ES3059995T3

ES3059995T3 - Cd80 and cd86 binding protein compositions and uses thereof

Info

Publication number: ES3059995T3
Application number: ES17851784T
Authority: ES
Inventors: Yang Liu; Martin Devenport; Pan Zheng; Wei Wu; Xuexiang Du; Mingyue Liu; Fei Tang
Original assignee: Childrens Res Institute Childrens National Medical Center; Oncoc4 Inc
Current assignee: Childrens Res Institute Childrens National Medical Center; Oncoc4 Inc
Priority date: 2016-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2026-03-24
Anticipated expiration: 2037-09-19
Also published as: CN116942793A; US20190263889A1; EP3515489B1; EP4667012A2; EP3515489A1; EP3515489A4; US20220259285A1; CA3036997A1; US12441780B2; US20220259286A1; WO2018053506A1; US12227557B2; DK3515489T3; CN109715210B; PL3515489T3; EP4667012A3; US11261233B2; CN109715210A

Abstract

Esta invención se refiere a composiciones de la proteína CTLA-4 (antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos) y su uso para mitigar los efectos adversos autoinmunes asociados a la inmunoterapia contra el cáncer. En concreto, la presente invención describe una proteína CTLA-4 que comprende un dominio extracelular mutante de CTLA-4, en la que la proteína CTLA-4 presenta una menor afinidad de unión a un anticuerpo anti-CTLA-4 en comparación con un dominio extracelular de CTLA-4 de tipo silvestre, en el que el anticuerpo anti-CTLA-4 posee actividad inmunoterapéutica contra el cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Composiciones de proteínas de unión a CD80 y CD86 y usos de las mismas

[0003] Antecedentes de la invención

[0004] Se ha demostrado que el tratamiento con anticuerpos anti-CTLA-4 es una herramienta potente para potenciar la inmunidad antitumoral en modelos preclínicos (10). La monoterapia con un anticuerpo contra CTLA-4 promovió el rechazo de tumores trasplantables de diversos orígenes. Basándose en estudios prometedores de modelos tumorales preclínicos, se ha explorado el potencial clínico de los anticuerpos contra CTLA-4 en neoplasias malignas humanas diferentes. Aunque el anti-CTLA-4 (ipilimumab, comercializado como Yervoy, divulgado en la patente de EE. UU. n.º 6 984720) ha demostrado su eficacia en el tratamiento del melanoma, el tratamiento y el direccionamiento de CTLA-4 se asocian a toxicidades de tipo autoinmunitario. Además, los mAb anti-CTLA-4, tales como ipilimumab y tremelimumab, se usan en combiterapia con anticuerpos anti-PD-1/PD-L1 con un efecto terapéutico superior. Sin embargo, el aumento del efecto terapéutico se asocia a tasas aún más elevadas de toxicidad orgánica de grado 3 y 4. Los efectos secundarios característicos de la inhibición de CTLA-4 generalmente se denominan acontecimientos adversos relacionados con el sistema inmunitario (irAE, por sus siglas en inglés) y los irAE más comunes son erupción cutánea, hepatitis, colitis y endocrinopatías, en particular hipopituitarismo. Por lo tanto, existe una gran necesidad médica no cubierta de tratar los irAE conservando al mismo tiempo el efecto terapéutico contra el cáncer del anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CTLA-4.

[0005] Los inventores han demostrado que tanto el mAb terapéutico anti-CTLA-4 humano clínicamente probado como dos mAb anti-Ctla-4 de ratón inducen el rechazo tumoral sin bloquear las interacciones B7-CTLA-4 en condiciones fisiológicamente relevantes. Por lo tanto, dicho bloqueo no fue necesario para el rechazo tumoral, incluso para el mAb que puede bloquear potentemente las interacciones B7-CTLA-4. Estos datos refutan la hipótesis de que el mAb anti-CTLA-4 confiere un efecto inmunoterápico a través del bloqueo de los puntos de control (108). En apoyo de esta idea, se ha mostrado además que el efecto inmunoterápico mediado por ipilimumab y posiblemente otros mAb anti-CTLA-4, no se vio afectado por el bloqueo de B7-1 y B7-2, que es fundamental para la patogenia de las enfermedades autoinmunitarias.

[0006] La acumulación de datos ha demostrado que el gen humanoCTLA-4codifica dos isoformas diferentes de proteínas mediante corte y empalme alternativo: una con un dominio transmembrana que, por tanto, es probable que esté anclada en la membrana, y otra que carece del dominio transmembrana y se prevé que sea secretada (sCTLA-4) (128). Cabe destacar que algunos estudios genéticos han demostrado que un polimorfismo deCTLA-4que reduce la abundancia relativa de la isoforma soluble se asocia fuertemente con múltiples enfermedades autoinmunitarias (64). El hecho de que los sujetos con alelos propensos a la autoinmunidad expresen menos ARNm de sCTLA-4 sugiere que sCTLA-4 puede ser protector. Esta noción está respaldada por el amplio efecto terapéutico del abatacept (129, 130), que es una forma de CTLA-4 soluble, y por un estudio genético en el que la ablación selectiva de la isoforma sCTLA-4 aceleró el desarrollo de diabetes de tipo I en ratones (131). Basándose en estos datos genéticos, los inventores tuvieron la idea de que un anticuerpo anti-CTLA-4 que muestre la unión más deficiente a CTLA-4 soluble debería dar los menores irAE. De hecho, en función del impacto de los anticuerpos sobre el aumento de peso corporal en ratones tratados con anticuerpos anti-CTLA-4 durante el periodo perinatal, se encontró una fuerte correlación entre cuatro mAb anti-CTLA-4: el ipilimumab tiene la unión más fuerte a sCTLA-4 y es el anti-TCLA-4 más tóxico, mientras que el anticuerpo L3D10 tenía la unión más débil a sCTLA-4 y era el menos tóxico. Por otra parte, las variantes humanizadas de L3D10 que redujeron preferentemente la unión a sCTLA-4 mostraron un perfeccionamiento adicional del perfil de seguridad con respecto al anticuerpo original.

[0007] La función protectora de las moléculas solubles de CTLA-4 apoya adicionalmente el enfoque de usar proteínas de fusión solubles de CTLA-4 para mitigar, reducir o tratar los irAE. Sin embargo, ya que los pacientes con irAE inducidos por mAb anti-CTLA-4 tienen mAb anti-CTLA-4 en circulación, las proteínas de fusión CTLA-4, tales como abatacept, no solo reducirán el efecto terapéutico de los mAb anti-CTLA-4 al impedir que se unan a moléculas de CTLA-4 asociadas a las células, sino que también se volverán ineficaces porque se eliminarán de la circulación tras formar inmunocomplejos con mAb anti-CTLA-4 en circulación. En consecuencia, existe una necesidad en la técnica de mejora de las composiciones y métodos de inmunoterapia con CTLA-4.

[0008] Los documentos WO 01/02337 A2, WO 2011/113019 A2 y US 2015/051158 A1 divulgan proteínas CTLA-4 que comprenden mutaciones en el dominio extracelular. Wekerleet al.(2012) ofrece una visión general del desarrollo preclínico de belatacept y analiza las pruebas de los ensayos clínicos. Schönfeldet al.(2009) divulga una lipocalina genomodificada, derivado de Lcn2 humano que se une específicamente al correceptor de linfocitos T CTLA-4 como diana proteica prescrita con afinidad subnanomolar.

[0009] Sumario de la invención

[0010] Se han divulgado en el presente documento proteínas CTLA-4 humanas y composiciones anti-B7-1 y anti-B7-2, y estas proteínas y composiciones para su uso en inmunoterapia y en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias e inflamación, y para la reducción de efectos secundarios autoinmunitarios asociados con la inmunoterapia anti-CTLA4. Específicamente, se divulga una proteína CTLA-4 que presenta una unión reducida o eliminada a anticuerpos anti-CTLA-4 utilizados en inmunoterapia contra el cáncer, pero que conserva la capacidad de unirse a B7-1 y B7-2. La invención se establece en las reivindicaciones adjuntas. Un aspecto de la invención proporciona una proteína CTLA-4 que comprende un dominio extracelular de CTLA-4 que comprende la secuencia establecida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 34, 36, 39, 40 y 46-48, en donde el dominio extracelular de CTLA-4 está fusionado con una región Fc de una proteína inmunoglobulina humana.

[0011] La proteína CTLA-4 puede comprender una proteína CTLA-4 en la que los aminoácidos de un epítopo de unión a anticuerpos anti-CTLA-4 están modificados o mutados con el fin de reducir o abolir la unión de un anticuerpo anti-CTLA-4 a la proteína CTLA-4, en comparación con un dominio extracelular natural de CTLA-4. La proteína CTLA-4 puede tener actividad inmunoterápica antineoplásica. El anticuerpo anti-CTLA-4 puede ser ipilimumab. La proteína CTLA-4 puede conservar su capacidad de unirse al menos a una de B7-1 y B7-2. Es posible que la proteína CTLA-4 no bloquee los efectos inmunoterápicos antineoplásicos del anticuerpo anti-CTLA-4.

[0012] La proteína CTLA-4 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 34, 36, 38, 39, 40 y 46-48, en donde el dominio extracelular de CTLA-4 está fusionado con una región Fc de una proteína inmunoglobulina humana. La proteína CTLA-4 puede ser soluble. La proteína CTLA-4 puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17, 19, 21, 22, 23 y 42-44. La proteína CTLA-4 puede ser belatacept.

[0013] En otra realización, el anticuerpo se une al menos a una de B7-1 y B7-2 humanas. En otra realización, el anticuerpo de la invención se proporciona para usar en inmunoterapia y en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias e inflamación, y para la reducción de los efectos secundarios autoinmunitarios asociados con la inmunoterapia anti-CTLA-4.

[0014] También se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína CTLA-4 de la presente invención, y un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable.

[0015] En otro aspecto, la invención proporciona la proteína CTLA-4 o composición farmacéutica de la invención para usar en el tratamiento de acontecimientos adversos relacionados con la inmunidad asociados con la inmunoterapia anti-CTLA-4 en un sujeto. En una realización específica, la proteína CTLA-4 o la composición farmacéutica de la invención son para usar para prevenir, tratar o gestionar una enfermedad en la que es deseable inhibir o reducir una o más funciones o respuestas inmunitarias. La enfermedad puede ser una enfermedad autoinmunitaria, tal como artritis reumatoide (AR) o artritis idiopática juvenil (AIJ).

[0016] La proteína CTLA-4 y la composición farmacéutica de la presente invención también pueden ser para usar para mitigar, minimizar o tratar los efectos adversos inmunitarios asociados con la inmunoterapia. En particular, la proteína CTLA-4 y la composición farmacéutica de la presente invención pueden bloquear o reducir la función de B7-1 y B7-2 sin afectar a la actividad inmunoterápica contra el cáncer de un anticuerpo anti-CTLA-4.

[0017] La proteína CTLA-4 y la composición farmacéutica de la presente invención pueden administrarse a un sujeto, que puede tener cáncer, junto con, o en un fondo de, inmunoterapia anti-CTLA-4. La proteína CTLA-4 y la composición farmacéutica de la presente invención pueden ser para uso profiláctico para impedir los irAE antes de que se inicie el tratamiento anti-CTLA-4 o antes de que aparezcan los signos clínicos de irAE. En otra realización, la proteína CTLA-4 y la composición farmacéutica de la presente invención para usar en el tratamiento de irAE después de que se inicie el tratamiento anti-CTLA-4 y se diagnostiquen los síntomas clínicos.

[0018] Breve descripción de los dibujos

[0019] FIG.1. Secuencia de CTLA-4 humana. La FIG.1A muestra la secuencia de la proteína CTLA-4 humana (número de registro del NCBI NP_005205; SEQ ID NO: 1) con el péptido señal en negrita, el dominio IgV subrayado y el dominio transmembrana con subrayado doble. La FIG.1B muestra la secuencia de abatacept (SEQ ID NO: 2) con la secuencia CTLA-4 en negrita y el resto de la proteína que comprende la región IgG1 Fc.

[0020] FIG. 2. Efecto terapéutico de L3D10 y 10D1 quiméricos en el modelo de tumor MC38. Para el estudio se usaron ratones con activación de CTLA-4 humano con un peso corporal de aproximadamente 20 gramos. Se inyectaron 1×10<6>células tumorales MC38 por vía subcutánea en ratones Ctla-4<h/h>y, cuando el tumor alcanzó un tamaño de 0,5 cm de diámetro, los ratones portadores de tumores se distribuyeron aleatoriamente en tres grupos de 5 o 6 ratones cada uno. Después, los ratones se trataron (i.p.) con 100 µg/inyección de 10D1, L3D10 quimérico o hIgGFc de control los días 7, 10, 13 y 16 como lo indican las flechas. Se muestran los resultados de los experimentos duplicados (paneles izquierdo y derecho) y los datos mostrados son medias y D.T. del tamaño tumoral (n = 6 por grupo en el panel izquierdo, n = 5 por grupo en el panel derecho). L3D10 y 10D1 tienen un efecto terapéutico similar en este modelo y ambos son capaces de inducir la remisión completa de los tumores establecidos. Los diámetros (d) de los tumores se calcularon usando la siguiente fórmula: D = √(ab), V = ab2/2, donde a es el diámetro largo, mientras que b es el diámetro corto. Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA de medidas repetidas de dos vías (tratamiento X tiempo).

[0021] Para el panel izquierdo: P = 10D1 frente a hIgGFc: 5,71e-07; L3D10 frente a hIgGFc: P = 5,53e-07; 10D1 frente a L3D10: P = 0,869.

[0022] FIG.3. Reacciones adversas de L3D10 y 10D1 quiméricos en combinación con anti-PD-1. El panel superior muestra el diseño experimental. Para el estudio se usaron ratones con activación de CTLA-4 humano exclusivamente hembras de 10 días de edad con un peso corporal de más de 4 gramos. Recibieron las proteínas indicadas o sus combinaciones. Las flechas indican el tiempo de tratamiento (100 µg/ratones/tratamiento). Los datos mostrados son medias y D.T. del % de aumentos de peso. L3D10 y 10D1 quiméricos tienen un efecto terapéutico contra el cáncer comparable en ratones adultos (FIG.2), pero se observan efectos adversos distintos cuando 10D1 se combina con el mAb anti-PD-1.

[0023] FIG.4. Reacciones adversas de L3D10 y 10D1 quiméricos en combinación con anti-PD-1. El gráfico muestra el peso corporal terminal el día 42 en los ratones del experimento esbozado en la FIG.3 que recibieron IgG de control, 10D1 anti-PD-1 o L3D10 quimérico anti-PD-1 (n = 5 por grupo). Se observa una reducción significativa de peso con la combinación anti-PD1+10D1, lo que no se observó con la combinación anti-PD-1+L3D10 quimérico.

[0024] FIG.5. Efectos patológicos de L3D10 y 10D1 quiméricos en combinación con anti-PD-1. El grupo 1 es hIgG, el grupo 2 es 10D1 anti-PD1 y el grupo 3 es L3D10 anti-PD1. Para examinar adicionalmente la toxicidad relativa de L3D10 en comparación con 10D1 cuando se administraron en combinación con anti-PD-1, se investigó la anatomía macroscópica de los ratones descritos anteriormente en la FIG.4. El útero/ovario/vejiga y el timo eran notablemente más pequeños en ratones tratados con 10D1 PD-1, mientras que los órganos de los ratones tratados con L3D10 anti-PD-1 eran comparables a los del control de hIgG. Por el contrario, los corazones disecados de ratones tratados con 10D1 parecían más grandes y con un aspecto notablemente más blanco.

[0025] FIG.6. El tratamiento con 10D1 junto con anti-PD-1 da lugar a una eritropoyesis anómala. Dadas las diferencias en los corazones observadas en la FIG. 5, se investigó la eritropoyesis dentro de los ratones y se observaron claras diferencias en los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 en relación con los grupos tratados con L3D10 anti-PD-1 o anticuerpo de control (hIgG), que eran bastante similares. La médula ósea de ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 tenía un color notablemente más blanco (FIG.6A) y la sangre aislada era de color casi completamente blanco (FIG.

[0026] 6B). De acuerdo con esto, cuando se analizó la diferenciación de los glóbulos rojos mediante la distribución de los marcadores CD119 y CD71, en los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 se observó una reducción estadísticamente significativa del número de células en estadio IV del desarrollo. En la FIG. 6C se muestran perfiles de FACS representativos, mientras que los datos resumidos se presentan en la FIG.6D.

[0027] FIG.7. Puntuaciones de toxicidad de ratones tratados con L3D10 y 10D1 quiméricos junto con anti-PD-1. Estos datos de tejido se resumen y muestran las altas puntuaciones de toxicidad de los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 con respecto a L3D10 anti-PD-1 que tiene puntuaciones solo ligeramente superiores al grupo de ratones de control de hIgG.

[0028] FIG.8. L3D10 y 10D1 muestran patrones de unión similares para CTLA-4 inmovilizado en placa. Las placas de ELISA se recubrieron con 1 µg/ml de proteína CTLA-4-His (Sino Biological, China). Se añadió la concentración dada de proteínas de unión biotiniladas y se midió la unión usando estreptavidina conjugada con HRP.10D1-1 y -2 son dos lotes de material independientes del mismo anticuerpo. hIgG-Fc es un control negativo de Ig humana.

[0029] FIG.9. L3D10 muestra CTLA-4 soluble de unión reducida. Se aplicaron concentraciones dadas de mAb anti-CTLA-4 humano como recubrimiento sobre la placa durante la noche, después de lavar y bloquear con seroalbúmina bovina, se añadió CTLA-4-Fc biotinilado a 0,25 µg/ml. Tras la incubación y el lavado, las cantidades de CTLA-4-Fc capturado se midieron usando estreptavidina marcada con HRP.

[0030] FIG.10.10D1+anti-PD-1 no tienen toxicidad significativa en los ratones Ctla-4<h/m>como demuestran los aumentos de peso corporal normales en ratones que recibieron tratamiento con anticuerpos durante el periodo perinatal. Los ratones recibieron tratamientos con el anticuerpo dado o combinaciones los días 10, 13, 16, 19 y 22 por vía intraperitoneal (100 µg/ratones/inyección/anticuerpo). Los ratones se pesaron al menos una vez cada 3 días.

[0031] FIG. 11. Actividad antitumoral de anticuerpos L3D10 humanizados en comparación con 10D1. El uso del modelo tumoral de ratón MC38 en ratones humanos con activación de CTLA-4, se investigó la actividad antitumoral de los anticuerpos L3D10 humanizados en comparación con el anticuerpo L3D10 quimérico y 10D1. La FIG.11A muestra el programa de tratamiento del experimentoin vivo. A los ratones se les administraron un total de 4 dosis de anticuerpo cada 3 días a partir del día 7 después de la inoculación. Todos los anticuerpos humanizados (n = 6 por grupo) erradicaron completamente los tumores y fueron comparables a 10D1 (FIG.11B).

[0032] FIG.12. Comparación entre hembras 10D1, mAb4 y mAb5 para determinar su toxicidad combinada con mAb anti-PD-1. Se trataron ratones Ctla-4<h/h>hembra los días 10 u 11 después del nacimiento con cuatro inyecciones de anticuerpos (100 µg/ratones/inyección, una vez cada tres días) o Fc de control como se especifica en las leyendas. Los ratones se pesaron una vez cada 3 días. Los datos mostrados son medias y ETM del % de aumento de peso durante un periodo de 30 días. Todos los ratones se sacrificaron el día 43 para el análisis histológico. El número de ratones utilizados por grupo se muestra en los paréntesis de los rótulos.

[0033] Los valores de p para las comparaciones entre diversos tratamientos son los siguientes.

[0035]

[0037] FIG. 13. La humanización de L3D10 no afecta a la unión a CTLA-4 inmovilizado. La capacidad de los anticuerpos L3D10 humanizados para unirse a CTLA-4 inmovilizado se determinó como se describe en la FIG.23. El eje X indica la concentración de mAb anti-CTLA-4 añadidos a la solución. La humanización no afecta a la unión a CTLA-4 inmovilizado y los tres anticuerpos humanizados demostraron una unión similar al anticuerpo L3D10 quiméri y 10D1. Se observaron patrones similares cuando se usó CTLA-4-lg en lugar de CTLA-4-his.

[0038] FIG.14. La humanización reduce adicionalmente la unión de L3D10 a CTLA-4 soluble. La capacidad de los anticuerpos L3D10 humanizados para unirse a CTLA-4 soluble se determinó como se describe en la FIG.23. El eje X indica la concentración de mAb anti-CTLA-4 aplicados como recubrimiento sobre placas de ELISA. La humanización reduce adicionalmente la unión a CTLA-4 soluble con respecto al anticuerpo L3D10 quimérico parental. Se observaron patrones similares cuando se usó CTLA-4-lg en lugar de CTLA-4-his.

[0039] FIG. 15. Alineación de los dominios extracelulares de CTLA-4 humanos, de macaco y de ratón. Las secuencias de aminoácidos de los dominios extracelulares de la proteína CTLA-4 humanos (Hm; aminoácidos 1-124 de la SEQ ID NO: 2), de macaco (Mc) y de ratón (Rn) están alineadas y los aminoácidos conservados (en relación con la secuencia humana) se muestran con guiones (-). Con el fin de ayudar a la alineación, la secuencia de ratón tiene una supresión y una inserción (con respecto a las secuencias humana y de mono) en las posiciones resaltadas. El sitio de unión de B7-1Ig conocido se muestra en negrita y subrayado. Las secuencias demuestran que las secuencias humanas y de mono están muy conservadas, mientras que la secuencia de ratón tiene varias diferencias de aminoácidos. Basándose en esta alineación de secuencia, se diseñaron 11 proteínas CTLA-4Fc humanas mutantes (M1 - M11) que incorporan aminoácidos específicos murinos; los aminoácidos incorporados en cada proteína mutante se muestran en color azul. FIGS. 16A y B. Composición de la secuencia de aminoácidos de las proteínas CTLA-4Fc WT (SEQ ID NO: 2) y mutantes (SEQ ID NO: 7-17). Las construcciones de ADN que codifican la proteína CTLA-4Fc WT y 11 proteínas mutantes, M1-M11, que incorporan aminoácidos de Ctla-4 murino se diseñaron como se muestra. Las secuencias de aminoácidos son para proteínas maduras, incluyendo la parte Fc de IgG1, pero no el péptido señal. El sitio de unión de B7-1Ig conocido se muestra en letras grandes y con subrayado doble. Los restos de aminoácidos murinos reemplazados en el mutante se muestran en minúsculas. La parte Fc de IgG1 de las proteínas está subrayada. FIGS.17A-D. La mutación en M11 (AA103-106, YLGI>fcGm) suprime selectivamente la unión del anticuerpo a CTLA-4 humano. Los datos mostrados son medias de duplicados, que representan la unión de B7-1Fc (FIG.17A), L3D10 (FIG. 17B), mAb4 (FIG. 17C) y mAb5 (FIG. 17D) que se unen a hCTLA-4-Fc (círculos abiertos), mCTLA-4-Fc (triángulos rellenos), M11 (círculos rellenos) e IgG1-Fc (triángulos abiertos) aplicados a placas.

[0040] FIG.18. Cartografiado de L3D10, mAb4 y mAb5 a un epítopo adyacente al sitio de unión B7-1 en una estructura 3D del complejo B7-1-CTLA-4. El motivo de unión de B7-1 y el epítopo del anticuerpo están sombreados de forma diferente. B7-1 se representa encima de CTLA-4 con una cinta rellena, mientras que CTLA-4 se representa como una cinta sin rellenar.

[0041] FIG.19. Composición de la secuencia de aminoácidos de las proteínas CTLA-4Fc mutantes, M12-M17 (SEQ ID NO: 18-23). Las construcciones de ADN que codifican las 6 proteínas CTLA-4Fc mutantes, M12-M17, que incorporan aminoácidos de Ctla-4 murino se diseñaron como se muestra. Las secuencias de aminoácidos son para proteínas maduras, incluyendo la parte Fc de IgG1, pero no el péptido señal. El sitio de unión de B7-1Ig conocido se muestra en letras grandes y con subrayado doble. Los restos de aminoácidos murinos reemplazados en el mutante se muestran en minúsculas. La parte Fc de IgG1 de las proteínas está subrayada.

[0042] FIGS. 20A y B. Identificación de proteínas mutantes CTLA-4Fc que conservan la unión a B7-1Fc biotinilado. Las proteínas de fusión de CTLA4-Fc M1-M17 se aplicaron a placas de 96 pocillos. El B7-1Fc biotinilado a la concentración dada se incubó con las placas y se detectó con HRP conjugada con estreptavidina. Los datos mostrados son medios de experimentos duplicados.

[0043] FIGS. 21A y B. Identificación de proteínas mutantes CTLA-4Fc que conservan la unión a proteínas B7-1 y B7-2 biotiniladas. Las proteínas de fusión de CTLA4-Fc mutantes (1 µg/ml) se aplicaron a placas de 96 pocillos. Se incubaron B7-1Fc (FIG. 21A) y B7-2Fc (FIG. 21B) biotinilados con las placas a las concentraciones dadas y se detectaron con HRP conjugada con estreptavidina. Los datos mostrados son medios de experimentos duplicados. FIGS.22A y B. Identificación de proteínas mutantes CTLA-4Fc que han perdido la unión a ipilimumab biotinilado (FIG.

[0044] 22A) y tremelimumab (FIG.22B). Las proteínas de fusión de CTLA4-Fc mutantes (1 µg/ml) se aplicaron a placas de 96 pocillos. El anticuerpo mAb2 biotinilado se incubó con las placas a las concentraciones dadas y se detectó con HRP conjugada con estreptavidina. Los datos mostrados son medios de experimentos duplicados.

[0045] FIGS. 23A y B. Identificación de proteínas mutantes CTLA-4Fc que han perdido la unión a mAb4 biotinilado. Las proteínas de fusión de CTLA4-Fc M1-M17 se aplicaron a placas de 96 pocillos. El anticuerpo mAb4 biotinilado se incubó con las placas a las concentraciones dadas y se detectó con HRP conjugada con estreptavidina. Los datos mostrados son medios de experimentos duplicados.

[0046] FIGS. 24A y B. Identificación de proteínas mutantes CTLA-4Fc que han perdido la unión a mAb5 biotinilado. Las proteínas de fusión de CTLA4-Fc M1-M17 se aplicaron a placas de 96 pocillos. El anticuerpo mAb5 biotinilado se incubó con las placas a las concentraciones dadas y se detectó con HRP conjugada con estreptavidina. Los datos mostrados son medios de experimentos duplicados.

[0047] FIGS.25A y B. Identificación de proteínas mutantes CTLA-4Fc que han perdido la unión a mAb4 biotinilado (FIG.25A) y mAb5 (FIG.25B). Las proteínas de fusión de CTLA4-Fc mutantes (1 µg/ml) se aplicaron a placas de 96 pocillos. Se incubaron mAb4 (FIG.25A) o mAb5 (FIG.25B) biotinilados con las placas a las concentraciones dadas y se detectaron con HRP conjugada con estreptavidina. Los datos mostrados son medios de experimentos duplicados.

[0048] FIGS.26A-F. El efecto terapéutico de ipilumumab no se consigue bloqueando B7-1 y/o B7-2. FIG.26A. Confirmación de las actividades de bloqueo de los mAb anti-B7. Las células CHO que expresan B7-1 o B7-2 de ratón se incubaron con una mezcla de 20 mg/ml de anti-B7-1 (panel superior) o anti-B7-2 (panel inferior) y CTLA-4Fc humano biotinilado (2 mg/ml) durante 1 hora. Después de lavar las proteínas no unidas, la superficie celular CTLA-4Fc se detectó mediante estreptavidina conjugada con PE y se midió mediante citometría de flujo. Los datos mostrados son perfiles de FACS representativos y se han repetido dos veces. FIG.26B. Diagrama del diseño experimental: los ratones Ctla-4<h/m>portadores de tumores MC38 recibieron anticuerpos anti-B7-1 y anti-B7-2 (300 µg/ratón/inyección, una vez cada 3 días durante un total de 3 inyecciones) junto con Ig de control o ipilimumab. Los ratones que recibieron ipilimumab sin anti-B7-1 y anti-B7-2 se utilizaron como control positivo del rechazo tumoral y el hIg se utilizó como control negativo. FIGS.26C y D. Saturación de B7-1 y B7-2 por tratamientos con anticuerpos según el diagrama de la FIG.26B. Los PBL de ratones tratados como se muestra en la FIG.26B se tiñeron con mAb anti-B7-1 y anti-B7-2 conjugados con fluorocromo a las 24 horas después del tratamiento con anti-B7. Como control negativo se utilizaron PBL de ratones Cd80<-/->Cd86<-/->. Fig. 26E. Bloqueo funcional de B7 por mAb anti-B7-1 y anti-B7-2 basado en la ablación de las respuestas de anticuerpos. Se recogieron sueros el día 22 después de la exposición tumoral para evaluar las respuestas de anticuerpos IgG antihumanos. Fig.26F. El bloqueo de saturación de B7-1 y B7-2 por mAb anti-B7-1 y anti-B7-2 no afecta al efecto inmunoterápico de ipilimumab. Los datos mostrados son volúmenes tumorales a lo largo del tiempo y se han repetido dos veces con resultados similares.

[0049] FIG. 27. Las proteínas de fusión de CTLA-4-Fc M11 y M15 protegen a los ratones contra los irAE causados por la combiterapia con anti-PD-1 y anti-CTLA-4 (ipilimumab).

[0050] FIGS.28A y B. Los mutantes de CTLA4-Fc M15 y M17 no interfieren con el efecto inmunoterápico de ipilimumab. A los ratones heterocigotos Ctla-4<h/m>se les trasplantaron tumores MC38 y se trataron con ipilimumab junto con IgG Fc de control o con proteínas mutantes CTLA-4 en los puntos temporales indicados por las flechas. FIG.28A. Reducción de los tamaños tumorales. FIG.28B. Supervivencia de ratones portadores de tumores, usando tamaños tumorales de hasta 2 cm de diámetro como criterio de extirpación precoz.

[0051] FIGS.29A y B. Función protectora de M15 y M17-2 contra la pérdida de peso inducida por ipilimumab (FIG.29A) y la toxicidad hepática potencial de M15 (FIG. 29B) en ratones NSG reconstituidos con células madre hematopoyéticas CD34<+>humanas.16 ratonas humanizadas se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos en función de la reconstitución leucocitaria humana en peso y del % de linfocitos T humanos en sangre. Se trataron los 4 grupos, respectivamente, con IgG Fc humano de control (400 µg/inyección), ipilimumab (100 µg/inyección)+IgG Fc humano (300 µg/inyección), ipilimumab (100 µg/inyección)+M15 (300 µg/inyección) o ipilimumab (100 µg/inyección)+M17-2 (300 µg/inyección) los días 0, 3 y 6. El día 18, los ratones recibieron una inyección más en la que la dosis de ipilimumab fue de 200 µg/ratón+IgG Fc humano (300 µg/inyección), ipilimumab (100 µg/inyección)+M15 (300 µg/inyección) o ipilimumab (100 µg/inyección)+M17-2 (300 µg/inyección). Durante 30 días se controló el cambio de peso de los ratones, utilizando el día 0 como el 100 %. FIG.29B. Se observó una elevación de la ALT en los ratones que recibieron ipilimumab junto con M15 pero no con M17-2.

[0052] FIGS.30A-F. Efecto diferencial de M15 y M17-2 en la activación de linfocitos T inducida por ipilimumab en función del análisis de linfocitos T del bazo el día 31. Los ratones se trataron como se describe en la FIG.29 y se sacrificaron el día 31 para la citometría de flujo. Frecuencia de CD4 (FIGS.30A-C) y CD8 (FIGS.30D-F) de linfocitos T CD4 y CD8 (FIGS.30A y D), células de memoria centrales (CD44<alto>CD62L<alto>) (FIGS.30B y E) y células de memoria efectoras (CD44<alto>CD62L<bajo>) (FIGS.30C y F).

[0053] FIG.31. Efecto diferencial de M15 y M17 en la expansión de los linfocitos NKT. Como se detalla en la FIG.30, excepto que se analizaron los linfocitos T NK (CD3<+>CD56<+>). Los ratones se trataron como se describe en la FIG. 29 y se sacrificaron el día 31 para la citometría de flujo.

[0054] FIGS. 32A-D. Efecto diferencial de M15 y M17-2 sobre la frecuencia de Treg (FIGS. 32A y B) y su expresión de la proteína CTLA-4 (FIGS.32C y D). Los ratones se trataron como se describe en la FIG.29 y se sacrificaron el día 31 para la citometría de flujo.

[0055] Descripción detallada

[0056] Los inventores han descubierto proteínas de fusión de CTLA-4 solubles que contienen mutaciones que impiden su unión con la mayoría de los mAb anti-CTLA-4, a la vez que conservan su capacidad para unirse a B7-1 y B7-2 en las células presentadoras de antígenos (APC). Sorprendentemente, estas proteínas de fusión impiden las reacciones adversas autoinmunitarias de los mAb anti-CTLA-4 sin afectar a los efectos terapéuticos contra el cáncer de los anti-CTLA-4.

[0057] 1. Definiciones

[0058] La terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no se pretende que sea limitante. Como se usan en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0059] Para la enumeración de intervalos numéricos en el presente documento, cada número intermedio entre los mismos se contempla de manera explícita con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y, para el intervalo 6,0-7,0, se contemplan de manera explícita los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.

[0060] Como se utiliza en el presente documento, el término "proteína", "péptido" o "polipéptido" se refiere a una cadena de aminoácidos de cualquier longitud, independientemente de modificaciones (p. ej., fosforilación o glucosilación). Los aminoácidos pueden ser naturales, sintéticos o una modificación o combinación de naturales y sintéticos. Un polipéptido de la presente invención pueden ser un polipéptido recombinante, un polipéptido recombinante o un polipéptido sintético, preferentemente un polipéptido recombinante.

[0061] Como se utiliza en el presente documento, los términos "parte", "segmento" y "fragmento", cuando se usan en relación con polipéptidos, se refieren a una secuencia continua de restos, tales como restos de aminoácidos, cuya secuencia forma un subconjunto de una secuencia más grande. Por ejemplo, si un polipéptido se sometiera a tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas comunes, tales como tripsina o quimotripsina, los oligopéptidos resultantes de dicho tratamiento representarían partes, segmentos o fragmentos del polipéptido de partida. Un "fragmento" de un polipéptido se refiere, por tanto, a cualquier subconjunto del polipéptido que sea un polipéptido más corto de la proteína de longitud completa. En general, los fragmentos tendrán una longitud de cinco o más aminoácidos.

[0062] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "parte soluble" de una proteína significa la parte del polipéptido de longitud completa que no incluye ninguna parte de la parte o el segmento transmembrana. Por ejemplo, con respecto a CTLA-4, una parte soluble incluiría la parte extracelular (con o sin la secuencia señal N-terminal) pero no incluiría ninguna parte de la parte transmembrana (o, al menos, no lo suficiente como para reducir la solubilidad). Por tanto, el DEC del CTLA-4 humano se muestra como SEQ ID NO: 3 (es decir, aminoácidos 36-161 de la secuencia de longitud completa (SEQ ID NO: 1), donde los aminoácidos 1-35 comprenden la secuencia señal y no están incluidos en la proteína extracelular madura y, por tanto, soluble.

[0063] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "proteína de fusión" se define como una o más secuencias de aminoácidos unidas mediante métodos conocidos en la técnica. Las secuencias de aminoácidos unidas forman de este modo una proteína de fusión. Las proteínas de fusión conocidas en la técnica incluyen el péptido hexa-histidina, el marcador de hemaglutinina "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe (Wilson, I. A.et al.(1984) "The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein", Cell, 37:767-778) y el marcador "flag" (Knappik, A.et al.(1994) "An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments", Biotechniques 17(4):754-761).

[0064] Un derivado, análogo u homólogo, de un polipéptido (o fragmento del mismo) de la invención puede ser (i) uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos están sustituidos por un resto de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente un resto de aminoácido conservado) y dicho resto de aminoácido sustituido puede ser o no uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales se fusionan al polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de proproteína. Tales derivados y análogos se consideran dentro del alcance de los expertos en la materia a partir de las enseñanzas del presente documento. Como se utiliza en el presente documento, se entiende que el término "anticuerpo" indica una molécula de inmunoglobulina que posee un sitio de reconocimiento de antígeno de "región variable". Se entiende que la expresión "región variable" distingue dicho dominio de la inmunoglobulina de dominios que son ampliamente compartidos por anticuerpos (tales como un dominio Fc de anticuerpo). La región variable comprende una "región hipervariable" cuyos restos son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende restos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (es decir, normalmente aproximadamente en los restos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) y 89 a 97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y aproximadamente en los restos 27 a 35 (H1), 50 a 65 (H2) y 95 a 102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; ref. 44) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (es decir, los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53 a 55 (H2) y 96 a 101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Ref. 45). Los restos de la "región estructural" o "FR" son los restos de dominio variable distintos de los restos de región hipervariable como se define en el presente documento. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos camelizados, anticuerpos monocatenarios, Fv unidos por enlaces disulfuro (sdFv), intracuerpos y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (que incluyen, p. ej., anticuerpos anti-Id y anti-anti-Id contra los anticuerpos de la invención). En particular, dichos anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina de cualquier tipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (p. ej., IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgA<1>e IgA<2>) o subclase.

[0065] Como se utiliza en el presente documento, la expresión "fragmento activo" se refiere a una parte de un polipéptido o anticuerpo natural, o a un polipéptido con alta homología de secuencia (por ejemplo, al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos) con un polipéptido o anticuerpo natural y que conserve la actividad biológica. Los ejemplos representativos de "actividad biológica" incluyen la capacidad de unirse a las proteínas B7 y de unirse a sus receptores naturales o de unirse a un anticuerpo específico. Por ejemplo, un fragmento activo de CTLA-4 sería capaz de unirse a B7.1 o B7.2 o uniéndose a un ligando de CTLA-4. Dicho fragmento puede consistir en el dominio extracelular (DEC) de una proteína CTLA-4.

[0066] Como se utiliza en el presente documento, se entiende que el término "aislado" describe un compuesto de interés (p. ej., un polinucleótido o un polipéptido) que se encuentra en un entorno diferente de aquel en el que el compuesto se produce de forma natural, p. ej., separado de su medio natural, tal como concentrando un péptido a una concentración a la que no se encuentra en la naturaleza. Se entiende que "aislado" incluye compuestos que están dentro de muestras que están sustancialmente enriquecidas para el compuesto de interés y/o en las que el compuesto de interés está purificado parcial o sustancialmente.

[0067] "Sustancialmente idénticas" puede significar que una secuencia de aminoácidos primera y segunda son al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % sobre una región de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 o 300 aminoácidos.

[0068] "Tratamiento" o "tratar", cuando se refieren a la protección de un animal de una enfermedad, significan prevenir, suprimir, reprimir o eliminar completamente la enfermedad. La prevención de la enfermedad implica administrar una composición de la presente invención a un animal antes de la aparición de la enfermedad. La supresión de la enfermedad implica administrar una composición de la presente invención a un animal después de la inducción de la enfermedad, pero antes de su aparición clínica. La represión de la enfermedad implica administrar una composición de la presente invención a un animal después de la aparición de la enfermedad.

[0070] Como se utiliza en el presente documento, un polipéptido "variante" contiene al menos una alteración de la secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos del correspondiente polipéptido natural. Como se utiliza en el presente documento, una "alteración de la secuencia de aminoácidos" puede ser, por ejemplo, una sustitución, que puede ser conservadora, una supresión o una inserción de uno o más aminoácidos. Variante también puede significar una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína de referencia con una secuencia de aminoácidos y puede conservar al menos una actividad biológica. Una variante puede ser un derivado, análogo u homólogo, de un polipéptido. Una variante puede ser también una parte soluble de un polipéptido. Una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, reemplazar un aminoácido con un aminoácido diferente de propiedades similares (p. ej., hidrofilia, grado y distribución de las regiones con carga) se reconoce en la técnica como una que implica generalmente un cambio minoritario. Estos cambios menores se pueden identificar, en parte, teniendo en cuenta el índice hidropático de los aminoácidos, como se sabe en la técnica. Kyteet al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobia y carga. Se sabe en la técnica que los aminoácidos de índices hidropáticos similares pueden sustituirse y aún conservar la función proteica. En un aspecto, están sustituidos los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ±2. La hidrofilia de los aminoácidos también se puede utilizar para revelar sustituciones que darían lugar a proteínas que conservan la función biológica. Una consideración de la hidrofilia de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la mayor hidrofilia promedio local de ese péptido, una medida útil que se ha señalado que se correlaciona bien con la antigenicidad y la inmunogenicidad. Patente de EE. UU. N.º 4554101. La sustitución de aminoácidos que tiene valores de hidrofilia similares puede dar lugar a péptidos que conservan la actividad biológica, por ejemplo, inmunogenicidad, como se entiende en la técnica. Las sustituciones se pueden realizar con aminoácidos que tienen valores de hidrofilia en un intervalo de ±2 entre sí. Tanto el índice de hidrofobia como el valor de hidrofilia de los aminoácidos están influidos por la cadena lateral particular de ese aminoácido. De acuerdo con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos y, en particular, de las cadenas laterales de esos aminoácidos, como lo revela la hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño y otras propiedades.

[0072] 2. Interacciones B7-CTLA-4 e inmunoterapia

[0074] La capacidad de los linfocitos T para mediar de manera óptima en una respuesta inmunitaria contra un antígeno requiere dos interacciones de señalización distintas. En primer lugar, el antígeno que se ha dispuesto en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) debe presentarse a linfocitos T indiferenciados específicos de antígeno en forma de complejo peptídico del MHC (1, 2). Dicha presentación suministra una señal a través del receptor de linfocitos T (TCR) que dirige a los linfocitos T para que inicien una respuesta inmunitaria que será específica del antígeno presentado. En segundo lugar, una serie de señales coestimuladoras, mediada a través de interacciones entre las APC y distintas moléculas de superficie de linfocitos T, desencadena en primer lugar la activación y proliferación de los linfocitos T y en última instancia su inhibición (3-5). Por tanto, la primera señal confiere especificidad a la respuesta inmunitaria mientras que la segunda señal sirve para determinar la naturaleza, la magnitud y la duración de la respuesta limitando al mismo tiempo la autoinmunidad. Es particularmente importante entre estas segundas moléculas señal la unión entre los ligandos B7.1 (CD80) (6) y B7.2 (CD86) (7-9) de la APC y los receptores CD28 y CTLA-4 (10-12) del linfocito T.

[0076] CD28 (grupo de diferenciación 28) y el antígeno 4 asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) son miembros de la superfamilia de proteínas inmunoglobulinas y participan en la regulación de la activación de los linfocitos T. CD28 se expresa de forma constitutiva en los linfocitos T indiferenciados y se une a B7.1 y B7.2 proporcionando una señal coestimuladora necesaria para la activación y supervivencia de los linfocitos T. Por el contrario, tras la activación de los linfocitos T, el CTLA-4 se regula por aumento en los linfocitos T y compite con CD28 por la unión a B7.1 y B7.2, transmitiendo de este modo una señal supresora de la activación de los linfocitos T.

[0078] Las moléculas de la familia B7 tienen un dominio IgC (constante) proximal de membrana y un dominio IgV (variable) distal de membrana. La familia de receptores de tipo CD28 para estos ligandos comparten un dominio extracelular de tipo IgV común. Las interacciones de pares receptor-ligando están mediadas predominantemente a través de restos en los dominios IgV de los ligandos y receptores (Schwartz,et al., Nature Immunol., 3:427-434 (2002)). El análisis cristalográfico reveló que la interfaz de unión CTLA-4/B7 está dominada por la interacción del bucle análogo a CDR3 de CTLA-4, compuesto por un motivo MYPPPY (Schwartz,et al., Nature, 410:604-608 (2001); y Stamper,et al., Nature, 410:608-611 (2001)).

[0080] Se ha demostrado que los anticuerpos contra CTLA-4 bloquean la interacción entre CTLA-4 y las moléculas coestimuladoras B7.1 y B7.2in vitro.Este bloqueo elimina la señal inhibidora mediada por CTLA-4 en los linfocitos T y, de este modo, estimula una respuesta inmunitaria natural que puede usarse como terapia contra el cáncer. Se ha demostrado que el tratamiento con anticuerpos anti-CTLA-4 es una herramienta potente para potenciar la inmunidad antitumoral en modelos preclínicos (10). La monoterapia con un anticuerpo contra CTLA-4 promovió el rechazo de tumores trasplantables de diversos orígenes. Basándose en estudios prometedores de modelos tumorales preclínicos, se ha explorado el potencial clínico de los anticuerpos contra CTLA-4 en neoplasias malignas humanas diferentes. Aunque el anti-CTLA-4 (ipilimumab, comercializado como Yervoy, divulgado en la patente de EE. UU. n.º 6984720) ha demostrado su eficacia en el tratamiento del melanoma, el tratamiento y el direccionamiento de CTLA-4 se asocian a toxicidades de tipo autoinmunitario. Los efectos secundarios característicos de la inhibición de CTLA-4 generalmente se denominan acontecimientos adversos relacionados con el sistema inmunitario (irAE, por sus siglas en inglés) y los irAE más comunes son erupción cutánea, hepatitis, colitis y endocrinopatías, en particular hipopituitarismo. Por lo tanto, existe el deseo de mejorar la seguridad de los anticuerpos anti-CTLA-4 reduciendo los irAE asociados.

[0081] Los inventores han descubierto sorprendentemente que tanto el mAb terapéutico anti-CTLA-4 humano clínicamente probado como dos mAb anti-Ctla-4 de ratón inducen el rechazo tumoral sin bloquear las interacciones B7-CTLA-4 en condiciones fisiológicamente relevantes. Por lo tanto, el bloqueo de las interacciones de CTLA-4 con B7.1 o B7.2 no es necesario para el rechazo del tumor, ni siquiera para el mAb que puede bloquear de forma potente estas interacciones B7-CTLA-4. Estos datos refutan la hipótesis de que el mAb anti-CTLA-4 confiere un efecto inmunoterápico a través del bloqueo de los puntos de control (108). Por otra parte, los inventores han identificado un anticuerpo anti-CTLA-4, L3D10, con una reducción de las toxicidades relacionadas con el sistema inmunitario, lo que demuestra que la inmunidad contra el cáncer y los irAE pueden desacoplarse genéticamente.

[0082] 3. CTLA-4 soluble

[0083] La acumulación de datos ha demostrado que el gen humanoCTLA-4codifica dos isoformas diferentes de proteínas mediante corte y empalme alternativo: una con un dominio transmembrana que, por tanto, es probable que esté anclada en la membrana, y otra que carece del dominio transmembrana y se prevé que sea secretada (sCTLA-4, SEQ ID NO: 4) (128). Cabe destacar que algunos estudios genéticos han demostrado que un polimorfismo deCTLA-4que reduce la abundancia relativa de la isoforma soluble se asocia fuertemente con múltiples enfermedades autoinmunitarias (64). El hecho de que los sujetos con alelos propensos a la autoinmunidad expresen menos ARNm de sCTLA-4 sugiere que sCTLA-4 puede ser protector. Esta noción está respaldada por el amplio efecto terapéutico del abatacept (129, 130), que es una forma de CTLA-4 soluble, y por el estudio genético en el que la ablación selectiva de la isoforma sCTLA-4 aceleró el desarrollo de diabetes de tipo I en ratones (131).

[0084] Basándose en estos datos genéticos, los inventores tuvieron la idea de que el anticuerpo que muestra la peor unión a sCTLA-4 debería estar asociado con el menor número de irAE. De hecho, los inventores identificaron un anticuerpo anti-CTLA-4, L3D10, con toxicidades relacionadas con el sistema inmunitario reducidas que ha demostrado tener una unión reducida al sCTLA-4 en relación con el CTLA-4 unido a la membrana o inmovilizado. En función del impacto de los anticuerpos sobre el aumento de peso corporal en ratones tratados con anticuerpos anti-CTLA-4 durante el periodo perinatal, se encontró una fuerte correlación entre cuatro mAb anti-CTLA-4: el ipilimumab tiene la unión más fuerte a sCTLA-4 y es el anti-TCLA-4 más tóxico, mientras que el L3D10 tenía la unión más débil a sCTLA-4 y era el menos tóxico. Por otra parte, la humanización del anticuerpo L3D10 redujo preferentemente la unión a sCTLA-4 y pareció mejorar aún más el perfil de seguridad con respecto al anticuerpo original.

[0085] Con el fin de cartografiar el epítopo de unión a CTLA-4 del anticuerpo original L3D10 y las variantes humanizadas, los inventores aprovecharon el hecho de que las proteínas CTLA-4 de ratón y humana tienen reactividad cruzada entre especies con B7-1, pero no con los anticuerpos anti-CTLA-4. En consecuencia, los inventores diseñaron varios mutantes de la proteína CTLA-4Fc humana en los que grupos de aminoácidos de la proteína CTLA-4 humana se reemplazaron con aminoácidos de la proteína Ctla-4 murina (SEQ ID NO: 5). Como los anticuerpos anti-CTLA-4 utilizados en este estudio no se unen a Ctla-4 murino, la unión de los anticuerpos anti-CTLA-4 humano debe suprimirse cuando los restos clave del epítopo de unión del anticuerpo se reemplazan por aminoácidos murinos. En consecuencia, los inventores han mostrado que el sitio de unión a L3D10 de CTLA-4 se sitúa directamente adyacente al motivo de unión a B7-1, MYPPPY (SEQ ID NO: 50). Esto se correlaciona bien con la capacidad demostrada del anticuerpo para bloquear las interacciones B7-CTLA-4 tantoin vitrocomoin vivo.Por el contrario, el ipilimumab no bloquea la unión de B7.1 o B7.2 a abatacept en condiciones fisiológicas, por lo que también debe unirse a una región que no incluya el motivo MYPPPY. Sin embargo, ya que no muestra una unión reductora a sCTLA-4, el dominio de unión debe ser diferente del anticuerpo L3D10.

[0086] El sCTLA-4 endógeno se produce por fusión del extremo C-terminal truncado del dominio IgV extracelular directamente con el dominio intracelular, sin el dominio transmembrana intermedio. En consecuencia, solo hay 12 aminoácidos del dominio extracelular CTLA-4 C-terminal con respecto al motivo MYPPPY en sCTLA-4, mientras que la versión endógena unida a la membrana tiene 21 aminoácidos. Basándose en esto, sin desear quedar ligados a teoría alguna, parece que un anticuerpo que se une a restos polimórficos del dominio C-terminal, tales como L3D10, tiene más probabilidades de perder reactividad frente a sCTLA-4. Por otra parte, los inventores han demostrado que es posible mutar estos aminoácidos de la proteína CTLA-4Fc en esta región para que dejen de unirse a los anticuerpos anti-CTLA-4.

[0087] 4. Proteínas CTLA-4 recombinantes

[0088] La proteína de fusión CTLA-4Fc (abatacept, comercializada como Orencia) es un modulador selectivo de la coestimulación que comprende el dominio extracelular de CTLA-4 fusionado con la región Fc de IgG1 humana (mostrada en la FIG.1B; SEQ ID NO: 2) que inhibe la activación de las células T (linfocitos T) uniéndose a B7.1 y B7.2, bloqueando de este modo la interacción con CD28.In vitro,abatacept disminuye la proliferación de linfocitos T e inhibe la producción de las citocinas TNF alfa (TNFα), interferón-γ e interleucina-2. Los linfocitos T activados están implicados en la patogenia de la artritis reumatoide (AR) y se encuentran en el sinovio de los pacientes con AR. En un modelo de artritis inducida por colágeno en ratas, el abatacept suprime la inflamación, disminuye la producción de anticuerpos anticolágeno y reduce la producción específica de interferón-γ. Basándose en esta actividad preclínica, abatacept se ha desarrollado y aprobado para el tratamiento de la AR y la artritis idiopática juvenil (AIJ) en seres humanos.

[0089] Aunque son capaces de reducir las respuestas inmunitarias, las proteínas de fusión CTLA-4Fc que comprenden el dominio extracelular endógeno CTLA-4, tales como abatacept, son incapaces de reducir o mitigar las toxicidades relacionadas con el sistema inmunitario asociadas a las inmunoterapias anti-CTLA-4, ya que la actividad de ambas moléculas se compensa. La proteína de fusión CTLA-4, tal como el abatacept, no solo reducirá el efecto terapéutico de los mAb anti-CTLA-4 al unirse directamente a los anticuerpos para impedir que se unan a las moléculas CTLA-4 endógenas asociadas a las células, sino que también se volverá ineficaz en sí misma porque se eliminarán de la circulación tras formar inmunocomplejos con mAb anti-CTLA-4 en circulación.

[0090] Dado que los anticuerpos anti-CTLA-4 tanto bloqueantes como no bloqueantes tienen efectos antitumorales y que los anticuerpos que muestran irAE reducidos se asocian con una menor unión a sCTLA-4, los inventores diseñaron un panel de proteínas CTLA-4 solubles con mutaciones que impiden la unión por parte de la mayoría de los mAb anti-CTLA-4 que se probaron, a la vez que conservan su capacidad para unirse a B7-1 y B7-2 en las células presentadoras de antígenos, lo que es fundamental para la patogenia de las enfermedades autoinmunitarias y los irAE. Tales proteínas, en virtud de su actividad de unión a B7 conservada, pueden usarse en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como la AR y la AIJ. Por otra parte, tales proteínas pueden usarse junto con el tratamiento de inmunoterapia anti-CTLA-4 para reducir los irAE asociados, dejando intacta la actividad antitumoral de la inmunoterapia.

[0091] a. Proteínas CTLA-4

[0092] Una proteína CTLA-4 que comprende un dominio extracelular de CTLA-4 que comprende la secuencia establecida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 34, 36, 39, 40 y 46-48, en donde el dominio extracelular de CTLA-4 está fusionado con una región Fc de una proteína inmunoglobulina humana. La proteína CTLA-4 puede ser soluble. La proteína CTLA-4 puede también comprender un péptido señal N-terminal. La proteína CTLA-4 puede conservar la capacidad de unirse a B7.1 y B7.2 humanos pero carecer de la capacidad de unirse a un anticuerpo anti-CTLA-4. En una realización específica, la proteína CTLA-4 no se une a ipilimumab ni a tremelimumab en condiciones fisiológicas. La proteína CTLA-4 puede aislarse.

[0093] b. Proteínas de fusión de CTLA-4

[0094] La proteína CTLA-4 se fusiona en su extremo N o C-terminal con una región Fc de la proteína Ig de una proteína Ig de mamífero, que puede ser humana o de ratón. La región Fc puede comprender la región bisagra y los dominios CH2 y CH3 de la proteína Ig. La proteína lg puede ser IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgA. La proteína Ig también puede ser IgM y la parte Fc puede comprender la región bisagra y los dominios CH3 y CH4 de IgM. En una realización, la región Fc es IgG1 humana que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41. La proteína CTLA-4 puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17, 19, 21, 22, 23, 34, 36, 39, 40, 42, 43, 44 y 46-48.

[0095] La proteína CTLA-4 también puede fusionarse en su extremo N o C-terminal con un marcador de proteína, que puede comprender GST, His o FLAG. Los métodos para preparar proteínas de fusión y purificar proteínas de fusión son bien conocidos en la técnica.

[0096] 5. Anticuerpos anti-B7

[0097] Se divulga en el presente documento como referencia una composición de anticuerpos anti-B7 que se une al menos a uno de los B7-1 y B7-2 humanos. El anticuerpo anti-B7 puede unirse a uno o ambos de los B7-1 y B7-2 endógenos, y puede neutralizar la actividad sin afectar a la actividad inmunoterápica contra el cáncer de los anticuerpos anti-CTLA-4. El anticuerpo anti-B7 puede humanizarse para minimizar los anticuerpos antifarmacológicos. El anticuerpo anti-B7 puede ser un anticuerpo monoclonal y puede tener reactividad cruzada tanto con B7-1 como con B7-2. En otra realización más, un anticuerpo biespecífico puede comprender dominios de unión a antígeno de dos anticuerpos, que se unen respectivamente a B7-1 o B7-2

[0098] 6. Producción

[0099] La proteína CTLA-4 se puede preparar usando un sistema de expresión eucariota. El sistema de expresión puede implicar la expresión de un vector en células de mamíferos, tales como células de ovario de hámster chino (CHO). El sistema también puede ser un vector vírico, tal como un vector retrovírico de replicación defectuosa que se puede usar para infectar células eucarióticas. La proteína CTLA-4 también puede producirse a partir de una línea celular estable que expresa la proteína CTLA-4 a partir de un vector o una parte de un vector que se ha integrado en el genoma celular. La línea celular estable puede expresar la proteína CTLA-4 a partir de un vector retrovírico integrado de replicación defectuosa. El sistema de expresión puede ser GPEx<™>.

[0100] La proteína CTLA-4 puede purificarse usando, por ejemplo, métodos cromatográficos, tales como cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, intercambio iónico con DEAE, filtración en gel y cromatografía de hidroxiapatita. En algunas realizaciones, se pueden genomanipular proteínas de fusión para que contengan un dominio adicional que contenga una secuencia de aminoácidos que permita capturar los polipéptidos en una matriz de afinidad. Por ejemplo, una proteína CTLA-4 o un anticuerpo anti-B7 que comprende la región Fc de un dominio de inmunoglobulina puede aislarse a partir de sobrenadante de cultivo celular o de un extracto citoplasmático utilizando una columna de proteína A. Además, un marcador, tal como un marcador c-myc, hemaglutinina, polihistidina o Flag<™>(Kodak) pueden usarse para facilitar la purificación del polipéptido. Dichos marcadores pueden insertarse en cualquier lugar del polipéptido, incluso en el extremo carboxilo o amino. Otras fusiones que pueden ser útiles incluyen enzimas que ayudan en la detección del polipéptido, tales como fosfatasa alcalina. También se puede utilizar cromatografía de inmunoafinidad para purificar polipéptidos. Además, se pueden genomanipular proteínas de fusión para que contengan una señal secretora (si no hay una señal secretora ya presente) que haga que la proteína de fusión sea secretada por las células en las que se produce. A continuación, las proteínas de fusión secretadas pueden aislarse convenientemente del medio celular.

[0101] 7. Composiciones farmacéuticas

[0102] La invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína CTLA-4 de la presente invención, y un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable. Preferentemente, las composiciones de la invención comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de la proteína CTLA-4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0103] En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que ha sido aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o que figura en la farmacopea de los Estados Unidos o en otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y, más en particular, en seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante (p. ej., adyuvante de Freund (completo e incompleto), excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los derivados del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de glucosa y glicerol como portadores líquidos, en particular, para soluciones inyectables. Algunos excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también pueden contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares.

[0104] En general, los ingredientes de las composiciones de la invención pueden suministrarse bien por separado o mezclados conjuntamente en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente cerrado, tal como una ampolla o un sobrecito, que indica la cantidad de principio activo. Cuando la composición se ha de administrar por infusión, esta se puede dispensar con un frasco de infusión que contenga agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de manera que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.

[0105] Las composiciones de la invención pueden formularse en sus formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, las formadas con aniones tales como los derivados de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. y las formadas con cationes tales como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína, etc.

[0106] 8. Proteína CTLA-4 o composición farmacéutica para usos médicos

[0107] a. Enfermedad autoinmunitaria

[0108] La proteína CTLA-4 o la composición farmacéutica de la misma pueden ser para usar en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria. Entre las enfermedades y trastornos inflamatorios o autoinmunitarios representativos que pueden tratarse con polipéptidos de fusión B7-H4 se incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistémico (LES), alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad autoinmunitaria de Addison, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del oído interno, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (alps), púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (PTA), enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, miocardiopatía, esprúe celiaco-dermatitis, síndrome de fatiga crónica e inmunodeficiencia (CFIDS, por sus siglas en inglés), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, penfigoide cicatricial, enfermedad por crioaglutininas, síndrome de Crest, enfermedad de Crohn, enfermedad de Dego, dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, enfermedad de Graves, enfermedad de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), nefropatía por IgA, diabetes insulinodependiente (tipo I), artritis juvenil, enfermedad de Ménière, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis múltiple (EM), miastenia grave, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjögren, síndrome del hombre rígido, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener. En una realización particular, la enfermedad autoinmunitaria puede ser la artritis reumatoide (AR) o la artritis idiopática juvenil (AIJ). La proteína CTLA-4 o el anticuerpo anti-B7, o la composición farmacéutica de los mismos, pueden administrarse a un sujeto que los necesite. El sujeto puede ser un mamífero, tal como un ser humano.

[0109] La proteína CTLA-4 o composición farmacéutica de la misma pueden ser para usar junto con otro medicamento, tal como un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad (FAME). El fármaco puede ser un antiinflamatorio no esteroideo (AINE), que puede ser un derivado del ácido propiónico, un derivado del ácido acético, un derivado del ácido enólico, un derivado del ácido fenámico o un inhibidor selectivo de la Cox2. El medicamento puede ser también un corticoesteroide o metotrexato. El fármaco puede ser un producto biológico, que puede ser un antagonista del TNF-α tal como un anticuerpo anti-TNF-α o una proteína de fusión que se une al TNF-α (Enbrel), un mAb anti-CD20, un antagonista de las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86, tal como un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión (CTLA-4Ig) que se une a las dos moléculas, o un antagonista de un receptor de IL-1 o IL-6. La proteína CTLA-4 o el anticuerpo anti-B7, o la composición farmacéutica de los mismos, y el otro fármaco pueden administrarse juntos o secuencialmente.

[0110] b. Proteína CTLA-4 o composición farmacéutica para inmunoterapia

[0111] La proteína CTLA-4 de la presente invención o la composición farmacéutica de la misma también puede usarse para mitigar, reducir o tratar los acontecimientos adversos relacionados con el sistema inmunitario (irAE) asociados a la inmunoterapia anti-CTLA-4 en pacientes con cáncer. La proteína CTLA-4 puede administrarse de forma profiláctica (antes de la aparición de irAE) o terapéutica (después de la aparición de irAE). En particular, la proteína CTLA-4 o la composición farmacéutica de la misma puede ser para su administración a un sujeto junto con, o en un fondo de, inmunoterapia anti-CTLA-4. El sujeto puede ser un enfermo de cáncer. En una realización, la proteína CTLA-4 o el anticuerpo anti-B7, o la composición farmacéutica de los mismos, se usan profilácticamente para impedir los irAE antes de que se inicie el tratamiento anti-CTLA-4 o antes de que aparezcan los signos clínicos de irAE. En otra realización, la proteína CTLA-4 o el anticuerpo anti-B7, o la composición farmacéutica de los mismos, se usan terapéuticamente para tratar los irAE después de que se inicie el tratamiento anti-CTLA-4 y se diagnostiquen los síntomas clínicos.

[0112] c. Modos de administración

[0113] La proteína CTLA-4 o la composición farmacéutica de la misma pueden administrarse mediante un método que incluye, pero sin limitación, administración parenteral (p. ej., intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), epidural y mucosa (p. ej., vías intranasal y oral). En una realización específica, la proteína CTLA-4 o la composición farmacéutica de la misma es para administración por vía intramuscular, por vía intravenosa o por vía subcutánea. La composición puede ser para administración por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (p. ej., mucosa oral, rectal e intestinal, etc.) y puede ser para administración junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

[0114] Ejemplos

[0115] Ejemplo 1

[0116] El anticuerpo L3D10 quimérico tiene una actividad equivalente a la de 10D1 para provocar el rechazo tumoralEn el entorno clínico, se ha mostrado que el anticuerpo anti-CTLA-4, ipilimumab (mab 10D1), mejora la supervivencia de los pacientes con cáncer, pero induce reacciones adversas autoinmunitarias significativas. Usando ratones con activación del gen de CTLA-4 humano y ratones hu-PBL-Scid, anteriormente se demostró que los anticuerpos de ratón anti-CTLA-4 humano reducían el crecimiento tumoral y se identificó L3D10 como el más eficaz entre el panel de mAb sometidos a ensayo (21).

[0117] La disponibilidad de ratones con activación del gen de CTLA-4 humano (20) proporcionó una oportunidad sin precedentes para probar la actividad biológica del anticuerpo quimérico L3D10 anti CTLA-4 humano, que comprende la región variable L3D10 parental y el dominio constante IgG1 humano (la región Fc), con mAb anti-CTLA-4 de uso clínico, 10D1. En este modelo de ratón humanizado, un gen de CTLA-4 que codifica un producto con un 100 % de identidad con la proteína CTLA-4 humana se expresa bajo el control del locusCTLA-4endógeno de ratón. Cuando se comparó directamente la actividad antitumoral de los L3D10 y 10D1 quiméricos en el modelo tumoral MC38 en ratones con activación de CTLA-4 humano, resultó evidente que ambos anticuerpos eran comparables a la hora de provocar rechazo tumoral, mientras que los tumores crecieron progresivamente en el grupo control de IgG. La FIG.2 muestra los resultados del tratamiento con anticuerpos sobre el tamaño tumoral a partir de experimentos duplicados.

[0118] Ejemplo 2

[0119] Reducción de la reacción adversa autoinmunitaria mediante otros anticuerpos inmunoterápicosEstudios clínicos recientes han revelado que la combiterapia entre mAb anti-PD-1 y anti-CTLA-4 aumenta adicionalmente la supervivencia de los pacientes con melanoma en estadio terminal. Sin embargo, el 55 % de los pacientes que recibieron la combiterapia desarrollaron eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario (irAE) de grados 3 y 4. Por lo tanto, es fundamental desarrollar anticuerpos con menos toxicidad. Los presentes inventores han desarrollado un modeloin vivoque recapitula los irAE asociados a la combiterapia de mAb anti-CTLA-4 y anti-PD-1 observados en la clínica. En este modelo los presentes inventores trataron ratones con activación del gen de CTLA-4 humano (CTLA-4h/h

) durante el periodo perinatal con dosis altas de mAb anti-PD-1 y anti-CTLA-4. Descubrieron que, aunque los ratones jóvenes toleran el tratamiento con mAb individuales, la combiterapia con anti-PD-1 y 10D1 provoca irAE graves con inflamación de múltiples órganos, anemia y, como se muestra en la FIG. 3, crecimiento gravemente atrofiado. Por el contrario, cuando se combina con anti-PD-1, el L3D10 quimérico presenta solo irAE leve como lo demuestra el aumento de peso normal.

[0120] Para examinar adicionalmente la toxicidad relativa de L3D10 quimérico en comparación con 10D1 cuando se administra en combinación con anti-PD-1, los presentes inventores observaron los efectos patológicos en los ratones con activación de CTLA-4<h/h>42 días después de la administración. Como se muestra en la FIG.4, el peso corporal terminal (día 42) en ratones tratados con L3D10 anti-PD-1 fue similar al de los ratones tratados con anticuerpo de control negativo hIgG. Sin embargo, en comparación, el peso de los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 fue mucho menor. En consecuencia, cuando los presentes inventores observaron la anatomía general de estos ratones, el útero/ovario/vejiga y el timo eran notablemente más pequeños en ratones tratados con 10D1 PD-1 (FIG. 5). De nuevo, los órganos en los ratones tratados con L3D10 anti-PD-1 fueron comparables a los del control de hIgG. Por el contrario, los corazones disecados de ratones tratados con 10D1 parecían de un tamaño ligeramente mayor con un aspecto notablemente más blanco. Como resultado, los presentes inventores decidieron observar la eritropoyesis dentro de los ratones y observaron diferencias claras en los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 con respecto a los grupos tratados con L3D10 anti-PD-1 o anticuerpo de control, que eran bastante similares. Como se muestra en la FIG.6A, la médula ósea de ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 tenía un color notablemente más blanco y la sangre aislada era de color casi completamente blanco (FIG. 6B). De acuerdo con esto, cuando los presentes inventores observaron más de cerca las células que atravesaban las diferentes fases de desarrollo sanguíneo usando los marcadores CD71 y CD119. En la FIG. 6C se muestran perfiles de FACS representativos, mientras que los datos resumidos se presentan en la FIG.6d. Estos datos revelaron una reducción estadísticamente significativa en el número de células que experimentaban desarrollo de fase IV en los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 (FIG.6D).

[0121] Para determinar adicionalmente la toxicología de L3D10 frente a 10D1 junto con anti-PD-1, se realizó un análisis histológico del corazón, el pulmón, la glándula salival y el riñón y el hígado tras su fijación en formol al 10 % durante al menos 24 horas. En cada uno de los tejidos estudiados, los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 mostraron un nivel alto de infiltración de linfocitos T. La puntuación de toxicidad, basándose en la gravedad de la inflamación, se resume en la FIG.7, que muestra las altas puntuaciones de toxicidad de los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 con respecto a L3D10 anti-PD-1 que tiene puntuaciones solo marginalmente superiores al grupo de ratones de control de hIgG.

[0122] Ejemplo 3

[0123] L3D10 tiene unión reducida para CTLA-4 soluble.

[0124] L3D10 y 10D1 muestran patrones de unión similares para CTLA-4 inmovilizado en placa (FIG. 8). Como posible explicación de la toxicidad reducida de L3D10 con respecto a 10D1, particularmente el aumento de la infiltración/actividad de linfocitos T asociada a 10D1, los presentes inventores decidieron observar la unión a CTLA-4 soluble. Los presentes inventores eligieron analizar esto porque la asociación entre el polimorfismo de CTLA-4 y múltiples enfermedades autoinmunitarias se relaciona con la producción defectuosa de CTLA-4 soluble (67) y el silenciamiento genético de la isoforma sCTLA-4 aumentó la aparición de diabetes de tipo I en ratones (131). Por otra parte, el CTLA-4 soluble (abatacept y belatacept) es un fármaco ampliamente utilizado para la supresión inmunitaria. De acuerdo con esta idea, cuando los presentes inventores observaron la unión relativa a CTLA-4 soluble, observaron una notable disminución en la unión de L3D10 con respecto a 10D1 (FIG.9).

[0125] Los presentes inventores han demostrado que el mAb anti-CTLA-4 induce una inyección tumoral robusta en ratones Ctla-4<h/m>heterocigotos en los que solo el 50 % de las moléculas de CTLA-4 pueden unirse a mAb anti-CTLA-4 humano. Para determinar si la participación del 50 % de CTLA-4 es suficiente para inducir irAE, los presentes inventores trataron ratones Ctla-4<h/m>con anti-PD-1+10D1. Como se muestra en la FIG.10, anti-PD-1+10D1 no lograron inducir la pérdida de peso en los ratones Ctla-4<h/m>. Por lo tanto, los irAE y la inmunidad frente al cáncer pueden desacoplarse genéticamente.

[0126] La actividadin vivodemuestra que el anticuerpo L3D10 conserva su actividad antitumoral, pero muestra un efecto adverso autoinmunitario reducido observado con otros anticuerpos inmunoterápicos tales como 10D1, lo que indica que es posible potenciar la actividad antitumoral sin agravar los eventos adversos autoinmunitarios. En consecuencia, los efectos secundarios autoinmunitarios no son un precio necesario para la inmunidad frente al cáncer y es posible desacoplar estas dos actividades. La caracterización de L3D10 demostró que su capacidad para bloquear la interacción de CTLA-4 con B7.1 y B7.2 es más eficaz que la de 10D 1. Una caracterización adicional demuestra que L3D10 y 10D1 se unen a CTLA-4 inmovilizado con un perfil de unión similar. Sin embargo, L3D10 demuestra una afinidad de unión mucho menor a CTLA-4 soluble que 10D1.

[0127] Ejemplo 4

[0128] Anticuerpos humanizados L3D10 anti-CTLA-4

[0129] Los anticuerpos humanizados L3D10 se diseñaron mediante la creación de múltiples secuencias híbridas que fusionan partes específicas de la secuencia del anticuerpo parental con las secuencias estructurales humanas, incluyendo el injerto de las secuencias de CDR en armazones aceptores. Se evaluó la actividad antitumoral de tres de los anticuerpos humanizados (mAb4, mAb5 y mAb6) en comparación con 10D1 y el anticuerpo quimérico L3D10 utilizando el modelo tumoral de ratón MC38 singénico en ratones con activación de CTLA-4 humano descrito anteriormente en el ejemplo 1. La FIG. 11A muestra el programa de tratamiento del experimentoin vivo; a los ratones se les administraron un total de 4 dosis de anticuerpo cada 3 días a partir del día 7 después de la inoculación. Como se muestra en la FIG.11B, todos los anticuerpos humanizados erradicaron completamente el tumor y fueron comparables a 10D1. Se observó una eficacia similar utilizando el modelo tumoral singénico MC38 de ratón en ratones heterocigotos Ctla-4<h/m>y el modelo tumoral singénico de ratón de melanoma B16-F1 en ratones humanos con activación de CTLA-4 (datos no mostrados).

[0130] Para someter a ensayo si los perfiles de seguridad superiores de L3D10 pueden mantenerse después de la humanización, los presentes inventores compararon mAb4 y mAb5 con 10D1 por sus efectos adversos cuando se usaron en combinación con anti-PD-1. Como se muestra en la FIG.12, tanto mAb4 como mAb5 son menos tóxicos que 10D1 cuando se usan junto con anti-PD-1.

[0131] Ejemplo 5

[0132] Características de unión de los anticuerpos anti-CTLA-4 humanizados

[0133] Con el fin de confirmar que los anticuerpos humanizados conservaron sus características de unión a CTLA-4, los presentes inventores observaron la unión a CTLA-4 inmovilizado y unido a placa. La humanización no afectó a la unión a CTLA-4 inmovilizado y los 3 anticuerpos humanizados demostraron una unión similar al anticuerpo L3D10 quimérico parental (FIG.13). Sin embargo, la humanización reduce adicionalmente la unión de L3D10 a CTLA-4 soluble (FIG.

[0134] 14).

[0135] Los presentes inventores han demostrado que L3D10 quimérico tiene una actividad de bloqueo de B71000 veces mayor que 10D1. Esto planteó una posibilidad interesante de que el bloqueo de las interacciones B7-CTLA-4 pueda explicar su falta de irAE. Sin embargo, ni mAb4 ni mAb5 bloquean las interacciones B7-CTL-A4in vitroein vivo.El hecho de que mAb4 y mAb5 muestren irAE disminuidos respalda adicionalmente la idea de que el bloqueo de la interacción B7-CTLA-4 no es responsable de la mayor seguridad de L3D10.

[0136] Dada la función propuesta para CTLA-4 en la protección contra enfermedades autoinmunitarias, los presentes inventores propusieron una unión reducida a CTLA-4 soluble como mecanismo subyacente para mejorar los perfiles de seguridad. Para someter a ensayo esta hipótesis, los presentes inventores usaron el aumento de peso en crecimiento entre las ratonas que recibieron mAb anti-PD-1+anti-CTLA-4 durante el periodo perinatal como indicador básico para irAE. Se observó una reducción grave del aumento de peso en los ratones que recibieron tanto 10D1 como anti-PD-1, mientras que los que recibieron mAb5 anti-PD-1 tuvieron el irAE más bajo, seguidos de mAb4 y después L3D10 (datos no mostrados). La estricta correlación inversa con la unión reducida a sCTLA-4 es coherente con la hipótesis central.

[0137] Ejemplo 6

[0138] Cartografiado de epítopos del L3D10 y anticuerpos humanizados

[0139] Con el fin de cartografiar el epítopo de unión a CTLA-4 del anticuerpo L3D10 y las variantes humanizadas, mAb4 y mAb5, los presentes inventores aprovecharon el hecho de que las proteínas CTLA-4 de ratón y humana tienen reactividad cruzada con B7-1, pero no con los anticuerpos anti-CTLA-4. El hecho de que los anticuerpos anti-CTLA-4 humano no presentan reacción cruzada con Ctla-4 murino, supuestamente refleja diferencias en la secuencia de aminoácidos entre CTLA-4 humano y de ratón en el dominio extracelular. La FIG. 15 muestra la alineación de los dominios extracelulares de CTLA-4 humano, de macaco y de ratón y destacan la conservación de secuencias entre seres humanos y macacos, mostrando al mismo tiempo las numerosas diferencias entre las secuencias murinas y de primates. Debido a la conservación del motivo de unión MYPPPY (SEQ ID NO: 50), las proteínas CTLA-4 de ratón y humana presentan reacción cruzada con B7-1 (72).

[0141] En consecuencia, se diseñaron 11 mutantes de la proteína CTLA-4Fc humana, designados M1-M11 (SEQ ID NO: 7-17) en los que se sustituyeron grupos de aminoácidos de la proteína CTLA-4 humana por aminoácidos de la proteína Ctla-4 murina. Los aminoácidos incorporados en cada uno de los 11 mutantes se muestran en la FIG. 15, y las secuencias de aminoácidos de las proteínas CTLA-4Fc WT y mutantes se muestran en las FIGS.16A y B. Como los anticuerpos anti-CTLA-4 utilizados en este estudio no se unen a Ctla-4 murino, la unión de los anticuerpos anti-CTLA-4 humano debe suprimirse cuando los restos clave del epítopo de unión del anticuerpo se reemplazan por aminoácidos murinos.

[0143] Los vectores de ADN que codifican 11 proteínas mutantes CTLA-4Fc se construyeron basándose en la secuencia de CTLA-4Fc humana natural y las proteínas se produjeron mediante transfección transitoria en HEK293 a escala de 0,01 ml seguida de purificación mediante cromatografía de Proteína A de una etapa, y el rendimiento se indica en la tabla 1. Muchas de las mutaciones parecen afectar a la expresión de proteínas como lo indican sus rendimientos con respecto a la proteína CTLA-4Fc humana WT.

[0145] Tabla 1 Proteínas CTLA-4Fc WT mutantes roducidas de forma transitoria en células HEK293.

[0147]

[0150] La capacidad de L3D10 quimérico y los anticuerpos humanizados mAb4 y mAb5 para unirse a las construcciones mutantes de CTLA-4Fc inmovilizadas se determinó después mediante ELISA en la que las placas se recubrieron con las proteínas mutantes de CTLA-4 a 1 µg/ml y se añadieron anticuerpos anti-CTLA-4 biotinilados, o proteína de control de Ig B7-1, y la unión se midió usando estreptavidina conjugada con HRP. Los resultados de los ensayos de unión se muestran en las tablas 2-5. Como era de esperar, las 4 proteínas de unión demostraron una buena unión dependiente de la dosis para la proteína CTLA-4Fc WT. Sin embargo, las mutaciones que se introdujeron en las proteínas M9 y M10 parecen alterar la estructura general y estos mutantes no lograron unirse a B7-1Fc. Las mutaciones introducidas en M2 y M4 también alteraron parcialmente la conformación de CTLA-4, como lo indica la unión reducida con respecto a la proteína WT. De manera coherente con esta idea, los 4 mutantes (M2, M4, M9 y M10) se expresaron con un rendimiento mucho menor (tabla 1). Por el contrario, usando la unión a la proteína CTLA-4Fc WT y la unión de las proteínas B7-1Fc como referencias, M11 destaca claramente por ser una proteína que se expresa bien, se une a B7-1Fc de manera eficiente pero no logró unirse a dos anticuerpos anti-CTLA-4 humanizados. Su unión al L3D10 original también se reduce aproximadamente 100 veces (tabla 3). Como era de esperar, las mutaciones que afectan a la conformación global también afectaron a la unión a los anticuerpos anti-CTLA-4.

[0151]

[0154] 

[0157] 

[0158]

[0161] 

[0162] Puesto que L3D10 mantuvo una unión significativa con el M11, los presentes inventores sometieron a ensayo si la unión es específica. Recubrieron la placa con CTLA-4-Fc humano (hCTLA-4Fc), CTLA-4-Fc de ratón (mCTLA-4-Fc), IgG1-Fc de control o todos los hCTLA-4-Fc mutantes y midieron su unión a B7-1Fc junto con L3D10, mAb4 y mAb5. Los datos en bruto se presentan en la tabla 6. Como se muestra en la FIG.17, el B7-1 biotinilado se une a hCTLA-4, mCTLA-4 y M11, igual de bien. La especificidad del ensayo se demuestra por la falta de unión a IgG1-Fc. Resulta interesante que, mientras que la unión de L3D10 a M11 es más fuerte que la de IgG1-Fc y mCTLA-4-Fc, la unión significativa a IgG1-Fc sugiere que la unión del anticuerpo quimérico a M11 puede no ser específica. Por el contrario, ninguno de los anticuerpos humanizados se une a M11, mCTLA-4 y control de IgG1-Fc. Estos datos demuestran que las mutaciones introducidas en M11 impidieron selectivamente que L3D10, mAb4 y mAb5 se unan a CTLA-4.

[0163] Usando la estructura compleja conocida 133, los presentes inventores cartografiaron el epítopo de CTLA-4 en una estructura 3D. Como se muestra en la FIG. 18, el epítopo es reconocido por estos mAb ubicados dentro del área cubierta por B7-1. Así pues, la unión de L3D10, mAb4 y mAb5 a CTLA-4 sería mutuamente excluyente de la de B7-1. El bloqueo deficiente de mAb4 y mAb5 se debe a una menor avidez más que a dominios de unión distintivos.

[0164] Usando varios mutantes de la proteína CTLA-4Fc humana en los que grupos de aminoácidos de la proteína CTLA-4 humana se reemplazaron con aminoácidos de la proteína Ctla-4 murina, los presentes inventores demostraron claramente que cuando reemplazan 4 aminoácidos que siguen inmediatamente al dominio de unión a B7-1 conocido de CTLA-4, MYPPPY, la unión de los anticuerpos dependiente de la dosis se suprime en gran medida. El hecho de que el epítopo de unión se cartografíe directamente adyacente al dominio de unión de B7-1 se correlaciona bien con la capacidad demostrada de los anticuerpos L3D10 para bloquear las interacciones B7-CTLA-4 tantoin vitrocomoin vivo.

[0165] Ejemplo 7

[0166] Generación de proteínas de fusión que muestran una menor unión a uno o más mAb anti-CTLA-4 inmunoterápicos contra el cáncer

[0167] Los presentes inventores han generado un panel de 17 proteínas de fusión CTLA-4-Fc con diversas mutaciones, designadas M1-M17 (SEQ ID NO: 7-23), que incluyen las 11 proteínas identificadas en el ejemplo 10 (FIG.16) más 6 mutantes adicionales (FIG.19). Se realizaron más mutaciones en M17. Los nuevos mutantes se denominan M17-1, M17-2, M17-3 y M17-4 (SEQ ID NO: 42-45). Estas mutaciones se generaron anticipando que eliminarían la unión a un amplio espectro de anticuerpos anti-CTLA-4, pero mantendrían la unión a los ligandos de CTLA-4, CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2). Como primera etapa, ser aplicó una concentración determinada de las proteínas de fusión a la placa y se añadió B7-1Fc biotinilado. Como se muestra en las FIGS.20A y B, todas las proteínas de fusión excepto 2 (M9 y M10) conservan la unión a B7-1, aunque se encontró una reducción significativa de la unión a B7-1 en M2, M4 y M7. Dado que estas proteínas son funcionalmente menos activas, es poco probable que estos mutantes sean óptimos para la protecciónin vivocontra los efectos adversos autoinmunitarios. Datos adicionales demuestran que M15, M17, M17-1 y M17-2 mantuvieron una fuerte unión tanto a CD80 como a CD86 (FIG.21).

[0168] A continuación, se evaluó si estas proteínas mutantes (M1-M17, y M17-1 a M17-4) han perdido la unión a mAb anti-CTLA4 que están aprobados para uso en clínica o que se están desarrollando para terapia clínica. Se probaron un total de 4 mAb. Para mAb1 (ipilimumab), las proteínas de fusión M11, M13, M15, M17, M17-1, M17-2 y M17-3 han perdido la unión, por lo que pueden usarse para la protección contra enfermedades autoinmunitarias inducidas por este mAb (FIG.22A). Para enfermedades autoinmunitarias inducidas por mAb2 (tremelimumab), M15, M17, M17-2 y M17-3 serán eficaces (FIG.22B). Para mAb4 y mAb5, M11, M12, M14 y M16 son probablemente los más eficaces, aunque M3 y M17 también pueden funcionar (FIGS.23, 24 y 25).

[0169] Por lo tanto, como se resume en la tabla 7, la proteína de fusión CTLA4-Fc M17 tiene una actividad de amplio espectro para usar en la protección contra enfermedades autoinmunitarias inducidas por anticuerpos anti-CTLA4. M17-3 muestra baja unión a anticuerpos anti-CTLA4 pero baja unión a B7-1 y B7-2. Sin embargo, M17-2 mostró una mejor unión a B7-1 y B7-2 y, sin embargo, muestra una reactividad cruzada aceptablemente baja frente a una amplia gama de mAb anti-CTLA-4 humano.

[0170] Tabla 7

[0171] Identificación de proteínas de fusión CTLA4-Fc que conservan la unión a B7-1, pero no al mAb anti-CTLA4. La unió relativa se presenta mediante "+" o "-", donde "++++" es la unión más fuerte y "-" indica que no hay unión. ND = no determinado.

[0173]

[0175] Ejemplo 8

[0176] El bloqueo de B7-1 y B7-2 no impide el efecto inmunoterápico del ipilimumab

[0177] Un requisito crítico para tratar los efectos adversos relacionados con la inmunoterapia anti-CTLA-4 con mutantes CTLA-4-Fc que se unen a B7-1/B7-2 es que el bloqueo de B7-1 y B7-2 no afecte al efecto inmunoterápico. Dado que los ratones con mutaciones dirigidas deCd80(que codifica B7-1) yCd86(que codifica B7-2) no tienen Treg (17) y, por tanto, expresan muy poco Ctla4, los presentes inventores probaron esta predicción utilizando una dosis de saturación de mAb anti-B7-1 (1G10) y anti-B7-2 (GL-1), que bloquean la unión de CTLA-4 humano a mB7-1 y mB7-2, respectivamente (FIG.26A). Como se esquematiza en la FIG.26B, se trataron ratones portadores de tumores MC38 con ipilimumab junto con Ig de control o una combinación de mAb anti-mB7-1 y anti-mB7-2. Los mAb anti-mB7 utilizados enmascararon completamente todos los B7-1 y B7-2 en los PBL, ya que su unión al nuevo mAb anti-mB7 se reduce a lo observado en ratones con mutaciones dirigidas tanto deCd80como deCd86(dKO) (FIG.26C, D). El bloqueo funcional de B7 por mAb anti-B7-1 y anti-B7-2 se evaluó utilizando sueros recogidos el día 22 después de la provocación tumoral para evaluar la respuesta de anticuerpos IgG antihumanos y se confirmó por el hecho de que se anuló la respuesta de anticuerpos contra ipilimumab (FIG.26E). Cabe destacar que el bloqueo de saturación de mB7 no afectó al rechazo tumoral inducido por Ipilimumab, ya que los ratones tratados con Ig anti-mB7 y de control responden por igual al ipilimumab (FIG.26F). Estos datos indican que los anticuerpos anti-B7-1 y anti-B7-2, así como las proteínas de fusión de CTLA-4 de unión a B7 que no se unen a los anticuerpos anti-CTLA-4, pueden utilizarse para tratar la irAE asociados a la inmunoterapia anti-CTLA-4, dejando intacta la actividad inmunoterápica protectora.

[0178] Ejemplo 9

[0179] Proteínas de fusión CTLA-4 para usar en el tratamiento de los efectos adversos autoinmunitarios asociados a la terapia combinada anti-CTLA-4 y anti-PD-1.

[0180] La terapia combinada con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 representa la inmunoterapia más eficaz contra el cáncer. Sin embargo, ya que más del 50 % de los pacientes que reciben inmunoterapia desarrollan irAE, existe una necesidad urgente de desarrollar enfoques terapéuticos para tratar o prevenir los irAE. Como se demuestra en el ejemplo 8, el efecto inmunoterápico del ipilimumab (mAb1) no se ve afectado por el bloqueo de B7-1 y B7-2. Estos hallazgos impulsaron a los presentes inventores a probar si el CTLA-4Fc mutante puede utilizarse para tratar los irAE asociados a la combiterapia de ipilimumab+anti-PD-1. Dado que el ipilimumab no se une a las proteínas de fusión CTLA-4-Fc M11 o M15 (belatacept), se realizaron ensayos para ver si la coadministración de belatacept o M11 o M15 puede aliviar los irAE, utilizando el crecimiento retardado como indicador de irAE (véase el ejemplo 2). Como se muestra en la FIG. 27, dosis bajas de M11 (100 µg/inyección) o M15 (200 µg/inyección) impidieron los irAE. Además de M11 y M15, otras proteínas con propiedades similares, incluyendo M13, M16 e M17, también pueden usarse.

[0181] Ejemplo 10

[0182] Identificación de proteínas de fusión que no interfieren con la actividad inmunoterápica anti-CTLA4Para determinar si las proteínas de fusión CTLA-4-Fc interfieren con los efectos inmunoterápicos anti-CTLA4, se inyectaron a ratones portadores de tumores MC38 IgG Fc de control (200 µg/inyección) o ipilimumab (100 µg/inyección) junto con IgGFc de control (100 µg/inyección) o las proteínas de fusión de CTLA4, abetacept, M15 o M17 (100 µg/inyección) los días 7, 10, 13 y 17. La tasa de crecimiento tumoral se muestra en la Fig.28A, mientras que la supervivencia de los ratones hasta el criterio de valoración de eliminación temprana se muestra en la FIG.28B. Como era de esperar, El abatacept anuló el efecto inmunoterápico del ipilimumab. Por el contrario, M15 y M17 no interfirieron con el efecto terapéutico del ipilimumab.

[0183] Ejemplo 11

[0184] Modulación de la activación de linfocitos T y su efecto adverso asociado en ratones NSG reconstituidos con sistema hematopoyético humano

[0185] Para determinar el impacto de las proteínas de fusión CTLA-4 en la activación de linfocitos T humanos y los irAE asociadosin vivo, se reconstituyeron los ratones NSG de 3 semanas de edad con células madre hematopoyéticas humanas y se controló la activación de los linfocitos T. Como se muestra en las FIGS. 29-32, los distintos mAb de CTLA-4 parecen tener efectos diferentes sobre el fenotipo de los linfocitos T y los efectos adversos de ipilimumab. Por tanto, como se muestra en la FIG.29A, el tratamiento con ipilimumab impide que los ratones NSG aumenten de peso, y esto se impide mediante la coadministración de M15 o M17-2. Resulta interesante que M15 indujo una elevación de la alanina transaminasa cuando se utilizó junto con ipilimumab (FIG.29B). Estos datos sugieren que M15 puede inducir daño hepático cuando se utiliza junto con ipilimumab. Cabe destacar que no se observó tal efecto cuando se utilizó M17-2 junto con M15.

[0186] Para comprender la base inmunológica de la diferenciación entre M15 y M17, se sacrificaron los ratones NSG el día 31 y se analizó la composición de los subconjuntos de linfocitos T. Como se muestra en la FIG.30, M17 indujo más linfocitos T centrales de memoria, mientras reducía los linfocitos T efectores. La reducción de los linfocitos T efectores puede explicar el menor efecto adverso, ya que este es el subconjunto que migra a los órganos para causar destrucción inmunitaria. Por otra parte, ya que los linfocitos NKT son el principal mediador de la hepatitis, se compararon M15 y M17-2 con respecto a su impacto en los linfocitos NKT, en función de la expresión de CD56 y CD3. Como se muestra en la FIG.31, M17-2 redujo el número de NKT, mientras que M15 lo aumentó.

[0187] Los linfocitos T reguladores suprimen las enfermedades autoinmunitarias y la inmunidad contra el cáncer. Por lo tanto, es deseable reducir los Treg para mejorar la inmunidad contra el cáncer. Sin embargo, si la reducción es demasiado intensa, se puede inducir una enfermedad autoinmunitaria. De forma coherente con una función crítica de las interacciones B7-CD28 en la generación y mantenimiento de Treg en ratones, tanto M15 como M17-2 redujeron significativamente el % de Treg (FIGS. 32A y B). Sin embargo, M15 es mucho más eficaz en la reducción de Treg (FIGS.32A y B). Por otra parte, los Treg de ratones tratados con M15 tenían un CTLA-4 sustancialmente menor (FIGS.

[0188] 32C y D). Dada la función esencial de CTLA-4 en la función de los Tregin vivo, es probable que los Treg de los ratones tratados con M15 estén funcionalmente deteriorados. Por tanto, una reducción intensa de Treg combinada con una reducción selectiva de los niveles de proteína CTLA-4 sugieren una interesante posibilidad de que M15 pueda inducir la destrucción autoinmunitaria cuando se utiliza junto con ipilimumab.

[0189] REFERENCIAS CITADAS

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Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Una proteína CTLA-4 que comprende un dominio extracelular de CTLA-4 que comprende la secuencia establecida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 34, 36, 39, 40 y 46-48, en donde el dominio extracelular de CTLA-4 está fusionado con una región Fc de una proteína inmunoglobulina humana.

2. La proteína CTLA-4 de la reivindicación 1, que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 47.

3. La proteína CTLA-4 de la reivindicación 1 o 2, en donde la proteína CTLA-4 tiene la capacidad de unirse al menos a una de B7-1 y B7-2.

4. La proteína CTLA-4 de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína CTLA-4 no bloquea los efectos inmunoterápicos antineoplásicos de un anticuerpo anti-CTLA-4.

5. La proteína CTLA-4 de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo anti-CTLA-4 es ipilimumab.

6. La proteína CTLA-4 de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la secuencia de la proteína CTLA-4 comprende la secuencia establecida en una cualquiera de las SEQ ID NO: 17, 19, 22, 23 y 42-44.

7. La proteína CTLA-4 de la reivindicación 6, que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 43.

8. La proteína CTLA-4 de la reivindicación 7, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína CTLA-4 consiste en la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 43.

9. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína CTLA-4 de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable.

10. La proteína CTLA-4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la composición farmacéutica de la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento de acontecimientos adversos relacionados con la inmunidad asociados con la inmunoterapia anti-CTLA-4 en un sujeto.

11. La proteína o composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 10, en donde la inmunoterapia anti-CTLA-4 es un anticuerpo anti-CTLA-4.

12. La proteína o composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 11, en donde el sujeto tiene cáncer.

13. La proteína o composición farmacéutica para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en donde la proteína CTLA-4 comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 17.

14. La proteína o composición farmacéutica para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en donde la proteína CTLA-4 comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 23.

15. La proteína CTLA-4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la composición farmacéutica de la reivindicación 9 para su uso para minimizar los acontecimientos adversos autoinmunitarios asociados con la inmunoterapia contra el cáncer en un sujeto.

16. La proteína o composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 15, en donde la proteína CTLA-4 comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 17.

17. La proteína o composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 16, en donde la proteína CTLA-4 comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 23.