAR no se han dilucidado completamente; sin embargo, se ha observado señalización independiente de energía y antígeno con algunos diseños que sugieren que estos receptores pueden no dar lugar completamente a la función de los receptores naturales en los que se basan (Brocker, Blood, 96(5):1999-2001, 2000; Brocker et al., The Journal of experimental medicine.

[0494] 181(5):1653-9, 1995; Milone et al., Molecular therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy, 17(8):1453-64, 2009).

[0496] La invención reivindicada en el presente documento describe CAR construidos sobre un diseño de receptor dividido más "natural" que tiene una mayor potencia en la activación de linfocitos T debido a las interacciones seleccionadas de forma natural entre las subunidades dentro del complejo receptor. Se eligió el sistema de receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos (KIR), que representa uno de los sistemas de receptores basados en ITAM más simples, como la base de un CAR (Thielens et al., Current Opinion in Immunology, 24(2):239-45, 2012). Aunque se expresa en linfocitos citolíticos naturales donde contribuyen a su citotoxicidad natural, también se ha observado la expresión de KIR tanto en linfocitos T CD4+ como CD8+ (Moretta et al., Immunological Review, 155:105-17, 1997; Falk et al., Human Immunology; 61(12):1219-32, 2000; Remtoula et al., Journal of Immunology, 180(5):2767-71, 2008). Los KIR activadores, tales como KIR2DS2, poseen un dominio citoplasmático corto sin capacidad de señalización endógena conocida. En su lugar, estos receptores forman un complejo no covalente con dímeros de DAP12, una molécula adaptadora que contiene ITAM capaz de unirse a cinasas Syk y Zap70 en células NK (Lanier et al., Nature, 391(6668):703-7, 1998). Además de estimular la citotoxicidad tras la unión del ligando, también se ha demostrado que los KIR presentan efectos coestimuladores dentro de los linfocitos T en ausencia de DAP12, lo que sugiere que estas moléculas podrían ser capaces de proporcionar tanto actividad desencadenante primaria como coestimulación en linfocitos T (Snyder et al., Journal of Immunology, 173(6):3725-31, 2004).

[0498] Se construyó un CAR basado en KIR empalmando el scFv SS1 específico de mesotelina en el dominio transmembranario y citoplasmático corto del KIR activador, KIR2DS2 (SS1-KIRS2) tal como se ilustra esquemáticamente en la Figura 1 (Hassan et al., Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 8(11):3520-6, 2002). La molécula adaptadora que contiene ITAM, DAP12, se expresa constitutivamente en linfocitos citolíticos naturales (NK), pero solo se expresa en un subconjunto de linfocitos T humanos (Morettaet al.). Por lo tanto, se generó un vector lentivírico bicistrónico que codifica tanto el CAR basado en KIR específico de mesotelina (SS1-KIRS2) como la molécula DAP12 separada por la secuencia del virus deThoseaasigna2A (T2A) con el fin de lograr la coexpresión de ambas moléculas (Fig.2). La transducción de linfocitos T humanos primarios con lentivirus bicistrónico SS1-KIRS2 y DAP12 después de la activación anti-CD3 y anti-CD28 demostró una expresión superficial robusta de SS1-KIRS2 que era comparable al CAR SS1ζ basado en CD3ζ (Fig.6). Los linfocitos T cotransducidos SS1-KIRS2/DAP12 se expandieron después de la estimulación policlonal anti-CD3/anti-CD28 con cinética que era comparable a la observada con linfocitos T transducidos de forma simulada o linfocitos T transducidos con un CAR específico para mesotelina que contenía el dominio citoplasmático CD3ζ (datos no mostrados). Se compararon las actividades citotóxicas de los linfocitos T-CAR basados en KIR frente a CD3ζ (SS1-z). Los linfocitos T transducidos por SS1-KIRS2/DAP12 mostraron una potente actividad citotóxica hacia células K562 que expresan mesotelina humana (K-meso), pero no muestran actividad hacia K562 natural (Kwt), de magnitud similar a la construcción SS1ζ que soporta la activación específica del receptor SS1-KIRS2 por el antígeno diana de mesotelina afín (Fig.6).

[0500] Dado que la expresión de KIR2DS2 se ha descrito en linfocitos T en ausencia de expresión de DAP12 detectable, se evaluó la expresión y función del receptor SS1-KIRS2 con o sin suministro conjunto de DAP12. Usando un vector lentivírico que coexpresaba DAP12 con la proteína fluorescente roja, dsRed (DAP12-dsRed) o un vector de control que expresa dsRed (dsRed), se transdujeron linfocitos T con la DAP12 lentivírica o vector de control seguido de transfección con ARN transcritoin vitroque expresa SS1-KIRS2. SS1-KIRS2 se expresó en la superficie de los linfocitos T sin la adición de DAP12; sin embargo, la expresión superficial de SS1-KIRS2 aumentó en ~1-log con la adición de DAP12 (Fig.12A). A pesar de la expresión de SS1-KIRS2 en ausencia del suministro conjunto de DAP12, estos linfocitos T no mostraron actividad citotóxica apreciable en respuesta a células diana que expresan mesotelina en comparación con linfocitos T que coexpresaron SS1-KIRS2 y DAP12 (Fig. 12B). Los datos presentados en el presente documento sugieren que DAP12 es necesario para la actividad SS1-KIRS2, pero no excluye la posibilidad de que el dominio KIR también pueda proporcionar actividad coestimuladora adicional independiente de su asociación con DAP12 de manera similar al receptor KIR2DS2 natural (Snyderet al.).

[0502] La asociación no covalente de KIR2DS2 y DAP12 naturales depende de las interacciones electrostáticas entre un residuo de ácido aspártico en el dominio transmembranario de KIR (TM) y un residuo de lisina en el dominio TM de DAP12 (Feng et al., PLoS biology, 4(5):e142, 2006). Aunque se cree que la configuración de estos residuos aminoacídicos ionizables en los dominios TM de las subunidades TCR y CD3 difiere de los KIR y DAP12, proporcionando cierta especificidad por las interacciones, se investigó la posibilidad de que SS1-KIRS2 pudiera estar interactuando con componentes del complejo CD3 en lugar de DAP12 suministrada conjuntamente. Dado que la asociación entre el complejo de CD3 y las cadenas de TCR es necesaria para la expresión de TCR en la superficie celular, cabría esperar que la competencia del KIR por componentes de CD3 interfiera con la expresión normal de TCR como se observó previamente con la expresión de TCR clonados (Varela-Rohena et al., Nature medicine, 14(12):1390-5, 2008). Por lo tanto, se evaluó el efecto de la expresión de SS1-KIRS2 sobre la expresión de un Vβ de TCR endógeno. La frecuencia o intensidad de los linfocitos T TCR Vβ 14.3+ no se vieron afectados en linfocitos T que expresan el SS1-KIRS2. Los datos presentados en el presente documento sugieren una ausencia de una interacción significativa entre SS1-KIRS2 y miembros del complejo CD3 (Fig.13).

[0504] Aunque la actividad citotóxica es una función efectora importante para la actividad antitumoral in vivo de los linfocitos T, la capacidad de un receptor de antígeno para desencadenar la secreción de citocinas y la proliferación de linfocitos T también son características importantes que generalmente se correlacionan con una actividad antitumoral robusta in vivo. Por lo tanto, se comparó la capacidad de los linfocitos T que expresan SS1-KIRS2/DAP12 y CAR basados en CD3z sin dominios coestimuladores (SS1-ζ) o con dominios coestimuladores CD28 o 4-1BB (SS1-28ζ y SS1-BBζ, respectivamente) para producir interferón-y e IL-2 en respuesta a mesotelina. La construcción SS1-ζ produjo los niveles más bajos tanto de IFN-y como de IL-2 (Fig.10, 11). La producción de interferón-y fue mayor y de manera similar elevada en los linfocitos T que expresan SS1-KIRS2/DAP12 o CAR basados en CD3ζ que portan dominios coestimuladores (Fig. 10). Los linfocitos T con los CAR basados en CD3ζ que portaban dominios coestimuladores produjeron mayores cantidades de IL-2 en comparación con los linfocitos T que expresaban SS1-ζ o SS1-KIRS2/DAP12 (Fig. 11). El receptor SS1-KIRS2/DAP12 también fue un potente estimulador de la proliferación de linfocitos T en respuesta al antígeno afín (Fig. 14). Sorprendentemente, esta proliferación no se vio afectada por la adición de anticuerpo agonista a CD28 (clon 9.3), lo que sugiere que no se requieren señales coestimuladoras adicionales. Los datos presentados en el presente documento son consistentes con una función coestimuladora informada previamente de KIR2DS2 expresada de forma natural en clones de linfocitos T CD8+ humanos en ausencia de DAP12 (Snyderet al.). Una explicación alternativa es que receptores adicionales expresados de forma natural por los linfocitos T también son capaces de utilizar la DAP12 suministrada conjuntamente que contribuye adicionalmente a la activación y proliferación de linfocitos T.

[0506] Que la actividad antitumoral in vivo de linfocitos T modificados con CAR basados en TCR-ζ específicos de mesotelina se potencia significativamente mediante la incorporación de dominios coestimuladores que incluyen CD28 y 4-1BB se demostró previamente (Carpenito et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(9):3360-5, 2009); sin embargo, la eficacia de una única inyección intravenosa de estos linfocitos T-CAR de segunda o tercera generación en ratones portadores de xenoinjertos de mesotelioma establecidos a menudo no logró conducir a una regresión tumoral completa (Moon EK et al. Clin Cancer Res 2011; 17(14):4719-30; Riese MJ et al. Cancer Res. 2013; 73(12):3566-77). Por lo tanto, se evaluó la actividad de linfocitos T modificados con SS1-KIRS2/DAP12 en este modelo subcutáneo resistente de mesotelioma. La capacidad de los linfocitos T modificados con SS1-KIRS2/DAP12, modificados con DAP12-dsRed y los linfocitos T SS1-28ζ para destruir células EMMESOin vitrose evaluó en primer lugar. Como se muestra en la Figura 15A, los tres tipos de linfocitos T modificados con CAR mostraron una eficacia de destrucciónin vitrosimilar, con citotoxicidad mínima inducida por linfocitos T modificados con DAP12-dsRed. A ratones que portaban grandes tumores EM-meso establecidos se les inyectó por vía intravenosa 10<7>linfocitos T, que fueron linfocitos T transducidos de forma simulada (simulada) o linfocitos T transducidos (a un nivel similar de transducción de ~80 %) con SS1-z, SS1-BBZ, SS1-28z o SS1-KIR-DAP12 y se siguió el crecimiento tumoral (Fig. 15A). En este modelo, los linfocitos T simulados, SS1ζ y SS1BBζ no tuvieron una eficacia antitumoral significativa. El crecimiento de los tumores fue significativa(datos no mostrados), pero solo se ralentizó ligeramente mediante la inyección de los linfocitos T-CAR SS1-28ζ. Por el contrario, después de un periodo de retraso de 10 días, los linfocitos T modificados con SS1-KIRS2/DAP12 indujeron una marcada inhibición de la regresión tumoral del crecimiento tumoral EM-meso durante hasta 48 días. En este momento, los animales fueron sacrificados y la sangre, los bazos y los tumores analizados. Se usó citometría de flujo para detectar la presencia de las células CD45+ humanas (Fig.15B). Solo los ratones que recibieron los linfocitos T-CAR SS1-BBZ tenían células hCD45+ detectables en la sangre y el bazo. Dentro de los tumores, no se detectaron células hCD45+ en ratones tratados con linfocitos T simulados y solo se observó un bajo porcentaje de linfocitos T en ratones tratados con SS1z. Por el contrario, los CAR SS1-KIRS2/DAP12, SS1-28z y SS1-41BB tenían células hCD45+ que comprendían un 2-4 % de las células viables totales con frecuencias comparables observadas para cada grupo (Fig.15B). Los datos presentados en el presente documento demuestran que la eficacia notablemente aumentada de SS1-KIRS2/DAP12 no se debió a una mayor frecuencia de linfocitos T dentro de los tumores.

[0508] Para explorar adicionalmente la ubicación de los linfocitos T dentro de los tumores, se realizó inmunohistoquímica. La tinción mostró linfocitos T CD8+ y linfocitos T CD4+ dentro de los tumores dentro de cada grupo. Los tumores de animales tratados con linfocitos T modificados con CAR SS1-BBζ y SS1-28ζ demostraron infiltrados de linfocitos T particularmente densos; sin embargo, estos infiltrados tendieron a estar dentro de la periferia del tumor, lo que sugiere que los linfocitos T modificados con CAR SS1-BBζ y SS1-28ζ podrían estar limitados en su capacidad de tráfico y/o funcionar con el microentorno tumoral en comparación con los linfocitos T-CAR SS1-KIRS2/DAP12.

[0510] Se ha informado que la expresión constitutiva de DAP12 solo en linfocitos T murinos confiere actividad similar a NK a estos linfocitos T con la capacidad de controlar un tumor sólido a través de efectos desencadenados por ligando NKG2D (Teng et al., The Journal of Biological Chemistry, 280(46):38235-41, 2005). Aunque se ha informado que NKG2D se asocia con DAP12 en ratones, esta asociación parece estar ausente en humanos (Rosen et al. Journal of Immunology, 173(4):2470-8, 2004). A pesar de la falta de actividad citolíticain vitropor parte de linfocitos T que expresan DAP12 solamente, se realizó un segundo experimentoin vivopara comparar linfocitos T que expresan DAP12 solo con SS1-KIRS2/DAP12 y con linfocitos T modificados SS1-28z. De manera similar a los resultadosin vitro, los linfocitos T que expresan DAP12 fueron incapaces de controlar tumores EM-meso en ausencia del receptor SS1-KIR2S específico para mesotelina (Fig. 15C). Los datos presentados en el presente documento muestran una respuesta antitumoral impresionante de los linfocitos T SS1-KIRS2/DAP12 con regresión tumoral franca y casi eliminación de los tumores para el día 48.

[0512] Se ha demostrado que la persistencia de linfocitos T en tumores es un determinante importante de la eficacia de transferencia de linfocitos T adoptivos. Sin embargo, los datos presentados en el presente documento muestran que los efectos potenciados del CAR-KIR no se deben a un mayor número de linfocitos T dentro de los tumores; tanto las construcciones SS1-28z como SS1-41BBz parecen persistir en números ligeramente mayores que los CAR-KIR. Sin embargo, la ubicación de los linfocitos T-CAR puede ser importante. Los datos de tinción presentados en el presente documento sugieren que los linfocitos T SS1-KIRS2/DAP12 pueden ser más eficaces para alcanzar el centro de los tumores.

[0514] Se están investigando activamente los mecanismos responsables de la eficacia notablemente mejorada de los CAR basados en el KIR. Aunque tanto los sistemas de receptores CD3 como KIR se basan en el reclutamiento y la activación basadas en ITAM de la señal posterior, la naturaleza de la señalización mediada por ITAM resultante puede no ser equivalente. Recientemente, se ha demostrado que varios receptores heterólogos sin mecanismo conocido para la interacción con receptores que contienen ITAM, incluidos los receptores de citocinas para interferón de tipo I e IL-3, los receptores de quimiocinas, CXCR4 y RANKL dependen del receptor que contiene ITAM para la señalización (Wang et al., Nature Immunology, 9(2):186-93, 2008; Hida et al., Nature Immunology, 10(2):214-22, 2009; Koga et al., Nature, 428(6984):758-63, 2004; Kumar et al., Immunity, 25(2):213-24, 2006). Por lo tanto, es posible que la introducción de DAP12 en linfocitos T pueda alterar una serie de señales adicionales que podrían ser relevantes para la función de los linfocitos T dentro del microentorno tumoral complejo. La proliferación robusta de linfocitos T después de la activación de CAR basados en KIR sin coestimulación adicional también podría ser una parte importante de la eficacia mejorada de linfocitos T modificados con SS1-KIRS2 y DAP12. La expansión clonal de los linfocitos T después del TCR y el acoplamiento coestimulador del receptor requiere enormes demandas sintéticas. Tanto los receptores CD28 como 4-1BB son potentes activadores de la vía mTOR que es un regulador importante del metabolismo requerido para apoyar la expansión clonal (Colombetti et al., Journal of Immunology, 176(5):2730-8, 2006; So et al., Frontiers in immunology, 4:139, 2013; Marelli-Berg et al. Immunology, 136(4):363-9, 2012). Curiosamente, Berezhnoy et al. informaron recientemente que la interrupción de mTOR usando un ARNip a Raptor dirigido por un aptámero de ARN específico para 4-1BB mejoró significativamente la actividad antitumoral de los linfocitos T después de la vacunación terapéutica de ratones portadores de tumores (Berezhnoy et al., The Journal of Clinical Investigation.

[0515] 124(1):188-97, 2014). Dado que las señales coestimuladoras, tales como CD28 y 4-1BB, se regulan normalmente tanto temporal como espacialmente durante una respuesta inmunitaria, esto sugiere que las señales coestimuladoras no reguladas producidas por los CAR BBζ y 28ζ, aunque son críticas para una proliferación robusta en respuesta a la activación de CAR CD3ζ, podrían tener efectos negativos sobre la función de los linfocitos T in vivo, tal vez a través de una señalización de mTOR persistente.

[0517] En conclusión, los datos presentados en el presente documento demuestran que la combinación de CAR basado en KIR y DAP12 proporciona un sistema de receptor altamente eficaz para conferir especificidad de antígeno artificial a linfocitos T. A pesar de la actividadin vitrorelativa equivalente, se ha demostrado además que este CAR basado en KIR tiene una eficacia antitumoral muy mejorada en comparación con los CAR basados en CD3ζ con uno o más dominios coestimuladores en el sistema tumoral modelo utilizado en el presente documento, tal vez debido a una mayor resistencia a la inactivación. Se llevará a cabo una exploración adicional en los mecanismos de esta eficacia aumentada y de diseños de receptores quiméricos basados en otros receptores de unión a ligando asociados con DAP12, así como sistemas receptores que contienen ITAM naturales adicionales tales como FcRy.

[0518] Ejemplo 7: Un CAR basado en KIR se puede coexpresar con un KIR inhibidor natural que permite la regulación mediante la expresión de HLA en las células diana

[0519] Generación y caracterización de una línea celular K562-meso que expresa el ligando KIR2DL3 HLA-CwMaterial y método:Se transdujeron células K562 naturales o una línea K562 diseñada previamente para expresar mesotelina (K562-meso) con un vector lentivírico que codifica el alelo HLA-Cw3. Las células se clasificaron para determinar la expresión uniforme de mesotelina y HLA-Cw3 mediante clasificación celular activada por fluorescencia. La expresión de HLA-Cw3 se confirmó mediante citometría de flujo después de la tinción con el anticuerpo W6/32 anti-HLA A, B, C conjugado con APC.

[0520] Resultado:Se pueden generar líneas celulares K562 que expresan mesotelina o HLA-Cw3 solos o combinados (Fig. 20).

[0521] Coexpresión de SS1-KIRS2 y KIR2DL3 en linfocitos T humanos primarios

[0522] Material y método:Se estimularon linfocitos T humanos primarios con microperlas anti-CD3/28 seguida de transducción con un vector lentivírico bicistrónico que expresa DAP12 y SS1-KIRS2 solos o en combinación con un vector lentivírico que expresa KIR2DL3 el día 1 después de la activación. La expresión del CAR SS1-KIRS2 se evaluó mediante citometría de flujo usando un anticuerpo policlonal de cabra anti-F(ab)2 de ratón biotinilado seguida de SA-APC. La expresión de KIR2DL3 se determinó usando un anticuerpo monoclonal específico para KIR2D.

[0523] Resultado:Pueden generarse linfocitos T humanos primarios que expresan un CAR basado en KIR específico de mesotelina con DAP12 (KIRS2) solo, KIR2DL3 solo o una combinación de los dos receptores (Fig.21).

[0524] KIR2DL3 coexpresado con un CAR-KIR puede suprimir la citotoxicidad específica para antígeno en presencia de HLA-Cw en las células diana

[0525] Material y método:Se estimularon linfocitos T humanos primarios con microperlas anti-CD3/28 seguida de transducción con un vector lentivírico bicistrónico que expresa DAP12 y SS1-KIRS2. Se introdujeron 5 µg de ARNm transcrito in vitro que codificaba KIR2DL3 en los linfocitos T transducidos lentivíricamente mediante electroporación después de 10 días de expansiónex vivo. Estas poblaciones de linfocitos T se mezclaron con células diana K562 marcadas con<51>Cr (K562, K562-meso, K562-HLACw y K562-meso/HLACw) como se indica en diferentes proporciones de linfocitos T efectores respecto a células K562 diana (relación E:T). La citotoxicidad se determinó midiendo la fracción de<51>Cr liberada en el sobrenadante a las 4 horas.

[0526] Resultado:Los linfocitos T que expresan SS1-KIRS2/DAP12 fueron capaces de destruir células K562 diana que expresan mesotelina independientemente de la expresión de HLA-Cw3. Por el contrario, los linfocitos T que coexpresan el complejo del receptor SS1-KIRS2/DAP12 y el KIR inhibidor, KIR2DL3 no pudieron presentar una citotoxicidad robusta contra K562 que expresaba mesotelina con HLA-Cw3; sin embargo, estas células demostraron actividad citotóxica hacia células K562 que expresaban mesotelina sola que era comparable a los linfocitos T modificados con SS1-KIRS2/DAP12. Estos resultados demuestran la capacidad de los receptores KIR inhibidores para regular la actividad funcional de activar CAR basados en KIR (Fig.22).

[0527] Ejemplo 8: Un CAR basado en KIR con especificidad para CD19 puede desencadenar citotoxicidad de células diana específicas para antígeno in vitro e in vivo

[0528] Un CAR basado en KIR con especificidad para CD19 puede desencadenar citotoxicidad de células diana específicas para antígeno in vitro

[0529] Material y método:Después de la activación de perlas anti-CD3/anti-CD28, se transdujeron linfocitos T con un vector lentivírico bicistrónico que expresa DAP12 junto con un CAR basado en KIR específico para CD19 en el que el scFv derivado de FMC63 se fusiona con KIR2DS2 de longitud completa (CD19-KIR2DS2) o un CAR basado en KIR generado fusionando el scFv de FMC63 con el dominio transmembranario y citoplasmático de KIR2DS2 a través de un conector corto [Gly]<4>-Ser (CD19-KIRS2). Los linfocitos T transducidos se cultivaron hasta el final del crecimiento de la fase logarítmica, y la expresión del CAR basado en KIR específico para CD19 se evaluó mediante citometría de flujo usando un anticuerpo policlonal de cabra anti-F(ab)<2>de ratón biotinilado seguida de SA-PE. Las células diana K562 marcadas con<51>Cr con (K562-CD19) o sin (K562-wt) expresión de CD19 se mezclaron en proporciones variables con linfocitos T respecto a células diana (relación E:T). La citotoxicidad se determinó midiendo la fracción de<51>Cr liberada en el sobrenadante a las 4 horas. Los linfocitos T de control que se transdujeron de forma simulada (NTD) o se transdujeron con un CAR basado en CD3ζ específico para CD19 (CD19-z) también se incluyeron como controles negativos y positivos, respectivamente.

[0530] Resultado:El análisis por citometría de flujo demuestra la expresión del scFv específico para CD19 en la superficie de los linfocitos T transducidos con CD19-KIR2DS2, CD19-KIRS2 y CD19-z (Fig. 16A). Los linfocitos T que expresan DAP12 con CD19-KIR2DS2 o CD19-KIRS2 fueron capaces de destruir células diana de una manera específica para el antígeno (FIG. 16B). La citotoxicidad mostrada por los linfocitos T modificados con CAR basados en KIR fue comparable o superior a los linfocitos T que expresan un CAR basado en CD3ζ específico para CD19.

[0531] Los linfocitos T transducidos con CD19-KIRS2/DAP12 inducen regresión tumoral en un xenoinjerto de leucemia humana

[0532] Material y método:Se injertaron ratones NOD-SCID-γ<c>-/-

(NSG) por vía intravenosa por vena de la cola el día 0 con 1 millón de células tumorales NALM-6 CBG, una línea celular de leucemia que expresa CD19. En el experimento, los linfocitos T se estimularon con perlas estimuladoras anti-CD3/anti-CD28 seguidas de transducción lentivírica el día 1 con una serie de CAR basados en CD3 con o sin un dominio coestimulador (CD19-z, CD19-BBz) o los CAR basados en KIR específicos para CD19, CD19-KIRS2 con DAP12 como se indica en la figura. Se usaron linfocitos T transducidos de forma simulada (NTD) como control. Los linfocitos T se expandieron hasta el final del crecimiento en fase logarítmica ex vivo y se inyectaron por vía intravenosa el día 5 después de la inyección de la línea celular de leucemia con 2 millones de linfocitos T-CAR por ratón. La carga tumoral se evaluó mediante obtención de imágenes bioluminiscentes. Se analizaron 5 animales para cada condición de linfocitos T (Fig.17).

[0533] Resultado:En el experimento in vivo presentado (Fig.17), los linfocitos T NTD no tuvieron efecto sobre el crecimiento tumoral, mientras que los linfocitos T transducidos con CD19z, CD19BBz□y CD19-KIRS2 presentan diversos efectos antitumorales. Los ratones infundidos con linfocitos T CD19zmostraron una ligera reducción en la carga tumoral, pero mantuvieron niveles detectables de luminiscencia. Por el contrario, la luminiscencia de las células tumorales en ratones infundidos con linfocitos T CD19BBz o CD19KIRS2 cayó hasta el límite inferior de detección (Fig.17B, línea punteada) solo 7 días después de la inyección de linfocitos T, mostrando un aclaramiento completo fuera de un pequeño depósito de células leucémicas en la raíz dental inaccesible a linfocitos T. En el día 15, la carga tumoral en el grupo de linfocitos T simulado superó el criterio de valoración (2×10<10>fotones/segundo) y se sacrificó, mientras que la luminiscencia en los grupos CD19BBz y CD19KIRS2 permaneció en el límite inferior de detección.

[0534] Ejemplo 9: Un CAR basado en un dominio VHH único de camélido se puede expresar en una superficie de linfocitos T en combinación con un CAR basado en scFv sin interacción apreciable con el receptor.

[0535] Material y método:Se transdujeron linfocitos T Jurkat que expresan GFP bajo un promotor dependiente de NFAT (NF-GFP) con un CAR activante específico para mesotelina (SS1-CAR), un CAR activante específico para CD19 (19-CAR) o un CAR generado usando un dominio VHH de camélido específico para EGFR (VHH-CAR). Después de la transducción con el CAR activante, las células se transdujeron con un CAR inhibidor adicional que reconoce CD19 (19-PD1) para generar células que coexpresan tanto el CAR activante como el inhibidor (SS1+19PD1, 19+19PD1 o VHH+19PD1). Los linfocitos T Jurkat transducidos se cocultivaron durante 24 horas con diferentes líneas celulares que están 1) desprovistas de todos los antígenos diana (K562), 2) expresan mesotelina (K-meso), CD19 (K-19) o EGFR (A431) únicamente, 3) expresan una combinación de EGFR y mesotelina (A431-mesotelina) o CD19 (A431-CD19) o 4) expresan una combinación de CD19 y mesotelina (K-19/meso). Condiciones adicionales que incluyen células sin estimulador (sin estim.) o K562 con 1 µg/ml de OKT3 (OKT3) también se incluyeron como controles negativos y positivos para la activación de NFAT, respectivamente. La expresión de GFP, como marcador de la activación de NFAT, se evaluó mediante citometría de flujo.

[0536] Resultado:Los camellos y especies relacionadas (por ejemplo, llama) producen de forma natural anticuerpos que tienen un solo dominio variable similar a una cadena pesada. Este dominio, conocido como dominio VHH de camélido, ha evolucionado para existir sin aparearse con un dominio variable de cadena ligera. La Fig. 27A muestra esquemáticamente la posibilidad de que dos moléculas scFv heterólogas puedan disociarse y reasociarse entre sí cuando se muestran en la superficie de una célula como lo demuestra la interrupción observada en la unión de scFv al ligando afín durante la coexpresión del receptor (Fig 25 y Fig 26). La Fig. 27B muestra una representación esquemática de la interacción reducida esperada entre un CAR scFv que se muestra en la superficie de una célula en combinación con un CAR basado en el dominio VHH. La Fig.28 muestra que la coexpresión de dos CAR basados en scFv (CAR activador SS1-z y CAR inhibidor CD19-PD1) en la superficie de Jurkat conduce a la incapacidad del CAR activador (SS1-z) de reconocer su ligando afín en la célula diana y desencadenar la activación de los linfocitos T a pesar de la ausencia del ligando del receptor inhibidor. Esto es consistente con la unión de ligando reducida observada en la superficie (Fig 25). Por el contrario, la coexpresión del mismo CAR inhibidor (CD19-PD1) con un CAR activador basado en VHH de camélido (VHH-z) no tiene impacto en la capacidad del CAR activador basado en VHH de reconocer su ligando afín. Estos datos respaldan el modelo representado en la Fig. 27B de que un CAR activador basado en VHH puede expresarse con un CAR basado en scFv sin una interacción significativa entre los receptores debido a la capacidad reducida de los dominios scFv y VHH de interactuar.

[0537] Ejemplo 10: Un CAR-NCR basado en NKp46 con especificidad de mesotelina desencadena citotoxicidad específica para antígeno

[0538] Material y método:Después de la activación de perlas anti-CD3/anti-CD28, se transdujeron linfocitos T con un vector lentivírico bicistrónico que expresa DAP12 y SS1-KIRS2 (control), o FcεRγ y un CAR basado en NKp46 específico para mesotelina (SS1-NKp46) o FcεRγ y un CAR NKp46 específico para mesotelina en el que el dominio extracelular de NKp46 natural se truncó (SS1-TNKp46). La expresión de los CAR específicos para mesotelina se evaluó mediante citometría de flujo usando un anticuerpo policlonal de cabra anti-F(ab)2 de ratón biotinilado seguida de SA-PE (Figura 18). Los linfocitos T se mezclaron con células diana K562 marcadas con<51>Cr que expresaban mesotelina en proporciones variables de linfocitos T efectores respecto a células K562 diana (relación E:T). La citotoxicidad se determinó midiendo la fracción de<51>Cr liberada en el sobrenadante a las 4 horas en comparación con la liberación espontánea.

[0539] Resultado:Tanto los receptores SS1-NKp46 como SS1-sNKp46 presentan expresión superficial en linfocitos T. Los linfocitos T transducidos SS1-TNKp46 muestran citólisis de células diana robusta que es comparable al CAR SS1-KIRS2 basado en KIR. SS1-NKp46 mostró una actividad citotóxica más débil que era evidente solo a altas relaciones de células efectoras respecto a células diana (Fig. 18). Estos datos demuestran que se puede generar un inmunorreceptor quimérico específico para antígeno para su uso en la redirección de la actividad citolítica de linfocitos T a partir de receptores de citotoxicidad naturales (NCR) usando un diseño similar al usado para crear un CAR basado en KIR.

[0540] Ejemplo 11: Interacción de dominios scFv

[0541] Material y método:En la figura 24, se transdujeron linfocitos T Jurkat con un vector lentivírico que codifica un CAR basado en KIR inhibidor específico para mesotelina (SS1-KIR2DL3). Estas células transducidas se transdujeron entonces con diluciones variables de un vector lentivírico que codifica un CAR basado en KIR activador específico para CD19 (CD19-KIR2DS2). Estos CAR-KIR se muestran esquemáticamente en la Figura 23. Después de la transducción con ambos CAR, se evaluó la frecuencia de células con expresión superficial de un CAR con un scFv intacto capaz de unirse a su ligando diana mediante citometría de flujo después de la tinción con una proteína de fusión mesotelina-Fc seguida de un anticuerpo anti-Fc secundario marcado con PE y un anticuerpo monoclonal antiidiotipo específico anti-CD19 (clon FMC63) marcado con APC. En la figura 25, se transdujeron linfocitos T humanos primarios activados anti-CD3/28 con diferentes vectores lentivíricos que codifican un CAR basado en CD3z específico de mesotelina que porta una fusión de mCherry al extremo C (SS1z-mCh), un CAR específico para CD19 con dominio citoplasmático CD3z y 4-1BB (19bbz) o una combinación de SS1z-mCh y 19bbz. La expresión de mCherry y un scFv SS1 funcional se evaluó mediante citometría de flujo después de la tinción con una proteína de fusión mesotelina-Fc seguido de un anticuerpo anti-Fc secundario marcado con FITC. En la figura 26, se transdujeron linfocitos T humanos primarios activados anti-CD3/28 con diferentes vectores lentivíricos que codifican un CAR basado en CD3z específico para mesotelina (SS1z), un CAR específico para CD19 que porta el scFv FMC63 (19bbz) o un CAR específico para CD19 que porta el scFv 21d4 (21d4bbz) o un CAR específico para CD19 que porta el scFv BL22 (BL22bbz) en el que el scFv estaba compuesto de un dominio variable de cadena pesada (VH) 5' al dominio variable de cadena ligera (VL) en el scFv (H2L) o el VL ubicado 5' respecto al VH (L2H). Después de la transducción con cada uno de los CAR específicos para CD19, los linfocitos T se cotransdujeron a continuación con SS1z. La unión del SS1z a mesotelina y la expresión superficial del scFv anti-CD19 se evaluó mediante citometría de flujo después de la tinción con una proteína de fusión mesotelina-Fc seguido de un anticuerpo anti-Fc secundario marcado con FITC o proteína L biotinilada seguido de APC conjugada con estreptavidina.

[0542] Resultado:La Fig. 24 muestra que la coexpresión de dos CAR basados en scFv de unión a ligando intactos (SS1-KIR2DL3 y CD19-KIR2DS2) en la superficie celular es mutuamente excluyente. La Figura 26 demuestra que la pérdida de unión al ligando se produce a pesar de la expresión del CAR en la célula como se ilustra por la presencia de células que expresan mCherry con unión reducida a mesotelina en células cotransducidas con SS1z-mCh y 19bbz. La Figura 26 demuestra que la interacción entre scFv que conduce a la pérdida de la función de unión a scFv se puede observar usando diferentes CAR basados en scFv que soportan la naturaleza universal de este efecto. Estas observaciones son coherentes con el modelo representado en la Fig. 27 Panel A en el que el dominio variable de un scFv puede experimentar emparejamiento intermolecular con un receptor quimérico basado en scFv heterólogo que conduce a la pérdida de unión por el scFv dentro de un único CAR.

[0543] Ejemplo 12: Secuencias de CAR-KIR

[0544] Secuencia del gen KIR2DS2 de SS1 (SEQ ID NO: 1)

[0545]

[0546]

[0547]

[0548] Secuencia del gen KIRS2 de SS1 (SEQ ID NO: 2)

[0549]

[0552] 

[0553]

[0556] 

[0557]

[0558]

[0559]

[0560] Secuencia de construcción KIR2DS2 de CD19 SEQ ID NO: 4

[0561]

[0562]

[0563]

[0564] Secuencia de CAR quimérica CD19-PD1 (SEQ ID NO: 5)

[0565]

[0566]

[0567] DAP12-T2A-SS1-KIRS2 (SEQ ID NO: 6)

[0568] ADN de 1464 pb

[0569]

[0570]

[0571]

[0572] DAP12-T2A-SS1-KIRS2 (SEQ ID NO: 7)

[0573] Proteína de 488 aa

[0575]

[0577] Secuencia

[0579]

[0580] FCERG-T2A-SS1-TNKp46 (SEQ ID NO: 8)

[0581] ADN de 1365 pb

[0583]

[0585] Secuencia

[0586]

[0587] FCERG-T2A-SS1-TNKp46 (SEQ ID NO: 9)

[0588] Proteína de 455 aa

[0590]

[0592] Secuencia

[0594]

[0595] DAP12-T2A-CD19-KIRS2 (SEQ ID NO: 10)

[0596] ADN de 1470 pb

[0598]

[0600] Secuencia

[0601]

[0602] DAP12-T2A-CD19-KIRS2 (SEQ ID NO: 11)

[0603] Proteína de 489 aa

[0605]

[0607] Secuencia

[0609]

[0610] Dominio intracelular de 4-1BB (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 12)KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

[0611] Dominio de CD3 zeta (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 13)

[0613]

[0614] Dominio citoplasmático de PD1 (SEQ ID NO: 14)

[0615] Aminoácidos 192-288

[0616]

[0617] Dominio citoplasmático de CTLA-4 (SEQ ID NO: 15)

[0618] Aminoácidos 183-223

[0619] AVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN

[0620] Traducción de IgG4H-bisagra (SEQ ID NO: 49)

[0621] 230 lineal

UNA

[0623]

[0624] Traducción de IgDH-bisagra (SEQ ID NO: 50)

[0625] 282 lineal

UNA

[0627]

[0628] Bisagra de CD8 humano (SEQ ID NO: 51)

[0629] 43 lineal

UNA 10-FEB-2009

[0630] TTTPAPRPPT PAPTIASQPL SLRPEACRPA AGGAVHTRGL DFA

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un receptor quimérico para el antígeno del receptor similar a inmunoglobulina de linfocitos citolíticos inhibidores (CAR-KIRinh) purificado, o de origen no natural, que comprende:

(i) un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de una molécula de anticuerpo o que comprende un armazón no de anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a un antígeno diana en una célula;

(ii) un dominio transmembranario; y

(iii) un dominio citoplasmático que contiene ITIM.

2. El CAR-KIRinh de la reivindicación 1, en donde dicho dominio de unión a antígeno extracelular:

(i) comprende un scFv;

(ii) comprende un dominio VH único;

(iii) comprende un anticuerpo de un solo dominio; o

(iv) comprende un dominio VHH de camélido.

3. El CAR-KIRinh de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho dominio de unión a antígeno extracelular se une a un antígeno no presente en una célula cancerosa o un antígeno que se expresa más altamente en una célula no cancerosa, en relación con una célula cancerosa del mismo tipo que la célula no cancerosa.

4. El CAR-KIRinh de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho dominio de unión a antígeno extracelular se une a desmogleína 1/3, un receptor de efrina o una claudina.

5. El CAR-KIRinh de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un dominio bisagra extracelular que:

(i) es distinto de un dominio bisagra de KIR;

(ii) deriva de una molécula natural;

(iii) deriva de una molécula natural distinta de un KIR;

(iv) comprende una secuencia polipeptídica de origen no natural;

(v) comprende la bisagra extracelular de CD8-alfa humano;

(vi) comprende una bisagra extracelular sintética;

(vii) tiene menos de 50, 20 o 10 aminoácidos de longitud; o

(viii) tiene menos aminoácidos que un dominio bisagra de KIR2DS2.

6. El CAR-KIRinh de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho CAR-KIRinh:

(i) comprende un dominio citoplasmático de KIRinh, tal como un dominio citoplasmático KIR2DL o KIR3DL; (ii) comprende un dominio transmembranario de KIR inhibidor;

(iii) comprende un dominio transmembranario distinto de un dominio transmembranario de KIR, tal como un dominio transmembranario de receptores PD-1, CTLA4 o que contienen ITIM de las familias de genes ILT (CD85), Siglec, LMIR (CD300) y/o SLAM de receptores;

(iv) comprende un dominio citoplasmático de un receptor inhibidor distinto de un KIR, tal como de receptores PD-1 o que contienen ITIM de las familias de genes ILT (CD85), Siglec, LMIR (CD300) y/o SLAM de receptores;

(v) comprende un dominio transmembranario y citoplasmático de un receptor inhibidor distinto de un KIR, tal como dominio transmembranario y citoplasmático, independientemente, de los receptores PD-1 o que contienen ITIM de las familias de genes ILT (CD85), Siglec, LMIR (CD300) y/o SLAM de receptores; o

(vi) bien (a) comprende un dominio D de KIR, un dominio D0 de KIR, un dominio D1 de KIR y/o un dominio D2 de KIR; o (b) no comprende un dominio D de KIR.

7. Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un CAR-KIRinh de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. El ácido nucleico de la reivindicación 7, que comprende además una secuencia que codifica un CAR que es un TCAR, que comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio citoplasmático activador del complejo de receptor de linfocitos T con CD3.

9. Una célula citotóxica que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 7 u 8.

10. Un método de preparación de la célula citotóxica de la reivindicación 9, que comprende:

(i) introducir en una célula citotóxica un ácido nucleico de la reivindicación 7 u 8; o

(ii) formar en una célula citotóxica un CAR-KIRinh de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. Una célula citotóxica de la reivindicación 9, en donde la célula comprende además un receptor quimérico para el antígeno del receptor similar a la inmunoglobulina de linfocitos citolíticos activadores (CAR-KIRact), para su uso en: (i) terapia; o

(ii) un método de tratamiento de un sujeto.

12. Una célula citotóxica de la reivindicación 9 para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde la célula comprende además un CAR-KIRact, y en donde:

(i) el CAR-KIRact se dirige a un primer antígeno que se expresa por el cáncer; y

(ii) el CAR-KIRinh se dirige a un segundo antígeno que no se expresa por el cáncer o un antígeno que se expresa más altamente en una célula no cancerosa, con respecto a una célula cancerosa del mismo tipo que la célula no cancerosa.

13. La célula citotóxica para el uso de la reivindicación 11 o 12, en donde:

(i) dicho sujeto o mamífero es un ser humano; o

(ii) dicho sujeto o mamífero tiene un cáncer.

14. La célula citotóxica para el uso de la reivindicación 11(ii) o la reivindicación 12, en donde dicho sujeto es un ser humano y tiene un efecto secundario del tratamiento con dicha célula citotóxica, y en donde el método comprende además tratar dicho efecto secundario con un agente anti-citocina, tal como un antagonista del factor de necrosis tumoral, un antagonista de IL-6, un antagonista del receptor de IL-6 o un corticosteroide.

15. La célula citotóxica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, donde dicha célula es:

(i) autóloga;

(ii) alógena;

(iii) un linfocito T autólogo;

(iv) un linfocito T alógeno;

(v) una célula NK autóloga;

(vi) una célula NK alógena; o

(vii) de una línea de células NK.