ES3060502T3 - Peptides having inhibitory activity on neuronal exocytosis - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a péptidos capaces de inhibir la exocitosis neuronal y a productos que contienen dichos péptidos, en particular productos farmacéuticos y cosméticos útiles para mejorar afecciones, trastornos y/o enfermedades de la piel mediadas por la exocitosis neuronal, como arrugas, sudoración excesiva, prurito, inflamación cutánea, dermatitis, atopia, psoriasis, hiperreactividad vascular, rosácea, acné, crecimiento del cabello, cicatrización de heridas, callos, verrugas o afecciones de piel sensible, como úlceras y lesiones en la piel. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Péptidos que tienen actividad inhibidora sobre la exocitosis neuronal

[0003] Campo de la invención

[0004] La presente invención se refiere a péptidos que pueden inhibir la exocitosis neuronal y a productos que comprenden tales péptidos, en particular, productos farmacéuticos y cosméticos útiles para mejorar las afecciones, trastornos y/o enfermedades de la piel mediados por exocitosis neuronal.

[0005] Estado de la técnica

[0006] La acetilcolina (ACh) es un neurotransmisor de acción rápida, punto a punto en la unión neuromuscular, en los ganglios autónomos, inervación de la glándula y en una variedad de sitios dentro del sistema nervioso central y periférico. La ACh está contenida en las vesículas secretoras de las fibras colinérgicas presinápticas y se exocita a la hendidura sináptica que actúa sobre los receptores de membrana postsinápticos colinérgicos. La exocitosis neuronal es un proceso desencadenado por el potencial de acción y dependiente de Ca<2+>impulsado por proteínas de la familia del receptor de proteína de unión al factor sensible a N-etilmaleimida soluble (SNARE). NSF (proteína de fusión sensible a N-etilmaleimida) es una ATPasa hexamérica esencial para todas las etapas de tráfico de membrana intracelular. En su papel en el tráfico de membranas, NSF es reclutada a las membranas por SNAP (proteínas de unión de NSF solubles), que a su vez son reclutadas por un complejo de proteínas SNARE (receptor SNAP) formadas durante la fusión de membranas. Este complejo está formado por una sola vesícula SNARE, sinaptobrevina o proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP) y dos SNARE de membrana plasmática diana, denominadas sintaxina y SNAP25, que están implicadas en el acoplamiento de vesículas y la fusión de membranas a la membrana plasmática (Kasai et al., Physiol Rev., (2012), 92: 1915-1964).

[0007] El acoplamiento mediado por el complejo de proteínas SNARE y la fusión vesicular son elementos clave que controlan cualquier secreción de neurotransmisores (Purves et al., Neuroscience, 2.ª edición, (2001)), ya que comparten un mecanismo molecular idéntico. Entre otros y similar a la ACh, serotonina, histamina, GABA, glutamato, aspartato, ATP, adrenalina, noradrenalina, dopamina, epinefrina, norepinefrina o neuropéptidos (péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), sustancia P, neurocininas, VIP, neurotrofinas, endorfinas), se liberan a través de un mecanismo dependiente de SNARE.

[0008] La escisión de la proteína SNARE por las toxinas botulínicas (BoNT) interrumpe la fusión de vesículas y la liberación de neurotransmisores (Binz et al., Toxins (Basilea), (2010), 2(4):665-682). A nivel molecular, toxinas botulínicas BoNT/A, /C y /E escinden SNAP-25; BoNT/B, /D, /F y /G escinden VAMP. Sólo BoNT/C es capaz de escindir tanto SNAP25 como sintaxina (Schiavo et al., Physiol Rev. (2000); 80: 717-66). Por lo tanto, Las proteínas SNARE se han convertido en objetivos para compuestos y/o productos terapéuticos y/o cosméticos usados para tratar y/o prevenir afecciones desencadenadas por la liberación de neurotransmisores. De hecho, los tratamientos aprobados derivados de la toxina botulínica bloquean la liberación de neurotransmisores de las vesículas presinápticas al desactivar las proteínas SNARE, principalmente a través de SNAP-25 o VAMP (Zakin et al., Toxicon (2018), EP 2318033 A2, EP 1856139 A2, EP 1180524 A1, EP 2123673 A1, WO 97/34620).

[0009] La piel interactúa profundamente con el sistema nervioso periférico. La creciente evidencia indica que el sistema neurológico participa directamente en numerosos procesos de la piel. Por ejemplo, debido a la inhibición de la liberación de ACh, la principal aplicación cosmética de los productos derivados de la toxina botulínica es su conocido efecto antiarrugas que permite la relajación de los músculos faciales. No obstante, en la piel, las fibras colinérgicas proporcionan inervación a otras varias estructuras anexas dentro del sistema tegumentario, incluidas las glándulas sudoríparas, folículos pilosos, vasos sanguíneos y músculos, tales como los músculos erectores del pelo. De hecho, los derivados de la toxina botulínica se usan experimentalmente en una serie de afecciones dermatológicas, que incluyen hiperhidrosis, prevención de cicatrices, inflamación cutánea, cicatrización, enrojecimiento facial, neuralgia postherpética, control de sebo y picazón con resultados exitosos (Kim et al., Toxins (2017), 9, 403). El mecanismo general subyacente a estas indicaciones novedosas incluye, además de ACh, la inhibición de la liberación de sustancia P, CGRP, glutamato e histamina, o incluso activación de mastocitos.

[0010] Por ejemplo, afecciones de la piel con sudoración excesiva, tales como eccema dishidrótico o dermatosis inflamatoria, se puede mejorar además de la hipertranspiración termorreguladora clásica. La inhibición de la liberación de ACh evita su acción directa sobre la glándula sudorípara y sobre los músculos lisos que rodean las glándulas sudoríparas (Swartling et al., J. Am. Acad. Dermatol. (2002), 47, 667-671; Wollina, U., J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. (2002), 16, 40-42.). En este sentido, la toxina botulínica ha mostrado efectos beneficiosos sobre la dermatitis o la psoriasis, afecciones de la piel que se agravan por la transpiración excesiva, a través de la reducción de la sudoración local (Zanchi et al., J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. (2008), 22, 431-436.). Además, la consiguiente inhibición de la liberación de neuropéptidos, sustancia P y/o CGRP, reduce el prurito y la vasodilatación asociados (Humm et al, Exp. Neurol. (2000), 161, 361-372, Ishikawa. et al., Jpn. J. Opthalmol. (2000), 44, 106-109), lo que provoca molestias y empeora los síntomas.

[0011] La inhibición de la exocitosis neuronal disminuye y previene el prurito en varias afecciones y a través de diferentes mecanismos moleculares. La ACh media el picor en afecciones cutáneas pruriginosas como la dermatitis atópica (Hallett M., Ann. Neurol. (2000), 48, 7-8). La sustancia P se asocia con picor y eritema a través de la liberación de histamina a través de la activación de mastocitos, mientras que CGRP a través de la vasodilatación. Por lo tanto, la interrupción de la liberación del neurotransmisor correspondiente por la toxina botulínica reduce la sensación de picor, tanto histaminérgicos como no histaminérgicos (Gazerani et al., Br. J. Dermatol. (2009), 161737-745.). El picor pruritogénico se acompaña de inflamación de la piel y la supresión de la exocitosis neuronal disminuyendo la inflamación neurogénica, por lo que se reduce el picor en la dermatitis atópica y la psoriasis (Han et al., Dermatol. Surg. (2017); Ward et al., J. Investig. Dermatol. (2012), 132, 1927-1930; Saber et al., Arch. Dermatol. (2011), 147, 629-630; Gilbert et al., J. Drugs Dermatol. (2014), 13, 1407-1408; Gazerani et al., Br. J. Dermatol. (2009), 161737-745; Cao et al., Neuroreport. (2017), 28, 518-526; Ramachandran et al., Toxins (2018), 10, pii: E134). De forma similar, la dermatosis inflamatoria de la piel, tal como la rosácea, caracterizada por enrojecimiento facial y eritema, mejoran mediante el bloqueo de la liberación de ACh, Sustancia P y CGRP, ya que se reducen la vasodilatación cutánea y la inflamación local de la piel. (Eshghi et al., Acta Med. Iran (2016), 54, 454-457; Bloom et al., Dermatol. Surg. (2015), 41 (Suppl. 1), S9-S16; Geddoa et al., Int. J. Dermatol. (2013), 52, 1547-1550; Odo et al., Dermatol. Surg.2011, 37, 1579-1583).

[0012] En los apéndices de la piel, como las glándulas sebáceas, la ACh aumenta la síntesis de lípidos en los sebocitos, y la toxina botulínica reduce significativamente la producción de sebo en humanos (Min et al., Aesthet. Surg. J. (2015), 35, 600-610; Rose. et al., Dermatol. Surg. (2013), 39, 443-448). Por lo tanto, los músculos erectores del pelo y los receptores muscarínicos locales en las glándulas sebáceas son objetivos para la regulación neuromoduladora a través de la inhibición de la liberación de la ACh.

[0013] Finalmente, la inhibición de la liberación de la ACh se puede usar para prevenir y controlar la cicatrización y/o para controlar los síntomas de las cicatrices hipertróficas. La reducción de la liberación local de la ACh, inmoviliza los músculos que rodean el tejido de cicatrización y reduce la tensión de la piel. Este proceso alivia las fibras nerviosas atrapadas en el queloide neutralizando el picor asociado (Uyesugi et al., Am J Phys Med Rehabil. (2010), 89(2):153-155). En este sentido, se ha demostrado que la toxina botulínica inhibe la proliferación de fibroblastos, factor de crecimiento transformante beta, colágeno I y III, miosina II y el músculo liso a que actúan en el fibroblasto queloide (Xiao et al., Aesthet. Plast. Surg. (2011), 35, 802-807; Chen et al., Ann. Plast. Surg. 2016, 77, e46-e49; Jeong al., Plast. Reconstr. Surg. (2015), 136, 171e-178e; Wang, X. et al., Aesthet. Surg. J. (2014), 34, 154-159. Basándose en esto, los efectos potenciales del bloqueo de la exocitosis neuronal en los músculos y fibroblastos circundantes a la cicatriz sugieren su uso para la cicatrización y la prevención de cicatrices.

[0014] Por tanto, en su conjunto, la inhibición y/o modulación de la liberación de neurotransmisores es útil, no solo para las arrugas faciales y las disfunciones de los músculos motores, sino también para prevenir, tratar o cuidar nuevas afecciones relacionadas con la piel, como la transpiración excesiva, prurito, inflamación cutánea, dermatitis, atopía, psoriasis, hiperreactividad vascular, rosácea, acné, crecimiento del cabello, cicatrización, callosidades, verrugas o afecciones de la piel sensible, tales como úlceras y lesiones en la piel.

[0015] Los tratamientos derivados de la toxina botulínica requieren inyecciones repetidas y pueden provocar una reacción inmunitaria que pierde eficacia. Otros efectos secundarios son cefaleas, náuseas, parálisis o debilidad muscular e insuficiencia respiratoria. Además, la labilidad e inestabilidad de la preparación farmacéutica los convierte en tratamientos de alto coste. Por tanto, se requiere el desarrollo de estructuras moleculares más simples y más estables para sustituirlos. Para este fin, los péptidos derivados de la estructura primaria de las proteínas del complejo central SNARE son capaces de interrumpir la liberación de neurotransmisores.

[0016] Un hexapéptido sintético derivado de la estructura primaria del fragmento amino terminal de SNAP25 se usa ampliamente en el tratamiento y la prevención de las arrugas de expresión como se describe en los documentos EP1180524A1 y EP2123673A1. Este péptido voltea a través de la membrana e interfiere específicamente con SNAP25, perjudicando así el ensamblaje del complejo SNARE y la exocitosis de neurotransmisores.

[0017] De forma similar, los péptidos derivados de la región carboxi terminal de SNAP25, o de sinaptobrevina o sintaxina también se diseñaron para inhibir la exocitosis neuronal como se describe en el documento WO97/34620. Sin embargo, deben tener una longitud mínima de 20 aminoácidos y una longitud máxima de 28 para una actividad óptima. Por lo tanto, su gran tamaño aumenta los costes de producción y dificulta el desarrollo posterior como agentes cosméticos y/o terapéuticos.

[0018] Otros péptidos, no derivados directamente de proteínas complejas de núcleo SNARE con mecanismo desconocido, se reivindica que reducen la exocitosis neuronal como se describe en los documentos WO2013153192A1 y WO2013070808A1. Igualmente, los péptidos derivados de la subunidad C del componente de membrana V-ATPasa se describen en el documento WO2011/048443 como inhibidores de la exocitosis neuronal dirigiéndose a la sinaptobrevina y mostrando un posible efecto antiarrugas.

[0019] La patente de EE.UU. n.º 6.169.074 de Montal, et al. divulga combinaciones de péptidos que interfieren con el complejo SNARE dentro del espacio sináptico en la unión neuromuscular.

[0020] La patente de EE.UU. n.º 6.866.856 de Lu et al. describe limonoides (extractos de alcaloides de frutos cítricos) que inhiben la liberación de acetilcolina en la unión neuromuscular del músculo esquelético.

[0021] La patente de EE.UU. n.º 7.566.464 de Belfer enseña una composición para el cuidado de la piel que mejora la apariencia de las líneas de expresión del rostro humano. Este producto comprende un extracto de Acmella oleracea que relaja rápidamente los elementos musculares contráctiles y suprime la acción del músculo facial expresivo basándose en la sinergia de fortalecer la dermis e inhibir los tejidos musculares relacionados con las líneas de expresión.

[0022] La patente de EE.UU. n.º 7.015.192 de Blanes, et al. descubre que los péptidos derivados del extremo N-terminal de la proteína SNAP-25 dentro del complejo SNARE inhiben la liberación de acetilcolina. Se reivindica que la molécula principal, acetil hexapéptido-8 (también llamado formalmente acetil hexapéptido-3 o ARGIRELINE<®>) compite con la eficacia de la toxina botulínica pero reduce los riesgos derivados de la administración y el coste de producción. Hay moléculas anexas que regulan el complejo SNARE que también son importantes en la exocitosis neuronal. Por ejemplo, Snapin es una proteína de unión a SNAP25, que estabiliza el acoplamiento entre la sinaptotagmina 1 y el complejo SNARE durante la exocitosis desencadenada por Ca<2+>(Ilardi et al., Nat Neurosci. (1999)2:119-124; Buxton et al., Biochem. J. (2003) 375, 433-440). La eliminación de Snapin no elimina completamente la liberación de neurotransmisores, sino que reduce las corrientes postsinápticas excitatorias en un 70 % (Pan et al., Neuron. (2009) 61:412-424.), sugiriendo Snapin como un modulador no esencial en la exocitosis neuronal. El extremo terminal carboxi de Snapin recombinante bloqueó la asociación del complejo SNARE con sinaptotagmina. De hecho, los péptidos derivados de la secuencia de Ct-Snapin interrumpieron el ensamblaje del complejo SNARE, deteriorando la exocitosis neuronal (Ilardi et al., Nat Neurosci. (1999), 2: 119-124). Solo cuatro fragmentos peptídicos de 20 meros correspondientes al dominio de bobina enrollada C-terminal solo derivados de la posición 117 a 136 inhibieron la exocitosis. Por lo tanto, Snapin es una diana potencial para diseñar reguladores de exocitosis en lugar de inhibidores completos, probablemente reduciendo los efectos no deseados de tratamientos más potentes.

[0023] En conclusión, esta innovación proporciona una alternativa a las necesidades existentes y abarca la identificación de secuencias peptídicas novedosas, que son capaces de reducir la exocitosis neuronal.

[0024] Sumario de la invención

[0025] El solicitante ha encontrado sorprendentemente péptidos capaces de inhibir, o al menos reducir, la liberación de neurotransmisores, en particular acetilcolina y el neuropéptido CGRP, de las neuronas.

[0026] Incluso si el mecanismo molecular exacto aún no se ha dilucidado y confirmado completamente, y sin estar sujeto a ninguna teoría, los inventores creen que la inhibición o reducción de la exocitosis puede deberse a la modulación indirecta de la formación del complejo SNARE a través de la interrupción de la interacción SNAP25.

[0027] El solicitante ha descubierto que los péptidos que tienen las siguientes secuencias no. 1 a 5 tienen un efecto de bloqueo de la exocitosis neuronal y, en consecuencia, dichos péptidos pueden inhibir, o al menos reducir, la liberación de acetilcolina de las terminaciones nerviosas periféricas.

[0028] Seq. ID No.1 HYWRELQYR

[0029] Seq. ID No.2 MQVWLRMWIDYRAT

[0030] Seq. ID No.3 RRVVLVNNIL

[0031] Seq. ID No.4 LRVQMVNMFL

[0032] Seq. ID No.5 WEQEFLRR

[0033] El solicitante también ha descubierto que el efecto de bloqueo de exocitosis neuronal también se obtiene con secuencias que tienen una longitud de no más de 20 aminoácidos y que comprenden las secuencias descritas anteriormente no. 1 a 5, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 % y más preferiblemente al menos un 90 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias no. 1 a 5.

[0034] El solicitante también ha descubierto que el efecto de bloqueo de exocitosis neuronal puede modularse uniéndose al extremo N terminal de las secuencias descritas anteriormente no.1 a 5 un grupo alquil carbonilo, tal como, por ejemplo, un grupo acetilo, un grupo palmitoílo o un grupo miristoílo, así como formando una sal de las secuencias descritas anteriormente no. 1 a 5 con un anión adecuado, tal como, por ejemplo, cloruro, acetato o trifluoroacetato.

[0035] De acuerdo con ello, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones adjuntas 1 a 13, y un derivado o sal del mismo.

[0036] Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o cosmética que comprende (i) un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones adjuntas 1 a 13, y un derivado o sal del mismo, y (ii) al menos un ingrediente farmacéutica o cosméticamente aceptable.

[0037] Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al uso de un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones adjuntas 1 a 13, y un derivado o sal del mismo, para mejorar las afecciones, trastornos y/o enfermedades de la piel mediados por exocitosis neuronal.

[0038] Más en particular, las afecciones, los trastornos y/o las enfermedades mediados por exocitosis neuronal incluyen arrugas, transpiración excesiva, prurito, inflamación cutánea, dermatitis, atopía, psoriasis, hiperreactividad vascular, rosácea, acné, crecimiento del cabello, cicatrización, callosidades, verrugas o afecciones de la piel sensible, tales como úlceras y lesiones en la piel.

[0039] Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

[0040] Descripción detallada de la invención

[0041] De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención se refiere a un péptido que tiene longitud igual o inferior a 20 aminoácidos, preferiblemente igual o inferior a 15 aminoácidos, más preferiblemente igual o inferior a 10 aminoácidos, y que comprende la secuencia ID no. 1, o una secuencia que tiene al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 %, y más preferiblemente al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia ID no. 1, y un derivado o sal del mismo.

[0042] Según el mejor conocimiento de los inventores y solicitantes mencionados de la presente solicitud, ninguno de los péptidos descritos en el presente documento se conoce en la técnica antes de la prioridad de la presente solicitud. Sin embargo, cualquier péptido conocido en la técnica antes de la fecha de prioridad de la presente solicitud que caiga dentro del alcance de la presente invención se desestima adecuadamente en el presente documento.

[0043] Las abreviaturas de las secuencias de aminoácidos usadas en el presente documento están de acuerdo con la nomenclatura IUPAC-IUB como se informa en la siguiente Tabla A.

[0044] Tabla A

[0047]

[0049] "Porcentaje de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia peptídica se refiere al porcentaje de residuos que son idénticos en dos secuencias. El porcentaje de identidad de secuencia (%SI) se calcula mediante la siguiente fórmula:

[0051]

[0053] en donde nt es el número de residuos en la secuencia básica y nd es el número total de residuos no idénticos en la secuencia confrontada cuando se alinean de modo que un número máximo de aminoácidos son idénticos. De acuerdo con ello, una secuencia RKVVLVNQIL tendrá una identidad de secuencia del 80 % con la secuencia ID. No 3 RRVVLVNNIL (nd=2 y nt=10).

[0054] Un péptido según la invención puede tener al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de referencia cuando se alinean óptimamente. La alineación óptima de las secuencias puede realizarse mediante diversos métodos conocidos e implementación computarizada de algoritmos conocidos (por ejemplo, BLAST, TFASTA, BESTFIT, tal como en el paquete informático de Wisconsin Genetic, Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, WI). El algoritmo BLAST (Altschul et al., Mol. Biol. (1990), 215, 403-410) para el que se puede obtener el software a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica www.ncbi.nlm.nih.gov/) también puede usarse.

[0055] La variación de la secuencia de aminoácidos en los péptidos de la presente invención comprende la sustitución conservadora de aminoácidos que no influyen en la actividad peptídica. Las sustituciones capaces de mantener la actividad peptídica se seleccionan basándose en (a) la eficacia para mantener la estructura de la cadena principal peptídica en el área de sustitución, tal como estructuras tridimensionales laminares o helicoidales, (b) la eficacia para mantener la carga eléctrica o hidrofobicidad de la molécula en el área diana, o (c) la eficacia para mantener la mayor parte de la cadena lateral.

[0056] Los aminoácidos se clasifican de acuerdo con las propiedades generales de la cadena lateral como se describe en la siguiente Tabla B.

[0057] Tabla B

[0060]

[0062] Los ejemplos de sustitución conservadora pertenecen al grupo que consiste en aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina, valina y metionina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina y treonina).

[0063] Se conocen en la técnica de la presente invención sustituciones de aminoácidos que no alteran en general la actividad específica.

[0064] Las alteraciones que se producen más comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly y las alteraciones opuestas. En la siguiente tabla C se muestra otro ejemplo de sustituciones conservadoras.

[0066] TABLA C

[0069]

[0071] El péptido de la presente invención puede estar en forma de péptido modificado, del cual el extremo N- y/o C-terminal está modificado químicamente o protegido con compuestos orgánicos.

[0072] El término "derivado" o "derivado del mismo" como se emplea en el presente documento en relación con un péptido de la presente invención significa un péptido en donde el extremo N- y/o C-terminal del mismo está modificado químicamente o protegido con un compuesto orgánico.

[0073] Ejemplos de modificación incluyen fosforilación, glucosilación, acilación (incluyendo acetilación, lauroilación, miristorilación, palmitoilación), alquilación, carboxilación, hidroxilación, glicación, biotinilación, ubiquitinilación y amidación.

[0074] Preferiblemente, el péptido de la presente invención puede modificarse en el extremo N-terminal del mismo, más preferiblemente por acilación, incluyendo acetilación, lauroilación, miristorilación y palmitoilación. Los derivados de péptidos de acetilo y palmitoílo N-terminales son un aspecto preferido de la presente invención.

[0075] El término "sal" o "sal del mismo" como se emplea en el presente documento en relación con un péptido de la presente invención significa una sal de un péptido o derivado del mismo con un ácido o base adecuado.

[0076] Ejemplos típicos de ácidos incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido metanosulfónico, ácido para-toluenosulfónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido tartárico y ácido láctico.

[0077] Los ejemplos típicos de bases incluyen, por ejemplo, mono-, di- y trialquilaminas, por ejemplo metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, dietilamina, trietilamina, propilamina, dipropilamina, tripropilamina, etilendiamina, mono-, di- y trialcanolaminas, por ejemplo, monoetanolamina, dietanolamina y trietanolamina; guanidina, morfolina, piperidina, pirrolidina, piperazina, 1-butilpiperidina, 1-etil-2-metil-piperidina, N-metilpiperazina, 1,4-dimetilpiperazina, N-bencilfeniletilamina, N-metilglucosamina y tris(hidroximetil)aminometano.

[0078] Una sal de acetato o trifluoroacetato de un péptido, o un derivado del mismo, se emplea preferiblemente en la presente invención.

[0079] Dependiendo de su longitud, el péptido de la presente invención puede sintetizarse mediante un método bien conocido en la técnica, por ejemplo, por un sintetizador de péptidos automatizado, o producido por una tecnología de ingeniería genética. Por ejemplo, un gen de fusión que codifica una proteína de fusión que incluye un asociado de fusión y el péptido de la presente invención se prepara mediante ingeniería genética y, a continuación, se transforma en una célula hospedadora para expresar la proteína de fusión. A partir de entonces, el péptido de la presente invención se escinde y aísla de la proteína de fusión usando una proteasa o un compuesto para producir el péptido deseado. Para este fin, una secuencia de ADN que codifica residuos de aminoácidos que pueden escindirse por una proteasa tal como factor Xa o enterocinasa, o un compuesto tal como CNBr o hidroxilamina puede insertarse entre los polinucleótidos que codifican el asociado de fusión y el péptido de la presente invención.

[0080] Los péptidos de la presente invención puede existir como estereoisómeros o mezclas de estereoisómeros; por ejemplo, los aminoácidos que los componen pueden tener configuración L, configuración D o ser racémicos independientemente entre sí. Por lo tanto, es posible obtener mezclas isoméricas, así como racematos o mezclas diastereoisómeras o diastereómeros o enantiómeros puros, dependiendo del número de carbonos asimétricos y de qué isómeros o mezclas isoméricas estén presentes. Las estructuras preferidas de los péptidos de la presente invención son isómeros puros, es decir, enantiómeros o diastereómeros. Las estructuras más preferidas de los péptidos de la presente invención incluyen aminoácidos que tienen la configuración L. A menos que se indique otra cosa, se entiende que cuando se indica que un aminoácido puede ser Ala, se entiende que se selecciona de L-Ala-, D-Ala- o mezclas racémicas o no racémicas de ambos.

[0081] La composición cosmética de la presente invención comprende al menos uno de los péptidos descritos anteriormente junto con al menos un ingrediente cosméticamente aceptable.

[0082] La composición farmacéutica de la presente invención comprende al menos uno de los péptidos descritos anteriormente junto con al menos un ingrediente farmacéuticamente aceptable.

[0083] La composición farmacéutica o cosmética de la presente invención puede comprender una cantidad del péptido, o un derivado y/o sal del mismo, que oscila entre el 0,00000001 % y el 20 % en peso, preferiblemente entre el 0,000001 % y el 15 % en peso, más preferiblemente entre el 0,0001 % y el 10 % en peso e incluso más preferiblemente entre el 0,0001 % y el 5 % en peso.

[0084] La composición cosmética de la presente invención puede contener una variedad de otros componentes opcionales adecuados para hacer que tales composiciones sean más cosmética o estéticamente aceptables o para proporcionarles beneficios de uso adicionales. Dichos ingredientes opcionales convencionales son bien conocidos por los expertos en la materia. Estos incluyen cualquier ingrediente cosméticamente aceptable, como los que se encuentran en el CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 7ª edición, editado por Wenninger y McEwen, (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, D. C., 1997). Como se usa en el presente documento, "cosméticamente aceptable" significa un material (por ejemplo, compuesto o composición) que es adecuado para su uso en contacto con la piel, cabello u otro sustrato adecuado como se define a continuación en el presente documento.

[0085] Los ingredientes cosméticamente aceptables útiles en la presente invención incluyen portadores cosméticamente aceptables, disolventes volátiles y no volátiles, agua y otros ingredientes adicionales, tales como tensioactivos, conservantes, absorbentes, agentes quelantes, lubricantes, hidratantes, repelentes al agua, antioxidantes, absorbentes de UV, antiirritantes, vitaminas, oligoelementos metálicos, agentes antimicrobianos, perfumes, colorantes e ingredientes de color y/o agentes estructurantes.

[0086] La expresión "portador cosméticamente aceptable", como se usa en el presente documento, significa una o más cargas, diluyentes, extensores y similares sólidos o líquidos compatibles, que son cosméticamente aceptables como se ha definido anteriormente en el presente documento. El término "compatible", como se usa en el presente documento, significa que los componentes de las composiciones de la presente invención pueden combinarse con los principios activos primarios de la presente invención, y entre sí, de un modo tal que no exista interacción que pueda reducir de manera sustancial la eficacia de la composición en situaciones de uso habituales.

[0087] El tipo de portador utilizado en la presente invención depende del tipo de producto deseado. Las composiciones útiles en la presente invención pueden adoptar una amplia variedad de formas de producto. Estas incluyen, pero sin limitación, lociones, cremas, geles, barras, pulverizaciones, pomadas, pastas, espumas y productos cosméticos (por ejemplo, maquillaje sólido, semisólido o líquido, incluidas las bases).

[0088] Estas formas de productos pueden comprender varios tipos de portadores que incluyen, pero sin limitación, soluciones, aerosoles, emulsiones (incluidas las de aceite en agua o agua en aceite), geles, sólidos y liposomas.

[0089] Las composiciones de la presente invención pueden comprender agua, en diferentes cantidades dependiendo de la forma de la composición. La cantidad de agua, si está presente, puede variar de menos del 1 % a más del 99 % en peso con respecto al peso de la composición total. La composición acuosa de la presente invención se formula especialmente como lociones acuosas o como emulsiones de agua en aceite o de aceite en agua o como emulsiones múltiples (emulsión triple de aceite en agua en aceite o agua en aceite en agua). Tales emulsiones se conocen y se describen, por ejemplo, por C. FOX en "Cosmetics and Toiletries" - noviembre de 1986 - vol. 101 - páginas 101 - 112. Las composiciones sólidas, las composiciones de pulverización y las cremas de agua en aceite normalmente comprenden cantidades de agua inferiores al 10 %, más preferiblemente inferior al 5 % en peso con respecto al peso total de la composición. Composiciones de roll-on, composiciones acuosas, y el desodorante normalmente comprende una cantidad de agua de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 99 %, más preferiblemente de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 90 %, incluso más preferiblemente de aproximadamente el 50 % al aproximadamente el 80 %, en peso con respecto al peso total de la composición.

[0090] Las composiciones de la presente invención pueden comprender también siliconas. Si está presente, las siliconas estarán generalmente a un nivel de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 85 %, más preferiblemente de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 75 %, incluso más preferiblemente de aproximadamente el 50 % al aproximadamente el 65 %, en peso con respecto al peso total de la composición.

[0091] Las siliconas útiles en el presente documento son preferiblemente siliconas lineales o cíclicas que tienen de 2 a 7 átomos de silicona, estando estas siliconas opcionalmente sustituidas con grupos alquilo o alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono. Las siliconas adecuadas incluyen dodecametilciclohexasiloxano, ciclopentasiloxano, decametilciclopenta siloxano, ciclotetrasiloxano, heptametiloctiltrisiloxano, hexametildisiloxano, decametiltetrasiloxano, dodecametilpentasiloxano, octametiltetrasiloxano y mezclas de los mismos.

[0092] Las composiciones de la presente invención pueden comprender uno o más disolventes volátiles. Si está presente, el disolvente volátil o la mezcla de disolventes estará generalmente a un nivel de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 90 %, más preferiblemente de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 75 %, incluso más preferiblemente de aproximadamente el 35 % al aproximadamente el 65 %, en peso con respecto al peso total de la composición. Los disolventes útiles en el presente documento son preferiblemente disolventes orgánicos volátiles.

[0093] Como se usa en el presente documento, "volátil" se refiere a sustancias con una cantidad significativa de presión de vapor en condiciones ambiente, como entienden los expertos en la materia.

[0094] Los disolventes volátiles para su uso en el presente documento tendrán preferiblemente una presión de vapor de aproximadamente 2 kPa o más, más preferiblemente de aproximadamente 6 kPa o más, a 25 °C. Los disolventes volátiles para su uso en el presente documento tendrán preferiblemente un punto de ebullición en atmósfera normal (1 atm) inferior a aproximadamente 150 °C, más preferiblemente inferior a aproximadamente 100 °C, incluso más preferiblemente inferior a aproximadamente 90 °C, incluso más preferiblemente todavía inferior a aproximadamente 80 °C.

[0095] Preferiblemente, los disolventes volátiles para su uso en el presente documento serán relativamente inodoros y seguros para su uso en la piel humana. Los disolventes volátiles adecuados incluyen, pero sin limitación, alcoholes C1-C4, siliconas volátiles y mezclas de los mismos. Los disolventes volátiles preferidos son alcoholes C1-C4 y mezclas de los mismos. Más preferido para su uso en el presente documento es etanol.

[0096] Las composiciones de la presente invención pueden comprender también uno o más disolventes no volátiles. Si está presente, el disolvente no volátil o la mezcla de disolventes estará generalmente a un nivel de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 20 %, más preferiblemente de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 10 %, incluso más preferiblemente de aproximadamente el 3 % a aproximadamente el 5 %, en peso con respecto al peso total de la composición. Los disolventes no volátiles adecuados incluyen, pero sin limitación, benzoato de bencilo, alcohol cetearílico, alcohol cetílico, ftalato de dietilo, miristato de isopropilo, dimeticona, caprililmeticona y mezclas de los mismos.

[0097] En las composiciones de la presente invención pueden estar presentes otros ingredientes adicionales. Estos incluyen, pero sin limitación, polímeros hidrófilos seleccionados de polietilenglicoles (PEG), polivinilpirrolidonas (PVP), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y poloxámeros; estabilizadores UV tales como benzofenona-3; antioxidantes tales como acetato de tocoferilo; conservadores tales como fenoxietanol, alcohol bencílico, metil-parabeno, propil parabeno; agentes de ajuste de pH tales como ácido láctico, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido succínico, ácido fosfórico, hidróxido de sodio, carbonato de sodio; desodorantes y antimicrobianos, tal como farnesol, fenolsulfonato de cinc y etilhexilglicerina; humectantes tales como tribehenina, glicerina; agentes acondicionadores de la piel tales como alantoína; agentes refrescantes tales como trimetil isopropil butanamida y mentol; ingredientes acondicionadores del cabello tales como pantenol, pantetina, pantoteína, pantenil etil éter y combinaciones de los mismos; propulsores tales como propano, isopropano, butano e isobuteno; sales en general, tales como acetato de potasio y cloruro de sodio y mezclas de los mismos; perfumes y colorantes.

[0098] Si están presentes, estos ingredientes adicionales estarán presentes preferiblemente a un nivel inferior al 10 %, más preferiblemente inferior al 5 %, en peso con respecto al peso total de la composición.

[0099] Preferiblemente, la composición farmacéutica de la presente invención se prepara en formas de dosificación adecuadas que comprenden una cantidad eficaz de al menos uno de los péptidos descritos anteriormente junto con al menos un ingrediente farmacéuticamente aceptable.

[0100] Los ejemplos de formas farmacéuticas adecuadas son los comprimidos, cápsulas, comprimidos recubiertos, gránulos, las soluciones y los jarabes para administración oral; soluciones, las pomadas y los ungüentos para administración tópica; los parches medicinales para administración transdérmica; los supositorios para administración rectal y las soluciones estériles inyectables. Otras formas farmacéuticas adecuadas son aquellas de liberación mantenida y aquellas basadas en liposomas para administración oral, inyectable o transdérmica.

[0101] Como se describe en el presente documento, la composición farmacéutica de la presente invención comprende al menos uno de los péptidos descritos anteriormente junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, que, como se usa en el presente documento, incluye todos y cada uno de los disolventes, diluyentes u otro vehículo, adyuvantes de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según sea adecuado para la forma farmacéutica particular deseada.

[0102] Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como excipiente farmacéuticamente aceptable incluyen, pero sin limitación, azúcares, tal como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tal como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tal como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón; aceite de cártamo; aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles; tales como un propilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua apirógena; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico y soluciones de tampón de fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos, tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, edulcorantes, agentes aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes.

[0103] Las expresiones "farmacéuticamente aceptable" y "fisiológicamente aceptable" pretenden definir, sin ninguna limitación particular, cualquier material adecuado para la preparación de una composición farmacéutica para administrarse a un ser vivo.

[0104] Las formas farmacéuticas también pueden contener otros ingredientes tradicionales, tales como: conservantes, estabilizantes, tensioactivos, tampones, sales para la regulación de la presión osmótica, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, aromatizantes y similares.

[0105] Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por vía oral, por vía parenteral, mediante pulverizador por inhalación, por vía tópica, por vía rectal, por vía nasal, por vía bucal, por vía vaginal o a través de un depósito implantado. El término parenteral tal como se usa en el presente documento incluye inyección subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraneal o técnicas de infusión.

[0106] Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también se pueden administrar mediante aerosol nasal o inhalación o administrarse mediante implantación (por ejemplo, quirúrgicamente), tal como con un dispositivo implantable o permanente, como una endoprótesis vascular.

[0107] Las formas farmacéuticas de la composición farmacéutica de la presente invención se pueden preparar mediante técnicas que son familiares para un químico farmacéutico y comprenden mezclado, granulación, compresión, la disolución, esterilización y similares.

[0108] Los péptidos de la presente invención son capaces de inhibir, o al menos reducir, la liberación de neurotransmisores, en particular acetilcolina, y del neuropéptido CGRP, de las neuronas.

[0109] De acuerdo con ello, un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de al menos uno de los péptidos descritos anteriormente, y un derivado o sal de los mismos, para mejorar las afecciones, trastornos y/o enfermedades de la piel mediados por exocitosis neuronal.

[0110] Como se ha analizado anteriormente, esta propiedad puede usarse no solo para el tratamiento de arrugas faciales y disfunciones musculares motoras, sino también para reducir, prevenir o para el cuidado de varias afecciones relacionadas con la piel en las que está implicada la liberación de vesículas neuronales, tales como la transpiración excesiva, prurito, inflamación cutánea, dermatitis, atopía, psoriasis, hiperreactividad vascular, rosácea, acné, crecimiento del cabello, cicatrización, callosidades, verrugas o afecciones de la piel sensible, tales como úlceras y lesiones en la piel.

[0111] En otras palabras, las afecciones, los trastornos y/o las enfermedades mediados por exocitosis neuronal incluyen arrugas faciales, disfunciones musculares motoras, transpiración excesiva, prurito, inflamación cutánea, dermatitis, atopía, psoriasis, hiperreactividad vascular, rosácea, acné, crecimiento del cabello, cicatrización, callosidades, verrugas o afecciones de la piel sensible, tales como úlceras y lesiones en la piel, y similares.

[0112] De acuerdo con ello, la presente invención también se refiere a un método terapéutico o no terapéutico para mejorar afecciones, trastornos y/o enfermedades de la piel mediadas por exocitosis neuronal, en particular para reducir las arrugas, transpiración excesiva, prurito, inflamación cutánea, dermatitis, atopía, psoriasis, hiperreactividad vascular, rosácea, acné, crecimiento del cabello, cicatrización, callosidades, verrugas o afecciones de la piel sensible, tales como úlceras y lesiones en la piel, que comprende la aplicación tópica de una composición farmacéutica o cosmética que comprende (i) al menos uno de los péptidos descritos anteriormente, y un derivado o sal del mismo, y (ii) al menos un ingrediente farmacéutica o cosméticamente aceptable.

[0113] Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica al menos uno de los péptidos descritos anteriormente.

[0114] El polinucleótido mencionado anteriormente permite la producción de los péptidos de la presente invención en grandes cantidades. Por ejemplo, el cultivo de vectores que incluyen polinucleótidos que codifican péptidos permite la producción de péptidos en grandes cantidades.

[0115] Un polinucleótido es una molécula de ácido nucleico que puede ser moléculas de ADN o ARN espontáneas o artificiales, ya sean monocatenarias o bicatenarias. La molécula de ácido nucleico puede ser uno o más ácidos nucleicos del mismo tipo (por ejemplo, que tienen la misma secuencia de nucleótidos) o ácidos nucleicos de diferentes tipos. Las moléculas de ácido nucleico comprenden uno o más ADN, ADNc, ADN señuelo, ARN, ARNip, miARN, ARNhc, ARNmc, ARNnop, ARNnp PNA, oligómero antisentido, plásmido y otros ácidos nucleicos modificados, pero sin limitación a estos.

[0116] Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar mejor la presente invención sin embargo sin limitarla. En la medida en que los siguientes ejemplos se refieren a péptidos que comprenden la SEQ. ID. No. 2 a 5, no guardan relación con la invención reivindicada y se muestran únicamente con fines ilustrativos.

[0117] Ejemplos

[0118] EJEMPLO 1: Síntesis química

[0119] Todos los péptidos se sintetizaron con el extremo C terminal amidado usando el método de fase sólida Fmoc estándar (Pérez de la Vega et al., Molecules (2010), 15:4924-4933; Behrendt et al., J. Pept. Sci. (2016), 22(1):4-27; Mäde et al., Beilstein J. Org. Chem. (2014), 10: 1197-1212). La síntesis de los péptidos de la invención, mezclas y/o sus sales cosméticamente aceptables pueden llevarse a cabo de acuerdo con los métodos convencionales, conocidos en la técnica anterior, tal como métodos de síntesis de péptidos en fase sólida, síntesis enzimática o cualquier combinación (Bondazky et al., Int. J. Pept. Protein Res. (1993), 42(1):10-3).

[0120] Todos los procesos sintéticos se llevaron a cabo con Kromasil-C18-HPLC (5 µm, 4,6 x 250 mm). Después, los péptidos se eluyeron con gradientes lineales de acetonitrilo (CH<3>CN) con ácido trifluoroacético (TFA) (gradiente: B al 5-55 % en 2 min, flujo: 1 ml/min, eluyente A: 100 % de H<2>O 0,1 % de TFA; eluyente B: 100 % de CH<3>CN 0,1 % de TFA). La detección de péptidos se realizó midiendo la absorbancia a 220 nm. El grupo Fmoc se eliminó con una solución de piperidina/DMF al 20 % durante 30 min de reacción. Los lavados entre etapas se realizaron con DMF (5 veces). Todas las reacciones sintéticas y lavados se realizaron a 25 °C. El análisis por HPLC de los péptidos obtenidos mostró una pureza superior al 80 % en todos los casos. La identidad de los péptidos obtenidos se confirmó mediante ESI- MS. Proceso para introducir el grupo Nt-acetilo en las resinas de peptidilo: 1 mmol (1 equiv.) de las resinas de peptidilo se trató con 25 equiv. de anhídrido acético predisuelto en presencia de 25 equiv. de DIEA, usando 5 ml de DMF como disolvente. Después de la reacción durante 30 min, las resinas peptídicas se levaron con DMF (1 min x 5), DCM (1 min x 4) y éter dietílico (1 min x 4). Finalmente, las resinas de peptidilo se secaron a vacío.

[0121] Proceso para introducir el grupo Nt-palmitoílo en las resinas de peptidilo: Se incorporaron 3 mmol (3 equiv.) de ácido palmítico predisuelto en resinas de peptidilo, en la presencia de 3 equiv. de HTBU y 6 equiv. de NMM. Se les permitió reaccionar durante 30-60 minutos usando DMF como reactivo. Posteriormente, las resinas se lavaron 3 veces con DMF.

[0122] Proceso de escisión del soporte polimérico de las resinas de peptidilo: Las resinas de peptidilo secas se trataron con TFA:TIS:H<2>O (95:2,5:2,5) durante 2 horas a 25 °C bajo vibración.

[0123] EJEMPLO 2: Inhibición de la liberación de CGRP en neuronas sensoriales cultivadas por los péptidos de la invención. La inducción de la liberación del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) con capsaicina permite la medición directa de la exocitosis neuronal (Meng J. et al., J. Cell. Sci. (2007) 15;120(Pt 16):2864-74, y Meng J. et al., Mol. Neurobiol. (2014); 50(2):574-88).

[0124] Los péptidos probados se evaluaron midiendo su capacidad de inhibir la liberación inducida por CGRP en neuronas sensoriales peptidérgicas. Los ganglios de la raíz dorsal se sembraron (50.000 células/pocillo) en una placa de 96 pocillos previamente recubierta con poli-L-lisina y laminina. Después de 48 horas desde la siembra, las células se incubaron con solución salina equilibrada de Hank que contenía péptidos de la invención a 20, 50 o 100 µM durante 1 hora. A continuación, las células se estimularon durante 10 min con capsaicina 1 µM a 37 °C. Entonces, el contenido de CGRP se determinó en sobrenadantes usando EIA de CGRP basado en colorimetría (Spi-Bio Inc) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las mediciones de absorbancia (405 nm) se normalizaron con respecto a la señal máxima detectada con estimulación con capsaicina en células tratadas con vehículo. Los valores de inhibición de la liberación de CGRP se calcularon como porcentajes considerando la señal máxima para la liberación inducida por capsaicina y la mínima como células no estimuladas. La Tabla D detalla los valores de inhibición de la inhibición de la actividad de M3 obtenidos para los péptidos de la invención.

[0126] TABLA D

[0127] Derivatización % de inhibición de liberación de CGRP Péptido Secuencia Nt 100µM 50µM 20µM Seq. ID No. 1 HYWRELQYR acetilo 39,1 - 10,1 Seq. ID No. 2 MQVWLRMWIDYRAT acetilo

55,3

49,3

[0128] palmitoílo 53,9 35,5 Seq. ID No. 3 RRVVLVNNIL

palmitoílo 74,8 34,0 Seq. ID No. 4 LRVQMVNMFL acetilo 77,4 14,2 Los péptidos inhibieron la liberación de CGRP inducida por capsaicina en un intervalo del 10-50 % a 20 µM, del 50-75 % a 50 µM para Nt-palmitoilado, y del 40-77 % a 100 µM para Nt-acetilado.

[0129] EJEMPLO 3: Inhibición de la liberación de acetilcolina en una línea celular de neuroblastoma por los péptidos de la invención.

[0130] Para determinar los efectos del compuesto de la invención sobre la liberación de acetilcolina, se usó una línea celular de neuroblastoma humano (50.000 células/pocillo). Las células se diferenciaron en fenotipo neuronal colinérgico durante 4 días. Entonces, las células se preincubaron durante 60 minutos con los compuestos (entre 0,1 y 100 µM) como forma de acetilo o palmitoílo y se conjugaron con trifluoroacetato (TFA) o sal de acetato. Posteriormente, la liberación de acetilcolina se indujo mediante la despolarización de la membrana evocada por 15 minutos de incubación con KCl 50 mM. El nivel de acetilcolina en los sobrenadantes se cuantificó utilizando Amplex<®>Red Acetylcholine Assay Kit (Thermofisher) siguiendo las instrucciones del fabricante. La acetilcolina se transforma enzimáticamente produciendo H<2>O<2>, lo que dio lugar a una señal fluorescente cuantificable. La fluorescencia (Ex 530 nm/ Em 590 nm) se midió en un equipo FluorStar. El contenido de acetilcolina se normalizó al contenido de proteína total usando el ensayo BCA (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las mediciones de fluorescencia se normalizaron a la señal máxima detectada con estimulación de KCI en células tratadas con vehículo. La interrupción de la exocitosis de vesículas por los compuestos de la invención conduce a una disminución de la liberación de acetilcolina (Tabla E).

[0131] TABLA E

[0132] % de inhibición de liberación de Ach Pé tido Secuencia Derivatización Nt M TFA Acetato

[0134]

[0137] Todos los péptidos se validaron funcionalmente como inhibidores de la exocitosis neuronal regulada en la línea celular de neuroblastoma. En particular, forma acetilada de Seq. ID No.1, 2, 4 y 5 disminuyeron significativamente la liberación de ACh entre un 50-87 % a una concentración de 10 µM como sal de TFA, y alrededor de un 40 % como sal de acetato a 0,1 µM. ID No. 4 palmitoilada redujo significativamente la liberación de acetilcolina alrededor de un 50 % a 10 µM. El péptido más potente fue Seq. ID No.3 palmitoilada, ya que era activo a la concentración más baja probada 0,1 µM. En general, todos los péptidos efectivos estaban en el intervalo micromolar.

[0139] EJEMPLO 4: Ensayos de viabilidad celular en queratinocitos epidérmicos humanos y fibroblastos dérmicos.

[0141] Este ejemplo evaluó los efectos de los péptidos de la invención sobre queratinocitos epidérmicos humanos y fibroblastos dérmicos. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo con bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT). El ensayo de MTT es una reacción colorimétrica basada en la capacidad de la enzima deshidrogenasa mitocondrial para romper y transformar los anillos de tetrazolio de MTT. Se sembraron queratinocitos epidérmicos (HEKa) en una placa de 96 pocillos previamente recubierta con una confluencia del 50-60 % en 100 µl del medio correspondiente suplementado. Se sembraron fibroblastos dérmicos (HDFa) en una placa de 96 pocillos con una confluencia del 70 % en 100 µl de medio suplementado. Para ambas líneas celulares, 24 horas después de la siembra, el medio se reemplazó por medio suplementado fresco que contenía péptidos disueltos en un intervalo de concentración entre 0,1 y 200 µM. Se incubaron todas las sustancias de prueba durante 24 horas a 37 °C y CO<2>al 5 %. Posteriomente, el medio se reemplazó por 0,5 mg/ml de solución de MTT durante 4 horas en medio completo. Entonces, el medio se retiró cuidadosamente y se añadieron 150 µl/pocillo de DMSO para solubilizar los cristales de formazán. La placa se protegió de la luz, se agitó durante 60 segundos y se midió la densidad óptica a 570 nm con un filtro de referencia de 620 nm. La Tabla F detalla los efectos de los péptidos de la invención sobre la viabilidad de las células de queratinocitos y fibroblastos expresada como porcentaje de inhibición.

[0144] TABLA F

[0145] % de inhibición de la viabilidad celular

[0147]

[0150] Los péptidos de Seq. ID 1, 2 y 5 con sustitución de Nt-acetilo no modificó la viabilidad celular en queratinocitos epidérmicos humanos y fibroblastos dérmicos hasta 200 µM. Péptido acetilado y palmitoilado con Seq. ID 4 no modificó la viabilidad de los queratinocitos cuando se evaluó por debajo de 50 µM. La Seq ID 3 palmitoilada no modificó la viabilidad de los queratinocitos y fibroblastos a 1 µM o menos.

[0151] EJEMPLO 5: Evaluación del efecto antitranspirante en la administración aguda en un modelo de ratón de secreción de sudor.

[0152] Este ejemplo evaluó los efectos agudos del péptido de la invención Seq. ID 1, forma palmitoilada, en un modelo de sudoración in vivo inducida por pilocarpina. Este modelo se estableció usando pilocarpina, un agonista no selectivo de los receptores muscarínicos, en ratones macho C57BL6/Rcc de 11 semanas de edad. El compuesto de prueba es el péptido de la invención que tiene la siguiente secuencia (secuencia ID No. 1):

[0153] Palm-HYWRELQYR-NH<2>

[0154] El compuesto de prueba se inyectó intraplantar (i.pl.) en la pata trasera derecha (10, 30 y 100 µg) 30 min antes de la estimulación de la sudoración. El vehículo era solución salina.

[0155] La sudoración se monitorizó a través de la detección de actividad amilasa en la superficie de la piel usando la reacción de yodo/almidón. Las gotas de sudoración oscura se cuantificaron después de 5 minutos de inducción contando el número de gotas por pata en cada condición. Muestra n = 5-6 individuos por grupo. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). Los datos sin procesar se normalizaron como porcentaje con respecto a individuos estimulados no inyectados (Control, 100 %) e individuos no estimulados inyectados con solución salina (Vehículo, 0 %). El análisis estadístico fue ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple post-hoc de Dunnett que comparó cada condición con el grupo de control correspondiente, ****p<0,0001 ***p<0,001 **p<0,01, *p<0,05

[0156] Los resultados se resumen en la siguiente Tabla G.

[0158] TABLA G

[0161]

[0163] El compuesto de prueba redujo significativamente la sudoración a 10, 30 y 100 µg.

[0164] EJEMPLO 6: Evaluación del efecto antitranspirante en la administración crónica en un modelo de ratón de secreción de sudor.

[0165] Este ejemplo evaluó los efectos crónicos del péptido de la invención Seq. ID No 1, forma pamitoilada, en un modelo de sudoración in vivo. Este modelo se estableció usando pilocarpina, un agonista no selectivo de los receptores muscarínicos, en ratones macho C57BL6/Rcc de 11 semanas de edad. El compuesto de prueba se administró localmente tres veces por semana durante 4 semanas (tratamiento). El sudor se indujo mediante inyección intraplantar (i.pl) de pilocarpina (3 µg/pata) en la pata trasera derecha (sudoración) una vez en las semanas 1, 2 y 4 de acuerdo con la tabla H.

[0167] TABLA H

[0170]

[0172] El compuesto de prueba es el péptido de la invención que tiene la siguiente secuencia (secuencia ID No. 1):

[0173] Palm-HYWRELQYR-NH<2>

[0174] El compuesto de prueba se inyectó i.pl. en la pata trasera derecha (1, 10 y 100 µg), y el vehículo era solución salina. La sudoración se monitorizó a través de la detección de actividad amilasa en la superficie de la piel usando la reacción de yodo/almidón. Las gotas de sudoración oscura se cuantificaron después de 5 minutos de inducción contando el número de gotas por pata en cada condición. Muestra n = 5-6 individuos por grupo. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). Los datos sin procesar se normalizaron como porcentaje con respecto a individuos estimulados no inyectados (control, 100 %). El análisis estadístico fue ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple post-hoc de Dunnett que comparó cada condición con el grupo de control correspondiente, ****p<0,0001 ***p<0,001 **p<0,01, *p<0,05

[0175] Los resultados se resumen en la siguiente Tabla I.

[0176] TABLA I

[0179]

[0181] Palm-Seq ID No 1 mostró una inhibición significativa de la sudoración durante 4 semanas de tratamiento cuando se probó a 100 µg/pata.

[0182] EJEMPLO 7: Ensayo funcional in vitro para la sensibilización neuronal

[0183] Este ejemplo evaluó los efectos in vitro de la forma palmitoilada de la Seq ID No 1 en la sensibilización de nociceptores en un contexto de piel sensible.

[0184] Los ganglios de la raíz dorsal de rata neonatal aislados de ratas Wistar (3-5 días de edad) se sembraron en chips de matriz de microelectrodos en DMEM Glutamax, FBS al 10 %, P/S al 1 % suplementado con NGF murino. Todos los experimentos se realizaron después de 48 h de siembra celular.

[0185] Las neuronas sensoriales se sensibilizaron por exposición aguda a un cóctel proinflamatorio con bradicinina, histamina y ATP. Se analizó la excitabilidad mediada por TRPV1, ya que las sensaciones de picor, ardor y hormigueo están provocadas principalmente por TRPV1. La aplicación repetitiva de capsaicina agonista de TRPV1 (15 s-aplicación 500 nM) permitió la primera activación (P1) seguida de desensibilización (segunda aplicación). Los cultivos desensibilizados se sensibilizaron con el cóctel para recuperar la excitabilidad, usando una solución externa entre el segundo pulso de capsaicina (P2) y el tercero (P3) (8 min). Para confirmar la viabilidad celular, se aplicó KCI 40 mM al final. El compuesto de prueba se incubó 1 hora antes de la monitorización a 0,1, 1 y 10 µM. El compuesto de prueba es el péptido que tiene la siguiente secuencia (secuencia ID No. 1):

[0186] Palm-HYWRELQYR-NH<2>

[0187] La sensibilización se calculó como la relación entre el pulso de capsaicina P3 y P1 (relación P3/P1), que representa la respuesta sensibilizada inducida por el cóctel proinflamatorio. El porcentaje de inhibición se calculó como 100-Sensibilización. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). El análisis estadístico fue ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple post-hoc de Dunnett que comparó cada condición con el grupo de control de sensibilización correspondiente, ****p<0,0001 ***p<0,001 **p<0,01, *p<0,05

[0188] Los resultados se resumen en la siguiente Tabla J.

[0190] TABLA J

[0193]

[0195] El compuesto de prueba a las tres concentraciones inhibió significativamente el proceso de sensibilización con una eficacia similar.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

1. Un péptido que tiene una longitud igual o inferior a 20 aminoácidos y que comprende la secuencia ID no. 1, o una secuencia que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia ID no. 1, y un derivado o una sal del mismo, en donde dicho derivado comprende un extremo N-terminal y/o un extremo C-terminal de dicho péptido que está químicamente modificado o protegido con un compuesto orgánico seleccionado del grupo que consiste en fosforilo, glicosilo, acilo, alquilo, carboxilo, hidroxilo, biotinilo, ubiquitinilo y grupos amido.

2. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho péptido tiene una longitud igual o inferior a 15 aminoácidos.

3. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho péptido comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia ID no. 1.

4. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho péptido comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia ID no. 1.

5. El péptido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho péptido tiene una longitud igual o inferior a 10 aminoácidos.

6. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho grupo acilo se selecciona del grupo que consiste en grupos acetilo, lauroílo, miristoílo y palmitoílo.

7. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho extremo N-terminal del mismo está modificado químicamente o protegido con un grupo acetilo o un grupo palmitoílo.

8. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha sal comprende una sal de dicho péptido o un derivado del mismo con un ácido o una base adecuados.

9. El péptido de conformidad con la reivindicación 8, en donde dicho ácido se selecciona del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido metanosulfónico, ácido paratoluenosulfónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido tartárico y ácido láctico.

10. El péptido de conformidad con la reivindicación 8, en donde dicho ácido se selecciona del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético y ácido trifluoroacético.

11. El péptido de conformidad con la reivindicación 8, en donde dicha base se selecciona del grupo que consiste en mono-, di- y trialquilaminas, por ejemplo metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, dietilamina, trietilamina, propilamina, dipropilamina, tripropilamina, etilendiamina, mono-, di- y trialcanolaminas, por ejemplo, monoetanolamina, dietanolamina y trietanolamina; guanidina, morfolina, piperidina, pirrolidina, piperazina, 1-butilpiperidina, 1-etil-2-metilpiperidina, N-metilpiperazina, 1,4-dimetilpiperazina, N-bencilfeniletilamina, N-metilglucosamina y tris(hidroximetil)aminometano.

12. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, en donde al menos un aminoácido como se enumera en la columna izquierda de la siguiente tabla de secuencia ID no.1 se sustituye con un aminoácido como se enumera en la columna derecha de la siguiente tabla, siempre que la secuencia resultante tenga al menos un 70 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 80 % y más preferiblemente al menos un 90 % con dicha secuencia ID no.1

n in i n

13. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, en donde al menos un aminoácido como se enumera en la columna izquierda de la siguiente tabla de dicha secuencia ID no.1 se sustituye con un aminoácido como se enumera en la columna derecha de la siguiente tabla, siempre que la secuencia resultante tenga al menos un 70 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 80 % y más preferiblemente al menos un 90 % con dicha secuencia ID no.

1

14. Una composición cosmética que comprende (i) un péptido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y un derivado o una sal del mismo, y (ii) al menos un ingrediente cosméticamente aceptable.

15. Una composición farmacéutica que comprende (i) un péptido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y un derivado o una sal del mismo, y (ii) al menos un ingrediente farmacéuticamente aceptable.

16. Péptido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o un derivado o una sal del mismo, para su uso en la mejora de las afecciones, los trastornos y/o las enfermedades de la piel mediados por exocitosis neuronal.

17. El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dichas afecciones, dichos trastornos y/o dichas enfermedades de la piel mediados por exocitosis neuronal se seleccionan del grupo que consiste en arrugas faciales, disfunciones musculares motoras, transpiración excesiva, prurito, inflamación cutánea, dermatitis, atopía, psoriasis, hiperreactividad vascular, rosácea, acné, crecimiento del cabello, cicatrización, callosidades, verrugas o afecciones de la piel sensible, tales como úlceras y lesiones en la piel.

18. Un polinucleótido que codifica un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.