ES3060303T3 - Anti-fucosyl-gm1 antibodies - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a agentes de unión específicos, como anticuerpos y fragmentos de los mismos, capaces de unirse específicamente a la fucosil-GM1 (Fuc-GM1). También se refiere al uso de dichos agentes de unión en medicina y a los ácidos nucleicos que los codifican, a métodos para detectar Fuc-GM1, así como a métodos para tratar diversas enfermedades, incluido el cáncer, mediante anticuerpos anti-Fuc-GM1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Anticuerpos anti-fucosil-GM1

[0003] La presente invención se refiere a miembros de unión específicos, que son anticuerpos capaces de unir específicamente fucosil-GM1 (Fuc-GM1, por sus siglas en inglés). También se refiere al uso de tales anticuerpos en medicina y a ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos, a métodos para detectar Fuc-GM1, así como al uso de tales anticuerpos en métodos para tratar diversas enfermedades, incluido el cáncer, usando anticuerpos anti-Fuc-GM1.

[0004] La Fucα1-2Galβ1-3GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glc-ceramida (en lo sucesivo denominada glicolípido Fuc-GM1) es un monosialogangliósido esfingolípido compuesto por un componente lipídico ceramida, que ancla la molécula en la membrana celular, y un componente carbohidrato que queda expuesto en la superficie celular. Se biosintetiza (Figura 1) por adiciones sucesivas de azúcares y ácidos siálicos a la ceramida (una esfingosina y un ácido graso) a través de diferentes glucosiltransferasas (proteína transmembrana tipo I glucosilceramida sintetasa, β-galactosiltransferasa, GM1 sintetasa, α1,2-fucosiltransferasas) (Kartal Yandim, Apohan and Baran 2013; Tokudaet al.2006). La sobreexpresión de algunas de estas enzimas se ha relacionado con el carcinoma microcítico de pulmón (SCLC, por sus siglas en inglés) (Martin-Satueet al.1998), lo que sugiere además que Fuc-GM1 participa en el desarrollo tumoral. Los antígenos de carbohidratos son los que se expresan más abundantemente en la superficie celular de los cánceres (Feizi 1985). En algunos tipos de tumores, tal como el SCLC, las respuestas iniciales a la quimioterapia son impresionantes, pero rápidamente se producen recaídas quimiorrefractarias. La intervención con inmunoterapéuticos novedosos puede lograr superar la recaída resistente a los fármacos (Johnson 1995). Se ha demostrado que varios antígenos de carbohidratos, tales como los gangliósidos GD3 y GD2, funcionan como objetivos efectivos para la inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales (mAb, por sus siglas en inglés) (Irie and Morton 1986; Houghtonet al.1985). También se ha demostrado que los antígenos gangliósidos son objetivos efectivos para la inmunoterapia activa con vacunas en ensayos clínicos (Kruget al.

[0005] 2004; Dickleret al.1999; Livingstonet al.1994). De hecho, el suero derivado de pacientes con SCLC que desarrollaron títulos de anticuerpos frente a Fuc-GM1 después de la vacunación con antígeno conjugado con KLH (por sus siglas en inglés), demostró una unión específica a células tumorales y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés) específica del tumor. Las toxicidades asociadas al título de anti-Fuc-GM1 fueron leves y transitorias, y tres pacientes con SCLC en etapa limitada estaban libres de recaídas a los 18, 24 y 30 meses (Kruget al.2004; Dickleret al.1999).

[0006] La expresión de Fuc-GM1 se ha demostrado en un alto porcentaje, 75-90 %, de los casos de SCLC (Drivsholmet al.1994) y a diferencia de otros antígenos gangliósidos, el glicolípido Fuc-GM1 tiene poca o ninguna expresión en tejidos normales (Nilssonet al.1984; Kruget al.2004; Brezickaet al.1989; Zhanget al.1997; Brezickaet al.2000; Fredmanet al.1986; Brezickaet al.1991; Nilssonet al.1986). Se ha demostrado la presencia de Fuc-GM1 en medios de cultivo de líneas celulares de SCLC, en extractos tumorales y suero de xenoinjertos de ratón desnudo y en el suero de pacientes de SCLC con enfermedad en etapa extensa (Vangstedet al.1991; Vangstedet al.

[0007] 1994). Estos informes proporcionan pruebas convincentes de que el Fuc-GM1 es un antígeno tumoral altamente específico, que puede ser el objetivo de un inmunoterapéutico.

[0008] Por consiguiente, se desean agentes efectivos que reconozcan antígenos de cáncer de pulmón, dirigidos principalmente a glicoesfingolípidos tales como el glicolípido Fuc-GM1, y métodos para usar tales agentes. Un mAb (“F12”) que se une a Fuc-GM1 es conocido en la técnica (Brezickaet al.1989; Brezickaet al.2000). Además, WO2007/067992, WO99/15201 y WO2016/049256A1 divulgan anticuerpos anti-Fuc-GM1.

[0009] La invención proporciona un anticuerpo aislado capaz de unirse específicamente a Fucα1-2Galβ1-3GalNAcβl-4(Neu5Acα2-3)Galβl-4Glc-ceramida (glicolípido Fuc-GM1) pero no capaz de unirse a Fucα1-2Galβ1-3GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glc (azúcar libre), en donde el anticuerpo comprende las siguientes CDR (por sus siglas en inglés) de acuerdo con el sistema IMGT para numerar secuencias de anticuerpos:

[0010] (a) GYSITSGYS (CDRH1), IHYRGNT (CDRH2) y AQEPVRNYAMDYW (CDRH3) en combinación con QSIGDD (CDRL1), YVS (CDRL2) y QNGHGFPPT (CDRL3);

[0011] (b) GYSITSGYS (CDRH1), IHYRGNT (CDRH2) y AQEPVRNYAMDYW (CDRH3) en combinación con QSISDD (CDRL1), YVS (CDRL2) y QNGYSFPPT (CDRL3); o

[0012] (c) GYSITSGYS (CDRH1), IHYRGNT (CDRH2) y AQEPVRNYAMDFW (CDRH3) en combinación con QSISDD (CDRL1), YVS (CDRL2) y QNGHGFPPT (CDRL3).

[0013] La invención también proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención, que se une a un agente quimioterapéutico o citotóxico.

[0014] La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención y un excipiente, diluyente, portador, amortiguador o estabilizador farmacéuticamente aceptable.

[0015] La invención proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso como medicamento.

[0016] La invención también proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para usar en el tratamiento o prevención de un tumor.

[0017] La invención proporciona además un anticuerpo de acuerdo con la invención para usar en el tratamiento de un tumor, en donde:

[0018] (a) el anticuerpo está en una preparación combinada con un agente activo para uso simultáneo; o

[0019] (b) se administra un agente activo por separado o secuencialmente con el anticuerpo.

[0020] La invención proporciona un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de acuerdo con la invención.

[0021] Los anticuerpos aislados de la presente invención se unen al glicolípido Fuc-GM1 pero no al azúcar libre. Como se describe detalladamente en los ejemplos en la presente, inicialmente los mAb se generaron contra el glicolípido Fuc-GM1 formulado en liposomas con un adyuvante inmunitario para garantizar que los anticuerpos reconocieran Fuc-GM1 dentro de las membranas celulares. Sin embargo, no se consiguió inducir una respuesta de anticuerpos de alta afinidad. Para mejorar la inmunogenicidad del glicolípido Fuc-GM1, se conjugó con el portador de células T albúmina sérica humana (HSA, por sus siglas en inglés). Esto se consiguió mediante la eliminación de una de las cadenas lipídicas por ozonólisis y la conjugación química con HSA para proporcionar ayuda a las células T para la maduración por afinidad. Las inmunizaciones posteriores se realizaron con Fuc-GM1-HSA. Inesperadamente, esto produjo anticuerpos IgG que se unieron al glicolípido Fuc-GM1 pero no al azúcar libre. Este requisito de la presencia de una cadena lipídica para la unión del anticuerpo es muy sorprendente, ya que los anticuerpos generalmente no se unen a restos hidrofóbicos tales como los lípidos. Curiosamente, a pesar de haber sido generados contra Fuc-GM1-HSA, se unieron con una afinidad entre 1.000 y 10.000 veces mayor al glicolípido Fuc-GM1 y a las células tumorales. El mAb anti-FucGM1, F12, mostrado en la presente también se une a GM1, mientras que los anticuerpos de la presente invención no tienen reacción cruzada con GM1.

[0022] Los inventores han proporcionado anticuerpos que demuestran una potente actividad antitumoralin vivo. Los anticuerpos de la invención muestran una potente actividad citotóxica inmunomediada contra células humanas de SCLCin vitromediante citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) y CDC. Al inmunizar con conjugados de células/glicanos, los inventores han producido un mAb anti-Fuc-GM1 glicolípido. Los ejemplos de estos mAb son los mAb murinos IgG3 denominados en la presente “FL133.63” (Figuras 2a y d) y “FL133.67” (Figuras 2b y e), el mAb IgG1 “FL134.33” (Figuras 2c y f) y el Ab quimérico hlgG1 “CH134” (Figura 3).

[0023] Los anticuerpos de la presente invención tienen una distribución normal muy restrictiva, ya que los tejidos normales no expresan lípidos que contengan ácidos grasos 2-hidroxilo. Sin embargo, se unen fuertemente al SCLC. La especificidad se refleja en la distinta secuencia de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera FL133.63/FL133.67/FL134.33/CH134.33. Los anticuerpos de la presente invención pueden unirse a gangliósidos específicos de SCLC expresados en lípidos que contienen ácido graso 2-hidroxilo.

[0024] El anticuerpo de acuerdo con la invención comprende los dominios de unión que tienen una secuencia de aminoácidos según se establece como residuos 27 a 38 (CDRH1, por sus siglas en inglés) y residuos 56 a 65 (CDRH2) de la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 2a, b, c y 3a, es decir:

[0025] (a) las CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de la Figura 2a,

[0026] (b) las CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de la Figura 2b,

[0027] (c) las CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de la Figura 2c, o

[0028] (d) las CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de la Figura 3a.

[0029] El anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en 1-127 (VH, por sus siglas en inglés) de la Figura 2a, b, c o 3a.

[0030] El anticuerpo de acuerdo con la invención comprende dominios de unión que tienen la secuencia de aminoácidos de los residuos 27 a 38 (CDRL1, por sus siglas en inglés), 56 a 65 (CDRL2) y 105 a 113 (CDRL3) de las Figuras 2d, e, f o 3b, es decir:

[0031] (a) las CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de la Figura 2d,

[0032] (b) las CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de la Figura 2e,

[0033] (c) las CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de la Figura 2f, o

[0034] (d) las CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de la Figura 3b.

[0035] Cada dominio de unión puede ser portador de un marco de anticuerpos humanos.

[0036] Un anticuerpo aislado de la invención comprende la secuencia de aminoácidos establecida sustancialmente como residuos 1 a 124 (VL, por sus siglas en inglés) de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2d, e, f o 3b. El anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en los residuos 1 a 127 (VH) de la secuencia de aminoácidos de las Figuras 2a, b, c o 3a, y una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en los residuos 1 a 124 (VL) de la secuencia de aminoácidos de las Figuras 2d, e, f o 3b. Preferiblemente, el anticuerpo comprende:

[0037] (a) una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en los residuos 1 a 127 (VH) de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2a, y una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en los residuos 1 a 124 (VL) de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2d,

[0038] (b) una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en los residuos 1 a 127 (VH) de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2b, y una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en los residuos 1 a 124 (VL) de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2e,

[0039] (c) una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la establecida como residuos 1 a 127 (VH) de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2c, y una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la establecida como residuos 1 a 124 (VL) de la secuencia de aminoácidos de la Figura 2f, o

[0040] (d) una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en los residuos 1 a 127 (VH) de la secuencia de aminoácidos de la Figura 3a, y una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en los residuos 1 a 124 (VL) de la secuencia de aminoácidos de la Figura 3b.

[0041] Una vez que se ha aislado un mAb arquetípico, por ejemplo, un mAb glicolípido Fuc-GM1, que tiene las propiedades deseadas descritas en la presente, es sencillo generar otros mAb con propiedades similares, usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el método de Jesperset al., 1994 (Jesperset al.1994), pueden usarse para guiar la selección de mAb que tengan el mismo epítopo y por lo tanto propiedades similares al mAb arquetípico. Usando el despliegue en fagos, primero se empareja la cadena pesada del anticuerpo arquetípico con un repertorio de cadenas ligeras (preferiblemente humanas) para seleccionar un mAb de unión a gangliósidos, y posteriormente se empareja la nueva cadena ligera con un repertorio de cadenas pesadas (preferiblemente humanas) para seleccionar un mAb de unión a gangliósidos (preferiblemente humano) que tenga el mismo epítopo que el mAb arquetípico.

[0042] Un miembro de unión específico puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, Fab, (Fab')<2>, scFv, Fv, dAb, Fd o un diacuerpo (por sus siglas en inglés, respectivamente). El anticuerpo puede ser policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal (mAb). Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos humanizados, quiméricos o revestidos, o pueden ser anticuerpos no humanos de cualquier especie.

[0043] Los anticuerpos murinos o quiméricos conllevan un mayor riesgo de reacciones adversas por anticuerpos antimurinos (HAMA, por sus siglas en inglés) en los pacientes (Schroffet al.1985; Azinovicet al.2006; Miottiet al.

[0044] 1999; D'Arcy and Mannik 2001). Por consiguiente, la mayoría de los mAb terapéuticos aprobados son anticuerpos IgG humanizados o totalmente humanos.

[0045] El anticuerpo de la invención puede comprender una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se muestra en la Figura 2a y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se muestra en la Figura 2d.

[0046] El anticuerpo de la invención puede comprender una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se muestra en la Figura 2b y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se muestra en la Figura 2e.

[0047] El anticuerpo de la invención puede comprender una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se muestra en la Figura 2c y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se muestra en la Figura 2f.

[0048] El anticuerpo de la invención puede comprender una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se muestra en la Figura 3a y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se muestra en la Figura 3b.

[0049] El anticuerpo puede competir por la unión a gangliósidos que contienen Fuc-GM1 con un anticuerpo que comprende una cadena VH que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a 127 de la Figura 2a, b, c o 3a y una cadena VL que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 a 124 de la Figura 2d, e, f o 3b, preferiblemente la cadena VH de la Figura 2a en combinación con la cadena VL de la Figura 2d, la cadena VH de la Figura 2b en combinación con la cadena VL de la Figura 2e, la cadena VH de la Figura 2c en combinación con la cadena VL de la Figura 2f, la cadena VH de la Figura 3a en combinación con la cadena VL de la Figura 3b. Un anticuerpo de acuerdo con la invención que es capaz de unirse específicamente al glicolípido Fuc-GM1 pero no al azúcar libre (Fucα1-2Galβ1-3GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glc) puede ser al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntico en el dominio VH y/o VL a los dominios VH o VL de las Figuras 2 o 3. El anticuerpo de acuerdo con la invención puede ser al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntico a la cadena pesada y/o a la cadena ligera de las Figuras 2 o 3. Preferiblemente, tales anticuerpos difieren de las secuencias de las Figuras 2 o 3 por un pequeño número de sustituciones de aminoácidos funcionalmente intrascendentes (por ejemplo, sustituciones conservativas), deleciones o inserciones.

[0050] El anticuerpo de la invención puede llevar una etiqueta detectable o funcional.

[0051] En otros aspectos, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo de la invención, tal como un anticuerpo que es al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % idéntico a las secuencias proporcionadas en la presente.

[0052] Los anticuerpos de la invención pueden usarse en un método de tratamiento o diagnóstico del cuerpo humano o animal, tal como para su uso en un método de tratamiento de un tumor en un paciente (preferiblemente humano) que comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención. La invención también proporciona un anticuerpo de la presente invención para usar como medicamento, preferiblemente para usar en el tratamiento de un tumor. El tumor puede ser un carcinoma microcítico de pulmón.

[0053] En la presente se divulga el antígeno al que se unen los anticuerpos de la presente invención. Puede proporcionarse un glicolípido Fuc-GM1 que sea capaz de unirse, preferiblemente de forma específica, a un anticuerpo de la presente invención. El glicolípido Fuc-GM1 puede proporcionarse en forma aislada, y puede usarse en una examinación para desarrollar más anticuerpos para el mismo. Por ejemplo, se puede examinar una biblioteca de compuestos en busca de miembros de la biblioteca que se unan específicamente al Fuc-GM1. El Fuc-GM1 puede sobre una cadena principal lipídica.

[0054] Un anticuerpo aislado de la invención puede usarse en el diagnóstico o pronóstico del SCLC.

[0055] Un método para el diagnóstico del cáncer puede comprender usar un anticuerpo de la invención para detectar Fuc-GM1 que contiene GSL (por sus siglas en inglés) en una muestra de un individuo. En el método de diagnóstico, el patrón de gangliósidos detectado por el anticuerpo puede usarse para estratificar las opciones terapéuticas para el individuo.

[0056] Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle a continuación.

[0057] Como se usa en la presente, un “miembro de unión específica” es un miembro de un par de moléculas que tienen especificidad de unión entre sí. Los miembros de un par de unión específico pueden derivarse de forma natural o producirse total o parcialmente de forma sintética. Uno de los miembros del par de moléculas tiene una zona en su superficie, que puede ser una protuberancia o una cavidad, que se une específicamente y por lo tanto es complementaria de una organización espacial y polar particular del otro miembro del par de moléculas. Así, los miembros del par tienen la propiedad de unirse específicamente entre sí. Los ejemplos de tipos de pares de unión específicos son antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, receptor hormonal-hormona, receptor-ligando, enzimasustrato. La presente invención se refiere en general a reacciones de tipo antígeno-anticuerpo.

[0058] Como se usa en la presente, “tratamiento” incluye cualquier régimen que pueda beneficiar a un animal humano o no humano, preferiblemente mamífero. El tratamiento puede referirse a una condición existente o ser profiláctico (tratamiento preventivo).

[0059] Como se usa en la presente, un “tumor” es un crecimiento anormal de tejido. Puede estar localizada (benigna) o invadir tejidos cercanos (maligna) o distantes (metastásica). Los tumores incluyen crecimientos neoplásicos que causan cáncer e incluyen el SCLC, así como tejidos o líneas celulares cancerosos.

[0060] El término “anticuerpo” como se usa en la presente se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno, ya sea natural o parcial o totalmente producido sintéticamente. El término también abarca cualquier polipéptido o proteína que tenga un dominio de unión que sea, o sea homólogo a, un dominio de unión de anticuerpos. Pueden proceder de fuentes naturales o ser producidos parcial o totalmente de forma sintética. Los ejemplos de anticuerpos de la invención son los isotipos de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) y sus subclases isotípicas; fragmentos que comprenden un dominio de unión a antígeno tal como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; y diacuerpos. Los isotipos preferidos son IgG1 e IgG3. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Un anticuerpo monoclonal puede denominarse “mAb”.

[0061] Es posible tomar anticuerpos monoclonales y de otro tipo y usar técnicas de la tecnología del ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que conserven la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas pueden implicar la introducción de ADN que codifique la región variable de la inmunoglobulina, o las CDR, de un anticuerpo en las regiones constantes, o regiones constantes más regiones marco, de una inmunoglobulina diferente. Ver, por ejemplo, EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400. Un hibridoma u otra célula productora de un anticuerpo puede estar sujeto a mutaciones genéticas u otros cambios, que pueden alterar o no la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.

[0062] Dado que los anticuerpos pueden modificarse de diversas formas, el término “anticuerpo” debe interpretarse como que abarca cualquier miembro o sustancia de unión específica que tenga un dominio de unión con la especificidad requerida. Así, este término abarca fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, anticuerpos humanizados, incluido cualquier polipéptido que comprenda un dominio de unión a inmunoglobulina, ya sea natural o total o parcialmente sintético. Se incluyen por lo tanto las moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión a inmunoglobulina, o equivalente, fusionado a otro polipéptido. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en EP-A-0120694 y EP-A-0125023. Un anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo modificado que tiene las regiones variables de un anticuerpo no humano, por ejemplo, murino, y la región constante de un anticuerpo humano. Los métodos para fabricar anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. No.5225539.

[0064] Se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden desempeñar la función de unir antígenos. Los ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab compuesto por los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd compuesto por los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv compuesto por los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Wardet al.1989) que consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')<2>, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados; (vii) moléculas Fv de cadena simple (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL están enlazados por un enlazador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión al antígeno (Birdet al.1988; Hustonet al.1988); (viii) dímeros de Fv de cadena única biespecíficos (PCT/US92/09965) y; (ix) “diacuerpos”, fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión génica (WO94/13804; (Holliger, Prospero y Winter 1993)).

[0066] Los diacuerpos son multímeros de polipéptidos, cada polipéptido comprende un primer dominio que comprende una región de unión de una cadena ligera de inmunoglobulina y un segundo dominio que comprende una región de unión de una cadena pesada de inmunoglobulina, los dos dominios están enlazados (por ejemplo, por un enlazador peptídico) pero incapaces de asociarse entre sí para formar un sitio de unión a antígeno: los sitios de unión a antígeno se forman por la asociación del primer dominio de un polipéptido dentro del multímero con el segundo dominio de otro polipéptido dentro del multímero (WO94/13804).

[0068] Cuando se vayan a usar anticuerpos biespecíficos, éstos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales, que pueden fabricarse de diversas maneras (Holliger y Winter 1993), por ejemplo, preparados químicamente o a partir de hibridomas, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos mencionados anteriormente. Puede ser preferible usar dímeros o diacuerpos de scFv en lugar de anticuerpos enteros. Los diacuerpos y los scFv pueden construirse sin región Fc, usando solamente dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de la reacción antiidiotípica. Otras formas de anticuerpos biespecíficos incluyen los “Janusins” de cadena simple (por su nombre en inglés) descritos en (Traunecker, Lanzavecchia and Karjalainen 1991).

[0070] Los diacuerpos biespecíficos, a diferencia de los anticuerpos enteros biespecíficos, también pueden ser útiles porque pueden construirse y expresarse fácilmente enE. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos tales como fragmentos de anticuerpos) con especificidades de unión adecuadas pueden seleccionarse fácilmente mediante el despliegue en fagos (WO94/13804) a partir de bibliotecas. Si uno de los brazos del diacuerpo debe mantenerse constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el antígeno X, posteriormente se puede hacer una biblioteca en la que se varíe el otro brazo y se seleccione un anticuerpo de la especificidad adecuada.

[0071] Un “dominio de unión” es la parte de un miembro de unión específico (por ejemplo, el anticuerpo) que comprende la zona que se une específicamente a un antígeno y es complementaria a una parte o a la totalidad del mismo. Cuando el miembro de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, el dominio de unión puede ser una CDR. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo solamente puede unirse a una parte particular del antígeno, que se denomina epítopo. Uno o más dominios variables de anticuerpo pueden proporcionar un dominio de unión a antígeno. Un dominio de unión a antígeno puede comprender una región variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL) y una región variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH).

[0073] “Específico” se usa generalmente para referirse a la situación en la que un miembro de un par de unión específico no mostrará ninguna unión significativa a moléculas distintas de su(s) pareja(s) de unión específica y, por ejemplo, tiene menos de aproximadamente 30 %, preferiblemente 20 %, 10 % o 1 % de reactividad cruzada con cualquier otra molécula. El término también es aplicable cuando, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno es específico para un epítopo particular que es portado por varios antígenos, en cuyo caso, el miembro de unión específico portador del dominio de unión a antígeno podrá unirse a los diversos antígenos portadores del epítopo.

[0075] “Aislado” se refiere al estado en el que preferiblemente estarán los anticuerpos de la invención o el ácido nucleico que codifica tal anticuerpo, de acuerdo con la presente invención. Los miembros y el ácido nucleico estarán generalmente libres o sustancialmente libres de material con el que están asociados de forma natural, tal como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los que se encuentran en su entorno natural, o el entorno en el que se preparan (por ejemplo, cultivo celular) cuando dicha preparación se realiza mediante tecnología de ADN recombinante practicadain vitrooin vivo. Los miembros de unión específicos y el ácido nucleico pueden formularse con diluyentes o adyuvantes y seguir estando aislados a efectos prácticos; por ejemplo, los miembros se mezclarán normalmente con gelatina u otros portadores si se usan para recubrir placas de microtitulación para su uso en inmunoensayos, o se mezclarán con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se usen en diagnóstico o terapia. Los miembros de unión específicos pueden estar glucosilados, de forma natural o por sistemas de células eucariotas heterólogas, o pueden estar (por ejemplo, si se producen por expresión en una célula procariota) sin glucosilar.

[0077] Por “sustancialmente como se establece” se entiende que la(s) secuencia(s) de aminoácidos de la invención será(n) idéntica(s) o altamente homóloga(s) a la(s) secuencia(s) de aminoácidos mencionada(s). Por “altamente homóloga” se entiende que puede haber de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3, 2 o 1 sustituciones en la secuencia.

[0079] La invención también incluye dentro de su alcance polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos como se indica en la Figura 2 o 3, polinucleótidos que tienen las secuencias de ácido nucleico como se indica en la Figura 2 o 3 y secuencias que tienen una identidad sustancial dentro del mismo, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % de identidad dentro del mismo. El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos se determina generalmente alineando las secuencias con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la primera secuencia para obtener el mejor alineamiento con la segunda secuencia) y comparando los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones correspondientes. El “mejor alineamiento” es un alineamiento de dos secuencias que resulta en el mayor porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se determina comparando el número de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos dentro de las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x100).

[0081] La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse usando un algoritmo matemático conocido por los expertos en la técnica. Un ejemplo de algoritmo matemático para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin and Altschul, 1990 (Karlin and Altschul 1990), modificado como en Karlin and Altschul, 1993 (Karlin and Altschul 1993). Los programas NBLAST y XBLAST de Altschulet al., 1990 (Altschulet al.1990) han incorporado tal algoritmo. Se pueden realizar búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una molécula de ácido nucleico de la invención. Se pueden realizar búsquedas de proteínas BLAST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína de la invención. Para obtener alineamientos con huecos con fines de comparación, se puede usar Gapped BLAST como se describe en Altschulet al., 1997 (Altschulet al.1997). Alternativamente, PSI-Blast puede usarse para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre moléculas (Id.). Al usar los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo de algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers and Miller, 1989 (Myers and Miller 1989). El programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de software de alineamiento de secuencias GCG, ha incorporado tal algoritmo. Otros algoritmos para el análisis de secuencias conocidos en la técnica incluyen ADVANCE y ADAM descritos en Torellis and Robotti, 1994 (Torelli and Robotti 1994); y FASTA descrito en Pearson and Lipman, 1988 (Pearson and Lipman 1988). Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y la velocidad de la búsqueda.

[0083] Los anticuerpos aislados de la presente invención son capaces de unirse a un glicoesfingolípido específico (GSL) pero no al azúcar libre del glicoesfingolípido. Excepcionalmente, los anticuerpos de la invención requieren la presencia del lípido para unirse. Los GSL son un grupo muy diverso de moléculas que estructuralmente consisten en glicanos unidos a un resto lipídico de ceramida (esfingosina unida a un ácido graso mediante un enlace amida). Las estructuras de ceramida varían en longitud y saturación, lo que contribuye a la diversidad de especies de GSL, pero la principal fuente de diversidad procede del grupo de cabeza del glicano. A diferencia de los aminoácidos o los ácidos nucleicos, que solamente pueden unirse linealmente, los hidratos de carbono pueden unirse entre sí en múltiples puntos.

[0085] Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de las inmunoglobulinas pueden determinarse consultando http://www.imqt.orq/.

[0087] Los dominios variables pueden derivarse de cualquier dominio variable humano de línea germinal o reordenado, o pueden ser un dominio variable sintético basado en secuencias consenso de dominios variables humanos conocidos. Las secuencias derivadas de CDR3 de la invención pueden introducirse en un repertorio de dominios variables que carezcan de regiones CDR3, usando tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, Markset al., 1992 (Markset al.1992) describen métodos de producción de repertorios de dominios variables de anticuerpos en los que se usan cebadores de consenso dirigidos al extremo 5' de la zona del dominio variable o adyacentes a él, junto con cebadores de consenso a la tercera región marco de los genes VH humanos, para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de una CDR3. Markset al., 1992 (Markset al.1992) describen además cómo puede combinarse este repertorio con una CDR3 de un anticuerpo particular. Usando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención pueden barajarse con repertorios de dominios VH o VL que carezcan de CDR3, y los dominios VH o VL completos barajados combinarse con un dominio VL o VH afín para proporcionar anticuerpos de la invención. Posteriormente, el repertorio puede desplegarse en un sistema hospedero adecuado, tal como el sistema de despliegue en fagos de WO92/01047, de modo que puedan seleccionarse los miembros de unión específicos adecuados. Un repertorio puede constar de 10<4>miembros individuales o más, por ejemplo, de 10<6>a 10<8>o 10<10>miembros.

[0088] Stemmer, 1994 (Stemmer 1994) también divulga técnicas análogas de barajado o combinatorias, y describe la técnica en relación con un gen de betalactamasa, pero observa que el enfoque puede usarse para la generación de anticuerpos. Otra alternativa es generar nuevas regiones VH o VL que lleven las secuencias derivadas de CDR3 de la invención usando mutagénesis aleatoria de, por ejemplo, los genes Fuc-GM1 VH o VL para generar mutaciones dentro de todo el dominio variable. Tal técnica es la descrita por Gramet al., 1992 (Gramet al.1992), que usaron la PCR (por sus siglas en inglés) propensa a errores.

[0089] Otro método que puede usarse es la mutagénesis directa en las regiones CDR de los genes VH o VL. Tales técnicas son divulgadas por Barbaset al., 1994 (Barbaset al.1994) y Schieret al., 1996 (Schieret al.1996). Una parte sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina comprenderá generalmente al menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones marco intermedias. La porción también puede incluir al menos aproximadamente 50 % de una o ambas de las regiones marco primera y cuarta, siendo 50 % el C-terminal 50 % de la primera región marco y 50 % el N-terminal de la cuarta región marco. Los residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de la parte sustancial del dominio variable pueden ser aquellos que no se asocian normalmente con las regiones de dominio variable que se producen de forma natural. Por ejemplo, la construcción de anticuerpos de la presente invención realizados mediante técnicas de ADN recombinante puede resultar en la introducción de residuos N- o C-terminales codificados por enlazadores introducidos para facilitar la clonación u otros pasos de manipulación, incluyendo la introducción de enlazadores para unir dominios variables de la invención a otras secuencias proteicas incluyendo cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo, en la producción de diacuerpos) o etiquetas proteicas como se discute con más detalle a continuación.

[0090] La invención proporciona anticuerpos que comprenden un par de dominios de unión basados en las secuencias de aminoácidos para las regiones VL y VH sustancialmente como se establece en las Figuras 2 y 3, es decir, aminoácidos 1 a 127 (VH) de la Figura 2a, b, c o 3a y aminoácidos 1 a 124 (VL) de la Figura 2d, e, f o 3b. En el caso de los dominios de unión basados en la secuencia de aminoácidos para la región VH expuesta sustancialmente en las Figuras 2a, b, c o 3a, tales dominios de unión pueden usarse como agentes de direccionamiento, ya que se sabe que los dominios VH de inmunoglobulina son capaces de unirse a antígenos objetivo de manera específica. En el caso de cualquiera de los dominios de unión específicos de cadena única, estos dominios pueden usarse para cribar dominios complementarios capaces de formar un miembro de unión específico de dos dominios que tenga propiedadesin vivotan buenas o iguales a las de los anticuerpos FL133/4 divulgados en la presente.

[0091] Esto puede conseguirse mediante métodos de cribado por despliegue en fagos que utilicen el denominado enfoque combinatorio dual jerárquico divulgado en WO92/01047, en el que una colonia individual que contiene un clon de cadena H o L se usa para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H) y el miembro de unión específico de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con técnicas de despliegue en fagos tales como las descritas en dicha referencia. Esta técnica también se divulga en Markset al., 1992 (Markset al.1992).

[0092] Los anticuerpos de la presente invención pueden comprender además regiones constantes de anticuerpos o partes de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos basados en la región VL mostrada en las Figuras 2d, e, f o 3b pueden unirse en su extremo C-terminal a dominios constantes de cadena ligera de anticuerpos. Del mismo modo, los anticuerpos basados en la región VH mostrada en la Figura 2a, b, c o 3a pueden unirse en su extremo C-terminal a toda o parte de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM y cualquiera de las subclases de isotipo, particularmente IgG1, IgG2 e IgG4.

[0093] Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en métodos de diagnóstico y tratamiento de tumores en sujetos humanos o animales.

[0094] Cuando se usan en diagnóstico, los anticuerpos de la invención pueden etiquetarse con una etiqueta detectable, por ejemplo, un radiomarcado tal como 131I o 99Tc, que puede unirse a los anticuerpos de la invención usando química convencional conocida en la técnica de la imagenología de anticuerpos. Las etiquetas también incluyen etiquetas de enzimas tales como la peroxidasa de rábano picante. Las etiquetas incluyen además elementos químicos tales como la biotina, que puede detectarse mediante la unión a un elemento detectable específico, por ejemplo, la avidina marcada.

[0095] Los anticuerpos de la invención pueden etiquetarse con una etiqueta funcional. Las etiquetas funcionales incluyen sustancias diseñadas para dirigirse a la zona del cáncer con el fin de destruirla. Tales etiquetas funcionales incluyen toxinas tales como la ricina y enzimas como la carboxipeptidasa bacteriana o la nitrorreductasa, que son capaces de convertir profármacos en fármacos activos. Además, los anticuerpos pueden estar unidos o asociados de otro modo a agentes quimioterapéuticos o citotóxicos, tales como maytansinas (DM1 y DM4), onidas, auristatinas, calicheamicina, duocamicina, doxorrubicina o radiomarcados, tales como<90>Y o<131>I.

[0096] Asimismo, los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse solos o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultánea o secuencialmente, dependiendo de la condición a tratar. Así, la presente invención proporciona además productos que contienen un anticuerpo de la presente invención y un agente activo como preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de un tumor. Los agentes activos pueden incluir agentes quimioterapéuticos o citotóxicos, como 5-fluorouracilo, cisplatino, mitomicina C, oxaliplatino y tamoxifeno, que pueden operar sinérgicamente con los anticuerpos de la presente invención. Otros agentes activos pueden incluir dosis adecuadas de fármacos analgésicos tales como antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, aspirina, paracetamol, ibuprofeno o ketoprofeno) u opiáceos como la morfina, o antieméticos.

[0098] Sin querer limitarse a la teoría, la capacidad de los anticuerpos de la invención de sinergizar con un agente activo para potenciar la eliminación de tumores puede no deberse a mecanismos efectores inmunitarios, sino más bien ser una consecuencia directa de la unión del anticuerpo a gangliósidos Fuc-GM1 unidos a la superficie celular. La inmunoterapia contra el cáncer, que emplea anticuerpos contra moléculas de puntos de control inmunitario, ha demostrado su efectividad contra diversas neoplasias malignas y en combinaciones con distintas modalidades de tratamiento inmuno-oncológico.

[0100] Los anticuerpos de la presente invención se administrarán usualmente en forma de una composición farmacéutica, que puede comprender al menos un componente además del anticuerpo. La composición farmacéutica puede comprender, además del principio farmacéutico activo, un excipiente, diluyente, portador, amortiguador, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables y bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral o por inyección, por ejemplo, intravenosa. Se contempla que las inyecciones sean la principal vía de administración terapéutica de las composiciones, aunque también se usa el suministro a través de un catéter u otro tubo quirúrgico. Algunas vías de administración adecuadas incluyen la administración intravenosa, subcutánea, intraperitoneal e intramuscular. Las formulaciones líquidas pueden usarse después de la reconstitución a partir de formulaciones en polvo.

[0102] Para inyección intravenosa, o inyección en el lugar de la aflicción, el principio activo estará en forma de solución acuosa aceptable parenteralmente que esté libre de pirógenos y tenga un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica son capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como la inyección de cloruro de sodio, la inyección de Ringer o la inyección de Ringer lactato. Pueden incluirse conservantes, estabilizadores, amortiguadores, antioxidantes y/u otros aditivos, según sea necesario.

[0104] Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden presentarse en forma de tableta, cápsula, polvo o líquido. Una tableta puede contener un portador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Puede incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando la formulación es líquida, puede ser, por ejemplo, una solución salina fisiológica que contenga un amortiguador no fosfato a pH 6,8-7,6, o un polvo liofilizado.

[0106] La composición también puede administrarse mediante microesferas, liposomas, otros sistemas de suministro de micropartículas o formulaciones de liberación sostenida colocadas en ciertos tejidos, incluida la sangre. Los ejemplos adecuados de portadores de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos compartidos, por ejemplo, supositorios o microcápsulas. Las matrices implantables o microcapsulares de liberación sostenida incluyen polilactidos (Patente de EE.UU. No.3, 773, 919; EP-A-0058481) copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidmanet al.1983), poli-(2-hidroxietilmetacrilato). Los liposomas que contienen los polipéptidos se preparan por métodos bien conocidos: DE 3.218, 121A; (Eppsteinet al.1985); (Hwang, Luk, and Beaumier 1980); EP-A-0052522; EP-A-0036676; EP-A-0088046; EP-A-0143949; EP-A-0142541; JP-A-83-11808; patentes de EE.UU. No.4,485,045 y 4,544,545. Normalmente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (de unos 200-800 Angstroms) en el que el contenido lipídico es mayor a aproximadamente 30 % en mol de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la tasa óptima de fuga del polipéptido. La composición puede administrarse de forma localizada en una zona tumoral u otra zona deseada o puede administrarse de forma que se dirija a células tumorales o de otro tipo.

[0108] Las composiciones se administran preferiblemente a un individuo en una “cantidad terapéuticamente efectiva”, siendo ésta suficiente para mostrar beneficio al individuo. La cantidad real administrada, así como el ritmo y el tiempo de administración, dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que se esté tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre dosificación, etc., son responsabilidad de los médicos generalistas y otros facultativos, y típicamente son el trastorno a tratar, la condición de cada paciente, el lugar de suministro, el método de administración y otros factores conocidos por los facultativos. Las composiciones de la invención son particularmente relevantes para usar en el tratamiento de tumores existentes, especialmente cáncer, y en la prevención de la recurrencia de tales condiciones después del tratamiento inicial o cirugía. Pueden encontrarse ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Oslo, A. (ed), 1980 (Remington 1980).

[0109] Los médicos pueden determinar la dosis óptima basándose en una serie de parámetros que incluyen, por ejemplo, la edad, el sexo, el peso, la gravedad de la condición tratada, el principio activo administrado y la vía de administración. En general, es deseable una concentración sérica de polipéptidos y anticuerpos que permita la saturación de los receptores. Normalmente es suficiente una concentración mayor a 0,1 nM aproximadamente. Por ejemplo, una dosis de 100 mg/m<2>de anticuerpo proporciona una concentración sérica de aproximadamente 20 nM por aproximadamente ocho días.

[0110] A título orientativo, las dosis de anticuerpos pueden administrarse semanalmente en cantidades de 10-300 mg/m<2>. Se deben usar dosis equivalentes de fragmentos de anticuerpos a intervalos más frecuentes para mantener un nivel sérico superior a la concentración que permite la saturación del carbohidrato Fuc-GM1. La dosis de la composición dependerá de las propiedades del miembro de unión, por ejemplo, su actividad de unión y su vida media plasmáticain vivo, la concentración del polipéptido en la formulación, la vía de administración, el lugar y la velocidad de dosificación, la tolerancia clínica del paciente implicado, la condición patológica que aflige al paciente y similares, como está bien dentro de la habilidad del médico. Por ejemplo, se prefieren dosis de 300 µg de anticuerpo por paciente y por administración, aunque las dosificaciones pueden estar en el rango de aproximadamente 10 µg a 6 mg por dosis. Se usan diferentes dosis durante una serie de inoculaciones secuenciales; el profesional puede administrar una inoculación inicial y posteriormente reforzar con dosis relativamente más pequeñas de anticuerpo.

[0111] Los anticuerpos de la presente invención pueden generarse total o parcialmente mediante síntesis química. Los anticuerpos pueden prepararse fácilmente según métodos de síntesis de péptidos en fase líquida o, preferiblemente, en fase sólida, bien establecidos y normalizados, cuyas descripciones generales están ampliamente disponibles (ver, por ejemplo, en J.M. Stewart and J.D. Young, 1984 (Stewart and Young 1984), en M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, 1984 (Bodanzsky and Bodanzsky 1984) o pueden prepararse en solución, por el método de fase líquida o por cualquier combinación de química de fase sólida, fase líquida y solución, por ejemplo, completando primero la porción peptídica respectiva y posteriormente, si se desea y es apropiado, después de la eliminación de cualquier grupo protector presente, mediante la introducción del residuo X por reacción del ácido carbónico o sulfónico respectivo o un derivado reactivo del mismo.

[0112] Otra forma conveniente de producir un anticuerpo según la presente invención es expresar el ácido nucleico que lo codifica, usando ácido nucleico en un sistema de expresión.

[0113] La presente invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo de la presente invención. El ácido nucleico incluye el ADN y el ARN. En un aspecto preferido, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo de la invención como se ha definido anteriormente. En las Figuras 2 y 3 se muestran ejemplos de tal ácido nucleico. El experto podrá determinar sustituciones, deleciones y/o adiciones a tales ácidos nucleicos que seguirán proporcionando un anticuerpo de la presente invención.

[0114] El ácido nucleico de la presente invención puede ser un constructo en forma de plásmido, vector, transcripción o casete de expresión. También se proporciona una célula hospedera recombinante que comprende uno o más constructos como los anteriores. Como se ha mencionado, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de la invención constituye un aspecto de la presente invención. Un método de producción del anticuerpo puede comprender la expresión a partir del ácido nucleico codificante. La expresión puede lograrse convenientemente cultivando en condiciones apropiadas células hospederas recombinantes que contengan el ácido nucleico. Después de la producción por expresión, un anticuerpo puede aislarse y/o purificarse mediante cualquier técnica adecuada, y posteriormente usarse como sea conveniente.

[0115] Los sistemas de clonación y expresión de un polipéptido en diversas células hospederas son bien conocidos. Las células hospederas adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, levaduras y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa (por sus siglas en inglés), células de riñón de hámster bebé, células de melanoma de ratón NSO (por sus siglas en inglés) y muchas otras. Un hospedero bacteriano común y preferiblemente esE. coli. La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en células procariotas tales comoE. coliestá bien establecida en la técnica. Para una revisión, ver por ejemplo, Plückthun, 1991 (Pluckthun 1991). La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la técnica como una opción para la producción de un miembro de unión específico, ver para una revisión reciente, por ejemplo, Reff, 1993 (Reff 1993); Trillet al., 1995 (Trill, Shatzman, and Ganguly 1995).

[0116] Pueden elegirse o construirse vectores adecuados, que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluidas secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias, como sea conveniente. Los vectores pueden ser plásmidos, por ejemplo, virales, fagos o fagémidos, como sea conveniente. Para más detalles, ver, por ejemplo, Sambrooket al., 1989 (Sambrook 1989). Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación del ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen detalladamente en Ausubelet al., 1992 (Ausubel 1992).

[0117] El ácido nucleico de la presente invención puede proporcionarse en una célula hospedera. También se proporciona un método que comprende la introducción de tal ácido nucleico en una célula hospedera. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir la transfección con fosfato de calcio, DEAE-Dextrano (por sus siglas en inglés), electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, para células de insectos, baculovirus. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir la transformación con cloruro de calcio, la electroporación y la transfección mediante bacteriófago. La introducción puede ir seguida de provocar o permitir la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células hospederas en condiciones para la expresión del gen.

[0119] El ácido nucleico de la invención puede integrarse en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula hospedera. La integración puede fomentarse mediante la inclusión de secuencias que promuevan la recombinación con el genoma, de acuerdo con las técnicas habituales.

[0121] Se divulga un método que comprende usar un constructo como el indicado anteriormente en un sistema de expresión para expresar un anticuerpo o polipéptido como el indicado anteriormente.

[0123] Los atributos preferidos de cada aspecto de la invención son los mismos que para cada uno de los demás aspectos mutatis mutandis.

[0125] Los mAb FL133/4 divulgados en la presente mostraron una potente actividad citotóxicain vitromediante ADCC y CDC.

[0127] La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y dibujos adjuntos, en los que:

[0129] Figura 1: Ruta de biosíntesis del glicolípido Fuc-GM1. Cer, ceramida; Fuc, fucosa; FucGm1, fucosil-GM1; Gal, galactosa; GalNac, N-acetilgalactosamina; Glc, glucosa; LacCer lactosilceramida; SA, ácido siálico.

[0130] Figura 2a: Secuencia de aminoácidos y nucleótidos del dominio variable de la cadena pesada IgG3 FL133.63 de ratón. Los números se refieren al sistema IMGT normalizado para la numeración de secuencias de anticuerpos (Lefrancet al.2009). Figura 2b: Secuencia de aminoácidos y nucleótidos del dominio variable de la cadena pesada IgG3 de ratón FL133.67. Los números se refieren al sistema IMGT normalizado para la numeración de secuencias de anticuerpos (Lefrancet al.2009). Figura 2c: Secuencia de aminoácidos y nucleótidos de la cadena pesada IgG1 FL134.33 de ratón. Los números se refieren al sistema IMGT normalizado para la numeración de secuencias de anticuerpos (Lefrancet al.2009). Figura 2d: Secuencia de aminoácidos y nucleótidos de la cadena kappa FL133.63 de ratón. Los números se refieren al sistema IMGT normalizado para la numeración de secuencias de anticuerpos (Lefrancet al.2009). Figura 2e: Secuencia de aminoácidos y nucleótidos de la cadena kappa FL133.67 de ratón. Los números se refieren al sistema IMGT normalizado para la numeración de secuencias de anticuerpos (Lefrancet al.2009). Figura 2f: Secuencia de aminoácidos y nucleótidos de la cadena kappa FL134.33 de ratón. Los números se refieren al sistema IMGT normalizado para la numeración de secuencias de anticuerpos (Lefrancet al.2009).

[0131] Figura 3a: Secuencia de aminoácidos y nucleótidos de la región variable de la cadena pesada FL134.33 de ratón quimerizada con la región constante de la cadena pesada IgG1 humana. Figura 3b: Secuencia de aminoácidos y nucleótidos de la región variable de la cadena kappa del ratón FL134.33 quimerizada con la región constante de la cadena kappa humana.

[0132] Figura 4: Ilustración esquemática de la ozonólisis de GSL fucosil GM1 y su subsecuente unión a un portador proteico mediante aminación reductora. El ozono reactivo ataca la unión doble en la fracción de esfingosina de la GSL y genera de forma estable un grupo aldehído libre que posteriormente puede usarse para unir la GSL a la proteína por un proceso de aminación reductora. Aquí, un aldehído reacciona con la amina primaria para formar primero una base de Shiff inestable que debe reducirse aún más para formar una amina secundaria estable. Figura 5: Análisis espectrofométrico de masas por transformada de Fourier de fucosil GM1 ozonolisado y original. A) fucosil GM1 ozonolisado y B) original probado por FTMS y analizado usando el sistema de espectrometría de masas de alta resolución, Exactive. Los análisis muestran una variedad de especies de fucosil GM1 dependiendo de las longitudes de las cadenas de acilo graso. Los iones fucosil GM1 estaban cargados individualmente. Las leyendas muestran los pesos moleculares de las especies presentes.

[0133] Figura 6: Detección de conjugados HSA-fucosil GM1 mediante ELISA e inmunotransferencia tipo Western. A) Tres muestras de conjugados HSA-fucosil GM1 detectados por ELISA, lectura de la absorbancia a 450 nm contra 620 nm de fondo. Las placas se recubrieron con conjugados HSA o HSA-fucosil GM1. Los anticuerpos primarios fueron suero de ratón con anticuerpos IgG anti-HSA (MOD66L) o mAb anti-fucosil GM1 F12. Los anticuerpos primarios se detectaron usando IgG-biotina anti-ratón y estreptavidina-HRP (por sus siglas en inglés). Los pozos en los que no se añadieron anticuerpos primarios sirvieron como controles negativos. B) Análisis de inmunotransferencia tipo Western de las tres muestras de conjugados HSA-fucosil GM1 detectados mediante suero de ratón con anticuerpos IgG anti-HSA (MOD66L) o mAb anti-fucosil GM1 F12. Los carriles 1 - 4 se usaron como controles donde el carril 1 = HSA original, el carril 2 = HSA que se sometió al procedimiento de aminación reactiva pero no se añadió gangliósido, el carril 3 = conjugado HSA-Lewis Y, el carril 4 = conjugado HSA-GD3, el carril 5 = muestra 1 de conjugado HSA-fucosil GM1, el carril 6 = muestra 2 de conjugado HSA-fucosil GM1 y el carril 7 = muestra 3 de conjugado HSA-fucosil GM1. Los anticuerpos primarios se detectaron usando IgG-HRP anti-ratón. Como control negativo se usó una membrana idéntica que solamente contenía anticuerpos secundarios. Las bandas positivas se desarrollaron por ECL (por sus siglas en inglés).

[0134] Figura 7: Unión de IgG de suero de ratón al conjugado HSA-Fuc-GM1 y al Fuc-GM1 purificado. Se analizó la unión de IgG de suero de ratón al conjugado HSA-Fuc-GM1 (A, C, E, G) o al Fuc-GM1 purificado (B, D, F, H). Los sueros de los ratones se analizaron por ELISA (por sus siglas en inglés), leyendo la absorbancia a 450 nm contra un fondo de 620 nm. Como control negativo se usó únicamente el anticuerpo secundario. Se usaron como controles positivos suero de ratón con anticuerpos IgG anti-HSA y mAb F12 anti-Fuc-GM1. * representa p < 0,05 en comparación con la ausencia de anticuerpo primario, analizado únicamente en dilución 1/100.

[0135] Figura 8: Unión de IgG de suero de ratón a la superficie de células DMS79. Unión de IgG de suero de ratón a la superficie celular de la línea celular DMS79 positiva para Fuc-GM1. Las células se incubaron primero con sueros de ratón a una dilución 1/100. La unión de los anticuerpos primarios se detectó con anti-ratón IgG FITC a 10 µg/mL. Las células se analizaron mediante citometría de flujo. Se usó IgG1 isotipo como control negativo (datos no mostrados) y mAb F12 como control positivo, ambos usados a 10 µg/mL. La intensidad de la unión del anticuerpo se expresa por la media geométrica.

[0136] Figura 9: Unión de mAb específicos de Fuc-GM1 a la superficie celular de células que expresan Fuc-GM1. La unión de los mAb purificados FL133.63, FL133.67 y FL134.33 a la superficie celular de las líneas celulares Fuc-GM1 positivas DMS79, DMS53, H128 y H69 se valoró mediante inmunofluorescencia indirecta y análisis de citometría de flujo. La unión a la superficie se detectó con anti-ratón IgG FITC. Se usó IgG1 isotipo como control negativo (datos no mostrados) y mAb F12 como control positivo. La intensidad de la unión del anticuerpo se expresa como media geométrica.

[0137] Figura 10: Unión de mAb específicos de Fuc-GM1 a la sangre total de voluntarios humanos sanos. Unión de A) IgG1 isotipo, B) IgG3 isotipo, C) mAb anti-MHC clase 1, D) mAb F12, E) mAb FL133.63, F) mAb FL133.67 y G) mAb FL134.33 a la sangre total de un voluntario humano sano valorada mediante inmunofluorescencia indirecta y análisis de citometría de flujo. La sangre total se incubó primero con anticuerpos primarios a 10 µg/mL, que se detectaron posteriormente con IgG anti-ratón FITC a 10 µg/mL. Antes del análisis, se lisaron los eritrocitos. Como controles negativos se usaron IgG1 isotipo de ratón, IgG3 isotipo de ratón y mAb F12. Se usó un mAb anti-MHC de clase I como control positivo. Los cuadrantes del gráfico de puntos se establecieron usando los controles negativos.

[0138] Figura 11: Unión de mAb Fuc-GM1 a varios glicolípidos purificados. Unión de A) FL133.63, B) FL133.67, C) FL134.33 a varios gangliósidos purificados analizados por ELISA, absorbancia de lectura a 450 nm contra 620 nm de fondo. La unión de los anticuerpos primarios se detectó mediante IgG anti-ratón biotinilada y estreptavidina-HRP. D) F12, E) anti-GD3 mAb R24 y F) anti-GM1 toxina CTxB-HRP se usaron como controles positivos. Aún no se han desarrollado mAb para los gangliósidos restantes. * representa p < 0,05 en comparación con la lactosilceramida, analizada únicamente en dilución 1/100.

[0139] Figura 12: Unión competitiva de los mAb Fuc-GM1 preincubados con el gangliósido purificado Fuc-GM1 a la línea celular DMS79. Se incubaron primero 2 µg de mAb con 5 µg de Fuc-GM1 purificado por 1 hora a temperatura ambiente. La unión a la superficie celular de las células DMS79 se ensayó por inmunofluorescencia indirecta y análisis de citometría de flujo. Se usaron IgG1 isotipo (datos no mostrados) y MHC I (por sus siglas en inglés) como controles negativos. F12 se usó como control positivo. También se usaron como controles positivos anticuerpos primarios no preincubados con Fuc-GM1 purificado. La intensidad de la unión del anticuerpo se expresa por la media geométrica.

[0140] Figura 13: La unión de FL133.63 y FL134.33 se comparó con la matriz de glicanos del Consorcio para la Glicómica Funcional, compuesta por 610 objetivos de glicanos de mamíferos. Se compara la especificidad fina entre a) FL133,63, b) FL134,33.

[0141] Figura 14: Unión de mAb de Fuc-GM1 a Fuc-GM1 purificado y DMS79 PM TGL. Unión de A) FL133.63, B) FL133.67 y C) FL134.33 a DMS 79 PM TGL (1 x 10<7>células por carril), a gangliósidos purificados Fuc-GM1 (5 µg por carril) y GM1 (5 µg por carril). La unión se analizó por TLC (por sus siglas en inglés) con inmunodetección. Los anticuerpos primarios se usaron a 1 µg/mL. La unión de los anticuerpos primarios se detectó por IRDye 680CW anti-ratón IgG usado a 1/10000. D) Se usó como control positivo una placa de TLC inmunotransparente con anti-Fuc-GM1 mAb F12. E) Se usó como control negativo una placa de TLC inmunotransparente solamente con anticuerpo secundario. Figura 15: Unión de mAb anti-Fuc-GM1 a conjugados HSA-Fuc-GM1. A) mAb FL133.63, B) mAb FL133.67, C) mAb FL134.33 D) La unión del mAb F12 a los conjugados HSA-Fuc-GM1 se analizó por ELISA, leyendo la absorbancia a 450 nm contra un fondo de 620 nm. Los anticuerpos primarios se detectaron usando biotina IgG anti-ratón y conjugado HRP de estreptavidina. La HSA (por sus siglas en inglés) original se usó como control negativo. Se usó mAb F12 como control positivo.

[0142] Figura 16: Unión de mAb anti-Fuc-GM1 a células purificadas de Fuc-GM1 y DMS79. Se valoró la unión de los mAb anti-Fuc-GM1 (FL133.63, FL133.67 y FL134.33) por ELISA a Fuc-GM1 purificado en el rango de concentración 100-0,001 nM. Se usó IgG1 isotipo como control negativo. Los valores EC50 (por sus siglas en inglés) se establecieron usando un ajuste no lineal de la curva dosis-respuesta (GraphPad Prism). Usando el mismo rango de concentración, también se valoró la unión de los mAb a la línea celular de SCLC DMS79 mediante citometría de flujo. Se usó IgG1 isotipo como control negativo. Los valores de Kd (por sus siglas en inglés) se establecieron usando un ajuste no lineal de la curva de unión (unión a un sitio específico) en Graphpad Prism.

[0143] Figura 17: Fuc-GM1 mAb mediada por ADCC y CDC de células DMS79. Los mAb FL133.63, FL133.67 y FL134.33 mediaron A) la ADCC y B) la CDC de la línea celular DMS79 positiva para Fuc-GM1. Se usó Anti-Lewisy/b mAb SC101 como control positivo. * representa p < 0,05.

[0144] Figura 18: Secuencias de las regiones VH de los mAb FL134.33, FL133.63 y FL133.67. La secuencia de anticuerpos de la línea germinal se muestra como codones de aminoácidos. A continuación, se muestran las mutaciones de cada anticuerpo específico de Fuc-GM1.

[0145] Figura 19: Secuencias de las regiones VL de los mAb FL134.33, FL133.63 y FL133.67. La secuencia de anticuerpos de la línea germinal se muestra como codones de aminoácidos. A continuación, se muestran las mutaciones de cada anticuerpo específico de Fuc-GM1.

[0146] Figura 20: Especificidad de los anticuerpos que se unen a antígenos purificados por ELISA. Las placas recubiertas con Fuc-GM1 se incubaron con anticuerpos y se detectaron usando IgG anti-ratón Fc específica o anti-cadena γ humana específica de biotina y estreptavidina HRP. Se usó mAb F12 como control positivo.

[0147] Figura 21: Valoración de la unión de anticuerpos a la superficie celular mediante inmunofluorescencia indirecta. Los mAb FL134.33, FL133.63, FL133.67 y CH134.33 se incubaron con células y la unión se detectó usando IgG FITC anti-ratón Fc específica o anti-cadena γ humana específica. A) histogramas generados por citometría de flujo con líneas celulares B) gráfico de barras de los valores de Gm para todas las líneas celulares. Se usó mAb F12 como control positivo.

[0149] Ejemplos

[0151] Métodos

[0153] Todos los experimentos se llevaron a cabo siguiendo las normas de seguridad aplicables. Los métodos de laboratorio se operaron siguiendo procedimientos de operación estándar con modificaciones aplicadas a condiciones específicas.

[0154] Vacunas

[0156] El trabajo con animales se llevó a cabo con una licencia de proyecto del Ministerio del Interior. Todos los reactivos usados se adquirieron a Sigma-Aldrich (Poole, Reino Unido), a menos que se indique lo contrario. Todos los experimentos de inmunización se realizaron usando ratones Balb/c o CD1 de entre 6 y 8 semanas de edad. Los ratones fueron generados y mantenidos en condiciones libres de patógenos por el personal de la Unidad de Servicios Biomédicos de la Universidad de Nottingham. Los ratones fueron inmunizados con el antígeno diluido en un máximo de 100 µL de PBS (por sus siglas en inglés), por vía subcutánea (s.c.) o intraperitoneal (i.p.), usando una jeringa de insulina de 0,5 mL. La frecuencia de las inyecciones difiere en cada inmunización y se indica en los capítulos de resultados correspondientes. Para valorar la respuesta de los anticuerpos de los ratones a la inmunización, 7 días después de cada inmunización se sangraron los ratones mediante la vena de la cola. La sangre se centrifugó dos veces a velocidad máxima (17968xg) por 2 min (SIGMA, 1-15PK Microfuge, Osterode am Harz, Alemania) para eliminar los eritrocitos y el suero se almacenó a - 20 ºC hasta su uso posterior.

[0158] Cultivo celular

[0160] Todos los cultivos de tejidos se realizaron de forma aséptica en una cabina de seguridad de clase II. Las líneas celulares cancerosas humanas se mantuvieron en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) suplementado con 10 % de suero fetal bovino inactivado por calor (HI-FBS, por sus siglas en inglés), excepto H128, que se mantuvo en RPMI 1640 suplementado con 20 % de HI-FBS, y DMS53, que se mantuvo en medio Weymouth suplementado con 10 % de HI-FBS. Las líneas celulares recién adquiridas se entregaron en hielo seco, manteniéndolas congeladas a -80 ºC. Para eliminar el medio de congelación del cultivo celular, las células se descongelaron en un baño de agua a 37 ºC y se transfirieron a un recipiente universal de 30 mL (Sterilin, Newport, Reino Unido) junto con 10 mL del medio de cultivo adecuado. Las células se centrifugaron a 1000g por 5 min. Posteriormente se eliminó el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió en 7 mL del medio de cultivo apropiado. Posteriormente, las células se transfirieron a un matraz de cultivo celular T25 Cellstar (VWR, Lutterworth, Reino Unido) y se incubaron a 37 ºC en 5 % de CO<2>. Una vez que las células alcanzaron aproximadamente 80 % de confluencia, se dividieron o se transfirieron a un matraz de cultivo celular más grande. En el caso de las líneas celulares adherentes, se aspiró el medio de cultivo gastado del matraz y se añadieron 5 mL de 1x tripsina/EDTA (por sus siglas en inglés). Las células tripsinizadas se incubaron a 37 ºC hasta que la célula se desprendió (usualmente alrededor de 10 min). Las células desprendidas se recogieron posteriormente en un recipiente universal de 30 mL y se añadieron 5 mL de medio de cultivo para reducir la efectividad de la tripsina sobre las células. Posteriormente, las células se centrifugaron a 1000g por 5 min. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular con medio de cultivo fresco. Posteriormente, las células se transfirieron a un matraz de cultivo Cellstar T75. Las células que crecen en forma de agregados flotantes se separan una vez que el medio de cultivo se ha gastado (pasa de un color naranja a amarillo) o cuando las células parecen enfermas o empiezan a morir. Las células, incluido el medio de cultivo, se transfirieron directamente a frascos de cultivo T75 y se añadieron 10 mL de medio de cultivo fresco. Para constituir y mantener las reservas de las líneas celulares recién adquiridas, se recogieron células de frascos de cultivo T75 confluentes al 80 % por el método descrito anteriormente.

[0162] Se contaron las células usando un hemocitómetro y se aplicó la tinción de viabilidad con azul tripán en relación 1:1. Las células se resuspendieron a 5x10<6>células/mL en sulfuro de dimetilo (DMSO, por sus siglas en inglés) al 5 %/medio de cultivo apropiado y se añadió 1 mL por microtubo de 2 mL (Sarstedt, Leicester, Reino Unido). Los viales se colocaron primero en el congelador a -80 ºC por un mínimo de 24 horas y posteriormente se trasladaron al nitrógeno líquido, donde se mantuvieron a -170 ºC.

[0163] Si se necesitaban grandes reservas de células vivas para diversos experimentos, las células se expandían gradualmente en frascos de cultivo T175 y se mantenían en condiciones saludables renovando los medios de cultivo gastados y dividiéndolos para garantizar el crecimiento en fase logarítmica de las células. Cuando se trabaja con líneas celulares no adherentes, las células se transfieren a un recipiente universal y se dejan reposar por 5 minutos. Esto permitió que los agregados flotantes que contenían las células vivas se depositaran en el fondo del recipiente universal y que se pudiera extraer posteriormente el sobrenadante que contenía las células muertas. Posteriormente, el sedimento celular se resuspendió con el medio de cultivo adecuado y las células se transfirieron de nuevo al matraz de cultivo.

[0164] Anticuerpos

[0165] Los anti-HLA-ABC (clon W6/32) y anti-CD44 se adquirieron a eBiosciences (Hatfield, Reino Unido). El anti-CD59 (BRIC 229) se adquirió en el IBGRL (Bristol, Reino Unido). Los anti-sialil Lewisa (CA19.9), anti-Lewisb (2-25 Le), anti-LewisX (P12), anti-GD2 (clon 2Q549), anti-GM2, anti-Gb3, anti-prohibitina (clon II-14-10) se adquirieron en Abcam (Cambridge, Reino Unido). El anti-NeuGc GM3 (clon M2590) se adquirió en COSMO BIO CO., LTD (Tokio, Japón). Los anti-CD46, anti-CD14 (clon M5E2), anti-CD11c (clon B-ly6) y el isotipo IgG1 se adquirieron a BD Biosciences (Crawley, Reino Unido). El anti-Lewis Y (BR96) se adquirió en ATCC (Middlesex, Reino Unido). El anti-sialil Lewis X (KM93) y el anti-CA125 (OC125) se adquirieron en Calbiochem (Darmstadt, Alemania). El anti-Globo H (clon MBr1) se adquirió a ENZO Life Sciences (Exeter, Reino Unido). El anti-Fuc-GM1 (F12) se adquirió a Fujirebio (Tokio, Japón). El antitransferrina (UNCONJ) se adquirió en Invitrogen (Paisley, Reino Unido). Los anti EGFR (IF4) y anti-calnexina se adquirieron a Cell Signalling Technology (Danvers, MA, EE.UU.). El anti-EpCAM (BerEP4) se adquirió a Dako (Cambridgeshire, Reino Unido). Los anti-EGFR (Erbitux) y anti Her2 (Herceptin) fueron donados por el NHS. El anti-GD3 (R24) fue un regalo de Philip O. Livingston del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. El conjugado estreptavidina-HRPO se adquirió a Invitrogen (Paisley, Reino Unido). Las inmunoglobulinas de conejo anti-ratón FITC y la IgG1 de conejo porcina FITC se adquirieron a Dako (Cambridgeshire, Reino Unido). La estreptavidina PE se adquirió a eBiosciences (Hatfield, Reino Unido). La biotina de la subunidad B de la toxina del cólera se adquirió a Stratech Scientific Ltd., (Newmarket, Reino Unido). El antiratón de burro IRDye 680RD y la estreptavidina IRDye 800CW se adquirieron en LI-COR, Nebraska, EE.UU. Preparación del antígeno

[0166] Los sedimentos de células secas (lavados una vez en solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés)) se almacenaron en un congelador a -80 ºC hasta su uso. Para extraer la membrana plasmática (PM, por sus siglas en inglés), se juntaron sedimentos celulares de 2x10<8>células y se homogeneizaron manualmente en 2 mL de manitol 50 mM/5 mM Hepes (pH7,4) y 10 mM de solución de cloruro de calcio usando agujas sucesivamente más pequeñas (23G, 25G y finalmente 29G). Posteriormente, la muestra se dejó reposar en hielo por 20 minutos y se centrifugó a 3000xg por 15 minutos para eliminar las membranas intracelulares y los núcleos. El sobrenadante se trasladó a tubos de ultracentrífuga de polialómero (Beckmann, High Wycombe, Reino Unido) y se centrifugó a 48.000xg por 30 min a 4 ºC para separar el precipitado que contenía PM del sobrenadante que contenía citosol. Posteriormente, el precipitado se resuspendió en 200 µL de PBS y se almacenó a -20 ºC hasta su uso.

[0167] Los TGL (por sus siglas en inglés) de PM se extrajeron añadiendo 2 mL de metanol y 2 mL de cloroformo, bien directamente al sedimento de PM en el tubo de ultracentrífuga de polialómero, bien a la PM resuspendida en 200 µL de PBS. Posteriormente, el material se transfirió a tubos de polipropileno de 15 mL, se agitó a fondo en vórtex y se dejó incubar sobre un rodillo por 30 minutos a temperatura ambiente (RT, por sus siglas en inglés). Después de centrifugar a 2000xg por 10 min, se recogió el sobrenadante que contenía TGL y se incubó a -20 ºC durante la noche. Al día siguiente, se volvió a centrifugar la muestra con los mismos ajustes, se recogió el sobrenadante y se conservó a 4 ºC.

[0168] Adyuvantes

[0169] Para potenciar la respuesta inmunitaria al antígeno, en el transcurso de esta tesis se usaron varios adyuvantes. α-GalCer (alfa-galactosil ceramida), α- GalCer análogo 7 o α-GalCer análogo 8, (ENZO Life Sciences, Exeter, Reino Unido) se desecaron junto con el resto de lípidos durante la formulación de los liposomas (10 µg-25 µg por ratón). Se usaron anti-CD40 de ratón (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido), oligonucleótido CpG de tipo C y lípido monofosforil A de S.mennesota (MPLA, por sus siglas en inglés) (InvivoGen, San Diego, CA, EE.UU.) a 10 µg por ratón y se mezclaron en los liposomas ya formados. Se usaron adyuvantes completos o incompletos de Freund para potenciar la respuesta inmunitaria a los antígenos proteicos. Se mezclaron con el antígeno en relación 1:1 (v:v).

[0170] Conjugación de gangliósidos purificados con proteínas

[0172] El gangliósido purificado se conjugó covalentemente con la HSA por aminación reductora indirecta, en la que el aldehído que contiene el gangliósido reacciona con la amina (lisina) que contienen las proteínas para formar una unión amínica estable. Para introducir el grupo aldehído reactivo en el gangliósido, se empleó el método de ozonólisis descrito previamente (Songet al., 2011). El ozono reactivo se generó fresco a partir de aire seco (secador de aire MAG-600, Ozone Solutions, Hull, lowa, US) mediante el generador de ozono OZV-8 (Ozone Solutions). Se hizo pasar ozono a través de la muestra que contenía glicolípidos resuspendida en un volumen mínimo de 500 µL de cloroformo:metanol 2:1 por 1 min mientras persistía el color azul. Posteriormente, se añadieron 50 µL de sulfuro de dimetilo para destruir el ozono residual y, después de incubar por 1 hora a temperatura ambiente, se secó la solución bajo una corriente de nitrógeno. El Fuc-GM1 ozonolisado (Matreya, PA, EE.UU.) resuspendido en DMSO se añadió a la albúmina de suero humano (HSA) resuspendida en amortiguador de carbonato-bicarbonato, pH > 9 en exceso molar de 10 veces. Posteriormente se añadieron 10 µL de borohidruro de sodio 5 M (H<4>BNa) en NaOH 1 M por cada 1 mL de reacción. Posteriormente, cada muestra se incubó por 2 horas a temperatura ambiente. Los sitios de aldehído sin reaccionar se bloquearon añadiendo 20 µL de etanolamina 3 M por 1 mL de reacción por 15 min. Los conjugados se purificaron mediante diálisis contra PBS.

[0173] Los conjugados proteína-Fuc-GM1 se analizaron mediante análisis MALDI-TOF (por sus siglas en inglés) de proteína entera. Para preparar las muestras, las puntas de pipeta ziptip C4 (Millipore, MA, EE.UU.) se activaron posteriormente con una solución de acetonitrilo:H<2>O al 50 % (v/v) y se equilibraron posteriormente con TFA (por sus siglas en inglés) al 0,1 % en H<2>O. Posteriormente, la muestra se unió a la resina de la punta ziptip pipeteando arriba y abajo 15 veces. La muestra unida a la resina se lavó posteriormente con TFA al 0,1 % en H<2>O 15 veces y se dispensó en la placa MALDI por una solución de elución (ácido sinápico saturado en acetonitrilo al 50 % (v/v):H<2>O con TFA al 0,1 %).

[0175] Generación de mAb

[0177] Al menos una semana antes de la fusión, se cultivaron varios matraces con células de mieloma NS0 (por sus siglas en inglés) en medio RPMI suplementado con un 10 % de HI-FCS. Se seleccionó el matraz que contenía las células de aspecto más saludable y se volvió a alimentar un día antes de la fusión. El medio NS0 usado se almacenó a -4 ºC. El día de la fusión, todos los reactivos se calentaron primero a 37 ºC. Se cosecharon las células NS0 y se contaron 4 veces. Posteriormente se lavaron centrifugándolas dos veces a 1000xg por 5 min usando RPMI libre de suero. Los ratones inmunizados fueron sacrificados y se les extrajo el bazo, manteniendo estéril el lugar de la incisión, usando etanol al 70 % (v/v). Se preparó una suspensión unicelular forzando el medio RPMI en el bazo a través de una aguja y aplicando presión simultáneamente con unas pinzas. Posteriormente, los esplenocitos se centrifugaron a 1000xg por 10 minutos en medio RPMI y se contaron 4 veces. Posteriormente, los esplenocitos se fusionaron con células de mieloma NS0 en una relación celular de 10:1. Más detalladamente, se combinaron 1 x 10<8>esplenocitos y 1 x 10<7>células de mieloma NS0 y se centrifugaron a 1000xg por 5 min. Se eliminó el sobrenadante y se mezclaron suavemente 800 µL de polietilenglicol 1500, que sirve para permeabilizar las membranas plasmáticas celulares, con el sedimento celular por 1 min. Posteriormente, con una mezcla suave, se añadió lentamente 1 mL de medio RPMI a las células por 1 min. Se aplicaron lentamente otros 5 mL de RPMI sobre las células por 5 minutos. Por último, se añadieron otros 20 mL de RPMI. Para facilitar el proceso de fusión, las células se centrifugaron posteriormente a 1200xg por 7 minutos. Se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron cuidadosamente en medio RPMI suplementado con 10 % de HI-FBS, 5 % de timidina hipoxantina metotrexato (reactivo de selección HMT (por sus siglas en inglés); Invitrogen, Paisley, Reino Unido), 5 % de factor de clonación de hibridomas (HCF; PAA, Piscataway, EE.UU.) y 10 % de sobrenadante NS0 gastado filtrado. Posteriormente, las células se sembraron en placas de cultivo de 96 pozos (Thermo Fisher Scientific, Rockford, Reino Unido) y se incubaron a 37 ºC y 5 % de CO<2>.

[0179] Aproximadamente dos semanas después de la fusión, cuando los hibridomas establecidos ocupaban alrededor de 1/3 del pozo, se examinaron para detectar la producción de anticuerpos específicos contra antígenos mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Se eligieron colonias de hibridoma productoras de anticuerpos con la especificidad deseada para su posterior clonación, cuyo objetivo es generar colonias unicelulares. Este es un paso crucial en la generación de un anticuerpo monoclonal. Para ello, los hibridomas elegidos se sembraron en placas de cultivo de 96 pozos a una densidad celular de 0,3 células por pozo. Los hibridomas se incubaron a 37 ºC, 5 % de CO<2>hasta que las colonias fueron lo suficientemente grandes como para ser examinadas de nuevo. La clonación se repitió un mínimo de dos veces, hasta que todos los clones mostraron una unión positiva al antígeno.

[0181] Purificación de mAb

[0183] Los hibridomas clonados dos veces se expandieron en medios libres de suero para hibridomas GIBCO (Life Technologies, Paisley, Reino Unido) suplementados con 10 % de suero de ternera recién nacida bajo en Ig (Life Technologies). Se recogió el medio usado y se centrifugó a 2000xg por 15 minutos para eliminar las células de hibridoma junto con los restos celulares. El sobrenadante que contenía anticuerpos se filtró posteriormente a través de un filtro de un único uso Minisart de 0,2 µm (Sartorius Stedim, Surrey, Reino Unido). Los anticuerpos se purificaron por FPLC (por sus siglas en inglés) usando columnas de proteína G recombinante de 1 mL (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido), se eluyeron con glicina 100 mM pH 12 y, después de la neutralización, se dializaron con 2 L de PBS durante la noche. La concentración final de los anticuerpos purificados se determinó mediante espectrofotómetro, leyendo la absorbancia a 280 nm. Se usó el kit de prueba de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón (ABD Serotec, Kidlington, Reino Unido) de acuerdo con las directrices del fabricante. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

[0184] Para el ELISA de glicolípidos, se recubrieron placas de fondo plano de PVC flexible de 96 pozos (BD biosciences, Oxford, Reino Unido) con 100 ng de gangliósido purificado por pozo, o con extracto de TGL de WC equivalente a 1 x 10<4>células por pozo, o con TGL de PM equivalente a 5 x 10<4>células por pozo resuspendidas en etanol al 100 % y dejadas secar durante la noche a temperatura ambiente.

[0185] Los gangliósidos purificados se resuspendieron a 1 mg/mL en cloroformo:metanol 2:1 (v/v). La extracción de PM TGL se ha descrito anteriormente. Preparación del antígeno. El WC TGL se preparó añadiendo 1 mL de metanol y 1 mL de cloroformo al sedimento celular seco. Las células se agitaron enérgicamente en vórtex y se dejaron incubar en un rodillo por 30 minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar a 2000xg por 10 minutos, se recogió el sobrenadante que contenía TGL y se almacenó a -20 ºC durante la noche. Al día siguiente, se volvió a centrifugar la muestra, se recogió el sobrenadante y se conservó a 4 ºC.

[0186] Para el ELISA de proteínas, se recubrieron placas de fondo plano de PVC flexible de 96 pozos con 100 ng de proteína/pozo resuspendida en amortiguador de carbonato-bicarbonato (pH 9,6) y se dejaron incubar durante la noche a 4 ºC. Al día siguiente, las placas se bloquearon con albúmina sérica bovina (BSA) al 2 % en PBS por 1 hora a RT. Posteriormente, se retiró el amortiguador de bloqueo y se añadieron a los pozos anticuerpos primarios o sueros de ratón preparados en BSA al 1 % en PBS. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron 3 veces con PBS. La unión de los anticuerpos primarios se detectó mediante anticuerpos secundarios y terciarios apropiados. Las placas se lavaron posteriormente y se revelaron añadiendo 90 µL de 3,3'5,5'-tetrametilbencidina (TMB, por sus siglas en inglés) en amortiguador de fosfato/citrato/perborato por pozo. La reacción se detuvo añadiendo 30 µL de H<2>SO<4>2 M. Los resultados se analizaron mediante espectrofotómetro, leyendo la absorbancia a 450 nm sobre un fondo de 620 nm. La media y las desviaciones estándar de los datos se calcularon con Microsoft Excel. Las diferencias significativas entre los grupos se calcularon usando ANOVA ordinario de una vía con comparaciones múltiples frente al control negativo, donde p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

[0187] Análisis de glicoma

[0188] Para aclarar las especificidades finas de los mAb FL133 y 134, los anticuerpos se etiquetaron con FITC y se enviaron al Consorcio para la Glicómica Funcional (http://www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourcecoreh8.shtml]), donde se analizaron frente a ≥ 600 glicanos naturales y sintéticos. Brevemente, se imprimieron glicanos sintéticos y de mamíferos con enlazadores amino en portaobjetos de vidrio activados con N-hidroxisuccinimida (NHS, por sus siglas en inglés), formando enlaces amida. Este trabajo ha sido realizado por el Núcleo H del CFG de la Universidad de Emory. El FG27 se probó a 1 µg/mL en PBS a temperatura ambiente. Brevemente, las muestras de anticuerpos se aplicaron a la superficie impresa de la micromatriz y se incubaron en una cámara humidificada por 1 h. El portaobjetos se enjuagó posteriormente 4 veces con PBS, seguido de la adición de IgG anti-conejo marcada fluorescentemente (Alexa Fluor 488), y se incubó por 1 h. El portaobjetos se enjuagó posteriormente 4 veces con PBS, y la fluorescencia se midió con un escáner Perkin-Elmer de micromatrices XL4000 y se analizó usando el software Imagene (BioDiscovery).

[0189] A continuación se detalla el protocolo usado:

[0190] Ensayo de unión a glicanos con anticuerpos monoclonales no marcados

[0191] 1. Introducción:

[0192] 1.1. El objetivo principal del núcleo H es determinar la especificidad de unión de las proteínas de unión a glicanos (GBP, por sus siglas en inglés) y diversos organismos presentados por los investigadores usando la micromatriz de glicanos impresa.

[0193] 2. Referencia:

[0194] 2.1. www.functionalglycomics.org

[0195] 3. Materiales necesarios:

[0196] 3.1. Portaobjetos impresos con glicanos (Core D), impresos en el lateral del portaobjetos con el código de barras grabado en blanco y marcas negras - NO TOCAR ESTA ZONA

[0197] 3.2. Cubreobjetos (Fisher Scientific, 12-545F)

[0198] 3.3. Cámaras de procesamiento de portaobjetos humidificadas (Fisher Scientific, NC9091416), o sistema casero usando placas de Petri, con toallas de papel húmedas en el fondo de la cámara

[0199] 3.4. Frascos Coplin de 100 mL para el lavado de portaobjetos

[0200] 3.5. Tris-HCl (Fisher Scientific, BP152-1)

[0201] 3.6. NaCl (Fisher Scientific, S271-3)

[0202] 3.1. CaCl<2>(Fisher Scientific, C79-500)

[0203] 3.8. MgCl<2>(Fisher Scientific, BP214-500)

[0204] 3.9. Fosfato de potasio monobásico (Fisher Scientific, P285-3)

[0205] 3.10. dH<2>O

[0206] 3.11. Cianina 5- Estreptavidina (ZYMED 43-4316)

[0207] 3.12. Anticuerpo secundario apropiado, con etiqueta fluorescente si está disponible

[0208] 3.13. BSA (Fisher Scientific, Bp1600-100)

[0209] 3.14. Tween-20 (EMD Biosciences, 655205)

[0210] 3.15. Azida de sodio (Fisher Scientific, S227-500)

[0211] 3.16. Escáner ProScanArray (Perkin Elmer)

[0213] 4. Amortiguadores:

[0215] 4.1. TSM = 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4150 mM de NaCl, 2 mM de CaCl<2>, 2 mM de MgCl<2>

[0216] 4.2. Amortiguador de lavado TSM (TSMW, por sus siglas en inglés) = Amortiguador TSM 0,05 % Tween-20 4.3. Amortiguador de unión TSM (TSMBB, por sus siglas en inglés) = Amortiguador TSM 0,05 % Tween 20 1 % BSA

[0218] 5. Protocolo:

[0220] 5.1. Preparar reservas de trabajo de amortiguadores de lavado (TSM, Amortiguador de lavado TSM y H<2>O) o recoger los reactivos y llevarlos a temperatura ambiente si han estado en el refrigeración.

[0221] 5.1.1. Amortiguador (A) TSM- 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4150 mM de NaCl, 2 mM de CaCl<2>, 2 mM de MgCl<2>5.1.2. Amortiguador (B) Amortiguador de lavado TSM (TSMW) - Amortiguador TSM 0,05 % Tween-20 5.1.3. Amortiguador (C) Amortiguador de unión TSM (TSMBB) - Amortiguador TSM 0,05 % Tween 20 1 % BSA 5.1.4. dH<2>O

[0222] 5.2. Preparar 100 µL de muestra diluyendo el anticuerpo en TSMBB o amortiguador de unión apropiado basado en las propiedades del anticuerpo hasta una concentración final de 5-50 μg/mL o una concentración apropiada requerida para el análisis.

[0223] 5.3. Retirar los portaobjetos del desecador y etiquetar con el nombre de la muestra cerca del código de barras, fuera de las marcas negras.

[0224] 5.4. Hidratar el portaobjetos colocando el mismo en un frasco de tinción Coplin de vidrio que contenga 100 mL de TSMW por 5 minutos.

[0225] 5.5. Eliminar el exceso de líquido del portaobjetos poniéndolo en posición vertical para que escurra el líquido. 5.6. Aplicar cuidadosamente 70 µL de muestra (ver 5.2) cerca del borde izquierdo del portaobjetos, entre las marcas negras.

[0226] 5.7. Colocar lentamente el cubreobjetos sobre el portaobjetos, intentando evitar la formación de burbujas en la muestra bajo el cubreobjetos. Eliminar las burbujas golpeando suavemente el cubreobjetos con una punta de pipeta si es necesario, o levantando lentamente un lado del cubreobjetos. Asegurarse de que el cubreobjetos se encuentra entre las marcas negras.

[0228] Cromatografía en capa fina (TLC)

[0230] Las placas de TLC (Nano Sílica Gel en placas de TLC) se cargaron con lípidos purificados a 1 µg/carril, o con WC TGL (1 x 10<6>células/carril), o con PM TGL (1 x 10<7>células/pozo) extraídos de líneas celulares como se ha descrito anteriormente. Para facilitar la carga de grandes cantidades de TGL derivados de células, los TGL se secaron posteriormente en un bloque calefactor a 60 ºC y se resuspendieron en un máximo de 20 µL de cloroformo/metanol 2:1. Una vez cargados, los lípidos se movilizaron pasando las placas dos veces por el disolvente 1 (cloroformo:metanol:dH<2>O, 60:30:5) hasta una distancia de 5 cm y una vez por el disolvente 2 (hexano:dietileter:ácido acético glacial, 80:20:1,5) hasta una distancia de 8 cm. Posteriormente, los lípidos se visualizaron mediante orcinol (20 mg de orcinol en 20 mL de H<2>SO<4>al 5 %) revelado a 120 ºC por 20 minutos o mediante inmunotransferencia.

[0232] Para la inmunotransferencia, una vez movilizados los glicolípidos, las placas de TLC se bloquearon primero con un recubrimiento fino de poliisobutilmetacrilato 50 mg/50 mL en acetona. Las placas se bloquearon posteriormente mediante incubación en BSA al 1 % (p/v) en PBS por 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se incubaron posteriormente en anticuerpos primarios (10 µg en 10 mL por placa) o sueros de ratón (dilución de 1/100 en 10 mL por placa) que se detectaron con biotina IgG anti-ratón (1/1000) y burro anti-ratón IRD 800 CW (LICOR Biosciences Ltd, Cambridge, UK). Cada incubación de anticuerpos se realizó con un suave balanceo y duró 1 hora. La incubación del anticuerpo terciario se realizó en la oscuridad. Todos los anticuerpos se prepararon en 1 % (p/v) de BSA en PBS. Después de cada incubación de anticuerpos, se lavaron las placas vertiendo PBS directamente sobre ellas. Por último, se lavaron las placas, se dejaron secar durante la noche en la oscuridad y se analizaron con el sistema de imagenología infrarroja Odyssey SA (LICOR).

[0233] Citotoxicidad dependiente de anticuerpos y complemento

[0234] Se usó cromato de sodio radiomarcado en solución salina normal (Cr<51>) para usar en la valoración de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos y complemento, que liberan las células muertas debido a la mayor permeabilidad de sus membranas plasmáticas celulares. En detalle, se etiquetaron 2 x 10<6>células objetivo con 40 µL (1 mBq) de Cr<51>(Perkin Elmer, Cambridge, Reino Unido) y se dejaron incubar por un mínimo de 1 hora a 37 ºC. Después de la incubación, las células objetivo marcadas se lavaron dos veces en 25 mL de medio SF RPMI a 1400xg por 5 minutos. Posteriormente, se resuspendieron en 25 mL de medio RPMI SF y se dejaron reposar por 20 minutos a 37 ºC. Posteriormente, se centrifugaron de nuevo para eliminar el medio RPMI SF, se resuspendieron en 1 mL de medio de cultivo (RPMI suplementado con 10 % de FCS y 1 % de penicilina-estreptomicina) y se contaron. Por último, las células objetivo etiquetadas se resuspendieron a 1 x 10<5>células /1 mL y se añadieron 50 µL (5 x 10<3>células) a los pozos pertinentes de una placa de 96 pozos de fondo redondo. Se prepararon diluciones de anticuerpos en medios de cultivo asegurándose de que las diluciones de trabajo fueran 4 veces las concentraciones finales. Se añadió un volumen de 50 µL de anticuerpos diluidos a los pozos correspondientes. Se aislaron células mononucleares periféricas (PBMC, por sus siglas en inglés) de un voluntario sano el día del experimento usando tubos vacutainer protegidos con tapa verde y recubrimiento de heparina (BD, Plymouth, Reino Unido). La sangre total se diluyó primero 1:1 en SF RPMI. Para separar las PBMC, se colocaron suavemente 25 mL de sangre diluida sobre 15 mL de Histopaque -1077 en un tubo falcon de 50 mL. La sangre se centrifugó a 2100xg por 20 minutos con una aceleración de 1 y una deceleración de 0. Posteriormente se cosechó la capa leucocitaria, que contenía PBMC, usando una pipeta de 10 mL y se lavó dos veces en 20 mL de SF RPMI a 2000xg por 5 minutos. Posteriormente se contaron las PBMC, se resuspendieron a 5 x 10<6>células/1 mL de medio de cultivo y se añadieron 100 µL de células a los pozos correspondientes.

[0235] Para preparar el suero sanguíneo, se recogió sangre de un voluntario sano en tubos vacutainer (BD, Plymouth, Reino Unido) protegidos con tapa roja que contenían un activador del coágulo. La sangre coagulada se transfirió a un recipiente universal de 30 mL y se centrifugó dos veces a 2000xg por 5 min para garantizar la eliminación de todos los eritrocitos. Por último, se preparó 20 % de suero sanguíneo en medio de cultivo y se añadieron 100 µL a los pozos correspondientes.

[0236] Se indujo la máxima muerte celular aplicando 1 gota (25 µL) de Triton X - 100 a 50 µL de células objetivo marcadas y 125 µL de medio de cultivo. La muerte celular espontánea se valoró incubando 50 µL de células objetivo marcadas en 150 µL de medio de cultivo. Para valorar el nivel de destrucción inducida directamente por PBMC, se incubaron 50 µL de células objetivo con 100 µL de PBMC y 50 µL de medio de cultivo.

[0237] Las placas se incubaron por 24 horas a 37 ºC, después de lo cual se transfirieron 50 µL de sobrenadante a Lumaplates y se dejaron secar por 24 horas. Posteriormente, las placas se analizaron usando un contador de centelleo TopCount (Perkin Elmer, Cambridge, Reino Unido).

[0238] Estudios de afinidad

[0239] Las constantes de afinidad se determinaron usando el principio de resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) con un Biacore X (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). El conjugado polivalente HSA-Fuc-GM1 (conjugado interno a 5 µg/mL, 686 unidades de respuesta por chip) se acopló a la celda de flujo del chip biosensor CM5 mediante acoplamiento amínico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó como celda de referencia una celda de flujo de referencia tratada de forma similar, pero omitiendo el conjugado. Los parámetros cinéticos de unión se determinaron a partir de varias concentraciones conocidas de anticuerpo diluido y dializado en amortiguador HBS-P (10 mmol/L de HEPES, pH 7,4, 150 mmol/L de NaCl, 0,005 % tensioactivo P20) usando la celda de flujo recubierta de Fuc-GM1 a una tasa de flujo de 50 µL/min. Se usó el software de ajuste de curvas (BiaEvaluation) proporcionado por el instrumento Biacore para generar estimaciones de las tasas de asociación y disociación a partir de las cuales se calculan las afinidades usando un modelo de analito bivalente. Análisis de datos

[0240] La significación estadística de los resultados de ELISA se determinó usando la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett de ANOVA unidireccional. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas al nivel de P < 0,05. El símbolo * representa P ≤ 0,05, el símbolo ** representa P ≤ 0,01, el símbolo *** representa P ≤ 0,001 y el símbolo **** representa P ≤ 0,0001.

[0241] Unión a sangre:Se incubaron 50 µL de sangre de donante sano con 50 µL de anticuerpo primario a 4 ºC por 1 h. La sangre se lavó con 150 µL de RPMI 10 % NBCS y se centrifugó a 1.000 rpm por 5 minutos. Se descartó el sobrenadante y se usaron 50 µL de mAb conjugado con FITC anti-IgG Fc específica de ratón (1/100 en RPMI 10 % NBCS) como anticuerpo secundario. Las células se incubaron a 4 ºC en la oscuridad por 1 hora y posteriormente se lavaron con 150 µL de RPMI 10 % NBCS y se centrifugaron a 1.000 rpm por 5 minutos. después de desechar el sobrenadante, se usaron 50 µL/pozo de Cal-Lyse (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) seguidos de 500 µL/pozo de agua destilada para lisar los eritrocitos. Subsecuentemente, la sangre se centrifugó a 1.000 rpm por 5 minutos. Se desechó el sobrenadante y se usó formaldehído al 0,4 % para fijar las células. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo FC-500 (Beckman Coulter). Para analizar y trazar los datos brutos se usó el programa WinMDI 2.9.

[0242] Extracción de ARN y síntesis de ADNc

[0243] Se tomaron aproximadamente 1 x 10<6>células de los hibridomas FL134.33, FL133.63 y FL133.67 del cultivo de tejidos, se lavaron una vez en PBS y se trataron con 500 µL de trizol (Life technologies). Las muestras homogeneizadas se trataron con 0,1 mL de cloroformo y se centrifugaron para separar el ARN del ADN y las proteínas contaminantes. El ARN se precipitó usando 0,25 mL de propan-2-ol y se centrifugó para formar un pequeño precipitado. El precipitado se lavó posteriormente con etanol al 75 % y se resuspendió en agua libre de ARNasa. El ARN se trató con ADNasa (ADNasa I recombinante, libre de RNasa, Roche) para eliminar el ADN genómico siguiendo las recomendaciones del fabricante. El ADNc de primera hebra se preparó a partir de 1 µg de ARN total usando un kit de transcriptasa inversa AMV (Roche Diagnostics. Basilea, Suiza) con el cebador oligo (dT)15 siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la síntesis del ADNc, se desnaturalizó la enzima incubándola a 95 ºC por 5 minutos. El ADNc se almacenó posteriormente a -20 ºC.

[0244] PCR de región variable

[0245] Los anticuerpos se valoraron previamente mediante un kit de pruebas de isotipado (Serotec. Kidlington, UK) y se determinó que FL134.33 era del subtipo IgG1, y FL133.63 y 133.67 eran de IgG3 (Datos no mostrados). Las regiones variables se determinaron mediante PCR usando un conjunto de cebadores previamente publicado (Jones & Bendig, 1991). La amplificación por PCR se llevó a cabo con 13 cebadores específicos de la región VK y un cebador específico de la Ck para la cadena ligera y 12 cebadores específicos de la región VH y un cebador específico de la subclase de la región constante para la cadena pesada. Se prepararon reacciones de PCR de 50 µL usando 1U de polimerasa (AmpliTaq Gold 360, Applied Biosystems. California, EE.UU.), una mezcla de 2'-desoxinucleósidos 5'-trifosfatos (dNTP) a una concentración final de 0,2 mM cada uno, cloruro de magnesio a una concentración final de 1,5 mM, y cebadores antisentido y directo a 1 µM. El paso de inicio en caliente de las reacciones se llevó a cabo por cinco minutos a 95 ºC. Posteriormente, la amplificación se llevó a cabo por 35 ciclos: 94 ºC por un minuto, seguido de 60 ºC por un minuto y 72 ºC por dos minutos. Por último, el paso de pulido se realizó a 72 ºC por 20 minutos Los productos amplificados se valoraron mediante electroforesis en gel de agarosa preparado con agarosa UltraPure al 1 % (Invitrogen. Carlsbad, EE.UU.) en amortiguador TAE (por sus siglas en inglés) con bromuro de etidio y a 90 voltios. Los geles se visualizaron usando transiluminación UV.

[0246] PCR de purificación de productos (cadena pesada y ligera)

[0247] Los productos de la PCR se purificaron usando un kit de extracción QIAquick Gel (Qiagen. Venlo, Países Bajos) para evitar el arrastre de nucleótidos o cebadores residuales y obtener gráficos de secuencias limpias. Se cargaron 150 µL de productos PCR de cadena pesada y ligera en un gel de agarosa al 1 % y se analizaron a 85 voltios. Los fragmentos de ADN se extrajeron del gel, se disolvieron y se purificaron en columnas siguiendo el protocolo del fabricante. La concentración final del ADN resultante se determinó mediante espectroscopia UV (Nanodrop, Thermoscientific. Waltham, EE.UU.)

[0248] PCR de corrección

[0249] Los cebadores para llevar a cabo la PCR de corrección se diseñaron para mantener el marco de lectura y preservar la secuencia de aminoácidos, basándose en los datos de la secuencia. Se consideraron los codones de inicio, la secuencia consenso de Kozak para la iniciación del proceso de traducción y se incorporaron los sitios de enzimas de restricción para permitir la integración en el vector de doble expresión. La amplificación por PCR se llevó a cabo usando los cebadores de clonación y una polimerasa correctora (PHUsion, NEB. Ipswich, Reino Unido) con el ADNc como molde. La reacción se realizó por triplicado para mejorar el rendimiento del producto. Las reacciones de 50 µL se prepararon como se ha indicado anteriormente. El paso de inicio en caliente se realizó por tres minutos a 98 ºC. Posteriormente se amplificó por 35 ciclos: 98 ºC por 30 segundos, seguido de 58 ºC por 30 segundos y 68 ºC por 60 segundos. El paso de pulido se realizó a 72 ºC por 10 minutos.

[0250] Clonación TOPO de productos de PCR

[0251] Los productos de PCR generados con la polimerasa de lectura de pruebas se trataron con Taq polimerasa (NEB, por sus siglas en inglés) por 15 min a 72 ºC para añadir adenina voladiza, y se clonaron en un vector TA (TOPO) (pCR2.1, Invitrogen) y se transformaron en células TOP10F químicamente competentes para su subsecuente digestión enzimática y ligación en el vector pDCOrig-hlgG1, siguiendo las instrucciones del fabricante. Las bacterias transformadas se cultivaron en placas de agar LB (por sus siglas en inglés) o en medios líquidos suplementados con 80 µg/mL de ampicilina.

[0252] Purificación del ácido nucleico

[0253] El ADN plasmídico se preparó a partir de un cultivo durante la noche de la bacteria transformada en cultivo líquido suplementado con el anticuerpo apropiado a 37 ºC y 120 rpm. Se prepararon pequeñas cantidades usando el kit spini miniprep (Qiagen) y cantidades mayores con el kit plasmid maxi (Qiagen), ambos siguiendo las instrucciones del fabricante. La purificación del ADN se llevó a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa como se ha descrito anteriormente y usando un kit de extracción en gel para recuperar el ADN, siguiendo el procedimiento del fabricante.

[0254] Digestión con enzimas de restricción y clonación de vectores de doble expresión

[0255] La digestión enzimática del ADN se realizó con 10 µL de ADN y la adición de 8 unidades de cada una de las enzimas de restricción, en presencia de albúmina sérica bovina (BSA) y del amortiguador óptimo propio de cada enzima. La incubación se realizó a la temperatura de actividad de cada enzima durante dos horas. El vector de expresión doble PDCOrig-hlgG1 y el inserto de cadena ligera se digirieron, se purificaron en gel de agarosa y se ligaron durante la noche a 16 ºC usando ADN ligasa T4 (NEB) siguiendo las indicaciones del fabricante. A continuación se realizó una segunda digestión del vector y de la cadena pesada, otra purificación mediante extracción en gel y una segunda ligación durante la noche a 16 ºC. después de cada digestión, el vector se transformó en células TOP10F químicamente competentes (Invitrogen). Las bacterias transformadas se cultivaron en placas de agar LB o en medios líquidos suplementados con 35 µg/mL de zeocina (Invivogen).

[0256] Secuenciación y transfección del vector de anticuerpos quimerizados

[0257] Los productos de la PCR y los plásmidos se secuenciaron usando cebadores 5' y 3' adecuados en las instalaciones de secuenciación de ADN de la Universidad de Nottingham y se analizaron usando el paquete de programas GeneTool y la base de datos IMGT para secuencias de nucleótidos de inmunoglobulinas de ratón. Las células CHO se transfectaron usando lipofectamina (Invitrogen) y medio de suero reducido Opti-mem (Gibco, Life technologies. Waltham, EE.UU.). Las células se cultivaron en suspensión en medio CHO-S-SFMII (Gibco) hasta que se agotó. Se recogió el sobrenadante y se purificó el anticuerpo mediante cromatografía preparativa (Äkta FPLC, GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) usando una columna de sefarosa preempaquetada con proteína G (HiTrap protein G HP, GE Healthcare). Después de la purificación, el anticuerpo se dializó y el rendimiento final se determinó mediante espectrometría UV.

[0258] Ejemplo 1 - Generación y caracterización inicial de mAb FUC-GM1

[0259] Se inmunizó a ratones con liposomas clásicos que contenían 10 µg de fucosil GM1 por inmunización por ratón administrado i.p. Alfa-GalCer se usó como adyuvante en la 1ª y 3ª inmunización, mientras que mAb anti-CD40 se usó como adyuvante en la 2ª y 4ª inmunización. Todos los ratones recibieron 4 inmunizaciones. Las tres primeras inmunizaciones se administraron a intervalos de dos semanas, mientras que la última inmunización se administró cuatro semanas después de la tercera. A partir de la segunda inmunización, se sangró a los ratones una semana después de la inmunización y posteriormente se analizaron los sueros para detectar la unión de IgG e IgM al fucosil GM1 purificado por ELISA. Después de la inmunización, los ratones presentaron una respuesta inmunitaria IgG significativa frente al fucosil GM1, con un título final de 1/100. También se valoró la unión de IgG de suero de ratón a la superficie celular de la línea celular DMS79, que expresa fucosil GM1. Lamentablemente, solamente se observó una unión débil a la línea celular. Es posible especular que los sueros de ratón reconocieron un epítopo del antígeno fucosil GM1 que no es accesible una vez que el lípido se integra en la membrana plasmática de la célula.

[0260] Como el glicolípido purificado incorporado en liposomas no consiguió generar respuestas IgG de título elevado, se evaluaron otros métodos de inmunización. Tradicionalmente, los carbohidratos y los glucolípidos se clasifican como antígenos independientes de las células T que evocan principalmente una respuesta de anticuerpos IgM. Las respuestas de anticuerpos IgG de alta afinidad se generan principalmente en respuesta a antígenos proteicos. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que la provisión de ayuda de células T vinculadas generaría una respuesta de anticuerpos IgG de alta afinidad mayor y más consistente frente a antígenos de carbohidratos y glicolípidos. Por lo tanto, el fucosil GM1 se conjugó con albúmina sérica humana (HSA).

[0261] La conjugación del fucosil GM1 a las proteínas siguió un proceso de dos pasos. En primer lugar, el gangliósido fucosil GM1 purificado se sometió a ozonólisis, en la que el ozono reactivo oxida el doble enlace carbono-carbono presente en la unión esfingosina del glicoesfingolípido para crear un grupo aldehído libre. En el siguiente paso, el fucosil GM1 ozonolisado se conjugó con la HSA mediante el proceso de aminación reductora. Aquí, se permitió que los aldehídos recién generados del fucosil GM1 ozonolisado reaccionaran con el grupo amina primario de las lisinas de la HSA para formar primero bases de Shiff lábiles que, al reducirse con borohidruro de sodio, forman uniones aminas secundarias altamente estables. Una representación esquemática de la generación de conjugados se ilustra en la (Figura 4).

[0263] Después de la ozonólisis, se analizaron muestras del fucosil GM1 original y del ozonolisado mediante espectrometría de masas por transformada de Fourier (FTMS, por sus siglas en inglés). La muestra original contenía varias especies de fucosil GM1 con distintas longitudes de las cadenas de ácidos grasos. La especie más abundante tenía un peso molecular de 1.746 Da. La muestra ozonolisada también contenía especies con diferentes tamaños de cadenas de ácidos grasos. En la muestra de fucosil GM1 ozonolisada, la especie principal tenía un peso molecular de 1.566 Da, presentando un desplazamiento de masa de exactamente 180 Da, correspondiente a la pérdida de la fracción de esfingosina. Adicionalmente, las especies originales de fucosil GM1 no eran detectables en la muestra ozonolisada (Figura 5). Se añadió fucosil GM1 ozonolisado resuspendido en DMSO a HSA resuspendida en amortiguador de carbonato-bicarbonato. A esto se añadió el agente reductor borohidrato de sodio (H<4>BNa) y se dejó incubar la reacción por 8 horas a temperatura ambiente, resuspendiéndose posteriormente en 100 µL de amortiguador PBS/EDTA. Posteriormente, se añadió el agente reticulante sulfo-MBS y se dejó incubar por 1 hora a temperatura ambiente.

[0265] La generación satisfactoria de conjugados HSA-fucosil GM1 se valoró mediante ELISA, inmunotransferencia tipo Western y espectrometría de masas. Por ELISA, tanto la HSA original como las tres muestras de conjugados HSA-fucosil GM1 fueron detectadas por suero de ratón que contenía anticuerpos IgG contra la HSA (títulos finales de 1/10.000), mientras que solamente los conjugados HSA-fucosil GM1 fueron detectados por mAb F12 anti-fucosil GM1 (título final de 1/10.000) (Figura 6A). La generación de conjugados HSA-fucosil GM1 en las tres muestras también se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia tipo Western. El suero de ratón anti-HSA se unió a la HSA original, a la HSA que había sido sometida a aminación reductora pero a la que no se había añadido fucosil GM1, al conjugado HSA-Lewis Y, al conjugado HSA-GD3 y a las tres muestras de conjugados HSA-fucosil GM1. Por otra parte, el mAb anti-fucosil GM1 F12 detectó únicamente conjugados HSA-fucosil GM1, y éstos tenían el tamaño esperado de 67 kDa. Este análisis también indicó un ligero aumento del peso molecular de los conjugados HSA-fucosil GM1 en comparación con la HSA original. Esto era coherente con la adición de moléculas de fucosil GM1 a la HSA (Figura 6b).

[0267] Se inmunizó a ratones con conjugados HSA-Fuc-GM1 (10 µg por inmunización), junto con liposomas que contenían Fuc-GM1 (10 µg por inmunización) y la línea celular de SCLC DMS79 positiva para Fuc-GM1 (1 x 10<6>células por inmunización). 15 ratones divididos en 5 grupos, cada uno de los cuales consistía en 3 ratones y variaba en los tipos y la secuencia de los adyuvantes inmunitarios que se usaban.

[0269] El grupo 1 recibió primero tres inmunizaciones con liposomas Fuc-GM1 seguidas de dos inmunizaciones con conjugados HSA-Fuc-GM1. Como adyuvantes, se usó α-GalCer en la primera inmunización, anti-CD40 en las dos inmunizaciones siguientes y adyuvante de Freund incompleto (IFA, por sus siglas en inglés) para los conjugados HSA-Fuc-GM1. Para mejorar las posibilidades de generar mAb capaces de reconocer Fuc-GM1 en la superficie celular, el grupo 2 fue inmunizado primero con 1 x 10<6>células DMS79, seguido de dos inmunizaciones con Fuc-GM1 que contenían liposomas y dos inmunizaciones con los conjugados HSA-Fuc-GM1. En la segunda y tercera inmunizaciones se usó α-GalCer, mientras que con los conjugados HSA-Fuc-GM1 se usó adyuvante incompleto de Freund. El grupo 3 fue inmunizado primero con conjugados HSA-Fuc-GM1, seguido de la inmunización con los liposomas Fuc-GM1. Se usó adyuvante completo de Freund como adyuvante con los conjugados HSA-Fuc-GM1, anti-CD40 como adyuvante en la segunda inmunización y α-GalCer en la tercera. En el grupo 4 se invirtió el orden de estos antígenos; los ratones fueron inmunizados primero con dos dosis de liposomas Fuc-GM1 seguidas de una inmunización con conjugados HSA-Fuc-GM1. Se usó α-GalCer como adyuvante en la primera inmunización, anti-CD40 en la segunda e IFA en la tercera. El grupo 5 fue inmunizado con tres dosis de conjugados HSA-Fuc-GM1. El CFA (por sus siglas en inglés) se usó como adyuvante en la primera inmunización y la IFA en las dos siguientes. Los grupos y sus inmunógenos se resumen en la (Tabla 1).

[0271] Tabla 1: Resumen de los ru os e inmunó enos usados en la inmunización.

[0273]

[0274] Los ratones fueron inmunizados mediante vía i.p. Las tres primeras inmunizaciones se administraron a intervalos de 2 semanas. Los grupos 1 y 2 también recibieron una cuarta inmunización 6 semanas después de la tercera, y una quinta inmunización 3 semanas después de la cuarta.

[0276] Después de cada inmunización, excepto la primera, se sangró la cola de los ratones y se analizó por ELISA la unión de IgG de suero de ratón a los conjugados HSA-Fuc-GM1. Además, puesto que se contemplaba generar mAb que reconocieran exclusivamente la Fuc-GM1 (en contraposición a la Fuc-GM1 unida a un residuo de lisina), también se analizaron los sueros de ratones para ver si se unían a la Fuc-GM1 purificada. Estos análisis mostraron que todos los ratones generaron una respuesta inmunitaria IgG a los conjugados HSA-Fuc-GM1 (títulos de punto final 1/10.000), pero solamente 6 de los 15 ratones generaron la respuesta Fuc-GM1 purificada deseada. Se detectó una respuesta IgG significativa a Fuc-GM1 purificado en dos ratones del Grupo1 (3x liposomas 2x conjugado), ambos con un título de punto final 1/1.000. Adicionalmente, se presentaron títulos detectables en dos ratones del Grupo 2 (células DMS79 2x liposomas 2x conjugado) con título de punto final 1/1000 para el ratón 2P y 1/100 para el ratón 2R y en dos ratones del G5 (3x conjugado) con título de punto final 1/100 para el ratón 5P y 1/1000 para el ratón 5R. En la (Figura 7) solamente se muestran los datos de los ratones que mostraron respuestas anti-Fuc-GM1 positivas.

[0278] El análisis del suero indicó que 6 ratones habían desarrollado una respuesta inmunitaria IgG al Fuc-GM1 purificado. Para valorar si estos anticuerpos también podían reconocer Fuc-GM1 en el contexto de una membrana plasmática celular intacta, se examinó su unión a células DMS79 por citometría de flujo. Este análisis mostró que solamente los dos ratones del Grupo 2 (que habían sido inmunizados con células DMS79 seguidas de 2 dosis de liposomas y 2 dosis de conjugado) generaron anticuerpos capaces de unirse a Fuc-GM1 en la superficie de las células (GM ≈ 500). Ninguno de los otros grupos que desarrollaron una respuesta IgG específica de Fuc-GM1 se unió también a la superficie de células vivas, lo que sugiere que la inclusión de células DMS79 vivas en el protocolo de inmunización tenía un valor crucial (Figura 8).

[0280] Después de la obtención de datos que indicaban una respuesta anti-Fuc-GM1 IgG prometedora, se sacrificó el ratón 2R y sus esplenocitos se fusionaron con células de mieloma NS0. Cinco días antes de la fusión, se reforzó la respuesta inmunitaria del ratón con 10 µg de Fuc-GM1 y α-GalCer en liposomas administrados i.v. Una vez establecidas, las colonias individuales de hibridomas se analizaron mediante ELISA para detectar la producción de anticuerpos IgG que se unieran a la Fuc-GM1 purificada. Se identificaron cuatro hibridomas con la unión de anticuerpos más fuerte y se clonaron dos veces a 0,3 células por pozo. Después de cada ronda de clonación, se volvieron a analizar los sobrenadantes de hibridoma para detectar la secreción de anticuerpos IgG que se unieran a Fuc-GM1 purificada mediante ELISA (resultados no mostrados). Después de la clonación, se seleccionaron los hibridomas FL133.63, FL133.67 y FL134.33, se expandieron y se purificaron los mAb a partir de los sobrenadantes de los hibridomas. Usando el kit de prueba de isotipo, los mAb FL133.63 y FL133.67 resultaron ser IgG3, kappa mientras que el mAb FL134.33 se identificó como IgG1, kappa.

[0282] Después de la clonación, expansión y purificación, era importante valorar la unión de estos mAb a la superficie celular de líneas celulares cancerosas positivas para Fuc-GM1. Todos los anticuerpos se usaron a la misma concentración de 10 µg/mL para permitir una comparación directa. El mAb FL133.63 se unió fuertemente a la línea celular DMS79 (GM ≈ 1000) y débilmente a la línea celular DMS53 (GM ≈ 100). El mAb FL133.67 se unió fuertemente a DMS79 (GM ≈ 1000) pero no se unió a ninguna otra línea celular Fuc-GM1 positiva. El mAb FL134.33 se unió fuertemente a DMS79 (GM ≈ 1000), moderadamente a H128 (GM ≈ 300) y débilmente a DMS53 (GM ≈ 100). El control positivo mAb F12 se unió a las 4 líneas celulares mostrando una intensidad de tinción mucho más fuerte con GM ≈ 2000 para DMS79, GM ≈ 700 para DMS53, GM ≈ 500 para H128 y GM ≈100 para la línea celular H69; de todos los mAb, mAb F12 solo se unió a la línea celular H69. El mAb FL134.33 mostró un comportamiento inusual al unirse a la línea celular H128 con una intensidad mayor que a la línea celular DMS53; según los informes, la línea DMS53 expresa mayores cantidades de Fuc-GM1 que la línea celular H128, un resultado confirmado aquí por la tinción con mAb F12 (Figura 9).

[0284] Se analizó la unión de los tres mAb a la sangre total de un voluntario humano sano, y no mostraron unión a ninguna célula nucleada presente. Como controles negativos se usaron los isotipos IgG1, IgG3 y F12, mientras que como control positivo se usó un mAb anti- MHC clase 1 (Figura 10).

[0286] Ejemplo 2 - Definición de los epítopos reconocidos por los mAb Fuc-GM1

[0288] La especificidad de los mAb FL133.63, FL133.67 y FL134.33 para Fuc-GM1 se valoró mediante ELISA de glicolípidos, en el que se probó la unión de los mAb a un rango de gangliósidos purificados disponibles, a saber, Fuc-GM1, GD3, GM1, GM3, GD1a, GT1b, Gb3 y ceramida lactosilada. Los tres mAb reconocieron exclusivamente el gangliósido Fuc-GM1 a concentraciones de 1-0,01 µg/mL. El control positivo mAb F12 también reconoce Fuc-GM1 en concentraciones de 1-0,01 µg/mL. El gangliósido GD3 fue detectado por el control positivo mAb R24, a concentraciones de 1 -0,01 µg/mL. Los gangliósidos Fuc-GM1, GM1 y GD1a se detectaron mediante el control positivo de la subunidad B de la toxina del cólera (CTxB) a 1 µg/mL. Aún no se han desarrollado mAb IgG específicos para GM3, GT1b, Gb3 y LacCer (Figura 11).

[0289] Para validar aún más la unión de los mAb FL133.63, FL133.67 y FL134.33 a Fuc-GM1 se valoraron en un ensayo de competición entre Fuc-GM1 purificado y este gangliósido expresado en la línea celular DMS79. En este experimento, los mAb se preincubaron con Fuc-GM1 purificado antes de usarlos como reactivo primario en la citometría de flujo. La preincubación del mAb FL133.63 con el gangliósido Fuc-GM1 redujo su unión a la línea celular DMS 79 de GM = 523 a GM = 4, la unión del mAb FL133.67 se redujo de GM = 201 a GM = 3, la unión del mAb FL134.33 se redujo de GM = 434 a GM = 29, y la unión del control positivo mAb F12 se redujo de GM = 1195 a GM = 6. La preincubación del mAb anti-MHC de clase 1 de control negativo con el gangliósido Fuc-GM1 no tuvo ningún efecto sobre su unión a las células DMS 79 (Figura 12).

[0290] Para aclarar aún más las especificidades de los mAb FL133/134, el Consorcio para la Glicómica Funcional los analizó frente a ≥ 600 glicanos naturales y sintéticos. FL133.63 (Figura 13a) a la matriz de glicanos mostró que inesperadamente (Tabla 2) no se unía a FucGM1 (azúcar libre) cuando se unía directamente al chip FucGM1sp0 (Gráfico número 63) o a FucGM1 (azúcar libre) unido al chip mediante un espaciador de 9 carbonos Fuc-Gm1sp9 (gráfico número 64).

[0291] Tabla 2: Unión de FL133.63 a azúcares en la matriz de licoma

[0293]

[0295] La unión de FL 134.33 (Figura 13B) a la matriz de glicanos mostró que inesperadamente (Tabla 3) no se unió a FucGM1 (azúcar libre) cuando se unió directamente al chip FucGM1sp0 (Gráfico número 63) y se unió muy débilmente cuando FucGM1 (azúcar libre) se unió al chip mediante un espaciador de 9 carbonos Fuc-Gm1 sp9 (gráfico número 64).

[0296] Tabla 3: Unión de FL134.33 a azúcares en la matriz de licoma

[0298]

[0300] Por último, la especificidad de estos mAb para Fuc-GM1 también se demostró mediante análisis de TLC. El gangliósido Fuc-GM1 purificado, el gangliósido GM1 purificado y el DMS79 PM TGL se cargaron en placas de sílice. Los tres mAb de Fuc-GM1 reconocieron Fuc-GM1 purificado y una banda presente en DMS79 PM TGL movilizando la misma distancia que Fuc-GM1 purificado. Ninguno de los anticuerpos se unió al gangliósido GM1 purificado. El patrón de reconocimiento de los mAb Fuc-GM1 generados aquí fue idéntico al del mAb de control positivo F12, que también reconoció Fuc-GM1 purificado y DMS79 PM TGL. Sorprendentemente, el mAb F12 también se unió débilmente al gangliósido GM1 purificado, unión que no se había detectado en ensayos anteriores (Figura 14).

[0301] La afinidad de los mAb anti-Fuc-GM1 a sus antígenos se determinó mediante SPR con un Biacore X. Los conjugados HSA-Fuc-GM1 originalmente usados para la generación de los tres mAb anti-Fuc-GM1 se usaron como objetivos para el análisis. La unión de los mAb anti-Fuc-GM1 a los conjugados se confirmó por ELISA (Figura 15). Para acoplar los conjugados HSA-Fuc-GM1 al chip biosensor CM5, primero se lavó el chip con amortiguador HSB-P, después de lo cual se aplicó el agente reticulante EDC-NHS. Posteriormente, los conjugados HSA-Fuc-GM1 se inyectaron en la celda de flujo a 20 µg/mL diluidos en amortiguador de acoplamiento de acetato 4,5. Después de inyectar un volumen de 5 µL, se adhirieron al chip 686 unidades de respuesta de conjugados. Por último, el agente de acoplamiento sin reaccionar se bloqueó con etanolamina. Los parámetros cinéticos de unión se determinaron a partir de varias concentraciones conocidas de anticuerpo diluido en amortiguador HBS-P usando la celda de flujo recubierta de HSA-Fuc-GM1. Se usó el software de ajuste de curvas (BiaEvaluation) suministrado con el instrumento Biacore para generar estimaciones de las tasas de asociación y disociación, a partir de las cuales se calcularon las afinidades usando el modelo de analito bivalente mejor ajustado. Este modelo calcula afinidades para proteínas bivalentes, pero solamente es capaz de calcular datos significativos para la unión del primer brazo del anticuerpo. Según este modelo, los mAb Fuc-GM1 tienen constantes de velocidad de asociación promedio k<on>(por sus siglas en inglés, 3,56 x 10<4>Ms<-1>para el Ab FL133.63, 9,43 x 10<3>Ms<-1>para el mAb FL133.67 y 2,01 x 10<3>Ms<-1>para el mAb FL134.33), pero constantes de velocidad de disociación muy rápidas k<off>(por sus siglas en inglés, 0,0637 s<-1>para el mAb FL133.63, 0,0783 s<-1>para el mAb FL133.67 y 0,117 s<-1>para el mAb FL134.33), lo que da una afinidad funcional global baja para el Fuc-GM1.0637 s<-1>para mAb FL133.63, 0.0783 s<-1>para mAb FL133.67 y 0.117 s<-1>para mAb FL134.33) dando una afinidad funcional global baja para estos mAb (1,8 x 10<-6>M para mAb FL133.63, 8,3 x 10<-6>M para mAb FL133.67 y 5,8 x 10<-5>M para mAb FL134.33 (Tabla 4).

[0302] Tabla 4: Parámetros cinéticos de unión de mAb anti-Fuc-GM1 determinados or SPR.

[0304]

[0306] La EC50 y la constante de disociación de equilibrio (Kd) de los 3 anticuerpos Fuc-GM1 se determinaron titulándolos en células Fuc-GM1 purificadas y DMS79, respectivamente (Figura 16). La afinidad funcional representada por los valores EC50 de Fuc-GM1 ELISA y el análisis de citometría de flujo en células DMS 79 fueron mayores a los proporcionados por la valoración SPR. El mAb FL133.63 tuvo una EC50 de 1 x 10<-9>en Fuc-GM1 ELISA y Kd = 7,5 x 10<-9>en células DMS79. Esto es 1.000 veces superior a la afinidad establecida por SPR. El mAb FL133.67 tuvo una EC50 de 2,1 x 10<-9>en Fuc-GM1 ELISA y Kd = 1,2 x 10<-8>en células DMS79. Esta afinidad es entre 100 y 1000 veces mayor a la establecida por SPR. El mAb FL134.33 tuvo una EC50 de 9,2 x 10<-10>en Fuc-GM1 ELISA y Kd = 6,3 x 10<-9>en células DMS79. Esto es 10.000 veces mayor a la afinidad establecida por SPR. Estos resultados sugieren que el análisis SPR midió la unión de anticuerpos monovalentes. Al unirse a los antígenos de la superficie celular, la avidez de los anticuerpos se potencia enormemente.

[0307] Ejemplo 3 - Ensayos funcionales

[0308] Dado que los tres mAb Fuc-GM1 se unieron a la línea celular DMS79, también era importante establecer sus funciones efectoras. El mAb FL134.33 (lgG1) demostró entre 50 % y 80 % de citotoxicidad por ADCC (dependiendo del donante), pero solamente 20 % de citotoxicidad por CDC. Ambos mAb FL133.63 (lgG3) y FL133.67 (lgG3) mostraron 20 % de citotoxicidad por ADCC pero 60-80 % de citotoxicidad mediada por CDC. Estos resultados concuerdan con estudios anteriores que demostraron que los mAb con isotipos IgG1 son más potentes en la inducción de ADCC y los mAb de isotipo IgG3 son más potentes en la inducción de CDC (Lopezet al., 1983, Niwaet al., 2005, Bruggemannet al., 1987, Natsumeet al., 2008). Por el contrario, el mAb murino de control positivo SC101 (lgG1) demostró una citotoxicidad mediada por ADCC de 70 % y CDC de 80 % de las células DMS79 (Figura 17).

[0309] Ejemplo 4 - mAb quimérico

[0310] Los mAb FL133.63, FL133.67 y FL134.33 fueron secuenciados y las secuencias de las cadenas VH y VL han sido comparadas con las secuencias del anticuerpo IgG de la línea germinal usando el programa IMGT/V_QUEST. En conjunto, todos los datos demuestran evidencias de hipermutación somática y también sugieren la presencia de cierta maduración por afinidad. Las cadenas VH de los tres anticuerpos Fuc-GM1 se asignaron al gen V3, subgrupo 1 y alelo 02. En comparación con la secuencia de la línea germinal, la región VH del mAb FL134.33 contenía 14 mutaciones de sustitución y un cambio de 7 aminoácidos, el mAb FL133.63 contenía 8 mutaciones de sustitución y un cambio de 6 aminoácidos, mientras que el mAb FL133.67 contenía 6 mutaciones de sustitución y un cambio de 4 aminoácidos (Figura 18 y Tabla 5).

[0311] En FR2, los tres mAb contenían una mutación de transición a157>g que resultaba en un cambio de aminoácido M53>V. En CDR2, los tres mAb contenían una mutación transversal a157>c que resultaba en un cambio de aminoácido S59>R y una mutación de transición g191>a que resultaba en un cambio de aminoácido S64>N. En FR3, los tres mAb contenían una mutación de transversión silenciosa t231>a, una mutación de transversión c248>a que resultaba en un cambio de aminoácido S83>Y y, por último, una mutación de transición silenciosa c309>t. El mAb FL134.33 también contenía una mutación de transversión a2>c que resultaba en un cambio de aminoácido D1>A, una mutación de transición silenciosa g9>a y una mutación de transición silenciosa c69>t en FR1; una mutación de transición silenciosa c198>t, una mutación de transición a226>g que resultaba en un cambio de aminoácido l6>V, una mutación de transición silenciosa g267>a, una mutación de transición silenciosa g273>a y una mutación de transversión g280>c que resultaba en un cambio de aminoácido V94>L en FR3.

[0312] El mAb FL133.63 también contenía una mutación de transición t259>c que resultaba en un cambio de aminoácido F87>L y una mutación de transición a269>g que resultaba en un cambio de aminoácido Q90>R.

[0313] Tabla 5: Mutación de la re ión VH cambio de aminoácidos

[0315]

[0317] Las cadenas VL de los tres anticuerpos Fuc-GM1 se asignaron al gen K5, subgrupo 39 y alelo 01. En comparación con la secuencia de la línea germinal, la región VL del mAb FL134.33 contenía 10 mutaciones de sustitución y un cambio de 6 aminoácidos, el mAb FL133.63 contenía 7 mutaciones de sustitución y un cambio de 6 aminoácidos, mientras que el mAb FL133.67 contenía 7 mutaciones de sustitución y un cambio de 6 aminoácidos (Figura 19 y Tabla 6).

[0318] Tabla 6: Mutación de la re ión VL cambio de aminoácidos

[0320]

[0322] En CDR1, los tres mAb contenían una mutación de transición t112>g que resultaba en un cambio de aminoácido Y38>D. En CDR2, los tres mAb contenían una mutación de transición c170>t que resultaba en un cambio de aminoácido A57>V. En FR3, los tres mAb contenían una mutación transversal g269>c que resultaba en un cambio de aminoácido S90>T y una mutación de transición silenciosa g303>a.

[0323] El mAb FL134.33 también contenía una mutación transversal c26>a que resultaba en un cambio de aminoácido A9>D en FR1; una mutación de transición silenciosa g153>a en FR2; una mutación de transición silenciosa c195>t en CDR2; mutaciones de transición g250>a y g252>a que resultaban en un cambio de aminoácido G84>R y una mutación transversal g301>c que resultaba en un cambio de aminoácido V101 >L en FR3.

[0325] El mAb FL133.63 también contenía una mutación transversal c14>g que resultaba en un cambio de aminoácido T5>S en FR1; una mutación transversal a106>g que resultaba en un cambio de aminoácido S36>G en CDR1 y una mutación transversal a256>t que resultaba en un cambio de aminoácido D86>Y en FR3.

[0327] El mAb FL133.67 también contenía una mutación transversal c14>g que resultaba en un cambio de aminoácido T5>S en FR1; una mutación transversal c200>a que resultaba en un cambio de aminoácido S67>Y y una mutación transversal c276>g que resultaba en un cambio de aminoácido N92>K.

[0329] De los tres anticuerpos de los que se han obtenido secuencias de región variable, FL134.33 fue el anticuerpo elegido para la quimerización. Para permitir la clonación de ambas secuencias del anticuerpo, hubo que diseñar cebadores específicamente para ellas e incorporarles sitios de enzimas de restricción. El vector de expresión doble contiene sitios de restricción para las enzimas BamHI y BsiWI para la cadena ligera, y las enzimas Hindlll y Afel para la cadena pesada. Los cebadores de región variable insertos deben tener también sitios que después de la digestión generen salientes compatibles con los del vector. En el caso de FL134.33, sin embargo, no se pudo añadir al cebador un sitio de restricción para la digestión con BamHI, ya que dicho sitio también estaba presente en la secuencia interna de la cadena ligera. Por ese motivo, se necesitaba un sitio de digestión alternativo que generara los voladizos compatibles con los de BamHI. La enzima de restricción con dichas características resultó ser Bglll.

[0331] Los cebadores diseñados y usados para llevar a cabo la amplificación por PCR y los subsecuentes procedimientos de clonación fueron 5'-ATTAAGATCTAAGATGGTGTCCACTTCTCAGCTC-3' para la cadena ligera (κ) hacia delante incluyendo el sitio de restricción Bglll y 5'- AATTCGTACGTTTGATTTCCAGC TTGGTGCCT-3' para la cadena ligera (κ) hacia atrás incluyendo el sitio de restricción BsiWI. Adicionalmente, 5'-TAATAAGCTTAAGATGAGAGTGCTGATTCTTTTG-3' fue el cebador para la cadena pesada directa, incluyendo el sitio de restricción Hindlll y 5'-AGAGCAGCGCTGGAGACGGTGACT GAGGT-3' para la cadena pesada inversa incluyendo el sitio de restricción Afel. La reacción de PCR se preparó con cebadores sentido y reverso y usando una polimerasa de lectura de prueba. La amplificación de las cadenas ligeras y pesadas se confirmó por la presencia de productos en la electroforesis en gel de agarosa. Las cadenas pesadas y ligeras se clonaron en el vector TOPO y se transformaron en células químicamente competentes suplementadas con ampicilina para crecimiento selectivo. Se seleccionaron seis colonias portadoras de la cadena ligera y seis portadoras de la cadena pesada para crecer en cultivo líquido y se preparó ADN plasmídico mediante minipreparación. Con la ventaja que representa el sitio de restricción interno de BamHI, la digestión enzimática podría resultar una forma segura de saber si realmente se ha clonado la secuencia correcta en el vector. Posteriormente se realizó la digestión enzimática usando EcoRI (dos sitios presentes en los extremos 5' y 3' del sitio de clonación) y BamHI más BsiWI (sitio interno en el centro de la secuencia y sitio de incorporación del cebador, respectivamente) y se usó para su valoración la electroforesis en gel de agarosa. La digestión EcoRI del vector mostró una secuencia del tamaño esperado (400 pb) en dos colonias analizadas para la cadena ligera y en tres para la cadena pesada. BamHI más BsiWI mostraron una secuencia del tamaño esperado (200 pb) en dos colonias analizadas para la cadena ligera y en tres para la cadena pesada. Después de confirmar que la clonación era correcta mediante secuenciación, se seleccionó una colonia de cada cadena pesada y ligera y se cultivó durante la noche en medio suplementado con ampicilina para la posterior preparación de ADN plasmídico mediante maxiprep.

[0333] Aunque la clonación directa de los productos de la PCR en el vector de doble expresión había demostrado previamente ser relativamente ineficaz, se intentó de todos modos con la expectativa de que funcionara correctamente. Después de clonar el producto PCR de la cadena ligera en el vector pDCOrig-hlgG1, se llevó a cabo la transformación y las células se cultivaron en medios suplementados con zeocina durante la noche. El ADN plasmídico se preparó mediante minipreparación, seguida de digestión enzimática del plásmido con BamHI y BsiWI. Las expectativas eran que, si se incorporaba la cadena pesada correcta al vector, aparecería una pequeña banda de 200 pb en el gel (procedente del BamHI interno presente en la secuencia). Sin embargo, si la cadena pesada no se incorporara y la cadena original permaneciera en el vector, mostraría posteriormente una banda de 400 pb (la secuencia original carecía de un sitio BamHI interno). Un pequeño número de colonias presentaba el mal esperado del inserto correcto, y la secuencia posterior confirmó el éxito de la clonación directa de la cadena ligera en el vector.

[0335] A continuación, se seleccionó una colonia y se cultivó durante la noche en medio suplementado con zeocina para la posterior preparación de ADN plasmídico mediante maxiprep.

[0337] Para cuando se confirmó que la cadena ligera se había incorporado al vector pDCOrig-hlgG1, la clonación TOPO de la cadena pesada también estaba lista y el plásmido preparado. Así pues, en lugar de intentar una clonación directa del producto de la PCR, la cadena pesada se obtuvo mediante digestión enzimática del vector TOPO ya preparado con las enzimas Hindlll y Afel, mediante purificación en gel de agarosa y extracción. Después de clonar la secuencia de la cadena pesada purificada en gel en el vector pDCOrig-hlgG1 que contiene la cadena ligera, se llevó a cabo la transformación y las células se cultivaron en medios suplementados con zeocina durante la noche.

[0338] El ADN plasmídico se preparó mediante minipreparación, seguida de digestión enzimática con Hind III más Afel, y Hindlll más BamHI más Afel. Las expectativas eran que con solamente dos enzimas, la digestión mostraría una banda de alrededor de 400 pb, y con las tres enzimas (ya que la cadena pesada también contiene un sitio BamHI alrededor de la mitad de la misma) mostraría una banda de aproximadamente 200 pb. Las colonias que presentaron los 200 pb pequeños se enviaron para secuenciación y, después de confirmar que la clonación era correcta, se seleccionó una de ellas y se cultivó durante la noche en medio suplementado con zeocina para la posterior preparación de ADN plasmídico mediante maxiprep. El rendimiento de la preparación de plásmidos se determinó por espectroscopia en 776 ng/µL. Una vez confirmada la secuencia de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo FL134.33, se usó el plásmido para transfectar células CHO (por sus siglas en inglés).

[0340] Una vez que se confirmó que la secuencia incluía las regiones variables pesada y ligera murinas esperadas acopladas con las regiones constantes humanas, se realizó una transfección transitoria. Se incubaron 15 µg del vector que contenía el anticuerpo quimérico CH134.33 con células CHO-S en presencia de lipofectamina y se cultivaron en suspensión 500 mL de medio de cultivo durante una semana. El sobrenadante que contenía el mAb se purificó en una columna de proteína G y se eluyó a pH 8. El rendimiento final del anticuerpo fue de 0,4 mg.

[0341] Ensayos de funcionalidad de anticuerpos

[0343] Los mAb probados en los ensayos fueron los siguientes: FL134.33, FL133.63, FL133.67 y Ch134.33 para realizar una comparación directa entre la versión murina y la versión quimérica, así como entre los tres anticuerpos murinos. Todos los anticuerpos se unieron bien a Fuc -GM1 (Figura 20). También se probó la unión de los anticuerpos contra cuatro líneas celulares DMS79, DMS53 (ATCC. Middlesex, Reino Unido), H128 y H69 (ECACC. Salisbury, Reino Unido) que mostraban niveles variables de expresión de Fuc-Gm1El control positivo fue el anti-Fuc-Gm1 disponible comercialmente (Fujirebio. Tokio, Japón) y el control negativo fue un isotipo IgG1 murino (Dako. Stockport, Reino Unido). La señal más fuerte la dio el control positivo F12 en todas las líneas celulares excepto en DMS79, donde FL134.33 se mostró más fuerte. El quimérico ch134.33 mostró una buena unión a las células DMS79 (Figura 21).

[0345] Referencias

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Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado capaz de unirse específicamente a Fucα1-2Galβ1-3GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glc-ceramida (glicolípido Fuc-GM1) pero no capaz de unirse a Fucα1-2Galβ1-3GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glc (azúcar libre), en donde el anticuerpo comprende las siguientes CDR de acuerdo con el sistema IMGT de numeración de secuencias de anticuerpos:

(a) GYSITSGYS (CDRH1), IHYRGNT (CDRH2) y AQEPVRNYAMDYW (CDRH3) en combinación con QSIGDD (CDRL1), YVS (CDRL2) y QNGHGFPPT (CDRL3);

(b) GYSITSGYS (CDRH1), IHYRGNT (CDRH2) y AQEPVRNYAMDYW (CDRH3) en combinación con QSISDD (CDRL1), YVS (CDRL2) y QNGYSFPPT (CDRL3); o

(c) GYSITSGYS (CDRH1), IHYRGNT (CDRH2) y AQEPVRNYAMDFW (CDRH3) en combinación con QSISDD (CDRL1), YVS (CDRL2) y QNGHGFPPT (CDRL3).

2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos

y la secuencia de aminoácidos

(b) la secuencia de aminoácidos

y la secuencia de aminoácidos

o

(c) la secuencia de aminoácidos

y la secuencia de aminoácidos

3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las CDR son transportadas por un marco de anticuerpo humano.

4. El anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende además una región constante humana.

5. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende

la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada:

y

la secuencia de aminoácidos de la cadena li era:

6. Un anticuerpo unido a un agente quimioterapéutico o citotóxico, en donde el anticuerpo es de acuerdo con cualquier reivindicación anterior.

7. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o anticuerpo unido a un agente quimioterapéutico o citotóxico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior y un excipiente, diluyente, portador, amortiguador o estabilizador farmacéuticamente aceptable.

8. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un anticuerpo unido a un agente quimioterapéutico o citotóxico de acuerdo con la reivindicación 6 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 para su uso como un medicamento.

9. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un anticuerpo unido a un agente quimioterapéutico o citotóxico de acuerdo con la reivindicación 6 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento o prevención de un tumor.

10. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un anticuerpo unido a un agente quimioterapéutico o citotóxico de acuerdo con la reivindicación 6 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 para usar en el tratamiento de un tumor, en donde:

(a) el anticuerpo está en una preparación combinada con un agente activo para uso simultáneo; o

(b) se administra un agente activo por separado o secuencialmente con el anticuerpo.

11. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde el tumor es un carcinoma microcítico de pulmón.

12. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.