ES3062541T3 - Preparation and storage of liposomal rna formulations suitable for therapy - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a métodos para preparar partículas lipoplejas de ARN para la administración de ARN a tejidos diana tras la administración parenteral, en particular tras la administración intravenosa, y a composiciones que comprenden dichas partículas lipoplejas de ARN. La presente divulgación también se refiere a métodos que permiten preparar partículas lipoplejas de ARN de forma industrial conforme a las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF). Además, la presente divulgación se refiere a métodos y composiciones para almacenar partículas lipoplejas de ARN sin una pérdida sustancial de la calidad del producto y, en particular, sin una pérdida sustancial de la actividad del ARN. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Preparación y almacenamiento de formulaciones de ARN liposomal adecuadas para terapia

[0003] Campo técnico

[0004] La presente enseñanza se refiere a métodos para preparar partículas de lipoplexos de ARN para el suministro de ARN a tejidos objetivo después de la administración parenteral, en particular después de la administración intravenosa, y composiciones que comprenden dichas partículas de lipoplexos de ARN. La presente enseñanza también se refiere a métodos que permiten preparar partículas de lipoplexos de ARN de una manera industrial conforme a las GMP. Además, la presente enseñanza se refiere a métodos y composiciones para almacenar partículas de lipoplexos de ARN sin pérdida sustancial de la calidad del producto y, en particular, sin pérdida sustancial de la actividad del ARN. Las formulaciones de partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento se pueden congelar o deshidratar mediante secado por congelación, secado por aspersión o métodos relacionados, lo que permite obtener una vida útil más prolongada de los productos en comparación con el almacenamiento en líquido. En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN comprenden ARN monocatenario, tal como ARNm, que codifica un péptido o proteína de interés, tal como un péptido o proteína farmacéuticamente activo. El ARN es absorbido por las células de un tejido objetivo y el ARN se traduce en el péptido o proteína codificado, que puede exhibir su actividad fisiológica. El péptido o proteína de interés puede ser un péptido o proteína que comprende uno o más epítopos para inducir o mejorar una respuesta inmune dirigida contra uno o más epítopos. Los métodos y composiciones descritos en este documento son adecuados para su uso de una manera que cumpla con los requisitos para productos farmacéuticos, más específicamente, que cumpla con los requisitos para la fabricación de GMP y los requisitos de calidad de productos farmacéuticos para aplicación parenteral.

[0005] Antecedentes

[0006] El uso de ARN para el suministro de información genética extraña a células objetivo ofrece una alternativa atractiva al ADN. Las ventajas de utilizar ARN incluyen la expresión transitoria y un carácter no transformante. El ARN no necesita entrar en el núcleo para expresarse y, además, no puede integrarse en el genoma del huésped, lo que elimina el riesgo de oncogénesis. El ARN se puede administrar mediante las denominadas formulaciones de lipoplexos, en las que el ARN se une a liposomas compuestos de una mezcla de un lípido catiónico y un lípido auxiliar para formar formulaciones de nanopartículas inyectables. Sin embargo, el desarrollo de formulaciones para la administración de ARN biológicamente activo a un tejido objetivo, incluso después del almacenamiento de las formulaciones, es una necesidad no satisfecha. Además, el desarrollo de métodos para la fabricación conforme a las GMP de formulaciones de partículas de lipoplexos de ARN inyectables que garanticen una larga vida útil sigue siendo una necesidad insatisfecha.

[0007] Por lo tanto, existe una necesidad de proporcionar formulaciones para la administración de ARN biológicamente activo a un tejido objetivo donde el ARN administrado se traduce eficientemente en el péptido o proteína que codifica. Además, existe la necesidad de proporcionar formulaciones que sean estables durante su almacenamiento sin una pérdida sustancial de la calidad del producto y, en particular, sin una pérdida sustancial de la actividad biológica del ARN.

[0008] Los inventores descubrieron sorprendentemente que las formulaciones de partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento cumplen los requisitos mencionados anteriormente.

[0009] Resumen de la invención

[0010] La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

[0011] Por lo tanto, la presente invención se refiere a una composición que comprende:

[0012] partículas de lipoplexos de ARN que comprenden:

[0013] ARN que codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo,

[0014] al menos un lípido catiónico y al menos un lípido adicional,

[0015] en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1.9:2, o aproximadamente 1.3:2.0,

[0016] cloruro de sodio a una concentración de 0 mM a aproximadamente 40 mM, y

[0017] un estabilizador

[0018] En una realización, la composición comprende además un tampón, en donde el tampón es ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfónico (HEPES), en donde el HEPES está preferiblemente en una concentración de aproximadamente 2.5 mM a aproximadamente 10 mM, o de aproximadamente 7.5 mM. En una realización, la cantidad de ARN en la composición es de aproximadamente 0.01 mg/mL a aproximadamente 1 mg/mL, de aproximadamente 0.05 mg/mL a aproximadamente 0.5 mg/mL, o de aproximadamente 0.05 mg/mL, y/o

[0019] el cloruro de sodio está en una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM, aproximadamente 20 mM o aproximadamente 30 mM, y/o

[0020] la concentración de estabilizador en la composición es superior al valor requerido para la osmolalidad fisiológica, y/o

[0021] la concentración de estabilizador en la composición es de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 por ciento en peso por volumen (% p/v), o de aproximadamente 12.5 a aproximadamente 25 por ciento en peso por volumen (% p/v).

[0022] En una realización, el estabilizador es un carbohidrato seleccionado de un monosacárido, un disacárido, un trisacárido, un alcohol de azúcar, un oligosacárido o su alcohol de azúcar correspondiente, y un polialcohol de cadena lineal, o el estabilizador es sacarosa en una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 por ciento en peso por volumen (% p/v), o

[0023] La sacarosa está preferiblemente en una concentración de aproximadamente 15% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v), de aproximadamente 20% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v), o en una concentración de aproximadamente 22% (p/v) o de aproximadamente 20% (p/v).

[0024] En una realización, la composición tiene un pH que es inferior al pH óptimo habitual para el almacenamiento de ARN, y/o la composición tiene un pH de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.7, o de aproximadamente 6.2.

[0025] En una realización, la composición comprende además un agente quelante, en donde el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), en donde el EDTA está preferiblemente en una concentración de aproximadamente 0.25 mM a aproximadamente 5 mM, o de aproximadamente 2.5 mM.

[0026] En una realización, la composición comprende:

[0027] partículas de lipoplexos de ARN que comprenden:

[0028] ARN que codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo a una concentración de aproximadamente 0.05 mg/mL, y

[0029] DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 2:1,

[0030] en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es aproximadamente 1.3:2.0,

[0031] cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 20 mM,

[0032] sacarosa a una concentración de aproximadamente 22% (p/v),

[0033] HEPES a una concentración de aproximadamente 7.5 mM con un pH de aproximadamente 6.2, y

[0034] EDTA a una concentración de aproximadamente 2.5 mM.

[0035] En una realización, la composición está en un estado líquido o congelado, en donde la composición congelada es preferiblemente estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C durante al menos un mes o estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C durante al menos un mes, de aproximadamente -15 °C durante al menos dos meses, de aproximadamente -20 °C durante al menos un mes, de aproximadamente -20 °C durante al menos dos meses, de aproximadamente -30 °C durante al menos un mes, o de aproximadamente -30 °C durante al menos dos meses.

[0036] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN se pueden obtener añadiendo un coloide de liposoma a una solución que comprende ARN,

[0037] en donde el coloide de liposoma se puede obtener inyectando una solución lipídica en etanol en una fase acuosa para producir el coloide de liposoma, y

[0038] en donde la concentración de al menos uno de los lípidos en la solución lipídica corresponde a o es mayor que la solubilidad de equilibrio del al menos un lípido en etanol; y/o

[0039] en donde las partículas de lipoplexos de ARN se caracterizan por un único pico de Bragg a aproximadamente 1 nm<-1>, en donde el ancho del pico es menor a 0.2 nm<-1>, y/o

[0040] en donde las partículas de lipoplexos de ARN tienen un diámetro promedio que varía de aproximadamente 200 a aproximadamente 800 nm, de aproximadamente 250 a aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 500 nm, o de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 400 nm.

[0041] En una realización, el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y/o 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), y/o

[0042] el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) y/o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), y/o

[0043] el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), y/o la relación molar del al menos un lípido catiónico al el al menos un lípido adicional es de aproximadamente 10:0 a aproximadamente 1:9, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1, y/o las partículas de lipoplexos de ARN comprenden DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 10:0 a 1:9, de aproximadamente 4:1 a 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1 y en donde la relación de cargas positivas en DOTMA a cargas negativas en el ARN es de aproximadamente 1:2 a 1.9:2.

[0044] En una realización, la composición comprende además un adyuvante.

[0045] En una realización, la composición está formulada para administración sistémica, en donde la administración sistémica es preferiblemente mediante administración intravenosa, y/o la composición es para uso terapéutico. La invención se refiere además a un método para preparar una composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN que comprende descongelar la composición congelada de la invención y, opcionalmente, ajustar la osmolalidad y la fuerza iónica añadiendo un líquido acuoso. En una realización, se añade un líquido acuoso para obtener una osmolalidad de la composición de aproximadamente 200 mOsmol a aproximadamente 450 mOsmol y/o para obtener cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 80 mM a aproximadamente 150 mM.

[0046] Resumen de la enseñanza

[0047] La siguiente divulgación proporciona enseñanzas que van más allá de la invención como tal, que está definida exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Las enseñanzas se proporcionan para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. La información técnica adicional que no cae dentro del alcance del objeto de las reivindicaciones adjuntas no es parte de la invención. En particular, los términos "realización" y "aspecto" no deben interpretarse como necesariamente referidos a la invención reivindicada, a menos que el objeto en cuestión esté dentro del alcance de las reivindicaciones.

[0048] I. Métodos para preparar partículas de lipoplexos de ARN, partículas de lipoplexos de ARN y composiciones que comprenden partículas de lipoplexos de ARN

[0049] En un primer aspecto, la presente enseñanza se refiere a métodos para preparar partículas de lipoplexos de ARN con actividad biológica mejorada, partículas de lipoplexos de ARN preparadas de acuerdo con la enseñanza y composiciones que comprenden dichas partículas de lipoplexos de ARN. Las partículas de lipoplexos de ARN y las composiciones que comprenden partículas de lipoplexos de ARN son útiles para la administración de ARN a un tejido objetivo después de la administración parenteral, en particular después de la administración intravenosa. Las partículas de lipoplexos de ARN se preparan utilizando liposomas que se obtienen inyectando una solución altamente concentrada de lípidos en etanol en agua o una fase acuosa adecuada. En una realización, el producto de lipoplexos de ARN se caracteriza por un patrón específico en la dispersión de rayos X, donde un único pico de Bragg a aproximadamente 1 nm<-1>se observa, donde el ancho del pico es menor a 0.2 nm<-1>.

[0050] En una realización, los liposomas y las partículas de lipoplexos de ARN comprenden 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE). La concentración de DOPE en la mezcla de lípidos es mayor que la solubilidad de equilibrio del DOPE en etanol solo. A temperatura ambiente, el DOPE solo tiene una solubilidad de aproximadamente 50 mM, junto con el DOTMA tiene una solubilidad de 100 mM o más. Las soluciones lipídicas para formar liposomas, de los cuales se obtienen lipoplexos altamente activos, pueden tener una concentración total de lípidos de 270 mM o superior (por ejemplo, DOPE a 90 mM o superior). Se pueden obtener soluciones de concentración aún mayor en etanol aumentando la temperatura. Los liposomas obtenidos a partir de soluciones lipídicas donde la concentración de DOPE está por encima de la solubilidad de equilibrio son significativamente más grandes que los liposomas de soluciones lipídicas donde la concentración de DOPE está en la solubilidad de equilibrio y por debajo. El tamaño de los liposomas aumenta monótonamente con la concentración de etanol.

[0051] Los liposomas preparados de acuerdo con la enseñanza se pueden utilizar para preparar partículas de lipoplexos de ARN mezclando los liposomas con ARN. En una realización, el ARN se incuba con NaCl antes de mezclarlo para ajustar una determinada fuerza iónica, que es necesaria para aumentar la actividad de los lipoplexos. Los lipoplexos que se forman a partir de estos liposomas más grandes tienen una actividad biológica significativamente mayor, como lo demuestran los experimentosin vitroein vivo. Estos lipoplexos con mayor actividad se pueden discriminar claramente de aquellos con menor actividad mediante ciertos parámetros fisicoquímicos, por ejemplo (i) un ancho de pico más bajo del pico de Bragg y (ii) un perfil de separación diferente en métodos analíticos dispersivos para mediciones de tamaño, como el fraccionamiento de flujo de campo. Los lipoplexos con menor actividad son en promedio más pequeños. Además, también tienen un perfil de elución diferente, que probablemente esté relacionado con parámetros como la conformación molecular, la forma y las interacciones con la fase en masa.

[0052] Por consiguiente, en este aspecto, la enseñanza se refiere a un método para producir un coloide de liposoma que comprende inyectar una solución lipídica en etanol en una fase acuosa para producir el coloide de liposoma, en donde la concentración de al menos uno de los lípidos en la solución lipídica corresponde a o es mayor que la solubilidad de equilibrio del al menos un lípido en etanol.

[0053] En una realización, el método comprende calentar la solución lipídica para aumentar la concentración de lípidos en la solución lipídica. En una realización, la solución lipídica se calienta a una temperatura de al menos aproximadamente 40 °C, o al menos aproximadamente 60 °C.

[0054] En una realización, la solución lipídica es una solución de una mezcla de dos o más lípidos diferentes.

[0055] En una realización, la concentración de un lípido en la solución lipídica corresponde o es mayor que la solubilidad de equilibrio del lípido en etanol.

[0056] En una realización, la concentración total de lípidos en la solución lipídica es de aproximadamente 180 mM a aproximadamente 600 mM, de aproximadamente 300 mM a aproximadamente 600 mM, o aproximadamente 330 mM.

[0057] En una realización, la solución lipídica comprende al menos un lípido catiónico y al menos un lípido adicional. En una realización, la concentración de un lípido adicional en la solución lipídica corresponde o es mayor que la solubilidad de equilibrio del lípido adicional en etanol.

[0058] En una realización, el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y/o 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP).

[0059] En una realización, el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) y/o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

[0060] En una realización, el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

[0061] En una realización, la relación molar del al menos un lípido catiónico al el al menos un lípido adicional es de aproximadamente 10:0 a aproximadamente 1:9, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1.

[0062] En una realización, la solución lipídica comprende DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 10:0 a aproximadamente 1:9, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1.

[0063] En una realización, la concentración de DOPE en la solución lipídica es de al menos aproximadamente 60 mM, o al menos aproximadamente 90 mM.

[0064] En una realización, la solución lipídica se inyecta en la fase acuosa a una velocidad de agitación de la fase acuosa de aproximadamente 50 rpm a aproximadamente 150 rpm.

[0065] En una realización, la fase acuosa es agua.

[0066] En una realización, la fase acuosa tiene un pH ácido. En una realización, la fase acuosa comprende ácido acético, por ejemplo, en una cantidad de aproximadamente 5 mM.

[0067] En una realización, el método comprende además agitar el coloide de liposoma.

[0068] En una realización, el coloide de liposoma se agita durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 60 minutos, o durante aproximadamente 30 minutos.

[0069] La enseñanza se refiere además a un método para producir un coloide de liposoma que comprende inyectar una solución lipídica que comprende DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 2:1 en etanol en agua agitada a una velocidad de agitación de aproximadamente 150 rpm para producir el coloide de liposoma, en donde la concentración de DOTMA y DOPE en la solución lipídica es de aproximadamente 330 mM.

[0070] En una realización, el método de producción de un liposoma no comprende el paso de extrudir los liposomas. La enseñanza se refiere además a un coloide de liposoma que se puede obtener mediante el método de producción de un liposoma.

[0071] En una realización, los liposomas tienen un diámetro promedio de al menos aproximadamente 250 nm. En una realización, los liposomas tienen un diámetro promedio que varía de aproximadamente 250 nm a aproximadamente 800 nm.

[0072] En una realización, los liposomas tienen un índice de polidispersidad menor que aproximadamente 0.5, menor que aproximadamente 0.4 o menor que aproximadamente 0.3.

[0073] En una realización, los liposomas son liposomas catiónicos.

[0074] En una realización, los liposomas comprenden al menos un lípido catiónico y al menos un lípido adicional. En una realización, el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y/o 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP).

[0075] En una realización, el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) y/o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

[0076] En una realización, el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

[0077] En una realización, la relación molar del al menos un lípido catiónico al el al menos un lípido adicional es de aproximadamente 10:0 a aproximadamente 1:9, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1.

[0078] En una realización, los liposomas comprenden DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 10:0 a aproximadamente 1:9, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1.

[0079] La enseñanza se refiere además a un método para preparar partículas de lipoplexos de ARN que comprende añadir el coloide de liposoma anterior a una solución que comprende ARN.

[0080] En una realización, en un patrón de dispersión de rayos X, los lipoplexos de ARN se caracterizan por un único pico de Bragg a aproximadamente 1 nm<-1>, en donde el ancho del pico es menor a 0.2 nm<-1>.

[0081] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN tienen un diámetro promedio que varía de aproximadamente 200 a aproximadamente 800 nm, de aproximadamente 250 a aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 500 nm, o de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 400 nm.

[0082] La enseñanza se refiere además a una composición que comprende partículas de lipoplexos de ARN que se pueden obtener como se describió anteriormente.

[0083] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN comprenden al menos un lípido catiónico y al menos un lípido adicional.

[0084] En una realización, el ARN codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo, en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1.9:2, o aproximadamente 1.3:2.0.

[0085] La enseñanza se refiere además a una composición que comprende:

[0086] partículas de lipoplexos de ARN que comprenden:

[0087] ARN que codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo, y

[0088] al menos un lípido catiónico y al menos un lípido adicional,

[0089] en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1.9:2, o aproximadamente 1.3:2.0, y

[0090] en donde las partículas de lipoplexos de ARN se caracterizan por un único pico de Bragg a aproximadamente 1 nm<-1>, en donde el ancho del pico es menor a 0.2 nm<-1>.

[0091] En una realización, la composición comprende además cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, o de aproximadamente 80 mM a aproximadamente 150 mM.

[0092] En una realización, la composición comprende además un tampón.

[0093] En una realización, la composición comprende además un agente quelante.

[0094] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este aspecto bajo I. tienen un diámetro promedio que varía de aproximadamente 200 a aproximadamente 800 nm, de aproximadamente 250 a aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 500 nm, o de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 400 nm.

[0095] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN tienen un índice de polidispersidad menor que aproximadamente 0.5, menor que aproximadamente 0.4 o menor que aproximadamente 0.3.

[0096] En una realización, el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y/o 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP).

[0097] En una realización, el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) y/o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

[0098] En una realización, el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

[0099] En una realización, la relación molar del al menos un lípido catiónico al el al menos un lípido adicional es de aproximadamente 10:0 a aproximadamente 1:9, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1.

[0100] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN comprenden DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 10:0 a 1:9, de aproximadamente 4:1 a 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1 y en donde la relación de cargas positivas en DOTMA a cargas negativas en el ARN es de aproximadamente 1:2 a 1.9:2.

[0101] En una realización, el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

[0102] En una realización, el EDTA está en una concentración de aproximadamente 0.25 mM a aproximadamente 5 mM, o de aproximadamente 2.5 mM.

[0103] En una realización, la composición comprende además un adyuvante.

[0104] En una realización, la composición está formulada para administración sistémica.

[0105] En una realización, la administración sistémica es mediante administración intravenosa.

[0106] La enseñanza se refiere además a una composición tal como se describe para uso terapéutico.

[0107] II. Métodos para preparar partículas de lipoplexos de ARN de manera industrial conforme a las GMP

[0108] En un segundo aspecto, la presente enseñanza se refiere a métodos que permiten preparar partículas de lipoplexos de ARN de una manera industrial conforme a las GMP.

[0109] En una realización de la enseñanza, se utiliza un sistema de rutas de fluido para la fabricación GMP del producto de partículas de lipoplexos de ARN farmacéutico, lo que permite un control preciso de la relación de mezcla de ARN a liposomas, lo que es importante para la calidad del producto. En una realización, la ruta de fluido comprende la mezcla de una solución de liposomas y una solución de ARN en una relación 1 a 1 (volumen/volumen), donde las concentraciones de los componentes se seleccionan para mantener exactamente la relación de carga prevista. En una realización, el ARN se incuba con NaCl antes de mezclarlo para ajustar una determinada fuerza iónica, que es necesaria para la actividad de los lipoplexos. En una realización, se realiza una configuración de mezcla de tipo Y, que se basa completamente en materiales de un solo uso.

[0110] La dinámica de fluidos está optimizada para mantener las características de las partículas y evitar obstrucciones. Por el contrario, cuando se utilizan dispositivos microfluídicos disponibles comercialmente, se produce una obstrucción después de un tiempo, lo que hace imposible la aplicación de las GMP.

[0111] En una realización, los lipoplexos se fabrican incubando ARN con liposomas catiónicos, donde la relación de mezcla y las condiciones de mezcla se controlan exactamente mediante el uso de una bomba de jeringa (bomba perfusora), donde dos jeringas, una que comprende liposomas y otra que comprende ARN, se insertan en bombas de jeringa, preferiblemente en paralelo en la misma bomba. Los pistones de las bombas de agua son movidos hacia adelante por el mismo impulsor, controlando así exactamente los volúmenes relativos que se mezclan. En las condiciones de proceso seleccionadas, se utilizan jeringas idénticas para ambas soluciones, lo que permite una condición de mezcla exacta uno a uno (v/v). Ajustando las concentraciones de las dos soluciones antes de mezclarlas, se controla con exactitud la relación entre ARN y liposomas (lípidos catiónicos). En consecuencia, en este aspecto, la enseñanza se refiere a un método para la fabricación de flujo continuo de partículas de lipoplexos de ARN que comprende mezclar una solución que comprende ARN y una solución que comprende liposomas catiónicos en condiciones de mezcla controladas del ARN y los liposomas catiónicos. En una realización, la solución que comprende liposomas catiónicos es el coloide de liposoma como se describió anteriormente.

[0112] En una realización, la solución que comprende ARN y la solución que comprende liposomas catiónicos son soluciones acuosas.

[0113] En una realización, se utiliza un caudal que permite mezclar la solución que comprende ARN y la solución que comprende liposomas catiónicos.

[0114] En una realización, el flujo se caracteriza por un número de Reynolds mayor que 300, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 2100.

[0115] En una realización, las condiciones de mezcla controladas comprenden controlar la relación de mezcla de la solución que comprende ARN y la solución que comprende liposomas catiónicos.

[0116] En una realización, las condiciones de mezcla controladas comprenden controlar el volumen relativo de la solución que comprende ARN y la solución que comprende liposomas catiónicos que se van a mezclar. En una realización, la relación de mezcla del ARN y los liposomas catiónicos se controla utilizando un volumen de mezcla idéntico (v/v) de la solución que comprende ARN y la solución que comprende liposomas catiónicos y ajustando las concentraciones de ARN y liposomas catiónicos en las respectivas soluciones.

[0117] En una realización, las condiciones de mezcla controladas se seleccionan para mantener las características de las partículas de lipoplexos de ARN y evitar la obstrucción.

[0118] En una realización, el método comprende utilizar un elemento mezclador de tipo Y o de tipo T.

[0119] En una realización, el elemento mezclador de tipo Y o de tipo T tiene un diámetro de aproximadamente 1.2 mm a aproximadamente 50 mm.

[0120] En una realización, el método comprende el uso de un elemento mezclador, por ejemplo un elemento mezclador de tipo Y o tipo T, en donde los fluidos de dos tubos o mangueras se juntan y en donde no hay elementos mezcladores estáticos internos como por ejemplo canales divididos y recombinados, espina de pescado escalonada, canales en zigzag o retorcidos o serpentinas tridimensionales. Los elementos mezcladores pueden tener diámetros entre 1.2 y 50.0 mm.

[0121] En una realización, el método comprende utilizar un dispositivo, en donde dos jeringas, una que comprende la solución que comprende liposomas catiónicos y una que comprende la solución que comprende ARN, se insertan en paralelo en el mismo o dos soportes y los pistones del dispositivo son sobresalidos por uno o dos actuadores de precisión. En una realización, el método comprende utilizar una bomba de jeringa, donde dos jeringas, una que comprende la solución que comprende liposomas catiónicos y una que comprende la solución que comprende ARN, se insertan en paralelo en la misma bomba.

[0122] En una realización, el método comprende el uso de un recipiente presurizado, una bomba de membrana, una bomba de engranajes, una bomba de levitación magnética, una bomba peristáltica, bombas HPLC/FPLC o cualquier otra bomba de pistón, opcionalmente en combinación con sensores de caudal, opcionalmente con bucle de retroalimentación para control en línea y ajuste en tiempo real del caudal.

[0123] En una realización, la mezcla de la solución que comprende ARN y la solución que comprende liposomas comprende cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 300 mM, o comprende una fuerza iónica correspondiente al cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 300 mM.

[0124] En una realización, la solución de ARN comprende cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 90 mM a aproximadamente 600 mM, o comprende una fuerza iónica correspondiente al cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 90 mM a aproximadamente 600 mM.

[0125] En una realización, la mezcla de la solución que comprende ARN y la solución que comprende liposomas tiene una fuerza iónica de al menos aproximadamente 50 mM.

[0126] En una realización, en un patrón de dispersión de rayos X, los lipoplexos de ARN se caracterizan por un único pico de Bragg a aproximadamente 1 nm<-1>, en donde el ancho del pico es menor a 0.2 nm<-1>.

[0127] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN tienen un diámetro promedio que varía de aproximadamente 200 a aproximadamente 800 nm, de aproximadamente 250 a aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 500 nm, o de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 400 nm.

[0128] La enseñanza se refiere además a una composición que comprende partículas de lipoplexos de ARN que se pueden obtener como se describió anteriormente.

[0129] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN comprenden al menos un lípido catiónico y al menos un lípido adicional.

[0130] En una realización, el ARN codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo, en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1.9:2, o aproximadamente 1.3:2.0.

[0131] La enseñanza se refiere además a una composición que comprende:

[0132] partículas de lipoplexos de ARN que comprenden:

[0133] ARN que codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo, y

[0134] al menos un lípido catiónico y al menos un lípido adicional,

[0135] en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1.9:2, o aproximadamente 1.3:2.0, y

[0136] en donde las partículas de lipoplexos de ARN se caracterizan por un único pico de Bragg a aproximadamente 1 nm<-1>, en donde el ancho del pico es menor a 0.2 nm<-1>.

[0137] En una realización, la composición comprende además cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 300 mM, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, o de aproximadamente 80 mM a aproximadamente 150 mM.

[0138] En una realización, la composición comprende además un tampón.

[0139] En una realización, la composición comprende además un agente quelante.

[0140] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este aspecto bajo II. tienen un diámetro promedio que varía de aproximadamente 200 a aproximadamente 800 nm, de aproximadamente 250 a aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 500 nm, o de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 400 nm.

[0141] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN tienen un índice de polidispersidad menor que aproximadamente 0.5, menor que aproximadamente 0.4 o menor que aproximadamente 0.3.

[0142] En una realización, el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y/o 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP).

[0143] En una realización, el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) y/o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

[0144] En una realización, el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

[0145] En una realización, la relación molar del al menos un lípido catiónico al el al menos un lípido adicional es de aproximadamente 10:0 a aproximadamente 1:9, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1.

[0146] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN comprenden DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 10:0 a 1:9, de aproximadamente 4:1 a 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1 y en donde la relación de cargas positivas en DOTMA a cargas negativas en el ARN es de aproximadamente 1:2 a 1.9:2.

[0147] En una realización, el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

[0148] En una realización, el EDTA está en una concentración de aproximadamente 0.25 mM a aproximadamente 5 mM, o de aproximadamente 2.5 mM.

[0149] En una realización, la composición comprende además un adyuvante.

[0150] En una realización, la composición está formulada para administración sistémica.

[0151] En una realización, la administración sistémica es mediante administración intravenosa.

[0152] La enseñanza se refiere además a una composición tal como se describe para uso terapéutico.

[0153] III. Métodos y composiciones para almacenar partículas de lipoplexos de ARN

[0154] En un tercer aspecto, la presente enseñanza se refiere a métodos y composiciones para almacenar partículas de lipoplexos de ARN sin pérdida sustancial de la calidad del producto y, en particular, sin pérdida sustancial de la actividad del ARN. En particular, la presente enseñanza se refiere a formulaciones que permiten la congelación, liofilización o secado por aspersión de partículas de lipoplexos de ARN sin pérdida sustancial de la calidad de las partículas de lipoplexos de ARN y, en particular, sin pérdida sustancial de la actividad del ARN. Las formulaciones de partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento se pueden congelar o deshidratar mediante secado por congelación, secado por aspersión o métodos relacionados, lo que permite obtener una vida útil más prolongada de los productos en comparación con el almacenamiento en líquido. Para permitir la congelación, se añade un estabilizador (crioprotector). En una realización, los lipoplexos se diluyen con el estabilizador (crioprotector), después de la fabricación, lo que permite ajustar la fuerza iónica, preferiblemente para reducir la fuerza iónica y ajustar la concentración adecuada del estabilizador. Para la congelación del producto, la concentración del estabilizador puede ser mayor que el valor para obtener la osmolalidad fisiológica. En ese caso, para su administración, el producto se diluye con una fase acuosa adecuada (por ejemplo, agua para inyección, solución salina) para ajustar la osmolalidad y la fuerza iónica deseadas. Como estabilizadores se pueden utilizar azúcares como la glucosa, la sacarosa o la trehalosa, pero también otros compuestos, como los dextranos.

[0155] Sorprendentemente, se ha encontrado, de acuerdo con la enseñanza, que una formulación de lipoplexos de ARN que comprende un estabilizador como el descrito en este documento también puede liofilizarse. Para la liofilización, la concentración de estabilizador (lioprotector) requerida puede ser menor que para la congelación, y la concentración de NaCl tolerada (fuerza iónica) puede ser mayor que para la congelación. El producto también puede secarse por pulverización, si se requiere una deshidratación económica a gran escala.

[0156] El pH de algunas de las formulaciones de lipoplexos de ARN se ajusta a un valor que es inferior al rango fisiológico habitual y al pH óptimo habitual para el almacenamiento de ARN en la fase en masa. El pH óptimo es de aproximadamente 6.2, un rango adecuado está entre aproximadamente 5.7 y aproximadamente 6.7. Para otras formulaciones el pH ideal puede ser incluso más bajo. Se plantea la hipótesis de que el pH local dentro de los lipoplexos de ARN es más alto que el pH de la fase en masa debido a las cargas positivas del lípido catiónico.

[0157] En aquellas realizaciones de la enseñanza en las que las composiciones de lipoplexos de ARN se congelan para su almacenamiento, las composiciones se pueden descongelar y opcionalmente la osmolalidad, la fuerza iónica y/o el pH de la composición se pueden ajustar añadiendo un líquido acuoso. La composición resultante puede administrarse a un sujeto.

[0158] En aquellas realizaciones de la enseñanza en donde las composiciones de lipoplexos de ARN se liofilizan o se secan por congelación para su almacenamiento, las composiciones se pueden reconstituir añadiendo un líquido acuoso y, opcionalmente, la osmolalidad, la fuerza iónica y/o el pH de la composición se pueden ajustar añadiendo un líquido acuoso. La composición resultante puede administrarse a un sujeto.

[0159] En consecuencia, en este aspecto, la enseñanza se refiere a un método para preparar una composición congelada que comprende partículas de lipoplexos de ARN que comprende (i) proporcionar una composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN y un estabilizador y (ii) congelar la composición. En una realización, la congelación se realiza a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C, o aproximadamente -30 °C.

[0160] En una realización, la composición se almacena, por ejemplo, a una temperatura de almacenamiento de entre aproximadamente -15 °C y aproximadamente -40 °C, o aproximadamente -20 °C.

[0161] En una realización, el estabilizador es un carbohidrato seleccionado de un monosacárido, un disacárido, un trisacárido, un alcohol de azúcar, un oligosacárido o su alcohol de azúcar correspondiente y un polialcohol de cadena lineal.

[0162] En una realización, proporcionar una composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN y un estabilizador comprende proporcionar una composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN y agregar el estabilizador a la composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN. Por consiguiente, un método para preparar una composición para congelación comprende proporcionar una composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN y agregar un estabilizador a la composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN.

[0163] En una realización, agregar el estabilizador a la composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN reduce la fuerza iónica de la composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN. En una realización, la concentración de estabilizador en la composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN y un estabilizador es mayor que el valor requerido para la osmolalidad fisiológica.

[0164] En una realización, la concentración de estabilizador en la composición acuosa que comprende lipoplexos de ARN y un estabilizador es suficiente para mantener la calidad de las partículas de lipoplexos de ARN y, en particular, para evitar una pérdida sustancial de la actividad del ARN después del almacenamiento de la composición a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C durante al menos un mes, durante al menos 6 meses, durante al menos 12 meses, durante al menos 24 meses o durante al menos 36 meses.

[0165] En una realización, la concentración de estabilizador en la composición acuosa que comprende lipoplexos de ARN y un estabilizador es de aproximadamente 5% a aproximadamente 35.0% (p/v), de aproximadamente 10% a aproximadamente 30.0% (p/v), de aproximadamente 12.5% a aproximadamente 25.0% (p/v), o aproximadamente 22.0% (p/v).

[0166] En una realización, el pH en la composición acuosa que comprende lipoplexos de ARN y un estabilizador es inferior al pH óptimo habitual para el almacenamiento de ARN.

[0167] En una realización, la composición acuosa que comprende lipoplexos de ARN y un estabilizador comprende cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, o comprende una fuerza iónica correspondiente al cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM.

[0168] En una realización, la composición acuosa que comprende lipoplexos de ARN y un estabilizador tiene una fuerza iónica correspondiente al cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 20 mM.

[0169] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN se pueden obtener mediante el método descrito anteriormente bajo I. y II.

[0170] En una realización, el método de preparación de una composición congelada comprende además almacenar la composición congelada que comprende partículas de lipoplexos de ARN. La composición puede almacenarse a una temperatura que corresponde o corresponde esencialmente a la temperatura de congelación, o a una temperatura que es mayor o menor que la temperatura de congelación. Generalmente, la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C, por ejemplo a aproximadamente -20 °C.

[0171] La enseñanza se refiere además a una composición que comprende partículas de lipoplexos de ARN que se puede obtener mediante el método anterior de preparación de una composición congelada. La enseñanza también se refiere a una composición que comprende partículas de lipoplexos de ARN que se puede obtener mediante el método anterior de preparación de una composición para congelación.

[0172] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN comprenden al menos un lípido catiónico y al menos un lípido adicional.

[0173] En una realización, el ARN codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo, en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1.9:2, o aproximadamente 1.3:2.0.

[0174] En una realización, la composición comprende además cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM.

[0175] La enseñanza se refiere además a una composición que comprende:

[0176] partículas de lipoplexos de ARN que comprenden:

[0177] ARN que codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo,

[0178] al menos un lípido catiónico y al menos un lípido adicional,

[0179] en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1.9:2, o aproximadamente 1.3:2.0,

[0180] cloruro de sodio a una concentración de 0 mM a aproximadamente 40 mM, y

[0181] un estabilizador

[0182] En una realización, la composición comprende además un tampón.

[0183] En una realización, la cantidad de ARN en la composición es de aproximadamente 0.01 mg/mL a aproximadamente 1 mg/mL, de aproximadamente 0.05 mg/mL a aproximadamente 0.5 mg/mL, o de aproximadamente 0.05 mg/mL.

[0184] En una realización, el cloruro de sodio está en una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM.

[0185] En una realización, el cloruro de sodio está en una concentración de aproximadamente 20 mM.

[0186] En una realización, el cloruro de sodio está en una concentración de aproximadamente 30 mM.

[0187] En una realización, la concentración de estabilizador en la composición es mayor que el valor requerido para la osmolalidad fisiológica.

[0188] En una realización, la concentración de estabilizador en la composición es de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 por ciento en peso por volumen (% p/v), o de aproximadamente 12.5 a aproximadamente 25 por ciento en peso por volumen (% p/v).

[0189] En una realización, el estabilizador es un carbohidrato seleccionado de un monosacárido, un disacárido, un trisacárido, un alcohol de azúcar, un oligosacárido o su alcohol de azúcar correspondiente y un polialcohol de cadena lineal.

[0190] En una realización, el estabilizador es sacarosa en una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 por ciento en peso por volumen (% p/v).

[0191] En una realización, la sacarosa está en una concentración de aproximadamente 15% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v). En una realización, la sacarosa está en una concentración de aproximadamente 20% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v). En una realización, la sacarosa está en una concentración de aproximadamente 22% (p/v).

[0192] En una realización, la sacarosa está en una concentración de aproximadamente 20% (p/v).

[0193] En una realización, la composición tiene un pH que es inferior al pH óptimo habitual para el almacenamiento de ARN.

[0194] En una realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.7, o de aproximadamente 6.2.

[0195] En una realización, el tampón es ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfónico (HEPES).

[0196] En una realización, el HEPES está en una concentración de aproximadamente 2.5 mM a aproximadamente 10 mM, o de aproximadamente 7.5 mM.

[0197] En una realización, la composición comprende además un agente quelante.

[0198] La enseñanza se refiere además a una composición que comprende:

[0199] partículas de lipoplexos de ARN que comprenden:

[0200] ARN que codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo a una concentración de aproximadamente 0.05 mg/mL, y

[0201] DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 2:1,

[0202] en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1.3:2.0,

[0203] cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 20 mM,

[0204] sacarosa a una concentración de aproximadamente 22% (p/v),

[0205] HEPES a una concentración de aproximadamente 7.5 mM con un pH de aproximadamente 6.2, y

[0206] EDTA a una concentración de aproximadamente 2.5 mM.

[0207] En una realización, la composición está en estado líquido o congelado.

[0208] En una realización, la composición congelada es estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C durante al menos un mes, durante al menos 6 meses, durante al menos 12 meses, durante al menos 24 meses o durante al menos 36 meses.

[0209] En una realización, la composición congelada es estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C durante al menos un mes, durante al menos 6 meses, durante al menos 12 meses, durante al menos 24 meses o durante al menos 36 meses.

[0210] En una realización, la composición congelada es estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C durante al menos dos meses.

[0211] En una realización, la composición congelada es estable a una temperatura de aproximadamente -20 °C durante al menos un mes, durante al menos 6 meses, durante al menos 12 meses, durante al menos 24 meses o durante al menos 36 meses.

[0212] En una realización, la composición congelada es estable a una temperatura de aproximadamente -20 °C durante al menos dos meses.

[0213] En una realización, la composición congelada es estable a una temperatura de aproximadamente -30 °C durante al menos un mes, durante al menos 6 meses, durante al menos 12 meses, durante al menos 24 meses o durante al menos 36 meses.

[0214] En una realización, la composición congelada es estable a una temperatura de aproximadamente -30 °C durante al menos dos meses.

[0215] La enseñanza se refiere además a una composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN que se pueden obtener descongelando la composición congelada anterior y ajustando opcionalmente la osmolalidad y la fuerza iónica añadiendo un líquido acuoso.

[0216] En una realización, la osmolalidad de la composición es de aproximadamente 200 mOsmol a aproximadamente 450 mOsmol.

[0217] En una realización, la composición comprende cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 80 mM a aproximadamente 150 mM.

[0218] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN se pueden obtener mediante el método descrito anteriormente bajo I. y II.

[0219] La enseñanza se refiere además a un método para preparar una composición deshidratada, por ejemplo liofilizada o secada por pulverización, que comprende partículas de lipoplexos de ARN que comprende (i) proporcionar una composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN y un estabilizador y (ii) deshidratar, por ejemplo liofilizar o secar por pulverización, la composición.

[0220] En una realización, el estabilizador es un carbohidrato seleccionado de un monosacárido, un disacárido, un trisacárido, un alcohol de azúcar, un oligosacárido o su alcohol de azúcar correspondiente y un polialcohol de cadena lineal.

[0221] En una realización, proporcionar una composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN y un estabilizador comprende proporcionar una composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN y agregar el estabilizador a la composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN. Por consiguiente, un método para preparar una composición para deshidratación, por ejemplo liofilización o secado por aspersión, comprende proporcionar una composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN y agregar un estabilizador a la composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN. En una realización, agregar el estabilizador a la composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN reduce la fuerza iónica de la composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN. En una realización, la concentración de estabilizador en la composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN y un estabilizador es mayor que el valor requerido para la osmolalidad fisiológica.

[0222] En una realización, la concentración de estabilizador en la composición acuosa que comprende lipoplexos de ARN y un estabilizador es suficiente para mantener la calidad de las partículas de lipoplexos de ARN y, en particular, para evitar una pérdida sustancial de la actividad del ARN después del almacenamiento de la composición durante al menos un mes, durante al menos 6 meses, durante al menos 12 meses, durante al menos 24 meses o durante al menos 36 meses.

[0223] En una realización, la concentración de estabilizador en la composición acuosa que comprende lipoplexos de ARN y un estabilizador es de aproximadamente 5% a aproximadamente 35.0% (p/v), de aproximadamente 10% a aproximadamente 30.0% (p/v), de aproximadamente 12.5% a aproximadamente 25.0% (p/v), o aproximadamente 22.0% (p/v).

[0224] En una realización, el pH en la composición acuosa que comprende lipoplexos de ARN y un estabilizador es inferior al pH óptimo habitual para el almacenamiento de ARN.

[0225] En una realización, la composición acuosa que comprende lipoplexos de ARN y un estabilizador comprende cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 80 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, o comprende una fuerza iónica correspondiente a cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 80 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM.

[0226] En una realización, la composición acuosa que comprende lipoplexos de ARN y un estabilizador tiene una fuerza iónica correspondiente al cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 20 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 60 mM o aproximadamente 80 mM.

[0227] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN se pueden obtener mediante el método descrito anteriormente bajo I. y II.

[0228] En una realización, el método de preparación de una composición deshidratada, por ejemplo liofilizada o secada por pulverización, comprende además almacenar la composición liofilizada o secada por pulverización que comprende partículas de lipoplexos de ARN. Generalmente, la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C, por ejemplo, a aproximadamente -20 °C. En ciertas realizaciones, la composición se almacena a una temperatura superior a 0 °C, por ejemplo, a aproximadamente 25 °C o aproximadamente 4 °C, o por ejemplo a temperatura ambiente.

[0229] La enseñanza se refiere además a una composición que comprende partículas de lipoplexos de ARN que se puede obtener mediante el método anterior de preparación de una composición deshidratada, por ejemplo liofilizada o secada por pulverización. La enseñanza también se refiere a una composición que comprende partículas de lipoplexos de ARN que se puede obtener mediante el método anterior de preparación de una composición para deshidratación, por ejemplo liofilización o secado por aspersión.

[0230] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN comprenden al menos un lípido catiónico y al menos un lípido adicional.

[0231] En una realización, el ARN codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo, en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1.9:2, o aproximadamente 1.3:2.0.

[0232] En una realización, la composición comprende además cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 80 mM o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM.

[0233] La enseñanza se refiere además a una composición que comprende:

[0234] partículas de lipoplexos de ARN que comprenden:

[0235] ARN que codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo,

[0236] al menos un lípido catiónico y al menos un lípido adicional,

[0237] en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1.9:2, o aproximadamente 1.3:2.0,

[0238] cloruro de sodio a una concentración de 10 mM a aproximadamente 80 mM, y

[0239] un estabilizador

[0240] En una realización, la composición comprende además un tampón.

[0241] En una realización, la cantidad de ARN en la composición es de aproximadamente 0.01 mg/mL a aproximadamente 1 mg/mL, de aproximadamente 0.05 mg/mL a aproximadamente 0.5 mg/mL, o de aproximadamente 0.05 mg/mL.

[0242] En una realización, el cloruro de sodio está en una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM.

[0243] En una realización, el cloruro de sodio está en una concentración de aproximadamente 20 mM.

[0244] En una realización, el cloruro de sodio está en una concentración de aproximadamente 30 mM.

[0245] En una realización, la concentración de estabilizador en la composición es mayor que el valor requerido para la osmolalidad fisiológica.

[0246] En una realización, la concentración de estabilizador en la composición es de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 por ciento en peso por volumen (% p/v), o de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 por ciento en peso por volumen (% p/v).

[0247] En una realización, el estabilizador es un carbohidrato seleccionado de un monosacárido, un disacárido, un trisacárido, un alcohol de azúcar, un oligosacárido o su alcohol de azúcar correspondiente y un polialcohol de cadena lineal.

[0248] En una realización, el estabilizador es trehalosa en una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 por ciento en peso por volumen (% p/v).

[0249] En una realización, la trehalosa está en una concentración de aproximadamente 5% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v).

[0250] En una realización, la trehalosa está en una concentración de aproximadamente 10% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v).

[0251] En una realización, la trehalosa está en una concentración de aproximadamente 10% (p/v).

[0252] En una realización, la trehalosa está en una concentración de aproximadamente 15% (p/v).

[0253] En una realización, la composición tiene un pH que es inferior al pH óptimo habitual para el almacenamiento de ARN.

[0254] En una realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.7, o de aproximadamente 6.2.

[0255] En una realización, el tampón es ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfónico (HEPES).

[0256] En una realización, el HEPES está en una concentración de aproximadamente 2.5 mM a aproximadamente 10 mM, o de aproximadamente 7.5 mM.

[0257] En una realización, la composición comprende además un agente quelante.

[0258] La enseñanza se refiere además a una composición que comprende:

[0259] partículas de lipoplexos de ARN que comprenden:

[0260] ARN que codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo a una concentración de aproximadamente 0.05 mg/mL, y

[0261] DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 2:1,

[0262] en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1.3:2.0,

[0263] cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 20 mM,

[0264] trehalosa a una concentración de aproximadamente 10% (p/v),

[0265] HEPES a una concentración de aproximadamente 7.5 mM con un pH de aproximadamente 6.2, y

[0266] EDTA a una concentración de aproximadamente 2.5 mM.

[0267] En una realización, la composición está en estado líquido o deshidratado, por ejemplo liofilizado o secado por congelación.

[0268] En una realización, la composición deshidratada, por ejemplo liofilizada o secada por congelación, es estable durante al menos un mes, durante al menos 6 meses, durante al menos 12 meses, durante al menos 24 meses o durante al menos 36 meses. En una realización, la composición se almacena a una temperatura superior a 0 °C, por ejemplo a aproximadamente 25 °C o aproximadamente 4 °C, o por ejemplo a temperatura ambiente. En una realización, la composición deshidratada, por ejemplo liofilizada o secada por congelación, es estable durante al menos un mes.

[0269] En una realización, la composición deshidratada, por ejemplo liofilizada o secada por congelación, es estable durante al menos dos meses.

[0270] La enseñanza se refiere además a una composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN que se pueden obtener reconstituyendo la composición deshidratada anterior, por ejemplo liofilizada o secada por congelación, y opcionalmente ajustando la osmolalidad y la fuerza iónica añadiendo un líquido acuoso. En una realización, la osmolalidad de la composición es de aproximadamente 150 mOsmol a aproximadamente 450 mOsmol.

[0271] En una realización, la composición comprende cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 80 mM a aproximadamente 150 mM.

[0272] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN se pueden obtener mediante el método descrito anteriormente bajo I. y II.

[0273] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este aspecto bajo III. se caracterizan por un único pico de Bragg a aproximadamente 1 nm<-1>, en donde el ancho del pico es menor a 0.2 nm<-1>.

[0274] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este aspecto bajo III. tienen un diámetro promedio que varía de aproximadamente 200 a aproximadamente 800 nm, de aproximadamente 250 a aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 500 nm, o de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 400 nm.

[0275] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN tienen un índice de polidispersidad menor que aproximadamente 0.5, menor que aproximadamente 0.4 o menor que aproximadamente 0.3.

[0276] En una realización, el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y/o 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP).

[0277] En una realización, el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) y/o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).

[0278] En una realización, el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE).

[0279] En una realización, la relación molar del al menos un lípido catiónico al el al menos un lípido adicional es de aproximadamente 10:0 a aproximadamente 1:9, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1.

[0280] En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN comprenden DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 10:0 a 1:9, de aproximadamente 4:1 a 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1 y en donde la relación de cargas positivas en DOTMA a cargas negativas en el ARN es de aproximadamente 1:2 a 1.9:2.

[0281] En una realización, el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

[0282] En una realización, el EDTA está en una concentración de aproximadamente 0.25 mM a aproximadamente 5 mM, o de aproximadamente 2.5 mM.

[0283] En una realización, la composición comprende además un adyuvante.

[0284] En una realización, la composición está formulada para administración sistémica.

[0285] En una realización, la administración sistémica es mediante administración intravenosa.

[0286] La enseñanza se refiere además a una composición tal como se describe para uso terapéutico.

[0287] La enseñanza se refiere además a un método para preparar una composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN que comprende descongelar la composición congelada descrita anteriormente o reconstituir la composición liofilizada o secada por pulverización descrita anteriormente y, opcionalmente, ajustar la osmolalidad y la fuerza iónica añadiendo un líquido acuoso.

[0288] En una realización, se añade un líquido acuoso para obtener una osmolalidad de la composición de aproximadamente 200 mOsmol a aproximadamente 450 mOsmol.

[0289] En una realización, se añade un líquido acuoso para obtener cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 80 mM a aproximadamente 150 mM.

[0290] Breve descripción de los dibujos

[0291] Figura 1 muestra la correlación entre la concentración de lípidos en la solución madre de lípidos y el tamaño de los liposomas. Los liposomas se prepararon mediante inyección de etanol en agua (no se realizó ningún proceso de filtración después de la inyección de etanol). El tamaño de los liposomas aumenta con la concentración de lípidos en etanol. Este ejemplo: mezcla de lípidos DOTMA/DOPE con una relación molar% de 66:33.

[0292] Figura 2 muestra la cantidad de partículas presentes en las formulaciones de liposomas DOTMA/DOPE preparadas con diferentes soluciones lipídicas en diferentes concentraciones.

[0293] Figura 3 muestra el impacto del tamaño del precursor del liposoma (coloide de liposoma no filtrado utilizado) en el tamaño del lipoplexo de ARN. Se obtuvieron pequeños lipoplexos de ARN cuando se utilizaron pequeños liposomas para su formación. No se encontró una correlación clara entre el tamaño del liposoma y el tamaño del lipoplexo de ARN en todos los lipoplexos de ARN preparados con liposomas más grandes.

[0294] Figura 4 muestra la cantidad de partículas presentes en las formulaciones de lipoplexos de ARN preparadas con diferentes precursores de liposomas (liposomas no filtrados). La cantidad de partículas de 0.5 µm aumenta en las formulaciones de lipoplexos de ARN preparadas con liposomas más grandes. Los liposomas se prepararon mediante inyección de etanol utilizando diferentes soluciones madre de lípidos en diferentes concentraciones.

[0295] Figura 5 muestra curvas de difracción obtenidas a partir de mediciones de SAXS de lipoplexos de ARN formados con liposomas preparados a una relación de carga de 4/1 (arriba) y a una relación de carga de 1.3/2, donde los liposomas para la formación de lipoplexos se obtuvieron con solución madre de lípidos mM en etanol de 400 mM, 300 mM y 100 mM.

[0296] Figura 6 muestra la longitud de correlación y la eficiencia de transfecciónin vitro(células dendríticas humanas) de diferentes lipoplexos de ARN preparados con diferentes precursores de liposomas. La actividad biológica (transfección de ARNin vitro) aumenta monótonamente con la longitud de correlación del lipoplexo de ARN. Los liposomas se prepararon mediante inyección de etanol y se prepararon diferentes soluciones madre de lípidos en diferentes concentraciones de lípidos.

[0297] Figura 7 muestra mediciones de AF4 de lipoplexos de dos tipos diferentes de liposomas, fabricados a partir de una solución madre de 150 mM en etanol o de una solución madre de 400 mM en etanol.

[0298] Figura 8 muestra la eficiencia de la transfecciónin vitrode diferentes lipoplexos de ARN en células dendríticas. La señal de luciferasa aumenta monótonamente con el tamaño del liposoma utilizado para la formación de lipoplexos de ARN.

[0299] Figura 9 muestra la eficiencia de la transfecciónin vitrode diferentes lipoplexos de ARN en células dendríticas. La señal de luciferasa aumenta monótonamente con el tamaño del liposoma.

[0300] Figura 10 muestra la eficiencia de la transfecciónin vivode las formulaciones de lipoplexos de ARN 6 h después de la aplicación. Se prepararon lipoplexos de ARN con liposomas pequeños y grandes (liposomas no filtrados). Los lipoplexos de ARN preparados con liposomas más grandes dan como resultado una mayor expresión de luciferasa.

[0301] Figura 11 muestra imágenesin vivode lipoplexos de ARN 6 h después de la aplicación. Se prepararon lipoplexos de ARN con liposomas pequeños y grandes. A) Lipoplexo de ARN preparado con pequeños liposomas a partir de un coloide crudo. B) Lipoplexo de ARN preparado con liposomas de mayor tamaño a partir de un coloide crudo. C) Lipoplexo de ARN preparado con pequeños liposomas filtrados. D) Lipoplexo de ARN preparado con liposomas grandes filtrados. Se obtuvieron señales de bioluminiscencia más altas con el lipoplexo de ARN preparado con liposomas más grandes.

[0302] Figura 12 muestra el procedimiento general para la fabricación automatizada por lotes de lipoplexos de ARN. Figura 13 muestra el promedio Z y la polidispersidad de los lipoplexos de ARN que se preparan utilizando un elemento mezclador de tipo Y con un diámetro interno de 3.2 mm a diferentes caudales.

[0303] Figura 14: muestra el promedio Z y la polidispersidad de los lipoplexos de ARN que se preparan utilizando un elemento mezclador de tipo Y con un diámetro interno de 2.4 mm a diferentes caudales.

[0304] Figura 15 muestra la correlación del tamaño de partícula y la concentración de ARN en la formación de lipoplexos. La medición de PCS se realizó antes de la congelación.

[0305] Figura 16 muestra la correlación de las características de las partículas y la concentración de ARN en la formación de lipoplexos después de tres ciclos de congelación y descongelación.

[0306] Figura 17 muestra la correlación de las características de las partículas y la relación de carga (positiva:negativa) en el rango de 1.0:2.0 a 2.1:2.0.

[0307] Figura 18 muestra la correlación de las características de las partículas y la relación de carga (positiva:negativa) en el rango de 2.0:1.0 a 5.0:1.0.

[0308] Figura 19 muestra la correlación de las características de las partículas y la concentración de NaCl en la formación de lipoplexos.

[0309] Figura 20 muestra la correlación de la bioactividad y la concentración de NaCl en la formación de lipoplexos. Figura 21 muestra mediciones de la integridad del ARN en las composiciones de ARN<(LIP)>sin crioprotector utilizando diferentes sustancias tampón (HEPES; acetato de Na; fosfato de Na; carbonato de Na) a diferentes valores de pH tras almacenamiento acelerado a 40 °C. Las diferentes barras indican periodos de almacenamiento crecientes, de izquierda (3 días) a derecha a derecha (21 días).

[0310] Figura 22 muestra mediciones de la integridad del ARN en formulaciones de lipoplexos de ARN con sacarosa como crioprotector, utilizando HEPES como sustancia tampón a diferentes valores de pH tras un almacenamiento acelerado a 40 °C. Las diferentes barras indican periodos de almacenamiento crecientes, de izquierda (1 día) a derecha (21 días).

[0311] Figura 23 muestra la integridad del ARN en lipoplexos almacenados a 40 °C con diferentes contenidos de EDTA.

[0312] Figura 24 es un diagrama general que indica que la concentración de NaCl y crioprotector se optimizó en cada paso.

[0313] Figura 25 muestra el promedio Z y la polidispersidad de los lipoplexos de ARN congelados en presencia de cantidades crecientes de crioprotectores alternativos.

[0314] Figura 26 muestra el número de partículas subvisibles ≥ 10 µm en formulaciones de lipoplexos de ARN congeladas en presencia de cantidades crecientes de crioprotectores alternativos.

[0315] Figura 27 muestra mediciones del tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN que contienen 5-20% p/v de sacarosa (eje X) y varias concentraciones bajas de NaCl antes y después de la congelación a -30 °C.

[0316] Figura 28 muestra mediciones del tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN que contienen 5-20% p/v de dihidrato de trehalosa (eje x) y varias concentraciones bajas de NaCl antes y después de la congelación a -30 °C.

[0317] Figura 29 muestra mediciones del tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN que contienen 50 mM de NaCl y varias cantidades (% p:v) de dihidrato de trehalosa después de múltiples ciclos de congelación y descongelación.

[0318] Figura 30 muestra mediciones del tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN que contienen 70 mM de NaCl y varias cantidades (% p/v) de dihidrato de trehalosa después de múltiples ciclos de congelación y descongelación.

[0319] Figura 31 muestra mediciones del tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN que contienen 90 mM de NaCl y varias cantidades (% p/v) de dihidrato de trehalosa después de múltiples ciclos de congelación y descongelación.

[0320] Figura 32 muestra mediciones del tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN que contienen 5-20% p/v de sacarosa y varias concentraciones bajas de NaCl después del almacenamiento a -15 °C durante 8 meses. Las diferentes barras indican períodos de almacenamiento crecientes de izquierda (0 meses) a derecha (8 meses). En combinaciones de sacarosa/NaCl con menos de 8 barras, el tamaño de las partículas excedió las especificaciones en los dos puntos de tiempo siguientes y se detuvo el análisis.

[0321] Figura 33 muestra mediciones del tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN que contienen 5-20% p/v de sacarosa y varias concentraciones bajas de NaCl después del almacenamiento a -30 °C durante 8 meses. Las diferentes barras indican períodos de almacenamiento crecientes de izquierda (0 meses) a derecha (8 meses). En combinaciones de sacarosa/NaCl con menos de 8 barras, el tamaño de las partículas excedió las especificaciones en los dos puntos de tiempo siguientes y se detuvo el análisis.

[0322] Figura 34 muestra mediciones del tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN que contienen 5-20% p/v de dihidrato de trehalosa y varias concentraciones bajas de NaCl después del almacenamiento a -15 °C durante 8 meses.

[0323] Las diferentes barras indican períodos de almacenamiento crecientes de izquierda (0 meses) a derecha (8 meses). En combinaciones de trehalosa/NaCl con menos de 8 barras, el tamaño de las partículas excedió las especificaciones en los dos puntos de tiempo siguientes y se detuvo el análisis.

[0324] Figura 35 muestra mediciones del tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN que contienen 5-20% p/v de dihidrato de trehalosa y varias concentraciones bajas de NaCl después del almacenamiento a -30 °C durante 8 meses.

[0325] Las diferentes barras indican períodos de almacenamiento crecientes de izquierda (0 meses) a derecha (8 meses). En combinaciones de trehalosa/NaCl con menos de 8 barras, el tamaño de las partículas excedió las especificaciones en los dos puntos de tiempo siguientes y se detuvo el análisis.

[0326] Figura 36 muestra mediciones del tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN que contienen 22% p/v de sacarosa y varias concentraciones bajas de NaCl después del almacenamiento a -20 °C.

[0327] Figura 37 muestra mediciones del tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN que contienen 22% p/v de dihidrato de trehalosa y varias concentraciones bajas de NaCl después del almacenamiento a -20 °C.

[0328] Figura 38 muestra mediciones del tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN que contienen 22% p/v de glucosa y varias concentraciones bajas de NaCl después del almacenamiento a -20 °C.

[0329] Figura 39 muestra mediciones del tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN que contienen 22% p/v de glucosa y 20 mM de NaCl congeladas y almacenadas a una temperatura de -15 a -40 °C.

[0330] Figura 40 muestra mediciones del tamaño de partícula de lipoplexos de ARN congelados en composiciones que contienen las combinaciones de crioprotectores enumeradas en la Tabla 10 después del almacenamiento a -20 °C.

[0331] Figura 41 muestra el efecto de la concentración de trehalosa en las formulaciones de lipoplexos de ARN [ARN (lip)] después de la congelación-descongelación o después del secado por congelación y reconstitución. Figura 42 muestra el cambio de tamaño de partícula en formulaciones de ARN(lip) secadas por congelación preparadas en 22% de trehalosa después de la reconstitución con solución de NaCl al 0.9% o WFI (agua para inyección).

[0332] Figura 43 muestra la transfecciónin vitrode Luc-ARN de formulaciones de lipoplexos de ARN [ARN (lip)] secados por congelación preparadas en 22% de trehalosa a diferentes concentraciones de NaCl. Las muestras secadas por congelación se reconstituyeron con solución de NaCl al 0.9%. (columna texturizada: control líquido).

[0333] Figura 44 muestra el diámetro promedio Z de formulaciones de lipoplexos de ARN [ARN (lip)] secadas por congelación formuladas en diferentes relaciones de trehalosa/NaCl almacenadas a 2-8 °C o 25 °C después de la reconstitución con una solución de NaCl al 0.9%. Las formulaciones se reconstituyeron en el volumen original después del secado por congelación.

[0334] Figura 45 muestra la integridad del ARN (porcentaje ARN de longitud completa) del ARN(lip) secado por congelación formulado en diferentes relaciones de trehalosa/NaCl tras su reconstitución con una solución de NaCl al 0.9% y almacenado a 2-8 °C o 25 °C. Las formulaciones se reconstituyeron en el volumen original tras el secado por congelación y se diluyeron 1:1 con una solución de NaCl al 0.9% para los experimentos de cultivo celular (0.01 mg/mL de ARN).

[0335] Descripción detallada

[0336] A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos normales en la técnica. Preferiblemente, los términos utilizados en este documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suiza, (1995).

[0337] La práctica de la presente enseñanza empleará, a menos que se indique otra cosa, métodos convencionales de química, bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura en el campo (cf., por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0338] A continuación se describirán los elementos de la presente enseñanza.

[0339] El término "alrededor de" significa aproximadamente o casi, y en el contexto de un valor numérico o rango establecido en este documento en una realización significa ±20%, ±10%, ±5% o ±3% del valor numérico o rango citado o reivindicado.

[0340] Los términos "un", "uno, una" y "el, la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la enseñanza (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse de manera que cubran tanto el singular como el plural, a menos que se indique otra cosa en el presente documento o el contexto los contradiga claramente. La citación de rangos de valores que se incluye en este documento tiene como único fin servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del rango. A menos que se indique otra cosa en este documento, cada valor individual se incorpora a la memoria descriptiva como si se citara individualmente en este documento. Todos los métodos descritos en este documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique otra cosa en este documento o el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos o lenguaje de ejemplo (por ejemplo, "tales como") proporcionados en este documento tiene como único fin ilustrar mejor la enseñanza. Ningún lenguaje de la memoria descriptiva debe interpretarse como indicativo de algún elemento no reivindicado que sea esencial para la práctica de la enseñanza.

[0341] A menos que se especifique expresamente otra cosa, el término "que comprende" se utiliza en el contexto del presente documento para indicar que, opcionalmente, pueden estar presentes otros miembros además de los miembros de la lista introducida por "que comprende". Sin embargo, se contempla como una realización específica de la presente enseñanza que el término "que comprende" abarca la posibilidad de que no haya otros miembros presentes, es decir, para el propósito de esta realización "que comprende" debe entenderse como que tiene el significado de "que consiste en".

[0342] A lo largo del texto de esta memoria descriptiva se citan varios documentos. Los documentos citados en este documento incluyen patentes, solicitudes de patentes, publicaciones científicas, especificaciones del fabricante, instrucciones, etc. Nada de lo aquí mencionado debe interpretarse como una admisión de que la presente enseñanza no tiene derechos para anticipar a tal enseñanza.

[0343] Definiciones

[0344] A continuación se proporcionarán definiciones que se aplican a todos los aspectos de la presente enseñanza. Los siguientes términos tienen los siguientes significados a menos que se indique otra cosa. Cualquier término no definido tiene su significado reconocido en la técnica.

[0345] Términos tales como "reducir" o "inhibir" como se utilizan en este documento significan la capacidad de causar una disminución general, por ejemplo, de aproximadamente 5% o más, aproximadamente 10% o más, aproximadamente 20% o más, aproximadamente 50% o más, o aproximadamente 75% o más, en el nivel. El término "inhibir" o expresiones similares incluyen una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.

[0346] Términos tales como "aumentar" o "mejorar" en una realización se refieren a un aumento o mejora de al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 80% o al menos aproximadamente 100%.

[0347] El término "pH fisiológico" utilizado en este documento se refiere a un pH de aproximadamente 7.5.

[0348] Tal como se utiliza en la presente enseñanza, "% p/v" se refiere al porcentaje en peso por volumen, que es una unidad de concentración que mide la cantidad de soluto en gramos (g) expresada como un porcentaje del volumen total de la solución en mililitros (mL).

[0349] El término "fuerza iónica" se refiere a la relación matemática entre el número de diferentes tipos de especies iónicas en una solución particular y sus respectivas cargas. Así, la fuerza iónica I se representa matemáticamente mediante la fórmula

[0352]

[0354] en donde c es la concentración molar de una especie iónica particular y z el valor absoluto de su carga. La suma Σ se toma para todos los diferentes tipos de iones (i) en solución.

[0355] De acuerdo con la enseñanza, el término "fuerza iónica" en una realización se refiere a la presencia de iones monovalentes. Respecto a la presencia de iones divalentes, en particular cationes divalentes, su concentración o concentración efectiva (presencia de iones libres) debido a la presencia de agentes quelantes es en una realización suficientemente baja como para evitar la degradación del ARN. En una realización, la concentración o concentración efectiva de iones divalentes está por debajo del nivel catalítico para la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos de ARN. En una realización, la concentración de iones divalentes libres es de 20 µM o menos. En una realización, no hay o esencialmente no hay iones divalentes libres.

[0356] "Osmolalidad" se refiere a la concentración de un soluto particular expresada como el número de osmoles de soluto por kilogramo de disolvente.

[0357] El número de Reynolds es un número adimensional, que se puede calcular utilizando el siguiente formalismo:

[0360]

[0362] en donde ρ es la densidad del fluido, v es la velocidad del fluido, l es la longitud característica (aquí el diámetro interior del elemento mezclador) y η es la viscosidad.

[0363] El término "congelación" se relaciona con la solidificación de un líquido, usualmente con la eliminación de calor. El término "liofilizar" o "liofilización" se refiere al secado por congelación de una sustancia congelándola y luego reduciendo la presión circundante para permitir que el medio congelado en la sustancia se sublime directamente de la fase sólida a la fase gaseosa.

[0364] El término "secado por aspersión" se refiere al secado por aspersión de una sustancia mezclando un gas (calentado) con un fluido que se atomiza (se pulveriza) dentro de un recipiente (secado por aspersión), donde el disolvente de las gotitas formadas se evapora, dando lugar a un polvo seco.

[0365] El término "crioprotector" se refiere a una sustancia que se añade a una formulación para proteger los ingredientes activos durante las etapas de congelación.

[0366] El término "lioprotector" se refiere a una sustancia que se añade a una formulación para proteger los ingredientes activos durante las etapas de secado.

[0367] El término "reconstituir" se refiere a agregar un disolvente como agua a un producto seco para devolverlo a un estado líquido como su estado líquido original.

[0368] El término "recombinante" en el contexto de la presente enseñanza significa "hecho mediante ingeniería genética". En una realización, un "objeto recombinante" en el contexto de la presente enseñanza no es de origen natural.

[0369] El término "de origen natural" utilizado en este documento se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (incluidos los virus) y que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural. El término "encontrado en la naturaleza" significa "presente en la naturaleza" e incluye objetos conocidos, así como objetos que aún no han sido descubiertos y/o aislados de la naturaleza, pero que pueden ser descubiertos y/o aislados en el futuro a partir de una fuente natural.

[0370] El término "solubilidad en equilibrio" se refiere a la concentración del soluto a la cual la tasa a la que el soluto se disuelve y la tasa a la que el soluto se deposita fuera de la solución son la misma. En una realización, el término se refiere a la concentración respectiva a temperatura ambiente.

[0371] Como se usa en el presente documento, el término "temperatura ambiente" se refiere a temperaturas superiores a 4 °C, preferiblemente de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 40 °C, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 24 °C, o de aproximadamente 16 °C a aproximadamente 21 °C. Dichas temperaturas incluirán 14 °C, 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19 °C, 20 °C, 21 °C y 22 °C.

[0372] En el contexto de la presente enseñanza, el término "partícula" se refiere a una entidad estructurada formada por moléculas o complejos de moléculas. En una realización, el término "partícula" se refiere a una estructura de tamaño micro o nanométrico, tal como una estructura compacta de tamaño micro o nanométrico.

[0373] En el contexto de la presente enseñanza, el término "partícula de lipoplexo de ARN" se refiere a una partícula que contiene lípido, en particular lípido catiónico, y ARN. Las interacciones electrostáticas entre liposomas cargados positivamente y ARN cargado negativamente dan como resultado la formación de complejos y espontánea de partículas de lipoplexos de ARN. Los liposomas cargados positivamente generalmente pueden sintetizarse utilizando un lípido catiónico, tal como DOTMA, y lípidos adicionales, tal como DOPE. En una realización, una partícula de lipoplexo de ARN es una nanopartícula.

[0374] Tal como se utiliza en la presente enseñanza, "nanopartícula" se refiere a una partícula que comprende ARN y al menos un lípido catiónico y que tiene un diámetro promedio adecuado para la administración intravenosa. El término "diámetro promedio" se refiere al diámetro hidrodinámico medio de las partículas medido mediante dispersión dinámica de la luz (DLS) con análisis de datos utilizando el llamado algoritmo cumulante, que proporciona como resultados el llamado Z<promedio>con la dimensión de una longitud y el índice de polidispersidad (PI), que es adimensional (Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321). Aquí "diámetro promedio", "diámetro" o "tamaño" de partículas se utiliza como sinónimo de este valor de Z<promedio>.

[0375] El término "índice de polidispersidad" se utiliza aquí como una medida de la distribución del tamaño de un conjunto de partículas, por ejemplo, nanopartículas. El índice de polidispersidad se calcula a partir de mediciones de dispersión dinámica de la luz mediante el denominado análisis cumulante.

[0376] Tal como se utiliza en este documento, "partículas subvisibles" se refiere a partículas que tienen un diámetro promedio inferior a 100 micrómetros (µm). El número de partículas subvisibles se puede medir utilizando el oscurecimiento de la luz para indicar el grado de agregación de partículas de lipoplexos de ARN en la presente enseñanza. En algunas realizaciones, se mide el número de partículas subvisibles que tienen un diámetro promedio mayor o igual a 10 µm. En otras realizaciones, se mide el número de partículas subvisibles que tienen un diámetro promedio mayor o igual a 25 µm.

[0377] El término "técnica de inyección de etanol" se refiere a un proceso en el que una solución de etanol que comprende lípidos se inyecta rápidamente en una solución acuosa a través de una aguja. Esta acción dispersa los lípidos en toda la solución y promueve la formación de estructuras lipídicas, por ejemplo, la formación de vesículas lipídicas tal como la formación de liposomas. Generalmente, las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento se pueden obtener agregando ARN a una dispersión de liposomas coloidales. Utilizando la técnica de inyección de etanol, dicha dispersión de liposomas coloidales se forma, en una realización, de la siguiente manera: una solución de etanol que comprende lípidos, tales como lípidos catiónicos como DOTMA y lípidos adicionales, se inyecta en una solución acuosa bajo agitación. En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento se pueden obtener sin un paso de extrusión. El término "extrudir” o “extrusión" se refiere a la creación de partículas que tienen un perfil transversal fijo. En particular, se refiere a la reducción del tamaño de una partícula, mediante la cual la partícula es forzada a pasar a través de filtros con poros definidos.

[0378] Diámetro de partículas de lipoplexo de ARN

[0379] Las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento tienen un diámetro promedio que en una realización varía de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1000 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 800 nm, de aproximadamente 250 a aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 500 nm, o de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 400 nm. En realizaciones específicas, las partículas de lipoplexos de ARN tienen un diámetro promedio de aproximadamente 200 nm, aproximadamente 225 nm, aproximadamente 250 nm, aproximadamente 275 nm, aproximadamente 300 nm, aproximadamente 325 nm, aproximadamente 350 nm, aproximadamente 375 nm, aproximadamente 400 nm, aproximadamente 425 nm, aproximadamente 450 nm, aproximadamente 475 nm, aproximadamente 500 nm, aproximadamente 525 nm, aproximadamente 550 nm, aproximadamente 575 nm, aproximadamente 600 nm, aproximadamente 625 nm, aproximadamente 650 nm, aproximadamente 700 nm, aproximadamente 725 nm, aproximadamente 750 nm, aproximadamente 775 nm, aproximadamente 800 nm, aproximadamente 825 nm, aproximadamente 850 nm, aproximadamente 875 nm, aproximadamente 900 nm, aproximadamente 925 nm, aproximadamente 950 nm, aproximadamente 975 nm o aproximadamente 1000 nm. En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN tienen un diámetro promedio que varía de aproximadamente 250 nm a aproximadamente 700 nm. En otra realización, las partículas de lipoplexos de ARN tienen un diámetro promedio que varía de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 500 nm. En una realización de ejemplo, las partículas de lipoplexos de ARN tienen un diámetro promedio de aproximadamente 400 nm. Las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento, por ejemplo generadas mediante los procesos descritos en este documento, exhiben un índice de polidispersidad menor que aproximadamente 0.5, menor que aproximadamente 0.4 o menor que aproximadamente 0.3. A modo de ejemplo, las partículas de lipoplexos de ARN pueden exhibir un índice de polidispersidad en un rango de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.3.

[0380] Lípidos

[0381] En una realización, las soluciones lipídicas, los liposomas y las partículas de lipoplexos de ARN descritos en este documento incluyen un lípido catiónico. Tal como se utiliza en este documento, un "lípido catiónico" se refiere a un lípido que tiene una carga neta positiva. Los lípidos catiónicos unen el ARN cargado negativamente mediante interacción electrostática a la matriz lipídica. Generalmente, los lípidos catiónicos poseen una fracción lipofílica, tal como un esterol, una cadena acilo o diacilo, y el grupo principal del lípido normalmente lleva la carga positiva. Ejemplos de lípidos catiónicos incluyen 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA), dimetildioctadecilamonio (DDAB), 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio propano (DOTAP), 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP), 1,2-diaciloxi-3-dimetilamonio propanos; 1,2-dialquiloxi-3-dimetilamoniopropano, cloruro de dioctadecildimetil amonio (DODAC), 2,3-di(tetradecoxi)propil-(2-hidroxietil)-dimetilazanio (DMRIE), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DMEPC), 1,2-dimiristoil-3-trimetilamonio propano (DMTAP), bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxietilamonio (DORIE) y trifluoroacetato de 2,3-dioleoiloxi-N-[2(espermina carboxamida)etil]-N,N-dimetil-l-propanamio (DOSPA). Los preferidos son DOTMA, DOTAP, DODAC y DOSPA. En realizaciones específicas, el al menos un lípido catiónico es DOTMA y/o DOTAP. Se puede incorporar un lípido adicional para ajustar la relación de carga positiva a negativa general y la estabilidad física de las partículas de lipoplexos de ARN. En ciertas realizaciones, el lípido adicional es un lípido neutro. Tal como se utiliza en este documento, un "lípido neutro" se refiere a un lípido que tiene una carga neta de cero. Ejemplos de lípidos neutros incluyen 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingoemielina, cefalina, colesterol y cerebrósido. En realizaciones específicas, el segundo lípido es DOPE, colesterol y/o DOPC.

[0382] En ciertas realizaciones, las partículas de lipoplexos de ARN incluyen tanto un lípido catiónico como un lípido adicional. En una realización de ejemplo, el lípido catiónico es DOTMA y el lípido adicional es DOPE. Sin querer limitarse a la teoría, la cantidad de al menos un lípido catiónico en comparación con la cantidad de al menos un lípido adicional puede afectar características importantes de las partículas de lipoplexos de ARN, tal como la carga, el tamaño de partícula, la estabilidad, la selectividad tisular y la bioactividad del ARN. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la relación molar del al menos un lípido catiónico al el al menos un lípido adicional es de aproximadamente 10:0 a aproximadamente 1:9, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:2, o de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1. En realizaciones específicas, la relación molar puede ser de aproximadamente 3:1, aproximadamente 2.75:1, aproximadamente 2.5:1, aproximadamente 2.25:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 1.75:1, aproximadamente 1.5:1, aproximadamente 1.25:1 o aproximadamente 1:1. En una realización de ejemplo, la relación molar del al menos un lípido catiónico al el al menos un lípido adicional es de aproximadamente 2:1.

[0383] ARN

[0384] En la presente enseñanza, el término "ARN" se refiere a una molécula de ácido nucleico que incluye residuos de ribonucleótidos. En realizaciones preferidas, el ARN contiene todos o la mayoría de los residuos de ribonucleótidos. Como se utiliza en este documento, "ribonucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo β-D-ribofuranosilo. El ARN abarca el ARN bicatenario, el ARN monocatenario, el ARN aislado tal como el ARN parcialmente purificado, el ARN esencialmente puro, el ARN sintético, el ARN producido de forma recombinante, así como el ARN modificado que se diferencia del ARN natural por la adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Estas alteraciones pueden referirse a la adición de material no nucleotídico a los nucleótidos internos del ARN o a los extremos del ARN. También se contempla aquí que los nucleótidos en el ARN pueden ser nucleótidos no estándar, tal como nucleótidos sintetizados químicamente o desoxinucleótidos. Para la presente enseñanza, estos ARN alterados se consideran análogos del ARN de origen natural.

[0385] En ciertas realizaciones de la presente enseñanza, el ARN es ARN mensajero (ARNm) que se relaciona con una transcripción de ARN que codifica un péptido o proteína. Como se ha establecido en la técnica, el ARNm generalmente contiene una región no traducida 5' (5'-UTR), una región codificante de péptidos y una región no traducida 3' (3'-UTR). En algunas realizaciones, el ARN se produce mediante transcripciónin vitroo síntesis química. En una realización, el ARNm se produce mediante transcripciónin vitroutilizando una plantilla de ADN, donde ADN se refiere a un ácido nucleico que contiene desoxirribonucleótidos.

[0386] En una realización, el ARN es ARN transcritoin vitro(IVT-ARN) y puede obtenerse mediante transcripciónin vitrode una plantilla de ADN apropiada. El promotor para controlar la transcripción puede ser cualquier promotor de cualquier ARN polimerasa. Una plantilla de ADN para transcripciónin vitropuede obtenerse mediante la clonación de un ácido nucleico, en particular ADNc, e introduciéndolo en un vector apropiado para transcripciónin vitro. El ADNc puede obtenerse mediante transcripción inversa del ARN.

[0387] En ciertas realizaciones de la presente enseñanza, el ARN en las composiciones de lipoplexos de ARN descritas en este documento está en una concentración de aproximadamente 0.01 mg/mL a aproximadamente 1 mg/mL, o de aproximadamente 0.05 mg/mL a aproximadamente 0.5 mg/mL. En realizaciones específicas, el ARN está en una concentración de aproximadamente 0.05 mg/mL, aproximadamente 0.06 mg/mL, aproximadamente 0.07 mg/mL, aproximadamente 0.08 mg/mL, aproximadamente 0.09 mg/mL, aproximadamente 0.10 mg/mL, aproximadamente 0.11 mg/mL, aproximadamente 0.12 mg/mL, aproximadamente 0.13 mg/mL, aproximadamente 0.14 mg/mL, aproximadamente 0.15 mg/mL, aproximadamente 0.16 mg/mL, aproximadamente 0.17 mg/mL, aproximadamente 0.18 mg/mL, aproximadamente 0.19 mg/mL, aproximadamente 0.20 mg/mL, aproximadamente 0.21 mg/mL, aproximadamente 0.22 mg/mL, aproximadamente 0.23 mg/mL, aproximadamente 0.24 mg/mL, aproximadamente 0.25 mg/mL, aproximadamente 0.26 mg/mL, aproximadamente 0.27 mg/mL, aproximadamente 0.28 mg/mL, aproximadamente 0.29 mg/mL, aproximadamente 0.30 mg/mL, aproximadamente 0.31 mg/mL, aproximadamente 0.32 mg/mL, aproximadamente 0.33 mg/mL, aproximadamente 0.34 mg/mL, aproximadamente 0.35 mg/mL, aproximadamente 0.36 mg/mL, aproximadamente 0.37 mg/mL, aproximadamente 0.38 mg/mL, aproximadamente 0.39 mg/mL, aproximadamente 0.40 mg/mL, aproximadamente 0.41 mg/mL, aproximadamente 0.42 mg/mL, aproximadamente 0.43 mg/mL, aproximadamente 0.44 mg/mL, aproximadamente 0.45 mg/mL, aproximadamente 0.46 mg/mL, aproximadamente 0.47 mg/mL, aproximadamente 0.48 mg/mL, aproximadamente 0.49 mg/mL o aproximadamente 0.50 mg/mL. En una realización de ejemplo, el ARN está en una concentración de 0.05 mg/mL.

[0388] En una realización, el ARN puede tener ribonucleótidos modificados. Ejemplos de ribonucleótidos modificados incluyen 5-metilcitidina y pseudouridina.

[0389] En algunas realizaciones, el ARN de acuerdo con la presente enseñanza comprende un 5’-protector. En una realización, el ARN de la presente enseñanza no tiene 5'-trifosfatos sin protector. En una realización, el ARN puede modificarse mediante un análogo de 5’-protector. El término "5'-protector" se refiere a una estructura que se encuentra en el extremo 5' de una molécula de ARNm y generalmente consiste en un nucleótido de guanosina conectado al ARNm a través de un enlace trifosfato de 5' a 5'. En una realización, esta guanosina está metilada en la posición 7. Proporcionar un ARN con un 5’-protector o un análogo de 5’-protector se puede lograr mediante transcripciónin vitro, en donde el 5'-protector se expresa cotranscripcionalmente en la cadena de ARN, o puede unirse al ARN postranscripcionalmente utilizando enzimas de protección.

[0390] En algunas realizaciones, el ARN de acuerdo con la presente enseñanza comprende un 5'-UTR y/o un 3'-UTR. El término "región no traducida" o "UTR" se relaciona con una región en una molécula de ADN que se transcribe pero no se traduce en una secuencia de aminoácidos, o con la región correspondiente en una molécula de ARN, tal como una molécula de ARNm. Una región no traducida (UTR) puede estar presente 5' (corriente arriba) de un marco de lectura abierto (5'-UTR) y/o 3' (corriente abajo) de un marco de lectura abierto (3'-UTR). Un 5'-UTR, si está presente, se ubica en el extremo 5', corriente arriba del codón de inicio de una región codificante de proteína. Un 5'-UTR está corriente abajo del 5'-protector, si está presente, por ejemplo directamente adyacente al 5'-protector. Un 3'-UTR, si está presente, se ubica en el extremo 3', corriente abajo del codón de terminación de una región codificante de proteína, pero el término "3'-UTR" preferiblemente no incluye la cola de poli(A). Por lo tanto, la 3'-UTR está corriente arriba de la secuencia poli(A) (si está presente), por ejemplo directamente adyacente a la secuencia poli(A).

[0391] En algunas realizaciones, el ARN de acuerdo con la presente enseñanza comprende una secuencia 3'-poli(A). El término "secuencia poli(A)" se refiere a una secuencia de residuos de adenilo (A) que típicamente se encuentra en el extremo 3' de una molécula de ARN. De acuerdo con la enseñanza, en una realización, una secuencia de poli(A) comprende al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 80, o al menos aproximadamente 100, y hasta aproximadamente 500, hasta aproximadamente 400, hasta aproximadamente 300, hasta aproximadamente 200, o hasta aproximadamente 150 nucleótidos A, y en particular aproximadamente 120 nucleótidos A.

[0392] En el contexto de la presente enseñanza, el término "transcripción" se relaciona con un proceso en donde el código genético de una secuencia de ADN se transcribe en ARN. Posteriormente, el ARN puede traducirse en péptido o proteína.

[0393] Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se relaciona con el proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una cadena de ARNm dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para formar un péptido o una proteína.

[0395] En una realización, después de la administración de las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento, al menos una porción del ARN se administra a una célula objetivo. En una realización, al menos una porción del ARN se suministra al citosol de la célula objetivo. En una realización, el ARN es ARN que codifica un péptido o una proteína y el ARN es traducido por la célula objetivo para producir el péptido o la proteína. En una realización, la célula objetivo es una célula del bazo. En una realización, la célula objetivo es una célula presentadora de antígeno, tal como una célula presentadora de antígeno profesional en el bazo. En una realización, la célula objetivo es una célula dendrítica en el bazo. Por lo tanto, las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento pueden usarse para administrar ARN a dicha célula objetivo. En consecuencia, la presente enseñanza también se refiere a un método para administrar ARN a una célula objetivo en un sujeto que comprende la administración de las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento al sujeto. En una realización, el ARN se suministra al citosol de la célula objetivo. En una realización, el ARN es ARN que codifica un péptido o una proteína y el ARN es traducido por la célula objetivo para producir el péptido o la proteína.

[0397] En una realización, el ARN codifica un péptido o proteína farmacéuticamente activo.

[0399] De acuerdo con la enseñanza, el término "ARN codifica" significa que el ARN, si está presente en el entorno apropiado, tal como dentro de las células de un tejido objetivo, puede dirigir el ensamblaje de aminoácidos para producir el péptido o la proteína que codifica durante el proceso de traducción. En una realización, el ARN puede interactuar con la maquinaria de traducción celular permitiendo la traducción del péptido o proteína. Una célula puede producir el péptido o proteína codificado intracelularmente (por ejemplo, en el citoplasma y/o en el núcleo), puede secretar el péptido o proteína codificado o puede producirlo en la superficie.

[0401] De acuerdo con la enseñanza, el término "péptido" comprende oligo y polipéptidos y se refiere a sustancias que comprenden aproximadamente dos o más, aproximadamente 3 o más, aproximadamente 4 o más, aproximadamente 6 o más, aproximadamente 8 o más, aproximadamente 10 o más, aproximadamente 13 o más, aproximadamente 16 o más, aproximadamente 20 o más, y hasta aproximadamente 50, aproximadamente 100 o aproximadamente 150, aminoácidos consecutivos unidos entre sí a través de enlaces peptídicos. El término "proteína" se refiere a péptidos grandes, en particular péptidos que tienen al menos aproximadamente 151 aminoácidos, pero los términos "péptido" y "proteína" se utilizan aquí generalmente como sinónimos.

[0403] Un "péptido o proteína farmacéuticamente activo" tiene un efecto positivo o ventajoso sobre una condición o estado de enfermedad de un sujeto cuando se le proporciona al sujeto en una cantidad terapéuticamente efectiva. En una realización, un péptido o proteína farmacéuticamente activo tiene propiedades curativas o paliativas y puede administrarse para mejorar, mitigar, aliviar, revertir, retrasar la aparición o disminuir la gravedad de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno. Un péptido o proteína farmacéuticamente activo puede tener propiedades profilácticas y puede usarse para retrasar la aparición de una enfermedad o para disminuir la gravedad de dicha enfermedad o condición patológica. El término "péptido o proteína farmacéuticamente activo" incluye proteínas o polipéptidos completos, y también puede referirse a fragmentos farmacéuticamente activos de los mismos. También puede incluir análogos farmacéuticamente activos de un péptido o proteína.

[0405] Ejemplos de proteínas farmacéuticamente activas incluyen citoquinas y proteínas del sistema inmunológico, tales como compuestos inmunológicamente activos (por ejemplo, interleucinas, factor estimulante de colonias (CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), eritropoyetina, factor de necrosis tumoral (TNF), interferones, integrinas, adresinas, seletinas, receptores de anidamiento, receptores de células T, inmunoglobulinas, antígenos solubles del complejo mayor de histocompatibilidad, antígenos inmunológicamente activos como antígenos bacterianos, parasitarios o virales, alérgenos, autoantígenos, anticuerpos), hormonas (insulina, hormona tiroidea, catecolaminas, gonadotropinas, hormonas tróficas, prolactina, oxitocina, dopamina, somatotropina bovina, leptinas y similares), hormonas de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento humana), factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento similar a la insulina y similares), factor de crecimiento receptores, enzimas (activador tisular del plasminógeno, estreptoquinasa, enzimas biosintéticas o degradativas del colesterol, enzimas estereodogénicas, quinasas, fosfodiesterasas, metilasas, desmetilasas, deshidrogenasas, celulasas, proteasas, lipasas, fosfolipasas, aromatasas, citocromos, adenilato o guanilato ciclasas, neuraminidasas y similares), receptores (receptores de hormonas esteroides, receptores peptídicos), proteínas de unión (proteínas de unión a la hormona del crecimiento o al factor de crecimiento y similares), factores de transcripción y traducción, proteínas supresoras del crecimiento tumoral (por ejemplo, proteínas que inhiben la angiogénesis), proteínas estructurales (tales como colágeno, fibroína, fibrinógeno, elastina, tubulina, actina y miosina), proteínas sanguíneas (trombina, albúmina sérica, factor VII, factor VIII, insulina, factor IX, factor X, activador tisular del plasminógeno, proteína C, factor de von Willebrand, antitrombina III, glucocerebrosidasa, factor estimulante de colonias de granulocitos eritropoyetina (GCSF) o factor VIII modificado, anticoagulantes y similares.

[0406] El término "compuesto inmunológicamente activo" se refiere a cualquier compuesto que altere una respuesta inmune, por ejemplo, induciendo y/o suprimiendo la maduración de células inmunes, induciendo y/o suprimiendo la biosíntesis de citoquinas, y/o alterando la inmunidad humoral estimulando la producción de anticuerpos por las células B. Los compuestos inmunológicamente activos poseen una potente actividad inmunoestimulante que incluye actividad antiviral y antitumoral, y también pueden subregular otros aspectos de la respuesta inmune, por ejemplo, desplazando la respuesta inmune lejos de una respuesta inmune TH2, lo que es útil para tratar un amplio rango de enfermedades mediadas por TH2. Los compuestos inmunológicamente activos pueden ser útiles como adyuvantes de vacunas.

[0407] En una realización, un péptido o proteína farmacéuticamente activo comprende uno o más antígenos o uno o más epítopos, es decir, la administración del péptido o proteína a un sujeto provoca una respuesta inmune contra uno o más antígenos o uno o más epítopos en un sujeto que puede ser terapéutica o parcial o totalmente protectora.

[0408] El término "antígeno" se refiere a un agente que comprende un epítopo contra el cual se puede generar una respuesta inmune. El término "antígeno" incluye, en particular, proteínas y péptidos. En una realización, un antígeno es presentado por células del sistema inmunológico, tales como células presentadoras de antígenos como células dendríticas o macrófagos. En una realización, un antígeno o un producto de procesamiento del mismo, tal como un epítopo de células T, está unido a un receptor de células T o B, o a una molécula de inmunoglobulina tal como un anticuerpo. Por consiguiente, un antígeno o un producto de procesamiento del mismo puede reaccionar específicamente con anticuerpos o linfocitos T (células T). En una realización, un antígeno es un antígeno asociado a una enfermedad, tal como un antígeno tumoral, un antígeno viral o un antígeno bacteriano y un epítopo se deriva de dicho antígeno.

[0409] El término "antígeno asociado a la enfermedad" se utiliza en su sentido más amplio para referirse a cualquier antígeno asociado a una enfermedad. Un antígeno asociado a una enfermedad es una molécula que contiene epítopos que estimularán el sistema inmunológico del huésped para producir una respuesta inmune celular específica del antígeno y/o una respuesta de anticuerpos humorales contra la enfermedad. Por lo tanto, el antígeno asociado a la enfermedad o un epítopo del mismo puede utilizarse con fines terapéuticos. Los antígenos asociados a enfermedades pueden estar asociados a infecciones por microbios, típicamente antígenos microbianos, o asociados al cáncer, típicamente tumores.

[0410] El término "antígeno tumoral" se refiere a un componente de las células cancerosas que puede derivar del citoplasma, la superficie celular y el núcleo celular. En particular, se refiere a aquellos antígenos que se producen intracelularmente o como antígenos de superficie en las células tumorales.

[0411] El término "antígeno viral" se refiere a cualquier componente viral que tenga propiedades antigénicas, es decir, capaz de provocar una respuesta inmune en un individuo. El antígeno viral puede ser una ribonucleoproteína viral o una proteína de envoltura.

[0412] El término "antígeno bacteriano" se refiere a cualquier componente bacteriano que tenga propiedades antigénicas, es decir, capaz de provocar una respuesta inmune en un individuo. El antígeno bacteriano puede derivar de la pared celular o de la membrana citoplasmática de la bacteria.

[0413] El término "epítopo" se refiere a una parte o fragmento de una molécula, tal como un antígeno, que es reconocido por el sistema inmunológico. Por ejemplo, el epítopo puede ser reconocido por células T, células B o anticuerpos. Un epítopo de un antígeno puede incluir una porción continua o discontinua del antígeno y puede tener entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. En una realización, un epítopo tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. El término "epítopo" incluye epítopos de células T.

[0414] El término "epítopo de célula T" se refiere a una parte o fragmento de una proteína que es reconocida por una célula T cuando se presenta en el contexto de moléculas MHC. El término "complejo mayor de histocompatibilidad" y la abreviatura "MHC" incluyen moléculas MHC de clase I y MHC de clase II y se relacionan con un complejo de genes que está presente en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas MHC son importantes para la señalización entre los linfocitos y las células presentadoras de antígenos o células enfermas en reacciones inmunes, en donde las proteínas o moléculas MHC se unen a epítopos peptídicos y los presentan para su reconocimiento por los receptores de células T en las células T. Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y muestran tanto antígenos propios (fragmentos de péptidos de la propia célula) como antígenos no propios (por ejemplo, fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T. En el caso de los complejos MHC/péptido de clase I, los péptidos de unión son típicamente de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, aunque pueden ser eficaces péptidos más largos o más cortos. En el caso de los complejos MHC/péptido de clase II, los péptidos de unión son típicamente de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 aminoácidos, y en particular aproximadamente 13 a aproximadamente 18 aminoácidos de longitud, mientras que los péptidos más largos y más cortos pueden ser eficaces.

[0416] En ciertas realizaciones de la presente enseñanza, el ARN codifica al menos un epítopo. En ciertas realizaciones, el epítopo se deriva de un antígeno tumoral. El antígeno tumoral puede ser un antígeno "estándar", que generalmente se sabe que se expresa en varios tipos de cáncer. El antígeno tumoral también puede ser un "neoantígeno", que es específico del tumor de un individuo y no ha sido reconocido previamente por el sistema inmunológico. Un neoantígeno o neoepítopo puede ser el resultado de una o más mutaciones específicas del cáncer en el genoma de las células cancerosas que resulten en cambios de aminoácidos. Ejemplos de antígenos tumorales incluyen p53, ART-4, BAGE, beta-catenina/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1 , CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, las proteínas de superficie celular de la familia de las claudinas, tales como CLAUD ΓN-6, CLAUDIN-18.2 y CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap 100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (o hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preferiblemente MAGE-A1 , MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE- A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A 10, MAGE-A 11, o MAGE- A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1 /Melan-A, MC1R, Miosin/m, MUC1 , MUM-1 , MUM -2, MUM -3, NA88-A, NF1 , NY-ESO-1 , NY-BR-1 , pl90 menor BCR-abL, Pml/RARa, PRAME, proteinasa 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, SCGB3A2, SCP1 , SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1 , TPI/m, TRP-1 , TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE, WT, y WT-1.

[0418] Las mutaciones del cáncer varían con cada individuo. Por lo tanto, las mutaciones del cáncer que codifican nuevos epítopos (neoepítopos) representan objetivos atractivos en el desarrollo de composiciones de vacunas e inmunoterapias. La eficacia de la inmunoterapia tumoral depende de la selección de antígenos y epítopos específicos del cáncer capaces de inducir una potente respuesta inmune dentro de un huésped. El ARN se puede utilizar para administrar epítopos tumorales específicos del paciente. Las células dendríticas (DC) que residen en el bazo representan células presentadoras de antígenos de particular interés para la expresión de ARN de epítopos inmunogénicos o antígenos tales como epítopos tumorales. Se ha demostrado que el uso de múltiples epítopos promueve la eficacia terapéutica en composiciones de vacunas tumorales. La secuenciación rápida del mutanoma tumoral puede proporcionar múltiples epítopos para vacunas individualizadas que pueden codificarse mediante el ARN descrito en este documento, por ejemplo, como un único polipéptido en el que los epítopos están opcionalmente separados por enlazadores. En ciertas realizaciones de la presente enseñanza, el ARN codifica al menos un epítopo, al menos dos epítopos, al menos tres epítopos, al menos cuatro epítopos, al menos cinco epítopos, al menos seis epítopos, al menos siete epítopos, al menos ocho epítopos, al menos nueve epítopos o al menos diez epítopos. Las realizaciones de ejemplo incluyen ARN que codifica al menos cinco epítopos (denominados "pentatopo") y ARN que codifica al menos diez epítopos (denominados "decatopo").

[0420] Relación de carga

[0422] La carga eléctrica de las partículas de lipoplexos de ARN de la presente enseñanza es la suma de las cargas eléctricas presentes en el al menos un lípido catiónico y las cargas eléctricas presentes en el ARN. La relación de carga es la relación de las cargas positivas presentes en el al menos un lípido catiónico y las cargas negativas presentes en el ARN. La relación de carga de las cargas positivas presentes en el al menos un lípido catiónico con respecto a las cargas negativas presentes en el ARN se calcula mediante la siguiente ecuación: relación de carga = [(concentración de lípido catiónico (mol)) * (el número total de cargas positivas en el lípido catiónico)]/[(concentración de ARN (mol)) * (el número total de cargas negativas en el ARN)]. La concentración de ARN y la cantidad de el al menos un lípido catiónico se pueden determinar utilizando métodos de rutina por un experto en la técnica.

[0424] En una primera realización, a pH fisiológico, la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1.9:2 a aproximadamente 1:2. En realizaciones específicas, la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN a pH fisiológico es de aproximadamente 1.9:2.0, aproximadamente 1.8:2.0, aproximadamente 1.7:2.0, aproximadamente 1.6:2.0, aproximadamente 1.5:2.0, aproximadamente 1.4:2.0, aproximadamente 1.3:2.0, aproximadamente 1.2:2.0, aproximadamente 1.1:2.0 o aproximadamente 1:2.0. En una realización, la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN a pH fisiológico es 1.3:2.0. En otra realización, las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento pueden tener un número igual de cargas positivas y negativas a pH fisiológico, produciendo partículas de lipoplexos de ARN con una relación de carga neta neutra.

[0426] En una segunda realización, a pH fisiológico, la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 1.5:1. En realizaciones específicas, la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN a pH fisiológico es de aproximadamente 6.0:1.0, aproximadamente 5.9:1.0, aproximadamente 5.8:1.0, aproximadamente 5.7:1.0, aproximadamente 5.6:1.0, aproximadamente 5.5:1.0, aproximadamente 5.4:1.0, aproximadamente 5.3:1.0, aproximadamente 5.2:1.0, aproximadamente 5.1:1.0, aproximadamente 5.0:1.0, aproximadamente 4.9:1.0, aproximadamente 4.8:1.0, aproximadamente 4.7:1.0, aproximadamente 4.6:1.0, aproximadamente 4.5:1.0, aproximadamente 4.4:1.0, aproximadamente 4.3:1.0, aproximadamente 4.2:1.0, aproximadamente 4.1:1.0, aproximadamente 4.0:1.0, aproximadamente 3.9:1.0, aproximadamente 3.8:1.0, aproximadamente 3.7:1.0, aproximadamente 3.6:1.0, aproximadamente 3.5:1.0, aproximadamente 3.4:1.0, aproximadamente 3.3:1.0, aproximadamente 3.2:1.0, aproximadamente 3.1:1.0, aproximadamente 3.0:1.0, aproximadamente 2.9:1.0, aproximadamente 2.8:1.0, aproximadamente 2.7:1.0, aproximadamente 2.6:1.0, aproximadamente 2.5:1.0, aproximadamente 2.4:1.0, aproximadamente 2.3:1.0, aproximadamente 2.2:1.0, aproximadamente 2.1:1.0, aproximadamente 2.0:1.0, aproximadamente 1.9:1.0, aproximadamente 1.8:1.0, aproximadamente 1.7:1.0, aproximadamente 1.6:1.0 o aproximadamente 1.5:1.0.

[0427] Para la inmunoterapia basada en ARN, es necesario direccionar a órganos precisos, tales como el bazo, para evitar una respuesta autoinmune en otros órganos y una posible toxicidad. De acuerdo con la enseñanza, el ARN puede dirigirse a diferentes células, tejidos u órganos.

[0428] Se ha encontrado que las partículas de lipoplexos de ARN que tienen una relación de carga de acuerdo con la primera realización se pueden utilizar para direccionar preferiblemente al tejido del bazo o a las células del bazo, tales como células presentadoras de antígenos, en particular células dendríticas. Por consiguiente, en una realización, después de la administración de las partículas de lipoplexos de ARN, se produce acumulación de ARN y/o expresión de ARN en el bazo. De esta manera, las partículas de lipoplexos de ARN de la enseñanza pueden utilizarse para expresar ARN en el bazo. En una realización, después de la administración de las partículas de lipoplexos de ARN, no se produce o esencialmente no se produce acumulación de ARN y/o expresión de ARN en el pulmón y/o el hígado. En una realización, después de la administración de las partículas de lipoplexos de ARN, se produce la acumulación de ARN y/o la expresión de ARN en células presentadoras de antígenos, tales como células presentadoras de antígenos profesionales en el bazo. De esta manera, las partículas de lipoplexos de ARN de la enseñanza pueden usarse para expresar ARN en dichas células presentadoras de antígenos. En una realización, las células presentadoras de antígenos son células dendríticas y/o macrófagos.

[0429] Se ha encontrado que las partículas de lipoplexos de ARN que tienen una relación de carga según la segunda realización se pueden utilizar para direccionar preferiblemente al tejido pulmonar o a las células pulmonares. Por consiguiente, en una realización, después de la administración de las partículas de lipoplexos de ARN, se produce acumulación de ARN y/o expresión de ARN en el pulmón. De esta manera, las partículas de lipoplexos de ARN de la enseñanza pueden utilizarse para expresar ARN en el pulmón. Por consiguiente, si se desea la expresión de ARN en un tejido distinto del bazo, en las realizaciones descritas en este documento en relación con una relación de carga de acuerdo con la primera realización, por ejemplo, una relación de carga de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1.9:2, se puede utilizar una relación de carga acuerdo con la segunda realización, por ejemplo, una relación de carga de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 1.5:1, en lugar de la relación de carga acuerdo con la primera realización. En estas y otras realizaciones descritas en este documento, se puede utilizar ARN distinto del ARN que codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo, por ejemplo, ARN que codifica un péptido o proteína farmacéuticamente activo como se describe en este documento. En una realización, el péptido o proteína farmacéuticamente activo es una citoquina y/o se pretende el tratamiento del cáncer de pulmón.

[0430] Composiciones que comprenden partículas de lipoplexos de ARN

[0431] A. Sal y fuerza iónica

[0432] De acuerdo con la presente enseñanza, las composiciones descritas en este documento pueden comprender sales tales como cloruro de sodio. Sin querer limitarnos a la teoría, el cloruro de sodio funciona como un agente de osmolalidad iónica para preacondicionar el ARN antes de mezclarlo con el al menos un lípido catiónico. Ciertas realizaciones contemplan sales orgánicas o inorgánicas alternativas al cloruro de sodio en la presente enseñanza. Las sales alternativas incluyen cloruro de potasio, fosfato dipotásico, fosfato monopotásico, acetato de potasio, bicarbonato de potasio, sulfato de potasio, acetato de potasio, fosfato disódico, fosfato monosódico, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, sulfato de sodio, acetato de sodio, cloruro de litio, cloruro de magnesio, fosfato de magnesio, cloruro de calcio y sales de sodio del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Generalmente, las composiciones que comprenden partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento comprenden cloruro de sodio a una concentración que varía preferiblemente de 0 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 400 mM, o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 300 mM. En una realización, las composiciones que comprenden partículas de lipoplexos de ARN comprenden una fuerza iónica correspondiente a dichas concentraciones de cloruro de sodio.

[0433] Generalmente, las composiciones para y resultantes de la formación de partículas de lipoplexos de ARN a partir de ARN y liposomas tales como los descritos en este documento comprenden altas concentraciones de cloruro de sodio o comprenden una alta fuerza iónica. En una realización, el cloruro de sodio está en una concentración de al menos 45 mM. En una realización, el cloruro de sodio está en una concentración de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 300 mM, o de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM. En una realización, las composiciones comprenden una fuerza iónica correspondiente a dichas concentraciones de cloruro de sodio.

[0434] Generalmente, las composiciones para almacenar partículas de lipoplexos de ARN tales como para la congelación de partículas de lipoplexos de ARN tales como las descritas en este documento comprenden concentraciones bajas de cloruro de sodio o comprenden una fuerza iónica baja. En una realización, el cloruro de sodio está en una concentración de 0 mM a aproximadamente 50 mM, de 0 mM a aproximadamente 40 mM, o de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM. En realizaciones específicas, el cloruro de sodio está en una concentración de aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 11 mM, aproximadamente 12 mM, aproximadamente 13 mM, aproximadamente 14 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 16 mM, aproximadamente 17 mM, aproximadamente 18 mM, aproximadamente 19 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 21 mM, aproximadamente 22 mM, aproximadamente 23 mM, aproximadamente 24 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 26 mM, aproximadamente 27 mM, aproximadamente 28 mM, aproximadamente 29 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 31 mM, aproximadamente 32 mM, aproximadamente 33 mM, aproximadamente 34 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 36 mM, aproximadamente 37 mM, aproximadamente 38 mM, aproximadamente 39 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 41 mM, aproximadamente 42 mM, aproximadamente 43 mM, aproximadamente 44 mM, aproximadamente 45 mM, aproximadamente 46 mM, aproximadamente 47 mM, aproximadamente 48 mM, aproximadamente 49 mM, o aproximadamente 50 mM. En realizaciones preferidas, el cloruro de sodio está en una concentración de aproximadamente 20 mM, aproximadamente 30 mM o aproximadamente 40 mM. En una realización de ejemplo, el cloruro de sodio está en una concentración de 20 mM. En otra realización de ejemplo, el cloruro de sodio está en una concentración de 30 mM. En una realización, las composiciones comprenden una fuerza iónica correspondiente a dichas concentraciones de cloruro de sodio.

[0435] Generalmente, las composiciones resultantes de descongelar composiciones de partículas de lipoplexos de ARN congeladas y ajustar opcionalmente la osmolalidad y la fuerza iónica mediante la adición de un líquido acuoso comprenden altas concentraciones de cloruro de sodio o comprenden una alta fuerza iónica. En una realización, el cloruro de sodio está en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM, o de aproximadamente 80 mM a aproximadamente 150 mM. En una realización, las composiciones comprenden una fuerza iónica correspondiente a dichas concentraciones de cloruro de sodio.

[0436] B. Estabilizador

[0437] Las composiciones descritas en este documento pueden comprender un estabilizador para evitar una pérdida sustancial de la calidad del producto y, en particular, una pérdida sustancial de la actividad del ARN durante la congelación, liofilización o secado por aspersión y el almacenamiento de la composición congelada, liofilizada o secada por pulverización. A dicha composición también se la denomina aquí estable. Típicamente, el estabilizador está presente antes del proceso de congelación, liofilización o secado por aspersión y persiste en la preparación congelada, liofilizada o secada por congelación resultante. Se puede utilizar para proteger partículas de lipoplexos de ARN durante la congelación, liofilización o secado por aspersión y el almacenamiento de la preparación congelada, liofilizada o secada por congelación, por ejemplo, para reducir o prevenir la agregación, el colapso de partículas, la degradación del ARN y/u otros tipos de daños.

[0438] En una realización, el estabilizador es un carbohidrato. El término "carbohidrato", tal como se utiliza en este documento, se refiere a y abarca monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. En una realización, el estabilizador es un monosacárido. El término "monosacárido", tal como se utiliza en este documento, se refiere a una única unidad de carbohidrato (por ejemplo, un azúcar simple) que no se puede hidrolizar en unidades de carbohidrato más simples. Los estabilizadores de monosacáridos de ejemplo incluyen glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, ribosa y similares.

[0439] En una realización, el estabilizador es un disacárido. El término "disacárido", tal como se utiliza en este documento, se refiere a un compuesto o una fracción química formada por 2 unidades de monosacárido que están unidas entre sí a través de un enlace glucosídico, por ejemplo a través de enlaces 1-4 o enlaces 1-6. Un disacárido puede hidrolizarse en dos monosacáridos. Los estabilizadores de disacáridos de ejemplo incluyen sacarosa, trehalosa, lactosa, maltosa y similares.

[0440] El término "trisacárido" significa tres azúcares unidos para formar una molécula. Ejemplos de trisacáridos incluyen rafinosa y melezitosa.

[0441] En una realización, el estabilizador es un oligosacárido. El término "oligosacárido", tal como se utiliza en este documento, se refiere a un compuesto o una fracción química formada por 3 a aproximadamente 15, preferiblemente 3 a aproximadamente 10 unidades de monosacáridos que están unidas entre sí a través de enlaces glucosídicos, por ejemplo a través de enlaces 1-4 o enlaces 1-6, para formar una estructura lineal, ramificada o cíclica. Los estabilizadores de oligosacáridos de ejemplo incluyen ciclodextrinas, rafinosa, melezitosa, maltotriosa, estaquiosa, acarbosa y similares. Un oligosacárido puede oxidarse o reducirse.

[0442] En una realización, el estabilizador es un oligosacárido cíclico. El término "oligosacárido cíclico", como se utiliza en este documento, se refiere a un compuesto o una fracción química formada por 3 a aproximadamente 15, preferiblemente 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de monosacáridos que están unidas entre sí a través de enlaces glucosídicos, por ejemplo a través de enlaces 1-4 o enlaces 1-6, para formar una estructura cíclica. Los estabilizadores de oligosacáridos cíclicos de ejemplo incluyen oligosacáridos cíclicos que son compuestos discretos, tal como α ciclodextrina, β ciclodextrina o γ ciclodextrina.

[0443] Otros estabilizadores de oligosacáridos cíclicos de ejemplo incluyen compuestos que incluyen una fracción de ciclodextrina en una estructura molecular más grande, tal como un polímero que contiene una fracción de oligosacárido cíclico. Un oligosacárido cíclico puede oxidarse o reducirse, por ejemplo, oxidarse a formas dicarbonílicas. El término "fracción de ciclodextrina", como se utiliza en este documento, se refiere a un radical de ciclodextrina (por ejemplo, una ciclodextrina α, β o γ) que se incorpora a, o es parte de, una estructura molecular más grande, tal como un polímero. Una fracción de ciclodextrina se puede unir a una o más fracciones directamente o a través de un enlazador opcional. Una fracción de ciclodextrina puede oxidarse o reducirse, por ejemplo, oxidarse a formas de dicarbonilo.

[0444] Los estabilizadores de carbohidratos, por ejemplo, los estabilizadores de oligosacáridos cíclicos, pueden ser carbohidratos derivados. Por ejemplo, en una realización, el estabilizador es un oligosacárido cíclico derivado, por ejemplo, una ciclodextrina derivada, por ejemplo, 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina, por ejemplo, ciclodextrinas parcialmente eterificadas (por ejemplo, β ciclodextrinas parcialmente eterificadas).

[0445] Un estabilizador de ejemplo es un polisacárido. El término "polisacárido", como se utiliza en este documento, se refiere a un compuesto o una fracción química formada por al menos 16 unidades de monosacáridos que están unidas entre sí a través de enlaces glucosídicos, por ejemplo a través de enlaces 1-4 o enlaces 1-6, para formar una estructura lineal, ramificada o cíclica, e incluye polímeros que comprenden polisacáridos como parte de su estructura principal. En las cadenas principales, el polisacárido puede ser lineal o cíclico. Los estabilizadores de polisacáridos de ejemplo incluyen glucógeno, amilasa, celulosa, dextrano, maltodextrina y similares.

[0446] En una realización, el estabilizador es un alcohol de azúcar. Tal como se utiliza en este documento, el término "alcohol de azúcar" se refiere a productos de reducción de "azúcares" e indica que todos los átomos de oxígeno en una molécula de alcohol de azúcar simple están presentes en forma de grupos hidroxilo. Los alcoholes de azúcar son "polioles". Este término se refiere a compuestos químicos que contienen tres o más grupos hidroxilo y es sinónimo de otro término habitual, alcohol polihídrico. Ejemplos de alcoholes de azúcar incluyen sorbitol, manitol, maltitol, lactitol, eritritol, glicerina, xilitol o inositol.

[0447] De acuerdo con la presente enseñanza, se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen sacarosa como estabilizador. Sin querer limitarse a la teoría, la sacarosa funciona para promover la crioprotección de la composición, evitando así la agregación de partículas de lipoplexos de ARN y manteniendo la estabilidad química y física de la composición. Ciertas realizaciones contemplan estabilizadores alternativos a la sacarosa en la presente enseñanza. Los estabilizadores alternativos incluyen trehalosa, glucosa, fructosa, arginina, glicerina, manitol, prolina, sorbitol, glicina betaína y dextrano. En una realización específica, un estabilizador alternativo a la sacarosa es la trehalosa.

[0448] En una realización, el estabilizador está en una concentración de aproximadamente 5% (p/v) a aproximadamente 35% (p/v), o de aproximadamente 10% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v). En realizaciones específicas, el estabilizador está en una concentración de aproximadamente 10% (p/v), aproximadamente 11% (p/v), aproximadamente 12% (p/v), aproximadamente 13% (p/v), aproximadamente 14% (p/v), aproximadamente 15% (p/v), aproximadamente 16% (p/v), aproximadamente 17% (p/v), aproximadamente 18% (p/v), aproximadamente 19% (p/v), aproximadamente 20% (p/v), aproximadamente 21% (p/v), aproximadamente 22% (p/v), aproximadamente 23% (p/v), aproximadamente 24% (p/v) o aproximadamente 25% (p/v). En una realización preferida, el estabilizador está en una concentración de aproximadamente 15% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v). En otra realización preferida, el estabilizador está en una concentración de aproximadamente 20% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v). En una realización de ejemplo, el estabilizador está en una concentración de aproximadamente 25% (p/v). En otra realización de ejemplo, el estabilizador está en una concentración de aproximadamente 22% (p/v). En las realizaciones de la enseñanza, el estabilizador es sacarosa o trehalosa. En una realización de la enseñanza, el estabilizador es sacarosa. En una realización de la enseñanza, el estabilizador es trehalosa.

[0449] De acuerdo con la presente enseñanza, las composiciones de partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento tienen una concentración de estabilizador adecuada para la estabilidad de la composición, en particular para la estabilidad de las partículas de lipoplexos de ARN y para la estabilidad del ARN.

[0450] C. pH y tampón

[0451] De acuerdo con la presente enseñanza, las composiciones de partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento tienen un pH adecuado para la estabilidad de las partículas de lipoplexos de ARN y, en particular, para la estabilidad del ARN. En una realización, las composiciones de partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento tienen un pH de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.7. En realizaciones específicas, las composiciones tienen un pH de aproximadamente 5.7, aproximadamente 5.8, aproximadamente 5.9, aproximadamente 6.0, aproximadamente 6.1, aproximadamente 6.2, aproximadamente 6.3, aproximadamente 6.4, aproximadamente 6.5, aproximadamente 6.6 o aproximadamente 6.7.

[0453] De acuerdo con la presente enseñanza, se proporcionan composiciones que incluyen tampón. Sin querer limitarse a la teoría, el uso de tampón mantiene el pH de la composición durante la fabricación, el almacenamiento y el uso de la composición. En ciertas realizaciones de la presente enseñanza, el tampón puede ser bicarbonato de sodio, fosfato monosódico, fosfato disódico, fosfato monopotásico, fosfato dipotásico, ácido [tris(hidroximetil)metilamino]propanosulfónico (TAPS), ácido 2-(bis(2-hidroxietil)amino)acético (Bicine), 2-amino-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol (Tris), N-(2-hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)glicina (Tricine), ácido 3-[[1,3-dihidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-il]amino]-2-hidroxipropano-1-sulfónico (TAPSO), ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfónico (HEPES), ácido 2-[[1,3-dihidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-il]amino]etanosulfónico (TES), ácido 1,4-piperazinedietanosulfónico (PIPES), ácido dimetilarsínico, ácido 2-morfolin-4-iletanosulfónico (MES), ácido 3-morfolino-2-hidroxipropanosulfónico (MOPSO) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). Otros tampones adecuados pueden ser ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.

[0455] En algunas realizaciones, el tampón tiene un pH de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.7. En realizaciones específicas, el tampón tiene un pH de aproximadamente 5.7, aproximadamente 5.8, aproximadamente 5.9, aproximadamente 6.0, aproximadamente 6.1, aproximadamente 6.2, aproximadamente 6.3, aproximadamente 6.4, aproximadamente 6.5, aproximadamente 6.6 o aproximadamente 6.7. En una realización, el tampón es HEPES. En una realización preferida, el HEPES tiene un pH de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.7. En realizaciones específicas, el HEPES tiene un pH de aproximadamente 5.7, aproximadamente 5.8, aproximadamente 5.9, aproximadamente 6.0, aproximadamente 6.1, aproximadamente 6.2, aproximadamente 6.3, aproximadamente 6.4, aproximadamente 6.5, aproximadamente 6.6 o aproximadamente 6.7. En una realización de ejemplo, el HEPES tiene un pH de aproximadamente 6.2.

[0457] En todavía otra realización, el tampón tiene una concentración de aproximadamente 2.5 mM a aproximadamente 10 mM. En realizaciones específicas donde HEPES es el tampón, la concentración de HEPES es de aproximadamente 2.5 mM, aproximadamente 2.75 mM, 3.0 mM, aproximadamente 3.25 mM, aproximadamente 3.5 mM, aproximadamente 3.75 mM, aproximadamente 4.0 mM, aproximadamente 4.25 mM, aproximadamente 4.5 mM, aproximadamente 4.75 mM, aproximadamente 5.0 mM, aproximadamente 5.25 mM, aproximadamente 5.5 mM, aproximadamente 5.75 mM, aproximadamente 6.0 mM, aproximadamente 6.25 mM, aproximadamente 6.5 mM, aproximadamente 6.75 mM, aproximadamente 7.0 mM, aproximadamente 7.25 mM, aproximadamente 7.5 mM, aproximadamente 7.75 mM, aproximadamente 8.0 mM, aproximadamente 8.25 mM, aproximadamente 8.5 mM, aproximadamente 8.75 mM, aproximadamente 9.0 mM, aproximadamente 9.25 mM, aproximadamente 9.5 mM, aproximadamente 9.75 mM o aproximadamente 10.0 mM. En una realización preferida, el HEPES está en una concentración de aproximadamente 7.5 mM.

[0459] D. Agente quelante

[0461] Ciertas realizaciones de la presente enseñanza contemplan el uso de un agente quelante. Los agentes quelantes se refieren a compuestos químicos que son capaces de formar al menos dos enlaces covalentes coordinados con un ion metálico, generando así un complejo estable y soluble en agua. Sin querer limitarnos a la teoría, los agentes quelantes reducen la concentración de iones divalentes libres, lo que de otro modo podría inducir una degradación acelerada del ARN en la presente enseñanza. Ejemplos de agentes quelantes adecuados incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), una sal de EDTA, desferrioxamina B, deferoxamina, ditiocarb sódico, penicilamina, pentetato cálcico, una sal sódica de ácido pentético, succímero, trientina, ácido nitrilotriacético, ácido trans-diaminociclohexanotetraacético (DCTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido bis(aminoetil)glicoléter-N,N,N',N'-tetraacético, ácido iminodiacético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido fumárico o una sal de los mismos. En ciertas realizaciones, el agente quelante es EDTA o una sal de EDTA. En una realización de ejemplo, el agente quelante es EDTA disódico dihidrato.

[0463] En algunas realizaciones, el EDTA está en una concentración de aproximadamente 0.25 mM a aproximadamente 5 mM. En realizaciones específicas, el EDTA está en una concentración de aproximadamente 0.25 mM, aproximadamente 0.3 mM, aproximadamente 0.4 mM, aproximadamente 0.5 mM, aproximadamente 0.6 mM, aproximadamente 0.7 mM, aproximadamente 0.8 mM, aproximadamente 0.9 mM, aproximadamente 1.0 mM, aproximadamente 1.1 mM, aproximadamente 1.2 mM, aproximadamente 1.3 mM, aproximadamente 1.4 mM, aproximadamente 1.5 mM, aproximadamente 1.6 mM, aproximadamente 1.7 mM, aproximadamente 1.8 mM, aproximadamente 1.9 mM, aproximadamente 2.0 mM, aproximadamente 2.1 mM, aproximadamente 2.2 mM, aproximadamente 2.3 mM. aproximadamente 2.4 mM, aproximadamente 2.5 mM, aproximadamente 2.6 mM, aproximadamente 2.7 mM, aproximadamente 2.8 mM, aproximadamente 2.9 mM, aproximadamente 3.0 mM, aproximadamente 3.1 mM, aproximadamente 3.2 mM, aproximadamente 3.3 mM, aproximadamente 3.4 mM, aproximadamente 3.5 mM, aproximadamente 3.6 mM, aproximadamente 3.7 mM, aproximadamente 3.8 mM, aproximadamente 3.9 mM, aproximadamente 4.0 mM, aproximadamente 4.1 mM, aproximadamente 4.2 mM, aproximadamente 4.3 mM, aproximadamente 4.4 mM, aproximadamente 4.5 mM, aproximadamente 4.6 mM, aproximadamente 4.7 mM, aproximadamente 4.8 mM, aproximadamente 4.9 mM o aproximadamente 5.0 mM. En una realización preferida, el EDTA está en una concentración de aproximadamente 2.5 mM.

[0465] E. Composiciones de ejemplo de la enseñanza

[0467] En una realización de ejemplo, la composición de partículas de lipoplexos de ARN incluye DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:1 y ARN a una concentración de aproximadamente 0.05 mg/mL que codifica al menos un epítopo, donde a pH fisiológico la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1.3:2.0; cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 20 mM; sacarosa a una concentración de aproximadamente 22% (p/v); HEPES a una concentración de aproximadamente 7.5 mM con un pH de aproximadamente 6.2; y EDTA a una concentración de aproximadamente 2.5 mM. En otras realizaciones específicas, el ARN codifica cinco epítopos o diez epítopos.

[0469] En otra realización de ejemplo, la composición de partículas de lipoplexos de ARN incluye DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:1 y ARN a una concentración de aproximadamente 0.05 mg/mL que codifica al menos un epítopo, donde a pH fisiológico la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1.3:2.0; cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 30 mM; sacarosa a una concentración de aproximadamente 20% (p/v); HEPES a una concentración de aproximadamente 7.5 mM con un pH de aproximadamente 6.2; y EDTA a una concentración de aproximadamente 2.5 mM. En otras realizaciones específicas, el ARN codifica cinco epítopos o diez epítopos.

[0471] F. Estabilidad de las composiciones de la enseñanza

[0473] Como se utiliza en este documento, "estable" se refiere a una composición donde los valores medidos para varios parámetros fisicoquímicos están dentro de un rango definido. En una realización, se analiza la composición para evaluar la estabilidad de acuerdo con varios parámetros. De acuerdo con la presente enseñanza, los parámetros de estabilidad incluyen el diámetro promedio de las partículas de lipoplexos de ARN, el índice de polidispersidad, la integridad del ARN, el contenido de ARN, el pH, la osmolalidad y el número de partículas subvisibles. Una persona experta en la técnica podría medir dichos parámetros utilizando técnicas e instrumentación de laboratorio de rutina. Por ejemplo, los parámetros de estabilidad pueden evaluarse utilizando dispersión dinámica de la luz (DLS), oscurecimiento de luz, espectrometría, electroforesis en gel de agarosa, bioanalizador u otra técnica adecuada. En una realización, el bioanalizador es un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies) capaz de medir tanto la integridad del ARN como el contenido de ARN. En una realización, el bioanalizador es un analizador de fragmentos de Advanced Analytical. Sin querer limitarse por la teoría, las mediciones de DLS son útiles para analizar parámetros relacionados con las partículas de lipoplexos de ARN de la presente enseñanza. En una realización, se puede utilizar DLS para determinar el diámetro promedio de partículas de lipoplexos de ARN, que se expresa en términos de Z-prom. (una medida del tamaño promedio de partícula). En otra realización, se puede utilizar DLS para determinar el índice de polidispersidad de partículas de lipoplexos de ARN, que indica la distribución del tamaño y el peso de las partículas de lipoplexos de ARN.

[0475] En ciertas realizaciones, la composición es estable cuando las mediciones de los parámetros de estabilidad están dentro de un rango definido. En una realización de una composición estable, las partículas de lipoplexo de ARN tienen un diámetro promedio que difiere del diámetro promedio original (es decir, el diámetro promedio antes de la congelación, secado por congelación, secado por aspersión y descongelación o reconstitución) en no más de ±20%, ±10%, ±5% o ±3% después del almacenamiento, por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C. En una realización de una composición estable, las partículas de lipoplexo de ARN tienen un diámetro promedio que no es mayor del 20%, 10%, 5% o 3% en comparación con el diámetro promedio original (es decir, el diámetro promedio antes de la congelación, secado por congelación, secado por aspersión y descongelación o reconstitución) después del almacenamiento, por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C. En otra realización de una composición estable, las partículas de lipoplexo de ARN presentan un índice de polidispersidad que difiere del índice de polidispersidad original (es decir, el índice de polidispersidad previo a la congelación, secado por congelación, secado por aspersión y descongelación o reconstitución) en no más de ±20%, ±10%, ±5% o ±3 % tras el almacenamiento, por ejemplo, a una temperatura de entre -15 °C y -40 °C. En una realización, una composición estable presenta no más de 6,000 partículas subvisibles con un diámetro mayor o igual a 10 µm tras el almacenamiento, por ejemplo, a una temperatura de entre -15 °C y -40 °C. En una realización, una composición estable no tiene más de 600 partículas subvisibles con un diámetro mayor o igual a 25 µm después del almacenamiento, por ejemplo, después del almacenamiento a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C.

[0476] En una realización de una composición estable, la integridad del ARN es al menos del 80 por ciento después del almacenamiento, por ejemplo, después del almacenamiento a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C.

[0477] En una realización, la composición es estable a una temperatura de almacenamiento de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C. En realizaciones específicas, la composición es estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C, aproximadamente -16 °C, aproximadamente -17 °C, aproximadamente -18 °C, aproximadamente -19 °C, aproximadamente -20 °C, aproximadamente -21 °C, aproximadamente -22 °C, aproximadamente -23 °C, aproximadamente -24 °C, aproximadamente -25 °C, aproximadamente -26 °C, aproximadamente -27 °C, aproximadamente -28 °C, aproximadamente -29 °C, aproximadamente -30 °C, aproximadamente -31 °C, aproximadamente -32 °C, aproximadamente -33 °C, aproximadamente -34 °C, aproximadamente -35 °C, aproximadamente -36 °C, aproximadamente -37 °C, aproximadamente -38 °C, aproximadamente -39 °C o aproximadamente -40 °C. En una realización preferida, la composición es estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C, aproximadamente -20 °C, aproximadamente -30 °C o aproximadamente -40 °C.

[0478] En una realización, la composición es estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C cuando la composición farmacéutica está protegida de la luz. En una realización preferida, la composición es estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -25 °C cuando la composición está protegida de la luz.

[0479] En una realización, la composición es estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C durante al menos 1 mes hasta aproximadamente 24 meses. En realizaciones específicas, la composición es estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C durante al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12 meses, al menos 13 meses, al menos 14 meses, al menos 15 meses, al menos 16 meses, al menos 17 meses, al menos 18 meses, al menos 19 meses, al menos 20 meses, al menos 21 meses, al menos 22 meses, al menos 23 meses, al menos 24 meses, al menos 25 meses, al menos 26 meses, al menos 27 meses, al menos 28 meses, al menos 29 meses, al menos 30 meses, al menos 31 meses, al menos 32 meses, al menos 33 meses, al menos 34 meses, al menos 35 meses, o al menos 36 meses.

[0480] En una realización preferida, la composición es estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C durante al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses o al menos 6 meses.

[0481] En otra realización preferida, la composición es estable a una temperatura de aproximadamente -20°C durante al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses o al menos 6 meses.

[0482] En todavía otra realización preferida, la composición es estable a una temperatura de aproximadamente -30 °C durante al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses o al menos 6 meses.

[0483] En una realización, la composición es estable después de congelarse a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C y descongelarse a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 25 °C (temperatura ambiente). En otra realización, la composición es estable después de la congelación a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C y la descongelación a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 25 °C (temperatura ambiente) en múltiples ciclos de congelación-descongelación.

[0484] G. Estado físico de las composiciones de la enseñanza

[0485] En realizaciones, la composición de la presente enseñanza es un líquido o un sólido. Ejemplos de un sólido incluyen una forma congelada o una forma liofilizada. En una realización preferida, la composición es un líquido. Composiciones farmacéuticas de la enseñanza

[0486] Las composiciones que comprenden partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento son útiles como o para preparar composiciones farmacéuticas o medicamentos para tratamientos terapéuticos o profilácticos.

[0487] Las partículas de la presente enseñanza pueden administrarse en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada.

[0488] El término "composición farmacéutica" se refiere a una formulación que comprende un agente terapéuticamente eficaz, preferiblemente junto con portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Dicha composición farmacéutica es útil para tratar, prevenir o reducir la gravedad de una enfermedad o trastorno mediante la administración de dicha composición farmacéutica a un sujeto. Una composición farmacéutica también se conoce en la técnica como formulación farmacéutica. En el contexto de la presente enseñanza, la composición farmacéutica comprende partículas de lipoplexos de ARN como se describe en este documento. Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza comprenden preferiblemente uno o más adyuvantes o pueden administrarse con uno o más adyuvantes. El término "adyuvante" se refiere a un compuesto que prolonga, mejora o acelera una respuesta inmune. Los adyuvantes comprenden un grupo heterogéneo de compuestos como emulsiones de aceite (por ejemplo, adyuvantes de Freund), compuestos minerales (tal como el alumbre), productos bacterianos (tal como la toxina de Bordetella pertussis) o complejos inmunoestimulantes. Ejemplos de adyuvantes incluyen LPS, GP96, oligodesoxinucleótidos CpG, factores de crecimiento y citoquinas, tales como monocinas, linfocinas, interleucinas y quimiocinas. Las quimiocinas pueden ser IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INFa, INF-γ, GM-CSF, LT-α. Otros adyuvantes conocidos incluyen hidróxido de aluminio, adyuvante de Freund y aceites tales como Montanide<®>ISA51. Otros adyuvantes adecuados para su uso en la presente enseñanza incluyen lipopéptidos, tales como Pam3Cys.

[0489] Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente enseñanza se aplican generalmente en una "cantidad farmacéuticamente eficaz" y en "una preparación farmacéuticamente aceptable".

[0490] El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.

[0491] El término "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado sola o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad determinada, la reacción deseada se refiere preferiblemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto incluye ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad también puede ser un retraso en la aparición o una prevención de la aparición de dicha enfermedad o dicha condición. Una cantidad efectiva de las partículas o composiciones descritas en este documento dependerá de la condición a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluida la edad, la condición fisiológica, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de terapia acompañante (si está presente), la vía específica de administración y factores similares. Por consiguiente, las dosis administradas de las partículas o composiciones descritas en este documento pueden depender de varios de dichos parámetros. En caso de que la reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden utilizar dosis más altas (o efectivamente dosis más altas logradas mediante una vía de administración diferente, más localizada).

[0492] Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza pueden contener sales, tampones, conservantes y opcionalmente otros agentes terapéuticos. En una realización, las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza comprenden uno o más portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

[0493] Los conservantes adecuados para su uso en las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza incluyen cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno y timerosal.

[0494] El término "excipiente" como se utiliza en este documento se refiere a una sustancia que puede estar presente en una composición farmacéutica de la presente enseñanza pero que no es un ingrediente activo. Ejemplos de excipientes incluyen portadores, aglutinantes, diluyentes, lubricantes, espesantes, agentes tensioactivos, conservantes, estabilizadores, emulsionantes, tampones, agentes saborizantes o colorantes.

[0495] El término "diluyente" se refiere a un agente diluyente y/o adelgazante. Además, el término "diluyente" incluye uno o más medios de suspensión y/o mezcla fluidos, líquidos o sólidos. Ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua.

[0496] El término "portador" se refiere a un componente que puede ser natural, sintético, orgánico, inorgánico en el que se combina el componente activo para facilitar, mejorar o permitir la administración de la composición farmacéutica. Un portador como se utiliza en este documento puede ser uno o más rellenos sólidos o líquidos, diluyentes o sustancias encapsulantes compatibles, que son adecuados para la administración al sujeto. Los portadores adecuados incluyen agua esterilizada, Ringer, lactato de Ringer, solución de cloruro de sodio estéril, solución salina isotónica, polialquilenglicoles, naftalenos hidrogenados y, en particular, polímeros de lactida biocompatibles, copolímeros de lactida/glicólido o copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno. En una realización, la composición farmacéutica de la presente enseñanza incluye solución salina isotónica.

[0497] Los portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit.1985).

[0498] Los portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticos pueden seleccionarse teniendo en cuenta la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar.

[0499] Vías de administración de composiciones farmacéuticas de la enseñanza

[0500] En una realización, las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden administrarse por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intradérmica o intramuscular. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica está formulada para administración local o administración sistémica. La administración sistémica puede incluir la administración enteral, que implica la absorción a través del tracto gastrointestinal, o la administración parenteral. Tal como se utiliza en este documento, "administración parenteral" se refiere a la administración de cualquier manera que no sea a través del tracto gastrointestinal, tal como mediante inyección intravenosa. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas están formuladas para administración sistémica. En otra realización preferida, la administración sistémica es mediante administración intravenosa.

[0501] Artículos de fabricación

[0502] En un aspecto, las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento están presentes en una composición farmacéutica. En otro aspecto, una composición descrita en este documento es una composición farmacéutica. En un aspecto, la enseñanza se refiere a un vial que contiene una composición farmacéutica descrita en este documento. En otro aspecto, la enseñanza se refiere a una jeringa que contiene una composición farmacéutica descrita en este documento.

[0503] Uso de composiciones farmacéuticas de la enseñanza

[0504] Las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento se pueden utilizar en el tratamiento terapéutico o profiláctico de diversas enfermedades, en particular enfermedades en las que la provisión de un péptido o proteína a un sujeto da como resultado un efecto terapéutico o profiláctico. Por ejemplo, la provisión de un antígeno o epítopo que se deriva de un virus puede ser útil en el tratamiento de una enfermedad viral causada por dicho virus. El suministro de un antígeno tumoral o epítopo puede ser útil en el tratamiento de una enfermedad cancerosa en donde las células cancerosas expresan dicho antígeno tumoral.

[0505] El término "enfermedad" se refiere a una condición anormal que afecta el cuerpo de un individuo. Una enfermedad a menudo se interpreta como una condición médica asociada con síntomas y signos específicos. Una enfermedad puede ser causada por factores originalmente de una fuente externa, tal como una enfermedad infecciosa, o puede ser causada por disfunciones internas, tales como las enfermedades autoinmunes. En el ámbito humano, el término "enfermedad" suele usarse de forma más amplia para referirse a cualquier condición que cause dolor, disfunción, angustia, problemas sociales o muerte al individuo afectado, o problemas similares para quienes están en contacto con el individuo. En este sentido más amplio, a veces incluye lesiones, discapacidades, trastornos, síndromes, infecciones, síntomas aislados, conductas desviadas y variaciones atípicas de la estructura y la función, mientras que en otros contextos y para otros fines estas pueden considerarse categorías distinguibles. Las enfermedades usualmente afectan a los individuos no sólo físicamente, sino también emocionalmente, ya que contraer y vivir con muchas enfermedades puede alterar la perspectiva de vida y la personalidad de uno.

[0506] En el presente contexto, el término "tratamiento", "tratar" o "intervención terapéutica" se relaciona con el manejo y cuidado de un sujeto con el propósito de combatir una condición tal como una enfermedad o trastorno. El término pretende incluir el espectro completo de tratamientos para una condición dada que padece el sujeto, tal como la administración del compuesto terapéuticamente eficaz para aliviar los síntomas o complicaciones, para retrasar la progresión de la enfermedad, trastorno o condición, para aliviar o aliviar los síntomas y complicaciones, y/o para curar o eliminar la enfermedad, trastorno o condición, así como para prevenir la condición, en donde la prevención debe entenderse como el manejo y cuidado de un individuo con el propósito de combatir la enfermedad, condición o trastorno e incluye la administración de los compuestos activos para prevenir la aparición de los síntomas o complicaciones.

[0507] El término "tratamiento terapéutico" se refiere a cualquier tratamiento que mejore el estado de salud y/o prolongue (aumente) la vida de un individuo. Dicho tratamiento puede eliminar la enfermedad en un individuo, detener o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, inhibir o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas en un individuo y/o disminuir la recurrencia en un individuo que actualmente tiene o que anteriormente ha tenido una enfermedad.

[0508] Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se refieren a cualquier tratamiento que tenga como objetivo evitar que una enfermedad se presente en un individuo. Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se utilizan aquí indistintamente.

[0509] Los términos "individuo" y "sujeto" se utilizan aquí indistintamente. Se refieren a un ser humano u otro mamífero (por ejemplo, ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado, cerdo, oveja, caballo o primate) que puede padecer o es susceptible a una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer), pero puede o no tener la enfermedad o el trastorno. En muchas realizaciones, el individuo es un ser humano. A menos que se indique otra cosa, los términos "individuo" y "sujeto" no denotan una edad particular y, por lo tanto, abarcan adultos, ancianos, niños y recién nacidos. En las realizaciones de la presente enseñanza, el “individuo” o “sujeto” es un “paciente”.

[0510] El término "paciente" significa un individuo o sujeto para tratamiento, en particular un individuo o sujeto enfermo. En una realización de la enseñanza, el objetivo es proporcionar una respuesta inmune contra células enfermas que expresan un antígeno tal como células cancerosas que expresan un antígeno tumoral, y tratar una enfermedad tal como una enfermedad cancerosa que involucra células que expresan un antígeno tal como un antígeno tumoral.

[0511] Una composición farmacéutica que comprende partículas de lipoplexos de ARN como se describe en este documento que comprenden ARN que codifica un péptido o proteína que comprende uno o más antígenos o uno o más epítopos se puede administrar a un sujeto para provocar una respuesta inmune contra uno o más antígenos o uno o más epítopos en el sujeto que puede ser terapéutica o parcial o totalmente protectora. Un experto en la técnica sabrá que uno de los principios de la inmunoterapia y la vacunación se basa en el hecho de que una reacción inmunoprotectora frente a una enfermedad se produce inmunizando a un sujeto con un antígeno o un epítopo, que es inmunológicamente relevante con respecto a la enfermedad a tratar. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas descritas en este documento son aplicables para inducir o mejorar una respuesta inmune. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas descritas en este documento son útiles en un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de una enfermedad que involucra un antígeno o epítopo. Como se utiliza en este documento, "respuesta inmune" se refiere a una respuesta corporal integrada a un antígeno o una célula que expresa un antígeno y se refiere a una respuesta inmune celular y/o una respuesta inmune humoral. Una respuesta inmune celular incluye una respuesta celular dirigida a las células que expresan un antígeno y que se caracteriza por la presentación de un antígeno con una molécula MHC de clase I o clase II. La respuesta celular se relaciona con los linfocitos T, que pueden clasificarse como células T auxiliares (también denominadas células T CD4+) que desempeñan un papel central al regular la respuesta inmune o células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T CD8+ o CTL) que inducen la apoptosis en células infectadas o cancerosas. En una realización, la administración de una composición farmacéutica de la presente enseñanza implica la estimulación de una respuesta de células T CD8+ antitumorales contra células cancerosas que expresan uno o más antígenos tumorales. En una realización específica, los antígenos tumorales se presentan con moléculas MHC de clase I.

[0512] La presente enseñanza contempla una respuesta inmune que puede ser protectora, preventiva, profiláctica y/o terapéutica. Como se utiliza en este documento, "induce [o inducir] una respuesta inmune" puede indicar que no había ninguna respuesta inmune contra un antígeno particular antes de la inducción o puede indicar que había un nivel basal de respuesta inmune contra un antígeno particular antes de la inducción, que se mejoró después de la inducción. Por lo tanto, "induce [o inducir] una respuesta inmune" incluye "mejora [o mejorar] una respuesta inmune".

[0513] El término "inmunoterapia" se relaciona con el tratamiento de una enfermedad o condición induciendo o mejorando una respuesta inmune. El término "inmunoterapia" incluye la inmunización con antígenos o la vacunación con antígenos.

[0514] Los términos "inmunización" o "vacunación" describen el proceso de administrar un antígeno a un individuo con el propósito de inducir una respuesta inmune, por ejemplo, por razones terapéuticas o profilácticas.

[0515] En una realización, la presente enseñanza prevé realizaciones en las que se administran partículas de lipoplexos de ARN como las descritas en este documento dirigidas al tejido del bazo. El ARN codifica un péptido o proteína que comprende un antígeno o un epítopo como se describe, por ejemplo, en este documento. El ARN es absorbido por las células presentadoras de antígenos en el bazo, tales como las células dendríticas, para expresar el péptido o la proteína. Después del procesamiento y presentación opcionales por parte de las células presentadoras de antígeno, se puede generar una respuesta inmune contra el antígeno o epítopo, lo que da como resultado un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de una enfermedad que involucra el antígeno o epítopo. En una realización, la respuesta inmune inducida por las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento comprende la presentación de un antígeno o fragmento del mismo, tal como un epítopo, por células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas y/o macrófagos, y la activación de células T citotóxicas debido a esta presentación. Por ejemplo, los péptidos o proteínas codificados por los ARN o productos de su procesamiento pueden ser presentados por proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) expresadas en células presentadoras de antígenos. El complejo peptídico MHC puede luego ser reconocido por células inmunes como las células T o las células B, lo que lleva a su activación. Por lo tanto, en una realización, el ARN en las partículas de lipoplexos de ARN descritas en este documento, después de la administración, se suministra al bazo y/o se expresa en el bazo. En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN se envían al bazo para activar las células presentadoras de antígenos esplénicos. Así, en una realización, después de la administración de las partículas de lipoplexos de ARN se produce la administración de ARN y/o la expresión de ARN en células presentadoras de antígeno. Las células presentadoras de antígenos pueden ser células presentadoras de antígenos profesionales o células presentadoras de antígenos no profesionales. Las células presentadoras de antígenos profesionales pueden ser células dendríticas y/o macrófagos, aún más preferiblemente células dendríticas esplénicas y/o macrófagos esplénicos.

[0516] En consecuencia, la presente enseñanza se refiere a partículas de lipoplexos de ARN o a una composición farmacéutica que comprende partículas de lipoplexos de ARN como se describe en este documento para inducir o mejorar una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta inmune contra el cáncer.

[0517] En una realización adicional, la presente enseñanza se refiere a partículas de lipoplexos de ARN o una composición farmacéutica que comprende partículas de lipoplexos de ARN como se describe en este documento para su uso en un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de una enfermedad que involucra un antígeno, preferiblemente una enfermedad cancerosa.

[0518] En una realización adicional, la presente enseñanza se refiere a un método para administrar un antígeno o un epítopo de un antígeno a células presentadoras de antígeno, tales como células presentadoras de antígenos profesionales, en el bazo, o expresar un antígeno o un epítopo de un antígeno en células presentadoras de antígeno, tales como células presentadoras de antígenos profesionales, en el bazo, que comprende administrar a un sujeto partículas de lipoplexos de ARN o una composición farmacéutica que comprende partículas de lipoplexos de ARN como se describe en este documento. En una realización, el antígeno es un antígeno tumoral. En este aspecto, el antígeno o un epítopo de un antígeno está codificado preferiblemente por el ARN en las partículas de lipoplexos de ARN.

[0519] En una realización, la administración sistémica de partículas de lipoplexos de ARN o una composición farmacéutica que comprende partículas de lipoplexos de ARN como se describe en este documento da como resultado la orientación y/o acumulación de las partículas de lipoplexos de ARN o ARN en el bazo y no en el pulmón y/o el hígado. En una realización, las partículas de lipoplexos de ARN liberan ARN en el bazo y/o ingresan a las células del bazo. En una realización, la administración sistémica de partículas de lipoplexos de ARN o una composición farmacéutica que comprende partículas de lipoplexos de ARN como se describe en este documento suministra el ARN a células presentadoras de antígenos en el bazo. En una realización específica, las células presentadoras de antígenos en el bazo son células dendríticas o macrófagos.

[0520] En una realización adicional, la presente enseñanza se refiere a un método para inducir o mejorar una respuesta inmune en un sujeto que comprende administrar al sujeto partículas de lipoplexos de ARN o una composición farmacéutica que comprende partículas de lipoplexos de ARN como se describe en este documento. En una realización de ejemplo, la respuesta inmune es contra el cáncer.

[0521] El término "macrófago" se refiere a un subgrupo de células fagocíticas producidas por la diferenciación de monocitos. Los macrófagos que se activan por la inflamación, las citoquinas inmunes o los productos microbianos engullen y matan de manera no específica a los patógenos extraños dentro del macrófago mediante un ataque hidrolítico y oxidativo que resulta en la degradación del patógeno. Los péptidos de las proteínas degradadas se muestran en la superficie de las células de los macrófagos, donde pueden ser reconocidos por las células T y pueden interactuar directamente con los anticuerpos en la superficie de las células B, lo que da como resultado la activación de las células T y B y una mayor estimulación de la respuesta inmune. Los macrófagos pertenecen a la clase de células presentadoras de antígenos. En una realización, los macrófagos son macrófagos esplénicos.

[0522] El término "célula dendrítica" (DC) se refiere a otro subtipo de células fagocíticas pertenecientes a la clase de células presentadoras de antígenos. En una realización, las células dendríticas se derivan de células progenitoras de médula ósea hematopoyética. Estas células progenitoras se transforman inicialmente en células dendríticas inmaduras. Estas células inmaduras se caracterizan por una alta actividad fagocítica y un bajo potencial de activación de células T. Las células dendríticas inmaduras toman muestras constantemente del entorno circundante en busca de patógenos como virus y bacterias. Una vez que entran en contacto con un antígeno presentable, se activan y se convierten en células dendríticas maduras y comienzan a migrar al bazo o al ganglio linfático. Las células dendríticas inmaduras fagocitan patógenos y degradan sus proteínas en pequeños fragmentos y, al madurar, presentan esos fragmentos en su superficie celular utilizando moléculas MHC. Simultáneamente, sobrerregulan los receptores de la superficie celular que actúan como correceptores en la activación de las células T, tales como CD80, CD86 y CD40, mejorando enormemente su capacidad para activar las células T. También sobrerregulan el CCR7, un receptor quimiotáctico que induce a la célula dendrítica a viajar a través del torrente sanguíneo hasta el bazo o a través del sistema linfático hasta un ganglio linfático. Aquí actúan como células presentadoras de antígenos y activan las células T auxiliares y las células T asesinas, así como las células B, presentándoles antígenos, junto con señales coestimuladoras no específicas del antígeno. De esta forma, las células dendríticas pueden inducir activamente una respuesta inmune relacionada con las células T o las células B. En una realización, las células dendríticas son células dendríticas esplénicas. El término "célula presentadora de antígeno" (APC) es una célula de una variedad de células capaces de mostrar, adquirir y/o presentar al menos un antígeno o fragmento antigénico en (o a) su superficie celular. Las células presentadoras de antígenos se pueden distinguir en células presentadoras de antígenos profesionales y células presentadoras de antígenos no profesionales.

[0523] El término "células presentadoras de antígenos profesionales" se refiere a las células presentadoras de antígenos que expresan de forma constitutiva las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC de clase II) necesarias para la interacción con células T inalteradas. Si una célula T interactúa con el complejo de moléculas MHC de clase II en la membrana de la célula presentadora de antígeno, esta última produce una molécula coestimuladora que induce la activación de la célula T. Las células presentadoras de antígenos profesionales incluyen las células dendríticas y los macrófagos.

[0525] El término "células presentadoras de antígenos no profesionales" se refiere a células presentadoras de antígenos que no expresan de forma constitutiva moléculas MHC de clase II, sino tras la estimulación por ciertas citoquinas como el interferón-gamma. Las células presentadoras de antígenos no profesionales a modo de ejemplo incluyen fibroblastos, células epiteliales tímicas, células epiteliales tiroideas, células gliales, células beta pancreáticas o células endoteliales vasculares.

[0527] El "procesamiento de antígeno" se refiere a la degradación de un antígeno en productos de procesamiento, que son fragmentos de dicho antígeno (por ejemplo, la degradación de una proteína en péptidos) y la asociación de uno o más de estos fragmentos (por ejemplo, mediante unión) con moléculas MHC para su presentación por células, tales como células presentadoras de antígenos a células T específicas.

[0529] El término "enfermedad que involucra un antígeno" o "enfermedad que involucra un epítopo" se refiere a cualquier enfermedad que implique un antígeno o epítopo, por ejemplo una enfermedad que se caracteriza por la presencia de un antígeno o epítopo. La enfermedad que involucra un antígeno o epítopo puede ser una enfermedad infecciosa, una enfermedad cancerosa o simplemente cáncer. Como se mencionó anteriormente, el antígeno puede ser un antígeno asociado a una enfermedad, tal como un antígeno asociado a un tumor, un antígeno viral o un antígeno bacteriano y el epítopo puede derivarse de dicho antígeno.

[0531] El término "enfermedad infecciosa" se refiere a cualquier enfermedad que puede transmitirse de un individuo a otro o de un organismo a otro y que es causada por un agente microbiano (por ejemplo, el resfriado común). Las enfermedades infecciosas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, una enfermedad viral, una enfermedad bacteriana o una enfermedad parasitaria, enfermedades que son causadas por un virus, una bacteria y un parásito, respectivamente. En este sentido, las enfermedades infecciosas pueden ser, por ejemplo, la hepatitis, las enfermedades de transmisión sexual (por ejemplo clamidia o gonorrea), la tuberculosis, el VIH/síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la difteria, la hepatitis B, la hepatitis C, el cólera, el síndrome respiratorio agudo severo (SARS), la gripe aviar y la gripe.

[0533] Los términos "enfermedad cancerosa" o "cáncer" se refieren o describen la condición fisiológica de un individuo que generalmente se caracteriza por un crecimiento celular subregulado. Ejemplos de cánceres incluyen carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más particularmente, los ejemplos de dichos cánceres incluyen cáncer de huesos, cáncer de sangre, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, carcinoma de los órganos sexuales y reproductivos, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (CNS), cáncer neuroectodérmico, tumores del eje espinal, glioma, meningioma y adenoma pituitario. El término "cáncer" de acuerdo con la enseñanza también comprende las metástasis del cáncer.

[0535] Las estrategias combinadas en el tratamiento del cáncer pueden ser deseables debido al efecto sinérgico resultante, que puede ser considerablemente más fuerte que el impacto de un enfoque monoterapéutico. En una realización, la composición farmacéutica se administra con un agente inmunoterapéutico. Tal como se utiliza en el presente documento, "agente inmunoterapéutico" se refiere a cualquier agente que pueda participar en la activación de una respuesta inmune específica y/o funciones efectoras inmunitarias. La presente enseñanza contempla el uso de un anticuerpo como agente inmunoterapéutico. Sin querer limitarnos a la teoría, los anticuerpos son capaces de lograr un efecto terapéutico contra las células cancerosas a través de diversos mecanismos, entre ellos la inducción de apoptosis, el bloqueo de componentes de las vías de transducción de señales o la inhibición de la proliferación de células tumorales. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo monoclonal puede inducir la muerte celular a través de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), o unirse a proteínas del complemento, lo que produce toxicidad celular directa, conocida como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Ejemplos de anticuerpos anticancerígenos y posibles objetivos de anticuerpos (entre paréntesis) que pueden utilizarse en combinación con la presente enseñanza incluyen: Abagovomab (CA-125), Abciximab (CD41), Adecatumumab (EpCAM), Afutuzumab (CD20), Alacizumab pegol (VEGFR2), Altumomab pentetato (CEA), Amatuximab (MORAb-009), Anatumomab mafenatox (TAG-72), Apolizumab (HLA-DR), Arcitumomab (CEA), Atezolizumab (PD-L1), Bavituximab (fosfatidilserina), Bectumomab (CD22), Belimumab (BAFF), Bevacizumab (VEGF-A), Bivatuzumab mertansina (CD44 v6), Blinatumomab (CD 19), Brentuximab vedotina (CD30 TNFRSF8), Cantuzumab mertansina (mucin CanAg), Cantuzumab ravtansina (MUC1), Capromab pendetida (células de carcinoma prostático), Carlumab (CNT0888), Catumaxomab (EpCAM, CD3), Cetuximab (EGFR), Citatuzumab bogatox (EpCAM), Cixutumumab (receptor IGF-1), Claudiximab (Claudina), Clivatuzumab tetraxetano (MUC1), Conatumumab (TRAIL-R2), Dacetuzumab (CD40), Dalotuzumab (receptor del factor de crecimiento similar a la insulina I), Denosumab (RANKL), Detumomab (Célula de linfoma B), Drozitumab (DR5), Ecromeximab (GD3 gangliósido), Edrecolomab (EpCAM), Elotuzumab (SLAMF7), Enavatuzumab (PDL192), Ensituximab (NPC-1C), Epratuzumab (CD22), Ertumaxomab (HER2/neu, CD3), Etaracizumab (integrina ανβ3), Farletuzumab (receptor de folato 1), FBTA05 (CD20), Ficlatuzumab (SCH 900105), Figitumumab (receptor IGF-1), Flanvotumab (glicoproteína 75), Fresolimumab (TGF-β), Galiximab (CD80), Ganitumab (IGF-I), Gemtuzumab ozogamicina (CD33), Gevokizumab (IL-Iβ), Girentuximab (anhidrasa carbónica 9 (CA-IX)), Glembatumumab vedotina (GPNMB), Ibritumomab tiuxetan (CD20), Icrucumab (VEGFR-1 ), Igovoma (CA-125), Indatuximab ravtansina (SDC1), Intetumumab (CD51), Inotuzumab ozogamicina (CD22), Ipilimumab (CD 152), Iratumumab (CD30), Labetuzumab (CEA), Lexatumumab (TRAIL-R2), Libivirumab (antígeno de superficie de la hepatitis B), Lintuzumab (CD33), Lorvotuzumab mertansina (CD56), Lucatumumab (CD40), Lumiliximab (CD23), Mapatumumab (TRAIL-R1), Matuzumab (EGFR), Mepolizumab (IL-5), Milatuzumab (CD74), Mitumomab (GD3 gangliósido), Mogamulizumab (CCR4), Moxetumomab pasudotox (CD22), Nacolomab tafenatox (antígeno C242), Naptumomab estafenatox (5T4), Namatumab (RON), Necitumumab (EGFR), Nimotuzumab (EGFR), Nivolumab (IgG4), Ofatumumab (CD20), Olaratumab (PDGF-R a), Onartuzumab (quinasa del receptor del factor de dispersión humano), Oportuzumab monatox (EpCAM), Oregovomab (CA-125), Oxelumab (OX-40), Panitumumab (EGFR), Patritumab (HER3), Pemtumoma (MUC1), Pertuzuma (HER2/neu), Pintumomab (antígeno de adenocarcinoma), Pritumumab (vimentina), Racotumomab (ácido N-glicolilneuramínico), Radretumab (dominio extra B de fibronectina), Rafivirumab (glicoproteína del virus de la rabia), Ramucirumab (VEGFR2), Rilotumumab (HGF), Rituximab (CD20), Robatumumab (receptor IGF-1), Samalizumab (CD200), Sibrotuzumab (FAP), Siltuximab (IL-6), Tabalumab (BAFF), Tacatuzumab tetraxetan (alfa-fetoproteína), Taplitumomab paptox (CD 19), Tenatumomab (tenascina C), Teprotumumab (CD221), Ticilimumab (CTLA-4), Tigatuzumab (TRAIL-R2), TNX-650 (IL-13), Tositumomab (CD20), Trastuzumab (HER2/neu), TRBS07 (GD2), Tremelimumab (CTLA-4), Tucotuzumab celmoleuquina (EpCAM), Ublituximab (MS4A1), Urelumab (4-1 BB), Volociximab (integrina α5β1), Votumumab (antígeno tumoral CTAA 16.88), Zalutumumab (EGFR), y Zanolimumab (CD4).

[0536] En una realización, el agente inmunoterapéutico es un antagonista de unión del eje PD-1. Un antagonista de unión del eje PD-1 incluye un antagonista de unión de PD-1, un antagonista de unión de PD-L1 y un antagonista de unión de PD-L2. Los nombres alternativos para "PD-1" incluyen CD279 y SLEB2. Los nombres alternativos para "PD-L1" incluyen B7-H1, B7-4, CD274 y B7-H. Los nombres alternativos para "PD-L2" incluyen B7-DC, Btdc y CD273. En algunas realizaciones, el antagonista de unión de PD-1 es una molécula que inhibe la unión de PD-1 a sus socios de unión de ligando. En un aspecto específico, los socios de unión de ligando PD-1 son PD-Ll y/o PD-L2. En otra realización, un antagonista de unión de PD-Ll es una molécula que inhibe la unión de PD-L1 a sus socios de unión. En una realización específica, los socios de unión de PD-L1 son PD-1 y/o B7-1. En otra realización, el antagonista de unión de PD-L2 es una molécula que inhibe la unión de PD-L2 a sus socios de unión. En una realización específica, el socio de unión de PD-L2 es PD-1. El antagonista de unión a PD-1 puede ser un anticuerpo, un fragmento de unión a antígeno del mismo, una inmunoadhesina, una proteína de fusión o un oligopéptido. En algunas realizaciones, el antagonista de unión de PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico). Ejemplos de anticuerpos anti-PD-1 incluyen MDX-1106 (Nivolumab, OPDIVO), Merck 3475 (MK-3475, Pembrolizumab, KEYTRUDA), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810, BGB-108 y BGB-A317.

[0537] En una realización, el antagonista de unión a PD-1 es una inmunoadhesina que incluye una porción extracelular o de unión a PD-1 de PD-L1 o PD-L2 fusionada a una región constante. En una realización, el antagonista de unión a PD-1 es AMP-224 (también conocido como B7-DCIg, es un PD-L2-Fc), que es un receptor soluble de fusión descrito en WO2010/027827 y WO2011/066342.

[0538] En una realización, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo anti-PD-Ll, que incluye YW243.55.S70, MPDL3280A (Atezolizumab), MEDI4736 (Durvalumab), MDX-1105 y MSB0010718C (Avelumab).

[0539] En una realización, el agente inmunoterapéutico es un antagonista de unión a PD-1. En otra realización, el antagonista de unión a PD-1 es un anticuerpo anti-PD-L1. En una realización de ejemplo, el anticuerpo anti-PD-L1 es Atezolizumab.

[0540] La cita de documentos y estudios aquí mencionados no pretende ser una admisión de que alguno de los anteriores sea técnica anterior pertinente. Todas las declaraciones sobre el contenido de estos documentos se basan en la información disponible para los solicitantes y no constituyen ninguna admisión en cuanto a la exactitud del contenido de estos documentos.

[0541] La siguiente descripción se presenta para permitir que una persona con conocimientos normales en la técnica pueda realizar y utilizar las diversas realizaciones. Las descripciones de dispositivos, técnicas y aplicaciones específicas se proporcionan solo como ejemplos.

[0542] Ejemplos

[0543] Ejemplo 1: Materiales

[0544] Los materiales notables utilizados para los experimentos descritos a continuación fueron:

[0546]

[0549] Ejemplo 2: Preparación de mezclas de lípidos

[0550] Mezcla de lípidos DOTMA/DOPE preparada en diferentes concentraciones de lípidos en etanol con una relación molar de lípidos de 2:1 respectivamente. La solución se prepara de la siguiente manera:

[0551] Pesar el lípido DOPE.

[0552] Calcular la cantidad de DOTMA para mantener la relación molar en% de 2:1 DOTMA/DOPE.

[0553] Pesar el lípido DOTMA.

[0554] Calcular la cantidad de etanol absoluto necesaria para disolver los lípidos.

[0555] Pesar el etanol absoluto.

[0556] Disolver los lípidos en etanol con ayuda de agua hirviendo a 37°C.

[0557] Se investigó la solubilidad de DOPE y DOPE/DOTMA en etanol preparando soluciones de 300 mM de DOPE o 330 mM de DOPE/DOTMA (66:33) en etanol. Los lípidos se disolvieron incubando las soluciones lipídicas a 37 °C durante 20 minutos. Las soluciones de DOPE se centrifugaron a 17000 G durante 1 h y se midió la concentración de DOPE en el sobrenadante mediante HPLC. Las soluciones DOTMA/DOPE se filtraron a través de un filtro de jeringa PES de 0.22 µm y se midió la concentración de lípidos en el filtrado mediante HPLC.

[0558] Otras mezclas de lípidos que se pueden preparar igualmente siguiendo los pasos básicos descritos en este ejemplo, siempre que se utilicen otros lípidos como materiales de partida y/o se calculen otras relaciones molares.

[0559] Ejemplo 3: Preparación de liposomas

[0560] Los liposomas se prepararon mediante inyección de etanol de la siguiente manera: Se inyectaron 0.2 mL de DOTM/DOPE o (otra solución lipídica) en etanol con la ayuda de una jeringa de 1 mL equipada con una aguja de 0.9 x 40 mm en 9.8 mL de agua bajo agitación a 120 rpm. El coloide liposómico se agitó durante 30 minutos. Los liposomas se filtraron o no a través de filtros de jeringa CA de 0.45, 1.2 o 5 µm. Los coloides liposomales se almacenaron a 4-8 °C. Las soluciones lipídicas DOTMA/DOPE se prepararon en una relación molar de 66:33% con diferentes concentraciones de lípidos totales, de 100 a 400 mM, con pasos intermedios de 50 mM.

[0561] Ejemplo 4: Preparación de lipoplexos de ARN

[0562] Las formulaciones de lipoplexos de ARN se prepararon de la siguiente manera primero se mezcla una solución de ARN (por ejemplo, solución de ARN luc) con una solución de NaCl para precondensar el ARN luc. Después de esto, el coloide del liposoma y la solución luc-ARN-NaCl se mezclaron para formar los lipoplexos de ARN. La formulación de lipoplexos de ARN se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos y se almacenó a 4-8 °C. Las diferentes formulaciones de lipoplexos de ARN se prepararon, por ejemplo, con una relación N/P de 0.65. La concentración de ARN en estas diferentes formulaciones de lipoplexos de ARN fue de 0.1 mg/mL y la concentración de NaCl fue de 50 mM. Para la preparación de los lipoplexos de ARN se utilizaron diferentes precursores de liposomas (de diferentes tamaños).

[0563] Ejemplo 5: Dispersión dinámica de la luz

[0564] Los tamaños de los liposomas y los lipoplexos de ARN se midieron mediante el método conocido de dispersión dinámica de la luz (DLS) utilizando un instrumento Nicomp (PSS. Santa Bárbara. EE.UU). Las muestras de liposomas se diluyeron con agua hasta una concentración total de lípidos de 1 mM. Las muestras de lipoplexos de ARN se diluyeron de 1 a 5 con una solución de NaCl al 0.9%. Las muestras se midieron en tubos de cultivo de 5x50 mm (Kimble. EE.UU).

[0565] Ejemplo 6: Oscurecimiento de la luz - Dispersión dinámica de la luz

[0566] El conteo/medición de partículas de las diferentes formulaciones de liposomas y lipoplexos de ARN en un rango de tamaño entre 0.5 -5 µm se realizó utilizando un instrumento Accusizer A7000 (PSS. Santa Bárbara. EE.UU). Se realizaron tres mediciones de un volumen de 5 mL (2.5 µL de muestra/20 mL de agua con partículas libres). Los resultados obtenidos representan el valor medio de la cantidad de partículas de tres mediciones.

[0567] Ejemplo 7: Dispersión de rayos X de ángulo pequeño

[0568] Los parámetros de estructura interna de diferentes formulaciones de lipoplexos de ARN preparadas con diferentes precursores de liposomas se midieron mediante dispersión de rayos X de Ángulo pequeño (SAXS). SAXS es una técnica mediante la cual se pueden cuantificar las diferencias de densidad a escala nanométrica en una muestra analizando el comportamiento de dispersión elástica de los rayos X cuando se desplazan a través del material, registrando su dispersión en ángulos pequeños. Se calcularon los parámetros de longitud de correlación y espaciado d para cada formulación de ARN probada. Las formulaciones de lipoplexos de ARN se prepararon con una relación N/P de 0.65, 0.1 mg/mL de ARN y 112 mM de NaCl.

[0569] Ejemplo 8: Electroforesis en gel de agarosa

[0570] La cantidad de ARN libre en las diferentes muestras de lipoplexos de ARN se midió mediante electroforesis en gel. Para realizar las mediciones se utilizó un gel de agarosa al 1% que contenía hipoclorito de sodio. Las muestras de lipoplexos de ARN se diluyeron 1:6 con colorante de carga de ADN. Se cargaron cuidadosamente 12 µL de muestras de lipoplexos de ARN diluido en el gel de agarosa. La electroforesis se realizó a 80 V con un tiempo de ejecución de 40 min.

[0571] Ejemplo 9: HPLC

[0572] La concentración de lípidos en las diferentes formulaciones de liposomas se midió mediante HPLC (tecnologías Agilent. Santa Clara. EE.UU.) utilizando una columna Sunfire C18 de 2.5 µm 4.6 x 75 mm (Waters. Massachusetts. EE.UU.) y una longitud de onda de 205 nm. La fase móvil A fue una mezcla de 70% metanol/30% isopropanol/0.1% TFA, la fase móvil B fue una mezcla de 55% metanol/15% isopropanol/30% agua/0.1% TFA. Las muestras de liposomas se diluyeron o no con agua a una concentración total de lípidos de 3 mM.

[0573] Ejemplo 10: Cultivo celular: Transfección de ARN en células dendríticas in vitro

[0574] Se prepararon formulaciones de lipoplexos de ARN con diferentes precursores de liposomas y ARN-luc. Los lipoplexos de ARN se diluyeron a 0.01 mg/mL de ARN con solución de NaCl al 0.9% para experimentos de cultivo celular. Se investigó la eficiencia de la transfección de ARN de las diferentes formulaciones de lipoplexos de ARN en células dendríticas humanas sembradas en medio o sangre completa.

[0575] Ejemplo 11: Modelo animal: Direccionamiento del bazo y transfección de ARN en células dendríticasSe investigó la eficiencia de transfección de diferentes formulaciones de lipoplexos de ARN en ratones BALB/c. Se inyectaron retroorbitalmente 20 µg de lipoplexos de ARN formulados y se midió la expresión de luciferasa en células dendríticas (objetivo del bazo) después de 6 horas. Se prepararon lipoplexos de ARN con luc-ARN y diferentes precursores de liposomas, liposomas pequeños o grandes obtenidos a partir de coloides crudos y liposomas pequeños y grandes después de una filtración de 0.45 µm, relación N/P 0.65 y 112 mM de NaCl.

[0576] Ejemplo 12: Prueba de solubilidad

[0577] Se ha probado si se pueden preparar soluciones que contengan DOPE en mayor concentración (en estado sobresaturado) y utilizar para inyección de etanol para la fabricación de liposomas (siguiente sección). Los resultados obtenidos en esta serie de pruebas de solubilidad se muestran en las Tablas 1 y 2:

[0578] Solubilidad del DOPE en etanol

[0579] Tabla 1: Solubilidad del lípido DOPE en etanol obtenido de diferentes proveedores. Proveedor Cargo Nr. mM

[0580] Corden Pharma F0624 56

[0581] Corden Pharma W0650 59

[0583] NOF 14099612 63

[0584] Merck MK2885-C 59

[0586] Solubilidad de DOPE en etanol que comprende 220 mM de DOTMA

[0587] Tabla 2: Aumento de la solubilidad del lípido DOPE en una mezcla de lípidos DOTMA/DOPE con una relación molar% de 66:33 preparada en etanol absoluto.

[0588] Proveedor Cargo Nr. mM después de la filtración Corden Pharma F0624 93

[0589] Corden Pharma W0650 106

[0590] NOF 14099612 103

[0591] Merck MK2885-C 94

[0593] De acuerdo con estos resultados, el DOPE adquirido a diferentes proveedores tiene una solubilidad de equilibrio en etanol de aproximadamente 50 a 60 mM (temperatura ambiente). Sin embargo, si se prepara una cosolución con el lípido catiónico DOTMA, la solubilidad en equilibrio aumenta significativamente, por ejemplo a aproximadamente 90 a 100 mM si se utiliza una cosolución DOTMA/DOPE con una relación molar de 66:33.

[0594] Ejemplo 13: Fabricación de liposomas de diferentes tamaños

[0595] Los liposomas se fabricaron mediante inyección de etanol utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo 3. No se realizó ningún proceso de filtración después de la inyección de etanol. Se varió la concentración de lípidos en etanol, manteniendo fijos todos los demás parámetros. Los tamaños de los liposomas se midieron como se describe mediante dispersión dinámica de la luz (DLS) en los ejemplos 5 y 6.

[0596] A modo de ejemplo, los resultados relativos a los liposomas obtenidos a partir de una mezcla DOTMA/DOPE con una relación molar% 66:33 se muestran en la Tabla 3 (a continuación) y en las Figuras 1 y 2.

[0597] Tabla 3: Dependencia de los tamaños de los liposomas en diferentes concentraciones de lípidos en la solución madre.

[0599]

[0600]

[0603] Como se puede observar, los tamaños obtenidos (promedio Z) de los liposomas aumentan con la concentración de lípidos en la solución de etanol utilizada para la inyección de etanol. De esta forma, la concentración de lípidos en etanol se puede utilizar de forma eficaz para controlar el tamaño de los liposomas. Curiosamente, el cambio de tamaño fue más prominente si la concentración de DOPE estaba por debajo y por encima de la solubilidad de equilibrio de DOPE en etanol solo. Si la concentración de DOPE era superior a 50 mM (concentración total de lípidos de 150 mM), el tamaño del liposoma obtenido aumentaba drásticamente, de < 50 nm a más de 500 nm (Figura 1). Sin embargo, incluso por encima del límite de solubilidad, el tamaño de los liposomas aumentó de forma monótona a medida que aumentaba la concentración de lípidos.

[0604] Una fracción de liposomas de 0.5 µm estuvo presente en todas las formulaciones de liposomas, esta fracción de liposomas fue mayor en los liposomas preparados con una solución de lípidos de 300 mM y disminuyó en los liposomas preparados con concentraciones de lípidos más bajas y más altas. Además, se midieron fracciones de liposomas de 0.6 µm y 0.7 µm en las formulaciones de liposomas preparadas en concentraciones de lípidos más altas (Figura 2). Después de la inyección de etanol de una solución lipídica altamente concentrada, se formaron liposomas más grandes. La cantidad total de liposomas formados fue menor en comparación con las formulaciones de liposomas preparadas con baja concentración de lípidos en la solución lipídica. Los resultados obtenidos representan el valor medio de la cantidad de partículas de tres mediciones.

[0605] Ejemplo 14: Fabricación de lipoplexos de ARN a partir de liposomas de diferentes tamaños

[0606] Los lipoplexos de ARN se fabricaron como se describe en el Ejemplo 4 utilizando diferentes precursores de liposomas, donde se varió el tamaño de los liposomas para su formación, manteniendo todos los demás parámetros fijos. Los tamaños de los liposomas (promedio z) y los índices de polidispersidad (PDI) se determinaron en el curso de experimentos de dispersión dinámica de la luz (DLS) como se describe en los Ejemplos 5 y 6. Los resultados relacionados con el impacto de las concentraciones de lípidos para la preparación de liposomas (y por lo tanto en el tamaño del precursor de liposomas) en los tamaños de lipoplexos de ARN (promedio Z) se muestran en la Tabla 4 (abajo) y las Figuras 3 y 4 correspondientes.

[0607] Tabla 4: Cantidad de partículas presentes en las formulaciones de lipoplexos de ARN preparadas con diferentes precursores de liposomas (liposomas no filtrados). La cantidad de partículas de 0.5 µm aumenta en las formulaciones de lipoplexos de ARN preparadas con liposomas más grandes. Los liposomas se prepararon mediante inyección de etanol utilizando diferentes soluciones madre de lípidos en diferentes concentraciones. El tamaño de los liposomas aumenta con la concentración de lípidos en la solución madre.

[0609]

[0610]

[0613] De acuerdo con esta serie de pruebas, los lipoplexos de ARN obtenidos a partir de liposomas pequeños eran más pequeños que los de liposomas grandes. Los lipoplexos de ARN obtenidos a partir de liposomas fabricados con una solución de 300 mM o más fueron aproximadamente dos veces más grandes que los de liposomas obtenidos a partir de una solución madre de 150 mM. No se encontró correlación entre el tamaño del liposoma y el tamaño del lipoplexo de ARN en todos los lipoplexos de ARN preparados con liposomas más grandes (Figura 3).

[0614] La cantidad de lipoplexos de ARN obtenida aumentó con el tamaño del liposoma utilizado para su formación. Se midieron mayores cantidades de partículas de lipoplexos de ARN de mayor tamaño en las formulaciones preparadas con liposomas de mayor tamaño, lo que confirma los datos obtenidos de las mediciones de dispersión dinámica de la luz (Figura 4). Los resultados obtenidos representan el valor medio de la cantidad de partículas de tres mediciones.

[0615] Ejemplo 15: Dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) de diferentes lipoplexos

[0616] Se realizaron experimentos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño como se describe con lipoplexos de ARN obtenidos a partir de liposomas de soluciones madre de diferente concentración. Por ejemplo, los lipoplexos de ARN se formaron a partir de liposomas DOTMA/DOPE 2/1 (mol/mol) y ARN con una relación de carga de 1.3 a 2. Los liposomas se fabricaron mediante inyección de etanol como se describe a partir de concentraciones de lípidos en etanol de 100 mM, 300 mM y 400 mM.

[0617] Las curvas de difracción obtenidas a partir de las mediciones de dispersión de rayos X de ángulo pequeño de lipoplexos de ARN formados con liposomas preparados a una relación de carga de 4/1 (arriba) y a una relación de carga de 1.3/2, donde los liposomas para la formación de lipoplexos se obtuvieron con una solución madre de lípidos mM en etanol de 400 mM, 300 mM y 100 mM, se muestran en la Figura 5.

[0618] Los patrones de dispersión comprenden un único pico de Bragg a alrededor de 1 nm<-1>. Este es el patrón de difracción típico de los lipoplexos dirigidos al bazo, donde se utilizó un exceso de ARN (cargado negativamente) para la formación del lipoplexo. Si los lipoplexos no están cargados negativamente, el perfil de dispersión es completamente diferente. Como ejemplo, se midieron lipoplexos de ARN en una relación de carga de /-4/1, donde se encuentran picos mucho menos pronunciados. También se puede discernir un pico de segundo orden (aunque de baja intensidad). De hecho, la característica general de los perfiles de dispersión de rayos X de los lipoplexos es que hay varios picos que pueden ser equidistantes o tener otros espaciamientos, dependiendo del estado de fase. Aquí. Por el contrario, sólo se determina un único pico. Además, el ancho del pico cambia dependiendo de la concentración de la solución madre que se utilizó originalmente para la fabricación de liposomas. Si la concentración de etanol era mayor, el ancho del pico era menor. El pico de Bragg indica que los lipoplexos están ordenados regularmente, donde la distancia de repetición (espaciado d) se da desde la posición del pico como:

[0621]

[0624] Aquí q es la transferencia del momento, con

, con n el orden y q<máx>la posición máxima del pico de Bragg respectivo, λ la longitud de onda y θ el ángulo. El espaciado d que se puede derivar de los picos de Bragg es del orden de 6.5 nm.

[0625] El ancho del pico, Δq, disminuye a medida que aumenta el número de unidades repetidas en la pila. Para una matriz cristalina líquida, la longitud de correlación se puede expresar como:

[0628]

[0631] Para el producto lipoplexo aquí, se puede derivar una correlación clara del patrón de dispersión con la concentración de lípidos antes mencionada en etanol para la fabricación de liposomas y la actividad biológica.

[0632] Si bien la posición del pico es invariable, el ancho del pico cambia monótonamente con la concentración de lípidos aplicada en etanol. El aumento de la concentración de lípidos en etanol (que conduce a un aumento del tamaño de los liposomas) corresponde a una disminución del ancho del pico y, por lo tanto, a una mayor longitud de correlación. Al mismo tiempo, la actividad biológica aumenta a medida que aumenta la longitud de correlación. De este modo, los lipoplexos descritos con actividad mejorada, que se fabrican a partir de liposomas para cuya fabricación se utilizó una solución madre de lípidos en etanol de mayor concentración, se pueden distinguir por una característica estructural clara. Además, también mediante otros métodos, como el fraccionamiento de flujo de campo asimétrico (AF4), los lipoplexos descritos con actividad mejorada se pueden distinguir de aquellos de menor actividad.

[0633] Ejemplo 16: Eficiencia de transfección de lipoplexos de ARN en células dendríticas humanas

[0634] Los lipoplexos de ARN-Luc se fabricaron como se describe utilizando diferentes precursores de liposomas, donde se varió el tamaño de los liposomas para su formación (variando la concentración lipídica inicial para su formación), manteniendo todos los demás parámetros fijos. Posteriormente, se investigó la eficiencia de la transfección de ARN de las diferentes formulaciones de lipoplexos de ARN en células dendríticas humanas sembradas en medio o sangre completa.

[0635] En la Figura 6 se muestran los resultados que ilustran la eficiencia de la transfecciónin vitro(células dendríticas humanas) determinada midiendo la expresión de luciferasa y la actividad biológica correspondiente de diferentes lipoplexos de ARN preparados con diferentes precursores de liposomas.

[0636] La actividad biológica (transfección de ARNin vitro) aumenta monótonamente con la longitud de correlación de los lipoplexos de ARN. Una longitud de correlación más alta indica una población más homogénea de bicapas lipídicas en el lipoplexo de ARN.

[0637] Ejemplo 17: Fraccionamiento del flujo en campos de flujo asimétrico de diferentes lipoplexos

[0638] El fraccionamiento del flujo en campos de flujo asimétricos (AF4), actualmente un método común y de última generación para el fraccionamiento y separación de partículas en una suspensión, se utilizó para determinar diferencias adicionales en los lipoplexos de ARN. De acuerdo con la teoría AF4, las partículas con propiedades similares y tamaño igual deberían eluirse al mismo tiempo.

[0639] En la Figura 7 se muestran algunos resultados relacionados con las mediciones de AF4 de lipoplexos de dos tipos diferentes de liposomas, fabricados a partir de una solución madre de 150 mM en etanol o de una solución madre de 400 mM en etanol.

[0640] En resumen, las mediciones del fraccionamiento de flujo de campo demuestran que los lipoplexos de los liposomas de una concentración de lípidos de 150 mM en etanol son cualitativa y cuantitativamente diferentes de los de una concentración de lípidos de 400 mM. Los lipoplexos derivados de 150 mM son más pequeños pero, contrariamente a la intuición, se eluyen más tarde, por lo tanto debe haber una diferencia cualitativa (forma, interacciones del medio, carga) entre las dos fracciones. Los lipoplexos de ARN de la solución de etanol de 150 mM se eluyen más tarde, aunque son de menor tamaño. Esto indica que los lipoplexos de ARN de los liposomas que se fabrican a partir de liposomas en los que se utilizó una solución de lípidos de 150 mM en etanol son en promedio más pequeños que los de los liposomas fabricados a partir de 400 mM de lípidos en etanol. Incluso con el mismo tamaño, los lipoplexos derivados de 150 mm tienen propiedades fisicoquímicas diferentes a las de los derivados de 400 mM. Estas diferencias en tamaño y propiedades fisicoquímicas están correlacionadas con la mayor actividad biológica de los lipoplexos de ARN derivados de 400 mM.

[0641] Ejemplo 18: Actividad biológica de los lipoplexos de ARN in vitro

[0642] Como se determinó mediante experimentos de transfección de cultivos celulares (células dendríticas) con lipoplexos de ARN codificantes de luciferasa de diferentes tamaños preparados a partir de liposomas, diferentes soluciones madre de lípidos y/o diferentes concentraciones de lípidos como se describió, las señales de luciferasa y, por lo tanto, las actividades biológicas aumentan de manera monótona con las concentraciones iniciales de lípidos y, por lo tanto, con los tamaños de liposomas utilizados para la formación de lipoplexos de ARN. Los resultados correspondientes se muestran en las figuras 6, 8 y 9.

[0643] En resumen, los lipoplexos de ARN generados a partir de mayores concentraciones de lípidos para la fabricación de liposomas exhiben una actividad significativamente mayorin vitro.

[0644] Ejemplo 19: Actividad biológica de los lipoplexos de ARN in vivo

[0645] Como se determinó mediante experimentos de transfección de cultivos celulares (células dendríticas) con lipoplexos de ARN codificantes de luciferasa preparados a partir de liposomas de diferentes tamaños, los lipoplexos de ARN preparados con liposomas más grandes dan como resultado una expresión de luciferasa significativamente mayor y una actividad biológica correspondiente.

[0646] Un ejemplo no limitativo de esta serie de pruebas se muestra en las Figuras 10 y 11. Los lipoplexos de ARN preparados con liposomas más grandes a partir de un coloide crudo de 360 mM conducen a una señal de expresiónin vivosignificativamente mayor que los lipoplexos de ARN pequeños a partir de un coloide crudo de 200 mM.

[0647] Ejemplo 20: Fabricación automatizada de lipoplexos de ARN

[0648] Para la fabricación automatizada por lotes de lipoplexos de ARN, se ha desarrollado un procedimiento de aplicación general que se muestra en la Figura 12. Todos los pasos se realizan utilizando una ruta de fluido de un solo uso preesterilizada que permite una manipulación aséptica segura de los materiales. En primer lugar, se ajusta la concentración del ARN a la concentración del liposoma y se añade NaCl para la condensación del ARN. De este modo, la solución de ARN se ajusta a una concentración de ARN que permite mezclar volúmenes idénticos de ARN y liposomas. Tanto la solución de ARN como la de liposomas se transfieren a jeringas de gran volumen y ambas jeringas se montan en una única bomba de jeringa que acciona simultáneamente los dos pistones de las jeringas. Después de la formación del lipoplexo de ARN, se agrega una solución crioprotectora y se ajusta la concentración final del medicamento. Después de llenar el producto fármaco en botellas de vidrio, el producto fármaco se congela como concentrado para su almacenamiento a largo plazo.

[0649] Un atributo de calidad crítico de los lipoplexos de ARN es la relación de carga ajustada por la relación de mezcla entre el ARN y los liposomas. Se desarrolló un proceso de fabricación industrial automatizable y escalable para lipoplexos de ARN que permite un control eficiente de la relación de mezcla. En un proceso de fabricación a pequeña escala (≤ 10 litros), el control de la mezcla de volúmenes idénticos de dos soluciones acuosas que contienen liposomas y ARN se logra utilizando una única bomba perfusora que acciona simultáneamente dos jeringas de gran volumen llenas de ARN o liposomas. Para el bombeo equivalente de volúmenes mayores (≥ 10 litros) se utilizan sistemas de bombeo como recipientes presurizados, bombas de membrana, bombas de engranajes, bombas de levitación magnética o bombas peristálticas en combinación con sensores de caudal con bucle de retroalimentación para el control en línea y el ajuste en tiempo real del caudal.

[0650] Para la fabricación automatizada de lipoplexos de ARN se requiere un elemento mezclador estático que garantice una mezcla eficiente de las soluciones acuosas que contienen ARN y liposomas. Se encontró que los elementos mezcladores microfluídica disponibles comercialmente que contienen serpentinas y estructuras integradas para mejorar la mezcla, así como los elementos mezcladores prototipo con una arquitectura comparable, se bloqueaban durante la fabricación. Por lo tanto, estos elementos mezcladores no son adecuados para la fabricación automatizada de lipoplexos de ARN. Se encontró que los elementos mezcladores de tipo Y y tipo T con diámetros entre 1.2 y 50.0 mm eran adecuados para la fabricación automatizada de lipoplexos de ARN.

[0651] Método: Los lipoplexos de ARN se prepararon utilizando diferentes elementos mezcladores (tabla 1). Durante la fabricación de los lipoplexos, el operador observó los elementos mezcladores y documentó la deposición de material o la obstrucción.

[0652] Resultados: Con el chip microfluídico disponible comercialmente (NanoAssemblr<™>, Precision Nanosystems, Vancouver, Canadá), se observó obstrucción después de la preparación de 3 ml de lipoplexos de ARN. Se realizaron observaciones similares durante las pruebas de otros prototipos de elementos mezcladores microfluídica (Tabla 5). Mientras que para todos los elementos mezcladores (micro)fluídica que comprenden arquitecturas comparables a los elementos mezcladores disponibles comercialmente se pudo observar la deposición y particularmente el bloqueo de los elementos, no hubo observaciones cuando se utilizaron elementos mezcladores de tipo Y o tipo T. Además del elemento mezclador de tipo Y descrito con un diámetro de 2.4 mm, se han probado elementos mezcladores con diámetros mayores. Como no se encontró ninguna limitación para el diámetro del elemento mezclador de tipo Y, se considera que el método descrito es adecuado para la preparación de lipoplexos de ARN en diámetros de hasta 50 mm de los elementos mezcladores de tipo Y.

[0653] Tabla 5: Obstrucción del chip microfluídico.

[0655]

[0656]

[0659] Cuando se utilizan elementos mezcladores de tipo Y o tipo T, se requiere un caudal mínimo para lograr una mezcla suficiente. La preparación de lipoplexos de ARN puede realizarse mezclando dos soluciones acuosas que contienen ARN y liposomas mediante un elemento mezclador de tipo Y o tipo T con un diámetro interno de 1.6 a 50 mm. El número de Reynolds resultante del caudal de mezcla no debe ser inferior a ca. 300 para garantizar una mezcla eficiente. La relación de caudal a diámetro del elemento mezclador no debe ser inferior a ca.150 para garantizar una mezcla eficiente. Se probaron experimentalmente números de Reynolds hasta aproximadamente 2100 y se encontró que eran adecuados para la fabricación automatizada. Los datos respaldan que también son posibles caudales más elevados. Esto se deriva del hecho que en el número de Reynolds de 2100 las condiciones ya estaban en modo turbulento y, por lo tanto, con caudales incluso más altos se deben esperar condiciones de mezcla similares.

[0660] Método: Los lipoplexos de ARN se prepararon bombeando la solución de ARN y la solución de liposomas utilizando una única bomba perfusora. La formación de lipoplexos de ARN se realizó con elementos mezcladores de tipo Y representativos que comprenden un diámetro interno de 2.4 y 3.2 mm. El tamaño de partícula y la polidispersidad de los lipoplexos de ARN se analizaron mediante espectroscopia de correlación de fotones (PCS). Los números de Reynolds resultantes de la combinación investigada de caudal y diámetro de los elementos mezcladores se calcularon teóricamente utilizando la ecuación (Figura 13). La relación de caudal a diámetro del elemento mezclador se calculó dividiendo el caudal (cm<3>/min) por el diámetro del elemento mezclador (cm). El factor se da como un número adimensional.

[0661] Resultados: Al fabricar lipoplexos de ARN con combinaciones de caudal y elementos mezcladores que dan como resultado números de Reynolds calculados teóricamente por debajo de ca.300, se forman lipoplexos de ARN con mayor tamaño de partícula y polidispersidad (Figura 13 y Tabla 6). Para garantizar la formación reproducible de lipoplexos de ARN con las características de partícula deseadas, el número de Reynolds teórico debe ser de al menos ca. 300 (Figura 13 y 14 y tabla 6) y la relación de caudal a diámetro del elemento mezclador debe ser de al menos ca. 150. Se encontró que el elemento mezclador de 2.4 mm permite una mezcla eficiente y reproducible de ARN y liposomas en un amplio rango de caudales (60 a 240 ml/min). Como no se encontró un límite superior durante estos estudios, no se espera ninguna limitación superior del número de Reynolds ni de la relación de caudal a diámetro del elemento mezclador.

[0662] Tabla 6: Números de Reynolds calculados y relación de caudal a diámetro del elemento mezclador.

[0664]

[0667] Ejemplo 21: Influencia de las concentraciones de ARN

[0668] Los lipoplexos de ARN se prepararon con el elemento mezclador de tipo y con dimensiones representativas (2.4 mm). Para identificar el rango de concentración en el que se pueden preparar lipoplexos de ARN en la configuración actual, la concentración de ARN se varió sistemáticamente de 0.05 mg/mL a 0.5 mg/mL. Para investigar la estabilidad de los lipoplexos formados, la formulación final se ajustó a 0.05 mg/mL de ARN, 22% de sacarosa y 20 mM de NaCl y las formulaciones se congelaron tres veces.

[0669] La formación de lipoplexos de ARN en concentraciones de ARN entre 0.1 y 0.5 mg/mL durante la formación de lipoplexos de ARN da como resultado características de partículas comparables (Fig.15). Las características de las partículas también se conservan después de tres congelaciones, lo que indica un proceso de fabricación muy robusto con respecto a las variaciones de la concentración de ARN (Fig.16). Dado que no existen indicios de una limitación de la concentración de ARN durante la preparación de lipoplexos de ARN, la configuración descrita se considera adecuada para la preparación de lipoplexos de ARN a una concentración de ARN de hasta 5 mg/mL.

[0670] El proceso descrito para la fabricación automatizada de lipoplexos de ARN permite la preparación reproducible de lipoplexos de ARN estables con diferentes relaciones de carga.

[0671] Método: Para demostrar la robustez de la preparación semiautomatizada de lipoplexos de ARN con respecto a la relación de carga, este parámetro se varió sistemáticamente de 1.0:2.0 a 2.1:2.0 y de 2.0:1.0 a 5.0:1:0. Los tamaños de partículas y la polidispersidad de los lipoplexos de ARN se analizaron mediante mediciones de espectroscopia de correlación de fotones (PCS).

[0672] Resultados: No se encontró impacto de la variación de la relación de carga en el tamaño y la polidispersidad de los lipoplexos de ARN entre una relación de carga de 1.0:2.0 y 2.1:2.0 (Fig.17). Por lo tanto, se considera que el rango entre 1.0:2.0 y 2.1:2.0 da como resultado preparaciones de lipoplexos de ARN con calidad equivalente. Además, se formaron partículas estables con tamaño y polidispersidad definidos entre una relación de carga de 3.0:1.0 y 5.0:1.0 (Fig.18).

[0673] Ejemplo 22: Concentración de sal durante la formación de lipoplexos de ARN

[0674] Para la fabricación automatizada de lipoplexos de ARN que comprenden alta actividad biológica, se requieren condiciones iónicas controladas durante la formación de lipoplexos de ARN. Para garantizar la actividad biológica, la formación de lipoplexos de ARN debe realizarse en presencia de 45 a 300 mM de NaCl. Otros compuestos iónicos como por ejemplo EDTA, HEPES, etc. contribuyen a la fuerza iónica y pueden reducir la concentración mínima requerida de NaCl.

[0675] Método: Los lipoplexos de ARN se prepararon automáticamente a diferentes concentraciones de NaCl durante la formación de lipoplexos de ARN. Los tamaños de partículas y la polidispersidad de los lipoplexos de ARN se analizaron mediante mediciones de espectroscopia de correlación de fotones (PCS). Además, se investigó la bioactividad de los lipoplexos midiendo la señal de luciferasain vitro.

[0676] Resultados: Las características de las partículas se pueden controlar mediante el ajuste de la fuerza iónica. El aumento de las concentraciones de sal durante la fabricación indujo un ligero aumento del tamaño de las partículas (Fig.19). Se encontró que la concentración de sal tenía un impacto en la bioactividad. El aumento de la concentración de sal durante la fabricación indujo un aumento de la bioactividad (Figura 20). Por lo tanto, la concentración de NaCl durante la formación del lipoplexo de ARN no debe ser inferior a 45 mM de NaCl.

[0677] Ejemplo 23: Estabilización de lipoplexos de ARN

[0678] Los sistemas tampón como HEPES, ácido acético/acetato de sodio y fosfato de sodio para la estabilización del ARN en lipoplexos en el rango de pH de 5.5 a 6.7 se pueden utilizar para la estabilización del ARN en lipoplexos de ARN tanto en presencia como en ausencia de un crioprotector. Se encontró que el sistema de carbonato de sodio no produjo una eficacia de estabilización comparable.

[0679] Método: Para investigar el rango de pH óptimo y probar la idoneidad de diferentes agentes tampones que cubren diferentes rangos de pH (HEPES pH 6,8-8.2, ácido acético/acetato de sodio pH 3,7-5.6, fosfato de sodio pH 5,8-8.0 y carbonato de sodio pH 6,2-8.6). Los lipoplexos de ARN se incuban inicialmente en condiciones de estrés (40 °C) en ausencia de crioprotector. La integridad del ARN se analizó mediante electroforesis capilar durante 21 días. Para investigar el rango de pH óptimo en presencia de un crioprotector de ejemplo, se incubaron lipoplexos de ARN en presencia de HEPES y sacarosa a 40 °C y se analizó la integridad del ARN durante 21 días.

[0680] Resultados: Mientras que para los sistemas tampón HEPES, ácido acético/acetato de sodio y fosfato de sodio se obtuvieron resultados comparables, el sistema de carbonato no resultó en una estabilización comparable del ARN (Fig.21). La integridad del ARN depende del valor de pH de la formulación. Se identificó que el rango de pH óptimo está en el rango entre pH 5.5 y 7.4. En presencia del crioprotector de ejemplo sacarosa, se identificó un rango de pH de 5.5 a 8.0 que resultó en la mejor estabilización del ARN (Fig.22).

[0681] Los iones metálicos bivalentes pueden surgir del proceso de síntesis de ARN, de excipientes de formulación o de recipientes de vidrio y pueden afectar la estabilidad del ARN. La sal disódica de EDTA forma complejos estables solubles en agua con iones alcalinotérreos y de metales pesados. La sal disódica de EDTA contribuye a la concentración de iones presentes durante la formación de lipoplexos de ARN y, por lo tanto, reduce la concentración de NaCl necesaria para la preparación de lipoplexos de ARN bioactivos. La formación de lipoplexos de ARN en presencia de EDTA (0 a 20 mM) es posible con el proceso descrito.

[0682] Método: Los lipoplexos de ARN se formaron en presencia de concentraciones crecientes de EDTA (hasta 18 mM) y, tras la dilución, se incubaron con un contenido reducido de EDTA (0.1 mM a 5.4 mM) a 40 °C. La integridad del ARN se analizó como un parámetro fisicoquímico clave durante 21 días.

[0683] Resultados: Se encontró que la formación de lipoplexos de ARN en presencia de altas concentraciones de EDTA (hasta 18 mM) daba como resultado características de partículas equivalentes a la preparación en presencia de concentraciones más bajas. No se encontraron diferencias significativas entre los diferentes grupos que contenían entre 0.01% (p:v) (0.1 mM) y 0.2% (p:v) (5.4 mM) EDTA (Fig. 23) durante el almacenamiento. Como la sal disódica de EDTA contribuye a la concentración de iones presentes durante la formación de lipoplexos de ARN y puede funcionar como eliminador de iones metálicos bivalentes que potencialmente disminuyen la integridad del ARN, la presencia de concentraciones de EDTA de hasta 20 mM durante la formación de lipoplexos de ARN se considera ventajosa.

[0684] Ejemplo 24: Optimización de NaCl y contenido del crioprotector

[0685] Las condiciones iónicas ajustadas deben ajustarse durante la fabricación de lipoplexos de ARN, el almacenamiento a largo plazo y la aplicación al paciente (Figura 24). La concentración de NaCl puede ser de 45 a 300 mM durante la formación de lipoplexos de ARN; de 10 a 50 mM durante el almacenamiento a largo plazo de lipoplexos de ARN en estado congelado; y de 80 a 150 mM después de la descongelación y dilución con solución salina.

[0686] Para cada concentración de NaCl ≤ 70 mM, se encontró un contenido respectivo de crioprotector que no debe disminuirse para garantizar la estabilización de las características de las partículas luego de la congelación múltiple. Como crioprotector se pueden utilizar azúcares mono y bimoleculares como glucosa, sacarosa, manitol, trehalosa, sorbitol, trioles como glicerina y mezclas de los mismos en concentraciones entre 12.5 y 35.0% (p:v). La eficacia estabilizadora del sorbitol es menor en comparación con estos últimos compuestos y la arginina no estabiliza eficazmente los lipoplexos de ARN durante la congelación.

[0687] Tabla 7: Combinaciones de concentración de NaCl y contenido crioprotector investigadas después de un solo paso de congelación.

[0689]

[0692] Tabla 8: Combinaciones de concentración de NaCl y contenido de crioprotector investigadas después de 1, 2,

[0693] 3, 5 y 10 pasos de congelación.

[0695]

[0698] Métodos: Se investigaron diferentes compuestos representativos de monosacáridos (glucosa y sorbitol), disacáridos (sacarosa y trehalosa), aminoácidos (arginina, prolina), trioles (glicerina), así como sistemas crioprotectores que contienen mezclas de diferentes azúcares (manitol y sacarosa) para identificar crioprotectores adecuados (Fig.25 y 26). Por lo tanto, los lipoplexos de ARN se congelaron en presencia de una concentración creciente de estos compuestos. Para identificar el contenido mínimo de crioprotector a una determinada concentración de NaCl, los lipoplexos de ARN se congelaron en presencia de cantidades crecientes de sacarosa o trehalosa como crioprotectores representativos (Tabla 7). Las muestras se congelaron inicialmente una sola vez para determinar el rango de concentración del crioprotector a investigar en detalle. En un tercer experimento, se puso a prueba la eficacia de la estabilización del tamaño de partícula mediante la congelación de los lipoplexos de ARN hasta 10 veces en presencia del crioprotector trehalosa (Tabla 8). Resultados: Mientras que la arginina desestabiliza claramente los lipoplexos de ARN, los demás crioprotectores son generalmente aplicables para la estabilización de los lipoplexos de ARN durante la congelación (Fig.25 y 26). Glicerina, manitol y sacarosa (1:1,p:p), la prolina y el sorbitol se pueden utilizar como crioprotectores para lipoplexos de ARN. Además de la arginina, todos los estabilizadores probados adicionalmente parecen adecuados, lo que indica que un amplio rango de aminoácidos, azúcares y mezclas de dichos compuestos son adecuados para la estabilización de los lipoplexos de ARN durante la congelación. La eficacia estabilizadora del sorbitol es menor en comparación con estos últimos compuestos.

[0699] Al investigar en detalle la cantidad requerida de crioprotector en cada concentración de NaCl (Tabla 8), se encontró una correlación directa entre la concentración de NaCl y la concentración requerida del crioprotector después de un solo paso de congelación (Fig.27 y 28). Mientras que se encontró una conservación aceptable del tamaño de partícula después de un solo paso de congelación de 0 a 60 mM de NaCl al 20% (p:v) sacarosa o dihidrato de trehalosa, no se encontró una estabilización suficiente para un menor porcentaje de crioprotector (por ejemplo, ≤ 15% para 60 mM NaCl; ≤ 10% para 40 mM NaCl; ≤ 5% para 20 mM NaCl). Dentro del rango investigado, no se encontraron diferencias entre sacarosa y trehalosa.

[0700] Al analizar el tamaño de partícula de los lipoplexos de ARN después de congelaciones 1, 2, 3, 5 y 10 veces en presencia de las combinaciones de NaCl y trehalosa que se muestran en la Tabla 9.3.2, se obtuvieron los siguientes resultados. Mientras que a una concentración de 50 mM de NaCl, ≥ 12.5% de trehalosa fue suficiente para estabilizar las características de las partículas de lipoplexos de ARN incluso después de 10 congelaciones (Fig. 29), a 70 mM de NaCl, ≥ 12.5% fueron necesarios para una estabilización mínima y ≥ 22.5% fueron necesarios para la preservación exacta del tamaño de partícula (Fig.30). Con 90 mM de NaCl, se requirió ≥ 15.0% de trehalosa para una estabilización mínima y no se pudo lograr la preservación exacta del tamaño de partícula incluso con la concentración más alta investigada del 27.5% (Fig.31).

[0701] Ejemplo 25: Combinación de sal y crioprotectores para almacenamiento a largo plazo

[0702] Para el almacenamiento a largo plazo a la temperatura indicada, se deben utilizar las combinaciones de NaCl y crioprotector que figuran en la tabla 9.

[0703] Métodos:

[0704] Para investigar el contenido mínimo de crioprotector para el almacenamiento a largo plazo a -15 a -30 °C con una determinada concentración de NaCl, se congelaron lipoplexos de ARN en presencia de combinaciones de NaCl y sacarosa o trehalosa. Las muestras se congelaron a -30 °C y luego se transfirieron a la temperatura respectiva para su almacenamiento a largo plazo (-15 o -30 °C). Después del tiempo de almacenamiento definido, se analizaron las muestras y se analizó la conservación de la estabilidad coloidal midiendo el tamaño de partícula utilizando PCS.

[0705] Resultados: Si bien las características de las partículas de lipoplexos de ARN se pudieron conservar durante la congelación en presencia de hasta 70 mM de NaCl, en estos experimentos se pudo observar un efecto adicional que contribuyó a la desestabilización de la estabilidad coloidal. También se confirmó una estabilización aceptable de las características de las partículas tras la congelación, por ejemplo, con una combinación de 60 mM de NaCl y 20% de sacarosa, con el tiempo, el tamaño de partícula de estas formulaciones aumentó significativamente (Figs. 32 y 33) a una temperatura de almacenamiento de -15 °C. Este efecto se redujo al almacenarse a -30 °C (Figs.34 y 35).

[0706] La estabilidad de los lipoplexos de ARN a un contenido determinado de NaCl depende de la cantidad de crioprotector. La cantidad de crioprotector necesaria para estabilizar aumenta con el aumento del contenido de sal dentro de la solución de almacenamiento. Este efecto es independiente del tipo de azúcar utilizado como crioprotector. Las composiciones de lipoplexos de ARN para almacenamiento a largo plazo en estado congelado a -15 o -30 °C deben contener el contenido de crioprotector que figura en la tabla 9.

[0707] Tabla 9: Las concentraciones máximas aceptables de NaCl en combinación con el contenido de crioprotector (sacarosa o trehalosa) para el almacenamiento a -15 °C y -30 °C.

[0709]

[0710]

[0713] Ejemplo 26: Almacenamiento a largo plazo con diferentes crioprotectores

[0714] La estabilización durante 9 meses en presencia de 22% (p:v) de azúcares mono o bimoleculares es posible con 10 a 40 mM de NaCl. Estas formulaciones se pueden congelar a una temperatura de -15 a -40 °C y se pueden conservar a la temperatura correspondiente para un almacenamiento a largo plazo. En presencia de 12.6 a 16.8% (p:v) de dextrano, son posibles de 10 a 30 mM de NaCl.

[0715] Método: Para investigar el contenido mínimo de crioprotectores representativos como sacarosa, trehalosa, glucosa y mezclas que incluyen dextrano necesarios para el almacenamiento a largo plazo a -20 °C, los lipoplexos de ARN se congelaron con un contenido fijo de crioprotector en combinación con concentraciones variables de NaCl. Para crioprotectores moleculares monoméricos o diméricos como glucosa, sacarosa y trehalosa, se ajustó una concentración del 22% (p:v). Estas formulaciones se congelaron y almacenaron a una temperatura de -15 a -40 °C y se investigó la estabilidad a largo plazo midiendo el tamaño de partícula utilizando PCS después de un tiempo de almacenamiento definido.

[0716] Para las formulaciones que contienen mezclas del polímero dextrano se ajustaron las composiciones enumeradas en la tabla 9.5.1. Las muestras se congelaron y almacenaron a -20 °C. Tras el tiempo de almacenamiento definido, se analizaron las muestras y se analizó la conservación de la estabilidad coloidal midiendo el tamaño de partícula.

[0717] Resultados: Para todos los crioprotectores moleculares monoméricos o diméricos investigados, se encontró una concentración máxima de NaCl que no debe superarse para garantizar la estabilización a largo plazo de los lipoplexos de ARN en estado congelado. Mientras que 60 y 80 mM de NaCl dieron como resultado una desestabilización rápida de los lipoplexos, las propiedades coloidales pudieron conservarse durante un mínimo de 9 meses cuando la concentración de NaCl fue ≤ 40 mM al almacenarse a -20 °C (Tabla 10 y Fig.36 a 38). No se encontraron diferencias en la eficacia de estabilización de la sacarosa, la trehalosa y la glucosa. Para una formulación que incluía 20 mM de NaCl, no se encontró diferencia en la estabilidad a largo plazo cuando las muestras se congelaron y almacenaron en -15 a -40 °C (Fig.39).

[0718] Se investigaron formulaciones que contenían dextrano con un contenido crioprotector más bajo (12.6 a 16.8% (p:v)), la eficacia de la estabilización es comparable o mejor cuando se compara con los azúcares mono o bimoleculares (Fig.40).

[0719] Tabla 10: Composición de la formulación 1 a 7 que contiene dextranos (véase Figura 40).

[0721]

[0722] Ejemplo 27: Secado por congelación

[0723] a) Congelación descongelación

[0724] Con el fin de determinar la concentración de crio/lioprotector más efectiva se realizaron estudios de congelación-descongelación. Las formulaciones de lipoplexos de ARN se congelaron y descongelaron en 5 mM HEPES, 80 mM NaCl, 2.6 mM EDTA con la adición de 10%, 15%, 20%, 25% y 30% de trehalosa. El tamaño de partícula se determinó antes y después del almacenamiento a -20 °C. Se observó agregación de partículas en formulaciones congeladas en ausencia de trehalosa, cuyo tamaño de partícula no se determinó. De acuerdo con la Figura 41, las formulaciones congeladas con crio/lioprotector mostraron crioprotección dependiente de la concentración, el tamaño de partícula aumentó a concentraciones más bajas de lio/crioprotector. Con un 22% p/v de trehalosa, solo se observó un aumento mínimo en el tamaño de partícula con un Sf/Si (Sf = tamaño final, Si = tamaño inicial) de 1.04, que al ser inferior a 1.3 todavía se considera aceptable. A concentraciones más bajas de trehalosa, las relaciones Sf/Si fueron más altas. Las relaciones Sf/Si obtenidas de los estudios de congelación-descongelación se correlacionaron con las relaciones Sf/Si obtenidas de las mismas formulaciones después del secado por congelación y la reconstitución.

[0725] b) Reconstitución y estabilidad de partículas

[0726] Las formulaciones de lipoplexos de ARN preparadas en 5 mM HEPES, 2.6 mM EDTA, 0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 80 mM NaCl y 5%, 10%, 15% y 22% de trehalosa se secaron por congelación. Todas las muestras secadas por congelación exhibieron un buen aspecto de torta. Las muestras se reconstituyeron en el volumen original con solución de NaCl al 0.9%. Todas las formulaciones de lipoplexos de ARN secadas por congelación se disuelven instantáneamente tras la reconstitución con una solución de NaCl al 0.9% o WFI. Se determinó el cambio en el tamaño de partícula en formulaciones de lipoplexos de ARN secadas por congelación preparadas en trehalosa al 22% después de la reconstitución con solución de NaCl al 0.9% o agua.

[0727] De acuerdo con la Figura 42, el tamaño de partícula se mantuvo estable en todas las formulaciones de lipoplexos de ARN secadas por congelación que contenían trehalosa después del secado por congelación y la reconstitución. Se observó una ligera disminución en el tamaño de los lipoplexos de ARN cuando las muestras secadas por congelación se reconstituyeron con NaCl al 0.9% en comparación con las muestras secadas por congelación reconstituidas con agua. Se observó una correlación entre la relación NaCl a trehalosa y la estabilidad de las partículas. El tamaño de las partículas de lipoplexos de ARN aumentó en las formulaciones preparadas con concentraciones más bajas de trehalosa y concentraciones más altas de NaCl.

[0728] c) Experimentos de cultivo celular con formulaciones de lipoplexos de ARN secadas por congelación Se realizaron experimentos de transfecciónin vitrode formulaciones de lipoplexos de ARN codificante de luciferasa secadas por congelación preparadas en 22% de trehalosa a diferentes concentraciones de NaCl. Las muestras secadas por congelación se reconstituyeron con solución de NaCl al 0.9%.

[0729] De acuerdo con la Figura 43, las formulaciones de lipoplexos de ARN secadas por congelación preparadas al 22% de trehalosa y a diferentes concentraciones de NaCl mostraron niveles de transfección de luc-ARN similares en células dendríticas. No se encontró correlación entre la concentración de NaCl presente en la formulación de lipoplexos de ARN y la transfección de ARNin vitro. Las muestras secadas por congelación mostraron una transfección de luc-ARN similar o incluso mejor en comparación con un control de lipoplexos de ARN frescos.

[0730] d) Estudios de estabilidad

[0731] Se investigaron formulaciones de lipoplexos de ARN secadas por congelación que contenían 10% de trehalosa, 22% de trehalosa y 0 mM, 20 mM, 40 mM, 60 mM y 80 mM de NaCl para estudios de estabilidad a 4 °C, 25 °C y 40 °C (1 mes y 6 meses). Después de la reconstitución al volumen original con solución de NaCl al 0.9%, las muestras se caracterizaron según el tamaño de partícula y la integridad del ARN (% de ARN de longitud completa).

[0732] De acuerdo con las figuras 44 y 45, los tamaños de los diferentes lipoplexos de ARN no cambiaron significativamente a lo largo del tiempo independientemente de la formulación o la temperatura de almacenamiento. De manera interesante, cantidades menores de crioprotector (por ejemplo, 10%) son suficientes para mantener la estabilidad de las partículas en la formulación secada por congelación, mientras que se requiere una cantidad mayor (por ejemplo, 22%) en el caso de la formulación congelada. La integridad del ARN (% de ARN de longitud completa) en las muestras secadas por congelación después de 6 meses de almacenamiento a 4 °C varió entre el 94% y el 100% y para las formulaciones de ARN(lip) almacenadas a 25 °C varió entre el 85% y el 94%. Sin embargo, no se identificó ninguna correlación con la relación de concentración de trehalosa a NaCl ni con el tiempo de almacenamiento.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende:

partículas de lipoplexos de ARN que comprenden:

ARN que codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo,

al menos un lípido catiónico y al menos un lípido adicional,

en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1.9:2, o aproximadamente 1.3:2.0,

cloruro de sodio a una concentración de 0 mM a aproximadamente 40 mM, y

un estabilizador.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición comprende además un tampón, en donde el tampón es ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfónico (HEPES), en donde el HEPES está preferiblemente en una concentración de aproximadamente 2.5 mM a aproximadamente 10 mM, o de aproximadamente 7.5 mM.

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en donde la cantidad de ARN en la composición es de aproximadamente 0.01 mg/mL a aproximadamente 1 mg/mL, de aproximadamente 0.05 mg/mL a aproximadamente 0.5 mg/mL, o de aproximadamente 0.05 mg/mL, y/o

en donde el cloruro de sodio está en una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM, aproximadamente 20 mM o aproximadamente 30 mM, y/o

en donde la concentración de estabilizador en la composición es mayor que el valor requerido para la osmolalidad fisiológica, y/o

en donde la concentración de estabilizador en la composición es de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 por ciento en peso por volumen (% p/v), o de aproximadamente 12.5 a aproximadamente 25 por ciento en peso por volumen (% p/v).

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el estabilizador es un carbohidrato seleccionado de un monosacárido, un disacárido, un trisacárido, un alcohol de azúcar, un oligosacárido o su alcohol de azúcar correspondiente y un polialcohol de cadena lineal, o en donde el estabilizador es sacarosa en una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 por ciento en peso por volumen (% p/v), o

en donde la sacarosa está preferiblemente en una concentración de aproximadamente 15% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v), de aproximadamente 20% (p/v) a aproximadamente 25% (p/v), o en una concentración de aproximadamente 22% (p/v) o de aproximadamente 20% (p/v).

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la composición tiene un pH que es inferior al pH óptimo habitual para el almacenamiento de ARN, y/o en donde la composición tiene un pH de aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.7, o de aproximadamente 6.2.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composición comprende además un agente quelante, en donde el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), en donde el EDTA está preferiblemente en una concentración de aproximadamente 0.25 mM a aproximadamente 5 mM, o de aproximadamente 2.5 mM.

7. La composición de la reivindicación 1 que comprende:

partículas de lipoplexos de ARN que comprenden:

ARN que codifica un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo a una concentración de aproximadamente 0.05 mg/mL, y

DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 2:1,

en donde la relación de cargas positivas a cargas negativas en las partículas de lipoplexos de ARN es de aproximadamente 1.3:2.0,

cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 20 mM,

sacarosa a una concentración de aproximadamente 22% (p/v),

HEPES a una concentración de aproximadamente 7.5 mM con un pH de aproximadamente 6.2, y

EDTA a una concentración de aproximadamente 2.5 mM.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la composición está en estado líquido o congelado, en donde la composición congelada es preferiblemente estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C a aproximadamente -40 °C durante al menos un mes o estable a una temperatura de aproximadamente -15 °C durante al menos un mes, de aproximadamente -15 °C durante al menos dos meses, de aproximadamente -20 °C durante al menos un mes, de aproximadamente -20 °C durante al menos dos meses, de aproximadamente -30 °C durante al menos un mes, o de aproximadamente -30 °C durante al menos dos meses.

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde las partículas de lipoplexos de ARN se pueden obtener añadiendo un coloide de liposoma a una solución que comprende ARN, en donde el coloide de liposoma se puede obtener inyectando una solución lipídica en etanol en una fase acuosa para producir el coloide de liposoma, y

en donde la concentración de al menos uno de los lípidos en la solución lipídica corresponde a o es mayor que la solubilidad en equilibrio del al menos un lípido en etanol; y/o en donde las partículas de lipoplexos de ARN se caracterizan por un único pico de Bragg a aproximadamente 1 nm<-1>, en donde el ancho del pico es menor a 0.2 nm<-1>, y/o

en donde las partículas de lipoplexos de ARN tienen un diámetro promedio que varía de aproximadamente 200 a aproximadamente 800 nm, de aproximadamente 250 a aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 400 a aproximadamente 600 nm, de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 500 nm, o de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 400 nm.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8 y 9, en donde el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y/o 1,2-dioleoil-3-trimetilamoniopropano (DOTAP), y/o

en donde el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), colesterol (Chol) y/o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), y/o

en donde el al menos un lípido catiónico comprende 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano (DOTMA) y el al menos un lípido adicional comprende 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), y/o

en donde la relación molar del al menos un lípido catiónico al el al menos un lípido adicional es de aproximadamente 10:0 a aproximadamente 1:9, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1, y/o

en donde las partículas de lipoplexos de ARN comprenden DOTMA y DOPE en una relación molar de aproximadamente 10:0 a 1:9, de aproximadamente 4:1 a 1:2, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1:1, o aproximadamente 2:1 y en donde la relación de cargas positivas en DOTMA a cargas negativas en el ARN es de aproximadamente 1:2 a 1.9:2.

11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además un adyuvante.

12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que está formulada para administración sistémica, en donde la administración sistémica es preferiblemente por administración intravenosa, y/o en donde la composición es para uso terapéutico.

13. Un método para preparar una composición acuosa que comprende partículas de lipoplexos de ARN que comprende descongelar la composición congelada de la reivindicación 8 y, opcionalmente, ajustar la osmolalidad y la fuerza iónica añadiendo un líquido acuoso.

14. El método de la reivindicación 13, en donde se añade un líquido acuoso para obtener una osmolalidad de la composición de aproximadamente 200 mOsmol a aproximadamente 450 mOsmol y/o para obtener cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 80 mM a aproximadamente 150 mM.