ES3060422T3 - Methods for improving milk production by administration of microbial consortia - Google Patents

Methods for improving milk production by administration of microbial consortia

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ES3060422T3
ES3060422T3 ES17736448T ES17736448T ES3060422T3 ES 3060422 T3 ES3060422 T3 ES 3060422T3 ES 17736448 T ES17736448 T ES 17736448T ES 17736448 T ES17736448 T ES 17736448T ES 3060422 T3 ES3060422 T3 ES 3060422T3
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microbial
milk
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rumen
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Mallory Embree
Luke Picking
Grant Gogul
Janna Tarasova
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Native Microbials Inc
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Abstract

La presente divulgación se refiere a microorganismos aislados -incluidas cepas novedosas-, consorcios microbianos y composiciones que los comprenden. Asimismo, describe métodos para utilizar dichos microorganismos, consorcios microbianos y composiciones en la modulación de la producción y el rendimiento de leche y sus componentes en rumiantes. En particular, proporciona métodos para aumentar los componentes deseables de la leche en rumiantes. Además, ofrece métodos para modular el microbioma ruminal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Métodos para mejorar la producción de leche mediante la administración de consorcios microbianosCAMPO
[0003] La presente divulgación se refiere a microorganismos aislados y biológicamente puros que tienen aplicaciones, entre otras, en la producción láctea. Los microorganismos divulgados pueden usarse en su estado aislado y biológicamente puro, así como en composiciones formuladas. Además, la divulgación proporciona consorcios microbianos que contienen al menos dos miembros de los microorganismos divulgados, así como métodos de uso de dichos consorcios. Además, la divulgación proporciona métodos de modulación del microbioma ruminal.DECLARACIÓN RELATIVA AL LISTADO DE SECUENCIAS
[0004] El listado de secuencias asociada a esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de en copia impresa. El nombre del archivo de texto que contiene el listado de secuencias es ASBI_002_02US_SeqList_ST25.txt. El archivo de texto tiene un tamaño de 893 kb, se creó el 31 de octubre de 2016 y se envía electrónicamente a través de EFS-Web.
[0005] ANTECEDENTES
[0006] Se prevé que la población mundial aumente a más de 9000 millones de personas para el año 2050, con una reducción simultánea de la cantidad de tierra, agua y otros recursos naturales disponibles per cápita. Las proyecciones indican que la renta media nacional también aumentará, con el aumento previsto del PIB de China y la India. El deseo de una dieta más rica en proteínas de origen animal aumenta a la par que aumentan los ingresos, por lo que el sector ganadero mundial se enfrentará al reto de producir más leche usando menos recursos. La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura prevé que habrá que producir un 70 % más de alimentos, pero la superficie de tierra cultivable disponible disminuirá. Es evidente que la producción de alimentos por unidad de recursos invertidos tendrá que aumentar considerablemente para poder sostener el crecimiento de la población.
[0007] La leche y los componentes de la leche de los rumiantes lactantes se utilizan principalmente en la preparación de alimentos en muchas formas diferentes. No obstante, la leche y los componentes de la leche tienen numerosas aplicaciones alternativas en ámbitos no alimentarios, como la fabricación de colas, fibras textiles, materiales plásticos o en la producción de etanol o metano. Se han aplicado muchas estrategias para mejorar la producción y el contenido de la leche en los rumiantes mediante modulaciones nutricionales, tratamientos hormonales, cambios en la gestión de los animales y la cría selectiva; sin embargo, es necesario producir de forma más eficiente la leche y los componentes de la leche por animal.
[0008] Identificar composiciones y métodos para aumentar de forma sostenible la producción de leche y modular los componentes de la leche de interés, al tiempo que se equilibra la salud y el bienestar de los animales, se ha convertido en algo imperativo para satisfacer las necesidades diarias de los seres humanos en una población en expansión. Aumentar la producción mundial de leche y modular aún más los componentes deseables de la leche mediante el aumento del número total de ganado en las explotaciones lecheras no solo sería económicamente inviable para muchas partes del mundo, sino que además tendría consecuencias negativas para el medio ambiente.
[0009] Por lo tanto, satisfacer las expectativas mundiales de rendimiento de leche y componentes de la leche simplemente ampliando los actuales sistemas agrícolas de alto rendimiento utilizados en la mayor parte del mundo desarrollado no es viable.
[0010] Por lo tanto, existe una necesidad urgente en la técnica de métodos mejorados para aumentar la producción de leche y aumentar aún más el rendimiento de los componentes deseables de la leche.
[0011] El documento de patente CN 101519638 A, número de acceso al GenBank EU556330.1 y número de acceso al GenBank EU663567.1 divulganPichia kudriavzeviicon una identidad del 100 % con SEQ ID NO: 32. El documento de patente EP 2320749 A1 divulga probióticos para vacas lecheras que comprenden, entre otras cosas, cepas deCandidaoPichia. El documento de patente CN 103053860 B divulga un pienso para vacas lecheras que contienePichia pastoris. Lund, 1974, J.Gen. Microbiol., 81, 453-462, Sirisan et al. Lett. App. Microbiol., 57(2), 102-107 y Mendes de Almeida et al. Rev. Bras. De Zootecnica, 41(11), 2336-2342 divulgan varias cepas dePichia kudriavzeviiaisladas de rumiantes.
[0012] SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN
[0013] La invención es como se describe en las reivindicaciones. Todas las realizaciones y divulgaciones que se derivan a continuación no forman parte de la presente invención, a menos que estén comprendidas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
[0014] TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS A LOS EFECTOS DE LOS PROCEDIMIENTOS DE PATENTES
[0015] Algunos microorganismos descritos en esta solicitud fueron depositados el 25 de abril de 2016<1>en la Colección de Cultivos (NRRL<®>) del Servicio de Investigación Agrícola (ARS) del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), situada en 1815 N. University St., Peoria, IL 61604, EE. UU. Algunos microorganismos descritos en esta solicitud se depositaron en el Centro Nacional Bigelow para Algas Marinas y Microbiota, ubicado en 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EE. UU.
[0017] 1 ASC-01 (NRRL B-67248) y ASC-02 (NRRL Y-67249) se depositaron en esta fecha
[0018] Los depósitos se realizaron según los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los efectos del procedimiento de patentes. Los números de acceso del NRRL<®>y/o del Centro Nacional Bigelow para Algas Marinas y Microbiota para los depósitos del Tratado de Budapest mencionados anteriormente se proporcionan en laTabla 3.Los números de acceso y las fechas correspondientes de depósito de los microorganismos descritos en esta solicitud se proporcionan por separado en laTabla 25.Las cepas designadas en las tablas siguientes han sido depositadas en los laboratorios de Ascus Biosciences, Inc. desde al menos el 15 de diciembre de 2015.
[0019] En laTabla 1, los resultados más cercanos previstos para la taxonomía de los microbios se enumeran en las columnas 2 y 5. La columna 2 es el resultado taxonómico principal previsto por BLAST, y la columna 5 es el resultado taxonómico principal para el género especie previsto por BLAST. Las cepas designadas en la tabla siguiente han sido depositadas en los laboratorios de Ascus Biosciences, Inc. desde al menos el 15 de diciembre de 2015.
[0020]
[0023] 
[0026] 
[0029] 
[0032] 
[0035] 
[0038] 
[0039]
[0040]
[0043] 
[0046] 
[0049] 
[0052] 
[0055] 
[0058] 
[0061] 
[0064] 
[0065]
[0066]
[0067]
[0070] 
[0073] 
[0076] 
[0079] 
[0082] 
[0085] 
[0088] 
[0089]
[0090]
[0091]
[0092]
[0095] 
[0098] 
[0101] 
[0104] 
[0107] 
[0110] 
[0111]
[0112]
[0113]
[0114]
[0115]
[0118] 
[0121] 
[0124] 
[0127] 
[0130] 
[0131]
[0132]
[0133]
[0134]
[0135]
[0136]
[0139] 
[0142] 
[0143]
[0146] 
[0147]
[0150] 
[0151] BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0152] LaFIG.1muestra un flujo de trabajo general de un método para determinar la abundancia absoluta de una o más cepas de microorganismos activos.
[0153] LaFIG.2muestra un flujo de trabajo general de un método para determinar la coexistencia de una o más, o dos o más, cepas de microorganismos activos en una muestra con uno o más parámetros de metadatos (ambientales), seguido del aprovechamiento de métodos de análisis de agrupaciones y detección de comunidades en la red de relaciones determinadas.
[0154] LaFIG.3muestra los resultados de un ensayo de campo en el que se administró a vacas lecheras una composición que comprendía Ascusb_3138 y Ascusf_15; laFIG. 3Arevela el número promedio de libras de grasa de la leche producidas a lo largo del tiempo; laFIG.3Brevela el número promedio de libras de proteína de la leche producidas a lo largo del tiempo; y laFIG. 3Crevela el número promedio de libras de leche corregida por energía (ECM) producidas a lo largo del tiempo. La línea vertical que interseca los puntos de datos en cada una de lasFIG. 3A,FIG.3ByFIG.3Cmarca el día en que cesó la administración de los bioconsorcios microbianos.
[0155] LaFIG. 4muestra la producción lechera (kg) media diaria (sin relleno) y media semanal por mínimos cuadrados ajustada por covariables (relleno sólido) ± EEM de vacas asignadas al Control (círculo) o Inoculado (trapecio) por días de estudio del periodo de intervención.
[0156] LaFIG.5muestra la producción diaria media de proteína cruda de la leche (CP, kg) (sin relleno) y la media semanal por mínimos cuadrados (relleno sólido) ± EEM de las vacas asignadas al Control (círculo) o Inoculado (trapecio) por días de estudio del periodo de intervención.
[0157] LaFIG. 6muestra la producción diaria de grasa de la leche (kg) (sin relleno) y la media semanal por mínimos cuadrados (relleno sólido) ± EEM de las vacas asignadas al Control (círculo) o Inoculado (trapecio) por días de estudio del periodo de intervención.
[0158] LaFIG. 7muestra la producción diaria de leche corregida por energía (ECM, kg) (sin relleno) y la media semanal por mínimos cuadrados (relleno sólido) ± EEM de las vacas asignadas al Control (círculo) o Inoculado (trapecio) por días de estudio del periodo de intervención.
[0159] LaFIG. 8muestra el porcentaje de similitud compartida (porcentaje de identidad) entre las bacterias(FIG. 8A)y los hongos(FIG. 8B)de laTabla 1. Los puntos de datos representan el mayor porcentaje de emparejamiento de similitud para cada cepa.
[0160] LaFIG. 9muestra la distribución de la puntuación MIC para las bacterias del rumen y la eficiencia de la grasa de la leche.
[0161] LaFIG. 10muestra la distribución de la puntuación MIC para los hongos del rumen y la eficiencia de la grasa de la leche.
[0162] LaFIG.11muestra la distribución de la puntuación MIC para las bacterias del rumen y la eficiencia láctea.
[0163] LaFIG.12muestra la distribución de la puntuación MIC para los hongos del rumen y la eficiencia láctea.
[0164] LaFIG.13muestra la distribución de la puntuación MIC para las bacterias del rumen y la eficiencia de la grasa de la leche con cuatro especies de bacterias y sus puntuaciones MIC, en las que las especies han sido evaluadas en estudios de terceros. Cuanto menor es la puntuación MIC, menos probable es que las especies/cepas sean capaces de modular positivamente la eficiencia de la grasa de la leche en las vacas lecheras.
[0165] LaFIG.14muestra una fuente de carbono no degradada (día 0) y una fuente de carbono degradada (día 7), como se utilizan en los ensayos de fuentes de carbono insolubles.
[0166] LaFIG.15muestra una disminución en el número de vacas que presentan un recuento de células somáticas (SSC) superior a 200.000/ml de leche en vacas lecheras a las que se les administró una composición microbiana de la presente divulgación en comparación con vacas lecheras a las que no se les administró una composición microbiana de la presente divulgación.
[0167] LaFIG.16muestra un diagrama que ejemplifica cómo la dieta influye en la producción de ácidos grasos volátiles, que a su vez modulan la producción de leche, la condición corporal, el crecimiento, etc. Reproducido de Moran, 2005. Tropical dairy farming: feeding management for small holder dairy farmers in the humic tropics (Capítulo 5), Landlinks Press, 312 págs.
[0168] LaFIG. 17muestra un diagrama esquemático que ilustra un flujo de proceso de ejemplo para su uso con un sistema a modo de ejemplo de análisis y selección de interacciones microbianas, incluyendo la determinación de las puntuaciones MIC abordadas a lo largo de la presente divulgación.
[0169] LaFIG.18muestra la no linealidad de las libras de grasa de la leche producidas a lo largo de un experimento para determinar los constituyentes de la comunidad microbiana del rumen que influyen en la producción de grasa de la leche en vacas lecheras.
[0170] LaFIG. 19muestra la correlación entre el recuento celular absoluto con filtro de actividad de la cepa objetivo Ascus_713 y las libras (lb) de grasa de la leche producidas.
[0171] LaFIG.20muestra el recuento celular absoluto con filtro de actividad de la cepa objetivo Ascus_7 y las libras (lb) de grasa de la leche producidas a lo largo de un experimento.
[0172] LaFIG.21muestra la correlación entre la abundancia relativa sin filtro de actividad de la cepa objetivo Ascus_3038 y las libras (lb) de grasa de la leche producidas.
[0173] DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0174] Definiciones
[0175] Aunque se cree que los siguientes términos son bien conocidos por un experto en la materia, se establecen las siguientes definiciones para facilitar la explicación de la materia divulgada actualmente.
[0176] El término «un» o «una» puede referirse a uno o más de esa entidad, es decir, puede referirse a referencias plurales. Como tal, los términos «un» o «una», «uno o más» y «al menos uno» se usan indistintamente en el presente documento. Además, la referencia a «un elemento» mediante el artículo indefinido «un» o «una» no excluye la posibilidad de que esté presente más de un elemento, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos.
[0177] Las referencias a lo largo de esta memoria descriptiva a «una realización» o «un aspecto» significan que una característica, estructura o rasgo particular descrito en relación con la realización se incluye en al menos una realización de la presente divulgación. Por lo tanto, las apariciones de las frases "en una realización" o "en una realización" en diversos lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no necesariamente se refieren todas a la misma realización. Además, los rasgos, estructuras o características particulares se pueden combinar de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.
[0178] Como se usan en el presente documento, los términos «alrededor de» o «aproximadamente» cuando preceden a un valor numérico indican el valor más o menos un intervalo del 10 %.
[0179] Como se usan en el presente documento, los términos «microorganismo» o «microbio» deben interpretarse en sentido amplio. Estos términos se usan indistintamente e incluyen, pero no están limitados a, los dos dominios procariotas, Bacteria y Archaea, los hongos eucariotas y los protistas, así como los virus. La divulgación puede referirse a los «microbios» de laTabla 1o laTabla 3. Esta caracterización puede referirse no solo a los identificadores microbianos taxonómicos previstos de la tabla, sino también a las cepas identificadas de los microbios enumerados en la tabla.
[0180] El término «consorcios microbianos» o «consorcio microbiano» se refiere a un subconjunto de una comunidad microbiana de especies microbianas individuales, o cepas de una especie, que pueden describirse como portadoras de una función común, o pueden describirse como participantes en, o conducentes a, o correlacionadas con, un parámetro reconocible, como un rasgo fenotípico de interés (por ejemplo, el aumento de la producción de leche en un rumiante). La comunidad puede comprender dos o más especies, o cepas de una especie, de microbios. En algunos casos, los microbios coexisten dentro de la comunidad de forma simbiótica.
[0181] El término «comunidad microbiana» significa un grupo de microbios que comprende dos o más especies o cepas. A diferencia de los consorcios microbianos, una comunidad microbiana no tiene por qué desempeñar una función común, ni tiene por qué participar en, conducir a o correlacionarse con un parámetro reconocible, como un rasgo fenotípico de interés (por ejemplo, el aumento de la producción de leche en un rumiante).
[0182] Como se usa en el presente documento, «aislar», «aislado», «microbio aislado», y términos similares, pretenden significar que uno o más microorganismos se han separado de al menos uno de los materiales con los que está asociado en un entorno particular (por ejemplo, suelo, agua, tejido animal).
[0183] Los microbios de la presente divulgación pueden incluir esporas y/o células vegetativas. Los microbios de la presente divulgación pueden incluir microbios en un estado viable pero no cultivable (VBNC). Véase Liao y Zhao (publicación de EE.UU. US2015267163A1). Los microbios de la presente divulgación pueden incluir microbios en una biopelícula. Véase Merritt et al. (patente de EE. UU.7.427.408).
[0185] Por tanto, un «microbio aislado» no existe en su entorno natural; más bien, es a través de las diversas técnicas descritas aquí que el microbio se ha sacado de su entorno natural y colocado en un estado de existencia no natural. Por lo tanto, la cepa aislada o el microbio aislado pueden existir, por ejemplo, como un cultivo biológicamente puro o como esporas (u otras formas de la cepa) en asociación con un portador aceptable.
[0187] Como se usa en el presente documento, «espora» o «esporas» se refieren a estructuras producidas por bacterias y hongos que están adaptadas para la supervivencia y la dispersión. Las esporas se caracterizan generalmente por ser estructuras inactivas, sin embargo, las esporas son capaces de diferenciarse a través del proceso de germinación. La germinación es la diferenciación de las esporas en células vegetativas que son capaces de actividades metabólicas, crecer y reproducirse. La germinación de una sola espora da como resultado una sola célula vegetativa fúngica o bacteriana. Las esporas fúngicas son unidades de reproducción asexual y, en algunos casos, son estructuras necesarias en los ciclos de vida de los hongos. Las esporas bacterianas son estructuras para sobrevivir a condiciones que normalmente pueden ser poco propicias para la supervivencia o el crecimiento de las células vegetativas.
[0189] Como se usa en el presente documento, «composición microbiana» se refiere a una composición que comprende uno o más microbios de la presente divulgación, en donde una composición microbiana puede administrarse a animales de la presente divulgación.
[0191] Como se usa en el presente documento, «portador», «portador aceptable» o «portador farmacéutico» se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto. Dichos portadores pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético; tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, y similares. Se emplean preferiblemente como portadores disoluciones salinas acuosas o agua y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol, por ejemplo, como disoluciones inyectables. Alternativamente, el portador puede ser un portador en forma farmacéutica sólida, que incluye, pero no se limita a, uno o más de un aglutinante (para píldoras comprimidas), un deslizante, un agente encapsulante, un aromatizante y un colorante. La elección del portador puede seleccionarse con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Véanse Hardee y Baggo (1998). Development and Formulation of Veterinary Dosage Forms.2.ª Ed. CRC Press.504 pg.); E.W. Martin (1970. Remington's Pharmaceutical Sciences. 17.ª Ed. Mack Pub. Co.); y Blaser et al. (publicación de EE. UU. US20110280840A1).
[0193] Los microbios aislados existen como cultivos aislados y biológicamente puros. Un experto en la técnica apreciará que un cultivo aislado y biológicamente puro de un microbio particular indica que dicho cultivo está sustancialmente libre (dentro de razones científicas) de otros organismos vivos, y contiene sólo el microbio individual en cuestión. El cultivo puede contener concentraciones variables de dicho microbio. La presente divulgación indica que los microbios aislados y biológicamente puros a menudo «difieren necesariamente de materiales menos puros o impuros». Véase, por ejemplo,In re Bergstrom,427 F.2d 1394, (CCPA 1970) (que trata prostaglandinas purificadas), véase tambiénIn re Bergy,596 F.2d 952 (CCPA 1979) (que trata microbios purificados), véase tambiénParke-Davis & Co. v. H.K. Mulford & Co.,189 F.95 (S.D.N.Y.1911) (Learned Hand que trata adrenalina purificada),aff'd in part, rev'd in part,196 F. 496 (2.ª Cir. 1912). Además, la divulgación proporciona ciertas medidas cuantitativas de la concentración, o limitaciones de pureza, que deben encontrarse dentro de un cultivo microbiano aislado y biológicamente puro. La presencia de estos valores de pureza puede ser un atributo adicional que distingue a los microbios divulgados en la presente divulgación de los microbios que existen en estado natural. Véase, por ejemplo,Merck & Co. v. Olin Mathieson Chemical Corp.,253 F.2d 156 (4.ª Cir. 1958) (que trata las limitaciones de pureza para la vitamina B12 producida por microbios).
[0195] Como se usa en el presente documento, «aislados individuales» debe entenderse como una composición o cultivo que comprende un predominio de un solo género, especie o cepa de microorganismo, tras la separación de uno o más microorganismos. La expresión no debe interpretarse para indicar el grado al que el microorganismo ha sido aislado o purificado. Sin embargo, los «aislados individuales» pueden comprender sustancialmente solo un género, especie o cepa de microorganismo.
[0197] Como se usa en el presente documento, «microbioma» se refiere al conjunto de microorganismos que habitan en el tubo digestivo o gastrointestinal de un animal (incluido el rumen si dicho animal es un rumiante)yal entorno físico de los microorganismos (es decir, el microbioma tiene un componente biótico y físico). El microbioma es fluido y puede verse modulado por numerosas condiciones naturales y artificiales (por ejemplo, cambios en la dieta, enfermedades, agentes antimicrobianos, afluencia de microorganismos adicionales, etc.). La modulación del microbioma de un rumen que puede lograrse mediante la administración de las composiciones de la presente divulgación puede adoptar la forma de: (a) el aumento o la disminución de una familia, género, especie o agrupación funcional de microbios en particular (es decir, la alteración del componente biótico del microbioma del rumen) y/o (b) el aumento o la disminución de los ácidos grasos volátiles en el rumen, el aumento o la disminución del pH del rumen, el aumento o la disminución de cualquier otro parámetro físico importante para la salud del rumen (es decir, la alteración del componente abiótico del microbioma del rumen).
[0198] Como se usa en el presente documento, «probiótico» se refiere a un microbio sustancialmente puro (es decir, un único aislado) o una mezcla de microbios deseados, y también puede incluir cualquier componente adicional que pueda administrarse a un mamífero para restaurar la microbiota. Los probióticos o las composiciones de inoculantes microbianos de la invención pueden administrarse con un agente para permitir que los microbios sobrevivan en el entorno del tubo gastrointestinal, es decir, resistir el pH bajo y crecer en el entorno gastrointestinal. Las presentes composiciones (por ejemplo, las composiciones microbianas) pueden ser probióticos en algunos aspectos.
[0199] Como se usa en el presente documento, «prebiótico» se refiere a un agente que aumenta el número y/o la actividad de uno o más microbios deseados. Ejemplos no limitativos de prebióticos que pueden ser útiles en los métodos de la presente divulgación incluyen fructooligosacáridos (por ejemplo, oligofructosa, inulina, fructanos de tipo inulina), galactooligosacáridos, aminoácidos, alcoholes y mezclas de los mismos. Véase Ramirez-Farias et al. (2008. Brit. J. Nutr.4:1-10) y Pool-Zobel y Sauer (2007. J. Nutr.137:2580-2584 y suplemento).
[0200] El término «medio de crecimiento», como se usa en el presente documento, es cualquier medio que sea adecuado para favorecer el crecimiento de un microbio. A modo de ejemplo, los medios pueden ser naturales o artificiales, incluyendo agar suplementario con gastrina, medios LB, suero sanguíneo y geles de cultivo de tejidos. Debe apreciarse que los medios pueden usarse solos o en combinación con uno o más medios diferentes. También se pueden usar con o sin la adición de nutrientes exógenos.
[0201] El medio puede modificarse o enriquecerse con compuestos o componentes adicionales, por ejemplo, un componente que pueda ayudar en la interacción y/o selección de grupos específicos de microorganismos. Por ejemplo, podrían estar presentes antibióticos (como la penicilina) o esterilizantes (por ejemplo, sales de amonio cuaternario y agentes oxidantes) y/o podrían modificarse las condiciones físicas (como la salinidad, los nutrientes (por ejemplo, minerales orgánicos e inorgánicos (como fósforo, sales nitrogenadas, amoníaco, potasio y micronutrientes como cobalto y magnesio), el pH y/o la temperatura).
[0202] Como se usa en el presente documento, el término «rumiante» incluye a los mamíferos que son capaces de obtener nutrientes de los alimentos de origen vegetal mediante su fermentación en un estómago especializado (rumen) antes de la digestión, principalmente a través de acciones microbianas. Los rumiantes incluyen ganado vacuno, cabras, ovejas, jirafas, yaks, ciervos, antílopes y otros.
[0203] Como se usa en el presente documento, el término «bóvido» incluye a cualquier miembro de la familia Bovidae, que incluye mamíferos ungulados como antílopes, ovejas, cabras y ganado vacuno, entre otros.
[0204] Como se usa en el presente documento, «leche corregida por energía» o «ECM» representa la cantidad de energía en la leche basada en el volumen de leche, la grasa de la leche y la proteína de la leche. ECM ajusta los componentes de la leche a 3,5 % de grasa y 3,2 % de proteína, igualando así el rendimiento animal y permitiendo comparar la producción a nivel individual del animal y del rebaño a lo largo del tiempo. Una ecuación usada para calcular la ECM, en relación con la presente descripción, es:
[0206] Como se usa en el presente documento, «mejorado» debe entenderse en sentido amplio para abarcar la mejora de una característica de interés, en comparación con un grupo de control o en comparación con una cantidad promedio conocida asociada a la característica en cuestión. Por ejemplo, la producción de leche «mejorada» asociada a la aplicación de un microbio beneficioso, o consorcio, de la divulgación puede demostrarse comparando la leche producida por un ungulado tratado con los microbios enseñados en el presente documento con la leche de un ungulado no tratado. En la presente divulgación, «mejorado» no exige necesariamente que los datos sean estadísticamente significativos (es decir, p < 0,05); sino que cualquier diferencia cuantificable que demuestre que un valor (por ejemplo, el valor promedio del tratamiento) es diferente de otro (por ejemplo, el valor promedio del control) puede alcanzar el nivel de «mejorado».
[0207] Como se usa en el presente documento, los términos «inhibir y suprimir» y términos similares no deben interpretarse como que requieren una inhibición o supresión completa, aunque esto pueda ser deseable.
[0208] El término «marcador» o «marcador único», como se usa en el presente documento, es un indicador de un tipo de microorganismo, cepa de microorganismo o actividad de una cepa de microorganismo únicos. Un marcador puede medirse en muestras biológicas, e incluye, sin limitación, un marcador basado en ácido nucleico, tal como un gen de ARN ribosómico, un marcador basado en péptido o proteína, y/o un metabolito u otro marcador de molécula pequeña.
[0209] El término «metabolito», como se usa en el presente documento, es un producto intermedio o producto del metabolismo. Un metabolito puede ser una molécula pequeña. Los metabolitos tienen diversas funciones, incluidas las de combustible, estructurales, de señalización, estimulantes e inhibidoras de las enzimas, como un cofactor de una enzima, en defensa, y en interacciones con otros organismos (tales como pigmentos, odorantes y feromonas). Un metabolito primario participa directamente en el crecimiento, desarrollo y reproducción normales. Un metabolito secundario no participa directamente en estos procesos, pero suele tener una función ecológica importante. Los ejemplos de metabolitos incluyen, pero no se limitan a, antibióticos y pigmentos tales como resinas y terpenos, etc. Algunos antibióticos usan metabolitos primarios como precursores, tal como la actinomicina, que se crea a partir del metabolito primario triptófano. Los metabolitos, como se usan en el presente documento, incluyen hidratos de carbono pequeños e hidrófilos; lípidos grandes e hidrófobos y compuestos naturales complejos.
[0210] Como se usa en el presente documento, el término «genotipo» se refiere a la composición genética de una célula individual, un cultivo celular, un tejido, un organismo o un grupo de organismos.
[0211] Como se usa en el presente documento, el término «alelo(s)» significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen, relacionándose todos los alelos con al menos un rasgo o característica. En una célula diploide, los dos alelos de un gen determinado ocupan los loci correspondientes en un par de cromosomas homólogos. Dado que la presente divulgación puede estar relacionada con QTL, es decir, regiones genómicas que pueden comprender uno o más genes o secuencias reguladoras, en algunos casos es más preciso referirse a «haplotipo» (es decir, un alelo de un segmento cromosómico) en lugar de «alelo»; sin embargo, en esos casos, el término «alelo» debe entenderse que comprende el término «haplotipo». Los alelos se consideran idénticos cuando expresan un fenotipo similar. Es posible que existan diferencias en la secuencia, pero no son importantes siempre que no influyan en el fenotipo.
[0212] Como se usa en el presente documento, el término «locus» (loci en plural) significa un lugar o lugares específicos o un sitio en un cromosoma donde, por ejemplo, se encuentra un gen o un marcador genético.
[0213] Como se usa en el presente documento, el término «genéticamente unido» se refiere a dos o más rasgos que se heredan conjuntamente en una alta proporción durante la reproducción, de modo que son difíciles de separar mediante cruces.
[0214] Una «recombinación» o «evento de recombinación», como se usa en el presente documento, se refiere a un cruce cromosómico o a una distribución independiente. El término «recombinante» se refiere a un organismo que tiene una nueva composición genética como resultado de un evento de recombinación.
[0215] Como se usa en el presente documento, el término «marcador molecular» o «marcador genético» se refiere a un indicador que se usa en métodos para visualizar diferencias en las características de las secuencias de ácido nucleico. Ejemplos de dichos indicadores son los marcadores de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), los marcadores de polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), las mutaciones por inserción, los marcadores de microsatélites (SSR), las regiones amplificadas caracterizadas por secuencias (SCAR), los marcadores de secuencias polimórficas amplificadas y escindidas (CAPS) o marcadores de isoenzimas o combinaciones de los marcadores descritos en el presente documento que definen una ubicación genética y cromosómica específica. Los marcadores incluyen además secuencias de polinucleótidos que codifican ARNr 16S o 18S, y secuencias de espaciadores transcritos internos (ITS), que son secuencias que se encuentran entre los genes de ARNr de subunidad pequeña y subunidad grande que han demostrado ser especialmente útiles para dilucidar relaciones o distinciones entre ellos cuando se comparan entre sí. El mapeo de marcadores moleculares en las proximidades de un alelo es un procedimiento que puede realizar cualquier persona con conocimientos medios en las técnicas de biología molecular.
[0216] La estructura primaria de la subunidad principal 16S del ARNr comprende una combinación particular de regiones conservadas, variables e hipervariables que evolucionan a diferentes velocidades y permiten la resolución tanto de linajes muy antiguos, como los dominios, como de linajes más modernos, como los géneros. La estructura secundaria de la subunidad 16S incluye aproximadamente 50 hélices que dan lugar a un emparejamiento de bases de alrededor del 67 % de los residuos. Estas características estructurales secundarias altamente conservadas son de gran importancia funcional y pueden usarse para garantizar la homología posicional en alineaciones de secuencias múltiples y análisis filogenéticos. Durante las últimas décadas, el gen ARNr 16S se ha convertido en el marcador taxonómico más secuenciado y es la piedra angular de la clasificación sistemática actual de bacterias y arqueas (Yarza et al.2014. Nature Rev. Micro.12:635-45).
[0217] Una identidad de secuencia del 94,5 % o inferior para dos genes ARNr 16S es una prueba sólida de géneros distintos, el 86,5 % o inferior es una prueba sólida de familias distintas, el 82 % o inferior es una prueba sólida de órdenes distintos, el 78,5 % es una prueba sólida de clases distintas y el 75 % o inferior es una prueba sólida de filos distintos. El análisis comparativo de las secuencias del gen ARNr 16S permite establecer umbrales taxonómicos que son útiles no solo para la clasificación de microorganismos cultivados, sino también para la clasificación de muchas secuencias ambientales. Yarza et al.2014. Nature Rev. Micro.12:635-45).
[0218] Como se usa en el presente documento, el término «rasgo» se refiere a una característica o fenotipo. Por ejemplo, en la presente divulgación, la cantidad de grasa de la leche producida se refiere a la cantidad de triglicéridos, triacilglicéridos, diacilglicéridos, monoacilglicéridos, fosfolípidos, colesterol, glucolípidos y ácidos grasos presentes en la leche. Los rasgos deseables también pueden incluir otras características de la leche, que incluyen, pero no están limitadas a: predominio de ácidos grasos de cadena corta, ácidos grasos de cadena media y ácidos grasos de cadena larga; cantidad de hidratos de carbono como lactosa, glucosa, galactosa y otros oligosacáridos; cantidad de proteínas como caseínas y suero de la leche; la cantidad de vitaminas, minerales, producción/volumen de leche; la reducción de las emisiones de metano o del estiércol; la mejora de la eficiencia en la utilización del nitrógeno; la mejora de la ingesta de materia seca; la mejora de la eficiencia alimentaria y la digestibilidad; el aumento de la degradación de la celulosa, la lignina y la hemicelulosa; el aumento de las concentraciones ruminales de ácidos grasos como el ácido acético, el ácido propiónico y el ácido butírico; etc.
[0219] Un rasgo puede heredarse de forma dominante o recesiva, o de forma parcial o dominante incompleta. Un rasgo puede ser monogénico (es decir, determinado por un solo locus) o poligénico (es decir, determinado por más de un locus) o también puede ser el resultado de la interacción de uno o más genes con el medioambiente.
[0220] En el contexto de esta divulgación, los rasgos también pueden ser el resultado de la interacción de uno o más genes de mamíferos y uno o más genes de microorganismos.
[0221] Como se usa en el presente documento, el término «homocigótico» significa una condición genética que existe cuando dos alelos idénticos residen en un locus específico, pero están posicionados individualmente en pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula de un organismo diploide. Por el contrario, como se usa en el presente documento, el término «heterocigoto» se refiere a una condición genética que existe cuando dos alelos diferentes residen en un locus específico, pero están situados individualmente en pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula de un organismo diploide.
[0222] Como se usa en el presente documento, el término «fenotipo» se refiere a las características observables de una célula individual, un cultivo celular, un organismo (por ejemplo, un rumiante) o un grupo de organismos que resultan de la interacción entre la composición genética del individuo (es decir, el genotipo) y el entorno.
[0223] Como se usa en el presente documento, el término «quimérico» o «recombinante», cuando describe una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de proteína, se refiere a un ácido nucleico o una secuencia de proteína que une al menos dos polinucleótidos heterólogos o dos polipéptidos heterólogos en una sola macromolécula, o que reorganiza uno o más elementos de al menos una secuencia natural de ácido nucleico o proteína. Por ejemplo, el término «recombinante» puede referirse a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia que de otro modo estarían separados, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética.
[0224] Como se usa en el presente documento, una «secuencia de nucleótidos sintética» o «secuencia de polinucleótidos sintética» es una secuencia de nucleótidos que no se conoce que exista en la naturaleza o que no se produce de forma natural. Por lo general, dicha secuencia de nucleótidos sintética comprenderá al menos una diferencia de nucleótidos en comparación con cualquier otra secuencia de nucleótidos que se produzca de forma natural. Como se usa en el presente documento, el término «ácido nucleico» se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos, o análogos de los mismos. Este término se refiere a la estructura primaria de la molécula y, por lo tanto, incluye el ADN de doble cadena y de cadena simple, así como el ARN de doble cadena y de cadena simple. También incluye ácidos nucleicos modificados, como ácidos nucleicos metilados y/o con caperuza, ácidos nucleicos que contienen bases modificadas, modificaciones de la cadena principal y similares. Los términos «ácido nucleico» y «secuencia de nucleótidos» se usan indistintamente.
[0225] Como se usa en el presente documento, el término «gen» se refiere a cualquier segmento de ADN asociado a una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen, pero no están limitados a, secuencias codificantes y/o secuencias reguladoras necesarias para su expresión. Los genes también pueden incluir segmentos de ADN no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Los genes pueden obtenerse de diversas fuentes, incluida la clonación a partir de una fuente de interés o la síntesis a partir de información de secuencias conocidas o previstas, y pueden incluir secuencias diseñadas para tener los parámetros deseados.
[0226] Como se usa en el presente documento, el término «homólogo» u «ortólogo» es conocido en la técnica y se refiere a secuencias relacionadas que comparten un antepasado o miembro de la familia común y se determinan en función del grado de identidad de la secuencia. Los términos «homología», «homólogo», «sustancialmente similar» y «correspondiente sustancialmente» se usan indistintamente en el presente documento. Se refieren a fragmentos de ácido nucleico en donde los cambios en una o más bases nucleotídicas no afectan a la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar la expresión génica o producir un determinado fenotipo. Estos términos también se refieren a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente divulgación, tales como la deleción o inserción de uno o más nucleótidos que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante en relación con el fragmento inicial no modificado. Por lo tanto, se entiende, como apreciarán los expertos en la materia, que la divulgación abarca más que las secuencias específicas a modo de ejemplo. Estos términos describen la relación entre un gen que se encuentra en una especie, subespecie, variedad, cultivar o cepa y el gen correspondiente o equivalente en otra especie, subespecie, variedad, cultivar o cepa. A los efectos de esta divulgación, se comparan secuencias homólogas. Se considera, se cree o se sabe que las «secuencias homólogas» u «homólogos» u «ortólogos» están funcionalmente relacionados. Una relación funcional puede indicarse de varias maneras, que incluyen, pero no están limitadas a: (a) el grado de identidad de la secuencia y/o (b) la misma función biológica o una función biológica similar. Preferiblemente, se indican tanto (a) como (b). La homología puede determinarse usando programas de software fácilmente disponibles en la técnica, como los descritos en Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Suplemento 30, sección 7.718, Tabla 7.71. Algunos programas de alineación son MacVector (Oxford Molecular Ltd, Oxford, Reino Unido), ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pensilvania) y AlignX (Vector NTI, Invitrogen, Carlsbad, California). Otro programa de alineación es Sequencher (Gene Codes, Ann Arbor, Míchigan), que usa parámetros predeterminados.
[0228] Como se usa en el presente documento, el término «cambio de nucleótido» se refiere, por ejemplo, a la sustitución, deleción y/o inserción de nucleótidos, como se entiende bien en la técnica. Por ejemplo, las mutaciones contienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones silenciosas, pero no alteran las propiedades o actividades de la proteína codificada ni cómo se producen las proteínas.
[0230] Como se usa en el presente documento, el término «modificación de proteínas» se refiere, por ejemplo, a la sustitución de aminoácidos, la modificación de aminoácidos, la deleción y/o la inserción, como se entiende bien en la técnica.
[0232] Como se usa en el presente documento, el término «al menos una parte» o «fragmento» de un ácido nucleico o polipéptido significa una parte que tiene las características de tamaño mínimo de dichas secuencias, o cualquier fragmento más grande de la molécula de longitud completa, hasta e incluyendo la molécula de longitud completa. Un fragmento de un polinucleótido de la divulgación puede codificar una parte biológicamente activa de un elemento regulador genético. Una parte biológicamente activa de un elemento regulador genético puede prepararse aislando una parte de uno de los polinucleótidos de la divulgación que comprende el elemento regulador genético y evaluando la actividad como se describe en el presente documento. De manera similar, una parte de un polipéptido puede ser de 4 aminoácidos, 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, y así sucesivamente, hasta llegar al polipéptido de longitud completa. La longitud de la parte que se usará dependerá de la aplicación particular. Una parte de un ácido nucleico útil como sonda de hibridación puede tener una longitud de tan solo 12 nucleótidos; puede tener 20 nucleótidos. Una parte de un polipéptido útil como epítopo puede tener una longitud de tan solo 4 aminoácidos. Una parte de un polipéptido que desempeña la función del polipéptido completo sería generalmente más larga que 4 aminoácidos.
[0234] Los polinucleótidos variantes también abarcan secuencias derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, como el reordenamiento de ADN. Las estrategias para dicho reordenamiento de ADN son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) PNAS 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al.(1997) Nature Biotech.15:436-438; Moore et al.(1997) J. Mol. Biol.272:336-347; Zhang et al.(1997) PNAS 94:4504-4509; Crameri et al.(1998) Nature 391:288-291; y las patentes de EE. UU. n.º 5.605.793 y 5.837.458. Para las amplificaciones por PCR de los polinucleótidos divulgados en el presente documento, se pueden diseñar cebadores de oligonucleótidos para su uso en reacciones de PCR con el fin de amplificar las secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y clonación por PCR son generalmente conocidos en la técnica y se divulgan en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Véase también Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero no están limitados a, métodos que usan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores específicos únicos, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vectores, cebadores parcialmente incompatibles y similares.
[0236] El término «cebador», como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido que es capaz de hibridarse con el objetivo de amplificación, lo que permite que una ADN polimerasa se adhiera a él, sirviendo así como punto de inicio de la síntesis de ADN cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis del producto de extensión del cebador, es decir, en presencia de nucleótidos y un agente para la polimerización, como la ADN polimerasa, y a una temperatura y pH adecuados. El cebador (de amplificación) es preferiblemente monocatenario para la máxima eficiencia en la amplificación. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser lo suficientemente largo como para iniciar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente para la polimerización. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo la temperatura y la composición (contenido de A/T frente a G/C) del cebador. Un par de cebadores bidireccionales consiste en un cebador directo y uno inverso, como se usa habitualmente en la técnica de amplificación de ADN, como en la amplificación por PCR.
[0238] Los términos «rigurosidad» o «condiciones de hibridación rigurosas» se refieren a las condiciones de hibridación que afectan a la estabilidad de los híbridos, por ejemplo, la temperatura, la concentración de sal, el pH, la concentración de formamida y similares. Estas condiciones se optimizan empíricamente para maximizar la unión específica y minimizar la unión no específica del cebador o la sonda a su secuencia de ácido nucleico diana. Los términos como se usan incluyen la referencia a las condiciones en las que una sonda o cebador se hibridará con su secuencia diana, en un grado detectable mayor que otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces más que el fondo). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en distintas circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Por lo general, las condiciones estrictas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) de la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50 % de una secuencia diana complementaria se hibrida con una sonda o cebador perfectamente compatibles. Normalmente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal sea inferior a aproximadamente 1,0 M de iones Na+, normalmente entre 0,01 y 1,0 M de iones Na+ (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3, y la temperatura sea de al menos 30 °C para sondas o cebadores cortos (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos de aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayores de 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizadores como la formamida. Las condiciones poco rigurosas o «condiciones de rigurosidad reducida» incluyen la hibridación con una disolución tampón de formamida al 30 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en 2×SSC a 40 °C. Las condiciones muy rigurosas a modo de ejemplo incluyen la hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en 0,1×SSC a 60 °C. Los procedimientos de hibridación son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ausubelet al.,1998 y Sambrooket al.,2001. Las condiciones rigurosas pueden ser la hibridación en tampón Na2HPO40,25 M (pH 7,2) que contenga Na2EDTA 1 mM, dodecilsulfato de sodio al 0,5-20 % a 45 °C, como 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o 20 %, seguido de un lavado en 5×SSC, que contiene 0,1 % (p/v) de dodecilsulfato de sodio, a 55 °C a 65 °C.
[0240] Como se usa en el presente documento, «promotor» se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. La secuencia promotora consiste en elementos proximales y más distales aguas arriba, estos últimos a menudo denominados potenciadores. En consecuencia, un «potenciador» es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad promotora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel o la especificidad tisular de un promotor. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintético. Los expertos en la materia entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Se reconoce además que, dado que en la mayoría de los casos no se han definido completamente los límites exactos de las secuencias reguladoras, los fragmentos de ADN de cierta variación pueden tener una actividad promotora idéntica.
[0242] Como se usa en el presente documento, un «promotor constitutivo» es un promotor que está activo en la mayoría de las condiciones y/o durante la mayoría de las etapas de desarrollo. El uso de promotores constitutivos en vectores de expresión usados en biotecnología presenta varias ventajas, tales como: alto nivel de producción de proteínas usadas para seleccionar células u organismos transgénicos; alto nivel de expresión de proteínas indicadoras o marcadores puntuables, lo que permite una fácil detección y cuantificación; alto nivel de producción de un factor de transcripción que forma parte de un sistema de transcripción regulador; producción de compuestos que requieren una actividad ubicua en el organismo; y producción de compuestos que son necesarios durante todas las etapas del desarrollo. Promotores constitutivos a modo de ejemplo no limitativos incluyen el promotor CaMV 35S, los promotores opina, el promotor ubiquitina, el promotor alcohol deshidrogenasa, etc.
[0244] Como se usa en el presente documento, un «promotor no constitutivo» es un promotor que está activo en determinadas condiciones, en determinados tipos de células y/o durante determinadas etapas de desarrollo. Por ejemplo, los promotores específicos de tejido, preferentes de tejido, específicos de tipo celular, preferentes de tipo celular, inducibles y los promotores bajo el control del desarrollo son promotores no constitutivos. Ejemplos de promotores bajo el control del desarrollo incluyen promotores que inician preferentemente la transcripción en determinados tejidos.
[0246] Como se usa en el presente documento, un promotor «inducible» o «represible» es un promotor que está bajo el control de factores químicos o ambientales. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaerobias, ciertos productos químicos, la presencia de luz, condiciones ácidas o básicas, etc.
[0248] Como se usa en el presente documento, un promotor «específico de tejido» es un promotor que inicia la transcripción solo en determinados tejidos. A diferencia de la expresión constitutiva de los genes, la expresión específica de tejido es el resultado de varios niveles de regulación génica que interactúan entre sí. Por ello, en la técnica a veces es preferible usar promotores de especies homólogas o estrechamente relacionadas para lograr una expresión eficiente y fiable de los transgenes en tejidos concretos. Esta es una de las principales razones por las que se han aislado grandes cantidades de promotores específicos de tejido a partir de tejidos concretos, como se recoge en la literatura científica y de patentes.
[0250] Como se usa en el presente documento, el término «operativamente unido» se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico, de modo que la función de uno está regulada por el otro. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante cuando es capaz de regular la expresión de dicha secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden estar operativamente unidas a secuencias reguladoras en una orientación sentido o antisentido. En otro ejemplo, las regiones de ARN complementarias de la divulgación pueden estar operativamente unidas, ya sea directa o indirectamente, 5' al ARNm diana, o 3' al ARNm diana, o dentro del ARNm diana, o una primera región complementaria es 5' y su complemento es 3' al ARNm diana.
[0252] Como se usa en el presente documento, las expresiones «construcción recombinante», «construcción de expresión», «construcción quimérica», «construcción» y «construcción de ADN recombinante» se usan indistintamente en el presente documento. Una construcción recombinante comprende una combinación artificial de fragmentos de ácido nucleico, por ejemplo, secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por ejemplo, una construcción quimérica puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. Dicha construcción puede usarse por sí sola o puede usarse en combinación con un vector. Si se usa un vector, la elección del vector depende del método que se use para transformar las células hospedadoras, como es bien sabido por los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede usar un vector plasmídico. El experto en la materia conoce bien los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector para transformar, seleccionar y propagar con éxito las células hospedadoras que comprenden cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados de la divulgación. El experto en la materia también reconocerá que diferentes eventos de transformación independientes darán lugar a diferentes niveles y patrones de expresión (Jones et al., (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86) y, por lo tanto, que deben seleccionarse múltiples eventos para obtener líneas que muestren el nivel y el patrón de expresión deseados. Dicha selección puede realizarse mediante análisis Southern del ADN, análisis Northern de la expresión del ARNm, análisis de inmunotransferencia de la expresión de proteínas o análisis fenotípico, entre otros. Los vectores pueden ser plásmidos, virus, bacteriófagos, provirus, fagémidos, transposones, cromosomas artificiales y similares, que se replican de forma autónoma o pueden integrarse en un cromosoma de una célula hospedadora. Un vector también puede ser un polinucleótido de ARN desnudo, un polinucleótido de ADN desnudo, un polinucleótido compuesto por ADN y ARN dentro de la misma cadena, un ADN o ARN conjugado con polilisina, un ADN o ARN conjugado con péptido, un ADN conjugado con liposoma o similares, que no se replica de forma autónoma. Como se usa en el presente documento, el término «expresión» se refiere a la producción de un producto final funcional, por ejemplo, un ARNm o una proteína (precursora o madura).
[0254] La célula u organismo puede tener al menos un rasgo heterólogo. Como se usa en el presente documento, el término «rasgo heterólogo» se refiere a un fenotipo impartido a una célula hospedadora transformada u organismo transgénico por un segmento de ADN exógeno, un polinucleótido heterólogo o un ácido nucleico heterólogo. Diversos cambios en el fenotipo son de interés para la presente divulgación, incluyendo, pero no están limitados a, la modificación de la composición de ácidos grasos en la leche, la alteración del contenido de hidratos de carbono de la leche, el aumento del rendimiento de un rasgo económicamente importante de un ungulado (por ejemplo, leche, grasa de la leche, proteínas de la leche, etc.) y similares. Estos resultados pueden lograrse proporcionando la expresión de productos heterólogos o una mayor expresión de productos endógenos en organismos usando los métodos y composiciones de la presente divulgación.
[0256] Como se usa en el presente documento, el término «MIC» significa coeficiente de información máximo. El MIC es un tipo de análisis de red no paramétrico que identifica una puntuación (puntuación MIC) entre las cepas microbianas activas de la presente divulgación y al menos un metadato medido (por ejemplo, grasa de la leche). Además, la solicitud de EE. UU. n.º 15/217.575, presentada el 22 de julio de 2016 (concedida como patente de EE. UU. n.º 9.540.676 el 10 de enero de 2017).
[0258] A continuación, se calcula el coeficiente de información máximo (MIC) entre las cepas y los metadatos 3021a, y entre las cepas 3021b, como se ve en laFIG. 17. Los resultados se combinan para crear una lista de todas las relaciones y sus correspondientes puntuaciones MIC 3022. Si la relación obtiene una puntuación inferior a un umbral determinado 3023, la relación se considera/identifica como irrelevante 3023b. Si la relación está por encima de un umbral determinado 3023, la relación se considera/identifica como relevante 2023a, y está sujeta además al análisis de red 3024. El siguiente fragmento de código muestra una metodología a modo de ejemplo para dicho análisis:
[0259] Leer la lista completa del archivo de relaciones como enlaces
[0261]
[0264] En base al resultado del análisis de red, se seleccionan cepas activas 3025 para preparar productos (por ejemplo, conjuntos, agregados y/u otros agrupamientos sintéticos) que contienen las cepas seleccionadas. El resultado del análisis de red también se puede usar para informar la selección de cepas para pruebas adicionales de composición del producto.
[0266] El uso de umbrales se analiza anteriormente para análisis y determinaciones. Los umbrales pueden ser, según la implementación y la aplicación: (1) determinados empíricamente (por ejemplo, basado en niveles de distribución, estableciendo un límite en un número que elimina una porción específica o significativa de lecturas de bajo nivel); (2) cualquier valor distinto de cero; (3) basado en porcentaje/percentiles; (4) sólo cepas cuyas lecturas del segundo marcador normalizado (es decir, actividad) son mayores que las lecturas del primer marcador normalizado (recuento de células); (5) cambio log2 veces entre actividad y cantidad o recuento de células; (6) las lecturas normalizadas del segundo marcador (actividad) son mayores que las lecturas medias del segundo marcador (actividad) para toda la muestra (y/o conjunto de muestras); y/o cualquier umbral de magnitud descrito anteriormente además de un umbral estadístico (es decir, prueba de significancia). El siguiente ejemplo proporciona detalles sobre los umbrales para las distribuciones de las mediciones del segundo marcador basado en ARN con respecto a las mediciones del primer marcador basado en ADN.
[0268] Como se usa en el presente documento, «estable durante el almacenamiento» se refiere a un atributo funcional y una nueva utilidad adquirida por los microbios formulados de acuerdo con la divulgación, que permiten que dichos microbios existan en un estado útil/activo fuera de su entorno natural en el rumen (es decir, una característica notablemente diferente). Por lo tanto, «estable durante el almacenamiento» es un atributo funcional creado por las formulaciones/composiciones de la divulgación y que indica que el microbio formulado en una composición estable durante el almacenamiento puede existir fuera del rumen y en condiciones ambientales durante un periodo de tiempo que puede determinarse en función de la formulación particular utilizada, pero en general significa que los microbios pueden formularse para existir en una composición que es estable en condiciones ambientales durante al menos unos días y, en general, al menos una semana. En consecuencia, un «suplemento para rumiantes estable durante el almacenamiento» es una composición que comprende uno o más microbios de la divulgación, dichos microbios formulados en una composición, de tal manera que la composición es estable en condiciones ambientales durante al menos una semana, lo que significa que los microbios comprendidos en la composición (por ejemplo, células completas, esporas o células lisadas) son capaces de conferir una o más propiedades fenotípicas beneficiosas a un rumiante cuando se administran (por ejemplo, aumento de la producción de leche, mejora de las características composicionales de la leche, mejora de la salud del rumen y/o modulación del microbioma del rumen).
[0270] Microbios aislados
[0272] La presente divulgación proporciona microbios aislados, incluidas cepas novedosas de microbios, que se presentan en laTabla 1y laTabla 3.
[0273] La presente divulgación proporciona cultivos microbianos completos aislados de los microbios identificados en laTabla 1y laTabla 3. Estos cultivos pueden comprender microbios en diversas concentraciones.
[0274] La divulgación prevé la utilización de uno o más microbios seleccionados de laTabla 1y laTabla 3para aumentar un rasgo fenotípico de interés en un rumiante.
[0275] La divulgación proporciona especies microbianas aisladas que pertenecen a las familias taxonómicas de Clostridiaceae, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Acidaminococcaceae, Peptococcaceae, Porphyromonadaceae, Prevotellaceae, Neocallimastigaceae, Saccharomycetaceae, Phaeosphaeriaceae, Erysipelotrichia, Anaerolinaeceae, Atopobiaceae, Botryosphaeriaceae, Eubacteriaceae, Acholeplasmataceae, Succinivibrionaceae, Lactobacillaceae, Selenomonadaceae, Burkholderiaceae, y Streptococcaceae.
[0276] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Clostridiaceae, incluyendoAcetanaerobacterium, Acetivibrio, Acidaminobacter, Alkaliphilus, Anaerobacter, Anaerostipes, Anaerotruncus, Anoxynatronum, Bryantella, Butyricicoccus, Caldanaerocella, Caloramator, Caloranaerobacter, Caminicella, Candidatus Arthromitus, Clostridium, Coprobacillus, Dorea, Ethanologenbacterium, Faecalibacterium, Garciella, Guggenheimella, Hespellia, Linmingia, Natronincola, Oxobacter, Parasporobacterium, Sarcina, Soehngenia, Sporobacter, Subdoligranulum, Tepidibacter, Tepidimicrobium, Thermobrachium, Thermohalobacter,yTindallia.Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Ruminococcaceae, incluyendoRuminococcus, Acetivibrio, Sporobacter, Anaerofilium, Papillibacter, Oscillospira, Gemmiger, Faecalibacterium, Fastidiosipila, Anaerotruncus, Ethanolingenens, Acetanaerobacterium, Subdoligranulum, Hydrogenoanaerobacterium,yCandidadus Soleaferrea.
[0277] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Lachnospiraceae, incluyendoButyrivibrio, Roseburia, Lachnospira, Acetitomaculum, Coprococcus, Johnsonella, Catonella, Pseudobutyrivibrio, Syntrophococcus, Sporobacterium, Parasporobacterium, Lachnobacterium, Shuttleworthia, Dorea, Anaerostipes, Hespellia, Marvinbryantia, Oribacterium, Moryella, Blautia, Robinsoniella, Cellulosilyticum, Lachnoanaerobaculum, Stomatobaculum, Fusicatenibacter, Acetatifactor,yEisenbergiella.
[0278] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Acidaminococcaceae, , incluyendoAcidaminococcus, Phascolarctobacterium, Succiniclasticum,ySuccinispira.
[0279] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Peptococcaceae, incluyendoDesulfotomaculum, Peptococcus, Desulfitobacterium, Syntrophobotulus, Dehalobacter, Sporotomaculum, Desulfosporosinus, Desulfonispora, Pelotomaculum, Thermincola, Cryptanaerobacter, Desulfitibacter, Candidatus Desulforudis, Desulfurispora,yDesulfitospora.
[0280] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Porphyromonadaceae, incluyendoPorphyromonas, Dysgonomonas, Tannerella, Odoribacter, Proteiniphilum, Petrimonas, Paludibacter, Parabacteroides, Barnesiella, Candidatus Vestibaculum, Butyricimonas, Macellibacteroides,yCoprobacter.Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Anaerolinaeceae, incluyendoAnaerolinea, Bellilinea, Leptolinea, Levilinea, Longilinea, Ornatilinea,yPelolinea.
[0281] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Atopobiaceae, incluyendoAtopbiumyOlsenella.
[0282] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Eubacteriaceae, incluyendo.Acetobacterium, Alkalibacter, Alkalibaculum, Aminicella, Anaerofustis, Eubacterium, Garciella,yPseudoramibacterLas especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Acholeplasmataceae, incluyendoAcholeplasma.
[0283] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Succinivibrionaceae, incluyendoAnaerobiospirillum, Ruminobacter, Succinatimonas, Succinimonas,ySuccinivibrio.
[0284] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Succinivibrionaceae, incluyendoLactobacillus, Paralactobacillus, Pediococcus,ySharpea.
[0285] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Succinivibrionaceae, incluyendoAnaerovibrio, Centipeda, Megamonas, Mitsuokella, Pectinatus, Propionispira, Schwartzia, Selenomonas,yZymophilus.
[0286] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Burkholderiaceae, incluyendoBurkholderia, Chitinimonas, Cupriavidus, Lautropia, Limnobacter, Pandoraea, Paraburkholderia, Paucimonas, Polynucleobacter, Ralstonia, Thermothrix,yWautersia.
[0287] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Burkholderiaceae, incluyendoLactococcus, Lactovum,yStreptococcus.
[0288] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Anaerolinaeceae, incluyendoAestuariimicrobium, Arachnia, Auraticoccus, Brooklawnia, Friedmanniella, Granulicoccus, Luteococcus, Mariniluteicoccus, Microlunatus, Micropruina, Naumannella, Propionibacterium, Propionicicella, Propioniciclava, Propioniferax, Propionimicrobium,yTessaracoccus.
[0289] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Prevotellaceae, incluyendoParaprevotella, Prevotella, hallella, Xylanibacter,yAlloprevotella.
[0290] En realizaciones adicionales, las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Neocallimastigaceae,Anaeromyces, Caecomyces, Cyllamyces, Neocallimastix, Orpinomyces,yPiromyces.Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Saccharomycetaceae, incluyendoBrettanomyces, Candida, Citeromyces, Cyniclomyces, Debaryomyces, Issatchenkia, Kazachstania(sin.Arxiozyma),Kluyveromyces, Komagataella, Kuraishia, Lachancea, Lodderomyces, Nakaseomyces, Pachysolen, Pichia, Saccharomyces, Spathaspora, Tetrapisispora, Vanderwaltozyma, Torulaspora, Williopsis, Zygosaccharomyces,yZygotorulaspora.
[0291] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Erysipelotrichaceae, incluyendoErysipelothrix, Solobacterium, Turicibacter, Faecalibaculum, Faecalicoccus, Faecalitalea, Holdemanella, Holdemania, Dielma, Eggerthia, Erysipelatoclostridium, Allobacterium, Breznakia, Bulleidia, Catenibacterium, Catenisphaera,yCoprobacillus.
[0292] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Phaeosphaeriaceae, incluyendoBarria, Bricookea, Carinispora, Chaetoplea, Eudarluca, Hadrospora, Isthmosporella, Katumotoa, Lautitia, Metameris, Mixtura, Neophaeosphaeria, Nodulosphaeria, Ophiosphaerella, Phaeosphaeris, Phaeosphaeriopsis, Setomelanomma, Stagonospora, Teratosphaeria,yWilmia.
[0293] Las especies microbianas aisladas pueden seleccionarse de géneros de la familia Botryosphaeriaceae, incluyendoAmarenomyces, Aplosporella, Auerswaldiella, Botryosphaeria, Dichomera, Diplodia, Discochora, Dothidothia, Dothiorella, Fusicoccum, Granulodiplodia, Guignardia, Lasiodiplodia, Leptodothiorella, Leptodothiorella, Leptoguignardia, Macrophoma, Macrophomina, Nattrassia, Neodeightonia, Neofusicocum, Neoscytalidium, Otthia, Phaeobotryosphaeria, Phomatosphaeropsis, Phyllosticta, Pseudofusicoccum, Saccharata, Sivanesania,yThyrostroma.
[0294] La divulgación puede proporcionar especies microbianas aisladas que pertenecen a géneros de:Clostridium, Ruminococcus, Roseburia, Hydrogenoanaerobacterium, Saccharofermentans, Papillibacter, Pelotomaculum, Butyricicoccus, Tannerella, Prevotella, Butyricimonas, Piromyces, Candida, Vrystaatia, Orpinomyces, Neocallimastix,yPhyllosticta.En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona especies microbianas aisladas que pertenecen a la familia de Lachnospiraceae y al orden de Saccharomycetales. En otras realizaciones, la divulgación proporciona especies microbianas aisladas deCandida xylopsoci, Vrystaatia aloeicolayPhyllosticta capitalensis.
[0295] Un microbio de los taxones divulgados en el presente documento puede utilizarse para conferir una o más propiedades beneficiosas o rasgos mejorados a la leche de los rumiantes.
[0296] La divulgación proporciona especies microbianas aisladas, seleccionadas del grupo que consiste en:Clostridium, Ruminococcus, Roseburia, Hydrogenoanaerobacterium, Saccharofermentans, Papillibacter, Pelotomaculum, Butyricicoccus, Tannerella, Prevotella, Butyricimonas, Piromyces, Pichia, Candida, Vrystaatia, Orpinomyces, NeocallimastixyPhyllosticta.
[0297] La divulgación proporciona novedosas cepas microbianas aisladas de especies, seleccionadas del grupo que consiste en:Clostridium, Ruminococcus, Roseburia, Hydrogenoanaerobacterium, Saccharofermentans, Papillibacter, Pelotomaculum, Butyricicoccus, Tannerella, Prevotella, Butyricimonas, Piromyces, Pichia, Candida, Vrystaatia, Orpinomyces, NeocallimastixyPhyllosticta.En laTabla 1y/o laTabla 3se pueden encontrar cepas novedosas concretas de estos grupos taxonómicos mencionados anteriormente.
[0298] La divulgación se refiere a microbios que tienen características sustancialmente similares a las de un microbio identificado en laTabla 1o laTabla 3.
[0299] Las especies microbianas aisladas y las cepas novedosas de dichas especies, identificadas en la presente divulgación, son capaces de conferir propiedades o rasgos beneficiosos a la producción de leche de rumiantes. Por ejemplo, los microbios aislados descritos en laTabla 1y laTabla 3, o los consorcios de dichos microbios, son capaces de aumentar la grasa total de la leche de rumiantes. El aumento puede medirse cuantitativamente, por ejemplo, midiendo el efecto que dicha aplicación microbiana tiene sobre la modulación de la grasa total de la leche. Las cepas microbianas aisladas pueden ser microbios de la presente divulgación que han sido modificados genéticamente. En algunas realizaciones, los microbios modificados genéticamente o recombinantes comprenden secuencias de polinucleótidos que no se producen de forma natural en dichos microbios. Los microbios pueden comprender polinucleótidos heterólogos. Los polinucleótidos heterólogos pueden estar operativamente unidos a uno o más polinucleótidos nativos de los microbios.
[0300] Los polinucleótidos heterólogos pueden ser genes indicadores o marcadores seleccionables. Los genes indicadores pueden seleccionarse de cualquiera de la familia de proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP, RFP, YFP y similares), β-galactosidasa, luciferasa. Los marcadores seleccionables pueden seleccionarse de neomicina fosfotransferasa, higromicina fosfotransferasa, aminoglucósido adeniltransferasa, dihidrofolato reductasa, acetolactasa sintasa, bromoxinil nitrilasa, β-glucuronidasa, dihidrofolato reductasa y cloranfenicol acetiltransferasa. El polinucleótido heterólogo puede estar operativamente unido a uno o más promotores.
[0301] Tabla 4: Taxones (en su mayoría géneros) de la presente divulgación que no se sabe que se hayan utilizado en la ganadería.
[0303]
[0304]
[0306] Consorcios microbianos
[0307] La divulgación proporciona consorcios microbianos que comprenden una combinación de al menos dos microbios seleccionados entre los microbios identificados en laTabla 1y/o laTabla 3.
[0308] En ciertas realizaciones, los consorcios de la presente divulgación comprenden dos microbios, o tres microbios, o cuatro microbios, o cinco microbios, o seis microbios, o siete microbios, u ocho microbios, o nueve microbios, o diez o más microbios. Dichos microbios de los consorcios son especies microbianas diferentes, o cepas diferentes de una especie microbiana.
[0309] En algunas realizaciones, la divulgación proporciona consorcios que comprenden: al menos dos especies microbianas aisladas pertenecientes a los géneros:Clostridium y Pichia.En laTabla 1y/o laTabla 3se pueden encontrar cepas novedosas concretas de especies de los géneros mencionados anteriormente.
[0310] La divulgación proporciona consorcios que comprenden: al menos dos especies microbianas aisladas, seleccionadas del grupo que consiste en especies de la familia Lachnospiraceae y el orden Saccharomycetales. La divulgación proporciona consorcios microbianos que comprenden especies agrupadas en lasTablas 5-11. Con respecto a lasTablas 5-11, las letrasAaIrepresentan una selección no limitativa de microbios de la presente divulgación, definidos como:
[0311] A= Designación de la cepa Ascusb_7 identificada en laTabla 1;
[0312] B= Designación de la cepa Ascusb_3138 identificada en laTabla 1;
[0313] C= Designación de la cepa Ascusb_82 identificada en laTabla 1;
[0314] D= Designación de la cepa Ascusb_119 identificada en laTabla 1;
[0315] E= Designación de la cepa Ascusb_1801 identificada en laTabla 1;
[0316] F= Designación de la cepa Ascusf_23 identificada en laTabla 1;
[0317] G= Designación de la cepa Ascusf_24 identificada en laTabla 1;
[0318] H= Designación de la cepa Ascusf_45 identificada en laTabla 1; y
[0319] I= Designación de la cepa Ascusf_15 identificada en laTabla 1.
[0320] Tabla 5: Consorcios de ocho y nueve cepas
[0322]
[0324] Tabla 6: Consorcios de siete cepas
[0326]
[0327]
[0329] Tabla 7: Consorcios de seis cepas
[0331]
[0333] Tabla 8: Consorcios de cinco cepas
[0335]
[0337] Tabla 9: Consorcios de cuatro cepas
[0339]
[0340]
[0342] Tabla 10: Consorcios de tres cepas
[0344]
[0346] Tabla 11: Consorcios de dos cepas
[0348]
[0350] Los consorcios microbianos pueden seleccionarse de cualquier grupo miembro de lasTablas 5-11.
[0351] Microbios aislados - Material de origen
[0352] Los microbios de la presente divulgación se obtuvieron, entre otros lugares, en diversos lugares de los Estados Unidos a partir del tubo gastrointestinal de vacas.
[0353] Microbios aislados - Técnicas de cultivo microbiano
[0354] Los microbios de laTabla 1y laTabla 3se emparejaron con sus grupos taxonómicos más cercanos utilizando herramientas de clasificación del Ribosomal Database Project (RDP) para secuencias de ARNr 16S y la base de datos User-friendly Nordic ITS Ectomycorrhiza (UNITE) para secuencias de ARNr ITS. Se pueden encontrar ejemplos de emparejamiento de microbios con sus taxones más cercanos en Lan et al. (2012. PLOS one.
[0355] 7(3):e32491), Schloss y Westcott (2011. Appl. Environ. Microbiol. 77(10):3219-3226), y Koljalg et al. (2005. New Phytologist.166(3):1063-1068).
[0356] El aislamiento, la identificación y el cultivo de los microbios de la presente divulgación pueden llevarse a cabo usando técnicas microbiológicas estándar. Ejemplos de dichas técnicas se pueden encontrar en Gerhardt, P. (ed.) Methods for General and Molecular Microbiology. American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) y Lennette, E. H. (ed.) Manual of Clinical Microbiology, tercera edición. American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1980).
[0357] El aislamiento puede llevarse a cabo mediante la siembra en estrías de la muestra sobre un medio sólido (por ejemplo, placas de agar nutritivo) para obtener una sola colonia, que se caracteriza por los rasgos fenotípicos descritos anteriormente (por ejemplo, Gram-positiva/negativa, capaz de formar esporas de forma aerobia/anaerobia, morfología celular, metabolismo de la fuente de carbono, producción de ácido/base, secreción de enzimas, secreciones metabólicas, etc.) y para reducir la probabilidad de trabajar con un cultivo que se haya contaminado.
[0358] Por ejemplo, para los microbios de la divulgación, se pueden obtener aislados biológicamente puros mediante subcultivos repetidos de muestras biológicas, cada subcultivo seguido de una siembra en estrías sobre medios sólidos para obtener colonias individuales o unidades formadoras de colonias. Los métodos de preparación, descongelación y cultivo de bacterias liofilizadas son comúnmente conocidos, por ejemplo, Gherna, R. L. y C. A. Reddy.2007. Culture Preservation, p.1019-1033. En C. A. Reddy, T. J. Beveridge, J. A. Breznak, G. A. Marzluf, T. M. Schmidt y L. R. Snyder, eds. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1033 páginas. Por lo tanto, se contempla el uso de formulaciones líquidas liofilizadas y cultivos almacenados a largo plazo a -70 °C en disoluciones que contienen glicerol para proporcionar las formulaciones de la presente divulgación.
[0360] Los microbios de la divulgación pueden propagarse en un medio líquido en condiciones aerobias o, alternativamente, en condiciones anaerobias. El medio para el cultivo de las cepas bacterianas de la presente divulgación incluye una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y sales inorgánicas, así como sustancias especialmente necesarias, tales como vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos y similares. Ejemplos de fuentes de carbono adecuadas que pueden usarse para el cultivo de los microbios incluyen, pero no están limitadas a, almidón, peptona, extracto de levadura, aminoácidos, azúcares como glucosa, arabinosa, manosa, glucosamina, maltosa y similares; sales de ácidos orgánicos como ácido acético, ácido fumárico, ácido adípico, ácido propiónico, ácido cítrico, ácido glucónico, ácido málico, ácido pirúvico, ácido malónico y similares; alcoholes como etanol y glicerol y similares; aceites o grasas como aceite de soja, aceite de salvado de arroz, aceite de oliva, aceite de maíz, aceite de sésamo. La cantidad de fuente de carbono añadida varía según el tipo de fuente de carbono y suele estar entre 1 y 100 gramos por litro de medio. Preferiblemente, el medio contiene glucosa, almidón y/o peptona como fuente principal de carbono, en una concentración del 0,1-5 % (p/v). Ejemplos de fuentes de nitrógeno adecuadas que pueden usarse para el cultivo de las cepas bacterianas de la presente divulgación incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos, extracto de levadura, triptona, extracto de carne de vacuno, peptona, nitrato de potasio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, sulfato de amonio, fosfato de amonio, amoniaco o combinaciones de los mismos. La cantidad de fuente de nitrógeno varía según el tipo de fuente de nitrógeno, normalmente entre 0,1 y 30 gramos por litro de medio. Las sales inorgánicas, dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato dipotásico, hidrogenofosfato disódico, sulfato de magnesio, cloruro de magnesio, sulfato férrico, sulfato ferroso, cloruro férrico, cloruro ferroso, sulfato manganoso, cloruro manganoso, sulfato de zinc, cloruro de zinc, sulfato cúprico, cloruro de calcio, cloruro de sodio, carbonato de calcio y carbonato de sodio pueden usarse solas o en combinación. La cantidad de ácido inorgánico varía según el tipo de sal inorgánica, normalmente entre 0,001 y 10 gramos por litro de medio. Ejemplos de sustancias especialmente necesarias incluyen, pero no están limitadas a, vitaminas, ácidos nucleicos, extracto de levadura, peptona, extracto de carne, extracto de malta, levadura seca y combinaciones de las mismas. El cultivo puede efectuarse a una temperatura que permita el crecimiento de las cepas microbianas, esencialmente entre 20 °C y 46 °C. En algunos aspectos, un intervalo de temperatura es 30 °C-39 °C. Para un crecimiento óptimo, en algunas realizaciones, el medio puede ajustarse a un pH de 6,0-7,4. Se apreciará que también pueden usarse medios disponibles comercialmente para cultivar las cepas microbianas, como caldo nutritivo o agar nutritivo disponibles en Difco, Detroit, MI. Se apreciará que el tiempo de cultivo puede variar dependiendo del tipo de medio de cultivo usado y de la concentración de azúcar como fuente principal de carbono.
[0362] El cultivo puede durar entre 24-96 horas. Las células microbianas así obtenidas se aíslan usando métodos bien conocidos en la técnica. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, filtración por membrana y separación centrífuga. El pH puede ajustarse usando hidróxido de sodio y similares, y el cultivo puede secarse usando un liofilizador, hasta que el contenido de agua sea igual o inferior al 4 %. Se pueden obtener cocultivos microbianos propagando cada cepa como se ha descrito anteriormente. En algunos aspectos, se pueden obtener cultivos microbianos de múltiples cepas propagando dos o más de las cepas descritas anteriormente. Se apreciará que las cepas microbianas se pueden cultivar juntas cuando se pueden emplear condiciones de cultivo compatibles.
[0363] Microbios aislados - Cepas microbianas
[0365] Los microbios pueden distinguirse en un género basado en la taxonomía polifásica, que incorpora todos los datos fenotípicos y genotípicos disponibles en una clasificación consensuada (Vandamme et al. 1996. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol Rev 1996, 60:407-438). Un método genotípico aceptado para definir las especies se basa en la relación genómica global, de modo que las cepas que comparten aproximadamente un 70 % o más de relación usando hibridación de ADN-ADN, con 5 °C o menos de ΔTm
(la diferencia en la temperatura de fusión entre híbridos homólogos y heterólogos), en condiciones estándar, se consideran miembros de la misma especie. Por lo tanto, las poblaciones que comparten más del umbral del 70 % mencionado anteriormente pueden considerarse variantes de la misma especie. Otro método genotípico aceptado para definir especies es aislar los genes marcadores de la presente divulgación, secuenciar estos genes y alinear estos genes secuenciados de múltiples aislados o variantes. Se interpreta que los microbios pertenecen a la misma especie si uno o más de los genes secuenciados comparten al menos un 97 % de identidad de secuencia.
[0367] Las secuencias de ARNr 16S o 18S o las secuencias ITS se usan a menudo para hacer distinciones entre especies y cepas, de modo que si una de las secuencias mencionadas anteriormente comparte menos de un porcentaje específico de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, se considera que los dos organismos de los que se obtuvieron las secuencias son de especies o cepas diferentes.
[0368] Por lo tanto, se podría considerar que los microbios son de la misma especie si comparten al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia en la secuencia de ARNr 16S o 18S, o en la secuencia ITS1 o ITS2.
[0369] Además, se podría definir lascepasmicrobianas de una especie como aquellas que comparten al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia en la secuencia de ARNr 16S o 18S, o en la secuencia ITS1 o ITS2.
[0370] Las cepas microbianas de la presente divulgación pueden incluir aquellas que comprenden secuencias de polinucleótidos que comparten al menos 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 39, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 2045, 2046, 2047, 2048, 2049, 2050, 2051, 2052, 2053, 2054, 2055, 2056, 2057, 2058, 2059, 2060, 2061, 2062, 2063, 2064, 2065, 2066, 2067, 2068, 2069, 2070, 2071, 2072, 2073, 2074, 2075, 2076, 2077, 2078, 2079, 2080, 2081, 2082, 2083, 2084, 2085, 2086, 2087, 2088, 2089, 2090, 2091, 2092, 2093, 2094, 2095, 2096, 2097, 2098, 2099, 2100, 2101, 2102, 2103, 2104, 2105, 2106, y 2107. Las cepas microbianas de la presente divulgación también pueden incluir aquellas que comprenden secuencias de polinucleótidos que comparten al menos 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NO: 1-2107.
[0371] También se pueden realizar comparaciones con secuencias de ARNr 23S frente a secuencias de referencia. Los microbios no cultivables a menudo no pueden asignarse a una especie definida en ausencia de una determinación fenotípica, por lo que se les puede asignar la designacióncandidatusdentro de un género, siempre que sus secuencias de ARNr 16S o 18S o secuencias ITS se ajusten a los principios de identidad con especies conocidas.
[0372] Un enfoque consiste en observar la distribución de un gran número de cepas de especies estrechamente relacionadas en el espacio de la secuencia e identificar agrupaciones de cepas que estén bien diferenciadas de otras agrupaciones. Este enfoque se ha desarrollado usando las secuencias concatenadas de múltiples genes centrales (de mantenimiento) para evaluar los patrones de agrupamiento, y se ha denominado análisis de secuencias multilocus (MLSA) o análisis filogenético de secuencias multilocus. El MLSA se ha usado con éxito para explorar los patrones de agrupamiento entre un gran número de cepas asignadas a especies muy estrechamente relacionadas por los métodos taxonómicos actuales, para examinar las relaciones entre un pequeño número de cepas dentro de un género, o dentro de una agrupación taxonómica más amplia, y para abordar cuestiones taxonómicas específicas. De manera más general, el método puede usarse para preguntarse si existen especies bacterianas, es decir, para observar si las grandes poblaciones de cepas similares se agrupan invariablemente en grupos bien diferenciados, o si en algunos casos existe una continuidad genética en la que no se observa una separación clara en agrupaciones.
[0373] Con el fin de hacer una determinación con mayor precisión de los géneros, se hace una determinación de rasgos fenotípicos, como las características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas, para compararlos con un arquetipo de género de referencia. La morfología de la colonia puede incluir el color, la forma, la pigmentación, la producción de capa mucosa, etc. Las características de la célula se describen en cuanto a forma, tamaño, reacción de Gram, material extracelular, presencia de endosporas, presencia y ubicación de flagelos, motilidad y cuerpos de inclusión. Las características bioquímicas y fisiológicas describen el crecimiento del organismo en diferentes intervalos de temperatura, pH, salinidad y condiciones atmosféricas, crecimiento en presencia de diferentes fuentes únicas de carbono y nitrógeno. Un experto en la materia estaría razonablemente informado sobre los rasgos fenotípicos que definen los géneros de la presente divulgación.
[0374] En una realización, los microbios enseñados en el presente documento se identificaron utilizando secuencias del gen ARNr 16S y secuencias ITS. Es conocido en la técnica que el ARNr 16S contiene regiones hipervariables que pueden proporcionar secuencias características específicas de especies/cepas útiles para la identificación bacteriana, y que las secuencias ITS también pueden proporcionar secuencias características específicas de especies/cepas útiles para la identificación fúngica.
[0375] El análisis filogenético usando los genes de ARNr y/o las secuencias ITS se usa para definir especies «sustancialmente similares» que pertenecen a géneros comunes y también para definir cepas «sustancialmente similares» de una especie taxonómica determinada. Además, las propiedades fisiológicas y/o bioquímicas de los aislados pueden utilizarse para resaltar las diferencias, tanto menores como significativas, entre cepas que podrían dar lugar a un comportamiento ventajoso en rumiantes.
[0376] Las composiciones de la presente divulgación pueden incluir combinaciones de esporas fúngicas y esporas bacterianas, esporas fúngicas y células vegetativas bacterianas, células vegetativas fúngicas y esporas bacterianas, células vegetativas fúngicas y células vegetativas bacterianas. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente divulgación comprenden bacterias solo en forma de esporas. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente divulgación comprenden bacterias solo en forma de células vegetativas. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente divulgación comprenden bacterias en ausencia de hongos. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente divulgación comprenden hongos en ausencia de bacterias.
[0377] Las esporas bacterianas pueden incluir endosporas y acinetos. Las esporas fúngicas pueden incluir estatismosporas, balistosporas, autosporas, aplanosporas, zoosporas, mitosporas, megasporas, microsporas, meiosporas, clamidosporas, urediniosporas, teliosporas, oosporas, carposporas, tetrasporas, esporangiosporas, zigosporas, ascosporas, basidiosporas, ascosporas y ascosporas.
[0378] En algunas realizaciones, las esporas de la composición germinan tras su administración a animales de la presente divulgación. En algunas realizaciones, las esporas de la composición germinan solo tras su administración a animales de la presente divulgación.
[0379] Composiciones microbianas
[0380] En algunas realizaciones, los microbios de la divulgación se combinan en composiciones microbianas.
[0381] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas incluyen piensos para rumiantes, tales como cereales (cebada, maíz, avena y similares); almidones (tapioca y similares); tortas de semillas oleaginosas; y residuos vegetales. En algunas realizaciones, las composiciones microbianas incluyen vitaminas, minerales, oligoelementos, emulsionantes, productos aromatizantes, aglutinantes, colorantes, odorantes, agentes espesantes y similares.
[0382] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación son sólidas. Cuando se usan composiciones sólidas, puede ser conveniente incluir uno o más materiales portadores, que incluyen, pero no están limitados a: tierras minerales como sílices, talco, caolín, piedra caliza, tiza, arcilla, dolomita, tierra de diatomeas; sulfato de calcio; sulfato de magnesio; óxido de magnesio; productos de origen vegetal como harinas de cereales, harina de corteza de árbol, harina de madera y harina de cáscara de nuez.
[0383] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación son líquidas. En otras realizaciones, el líquido comprende un disolvente que puede incluir agua o un alcohol, y otros disolventes seguros para los animales. En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación incluyen aglutinantes tales como polímeros seguros para los animales, carboximetilcelulosa, almidón, alcohol polivinílico y similares.
[0384] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación comprenden agentes espesantes, tales como sílice, arcilla, extractos naturales de semillas o algas marinas, derivados sintéticos de celulosa, goma guar, goma de algarroba, alginatos y metilcelulosas. En algunas realizaciones, las composiciones microbianas comprenden agentes antisedimentantes, tales como almidones modificados, alcohol polivinílico, goma xantana y similares.
[0385] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación comprenden colorantes que incluyen cromóforos orgánicos clasificados como nitroso; nitro; azo, incluyendo monoazo, bisazo y poliazo; acridina, antraquinona, azina, difenilmetano, indamina, indofenol, metina, oxazina, ftalocianina, tiazina, tiazol, triarilmetano y xanteno. En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación comprenden oligoelementos como sales de hierro, manganeso, boro, cobre, cobalto, molibdeno y zinc.
[0386] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación comprenden un virucida o nematicida seguro para los animales.
[0387] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación comprenden sacáridos (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, polisacáridos, oligosacáridos y similares), sacáridos poliméricos, lípidos, lípidos poliméricos, lipopolisacáridos, proteínas, proteínas poliméricas, lipoproteínas, ácidos nucleicos, polímeros de ácidos nucleicos, sílice, sales inorgánicas y combinaciones de los mismos. En una realización adicional, las composiciones microbianas comprenden polímeros de agar, agarosa, gelrite, goma gellan y similares. En algunas realizaciones, las composiciones microbianas comprenden cápsulas de plástico, emulsiones (por ejemplo, agua y aceite), membranas y membranas artificiales. En algunas realizaciones, las emulsiones o disoluciones de polímeros enlazados pueden comprender composiciones microbianas de la presente divulgación. Véase Harel y Bennett (patente de EE. UU.8.460.726B2).
[0388] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación se presentan en forma sólida (por ejemplo, esporas liofilizadas dispersas) o en forma líquida (microbios intercalados en un medio de almacenamiento).
[0389] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación comprenden uno o más conservantes. Los conservantes pueden estar en formulaciones líquidas o gaseosas. Los conservantes pueden seleccionarse de uno o más de monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, polisacáridos, ácido acético, ácido ascórbico, ascorbato de calcio, ácido eritórbico, ácido isoascórbico, ácido eritrobico, nitrato de potasio, ascorbato de sodio, eritorbato de sodio, isoascorbato de sodio, nitrato de sodio, nitrito de sodio, nitrógeno, ácido benzoico, sorbato de calcio, etil lauroil arginato,p-hidroxibenzoato de metilo, metilparabeno, acetato de potasio, benzoato de potasio, bisulfito de potasio, diacetato de potasio, lactato de potasio, metabisulfito de potasio, sorbato de potasio,p-hidroxibenzoato de propilo, propilparabeno, acetato de sodio, benzoato de sodio, bisulfito de sodio, nitrito de sodio, diacetato de sodio, lactato de sodio, metabisulfito de sodio, sal sódica del ácido metil-p-hidroxibenzoico, sal sódica del ácido propil-p-hidroxibenzoico, sulfato de sodio, sulfito de sodio, ditionito de sodio, ácido sulfuroso, propionato de calcio, dicarbonato de dimetilo, natamicina, sorbato de potasio, bisulfito de potasio, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, diacetato de sodio, propionato de sodio, sorbato de sodio, ácido sórbico, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, estearato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado (BHT), hidroxilanisol butilado (BHA), ácido cítrico, ésteres de ácido cítrico de mono y/o diglicéridos, L-cisteína, clorhidrato de L-cisteína, goma guaiacum, goma guaiac, lecitina, citrato de lecitina, citrato de monoglicérido, citrato de monoisopropilo, galato de propilo, metabisulfito de sodio, ácido tartárico, terc-butilhidroquinona, cloruro de estaño, ácido tiodipropiónico, tiodipropionato de dilaurilo, tiodipropionato de diestearilo, etoxiquina, dióxido de azufre, ácido fórmico o tocoferol(es).
[0391] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación incluyen células bacterianas y/o fúngicas en forma de esporas, en forma de células vegetativas y/o en forma de células lisadas. En una realización, la forma celular lisada actúa como un aglutinante de micotoxinas, por ejemplo, micotoxinas que se unen a células muertas.
[0393] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas son estables en anaquel en un refrigerador (35-40° F) durante un periodo de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 días. En algunas realizaciones, las composiciones microbianas son estables en anaquel en un refrigerador (35-40° F) durante un periodo de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 semanas.
[0395] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas son estables en anaquel a temperatura ambiente (68-72° F) o entre 50-77 °F durante un periodo de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 días. En algunas realizaciones, las composiciones microbianas son estables en anaquel a temperatura ambiente (68-72° F) o entre 50-77 °F durante un periodo de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 semanas.
[0397] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas son estables en anaquel a -23-35° F durante un periodo de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 días. En algunas realizaciones, las composiciones microbianas son estables en anaquel a -23-35° F durante un periodo de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 semanas.
[0399] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas son estables en anaquel a 77-100 °F durante un periodo de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 días. En algunas realizaciones, las composiciones microbianas son estables en anaquel a 77-100 °F durante un periodo de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 semanas.
[0401] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas son estables en anaquel a 101-213 °F durante un periodo de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 días. En algunas realizaciones, las composiciones microbianas son estables en anaquel a 101-213 °F durante un periodo de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 semanas.
[0403] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación son estables en anaquel a temperaturas de refrigeración (35-40 °F), a temperatura ambiente (68-72 °F), entre 50-77 °F, entre -23-35 °F, entre 70-100 °F, o entre 101-213 °F durante un periodo de aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 95, aproximadamente 1 a 90, aproximadamente 1 a 85, aproximadamente 1 a 80, aproximadamente 1 a 75, aproximadamente 1 a 70, aproximadamente 1 a 65, aproximadamente 1 a 60, aproximadamente 1 a 55, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 45, aproximadamente 1 a 40, aproximadamente 1 a 35, aproximadamente 1 a 30, aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 20, aproximadamente 1 a 15, aproximadamente 1 a 10, aproximadamente 1 a 5, aproximadamente 5 a 100, aproximadamente 5 a 95, aproximadamente 5 a 90, aproximadamente 5 a 85, aproximadamente 5 a 80, aproximadamente 5 a 75, aproximadamente 5 a 70, aproximadamente 5 a 65, aproximadamente 5 a 60, aproximadamente 5 a 55, aproximadamente 5 a 50, aproximadamente 5 a 45, aproximadamente 5 a 40, aproximadamente 5 a 35, aproximadamente 5 a 30, aproximadamente 5 a 25, aproximadamente 5 a 20, aproximadamente 5 a 15, aproximadamente 5 a 10, aproximadamente 10 a 100, aproximadamente 10 a 95, aproximadamente 10 a 90, aproximadamente 10 a 85, aproximadamente 10 a 80, aproximadamente 10 a 75, aproximadamente 10 a 70, aproximadamente 10 a 65, aproximadamente 10 a 60, aproximadamente 10 a 55, aproximadamente 10 a 50, aproximadamente 10 a 45, aproximadamente 10 a 40, aproximadamente 10 a 35, aproximadamente 10 a 30, aproximadamente 10 a 25, aproximadamente 10 a 20, aproximadamente 10 a 15, aproximadamente 15 a 100, aproximadamente 15 a 95, aproximadamente 15 a 90, aproximadamente 15 a 85, aproximadamente 15 a 80, aproximadamente 15 a 75, aproximadamente 15 a 70, aproximadamente 15 a 65, aproximadamente 15 a 60, aproximadamente 15 a 55, aproximadamente 15 a 50, aproximadamente 15 a 45, aproximadamente 15 a 40, aproximadamente 15 a 35, aproximadamente 15 a 30, aproximadamente 15 a 25, aproximadamente 15 a 20, aproximadamente 20 a 100, aproximadamente 20 a 95, aproximadamente 20 a 90, aproximadamente 20 a 85, aproximadamente 20 a 80, aproximadamente 20 a 75, aproximadamente 20 a 70, aproximadamente 20 a 65, aproximadamente 20 a 60, aproximadamente 20 a 55, aproximadamente 20 a 50, aproximadamente 20 a 45, aproximadamente 20 a 40, aproximadamente 20 a 35, aproximadamente 20 a 30, aproximadamente 20 a 25, aproximadamente 25 a 100, aproximadamente 25 a 95, aproximadamente 25 a 90, aproximadamente 25 a 85, aproximadamente 25 a 80, aproximadamente 25 a 75, aproximadamente 25 a 70, aproximadamente 25 a 65, aproximadamente 25 a 60, aproximadamente 25 a 55, aproximadamente 25 a 50, aproximadamente 25 a 45, aproximadamente 25 a 40, aproximadamente 25 a 35, aproximadamente 25 a 30, aproximadamente 30 a 100, aproximadamente 30 a 95, aproximadamente 30 a 90, aproximadamente 30 a 85, aproximadamente 30 a 80, aproximadamente 30 a 75, aproximadamente 30 a 70, aproximadamente 30 a 65, aproximadamente 30 a 60, aproximadamente 30 a 55, aproximadamente 30 a 50, aproximadamente 30 a 45, aproximadamente 30 a 40, aproximadamente 30 a 35, aproximadamente 35 a 100, aproximadamente 35 a 95, aproximadamente 35 a 90, aproximadamente 35 a 85, aproximadamente 35 a 80, aproximadamente 35 a 75, aproximadamente 35 a 70, aproximadamente 35 a 65, aproximadamente 35 a 60, aproximadamente 35 a 55, aproximadamente 35 a 50, aproximadamente 35 a 45, aproximadamente 35 a 40, aproximadamente 40 a 100, aproximadamente 40 a 95, aproximadamente 40 a 90, aproximadamente 40 a 85, aproximadamente 40 a 80, aproximadamente 40 a 75, aproximadamente 40 a 70, aproximadamente 40 a 65, aproximadamente 40 a 60, aproximadamente 40 a 55, aproximadamente 40 a 50, aproximadamente 40 a 45, aproximadamente 45 a 100, aproximadamente 45 a 95, aproximadamente 45 a 90, aproximadamente 45 a 85, aproximadamente 45 a 80, aproximadamente 45 a 75, aproximadamente 45 a 70, aproximadamente 45 a 65, aproximadamente 45 a 60, aproximadamente 45 a 55, aproximadamente 45 a 50, aproximadamente 50 a 100, aproximadamente 50 a 95, aproximadamente 50 a 90, aproximadamente 50 a 85, aproximadamente 50 a 80, aproximadamente 50 a 75, aproximadamente 50 a 70, aproximadamente 50 a 65, aproximadamente 50 a 60, aproximadamente 50 a 55, aproximadamente 55 a 100, aproximadamente 55 a 95, aproximadamente 55 a 90, aproximadamente 55 a 85, aproximadamente 55 a 80, aproximadamente 55 a 75, aproximadamente 55 a 70, aproximadamente 55 a 65, aproximadamente 55 a 60, aproximadamente 60 a 100, aproximadamente 60 a 95, aproximadamente 60 a 90, aproximadamente 60 a 85, aproximadamente 60 a 80, aproximadamente 60 a 75, aproximadamente 60 a 70, aproximadamente 60 a 65, aproximadamente 65 a 100, aproximadamente 65 a 95, aproximadamente 65 a 90, aproximadamente 65 a 85, aproximadamente 65 a 80, aproximadamente 65 a 75, aproximadamente 65 a 70, aproximadamente 70 a 100, aproximadamente 70 a 95, aproximadamente 70 a 90, aproximadamente 70 a 85, aproximadamente 70 a 80, aproximadamente 70 a 75, aproximadamente 75 a 100, aproximadamente 75 a 95, aproximadamente 75 a 90, aproximadamente 75 a 85, aproximadamente 75 a 80, aproximadamente 80 a 100, aproximadamente 80 a 95, aproximadamente 80 a 90, aproximadamente 80 a 85, aproximadamente 85 a 100, aproximadamente 85 a 95, aproximadamente 85 a 90, aproximadamente 90 a 100, aproximadamente 90 a 95, o 95 a 100 semanas.
[0405] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación son estables en almacenamiento a temperaturas de refrigeración (35-40 °F), a temperatura ambiente (68-72 °F), entre 50-77 °F, entre -23-35 °F, entre 70-100 °F, o entre 101-213 °F durante un período de 1 a 100, 1 a 95, 1 a 90, 1 a 85, 1 a 80, 1 a 75, 1 a 70, 1 a 65, 1 a 60, 1 a 55, 1 a 50, 1 a 45, 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 5 a 100, 5 a 95, 5 a 90, 5 a 85, 5 a 80, 5 a 75, 5 a 70, 5 a 65, 5 a 60, 5 a 55, 5 a 50, 5 a 45, 5 a 40, 5 a 35, 5 a 30, 5 a 25, 5 a 20, 5 a 15, 5 a 10, 10 a 100, 10 a 95, 10 a 90, 10 a 85, 10 a 80, 10 a 75, 10 a 70, 10 a 65, 10 a 60, 10 a 55, 10 a 50, 10 a 45, 10 a 40, 10 a 35, 10 a 30, 10 a 25, 10 a 20, 10 a 15, 15 a 100, 15 a 95, 15 a 90, 15 a 85, 15 a 80, 15 a 75, 15 a 70, 15 a 65, 15 a 60, 15 a 55, 15 a 50, 15 a 45, 15 a 40, 15 a 35, 15 a 30, 15 a 25, 15 a 20, 20 a 100, 20 a 95, 20 a 90, 20 a 85, 20 a 80, 20 a 75, 20 a 70, 20 a 65, 20 a 60, 20 a 55, 20 a 50, 20 a 45, 20 a 40, 20 a 35, 20 a 30, 20 a 25, 25 a 100, 25 a 95, 25 a 90, 25 a 85, 25 a 80, 25 a 75, 25 a 70, 25 a 65, 25 a 60, 25 a 55, 25 a 50, 25 a 45, 25 a 40, 25 a 35, 25 a 30, 30 a 100, 30 a 95, 30 a 90, 30 a 85, 30 a 80, 30 a 75, 30 a 70, 30 a 65, 30 a 60, 30 a 55, 30 a 50, 30 a 45, 30 a 40, 30 a 35, 35 a 100, 35 a 95, 35 a 90, 35 a 85, 35 a 80, 35 a 75, 35 a 70, 35 a 65, 35 a 60, 35 a 55, 35 a 50, 35 a 45, 35 a 40, 40 a 100, 40 a 95, 40 a 90, 40 a 85, 40 a 80, 40 a 75, 40 a 70, 40 a 65, 40 a 60, 40 a 55, 40 a 50, 40 a 45, 45 a 100, 45 a 95, 45 a 90, 45 a 85, 45 a 80, 45 a 75, 45 a 70, 45 a 65, 45 a 60, 45 a 55, 45 a 50, 50 a 100, 50 a 95, 50 a 90, 50 a 85, 50 a 80, 50 a 75, 50 a 70, 50 a 65, 50 a 60, 50 a 55, 55 a 100, 55 a 95, 55 a 90, 55 a 85, 55 a 80, 55 a 75, 55 a 70, 55 a 65, 55 a 60, 60 a 100, 60 a 95, 60 a 90, 60 a 85, 60 a 80, 60 a 75, 60 a 70, 60 a 65, 65 a 100, 65 a 95, 65 a 90, 65 a 85, 65 a 80, 65 a 75, 65 a 70, 70 a 100, 70 a 95, 70 a 90, 70 a 85, 70 a 80, 70 a 75, 75 a 100, 75 a 95, 75 a 90, 75 a 85, 75 a 80, 80 a 100, 80 a 95, 80 a 90, 80 a 85, 85 a 100, 85 a 95, 85 a 90, 90 a 100, 90 a 95 o 95 a 100 semanas.
[0407] En algunas realizaciones, las temperaturas de refrigeración (35-40 °F), a temperatura ambiente (68-72 °F), entre 50-77 °F, entre -23-35 °F, entre 70-100 °F, o entre 101-213 °F durante un periodo de aproximadamente 1 a 36, aproximadamente 1 a 34, aproximadamente 1 a 32, aproximadamente 1 a 30, aproximadamente 1 a 28, aproximadamente 1 a 26, aproximadamente 1 a 24, aproximadamente 1 a 22, aproximadamente 1 a 20, aproximadamente 1 a 18, aproximadamente 1 a 16, aproximadamente 1 a 14, aproximadamente 1 a 12, aproximadamente 1 a 10, aproximadamente 1 a 8, aproximadamente 1 a 6, aproximadamente 1 a 4, aproximadamente 1 a 2, aproximadamente 4 a 36, aproximadamente 4 a 34, aproximadamente 4 a 32, aproximadamente 4 a 30, aproximadamente 4 a 28, aproximadamente 4 a 26, aproximadamente 4 a 24, aproximadamente 4 a 22, aproximadamente 4 a 20, aproximadamente 4 a 18, aproximadamente 4 a 16, aproximadamente 4 a 14, aproximadamente 4 a 12, aproximadamente 4 a 10, aproximadamente 4 a 8, aproximadamente 4 a 6, aproximadamente 6 a 36, aproximadamente 6 a 34, aproximadamente 6 a 32, aproximadamente 6 a 30, aproximadamente 6 a 28, aproximadamente 6 a 26, aproximadamente 6 a 24, aproximadamente 6 a 22, aproximadamente 6 a 20, aproximadamente 6 a 18, aproximadamente 6 a 16, aproximadamente 6 a 14, aproximadamente 6 a 12, aproximadamente 6 a 10, aproximadamente 6 a 8, aproximadamente 8 a 36, aproximadamente 8 a 34, aproximadamente 8 a 32, aproximadamente 8 a 30, aproximadamente 8 a 28, aproximadamente 8 a 26, aproximadamente 8 a 24, aproximadamente 8 a 22, aproximadamente 8 a 20, aproximadamente 8 a 18, aproximadamente 8 a 16, aproximadamente 8 a 14, aproximadamente 8 a 12, aproximadamente 8 a 10, aproximadamente 10 a 36, aproximadamente 10 a 34, aproximadamente 10 a 32, aproximadamente 10 a 30, aproximadamente 10 a 28, aproximadamente 10 a 26, aproximadamente 10 a 24, aproximadamente 10 a 22, aproximadamente 10 a 20, aproximadamente 10 a 18, aproximadamente 10 a 16, aproximadamente 10 a 14, aproximadamente 10 a 12, aproximadamente 12 a 36, aproximadamente 12 a 34, aproximadamente 12 a 32, aproximadamente 12 a 30, aproximadamente 12 a 28, aproximadamente 12 a 26, aproximadamente 12 a 24, aproximadamente 12 a 22, aproximadamente 12 a 20, aproximadamente 12 a 18, aproximadamente 12 a 16, aproximadamente 12 a 14, aproximadamente 14 a 36, aproximadamente 14 a 34, aproximadamente 14 a 32, aproximadamente 14 a 30, aproximadamente 14 a 28, aproximadamente 14 a 26, aproximadamente 14 a 24, aproximadamente 14 a 22, aproximadamente 14 a 20, aproximadamente 14 a 18, aproximadamente 14 a 16, aproximadamente 16 a 36, aproximadamente 16 a 34, aproximadamente 16 a 32, aproximadamente 16 a 30, aproximadamente 16 a 28, aproximadamente 16 a 26, aproximadamente 16 a 24, aproximadamente 16 a 22, aproximadamente 16 a 20, aproximadamente 16 a 18, aproximadamente 18 a 36, aproximadamente 18 a 34, aproximadamente 18 a 32, aproximadamente 18 a 30, aproximadamente 18 a 28, aproximadamente 18 a 26, aproximadamente 18 a 24, aproximadamente 18 a 22, aproximadamente 18 a 20, aproximadamente 20 a 36, aproximadamente 20 a 34, aproximadamente 20 a 32, aproximadamente 20 a 30, aproximadamente 20 a 28, aproximadamente 20 a 26, aproximadamente 20 a 24, aproximadamente 20 a 22, aproximadamente 22 a 36, aproximadamente 22 a 34, aproximadamente 22 a 32, aproximadamente 22 a 30, aproximadamente 22 a 28, aproximadamente 22 a 26, aproximadamente 22 a 24, aproximadamente 24 a 36, aproximadamente 24 a 34, aproximadamente 24 a 32, aproximadamente 24 a 30, aproximadamente 24 a 28, aproximadamente 24 a 26, aproximadamente 26 a 36, aproximadamente 26 a 34, aproximadamente 26 a 32, aproximadamente 26 a 30, aproximadamente 26 a 28, aproximadamente 28 a 36, aproximadamente 28 a 34, aproximadamente 28 a 32, aproximadamente 28 a 30, aproximadamente 30 a 36, aproximadamente 30 a 34, aproximadamente 30 a 32, aproximadamente 32 a 36, aproximadamente 32 a 34, o aproximadamente 34 a 36 meses.
[0409] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación son estables en anaquel a temperaturas de refrigeración (35-40 °F), a temperatura ambiente (68-72 °F), entre 50-77 °F, entre -23-35 °F, entre 70-100 °F, o entre 101-213 °F durante un período de 1 a 361 a 341 a 321 a 301 a 281 a 261 a 241 a 221 a 20 1 a 181 a 161 a 141 a 121 a 101 a 81 a 61 a 41 a 24 a 364 a 344 a 324 a 304 a 284 a 264 a 244 a 224 a 204 a 184 a 164 a 144 a 124 a 104 a 84 a 66 a 366 a 346 a 326 a 306 a 286 a 266 a 246 a 226 a 206 a 186 a 166 a 146 a 126 a 106 a 88 a 368 a 348 a 328 a 308 a 288 a 268 a 248 a 228 a 208 a 188 a 168 a 148 a 128 a 1010 a 3610 a 3410 a 3210 a 3010 a 2810 a 2610 a 2410 a 2210 a 2010 a 1810 a 1610 a 14 10 a 1212 a 3612 a 3412 a 3212 a 3012 a 2812 a 2612 a 2412 a 2212 a 2012 a 1812 a 1612 a 1414 a 36 14 a 3414 a 3214 a 3014 a 2814 a 2614 a 2414 a 2214 a 2014 a 1814 a 1616 a 3616 a 3416 a 3216 a 30 16 a 2816 a 2616 a 2416 a 2216 a 2016 a 1818 a 3618 a 3418 a 3218 a 3018 a 2818 a 2618 a 2418 a 22 18 a 2020 a 3620 a 3420 a 3220 a 3020 a 2820 a 2620 a 2420 a 2222 a 3622 a 3422 a 3222 a 3022 a 28 22 a 2622 a 2424 a 3624 a 3424 a 3224 a 3024 a 2824 a 2626 a 3626 a 3426 a 3226 a 3026 a 2828 a 36 28 a 3428 a 3228 a 3030 a 3630 a 3430 a 3232 a 3632 a 34, o aproximadamente 34 a 36.
[0411] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación son estables en anaquel a cualquiera de las temperaturas y/o intervalos de temperatura y periodos de tiempo divulgados a una humedad relativa de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, o 98%
[0412] Composiciones de encapsulación
[0413] En algunas realizaciones, los microbios o las composiciones microbianas de la divulgación están encapsulados en una composición encapsulante. Una composición encapsulante protege a los microbios de factores de estrés externos antes de entrar en el tubo gastrointestinal de los ungulados. Las composiciones de encapsulación crean además un entorno que puede ser beneficioso para los microbios, como minimizar el estrés oxidativo de un entorno aerobio en los microbios aerobios. Véase Kalsta et al. (documento de patente US 5.104.662A), Ford (documento de patente US 5.733.568A) y Mosbach y Nilsson (documento de patente US 4.647.536A) para composiciones de encapsulación de microbios y métodos de encapsulación de microbios.
[0414] En una realización, la composición de encapsulación comprende microcápsulas que tienen una multiplicidad de núcleos líquidos encapsulados en un material de cubierta sólida. A los efectos de la divulgación, se define una «multiplicidad» de núcleos como dos o más.
[0415] Una primera categoría de materiales de cubierta fusibles útiles es la de las grasas normalmente sólidas, incluidas las grasas que ya tienen una dureza adecuada y las grasas y aceites animales o vegetales que se hidrogenan hasta que sus puntos de fusión son lo suficientemente altos como para servir a los fines de la presente divulgación. Dependiendo de las temperaturas de proceso y almacenamiento deseadas y del material específico seleccionado, una grasa concreta puede ser un material normalmente sólido o normalmente líquido. Los términos «normalmente sólido» y «normalmente líquido», como se usan en el presente documento, se refieren al estado de un material a las temperaturas deseadas para almacenar las microcápsulas resultantes. Dado que las grasas y los aceites hidrogenados, en sentido estricto, no tienen puntos de fusión, el término «punto de fusión» se usa en el presente documento para describir la temperatura mínima a la que el material fusible se ablanda o se vuelve lo suficientemente líquido como para ser emulsionado y enfriado por pulverización con éxito, lo que corresponde aproximadamente a la temperatura máxima a la que el material de la cubierta tiene suficiente integridad para impedir la liberación de los núcleos de colina. El «punto de fusión» se define de manera similar en el presente documento para otros materiales que no tienen un punto de fusión definido.
[0416] Ejemplos específicos de grasas y aceites útiles en el presente documento (algunos de los cuales requieren endurecimiento) son los siguientes: aceites y grasas animales, como sebo de vacuno, sebo de cordero, sebo de oveja, manteca de cerdo o grasa de cerdo, aceite de pescado y aceite de ballena; aceites vegetales, como aceite de canola, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cártamo, aceite de coco, aceite de palma, aceite de linaza, aceite de tung y aceite de ricino; monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos; ácidos grasos libres, como ácido esteárico, ácido palmítico y ácido oleico; y mezclas de los mismos. El listado anterior de aceites y grasas no pretende ser exhaustivo, sino solo a modo de ejemplo.
[0417] Ejemplos específicos de ácidos grasos incluyen ácido linoleico, ácido γ-linoleico, ácido dihomo-γ-linolénico, ácido araquidónico, ácido docosatetraenoico, ácido vaccénico, ácido nervónico, ácido meadico, ácido erúcico, ácido gondoico, ácido elaídico, ácido oleico, ácido palitoleico, ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido valérico, ácido caproico, ácido enántico, ácido caprílico, ácido pelargónico, ácido cáprico, ácido undecílico, ácido láurico, ácido tridecílico, ácido mirístico, ácido pentadecílico, ácido palmítico, ácido margárico, ácido esteárico, ácido nonadecílico, ácido araquídico, ácido heneicosílico, ácido behénico, ácido tricosílico, ácido lignocérico, ácido pentacosílico, ácido cerótico, ácido heptacosílico, ácido montánico, ácido nonacosílico, ácido melísico, ácido henatriacontílico, ácido laceroico, ácido psílico, ácido geddico, ácido ceroplástico, ácido hexatriacontílico, ácido heptatriacontanoico y ácido octatriacontanoico.
[0418] Otra categoría de materiales fusibles útiles como materiales de recubrimiento de encapsulación es la de las ceras. Las ceras representativas contempladas para su uso en el presente documento son las siguientes: ceras animales, como cera de abejas, lanolina, cera de concha y cera de insectos china; ceras vegetales, como carnauba, candelilla, árbol de la cera y caña de azúcar; ceras minerales, como parafina, petróleo microcristalino, ozocerita, ceresina y montana; ceras sintéticas, como poliolefinas de bajo peso molecular (por ejemplo, CARBOWAX) y éterésteres de poliol (por ejemplo, sorbitol); ceras sintéticas del proceso Fischer-Tropsch; y mezclas de las mismas. Las ceras solubles en agua, como CARBOWAX y sorbitol, no se contemplan en el presente documento si el núcleo es acuoso.
[0419] Otros compuestos fusibles útiles en el presente documento son las resinas naturales fusibles, como la colofonia, el bálsamo, la goma laca y mezclas de las mismas.
[0420] Se contemplan diversos materiales adyuvantes para su incorporación en materiales fusibles según la presente divulgación. Por ejemplo, antioxidantes, estabilizadores de la luz, colorantes y lacas, aromatizantes, aceites esenciales, agentes antiaglomerantes, rellenos, estabilizadores de pH, azúcares (monosacáridos, disacáridos, trisacáridos y polisacáridos) y similares pueden incorporarse al material fusible en cantidades que no disminuyan su utilidad para la presente divulgación.
[0422] El material del núcleo contemplado en el presente documento constituye de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 35 %, o aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 30 % en peso de las microcápsulas. En algunas realizaciones, el material del núcleo contemplado en el presente documento constituye no más del 30 % en peso de las microcápsulas. En algunas realizaciones, el material del núcleo contemplado en el presente documento constituye aproximadamente el 5 % en peso de las microcápsulas. El material del núcleo se contempla como líquido o sólido a las temperaturas de almacenamiento contempladas de las microcápsulas.
[0424] Los núcleos pueden incluir otros aditivos bien conocidos en el campo farmacéutico, incluyendo azúcares comestibles, tales como sacarosa, glucosa, maltosa, fructosa, lactosa, celobiosa, monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, polisacáridos y mezclas de los mismos; edulcorantes artificiales, tales como aspartamo, sacarina, sales de ciclamato y mezclas de los mismos; ácidos comestibles, tales como ácido acético (vinagre), ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido tartárico y mezclas de los mismos; almidones comestibles, tales como almidón de maíz; proteína vegetal hidrolizada; vitaminas hidrosolubles, tales como vitamina C; medicamentos hidrosolubles; materiales nutricionales hidrosolubles, tales como sulfato ferroso; aromatizantes; sales; glutamato monosódico; agentes antimicrobianos, tales como ácido sórbico; agentes antimicóticos, tales como sorbato de potasio, ácido sórbico, benzoato de sodio y ácido benzoico; pigmentos y colorantes de grado alimenticio; y mezclas de los mismos. Otros materiales complementarios potencialmente útiles serán evidentes para los expertos en la materia.
[0425] Se pueden emplear agentes emulsionantes para ayudar a la formación de emulsiones estables. Los agentes emulsionantes representativos incluyen monoestearato de glicerilo, ésteres de polisorbato, mono y diglicéridos etoxilados y mezclas de los mismos.
[0427] Para facilitar el procesamiento y, en particular, para permitir la formación satisfactoria de una emulsión razonablemente estable, las viscosidades del material del núcleo y del material de la cubierta deben ser similares a la temperatura a la que se forma la emulsión. En particular, la relación entre la viscosidad de la cubierta y la viscosidad del núcleo, expresada en centipoises o unidades comparables, y ambas medidas a la temperatura de la emulsión, debe ser de aproximadamente 22:1 a aproximadamente 1:1, deseablemente de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 1:1, y preferiblemente de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1. Una relación de 1:1 sería ideal, pero cualquier relación de viscosidad dentro de los intervalos indicados es útil.
[0429] Las composiciones de encapsulación no se limitan a las composiciones de microcápsulas divulgadas anteriormente. En algunas realizaciones, las composiciones de encapsulación encapsulan las composiciones microbianas en un polímero adhesivo que puede ser natural o sintético sin efecto tóxico. En algunas realizaciones, la composición de encapsulación puede ser una matriz seleccionada de matriz de azúcar, matriz de gelatina, matriz de polímero, matriz de sílice, matriz de almidón, matriz de espuma, etc. En algunas realizaciones, la composición de encapsulación puede seleccionarse de poli(acetatos de vinilo); copolímeros de poli(acetato de vinilo); copolímeros de etileno y acetato de vinilo (EVA); alcoholes polivinílicos; copolímeros de alcohol polivinílico; celulosas, incluyendo etilcelulosas, metilcelulosas, hidroximetilcelulosas, hidroxipropilcelulosas y carboximetilcelulosa; polivinilpirrolidonas; polisacáridos, incluyendo almidón, almidón modificado, dextrinas, maltodextrinas, alginato y quitosanos; monosacáridos; grasas; ácidos grasos, incluyendo aceites; proteínas, incluyendo gelatina y zeínas; goma arábiga; goma laca; cloruro de vinilideno y copolímeros de cloruro de vinilideno; lignosulfonatos de calcio; copolímeros acrílicos; poli(acrilatos de vinilo); poli(óxido de etileno); polímeros y copolímeros de acrilamida; acrilato de polihidroxietilo, monómeros de metilacrilamida; y policloropreno.
[0431] En algunas realizaciones, la cubierta de encapsulación de la presente divulgación puede ser de hasta 10µm, 20µm, 30µm, 40µm, 50µm, 60µm, 70µm, 80µm, 90µm, 100µm, 110µm, 120µm, 130µm, 140µm, 150µm, 160µm, 170µm, 180µm, 190µm, 200µm, 210µm, 220µm, 230µm, 240µm, 250µm, 260µm, 270µm, 280µm, 290µm, 300µm, 310µm, 320µm, 330µm, 340µm, 350µm, 360µm, 370µm, 380µm, 390µm, 400µm, 410µm, 420µm, 430µm, 440µm, 450µm, 460µm, 470µm, 480µm, 490µm, 500µm, 510µm, 520µm, 530µm, 540µm, 550µm, 560µm, 570µm, 580µm, 590µm, 600µm, 610µm, 620µm, 630µm, 640µm, 650µm, 660µm, 670µm, 680µm, 690µm, 700µm, 710µm, 720µm, 730µm, 740µm, 750µm, 760µm, 770µm, 780µm, 790µm, 800µm, 810µm, 820µm, 830µm, 840µm, 850µm, 860µm, 870µm, 880µm, 890µm, 900µm, 910µm, 920µm, 930µm, 940µm, 950µm, 960µm, 970µm, 980µm, 990µm, 1000µm, 1010µm, 1020µm, 1030µm, 1040µm, 1050µm, 1060µm, 1070µm, 1080µm, 1090µm, 1100µm, 1110µm, 1120µm, 1130µm, 1140µm, 1150µm, 1160µm, 1170µm, 1180µm, 1190µm, 1200µm, 1210µm, 1220µm, 1230µm, 1240µm, 1250µm, 1260µm, 1270µm, 1280µm, 1290µm, 1300µm, 1310µm, 1320µm, 1330µm, 1340µm, 1350µm, 1360µm, 1370µm, 1380µm, 1390µm, 1400µm, 1410µm, 1420µm, 1430µm, 1440µm, 1450µm, 1460µm, 1470µm, 1480µm, 1490µm, 1500µm, 1510µm, 1520µm, 1530µm, 1540µm, 1550µm, 1560µm, 1570µm, 1580µm, 1590µm, 1600µm, 1610µm, 1620µm, 1630µm, 1640µm, 1650µm, 1660µm, 1670µm, 1680µm, 1690µm, 1700µm, 1710µm, 1720µm, 1730µm, 1740µm, 1750µm, 1760µm, 1770µm, 1780µm, 1790µm, 1800µm, 1810µm, 1820µm, 1830µm, 1840µm, 1850µm, 1860µm, 1870µm, 1880µm, 1890µm, 1900µm, 1910µm, 1920µm, 1930µm, 1940µm, 1950µm, 1960µm, 1970µm, 1980µm, 1990µm, 2000µm, 2010µm, 2020µm, 2030µm, 2040µm, 2050µm, 2060µm, 2070µm, 2080µm, 2090µm, 2100µm, 2110µm, 2120µm, 2130µm, 2140µm, 2150µm, 2160µm, 2170µm, 2180µm, 2190µm, 2200µm, 2210µm, 2220µm, 2230µm, 2240µm, 2250µm, 2260µm, 2270µm, 2280µm, 2290µm, 2300µm, 2310µm, 2320µm, 2330µm, 2340µm, 2350µm, 2360µm, 2370µm, 2380µm, 2390µm, 2400µm, 2410µm, 2420µm, 2430µm, 2440µm, 2450µm, 2460µm, 2470µm, 2480µm, 2490µm, 2500µm, 2510µm, 2520µm, 2530µm, 2540µm, 2550µm, 2560µm, 2570µm, 2580µm, 2590µm, 2600µm, 2610µm, 2620µm, 2630µm, 2640µm, 2650µm, 2660µm, 2670µm, 2680µm, 2690µm, 2700µm, 2710µm, 2720µm, 2730µm, 2740µm, 2750µm, 2760µm, 2770µm, 2780µm, 2790µm, 2800µm, 2810µm, 2820µm, 2830µm, 2840µm, 2850µm, 2860µm, 2870µm, 2880µm, 2890µm, 2900µm, 2910µm, 2920µm, 2930µm, 2940µm, 2950µm, 2960µm, 2970µm, 2980µm, 2990µm, o 3000µm de espesor.
[0432] Pienso para animales
[0433] En algunas realizaciones, las composiciones de la presente divulgación se mezclan con pienso para animales. En algunas realizaciones, el pienso para animales puede presentarse en diversas formas, tales como gránulos, cápsulas, granulados, en polvo, líquidos o semilíquidos.
[0434] En algunas realizaciones, las composiciones de la presente divulgación se mezclan en la premezcla en la fábrica de piensos (por ejemplo, Carghill o Western Millin), solas como premezcla independiente, y/o junto con otros aditivos para piensos tales como MONENSINA, vitaminas, etc. En una realización, las composiciones de la presente divulgación se mezclan con el pienso en la fábrica de piensos. En otra realización, las composiciones de la presente divulgación se mezclan con el propio pienso.
[0435] En algunas realizaciones, el pienso de la presente divulgación puede complementarse con agua, premezcla o premezclas, forraje, pienso, alubias (por ejemplo, enteras, partidas o molidas), granos (por ejemplo, enteros, partidos o molidos), aceites a base de alubias o cereales, harinas a base de alubias o cereales, heno o ensilado a base de alubias o cereales, jarabes a base de alubias o cereales, ácidos grasos, alcoholes de azúcar (por ejemplo, alcoholes polihidroxilados), piensos formulados disponibles en el mercado y mezclas de los mismos.
[0436] En algunas realizaciones, el forraje abarca heno, henolaje y ensilaje. En algunas realizaciones, los henos incluyen henos de hierba (por ejemplo, pasto sudán, pasto de huerto o similares), heno de alfalfa y heno de trébol. En algunas realizaciones, los henolajes incluyen henolajes de hierba, henolaje de sorgo y henolaje de alfalfa. En algunas realizaciones, los ensilajes incluyen maíz, avena, trigo, alfalfa, trébol y similares.
[0437] En algunas realizaciones, se pueden utilizar premezcla o premezclas en el pienso. Las premezclas pueden comprender microingredientes tales como vitaminas, minerales, aminoácidos; conservantes químicos; composiciones farmacéuticas tales como antibióticos y otros medicamentos; productos de fermentación y otros ingredientes. En algunas realizaciones, las premezclas se mezclan con el pienso.
[0438] En algunas realizaciones, el pienso puede incluir concentrados de pienso tales como cáscaras de soja, pulpa de remolacha azucarera, melaza, harina de soja con alto contenido en proteínas, maíz molido, maíz descascarillado, salvado de trigo, grano de destilería, cáscaras de semillas de algodón, proteína que no se digiere en el rumen, grasa que no se digiere en el rumen y grasa. Véase Luhman (publicación de EE. UU. US20150216817A1), Anderson et al. (patente de EE. UU.3.484.243) y Porter y Luhman (patente de EE. UU.9.179.694B2) para piensos y suplementos alimenticios para animales que pueden usarse en las presentes composiciones y métodos.
[0439] En algunas realizaciones, el pienso se presenta como un compuesto que incluye, en una composición mixta capaz de satisfacer las necesidades dietéticas básicas, el pienso en sí, vitaminas, minerales, aminoácidos y otros componentes necesarios. El pienso compuesto puede comprender además premezclas.
[0440] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación pueden mezclarse con piensos para animales, premezclas y/o piensos compuestos. Los componentes individuales del pienso para animales pueden mezclarse con las composiciones microbianas antes de alimentar a los rumiantes. Las composiciones microbianas de la presente divulgación pueden aplicarse en o sobre una premezcla, en o sobre un pienso, y/o en o sobre un pienso compuesto.
[0441] Administración de composiciones microbianas
[0442] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación se administran a rumiantes por vía oral. En algunas realizaciones, las composiciones microbianas se administran por vía de inyección directa en el tubo gastrointestinal. En otras realizaciones, la administración por inyección directa administra las composiciones microbianas directamente al rumen. En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación se administran a los animales por vía anal. En otras realizaciones, la administración anal se realiza en forma de supositorio insertado.
[0443] En algunas realizaciones, la composición microbiana se administra en una dosis que comprende un total de, o al menos, 1ml, 2ml, 3ml, 4ml, 5ml, 6ml, 7ml, 8ml, 9ml, 10ml, 11ml, 12ml, 13ml, 14ml, 15ml, 16ml, 17ml, 18ml, 19ml, 20ml, 21ml, 22ml, 23ml, 24ml, 25ml, 26ml, 27ml, 28ml, 29ml, 30ml, 31ml, 32ml, 33ml, 34ml, 35ml, 36ml, 37ml, 38ml, 39ml, 40ml, 41m, 42ml, 43ml, 44ml, 45ml, 46ml, 47ml, 48ml, 49ml, 50ml, 60ml, 70ml, 80ml, 90ml, 100ml, 200ml, 300ml, 400ml, 500ml, 600ml, 700ml, 800ml, 900ml, o 1,000ml.
[0444] En algunas realizaciones, la composición microbiana se administra en una dosis que comprende un total de, o al menos, 10<18>, 10<17>, 10<16>, 10<15>, 10<14>, 10<13>, 10<12>, 10<11>, 10<10>, 10<9>, 10<8>, 10<7>, 10<6>, 10<5>, 10<4>, 10<3>, o 10<2>células microbianas. En algunas realizaciones, las composiciones microbianas se mezclan con el pienso, y la administración se produce mediante la ingestión de las composiciones microbianas junto con el pienso. En algunas realizaciones, la dosis de la composición microbiana se administra de manera que existan 10<2>a 10<12>, 10<3>a 10<12>, 10<4>a 10<12>, 10<5>a 10<12>, 10<6>a 10<12>, 10<7>a 10<12>, 10<8>a 10<12>, 10<9>a 10<12>, 10<10>a 10<12>, 10<11>a 10<12>, 10<2>a 10<11>, 10<3>a 10<11>, 10<4>a 10<11>, 10<5>a 10<11>, 10<6>a 10<11>, 10<7>a 10<11>, 10<8>a 10<11>, 10<9>a 10<11>, 10<10>a 10<11>, 10<2>a 10<10>, 10<3>a 10<10>, 10<4>a 10<10>, 10<5>a 10<10>, 10<6>a 10<10>, 10<7>a 10<10>, 10<8>a 10<10>, 10<9>a 10<10>, 10<2>a 10<9>, 10<3>a 10<9>, 10<4>a 10<9>, 10<5>a 10<9>, 10<6>a 10<9>, 10<7>a 10<9>, 10<8>a 10<9>, 10<2>a 10<8>, 10<3>a 10<8>, 10<4>a 10<8>, 10<5>a 10<8>, 10<6>a 10<8>, 10<7>a 10<8>, 10<2>a 10<7>, 10<3>a 10<7>, 10<4>a 10<7>, 10<5>a 10<7>, 10<6>a 10<7>, 10<2>a 10<6>, 10<3>a 10<6>, 10<4>a 10<6>, 10<5>a 10<6>, 10<2>a 10<5>, 10<3>a 10<5>, 10<4>a 10<5>, 10<2>a 10<4>, 10<3>a 10<4>, 10<2>a 10<3>, 10<12>, 10<11>, 10<10>, 10<9>, 10<8>, 10<7>, 10<6>, 10<5>, 10<4>, 10<3>o 10<2>células microbianas totales por gramo o mililitro de la composición.
[0445] En algunas realizaciones, la dosis administrada de la composición microbiana comprende 10<2>a 10<18>, 10<3>a 10<18>, 10<4>a 10<18>, 10<5>a 10<18>, 10<6>a 10<18>, 10<7>a 10<18>, 10<8>a 10<11>, 10<9>a 10<18>, 10<10>a 10<11>, 10<11>a 10<11>, 10<12>a 10<11>, 10<13>a 10<11>, 10<14>a 10<18>, 10<15>a 10<11>, 10<16>a 10<18>, 10<17>a 10<11>, 10<2>a 10<12>, 10<3>a 10<12>, 10<4>a 10<12>, 10<5>a 10<12>, 10<6>a 10<12>, 10<7>a 10<12>, 10<8>a 10<12>, 10<9>a 10<12>, 10<10>a 10<12>, 10<11>a 10<12>, 10<2>a 10<11>, 10<3>a 10<11>, 10<4>a 10<11>, 10<5>a 10<11>, 10<6>a 10<11>, 10<7>a 10<11>, 10<8>a 10<11>, 10<9>a 10<11>, 10<10>a 10<11>, 10<2>a 10<10>, 10<3>a 10<10>, 10<4>a 10<10>, 10<5>a 10<10>, 10<6>a 10<10>, 10<7>a 10<10>, 10<8>a 10<10>, 10<9>a 10<10>, 10<2>a 10<9>, 10<3>a 10<9>, 10<4>a 10<9>, 10<5>a 10<9>, 10<6>a 10<9>, 10<7>a 10<9>, 10<8>a 10<9>, 10<2>a 10<8>, 10<3>a 10<8>, 10<4>a 10<8>, 10<5>a 10<8>, 10<6>a 10<8>, 10<7>a 10<8>, 10<2>a 10<7>, 10<3>a 10<7>, 10<4>a 10<7>, 10<5>a 10<7>, 10<6>a 10<7>, 10<2>a 10<6>, 10<3>a 10<6>, 10<4>a 10<6>, 10<5>a 10<6>,10<2>a 10<5>, 10<3>a 10<5>, 10<4>a 10<5>, 10<2>a 10<4>, 10<3>a 10<4>, 10<2>a 10<3>, 10<18>, 10<17>, 10<16>, 10<15>, 10<14>, 10<13>, 10<12>, 10<11>, 10<10>, 10<9>, 10<8>, 10<7>, 10<6>, 10<5>, 10<4>, 10<3>o 10<2>células microbianas totales.
[0446] En algunas realizaciones, la composición se administra una o más veces al día. En algunos aspectos, la composición se administra con la comida cada vez que se alimenta al animal. En algunas realizaciones, la composición se administra 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, 2 a 3, 3 a 10, 3 a 9, 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6, 3 a 5, 3 a 4, 4 a 10, 4 a 9, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 4 a 5, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, 5 a 7, 5 a 6, 6 a 10, 6 a 9, 6 a 8, 6 a 7, 7 a 10, 7 a 9, 7 a 8, 8 a 10, 8 a 9, 9 a 10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces al día.
[0447] En algunas realizaciones, la composición microbiana se administra 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, 2 a 3, 3 a 10, 3 a 9, 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6, 3 a 5, 3 a 4, 4 a 10, 4 a 9, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 4 a 5, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, 5 a 7, 5 a 6, 6 a 10, 6 a 9, 6 a 8, 6 a 7, 7 a 10, 7 a 9, 7 a 8, 8 a 10, 8 a 9, 9 a 10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces por semana.
[0448] En algunas realizaciones, la composición microbiana se administra 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, 2 a 3, 3 a 10, 3 a 9, 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6, 3 a 5, 3 a 4, 4 a 10, 4 a 9, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 4 a 5, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, 5 a 7, 5 a 6, 6 a 10, 6 a 9, 6 a 8, 6 a 7, 7 a 10, 7 a 9, 7 a 8, 8 a 10, 8 a 9, 9 a 10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces al mes.
[0449] En algunas realizaciones, la composición se administra 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, 2 a 3, 3 a 10, 3 a 9, 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6, 3 a 5, 3 a 4, 4 a 10, 4 a 9, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 4 a 5, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, 5 a 7, 5 a 6, 6 a 10, 6 a 9, 6 a 8, 6 a 7, 7 a 10, 7 a 9, 7 a 8, 8 a 10, 8 a 9, 9 a 10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces al año.
[0450] En algunas realizaciones, el pienso puede recubrirse uniformemente con una o más capas de los microbios y/o composiciones microbianas divulgados en el presente documento, usando métodos convencionales de mezcla, pulverización o una combinación de ambos mediante el uso de equipos de aplicación de tratamiento diseñados y fabricados específicamente para aplicar recubrimientos de forma precisa, segura y eficiente. Dicho equipo usa diversos tipos de tecnología de recubrimiento, como recubridores rotativos, recubridores de tambor, técnicas de lecho fluidizado, lechos surtidores, nieblas rotativas o una combinación de los mismos. Los tratamientos líquidos como los de la presente divulgación pueden aplicarse mediante un disco «atomizador» giratorio o una boquilla pulverizadora, que distribuye uniformemente la composición microbiana sobre el pienso a medida que este se mueve a través del patrón de pulverización. En algunos aspectos, el pienso se mezcla o se voltea durante un periodo de tiempo adicional para lograr una distribución y un secado adicionales del tratamiento.
[0451] En algunas realizaciones, las cubiertas de pienso de la presente divulgación puede ser de hasta 10µm, 20µm, 30µm, 40µm, 50µm, 60µm, 70µm, 80µm, 90µm, 100µm, 110µm, 120µm, 130µm, 140µm, 150µm, 160µm, 170µm, 180µm, 190µm, 200µm, 210µm, 220µm, 230µm, 240µm, 250µm, 260µm, 270µm, 280µm, 290µm, 300µm, 310µm, 320µm, 330µm, 340µm, 350µm, 360µm, 370µm, 380µm, 390µm, 400µm, 410µm, 420µm, 430µm, 440µm, 450µm, 460µm, 470µm, 480µm, 490µm, 500µm, 510µm, 520µm, 530µm, 540µm, 550µm, 560µm, 570µm, 580µm, 590µm, 600µm, 610µm, 620µm, 630µm, 640µm, 650µm, 660µm, 670µm, 680µm, 690µm, 700µm, 710µm, 720µm, 730µm, 740µm, 750µm, 760µm, 770µm, 780µm, 790µm, 800µm, 810µm, 820µm, 830µm, 840µm, 850µm, 860µm, 870µm, 880µm, 890µm, 900µm, 910µm, 920µm, 930µm, 940µm, 950µm, 960µm, 970µm, 980µm, 990µm, 1000µm, 1010µm, 1020µm, 1030µm, 1040µm, 1050µm, 1060µm, 1070µm, 1080µm, 1090µm, 1100µm, 1110µm, 1120µm, 1130µm, 1140µm, 1150µm, 1160µm, 1170µm, 1180µm, 1190µm, 1200µm, 1210µm, 1220µm, 1230µm, 1240µm, 1250µm, 1260µm, 1270µm, 1280µm, 1290µm, 1300µm, 1310µm, 1320µm, 1330µm, 1340µm, 1350µm, 1360µm, 1370µm, 1380µm, 1390µm, 1400µm, 1410µm, 1420µm, 1430µm, 1440µm, 1450µm, 1460µm, 1470µm, 1480µm, 1490µm, 1500µm, 1510µm, 1520µm, 1530µm, 1540µm, 1550µm, 1560µm, 1570µm, 1580µm, 1590µm, 1600µm, 1610µm, 1620µm, 1630µm, 1640µm, 1650µm, 1660µm, 1670µm, 1680µm, 1690µm, 1700µm, 1710µm, 1720µm, 1730µm, 1740µm, 1750µm, 1760µm, 1770µm, 1780µm, 1790µm, 1800µm, 1810µm, 1820µm, 1830µm, 1840µm, 1850µm, 1860µm, 1870µm, 1880µm, 1890µm, 1900µm, 1910µm, 1920µm, 1930µm, 1940µm, 1950µm, 1960µm, 1970µm, 1980µm, 1990µm, 2000µm, 2010µm, 2020µm, 2030µm, 2040µm, 2050µm, 2060µm, 2070µm, 2080µm, 2090µm, 2100µm, 2110µm, 2120µm, 2130µm, 2140µm, 2150µm, 2160µm, 2170µm, 2180µm, 2190µm, 2200µm, 2210µm, 2220µm, 2230µm, 2240µm, 2250µm, 2260µm, 2270µm, 2280µm, 2290µm, 2300µm, 2310µm, 2320µm, 2330µm, 2340µm, 2350µm, 2360µm, 2370µm, 2380µm, 2390µm, 2400µm, 2410µm, 2420µm, 2430µm, 2440µm, 2450µm, 2460µm, 2470µm, 2480µm, 2490µm, 2500µm, 2510µm, 2520µm, 2530µm, 2540µm, 2550µm, 2560µm, 2570µm, 2580µm, 2590µm, 2600µm, 2610µm, 2620µm, 2630µm, 2640µm, 2650µm, 2660µm, 2670µm, 2680µm, 2690µm, 2700µm, 2710µm, 2720µm, 2730µm, 2740µm, 2750µm, 2760µm, 2770µm, 2780µm, 2790µm, 2800µm, 2810µm, 2820µm, 2830µm, 2840µm, 2850µm, 2860µm, 2870µm, 2880µm, 2890µm, 2900µm, 2910µm, 2920µm, 2930µm, 2940µm, 2950µm, 2960µm, 2970µm, 2980µm, 2990µm, o 3000µm de espesor.
[0453] En algunas realizaciones, las células microbianas pueden recubrirse libremente sobre cualquier número de composiciones o pueden formularse en una composición líquida o sólida antes de recubrirse sobre una composición. Por ejemplo, una composición sólida que comprende los microorganismos puede prepararse mezclando un portador sólido con una suspensión de las esporas hasta que los portadores sólidos se impregnen con la suspensión de esporas o células. A continuación, esta mezcla puede secarse para obtener las partículas deseadas.
[0455] En otras realizaciones, se contempla que las composiciones microbianas sólidas o líquidas de la presente divulgación contengan además agentes funcionales, por ejemplo, carbón activado, minerales, vitaminas y otros agentes capaces de mejorar la calidad de los productos o una combinación de los mismos.
[0457] Los métodos de recubrimiento y las composiciones en uso de dichos métodos que son conocidos en la técnica pueden ser particularmente útiles cuando se modifican mediante la adición de una de las realizaciones de la presente divulgación. Dichos métodos de recubrimiento y aparatos para su aplicación se divulgan, por ejemplo, en: las patentes de EE. UU. n.º. 8.097.245 y 7.998.502; y las publicaciones de solicitud de patente PCT n.º WO 2008/076975, WO 2010/138522, WO 2011/094469, WO 2010/111347 y 7.998.502; y la solicitud de patente WO 2010/111565.
[0459] En algunas realizaciones, los microbios o consorcios microbianos de la presente divulgación exhiben un efecto sinérgico, en uno o más de los rasgos descritos en el presente documento, en presencia de uno o más de los microbios o consorcios que entran en contacto entre sí. El efecto sinérgico obtenido por los métodos enseñados puede cuantificarse, por ejemplo, según la fórmula de Colby (es decir, (E) = X+Y - (X*Y/100)). Véase Colby, R.S., «Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations», 1967. Weeds. Vol.15, págs.20-22. Por lo tanto, «sinérgico» pretende reflejar un resultado/parámetro/efecto que se ha incrementado en más de una cantidad aditiva.
[0461] En algunas realizaciones, los microbios o consorcios microbianos de la presente divulgación pueden administrarse mediante un bolo. En una realización, se inserta un bolo (por ejemplo, una cápsula que contiene la composición) en una pistola de bolo, y la pistola de bolo se inserta en la cavidad bucal y/o el esófago del animal, seguido de la liberación/inyección del bolo en el tubo digestivo del animal. En una realización, la pistola/aplicador de bolo es una pistola/aplicador de bolo BOVIKALC. En otra realización, la pistola/aplicador de bolo es una pistola/aplicador QUADRICAL.
[0463] En algunas realizaciones, los microbios o consorcios microbianos de la presente divulgación pueden administrarse mediante rociado. En una realización, el rociado es un rociado oral. Una administración por rociado comprende la utilización de un kit/aplicador/jeringa de rociado que inyecta/libera un líquido que comprende los microbios o consorcios microbianos en la cavidad bucal y/o el esófago del animal.
[0465] En algunas realizaciones, los microbios o consorcios microbianos de la presente divulgación pueden administrarse de forma retardada. La composición puede recubrirse con una composición química, o puede contenerse en un dispositivo mecánico o cápsula que libere los microbios o consorcios microbianos durante un periodo de tiempo en lugar de hacerlo de una sola vez. En una realización, los microbios o consorcios microbianos se administran a un animal en una cápsula de liberación prolongada. En una realización, la composición puede estar recubierta de una composición química, o puede estar contenida en un dispositivo mecánico o cápsula que libera los microbios o consorcios microbianos de una sola vez un periodo de tiempo horas después de la ingestión.
[0466] En algunas realizaciones, los microbios o consorcios microbianos se administran de forma liberada gradualmente entre 1 y 5, 1 y 10, 1 y 15, 1 y 20, 1 y 24, 1 y 25, 1 y 30, 1 y 35, 1 y 40, 1 y 45, 1 y 50, 1 y 55, 1 y 60, 1 y 65, 1 y 70, 1 y 75, 1 y 80, 1 y 85, 1 y 90, 1 y 95 o 1 y 100 horas.
[0467] En algunas realizaciones, los microbios o consorcios microbianos se administran de forma liberada gradualmente entre 1 y 2, 1 y 3, 1 y 4, 1 y 5, 1 y 6, 1 y 7, 1 y 8, 1 y 9, 1 y 10, 1 y 11, 1 y 12, 1 y 13, 1 y 14, 1 y 15, 1 y 16, 1 y 17, 1 y 18, 1 y 19, 1 y 20, 1 y 21, 1 y 22, 1 y 23, 1 y 24, 1 y 25, 1 y 26, 1 y 27, 1 y 28, 1 y 29 o 1 y 30 días.
[0468] Microorganismos
[0469] Como se usa utiliza en el presente documento, el término «microorganismo» debe interpretarse en sentido amplio. Incluye, pero no está limitado a, los dos dominios procariotas, Bacteria y Archaea, así como hongos eucariotas, protistas y virus.
[0470] A modo de ejemplo, los microorganismos pueden incluir especies de los géneros:Clostridium, Ruminococcus, Roseburia, Hydrogenoanaerobacterium, Saccharofermentans, Papillibacter, Pelotomaculum, Butyricicoccus, Tannerella, Prevotella, Butyricimonas, Piromyces, Pichia, Candida, Vrystaatia, Orpinomyces, Neocallimastix,yPhyllosticta.Los microorganismos pueden incluir además especies pertenecientes a la familia de Lachnospiraceae y al orden de Saccharomycetales. En algunas realizaciones, los microorganismos pueden incluir especies de cualquier género divulgado en el presente documento.
[0471] En ciertas realizaciones, el microorganismo no es cultivable. Esto debe entenderse en el sentido de que no se sabe si el microorganismo es cultivable o si es difícil de cultivar usando métodos conocidos por un experto en la materia.
[0472] En una realización, los microbios se obtienen de animales (por ejemplo, mamíferos, reptiles, aves y similares), suelo (por ejemplo, rizosfera), aire, agua (por ejemplo, marina, dulce, lodos de aguas residuales), sedimentos, petróleo, plantas (por ejemplo, raíces, hojas, tallos), productos agrícolas y entornos extremos (por ejemplo, drenaje ácido de minas o sistemas hidrotermales). En una realización adicional, los microbios se obtienen de entornos marinos o de agua dulce, como un océano, un río o un lago. En una realización adicional, los microbios pueden proceder de la superficie del cuerpo de agua o de cualquier profundidad del cuerpo de agua (por ejemplo, una muestra de aguas profundas).
[0473] Los microorganismos de la divulgación pueden aislarse en cultivos sustancialmente puros o mixtos. Pueden concentrarse, diluirse o proporcionarse en las concentraciones naturales en las que se encuentran en el material de origen. Por ejemplo, los microorganismos de sedimentos salinos pueden aislarse para su uso en esta divulgación suspendiendo el sedimento en agua dulce y dejando que el sedimento caiga al fondo. El agua que contiene la mayor parte de los microorganismos puede eliminarse por decantación tras un periodo adecuado de sedimentación y administrarse al tubo GI de un ungulado, o concentrarse mediante filtración o centrifugación, diluirse a una concentración adecuada y administrarse al tubo GI de un ungulado con la mayor parte de la sal eliminada. A modo de ejemplo adicional, los microorganismos de fuentes mineralizadas o tóxicas pueden tratarse de manera similar para recuperar los microbios para su aplicación al ungulado para minimizar así el potencial de daño al animal.
[0474] En otra realización, los microorganismos se usan en forma bruta, en la que no se aíslan del material de origen en el que residen naturalmente. Por ejemplo, los microorganismos se proporcionan en combinación con el material de origen en el que residen; por ejemplo, materia fecal, bolo alimenticio u otra composición que se encuentra en el tubo gastrointestinal. En esta realización, el material de origen puede incluir una o más especies de microorganismos.
[0475] En algunas realizaciones, se usa una población mixta de microorganismos en los métodos de la divulgación. En las realizaciones de la divulgación en las que los microorganismos se aíslan de un material de origen (por ejemplo, el material en el que residen de forma natural), se puede usar una cualquiera o una combinación de varias técnicas estándar que serán fácilmente conocidas por los expertos en la materia. Sin embargo, a modo de ejemplo, estas emplean en general procesos mediante los cuales se puede obtener un cultivo sólido o líquido de un solo microorganismo en una forma sustancialmente pura, normalmente mediante separación física en la superficie de un medio de cultivo microbiano sólido o mediante aislamiento por dilución volumétrica en un medio de cultivo microbiano líquido. Estos procesos pueden incluir el aislamiento a partir de material seco, suspensión líquida, lodos u homogeneizados en los que el material se extiende en una capa fina sobre un medio de crecimiento de gel sólido adecuado, o diluciones seriadas del material en un medio estéril e inoculadas en medios de cultivo líquidos o sólidos.
[0476] Aunque no es esencial, en una realización, el material que contiene los microorganismos puede ser pretratado antes del proceso de aislamiento con el fin de multiplicar todos los microorganismos del material. A continuación, los microorganismos pueden aislarse de los materiales enriquecidos como se ha divulgado anteriormente.
[0477] En determinadas realizaciones, como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, el microorganismo o microorganismos pueden usarse en forma bruta y no es necesario aislarlos de un animal o de un medio. Por ejemplo, se pueden obtener y usar como fuente cruda de microorganismos para la siguiente ronda del método o como fuente cruda de microorganismos al final del método, el bolo alimenticio, las heces o los medios de cultivo que incluyen los microorganismos identificados como beneficiosos para aumentar la producción de leche en ungulados. Por ejemplo, se pueden obtener heces frescas y procesarlas opcionalmente.
[0478] Cambio en el microbioma y abundancia de microbios
[0479] En algunas realizaciones, el microbioma de un rumiante, incluido el microbioma del rumen, comprende una llegada diversa de microbios con una amplia variedad de capacidades metabólicas. El microbioma está influenciado por una serie de factores que incluyen la dieta, las variaciones en el metabolismo animal y la raza, entre otros. La mayoría de las dietas bovinas son de origen vegetal y ricas en polisacáridos complejos que enriquecen la comunidad microbiana gastrointestinal con microbios capaces de descomponer componentes poliméricos específicos de la dieta. Los productos finales de la degradación primaria sustentan una cadena de microbios que, en última instancia, producen una gama de ácidos orgánicos junto con hidrógeno y dióxido de carbono. Debido a la naturaleza compleja e interrelacionada del microbioma, cambiar la dieta y, por lo tanto, los sustratos para la degradación primaria pueden tener un efecto en cascada sobre el metabolismo microbiano del rumen, con cambios tanto en los perfiles de ácidos orgánicos como en los niveles de metano producidos, lo que repercute en la calidad y la cantidad de la producción animal y/o los productos producidos por el animal. Véase Menezes et al. (2011. FEMS Microbiol. Ecol.78(2):256-265).
[0480] En algunos aspectos, la presente divulgación se refiere a la administración de composiciones microbianas descritas en el presente documento para modular o cambiar el microbioma de un rumiante.
[0481] En algunas realizaciones, el microbioma se modifica mediante la administración de dos o más microbios al tubo gastrointestinal. En algunas realizaciones, la modificación o modulación del microbioma incluye una disminución o pérdida de microbios específicos que estaban presentes antes de la administración de uno o más microbios de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la modificación o modulación del microbioma incluye un aumento de los microbios que estaban presentes antes de la administración de uno o más microbios de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la modificación o modulación del microbioma incluye una ganancia de uno o más microbios que no estaban presentes antes de la administración de uno o más microbios de la presente divulgación. En una realización adicional, la ganancia de uno o más microbios es un microbio que no se incluyó específicamente en el consorcio microbiano administrado.
[0482] En algunas realizaciones, la administración de microbios de la presente divulgación da como resultado una modulación sostenida del microbioma, de modo que los microbios administrados están presentes en el microbioma durante un periodo de al menos 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, 2 a 3, 3 a 10, 3 a 9, 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6, 3 a 5, 3 a 4, 4 a 10, 4 a 9, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 4 a 5, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, 5 a 7, 5 a 6, 6 a 10, 6 a 9, 6 a 8, 6 a 7, 7 a 10, 7 a 9, 7 a 8, 8 a 10, 8 a 9, 9 a 10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días.
[0483] En algunas realizaciones, la administración de microbios de la presente divulgación da como resultado una modulación sostenida del microbioma, de modo que los microbios administrados están presentes en el microbioma durante un periodo de al menos 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, 2 a 3, 3 a 10, 3 a 9, 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6, 3 a 5, 3 a 4, 4 a 10, 4 a 9, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 4 a 5, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, 5 a 7, 5 a 6, 6 a 10, 6 a 9, 6 a 8, 6 a 7, 7 a 10, 7 a 9, 7 a 8, 8 a 10, 8 a 9, 9 a 10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 semanas.
[0484] En algunas realizaciones, la administración de microbios de la presente divulgación da como resultado una modulación sostenida del microbioma, de modo que los microbios administrados están presentes en el microbioma durante un periodo de al menos 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 1 a 2, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, 2 a 3, 3 a 10, 3 a 9, 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6, 3 a 5, 3 a 4, 4 a 10, 4 a 9, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 4 a 5, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, 5 a 7, 5 a 6, 6 a 10, 6 a 9, 6 a 8, 6 a 7, 7 a 10, 7 a 9, 7 a 8, 8 a 10, 8 a 9, 9 a 10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses.
[0485] En algunas realizaciones, la presencia de los microbios administrados se detecta mediante el muestreo del tubo gastrointestinal y el uso de cebadores para amplificar las secuencias de ADNr 16S o 18S, o las secuencias de ADNr ITS de los microbios administrados.
[0486] En algunas realizaciones, el microbioma de un rumiante se mide amplificando polinucleótidos recogidos de muestras gastrointestinales, en donde los polinucleótidos pueden ser fragmentos de ADNr 16S o 18S, o fragmentos de ADNr ITS de ADNr microbiano. En una realización, se toma la huella digital del microbioma mediante un método de electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), en donde los fragmentos de ADNr amplificados se clasifican según el lugar donde se desnaturalizan y forman un patrón de bandas único en un gel que puede usarse para comparar el microbioma del mismo rumiante a lo largo del tiempo o los microbiomas de múltiples rumiantes. En otra realización, se obtiene la huella digital del microbioma mediante un método de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (T-RFLP), en donde los fragmentos de PCR marcados se digieren usando una enzima de restricción y luego se clasifican por tamaño. En una realización adicional, los datos recopilados mediante el método T-RFLP se evalúan mediante escalamiento multidimensional no métrico (nMDS) y estadísticas PERMANOVA identifican diferencias en los microbiomas, lo que permite la identificación y la medición de cambios en el microbioma. Véase también Shanks et al. (2011. Appl. Environ. Microbiol. 77(9):2992-3001), Petri et al. (2013. PLOS one.8(12):e83424), y Menezes et al. (2011. FEMS Microbiol. Ecol.78(2):256-265).
[0487] En algunas realizaciones, la administración de microbios de la presente divulgación da lugar a una modulación o modificación del microbioma que, a su vez, da lugar a un fenotipo deseado o a una mejora de los rasgos.
[0489] Según los siguientes métodos descritos en el presente documento, pero que no entran dentro del alcance de las reivindicaciones, se procesa una muestra para detectar la presencia de uno o más tipos de microorganismos en la muestra(FIG. 1,1001;FIG. 2,2001). Se determina el número absoluto de uno o más tipos de organismos microbianos en la muestra(FIG. 1,1002;FIG. 2,2002). La determinación de la presencia de uno o más tipos de organismos y el número absoluto de al menos un tipo de organismo se puede realizar en paralelo o en serie. Por ejemplo, en el caso de una muestra que comprende una comunidad microbiana que comprende bacterias (es decir, un tipo de microorganismo) y hongos (es decir, un segundo tipo de microorganismo), el usuario, en una realización, detecta la presencia de uno o ambos tipos de organismos en la muestra(FIG. 1,1001;FIG. 2,2001). El usuario puede determinar el número absoluto de al menos un tipo de organismo en la muestra; en el caso de este ejemplo, el número de bacterias, hongos o una combinación de ambos en la muestra(FIG.1,1002;FIG.2,2002).
[0491] La muestra, o una parte de ella, puede someterse a un análisis de citometría de flujo (FC) para detectar la presencia y/o el número de uno o más tipos de microorganismos(FIG.1,1001, 1002;FIG.2,2001, 2002). En una realización de citómetro de flujo, las células microbianas individuales pasan a través de una zona de iluminación, a una velocidad de al menos alrededor de 300 *s<-1>, o al menos alrededor de 500 *s<-1>, o al menos alrededor de 1000 *s<-1>. Sin embargo, un experto en la técnica reconocerá que esta velocidad puede variar dependiendo del tipo de instrumento que se emplee. Los detectores controlados electrónicamente miden la magnitud de un pulso que representa la extensión de la luz dispersada. Las magnitudes de estos pulsos se clasifican electrónicamente en "contenedores" o "canales", lo que permite la visualización de histogramas del número de células que poseen una determinada propiedad cuantitativa (por ejemplo, propiedad de tinción celular, diámetro, membrana celular) frente al número de canal. Dicho análisis permite la determinación del número de células en cada "contenedor" que en las realizaciones descritas aquí es un contenedor de "tipo microorganismo", por ejemplo, una bacteria, un hongo, un nematodo, un protozoo, una arquea, un alga, un dinoflagelado, un virus, un viroide, etc.
[0493] Una muestra puede teñirse con uno o más colorantes fluorescentes, en donde un colorante fluorescente es específico para un tipo de microorganismo concreto, para permitir la detección mediante un citómetro de flujo o algún otro método de detección y cuantificación que aproveche la fluorescencia, como la microscopía de fluorescencia. El método puede proporcionar la cuantificación del número de células y/o del volumen celular de un tipo de organismo determinado en una muestra. En una realización adicional, como se describe aquí, la citometría de flujo se aprovecha para determinar la presencia y cantidad de un primer marcador único y/o un segundo marcador único del tipo de organismo, tal como expresión de enzimas, expresión de proteínas de la superficie celular, etc. También se pueden generar histogramas de tres variables o diagramas de contorno de, por ejemplo, dispersión de la luz frente a fluorescencia de una tinción de membrana celular (frente a fluorescencia de una tinción de proteínas o tinción de ADN), y así se puede obtener una impresión de la distribución de una variedad de propiedades de interés entre las células de la población en su conjunto. Una serie de visualizaciones de tales datos de citometría de flujo multiparamétrico son de uso común, y se pueden usar con los métodos descritos aquí.
[0494] Al procesar la muestra para detectar la presencia y el número de uno o más tipos de microorganismos, puede emplearse un ensayo de microscopía(FIG. 1,1001, 1002). La microscopía puede ser óptica, en la que se utiliza luz visible y un sistema de lentes para ampliar las imágenes de muestras pequeñas. Las imágenes digitales se pueden capturar mediante una cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD). Otras técnicas microscópicas incluyen, pero no se limitan a, microscopía electrónica de barrido y microscopía electrónica de transmisión. Los tipos de microorganismos se visualizan y cuantifican según los aspectos aquí previstos.
[0496] Con el fin de detectarla presencia y el número de uno o más tipos de microorganismos, la muestra, o una parte de la parte, pueden someterse a microscopía de fluorescencia. Se pueden usar diferentes tintes fluorescentes para teñir directamente las células en muestras y cuantificar el recuento de células total usando un microscopio de epifluorescencia y citometría de flujo, descrito anteriormente. Los colorantes útiles para cuantificar microorganismos incluyen, pero no se limitan a, naranja de acridina (AO), 4,6-di-amino-2 fenilindol (DAPI) y cloruro de 5-ciano-2,3 ditolil tetrazolio (CTC). Las células viables pueden estimarse mediante un método de tinción de viabilidad, como el kit de viabilidad bacteriana LIVE/DEAD<®>(Bac-Light<™>), que contiene dos colorantes de ácido nucleico: el colorante SYTO 9<™>, de fluorescencia verde, que penetra en todas las membranas, y el colorante yoduro de propidio (PI), de fluorescencia roja, que penetra en las células con membranas dañadas. Por lo tanto, las células con membranas comprometidas se teñirán de rojo, mientras que las células con membranas intactas se teñirán de verde. La hibridación fluorescentein situ(FISH) amplía la microscopía de epifluorescencia, lo que permite la detección y enumeración rápidas de organismos específicos. FISH usa sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia (generalmente de 15 a 25 pares de bases) que se unen específicamente al ADN del organismo en la muestra, lo que permite la visualización de las células mediante un microscopio de epifluorescencia o de barrido láser confocal (CLSM). La hibridaciónin situcon fluorescencia de deposición informadora catalizada (CARD-FISH) mejora el método FISH mediante el uso de sondas oligonucleotídicas marcadas con peroxidasa de rábano picante (HRP) para amplificar la intensidad de la señal obtenida de los microorganismos que se estudian. FISH se puede combinar con otras técnicas para caracterizar comunidades de microorganismos. Una técnica combinada es el ácido nucleico peptídico de alta afinidad (PNA)-FISH, en la que la sonda tiene una capacidad mejorada para penetrar a través de la matriz de sustancia polimérica extracelular (EPS). Otro ejemplo es LIVE/DEAD-FISH, que combina el kit de viabilidad celular con FISH y se ha usado para evaluar la eficiencia de la desinfección en sistemas de distribución de agua potable.
[0498] La muestra, o una parte de ella, puede someterse a microespectroscopia Raman para determinar la presencia de un tipo de microorganismo y el número absoluto de al menos un tipo de microorganismo(FIG.1,1001-1002;FIG.
[0499] 2,2001-2002). La microespectroscopia Raman es una tecnología no destructiva y sin marcadores capaz de detectar y medir un espectro Raman de una sola célula (SCRS). Un SCRS típico proporciona una "huella" bioquímica intrínseca de una sola célula. Un SCRS contiene rica información de las biomoléculas que contiene, incluidos ácidos nucleicos, proteínas, hidratos de carbono y lípidos, lo que permite la caracterización de diferentes especies celulares, cambios fisiológicos y fenotipos celulares. La microscopía Raman examina la dispersión de la luz láser por los enlaces químicos de diferentes biomarcadores celulares. Un SCRS es una suma de los espectros de todas las biomoléculas en una sola célula, lo que indica el perfil fenotípico de una célula. Los fenotipos celulares, como consecuencia de la expresión genética, suelen reflejar genotipos. Por lo tanto, en condiciones de crecimiento idénticas, diferentes tipos de microorganismos dan SCRS distintos correspondientes a diferencias en sus genotipos, y por lo tanto pueden identificarse mediante sus espectros Raman.
[0501] La muestra, o una parte de la misma, puede someterse a centrifugación para determinar la presencia de un tipo de microorganismo y el número de al menos un tipo de microorganismo(FIG. 1,1001-1002;FIG. 2,2001-2002). Este procedimiento sedimenta una mezcla heterogénea mediante el uso de la fuerza centrífuga creada por una centrífuga. Los componentes más densos de la mezcla se alejan del eje de la centrífuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla migran hacia el eje. La centrifugación puede permitir el fraccionamiento de muestras en porciones citoplasmáticas, de membrana y extracelulares. También se puede usar para determinar información de localización de moléculas biológicas de interés. Además, la centrifugación se puede usar para fraccionar el ADN de la comunidad microbiana total. Los diferentes grupos procarióticos difieren su contenido de guanina más citosina (G+C) de ADN, por lo que la centrifugación en gradiente de densidad basada en el contenido de G+C es un método para diferenciar los tipos de organismos y la cantidad de células asociadas con cada tipo. La técnica genera un perfil fraccionado de todo el ADN de la comunidad e indica la abundancia de ADN en función del contenido de G+C. El ADN total de la comunidad se separa físicamente en fracciones altamente purificadas, cada una de las cuales representa un contenido diferente de G+C que puede analizarse mediante técnicas moleculares adicionales, como la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)/análisis de restricción del ADN ribosómico amplificado (ARDRA) (véase la discusión en el presente documento) para evaluar la diversidad total de la comunidad microbiana y la presencia/cantidad de uno o más tipos de microorganismos.
[0502] La muestra, o una parte de la misma, puede someterse a tinción para determinar la presencia de un tipo de microorganismo y el número de al menos un tipo de microorganismo(FIG. 1,1001-1002;FIG. 2,2001-2002). Se pueden usar colorantes y tintes para visualizar tejidos biológicos, células u orgánulos dentro de las células. La tinción se puede usar junto con microscopía, citometría de flujo o electroforesis en gel para visualizar o marcar células o moléculas biológicas que son exclusivas de diferentes tipos de microorganismos. La tinciónin vivoes el procedimiento de teñir tejidos vivos, mientras que la tinciónin vitroimplica teñir células o estructuras que han sido eliminadas de su contexto biológico. Ejemplos de técnicas de tinción específicas para su uso con los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no están limitados a: tinción de Gram para determinar el estado de Gram de las bacterias, tinción de endosporas para identificar la presencia de endosporas, tinción de Ziehl-Neelsen, tinción con hematoxilina y eosina para examinar cortes delgados de tejido, tinción de Papanicolaou para examinar muestras celulares de diversas secreciones corporales, tinción con ácido peryódico de Schiff de hidratos de carbono, la tinción de Masson empleando un protocolo de tinción de tres colores para distinguir las células del tejido conjuntivo circundante, tinciones de Romanowsky (o variantes comunes que incluyen la tinción de Wright, la tinción de Jenner, la tinción de May-Grunwald, la tinción de Leishman y la tinción de Giemsa) para examinar muestras de sangre o médula ósea, tinción con plata para revelar proteínas y ADN, tinción de Sudán para lípidos y tinción de Conklin para detectar endosporas verdaderas. Las tinciones biológicas comunes incluyen naranja de acridina para la determinación del ciclo celular; marrón bismarck para mucinas ácidas; carmín para glucógeno; alumbre carmín para núcleos; azul de Coomassie para proteínas; violeta de cresilo para los componentes ácidos del citoplasma neuronal; violeta cristal para paredes celulares; DAPI para núcleos; eosina para material citoplasmático, membranas celulares, algunas estructuras extracelulares y glóbulos rojos; bromuro de etidio para ADN; fucsina ácida para colágeno, músculo liso o mitocondrias; hematoxilina para núcleos; tinciones de Hoechst para ADN; yodo para almidón; verde malaquita para bacterias en la técnica de tinción de Gimenez y para esporas; verde de metilo para la cromatina; azul de metileno para células animales; rojo neutro para sustancia Nissl; azul del Nilo para núcleos; rojo del Nilo para entidades lipofílicas; tetróxido de osmio para lípidos; la rodamina se usa en microscopía de fluorescencia; safranina para los núcleos. Las tinciones también se utilizan en microscopía electrónica de transmisión para mejorar el contraste, e incluyen ácido fosfotúngstico, tetróxido de osmio, tetróxido de rutenio, molibdato de amonio, yoduro de cadmio, carbohidrazida, cloruro férrico, hexamina, tricloruro de indio, nitrato de lantano, acetato de plomo, citrato de plomo, nitrato de plomo (II), ácido periódico, ácido fosfomolíbdico, ferricianuro de potasio, ferrocianuro de potasio, rojo de rutenio, nitrato de plata, proteinato de plata, cloroaurato de sodio, nitrato de talio, tiosemicarbazida, acetato de uranilo, nitrato de uranilo y sulfato de vanadilo.
[0504] La muestra, o una parte de ella, se somete a espectrometría de masas (MS) para determinar la presencia de un tipo de microorganismo y el número de al menos un tipo de microorganismo (FIG.1,1001-1002; FIG. 2, 2001-2002). La MS, como se explica más adelante, también se puede usarse para detectar la presencia y expresión de uno o más marcadores únicos en una muestra (FIG.1,1003-1004; FIG.2, 2003-2004). La MS se usa, por ejemplo, para detectar la presencia y cantidad de marcadores proteicos y/o peptídicos exclusivos de los tipos de microorganismos, y por lo tanto para proporcionar una evaluación del número del tipo de microorganismo respectivo en la muestra. La cuantificación puede realizarse con marcaje con isótopos estables o sin marcadores. La secuenciación de novo de péptidos también puede ocurrir directamente a partir de espectros MS/MS o etiquetado de secuencia (produce una etiqueta corta que puede compararse con una base de datos). La MS también puede revelar modificaciones postraduccionales de proteínas e identificar metabolitos. La MS se puede usar junto con técnicas cromatográficas y otras técnicas de separación (tales como cromatografía de gases, cromatografía líquida, electroforesis capilar, movilidad iónica) para mejorar la resolución y determinación de masas.
[0505] La muestra, o una parte de la misma, se somete a análisis de lípidos para determinar la presencia de un tipo de microorganismo y el número de al menos un tipo de microorganismo(FIG.1,1001-1002;FIG.2,2001-2002). Los ácidos grasos están presentes en una proporción relativamente constante de la biomasa celular, y existen ácidos grasos característicos en las células microbianas que pueden diferenciar los tipos de microorganismos dentro de una comunidad. Los ácidos grasos se extraen mediante saponificación, seguida de derivatización, para obtener los respectivos ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME), que luego se analizan mediante cromatografía de gases. Después, el perfil FAME, en una realización, se compara con una base de datos FAME de referencia para identificar los ácidos grasos y sus firmas microbianas correspondientes mediante análisis estadísticos multivariados.
[0507] En los métodos proporcionados en el presente documento, se mide el número de primeros marcadores únicos en la muestra, o en una parte de la misma (por ejemplo, una alícuota de la muestra), así como la abundancia de cada uno de los primeros marcadores únicos (FIG. 1,1003;FIG. 2,2003). Un marcador único es un marcador de una cepa de microorganismo. Un experto en la técnica debería entender que, dependiendo del marcador único que se esté probando y midiendo, no es necesario analizar toda la muestra. Por ejemplo, si el marcador único es exclusivo de las cepas bacterianas, entonces no es necesario analizar la porción fúngica de la muestra. Como se ha descrito anteriormente, la medición de la abundancia absoluta de uno o más tipos de organismos en una muestra comprende la separación de la muestra por tipo de organismo, por ejemplo, mediante citometría de flujo.
[0509] Aquí se puede emplear cualquier marcador que sea exclusivo de una cepa de organismo. Por ejemplo, los marcadores pueden incluir, pero no se limitan a, genes de ARNr de subunidades pequeñas (ADNr 16S/18S), genes de ARN ribosómico de subunidades grandes (ADNr 23S/25S/28S), gen 5.8S intercalario, citocromo c oxidasa, beta-tubulina, factor de elongación, ARN polimerasa, y espaciador transcrito interno (ITS).
[0511] Los genes de ARN ribosómico (ADNr), especialmente los genes de ARN ribosómico de subunidad pequeña, es decir, genes de ARNr 18S (ADNr 18S) en el caso de eucariotas y ARNr 16S (ADNr 16S) en el caso de procariotas, han sido la diana predominante de la evaluación de tipos y cepas de organismos en una comunidad microbiana. Sin embargo, también se han seleccionado como dianas los genes del ARNr de subunidades grandes, los ADNr 28S. Los ADNr son adecuados para la identificación taxonómica debido a que: (i) son omnipresentes en todos los organismos conocidos; (ii) poseen regiones tanto conservadas como variables; (iii) existe una base de datos en expansión exponencial de sus secuencias disponible para comparación. En el análisis comunitario de muestras, las regiones conservadas sirven como sitios de hibridación para la PCR universal correspondiente y/o cebadores de secuenciación, mientras que las regiones variables pueden usarse para la diferenciación filogenética. Además, el alto número de copias del ADNr en las células facilita la detección en muestras ambientales.
[0513] También se ha apuntado al espaciador interno transcrito (ITS), ubicado entre el ADNr 18S y el ADNr 28S. El ITS se transcribe, pero se corte y empalma antes del ensamblaje de los ribosomas. La región ITS está compuesta por dos espaciadores altamente variables, ITS1 e ITS2, y el gen intercalario 5.8S. Este operón de ADNr se produce en múltiples copias en los genomas. Debido a que la región ITS no codifica componentes ribosómicos, es muy variable.
[0515] El marcador de ARN único puede ser un marcador de ARNm, un marcador de ARNip o un marcador de ARN ribosómico.
[0516] Los genes funcionales que codifican proteínas también se pueden usar aquí como primer marcador único. Dichos marcadores incluyen, pero no se limitan a: la familia de genes de la recombinasa A (RecA bacteriana, arqueas RadA y RadB, Rad51 y Rad57 eucariotas, fago UvsX); gen de la subunidad β de la ARN polimerasa (RpoB), que es responsable del inicio y el alargamiento de la transcripción; chaperoninas. También se han identificado genes marcadores candidatos para bacterias y arqueas: proteína ribosómica S2 (rpsB), proteína ribosómica S10 (rpsJ), proteína ribosómica L1 (rplA), factor de elongación de la traducción EF-2, factor de iniciación de la traducción IF-2, metaloendopeptidasa, proteína ribosómica L22, proteína de la partícula de reconocimiento de señales ffh, proteína ribosómica L4/L1e (rplD), proteína ribosómica L2 (rplB), proteína ribosómica S9 (rpsI), proteína ribosómica L3 (rplC), subunidad beta de la fenilalanil-tRNA sintetasa, proteína ribosómica L14b/L23e (rplN), proteína ribosómica S5, proteína ribosómica S19 (rpsS), proteína ribosómica S7, proteína ribosómica L16/L10E (rplP), proteína ribosómica S13 (rpsM), subunidad alfa de la fenilalanil-tRNA sintetasa, proteína ribosómica L15, proteína ribosómica L25/L23, proteína ribosómica L6 (rplF), proteína ribosómica L11 (rplK), proteína ribosómica L5 (rplE), proteína ribosómica S12/S23, proteína ribosómica L29, proteína ribosómica S3 (rpsC), proteína ribosómica S11 (rpsK), proteína ribosómica L10, proteína ribosómica S8, pseudouridina sintasa B del ARNt, proteína ribosómica L18P/L5E, proteína ribosómica S15P/S13e, porfobilinógeno desaminasa, proteína ribosómica S17, proteína ribosómica L13 (rplM), fosforribosilformilglicinamidina cicloligasa (rpsE), ribonucleasa HII y proteína ribosómica L24. Otros genes marcadores candidatos para bacterias incluyen: proteína de elongación de la transcripción NusA (nusA), subunidad beta de la ARN polimerasa dirigida por ADN rpoB (rpoB), proteína de unión a GTP EngA, subunidad beta' de la ARN polimerasa dirigida por ADN rpoC, proteína de ensamblaje de primosoma priA, factor de acoplamiento de transcripción-reparación, CTP sintasa (pyrG), subunidad secY de translocasa de preproteína SecY, proteína de unión a GTP Obg/CgtA, ADN polimerasa I, proteína ribosómica rpsF 30S S6, subunidad alfa de ARN polimerasa dirigida por ADN poA, factor de liberación de cadena peptídica 1, rplI proteína ribosómica 50S L9, polirribonucleótido nucleotidiltransferasa, factor de elongación tsf Ts (tsf), rplQ proteína ribosómica 50S L17, ARNt (guanina-N(1)-)-metiltransferasa (rplS), rplY probable proteína ribosómica 50S L25, proteína reparadora de ADN RadA, proteína A de división inhibida por glucosa, factor A de unión a ribosomas, proteína de reparación de errores de coincidencia de ADN MutL, proteína de unión a smpB SsrA (smpB), N-acetilglucosaminil transferasa, S-adenosil-metiltransferasa MraW, UDP-N-acetilmuramoilalanina--D-glutamato ligasa, proteína ribosómica rplS 50S L19, proteína ribosómica rplT 50S L20 (rplT), ADN helicasa de unión Holliday ruvA, ADN helicasa B de unión Holliday ruvB, serS seril-ARNt sintetasa, proteína ribosómica rplU 50S L21, proteína ribosómica rpsR 30S S18, ADN proteína de reparación de desajustes MutS, proteína ribosómica rpsT 30S S20, proteína de reparación de ADN RecN, factor de reciclaje de ribosomas frr (frr), proteína de recombinación RecR, proteína de función desconocida UPF0054, isopenteniltransferasa de ARNt miaA, proteína de unión a GTP YchF, proteína iniciadora de replicación cromosómica DnaA, defosfo-CoA cinasa, proteína procesadora de ARNr 16S RimM, proteína de dominio de cono de ATP, 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa, 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintasa, proteína de síntesis de ácidos grasos/fosfolípidos PlsX, tRNA(Ile)-lisidina sintetasa, dnaG ADN primasa (dnaG), resolvasa de unión ruvC Holliday, proteína ribosómica rpsP 30S S16, recombinasa A recA, proteína de biosíntesis de riboflavina RibF, subunidad beta de glicil-tRNA sintetasa, trmU tRNA (5-metilaminometil-2-tiouridilato)-metiltransferasa, proteína ribosómica L35 rpmI 50S, uroporfirinógeno descarboxilasa hemE, proteína determinante de la forma de la varilla, proteína ribosómica L27 rpmA 50S (rpmA), peptidil-ARNt hidrolasa, factor de iniciación de traducción IF-3 (infC), UDP-N-acetilmuramil-tripéptido sintetasa, proteína ribosómica L32 rpmF 50S, proteína ribosómica rpIL 50S L7/L12 (rpIL), leuS leucil-ARNt sintetasa, ADN ligasa dependiente de ligA NAD, proteína de división celular FtsA, proteína de unión a GTP TypA, Clp proteasa dependiente de ATP, subunidad de unión a ATP ClpX, proteína de replicación y reparación de ADN RecF, y UDP-N-acetilenolpiruvoilglucosamina reductasa.
[0518] Los ácidos grasos fosfolípidos (PLFA) también se pueden usar como primeros marcadores únicos según los métodos descritos aquí. Debido a que los PLFA se sintetizan rápidamente durante el crecimiento microbiano, no se encuentran en las moléculas de almacenamiento y se degradan rápidamente durante la muerte celular, proporciona un censo preciso de la comunidad viva actual. Todas las células contienen ácidos grasos (FA) que pueden extraerse y esterificarse para formar ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME). Cuando los FAME se analizan mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas, el perfil resultante constituye una "huella digital" de los microorganismos de la muestra. Las composiciones químicas de las membranas de los organismos de los dominios Bacteria y Eukarya se componen de ácidos grasos unidos al glicerol mediante un enlace tipo éster (ácidos grasos fosfolípidos (PLFA)). Por el contrario, los lípidos de membrana de Archaea están compuestos por hidrocarburos largos y ramificados que están unidos al glicerol mediante un enlace de tipo éter (lípidos éter fosfolípidos (PLEL)). Este es uno de los criterios no genéticos más usados para distinguir los tres dominios. En este contexto, los fosfolípidos derivados de las membranas celulares microbianas, caracterizados por diferentes cadenas de acilo, son excelentes moléculas distintivas, porque dicha diversidad estructural de lípidos puede vincularse a taxones microbianos específicos.
[0520] Como se proporciona en el presente documento, para determinar si una cepa de organismo está activa, se mide el nivel de expresión de uno o más segundos marcadores únicos, que pueden ser iguales o diferentes al primer marcador (FIG. 1,1004;FIG. 2,2004). Los primeros marcadores únicos se describen anteriormente. El segundo marcador único es un marcador de actividad de microorganismos. Por ejemplo, en una realización, la expresión de ARNm o proteína de cualquiera de los primeros marcadores descritos anteriormente se considera un segundo marcador único a los efectos de la presente invención.
[0521] Si el nivel de expresión del segundo marcador está por encima de un nivel umbral (por ejemplo, un nivel de control) o en un nivel umbral, se considera que el microorganismo está activo (FIG.1, 1005;FIG.2, 2005). La actividad se determina en una realización, si el nivel de expresión del segundo marcador se altera en al menos aproximadamente un 5 %, al menos alrededor de 10 %, al menos alrededor de 15 %, al menos alrededor de 20 %, al menos alrededor de 25 %, o al menos aproximadamente el 30 %, en comparación con un nivel umbral, que en algunas realizaciones es un nivel de control.
[0523] Los segundos marcadores únicos se miden al nivel de proteína, ARN o metabolito. Un segundo marcador único es igual o diferente que el primer marcador único.
[0525] Como se proporcionó anteriormente, se pueden detectar varios primeros marcadores únicos y segundos marcadores únicos según los métodos descritos aquí. Además, la detección y cuantificación de un primer marcador único se lleva a cabo de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia (FIG. 1,1003-1004,FIG.
[0526] 2,2003-2004).
[0528] La secuenciación de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNg, ADNc, ARNr, ARNm) en una realización se usa para determinar la abundancia absoluta de un primer marcador único y/o un segundo marcador único. Las plataformas de secuenciación incluyen, pero no se limitan a, secuenciación Sanger y métodos de secuenciación de alto rendimiento disponibles en Roche/454 Life Sciences, Illumina/Solexa, Pacific Biosciences, Ion Torrent y Nanopore. La secuenciación puede ser secuenciación de amplicones de secuencias particulares de ADN o ARN o secuenciación de metagenoma/transcriptoma completo.
[0530] La secuenciación tradicional de Sanger (Sanger et al. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl. Acad. Sci. USA, 74, págs. 5463-5467) se basa en la incorporación selectiva de didesoxinucleótidos de terminación de cadena por la ADN polimerasa durante la replicación del ADN in vitro y es susceptible de usarse con los métodos descritos en el presente documento.
[0532] En otra realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a extracción de ácidos nucleicos, amplificación de ADN de interés (tal como el gen de ARNr) con cebadores adecuados y construcción de bibliotecas de clones usando vectores de secuenciación. Después, los clones seleccionados se secuencian mediante secuenciación Sanger y se recupera la secuencia de nucleótidos del ADN de interés, lo que permite calcular el número de cepas de microorganismos únicas en una muestra.
[0534] La pirosecuenciación 454 de Roche/454 Life Sciences produce lecturas largas y puede aprovecharse en los métodos descritos en el presente documento (Margulies et al. (2005) Nature, 437, págs.376-380; patentes de EE. UU. n.º 6.274.320; 6.258.568; 6.210.89). El ácido nucleico que se va a secuenciar (por ejemplo, amplicones o ADN genómico/metagenómico nebulizado) tiene adaptadores específicos fijados en ambos extremos mediante PCR o ligadura. El ADN con adaptadores se fija a pequeñas perlas (idealmente, una perla tendrá un fragmento de ADN) que se suspenden en una emulsión de agua en aceite. Después se lleva a cabo una etapa de PCR en emulsión para hacer múltiples copias de cada fragmento de ADN, lo que da como resultado un conjunto de perlas en el que cada perla contiene muchas copias clonadas del mismo fragmento de ADN. A continuación se coloca cada perla en un pocillo de un chip de fibra óptica que también contiene las enzimas necesarias para las reacciones de secuenciación por síntesis. La adición de bases (tales como A, C, G o T) desencadena la liberación de pirofosfato, que produce destellos de luz que se registran para inferir la secuencia de los fragmentos de ADN en cada pocillo. Se pueden lograr alrededor de 1 millón de lecturas por ejecución, con lecturas de hasta 1000 bases de longitud. Se puede realizar una secuenciación de extremos emparejados, que produce pares de lecturas, cada una de las cuales comienza en un extremo de un fragmento de ADN determinado. Se puede crear un código de barras molecular y colocarlo entre la secuencia adaptadora y la secuencia de interés en reacciones múltiples, lo que permite asignar bioinformáticamente cada secuencia a una muestra.
[0536] La secuenciación Illumina/Solexa produce longitudes de lectura promedio de aproximadamente 25 pares de bases (pb) a aproximadamente 300 pb (Bennett et al. (2005) Pharmacogenomics, 6:373-382; Lange et al. (2014). BMC Genomics 15, p. 63; Fadrosh et al. (2014) Microbiome 2, p. 6; Caporaso et al. (2012) ISME J, 6, p. 1621-1624; Bentley et al. (2008) Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature, 456:53-59). Esta tecnología de secuenciación también es secuenciación por síntesis, pero emplea terminadores de colorantes reversibles y una celda de flujo con un campo de oligos adjunto. Los fragmentos de ADN que se van a secuenciar tienen adaptadores específicos en cada extremo, y se lavan sobre una celda de flujo llena de oligonucleótidos específicos que se hibridan con los extremos de los fragmentos. Después, cada fragmento se replica para formar un grupo de fragmentos idénticos. Los nucleótidos terminadores de colorante reversibles se lavan entonces sobre la celda de flujo y se les da tiempo para que se adhieran. Se elimina el exceso de nucleótidos, se obtienen imágenes de la celda de flujo, y se pueden eliminar los terminadores reversibles para que el proceso pueda repetirse y se puedan continuar añadiendo nucleótidos en ciclos posteriores. Se pueden lograr lecturas de extremos emparejados de 300 bases de longitud cada una. Una plataforma Illumina puede producir 4 mil millones de fragmentos en pares con 125 bases para cada lectura en una sola ejecución. También se pueden usar códigos de barras para la multiplexación de muestras, pero se usan cebadores de indexación.
[0537] El proceso SOLiD (secuenciación por ligadura y detección de oligonucleótidos, Life Technologies) es un enfoque de «secuenciación por ligadura» y puede usarse con los métodos descritos en el presente documento para detectar la presencia y abundancia de un primer marcador y/o un segundo marcador (FIG. 1,1003-1004;FIG. 2,2003-2004) (Peckham et al. SOLiD™ Sequencing and 2-Base Encoding. San Diego, CA: American Society of Human Genetics, 2007; Mitra et al. (2013) Analysis of the intestinal microbiota using SOLiD 16S rRNA gene sequencing and SOLiD shotgun sequencing. BMC Genomics, 14 (suplemento 5): S16; Mardis (2008) Next-generation DNA sequencing methods. Annu Rev Genomics Hum Genet, 9:387-402). Se prepara una biblioteca de fragmentos de ADN a partir de la muestra que se va a secuenciar, y se usa para preparar poblaciones de perlas clonales, en las que solo estará presente una especie de fragmento en la superficie de cada perla magnética. Los fragmentos unidos a las perlas magnéticas tendrán una secuencia adaptadora P1 universal, de modo que la secuencia inicial de cada fragmento sea conocida e idéntica. Los cebadores se hibridan con la secuencia del adaptador P1 dentro de la plantilla de la biblioteca. Un conjunto de cuatro sondas dibase marcadas con fluorescencia compiten por la ligación al cebador de secuenciación. La especificidad de la sonda dibase se logra interrogando cada 1ª y 2ª base en cada reacción de ligación. Se realizan múltiples ciclos de ligadura, detección y escisión, y el número de ciclos determina la longitud de lectura final. La plataforma SOLiD puede producir hasta 3 mil millones de lecturas por ejecución con lecturas de 75 bases de longitud. La secuenciación de extremos emparejados está disponible y se puede usar aquí, pero la segunda lectura en el par tiene sólo 35 bases de longitud. La multiplexación de muestras es posible a través de un sistema similar al usado por Illumina, con una ejecución de indexación separada.
[0538] El sistema Ion Torrent, al igual que la secuenciación 454, es apto para su uso con los métodos descritos en el presente documento para detectar la presencia y abundancia de un primer marcador y/o un segundo marcador (FIG. 1,1003-1004;FIG. 2,2003-2004). Usa una placa de micropocillos que contienen perlas a las que se unen fragmentos de ADN. Sin embargo, se diferencia de todos los demás sistemas en la forma en que se detecta la incorporación de bases. Cuando se añade una base a una cadena de ADN en crecimiento, se libera un protón que altera ligeramente el pH circundante. Microdetectores sensibles al pH están asociados a los pocillos de la placa y registran cuándo se producen estos cambios. Las diferentes bases (A, C, G, T) se lavan secuencialmente a través de los pocillos, lo que permite inferir la secuencia de cada pocillo. La plataforma Ion Proton puede producir hasta 50 millones de lecturas por ejecución con longitudes de lectura de 200 bases. La plataforma Personal Genome Machine tiene lecturas más largas en 400 bases. La secuenciación bidireccional está disponible. La multiplexación es posible mediante la secuenciación estándar de códigos de barras moleculares en línea.
[0540] La secuenciación SMRT de Pacific Biosciences (PacBio) usa un enfoque de secuenciación en tiempo real de molécula única y puede usarse con los métodos descritos en el presente documento para detectar la presencia y abundancia de un primer marcador y/o un segundo marcador (FIG. 1,1003-1004;FIG. 2,2003-2004). El sistema de secuenciación PacBio no implica ninguna etapa de amplificación, lo que lo diferencia de otros sistemas importantes de secuenciación de próxima generación. La secuenciación se realiza en un chip que contiene muchos detectores de guía de onda en modo cero (ZMW). Las ADN polimerasas están unidas a los detectores ZMW, y la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes fosfoenlazados se visualiza en tiempo real a medida que se sintetizan las cadenas de ADN. El sistema PacBio produce longitudes de lectura muy largas (con un promedio de aproximadamente 4.600 bases) y una cantidad muy alta de lecturas por ejecución (aproximadamente de 47.000). El enfoque típico de "extremo emparejado" no se usa con PacBio, ya que las lecturas suelen ser lo suficientemente largas como para que los fragmentos, a través de CCS, puedan cubrirse varias veces sin tener que secuenciar desde cada extremo de forma independiente. La multiplexación con PacBio no implica una lectura independiente, sino que sigue el modelo de código de barras estándar "en línea".
[0542] Cuando el primer marcador único es la región genómica ITS, se usa el análisis automatizado del espaciador intergénico ribosómico (ARISA) en una realización para determinar el número y la identidad de las cepas de microorganismos en una muestra (FIG. 1,1003,FIG. 2,2003) (Ranjard et al. (2003). Environmental Microbiology 5, págs.1111-1120). La región ITS tiene una heterogeneidad significativa tanto en longitud como en secuencia de nucleótidos. El uso de un cebador directo marcado con fluorescencia y un secuenciador de ADN automático permite una alta resolución de separación y un alto rendimiento. La inclusión de un patrón interno en cada muestra proporciona precisión en el dimensionamiento general de los fragmentos.
[0544] El polimorfismo de longitud de fragmentos (RFLP) de fragmentos de ADN ribosómico amplificados por PCR, también conocido como análisis de restricción de ADN ribosómico amplificado (ARDRA), se usa para caracterizar marcadores únicos y su abundancia en muestras (FIG. 1,1003,FIG. 2,2003) (Massol-Deya et al. (1995). Mol. Microb. Ecol. Manual. 3.3.2, págs. 1-18). Los fragmentos de ADNr se generan mediante PCR usando cebadores generales, se digieren con enzimas de restricción, se someten a electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, y se tiñen con bromuro de etidio o nitrato de plata.
[0546] Una técnica de huella genética usada en la detección de la presencia y abundancia de un primer marcador único es el polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP) (Lee et al. (1996). Appl Environ Microbiol 62, págs.
[0547] 3112-3120; Scheinert et al. (1996). J. Microbiol. Methods 26, págs. 103-117; Schwieger y Tebbe (1998). Appl. Environ. Microbiol. 64, págs. 4870-4876). En esta técnica, los fragmentos de ADN, tales como los productos de PCR obtenidos con cebadores específicos para el gen 16S rRNA, se desnaturalizan y se someten a electroforesis directa en un gel no desnaturalizante. La separación se basa en diferencias de tamaño y en la conformación plegada del ADN monocatenario, lo que influye en la movilidad electroforética. La reasociación de las cadenas de ADN durante la electroforesis se puede prevenir mediante una serie de estrategias, incluido el uso de un cebador fosforilado en la PCR, seguido de una digestión específica de las cadenas fosforiladas con exonucleasa lambda y el uso de un cebador biotinilado para realizar la separación magnética de una sola hebra después de la desnaturalización. Para evaluar la identidad de las poblaciones predominantes en un consorcio dado, en una realización, se cortan las bandas y se secuencian, o los patrones de SSCP pueden hibridarse con sondas específicas. Las condiciones electroforéticas, tales como la matriz del gel, la temperatura y la adición de glicerol al gel, pueden influir en la separación.
[0549] Además de los métodos basados en secuenciación, otros métodos de cuantificación de la expresión (por ejemplo, gen, expresión de proteína) de un segundo marcador son aptos para su uso con los métodos proporcionados en el presente documento para la determinación del nivel de expresión de uno o más segundos marcadores (FIG.1,1004;FIG. 2,2004). Por ejemplo, RT-PCR cuantitativa, análisis de micromatrices, técnicas de amplificación lineal tales como amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), son todas susceptibles de uso con los métodos descritos aquí, y se pueden llevar a cabo según métodos conocidos por los expertos en la técnica.
[0550] La muestra, o una parte de la misma, puede someterse a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa para la detección de la presencia y abundancia de un primer marcador y/o un segundo marcador (FIG.
[0551] 1,1003-1004;FIG. 2,2003-2004). La actividad de cepas de microorganismos específicos se mide mediante la transcripción inversa del ARN ribosómico y/o mensajero (ARNr y ARNm) transcrito en ADN complementario (ADNc), seguido de PCR (RT-PCR).
[0553] La muestra, o una parte de la misma, puede someterse a técnicas de huella genética basadas en PCR para detectar la presencia y abundancia de un primer marcador y/o un segundo marcador (FIG. 1,1003-1004;FIG. 2,2003-2004). Los productos de la PCR se pueden separar mediante electroforesis según la composición de nucleótidos. La variación de secuencia entre las diferentes moléculas de ADN influye en el comportamiento de fusión y, por lo tanto, las moléculas con secuencias diferentes dejarán de migrar en diferentes posiciones en el gel. Por lo tanto, los perfiles electroforéticos pueden definirse por la posición y la intensidad relativa de diferentes bandas o picos, y pueden traducirse a datos numéricos para el cálculo de índices de diversidad. También se pueden cortar bandas del gel y posteriormente secuenciarlas para revelar la afiliación filogenética de los miembros de la comunidad. Los métodos de electroforesis incluyen, pero no están limitados a: electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE), polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP), análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) o análisis de restricción de ADN ribosómico amplificado (ARDRA), análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (T-RFLP), análisis automatizado de espaciadores intergénicos ribosómicos (ARISA), ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD), huella genética por amplificación de ADN (DAF) y electroforesis Bb-PEG.
[0555] La muestra, o una parte de la misma, puede someterse a una plataforma basada en chips, como un micromatriz o microfluídica, para determinar la abundancia de un primer marcador único y/o la presencia/abundancia de un segundo marcador único (FIG.1,1003-1004,FIG. 2,2003-2004). Los productos de la PCR se amplifican a partir del ADN total de la muestra, y se hibridan directamente con sondas moleculares conocidas fijadas a micromatrices. Después de que los amplicones de PCR marcados fluorescentemente se hibridan con las sondas, las señales positivas se puntúan mediante el uso de microscopía de barrido láser confocal. La técnica de micromatrices permite evaluar rápidamente las muestras con replicación, lo cual es una ventaja significativa en los análisis de comunidades microbianas. En general, la intensidad de la señal de hibridación en las micromatrices es directamente proporcional a la abundancia del organismo diana. La micromatriz 16S de alta densidad universal (PhyloChip) contiene aproximadamente 30.000 sondas del gen ARNr 16S dirigido a varias especies microbianas cultivadas y «divisiones candidatas». Estas sondas se dirigen a los 121 órdenes procariotas demarcados, y permiten la detección simultánea de 8.741 taxones bacterianos y arqueales. Otra micromatriz que se usa para perfilar comunidades microbianas es el Functional Gene Array (FGA). A diferencia de PhyloChips, las FGA están diseñadas principalmente para detectar grupos metabólicos específicos de bacterias. Por lo tanto, las FGA no sólo revelan la estructura de la comunidad, sino que también arrojan luz sobre el potencial metabólico de la comunidadin situ. Las FGA contienen sondas de genes con funciones biológicas conocidas, por lo que son útiles para vincular la composición de la comunidad microbiana con las funciones del ecosistema. Una FGA denominada GeoChip contiene >24.000 sondas de todos los genes metabólicos conocidos que intervienen en diversos procesos biogeoquímicos, ecológicos y medioambientales, como la oxidación del amoníaco, la oxidación del metano y la fijación del nitrógeno.
[0557] En una de las realizaciones, se usa un ensayo de expresión de proteínas con los métodos descritos en el presente documento para determinar el nivel de expresión de uno o más segundos marcadores (FIG.1,1004;FIG.2,2004). Por ejemplo, en una realización, se usa espectrometría de masas o un inmunoensayo, tal como un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), para cuantificar el nivel de expresión de uno o más segundos marcadores únicos, en el que el uno o más segundos marcadores únicos es una proteína.
[0558] La muestra, o una parte de la misma, puede someterse a incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU) para determinar el nivel de un segundo marcador único (FIG. 1,1004;FIG. 2,2004). BrdU, un nucleósido sintético análogo de la timidina, se puede incorporar al ADN recién sintetizado de células en replicación. Después, se pueden usar anticuerpos específicos para BRdU para la detección del análogo de base. Por tanto, la incorporación de BrdU identifica células que están replicando activamente su ADN, una medida de la actividad de un microorganismo según una realización de los métodos descritos aquí. La incorporación de BrdU se puede usar en combinación con FISH para proporcionar la identidad y actividad de las células diana.
[0560] La muestra, o una parte de la misma, puede someterse a microautorradiografía (MAR) combinada con FISH para determinar el nivel de un segundo marcador único (FIG.1,1004;FIG. 2,2004). MAR-FISH se basa en la incorporación de sustrato radiactivo a las células, la detección de las células activas mediante autorradiografía, y la identificación de las células mediante FISH. La detección e identificación de células activas con resolución unicelular se realiza con un microscopio. MAR-FISH proporciona información sobre el total de células, las células diana de la sonda, y el porcentaje de células que incorporan una determinada sustancia radiomarcada. El método proporciona una evaluación de la funciónin situde los microorganismos específicos, y es un enfoque eficaz para estudiar la fisiologíain vivode los microorganismos. Una técnica desarrollada para cuantificar la absorción de sustrato específico de cada célula en combinación con MAR-FISH se conoce como MAR cuantitativo (QMAR).
[0561] La muestra, o una parte de la misma, puede someterse a una espectroscopia Raman de isótopos estables combinada con FISH (Raman-FISH) para determinar el nivel de un segundo marcador único (FIG.1,1004;FIG.2,2004). Esta técnica combina sondeo de isótopos estables, espectroscopia Raman y FISH para vincular procesos metabólicos con organismos particulares. La proporción de incorporación de isótopos estables por parte de las células afecta la dispersión de la luz, lo que da como resultado cambios de pico medibles para los componentes celulares marcados, incluidos los componentes de proteínas y ARNm. La espectroscopia Raman puede usarse para identificar si una célula sintetiza compuestos que incluyen, pero no están limitados a: aceite (como alcanos), lípidos (como triacilgliceroles (TAG)), proteínas específicas (como proteínas hemo, metaloproteínas), citocromo (como P450, citocromo c), clorofila, cromóforos (como pigmentos para carotenoides y rodopsinas que captan la luz), polímeros orgánicos (como polihidroxialcanoatos (PHA), polihidroxibutirato (PHB)), hopanoides, esteroides, almidón, sulfuro, sulfato y metabolitos secundarios (como la vitamina B12).
[0563] La muestra, o una parte de la misma, puede someterse a un ensayo de isótopos estables (SIP) de ADN/ARN para determinar el nivel de un segundo marcador único (FIG.1,1004;FIG.2,2004). SIP permite la determinación de la diversidad microbiana asociada con rutas metabólicas específicas, y se ha aplicado generalmente para estudiar microorganismos involucrados en la utilización de compuestos de carbono y nitrógeno. El sustrato de interés se marca con isótopos estables (tales como<13>C o<15>N), y se añade a la muestra. Sólo los microorganismos capaces de metabolizar el sustrato lo incorporarán a sus células. Posteriormente, el ADN<13>C y el ADN<15>N se pueden aislar mediante centrifugación en gradiente de densidad y usarse para análisis metagenómico. El SIP basado en ARN puede ser un biomarcador sensible para uso en estudios de SIP, ya que el ARN en sí es un reflejo de la actividad celular.
[0565] La muestra, o una parte de la misma, puede someterse a una matriz de isótopos para determinar el nivel de un segundo marcador único (FIG.1,1004;FIG.2,2004). Los conjuntos de isótopos permiten la detección funcional y filogenética de comunidades microbianas activas de manera de alto rendimiento. La técnica usa una combinación de SIP para monitorizar los perfiles de absorción de sustrato, y tecnología de micromatrices para determinar las identidades taxonómicas de comunidades microbianas activas. Las muestras se incuban con un sustrato marcado con<14>C, que durante el curso del crecimiento se incorpora a la biomasa microbiana. El ARNr marcado con<14>C se separa del ARNr no marcado, y entonces se marca con fluorocromos. El ARNr marcado con fluorescencia se hibrida con una micromatriz filogenética, seguido de un barrido en busca de señales radiactivas y fluorescentes. Por tanto, la técnica permite el estudio simultáneo de la composición de la comunidad microbiana y el consumo de sustrato específico por parte de microorganismos metabólicamente activos de comunidades microbianas complejas.
[0567] La muestra, o una parte de la misma, puede someterse a un ensayo de metabolómica para determinar el nivel de un segundo marcador único (FIG.1,1004;FIG.2,2004). La metabolómica estudia el metaboloma que representa la colección de todos los metabolitos, los productos finales de los procesos celulares, en una célula, tejido, órgano u organismo biológico. Esta metodología se puede usar para monitorizar la presencia de microorganismos y/o procesos mediados por microbios, ya que permite asociar perfiles de metabolitos específicos con diferentes microorganismos. Los perfiles de metabolitos intracelulares y extracelulares asociados con la actividad microbiana se pueden obtener usando técnicas tal como la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). La mezcla compleja de una muestra metabolómica se puede separar mediante técnicas como cromatografía de gases, cromatografía de líquidos de alta resolución, y electroforesis capilar. La detección de metabolitos puede realizarse mediante espectrometría de masas, espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), espectrometría de movilidad iónica, detección electroquímica (acoplada a HPLC) y radiomarcado (cuando se combina con cromatografía de capa fina).
[0568] Se puede determinar la presencia y el número respectivo de una o más cepas de microorganismos activos en una muestra (FIG. 1,1006;FIG. 2,2006). Por ejemplo, la información sobre la identidad de la cepa obtenida a partir del análisis del número y la presencia de los primeros marcadores se analiza para determinar cuántas veces aparece un primer marcador único, lo que representa una cepa de microorganismo única (por ejemplo, contando el número de lecturas de secuencia en un ensayo de secuenciación). Este valor puede representarse como un porcentaje del total de lecturas de secuencias del primer marcador para obtener un porcentaje de cepas de microorganismos únicas de un tipo de microorganismo concreto. Este porcentaje puede multiplicarse por el número de tipos de microorganismos (obtenido en la etapa 1002 o 2002, véanse laFIG. 1y laFIG. 2) para dar la abundancia absoluta de una o más cepas de microorganismos en una muestra y un volumen determinado. La una o más cepas de microorganismos se consideran activas, como se ha descrito anteriormente, si el nivel de expresión del segundo marcador único se encuentra en un nivel umbral, superior a un valor umbral, por ejemplo, superior al menos en aproximadamente un 5 %, al menos en aproximadamente un 10 %, al menos en aproximadamente un 20 % o al menos en aproximadamente un 30 % por encima de un nivel de control.
[0569] Se puede determinar un método de determinación de la abundancia absoluta de una o más cepas de microorganismos en una pluralidad de muestras (FIG. 2, véase, en particular, 2007). Para que una cepa de microorganismo sea clasificada como activa, basta con que esté activa en una de las muestras. Las muestras pueden tomarse en múltiples momentos de la misma fuente, o pueden ser de diferentes fuentes ambientales (por ejemplo, diferentes animales).
[0570] Los valores de abundancia absoluta en las muestras pueden usarse para relacionar una o más cepas de microorganismos activos con un parámetro ambiental (FIG. 2,2008). El parámetro ambiental puede ser la presencia de una segunda cepa de microorganismos activos. La relación entre una o más cepas de microorganismos activos y el parámetro ambiental puede llevarse a cabo determinando la coexistencia de la cepa y el parámetro mediante correlación o mediante análisis de redes.
[0571] La determinación de la coexistencia de una o más cepas de microorganismos activos con un parámetro ambiental puede comprender un método de análisis de redes y/o de clústeres para medir la conectividad de las cepas o de una cepa con un parámetro ambiental dentro de una red, en donde la red es una colección de dos o más muestras que comparten un parámetro ambiental común o similar. El método de análisis de redes y/o agrupaciones puede aplicarse para determinar la coexistencia de dos o más cepas de microorganismos activos en una muestra (FIG.
[0572] 2,2008). El análisis de redes puede comprender enfoques no paramétricos, incluida la información mutua, para establecer la conectividad entre variables. El análisis de redes puede comprender análisis de vinculación, análisis de modularidad, medidas de robustez, medidas de intermediación, medidas de conectividad, medidas de transitividad, medidas de centralidad o una combinación de las mismas (FIG. 2,2009). El método de análisis de agrupaciones puede comprender la construcción de un modelo de conectividad, un modelo de subespacio, un modelo de distribución, un modelo de densidad o un modelo de centroide y/o el uso de algoritmos de detección de comunidades, tales como los algoritmos Louvain, Bron-Kerbosch, Girvan-Newman, Clauset-Newman-Moore, Pons-Latapy y Wakita-Tsurumi (FIG.2,2010).
[0573] El método de análisis de agrupaciones puede ser un método heurístico basado en la optimización de la modularidad. El método de análisis de agrupaciones puede ser el método Louvain. Véase, por ejemplo, el método descrito por Blondel et al. (2008). Fast unfolding of communities in large networks. Journal of Statistical Mechanics: Theory and Experiment, Volumen 2008, Octubre de 2008.
[0574] El análisis de redes puede comprender el modelado predictivo de redes mediante la extracción y predicción de enlaces, la clasificación colectiva, la agrupación basada en enlaces, la similitud relacional o una combinación de los mismos. El análisis de redes puede comprender el modelado de poblaciones basado en ecuaciones diferenciales. El análisis de redes puede comprender el modelado de Lotka-Volterra.
[0575] Relacionar una o más cepas de microorganismos activos con un parámetro ambiental (por ejemplo, determinar la coexistencia) en la muestra puede comprender la creación de matrices pobladas con enlaces que indican asociaciones entre parámetros ambientales y cepas de microorganismos.
[0576] Los datos de múltiples muestras obtenidos en la etapa 2007 (por ejemplo, más de dos muestras que pueden recogerse en dos o más puntos temporales, donde cada punto temporal corresponde a una muestra individual) pueden compilarse. El número de células de cada una de las cepas de microorganismos en cada muestra puede almacenarse en una matriz de asociación (que puede ser, en algunas realizaciones, una matriz de abundancia). La matriz de asociación puede usarse para identificar asociaciones entre cepas de microorganismos activos en una muestra de un momento específico usando enfoques de minería de reglas ponderados con datos de asociación (por ejemplo, abundancia). En una realización se aplican filtros para eliminar reglas insignificantes.
[0577] La abundancia absoluta de una o más, o dos o más, cepas de microorganismos activos puede estar relacionada con uno o más parámetros ambientales (FIG.2,2008), por ejemplo, mediante la determinación de la coexistencia. Los parámetros ambientales los escoge el usuario dependiendo de las muestras que se van a analizar, y no están restringidos por los métodos descritos aquí. El parámetro ambiental puede ser un parámetro de la propia muestra, por ejemplo pH, temperatura, cantidad de proteína en la muestra. Alternativamente, el parámetro ambiental es un parámetro que afecta un cambio en la identidad de una comunidad microbiana (es decir, en el que la "identidad" de una comunidad microbiana se caracteriza por el tipo de cepas de microorganismos y/o el número de cepas de microorganismos particulares en una comunidad), o se ve afectado por un cambio en la identidad de una comunidad microbiana. Por ejemplo, un parámetro ambiental es la ingesta de alimentos de un animal o la cantidad de leche (o el contenido de proteínas o grasas de la leche) producida por un rumiante lactante. El parámetro ambiental puede ser la presencia, actividad y/o abundancia de una segunda cepa de microorganismos en la comunidad microbiana, presente en la misma muestra.
[0578] Un parámetro ambiental puede denominarse parámetro de metadatos.
[0579] Otros ejemplos de parámetros de metadatos incluyen, pero no se limitan a, información genética del hospedante del que se obtuvo la muestra (por ejemplo, información de mutación del ADN), pH de la muestra, temperatura de la muestra, expresión de una proteína o ARNm particular, condiciones de nutrientes (por ejemplo, nivel y/o identidad de uno o más nutrientes) del entorno/ecosistema circundante), susceptibilidad o resistencia a enfermedades, aparición o progresión de enfermedades, susceptibilidad o resistencia de la muestra a toxinas, eficacia de compuestos xenobióticos (fármacos), biosíntesis de productos naturales, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, los cambios en el número de cepas de microorganismos pueden calcularse en múltiples muestras según el método de laFIG.2(es decir, en 2001-2007). Se compilan los cambios en el número de cepas de una o más cepas activas a lo largo del tiempo (por ejemplo, una o más cepas que inicialmente se identificaron como activas según la etapa 2006), y se anota la direccionalidad del cambio (es decir, los valores negativos indican disminuciones, los valores positivos indican aumentos). El número de células a lo largo del tiempo se representa como una red, en la que las cepas de microorganismos representan los nodos y las reglas ponderadas por abundancia representan los bordes. Se aprovechan las cadenas de Markov y los paseos aleatorios para determinar la conectividad entre nodos y definir clústeres. Los clústeres en una realización se filtran usando metadatos para identificar los clústeres asociados con metadatos deseables (FIG.2, 2008).
[0580] Las cepas de microorganismos pueden clasificarse según su importancia integrando los cambios en el número de células a lo largo del tiempo y las cepas presentes en las agrupaciones objetivo, con los cambios más altos en el número de células en la clasificación más alta.
[0581] El método de análisis de redes y/o clústeres puede usarse para medir la conectividad de una o más cepas dentro de una red, en donde la red es una colección de dos o más muestras que comparten un parámetro ambiental común o similar. El análisis de redes puede comprender análisis de vinculación, análisis de modularidad, medidas de robustez, medidas de intermediación, medidas de conectividad, medidas de transitividad, medidas de centralidad o una combinación de las mismas. El análisis de redes puede comprender el modelado predictivo de redes mediante la minería y predicción de vínculos, la teoría de redes sociales, la clasificación colectiva, la agrupación basada en enlaces, la similitud relacional o una combinación de las mismas. El análisis de redes puede comprender el modelado de poblaciones basado en ecuaciones diferenciales. El análisis de redes puede comprender el modelado de Lotka-Volterra.
[0582] El método de análisis de agrupaciones comprende la construcción de un modelo de conectividad, un modelo subespacial, un modelo de distribución, un modelo de densidad, o un modelo de centroide.
[0583] El análisis basado en redes y agrupaciones, por ejemplo, para llevar a cabo la etapa 2008 del método de laFIG.
[0584] 2,puede realizarse a través de un módulo. Como se usa en el presente documento, un módulo puede ser, por ejemplo, cualquier conjunto, instrucciones y/o conjunto de componentes eléctricos acoplados operativamente, y puede incluir, por ejemplo, una memoria, un procesador, trazas eléctricas, conectores ópticos, software (que se ejecuta en hardware) y/o similares.
[0585] Resistencia y eliminación de patógenos bovinos
[0586] En algunos aspectos, la presente divulgación se refiere a la administración de una o más composiciones microbianas descritas en el presente documento a vacas para eliminar los microbios patógenos del tubo gastrointestinal. En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere además a la administración de composiciones microbianas descritas en el presente documento para prevenir la colonización de microbios patógenos en el tubo gastrointestinal. En algunas realizaciones, la administración de composiciones microbianas descritas en el presente documento elimina además los patógenos del tegumento y de las vías respiratorias de las vacas, y/o previene la colonización de patógenos en el tegumento y en las vías respiratorias. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones microbianas descritas en el presente documento reduce el intestino permeable/permeabilidad intestinal, la inflamación y/o la incidencia de enfermedades hepáticas.
[0587] En algunas realizaciones, las composiciones microbianas de la presente divulgación comprenden uno o más microbios que están presentes en el tubo gastrointestinal de las vacas en una abundancia relativa de menos del 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, o 0,01%.
[0588] En algunas realizaciones, después de la administración de las composiciones microbianas de la presente divulgación, el uno o más microbios están presentes en el tubo gastrointestinal de la vaca en una abundancia relativa de al menos el 0,5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95%.
[0589] Los microbios patógenos de las vacas pueden incluir lo siguiente:Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Salmonella typi, Salmonella typhimurium, Salmonella enterica, Salmonella pullorum, Erysipelothrix insidiosa, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari, Listeria monocytogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Corynebacterium bovis, Mycoplasmasp.,Citrobactersp.,Enterobactersp.,Pseudomonas aeruginosa, Pasteurellasp.,Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus,y cepas patógenas deEscherichia coliyStaphylococcus aureus.En algunas realizaciones, los microbios patógenos incluyen patógenos víricos. En algunas realizaciones, los microbios patógenos son patógenos tanto para las vacas como para los seres humanos. En algunas realizaciones, los microbios patógenos son patógenos tanto cualquiera de las vacas y los seres humanos.
[0590] En algunas realizaciones, la administración de las composiciones de la presente divulgación a las vacas modula la composición del microbioma gastrointestinal, de modo que los microbios administrados superan a los patógenos microbianos presentes en el tubo gastrointestinal. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones de la presente divulgación a vacas que albergan patógenos microbianos supera a los patógenos y elimina los patógenos de las vacas. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones de la presente divulgación da como resultado la estimulación de la inmunidad del huésped y ayuda a eliminar los patógenos microbianos. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones de la presente divulgación introduce microbios que producen componentes bacteriostáticos y/o bactericidas que disminuyen o eliminan los patógenos microbianos de las vacas (patente de EE. UU.8.345.010).
[0591] En algunas realizaciones, exponer a las vacas a un colonizador microbiano o patógeno microbiano después de administrar una o más composiciones de la presente divulgación evita que el colonizador microbiano o patógeno microbiano crezca hasta una abundancia relativa superior al 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, o 0,01%.. En realizaciones adicionales, exponer a las vacas a un colonizador microbiano o patógeno microbiano después de administrar una o más composiciones de la presente divulgación evita que el colonizador microbiano o patógeno microbiano colonice las vacas.
[0592] En algunas realizaciones, la eliminación del colonizador microbiano o del patógeno microbiano se produce en menos de 25 días, menos de 24 días, menos de 23 días, menos de 22 días, menos de 21 días, menos de 20 días, menos de 19 días, menos de 18 días, menos de 17 días, menos de 16 días, menos de 15 días, menos de 14 días, menos de 13 días, menos de 12 días, menos de 11 días, menos de 10 días, menos de 9 días, menos de 8 días, menos de 7 días, menos de 6 días, menos de 5 días, menos de 4 días, menos de 3 días o menos de 2 días tras la administración de una o más composiciones de la presente divulgación.
[0593] En algunas realizaciones, la eliminación del colonizador microbiano o del patógeno microbiano se produce en un plazo de 1 a 30 días, 1 a 25 días, 1 a 20 días, 1 a 15 días, 1 a 10 días, 1 a 5 días, 5 a 30 días, 5 a 25 días, 5 a 20 días, 5 a 15 días, 5 a 10 días, 10-30 días, 10-25 días, 10-20 días, 10-15 días, 15-30 días, 15-25 días, 15-20 días, 20-30 días, 20-25 días o 25-30 días tras la administración de una o más composiciones de la presente divulgación.
[0594] Rasgos mejorados
[0595] En algunos aspectos, la presente divulgación se refiere a la administración de composiciones microbianas descritas en el presente documento a rumiantes para mejorar uno o más rasgos mediante la modulación de aspectos de la producción de leche, la cantidad de leche, la calidad de la leche, la química digestiva de los rumiantes y la eficiencia de la utilización y digestibilidad del pienso.
[0596] En algunas realizaciones, es deseable mejorar la cantidad de grasa de la leche producida por un rumiante, en donde la grasa de la leche incluye triglicéridos, triacilglicéridos, diacilglicéridos, monoacilglicéridos, fosfolípidos, colesterol, glucolípidos y ácidos grasos libres. En realizaciones adicionales, los ácidos grasos libres incluyen ácidos grasos de cadena corta (es decir, C4:0, C6:0 y C8:0), ácidos grasos de cadena media (es decir, C10:0, C10:1, C12:0, C14:0, C14:1 y C15:0) y ácidos grasos de cadena larga (es decir, C16:0, C16:1, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1, C18:2, C18:3 y C20:0). En realizaciones adicionales, es deseable lograr un aumento en la eficiencia de la grasa de la leche, que se mide por el peso total de la grasa de la leche producida, dividido por el peso del pienso ingerido. El peso de la grasa de la leche producida se calcula a partir del porcentaje de grasa medido multiplicado por el peso de la leche producida.
[0597] En algunas realizaciones, es deseable mejorar la cantidad de hidratos de carbono en la leche producida por un rumiante, en donde los hidratos de carbono incluyen lactosa, glucosa, galactosa y oligosacáridos. Tao et al. (2009. J. Dairy Sci.92:2991-3001) divulgan numerosos oligosacáridos que pueden encontrarse en la leche bovina. En algunas realizaciones, es deseable mejorar la cantidad de proteínas en la leche producida por un rumiante, en donde las proteínas incluyen caseínas y suero. En algunas realizaciones, las proteínas de interés son solo aquellas proteínas producidas en la leche. En otras realizaciones, no es necesario que las proteínas de interés se produzcan solo en la leche. Las proteínas del suero de la leche incluyen inmunoglobulinas, albúmina sérica, betalactoglobulina y alfa-lactoglobulina.
[0598] En algunas realizaciones, es deseable mejorar la cantidad de vitaminas en la leche producida por un rumiante. Las vitaminas que se encuentran en la leche incluyen las vitaminas liposolubles A, D, E y K, así como las vitaminas B que se encuentran en la fase acuosa de la leche.
[0599] En algunas realizaciones, es deseable mejorar la cantidad de minerales en la leche producida por un rumiante. Los minerales que se encuentran en la leche incluyen hierro, zinc, cobre, cobalto, magnesio, manganeso, molibdeno, calcio, fósforo, potasio, sodio, cloro y ácido cítrico. En la leche se pueden encontrar cantidades traza de los siguientes: aluminio, arsénico, boro, bromo, cadmio, cromo, flúor, yodo, plomo, níquel, selenio, silicio, plata, estroncio y vanadio.
[0600] En algunas realizaciones, es deseable mejorar el rendimiento y el volumen de leche producidos por un rumiante. En algunas realizaciones, es aún más deseable que el aumento del rendimiento y el volumen de leche no vaya acompañado simplemente de un aumento del volumen de soluto.
[0601] En algunas realizaciones, es deseable mejorar la leche corregida por energía (ECM). En realizaciones adicionales, mejorar la ECM equivale a aumentar la producción calculada de ECM. En algunas realizaciones, la ECM se calcula de la siguiente manera: ECM = (0,327 x libras de leche) (12,95 x libras de grasa) (7,2 x libras de proteína). En algunas realizaciones, es deseable mejorar la eficiencia y la digestibilidad del pienso para animales. En algunas realizaciones, es deseable aumentar la degradación de los componentes lignocelulósicos del pienso para animales. Los componentes lignocelulósicos incluyen lignina, celulosa y hemicelulosa.
[0602] En algunas realizaciones, es deseable aumentar la concentración de ácidos grasos en el rumen de los rumiantes. Los ácidos grasos incluyen ácido acético, ácido propiónico y ácido butírico. En algunas realizaciones, es deseable mantener el equilibrio del pH en el rumen para evitar la lisis de consorcios microbianos beneficiosos. En algunas realizaciones, es deseable mantener el equilibrio del pH en el rumen para evitar una reducción de los consorcios microbianos beneficiosos.
[0603] En algunas realizaciones, es deseable disminuir la cantidad de metano y estiércol producidos por los rumiantes. En algunas realizaciones, es deseable mejorar la ingesta de materia seca. En algunas realizaciones, es deseable mejorar la eficiencia de la utilización del nitrógeno del pienso y la materia seca ingerida por los rumiantes.
[0604] En algunas realizaciones, los rasgos mejorados de la presente divulgación son el resultado de la administración de las composiciones microbianas descritas actualmente. Se cree que las composiciones microbianas modulan el microbioma de los rumiantes de tal manera que la bioquímica del rumen se modifica de tal forma que el sustrato líquido y sólido ruminal se degrada de manera más eficiente y más completa en subcomponentes y metabolitos que en los rumiantes a los que no se les han administrado las composiciones microbianas de la presente divulgación.
[0605] En algunas realizaciones, el aumento de la eficiencia y el aumento de la degradación del sustrato ruminal dan como resultado un aumento de las características mejoradas de la presente divulgación.
[0606] Modo de acción: Mejora en la digestibilidad en rumiantes
[0607] El rumen es un estómago especializado dedicado a la digestión de los componentes del pienso en los rumiantes. Una población microbiana diversa habita en el rumen, donde su función principal gira en torno a la conversión de los componentes de hidratos de carbono fibrosos y no fibrosos en fuentes utilizables de energía y proteínas (FIG.
[0608] 16). La celulosa, en particular, constituye hasta el 40 % de la biomasa vegetal y se considera indigesta para los mamíferos. También está estrechamente relacionada con otros hidratos de carbono estructurales, como la hemicelulosa, la pectina y la lignina. Los microbios celulolíticos del rumen aprovechan una amplia actividad enzimática para descomponer estas moléculas en azúcares simples y ácidos grasos volátiles. Esta actividad enzimática es fundamental para la extracción de energía del pienso, y una degradación más eficiente proporciona en última instancia más energía al animal. Los azúcares solubles que se encuentran en la parte no fibrosa del pienso también se fermentan en gases y ácidos grasos volátiles como el butirato, el propionato y el acetato. Los ácidos grasos volátiles que se producen a partir de la digestión de los componentes fibrosos y no fibrosos del pienso son, en última instancia, la principal fuente de energía del rumiante.
[0609] Se han probado ácidos grasos individuales en rumiantes con el fin de identificar sus efectos en diversos aspectos de la producción.
[0610] Acetato:Los hidratos de carbono estructurales producen grandes cantidades de acetato cuando se degradan. Se ha demostrado que una infusión de acetato directamente en el rumen mejora la producción de leche, así como la cantidad de grasa de la leche producida. El acetato representa al menos el 90 % de los ácidos en la sangre periférica; es posible que el acetato pueda ser utilizado directamente por el tejido mamario como fuente de energía. Véase Rook y Balch.1961. Brit. J. Nutr.15:361-369.
[0611] Propionato:Se ha demostrado que el propionato aumenta la producción de proteínas de la leche, pero disminuye la producción de leche. Véase Rook y Balch.1961. Brit. J. Nutr.15:361-369.
[0612] Butirato:Una infusión de butirato directamente en el rumen de las vacas lecheras aumenta la producción de grasa de la leche sin alterar la producción de leche. Véase Huhtanen et al.1993. J. Dairy Sci.76:1114-1124.
[0613] Análisis de redes
[0614] Se utiliza un método de análisis de redes y/o clústeres, que no se reivindica, para medir la conectividad de una o más cepas dentro de una red, en donde la red es una colección de dos o más muestras que comparten un parámetro ambiental común o similar. El análisis de redes puede comprender análisis de vinculación, análisis de modularidad, medidas de robustez, medidas de intermediación, medidas de conectividad, medidas de transitividad, medidas de centralidad o una combinación de las mismas. El análisis de redes puede comprender el modelado predictivo de redes mediante la minería y predicción de vínculos, la teoría de redes sociales, la clasificación colectiva, la agrupación basada en enlaces, la similitud relacional o una combinación de las mismas. El análisis de redes puede comprender información mutua, cálculos del coeficiente de información máxima (MIC) u otros métodos no paramétricos entre variables para establecer la conectividad. El análisis de redes puede comprender el modelado de poblaciones basado en ecuaciones diferenciales. El análisis de redes puede comprender el modelado de Lotka-Volterra.
[0615] El parámetro ambiental puede ser un parámetro de la propia muestra, por ejemplo pH, temperatura, cantidad de proteína en la muestra. Alternativamente, el parámetro ambiental es un parámetro que afecta un cambio en la identidad de una comunidad microbiana (es decir, en el que la "identidad" de una comunidad microbiana se caracteriza por el tipo de cepas de microorganismos y/o el número de cepas de microorganismos particulares en una comunidad), o se ve afectado por un cambio en la identidad de una comunidad microbiana. Por ejemplo, un parámetro ambiental en una realización es la ingesta de alimentos de un animal o la cantidad de leche (o el contenido de proteínas o grasas de la leche) producida por un rumiante lactante. El parámetro ambiental puede ser la presencia, actividad y/o abundancia de una segunda cepa de microorganismos en la comunidad microbiana, presente en la misma muestra. Un parámetro ambiental puede denominarse parámetro de metadatos.
[0616] Otros ejemplos de parámetros de metadatos incluyen, pero no están limitados a, la información genética del huésped del que se obtuvo la muestra (por ejemplo, información sobre mutaciones del ADN), el pH de la muestra, la temperatura de la muestra, la expresión de una proteína o ARNm concretos, las condiciones nutricionales (por ejemplo, el nivel y/o la identidad de uno o más nutrientes) del entorno/ecosistema circundante, susceptibilidad o resistencia a enfermedades, aparición o progresión de enfermedades, susceptibilidad o resistencia de la muestra a toxinas, eficacia de compuestos xenobióticos (fármacos), biosíntesis de productos naturales o una combinación de los mismos.
[0617] EJEMPLOS
[0618] Ejemplo I. Aumento de la grasa de la leche total, la proteína láctea y la leche corregida por energía (ECM) en vacas
[0619] Los métodos del Ejemplo I tienen como objetivo aumentar la cantidad total de grasa de la leche y proteína de la leche producidas por un rumiante lactante, y la ECM calculada.
[0620] Las metodologías aquí presentadas, basadas en la utilización de los microbios aislados, consorcios y composiciones que los comprenden, demuestran un aumento en la cantidad total de grasa de la leche y proteína de la leche producida por un rumiante lactante. Estos aumentos se realizaron sin necesidad de añadir hormonas adicionales.
[0621] En este ejemplo, se administró un consorcio microbiano que comprendía dos microbios aislados, Ascusb_3138 (SEQ ID NO:28; depositada como NRRL Y-67248) y Ascusf_15 (SEQ ID NO:32; depositada como NRRL Y67249), a vacas Holstein en fase intermedia de lactancia durante un periodo de cinco semanas.
[0622] Las vacas se asignaron aleatoriamente a 2 grupos de 8, en donde uno de los grupos era un grupo de control que recibió un tampón que carecía de un consorcio microbiano. Al segundo grupo, el grupo experimental, se le administró un consorcio microbiano que comprendía Ascusb_3138 (SEQ ID NO:28) y Ascusf_15 (SEQ ID NO:32) una vez al día durante cinco semanas. Cada una de las vacas se alojó en establos individuales, y se les dio libre acceso a alimento y agua. La dieta fue una dieta de alto rendimiento lácteo. Las vacas se alimentaron a voluntad y el alimento se pesó al final del día, y los rechazos del día anterior se pesaron y descartaron. El pesaje se realizó con una báscula PS-2000 de Salter Brecknell (Fairmont, MN).
[0623] Las vacas se canularon de manera que una cánula se extendiera hasta el rumen de las vacas. Además, a las vacas se les proporcionó al menos 10 días de recuperación después de la canulación antes de administrar dosis de control o dosis experimentales.
[0624] Cada administración consistió en 20 ml de una solución salina tamponada neutra, y cada administración consistió en aproximadamente 10<9>células suspendidas en la solución salina. El grupo de control recibió 20 ml de la solución salina una vez al día, mientras que el grupo experimental recibió 20 ml de la solución salina que además comprendía 10<9>células microbianas del consorcio microbiano descrito.
[0625] Se tomaron muestras del rumen de cada vaca los días 0, 7, 14, 21 y 35, en el que el día 0 fue el día anterior a la administración microbiana. Tenga en cuenta que las administraciones experimental y de control se realizaron después de que se tomó la muestra del rumen ese día. Se insertó un muestreo diario del rumen, comenzando el día 0, con un medidor de pH de Hanna Instruments (Woonsocket, RI) en el fluido del rumen recolectado, para realizar registros. El muestreo del rumen incluyó muestreo de partículas y fluidos de las regiones central, dorsal, ventral, anterior y posterior del rumen a través de la cánula, y las cinco muestras se agruparon en viales cónicos de 15 ml que contenían 1,5 ml de disolución de parada (95 % de etanol, 5 % de fenol). También se recogió una muestra fecal cada día de muestreo, en la que las heces se recogieron del recto con el uso de una manga de palpación. Las vacas se pesaron en el momento de cada muestreo.
[0626] Las muestras fecales se colocaron en un vial de 2 onzas, se almacenaron congeladas, y se analizaron para determinar los valores de digestibilidad aparente de fibras detergentes neutras (NDF), digestibilidad aparente de almidón, y digestibilidad aparente de proteínas. El muestreo del rumen consistió en tomar muestras de porciones de líquido y partículas del rumen, cada una de las cuales se almacenó en un tubo cónico de 15 ml. Las células se fijaron con una disolución de parada al 10 % (mezcla de 5 % de fenol y 95 % de etanol) y se mantuvieron a 4 °C y se enviaron a Ascus Biosciences (Vista, California) en hielo.
[0627] La producción de leche se midió dos veces al día, una por la mañana y otra por la noche. La composición de la leche (% de grasas y % de proteínas, etc.) se midió dos veces al día, una vez por la mañana y otra por la noche. Las muestras de leche se analizaron adicionalmente con espectroscopia de infrarrojo cercano para grasas proteicas, sólidos, análisis de nitrógeno ureico en leche (MUN), y recuentos de células somáticas (SCC) en la Tulare Dairy Herd Improvement Association (DHIA) (Tulare, California). El consumo de alimento de cada vaca y el pH del rumen se determinaron una vez al día.
[0628] Se recogió una muestra de la ración mixta total (RTM) el último día del período de adaptación, y después se recogió sucesivamente una vez por semana. El muestreo se realizó con el método de despiece, en el que las muestras se almacenaron en bolsas selladas al vacío que se enviaron a Cumberland Valley Analytical Services (Hagerstown, MD) y se analizaron con el paquete NIR1.
[0629] El último día de administración del tampón y/o los bioconsorcios microbianos fue el día 35, sin embargo, todas las demás mediciones y muestreos continuaron como se ha descrito hasta el día 46.
[0630] Tabla 12: Medias por mínimos cuadrados (± EEM) de la ingesta de materia seca, producción y composición de la leche, aumento de peso corporal (PC) y pH del rumen de vacas asignadas a los grupos de Control e Inoculado.
[0632]
[0633]
[0636]
[0638] LaTabla 12revela los efectos de la administración diaria de un consorcio microbiano Ascus sobre el rendimiento de vacas Holstein multíparas (entre 60 y 120 días con leche). Se observaron diferencias notables entre los tratamientos de control y los inoculados. El grupo inoculado experimentó aumentos en todos los parámetros, excepto en FCM/DMI y pH ruminal. Los valores semanales al comienzo del periodo de intervención, cuando las vacas aún se estaban adaptando al tratamiento, se incluyen en los cálculos.
[0639] Las FIG. 4-7demuestran los efectos significativos de los consorcios microbianos en las vacas lecheras para la producción diaria de leche, la producción diaria de proteína cruda de la leche, la producción diaria de grasa de la leche y la producción diaria de leche corregida por energía a lo largo del tiempo. Tras un periodo de adaptación inicial, durante el cual se observó que los microbios colonizaban el rumen, las características de producción del grupo de tratamiento inoculado aumentaron y se diferenciaron del grupo de control.
[0640] La FIG.3Ademuestra que las vacas a las que se administró el consorcio microbiano exhibieron un aumento del 20,9 % en la producción promedio de grasa de la leche en comparación con las vacas a las que se administró solo la disolución tamponada. LaFIG. 3Bdemuestra que las vacas a las que se administró el consorcio microbiano exhibieron un aumento del 20,7 % en la producción promedio de proteína de la leche en comparación con las vacas a las que se administró solo la disolución tamponada. LaFIG. 3Cdemuestra que las vacas a las que se administró el consorcio microbiano exhibieron un aumento del 19,4 % en la producción promedio de leche corregida por energía. Los aumentos observados en lasFIG. 3A-Cse hicieron menos pronunciados tras cesar la administración de los consorcios, como se muestra en la línea vertical que interseca los puntos de datos.
[0641] LaFIG.14identifica claramente el efecto de los consorcios microbianos en el recuento de células somáticas en la leche. El grupo experimental de vacas que recibieron los consorcios microbianos exhibió una disminución en el número de vacas con más de 200.000 células somáticas/ml de leche. En el campo de la ganadería lechera, el SCC es un indicador fiable de la calidad de la leche. La mayoría de las células somáticas que se encuentran en la leche son leucocitos, células inmunitarias que se acumulan en un tejido o líquido concreto en cantidades cada vez mayores, normalmente debido a una respuesta inmunitaria a un patógeno. Por lo general, cuanto menor es el SCC, mayor es la calidad de la leche. Dosogne et al.2011. J. Dairy Sci.86(3):828-834.
[0642] Ejemplo II. Aumento de la grasa de la leche y la proteína de la leche totales en vacas
[0643] En determinadas realizaciones de la divulgación, los métodos actuales tienen como objetivo aumentar la cantidad total de grasa de la leche y proteína de la leche producida por un rumiante lactante.
[0644] Las metodologías presentadas en el presente documento, basadas en la utilización de los microbios aislados divulgados, consorcios y composiciones que los comprenden, tienen el potencial de aumentar la cantidad total de grasa de leche y proteína de la leche producida por un rumiante lactante. Estos aumentos pueden lograrse sin necesidad de adición adicional de hormonas.
[0645] En este ejemplo, se administran siete consorcios microbianos que comprenden microbios aislados de laTabla 1a vacas Holstein en fase intermedia de lactancia durante un periodo de seis semanas. Los consorcios son los siguientes:
[0646] Consorcio 1 - Ascusb_7, Ascusb_32, Ascusf_45 y Ascusf_24;
[0647] Consorcio 2 - Ascusb_7, Ascusb_1801, Ascusf_45 y Ascusf_24;
[0648] Consorcio 3 - Ascusb_7, Ascusb_268, Ascusf_45 y Ascusf_24;
[0649] Consorcio 4 - Ascusb_7, Ascusb_232, Ascusf_45 y Ascusf_24;
[0650] Consorcio 5 - Ascusb_7, Ascusb_32, Ascusf_45 y Ascusf_249;
[0651] Consorcio 6 - Ascusb_7, Ascusb_32, Ascusf_45 y Ascusf_353; y
[0652] Consorcio 7 - Ascusb_7, Ascusb_32, Ascusf_45 y Ascusf_23.
[0653] Consorcio 8 - Ascusb_3138, Ascusb_1801, Ascusf_45 y Ascusf_15.
[0654] Consorcio 9 - Ascusb_3138, Ascusb_268, Ascusf_45 y Ascusf_15.
[0655] Consorcio 10 - Ascusb_3138, Ascusb_232, Ascusf_23 y Ascusf_15.
[0656] Consorcio 11 - Ascusb_7, Ascusb_3138, Ascusf_15 y Ascusf_249.
[0657] Consorcio 12 - Ascusb_7, Ascusb_3138, Ascusf_45 y Ascusf_15.
[0658] Consorcio 13 - Ascusb_3138, Ascusb_32, Ascusf_15 y Ascusf_23.
[0659] Consorcio 14 - Ascusb_3138 y Ascusf_15.
[0660] Las vacas se asignan aleatoriamente a 15 grupos de 8, en donde uno de los grupos es un grupo de control que recibe un tampón que carece de un consorcio microbiano. Los siete grupos restantes son grupos experimentales y a cada uno se le administrará uno de los trece bioconsorcios microbianos una vez al día durante seis semanas. Cada una de las vacas se mantiene en corrales individuales para mitigar la contaminación cruzada y se les da libre acceso a pienso y agua. La dieta es una dieta de alta producción de leche. Las vacas se alimentan dos veces al día y el pienso se pesa en cada comida, y los restos del día anterior se pesan y se desechan. El pesaje se realiza con una báscula PS-2000 de Salter Brecknell (Fairmont, Minnesota).
[0661] Se coloca una cánula a las vacas de manera que esta se extienda hasta el rumen. Además, se les proporciona al menos 10 días de recuperación después de la colocación de la cánula antes de administrarles las dosis de control o las dosis experimentales.
[0662] Cada administración consiste en 5 ml de una solución salina tamponada neutra, y cada administración consiste en aproximadamente 10<9>células suspendidas en la solución salina. El grupo de control recibe 5 ml de la solución salina una vez al día, mientras que los grupos experimentales reciben 5 ml de la solución salina que además contiene 10<9>células microbianas de los consorcios descritos.
[0663] Se toman muestras del rumen de cada vaca los días 0, 7, 14, 21 y 35, siendo el día 0 el día anterior a la administración microbiana. Cabe señalar que las administraciones experimentales y de control se realizan después de tomar la muestra del rumen ese día. El muestreo diario del rumen, que comienza el día 0, se realiza con un medidor de pH de Hanna Instruments (Woonsocket, RI) que se inserta en el líquido ruminal recogido para realizar los registros. El muestreo del rumen incluyó muestreo de partículas y fluidos de las regiones central, dorsal, ventral, anterior y posterior del rumen a través de la cánula, y las cinco muestras se agruparon en viales cónicos de 15 ml que contenían 1,5 ml de disolución de parada (95 % de etanol, 5 % de fenol). También se recogió una muestra fecal cada día de muestreo, en donde se recogieron heces del recto con el uso de una manga de palpación. Las vacas se pesan en el momento de cada muestreo.
[0664] Las muestras fecales se colocan en un vial de 59,15 ml (2 onzas), se almacenan congeladas y se analizan para determinar los valores de digestibilidad aparente de NDF, digestibilidad aparente de almidón y digestibilidad aparente de proteínas. El muestreo del rumen consiste en tomar muestras tanto de la parte líquida como de la parte particulada del rumen, cada una de las cuales se almacena en un tubo cónico de 15 ml. Las células se fijan con una disolución de parada al 10 % (mezcla de 5 % de fenol y 95 % de etanol) y se mantuvieron a 4 °C y se enviaron a Ascus Biosciences (Vista, California) en hielo.
[0665] La producción de leche se mide dos veces al día, una vez por la mañana y otra vez por la noche. La composición de la leche (% de grasas y % de proteínas, etc.) se mide dos veces al día, una vez por la mañana y otra vez por la noche. Las muestras de leche se analizan posteriormente con espectroscopia de infrarrojo cercano para proteínas, grasas, sólidos, análisis de nitrógeno ureico de la leche (MUN) y el recuento de células somáticas (SCC) en la Tulare Dairy Herd Improvement Association (DHIA) (Tulare, California). La ingesta de pienso de cada vaca y el pH ruminal se determinan una vez al día.
[0666] Se recoge una muestra de la ración mixta total (TMR) el último día del periodo de adaptación y, a continuación, se recoge una vez a la semana. El muestreo se realiza con el método de cuartos, en donde las muestras se almacenan en bolsas selladas al vacío que se envían a Cumberland Valley Analytical Services (Hagerstown, Maryland) y se analizan con el paquete NIR1.
[0667] En algunas realizaciones, se espera que el porcentaje de grasas y el porcentaje de proteínas de la leche en cada uno de los grupos de vacas experimentales muestren un aumento estadísticamente significativo con respecto al porcentaje de grasas y el porcentaje de proteínas de la leche en el grupo de vacas de control. En otras realizaciones, no se espera que el aumento sea estadísticamente significativo, pero se espera que siga siendo cuantificable.
[0668] Ejemplo III. Cambio del microbioma de los rumiantes
[0669] En determinadas realizaciones de la divulgación, los presentes métodos tienen como objetivo modular el microbioma de los rumiantes mediante la administración de uno o más microbios al tubo gastrointestinal de los rumiantes.
[0670] Las metodologías presentadas en el presente documento, basadas en la utilización de los microbios aislados, consorcios y composiciones que los comprenden, tienen el potencial de modular el microbioma de los rumiantes. La modulación del microbioma gastrointestinal de un rumiante puede conducir a un aumento de los rasgos deseables de la presente divulgación.
[0671] En este ejemplo, los consorcios microbianos de laTabla 5se administran a vacas Holstein durante un período de seis semanas.
[0672] Las vacas se asignan aleatoriamente a 37 grupos de 8, en donde uno de los grupos es un grupo de control que recibe un tampón que carece de un consorcio microbiano. Los treinta y seis grupos restantes son grupos experimentales y a cada uno de ellos se le administrará uno de los treinta y seis consorcios microbianos una vez al día durante seis semanas. Cada una de las vacas se mantiene en corrales individuales para mitigar la contaminación cruzada y se les da libre acceso a pienso y agua. La dieta es una dieta de alta producción de leche. Las vacas se alimentan dos veces al día y el pienso se pesa en cada comida, y los restos del día anterior se pesan y se desechan. El pesaje se realiza con una báscula PS-2000 de Salter Brecknell (Fairmont, Minnesota).
[0673] Se coloca una cánula a las vacas de manera que esta se extienda hasta el rumen. Además, se les proporciona al menos 10 días de recuperación después de la colocación de la cánula antes de administrarles las dosis de control o las dosis experimentales.
[0674] Cada administración consiste en 5 ml de una solución salina tamponada neutra, y cada administración consiste en aproximadamente 10<9>células suspendidas en la solución salina. El grupo de control recibe 5 ml de la solución salina una vez al día, mientras que los grupos experimentales reciben 5 ml de la solución salina que además contiene 10<9>células microbianas de los consorcios descritos.
[0675] Se toman muestras del rumen de cada vaca los días 0, 7, 14, 21 y 35, siendo el día 0 el día anterior a la administración. Cabe señalar que las administraciones experimentales y de control se realizan después de tomar la muestra del rumen ese día. El muestreo diario del rumen, que comienza el día 0, se realiza con un medidor de pH de Hanna Instruments (Woonsocket, RI) que se inserta en el líquido ruminal recogido para realizar los registros. El muestreo del rumen incluyó muestreo de partículas y fluidos de las regiones central, dorsal, ventral, anterior y posterior del rumen a través de la cánula, y las cinco muestras se agruparon en viales cónicos de 15 ml que contenían 1,5 ml de disolución de parada (95 % de etanol, 5 % de fenol). También se recogió una muestra fecal cada día de muestreo, en donde se recogieron heces del recto con el uso de una manga de palpación. Las vacas se pesan en el momento de cada muestreo.
[0676] Las muestras fecales se colocan en un vial de 59,15 ml (2 onzas), se almacenan congeladas y se analizan para determinar los valores de digestibilidad aparente de NDF, digestibilidad aparente de almidón y digestibilidad aparente de proteínas. El muestreo del rumen consiste en tomar muestras tanto de la parte líquida como de la parte particulada del rumen, cada una de las cuales se almacena en un tubo cónico de 15 ml. Las células se fijan con una disolución de parada al 10 % (mezcla de 5 % de fenol y 95 % de etanol) y se mantuvieron a 4 °C y se enviaron a Ascus Biosciences (Vista, California) en hielo.
[0677] Las muestras de las partes líquidas y particuladas del rumen, así como las muestras fecales, se evalúan para obtener la huella genética del microbioma utilizando el método T-RFLP combinado con la ordenación nMDS y las estadísticas PERMANOVA.
[0678] En algunas realizaciones, se espera que el microbioma ruminal y fecal de cada uno de los grupos de vacas experimentales muestre un cambio estadísticamente significativo en los microbiomas con respecto a los microbiomas del grupo de vacas de control, así como a las muestras de microbioma del día 0, en donde el cambio es un aumento significativo de la proporción de microbios administrados en las administraciones experimentales. En otras realizaciones, no se espera que el aumento sea estadísticamente significativo, pero se espera que siga siendo cuantificable.
[0679] Ejemplo IV. Grasa de la leche producida frente a abundancia absoluta de microbios
[0680] Determinar los constituyentes de la comunidad microbiana del rumen que impactan la producción de grasa láctea en vacas lecheras.
[0681] Ocho vacas Holstein lactantes, canuladas ruminalmente, se alojaron en establos individuales para uso en el experimento. Las vacas eran alimentadas dos veces al día, ordeñadas dos veces al día, y tenían acceso continuo a agua dulce. Una vaca (vaca 4201) fue retirada del estudio después de la primera Depresión de Grasa Láctea en la dieta debido a complicaciones derivadas de un aborto antes del experimento.
[0682] Diseño y tratamiento experimental:El experimento usó un diseño cruzado con 2 grupos y 1 período experimental. El período experimental duró 38 días: 10 días para el período de covariable/lavado y 28 días para la recopilación de datos y el muestreo. El período de recopilación de datos consistió en 10 días de Depresión de Grasa Láctea (MFD) en la dieta y 18 días de recuperación. Después del primer período experimental, todas las vacas se sometieron a un período de reposo farmacológico de 10 días antes del comienzo del período 2.
[0683] La MFD dietética se indujo con una ración mixta total (TMR) baja en fibra (29 % NDF) con alta degradabilidad del almidón (70 % degradable) y altos niveles de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA, 3,7 %). La fase de Recuperación incluyó dos dietas variables en la degradabilidad del almidón. Cuatro vacas se asignaron aleatoriamente a una dieta de recuperación alta en fibra (37 % FND), baja en PUFA (2,6 %) y alta en degradabilidad del almidón (70 % degradable). Las cuatro vacas restantes se alimentaron con una dieta de recuperación rica en fibra (37 % FDN), baja en PUFA (2,6 %), pero baja en degradabilidad del almidón (35 %).
[0684] Durante los períodos de covariable de 10 días y de reposo farmacológico de 10 días, las vacas se alimentaron con una dieta alta en fibra, baja en PUFA y baja degradabilidad del almidón.
[0685] Muestras y Medidas:La producción de leche, el consumo de materia seca y la eficiencia alimenticia se midieron diariamente para cada animal durante los períodos de covariable, de reposo y de recolección de muestras. Se midieron muestras de TMR para determinar la composición de nutrientes. Durante el período de recolección, se recolectaron y analizaron muestras de leche cada 3 días. Las muestras se analizaron para determinar las concentraciones de los componentes de la leche (grasa de la leche, proteína de la leche, lactosa, nitrógeno ureico de la leche, recuentos de células somáticas, y sólidos) y composiciones de ácidos grasos.
[0686] Se recolectaron y analizaron muestras de rumen para determinar la composición y actividad de la comunidad microbiana cada 3 días durante el período de recolección. Se tomaron muestras intensivas del rumen 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22 horas después de la alimentación durante los días 0, 7 y 10 de la MFD en la dieta. Del mismo modo, se tomaron muestras intensivas del rumen 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22 horas después de la alimentación en el día 16 y el día 28 del periodo de recolección de muestras. Los contenidos ruminales se analizaron para determinar el pH, la concentración de acetato, la concentración de butirato, la concentración de propionato, la concentración de isoácidos, y las concentraciones de isómeros de CLA y de cadena larga. El muestreo del rumen incluyó tanto el muestreo de partículas como de fluidos de las regiones central, dorsal, ventral, anterior y posterior del rumen a través de la cánula, y las cinco muestras se reunieron en viales cónicos de 15 ml.
[0687] Preparación y secuenciación de muestras de rumen:Tras su recogida, las muestras de rumen se centrifugaron a 4.000 rpm en una centrífuga de cubeta oscilante durante 20 minutos a 4 °C. Se decantó el sobrenadante y se añadió una alícuota de cada muestra de contenido ruminal (1-2 mg) a un tubo estéril de 1,7 ml precargado con perlas de vidrio de 0,1 mm. Se recogió una segunda alícuota, y se almacenó en un tubo vacío y estéril de 1,7 ml para el recuento celular.
[0688] Las muestras de rumen en tubos vacíos se tiñeron y se pasaron por un citómetro de flujo para cuantificar el número de células de cada tipo de microorganismo en cada muestra. Las muestras de rumen con perlas de vidrio se homogeneizaron con batido con perlas para lisar los microorganismos. El ADN y el ARN se extrajeron y purificaron de cada muestra, y se prepararon para la secuenciación en un Illumina Miseq. Las muestras se secuenciaron mediante química de extremos pares, con 300 pares de bases secuenciados en cada extremo de la biblioteca.
[0689] Secuenciación, procesamiento de lectura y análisis de datos:Las lecturas de secuenciación se recortaron por calidad y se procesaron para identificar las especies bacterianas presentes en el rumen basándose en un gen marcador, ARNr 16S o ITS1 y/o ITS2. Se integraron conjuntos de datos de recuento y de actividad con las lecturas de secuenciación para determinar el número absoluto de células de especies microbianas activas dentro de la comunidad microbiana del rumen. Las características de producción de la vaca a lo largo del tiempo, incluidas las libras de leche producidas, se vincularon con la distribución de microorganismos activos dentro de cada muestra durante el transcurso del experimento usando información mutua.
[0690] Los casos de prueba para determinar el impacto de los datos de recuento, los datos de actividad y el recuento y la actividad en el resultado final se ejecutaron omitiendo los conjuntos de datos apropiados del análisis de secuenciación. Para evaluar el impacto del uso de una correlación lineal en lugar de la MIC en la selección de objetivos, también se calcularon los coeficientes de Pearson para las libras de grasa de la leche producidas en comparación con la abundancia relativa de todos los microorganismos y la abundancia absoluta de microorganismos activos.
[0691] Resultados
[0692] Uno de los componentes de la tecnología de Ascus Biosciences utilizada en esta solicitud aprovecha la información mutua para clasificar la importancia de las cepas microbianas nativas que residen en el tubo gastrointestinal del animal en función de rasgos específicos del animal. Las puntuaciones del coeficiente de información máxima (MIC) se calculan para todos los microorganismos y el rasgo animal deseado. Las relaciones se puntuaron en una escala de 0 a 1, representando 1 una relación fuerte entre la cepa microbiana y el rasgo animal, y representando 0 que no hay relación. Se usa un valor de corte basado en esta puntuación para definir los microorganismos útiles y no útiles con respecto a la mejora de rasgos específicos. LaFIG. 9y laFIG. 10muestran la distribución de las puntuaciones MIC para las cepas microbianas del rumen que comparten una relación con la eficiencia de la grasa de la leche en las vacas lecheras. El punto en el que la curva pasa de exponencial a lineal (~0,45-0,5 para las bacterias y ~0,3 para los hongos) representa el valor de corte entre las cepas de microorganismos útiles y no útiles en relación con la eficiencia de la grasa de la leche. LaFIG. 11y laFIG. 12muestran las distribuciones de puntuación MIC para las cepas microbianas del rumen que guardan relación con la eficiencia lechera. El punto en el que la curva pasa de exponencial a lineal (~0,45-0,5 para las bacterias y ~0,25 para los hongos) representa el valor de corte entre las cepas de microorganismos útiles y no útiles.
[0693] Las MIC se calcularon entre las libras de grasa de la leche producidas y la abundancia absoluta de cada microorganismo activo. Los microorganismos se clasificaron según su puntuación MIC, y los microorganismos con las puntuaciones MIC más altas se seleccionaron como las especies diana más relevantes para las libras de leche producidas. Las puntuaciones MIC de los microbios de la presente divulgación se recogen en laTabla 1. Cuanto mayor es la puntuación MIC, mayor es la capacidad del microbio para conferir un aumento en el peso de la grasa de la leche producida por una vaca
[0694] Ejemplo V. Análisis comparativo de las puntuaciones MIC de trabajos publicados por otros gruposUtilizando la tecnología de Ascus Biosciences, se predijo el rendimiento de los productos aditivos microbianos para piensos disponibles en la actualidad.
[0695] Los productos microbianos de alimentación directa que afirman mejorar el rendimiento lechero están disponibles abiertamente en el mercado. Algunos de estos productos contienen cepas de microorganismos que son microorganismos nativos del rumen (Megasphaera elsdenii) o tienen una similitud de secuencia del 97 % con los microorganismos nativos del rumen. Los presentes inventores han identificado las especies de microbios utilizadas en estos productos y han calculado su puntuación MIC con respecto a la eficiencia de la grasa de la leche (FIG.
[0696] 13). Como se demuestra por la curva en laFIG.13, todas las cepas analizadas que estaban disponibles se situaron por debajo del umbral usado para definir las cepas útiles y no útiles, como se ha descrito anteriormente. La especie/cepa más cercana al umbral,Prevotella bryantii,ha mostrado un efecto positivo en un estudio.
[0697] Lactobacillus plantarum: MIC 0.28402
[0698] La MIC calculada predice queLactobacillus plantarumestá poco asociado con la eficiencia de la grasa de la leche, y la técnica divulga que una inoculación deL. plantarumno produce ningún aumento en el producto de grasa de la leche, y al menos un estudio divulga que algunas cepas deL. plantarumcrean moléculas que causan la depresión de la grasa de la leche. Véase Lee et al.2007. J. Appl. Microbiol.103(4):1140-1146 y Mohammed et al.
[0699] 2012. J. Dairy Sci.95(1):328-339.
[0700] Lactobacillus acidophilus: MIC 0.30048
[0701] La MIC calculada predice queLactobacillus acidophilusestá poco asociado con la eficiencia de la grasa de la leche, y la técnica divulga que la administración deL. acidophilusa vacas lecheras/terneros no tuvo ningún efecto en diversos aspectos de la producción de leche/producción de componentes de la leche. Véase Higginbotham y Bath.1993. J. Dairy Sci.76(2):615-620; Abu-Tarboush et al.1996. Animal Feed Sci. Tech.57(1-2):39-49; McGilliard y Stallings. 1998. J. Dairy Sci. 81(5):1353-1357; y Raeth-Knight et al. 2007. J. Dairy Sci. 90(4):1802-1809; pero véase Boydet al.2011.94(9):4616-4622 (divulga un aumento en la producción de leche y producción de proteína de la leche). Aunque Boydet al.divulgan un aumento en la producción de leche y proteína de la leche, los controles de este único estudio no parecen aislar adecuadamente la presencia deL. acidophiluscomo la causa del aumento. El conjunto de la técnica anterior contradice el hallazgo de Boydet al.
[0702] Megasphaera elsdenii: MIC 0.32548
[0703] La MIC calculada predice queMegasphaera elsdeniiestá poco relacionada con la eficiencia de la grasa de la leche, y el estado de la técnica proporciona pruebas sustanciales que sugieren queMegasphaera elsdeniino tiene ningún efecto positivo sobre la eficiencia de la grasa de la leche, pero múltiples referencias proporcionan pruebas que indican que tiene un efecto negativo sobre la eficiencia de la grasa de la leche. Véase Kim et al. 2002. J. Appl. Micro. 92(5):976-982; Hagg. 2008. Tesis doctoral, Universidad de Pretoria. 1-72; Hagg et al. 2010. S. African. J. Animal Sci.40(2):101-112; Zebeli et al.2011. J. Dairy Res.79(1):16-25; Aikman et al.2011. J. Dairy Sci.94(6):2840-2849; Mohammed et al. 2012. J. Dairy Sci. 95(1):328-339; y Cacite y Weimer. 2016. J. Animal Sci. Resumen del póster.94(sup.5):784.
[0704] Prevotella bryantii: MIC 0.40161
[0705] La MIC calculada predice quePrevotella bryantiino está muy relacionada con la eficiencia de la grasa de la leche, y la técnica proporciona pruebas de queP. bryantiiadministrada durante una prueba de acidosis subaguda en vacas lecheras en mitad de la lactancia no tiene ningún efecto aparente sobre la producción de leche, mientras que la administración del microbio a vacas lecheras en la fase inicial de la lactancia produce una mejora en las concentraciones de grasa de la leche. Véase Chiquette et al. 2012. J. Dairy Sci. 95(10):5985-5995, pero véase Chiquetteet al.2008.91(9):3536-3543; respectivamente.
[0706] Ejemplo VI. Cambio en la composición microbiana del rumen tras la administración de una composición microbiana
[0707] Los métodos del presente ejemplo tienen como objetivo aumentar la cantidad total de grasa de la leche y proteína de la leche producida por un rumiante lactante, y la leche corregida por energía (ECM) calculada.
[0708] Las metodologías aquí presentadas, basadas en la utilización de los microbios aislados, consorcios y composiciones que los comprenden, demuestran un aumento en la cantidad total de grasa de la leche y proteína de la leche producida por un rumiante lactante. Estos aumentos se realizaron sin necesidad de añadir hormonas adicionales.
[0709] En este ejemplo, se administró un consorcio microbiano que comprendía dos microbios aislados, Ascusb_3138 (SEQ ID NO:28) y Ascusf_15 (SEQ ID NO:32), a vacas Holstein en fase intermedia de lactancia durante un periodo de cinco semanas.
[0710] Las vacas se asignaron aleatoriamente a 2 grupos de 8, en en la que uno de los grupos era un grupo de control que recibió un tampón que carecía de un consorcio microbiano. Al segundo grupo, el grupo experimental, se le administró un consorcio microbiano que comprendía Ascusb_3138 (SEQ ID NO:28) y Ascusf_15 (SEQ ID NO:32) una vez al día durante cinco semanas. Cada vaca se alojó en un corral individual y se le dio libre acceso a pienso y agua. La dieta fue una dieta de alto rendimiento lácteo. Las vacas se alimentaron a voluntad y el pienso se pesó al final de cada día, y los restos del día anterior se pesaron y se desecharon. El pesaje se realizó con una báscula PS-2000 de Salter Brecknell (Fairmont, MN).
[0711] Las vacas se canularon de manera que una cánula se extendiera hasta el rumen de las vacas. Además, a las vacas se les proporcionó al menos 10 días de recuperación después de la canulación antes de administrar dosis de control o dosis experimentales.
[0712] Cada administración consistió en 20 ml de una solución salina tamponada neutra, y cada administración consistió en aproximadamente 10<9>células suspendidas en la solución salina. El grupo de control recibió 20 ml de la solución salina una vez al día, mientras que el grupo experimental recibió 20 ml de la solución salina que además comprendía 10<9>células microbianas del consorcio microbiano descrito.
[0713] Se tomaron muestras del rumen de cada vaca los días 0, 7, 14, 21 y 35, en el que el día 0 fue el día anterior a la administración microbiana. Tenga en cuenta que las administraciones experimental y de control se realizaron después de que se tomó la muestra del rumen ese día. Se insertó un muestreo diario del rumen, comenzando el día 0, con un medidor de pH de Hanna Instruments (Woonsocket, RI) en el fluido del rumen recolectado, para realizar registros. El muestreo del rumen incluyó tanto el muestreo de partículas como de fluidos del centro, las regiones dorsal, ventral, anterior y posterior del rumen a través de la cánula, y las cinco muestras se reunieron en viales cónicos de 15 ml que contenían 1,5 ml de disolución de parada (95 % de etanol, 5 % de fenol) y se almacenaron a 4 °C y se enviaron a Ascus Biosciences (Vista, California) en hielo.
[0714] Una parte de cada muestra de rumen se tiñó y se sometió a un citómetro de flujo para cuantificar el número de células de cada tipo de microorganismo en cada muestra. Una parte separada de la misma muestra de rumen se homogeneizó con batida con perlas para lisar los microorganismos. El ADN y el ARN se extrajeron y purificaron de cada muestra, y se prepararon para la secuenciación en un Illumina Miseq. Las muestras se secuenciaron mediante química de extremos pares, con 300 pares de bases secuenciados en cada extremo de la biblioteca. Las lecturas de secuenciación se usaron para cuantificar el número de células de cada miembro microbiano activo presente en el rumen de cada animal de los grupos de control y experimental a lo largo del experimento.
[0716] Tanto Ascusb_3138 como Ascusf_15 colonizaron y estuvieron activos en el rumen después de ~3-5 días de administración diaria, dependiendo del animal. Esta colonización se observó en el grupo experimental, pero no en el grupo de control. El rumen es un entorno dinámico, en el que la química de la población microbiana acumulada en el rumen está muy entrelazada. La adición artificial de Ascusb_3138 y Ascuf_15 podría tener efectos en la estructura general de la comunidad. Para evaluar este impacto potencial, se analizó toda la comunidad microbiana a lo largo del experimento con el fin de identificar cambios taxonómicos de mayor nivel en la población de la comunidad microbiana.
[0718] No se observaron tendencias distintivas en las poblaciones de hongos a lo largo del tiempo, aparte del mayor número de células de Ascusf_15 en los animales experimentales. Sin embargo, las poblaciones bacterianas cambiaron de forma más predecible. Para evaluar las tendencias de alto nivel en los animales individuales a lo largo del tiempo, se calcularon y compararon los porcentajes de composición de las poblaciones microbianas. Véase[0448] Tabla 13.Solo se analizaron los géneros que componían más del 1 % de la comunidad. Se observó que el porcentaje de composición de los géneros que contienen bacterias degradadoras de fibra conocidas, incluidoRuminococcus,aumentaba en los animales experimentales en comparación con los animales de control. Los géneros productores de ácidos grasos volátiles, incluida la agrupación XIVa de Clostridium,Clostridium, Pseudobutyrivibrio, ButyricimonasyLachnospira, también se encontraron en mayor abundancia en los animales experimentales. El mayor cambio se observó en el géneroPrevotella.Se ha demostrado que los miembros de este género participan en la digestión de la celobiosa, la pectina y diversos otros hidratos de carbono estructurales en el rumen.Prevotella sp.también ha sido implicada en la conversión de ligninas vegetales en antioxidantes beneficiosos (Schogor et al. PLOS One.9(4):e87949 (10 p.)).
[0720] Para medir de forma más directa los cambios cuantitativos en el rumen a lo largo del tiempo, se integraron los datos del recuento celular con los datos de secuenciación para identificar los cambios globales en la población a nivel celular. Los factores de cambio en los números de células se determinaron dividiendo el número promedio de células de cada género en el grupo experimental por el número promedio de células de cada género en el grupo de control. Véase laTabla 13.El análisis del recuento celular capturó muchos géneros que quedaban por debajo del umbral en el análisis anteriorPromicromonospora, Rhodopirellula, Olivibacter, Victivallis, Nocardia, Lentisphaera, Eubacteiru, Pedobacter, Butyricimonas, Mogibacterium,yDesulfovibriose encontraron al menos 10 veces más altos de media en los animales experimentales.Prevotella, Lachnospira, Butyricicoccus, Clostridium XIVa, Roseburia, Clostridium_sensu_stricto,yPseudobutyrivibriose encontraron aproximadamente 1,5 veces más altos en los animales experimentales.
[0722] Tabla 13: Análisis a nivel de familia y género de los cambios en las poblaciones bacterianas
[0724]
[0725] Tabla 14: Análisis de los factores de cambio en las células bacterianas
[0727]
[0729] Ejemplo VII. Análisis de microbios ruminales para la producción de ácidos grasos volátiles y el uso de fuentes de carbono
[0730] A. Producción de ácidos grasos volátiles (AGV)
[0731] Para evaluar la capacidad de las cepas para producir ácidos grasos volátiles, se utilizó cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) para medir la concentración de acetato, butirato y propionato en los medios usados. Se usó medio M2GSC en un ensayo que imitaba las condiciones del rumen lo más fielmente posible.
[0732] Para los cultivos puros, se inoculó una sola colonia de cada una de las cepas deseadas (de placas de agar anaerobio) en medio M2GSC. También se preparó un medio en blanco (control). Los cultivos y el medio en blanco se incubaron a 37 °C hasta que se observó un crecimiento significativo. Se determinó la densidad óptica (DO600) de cada cultivo y se confirmó la ID de la cepa mediante secuenciación Illumina. Se sometió una alícuota del cultivo a filtración estéril en un vial de muestra de vidrio lavado de 15 ml y se analizó mediante HPLC; los ensayos de HPLC se realizaron en la Universidad Estatal de Míchigan. Los enriquecimientos que mostraron crecimiento también se tiñeron y se contó el número de células para confirmar que las cepas individuales dentro de cada enriquecimiento crecieron. Las cepas aparecieron a menudo en múltiples enriquecimientos, por lo que en laTabla 15se indica el enriquecimiento con la mayor cantidad de crecimiento para la cepa (es decir, el mayor aumento en el número de células de esa cepa).
[0733] Debido a la gran complejidad de los metabolismos y los estilos de vida microbianos presentes en el rumen, muchos microorganismos del rumen son incapaces de crecer en condiciones axénicas. Con el fin de analizar estos organismos para características deseables, se establecieron cultivos de enriquecimiento en una variedad de condiciones que imitaban características particulares del entorno del rumen. Se inoculó líquido ruminal diluido (dilución 1/100) en medios M2GSC o M2 suplementados con una variedad de fuentes de carbono, incluyendo xilosa (4 g/L), manitol (4 g/L), glicerol (4 g/l), xilano (2 g/l), celobiosa (2 g/l), arabinosa (4 g/l), manosa (4 g/l), raminosa (2 g/l), maltosa (2 g/l) y melaza. En ocasiones, también se omitió el líquido ruminal de la receta. Las adiciones, incluyendo aminoácidos, ácidos grasos volátiles y antibióticos, también variaban entre los enriquecimientos. También se preparó un medio en blanco (control). Los cultivos y el medio en blanco se incubaron a 37 °C hasta que se observó un crecimiento significativo. Se determinó la densidad óptica (DO600) de cada cultivo y se confirmaron las ID de las cepas mediante secuenciación Illumina. Se sometió una alícuota del cultivo a filtración estéril en un vial de muestra de vidrio lavado de 15 ml y se analizó mediante HPLC; los ensayos de HPLC se realizaron en la Universidad Estatal de Míchigan. Los enriquecimientos que mostraron crecimiento también se tiñeron y se contó el número de células para confirmar que las cepas individuales dentro de cada enriquecimiento crecieron. Las cepas aparecieron a menudo en múltiples enriquecimientos, por lo que en laTabla 15se indica el enriquecimiento con la mayor cantidad de crecimiento para la cepa (es decir, el mayor aumento en el número de células de esa cepa).
[0735] Se cuantificaron las concentraciones de acetato, butirato y propionato para los medios en blanco, así como para las muestras de cultivo filtradas y esterilizadas, tanto para los experimentos con cepas puras como para los de enriquecimiento. Los parámetros de HPLC fueron los siguientes: Columna Biorad Aminex HPX-87H, 60 °C, fase móvil de 0,5 ml/minuto, H<2>SO<4>0,00325 N, 3,44 MPa (500 psi), detector RI de 35 °C, tiempo de ejecución de 45 minutos y volumen de inyección de 5 µl. Las concentraciones de acetato, butirato y propionato tanto para los cultivos puros como para los enriquecimientos se indican en laTabla 15.
[0737] Tabla 15. Producción de ácidos grasos volátiles de cepas microbianas analizadas con HPLC, normalizadas a 1 DO
[0739]
[0740]
[0741]
[0743] B. Ensayo de fuentes de carbono solubles
[0744] Para evaluar la capacidad de las cepas para degradar diversas fuentes de carbono, se usó una densidad óptica (DO600) para medir el crecimiento de las cepas en múltiples fuentes de carbono a lo largo del tiempo.
[0745] Para los aislados puros, se inoculó una sola colonia de cada una de las cepas deseadas (de placas de agar anaerobio) en medio M2GSC. También se preparó un medio en blanco (control). Las cepas se inocularon en un ensayo de fuente de carbono anaerobio, en donde el ensayo se preparó en una placa estéril de 96 pocillos de 2 ml, conteniendo cada pocillo sales RAMM, vitaminas, minerales, cisteína y una única fuente de carbono. Las fuentes de carbono incluían glucosa, xilano, lactato, xilosa, manosa, glicerol, pectina, melaza y celobiosa. Las células se inocularon de manera que cada pocillo comenzara con una DO600 de 0,01. Las densidades ópticas se leyeron a 600 nm con el lector de placas híbrido Synergy H4. Las ID de las cepas se confirmaron con secuenciación Illumina después de que todos los pocillos estuvieran en fase estacionaria.
[0746] Al igual que en el ensayo de ácidos grasos volátiles anterior, también se usaron enriquecimientos para analizar la degradación de la fuente de carbono. Se inoculó líquido ruminal diluido (dilución 1/100) en medios M2GSC o M2 suplementados con una variedad de fuentes de carbono, incluyendo xilosa (4 g/L), manitol (4 g/L), glicerol (4 g/l), xilano (2 g/l), celobiosa (2 g/l), arabinosa (4 g/l), manosa (4 g/l), raminosa (2 g/l), maltosa (2 g/l) y melaza. En ocasiones, también se omitió el líquido ruminal de la receta. Las adiciones, incluyendo aminoácidos, ácidos grasos volátiles y antibióticos, también variaban entre los enriquecimientos. También se preparó un medio en blanco (control). Los cultivos y el medio en blanco se incubaron a 37 °C hasta que se observó un crecimiento significativo. Se determinó la densidad óptica (DO600) de cada cultivo y se confirmaron las ID de las cepas mediante secuenciación Illumina. Los enriquecimientos que mostraron crecimiento también se tiñeron y se contó el número de células para confirmar que las cepas individuales dentro de cada enriquecimiento crecieron.
[0747] C. Ensayo de fuentes de carbono insolubles
[0748] Para evaluar la capacidad de las cepas para degradar fuentes de carbono insolubles, se aprovechó la inspección visual para determinar cualitativamente las capacidades de degradación de una cepa.
[0749] Para los cultivos puros, se inoculó una sola colonia de cada una de las cepas deseadas (de placas de agar anaerobio) en tubos Hungate anaerobios que contenían medios semidefinidos de Lowe con papel de celulosa, almidón o hierba como única fuente de carbono. (Lowe et al.1985. J. Gen. Microbiol.131:2225-2229). También se prepararon cultivos de enriquecimiento usando una dilución 1/100 de líquido ruminal usando las mismas condiciones de medio. Se comprobó visualmente la degradación de las fuentes de carbono insolubles en los cultivos (véase laFIG. 14). La ID de las cepas se confirmó usando secuenciación Illumina. Los enriquecimientos que mostraron crecimiento también se tiñeron y se contó el número de células para confirmar que las cepas individuales dentro de cada enriquecimiento crecieron.
[0750]
[0751]
[0752]
[0753]
[0754] Tabla 17: Recetas de medios M2GSC y M2
[0756]
[0758] Tabla 18: Recetas de medio de Wolfe modificado
[0760]
[0762] Todos los medios se prepararon con agua anaerobia (H<2>O DI hervida durante 15 minutos y luego enfriada a temperatura ambiente en un baño de agua mientras se burbujeaba con N<2>. Todos los medios se ajustaron a un pH de 6,8 con HCl 2M. A continuación, se distribuyeron 10 ml de medio en tubos Hungate de 15 ml y se burbujearon con 80 % de N<2>y 20 % de CO<2>durante 3 minutos.
[0763] Tabla 19: Receta de medio salino de RAMM
[0765]
[0766]
[0768] Después de la esterilización (autoclave) se añadieron: 2 ml de mezcla vitamínica de Wolfe modificado 250X, 10 ml de mezcla mineral de Wolfe modificado 50X y 5 ml de cisteína 100 mM.
[0769] Ejemplo VIII. Determinación de las puntuaciones de los coeficientes de información máxima (MIC) para cepas microbianas relevantes para las libras de leche producidas
[0770] Diseño experimental y materiales y métodos.
[0771] Objetivo:Determinar los constituyentes de la comunidad microbiana del rumen que impactan la producción de grasa láctea en vacas lecheras.
[0772] Animales:Ocho vacas Holstein lactantes, canuladas ruminalmente, se alojaron en establos individuales para uso en el experimento. Las vacas eran alimentadas dos veces al día, ordeñadas dos veces al día, y tenían acceso continuo a agua dulce. Una vaca (vaca 1) fue retirada del estudio después de la primera Depresión de Grasa Láctea en la dieta debido a complicaciones derivadas de un aborto antes del experimento.
[0773] Diseño y tratamiento experimental:El experimento usó un diseño cruzado con 2 grupos y 1 período experimental. El período experimental duró 38 días: 10 días para el período de covariable/lavado y 28 días para la recopilación de datos y el muestreo. El período de recopilación de datos consistió en 10 días de Depresión de Grasa Láctea (MFD) en la dieta y 18 días de recuperación. Después del primer período experimental, todas las vacas se sometieron a un período de reposo farmacológico de 10 días antes del comienzo del período 2.
[0774] La MFD dietética se indujo con una ración mixta total (TMR) baja en fibra (29 % NDF) con alta degradabilidad del almidón (70 % degradable) y altos niveles de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA, 3,7 %). La fase de Recuperación incluyó dos dietas variables en la degradabilidad del almidón. Cuatro vacas se asignaron aleatoriamente a una dieta de recuperación alta en fibra (37 % FND), baja en PUFA (2,6 %) y alta en degradabilidad del almidón (70 % degradable). Las cuatro vacas restantes se alimentaron con una dieta de recuperación rica en fibra (37 % FDN), baja en PUFA (2,6 %), pero baja en degradabilidad del almidón (35 %).
[0775] Durante los períodos de covariable de 10 días y de reposo farmacológico de 10 días, las vacas se alimentaron con una dieta alta en fibra, baja en PUFA y baja degradabilidad del almidón.
[0776] Muestras y Medidas:La producción de leche, el consumo de materia seca y la eficiencia alimenticia se midieron diariamente para cada animal durante los períodos de covariable, de reposo y de recolección de muestras. Se midieron muestras de TMR para determinar la composición de nutrientes. Durante el período de recolección, se recolectaron y analizaron muestras de leche cada 3 días. Las muestras se analizaron para determinar las concentraciones de los componentes de la leche (grasa de la leche, proteína de la leche, lactosa, nitrógeno ureico de la leche, recuentos de células somáticas, y sólidos) y composiciones de ácidos grasos.
[0777] Se recolectaron y analizaron muestras de rumen para determinar la composición y actividad de la comunidad microbiana cada 3 días durante el período de recolección. Se tomaron muestras intensivas del rumen 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22 horas después de la alimentación durante los días 0, 7 y 10 de la MFD en la dieta. De manera similar, se tomaron muestras intensivas del rumen 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22 horas después de la alimentación los días 16 y 28 durante el período de recuperación. Los contenidos ruminales se analizaron para determinar el pH, la concentración de acetato, la concentración de butirato, la concentración de propionato, la concentración de isoácidos, y las concentraciones de isómeros de CLA y de cadena larga.
[0778] Preparación y secuenciación de muestras de rumen:Tras su recogida, las muestras de rumen se centrifugaron a 4.000 rpm en una centrífuga de cubeta oscilante durante 20 minutos a 4 °C. Se decantó el sobrenadante y se añadió una alícuota de cada muestra de contenido ruminal (1-2 mg) a un tubo estéril de 1,7 ml precargado con perlas de vidrio de 0,1 mm. Se recogió una segunda alícuota, y se almacenó en un tubo vacío y estéril de 1,7 ml para el recuento celular.
[0779] Se homogeneizaron muestras de rumen con perlas de vidrio (1ª alícuota), batiendo las perlas para lisar los microorganismos. El ADN y el ARN se extrajeron y purificaron de cada muestra, y se prepararon para la secuenciación en un Illumina Miseq. Las muestras se secuenciaron mediante química de extremos pares, con 300 pares de bases secuenciados en cada extremo de la biblioteca. Se tiñeron muestras de rumen en tubos vacíos (2ª alícuota), y se sometieron a un citómetro de flujo para cuantificar el número de células de cada tipo de microorganismo en cada muestra.
[0780] Secuenciación, procesamiento de lectura y análisis de datos:Las lecturas de secuenciación se recortaron y procesaron con calidad para identificar especies bacterianas presentes en el rumen en función de un gen marcador. Se integraron conjuntos de datos de recuento y de actividad con las lecturas de secuenciación para determinar el número absoluto de células de especies microbianas activas dentro de la comunidad microbiana del rumen. Las características de producción de la vaca a lo largo del tiempo, incluidas las libras de leche producidas, se vincularon con la distribución de microorganismos activos dentro de cada muestra durante el transcurso del experimento usando información mutua. Los puntuaciones del coeficiente de informaciones máximas (MIC) se calcularon entre las libras de grasa láctea producidas y el recuento de células absoluto de cada microorganismo activo. Los microorganismos se clasificaron según su puntuación MIC, y los microorganismos con las puntuaciones MIC más altas se seleccionaron como las especies diana más relevantes para las libras de leche producidas.
[0781] Los casos de prueba para determinar el impacto de los datos de recuento, los datos de actividad y el recuento y la actividad en el resultado final se ejecutaron omitiendo los conjuntos de datos apropiados del análisis de secuenciación. Para evaluar el impacto del uso de una correlación lineal en lugar de la MIC en la selección de dianas, también se calcularon los coeficientes de Pearson para las libras de grasa láctea producidas en comparación con la abundancia relativa de todos los microorganismos y el recuento de células absoluto de los microorganismos activos.
[0782] Resultados y discusión
[0783] Abundancias relativas frente a recuentos de células absolutos
[0784] Se identificaron las 15 especies objetivo principales para el conjunto de datos que incluía datos de recuento celular (recuento celular absoluto,Tabla 21) y para el conjunto de datos que no incluía datos de recuento celular (abundancia relativa,Tabla 20) basándose en las puntuaciones de MIC. Los datos de actividad no se usaron en este análisis, para aislar el efecto de los datos del recuento de células en la selección final de las dianas. Al final, las 8 dianas principales fueron las mismas en los dos conjuntos de datos. De las 7 restantes, 5 cepas estaban presentes en ambas listas en diferente orden. A pesar de las diferencias en la clasificación de estas cinco cepas, la puntuación MIC calculada para cada cepa fue idéntica en las dos listas. Las dos cepas presentes en la lista de recuento de células absoluto pero no en la lista de abundancia relativa, ascus_111 y ascus_288, ocuparon el puesto 91 y el puesto 16, respectivamente, en la lista de abundancia relativa. Las dos cepas presentes en la lista de abundancia relativa pero no en la lista de recuento de células absoluto, ascus_102 y ascus_252, ocuparon el puesto 50 y el puesto 19, respectivamente, en la lista de recuento de células absoluto. Estas cuatro cepas tenían puntuaciones MIC diferentes en cada lista, lo que explica su cambio de clasificación y el impacto posterior en las otras cepas de la lista.
[0785] Tabla 20: Las 15 principales cepas diana que usan abundancia relativa sin filtro de actividad
[0787]
[0788]
[0790] Tabla 21: Las 15 principales cepas diana que usan el recuento de células absoluto sin filtro de actividad
[0792]
[0794] La integración de los datos del recuento celular no siempre afectó la puntuación MIC final asignada a cada cepa. Esto puede atribuirse al hecho de que, aunque la población microbiana cambió dentro del rumen diariamente y durante el transcurso del experimento de 38 días, siempre estuvo dentro de 10<7>-10<8>células por mililitro. Sin duda, cambios mucho mayores en las cifras de población tendrían un impacto más amplio en las puntuaciones MIC finales.
[0795] Especies inactivas frente a especies activas
[0796] Con el fin de evaluar el impacto del filtrado de cepas basado en datos de actividad, se identificaron las especies objetivo a partir de un conjunto de datos que aprovechaba la abundancia relativa con (Tabla 22) y sin (Tabla 20) datos de actividad, así como un conjunto de datos que aprovechaba los recuentos absolutos de células con (Tabla 23) y sin
[0797] (Tabla 21) datos de actividad.
[0798] Para el caso de abundancia relativa, ascus_126, ascus_1366, ascus_1780, ascus_299, ascus_1139, ascus_127, ascus_341 y ascus_252 se consideraron cepas diana antes de aplicar los datos de actividad. Estas ocho cepas (53 % de las 15 dianas principales iniciales) cayeron por debajo del puesto 15 después de integrar los datos de actividad. Se observó una tendencia similar para el caso del recuento de células absoluto. Ascus_126, ascus_1366, ascus_1780, ascus_299, ascus_1139, ascus_127 y ascus_341 (46 % de las 15 dianas principales iniciales) cayeron por debajo del intervalo 15 después de la integración del conjunto de datos de actividad.
[0799] Los conjuntos de datos de actividad tuvieron un efecto mucho más severo en la clasificación y selección de dianas que los conjuntos de datos de recuento de células. Al integrar estos conjuntos de datos, si se descubre que una muestra está inactiva, esencialmente se cambia a "0" y no se considera parte del análisis. Debido a esto, la distribución de puntos dentro de una muestra puede verse muy alterada o sesgada después de la integración, lo que a su vez afecta en gran medida la puntuación MIC final y, por lo tanto, el orden de clasificación de los microorganismos diana.
[0800] Tabla 22: Las 15 cepas objetivo principales usando la abundancia relativa con filtro de actividad
[0802]
[0804] Tabla 23: Las 15 principales cepas diana que usan el recuento de células absoluto con filtro de actividad
[0806] Abundancias relativas e inactivos frente a recuentos de células absolutos y activos
[0807] En última instancia, el método definido aquí aprovecha tanto los datos de recuento de células como los de actividad para identificar microorganismos altamente vinculados a características de metadatos relevantes. Entre los 15 objetivos principales seleccionados mediante ambos métodos (Tabla 23, Tabla 20), solo 7 cepas aparecían en ambas listas. Ocho cepas (53 %) fueron exclusivas del recuento de células absoluto y la lista de actividad. Las 3 dianas principales en ambas listas coincidieron tanto en cepa como en intervalo. Sin embargo, dos de las tres no tuvieron la misma puntuación MIC en ambas listas, lo que sugiere que fueron influidas por la integración del conjunto de datos de actividad, pero no lo suficiente como para alterar su orden de clasificación.
[0808] Correlaciones lineales frente a enfoques no paramétricos
[0809] Se calcularon los coeficientes de Pearson y las puntuaciones MIC entre las libras de grasa de la leche producidas y el recuento celular absoluto de microorganismos activos en cada muestra (Tabla 24). Las cepas se clasificaron según el MIC (Tabla 24a) o el coeficiente de Pearson (Tabla 24b) para seleccionar las cepas objetivo más relevantes para la producción de grasa de la leche. En cada caso, se informa tanto la puntuación MIC como el coeficiente de Pearson. Se encontraron seis cepas en ambas listas, lo que significa que se identificaron nueve (60 %) cepas únicas mediante el enfoque MIC. El orden de clasificación de las cepas entre las listas no coincidía: las 3 principales cepas diana identificadas por cada método también eran únicas.
[0810] Al igual que los coeficientes de Pearson, la puntuación MIC se informa en un intervalo de 0 a 1, en el que 1 sugiere una relación muy estrecha entre las dos variables. Aquí, las 15 dianas principales exhibieron puntuaciones de MIC que oscilaron entre 0,97 y 0,74. Sin embargo, los coeficientes de Pearson para el caso de prueba de correlación oscilaron entre 0,53 y 0,45, sustancialmente más bajos que el caso de prueba de información mutua. Esta discrepancia puede deberse a las diferencias inherentes a cada método de análisis. Si bien las correlaciones son una estimación lineal que mide la dispersión de puntos alrededor de una línea, la información mutua aprovecha las distribuciones de probabilidad y mide la similitud entre dos distribuciones. A lo largo del experimento, las libras de grasa de la leche producidas cambiaron de forma no lineal (FIG.18). Esta función particular puede representarse y aproximarse mejor mediante información mutua que mediante correlaciones. Para investigar esto, se representaron gráficamente las cepas objetivo principales identificadas mediante correlación e información mutua, Ascus_713 (FIG. 19) y Ascus_7 (FIG. 20) respectivamente, para determinar cómo de bien predecía cada método las relaciones entre las cepas y la grasa de la leche. Si dos variables muestran una fuerte correlación, se representan mediante una línea con poca o ninguna dispersión de puntos cuando se comparan entre sí. En laFIG.
[0811] 19, Ascus_713 se correlaciona débilmente con la grasa de la leche, como se indica por la amplia dispersión de puntos. La información mutua, nuevamente, mide qué tan similares son dos distribuciones de puntos. Cuando se representa gráficamente Ascus_7 con la grasa de la leche (FIG. 20), se observa que las distribuciones de ambos puntos son muy similares.
[0812] El presente método en su totalidad frente a enfoques convencionales
[0813] El enfoque convencional de analizar comunidades microbianas se basa en el uso de datos de abundancia relativa sin incorporación de información de actividad, y en última instancia termina con una simple correlación de especies microbianas con metadatos (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.º 9.206.680). Aquí, hemos mostrado cómo la incorporación de cada conjunto de datos influye incrementalmente en la lista final de dianas. Cuando se aplicó en su totalidad, el método descrito en el presente documento seleccionó un conjunto de objetivos completamente diferente en comparación con el método convencional (Tabla 24ayTabla 24c). Ascus_3038, la cepa objetivo principal seleccionada mediante el enfoque convencional, se representó gráficamente frente a la grasa de la leche para visualizar la fuerza de la correlación (FIG.24c). Al igual que el ejemplo anterior, Ascus_3038 también mostró una correlación débil con la grasa láctea.
[0814] Tabla 24: Las 15 principales cepas diana que usan información mutua o correlaciones
[0815] Tabla 24a. MIC usando recuento de células absoluto con filtro de actividad
[0817]
[0818]
[0820] Tabla 24b. Correlación usando el recuento de células absoluto con filtro de actividad
[0821]
[0823] Tabla 24c. Correlación usando abundancia relativa sin filtro de actividad
[0824]
[0827] Las composiciones mencionadas anteriormente, utilizadas en los métodos descritos, tienen características y/o propiedades notablemente diferentes que no poseen ninguna bacteria u hongo individual como existen de forma natural en el rumen. Las características y/o propiedades notablemente diferentes que poseen las composiciones mencionadas anteriormente, utilizadas en los métodos descritos, pueden ser estructurales, funcionales o ambas. Por ejemplo, las composiciones utilizadas en los métodos descritos poseen la propiedad funcional marcadamente diferente de poder aumentar la producción de leche o mejorar las características de composición de la leche, cuando se administran a un rumiante, como se enseña en el presente documento. Además, las composiciones utilizadas en los métodos descritos poseen la propiedad funcional marcadamente diferente de ser estables en anaquel.
[0829] Las especies microbianas mencionadas anteriormente, es decir, una población microbiana purificada que comprende una bacteria con una secuencia de ácido nucleico 16S y/o un hongo con una secuencia de ácido nucleico ITS, que es al menos aproximadamente un 97 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1-60 y 2045-2107 - son miembros de un grupo Markush, ya que la presente divulgación ilustra que los miembros pertenecen a una clase de microbios caracterizados por diversos atributos físicos y funcionales, que pueden incluir cualquiera de los siguientes: a) la capacidad de convertir una fuente de carbono en un ácido graso volátil, como acetato, butirato, propionato o combinaciones de los mismos; b) la capacidad de degradar una fuente de carbono soluble o insoluble; c) la capacidad de impartir un aumento en la producción de leche o características composicionales mejoradas de la leche a un rumiante al que se le administra el microbio; d) la capacidad de modular el microbioma del rumen de un rumiante al que se le administra el microbio; e) la capacidad de formularse en una composición estable en almacenamiento; y/o f) poseer una puntuación MIC de al menos aproximadamente 0,4 si se trata de una bacteria y poseer una puntuación MIC de al menos aproximadamente 0,2 si se trata de un hongo. Por lo tanto, los miembros del grupo Markush poseen al menos una propiedad en común, que puede ser responsable de su función en la relación reivindicada.
[0831] Tabla 25. Depósitos del Tratado de Budapest de la divulgación
[0833]

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES
1. Una composición oral que comprende:
a) una población purificada de hongosPichiaque comprende una secuencia de ácido nucleico ITS de SEQ ID NO: 32; y una población purificada de bacteriasClostridiumque comprende una secuencia de ácido nucleico ARNr 16S de SEQ ID NO: 28; y
b) un portador adecuado para la administración a rumiantes,
en donde la población purificada de hongosPichiayClostridiumestán presentes en la composición en una cantidad eficaz para aumentar la producción de leche o mejorar las características composicionales de la leche en un rumiante al que se le administra la composición, en comparación con un rumiante al que no se le administra la composición.
2. La composición según la reivindicación 1, en donde la población purificada de hongosPichiase deposita como NRRL Y- 67249.
3. La composición según la reivindicación 1, en donde la población purificada de bacteriasClostridiumse deposita como NRRL B-67248.
4. La composición según la reivindicación 1, que comprende además:
(i) una población purificada de bacterias que comprende una bacteria con una secuencia de ácido nucleico 16S que es al menos aproximadamente un 97 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1-30 y 2045-2103, y/o
(ii) una población purificada de hongos que comprende un hongo con una secuencia de ácido nucleico ITS que es al menos aproximadamente un 97 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en : SEQ ID NO: 31, 33-60 y 2104-2107.
5. La composición microbiana según la reivindicación 1, en donde:
(i) la composición está formulada para su administración a una vaca; o
(ii) la composición microbiana es estable en condiciones ambientales durante al menos un día; o
(iii) la composición está formulada como: encapsulado, comprimido, cápsula, píldora, aditivo para piensos, ingrediente alimentario, aditivo alimentario, preparado alimentario, complemento alimentario, disolución consumible, aditivo consumible en aerosol, sólido consumible, gel consumible, inyección, supositorio, bolo, rociado o combinaciones de los mismos; o
(iv) lasPichiaestán encapsuladas en un material de cubierta fusible; opcionalmente, en donde el material de cubierta fusible comprende: monosacárido, disacárido, trisacárido, polisacárido, cera, colofonia, bálsamo, goma laca, grasa animal, aceite animal, grasa vegetal, aceite vegetal, ácidos grasos o combinaciones de los mismos.
6. La composición microbiana según la reivindicación 1, en donde la población purificada de hongosPichiay bacteriasClostridiumen la composición microbiana comprende al menos 10<2>células.
7. Un método para aumentar la producción de leche o mejorar las características composicionales de la leche en un rumiante, que comprende la administración oral a un rumiante de una composición según la reivindicación 1.
8. El método según la reivindicación 7, en donde el rumiante es una vaca.
9. La composición microbiana según la reivindicación 1, o el método según la reivindicación 8, en donde el rumiante al que se le administra la cantidad eficaz de la composición muestra:
(i) un aumento en la producción de leche que conduce a un aumento medible en el rendimiento de leche; o (ii) un aumento en la producción de leche y características composicionales mejoradas de la leche que conducen a un aumento medible en la leche corregida por energía; o
(iii) una característica composicional mejorada de la leche seleccionada del grupo que consiste en: un aumento en la grasa o grasas de la leche, un aumento en la proteína o proteínas de la leche, un aumento de los hidratos de carbono en la leche, un aumento de las vitaminas en la leche, un aumento de los minerales en la leche, o combinaciones de los mismos.
10. El método según la reivindicación 7, en donde el rumiante al que se le ha administrado la cantidad eficaz de la composición muestra además:
al menos un rasgo fenotípico mejorado, seleccionado del grupo que consiste en: una eficiencia mejorada en la utilización del pienso, una digestibilidad mejorada, un aumento en la degradación de polisacáridos y lignina, un aumento de la concentración de ácidos grasos en el rumen, equilibrio del pH en el rumen, una reducción de las emisiones de metano, una reducción de la producción de estiércol, una mejora de la ingesta de materia seca, una mejora de la eficiencia en la utilización del nitrógeno, o combinaciones de los mismos.
11. El método según la reivindicación 7, en donde el rumiante al que se le ha administrado la cantidad eficaz de la composición muestra además: un cambio en la microbiota del rumen.
12. El método según la reivindicación 7, en donde el rumiante al que se le ha administrado la cantidad eficaz de la composición muestra además: un cambio en el microbioma del rumen,
en donde una primera población de microbios presentes en el rumen antes de la administración de la composición aumenta en abundancia después de la administración de la composición, y
en donde una segunda población de microbios presentes en el rumen antes de la administración de la composición disminuye en abundancia después de la administración de la composición.
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