ES3059886T3 - Detection and treatment of disease exhibiting disease cell heterogeneity and systems and methods for communicating test results - Google Patents

Abstract

Esta divulgación proporciona, entre otras cosas, métodos para generar y aplicar intervenciones terapéuticas. Los métodos incluyen, por ejemplo: (a) secuenciar polinucleótidos de células cancerosas de un sujeto; (b) identificar y cuantificar mutaciones somáticas en los polinucleótidos; (c) desarrollar un perfil de heterogeneidad tumoral en el sujeto que indique la presencia y la cantidad relativa de varias mutaciones somáticas en los polinucleótidos, donde diferentes cantidades relativas indican heterogeneidad tumoral; y (d) determinar una intervención terapéutica para un cáncer que presente la heterogeneidad tumoral, donde la intervención terapéutica sea eficaz contra un cáncer que tenga el perfil de heterogeneidad tumoral determinado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Detección y tratamiento de enfermedades que presentan heterogeneidad de células enfermas, y sistemas y métodos para comunicar los resultados de las pruebas

[0003] ANTECEDENTES

[0004] La atención sanitaria está empezando ahora a usar de manera eficaz la información del genoma humano para diagnosticar y tratar enfermedades. En ningún ámbito es esto más crucial que en el tratamiento del cáncer, que cada año provoca la muerte de 7,6 millones de personas en los Estados Unidos y para cuyo tratamiento los Estados Unidos gastan 87.000 millones de dólares al año. El cáncer se refiere a cualquier trastorno de varias neoplasias malignas caracterizadas por la proliferación de células anaplásicas que tienden a invadir el tejido circundante y a metastatizar a nuevas partes del cuerpo, así como a las condiciones patológicas caracterizadas por tales crecimientos.

[0005] Una de las razones por las que el cáncer es difícil de tratar es que los métodos de prueba actuales pueden no ayudar a los médicos a relacionar cánceres específicos con tratamientos farmacéuticos eficaces. Además, se trata de una diana móvil, ya que las células cancerosas cambian y mutan constantemente. Los cánceres pueden acumular variantes genéticas a través, por ejemplo, de mutaciones en las células somáticas. Tales variantes incluyen, por ejemplo, variantes de secuencia y variantes del número de copias. El análisis de los tumores ha indicado que las diferentes células de un tumor pueden llevar diferentes variantes genéticas. Esta diferenciación entre las células tumorales se ha denominado heterogeneidad tumoral.

[0006] Los cánceres pueden evolucionar a lo largo del tiempo y volverse resistentes a una intervención terapéutica. Se sabe que ciertas variantes se correlacionan con la respuesta o la resistencia a intervenciones terapéuticas específicas. Sería beneficioso contar con tratamientos más eficaces para los cánceres que presentan heterogeneidad tumoral. Tales cánceres pueden tratarse con una segunda intervención terapéutica diferente a la que responda el cáncer.

[0007] Los métodos de secuenciación del ADN permiten la detección de variantes genéticas en el ADN de las células tumorales. Los tumores cancerosos liberan continuamente su material genómico único al torrente sanguíneo. Desafortunadamente, estas 'señales' genómicas reveladoras son tan débiles que las tecnologías actuales de análisis genómico, incluyendo la secuenciación de última generación, solo pueden detectar tales señales esporádicamente o en pacientes con una carga tumoral terminalmente alta. La razón principal de esto es que estas tecnologías adolecen de índices de error y sesgos que pueden ser órdenes de magnitud superiores a los necesarios para detectar de manera fiable las alteraciones genómicas de novo asociadas al cáncer.

[0008] En una tendencia paralela, para comprender la importancia clínica de una prueba genética, los profesionales que la realizan deben tener un conocimiento práctico de los principios básicos de la herencia genética y una facilidad razonable para interpretar los datos probabilísticos. Algunos estudios sugieren que muchos profesionales del tratamiento que realizan estas pruebas no están adecuadamente preparados para interpretar las pruebas genéticas de susceptibilidad a enfermedades. Algunos médicos tienen dificultades para interpretar los datos probabilísticos relacionados con la utilidad clínica de las pruebas diagnósticas, como el valor predictivo positivo o negativo de una prueba de laboratorio.

[0009] Las tasas de error y el sesgo en la detección de alteraciones genómicas de novo asociadas al cáncer, junto con una explicación inadecuada o las implicaciones de las pruebas genéticas para el cáncer, han reducido la calidad de la atención a los pacientes con cáncer. Las sociedades profesionales, como el Colegio Americano de Patólogos (CAP) y el Colegio Americano de Genética Médica (ACMG), han publicado normas o directrices para los laboratorios que realizan pruebas genéticas, que exigen que los informes que contienen información genética incluyan un contenido interpretativo que sea comprensible para los médicos generalistas.

[0010] El documento WO 2014/151117 (UNIV LELAND STANFORD JUNIOR) analiza la 'Identificación y el uso de marcadores tumorales de ácido nucleico circulante' (título). El documento WO 2012/024543 (CARIS LIFE SCIENCES LUXEMBOURG HOLDINGS) analiza 'Biomarcadores circulantes para enfermedades' (título). El documento WO 2013/190441 (THE CHINESE UNIVERSITY OF HONG KONG) analiza 'Análisis mutacional del ADN plasmático para la detección del cáncer' (título).

[0011] RESUMEN

[0012] La invención se describe en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. Las referencias a métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y métodos de diagnóstico practicados en el cuerpo humano o animal deben interpretarse como productos, por ejemplo, sustancias o composiciones, para su uso en tales métodos.

[0013] En algunas realizaciones, las células cancerosas son espacialmente distintas. En algunas realizaciones, la intervención terapéutica es más eficaz contra un cáncer que presenta una pluralidad de mutaciones somáticas que contra un cáncer que presenta cualquiera, pero no todas, las mutaciones somáticas. En algunas realizaciones, el método comprende además: (e) monitorizar los cambios en la heterogeneidad tumoral en el sujeto a lo largo del tiempo y determinar diferentes intervenciones terapéuticas a lo largo del tiempo basándose en los cambios. En algunas realizaciones, el método comprende además: (e) mostrar la intervención terapéutica. En algunas realizaciones, el método comprende además: (e) implementar la intervención terapéutica. En algunas realizaciones, el método comprende además: (e) generar una filogenia de la evolución del tumor sobre la base del perfil del tumor; en donde la determinación de la intervención terapéutica tiene en cuenta la filogenia.

[0015] En algunas realizaciones, la determinación se lleva a cabo con la ayuda de un algoritmo ejecutado por ordenador. En algunas realizaciones, las lecturas de secuencias generadas por secuenciación se someten a una reducción de ruido antes de su identificación y cuantificación. En algunas realizaciones, la reducción de ruido comprende el seguimiento molecular de secuencias generadas a partir de un único polinucleótido en la muestra.

[0017] En algunas realizaciones, la determinación de una intervención terapéutica tiene en cuenta las frecuencias relativas de las alteraciones genéticas relacionadas con el tumor. En algunas realizaciones, la intervención terapéutica comprende administrar, en combinación o en serie, una pluralidad de fármacos, en donde cada fármaco es relativamente más eficaz contra un cáncer que presenta una mutación somática diferente que se produce con una frecuencia relativa diferente. En algunas realizaciones, se administra en mayor cantidad un fármaco que es relativamente más eficaz contra un cáncer que presenta una mutación somática que se produce con una frecuencia relativa más alta. En algunas realizaciones, los fármacos se administran en dosis que se estratifican para reflejar las cantidades relativas de las variantes en el ADN. En algunas realizaciones, los cánceres que presentan por lo menos una de las variantes genéticas son resistentes a por lo menos uno de los fármacos. En algunas realizaciones, la determinación de una intervención terapéutica tiene en cuenta el tejido de origen del cáncer. En algunas realizaciones, la intervención terapéutica se determina sobre la base de una base de datos de intervenciones que han demostrado ser terapéuticas para cánceres que presentan heterogeneidad tumoral caracterizada por cada una de las mutaciones somáticas.

[0019] En algunas realizaciones, los polinucleótidos comprenden ADNcf de una muestra de sangre. En algunas realizaciones, los polinucleótidos comprenden polinucleótidos de células cancerosas espacialmente distintas. En algunas realizaciones, los polinucleótidos comprenden polinucleótidos de diferentes sitios tumorales metastásicos. En algunas realizaciones, los polinucleótidos comprenden polinucleótidos de un tumor sólido o un tumor difuso. En algunas realizaciones, los polinucleótidos están comprendidos en una muestra de sangre.

[0021] En algunas realizaciones, la identificación comprende generar una pluralidad de lecturas de secuencia para polinucleótidos parentales de la muestra, y colapsar las lecturas de secuencia para generar llamadas de consenso para bases en cada polinucleótido parental. En algunas realizaciones, la cuantificación comprende determinar la frecuencia con la que se detectan las mutaciones somáticas en la población de polinucleótidos de la muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra biológica comprende moléculas biológicas de células no enfermas. En algunas realizaciones, la muestra biológica comprende moléculas biológicas de una pluralidad de tejidos diferentes. En algunas realizaciones, las biomoléculas están comprendidas en una muestra biológica. En algunas realizaciones, las biomoléculas están comprendidas en una pluralidad de muestras biológicas. En algunas realizaciones, la pluralidad de muestras biológicas son tumores de una pluralidad de metástasis.

[0023] En algunas realizaciones, la secuenciación comprende secuenciar todo o parte de un subconjunto de genes del genoma del sujeto. En algunas realizaciones, las mutaciones somáticas se seleccionan entre variaciones de un solo nucleótido (SNV), inserciones, deleciones, inversiones, transversiones, translocaciones, variaciones del número de copias (CNV) (por ejemplo, aneuploidía, aneuploidía parcial, poliploidía), inestabilidad cromosómica, alteraciones de la estructura cromosómica, fusiones génicas, fusiones cromosómicas, truncamientos génicos, amplificación génica, duplicaciones génicas, lesiones cromosómicas, lesiones de ADN, cambios anormales en las modificaciones químicas del ácido nucleico, cambios anormales en los patrones epigenéticos y cambios anormales en la metilación del ácido nucleico. En algunas realizaciones, los loci genéticos se seleccionan a partir de nucleótidos individuales, genes y cromosomas.

[0025] En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas, mielomas y cánceres del sistema nervioso central (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de cerebro, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer ginecológico, liposarcoma y mieloma múltiple). En algunas realizaciones, las células cancerosas del tumor se derivan de una célula parental común de la enfermedad. En algunas realizaciones, las células cancerosas del tumor se derivan de diferentes células cancerosas parentales del mismo tipo de cáncer o de tipos diferentes. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar una medida de las mutaciones somáticas para una o más referencias de control para determinar la cantidad relativa.

[0027] En algunas realizaciones, los polinucleótidos provienen tanto de polinucleótidos cancerosos circulantes como de biopsias de tumores sólidos. En algunas realizaciones, se desarrollan perfiles por separado para los polinucleótidos provenientes de polinucleótidos cancerosos circulantes y de biopsias de tumores sólidos.

[0029] En algunas realizaciones, el perfil tumoral indica la frecuencia relativa de una pluralidad de más mutaciones somáticas. En algunas realizaciones, el método comprende además monitorizar los cambios en las frecuencias relativas en el sujeto a lo largo del tiempo y determinar diferentes intervenciones terapéuticas a lo largo del tiempo basándose en los cambios. En algunas realizaciones, la intervención terapéutica es más eficaz contra un cáncer que presenta cada una de las mutaciones somáticas de lo qué los es contra un cáncer que presenta cualquiera, pero no todas, las mutaciones somáticas. En algunas realizaciones, la intervención terapéutica comprende la administración, en combinación o en serie, de una pluralidad de fármacos, en donde cada fármaco es relativamente más eficaz contra un cáncer que presenta una mutación somática diferente que se produce con una frecuencia relativa diferente. En algunas realizaciones, se administra en mayor cantidad un fármaco que es relativamente más eficaz contra un cáncer que presenta una mutación somática que se produce con una frecuencia relativa más alta. En algunas realizaciones, los fármacos se administran en dosis que se estratifican para que reflejen las cantidades relativas de las variantes en el ADN. En algunas realizaciones, los cánceres que presentan por lo menos una de las variantes genéticas son resistentes a por lo menos uno de los fármacos. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas, mielomas y cánceres del sistema nervioso central (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de cerebro, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer ginecológico, liposarcoma y mieloma múltiple).

[0031] En algunas realizaciones, las células enfermas son células enfermas espacialmente distintas. En algunas realizaciones, la intervención terapéutica se determina sobre la base de una base de datos de intervenciones que han demostrado ser terapéuticas para cánceres que presentan heterogeneidad tumoral caracterizada por cada una de las mutaciones somáticas.

[0033] En algunas realizaciones, la detección de la heterogeneidad tumoral en un sujeto, comprende: a) cuantificar los polinucleótidos que portan una variante de secuencia en cada uno de una pluralidad de loci genéticos en el ADN libre de células de una muestra del sujeto, en donde la muestra comprende polinucleótidos de células somáticas y de células enfermas; b) determinar para cada locus una medida de la variación del número de copias (CNV) para los polinucleótidos que portan la variante de secuencia; c) determinar para cada locus una medida ponderada de la cantidad de polinucleótidos que portan una variante de secuencia en el locus en función de la CNV en el locus; y d) comparar las medidas ponderadas en cada uno de los múltiples loci, en donde diferentes medidas ponderadas indican la heterogeneidad celular de la enfermedad.

[0035] En algunas realizaciones, el método comprende: a) determinar una medida de desviación de un valor de tendencia central (por ejemplo, desviación estándar, varianza) del número de copias en polinucleótidos en una muestra a lo largo de una región de por lo menos 1 kb, por lo menos 10 kb, por lo menos 100 kb, por lo menos 1 mb, por lo menos 10 mb o por lo menos 100 mb de un genoma; b) inferir una medida de la carga de ADN de las células que experimentan división celular en la muestra basándose en la medida de desviación. En algunas realizaciones, el valor de tendencia central es la media, la mediana o la moda. En algunas realizaciones, la determinación comprende dividir la región en una pluralidad de intervalos no superpuestos, determinar una medida del número de copias en cada intervalo y determinar la medida de la desviación basándose en las medidas del número de copias en cada intervalo. En algunas realizaciones, el intervalo no tiene más de 1 base, 10 bases, 100 bases, 1 kb de bases o 10 kb.

[0037] En algunas realizaciones, el método comprende inferir una medida de la carga de ADN de las células que experimentan división celular en una muestra, que comprende medir la variación del número de copias inducida por la proximidad de uno o más loci genómicos a los orígenes de replicación de las células, en donde el aumento de la CNV indica células que experimentan división celular. De acuerdo con la invención, la carga se mide en ADN libre de células. En algunas realizaciones, la medida de la carga se refiere a la fracción de células tumorales o equivalentes genómicos de ADN de células tumorales en la muestra. En algunas realizaciones, la CNV debida a la proximidad a los orígenes de replicación se infiere a partir de un conjunto de muestras de control o líneas celulares. En algunas realizaciones, para aproximar las variaciones debidas a los orígenes de replicación se usa un modelo de Markov oculto, un modelo de regresión, un modelo basado en el análisis de componentes principales o un modelo modificado por genotipo. En algunas realizaciones, la medida de la carga es la presencia o ausencia de células que experimentan división celular. En algunas realizaciones, la proximidad es de 1 kb de un origen de replicación.

[0039] En algunas realizaciones, el método comprende aumentar la sensibilidad y/o la especificidad de la determinación de las variaciones del número de copias relacionadas con los genes mejorando el efecto de las variaciones debidas a la proximidad a los orígenes de replicación. En algunas realizaciones, el método comprende medir la CNV en un locus, determinar la cantidad de CNV debida a la proximidad del locus a un origen de replicación y corregir la CNV medida para que refleje la CNV genómica, por ejemplo, restando la cantidad de CNV atribuible a la división celular. De acuerdo con la invención, los datos genómicos se obtienen a partir de ADN libre de células. En algunas realizaciones, la medida de la carga se refiere a la fracción de células tumorales o equivalentes genómicos de ADN en una muestra. En algunas realizaciones, las variaciones debidas a los orígenes de replicación se infieren a partir de un conjunto de muestras de control o líneas celulares. En algunas realizaciones, para aproximar las variaciones debidas a los orígenes de replicación se usa un modelo de Markov oculto, un modelo de regresión, un modelo basado en el análisis de componentes principales o un modelo modificado por genotipo.

[0041] En algunas realizaciones, el método comprende: a) determinar una medida de referencia de las copias de moléculas de ADN en uno o más loci a partir de una o más muestras de control, en donde uno o más de los loci incluyen un origen de replicación, cada uno de los cuales contiene ADN de células que experimentan un nivel predeterminado de división celular; b) determinar una medida de prueba de moléculas de ADN en una muestra de prueba; en donde la medida en la muestra de prueba es de uno o más loci divididos en una o más particiones y en donde uno o más de los loci incluyen un origen de replicación; c) comparar la medida de prueba y la medida de referencia, en donde una medida de prueba por encima de una medida de referencia indica ADN en la muestra de prueba procedente de células que se dividen a una velocidad más rápida que las células que proporcionan ADN a la muestra de control. En algunas realizaciones, la medida se selecciona entre el recuento de moléculas, una medida de la tendencia central del recuento de moléculas en todas las particiones o una medida de la variación del recuento de moléculas en todas las particiones.

[0043] En algunas realizaciones, el método comprende compilar una base de datos como se define en las reivindicaciones, en donde la base de datos es útil para inferir la eficacia de las intervenciones terapéuticas en sujetos con un perfil genómico tumoral. En algunas realizaciones, la pluralidad es de por lo menos 50, por lo menos 500 o por lo menos 5000. En algunas realizaciones, los datos de las pruebas genómicas tumorales se recopilan mediante biopsia en serie, ADN libre de células, ARN libre de células o células tumorales circulantes. En algunas realizaciones, para clasificar la eficacia del tratamiento se usan las frecuencias relativas de las variantes genéticas detectadas. En algunas realizaciones, se usa información adicional para ayudar a clasificar la eficacia del tratamiento que incluye, pero no se limita a, el peso, los efectos adversos del tratamiento, las pruebas histológicas, pruebas de sangre, la información radiográfica, los tratamientos previos y el tipo de cáncer. En algunas realizaciones, se recopila y clasifica cuantitativamente la respuesta al tratamiento por paciente mediante pruebas adicionales. En algunas realizaciones, las pruebas adicionales son pruebas basadas en sangre u orina.

[0045] En algunas realizaciones, las intervenciones terapéuticas identificadas se estratifican por eficacia. En algunas realizaciones, se informa de los límites cuantitativos de la eficacia prevista de las intervenciones terapéuticas o la falta de la misma. En algunas realizaciones, las intervenciones terapéuticas usan información sobre la evolución genómica prevista del tumor o los mecanismos de resistencia adquiridos en pacientes similares en respuesta al tratamiento.

[0047] En algunas realizaciones, el método comprende clasificar la eficacia del tratamiento usando un algoritmo de clasificación, por ejemplo, procesos de regresión lineal (por ejemplo, regresión lineal múltiple (MLR), regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS) y regresión por componentes principales (PCR)), árboles de decisión binarios (por ejemplo, procesos de partición recursiva como CART - árboles de clasificación y regresión), redes neuronales artificiales como redes de retropropagación, análisis discriminantes (por ejemplo, clasificador bayesiano o análisis de Fischer), clasificadores logísticos y clasificadores de vectores de soporte (por ejemplo, máquinas de vectores de soporte).

[0049] En algunas realizaciones, el método comprende informar de los resultados de una o más pruebas genéticas que comprenden: capturar información genética, incluyendo variantes genéticas y medidas cuantitativas de las mismas, en uno o más puntos de prueba usando un analizador genético; normalizar las medidas cuantitativas para representarlas con los uno o más puntos de prueba y generar un factor de escala; aplicar el factor de escala para representar un mapa de respuesta tumoral; y generar un resumen de variantes genéticas. En algunas realizaciones, el método comprende analizar frecuencias de alelos mutantes no CNV (variación del número de copias). En algunas realizaciones, el método comprende transformar un valor absoluto en una métrica relativa para representar el mapa de respuesta tumoral. En algunas realizaciones, el método comprende multiplicar una frecuencia de alelos mutantes por un valor predeterminado y tomar un logaritmo de la misma. En algunas realizaciones, el método comprende: multiplicar el factor de escala por un valor transformado para cada gen a fin de determinar un indicador de cantidad que se representará en el mapa de respuesta tumoral; y asignar un indicador visual único para cada alteración en un panel visual. En algunas realizaciones, el método comprende centrar en el eje Y o centrar verticalmente el indicador de cantidad en un panel colocado contiguamente que indica continuidad. En algunas realizaciones, la asignación comprende además proporcionar un color único para cada alteración.

[0051] En algunas realizaciones, el método comprende analizar la información genética de otro punto de prueba o momento de prueba. En algunas realizaciones, en las que un nuevo resultado de prueba no difiere de un resultado de prueba anterior, el método comprende representar el panel visual anterior. En algunas realizaciones, en las que si las alteraciones siguen siendo las mismas, pero cambian las cantidades, el método comprende: mantener el orden y el indicador visual único para cada alteración; y determinar un nuevo indicador de cantidad y generar un nuevo panel visual para todos los puntos de prueba. En algunas realizaciones, el método comprende determinar una nueva alteración en la información genética y añadir la alteración a la parte superior de las alteraciones existentes. En algunas realizaciones, el método comprende determinar una nueva alteración en la información genética y determinar nuevos valores transformados y factor de escala y asignar un indicador visual único para cada nueva alteración. En algunas realizaciones, el método comprende determinar una nueva alteración en la información genética y regenerar el mapa de respuesta tumoral incluyendo las alteraciones de un punto de prueba anterior que todavía se detectan en el punto de prueba actual y la nueva alteración. En algunas realizaciones, el método comprende determinar si ya no se encuentra una alteración anterior y, si es así, comprende usar una altura de cero al representar la cantidad de la alteración de la alteración anterior para puntos de prueba posteriores. En algunas realizaciones, el método comprende determinar si ya no se encuentra una alteración previa y, si es así, reservar el indicador visual único asociado con la alteración previa para su uso futuro.

[0053] En algunas realizaciones, el método comprende analizar las frecuencias de alelos mutantes de CNV y las frecuencias de alelos mutantes de metilación. En algunas realizaciones, el método comprende agrupar las frecuencias máximas de alelos mutantes para representarlas primero en el mapa de respuesta tumoral. En algunas realizaciones, el método comprende representar las alteraciones del gen en orden decreciente de frecuencia de alelos mutantes de las alteraciones. En algunas realizaciones, el método comprende representar las alteraciones del gen en un orden decreciente. En algunas realizaciones, el método comprende seleccionar un siguiente gen con la siguiente frecuencia de alelos mutantes más alta.

[0055] En algunas realizaciones, para cada alteración notificada, el método comprende generar un indicador de tendencia para la alteración en los diferentes puntos de prueba. En algunas realizaciones, el método comprende generar un resumen de las alteraciones. En algunas realizaciones, el método comprende generar un resumen de las opciones de tratamiento. En algunas realizaciones, el método comprende generar un resumen de la frecuencia de alelos mutantes, la amplificación libre de células, la indicación de aprobación clínica y el ensayo clínico. En algunas realizaciones, el método comprende generar un panel sobre la base de una vía biológica. En algunas realizaciones, el método comprende generar un panel sobre la base de un nivel de evidencia. En algunas realizaciones, la información genética incluye una o más variaciones de un solo nucleótido, variaciones del número de copias, inserciones y deleciones, y reordenamientos de genes. En algunas realizaciones, el método comprende generar un informe de relevancia clínica sobre las alteraciones detectadas. En algunas realizaciones, el método comprende generar un resumen de los resultados de la terapia.

[0057] En algunas realizaciones, el método comprende generar un informe genético que comprende: generar datos de variación no relacionada con el número de copias (CNV) usando un analizador genético; determinar un factor de escala para cada frecuencia de alelo mutante no CNV; para una primera prueba, generar un panel visual de cada alteración no CNV usando el factor de escala; y para cada prueba posterior, generar cambios en la alteración no CNV para el panel visual usando el factor de escala.

[0059] En algunas realizaciones, el método comprende transformar un valor absoluto en una métrica relativa para su representación. En algunas realizaciones, el método comprende multiplicar una frecuencia de alelo mutante por un valor predeterminado y tomar un logaritmo del valor predeterminado. En algunas realizaciones, el método comprende determinar un factor de escala usando un valor máximo observado. En algunas realizaciones, para cada alteración no CNV, el método comprende multiplicar un factor de escala por un valor transformado para cada variante génica como indicador de cantidad para visualizar la variante génica.

[0061] En algunas realizaciones, el método comprende asignar un indicador visual único para cada alteración. En algunas realizaciones, para la prueba posterior, el método comprende usar el panel visual si el resultado de la prueba no ha cambiado. En algunas realizaciones, si las alteraciones siguen siendo iguales en la prueba posterior, el método comprende mantener el orden y el indicador visual único para cada alteración; y volver a calcular un indicador de cantidad para visualizar esa variante y volver a representar los valores actualizados en el panel o paneles existentes y en el nuevo panel para la última prueba. En algunas realizaciones, si se encuentra una nueva alteración en la prueba posterior, el método comprende añadir las alteraciones a la parte superior de todas las alteraciones existentes; calcular los valores transformados y el factor de escala; y asignar un indicador visual único para cada nueva alteración.

[0063] En algunas realizaciones, el método comprende: volver a representar las alteraciones en el punto de prueba anterior y la nueva alteración; y centrar verticalmente una imagen de las alteraciones en un panel colocado contiguamente que indica continuidad. En algunas realizaciones, si en una prueba posterior no se encuentra una alteración anterior, el método comprende usar una altura de cero como la cantidad de la alteración para una representación posterior. En algunas realizaciones, el método comprende representar información del sujeto o de la intervención asociada con los cambios de alteración. En algunas realizaciones, el método comprende identificar una alteración con la frecuencia máxima de alelos mutantes.

[0065] En algunas realizaciones, el método comprende: informar de las alteraciones de ese gen en orden decreciente de frecuencia de alelos mutantes de alteraciones no de CNV; e informar de las alteraciones de CNV de ese gen en orden decreciente de valor de CNV. En algunas realizaciones, el método comprende seleccionar el siguiente gen con la siguiente frecuencia de alelo mutante no CNV más alta e informar de las alteraciones de ese gen en orden decreciente de frecuencia de alelo mutante de las alteraciones no de CNV; e informar de las alteraciones de CNV de ese gen en orden decreciente de valor de CNV.

[0067] En algunas realizaciones, el método comprende representar un indicador de tendencia para una alteración en diferentes fechas de prueba. En algunas realizaciones, el método comprende agrupar las frecuencias máximas de alelos mutantes y generar anotaciones que incluyen vías biológicas o nivel de evidencia. En algunas realizaciones, el método comprende generar un panel basado en un nivel de evidencia. En algunas realizaciones, el método comprende generar un panel basado en una vía biológica. En algunas realizaciones, la información genética incluye una o más de variaciones de un solo nucleótido, variaciones del número de copias, inserciones y deleciones, y reordenamientos genéticos.

[0069] En algunas realizaciones, el método comprende: a) proporcionar una pluralidad de muestras de ácido nucleico de un sujeto, las muestras recogidas en puntos temporales en serie; b) secuenciar el ADN libre de células de las muestras para generar secuencias; c) determinar una medida cuantitativa de cada una de una pluralidad de variantes genéticas entre los polinucleótidos en cada muestra; d) representar gráficamente mediante un ordenador las cantidades relativas de variantes genéticas en cada punto temporal en serie para aquellas mutaciones somáticas presentes en una cantidad distinta de cero por lo menos en uno de los puntos temporales en serie. En algunas realizaciones, la medida cuantitativa es la frecuencia de la variante genética entre todas las secuencias que se mapean al mismo locus genético. En algunas realizaciones, las cantidades relativas se representan como un gráfico de áreas apiladas. En algunas realizaciones, las cantidades relativas se apilan, en el punto temporal más temprano, de mayor a menor desde la parte inferior a la parte superior del gráfico, y en donde una variante genética que aparece por primera vez en una cantidad distinta de cero en un punto temporal posterior se apila en la parte superior del gráfico. En algunas realizaciones, las áreas se representan mediante diferentes colores. En algunas realizaciones, la representación gráfica indica además, para cada punto temporal, la medida cuantitativa de la variante genética predominante. En algunas realizaciones, la representación gráfica incluye además una clave que identifica las variantes genéticas representadas en el gráfico. En algunas realizaciones, la representación gráfica comprende normaliza y escalar las medidas cuantitativas.

[0071] En algunas realizaciones, los loci se encuentran en oncogenes. En algunas realizaciones, la pluralidad de variantes genéticas se mapea a un gen diferente en el genoma. En algunas realizaciones, la pluralidad de variantes genéticas se mapea al mismo gen en el genoma. En algunas realizaciones, se secuencian por lo menos 10 oncogenes diferentes.

[0073] En algunas realizaciones, la determinación comprende recibir las secuencias en la memoria de un ordenador y usar un procesador informático para ejecutar un software para determinar la medición cuantitativa. En algunas realizaciones, representar gráficamente comprende usar un procesador informático para ejecutar un software que transforme las medidas cuantitativas en un formato gráfico y representar el formato gráfico en una interfaz gráfica de usuario electrónica, por ejemplo, una pantalla de visualización.

[0075] En algunas realizaciones, el método comprende generar un informe de prueba del paciente en papel o electrónico a partir de datos generados por un analizador genético que comprende: a) resumir datos de dos o más puntos temporales de prueba, mediante lo cual se informa de una unión de todos los resultados de prueba distintos de cero en cada punto de prueba posterior a la primera prueba; y b) representar los resultados de las pruebas en el informe de prueba del paciente en papel o electrónico. En algunas realizaciones, el resumen y la representación se realizan en un ordenador ejecutando código con un procesador informático para (i) identificar todos los resultados de pruebas distintos de cero, (ii) generar el informe de pruebas y (iii) mostrar el informe de pruebas en una interfaz gráfica de usuario.

[0077] En algunas realizaciones, el método comprende representar gráficamente la evolución de las variantes genéticas de un tumor en un sujeto a partir de datos generados por un analizador genético que comprende: a) generar mediante ordenador una representación apilada de las variantes genéticas detectadas en cada uno de una pluralidad de puntos temporales en el sujeto, en donde una altura o anchura de cada capa de la pila que corresponde a una variante genética representa una contribución cuantitativa de la variante genética a la cantidad total de variantes genéticas en cada punto temporal; y b) mostrar la representación apilada en un monitor de ordenador o en un informe en papel. En algunas realizaciones, el método comprende además usar una combinación de una magnitud de las variantes genéticas detectadas en una prueba basada en fluidos corporales para inferir una carga de la enfermedad. En algunas realizaciones, el método comprende además usar fracciones alélicas de mutaciones detectadas, desequilibrios alélicos y cobertura específica de genes para inferir la carga de la enfermedad.

[0079] En algunas realizaciones, la altura total de la pila es representativa de la carga total de la enfermedad o de una puntuación de la carga de la enfermedad en el sujeto. En algunas realizaciones, para representar cada variante genética se usa un color distinto. En algunas realizaciones, solo se traza un subconjunto de las variantes genéticas detectadas. En algunas realizaciones, el subconjunto se elige sobre la base de la probabilidad de que sea una alteración impulsora o de su asociación con una respuesta aumentada o reducida al tratamiento.

[0081] En algunas realizaciones, el método comprende producir un informe de prueba para una prueba genómica. En algunas realizaciones, para representar las alturas o anchuras de cada variante genética representada se usa una escala no lineal. En algunas realizaciones, en el informe se representa un gráfico de los puntos de prueba anteriores. En algunas realizaciones, el método comprende estimar una progresión o remisión de la enfermedad sobre la base de la tasa de cambio y/o la precisión cuantitativa de cada resultado de la prueba. En algunas realizaciones, el método comprende mostrar una intervención terapéutica entre puntos de prueba intermedios. En algunas realizaciones, mostrar comprende: a) recibir datos que representan las variantes genéticas tumorales detectadas en la memoria del ordenador; b) ejecutar código con un procesador informático para representar gráficamente la contribución cuantitativa de cada variante genética en un punto temporal como una línea o área proporcional a la contribución relativa; y c) mostrar la representación gráfica en una interfaz gráfica de usuario.

[0083] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0085] LaFigura 1muestra un diagrama de flujo de un método ejemplar de determinación y uso de una intervención terapéutica.

[0086] LaFigura 2muestra un diagrama de flujo de un método ejemplar para determinar la frecuencia de variantes en una muestra corregida sobre la base de la CNV en un locus.

[0087] LaFigura 3muestra un diagrama de flujo de un método ejemplar para proporcionar ciclos de terapia pulsada que pueden retrasar la resistencia a los fármacos.

[0088] LaFigura 4muestra un diagrama de flujo de un método ejemplar para detectar la carga tumoral usando CNV en los orígenes de replicación para detectar ADN de células en división.

[0089] LaFigura 5muestra un sistema informático ejemplar.

[0090] LaFigura 6muestra un escaneo ejemplar de CNV en una región de un genoma a partir de muestras que contienen células en estado de reposo y en estado de división celular. No se observa CNV genómico en los loci a y b, pero el locus c muestra duplicación génica. En las células en estado de reposo, el número de copias es relativamente igual en todos los intervalos de la región, excepto en aquellos intervalos que se superponen al locus de duplicación génica. En la muestra que contiene ADN de células tumorales, que están experimentado división celular, el número de copias parece aumentar inmediatamente después de los orígenes de replicación, lo que proporciona una variación en la CNV en toda la región. La desviación es particularmente importante en un locus que muestra CNV en un origen de replicación (c).

[0091] LaFigura 7muestra un curso ejemplar de monitorización y tratamiento de la enfermedad en un sujeto.

[0092] LaFigura 8muestra un panel ejemplar de 70 genes que presentan variación genética en el cáncer.

[0093] LaFigura 9Amuestra un sistema ejemplar para comunicar los resultados de las pruebas de cáncer.

[0094] LaFigura 9Bmuestra un proceso ejemplar para reducir las tasas de error y el sesgo en las lecturas de secuencias de ADN y generar informes genéticos para los usuarios.

[0095] LasFiguras 10A-10Cmuestran procesos ejemplares para NOTIFICAR los resultados de las pruebas genéticas a los usuarios.

[0096] LasFiguras 10D-10I-2muestran páginas de un informe de pruebas genéticas ejemplar.

[0097] LasFiguras 10J-10Pmuestran varios gráficos de corrientes (streamgraph) modificados ejemplares.

[0098] LasFiguras 11A-11Bmuestran procesos ejemplares para detectar mutaciones y notificar los resultados de las pruebas a los usuarios.

[0100] DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0102] Los métodos de la presente divulgación pueden detectar mosaicismo biomolecular (por ejemplo, mosaicismo genético) en una muestra biológica, como una población genómica heterogénea de células o ácido desoxirribonucleico (ADN). El mosaicismo genético puede existir a nivel orgánico. Por ejemplo, las variantes genéticas que surgen en las primeras etapas del desarrollo pueden dar lugar a diferentes células somáticas que tengan diferentes genomas. Un individuo puede ser una quimera, por ejemplo, producida por la fusión de dos cigotos. El trasplante de órganos de un donante alogénico puede dar lugar a mosaicos genéticos, que también pueden detectarse examinando los polinucleótidos liberados en la sangre desde el órgano trasplantado. La heterogeneidad celular de la enfermedad, en la que las células enfermas tienen diferentes variantes genéticas, es otra forma de mosaicismo genético. Los métodos proporcionados en la presente pueden detectar el mosaicismo y, en caso de enfermedad, proporcionar una intervención terapéutica. En ciertas realizaciones, esta divulgación proporciona métodos para realizar perfiles de mosaicismo biomolecular en todo el organismo mediante el uso de polinucleótidos circulantes, que pueden derivarse u originarse de otro modo de células en diversas localizaciones del cuerpo de un sujeto.

[0104] Las células enfermas, como los tumores, pueden evolucionar a lo largo del tiempo, lo que da como resultado diferentes subpoblaciones clonales que tienen nuevas características genéticas y fenotípicas. Esto puede ser el resultado de mutaciones naturales a medida que se dividen las células, o puede estar impulsado por tratamientos que se dirigen a ciertas subpoblaciones clonales, permitiendo que los clones más resistentes al tratamiento proliferen por selección negativa. La existencia de subpoblaciones de células enfermas que portan diferentes características genotípicas o fenotípicas se denomina en la presente heterogeneidad celular de la enfermedad o, en el caso del cáncer, heterogeneidad tumoral.

[0106] Actualmente, los cánceres se tratan sobre la base de las formas mutantes que se encuentran en una biopsia de cáncer. Por ejemplo, el descubrimiento de Her2+ incluso en pequeñas cantidades de células de cáncer de mama puede ser indicativo de cáncer de mama, lo que puede seguirse con un tratamiento que use una terapia anti-Her2+. Como otro ejemplo, un cáncer colorrectal en el que se encuentra una mutación KRAS en pequeñas cantidades puede tratarse con una terapia a la que responde KRAS.

[0107] Las herramientas para el análisis detallado de las células enfermas (por ejemplo, los tumores) permiten la detección de la heterogeneidad celular de la enfermedad. Además, el análisis de los polinucleótidos procedentes de células enfermas localizadas en todo el cuerpo permite obtener un perfil de todo el cuerpo de la heterogeneidad celular de la enfermedad. El uso de ADN libre de células, o ADN circulante, es especialmente eficaz porque los polinucleótidos de la sangre no proceden de células localizadas físicamente. Más bien, incluyen células de sitios metastásicos de todo el cuerpo. Por ejemplo, el análisis puede mostrar que una población de células de cáncer de mama incluye un 90% que son Her2+ y un 10% que son Her2-. Esto puede determinarse, por ejemplo, cuantificando el ADN para cada forma en una muestra, por ejemplo, el ADN libre de células (ADNcf), detectando de este modo la heterogeneidad tumoral.

[0108] Esta información puede ser usada por un profesional de la salud, por ejemplo, un médico, para desarrollar intervenciones terapéuticas. Por ejemplo, un sujeto que tiene un tumor heterogéneo puede ser tratado como si tuviera dos tumores, y una intervención terapéutica puede tratar cada uno de los tumores. La intervención terapéutica podría incluir, por ejemplo, una terapia combinada que incluya un primer fármaco eficaz contra el primer tipo de tumor y un segundo fármaco eficaz contra el segundo tipo de tumor. Los fármacos pueden administrarse en cantidades que reflejen las cantidades relativas de las formas mutantes detectadas. Por ejemplo, un fárma

[0109] mutante que se encuentra en cantidades relativas más elevadas puede administrarse a una dosis mayor que un fárma

[0111] La monitorización de los cambios en el perfil de heterogeneidad celular de la enfermedad a lo largo del tiempo permite calibrar la intervención terapéutica para un tumor en evolución. Por ejemplo, el análisis puede mostrar cantidades crecientes de polinucleótidos que portan mutantes resistentes a los fármacos. En este caso, la intervención terapéutica puede modificarse para disminuir la cantidad de fármaco eficaz para tratar un tumor que no porta el mutante de resistencia y aumentar la administración de un fármaco que sí trata un tumor que porta el marcador de resistencia.

[0112] Las intervenciones terapéuticas pueden ser determinadas por un profesional de la salud o por un algoritmo informático, o por una combinación de ambos. Una base de datos, como se define en las reivindicaciones, puede contener los resultados de intervenciones terapéuticas contra enfermedades que presentan varios perfiles de heterogeneidad celular de la enfermedad. La base de datos puede consultarse para determinar una intervención terapéutica para una enfermedad con un perfil particular.

[0113] La presente divulgación proporciona, entre otras cosas, métodos para determinar una intervención terapéutica para un sujeto que tenga cáncer que presenta heterogeneidad tumoral. El método implica analizar macromoléculas biológicas (por ejemplo, secuenciar polinucleótidos) de células enfermas (por ejemplo, células enfermas espacialmente distintas) de un sujeto que padece la enfermedad. Se desarrolla un perfil de heterogeneidad celular de la enfermedad que indica la existencia de variantes genéticas específicas para las células de la enfermedad y la cantidad de estas variantes unas con respecto a las otras. A su vez, esta información se usa para determinar una intervención terapéutica que tenga en cuenta el perfil.

[0114] Células enfermas

[0115] Un sujeto de los métodos de esta divulgación es cualquier organismo multicelular. Más específicamente, el sujeto puede ser un humano. Los animales incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales deportivos y mascotas. Un sujeto puede ser un individuo sano, un individuo que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad o una predisposición a la enfermedad, o un individuo que necesita terapia o se sospecha que necesita terapia. Un sujeto puede ser un paciente, por ejemplo, un sujeto bajo el cuidado de un proveedor de atención médica profesional.

[0116] El sujeto puede tener una afección patológica (enfermedad). En la presente las células que presentan la patología de enfermedad se denominan 'células enfermas'.

[0117] En particular, la enfermedad es un cáncer. El cáncer es una afección caracterizada por células anormales que se dividen sin control. Los cánceres incluyen, sin limitación, carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas, mielomas y cánceres del sistema nervioso central. Ejemplos más específicos de cánceres son el cáncer de mama, el cáncer de próstata, el cáncer colorrectal, el cáncer de cerebro, el cáncer de esófago, el cáncer de cabeza y cuello, el cáncer de vejiga, el cáncer ginecológico, el liposarcoma y el mieloma múltiple.

[0118] Otros tipos de cáncer incluyen, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), carcinoma adrenocortical, sarcoma de Kaposi, cáncer anal, carcinoma de células basales, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, cáncer cerebral, craneofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, tumor del parénquima pineal, cáncer de mama, tumor bronquial, linfoma de Burkitt, linfoma no Hodgkin, tumor carcinoide, cáncer de cuello uterino, cordoma, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide crónica (LMC), cáncer de colon, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de células T, carcinoma ductal in situ, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, cáncer de ojo, melanoma intraocular, retinoblastoma, histiocitoma fibroso, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, glioma, leucemia de células peludas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, cáncer renal, cáncer laríngeo, cáncer de labios, cáncer de cavidad oral, cáncer de pulmón, carcinoma de células no pequeñas, carcinoma de células pequeñas, melanoma, cáncer de boca, síndromes mielodisplásicos, mieloma múltiple, meduloblastoma, cáncer de la cavidad nasal, cáncer de senos paranasales, neuroblastoma, cáncer nasofaríngeo, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, papilomatosis, paraganglioma, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, tumor hipofisario, neoplasia de células plasmáticas, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, síndrome de Sezary, cáncer de piel, no melanoma, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer de testículo, cáncer de garganta, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenström y/o tumor de Wilms.

[0120] Un tumor es una acumulación de células cancerosas (células enfermas con cáncer). Esto incluye, por ejemplo, una acumulación de células en una sola masa celular (por ejemplo, un tumor sólido), una colección de células de diferentes sitios tumorales metastásicos (tumores metastásicos) y tumores difusos (por ejemplo, células tumorales circulantes). Un tumor puede incluir células de un solo cáncer (por ejemplo, cáncer colorrectal) o de múltiples cánceres (por ejemplo, cáncer colorrectal y cáncer de páncreas). Un tumor puede incluir células que se originan en una sola célula somática original o de diferentes células somáticas.

[0122] En ciertas realizaciones, las células enfermas del sujeto son espacialmente distintas. Las células enfermas son espacialmente distintas si se encuentran separadas por lo menos 1 cm, por lo menos 2 cm, por lo menos 5 cm o por lo menos 10 cm en el cuerpo, por ejemplo, en diferentes tejidos u órganos, o en el mismo tejido u órgano. En el caso del cáncer, los ejemplos de células cancerosas espacialmente distintas incluyen las células cancerosas de cánceres difusos (como las leucemias), las células cancerosas en diferentes sitios metastásicos y las células cancerosas de la misma masa de células tumorales que están separadas por al menos 1 cm.

[0124] La carga celular de la enfermedad (por ejemplo, 'carga tumoral') es una medida cuantitativa de la cantidad de células enfermas en un sujeto. Una medida de la carga celular de la enfermedad es la fracción de las macromoléculas biológicas totales en una muestra que son macromoléculas biológicas de la enfermedad, por ejemplo, la cantidad relativa de polinucleótidos tumorales en una muestra de polinucleótidos libres de células. Por ejemplo, si el ADNcf de un primer sujeto tiene un 10% de polinucleótidos cancerosos, puede decirse que el sujeto tiene una carga tumoral libre de células del 10%. Si el ADNcf de un segundo sujeto tiene un 5% de polinucleótidos cancerosos, puede decirse que el segundo sujeto tiene la mitad de la carga tumoral libre de células del primer sujeto. Estas medidas son mucho más relevantes a nivel intraindividual que a nivel interindividual, ya que la carga tumoral libre de células en un individuo puede ser mucho mayor o menor que en otro, a pesar de los diferentes niveles de carga de la enfermedad. Sin embargo, estas medidas pueden usarse de manera bastante eficaz para monitorizar la carga de la enfermedad en un individuo, por ejemplo, un aumento de la carga tumoral de ADN libre del 5% al 15% puede indicar una progresión significativa de la enfermedad, mientras que una disminución del 10% al 1% puede indicar una respuesta parcial al tratamiento.

[0126] Los polinucleótidos que se van a secuenciar pueden proceder de sitios espacialmente distintos. Esto incluye polinucleótidos procedentes de biopsias de diferentes ubicaciones en una misma masa tumoral. También incluye polinucleótidos procedentes de células en diferentes sitios tumorales metastásicos. Las células liberan polinucleótidos en la sangre, donde son detectables como polinucleótidos libres de células (por ejemplo, ADN tumoral circulante). Los polinucleótidos libres de células también pueden encontrarse en otros fluidos corporales, como la orina. Por lo tanto, el ADNcf proporciona un perfil más preciso de la heterogeneidad tumoral en toda la población de células enfermas que el ADN procedente de una única localización tumoral. El ADN extraído de células de toda la población de células enfermas de un organismo se denomina 'ADN de carga de enfermedad' o, en el caso del cáncer, 'ADN de carga tumoral'.

[0128] Las células enfermas, como los tumores, pueden compartir perfiles biomoleculares iguales o similares. Por ejemplo, los tumores pueden compartir una, dos, tres o más variantes genéticas. Tales variantes pueden compartir la misma estratificación, por ejemplo, la frecuencia más alta, la segunda frecuencia más alta, etc. Los perfiles también pueden compartir cargas de células enfermas similares, por ejemplo, cargas de ADNcf, por ejemplo, dentro del 15%, dentro del 10%, dentro del 5% o dentro del 2%.

[0130] Analitos

[0132] Como se usa en la presente en la presente, una macromolécula es una molécula formada a partir de subunidades monoméricas. Las subunidades monoméricas que forman macromoléculas biológicas incluyen, por ejemplo, nucleótidos, aminoácidos, monosacáridos y ácidos grasos. Las macromoléculas biológicas incluyen, por ejemplo, biopolímeros y macromoléculas no poliméricas.

[0134] Un polinucleótido es una macromolécula que comprende un polímero de nucleótidos. Los polinucleótidos incluyen, por ejemplo, polidesoxirribonucleótidos (ADN) y polirribonucleótidos (ARN). Un polipéptido es una macromolécula que comprende un polímero de aminoácidos. Un polisacárido es una macromolécula que comprende un polímero de monosacáridos. Los lípidos son un grupo diverso de compuestos orgánicos que incluyen, por ejemplo, grasas, aceites y hormonas que comparten la característica funcional de no interactuar apreciablemente con el agua. Por ejemplo, un triglicérido es una grasa formada a partir de tres cadenas de ácidos grasos.

[0135] Un polinucleótido de cáncer (por ejemplo, ADN de cáncer) es un polinucleótido (por ejemplo, ADN) derivado de una célula cancerosa. El ADN y/o ARN de cáncer pueden extraerse de tumores, de células cancerosas aisladas o de fluidos biológicos (por ejemplo, saliva, suero, sangre u orina) en forma de ADN libre de células (ADNcf) o ARN libre de células.

[0136] El ADN libre de células es el ADN situado fuera de una célula en un fluido corporal, por ejemplo, en la sangre o la orina. Los ácidos nucleicos circulantes (CNA) son ácidos nucleicos que se encuentran en el torrente sanguíneo. El ADN libre de células en la sangre es una forma de ácido nucleico circulante. Se cree que el ADN libre de células proviene de células moribundas que liberan su ADN en la sangre. Como las células cancerosas espacialmente distintas liberarán ADN en los fluidos corporales, como la sangre, el ADNcf de los sujetos con cáncer comprende típicamente ADN canceroso de células cancerosas espacialmente distintas.

[0137] Muestras biológicas

[0138] Los analitos para el análisis en los métodos de esta divulgación pueden derivarse de una muestra biológica, por ejemplo, una muestra que comprenda una macromolécula biológica. Una muestra biológica puede derivarse de cualquier órgano, tejido o fluido biológico. Una muestra biológica puede comprender, por ejemplo, un fluido corporal o una muestra de tejido sólido. Un ejemplo de una muestra de tejido sólido es una muestra de tumor, por ejemplo, de una biopsia de tumor sólido. Los fluidos corporales incluyen, por ejemplo, sangre, suero, células tumorales, saliva, orina, líquido linfático, líquido prostático, líquido seminal, leche, esputo, heces y lágrimas. Los fluidos corporales son fuentes particularmente buenas de macromoléculas biológicas procedentes de células de enfermedad espacialmente distintas, ya que tales células de muchas localizaciones del cuerpo pueden liberar estas moléculas al fluido corporal. Por ejemplo, la sangre y la orina son buenas fuentes de polinucleótidos libres de células. Las macromoléculas procedentes de tales fuentes pueden proporcionar un perfil más preciso de las células enfermas que las macromoléculas derivadas de una masa celular enferma localizada.

[0139] Pueden aumentarse las cantidades de polinucleótidos de la enfermedad en una muestra de fluido corporal. Tales aumentos pueden incrementar la sensibilidad de la detección de los polinucleótidos de la enfermedad. En un método, se administra una intervención, como una intervención terapéutica, a un sujeto que provoca la lisis de las células de la enfermedad, vaciando su ADN en el fluido circundante. Tales intervenciones pueden incluir la administración de quimioterapia. También pueden incluir la administración de radiación o ultrasonidos a todo el cuerpo de un sujeto, o a una parte del cuerpo de un sujeto, como por ejemplo, dirigida a un tumor o a un órgano enfermo. Después de la administración de la intervención y cuando aumenta la cantidad de polinucleótidos de la enfermedad en el fluido, se recoge una muestra de fluido para su análisis. El intervalo entre la administración de la intervención y la recogida puede ser lo suficientemente largo como para que aumenten los polinucleótidos de la enfermedad, pero no tan largo como para que se depuren del cuerpo. Por ejemplo, aproximadamente una semana antes de la recogida de la muestra puede administrarse una dosis baja de quimioterapia.

[0140] Métodos analíticos

[0141] Esta divulgación contempla varios tipos de análisis biomoleculares que incluyen, por ejemplo, genómico, epigenético (por ejemplo, metilación), expresión de ARN y proteómico. El análisis genómico puede realizarse, por ejemplo, mediante un analizador genético, por ejemplo, usando secuenciación de ADN. El análisis de metilación puede realizarse, por ejemplo, mediante la conversión de bases metiladas seguido de la secuenciación del ADN. El análisis de expresión del ARN puede realizarse, por ejemplo, mediante hibridación de matrices de polinucleótidos. El análisis proteómico puede realizarse, por ejemplo, mediante espectrometría de masas.

[0142] Como se usa en la presente en la presente, el término 'analizador genético' se refiere a un sistema que incluye un secuenciador de ADN para generar información sobre la secuencia del ADN y un ordenador que comprende un software que realiza análisis bioinformáticos sobre la información de secuencia del ADN. El análisis bioinformático puede incluir, sin limitación, el ensamblaje de datos de secuencias, la detección y cuantificación de variantes genéticas en una muestra, incluyendo variantes de la línea germinal (por ejemplo, heterocigosidad) y variantes de células somáticas (por ejemplo, variantes de células cancerosas).

[0143] Los métodos analíticos pueden incluir la generación y la captura de información genética. La información genética puede incluir información de secuencias genéticas, estados de ploidía, la identidad de una o más variantes genéticas, así como una medida cuantitativa de las variantes. El término 'medida cuantitativa' se refiere a cualquier medida de cantidad, incluyendo las medidas absolutas y relativas. Una medida cuantitativa puede ser, por ejemplo, un número (por ejemplo, un recuento), un porcentaje, una frecuencia, un grado o una cantidad umbral.

[0144] Los polinucleótidos pueden analizarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Típicamente, el secuenciador de ADN empleará secuenciación de última generación (por ejemplo, Illumina, 454, Ion Torrent, SOLiD). El análisis de secuencias puede realizarse mediante secuenciación masivamente paralela, es decir, secuenciando simultáneamente (o en rápida sucesión) cualquiera de por lo menos 100.000, 1 millón, 10 millones, 100 millones o 1000 millones de moléculas de polinucleótidos. Los métodos de secuenciación pueden incluir, pero no se limitan a: secuenciación de alto rendimiento, pirosecuenciación, secuenciación por síntesis, secuenciación de moléculas individuales, secuenciación por nanoporos, secuenciación por semiconductores, secuenciación por ligación, secuenciación por hibridación, RNA-Seq (Illumina), expresión génica digital (Helicos), secuenciación de nueva generación, secuenciación de moléculas individuales por síntesis (SMSS) (Helicos), secuenciación masivamente paralela, matriz de moléculas individuales clonales (Solexa), secuenciación 'shotgun', secuenciación Maxam-Gilbert o Sanger, caminata con cebadores, secuenciación usando plataformas PacBio, SOLiD, Ion Torrent, Genius (GenapSys) o Nanopore (por ejemplo, Oxford Nanopore) y cualquier otro método de secuenciación conocido en la técnica.

[0146] El secuenciador de ADN puede aplicar el método de secuenciación de Gilbert, basado en la modificación química del ADN seguido de la escisión en bases específicas, o puede aplicar la técnica de Sanger, que se basa en la terminación de la cadena de didesoxinucleótidos. El método de Sanger se popularizó debido a su mayor eficiencia y baja radiactividad. El secuenciador de ADN puede usar técnicas que no requieren amplificación de ADN (reacción en cadena de la polimerasa, PCR), lo que acelera la preparación de las muestras antes de la secuenciación y reduce los errores. Además, los datos de secuenciación se recogen de las reacciones provocadas por la adición de nucleótidos en la cadena complementaria en tiempo real. Por ejemplo, los secuenciadores de ADN pueden utilizar un método denominado 'tiempo real de molécula única' (SMRT), en el que los datos de secuenciación se producen mediante la luz (capturada por una cámara) emitida cuando se añade un nucleótido a la cadena complementaria mediante enzimas que contienen colorantes fluorescentes.

[0148] La secuenciación del genoma puede ser selectiva, es decir, estar dirigida a partes del genoma de interés. Por ejemplo, se sabe que muchos genes (y formas mutantes de estos genes) están asociados a varios tipos de cáncer. La secuenciación de genes seleccionados, o de partes de genes, puede ser suficiente para el análisis deseado. Los polinucleótidos que se mapean a loci específicos en el genoma que son objeto de interés pueden aislarse para su secuenciación mediante, por ejemplo, la captura de secuencias o la amplificación específica de sitio.

[0150] Una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, una secuencia de ADN) puede referirse a lecturas de secuencias en bruto o a lecturas de secuencias procesadas, como recuentos moleculares únicos inferidos a partir de lecturas de secuencias en bruto.

[0152] Las lecturas de secuencias generadas a partir de la secuenciación están sujetas a análisis que incluyen, por ejemplo, la identificación de variantes genéticas. Esto puede incluir la identificación de variantes de secuencias y la cuantificación de la cantidad de llamadas de bases en cada locus. La cuantificación puede implicar, por ejemplo, el recuento del número de lecturas que se mapean a un locus genético concreto. Una cantidad diferente de lecturas en diferentes loci puede indicar una variación del número de copias (CNV).

[0154] Los métodos de secuenciación y bioinformática que reducen el ruido y la distorsión son especialmente útiles cuando la cantidad de polinucleótidos diana en una muestra es pequeña en comparación con los polinucleótidos no diana. Cuando las moléculas diana son pocas, la señal de la diana puede ser débil. Este puede ser el caso, por ejemplo, del ADN libre de células, en donde una pequeña cantidad de polinucleótidos tumorales puede mezclarse con una cantidad mucho mayor de polinucleótidos de células sanas. En tales situaciones pueden ser útiles los métodos de seguimiento molecular. El seguimiento molecular implica hacer un seguimiento de las lecturas de secuencias de un protocolo de secuenciación hasta las moléculas de una muestra original (por ejemplo, antes de la amplificación y/o secuenciación) de las que se derivan las lecturas. Ciertos métodos implican etiquetar las moléculas de tal manera que las múltiples lecturas de secuencias producidas a partir de las moléculas originales puedan agruparse en familias de secuencias derivadas de las moléculas originales. De esta manera, pueden filtrarse las llamadas de bases que representan ruido. Tales métodos se describen con más detalle, por ejemplo, en los documentos WO 2013/142389 (Schmitt et al.), US 2014/0227705 (Vogelstein et al.) y WO 2014/149134 (Talasaz et al.). Los métodos de sobremuestreo también son útiles para determinar con más precisión el recuento de moléculas en una muestra. En algunas realizaciones, los métodos de sobremuestreo implican determinar una medida cuantitativa de moléculas de ADN individuales para las que se detectan ambas cadenas (cadenas de Watson y Crick); determinar una medida cuantitativa de moléculas de ADN individuales para las que solo se detecta una de las cadenas de ADN; inferir a partir de estas medidas una medida cuantitativa de moléculas de ADN individuales para las que no se detectó ninguna cadena; y usar estas medidas para determinar la medida cuantitativa indicativa de un número de moléculas de ADN de cadena doble individuales en la muestra. Este método se describe con más detalle en el documento PCT/US2014/072383, presentado el 24 de diciembre de 2014.

[0156] Variantes genéticas

[0158] Los métodos de la presente divulgación pueden usarse en la detección de variantes genéticas (también denominadas 'alteraciones genéticas'). Las variantes genéticas son formas alternativas en un locus genético. En el genoma humano, aproximadamente el 0,1% de las posiciones de nucleótidos son polimórficas, es decir, existen en una segunda forma genética que se produce en por lo menos el 1% de la población. Las mutaciones pueden introducir variantes genéticas en la línea germinal y también en células enfermas, como las de cáncer. Las secuencias de referencia, como hg19 o NCBI Build 37 o Build 38, se pretende que representen un genoma 'de tipo salvaje' o 'normal'. Sin embargo, en la medida en que tienen una única secuencia, no identifican polimorfismos comunes que también pueden considerarse normales.

[0160] Las variantes genéticas incluyen variantes de secuencia, variantes de número de copias y variantes de modificación de nucleótidos. Una variante de secuencia es una variación en una secuencia genética de nucleótidos. Una variante de número de copias es una desviación del tipo salvaje en el número de copias de una parte de un genoma. Las variantes genéticas incluyen, por ejemplo, variaciones de un solo nucleótido (SNP), inserciones, deleciones, inversiones, transversiones, translocaciones, fusiones génicas, fusiones cromosómicas, truncamientos génicos, variaciones del número de copias (por ejemplo, aneuploidía, aneuploidía parcial, poliploidía, amplificación génica), cambios anormales en las modificaciones químicas del ácido nucleico, cambios anormales en los patrones epigenéticos y cambios anormales en la metilación del ácido nucleico.

[0162] Las variantes genéticas pueden detectarse comparando secuencias de polinucleótidos en una muestra con una referencia, por ejemplo, con una secuencia genómica de referencia, con un índice o con una base de datos de mutaciones conocidas. En una realización, la secuencia de referencia es una secuencia de referencia disponible públicamente, como la secuencia del genoma humano HG-19 o NCBI Build 37. En otra realización, la secuencia de referencia es una secuencia de una base de datos no pública. En otra realización, la secuencia de referencia es una secuencia de la línea germinal de un organismo inferida o determinada a partir de la secuenciación de polinucleótidos del organismo.

[0164] Una mutación somática o alteración somática es una variante genética que surge en una célula somática. Las mutaciones somáticas se distinguen de las mutaciones que surgen en el genoma de una célula de la línea germinal (es decir, espermatozoide u óvulo) o un cigoto de un individuo. Las mutaciones somáticas, por ejemplo, las que se encuentran en las células cancerosas, se distinguen del genoma de la línea germinal de un sujeto en el que surgió el cáncer. También pueden detectarse comparando el genoma del cáncer con el genoma de la línea germinal o con un genoma de referencia. También se conocen variantes genéticas que son comunes en las células cancerosas. Una base de datos de SNV en el cáncer humano puede encontrarse en el sitio web: cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/.

[0166] La Figura 8 muestra genes que se sabe que, en el cáncer, presentan mutaciones puntuales, amplificaciones, fusiones e indeles.

[0168] Desviación de CNV en célulasde división rápida

[0170] Durante la fase S del ciclo celular, la célula replica el ADN. Una célula diploide que tiene 2N cromosomas con ADN replicado puede corresponder a un contenido de ADN de aproximadamente 4X, mientras que una célula diploide que tiene 2N cromosomas sin ADN replicado puede corresponder a un contenido de ADN de aproximadamente 2X. La replicación se produce a partir de los orígenes de replicación. En los mamíferos, los orígenes de replicación están espaciados a intervalos de entre 15 kb y 300 kb aproximadamente. Durante este periodo, las partes del genoma existen en forma poliploide. Esas áreas entre los orígenes de replicación y la posición de la polimerasa se duplican, mientras que las áreas más allá de la posición de la polimerasa (o justo antes del origen de replicación) siguen teniendo un solo número de copias en la cadena que se está sometiendo a replicación. Cuando se escanea todo el genoma, el número de copias parece desigual o distorsionado, que tienen regiones que existen en forma poliploide y regiones que existen en forma diploide. Dicho escaneo parece ruidoso. Esto es cierto incluso para las células que no portan variaciones en el número de copias en el genoma en estado de reposo. Por el contrario, un escaneo de CNV en células en G<0>muestra un perfil en el que el número de copias es relativamente plano o no distorsionado en todo el genoma. Debido a que las células cancerosas se dividen rápidamente, su perfil de CNV en todo el genoma muestra distorsión, independientemente de si el genoma también porta CNV en ciertos loci o no.

[0172] Este hecho puede aprovecharse para detectar la carga tumoral en el ADN de muestras que comprenden ADN heterogéneo, por ejemplo, una mezcla de ADN enfermo y ADN sano, como el ADNcf. Un método para detectar la carga tumoral consiste en determinar la variación del número de copias debida a la proximidad del locus o loci examinados para varios orígenes de replicación. Las regiones que incluyen un origen de replicación tendrán muy cerca de 4 copias de ADN en ese locus (en una célula diploide), mientras que las regiones que están muy alejadas de un origen de replicación tendrán más cerca de 2 copias (en una célula diploide). En ciertas realizaciones, el locus o los loci examinados incluyen, por lo menos 1 kb, por lo menos 10 kb, por lo menos 100 kb, por lo menos 1 mb, por lo menos 10 mb, por lo menos 100 mb, en todo un cromosoma o en todo un genoma. Se determina una medida de la CNV del origen de replicación (ROCNV) en toda la región. Esta puede ser, por ejemplo, una medida de la desviación en el número de copias con respecto a un valor de tendencia central. El valor de tendencia central puede ser, por ejemplo, la media, la mediana o la moda. La medida de la desviación puede ser, por ejemplo, la varianza o la desviación estándar. Esta medida puede compararse con una medida de las ROCNV en la misma región en una muestra de control, por ejemplo, de un individuo sano o de células en estado de reposo. Las ROCNV pueden determinarse dividiendo la región o regiones analizadas en particiones no superpuestas de varias longitudes y tomando una medida de la CNV en esta partición. Esta medida de la CNV puede derivarse del número de lecturas o fragmentos que se ha determinado que se mapean a esas regiones después de la secuenciación. Las particiones pueden tener varios tamaños, para producir varios niveles de resolución, por ejemplo, un solo nivel de base (base por base), 10 bases, 100 bases, 1 kb, 10 kb o 100 kb. Las desviaciones que son mayores que un control indican la presencia de ADN que está experimentado replicación, lo que, a su vez, indica enfermedad maligna. Cuanto mayor sea el grado de desviación, mayor será la cantidad de ADN de las células que están experimentando división en la muestra.

[0174] Pueden usarse varios métodos para calcular las variaciones reales del número de copias genéticas que difieren de la distorsión basada en el origen de la replicación. Por ejemplo, pueden usarse las posiciones de SNP heterocigotos en los loci de CNV afectados para inferir la variación del número de copias calculando la desviación del 50% o el desequilibrio alélico en esos loci. La distorsión debida a la proximidad del origen de replicación no debería afectar a este desequilibrio, ya que ambas copias se copiarían generalmente en intervalos de tiempo similares y, por lo tanto, se autonormalizarían (aunque los cambios alélicos podrían cambiar la replicación del origen entre las dos variantes alélicas). Por ejemplo, la duplicación de un segmento cromosómico que contiene un SNP podría detectarse en alrededor del 67% de las lecturas, mientras que la duplicación resultante de la ROCNV se detectaría en aproximadamente el 50% de las lecturas. En otro método, se usan técnicas basadas en recuento que usan la densidad de fragmentos detectados o lecturas en un cierto locus para calcular el número relativo de copias. Estas técnicas generalmente están limitadas por el ruido de Poisson y el sesgo sistemático debido a la preparación de la muestra de ADN y el sesgo de secuenciación. Una combinación de estos métodos también podría usarse para obtener una precisión aún mayor.

[0176] La ROCNV puede calcularse para una muestra dada y usarse para dar un valor de la carga tumoral libre de células a pesar de la falta de detección de variantes somáticas tradicionales, como SNV, CNV específicas de genes, reordenamientos genómicos, variantes epigenéticas, pérdida de heterocigosidad, etc. Las ROCNV también pueden usarse para restar la distorsión para una muestra dada con el fin de aumentar la sensibilidad y/o la especificidad de un método de detección/estimación de CNV dado, eliminando la variación relacionada con la proximidad del origen de la replicación en lugar de deberse a cambios reales en el número de copias de una célula. Como referencia de las ROCNV para estimar su contribución a una muestra dada también pueden usarse líneas celulares con cambios conocidos o sin cambios en el número de copias con respecto a una referencia.

[0178] En una realización, el método implica determinar un nivel de referencia de copias de moléculas de ADN en uno o más loci a partir de una o más muestras de control, cada una de las cuales contiene ADN de células que experimentan un nivel predeterminado de división celular, por ejemplo, células en estado de reposo o células tumorales en rápida división. También se determina una medida de las copias de moléculas de ADN en una muestra de prueba. La medida en las muestras de prueba puede proceder de uno o más loci divididos en una o más particiones. En cada caso, una pluralidad de loci incluye cada uno un origen o replicación. La medida de las copias de la muestra de prueba puede ser una media de todas las particiones o un nivel de varianza entre los loci. Se compara con la muestra de control una medida de la tendencia central o de la variación (por ejemplo, la varianza o la desviación estándar) en el número de copias de la muestra de prueba. Una medida que sea mayor en una muestra de prueba que en un control de células en estado de reposo, o que se dividen lentamente, indica que las células que generan el ADN en la muestra de prueba se dividen más rápidamente que las células que proporcionan ADN a la muestra de control, por ejemplo, son cancerosas. De manera similar, las medidas que son similares entre una muestra de prueba y un control de células en estado de división activa indican que las células que generan el ADN en la muestra de prueba se están dividiendo a una velocidad similar a la de las células que se dividen rápidamente, es decir, que son cancerosas.

[0180] Heterogeneidad celular de la enfermedad

[0182] La heterogeneidad celular de la enfermedad, por ejemplo, la heterogeneidad tumoral, es la aparición de células enfermas que tienen diferentes variantes genéticas. La heterogeneidad celular de la enfermedad puede determinarse mediante el examen de polinucleótidos aislados de células enfermas y la detección de diferencias en sus genomas. La heterogeneidad celular de la enfermedad también puede inferirse a partir del examen de polinucleótidos de una muestra que contenga polinucleótidos tanto de células enfermas como de sanas, basándose en las diferencias en la frecuencia relativa de las mutaciones somáticas. Por ejemplo, el cáncer se caracteriza por cambios a nivel genético, por ejemplo, a través de la acumulación de mutaciones somáticas en diferentes grupos clonales de células. Estos cambios pueden contribuir al crecimiento descontrolado de las células cancerosas o funcionar como marcadores de respuesta o falta de respuesta a diversas intervenciones terapéuticas.

[0184] La heterogeneidad tumoral es una condición en la que un tumor se caracteriza por células cancerosas que contienen diferentes combinaciones de variantes genéticas, por ejemplo, diferentes combinaciones de mutaciones somáticas. Es decir, el tumor puede tener diferentes células que contienen alteraciones en diferentes genes, o que contienen diferentes alteraciones en el mismo gen. Por ejemplo, una primera célula podría incluir una forma mutante de BRAF, mientras que una segunda célula podría incluir formas mutantes tanto de BRAF como de ERBB2. Alternativamente, una primera célula cancerosa podría incluir el polimorfismo de un solo nucleótido EGRF 55249063 G>A, mientras que una segunda célula podría incluir el polimorfismo de un solo nucleótido EGRF 55238874 T>A. (Los números se refieren a la posición del nucleótido en la secuencia de referencia genómica).

[0186] Por ejemplo, una célula tumoral original puede incluir una variante genética en un gen, por ejemplo, un oncogén. A medida que las células continúan dividiéndose, algunas células de la progenie, que portan la mutación original, pueden desarrollar independientemente variantes genéticas en otros genes o en diferentes partes del mismo gen. En divisiones posteriores, las células tumorales pueden acumular aún más variantes genéticas.

[0188] Perfil de la heterogeneidad de la enfermedad

[0190] Los métodos de esta divulgación permiten la realización de perfiles cuantitativos y cualitativos de la heterogeneidad tumoral. En una realización, el perfil incluye información de polinucleótidos de células de la enfermedad espacialmente distintas. En una realización, el perfil es un perfil de todo el cuerpo que contiene información de células distribuidas por todo el cuerpo. El análisis de polinucleótidos en el ADNcf permite tomar muestras de ADN en toda la extensión geográfica de un tumor, al contrario que la toma de muestras de un área localizada de un tumor. En particular, permite tomar muestras de tumores difusos y metastásicos. Esto contrasta con los métodos que detectan la mera existencia de heterogeneidad tumoral mediante la toma de muestras localizada de un tumor. El perfil puede indicar la secuencia exacta de nucleótidos de la variante, o puede indicar simplemente un gen que porta la mutación somática.

[0192] En una realización de un perfil de heterogeneidad de células tumorales, el perfil identifica variaciones genéticas y las cantidades relativas de cada variante. A partir de esta información, pueden inferirse posibles distribuciones de las variantes en diferentes subpoblaciones de células. Por ejemplo, un cáncer puede comenzar con una célula que porta la mutación somática X. Como resultado de la evolución clonal, alguna progenie de esta célula puede desarrollar la variante Y. Otra progenie puede desarrollar la variante Z. A nivel celular, después del análisis, el tumor puede caracterizarse como un 50% X, un 35% XY y un 15% XZ. A nivel del ADN (y considerando solo el ADN de las células tumorales), el perfil puede indicar un 100% de X, un 35% de Y y un 15% de Z. También pueden detectarse tanto CNV en un primer locus como variantes de secuencia en un segundo locus.

[0194] La heterogeneidad tumoral puede detectarse a partir del análisis de secuencias de polinucleótidos cancerosos, sobre la base de la existencia de variaciones genómicas en diferentes loci que se producen con diferentes frecuencias. Por ejemplo, en una muestra de ADN libre de células (que probablemente contenga ADN de la línea germinal así como ADN canceroso), puede encontrarse que una variante de secuencia de BRAF se produce con una frecuencia del 17%, una variante de secuencia de CDKN2A se produce con una frecuencia del 6%, una variante de secuencia de ERBB2 se produce con una frecuencia del 3% y una variante de secuencia de ATM se produce con una frecuencia del 1%. Estas diferentes frecuencias de variantes de secuencia indican la heterogeneidad tumoral. De manera similar, las secuencias genéticas que presentan diferentes cantidades de variación en el número de copias también indican la heterogeneidad tumoral. Por ejemplo, el análisis de una muestra puede mostrar diferentes niveles de amplificación para los genes EGFR y CCNE1. Esto también indica la heterogeneidad tumoral.

[0196] En el caso del ADN libre de células, la detección de mutaciones somáticas puede realizarse comparando las llamadas de bases en la muestra con una secuencia de referencia o, internamente, como llamadas de bases menos frecuentes con llamadas de bases más comunes, que se presume que están en la secuencia de la línea germinal. En cualquier caso, la existencia de formas subdominantes (por ejemplo, menos del 40% del total de llamadas de bases) en diferentes loci y a diferente frecuencia indica la heterogeneidad celular de la enfermedad.

[0198] El ADN libre de células comprende típicamente una preponderancia de ADN de células normales que tienen la secuencia del genoma de la línea germinal y, en el caso de una enfermedad, como el cáncer, un pequeño porcentaje de ADN de células cancerosas y que tiene una secuencia del genoma del cáncer. Las secuencias generadas a partir de polinucleótidos en una muestra de ADNcf pueden compararse con una secuencia de referencia para detectar diferencias entre la secuencia de referencia y los polinucleótidos en el ADNcf. En cualquier locus, todos o casi todos los polinucleótidos de una muestra de prueba pueden ser idénticos a un nucleótido de la secuencia de referencia. Alternativamente, un nucleótido detectado con una frecuencia cercana al 100% en una muestra puede ser diferente a un nucleótido de la secuencia de referencia. Esto indica muy probablemente una forma polimórfica normal en este locus. Si se detecta un primer nucleótido que coincide con un nucleótido de referencia en aproximadamente un 50% y un segundo nucleótido que es diferente de un nucleótido de referencia en aproximadamente un 50%, lo más probable es que esto indique una heterocigosidad normal. La heterocigosidad puede presentarse en proporciones de alelos divergentes de 50:50, por ejemplo, 60:40 o incluso 70:30. Sin embargo, si la muestra comprende un nucleótido detectable por encima del ruido a una frecuencia por debajo (o por encima) de un intervalo heterocigótico inequívoco (por ejemplo, menos del 45%, menos del 40%, menos del 30%, menos del 20%, menos del 10% o menos del 5%), esto puede atribuirse a la existencia de mutaciones somáticas en un porcentaje de las células que aportan ADN a la población de ADNcf. Estas pueden provenir de células enfermas, por ejemplo, células cancerosas. (El porcentaje exacto depende de la carga tumoral). Si la frecuencia de mutaciones somáticas en dos loci genéticos diferentes es diferente, por ejemplo, 16% en un locus y 5% en otro, esto indica que las células enfermas, por ejemplo, las células cancerosas, son heterogéneas.

[0199] En el caso del ADN de tumores sólidos, que se espera que esté compuesto principalmente por ADN tumoral, las mutaciones somáticas también pueden detectarse mediante la comparación con una secuencia de referencia. La detección de mutaciones somáticas que existen en el 100% de las células tumorales puede requerir la referencia a una secuencia estándar o información sobre mutantes conocidos. Sin embargo, la existencia de secuencias subdominantes entre el grupo de polinucleótidos en diferentes loci y a diferentes frecuencias relativas indica heterogeneidad tumoral.

[0201] El perfil puede incluir variantes genéticas en genes que se sabe que son accionables. El conocimiento de tales variantes puede contribuir a la selección de intervenciones terapéuticas, ya que las terapias pueden dirigirse a tales variantes. En el caso del cáncer, ya se conocen muchas variantes genéticas accionables.

[0203] CNV y SNV en la heterogeneidad celular de la enfermedad

[0205] En general, el estado del número de copias de un gen debe reflejarse en la frecuencia de una forma genética del gen en la muestra. Por ejemplo, una variante de secuencia puede detectarse a una frecuencia congruente con la homocigosidad o la heterocigosidad (por ejemplo, aproximadamente el 100% o aproximadamente el 50%, respectivamente) sin variación en el número de copias. Esto es congruente con un polimorfismo o mutación de la línea germinal. Una variante de secuencia puede detectarse a una frecuencia de aproximadamente el 67% (o, alternativamente, de aproximadamente el 33%) de polinucleótidos en un locus, y también en un gen medido con un número de copias aumentado (generalmente, n = 2). Esto es congruente con la duplicación génica en la línea germinal. Por ejemplo, de esta manera habría una trisomía. Sin embargo, si se detecta una variante de secuencia a un nivel congruente con la homocigosis (por ejemplo, de aproximadamente el 100%), pero en cantidades congruentes con la variación del número de copias, es más probable que esto refleje la presencia de polinucleótidos de células de enfermedad que han experimentado una amplificación génica. De manera similar, si se detecta una variante de secuencia a un nivel que no es incompatible con la heterocigosidad (por ejemplo, que se desvía algo del 50%), pero en cantidades congruentes con la variación del número de copias, es más probable que esto refleje la presencia de polinucleótidos de células de enfermedad; los polinucleótidos enfermos crean cierto nivel de desequilibrio en la frecuencia alélica, alejándose del 50:50.

[0207] Esta observación puede usarse para inferir si es más probable que hay una variante de secuencia en el nivel de la línea germinal o que sea el resultado de una mutación de células somáticas, por ejemplo, en una célula cancerosa. Por ejemplo, una variante de secuencia en un gen detectada a niveles que podrían considerarse congruentes con la heterocigosidad en la línea germinal es más probable que sea el producto de una mutación somática en células de enfermedad si también se detecta en ese gen una variación del número de copias.

[0209] Además, en la medida en que esperamos que una duplicación génica en la línea germinal porte una variante congruente con el aumento de la dosis genética (por ejemplo, aproximadamente el 67% para la trisomía en un locus), la detección de la amplificación génica con una dosis de variante de secuencia que se desvía significativamente de esta cantidad esperada indica que es más probable que la CNV esté presente como resultado de una mutación celular somática.

[0211] El hecho de que pueda haber mutaciones somáticas en diferentes loci en un número de copias único o múltiple en la misma célula de enfermedad también puede usarse para inferir la heterogeneidad tumoral. Más específicamente, puede inferirse la heterogeneidad tumoral cuando se detectan dos genes con una frecuencia diferente, pero su número de copias es relativamente igual. Alternativamente, la homogeneidad tumoral puede inferirse cuando la diferencia de frecuencia entre dos variantes de secuencia es congruente con la diferencia en el número de copias de los dos genes. Por tanto, si se detecta una variante del EGFR en un 11% y una variante del KRAS en un 5%, y no se detecta ninguna CNV en estos genes, es probable que la diferencia en la frecuencia refleje la heterogeneidad tumoral (por ejemplo, todas las células tumorales portan una mutación del EGFR y la mitad de las células tumorales también portan una mutación del KRAS). Por otra parte, si el gen EGFR portador del mutante se detecta con un número de copias aumentado, una interpretación congruente es una población homogénea de células tumorales, cada una de las cuales porta un mutante en los genes EGFR y KRAS, pero en la que el gen KRAS está duplicado. Por consiguiente, en el locus de la variante de secuencia en una muestra puede determinarse tanto la frecuencia de una variante de secuencia como una medida de CNV. A continuación, la frecuencia puede corregirse para reflejar el número relativo de células que portan la variante ponderando la frecuencia sobre la base de la dosis por célula determinada a partir de la medida de CNV. Este resultado es ahora más comparable en términos de número de células que portan la variante con una variante de secuencia que no varía en el número de copias.

[0213] Comunicación de los resultados de las pruebas

[0215] Un generador de informes puede proporcionar un informe de los resultados del análisis de variantes genéticas (por ejemplo, variantes de secuencia, CNV, heterogeneidad celular de la enfermedad y combinaciones de las mismas) a un profesional de la salud, por ejemplo, un médico, para ayudar en la interpretación de los resultados de la prueba (por ejemplo, los datos) y seleccionar las opciones de tratamiento. Un informe generado por un generador de informes puede proporcionar información adicional, como resultados de laboratorio clínico, que puede ser útil para diagnosticar enfermedades y seleccionar opciones de tratamiento.

[0217] En referencia ahora a la FIG. 9A, se ilustra esquemáticamente un sistema con un generador de informes 1 para informar, por ejemplo, sobre los resultados de pruebas de cáncer y las opciones de tratamiento del mismo. El sistema generador de informes puede ser un sistema central de procesamiento de datos configurado para establecer comunicaciones directamente con: un sitio de datos remoto o laboratorio 2, un consultorio médico/proveedor de atención médica (profesional tratante) 4 y/o un paciente/sujeto 6 a través de enlaces de comunicaciones. El laboratorio 2 puede ser un laboratorio médico, un laboratorio de diagnóstico, un centro médico, una consulta médica, un dispositivo de pruebas en el punto de atención o cualquier otro sitio de datos remoto capaz de generar información clínica del sujeto. La información clínica del sujeto incluye, pero no se limita a, datos de pruebas de laboratorio, por ejemplo, análisis de variantes genéticas; datos de imágenes y rayos X; resultados de exámenes; y diagnósticos. El proveedor de atención médica o el consultorio 6 pueden incluir proveedores de servicios médicos, como médicos, enfermeras, auxiliares de salud a domicilio, técnicos y asistentes médicos, y el consultorio puede ser cualquier centro de atención médica que cuente con proveedores de atención médica. En ciertos casos, el proveedor de atención médica/consultorio es también un sitio de datos remoto. Cuando el cáncer es una enfermedad que debe tratarse, el sujeto puede padecer cáncer, entre otras enfermedades o trastornos posibles.

[0219] Otra información clínica sobre un sujeto con cáncer 6 puede incluir los resultados de pruebas de laboratorio, por ejemplo, análisis de variantes genéticas, panel metabólico, hemograma completo, etc.; datos de imagenología médica; y/o procedimientos médicos dirigidos a diagnosticar la afección, proporcionar un pronóstico, monitorizar la progresión de la enfermedad, determinar la recaída o la remisión, o combinaciones de los mismos. La lista de fuentes adecuadas de información clínica sobre el cáncer incluye, pero no se limita a, tomografías computarizadas, resonancias magnéticas, ecografías, gammagrafías óseas, exploraciones PET, pruebas de médula ósea, radiografías con bario, endoscopias, linfangiogramas, IVU (urograma intravenoso) o IVP (pielograma intravenoso), punciones lumbares, cistoscopias, pruebas inmunológicas (cribado de anticuerpos contra enfermedades malignas) y pruebas de marcadores de cáncer.

[0221] La información clínica del sujeto 6 puede obtenerse del laboratorio 2 manual o automáticamente. Cuando se desea la simplicidad del sistema, la información puede obtenerse automáticamente a intervalos de tiempo predeterminados o regulares. Un intervalo de tiempo regular puede referirse a un intervalo de tiempo en el que la recopilación de los datos de laboratorio se lleva a cabo automáticamente mediante los métodos y sistemas descritos en la presente, basándose en una medición de tiempo como horas, días, semanas, meses, años, etc. En una realización, la recopilación de datos y el procesamiento se llevan a cabo por lo menos una vez al día. En una realización, la transferencia y la recopilación de datos se llevan a cabo aproximadamente cada mes, cada dos semanas, cada semana, varias veces a la semana o diariamente. Alternativamente, la recuperación de información puede llevarse a cabo en intervalos de tiempo predeterminados, que pueden no ser intervalos de tiempo regulares. Por ejemplo, un primer paso de recuperación puede realizarse después de una semana y un segundo paso de recuperación puede realizarse después de un mes. La transferencia y recopilación de datos puede personalizarse de acuerdo con la naturaleza del trastorno que se esté tratando y la frecuencia de las pruebas y exámenes médicos necesarios de los sujetos.

[0223] La FIG.9B muestra un proceso ejemplar para generar informes genéticos, que incluyen un mapa de respuesta tumoral y un resumen asociado de las alteraciones. Un mapa de respuesta tumoral es una representación gráfica de la información genética que indica los cambios a lo largo del tiempo en la información genética de un tumor, por ejemplo, cambios cualitativos y cuantitativos. Tales cambios pueden reflejar la respuesta de un sujeto a una intervención terapéutica. Este proceso puede reducir las tasas de error y el sesgo que pueden ser órdenes de magnitud superiores a los necesarios para detectar de manera fiable variantes genéticas de novo asociadas al cáncer. El proceso puede comprender capturar primero información genética recogiendo muestras de fluidos corporales como fuentes de material genético (por ejemplo, sangre, saliva, sudor, orina, etc.). A continuación, el proceso puede comprender secuenciar los materiales (11). Por ejemplo, pueden secuenciarse los polinucleótidos de una muestra, produciendo una pluralidad de lecturas de secuencias. La carga tumoral en una muestra que comprende polinucleótidos puede estimarse como la cantidad relativa de lecturas de secuencias que presentan una variante con respecto a la cantidad total de lecturas de secuencias generadas a partir de la muestra. Cuando se analizan las variantes del número de copias, la carga tumoral puede estimarse como el exceso relativo (por ejemplo, en el caso de la duplicación de genes) o el déficit relativo (por ejemplo, en el caso de la eliminación de genes) de la cantidad total de lecturas de secuencias en los loci de prueba y control. Por ejemplo, una ejecución puede producir 1000 lecturas que se mapean a un locus oncogénico, de las cuales 900 corresponden al tipo salvaje y 100 corresponden a un mutante de cáncer, lo que indica una variante del número de copias en este gen. A continuación, en las FIGS.10-11, se ofrecen más detalles sobre la recogida de muestras y la secuenciación de materiales genéticos a modo de ejemplo.

[0225] A continuación, puede procesarse la información genética (12). A continuación, pueden identificarse las variantes genéticas. El proceso puede comprender determinar la frecuencia de las variantes genéticas en la muestra que contiene el material genético. El proceso puede comprender separar la información del ruido (13) si este proceso es ruidoso.

[0226] Los métodos de secuenciación para el análisis genético pueden tener tasas de error. Por ejemplo, el sistema mySeq de Illumina puede producir índices de error porcentuales de un solo dígito bajo. Para 1000 lecturas de secuencia mapeadas a un locus, puede esperarse que aproximadamente 50 lecturas (aproximadamente el 5%) incluyan errores. Ciertas metodologías, como las descritas en el documento WO 2014/149134, pueden reducir significativamente a tasa de error. Los errores crean ruido que puede ocultar las señales del cáncer presentes a niveles bajos en una muestra. Por ejemplo, si una muestra tiene una carga tumoral en un nivel cercano a la tasa de error del sistema de secuenciación, por ejemplo, alrededor del 0,1%-5%, puede ser difícil distinguir una señal correspondiente a una variante genética debida al cáncer de otra debida al ruido.

[0228] El análisis de variantes genéticas puede usarse para el diagnóstico en presencia de ruido. El análisis puede basarse en la frecuencia de las variantes de secuencia o el nivel de CNV (14) y puede establecerse una indicación o nivel de confianza en el diagnóstico para detectar variantes genéticas en el intervalo de ruido (15).

[0230] A continuación, el proceso puede comprender aumentar la confianza del diagnóstico. Esto puede hacerse usando una pluralidad de mediciones para aumentar la confianza del diagnóstico (16) o, alternativamente, usando mediciones en una pluralidad de puntos temporales para determinar si el cáncer está avanzando, en remisión o se ha estabilizado (17). La confianza del diagnóstico puede usarse para identificar los estados de la enfermedad. Por ejemplo, los polinucleótidos libres de células tomados de un sujeto pueden incluir polinucleótidos derivados de células normales, así como polinucleótidos derivados de células enfermas, como las células cancerosas. Los polinucleótidos de las células cancerosas pueden presentar variantes genéticas, como mutaciones de células somáticas y variantes del número de copias. Cuando se secuencian los polinucleótidos libres de células de una muestra de un sujeto, estos polinucleótidos cancerosos se detectan como variantes de secuencia o como variantes del número de copias.

[0232] Las mediciones de un parámetro, independientemente de si se encuentran o no en el intervalo de ruido, pueden proporcionarse con un intervalo de confianza. Tras realizar pruebas a lo largo del tiempo, puede determinarse si un cáncer está avanzando, se ha estabilizado o está en remisión comparando los intervalos de confianza a lo largo del tiempo. Cuando los intervalos de confianza se superponen, puede no ser posible determinar si la enfermedad está aumentando o disminuyendo, ya que no hay una diferencia estadísticamente significativa entre las medidas. Sin embargo, cuando los intervalos de confianza no se superponen, esto indica la dirección de la enfermedad. Por ejemplo, la comparación del punto más bajo de un intervalo de confianza en un punto temporal dado y el punto más alto de un intervalo de confianza en un segundo punto temporal indica la dirección.

[0234] A continuación, el proceso puede comprender generar un informe/diagnóstico genético. El proceso puede comprender generar un gráfico genético para una pluralidad de mediciones que muestran la tendencia de la mutación (18) y generar un informe que muestre los resultados y las opciones de tratamiento (19).

[0236] Las FIGS.10A-10C muestran con más detalle una realización para generar informes y diagnósticos genéticos (por ejemplo, informe/diagnóstico). En una implementación, la FIG.10C muestra un pseudocódigo ejemplar ejecutado por el sistema de la FIG. 9A para procesar frecuencias de alelos mutantes no de CNV notificadas. Sin embargo, el sistema también puede procesar frecuencias de alelos mutantes de CNV notificadas.

[0238] Las muestras que comprenden material genético, como el ADNcf, pueden recogerse de un sujeto en una pluralidad de puntos temporales, es decir, en serie. El material genético puede secuenciarse, por ejemplo, usando un sistema de secuenciación de alto rendimiento. La secuenciación puede dirigir los loci de interés para detectar variantes genéticas, como genes que portan mutaciones somáticas, genes que experimentan variaciones en el número de copias o genes implicados en fusiones génicas, por ejemplo, en el cáncer. En cada punto temporal, puede determinarse una medida cuantitativa de las variantes genéticas encontradas. Por ejemplo, en el caso del ADNcf, la medida cuantitativa puede ser la frecuencia o el porcentaje de una variante genética entre los polinucleótidos que se mapean a un locus, o el número absoluto de lecturas de secuencias o polinucleótidos que se mapean a un locus. Las variantes genéticas que tienen una cantidad distinta de cero en por lo menos un punto temporal pueden representarse gráficamente a lo largo de todos los puntos temporales. Por ejemplo, en una colección de 1000 secuencias, la variante 1 puede encontrarse en los puntos temporales 1, 2 y 3 en cantidades de 50, 30 y 0, respectivamente. La variante 2 puede encontrarse en cantidades de 0, 10 y 20 en estos puntos temporales. Estas cantidades pueden normalizarse, para la variante 1, al 5%, 3% y 0%, y, para la variante 2, al 0%, 1% y 2%. Una representación gráfica que muestre la unión de todos los resultados distintos de cero puede indicar estas cantidades para ambas variantes en todos los puntos temporales. Las cantidades normalizadas pueden escalarse de tal manera que cada porcentaje esté representado por una capa, por ejemplo, que tenga una altura de 1 mm. Así, por ejemplo, en este caso las alturas serían en el punto temporal 1: alturas de 5 mm (variante 1) y 0 mm (variante 2); en el punto temporal 2: alturas de 3 mm (variante 1) y 1 mm (variante 2), en el punto temporal 3: alturas de 0 mm (variante 1) y 2 mm (variante 2). La representación gráfica puede adoptar la forma de un gráfico de áreas apiladas, como un gráfico de corrientes. Un punto temporal 'cero' (antes del primer punto temporal) puede representarse mediante un punto, con todos los valores en 0. La altura de la cantidad de las variantes en la representación gráfica puede ser, por ejemplo, relativa o proporcional entre sí. Por ejemplo, una variante con una frecuencia del 5% en un punto temporal podría representarse con una altura del doble de la de una frecuencia de variante del 2,5% en el mismo punto temporal. El orden de apilamiento puede elegirse para facilitar la comprensión. Por ejemplo, las variantes pueden apilarse en orden de cantidad, de mayor a menor, de abajo hacia arriba. O, pueden apilarse en un gráfico de corrientes con la variante de mayor cantidad inicial en el centro y otras variantes de cantidad decreciente a ambos lados. En ciertas realizaciones, las áreas pueden codificarse por colores sobre la base de la variante. Las variantes del mismo gen pueden mostrarse en diferentes tonos del mismo color. Por ejemplo, los mutantes de KRAS pueden mostrarse en diferentes tonos de azul, y los mutantes de EGFR en diferentes tonos de rojo.

[0240] Pasando ahora a la FIG.10A, el proceso puede comprender recibir información genética de un secuenciador de ADN (30). A continuación, el proceso puede comprender determinar las alteraciones genéticas específicas y las cantidades de las mismas (32).

[0242] A continuación, se genera un mapa de respuesta tumoral. Para generar el mapa, el proceso puede comprender normalizar las cantidades de cada alteración genética para su representación en todos los puntos de prueba y, a continuación, generar un factor de escala (34). Como se usa en la presente en la presente, el término 'normalizar' se refiere generalmente a los medios para ajustar los valores medidos en diferentes escalas a una escala teóricamente común. Por ejemplo, los datos medidos en diferentes puntos se convierten/ajustan de tal manera que todos los valores puedan redimensionarse a una escala común. Como se usa en la presente, el término 'factor de escala' se refiere de manera general a un número que escala, o multiplica, alguna cantidad. Por ejemplo, en la ecuación y = Cx, C es el factor de escala para x. C es también el coeficiente de x, y puede denominarse la constante de proporcionalidad de y con respecto a x. Los valores se normalizan para permitir su trazado en una escala común que sea visualmente fácil de interpretar. Y el factor de escala se usa para conocer las alturas exactas que corresponden a los valores que se van a trazar (por ejemplo, una frecuencia de alelos mutantes del 10% puede representar 1 cm en el informe, en donde la altura total es de 10 cm). El factor de escala se aplica a todos los puntos de prueba y, por lo tanto, se considera un factor de escala universal. Para cada punto de prueba, el proceso puede comprender representar información en un mapa de respuesta tumoral (36). En la operación 36, el proceso puede comprender representar las alteraciones y las alturas relativas usando el factor de escala determinado (38) y asigna un indicador visual único para cada alteración (40). Además del mapa de respuesta, el proceso puede comprender generar un resumen de las alteraciones y las opciones de tratamiento (42). Además, se presenta información de pruebas clínicas que puede ayudar a identificar alteraciones genéticas particulares y otras sugerencias de tratamiento útiles, junto con explicaciones de la terminología, la metodología de la prueba y otra información que se añade al informe y se representa para el usuario.

[0244] En una implementación, la variación del número de copias puede presentarse como un gráfico, indicando varias posiciones en el genoma y el aumento o disminución o mantenimiento correspondiente de la variación del número de copias en cada posición respectiva. Además, la variación del número de copias puede usarse para informar de una puntuación porcentual que indique cuanto material de la enfermedad (o ácidos nucleicos con una variación del número de copias) hay en la muestra de polinucleótidos libres de células.

[0246] En otra realización, el informe incluye anotaciones para ayudar a los médicos a interpretar los resultados y recomendar opciones de tratamiento. Las anotaciones pueden incluir anotar un informe para una afección en las Guías de práctica clínica en oncología de la NCCN™ o las guías de práctica clínica de la Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO). Las anotaciones pueden incluir enumerar uno o más fármacos aprobados por la FDA para uso no indicado en el prospecto, uno o más fármacos enumerados en un compendio de tratamientos contra el cáncer de los Centros de Servicios de Medicare y Medicaid (CMS) y/o uno o más fármacos experimentales que se encuentran en la bibliografía científica. Las anotaciones pueden incluir la conexión de una opción de tratamiento farmacéutico enumerada con una referencia que contenga información científica referente a la opción de tratamiento farmacéutico. La información científica puede proceder de un artículo revisado por pares de una revista médica. Las anotaciones pueden incluir proporcionar un enlace a información sobre un ensayo clínico de una opción de tratamiento farmacéutico en el informe. Las anotaciones pueden incluir presentar información en un cuadro emergente o un cuadro flotante cerca de las opciones de tratamiento farmacéutico proporcionadas en un informe electrónico. Las anotaciones pueden incluir añadir información a un informe seleccionado del grupo que consiste en una o más opciones de tratamiento farmacéutico, información científica relativa a una o más opciones de tratamiento farmacéutico, uno o más enlaces a información científica relativa a una o más opciones de tratamiento farmacéutico, uno o más enlaces a citas de información científica relativa a una o más opciones de tratamiento farmacéutico, e información de ensayos clínicos relativa a una o más opciones de tratamiento farmacéutico.

[0248] La Figura 10B muestra un proceso ejemplar para generar una ruta de mapa de respuesta tumoral que puede ser usada por un profesional de la salud, por ejemplo, un médico, para tomar decisiones sobre la atención al paciente. En esta realización, el proceso puede comprender determinar primero un factor de escalado global (43). En una realización, para todas las frecuencias de alelos mutantes no de CNV (variación del número de copias) notificadas, el proceso puede comprender transformar el valor absoluto en una métrica/escala relativa que pueda ser más susceptible de representarse gráficamente (por ejemplo, multiplicar la frecuencia de alelos mutantes por 100 y tomar el logaritmo de ese valor) y determinar un factor de escalado global usando el valor máximo observado. A continuación, el proceso implica visualizar la información del conjunto de datos de pruebas más temprano (44). La visualización puede comprender representar gráficamente la información en una interfaz de usuario (por ejemplo, una pantalla de ordenador) o en forma tangible (por ejemplo, en una hoja de papel). Para cada alteración no CNV, el proceso puede comprender multiplicar el factor de escalado por un valor transformado para cada gen y usarlo como indicador cuantitativo para trazar esa variante, y luego asignar un color/indicador visual único para cada alteración. A continuación, el proceso puede comprender visualizar la información de los puntos de prueba posteriores (45) usando el siguiente pseudocódigo:

[0249] Si la composición de los resultados de la prueba no ha cambiado, continuar con la visualización de la fecha del panel anterior en el nuevo panel.

[0250] Si las alteraciones siguen siendo las mismas, pero las cantidades han cambiado

[0251] Volver a calcular el indicador de cantidad para trazar esa variante y volver a trazar todos los valores actualizados en el panel o los paneles existentes y en el nuevo panel para la última fecha de prueba.

[0252] Si se añaden nuevas alteraciones

[0253] Añadir las alteraciones a la parte superior de todas las alteraciones existentes.

[0254] Calcular los valores transformados.

[0255] Volver a calcular el factor de escalado.

[0256] Volver a dibujar el mapa de respuesta, volver a trazar las alteraciones de la fecha de prueba anterior que aún se detectan en la fecha de prueba actual, así como las alteraciones que hayan surgido recientemente.

[0257] Si la alteración existente anterior no se encuentra entre el conjunto de alteraciones detectadas

[0258] Usar una altura de cero y trazar la cantidad de la alteración para todas las fechas de prueba posteriores Seguir incluyendo el color aunque el conjunto de colores no esté disponible

[0259] Cada panel posterior que indique una fecha de prueba también puede incluir información adicional sobre el paciente o la intervención que pueda correlacionarse con los cambios de alteración observados en el resto del mapa. También puede aplicarse un escalado, trazado y transformación similares a la CNV y otros tipos de alteraciones del ADN (por ejemplo, metilación) para mostrar estas cantidades en gráficos separados o combinados. Estas anotaciones adicionales también pueden ser cuantificables y trazarse de manera similar en el mapa.

[0260] El proceso puede comprender entonces determinar un resumen de las alteraciones y las opciones de tratamiento (46). En una realización, para la alteración con las frecuencias máximas de alelos mutantes, se realizan las siguientes acciones:

[0261] Informar de todas las alteraciones para ese gen en orden decreciente de frecuencia de alelos mutantes de alteraciones no de CNV.

[0262] Informar de todas las alteraciones de CNV para ese gen en orden decreciente de valor de CNV.

[0263] Repetir para el siguiente gen con la siguiente frecuencia de alelos mutantes no de CNV más alta aún no informada Para cada alteración informada, el proceso puede consistir en incluir un indicador de tendencia para esa alteración en las diferentes fechas de prueba.

[0264] La agrupación de las frecuencias máximas de alelos mutantes también puede extenderse más allá de los genes en los que se encuentran en anotaciones de encapsulación mayores como vías biológicas, nivel de evidencia, etc.

[0265] Las FIGS.10D-10I muestran un informe ejemplar generado por el sistema de la FIG.9A. En la FIG.10D, una sección de identificación del paciente 52 proporciona información sobre el paciente, la fecha del informe y la información de contacto del médico. Un mapa de respuesta tumoral 54 incluye un gráfico de corrientes modificado 56 que muestra las actividades tumorales con colores únicos para cada gen mutante. El gráfico 56 va acompañado de un cuadro de texto con una explicación resumida 58. Se proporcionan más detalles en un resumen de las alteraciones y la sección de opciones de tratamiento 60. Las alteraciones 62 y 64 se presentan en la sección 60, junto con la tendencia de mutación, la frecuencia de alelos mutantes, la amplificación libre de células, la indicación de medicamentos aprobados por la FDA, los fármacos aprobados por la FDA con otras indicaciones y la información sobre ensayos clínicos de fármacos. Las FIGS.10D-1, 10D-2 y 10D-3 proporcionan vistas ampliadas de la FIG.10D.

[0266] La FIG. 10E muestra una sección de informe ejemplar que proporciona definiciones, comentarios e interpretación de las pruebas. Las FIGS. 10E-1 y 10E-2 proporcionan vistas ampliadas de la FIG. 10E. La FIG.10F muestra una parte detallada ejemplar de resultados de la terapia del informe. Las FIGS.10F-1 y 10F-2 proporcionan vistas ampliadas de la FIG. 10F. La FIG. 10G muestra un análisis ejemplar sobre la relevancia clínica de las alteraciones detectadas. Las FIGS.10G-1 y 10G-2 proporcionan vistas ampliadas de la FIG.10G. La FIG.10H muestra los medicamentos potencialmente disponibles que están pasando por ensayos clínicos. La FIG. 10I muestra los métodos de prueba y las limitaciones de los mismos. Las FIGS.10I-1 y 10I-2 proporcionan vistas ampliadas de la FIG.

[0267] 10I.

[0269] Las FIG.10J-10P muestran varios gráficos de corrientes modificados 56 ejemplares. Un gráfico de corrientes, es un tipo de gráfico de área apilada que se desplaza alrededor de un eje central, lo que da como resultado una forma orgánica y fluida. Los gráficos de corrientes son una generalización de los gráficos de área apilada en los que la línea de base es libre. Al desplazar la línea de base, es posible minimizar el cambio en la pendiente (u 'oscilación') en series individuales, facilitando de este modo la percepción del grosor de cualquier capa dada a través de los datos.

[0271] Por ejemplo, la FIG.10J muestra siete capas que representan por lo menos 8 mutantes en tres periodos de tiempo, y un punto temporal '0' (todos los valores '0'). La FIG.10K muestra un único mutante en 4 periodos de tiempo. En el segundo, el tercer y el cuarto puntos temporales no se detectan mutantes. La FIG.10L indica la frecuencia del alelo dominante en cada punto temporal. La FIG.10M muestra un único punto temporal con un total de cuatro mutantes en dos genes. Los mutantes se identifican por el aminoácido en una posición cambiada (es decir, EGFR T790M).

[0273] Una realización representa un gráfico de corrientes de tal manera que no refleja el eje x. El gráfico modificado aplica un escalado único para denotar atributos proporcionales. El gráfico puede indicar la adición de nuevos atributos a lo largo del tiempo. La presencia o ausencia de una mutación puede reflejarse en forma gráfica, indicando varias posiciones en el genoma y el aumento, disminución o mantenimiento correspondiente de la frecuencia de mutación en cada posición respectiva. Además, las mutaciones pueden usarse para informar de una puntuación porcentual que indique la cantidad de material patológico existente en la muestra de polinucleótidos libres de células. Cada mutación detectada puede ir acompañada de una puntuación de confianza, dadas las estadísticas conocidas de las variaciones típicas en las posiciones notificadas en secuencias de referencia no de enfermedad. Las mutaciones también pueden clasificarse por orden de abundancia en el sujeto o clasificarse por importancia clínica procesable.

[0275] El mapeado de las posiciones del genoma y la variación del número de copias para el sujeto con cáncer puede indicar que un cáncer particular es agresivo y resistente al tratamiento. El sujeto puede ser monitorizado durante un período y volver ser sometido a pruebas. Si al final del período, el perfil de variación del número de copias, por ejemplo, como se representa en un mapa de respuesta tumoral, comienza a aumentar drásticamente, esto puede indicar que el tratamiento actual no está funcionando. También puede realizarse una comparación con los perfiles genéticos de otros sujetos. Por ejemplo, si se determina que este aumento en la variación del número de copias indica que el cáncer está avanzando, entonces el régimen de tratamiento original prescrito ya no está tratando el cáncer y se prescribe un nuevo tratamiento.

[0277] Estos informes pueden enviarse y consultarse electrónicamente a través de Internet. El análisis de los datos de secuencia puede realizarse en un lugar distinto al de la ubicación del sujeto. El informe puede generarse y transmitirse a la ubicación del sujeto. A través de un ordenador conectado a Internet, el sujeto puede acceder a los informes que reflejan su carga tumoral.

[0279] A continuación, se divulgan los detalles de los procesos de pruebas genéticas ejemplares. Pasando ahora a la FIG.11A, un proceso ejemplar recibe material genético de muestras de sangre u otras muestras corporales (1102). El proceso puede comprender convertir los polinucleótidos del material genético en nucleótidos parentales etiquetados (1104). Los nucleótidos parentales etiquetados se amplifican para producir polinucleótidos de progenie amplificados (1106). Se secuencia un subconjunto de los polinucleótidos amplificados para producir lecturas de secuencia (1108), que se agrupan en familias, cada una generada a partir de un nucleótido parental etiquetado único (1110). En un locus seleccionado, el proceso puede comprender asignar a cada familia una puntuación de confianza para cada familia (1112). A continuación, se determina un consenso usando lecturas previas. Esto se hace revisando la puntuación de confianza anterior para cada familia y, si existen puntuaciones de confianza previas congruentes, se aumenta la puntuación de confianza actual (1114). Si hay puntuaciones de confianza anteriores, pero son incongruentes, en una realización la puntuación de confianza actual no se modifica (1116). En otras realizaciones, la puntuación de confianza se ajusta de una manera predeterminada para las puntuaciones de confianza anteriores incongruentes. Si es la primera vez que se detecta la familia, la puntuación de confianza actual puede reducirse, ya que puede tratarse de una lectura falsa (1118). El proceso puede comprender inferir la frecuencia de la familia en el locus en el conjunto de polinucleótidos parentales etiquetados sobre la base de la puntuación de confianza. A continuación, se generan los informes de pruebas genéticas como se ha analizado con anterioridad (1120).

[0281] Aunque en las Figuras 11A-11B se ha usado información temporal para mejorar la información para la detección de mutaciones o variaciones en el número de copias, pueden aplicarse otros métodos de consenso. En otras realizaciones, puede usarse la comparación histórica junto con otras secuencias de consenso que se mapean a una secuencia de referencia particular para detectar casos de variación genética. Las secuencias de consenso que se mapean a secuencias de referencia particulares pueden medirse y normalizarse frente a muestras de control. Las medidas de las moléculas que se mapean a secuencias de referencia pueden compararse en todo el genoma para identificar áreas del genoma en las que varía el número de copias o se pierde la heterocigosidad. Los métodos de consenso incluyen, por ejemplo, métodos lineales o no lineales de construcción de secuencias de consenso (por ejemplo, votación, promediado, estadístico, detección máxima a posteriori o máxima verosimilitud, programación dinámica, métodos bayesianos, de Markov ocultos o de máquinas de vectores de soporte, etc.) derivados de la teoría de la comunicación digital, la teoría de la información o la bioinformática. Después de que se ha determinado la cobertura de lectura de la secuencia, se aplica un algoritmo de modelización estocástica para convertir la cobertura de lectura normalizada de la secuencia de ácido nucleico para cada región de ventana en estados discretos del número de copias. En algunos casos, este algoritmo puede comprender uno o más de los siguientes: modelo de Markov oculto, programación dinámica, máquina de vectores de soporte, red bayesiana, decodificación en trellis, decodificación de Viterbi, maximización de la expectativa, metodologías de filtrado de Kalman y redes neuronales.

[0283] Como se muestra en la FIG. 11B, una comparación de la cobertura de la secuencia con una muestra de control o una secuencia de referencia puede ayudar a la normalización entre ventanas. En esta realización, los ADN libres de células se extraen y aíslan de un fluido corporal fácilmente accesible, como sangre, sudor, saliva, orina, etc. Por ejemplo, los ADN libres de células pueden extraerse usando una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, la precipitación con isopropanol y/o la purificación basada en sílice. El ADN libre de células puede extraerse de cualquier número de sujetos, como sujetos sin cáncer, sujetos con riesgo de cáncer o sujetos que se sabe que tienen cáncer (por ejemplo, a través de otros medios).

[0285] Después del paso de aislamiento/extracción, puede realizarse cualquiera de una serie de operaciones de secuenciación diferentes en la muestra de polinucleótidos libres de células. Las muestras pueden procesarse antes de la secuenciación con uno o más reactivos (por ejemplo, enzimas, identificadores únicos (por ejemplo, códigos de barras), sondas, etc.). En algunos casos, si la muestra se procesa con un identificador único, como un código de barras, las muestras o fragmentos de muestras pueden etiquetarse individualmente o en subgrupos con el identificador único. La muestra etiquetada puede usarse luego en una aplicación posterior, como una reacción de secuenciación, y las moléculas individuales pueden rastrearse hasta las moléculas parentales.

[0287] Los polinucleótidos libres de células pueden etiquetarse o hacerles un seguimiento para permitir la identificación posterior y el origen del polinucleótido particular. La asignación de un identificador a polinucleótidos individuales o subgrupos de polinucleótidos puede permitir que se asigne una identidad única a secuencias individuales o fragmentos de secuencias. Esto puede permitir la adquisición de datos de muestras individuales y no se limita a los promedios de las muestras. En algunos ejemplos, los ácidos nucleicos u otras moléculas derivadas de una sola cadena pueden compartir una etiqueta o identificador común y, por lo tanto, pueden identificarse posteriormente como derivadas de esa cadena. De manera similar, todos los fragmentos de una única cadena de ácido nucleico pueden etiquetarse con el mismo identificador o etiqueta, permitiendo de este modo la identificación posterior de los fragmentos de la cadena parental. En otros casos, pueden etiquetarse los productos de expresión génica (por ejemplo, el ARNm) para cuantificar la expresión. Puede contarse un código de barras o un código de barras en combinación con la secuencia a la que está unido. En otros casos más, los sistemas y métodos pueden usarse como control de amplificación por PCR. En tales casos, pueden etiquetarse con la misma etiqueta o identificador múltiples productos de amplificación de una reacción de PCR. Si los productos se secuencian posteriormente y muestran diferencias de secuencia, las diferencias entre productos con el mismo identificador pueden atribuirse entonces a un error de PCR. Además, las secuencias individuales pueden identificarse basándose en las características de los datos de secuencia de las propias lecturas. Por ejemplo, la detección de datos de secuencia únicos en las partes inicial (inicio) y final (parada) de las lecturas de secuenciación individuales puede usarse, sola o en combinación, con la longitud o la cantidad de pares de bases de cada lectura de secuencia para asignar identidades únicas a moléculas individuales. Los fragmentos de una sola cadena de ácido nucleico, a los que se ha asignado una identidad única, pueden permitir de este modo la identificación posterior de fragmentos de la cadena parental. Esto puede usarse junto con el efecto de cuello de botella del material genético inicial para limitar la diversidad.

[0289] Además, pueden usarse datos de secuencias únicas en las partes inicial (inicio) y final (parada) de las lecturas de secuenciación individuales y la longitud de las lecturas de secuenciación, solas o en combinación, con el uso de códigos de barras. En algunos casos, los códigos de barras pueden ser únicos, como se describe en la presente. En otros casos, los propios códigos de barras pueden no ser únicos. En este caso, el uso de códigos de barras no únicos, en combinación con los datos de secuencia en las partes inicial (inicio) y final (parada) de las lecturas de secuenciación individuales y la longitud de lectura de secuenciación, puede permitir la asignación de una identidad única a secuencias individuales. De manera similar, los fragmentos de una sola cadena de ácido nucleico a los que se ha asignado una identidad única pueden permitir de este modo la identificación posterior de fragmentos de la cadena parental.

[0291] En general, los métodos y sistemas proporcionados en la presente son útiles para la preparación de secuencias de polinucleótidos libres de células para una reacción de secuenciación de aplicación en sentido descendente. A menudo, el método de secuenciación es la secuenciación clásica de Sanger. Los métodos de secuenciación pueden incluir, pero no se limitan a: secuenciación de alto rendimiento, pirosecuenciación, secuenciación por síntesis, secuenciación de moléculas individuales, secuenciación por nanoporos, secuenciación por semiconductores, secuenciación por ligación, secuenciación por hibridación, RNA-Seq (Illumina), Expresión génica digital (Helicos), secuenciación de próxima generación, secuenciación de moléculas individuales por síntesis (SMSS) (Helicos), secuenciación masivamente paralela, Matriz de moléculas individuales clonales (Solexa), secuenciación de escopeta, secuenciación Maxim-Gilbert, caminata con cebadores y cualquier otro método de secuenciación conocido en la técnica.

[0293] Los métodos de secuenciación implican típicamente la preparación de muestras, la secuenciación de polinucleótidos en la muestra preparada para producir lecturas de secuencias y la manipulación bioinformática de las lecturas de secuencias para producir información genética cuantitativa y/o cualitativa sobre la muestra. La preparación de muestras implica típicamente la conversión de los polinucleótidos de una muestra a una forma compatible con la plataforma de secuenciación usada. Esta conversión puede implicar el etiquetado de polinucleótidos. En ciertas realizaciones de esta invención, las etiquetas comprenden etiquetas de secuencia de polinucleótidos. Las metodologías de conversión usadas en la secuenciación pueden no ser 100% eficaces. Por ejemplo, no es raro convertir polinucleótidos en una muestra con una eficacia de conversión de aproximadamente el 1 al 5%, es decir, aproximadamente del 1 al 5% de los polinucleótidos de una muestra se convierten en polinucleótidos etiquetados. Los polinucleótidos que no se convierten en moléculas etiquetadas no están representados en una biblioteca etiquetada para secuenciación. Por consiguiente, los polinucleótidos que tienen variantes genéticas representadas a baja frecuencia en el material genético inicial pueden no estar representados en la biblioteca etiquetada y, por lo tanto, pueden no secuenciarse ni detectarse. Al aumentar la eficiencia de conversión, aumenta la probabilidad de que un polinucleótido del material genético inicial esté representado en la biblioteca etiquetada y, en consecuencia, se detecte mediante secuenciación. Además, en lugar de abordar directamente el problema de la baja eficiencia de conversión de la preparación de la biblioteca, la mayoría de los protocolos actuales requieren más de 1 microgramo de ADN como material de entrada. Sin embargo, cuando el material de muestra de entrada es limitado o se desea detectar polinucleótidos con baja representación, una alta eficiencia de conversión puede secuenciar eficazmente la muestra y/o detectar adecuadamente tales polinucleótidos.

[0295] En general, la detección de mutaciones puede realizarse en regiones selectivamente enriquecidas del genoma o del transcriptoma purificado y aislado (1302). Como se describe en la presente, las regiones específicas, que pueden incluir, pero no se limitan a, genes, oncogenes, genes supresores de tumores, promotores, elementos de secuencia reguladora, regiones no codificantes, ARNmi, ARNsn y similares, pueden amplificarse selectivamente a partir de una población total de polinucleótidos libres de células. Esto puede realizarse como se describe en la presente. En un ejemplo, puede usarse secuenciación múltiplex, con o sin marcadores de código de barras para secuencias de polinucleótidos individuales. En otros ejemplos, la secuenciación puede realizarse usando cualquier plataforma de secuenciación de ácidos nucleicos conocida en la técnica. Este paso genera una pluralidad de lecturas de secuencias de fragmentos genómicos (1304). Además, se obtiene una secuencia de referencia a partir de una muestra de control, tomada de otro sujeto. En algunos casos, el sujeto de control puede ser un sujeto del que se sabe que no tiene aberraciones genéticas o enfermedades conocidas. En algunos casos, estas lecturas de secuencias pueden contener información de códigos de barras. En otros ejemplos, no se utilizan códigos de barras.

[0297] Después de la secuenciación, a las lecturas se les puede asignar una puntuación de calidad. Una puntuación de calidad puede ser una representación de las lecturas que indica si estas pueden ser útiles en análisis posteriores basados en un umbral. En algunos casos, algunas lecturas no tienen la calidad o la longitud suficientes para realizar el paso de mapeo posterior. Las lecturas de secuenciación con una puntuación de calidad de por lo menos el 90%, 95%, 99%, 99,9%, 99,99% o 99,999% pueden filtrarse del conjunto de datos. En otros casos, las lecturas de secuenciación a las que se les ha asignado una puntuación de calidad de por lo menos un 90%, 95%, 99%, 99,9%, 99,99% o 99,999% pueden filtrarse del conjunto de datos. En el paso 1306, las lecturas de fragmentos genómicos que cumplen un umbral de puntuación de calidad especificado se mapean a un genoma de referencia, o una secuencia de referencia que se sabe que no contiene mutaciones. Después de la alineación del mapeo, a las lecturas de secuencias se les asigna una puntuación de mapeo. Una puntuación de mapeo puede ser una representación o lecturas mapeadas de nuevo a la secuencia de referencia que indican si cada posición es o no asignable de manera única. En algunos casos, las lecturas pueden ser secuencias no relacionadas con el análisis de mutaciones. Por ejemplo, algunas lecturas de secuencias pueden provenir de polinucleótidos contaminantes. Las lecturas de secuenciación con una puntuación de mapeo de por lo menos un 90%, 95%, 99%, 99,9%, 99,99% o 99,999% pueden filtrarse del conjunto de datos. En otros casos, pueden filtrarse del conjunto de datos las lecturas de secuenciación a las que se les ha asignado una puntuación de mapeo de menos del 90%, 95%, 99%, 99,9%, 99,99% o 99,999%.

[0299] Para cada base mapeable, las bases que no cumplan el umbral mínimo de mapeabilidad, o las bases de baja calidad, pueden sustituirse por las bases correspondientes que se encuentran en la secuencia de referencia.

[0301] La frecuencia de las bases variantes puede calcularse como el número de lecturas que contienen la variante dividido por el número total de lecturas 1308 después de determinar la cobertura de lectura e identificar las bases variantes con respecto a la secuencia de control en cada lectura. Esto puede expresarse como una proporción para cada posición mapeable en el genoma.

[0302] Para cada posición base, pueden analizarse las frecuencias de los cuatro nucleótidos, citosina, guanina, timina y adenina en comparación con la secuencia de referencia. Para convertir las relaciones normalizadas de cada posición mapeable puede aplicarse un algoritmo de modelado estocástico o estadístico con el fin de reflejar los estados de frecuencia de cada variante de base. En algunos casos, este algoritmo puede comprender uno o varios de los siguientes: modelo oculto de Markov, programación dinámica, máquina de vectores de soporte, modelado bayesiano o probabilístico, decodificación en trellis, decodificación de Viterbi, maximización de la expectativa, metodologías de filtrado de Kalman y redes neuronales.

[0303] Pueden usarse los estados de mutación discretos de cada posición de base para identificar una variante de base con una alta frecuencia de variación en comparación con el valor de referencia de la secuencia de referencia. En algunos casos, el valor de referencia puede representar una frecuencia de por lo menos un 0,0001%, 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1,0%, 2,0%, 3,0%, 4,0%, 5,0%, 10% o 25%. En otros casos, el valor de referencia puede representar una frecuencia de por lo menos un 0,0001%, 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1,0%, 2,0%, 3,0%, 4,0%, 5,0%, 10% o 25%. En algunos casos, todas las posiciones de bases adyacentes con la variante o mutación de base pueden fusionarse en un segmento para notificar la presencia o ausencia de una mutación. En algunos casos, pueden filtrarse varias posiciones antes de fusionarlas con otros segmentos.

[0304] Después del cálculo de las frecuencias de variancia para cada posición de base, la variante con mayor desviación para una posición específica en la secuencia derivada del sujeto en comparación con la secuencia de referencia puede identificarse como una mutación. En algunos casos, una mutación puede ser una mutación cancerosa. En otros casos, una mutación podría estar correlacionada con un estado de enfermedad.

[0305] Una mutación o variante puede comprender una aberración genética que incluye, pero no se limita a, una sustitución de una sola base, o indeles, transversiones, translocaciones, inversiones, deleciones, truncamientos o truncamientos génicos pequeños. En algunos casos, una mutación puede tener una longitud de como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 nucleótidos. En otros casos, una mutación puede tener como mínimo una longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 nucleótidos.

[0306] A continuación, se determina un consenso usando lecturas previas. Esto se hace revisando la puntuación de confianza previa para las bases correspondientes y, si existen puntuaciones de confianza previas consistentes, se aumenta la puntuación de confianza actual (1314). Si hay puntuaciones de confianza previas, pero son inconsistentes, en una realización la puntuación de confianza actual no se modifica (1316). En otras realizaciones, la puntuación de confianza se ajusta de una manera predeterminada para las puntuaciones de confianza previas inconsistentes. Si es la primera vez que se detecta la familia, la puntuación de confianza actual puede reducirse, ya que puede tratarse de una lectura falsa (1318). El proceso puede comprender convertir luego la frecuencia de la varianza por cada base en estados variantes discretos para cada posición de base (1320).

[0307] Usando los métodos y sistemas descritos en la presente pueden detectarse numerosos tipos de cáncer. Las células cancerosas, como la mayoría de las células, pueden caracterizarse por una tasa de recambio, en la que las células viejas mueren y son sustituidas por células más nuevas. Por lo general, las células muertas, en contacto con la vasculatura de un sujeto dado, pueden liberar ADN o fragmentos de ADN al torrente sanguíneo. Esto también es válido para las células cancerosas durante las varias etapas de la enfermedad. Las células cancerosas también pueden caracterizarse, dependiendo de la etapa de la enfermedad, por varias aberraciones genéticas, como la variación del número de copias así como las mutaciones. Este fenómeno puede usarse para detectar la presencia o ausencia de cánceres individuales usando los métodos y sistemas descritos en la presente.

[0308] Por ejemplo, puede extraerse sangre de sujetos con riesgo de cáncer y prepararla como se describe en la presente para generar una población de polinucleótidos libres de células. En un ejemplo, esto podría ser ADN libre de células. Los sistemas y métodos de la divulgación pueden emplearse para detectar mutaciones o variaciones en el número de copias que pueden existir en ciertos cánceres presentes. El método puede ayudar a detectar la presencia de células cancerosas en el organismo, a pesar de la ausencia de síntomas u otras características distintivas de la enfermedad.

[0309] Los tipos y la cantidad de cánceres que pueden detectarse pueden incluir, pero no se limitan a, cánceres de sangre, cánceres de cerebro, cánceres de pulmón, cánceres de piel, cánceres de nariz, cánceres de garganta, cánceres de hígado, cánceres de huesos, linfomas, cánceres de páncreas, cánceres de piel, cánceres de intestino, cánceres de recto, cánceres de tiroides, cánceres de vejiga, cánceres de riñón, cánceres de boca, cánceres de estómago, tumores de estado sólido, tumores heterogéneos, tumores homogéneos y similares.

[0310] El sistema y los métodos pueden usarse para detectar cualquier cantidad de aberraciones genéticas que puedan provocar o ser consecuencia de cánceres. Estas pueden incluir, pero no se limitan a, mutaciones, indeles, variaciones en el número de copias, transversiones, translocaciones, inversiones, deleciones, aneuploidía, aneuploidía parcial, poliploidía, inestabilidad cromosómica, alteraciones de la estructura cromosómica, fusiones génicas, fusiones cromosómicas, truncamientos génicos, amplificación génica, duplicaciones génicas, lesiones cromosómicas, lesiones de ADN, cambios anormales en las modificaciones químicas del ácido nucleico, cambios anormales en los patrones epigenéticos, cambios anormales en la metilación del ácido nucleico, infección y cáncer.

[0312] Además, los sistemas y métodos descritos en la presente también pueden usarse para ayudar a caracterizar ciertos cánceres. Los datos genéticos producidos a partir del sistema y los métodos de esta divulgación pueden permitir a los profesionales ayudar a caracterizar mejor una forma específica de cáncer. A menudo, los cánceres son heterogéneos tanto en su composición como en su estadificación. Los datos del perfil genético pueden permitir la caracterización de subtipos específicos de cáncer que pueden ser importantes en el diagnóstico o el tratamiento de ese subtipo específico. Esta información también puede proporcionar al sujeto o al profesional pistas referentes al pronóstico de un tipo específico de cáncer.

[0314] [00169] Los sistemas y métodos proporcionados en la presente pueden usarse para monitorizar cánceres ya conocidos u otras enfermedades en un sujeto particular. Esto puede permitir al sujeto o al profesional adaptar las opciones de tratamiento de acuerdo con la evolución de la enfermedad. En este ejemplo, los sistemas y métodos descritos en la presente pueden usarse para construir perfiles genéticos de un sujeto particular del curso de la enfermedad. En algunos casos, los cánceres pueden progresar, volviéndose más agresivos y genéticamente inestables. En otros ejemplos, los cánceres pueden permanecer benignos, inactivos o latentes. El sistema y los métodos de esta divulgación pueden ser útiles para determinar la progresión de la enfermedad.

[0316] Además, los sistemas y métodos descritos en la presente pueden ser útiles para determinar la eficacia de una opción de tratamiento particular. En un ejemplo, las opciones de tratamiento con éxito pueden aumentar la cantidad de variaciones en el número de copias o mutaciones detectadas en la sangre del sujeto si el tratamiento tiene éxito, ya que pueden morir más cánceres y desprender ADN. En otros ejemplos, esto puede no producirse. En otro ejemplo, es posible que ciertas opciones de tratamiento puedan correlacionarse con los perfiles genéticos de los cánceres a lo largo del tiempo. Esta correlación puede ser útil para seleccionar una terapia. Además, si se observa que un cáncer está en remisión después del tratamiento, los sistemas y métodos descritos en la presente pueden ser útiles para monitorizar la enfermedad residual o la recurrencia de la enfermedad.

[0318] Varias otras enfermedades e infecciones pueden dar como resultado otros tipos de afecciones que pueden ser adecuadas para la detección precoz y la monitorización. Por ejemplo, en ciertos casos, los trastornos genéticos o las enfermedades infecciosas pueden provocar un cierto mosaicismo genético en un sujeto. Este mosaicismo genético puede provocar variaciones en el número de copias y mutaciones que podrían observarse. También pueden monitorizarse los genomas de las células inmunitarias del organismo. Las células inmunitarias, como las células B, pueden experimentar una rápida expansión clonal ante la presencia de ciertas enfermedades. Las expansiones clonales pueden monitorizarse usando la detección de variaciones en el número de copias y pueden monitorizarse ciertos estados inmunitarios. En este ejemplo, el análisis de la variación en el número de copias puede realizarse a lo largo del tiempo para elaborar un perfil de cómo está progresando una enfermedad particular.

[0320] También pueden monitorizarse infecciones sistémicas, ya que pueden estar provocadas por un patógeno, como una bacteria o un virus. La variación del número de copias o incluso la detección de mutaciones pueden usarse para determinar cómo está cambiando una población de patógenos durante el curso de la infección. Esto puede ser particularmente importante en el caso de infecciones crónicas, como infección por el VIH/SIDA o la hepatitis, en las que los virus pueden cambiar su estado ciclo de vida y/o mutar a formas más virulentas durante el curso de la infección.

[0322] Otro ejemplo más es la monitorización de sujetos trasplantados. Por lo general, el tejido trasplantado experimenta un cierto grado de rechazo por parte del organismo tras el trasplante. Pueden determinarse o realizarse perfiles de las actividades de rechazo del organismo huésped, ya que las células inmunitarias intentan destruir el tejido trasplantado. Esto puede ser útil para monitorizar el estado del tejido trasplantado, así como para alterar el curso del tratamiento o la prevención del rechazo.

[0324] Además, los métodos de la divulgación pueden usarse para caracterizar la heterogeneidad de una condición anormal en un sujeto, el método comprendiendo generar un perfil genético de polinucleótidos extracelulares en el sujeto, en donde el perfil genético comprende una pluralidad de datos resultantes de análisis de variación del número de copias y mutaciones. En algunos casos, que incluyen pero no se limitan al cáncer, una enfermedad puede ser heterogénea. Las células de la enfermedad pueden no ser idénticas. En el ejemplo del cáncer, se sabe que algunos tumores comprenden diferentes tipos de células tumorales, algunas de ellas en diferentes estadios del cáncer. En otros ejemplos, la heterogeneidad puede comprender múltiples focos de enfermedad. De nuevo, en el ejemplo del cáncer, puede haber múltiples focos tumorales, quizás cuando uno o más focos son el resultado de metástasis que se han extendido desde un sitio primario.

[0326] Los métodos de esta divulgación pueden usarse para generar o realizar perfiles, tomar huellas dactilares o crear un conjunto de datos que sea una suma de la información genética derivada de diferentes células en una enfermedad heterogénea. Este conjunto de datos puede comprender análisis de variación del número de copias y mutaciones, solos o en combinación.

[0327] Además, pueden diagnosticarse, pronosticarse, monitorizarse u observarse cánceres u otras enfermedades de origen fetal. Es decir, estas metodologías pueden emplearse en una mujer embarazada para diagnosticar, pronosticar, monitorizar u observar cánceres u otras enfermedades en un feto cuyo ADN y otros polinucleótidos pueden circular conjuntamente con moléculas maternas.

[0329] Además, estos informes se envían y se consultan electrónicamente a través de Internet. El análisis de los datos de secuencia se produce en un lugar distinto al de la persona. El informe se genera y se transmite a la ubicación del sujeto. A través de un ordenador conectado a Internet, el sujeto accede a los informes que reflejan su carga tumoral.

[0331] La información anotada puede ser usada por un proveedor de atención médica para seleccionar otras opciones de tratamiento farmacéutico y/o proporcionar información sobre las opciones de tratamiento farmacéutico a una compañía de seguros. El método puede incluir anotar las opciones de tratamiento farmacéutico para una afección en, por ejemplo, las Guías de práctica clínica en oncología de la NCCN™ o las guías de práctica clínica de la Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO).

[0333] Las opciones de tratamiento farmacéutico que se estratifican en un informe pueden anotarse en el informe enumerando opciones adicionales de tratamiento farmacéutico. Un tratamiento farmacéutico adicional puede ser un fármaco aprobado por la FDA para un uso no indicado en el prospecto. Una disposición de la Ley Ómnibus de Reconciliación Presupuestaria (Omnibus Budget Reconciliation Act, OBRA) de 1993 exige que Medicare cubra los usos no indicados en el prospecto de los fármacos contra el cáncer que se incluyen en los compendios médicos estándar. Los fármacos usados para anotar las listas pueden encontrarse en los compendios aprobados por los CMS, que incluyen el Compendio de Medicamentos y Productos Biológicos de la Red Nacional Integral del Cáncer (NCCN)™, Thomson Micromedex DrugDex®, el compendio de Farmacología Clínica de Elsevier Gold Standard y el Compendio de Información sobre Medicamentos del Servicio de Formulario Hospitalario Americano® (American Hospital Formulary Service-Drug Information Compendium®).

[0335] Las opciones de tratamiento farmacéutico pueden anotarse enumerando un fármaco experimental que pueda ser útil para tratar un cáncer con uno o más marcadores moleculares de un estado particular. El fármaco experimental puede ser un fármaco para el que se disponga de datos in vitro, datos in vivo, datos de modelos animales, datos de ensayos preclínicos o datos de ensayos clínicos. Los datos pueden publicarse en bibliografía médica revisada por pares que se encuentre en revistas incluidas en el Manual de políticas de beneficios de Medicare del CMS, que incluyen, por ejemplo, American Journal of Medicine, Annals of Internal Medicine, Annals of Oncology, Annals of Surgical Oncology, Biology of Blood and Marrow Transplantation, Blood, Bone Marrow Transplantation, British Journal of Cancer, British Journal of Hematology, British Medical Journal, Cancer, Clinical Cancer Research, Drugs, European Journal of Cancer (anteriormente European Journal of Cancer and Clinical Oncology), Gynecologic Oncology, International Journal of Radiation, Oncology, Biology, and Physics, The Journal of the American Medical Association, Journal of Clinical Oncology, Journal of the National Cancer Institute, Journal of the National Comprehensive Cancer Network (NCCN), Journal of Urology, Lancet, Lancet Oncology, Leukemia, The New England Journal of Medicine, y Radiation Oncology.

[0337] Las opciones de tratamiento farmacéutico pueden anotarse proporcionando un enlace en un informe electrónico que conecte un fármaco de la lista con información científica referente al fármaco. Por ejemplo, puede proporcionarse un enlace a información referente a un ensayo clínico de un fármaco (clinicaltrials.gov). Si el informe se proporciona a través de un ordenador o un sitio web, el enlace puede ser una nota al pie, un hipervínculo a un sitio web, un cuadro emergente o un cuadro flotante con información, etc. El informe y la información anotada pueden proporcionarse en un formulario impreso, y las anotaciones pueden ser, por ejemplo, una nota al pie de una referencia.

[0339] La información para anotar una o más opciones de tratamiento farmacéutico en un informe puede ser proporcionada por una entidad comercial que almacene información científica. Un proveedor de atención médica puede tratar a un sujeto, como un paciente con cáncer, con un fármaco experimental enumerado en la información anotada, y el proveedor de atención médica puede acceder a la opción de tratamiento farmacéutico anotada, recuperar la información científica (por ejemplo, imprimir un artículo de una revista médica) y enviarla (por ejemplo, un artículo de revista impreso) a una compañía de seguros junto con una solicitud de reembolso por proporcionar el tratamiento farmacéutico. Los médicos pueden usar cualquiera de los códigos del grupo relacionado con el diagnóstico (DRG) para habilitar el reembolso.

[0341] Una opción de tratamiento farmacéutico en un informe también puede anotarse con información referente a otros componentes moleculares de una vía a la que afecta un fármaco (por ejemplo, información sobre un fármaco que se dirige a una quinasa situada en sentido descendente de un receptor de la superficie celular que es una diana farmacéutica). La opción de tratamiento farmacéutico puede anotarse con información sobre fármacos que se dirigen a uno o más componentes de la vía molecular. La identificación y/o anotación de la información relacionada con las vías puede externalizarse o subcontratarse a otra empresa.

[0342] La información anotada puede ser, por ejemplo, el nombre de un fármaco (por ejemplo, un fármaco aprobado por la FDA para uso no indicado en el prospecto; un fármaco que se encuentra en un compendio aprobado por los CMS, y/o un fármaco descrito en un artículo de una revista científica (médica)), información científica relativa a una o más opciones de tratamiento farmacéutico, uno o más enlaces a información científica referente a uno o más fármacos, información sobre ensayos clínicos referentes a uno o más fármacos (por ejemplo, información de clinicaltrials.gov/), uno o más enlaces a citas de información científica relativa a fármacos, etc.

[0344] La información anotada puede insertarse en cualquier lugar en un informe. La información anotada puede insertarse en varios lugares del informe. La información anotada puede insertarse en un informe cerca de una sección sobre opciones de tratamiento farmacéutico estratificado. La información anotada puede insertarse en un informe en una página separada de las opciones de tratamiento farmacéutico estratificado. Un informe que no contenga opciones de tratamiento farmacéutico estratificado puede anotarse con información.

[0346] El sistema también puede incluir informes sobre los efectos de los fármacos en una muestra (por ejemplo, células tumorales) aisladas de un sujeto (por ejemplo, un paciente con cáncer). Un cultivo in vitro usando un tumor de un paciente con cáncer puede establecerse usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. El sistema también puede incluir el cribado de alto rendimiento de fármacos aprobados por la FDA para uso no indicado en el prospecto o fármacos experimentales que usen dicho cultivo in vitro y/o modelo de xenoinjerto. El sistema también puede incluir la monitorización del antígeno tumoral para la detección de recurrencias.

[0348] El sistema puede proporcionar acceso a través de Internet a los informes de un sujeto con cáncer. El sistema puede usar un secuenciador de ADN de mano o un secuenciador de ADN de sobremesa. El secuenciador de ADN es un instrumento científico usado para automatizar el proceso de secuenciación del ADN. A partir de una muestra de ADN, un secuenciador de ADN se usa para determinar el orden de las cuatro bases: adenina, guanina, citosina y timina. El orden de las bases del ADN se informa como una cadena de texto, denominada lectura. Algunos secuenciadores de ADN también pueden considerarse instrumentos ópticos, ya que analizan señales luminosas procedentes de fluorocromos unidos a nucleótidos.

[0350] Los datos son enviados por los secuenciadores de ADN a través de una conexión directa o por Internet a un ordenador para su procesamiento. Los aspectos de procesamiento de datos del sistema pueden implementarse en circuitos electrónicos digitales, o en hardware, firmware, software o combinaciones de los mismos. El aparato de procesamiento de datos de la invención puede implementarse en un producto de programa informático incorporado de manera tangible en un dispositivo de almacenamiento legible por máquina para su ejecución por un procesador programable; y los pasos del método de procesamiento de datos de la invención pueden ser realizados por un procesador programable que ejecute un programa de instrucciones para realizar las funciones de la invención operando sobre los datos de entrada y generando la salida. Los aspectos de procesamiento de datos de la invención pueden implementarse ventajosamente en uno o más programas informáticos que sean ejecutables en un sistema programable que incluya por lo menos un procesador programable conectado para recibir datos e instrucciones de y para transmitir datos e instrucciones a un sistema de almacenamiento de datos, por lo menos un dispositivo de entrada y por lo menos un dispositivo de salida. Cada programa informático puede implementarse en un lenguaje de programación de alto nivel procedimental u orientado a objetos, o en lenguaje ensamblador o máquina, si se desea; y, en cualquier caso, el lenguaje puede ser un lenguaje compilado o interpretado. Los procesadores adecuados incluyen, a modo de ejemplo, microprocesadores tanto de uso general como de uso específico. En general, un procesador recibirá instrucciones y datos de una memoria de solo lectura y/o una memoria de acceso aleatorio. Los dispositivos de almacenamiento adecuados para incorporar de manera tangible las instrucciones y los datos de los programas informáticos incluyen todas las formas de memoria no volátil, que incluyen, a modo de ejemplo, dispositivos de memoria semiconductora, como EPROM, EEPROM y dispositivos de memoria flash; discos magnéticos, como discos duros internos y discos extraíbles; discos magnetoópticos; y discos CD-ROM. Cualquiera de los anteriores puede suplementarse o incorporarse en ASIC (circuitos integrados de aplicación específica).

[0352] Para permitir la interacción con un usuario, la invención puede implementarse usando un sistema informático que tenga un dispositivo de visualización, como un monitor o una pantalla LCD (pantalla de cristal líquido), para mostrar información al usuario, y dispositivos de entrada mediante los cuales el usuario pueda introducir datos en el sistema informático como un teclado, un dispositivo de señalización bidimensional, como un ratón o un trackball, o un dispositivo de señalización tridimensional, como un guante de datos o un ratón giroscópico. El sistema informático puede programarse para proporcionar una interfaz gráfica de usuario a través de la cual los programas informáticos interactúan con los usuarios. El sistema informático puede programarse para proporcionar una interfaz de visualización tridimensional de realidad virtual.

[0354] Intervención terapéutica

[0356] Los métodos de esta divulgación permiten proporcionar intervenciones terapéuticas dirigidas con mayor precisión a la forma de una enfermedad en un sujeto y calibrar estas intervenciones terapéuticas a lo largo del tiempo. Esta precisión refleja, en parte, la precisión con la que puede perfilarse el estado tumoral de todo el cuerpo de un sujeto, como se refleja en la heterogeneidad tumoral. Por tanto, la intervención terapéutica es más eficaz contra los cánceres con este perfil que contra los cánceres con cualquiera de estas variantes por separado.

[0357] Una intervención terapéutica es una intervención que produce un efecto terapéutico (es decir, es terapéuticamente eficaz). Las intervenciones terapéuticamente eficaces previenen, ralentizan la progresión, mejoran el estado (por ejemplo, provocan la remisión) o curan una enfermedad, como un cáncer. Una intervención terapéutica puede incluir, por ejemplo, la administración de un tratamiento, como quimioterapia, radioterapia, cirugía, inmunoterapia, administración de un producto farmacéutico o un nutracéutico, o un cambio en el comportamiento, como la dieta. Una medida de la eficacia terapéutica es la eficacia en por lo menos el 90% de los sujetos sometidos a la intervención entre por lo menos 100 sujetos.

[0358] Las dianas farmacéuticas en el cáncer y los fármacos eficaces contra estas dianas se exponen en las Tablas 1 y 2 (tomadas de Bailey et al., Discovery Medicine, v.18 Nº92, 2/7/14).

[0361]

[0362] (continuación)

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[0364]

[0365] (continuación)

[0366]

[0367] (continuación)

[0369]

[0372] En una realización, sobre la base del perfil de heterogeneidad de la enfermedad, se determina una intervención terapéutica que tiene en cuenta tanto el tipo de variantes genéticas encontradas en las células de la enfermedad como sus cantidades relativas (por ejemplo, la proporción). La intervención terapéutica puede tratar al sujeto como si cada variante clonal fuese un cáncer diferente que debe tratarse independientemente. En algunos casos, cuando se detectan una o más variantes genéticas en cantidades menores que las subclínicas, por ejemplo, por lo menos 5 veces menores, por lo menos 10 veces menores o por lo menos 100 veces menores a los clones dominantes detectados, estas variantes pueden quedar fuera de la intervención terapéutica hasta que alcancen un umbral clínico o una frecuencia relativa significativa (por ejemplo, superior al umbral indicado anteriormente).

[0374] Cuando se encuentra una pluralidad de variantes genéticas diferentes en cantidades diferentes, por ejemplo, números diferentes o cantidades relativas diferentes, una intervención terapéutica puede incluir tratamientos eficaces contra enfermedades con cada una de las variantes genéticas. Por ejemplo, en el caso del cáncer, las variantes genéticas, como las formas mutantes de un gen o la amplificación de un gen, pueden detectarse en varios genes (por ejemplo, un clon principal y un clon secundario). Cada una de estas formas puede tener implicación terapéutica, es decir, puede conocerse un tratamiento al que respondan los cánceres con la variante particular. Sin embargo, el perfil de heterogeneidad tumoral puede indicar que una de las variantes está presente en los polinucleótidos, por ejemplo, a un nivel cinco veces superior al de cada una de las otras dos variantes. Puede determinarse una intervención terapéutica que implique la administración de tres fármacos diferentes al sujeto, cada fármaco es relativamente más eficaz contra los cánceres que portan cada una de las variantes. Los fármacos pueden administrarse como un cóctel o de manera secuencial.

[0376] En una realización adicional, los fármacos pueden administrarse en dosis estratificadas para reflejar las cantidades relativas de las variantes en el ADN. Por ejemplo, un fármaco eficaz contra la variante más común puede administrarse en mayor cantidad que los fármacos eficaces contra las dos variantes menos comunes.

[0378] Alternativamente, el perfil de heterogeneidad tumoral puede mostrar la presencia de una subpoblación de células cancerosas que portan una variante genética que sea resistente a un fármaco al que típicamente responde la enfermedad. En este caso, la intervención terapéutica puede implicar incluir tanto un primer fármaco eficaz contra las células tumorales sin la variante resistente como un segundo fármaco eficaz contra las células tumorales con la variante resistente. De nuevo, las dosis pueden estratificarse para reflejar las cantidades relativas de cada variante detectada en el perfil.

[0380] En otra realización, se examinan los cambios en el perfil de heterogeneidad tumoral a lo largo del tiempo y se desarrollan intervenciones terapéuticas para tratar el tumor cambiante. Por ejemplo, la heterogeneidad de la enfermedad puede determinarse en una pluralidad de momentos diferentes. Usando los métodos de realización de perfiles de esta divulgación, pueden elaborarse inferencias más precisas sobre la evolución del tumor. Esto permite al profesional monitorizar la evolución de la enfermedad, en particular a medida que surgen nuevas subpoblaciones clonales después de la remisión llevada a cabo por una primera línea de terapia. En este caso, las intervenciones terapéuticas pueden calibrarse a lo largo del tiempo para tratar el tumor cambiante. Por ejemplo, un perfil puede mostrar que un cáncer tiene una forma que responde a cierto tratamiento. Se administra el tratamiento y se observa que la carga tumoral disminuye a lo largo del tiempo. En algún momento, se encuentra una variante genética en el tumor que indica la presencia de una población de células cancerosas que no responde al tratamiento. Se determina una nueva intervención terapéutica que se dirige a las células que portan el marcador de no respuesta.

[0382] En respuesta a la quimioterapia, una forma tumoral dominante puede acabar cediendo mediante selección darwiniana a las células cancerosas portadoras de mutantes que hacen que el cáncer no responda al régimen terapéutico. La aparición de estos mutantes resistentes puede retrasarse mediante los métodos de esta divulgación. En una realización de este método, un sujeto se somete a uno o más ciclos de terapia pulsada, cada ciclo de terapia pulsada comprendiendo un primer período durante el cual se administra un fármaco en una primera cantidad y un segundo ciclo durante el cual se administra el fármaco en una segunda cantidad reducida. El primer período se caracteriza por una carga tumoral detectada por encima de un primer nivel clínico. El segundo periodo se caracteriza por una carga tumoral detectada por debajo de un segundo nivel clínico. El primer y el segundo niveles clínicos pueden ser diferentes en distintos ciclos de terapia pulsada. Así, por ejemplo, el primer nivel clínico puede ser más bajo en ciclos sucesivos. Una pluralidad de ciclos puede incluir por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más ciclos. Por ejemplo, el mutante V600E de BRAF puede detectarse en polinucleótidos de células de enfermedad en una cantidad que indique una carga tumoral del 5% en el ADNcf. La quimioterapia puede comenzar con dabrafenib. Las pruebas posteriores pueden mostrar que la cantidad del mutante de BRAF en el ADNcf cae por debajo del 0,5% o hasta niveles indetectables. En este punto, la terapia con dabrafenib puede detenerse o reducirse significativamente. Pruebas posteriores adicionales pueden descubrir que el ADN que porta la mutación BRAF ha aumentado al 2,5% de los polinucleótidos en el ADNcf. En ese punto, se reanuda la terapia con dabrafenib, por ejemplo, al mismo nivel que el tratamiento inicial. Las pruebas posteriores pueden descubrir que el ADN portador de la mutación de BRAF ha disminuido hasta el 0,5% de los polinucleótidos en el ADNcf. De nuevo, se interrumpe o se reduce la terapia con dabrafenib. El ciclo puede repetirse varias veces.

[0384] La Figura 7 muestra un curso ejemplar de la monitorización y el tratamiento de la enfermedad en un sujeto. Un sujeto sometido a pruebas en el momento de la primera extracción de sangre tiene una carga tumoral del 1,4% y presenta alteraciones genéticas en los genes 1, 2 y 3. El sujeto se trata con el fármaco A. Después de un tiempo, se interrumpe el tratamiento. En un segundo momento posterior, una segunda extracción de sangre muestra que el cáncer está en remisión. En un tercer momento posterior, una tercera extracción de sangre indica que el cáncer ha reaparecido, en este caso, presentando una variante genética en el gen 4. El sujeto ahora recibe un tratamiento con el fármaco B, al que responden los cánceres que tienen esta variante.

[0386] En otra realización, la intervención terapéutica puede modificarse tras la detección del aumento de una forma mutante resistente al fármaco original. Por ejemplo, los cánceres con la mutación L858R del EGFR responden a la terapia con erlotinib. Sin embargo, los cánceres con la mutación T790M del EGFR son resistentes al erlotinib. Sin embargo, responden al ruxolitinib. Un método de esta divulgación implica monitorizar los cambios en el perfil tumoral y cambiar una intervención terapéutica cuando una variante genética asociada a la resistencia a los fármacos alcanza un nivel clínico predeterminado.

[0388] Base de datos

[0389] Puede construirse una base de datos como se define en las reivindicaciones en la que se registre la información genética de muestras en serie recogidas de pacientes con cáncer. Esta base de datos también puede contener información sobre tratamientos intermedios y otra información clínicamente relevante, como el peso, los efectos adversos, las pruebas histológicas, los análisis de sangre, la información radiográfica, los tratamientos previos, el tipo de cáncer, etc. Los resultados de las pruebas en serie pueden usarse para inferir la eficacia del tratamiento, especialmente cuando se usan con muestras de sangre, que pueden proporcionar una estimación más imparcial de la carga tumoral que los informes propios o los informes radiográficos de un profesional médico. La eficacia del tratamiento puede agruparse por aquellos con perfiles genómicos similares y viceversa. Los perfiles genómicos pueden organizarse en torno a, por ejemplo, la alteración genética primaria, la alteración o las alteraciones genéticas secundarias, las cantidades relativas de estas alteraciones genéticas y la carga tumoral. Esta base de datos puede usarse como apoyo para la toma de decisiones en pacientes posteriores. Para determinar la eficacia del tratamiento pueden usarse tanto las alteraciones germinales como las somáticas. Cuando los tratamientos que eran eficaces inicialmente comienzan a fallar también pueden inferirse de la base de datos las alteraciones de resistencia adquirida. Este fracaso puede detectarse mediante radiografías, análisis de sangre u otros medios. Los datos primarios usados para la inferencia de los mecanismos de resistencia adquirida son los perfiles genómicos tumorales recopilados después del tratamiento por paciente. Estos datos también pueden usarse para establecer límites cuantitativos sobre la posible respuesta al tratamiento, así como para predecir el tiempo hasta el fracaso del tratamiento. Sobre la base de las posibles alteraciones de resistencia adquirida para un tratamiento dado y el perfil genómico del tumor, puede modificarse el régimen de tratamiento para suprimir la adquisición de las alteraciones de resistencia más probables.

[0391] Sistemas informáticos

[0393] Los métodos de la presente divulgación pueden implementarse usando, o con la ayuda de, sistemas informáticos. La FIG. 5 muestra un sistema informático 1501 que está programado o configurado de otro modo para implementar los métodos de la presente divulgación. El sistema informático 1501 incluye una unidad central de procesamiento (CPU, también denominada 'procesador' y 'procesador informático' en la presente) 1505. El sistema informático 1501 también incluye una memoria o ubicación de memoria 1510 (por ejemplo, memoria de acceso aleatorio, memoria de solo lectura, memoria flash), unidad de almacenamiento electrónico 1515 (por ejemplo, disco duro), interfaz de comunicaciones 1520 (por ejemplo, adaptador de red) para comunicarse con uno o más sistemas, y dispositivos periféricos 1525, como caché, otra memoria, almacenamiento de datos y/o adaptadores de pantalla electrónica. La memoria 1510, la unidad de almacenamiento 1515, la interfaz 1520 y los dispositivos periféricos 1525 están comunicados con la CPU 1505 a través de un bus de comunicación (líneas continuas). La unidad de almacenamiento 1515 puede ser una unidad de almacenamiento de datos (o repositorio de datos) para almacenar datos. El sistema informático 1501 puede estar conectado operativamente a una red informática ('red') 1530 con la ayuda de la interfaz de comunicaciones 1520. La red 1530 puede ser Internet, una intranet y/o extranet, o una intranet y/o extranet que esté en comunicación con Internet. La red 1530, en algunos casos, es una red de telecomunicaciones y/o de datos. La red 1530 puede incluir uno o más servidores informáticos, que pueden permitir la computación distribuida, como la computación en la nube. La CPU 1505 puede ejecutar una secuencia de instrucciones legibles por máquina, que pueden estar incorporadas en un programa o software. Las instrucciones pueden almacenarse en una ubicación de memoria, como la memoria 1510. La unidad de almacenamiento 1515 puede almacenar archivos, como controladores, bibliotecas y programas guardados. El sistema informático 1501 puede comunicarse con uno o más sistemas informáticos remotos a través de la red 1530. Los métodos descritos en la presente pueden implementarse mediante código ejecutable por máquina (por ejemplo, un procesador informático) almacenado en una ubicación de almacenamiento electrónico del sistema informático 1501 como, por ejemplo, en la memoria 1510 o en la unidad de almacenamiento electrónico 1515. El código ejecutable o legible por máquina puede proporcionarse en forma de software. Los aspectos de los sistemas y métodos proporcionados en la presente, como el sistema informático 1501, pueden materializarse en la programación. Varios aspectos de la tecnología pueden considerarse 'productos' o 'artículos de fabricación', normalmente en forma de código ejecutable por máquina (o procesador) y/o datos asociados que se transportan o incorporan en un tipo de medio legible por máquina. El código ejecutable por máquina puede almacenarse en una unidad de almacenamiento electrónico, como una memoria (por ejemplo, memoria de solo lectura, memoria de acceso aleatorio, memoria flash) o un disco duro. Los medios de 'almacenamiento' pueden incluir cualquiera o todos los tipos de memoria tangible de los ordenadores, procesadores o similares, o módulos asociados a los mismos, como varias memorias semiconductoras, unidades de cinta, unidades de disco y similares, que pueden proporcionar almacenamiento no transitorio en cualquier momento para la programación del software. Todo o parte del software puede comunicarse en ocasiones a través de Internet o de otras redes de telecomunicaciones. El sistema informático 1501 puede incluir o estar en comunicación con una pantalla electrónica que comprenda una interfaz de usuario (UI) para proporcionar, por ejemplo, uno o más resultados del análisis de muestras.

[0395] EJEMPLOS

[0397] Las posiciones de los nucleótidos (por ejemplo, los loci) en el genoma pueden designarse por números, como se representa en la Figura 2. Se deduce que las posiciones en las que aproximadamente el 100% de las llamadas de bases son idénticas a la secuencia de referencia o en las que aproximadamente el 100% de las llamadas de bases son diferentes a la secuencia de referencia representan la homocigosidad del ADNcf (que se presume normal). Las posiciones en las que aproximadamente el 50% de las llamadas de bases son idénticas a la secuencia de referencia se infieren como representativas de la heterocigosidad del ADNcf (también presuntamente normal). Las posiciones en las que el porcentaje de llamadas de bases en un locus se encuentra sustancialmente por debajo del 50% y por encima del límite de detección del sistema de llamada de bases se infieren como representativas de variantes genéticas asociadas a tumores.

[0398] Ejemplo 1. Métodos paraladetección de variaciones en el número de copias

[0399] Extracción de sangre

[0400] Se recogen muestras de sangre de 10-30 ml a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugan para eliminar las células. El plasma se recoge después de la centrifugación.

[0401] Extracción de ADNcf

[0402] La muestra se somete a digestión con proteinasa K. El ADN se precipita con isopropanol. El ADN se captura en una columna de purificación de ADN (por ejemplo, un QIAamp DNA Blood Mini Kit) y se eluye en 100 µl de solución. Los ADN por debajo de 500 bp se seleccionan con captura magnética de perlas Ampure SPRI (PEG/sal). La producción resultante se suspende en 30 µl de H<2>O. Se comprueba la distribución del tamaño (pico principal = 166 nucleótidos; pico secundario = 330 nucleótidos) y se cuantifica. 5 ng de ADN extraído contienen aproximadamente 1700 equivalentes de genoma haploide ('HGE'). La correlación general entre la cantidad de ADN y los HGE es la siguiente: 3 pg de ADN = 1 HGE; 3 ng de ADN = 1K HGE; 3 µg de ADN = 1M HGE; 10 pg de ADN = 3 HGE; 10 ng de ADN = 3K HGE; 10 µg de ADN = 3M HGE.

[0403] Preparación de bibliotecas de 'moléculas individuales'

[0404] El etiquetado de ADN de alta eficiencia (>80%) se realiza mediante reparación de extremos, adición de colas A y ligación de extremos cohesivos con 2 octómeros diferentes (es decir,4 combinaciones) con adaptadores en horquilla sobrecargados. Como material de partida se usan 2,5 ng de ADN (es decir, aproximadamente 800 HGE). Cada adaptador en horquilla comprende una secuencia aleatoria en su parte no complementaria. Ambos extremos de cada fragmento de ADN se unen con adaptadores en horquilla. Cada fragmento etiquetado puede identificarse mediante una combinación de la secuencia del octómero en los adaptadores en horquilla y las partes endógenas de la secuencia insertada.

[0405] El ADN etiquetado se amplifica mediante 12 ciclos de PCR para producir aproximadamente de 1 a 7 µg de ADN que contienen aproximadamente 500 copias de cada uno de los 800 HGE del material de partida.

[0406] Para optimizar las reacciones de PCR puede realizarse una optimización del tampón, una optimización de la polimerasa y una reducción del ciclo. Mediante la optimización también se reduce el sesgo de amplificación, por ejemplo, el sesgo no específico, el sesgo GC y/o el sesgo de tamaño. El ruido (por ejemplo, los errores introducidos por la polimerasa) se reduce usando polimerasas de alta fidelidad.

[0407] Las secuencias pueden enriquecerse de la siguiente manera: los ADN con regiones de interés (ROI) se capturan usando perlas marcadas con biotina con sonda para las ROI. Las ROI se amplifican con 12 ciclos de PCR para generar una amplificación de 2000 veces.

[0408] Secuenciación masiva en paralelo

[0409] Para la secuenciación se usa entre un 0,1 y un 1% de la muestra (aproximadamente 100 pg). A continuación, el ADN resultante se desnaturaliza y se diluye a 8 pM y se carga en un secuenciador Illumina.

[0410] Bioinformática digital

[0411] Las lecturas de secuencias se agrupan en familias, con aproximadamente 10 lecturas de secuencias en cada familia. Las familias se agrupan en secuencias de consenso mediante votación (por ejemplo, votación sesgada) de cada posición en una familia. Una base se denomina secuencia de consenso si coinciden 8 o 9 miembros. Una base no se denomina secuencia de consenso si no coinciden más del 60% de los miembros.

[0412] Las secuencias de consenso resultantes se mapean a un genoma de referencia, como hg19. Cada base de una secuencia de consenso está cubierta por aproximadamente 3000 familias diferentes. Se calcula una puntuación de calidad para cada secuencia y las secuencias se filtran sobre la base de sus puntuaciones de calidad. Las llamadas de bases en cada posición de una secuencia de consenso se comparan con la secuencia de referencia HG-19. En cada posición en la que una llamada de base difiere de la secuencia de referencia, se determina y se informa de la identidad de la base o bases diferentes y su porcentaje en función del total de llamadas de bases en el locus.

[0413] La variación de la secuencia se detecta contando la distribución de las bases en cada locus. Si el 98% de las lecturas tienen la misma base (homocigótica) y el 2% tienen una base diferente, es probable que el locus tenga una variante de secuencia, presumiblemente del ADN canceroso.

[0414] La CNV se detecta contando el número total de secuencias (bases) que se mapean a un locus y comparándolo con un locus de control. Para aumentar la detección de CNV, el análisis de CNV se realiza en regiones específicas, que incluyen las regiones en los genes ALK, APC, BRAF, CDKN2A, EGFR, ERBB2, FBXW7, KRAS, MYC, NOTCH1, NRAS, PIK3CA, PTEN, RB1, TP53, MET, AR, ABL1, AKT1, ATM, CDH1, CSF1R, CTNNB1, ERBB4, EZH2, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, GNA11, GNAQ, GNAS, HNF1A, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, MLH1, MPL, NPM1, PDGFRA, PROC, PTPN11, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, VHL, TERT, CCND1, CDK4, CDKN2B, RAF1, BRCA1, CCND2, CDK6, NF1, TP53, ARID1A, BRCA2, CCNE1, ESR1, RIT1, GATA3, MAP2K1, RHEB, ROS1, ARAF, MAP2K2, NFE2L2, RHOA o NTRK1.

[0415] Ejemplo 2. Método para corregir la llamada de bases mediante determinando el número total de moléculas no observadas en una muestra

[0416] Después de que los fragmentos se hayan amplificado y de que las secuencias de los fragmentos amplificados, se hayan leído y alienado, se somete a los fragmentos a llamada de bases. Las variaciones en el número de fragmentos amplificados y los fragmentos amplificados no observados pueden introducir errores en la llamada de bases. Estas variaciones se corrigen calculando la cantidad de fragmentos amplificados no observados.

[0417] Al realizar la identificación de bases para el locus A (un locus arbitrario), se supone primero que hay N fragmentos amplificados. Las lecturas de secuencias pueden provenir de dos tipos de fragmentos: fragmentos de cadena doble y fragmentos de cadena sencilla. A continuación se muestra un ejemplo teórico del cálculo del número total de moléculas no observadas en una muestra.

[0418] N es el número total de moléculas en la muestra.

[0419] Suponiendo que 1000 es el número de dúplex detectados.

[0420] Suponiendo que 500 es el número de moléculas de cadena sencilla detectadas.

[0421] P es la probabilidad de ver una cadena.

[0422] Q es la probabilidad de no detectar una cadena.

[0423] Como Q = 1-P.

[0424] 1000 = NP(2).

[0425] 500 = N2PQ.

[0427] 1000 / P(2) = N.

[0429] 500÷2 PQ = N.

[0431] 1000 / P(2) = 500÷2PQ.

[0433] 1000 * 2 PQ = 500 P(2).

[0434] 2000 PQ = 500 P(2).

[0435] 2000 Q = 500 P.

[0437] 2000 (1-P) = 500P

[0439] 2000-2000 P = 500P.

[0441] 2000 = 500P 2000 P

[0442] 2000 = 2500 P.

[0444] 2000÷2500 = P.

[0445] 0.8 = P.

[0447] 1000/ P(2) = N.

[0449] 1000÷0.64 = N.

[0450] 1562 = N.

[0451] Número de fragmento no observados = 62.

[0452] Ejemplo 3. Identificación de variantes genéticas en variantes somáticas asociadas al cáncer en un pacienteSe usa un ensayo para analizar un panel de genes con el fin de identificar variantes genéticas en variantes somáticas asociadas al cáncer con alta sensibilidad.

[0453] Se extrae ADN libre de células del plasma de un paciente y se amplifica mediante PCR. Las variantes genéticas se analizan mediante secuenciación masiva en paralelo de los genes diana amplificados. Para un conjunto de genes, se secuencian todos los exones, ya que se ha demostrado que dicha cobertura de secuenciación tiene utilidad clínica (Tabla 3). Para otro conjunto de genes, la cobertura de secuenciación incluyó aquellos exones con una mutación somática notificada con anterioridad (Tabla 4). El alelo mutante mínimo detectable (límite de detección) depende de la concentración de ADN libre de células de la muestra del paciente, que variaba de menos de 10 a más de 1000 equivalentes genómicos por ml de sangre periférica. Es posible que no se detecte la amplificación en muestras con cantidades más bajas de ADN libre de células y/o amplificación de copias génicas de bajo nivel. Ciertas características de la muestra o de la variante dieron como resultado una reducción de la sensibilidad analítica, como la baja calidad de la muestra o una recogida inadecuada.

[0454] El porcentaje de variantes genéticas encontradas en el ADN libre circulante en sangre está relacionado con la biología tumoral única de este paciente. Los factores que afectaron a la cantidad/porcentaje de variantes genéticas detectadas en el ADN libre circulante en sangre incluyen el crecimiento tumoral, el recambio, el tamaño, la heterogeneidad, la vascularización, la progresión de la enfermedad o el tratamiento. La Tabla 5 muestra el porcentaje, o frecuencia alélica, del ADN libre circulante alterado (% de ADNcf) detectado en este paciente. Algunas de las variantes genéticas detectadas se enumeran en orden descendente por % de ADNcf.

[0455] Se detectan variantes genéticas en el ADN libre circulante aislado del espécimen de sangre de este paciente. Estas variantes genéticas son variantes somáticas asociadas al cáncer, algunas de las cuales se han relacionado con una respuesta clínica aumentada o disminuida a un tratamiento específico. Las 'alteraciones menores' se definen como aquellas alteraciones detectadas en menos del 10% de la frecuencia alélica de las 'alteraciones principales'. Una alteración principal es la alteración predominante en un locus. Se anotan las frecuencias alélicas detectadas de estas alteraciones (Tabla 5) y los tratamientos asociados para este paciente.

[0456] Como parte de la prueba se analizan todos los genes enumerados en las Tablas 3 y 4. En el ADN libre circulante aislado de la muestra de sangre de este paciente no se detecta amplificación paraERBB2, EGFRoMET.

[0457] En la Tabla 6 se enumeran los resultados de las pruebas de pacientes que comprenden las variantes genéticas.

[0458] En referencia a la Tabla 4, en 13 posiciones, un nucleótido detectado con una frecuencia de por lo menos el 98,8% en la muestra es diferente que un nucleótido de la secuencia de referencia, lo que indica homocigosidad en estos loci. Por ejemplo, en el gen KRAS, en la posición 25346462, se detectó T en lugar del nucleótido de referencia C en el 100% de los casos.

[0459] En 35 posiciones, un nucleótido detectado con una frecuencia de entre el 41,4% y el 55% en la muestra es diferente al nucleótido de la secuencia de referencia, lo que indica heterocigosidad en estos loci. Por ejemplo, en el gen ALK, en la posición 29455267, se detectó G en lugar del nucleótido de referencia A en el 50% de los casos.

[0460] En 3 posiciones, un nucleótido detectado con una frecuencia de menos del 9% es diferente al nucleótido de la secuencia de referencia. Estos incluyen variantes en BRAF (140453136 A>T, 8,9%), NRAS (115256530 G>T 2,6%) y JAK2 (5073770 G>T 1,5%). Se presume que son mutaciones somáticas del ADN canceroso.

[0461] Se calculan las cantidades relativas de variantes genéticas asociadas al tumor. La relación de las cantidades de BRAF:NRAS:JAK2 es de 8,9: 2,6: 1,5, o 1: 0,29: 0,17. A partir de este resultado puede inferirse la presencia de heterogeneidad tumoral. Por ejemplo, una posible interpretación es que el 100% de las células tumorales contienen una variante en BRAF, un 83% contienen variantes en BRAF y NRAS, y un 17% contienen variantes en BRAF, NRAS y JAK2. Sin embargo, el análisis de CNV puede mostrar una amplificación de BRAF, en cuyo caso el 100% de las células tumorales pueden tener variantes tanto en BRAF como en NRAS.

[0462] Tabla 3. Genes en los que se secuencian todos los exones

[0464]

[0466] Tabla 4. Genes en los que se secuencian exones con una mutación somática previamente descrita

[0467]

[0468] (continuación)

[0470]

[0473]

[0475] Tabla 6. Alteraciones genómicas detectadas en genes seleccionados

[0476]

[0477] (continuación)

[0478]

[0479] (continuación)

[0481]

[0483] Ejemplo 4. Determinación de los límites de detección específicos del paciente para los genes analizados mediante ensayos

[0484] Usando el método del Ejemplo 3, se detectan alteraciones genéticas en el ADN libre de células de un paciente. Las lecturas de secuencia de estos genes incluyen secuencias de exones y/o intrones.

[0485] Ejemplo 5. Corrección de errores de secuencia comparando las secuencias de Watson y Crick

[0486] Se aísla el ADN libre de células de cadena doble del plasma de un paciente. Los fragmentos de ADN libre de células se etiquetan usando 16 adaptadores diferentes que contienen burbujas, cada uno de los cuales comprende un código de barras distintivo. Los adaptadores que contienen burbujas se unen a ambos extremos de cada fragmento de ADN libre de células mediante ligadura. Después de la ligadura, cada uno de los fragmentos de ADN libre de células puede identificarse inequívocamente por la secuencia de los códigos de barras distintos y dos secuencias endógenas de 20 bp en cada extremo del fragmento de ADN libre de células.

[0487] Los fragmentos de ADN libre de células marcados se amplifican mediante PCR. Los fragmentos amplificados se enriquecen usando perlas que comprenden sondas de oligonucleótidos que se unen específicamente a un grupo de genes asociados al cáncer. Por lo tanto, los fragmentos de ADN libre de células del grupo de genes asociados al cáncer se enriquecen selectivamente.

[0488] Los adaptadores de secuenciación, cada uno de los cuales comprende un sitio de unión al cebador de secuenciación, un código de barras de muestra y una secuencia de flujo celular, se unen a las moléculas de ADN enriquecidas. Las moléculas resultantes se amplifican mediante PCR.

[0489] Se secuencian ambas cadenas de los fragmentos amplificados. Como cada adaptador que contiene burbuja comprende una parte no complementaria (por ejemplo, la burbuja), la secuencia de una cadena del adaptador que contiene la burbuja es diferente de la secuencia de la otra cadena (complemento). Por lo tanto, las lecturas de secuencia de los amplicones derivados de la cadena Watson de un ADN libre de células original pueden distinguirse de los amplicones de la cadena Crick del ADN libre de células original por las secuencias de adaptadores que contienen burbujas unidas.

[0490] Las lecturas de secuencia de una cadena de un fragmento de ADN libre de células original se comparan con las lecturas de secuencia de la otra cadena del fragmento de ADN libre de células original. Si se produce una variante solo en las lecturas de secuencia de una cadena, pero no en la otra cadena del fragmento de ADN libre de células original, esta variante se identificará como un error (por ejemplo, resultante de la PCR y/o la amplificación), en lugar de una variante genética verdadera.

[0491] Las lecturas de secuencias se agrupan en familias. Se corrigen los errores en las lecturas de secuencias. La secuencia de consenso de cada familia se genera mediante colapso.

[0492] Ejemplo 6. Intervención terapéutica

[0493] Se determina una intervención terapéutica para tratar el cáncer. Los cánceres con mutantes de BRAF responden al tratamiento con vemurafenib, regorafenib, tranetinib y dabrafenib. Los cánceres con mutantes de NRAS responden al tratamiento con trametinib. Los cánceres con mutantes de JAK2 responden al tratamiento con ruxolitinib. Se determina que una intervención terapéutica que incluye la administración de trametinib y ruxolitinib es más eficaz contra este cáncer que el tratamiento con cualquiera de los fármacos mencionados anteriormente por sí solos. El sujeto se trata con una combinación de trametinib y ruxolitinib en una relación de dosis de 5:1.

[0494] Después de varias rondas de tratamiento, se vuelve a analizar el ADNcf del sujeto para detectar la presencia de heterogeneidad tumoral. Los resultados muestran que la relación de BRAF:NRAS:JAK2 es ahora de aproximadamente 4: 2: 1,5. Esto indica que la intervención terapéutica ha reducido la cantidad de células con mutantes de BRAF y NRAS y ha detenido el crecimiento de las células con mutantes de JAK2. Se determina una segunda intervención terapéutica en la que se establece que el trametinib y el ruxolitinib son eficaces en una relación de dosis de 1:1. Se administra al sujeto un ciclo de quimioterapia con cantidades en esta relación. Las pruebas posteriores muestran que los mutantes de BRAF, NRAS y JAK2 están presentes en el ADNcf en cantidades por debajo del 1%.

[0495] Ejemplo 7. Intervención terapéutica

[0496] Se recoge una muestra de sangre de un individuo con melanoma antes del tratamiento y se determina que el paciente tiene una mutación de BRAF V600E a una concentración del 2,8% y que no hay mutaciones de NRAS detectables usando análisis de ADN libre de células. Se somete al paciente a una terapia anti-BRAF (dabrafenib). Después de 3 semanas, se recoge otra muestra de sangre y se analiza. Se determina que el nivel de BRAF V600E ha descendido al 0,1%. Se interrumpe la terapia y se repite la prueba cada dos semanas. El nivel de BRAF V600E vuelve a aumentar y se reinicia la terapia cuando el nivel de BRAF V600E alcanza el 1,5%. La terapia se interrumpe de nuevo cuando el nivel vuelve a descender al 0,1%. Este ciclo se repite.

[0497] Ejemplo 8. Corrección delaCNV sobre la base de mediciones de ROCNV

[0498] Se determinan las variaciones en el número de copias en una muestra del paciente. Los métodos para determinarlas pueden incluir el seguimiento molecular y el sobremuestreo, como se ha descrito con anterioridad. Para eliminar el efecto de la proximidad del origen de replicación de las variaciones estimadas del número de copias en la muestra del paciente se usa un modelo de Markov oculto basado en las ubicaciones esperadas de los orígenes de replicación. Posteriormente, se reduce en un 40% la desviación estándar de las variaciones del número de copias para cada gen. Para inferir la carga tumoral libre de células en el paciente también se usa el modelo de proximidad del origen de replicación.

[0499] En muchos casos, el nivel de tumor libre de células derivado puede ser bajo o estar por debajo del límite de detección de una tecnología particular. Este puede ser el caso cuando el número de equivalentes del genoma humano de ADN derivado del tumor en plasma es de menos de 1 copia por 5 ml. Se ha demostrado que la radiación y la quimioterapia afectan más a las células que se dividen rápidamente que a las células sanas estables, de ahí su eficacia en el tratamiento de pacientes con cáncer avanzado. Por lo tanto, antes de la extracción de sangre se administra al paciente un procedimiento con efectos adversos mínimos para aumentar preferentemente la fracción de ADN derivado del tumor recogido. Por ejemplo, al paciente se le podría administrar una dosis baja de quimioterapia y podría recogerse una muestra de sangre en un plazo de 24 horas, 48 horas, 72 horas o menos de 1 semana. Para que la quimioterapia sea eficaz, esta muestra de sangre contiene concentraciones más altas de ADN libre de células derivado del tumor debido a las tasas potencialmente más altas de muerte celular de las células cancerosas. Alternativamente, se aplica radioterapia a dosis bajas mediante un instrumento radiográfico de cuerpo entero o localmente en las regiones afectadas, en lugar de quimioterapia a dosis bajas. Se prevén otros procedimientos, que incluyen someter al paciente a ultrasonidos, ondas sonoras, ejercicio, estrés, etc.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

1. Un método que comprende:

(a) realizar un análisis biomolecular del ADN libre de células cancerosas de un sujeto;

(b) identificar y cuantificar variantes biomoleculares en el ADN libre de células;

(c) desarrollar un perfil de heterogeneidad tumoral en el sujeto que indique la presencia y la cantidad relativa de una pluralidad de variantes en el ADN libre de células, en donde diferentes cantidades relativas indican heterogeneidad tumoral; y

(d) determinar una intervención terapéutica para un cáncer que presenta la heterogeneidad tumoral, en donde la intervención terapéutica es eficaz contra un cáncer que tiene el perfil de heterogeneidad tumoral determinado, y en donde la determinación comprende:

usar una base de datos para identificar una o más intervenciones terapéuticas eficaces para el sujeto, en donde la base de datos comprende, para cada uno de una pluralidad de sujetos que tienen cáncer, datos de pruebas genómicas tumorales, que incluyen alteraciones somáticas, recopilados en dos o más intervalos de tiempo por sujeto, una o más intervenciones terapéuticas administradas a cada uno de los sujetos en uno o más momentos y la eficacia de las intervenciones terapéuticas.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el análisis biomolecular es un análisis genómico y un análisis epigenético, opcionalmente en donde el análisis epigenético es un análisis de metilación.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el ADN libre de células procede de una muestra de fluido corporal del sujeto, por ejemplo, sangre u orina.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que

El paso (b) comprende cuantificar los polinucleótidos que portan una variante de secuencia en cada uno de una pluralidad de loci genéticos en el ADN libre de células y determinar para cada locus una medida de variación del número de copias (CNV) para los polinucleótidos que portan la variante de secuencia; y

en el paso (c), la heterogeneidad tumoral se indica

(i) determinando para cada locus una medida ponderada de la cantidad de polinucleótidos que portan una variante de secuencia en el locus en función de la CNV en el locus, y

(ii) comparando las medidas ponderadas en cada uno de los múltiples loci, en donde diferentes medidas ponderadas indican la heterogeneidad tumoral,

5. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la determinación de una intervención terapéutica tiene en cuenta las frecuencias relativas de las alteraciones genéticas relacionadas con el tumor.

6. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la determinación de una intervención terapéutica tiene en cuenta el tejido de origen del cáncer.

7. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la intervención terapéutica del paso (d) incluye una terapia combinada que comprende un primer fármaco eficaz contra un primer tipo de tumor y un segundo fármaco eficaz contra un segundo tipo de tumor.

8. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el método comprende seguimiento molecular, por ejemplo, que comprende etiquetar polímeros biomoleculares de tal manera que las múltiples lecturas de secuencias producidas a partir de moléculas originales puedan agruparse en familias de secuencias derivadas de moléculas originales, el método comprendiendo opcionalmente además filtrar las llamadas de bases que representan ruido.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el seguimiento molecular comprende usar los datos de secuencia únicos en las partes inicial (inicio) y final (parada) de las lecturas de secuenciación individuales, solos o en combinación con la longitud o la cantidad de pares de bases de cada lectura de secuencia, para asignar identidades únicas a moléculas individuales.

10. El método de la reivindicación 8, en el que el seguimiento molecular comprende usar los datos de secuencia en las partes inicial (inicio) y final (parada) de las lecturas de secuenciación individuales y la longitud de las lecturas de secuenciación, solos o en combinación, con códigos de barras.

11. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el método comprende monitorizar los cambios en el perfil de heterogeneidad tumoral a lo largo del tiempo.

12. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el perfil de heterogeneidad tumoral se determina en una pluralidad de momentos diferentes, y el método comprende además calibrar las intervenciones terapéuticas a lo largo del tiempo.

13. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que (A) las intervenciones terapéuticas identificadas se estratifican por eficacia, (B) se informa de los límites cuantitativos de la eficacia prevista de las intervenciones terapéuticas o la falta de la misma, y/o (C) las intervenciones terapéuticas usan información sobre la evolución genómica prevista del tumor o los mecanismos de resistencia adquiridos en pacientes similares en respuesta al tratamiento.

14. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el método comprende además generar y proporcionar (A) un informe de la heterogeneidad tumoral y/o (B) un informe de los resultados de las pruebas de cáncer y las opciones de tratamiento, por ejemplo, proporcionando el informe a un profesional de la salud, como un médico.