ES2235916T3 - Preparacion de agentes terapeuticos de encapsulacion lipidica. - Google Patents

Abstract

Un método para preparar las partículas del producto terapéutico totalmente encapsuladas en lípidos de un producto terapéutico con carga que comprende los pasos de combinar una composición lipídica que comprende vesículas preformadas de lípido, un producto terapéutico con carga y un agente desestabilizante para formar una mezcla de vesículas preformadas y producto terapéutico en un disolvente de desestabilización, en el cual dicho disolvente de desestabilización es eficaz para desestabilizar la membrana de las vesículas preformadas de lípido sin romper las vesículas, incubar la mezcla durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la encapsulación del producto terapéutico en el interior de las vesículas preformadas de lípido, y eliminar el agente desestabilizante, en el cual las vesículas preformadas de lípido comprenden un lípido cargado que tiene una carga que es opuesta a la carga del producto terapéutico con carga y un lípido modificado que tiene una estructura de barrera estéricapara el control de la agregación, y en el cual el lípido modificado está presente en las vesículas preformadas en una cantidad eficaz para retardar, pero no prevenir, la agregación de las vesículas preformadas.

Description

Preparación de agentes terapéuticos de encapsulación lipídica.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un nuevo método para la preparación de partículas de productos terapéuticos encapsuladas en lípidos, y en particular, partículas terapéuticas de ácidos nucleicos encapsuladas en lípidos que pueden ser útiles en la terapia antisentido o la terapia génica.

Antecedentes de la invención

El concepto de utilizar partículas lipídicas como vehículos para productos terapéuticos ha sido propuesto por muchos autores. Las formulaciones se basan en la formación de complejos del producto terapéutico en el exterior de la partícula lipídica, o el atrapamiento real del producto terapéutico, aunque la capacidad de preparar formulaciones de ambos tipos depende de la equiparación de las características de los lípidos y el producto terapéutico, y también de los métodos empleados para preparar la partícula. En el caso de partículas con productos terapéuticos atrapados, el método de atrapamiento puede ser pasivo, es decir, las partículas lipídicas se montan en presencia del producto terapéutico, parte del cual se queda atrapado, o activo, es decir, el producto terapéutico es empujado u obligado a entrar en el interior de una partícula lipídica como consecuencia de un gradiente inducido de algún tipo. A pesar de los muchos esfuerzos realizados para utilizar partículas lipídicas como vehículos, siguen existiendo problemas que pueden limitar las aplicaciones reales de los productos terapéuticos atrapados en lípidos. Entre ellas, se pueden mencionar los niveles bajos de incorporación del producto terapéutico según la relación fármaco/lípidos, una eficiencia de captura del producto terapéutico baja y la ausencia de un procedimiento adecuado para la fabricación a mayor escala de las partículas del producto terapéutico encapsuladas en lípidos.

La fabricación a gran escala de las partículas del producto terapéutico totalmente encapsuladas en lípidos no se ha conseguido cuando existe una interacción electrostática significativa entre el lípido y el producto terapéutico. Un problema básico es la agregación. La agregación se produce normalmente cuando el lípido cargado se mezcla con un producto terapéutico que tiene una carga opuesta, dando lugar a una solución que contiene una masa lechosa floculada que no se puede usar en otras fases del procesamiento, mucho menos para el uso terapéutico. El problema de la agregación ha impedido el desarrollo de composiciones terapéuticas que pudieran ser de gran uti-
lidad.

Las formulaciones a escala de laboratorio que utilizan el lípido cargado y un producto terapéutico que tiene una carga opuesta han podido prepararse con éxito usando lípidos catiónicos y ácidos nucleicos aniónicos en un proceso de encapsulación pasivo que se describe en la Patente de los EE.UU. Nº 5.705.385 de Bally y cols. (Solicitud PCT Nº WO 96/40964; ver también las solicitudes de Patente de los EE.UU. S.N. 08/484.282; 08/485.458; 08/660.025; y 09/140.476) y la Solicitud de Patente PCT Nº WO 98/51278 de Semple y cols. (Ver también la Solicitud de Patente de los EE.UU. S.N. 08/856.374). Ver también Wheeler y cols. (1999) Stabilized plasmid-lipid particles: Construction and characterization. Gen. Ther. 6:271-281. Estas técnicas utilizan un lípido que previene la agregación, como un PEG-lípidos o un ATTA-lípidos (revelado en la Solicitud de Patente pendiente paralela de los EE.UU. 08/996,783), que previene eficazmente la formación de agregados complejos. Las partículas resultantes del producto terapéutico totalmente encapsuladas en lípidos tienen unas características farmacéuticas excelentes, como su tamaño controlado (dentro del intervalo de 30-250 nm), una encapsulación completa (medida por la resistencia a nucleasa, por ejemplo) y estabilidad en suero.

En el documento US-A-5 785 992 se revelan métodos para la preparación de composiciones útiles para la introducción de material polianiónico en las células, composiciones que comprenden compuestos catiónicos y lípidos neutros.

En el documento WO98/51278 se describe un procedimiento a escala de laboratorio para la preparación de las partículas del producto terapéutico encapsuladas en lípidos usando el atrapamiento pasivo. Este método conocido utiliza los dos pasos básicos de hidratación del lípido y determinación del tamaño de los liposomas. En el paso de hidratación del lípido se añade gota a gota una solución de un lípido catiónico (con EtOH al 95% como disolvente) en un reservorio con agitación que contiene un producto terapéutico polinucleótido en tampón citrato (pH 3,8) hasta una composición final que contiene un 40% de EtOH, 9,9 mg/ml del lípido y 2,0 mg/ml del polinucleótido. Las partículas lipídicas resultantes de este paso de hidratación tienen típicamente un diámetro de 400 nm y mayor, que es demasiado grande para su uso general como producto terapéutico. Por lo tanto, se necesita un extenso procesamiento postformulación como la extrusión a temperatura elevada (a 65ºC) y opcionalmente un paso de congelación-descongelación (desde nitrógeno líquido hasta un baño a 65ºC) para obtener las partículas lipídicas de un tamaño adecuado. La eficiencia de la encapsulación usando este método es bastante elevada (60-90%) en términos de la relación final fármaco:lípido recuperada, pero la eficiencia absoluta de la incorporación de un polinucleótido de partida en la formulación final de la partícula no es óptima (25-45%).

La fabricación comercial a gran escala de estas partículas no se ha alcanzado eficientemente usando los métodos tradicionales que se utilizan en el campo de los liposomas. Estos problemas existen a pesar de la gran cantidad de procedimientos existentes en la fabricación de formulaciones de liposomas/fármaco que han aparecido desde la primera descripción de una preparación de liposomas realizada por Bangham, AD. y cols. (1965) "The action of steroids and streptolysin S on the permeability of phospholipid structures to cations", J. Mol. Biol. 13, 138-147.

Las técnicas de fabricación a gran escala conocidas para las partículas lipídicas pueden clasificarse genéricamente en las siguientes categorías: 1) Hidratación de una película lipídica (es decir, atrapamiento pasivo); 2) Evaporación en fase inversa; 3) Extrusión a alta presión; 4) e Inyección de un disolvente (dilución) (ver por ejemplo las Patentes de los EE.UU. Nº 4752425 y 4737323 de Martin y cols.). Los instrumentos particulares para la fabricación de partículas lipídicas revelados en este campo son: las Patentes de los EE.UU. Nº 5270053 y 5466468 de Schneider y cols; Isele, U. y cols. (1994) Large-Scale Production of Liposomes Containing Monomeric Zinc Phthalo-cyanine by Controlled Dilution of Organic Solvents. J. Pharma. Sci. vol 83 (11) 1608-1616; Kriftner, RW. (1992) Liposome Production: The Ethanol Injection Technique, en Bruan-Falco y cols., eds, Liposome Derivatives, Berlín, Springer -Verlag, 1992, pp. 91-100; Kremer y cols. (1977) Vesicles of Variable Diameter Prepared by a Modified Injection Method. Biochemistry 16 (17) : 3932-3935; Batzri, S. y Kom, ED. (1973) Single Bilayer Liposomes Prepared Without Sonication, Bioch. Biophys. Acta 298: 1015-1019.

Ninguno de los métodos o instrumentos mencionados anteriormente es adecuado para las formulaciones a mayor escala del lípido cargado y productos terapéuticos que tienen una carga opuesta con las características farmacéuticas excelentes de Bally y cols., supra, y Semple y cols., supra. Las técnicas de fabricación expuestas en Bally y cols., supra, y Semple y cols., supra, se desarrollaron sólo para preparaciones de 1 - 100 ml, y son pesadas y dan lugar a ineficiencias insostenibles en la fabricación a gran escala (es decir, a una escala de 20-200 litros).

La invención presente proporciona, por primera vez, métodos para la preparación a gran escala de partículas totalmente encapsuladas de lípido-producto terapéutico en las que el lípido y el producto terapéutico tienen cargas opuestas. Estas partículas son útiles como composiciones terapéuticas y para la experimentación y otros usos. Es un objeto de esta invención proporcionar dichos métodos.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención, las partículas del producto terapéutico totalmente encapsuladas en lípidos de un producto terapéutico con carga se preparan mediante la combinación de una composición lipídica que comprende vesículas preformadas de lípido, un producto terapéutico con carga, y un agente desestabilizante para formar una mezcla de vesículas preformadas y producto terapéutico en un disolvente de desestabilización. El disolvente de desestabilización es eficaz para desestabilizar la membrana de las vesículas preformadas de lípido sin romper las vesículas. La mezcla resultante se incuba durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la encapsulación del producto terapéutico en el interior de las vesículas preformadas de lípido. El agente desestabilizante se elimina a continuación para dar lugar a las partículas del producto terapéutico totalmente encapsuladas en lípidos. Las vesículas preformadas de lípido comprenden un lípido cargado que tiene una carga que es opuesta a la carga del producto terapéutico con carga y un lípido modificado que tiene una estructura de barrera estérica para el control de la agregación. El lípido modificado está presente en las vesículas preformadas en una cantidad eficaz para retardar, pero no prevenir, la agregación de las vesículas preformadas. En una realización preferida de la invención, eficaz para proporcionar la formación eficiente de partículas lipídicas a gran escala (por ejemplo 20-200 litros), se combina una solución del producto terapéutico que comprende ácidos nucleicos (por ejemplo oligodesoxinucleótidos antisentido) con las vesículas preformadas de lípido en una solución acuosa de etanol al 25-40%. La incubación de esta mezcla durante un periodo de aproximadamente 1 hora es suficiente para dar lugar a la producción espontánea de las partículas totalmente encapsuladas del producto terapéutico.

Breve descripción de los dibujos

En la figura 1 se muestra un modelo posible de los pasos mecánicos del método de la invención;

En la figura 2 se describen las eficiencias de encapsulación en función de la concentración de etanol para liposomas que contiene 10 mol% de PEG-Cer;

En la figura 3A se describe la liberación de la calceína atrapada en concentraciones de autodesactivación en liposomas de DSPC/Col/PEG-CerC_{14}/ DODAP en función de la concentración de etanol (círculos negros) junto a las eficiencias de encapsulación obtenidas con liposomas de la misma composición lipídica (círculos blancos);

En la figura 3B se ilustra un intercambio rápido de lípidos durante la formación de ácidos nucleicos atrapados en lípidos usando el método de la invención;

En la figura 4 se muestran los datos de las eficiencias de atrapamiento y pérdida de calceína trazados en función de la temperatura;

En las figuras 5A, B y C se muestra el espectro de RM de los oligonucleótidos asociados a lípidos;

En la figura 6 se muestra un gráfico de la eficiencia de atrapamiento trazada en función de la relación inicial entre oligonucleótidos-lípidos; y

En la figura 7 se muestra la eficiencia de encapsulación de varias clases de oligodesoxinucleótidos antisentido y para el ADN de plásmido (pDNA).

Descripción detallada Definiciones de la invención

Si bien los términos usados en la solicitud están destinados a interpretarse con el significado ordinario que entenderían las personas expertas en la materia, algunos términos se definen expresamente para evitar cualquier ambigüedad. Por tanto, tal como se usa en la especificación y en las reivindicaciones de esta solicitud, el término:

Lípido cargado se refiere a una clase de lípido que tiene o una carga catiónica o una carga negativa o que es un zwiterión que no tiene una carga neta neutra y, en general, es necesario hacer referencia al pH de la solución en la que se encuentra el lípido.

Desestabilización se refiere a la modificación de las propiedades de una membrana lipídica como consecuencia de la interacción con un disolvente. Cuando la membrana se desestabiliza, se conserva la morfología fundamental de la membrana lipídica original. No obstante, la tasa de pérdida de los solutos de bajo peso molecular aumenta y los lípidos pueden "invertirse" a través de la membrana e intercambiarse rápidamente con otras partículas lipídicas. La desestabilización de una membrana lipídica se observa en la invención, por ejemplo, en una concentración de etanol del 25%-40%. Los disolventes que consiguen la desestabilización pero no la rotura de las vesículas de lípido se denominan en este documento disolventes de desestabilización.

Rotura se refiere a la modificación de las propiedades de una membrana lipídica tal que se pierde la morfología fundamental de la membrana original. La rotura de una membrana lipídica se observa, por ejemplo, en una concentración de etanol >60%.

Totalmente encapsulado se refiere a las partículas lipídicas en las que el producto terapéutico está contenido en la luz de una vesícula de lípido como un liposoma, o incluido en el interior de una bicapa de una partícula lipídica de forma que ninguna parte del producto terapéutico está directamente accesible al medio externo que rodea la partícula lipídica. Las partículas lipídicas en las que el producto terapéutico está totalmente encapsulado son distintas de las partículas en las que un producto terapéutico está formando complejos (por ejemplo mediante interacción iónica) con el exterior de la partícula, o de las partículas en las que el producto terapéutico está parcialmente embebido en el lípido y parcialmente expuesto al medio exterior. El grado de encapsulación puede determinarse usando métodos que degraden el producto terapéutico disponible. En el caso de un polinucleótido, estos métodos comprenden la digestión con nucleasa S1, la nucleasa sérica y el análisis de nucleasa de micrococos. Como alternativa, se puede usar una determinación con OliGreen^{TM}. En un sentido cuantitativo, un producto terapéutico "totalmente encapsulado" es aquel en el que menos del 10% del producto terapéutico, y preferiblemente menos del 5% del producto terapéutico en una partícula lipídica se degrada en condiciones en las que más del 90% del producto terapéutico se degrada en su forma libre. Además, habría que mencionar que se puede asociar otro (s) producto (s) terapéutico (s) con la partícula lipídica por la formación de complejos u otra forma que no esté totalmente encapsulada sin apartarse de la presente invención.

Hidratación se refiere a un proceso común por el que se forman las partículas lipídicas, incluidos los liposomas. En este proceso, la cantidad de agua en el disolvente que rodea los lípidos aumenta desde una concentración de aproximadamente el 5% o menos (a la que la concentración de las moléculas de lípido se solvatan individualmente) hasta una concentración del 40%-60% o mayor (a las que los lípidos forman espontáneamente membranas, micelas o partículas).

Lípido se refiere a un grupo de compuestos orgánicos que son ésteres de los ácidos grasos y se caracterizan por ser insolubles en agua pero solubles en muchos disolventes orgánicos. Se dividen habitualmente al menos en tres clases: (1) "lípidos simples" que comprenden grasas y aceites, además de ceras; (2) "lípidos compuestos" que comprenden fosfolípidos y glicolípidos; y (3) "lípidos derivados" como los esteroides. En esta invención se puede usar una amplia variedad de lípidos, algunos de los cuales se describen a continuación.

Vesícula preformada se refiere a la composición lipídica de partida usada en el método de la invención que contiene las vesículas de lípido. Estas vesículas tienen una estructura que se cierra sola con una forma generalmente esférica u oval formada por uno o más capas lipídicas y que tiene una luz interior que contiene una parte del disolvente. Las vesículas pueden ser unilamelares, oligolamelares o multilamelares.

La invención que se revela en este documento se refiere a un nuevo método para la preparación de las partículas del producto terapéutico encapsuladas en lípidos que es particularmente aplicable a la fabricación a gran escala de tales partículas cuando el lípido y el producto terapéutico tienen cargas opuestas, como las que se encuentran en las formulaciones de un lípido catiónico y un polinucleótido aniónico. Esta invención se basa en la observación, sorprendente e inesperada, de que al combinar las vesículas preformadas de lípido con una solución de producto terapéutico se puede dar lugar espontáneamente a la formación de partículas de un producto terapéutico totalmente encapsulado en lípidos de un tamaño terapéuticamente útil. Por tanto, las partículas del producto terapéutico totalmente encapsuladas en lípidos se forman de acuerdo con la invención por un método que comprende el paso de combinar un componente lipídico que comprende las vesículas preformadas de lípido y una solución del producto terapéutico y de incubar la mezcla resultante durante un periodo de tiempo para dar lugar a la encapsulación del producto terapéutico en las vesículas de lípido. El componente lipídico comprende además un sistema disolvente que es eficaz para desestabilizar la membrana de las vesículas de lípido sin romper las vesículas.

El método de la invención tiene varias características importantes que la confieren una utilidad sustancial en este campo. En primer lugar, se trata de un método a gran escala que se puede usar para preparar cantidades sustanciales (p. ej. >100 g) del producto terapéutico encapsulado en un solo lote. En segundo lugar, el tamaño de las vesículas preformadas de lípido se mantiene sustancialmente, de forma que no es necesario el procesamiento de las partículas lipídicas después de la introducción del producto terapéutico para obtener partículas de un tamaño terapéuticamente útil. En tercer lugar, la eficiencia de la encapsulación es alta. En cuarto lugar, la cantidad del producto terapéutico cargado en las partículas es alto.

Las partículas lipídicas usadas en la presente invención se forman a partir de una combinación de varios tipos de lípidos, que incluye al menos (1) un lípido cargado, que tiene una carga neta que es opuesta a la carga del producto terapéutico; y (2) un lípido modificado que incluye una modificación como un sustituyente polietilenglicol eficaz para limitar la agregación. Además, la formulación puede contener un lípido neutro o un esterol. A la hora de formular las partículas lipídicas usando todos los componentes mencionados, se usan idóneamente las siguientes cantidades de cada uno de los componentes lipídicos: 10 a 40 mol% del lípido cargado; 25 a 45 mol% del lípido neutro, 35-55 mol% del esterol; y 0,5 a 15 mol% del lípido modificado. Los componentes lipídicos específicos se pueden seleccionar entre los siguientes ejemplos no limitativos:

Lípidos cargados

Para la invención se pueden usar varios lípidos cargados y productos terapéuticos que tengan cargas opuestas. Los ejemplos de tales componentes son accesibles y conocidos por los expertos en la materia. Las relaciones siguientes tienen como objetivo proporcionar ejemplos ilustrativos no limitativos.

Lípidos catiónicos cargados en un pH fisiológico, como son, entre otros, cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamónico ("DODAC"); cloruro de N-(2,3-dioleiloxi) propil)-N,N,N-trimetilamónico ("DOTMA"); bromuro de N,N-distearil-N,N-dimetilamónico ("DDAB"); cloruro de N-(2,3-dioleiloxi) propil)-N,N,N-trimetilamónico ("DOTAP"); 3\beta-(N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil) colesterol ("DC-Col") y bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hydroxietil amónico ("DMRIE"). Además, existen varios preparados comerciales de lípidos catiónicos que se pueden usar en la presente invención. Entre ellos se incluyen, por ejemplo, Lipofectin^{TM} (liposomas catiónicos comerciales que comprenden DOTMA y 1,2-dioleoil-sn-3-fosfoetanolamina ("DOPE"), de GIBCO/BRL, Grand Island, Nueva York, USA); Lipofectamine^{TM} (liposomas catiónicos comerciales que comprenden trifluoroacetato de N-(1-(2,3-dioleiloxi) propil)-N-(2-(esperminecarboxamido) etil)-N,N-dimetilamónico ("DOSPA") y DOPE de
GIBCO/BRL); y Transfectam^{TM} (lípidos catiónicos comerciales que comprenden dioctadecilamidoglicil carboxiespermina ("DOGS") en etanol, de Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA).

Algunos lípidos catiónicos cargados pueden valorarse, lo que significa que tendrían un pKa en un pH fisiológico o cercano, con la consecuencia significativa para esta invención de que tienen un comportamiento fuertemente catiónico en un medio ácido débil y débilmente (o no) catiónico en un pH fisiológico. Estos lípidos catiónicos cargados son, entre otros, cloruro de N-(2,3-dioleiloxi) propil)-N, N-dimetilamónico ("DODMA") y 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano ("DODAP").

Los lípidos aniónicos cargados en un pH fisiológico son, entre otros, fosfatidil inositol, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol, ácido fosfatídico, difosfatidil glicerol, poli (etilenglicol)-fosfatidil etanolamina, dimiristoilfosfatidil glicerol, dioleoilfosfatidil glicerol, dilauriloilfosfatidil glicerol, dipalmitoilfosfatidil glicerol, disteariloilfosfatidil glicerol, ácido dimiristoil fosfatídico, ácido dipalmitoil fosfatídico, dimiristoil fosfatidil serina, dipalmitoil fosfatidil serina, fosfatidil serina cerebral, etc.

Algunos lípidos aniónicos cargados pueden valorarse, lo que significa que tendrían un pKa en un pH fisiológico o cercano, con la consecuencia significativa para esta invención de que tienen un comportamiento fuertemente aniónico en un medio alcalino débil y débilmente (o no) aniónico en un pH fisiológico. Un experto en la materia puede identificar estos lípidos aniónicos cargados según los principios que se revelan en este documento.

Lípidos neutros y esteroles

El término "lípido neutro" se refiere a cualquiera de las distintas clases de lípidos que existen tanto en forma sin carga o neutra zwiteriónica a partir de un pH fisiológico. Tales lípidos son, por ejemplo, diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingomielina, cefalina, colesterol, cerebrósidos y diacilgliceroles.

Lípidos modificados

Algunas formulaciones preferidas que se usan en la invención incluyen lípidos que previenen la agregación como PEG-lípidos u oligómeros de poliamida-lípidos (como un ATTA-lípido), y otros lípidos formadores de barreras estéricas o "furtivos". Tales lípidos se describen en las Patentes de los EE.UU. Nº 4320121 de Sears, 5.820.873 de Choi y cols., 5.885.613 de Holland y cols., WO 98/51278 (inventores, Semple y cols.), y la Solicitud de Patente de los EE.UU. Nº de serie 09/218988 relativa a oligómeros de poliamida, todas ellas incorporadas como referencia al presente documento. Estos lípidos previenen la precipitación y agregación de las formulaciones que contienen lípidos cargados y productos terapéuticos con cargas opuestas. Estos lípidos también se pueden utilizar para mejorar el tiempo útil de circulación in vivo (ver Klibanov y cols. (1990) FEBS Letters, 268 (1) : 235-237), o pueden seleccionarse para salir rápidamente de la formulación mediante intercambios in vivo (ver la Patente de los EE.UU. Nº 5885613). Lípidos intercambiables particularmente útiles son PEG-ceramidas que tienen cadenas acilo más cortas (es decir, C14 o C 18, que en este documento se denominan PEG-CerC 14 y PEG-CerC 18) o PEG-PE que tiene una cadena acilo C14.

Algunas formulaciones de partículas lipídicas pueden utilizar estructuras de direccionamiento diseñadas para facilitar la localización de los liposomas en algunas células o tejidos diana. Las estructuras de direccionamiento pueden estar unidas a la bicapa externa de la partícula lipídica durante la formulación o después de la formulación. Estos métodos son bien conocidos en este campo. Además, algunas formulaciones de partículas lipídicas pueden utilizar polímeros fusogénicos como PEAA, hemaglutinina, otros lipopéptidos (ver las solicitudes de Patente de los EE.UU. SN 08/835.281, y 60/083.294, todas ellas incorporadas en este documento como referencia) y otras características útiles para liberación in vivo y/o intracelular.

Las vesículas preformadas de lípido pueden prepararse en una solución de etanol u otro disolvente orgánico, usando un paso sencillo de hidratación del lípido. El porcentaje de etanol u otro disolvente orgánico debe seleccionarse de tal forma que las partículas lipídicas no se desmonten ni se redisuelvan en el disolvente (en general, con >60% de etanol) pero aportando las condiciones que permitan el proceso espontáneo de encapsulación de la invención (aproximadamente el 5%-50% de etanol, más preferiblemente el 25%-40% de etanol). Como alternativa, se pueden incluir componentes adicionales como detergentes en la solución de la vesícula de lípido que contribuye a la desestabilización de la membrana. Para el propósito de esta especificación, "disolvente orgánico" significa o un disolvente completamente orgánico (es decir, 100% de etanol) o un disolvente parcialmente orgánico (como etanol en agua, por ejemplo, un 20% de etanol, un 40% de etanol, etc.). Se puede usar una gran variedad de disolventes orgánicos miscibles en agua, como etanol u otros alcoholes, acetonitrilo, dimetilformamida, DMSO, acetona, otras cetonas, etc. En algunos casos pueden ser necesarios disolventes que tienen una polaridad mayor o menor. Las soluciones de detergente incluyen \beta-D-glucopiranósido, Tween 20 y los mencionados en el documento WO 96/40964 y en la Solicitud de Patente de los EE.UU. SN 09/169573, incorporados ambos en este documento como referencia, y cualquier otro detergente o compuesto de barrera estérica que pueda proporcionar las mismas características de solubilidad, y/o pueda prevenir la agregación de partículas durante la mezcla de un lípido cargado y el producto terapéutico con cargas opuestas. Preferiblemente, todos los disolventes orgánicos o soluciones de detergente son farmacéuticamente aceptables en cantidades muy pequeñas, o mayores, para que el proceso de formulación no impida la administración a un paciente.

Los productos terapéuticos aniónicos comprenden cualquier producto terapéutico que tenga una carga neta negativa, o que tenga un grupo cargado negativamente que sea capaz de interaccionar con un lípido catiónico sin ser bloqueado por grupos de otra carga catiónica del producto terapéutico. Estos productos terapéuticos comprenden cualquier producto terapéutico conocido o potencial, incluidos todos los fármacos y compuestos como, por ejemplo, entre otros, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos modificados (incluidos los complejos proteínas-ácidos nucleicos y etc.), proteínas y péptidos con grupos con carga negativa, fármacos convencionales como alcaloides vegetales y análogos que tengan grupos con carga negativa, etc. Los productos terapéuticos que no son inherentemente aniónicos pueden derivarse con grupos aniónicos para facilitar su uso en la invención. Por ejemplo, se puede derivar paclitaxel con un grupo de ácido poliglutámico unido en el carbono 2'.

Los productos terapéuticos catiónicos comprenden cualquier producto terapéutico que tenga una carga neta positiva o que tenga un grupo con carga positiva que sea capaz de interaccionar con un lípido negativo sin ser bloqueado por otros grupos del producto terapéutico que tengan una carga negativa. Estos productos terapéuticos comprenden cualquier producto terapéutico conocido o potencial, incluidos todos los fármacos y compuestos como, por ejemplo, los ácidos nucleicos modificados unidos a cargas catiónicas, proteínas y péptidos con grupos con carga positiva, fármacos convencionales como alcaloides vegetales y análogos que tengan grupos con carga positiva, etc. Los productos terapéuticos que no son inherentemente catiónicos pueden derivarse con grupos catiónicos para facilitar su uso en la invención.

Típicamente, los productos terapéuticos con carga se proporcionan inicialmente en una solución acuosa tamponada, que contiene en general una cierta cantidad de etanol u otro disolvente orgánico. La concentración de sal puede afectar en gran medida al proceso de autoensamblado (ver la Solicitud de Patente de los EE.UU. SN 09/169573, que se incorpora en este documento como referencia) que se utiliza en la invención, por lo que las sales tamponadas que se utilicen deben seleccionarse cuidadosamente. Además, todos los tampones deben ser farmacéuticamente aceptables, ya que pueden quedar restos en la formulación final. Un tampón adecuado es el tampón citrato 300 mM para los oligodesoxinucleótidos fosforotioato. En caso de oligodesoxinucleótidos con fosfodiéster y ADN de plásmido que tienen unas afinidades de unión más bajas, es apropiado usar un tampón que tenga una fuerza iónica más baja. Por ejemplo, las concentraciones habituales de citrato varían entre 25 y 150 mM, produciéndose el atrapamiento máximo en torno a los 50 mM. La cantidad de etanol u otro disolvente orgánico que puede incluirse se controla por la solubilidad del producto terapéutico en la mezcla orgánica acuosa y también por las características deseadas de la mezcla final del producto terapéutico y de las vesículas preformadas de lípido.

La selección de lípidos, el disolvente de desestabilización y los productos terapéuticos se elaboran para actuar en concierto y proporcionar unas composiciones totalmente encapsuladas en lípidos. Por tanto, si el producto terapéutico es un oligonucleótido polianiónico, los componentes lipídicos deben seleccionarse de forma que incluyan lípidos que sean catiónicos en las condiciones del disolvente de estabilización. Por el contrario, si el producto terapéutico es catiónico, los componentes lipídicos deben seleccionarse de forma que incluyan lípidos que sean aniónicos en las condiciones del disolvente de desestabilización, lo que no significa que todos los lípidos incluidos en la solución lipídica deban tener carga ni tampoco excluye la incorporación de una cierta cantidad de compuestos de tipo lipídico cargado o de lípidos zwiteriónicos. Sólo significa que la solución lipídica debe incluir los lípidos que tienen una carga neta opuesta a la carga neta del producto terapéutico.

El método de la invención utiliza soluciones de partículas lipídicas y producto terapéutico relativamente diluidas. En general, la solución del producto terapéutico tendrá una concentración de 1 a 1000 mg/ml, preferiblemente 10-50 mg/ml del producto terapéutico, para obtener una concentración final (después de mezclar con las vesículas preformadas de lípido) en el intervalo de 0,2 - 10 mg/ml, preferiblemente aproximadamente 1-2 mg/ml. Las vesículas preformadas de lípido se combinan con la solución del producto terapéutico de tal forma que la concentración resultante de lípidos (después de mezclar con la solución del producto terapéutico) es aproximadamente de 1,5 - 30 mg/ml (aproximadamente 2-40 mM), preferiblemente 10 mg/ml. Una composición preferida para las vesículas preformadas que se van a usar con un producto terapéutico polinucleótido se elabora con relaciones estándar entre lípidos (PEG-cerC14: DODAP: DSPC:Col (relaciones molares 5:25:25:45). Esta solución, en un 100% de etanolse diluye hasta un 5%-50% de etanol, preferiblemente un 40% de etanol, mezclando con un tampón acuoso, por ejemplo citrato 300 mM, pH 4,0.

La encapsulación tiene lugar tras la agitación de la solución lipídica y la solución de oligonucleótidos juntas hasta que se mezclan bien, y después se incuba sin mezclar o con una mezcla suave durante un periodo de aproximadamente 1 a 2 horas. La solución resultante se dializa a continuación para eliminar el etanol u otro material que desestabilice la membrana de la partícula lipídica. Se pueden usar los ajustes de pH para neutralizar las cargas de superficie (en caso de que el lípido cargado sea valorable) para liberar el producto terapéutico que pueda formar complejos con el exterior de la partícula.

Al final de la incubación, el método de la invención da lugar a partículas de productos terapéuticos totalmente encapsuladas que se forman espontáneamente con un tamaño que es aceptable para el uso terapéutico y que puede predecirse según el lado de partida de las vesículas preformadas de lípido. Por tanto, en general, no es necesario el paso de determinar el tamaño como el que se conoce en este campo después de añadir el producto terapéutico, lo cual supone una ventaja porque no es necesario aplicar una tensión mecánica sobre las vesículas de lípido después de la incorporación del producto terapéutico, y por tanto, no hay riesgo de pérdida o daños para el producto terapéutico. No obstante, en caso de que se desee determinar mejor el tamaño de las partículas del producto se puede utilizar un paso opcional para determinar el tamaño de las partículas lipídicas resultantes. Además, se puede utilizar un paso para determinar el tamaño dentro de la preparación de las vesículas preformadas antes de la introducción del producto terapéutico para obtener las vesículas de partida del tamaño deseado.

Hay varios métodos para determinar el tamaño de las partículas lipídicas, y cualquiera de esos métodos pueden utilizarse en general cuando se determine el tamaño dentro del procedimiento de la invención. El método de extrusión es un método preferido de determinación del tamaño de los liposomas. Ver Hope, MJ y cols. Reduction of Liposome Size and Preparation of Unilamellar Vesicles by Extrusion Techniques. In: Liposome Technology (G. Gregoriadis, Ed.) Vol. 1. p 123 (1993). El método consiste en la extrusión de los liposomas a través de una membrana de policarbonato de un tamaño de poro pequeño o de una membrana asimétrica de cerámica para reducir el tamaño de los liposomas hasta una distribución del tamaño relativamente bien definida. Típicamente, la suspensión pasa en ciclos a través de la membrana una o más veces hasta que se alcanza la distribución de tamaño de los liposomas deseada. Los liposomas pueden extruirse a través de membranas con un tamaño de poro sucesivamente más pequeño hasta alcanzar la reducción gradual del tamaño de los liposomas.

En este campo se conocen varios métodos alternativos para reducir el tamaño de una población de liposomas ("determinación del tamaño de los liposomas"). Un método de determinación del tamaño de los liposomas se describe en la Patente de los EE.UU. Nº 4.737.323, que se incorpora en este documento como referencia. La sonicación de la suspensión de liposomas en un baño o la sonicación con sonda produce una reducción progresiva del tamaño hasta vesículas unilamelares pequeñas menores de aproximadamente 0,05 micras de diámetro. La homogenización es otro método; se basa en la energía de cizallamiento para fragmentar liposomas grandes en otros más pequeños. En un procedimiento típico de homogeneización, las vesículas multilamelares se hacen recircular a través de un homogenizador estándar de la emulsión hasta que se observan los tamaños seleccionados de los liposomas, habitualmente entre aproximadamente 0,1 y 0,5 micras. El tamaño de las vesículas de liposomas puede determinarse por dispersión de luz cuasi-eléctrica (QELS) como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-450 (1981), que se incorpora en este documento como referencia. El diámetro medio de los liposomas puede reducirse por sonicación de los liposomas formados. Se pueden alternar los ciclos de sonicación intermitente con la evaluación mediante QELS para guiar la síntesis eficiente de liposomas.

Los tamaños preferidos para los liposomas fabricados con los distintos métodos de determinación del tamaño de los liposomas dependerán en cierto modo de la aplicación para la que se preparen los liposomas, pero en general quedarán en el interior del intervalo de 25 a 250 nm. En los ejemplos siguientes se establecen algunos ejemplos específicos de los tamaños adecuados.

Al estudiar las partículas lipídicas elaboradas de acuerdo con la invención, se encontró, sorprendentemente, que las vesículas unilamelares vacías más grandes (LUV), se convertían en vesículas multilamelares con el producto terapéutico atrapado. Si bien no estaba prevista su unión por ningún mecanismo en particular, se cree que el proceso que se produce es el que se muestra en la figura 1, en la cual se supone un lípido con carga catiónica y un producto terapéutico con carga aniónica. El proceso comienza con una vesícula unilamelar 10 que, como consecuencia de la inclusión de lípidos catiónicos, tiene cargas positivas de superficie en las superficies interna y externa de la pared bicapa. La adición del producto terapéutico aniónico, como los oligodesoxinucleótidos antisentido 11, da lugar a la formación de un complejo intermedio 12 en el que las moléculas del producto terapéutico 11 se unen mediante un mecanismo iónico/electrostático a los lípidos con carga opuesta que se encuentran en la superficie de la LUV.

El siguiente paso del proceso parece ser un paso de agregación, en el que se forman los agregados 13 de los complejos LUV/producto terapéutico. Este paso de agregación es muy complejo y depende, aparentemente, de la cantidad del agente desestabilizante (por ejemplo, etanol) y la cantidad del lípido modificado en las vesículas preformadas, además de estar mediado por el producto terapéutico con carga. Hay algunos conocimientos escasos en este campo sobre estos procesos, pero ni predicen ni explican el fenómeno que es la base de la presente invención. Se sabe que los complejos liposomas catiónicos/complejos de ADN muestran una gran variedad de estructuras diferentes incluidas las agrupaciones de liposomas agregados con diafragmas planos de bicapa doble en las superficies de contacto, liposomas recubiertos con ADN y estructuras multilamelares (agregadas), en las que el ADN queda encerrado a modo de sándwich entre bicapas de lípidos (Gustafsson y cols., 1995; Lasic, 1997; Lasic y cols., 1997; Huebner y cols., 1999; Xu y cols. 1999). Estas últimas estructuras pueden ser apilamientos planos de bicapas o liposomas, que con frecuencia muestran segmentos abiertos bicapa en su superficie externa. Se han observado estructuras similares después de la unión de Ca^{2+} a liposomas con carga negativa (Papahadjopoulos, 1975; Miller y Dahl, 1982; Rand y cols., 1985; Kachar y cols. 1986). Las transformaciones estructurales que se producen en estos sistemas se atribuyeron a procesos mediados por la adhesión, como la rotura y la fusión de la bicapa (Rand y cols., 1985; Kachar y cols., 1986; Huebner y cols., 1999). En primer lugar, los liposomas se agregan formado reticulaciones mediante ADN o Ca^{2+}. La rápida diseminación de la superficie de contacto deforma los liposomas a medida que se van aplanando unos contra otros, lo que somete a la bicapa a un aumento de tensión. Si la tensión (energía de adhesión) es suficientemente alta, la tensión impuesta sobre la membrana lipídica puede aliviarse por la fusión (aumento de la relación superficie/volumen) y/o por la rotura (pérdida de volumen). La mayoría de las bicapas se rompen cuando la superficie aumenta aproximadamente en un 3% (Evans y Parsegian, 1983). Tras la rotura de la bicapa, las vesículas se colapsan aplanándose unas contra otras para formar apilamientos multilamelares. Los agentes desestabilizantes de la membrana, como etanol, pueden modular las redistribuciones estructurales tras la interacción de los liposomas catiónicos con ADN u oligonucleó-
tidos.

En el método de la presente invención, la formación de liposomas multilamelares a partir de vesículas unilamelares en presencia de etanol también señala a un proceso mediado por la adhesión para su formación. No obstante, el proceso difiere de algún modo de los complejos con sus membranas terminadas, ya que el producto en este caso está formado por cubiertas concéntricas bicapa. Si bien es necesario etanol o un agente desestabilizante comparable para formar estas últimas estructuras, no está claro cómo afectan a estas redistribuciones estructurales. Estas redistribuciones se correlacionan con la pérdida de la barrera de la permeabilidad de la membrana para moléculas más pequeñas y un intercambio de lípidos rápido, así como una inversión de lípidos (que se correlaciona con la concentración de alcohol). Además, el intercambio del lípido modificado a partir de las LUV puede ser un factor significativo en la reorganización de las vesículas de lípido. En cualquier caso, por algunos mecanismos los agregados 13 se redistribuyen para formar vesículas multilamelares 14 con el producto terapéutico atrapado entre las laminillas y en el interior de la vesícula. Esta redistribución depende no sólo de la naturaleza de los agregados formados, sino también de la temperatura a la que se incuban los agregados. Parte del producto terapéutico también puede mantenerse asociado a cargas en el exterior de la vesícula multilamelar, y éstas se pueden eliminar mediante la neutralización de la carga (por ejemplo con un ácido o una base en el caso de un lípido cargado valorable), o mediante intercambio iónico.

Experimentalmente se encontraron varias características de las vesículas de lípido y el disolvente de desestabilización que eran importantes para las características de los productos finales, y una selección de las mismas se puede usar para controlar las características de las vesículas multilamelares del producto. Estas características son:

(1)

la inclusión de un lípido cargado en las vesículas preformadas de lípido con una carga opuesta a la del producto terapéutico;

(2)

la inclusión de un lípido modificado en una cantidad suficiente para retrasar la agregación, pero no suficiente como para prevenir la agregación. En el caso de PEG-CerC_{14}, se encontró que esta cantidad era del orden del 2,5% al 10%;

(3)

la inclusión en el disolvente de desestabilización de un agente desestabilizante (como etanol o detergente) en una cantidad que desestabiliza pero no rompe las vesículas preformadas de lípido; y

(4)

el montaje de las partículas del producto terapéutico totalmente encapsuladas en lípidos a una temperatura en la que los pasos de agregación y atrapamiento no se desacoplan. En general, para ello se requiere trabajar a una temperatura que varía desde la temperatura ambiente (\sim20ºC) a una temperatura superior, dependiendo de la concentración del agente desestabilizante y de la composición lipídica.

El método de la invención se puede llevar a la práctica usando aparatos de mezcla convencionales. Para una fabricación a gran escala, no obstante, puede ser deseable usar un aparato adaptado específicamente, que es el que se describe en una solicitud PCT presentada simultáneamente, titulada "Methods and Apparatus for Preparation of Lipid Vesicles", Nº de serie aún no asignado, presentada el 14 de julio de 2000, (Attorney Docket No. 80472-6).

El método de la invención se describirá ahora haciendo referencia a los siguientes ejemplos, no limitativos.

Ejemplos Los materiales usados en los siguientes ejemplos se suministran como sigue:

Los oligodesoxinucleótidos antisentido fosforotioato y el ADN de plásmido usados en este estudio fueron proporcionados por Inex Pharmaceuticals (Burnaby, BC, Canadá). Las dianas y secuencias del ARNm de los oligonucleótidos son las siguientes:

c-myc humano, 5'-TAACGTTGAGGGGCAT-3' (Nº de ID de la Sec. 1)

ICAM-1 humano, 5'-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3' (Nº de ID de la Sec. 2);

Y

EGFR humano marcado con FITC, 5'-CCGTGGTCATGCTCC-3' (Nº de ID de la Sec. 3).

EGFR humano marcado con FITC, 5'-CCGTGGTCATGCTCC-3' (Nº de ID de la Sec. 3).

La 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) fue adquirida en Northern Lipids (Vancouver, BC, Canadá) y el propano 1,2-dioleoil-3-dimetilamónico (DODAP), el 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoserina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (NBD-PS), la 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), la 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(sulfonilo de lisamina rodamina b) (LRh-PE) y también el 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (NBD-PE) procedían de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). La 1-hexadecanoil-2-(1-pirenodecanoil)-sn-glicero-3-fosfocolina (Py-HPC) y el colorante de unión a oligonucleótidos OliGreen fueron obtenidos en Molecular Probes (Eugene, OR). La 1-0-(2^{'}-(\omega-metoxipolietilenglicol) succinoil)-2-N-miristoilesfingosina (PEG-CerC_{14}), la [^{3}H]-PEG-CerC_{14} marcada radiactivamente y también la 1-O-(2'-(\omega-metoxipolietilenglicol) succinoil)-2-N-dodecanoilesfingosina (PEG-CerC_{20}) fueron suministradas por INEX Pharmaceuticals (Burnaby, BC, Canadá). El colesterol (col), el n-octil \beta-D-glucopiranósido (OGP), el Triton X-100, la calceína, el diclorodimetilsilano, el hidrosulfito sódico (ditionito), el 2-p-toluidinilnaftalen-6-sulfonato (TNS) y el ácido polianetolesulfónico (PASA) fueron adquiridos en Sigma (Oakville, ON, Canadá). Todos los materiales para el microscopio electrónico de transmisión, incluidos el tetraóxido de osmio, el citrato de plomo, el ácido maléico, el cacodilato sódico y la resina de inclusión Embed 812, fueron adquiridos en Electron Microscopy Sciences (Fort Washington, PA) y la agarosa de punto de fusión bajo (L.M.P.) en Life Technologies (Burlington, Ontario). El colesterol (COL) fue adquirido en Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri, USA). Las PEG-ceramidas fueron sintetizadas por el Dr. Zhao Wang en Inex Pharmaceuticals Corp. usando los procedimientos que se describen en el documento PCT WO 96/40964, que se incorpora en el presente documento como referencia. La [^{3}H] o [^{14}C]-CHE fue adquirida en NEN (Boston, Massachussets, USA). Todos los lípidos tenían una pureza > 99%. El etanol (95%), el metanol, el cloroformo, el ácido cítrico, el HEPES y el NaCl fueron adquiridos de proveedores habituales.

Métodos analíticos: Los métodos utilizados para determinar si un complejo lípido-producto terapéutico se "encapsula" de forma que esté "totalmente encapsulado" se establecen en el documento WO 98/51278, que se incorpora en este documento como referencia. Tales métodos comprenden la digestión con nucleasa S 1, nucleasa sérica y análisis de nucleasa de micrococos.

El método Oligreen se ha usado para cuantificar la cantidad de oligonucleótidos cargados en las vesículas. Un método de unión del colorante fluorescente para cuantificar oligonucleótidos monocatenáricos en soluciones acuosas se estableció usando un lector de placas fluorescentes Biolumin^{TM} 960 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, California, USA). Brevemente, las alícuotas de los oligonucleótidos encapsulados se diluyeron en solución salina tamponada con HEPES (HBS; HEPES 20 mM, NaCl 145 mM, pH 7,5). Una alícuota de 10 \mul de la muestra diluida se añadió a 100 \mul de una dilución 1:200 de reactivo Oligreen^{TM}, con o sin un 0,1% de Triton X-100 como detergente. Se preparó una curva estándar de oligos con y sin un 0,1% de Triton X-100 para la cuantificación de oligos encapsulados. La fluorescencia del complejo Oligreen^{TM}-antisentido se midió usando las longitudes de onda de la excitación y emisión de 485 nm y 520 nm, respectivamente. El antisentido asociado a la superficie se determinó comparando las mediciones de fluorescencia en ausencia y en presencia del detergente.

Dispersión dinámica de la luz. Los tamaños se determinaron mediante la dispersión dinámica de la luz usando un calibrador de partículas NICOMP 370 (Nicomp Particle Sizing Inc., Santa Barbara, California). En esta solicitud se muestran las medias de los resultados de los tamaños, que se obtuvieron mediante el ajuste acumulado a partir de las funciones de correlación experimentales. La polidispersión se expresa como la mitad de la anchura en la mitad de la altura de una distribución del tamaño gausiana monomodal. La viscosidad del etanol/tampón citrato se determinó usando un viscómetro Ubelohde-type (Cannon 50). Se encontró que la viscosidad de etanol/tampón citrato 300 mM (40/60 (v/v) ) a 23ºC medida en relación con el agua a la misma temperatura era de 2,674 mPa*s. El potencial zeta se determinó mediante la dispersión de la luz en la electroforesis usando un instrumento de dispersión de la luz Coulter (DELSA, Coulter Electronics Inc., FL).

Inversión de lípidos. La inversión de los lípidos se determinó mediante la reducción química del lípido fluorescente, NBD-PS, a un compuesto no fluorescente con ditionito sódico (McIntyre y Sleight, 1991; Lentz y cols., 1997). Los liposomas se prepararon con 20 mM de lípidos mediante la extrusión en presencia de 1 mol% de NBD-PS. Sólo el NBD-PS situado en la monocapa externa es accesible al agente reductor, ditionito, que se añade al medio externo. Su redistribución desde la monocapa interna hacia la externa puede producirse después de la reducción del NBD-PS en la lámina de la membrana externa. Se preparó de nuevo una solución 1 M de ditionito sódico en tampón TRIS 1 M. El NBD-PS de la monocapa externa se redujo mediante la adición de un exceso de ditionito sódico 100 veces molar en relación con el NBD y con una incubación durante 10 min. La terminación de la reacción se comprobó midiendo la fluorescencia de ditionito a 520 nm antes y después de la reducción de la excitación a 465 nm. El exceso de ditionito se eliminó a continuación mediante una cromatografía de exclusión en una columna Sephadex G50. Los liposomas se incubaron en presencia de un 40% de etanol y se extrajeron alícuotas correspondientes a una concentración final de lípidos de 150 \muM para su medición en distintos tiempos.

Experimentos sobre las pérdidas. La permeabilización de las LUV inducida por el etanol se midió a distintas temperaturas y en función del tamaño (PM) del soluto atrapado. Como marcador de bajo peso molecular de las pérdidas se usó calceína, y como marcador de alto peso molecular se usó FITC-dextrano (PM 19500). La pérdida de calceína atrapada en concentraciones de autodesactivación se vigiló monitorizando la desactivación de la fluorescencia de calceína. Las LUV se prepararon mediante la hidratación de una película lipídica con una solución acuosa que contenía calceína 75 mM y HEPES 5 mM ajustando el pH a 7,5 mediante la adición de hidróxido sódico, seguido por 5 ciclos de congelación/descongelación y extrusión a través de dos filtros apilados de 100 nm (10 pases). En el caso de DSPC/col/PEG-CerC_{14}/DODAP, la extrusión se realizó a 60ºC. La calceína no atrapada se intercambió frente a un tampón HBS isoosmótico mediante cromatografía de intercambio de aniones en una columna de DEAE Sepharose CL6B. La solución madre de liposomas se diluyó hasta alcanzar una concentración de los lípidos de 3\muM en HBS que contenía cantidades variables de etanol preequilibrado a 25ºC, 40ºC o 60ºC. La fluorescencia a 520 nm se midió (longitud de onda de la excitación, 488 nm, filtro de paso largo a 430 nm) con un Perkin Elmer LS50 Fluorimeter (Perkin Elmer) después de incubar 5 min a la temperatura correspondiente. El valor de la pérdida al 100% (desactivación máxima) se obtuvo mediante la adición de una solución al 10% de Triton X-100 hasta una concentración final del 0,05%. La pérdida de calceína se calculó según la fórmula % de la pérdida= (F_{s}-F_{b}) / (F_{TX}-F_{b}) *100, donde F_{S} es la fluorescencia de la muestra, F_{b} es el ruido de fondo correspondiente a liposomas que contienen calceína en ausencia de etanol y F_{TX} es el valor del Triton X-100.

El FITC-dextrano (PM 19500) quedó atrapado en liposomas de DSPC/Col/PEG-CerC_{14}/DODAP en los que se incorporó un 0,5 mol% de LRh-PE en una concentración final de 45 mg/ml. El atrapamiento se realizó añadiendo los lípidos disueltos en etanol a la solución de FITC-dextrano en HBS seguido por la extrusión (2 filtros apilados de 100 nm, 2 pases) y la posterior extracción de etanol por diálisis. El FITC-dextrano no atrapado se eliminó mediante una cromatografía de exclusión según el tamaño en una columna Sepharose CL4B (1,5x15 cm). La pérdida de FITC-dextrano desde los liposomas expuestos a un 40% de etanol se determinó después de la eliminación del FITC-dextrano liberado por la cromatografía de exclusión según el tamaño en una columna Sepharose CL4B (1,5x15 cm). La relación FITC/LRh-PE se midió antes y después de la adición de etanol. La fluorescencia de FITC y de LRh-PE se midió a 515 nm y 590 nm con una longitud de onda de la excitación establecida en 485 nm y 560 nm, respectivamente.

Mezclado de los lípidos. El mezclado e intercambio de los lípidos inducidos por etanol se vigiló por la pérdida de la transferencia de energía de resonancia, que se produce entre un donante, NBD-PE, y un aceptor, LRh-PE, que se encuentran muy próximos entre sí, hasta la dilución de las sondas en una membrana diana no marcada (Struck y cols., 1981). Las LUV contenían un 0,75 mol% de NBD-PE y un 0,75 mol% de LRh-PE. Los liposomas marcados y no marcados se prepararon en HBS pH 7,5 mediante extrusión cuando las concentraciones de los lípidos son de 20 mM. Se añadió etanol a los liposomas marcados y no marcados hasta una concentración final del 40% (v/v). Posteriormente, las dispersiones en etanol de los liposomas marcados y no marcados se mezclaron en una relación molar entre los lípidos de 1:5 y se incubaron a las temperaturas apropiadas. Las alícuotas se extrajeron en los tiempos establecidos y se añadieron a 2 ml de HBS para obtener una concentración final de lípidos de 150 \muM. El espectro de emisión de NBD y LRh se midió en la región de 505 a 650 nm con una longitud de onda de la excitación fijada en 465 nm (emisión del filtro de paso largo a 430 nm). Después de la sustracción del ruido de fondo (liposomas no marcados con 150\muM de lípidos) la pérdida de la transferencia de energía de resonancia se expresó como el incremento de la relación NBD/LRh.

Determinación del pireno-HPC. El pireno-HPC forma dímeros en estado excitado en concentraciones elevadas con una fluorescencia en longitudes de onda distintas que los monómeros. La formación del excímero es un proceso controlado por la difusión y requiere que dos moléculas entren en contacto para formar un dímero. El mezclado de los lípidos (membrana diana) y también el descenso de la movilidad lateral del pireno-HPC en la membrana pueden dar lugar al descenso del excímero de fluorescencia con pirenos (Hoekstra, 1990; Duportail y Lianos, 1996). La separación de la fase lateral da lugar normalmente al incremento del excímero de fluorescencia con pirenos (Duportail y Lianos, 1996). Este experimento se justificaba porque se quería comprobar el efecto de la unión de los oligonucleótidos en la membrana de los liposomas. La fluorescencia de los liposomas de pireno-HPC que atrapaban los oligonucleótidos se comparó con la de los liposomas de control vacíos y después de la depleción del gradiente de pH de transmembrana. El incremento del pH interno a 7,5 da lugar a la liberación de los oligonucleótidos unidos en la membrana. Se prepararon liposomas que incorporaban pireno-HPC en una concentración de 7 mol% mediante la adición de lípidos disueltos en etanol con un tampón citrato de pH 4. Se extrajo una alícuota y se atraparon los oligonucleótidos como se describe anteriormente. Los liposomas iniciales restantes se trataron del mismo modo en todos los pasos posteriores (ver en Atrapamiento). El gradiente de pH se disipó con acetato amónico ajustado hasta un pH de 7,5. Los liposomas se diluyeron en el tampón apropiado, HBS de pH 7,5 o acetato amónico 150 mM de pH 7,5, hasta una concentración final de lípidos de 2 \muM. El espectro de emisión de pireno-HPC se registró en una región de longitud de onda de 365-550 nm con una excitación a 345 nm y un filtro del valor umbral de la emisión de 350 nm. La relación de intensidad entre la fluorescencia del monómero a 397 nm y la fluorescencia del dímero a 478 nm se trazó con los liposomas iniciales y también con los liposomas que contienen oligonucleótidos antes y después de la depleción del gradiente de pH.

Espectroscopia con ^{31}PRM. El espectro con ^{31}PRM se obtuvo mediante un espectrómetro Bruker MSL200 funcionando a 81 MHz. Se recopilaron las desintegraciones por inducción libre (FIDS) que corresponden a 800 ó 2400 barridos usando un impulso de 2,8 \mus 50º con un retardo entre impulsos de 3 segundos y una anchura del espectro de 20000 Hz en una muestra de 2,0 ml con una sonda de 10 mm. No se utilizó el desacoplamiento de protones. Se aplicó a las FIDS una multiplicación exponencial correspondiente a un ensanchamiento de la línea de 25 Hz antes de la transformación de Fourier. El desplazamiento químico se estableció con referencia al control externo con ácido fosfórico al 85% (H_{3}PO_{4}). Los tiempos de relación spin-red (T_{1}) de los oligonucleótidos libres y encapsulados a un pH 7,5 son esencialmente los mismos con T_{1}^{free}_{=}1,7s y T_{1}^{enc}=2,1 s. Los valores de T_{1} se midieron por la secuencia de impulsos de inversión-recuperación. El retardo entre impulsos de 3 segundos durante impulsos de 50º permite completar la relajación de todas las resonancias antisentido.

Ultracentrifugación. Los liposomas con y sin oligonucleótidos atrapados se fraccionaron mediante ultracentrifugación en un gradiente escalonado de sacarosa que comprende un 1%, 2,5%, 10% y 15% (p/v) de sacarosa en HBS de pH 7,5 con un volumen de escalonamiento de 3,5, 3,5, 2,5 y 1,5 ml, respectivamente. Las muestras se centrifugaron durante 2 h a 36000 rpm (RCF_{Rmax} 221.000 xg) usando una ultracentrífuga Beckmann L8-70 en combinación con un rotor SW41Ti. El gradiente se fraccionó desde la parte superior o cada banda se extrajo con una jeringa después de puncionar el tubo con una aguja.

Microscopio electrónico de criotransmisión (crio-TEM). Se aplicó una gota de la muestra a una rejilla estándar de un microscopio electrónico con una película de carbono perforada. El exceso de líquido se extrajo por transferencia en un papel de filtro, dejando una fina capa de agua sin cubrir los orificios de la película de carbono. La rejilla se congeló rápidamente en etano líquido, haciendo que las vesículas quedaran embebidas en una película fina de hielo amorfo. Las imágenes de las vesículas en hielo se obtuvieron en condiciones criogénicas con una ampliación de 66000 y un desenfoque de -1,5 micras usando un criosoporte Gatan en un microscopio electrónico Philips CM200 FEG.

Microscopio electrónico con fractura por congelación. Las muestras se criofijaron en presencia de glicerol al 25% sumergiéndolas en Freón 22 líquido enfriado mediante N_{2} líquido. La superficie fracturada se ensombreció unidireccionalmente con platino (45º) y se recubrió con carbono (90º) utilizando un equipo Balzers Freeze-Etching sistema BAF 400D (Balzers, Liechtenstein). Las réplicas se analizaron usando un microscopio electrónico JEOL Modelo JEM 1200 EX (Soquelec, Montreal, QC, Canadá).

Microscopio electrónico de transmisión (TEM). Las vesículas se fijaron mediante la adición de 1 volumen de tetraóxido de osmio al 2% a 0,5 volúmenes de vesículas en HBS seguida por la centrifugación a 17.000 x g y 4ºC durante 45 min. El pellet resultante se mezcló con un volumen igual de agarosa al 3%/PBS, pipetado en un porta de microscopio y se dejó enfriar a 4ºC. La agarosa solidificada que contiene las vesículas se cortó en piezas de 1 mm y se transfirió a un tubo de vidrio para su procesamiento posterior. Los bloques se lavaron durante 3 x 5 min con ácido maléico 0,05 M a pH 5,2 antes de la tinción en acetato de uranilo al 2% durante 1 h. Las piezas de tejido se deshidrataron a través de una serie graduada de alcoholes (50%-100%), infiltrados con relaciones crecientes de resina epoxi (EMbed 812) :óxido de propileno y se embebieron EMbed 812 al 100% a 60ºC durante 24 h. Los cortes ultrafinos se tiñeron con citrato de plomo al 2% y se examinaron usando un microscopio electrónico de transmisión Zeiss EM 10C (Oberkochen, Alemania)

Microscopio de contraste de fase y fluorescencia. El estudio con el microscopio de contraste de fase y fluorescencia se realizó en un microscopio Zeiss Axiovert 100 usando un objetivo de inmersión en aceite Plan Apochromat 63x/1,4NA combinado con una lente optovar 1,6x y un filtro XF100 obtenido en Omega Optical (Brattleboro, Vermont) con las siguientes especificaciones ópticas: excitación 475 \pm 20/dicroico 500/emisión 535 \pm 22,5. Las imágenes se registraron en una película Kodak Ektachrome P1600 con inversión de color con 1600 ISO mediante una cámara para microscopios Zeiss MC80 DX. Los portas y los cubres se siliconizaron con diclorodimetilsilano para neutralizar la superficie de vidrio que, en caso contrario, tendría una carga negativa.

Ejemplo 1

Las vesículas preformadas vacías se prepararon a partir de una mezcla de lípidos que contienen PEG-CerC14, DODAP, DPSC y COL en una relación molar de 5:25:25:45. Los cuatro lípidos se disolvieron en etanol al 100% hasta una concentración de lípidos totales de 25 mg/ml (33 mM). El lípido en etanol se introdujo a continuación a través de un acceso de inyección con un diámetro del orificio de 0,25 mm en un reservorio que contiene tampón citrato 300 mM, pH 4,0. El reservorio y todas las soluciones estaban a temperatura ambiente. El volumen total de lípidos en etanol fue de 6 litros y la velocidad de introducción de los lípidos fue de 200-300 ml/min. El volumen total de tampón citrato fue de 9 litros. La mezcla resultante de 15 litros tenía una concentración de etanol del 40% y citrato 180 mM. Se generaron vesículas de una mediana de diámetro de 170 \pm 20 nm. Se modificó el tamaño de las vesículas preformadas vacías hasta una mediana del diámetro de 90-120 nm mediante 1-3 pases a través de un circuito de extrusión (65ºC) a baja presión (100 p.s.i., reducida desde la presión clásica de 500-1000 p.s.i.) usando dos membranas de 80 nm apiladas. Las vesículas preformadas vacías se mezclaron entonces en un reservorio 20 y se mantuvieron a 40ºC hasta la adición de la solución del producto terapéutico.

Ejemplo 2

Las vesículas preformadas del Ejemplo 1 se usaron para tomar las partículas del producto terapéutico totalmente encapsuladas en lípidos usando oligonucleótidos INX-6295 (Nº de ID de la Sec. 1) como el producto terapéutico. Los oligonucleótidos INX-6295 en agua destilada se diluyeron mediante la adición de etanol al 100% para formar varias soluciones de 10, 20, 30 40 ó 50 mg/ml de oligonucleótidos en etanol al 40%. Los oligonucleótidos en etanol se añadieron a las vesículas preformadas en el reservorio 20 a 40ºC con un suave mezclado. La cantidad y volumen de los oligonucleótidos en etanol se calcularon de forma que se pudiera alcanzar una relación fármaco final:lípidos de 0,1 a 0,25 en peso. La mezcla se incubó a continuación a 40ºC con un mezclado suave y periódico durante 1 hora. Después de la incubación, la solución se procesó mediante la diafiltración para quitar los oligonucleótidos libres o en exceso presentes, extraer el etanol e intercambiar el sistema de tampón a una solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4. La concentración, filtración estéril y envasado completan la preparación de un producto comercial.

Ejemplo 3

El procedimiento del Ejemplo 2 se repitió con cambios en distintos parámetros para determinar cuál podría ser crítico para la preparación de las partículas del producto terapéutico totalmente encapsuladas en lípidos de acuerdo con la invención. En estos experimentos se consideraron la recuperación total de oligonucleótidos (rendimiento), la recuperación total de lípidos (rendimiento) y la eficiencia de la encapsulación como indicaciones de la calidad del producto y el proceso.

La recuperación total de oligonucleótidos se calculó usando la fórmula:

\frac{\text{concentración final de oligo (mg/ml) X volumen final(ml)}}{\text{concentración inicial de oligo (mg/ml) X volumen inicial (ml)}}\times 100%

La recuperación total de lípidos se calculó usando la fórmula:

\frac{\text{concentración final de lípidos (mg/ml) X volumen final (ml)}}{\text{concentración inicial de lípidos (mg/ml) X volumen inicial (ml)}}\times 100%

La eficiencia de la encapsulación (E.E.) se calculó usando la fórmula:

\frac{\text{oligo inicial (mg/ml) /lípidos inicial (mg/ml)}}{\text{oligo final (mg/ml) /lípidos final (mg/ml)}}\times 100%

El porcentaje de oligos que se encapsulan (es decir, que se incorporan en las bicapas o que quedan atrapados en el interior de la partícula lipídica) se determinó con la prueba OliGreen que se describe anteriormente.

Para evaluar el significado de la relación inicial fármaco/lípidos se realizó el experimento con dos relaciones de partida diferentes. Los resultados se resumen en la Tabla 1. No se observó ningún cambio en el tamaño de las vesículas en el proceso de carga de los oligonucleótidos.

TABLA 1

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1

Para evaluar el significado de la temperatura de incubación, el experimento se realizó a temperatura ambiente y en dos temperaturas elevadas durante 1 hora. Los resultados se resumen en la Tabla 2. Como se ve, la eficiencia del proceso comienza a alterarse con una temperatura por encima de 60ºC y se provoca un incremento del tamaño de partículas. Por tanto, se prefieren las temperaturas más bajas.

TABLA 2

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2

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Para evaluar el significado del tiempo de incubación, el experimento se realizó en tres tiempos de incubación y a una temperatura de incubación de 40ºC. Los resultados se resumen en la Tabla 3. Como se demuestra, el rendimiento mejora entre 0,5 horas y 1 hora pero al aumentar el tiempo de incubación por encima de una hora no se consigue una mejoría sustancial. Por tanto, el proceso más eficiente en el aparato usado utilizará un tiempo de incubación de aproximadamente 1 hora.

TABLA 3

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3

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Para evaluar el significado de la concentración del tampón en la solución de oligonucleótidos, el experimento se realizó en cuatro concentraciones diferentes del tampón citrato y una relación inicial de fármaco/lípidos de 0,1. Los resultados se resumen en la Tabla 4.

TABLA 4

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4

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Para evaluar el significado de la concentración inicial de etanol durante el paso de mezcla, se realizó el experimento con 3 concentraciones iniciales diferentes de etanol en cada una de las dos relaciones iniciales de fármaco/lípidos. Los resultados se resumen en la Tabla 5. Parece haber una concentración óptima de etanol que es diferente en cada relación inicial de oligo/lípidos. En otro experimento adicional que no se incluye en la Tabla, se usó una concentración inicial de etanol de 50% que tiene una relación oligo/lípidos de 0,1. En este experimento se encontraron problemas significativos de causa desconocida y no se consiguió rendimiento alguno del producto.

TABLA 5

5

Para evaluar el significado de la concentración inicial de oligonucleótidos (y, por tanto, del volumen de la solución del producto terapéutico para obtener la misma relación inicial fármaco/lípidos), se usaron soluciones madre de cuatro concentraciones diferentes de oligonucleótidos. Los resultados se resumen en la Tabla 6. Como se demuestra, este parámetro no parece ser crítico para los resultados obtenidos usando el método de la invención.

TABLA 6

6

Ejemplo 4

Para demostrar la posibilidad de aplicar la invención a productos terapéuticos de mayor tamaño, se introdujo en las vesículas preformadas de lípido el plásmido pINEX L1018, un plásmido de 5,5 kb que codifica el gen luciferasa ligado al gen promotor del CMV, y que también actúa como vehículo de los elementos potenciadores SV40 y un gen AmpL.

Las vesículas preformadas de lípido se prepararon añadiendo lentamente 10 mg de lípidos (DSPC/Col/DODAV/
VEG-CerC14 en una relación 20/45/25/10 mol%) disueltos en etanol al 100% a un tampón citrato 25 mM (ácido cítrico 25 mM y sacarosa 255 mM, ajustado a pH 4 con hidróxido sódico). Ambas soluciones se precalentaron hasta 40ºC antes de su mezclado. La concentración final de etanol fue del 40% (v/v). La dispersión en etanol de las vesículas de lípido se extruyó 2X a través de 2 filtros de policarbonato de 100 nm apilados a temperatura ambiente. Se añadieron 0,25 mg de ADN de plásmido en etanol al 40% a las vesículas de lípido a temperatura ambiente, seguido por la incubación de la muestra durante 1 hora a 40ºC. La relación inicial de plásmido/lípidos fue de 0,025. Posteriormente, la muestra se dializó frente a 2 litros de solución salina 25 mM, pH 7,5 (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM) durante un total de 18-20 horas.

La eficiencia de atrapamiento se determinó después de eliminar el ADN externo del plásmido mediante una cromatografía por intercambio de aniones en una columna DEAE Sepharose CL6B. El ADN de plásmido se cuantificó usando el sistema de unión de ADN Pi-coGreen Lipid mediante una determinación con fosfato inorgánico según Fiske y Subbarrow después de la separación del plásmido mediante la extracción con el método de Bligh y Dyer. Además, la concentración final de lípidos se determinó mediante la incorporación de 0,25 mol% del lípido Lissamina rodamina-PE marcado con fluorescencia en las vesículas de lípido.

La relación final plásmido-lípidos fue de 0,022, que corresponde a un atrapamiento del 88%. Las partículas del producto terapéutico encapsuladas en lípidos resultantes tenían un tamaño medio de 100 nm y una distribución de tamaños muy pequeña.

Ejemplo 5 Preparación de los liposomas

Los liposomas unilamelares grandes en las soluciones de etanol/tampón se prepararon mediante la adición de etanol a los liposomas extruídos o mediante la adición de lípidos disueltos en etanol a una solución de tampón acuoso y la extrusión consecuente. Ambos métodos dan los mismos resultados de atrapamiento y serán los que se describen con más detalle a continuación:

1.

Después de la hidratación de una película lipídica en tampón citrato de pH 4 y 5 ciclos de congelación/descongelación se generaron las LUV por extrusión a través de 2 filtros de 100 nm apilados (10 pasos). En el caso de los liposomas DODAP/DSPC/Col/PEG-CerC14 la extrusión se realizó a 60ºC. El etanol se añadió lentamente a continuación mezclando rápidamente. Los tamaños típicos de los liposomas determinados después de la extracción del etanol mediante dispersión dinámica de la luz fueron de 90 \pm 20 nm para el sistema DODAP/DSPC/ Col/PEG-CerC_{14}. La adición lenta de etanol y el mezclado rápido son importantes a medida que los liposomas se convierten en inestables y coalescen en grandes estructuras de lípidos en cuanto la concentración de etanol supera un límite superior determinado. Esto último depende de la composición lipídica. Por ejemplo, una dispersión de liposomas DSPC/Col/PEG-CerC_{14}/DODAP inicialmente traslúcida se convierte en lechosa si la concentración de etanol supera el 50% (v/v).

2.

Las LUV se prepararon mediante la adición lenta de lípidos disueltos en etanol (0,4 ml) al tampón citrato de pH 4 (0,6 ml) seguida por la extrusión a través de 2 filtros de 100 nm apilados (2 pases) a TA. La medición de la dispersión dinámica de la luz realizada en etanol y después de la extracción del etanol mediante diálisis no muestra diferencias significativas en el tamaño, que es típicamente de 75 \pm 18 nm. El paso de extrusión puede omitirse si se añade etanol muy lentamente bajo mezclado enérgico para evitar concentraciones localmente elevadas de etanol.

Procedimiento de atrapamiento

Se añadió lentamente una solución de oligonucleótidos bajo agitación con vortex a la dispersión de liposomas en etanol, que posteriormente se incubó a la temperatura adecuada durante 1 h, dializada durante 2 horas frente al tampón citrato para eliminar la mayoría del etanol y dos veces frente a HBS (HEPES 20 mM/NaCl 145 mM, pH 7,5). A un pH 7,5 se neutraliza la carga del DODAP y los oligonucleótidos unidos a la superficie de la membrana externa se liberan de su asociación con el lípido catiónico. Los oligonucleótidos no encapsulados se extrajeron posteriormente mediante cromatografía por intercambio de aniones en columnas de DEAE-sepharose CL-6B equilibradas en HBS a pH 7,5. Cuando se usó octilglucósido en lugar de etanol el detergente se añadió a los liposomas (1:1 v/v) hasta unas concentraciones finales que variaban entre 30-40 mM. Todos los pasos posteriores se realizaron como se describe anteriormente, excepto que el paso inicial de diálisis frente al tampón citrato de pH 4 se prolongó hasta 5 h. En los ejemplos siguientes, si no se menciona lo contrario, se usaron los liposomas DSPC/Col/PEG-CerC_{14}/DODAP (20:45:10:25 mol%), c-myc (Nº de ID de la Sec. 1), etanol al 40% (v/v), tampón citrato 300 mM e incubación a
40ºC.

Determinación de las eficiencias de atrapamiento

Las eficiencias de atrapamiento se determinaron después de la extracción de los oligonucleótidos externos mediante cromatografía por intercambio de aniones. Las concentraciones de oligonucleótidos se determinaron mediante espectroscopia UV en un espectrofotómetro Shimadzu UV160U. La absorbancia a 260 nm se midió después de la solubilización de las muestras en cloroformo/metanol en una relación de volumen de 1:2,1:1 cloroformo/metanol/fase acuosa (muestra/HBS). Si la solución no era totalmente transparente después de la mezcla, se añadían otros 50-100 \mul de metanol. Como alternativa, la absorbancia se leyó después de la solubilización de las muestras en octilglucósido 100 mM. Las concentraciones antisentido se calcularon según: c [\mug/\muI]=A260*1 OD_{260}unidades [\mug/ml]*factor de dilución [ml/\mul], donde el factor de dilución viene dado por el volumen total de la determinación [ml] dividido por el volumen de la muestra [\mul]. Las unidades OD_{260}se calcularon a partir de los coeficientes pareados de extinción para cada desoxinucleótido individual, que tiene en cuenta las interacciones vecinas más cercanas. 10D corresponde a 30,97 \mug/ ml de c-myc (Nº de ID de la Sec. 1), 33,37 \mug/ml de h-ICAM-1 (Nº de ID de la Sec. 2) y 34 \mug/ml de EGFR (Nº de ID de la Sec. 3). Las concentraciones de lípidos se determinaron mediante la determinación de fósforo inorgánico después de separar los lípidos de los oligonucleótidos mediante una extracción de Bligh y Dyer (Bligh y Dyer, 1959). Brevemente, se añadieron 250 \mul de una fase acuosa (muestra/HBS), 525 \mul de metanol y 250 \mul de cloroformo para formar una fase transparente única (fase acuosa/metanol/cloroformo 1:2,1:1 vol). Si la solución no estaba transparente, se añadía una pequeña cantidad de metanol. A continuación, se añadieron 250 \mul de HBS y un volumen igual de cloroformo. Las muestras se fijaron y centrifugaron durante 5-10 min a 3000 rpm. Con eso, se consiguió un sistema transparente de dos fases. En la fase de cloroformo se determinó el contenido de fosfolípidos según el método de Fiske y Subbarrow (1925). Si no se menciona lo contrario, las eficiencias de atrapamiento se expresaron como relaciones de peso entre oligonucleótidos y lípidos [p/p].

Ejemplo 6

Después de los procedimientos del Ejemplo 5, se añadieron cantidades crecientes de etanol a 100 nm de liposomas DSPC/Col/ DODAP (no el componente del lípido modificado) preparados por extrusión. Todas las muestras se volvieron blancas lechosas inmediatamente después de la adición de los oligonucleótidos, lo que indica la agregación inducida por los oligonucleótidos. Después de la incubación con oligonucleótidos antisentido en una relación molar de ODN/lípidos de 0,035 a pH 4, se extrajeron el etanol y los oligonucleótidos no atrapados. En la Tabla 7 se enumeran las eficiencias de encapsulación determinadas mediante la dispersión dinámica de la luz, junto a los tamaños finales de las vesículas multilamelares resultantes. Cada vez más oligonucleótidos antisentido quedan atrapados a medida que aumenta la concentración de etanol. El incremento concomitante del tamaño y la polidispersión refleja una reorganización progresiva de las LUV en las estructuras lipídicas de mayor tamaño, que aparecen ser predominantemente liposomas multilamelares grandes. Obsérvese que, debido al tamaño de estos sistemas, parte de los lípidos se pierden en la columna de intercambio aniónico usada para eliminar los oligonucleótidos externos no atrapados. La fracción eluida corresponde a aproximadamente el 50%-60% de los lípidos totales. Con concentraciones de etanol del 40% y mayor los liposomas iniciales se convirtieron en inestables y se fusionaron para formar la dispersión blanca
lechosa.

TABLA 7

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7

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Estos resultados demuestran que el etanol hace que las membranas lipídicas sean susceptibles a las redistribuciones estructurales que provocan el atrapamiento de los oligonucleótidos entre las laminillas concéntricas de los liposomas multilamelares grandes. No obstante, el tamaño de los liposomas resultantes no se puede controlar fácil-
mente.

Ejemplo 7

Los liposomas se prepararon para contener de 2,5 a 10 mol% del lípido modificado (PEG-Cer) y se estudiaron usando los protocolos de los Ejemplos 5 y 6. En cada caso, el descenso de la concentración de PEG-Cer se consiguió con el aumento de las concentraciones de DPSC. Se encontró que la incorporación del lípido modificado en los liposomas permite regular el tamaño final de los liposomas que contienen antisentido. Los liposomas se mantuvieron estables en concentraciones mayores de etanol en presencia de PEG-Cer que en su ausencia. Las dispersiones se mantuvieron ópticamente traslúcidas en etanol al 40%, aunque se observó un ligero descenso de la turbidez en la muestra que contiene un 2,5 mol% PEG-Cer. El aumento de estabilidad también se refleja en las cantidades mayores de etanol necesarias para que se produzca el atrapamiento (Tabla 8, Fig. 2). En la figura 2 se reflejan las eficiencias de encapsulación en función de la concentración de etanol para los liposomas que contienen un 10 mol% de PEG-Cer. El atrapamiento máximo se alcanzó con una concentración de etanol del 40% y se necesitaron concentraciones de etanol mayores del 25% (v/v) (>4,3 M) para que se produjera el atrapamiento. No se encontró atrapamiento en ausencia de etanol. En la Tabla 8 se enumeran las eficiencias de atrapamiento y los tamaños determinados por dispersión dinámica de la luz en función del contenido de PEG-Cer (2,5-10 mol%) en las concentraciones máximas y mínimas de etanol determinadas a partir de la figura 2. Los tamaños de los liposomas iniciales extruídos se incluyen entre paréntesis. La cantidad de etanol necesaria para que se produzca el atrapamiento depende del contenido de PEG-Cer de los liposomas. Los liposomas que contenían un 2,5 mol% de PEG-Cer atrapaban aproximadamente el 15% de los oligonucleótidos con etanol al 25% y el 45% en presencia de un 40% de etanol. Por el contrario, con un 10 mol% de PEG-Cer el atrapamiento se anuló prácticamente en presencia de etanol al 25% (\leq 5%) y fue del 60% en etanol al 40%. En todos los casos, la relación inicial entre oligonucleótidos-lípidos fue de 0,037 (mol/mol). Los niveles de atrapamiento aumentaron desde el 45% hasta casi el 60% en etanol al 40% cuando el contenido de PEG-Cer aumentaba desde 2,5 a 10 mol%. El tamaño de los liposomas y la polidispersión de los liposomas disminuyó desde 131 \pm 40 nm a 100 \pm
26 nm.

TABLA 8

8

Ejemplo 8

El efecto perturbador del etanol sobre las membranas lipídicas se ha estudiado principalmente con una concentración baja de etanol (<15% v/v) en relación con los cambios en la hidratación del lípido, el orden de la cadena de acilo, la permeabilidad de la membrana ante iones pequeños y la inducción de la interdigitación de la cadena en los sistemas de DPPC (Slater y Huang, 1988; Barchfeld y Deamer, 1988; Schwichtenhovel y cols. 1992; Slater y cols., 1993; Barry y Gawrisch, 1994; Vied y cols., 1994; Lobbecke y Cevc, 1995; Komatsu y Okada, 1996; Holte y Gawrisch, 1997). Era lógico preguntarse si el atrapamiento de los liposomas se mantenía intacto ante concentraciones elevadas de etanol. En la figura 3A se refleja la liberación de calceína atrapada en concentraciones de autodesactivación en liposomas de DSPC/Col/PEG-CerC_{14}/DODAP en función de la concentración de etanol (círculos negros) junto a las eficiencias de encapsulación obtenidas usando los liposomas de la misma composición lipídica (círculos blancos). Tanto los experimentos de encapsulación como los de pérdida se realizaron a 40ºC. La pérdida de calceína, una molécula pequeña con un PM de 623, comienza con una concentración de etanol \geq30% y alcanza el máximo en torno a un 40% de etanol. El atrapamiento de los oligonucleótidos muestra una dependencia similar al etanol, lo que indica que el atrapamiento se correlaciona fuertemente con la desestabilización de la barrera de permeabilidad de la membrana liposomal. Al contrario de lo que sucede con la calceína, la liberación de FITC-dextrano (PM 19500) fue menor del 10% en etanol al 40%. Esto demuestra que la pérdida de la barrera de permeabilidad depende del PM, tal como también se ha descrito para detergentes como el octilglucósido (Almog y cols., 1990). Los liposomas mantenían su morfología en presencia de etanol al 40%. El estudio con el microscopio con contraste de fase de los liposomas gigantes en etanol al 40% también reveló las estructuras intactas de los liposomas.

Los lípidos también pueden intercambiarse rápidamente entre los liposomas y entre las monocapas internas y externas de las bicapas de lípidos que comprenden los liposomas. Como se demuestra en la figura 3B, la mezcla de los lípidos tal como se detecta mediante la determinación de NBD-PE/LRh-PE FRET es eficazmente inmediata en etanol al 40%. No se observó ningún aumento del tamaño de las vesículas, lo que indica que el mezclado de los lípidos surge de un intercambio rápido de lípidos entre los liposomas y no por la fusión de los liposomas. Los resultados que se muestran en la figura 3B también demuestran que los lípidos pueden migrar rápidamente (inversión) de un lado de la bicapa de lípidos de los liposomas al otro, como se demuestra por la pérdida de fluorescencia del NBD-PS situado en la monocapa externa de lípidos tras la reducción química con ditionito sódico.

Ejemplo 9

El incremento de la turbidez durante la encapsulación indica que el atrapamiento está precedido por un paso inicial de agregación (formación de microagregados). El paso de agregación y el atrapamiento pueden desacoplarse a temperaturas bajas. Las muestras se vuelven turbias al añadir los oligonucleótidos o poco después y la turbidez aumenta con el tiempo. En ausencia de etanol sólo hay un ligero incremento de la turbidez después de lo cual la transmisión de la luz se mantiene constante. Al contrario de lo que sucede con las muestras preparadas a 40ºC, las muestras incubadas a 4ºC se vuelven traslúcidas de nuevo cuando se elimina el etanol y los liposomas no atrapan oligonucleótidos. Las eficiencias de atrapamiento se dibujan en función de la temperatura en la figura 4 junto a los datos sobre la pérdida de calceína. Los datos de la pérdida se presentan como las concentraciones de etanol necesarias para inducir una liberación de calceína del 50%. De nuevo, existe una correlación cualitativa entre la desestabilización de la membrana liposomal y la eficiencia del atrapamiento.

Ejemplo 10

Para determinar el atrapamiento de los oligonucleótidos se puede usar la ^{31}P RM. En las figuras 5A y 5B se muestra el espectro de ^{31}PRM de c-myc en solución (Fig. 5A) y atrapados en liposomas de DODAP/DSPC/Col/ PEG-CerC_{14} (Fig. 5B). Inicialmente, los liposomas mostraron un gradiente de pH de transmembrana, en el que el pH interno es de 4 y el pH externo es de pH 7,5. En estas circunstancias, los oligonucleótidos atrapados se asocian con fuerza a la membrana de los liposomas con carga positiva. Esta inmovilización da lugar a la desaparición (ensanchamiento) de la señal de RM (Fig. 5B). Al disiparse el gradiente de pH mediante la adición de acetato amónico y el ajuste del pH externo a 7,5, el DODAP se desprotona y los oligonucleótidos se disocian de la membrana de los liposomas. Este resultado se demuestra por la recuperación de la señal de RM en la figura 5C. No obstante, la recuperación es incompleta, aproximadamente del 50% de la señal inicial. La atenuación de la señal no se debe a la saturación de la resonancia en la RM. Se puede atribuir a dos posibilidades: o bien la cantidad de antisentido encapsulado es mayor a su solubilidad, con lo que una porción del mismo precipita, o bien la movilidad de las moléculas de antisentido está limitada en el espacio, por ejemplo mediante la inmovilización entre dos bicapas estrechamente juntas (ver la Fig. 3A). Para confirmar que los oligonucleótidos estaban encapsulados y localizados en el interior acuoso de los liposomas, se añadió MnSO4 5 mM a la solución externa (Fig. 5D). Mn^{2+} es un agente que ensancha la línea paramagnética impermeable a la membrana y que desactiva las señales de todos los grupos fosfato accesibles, los fosfolípidos y también los oligonucleótidos. No obstante, la señal de los oligonucleótidos no se afecta y desapareció sólo tras la solubilización de los liposomas con OGP (Fig. 5E). La señal completa de los oligonucleótidos se recupera cuando los liposomas iniciales (Fig. 5B) se solubilizan con el OGP en ausencia de Mn^{2+} (Fig. 5F). Estos datos demuestran claramente que los oligonucleótidos quedan atrapados en los liposomas y no simplemente asociados a la membrana externa. También habría que mencionar que los oligonucleótidos atrapados no quedaban accesibles al colorante de unión a oligonucleótidos OliGreen.

En los estudios de RM se describe la interacción entre oligonucleótidos y liposomas, como se ve desde la perspectiva de los oligonucleótidos. Los cambios de la dinámica de los lípidos y la organización de la membrana se pueden demostrar con los lípidos marcados con pireno (Duportail y Lianos, 1996). Los lípidos marcados con pireno forman dímeros en estado excitado en concentraciones altas cuya fluorescencia en una longitud de onda es distinta de la de los monómeros. La formación de excímero es un proceso controlado por la difusión y requiere que dos moléculas se unan para formar un dímero. La unión de los oligonucleótidos da lugar a una reducción espectacular de la movilidad lateral de todas las clases de lípidos en relación con los liposomas de control, que no contienen oligonucleótidos. La membrana se comprime lateralmente, como consecuencia del descenso observado de la fluorescencia del excímero en el pireno-HPC. La depleción del gradiente de pH de transmembrana da lugar al incremento de la fluorescencia del excímero y restaura la movilidad de los lípidos.

Ejemplo 11

Tanto el tamaño de los liposomas que atrapan los antisentido como la eficiencia de atrapamiento dependen de la relación inicial entre antisentido-lípidos. En la figura 6 se muestra que los oligonucleótidos pueden quedar atrapados eficientemente con relaciones altas entre antisentido-lípidos. La eficiencia de atrapamiento se dibuja en función de la relación inicial entre oligonucleótidos-lípidos. El nivel de unión con el atrapamiento máximo es de 0,16 mg de oligonucleótidos por mg de lípido (0,024 mol/mol), lo que corresponde a aproximadamente 2250 moléculas de oligonucleótidos por 100 nm de liposomas y demuestra la alta eficiencia de este procedimiento de atrapamiento. Las eficiencias de atrapamiento son aproximadamente 3 órdenes de magnitud mayores que las obtenidas mediante la encapsulación pasiva.

Cuando se aumentó la relación oligonucleótidos-lípidos aumentó ligeramente el tamaño y también la polidispersión de las muestras, desde 70 \pm 10 nm para los liposomas solos hasta 110 \pm 30 para una relación inicial en peso de ODN-lípidos de 0,2. El microscopio electrónico con fractura por congelación demostró el incremento del número de liposomas mayores cuando aumentaba la relación inicial entre oligonucleótidos-lípidos. Al margen, hay que mencionar que la dispersión inicialmente traslúcida de los liposomas se va convirtiendo en turbia a medida que va aumentando la relación antisentido-lípidos.

Ejemplo 12

Sería de esperar que el recubrimiento con PEG inhibiera la formación de las membranas opuestas muy cercanas, como se observa en las estructuras lamelares mediante TEM. Por tanto, se examinó el destino de PEG-Cer utilizando PEG-CerC_{14} marcado radiactivamente. Los oligonucleótidos antisentido se encapsularon en liposomas que contenían cantidades mínimas de [^{3}H]-PEG-CerC_{14} además de un 10 mol% de PEG-CerC_{14} no marcado y [^{14}C]-colesterol hexadeciléter (CHE) como marcador de colesterol con una relación [^{3}H]/[^{14}C] de 5,9. Esta relación representa una relación aparente de PEG-Cer/col y se usará en lugar de la relación molar PEG-Cer/col. La relación de peso inicial antisentido-lípidos fue de 0,29. El atrapamiento dio lugar a una relación final entre antisentido-lípidos de 0,16. Las micelas libres de PEG-Cer y PEG se separaron de los liposomas mediante ultracentrifugación usando un gradiente escalonado en sacarosa (1%, 2,5%, 10%, 15% (p/v) de sacarosa en HBS). La banda de liposomas vacíos en la interfase entre el 2,5% y el 10% de sacarosa, con una relación aparente PEG-Cer/col de 5,5. Esta banda representa aproximadamente el 80% de los lípidos totales. Los liposomas que contienen antisentido muestran una banda débil en la misma localización, que se corresponde a menos del 9% de los lípidos totales. No obstante, la mayoría de los antisentido liposomales migran hacia abajo, hacia la capa de sacarosa del 15% o forman pellets en la parte inferior. En la Tabla 9 se presenta un análisis completo de las fracciones que contienen liposomas en este gradiente. Los resultados son representativos de las muestras preparadas en relaciones oligonucleótidos-lípidos altas. También puede verse que las relaciones PEG-Cer/col van disminuyendo progresivamente hacia la parte inferior del gradiente. Se pierde más del 50% de PEG-Cer de la fracción inferior en relación con los liposomas iniciales (relación aparente PEG-Cer/col de 5,5). La relación DSPC/Col no cambia. El 27% del PEG-Cer se pueden encontrar en las fracciones superiores junto al 6,6% de colesterol. Se encontró aproximadamente la misma cantidad de PEG-Cer no asociado a liposomas en los liposomas de control vacíos.

Un análisis más detallado de las fracciones del gradiente obtenido anteriormente demuestra que los liposomas que contienen antisentido muestran grandes diferencias en su contenido de antisentido y en su tamaño (Tabla 9). Las relaciones entre oligonucleótidos-lípidos y también el tamaño medio aumentan desde arriba hacia abajo. Se pueden identificar tres poblaciones principales como bandas diferenciadas (Tabla 10). Sus proporciones relativas dependían de la relación inicial entre oligonucleótidos-lípidos (Tabla 10). En primer lugar, los liposomas que atrapan los antisentido con una relación baja ODN/lípidos (0,03-0,05). En segundo lugar, los liposomas que tienen una relación ODN/lípidos de 0,14-0,15 y, por último, los liposomas que tienen unas relaciones ODN/lípidos muy altas (0,29 mg/mg). Esta última población desciende a favor de las dos primeras, con un descenso de la relación inicial ODN/l. Es óptimamente turbia, mientras que las otras dos son translúcidas. Se intentó correlacionar las diferencias observadas en el atrapamiento y el tamaño de la heterogeneidad morfológica observada en la crio-TEM. Los antisentidos se quedaron atrapados con una relación inicial alta entre oligonucleótidos-lípidos (0,28 mg/mg) y las dos fracciones principales que correspondían a las fracciones 15 y 17 de la Tabla 10 se observaron mediante crio-TEM después de la extracción de la sacarosa mediante diálisis. La fracción superior consiste exclusivamente en liposomas bilamelares, muchos de los cuales muestran bulbos, mientras que la fracción inferior contenía una mezcla de liposomas bi y multilamelares.

TABLA 9

9

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TABLA 10

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10

Ejemplo 13

La adición de oligonucleótidos a liposomas catiónicos en presencia de etanol puede dar lugar a la formación de un dominio. La formación de los liposomas multilamelares que se encuentra debe estar precedida por la adhesión de los liposomas. No obstante, la presencia de PEG-Cer 10 mol% inhibe completamente la adhesión en ausencia de etanol. En presencia de etanol hay dos efectos que podrían contribuir a la adhesión de los liposomas: en primer lugar, el incremento de la cantidad de PEG-Cer no incorporado a la membrana mediante un intercambio rápido de lípidos y en segundo lugar, la formación de pequeños dominios con depleción de PEG-Cer y enriquecidos en oligonucleótidos antisentido. Se investigó esta última posibilidad. El efecto de la unión de los oligonucleótidos se visualizó mediante el microscopio con contraste de fase y fluorescencia usando liposomas gigantes de DSPC/Col/DODAV/VEG-CerC_{14} junto con oligonucleótidos marcados con FITC. La mayoría de los liposomas observados eran multilamelares y mostraban una estructura interna. En ausencia de etanol los liposomas gigantes se desintegraban en agregados de forma irregular y en liposomas más pequeños tras la adición del antisentido. La fluorescencia verde del FITC reveló la localización de los oligonucleótidos. En presencia de un 40% de etanol se observa un cuadro completamente diferente. Los liposomas inicialmente redondeados adoptan una forma de pera 5-10 min después de añadir los oligonucleótidos, situándose éstos en un semicírculo en uno de los lados de estas estructuras. Las membranas interiores se exprimen hacia el exterior de esta herradura, que se desprende y colapsa, en particular cuando se aumenta la temperatura, en una estructura compacta ligeramente irregular que aparece completamente verde en la fluorescencia. La segregación de los oligonucleótidos indica que el etanol es capaz de estimular la formación de un dominio.

Ejemplo 14

El procedimiento de encapsulación de la invención no depende de una composición de oligonucleótidos y lípidos en particular, ni está limitado por concentraciones elevadas de citrato utilizadas. La encapsulación es más eficiente en un tampón citrato 50 mM y disminuye con concentraciones más altas o más bajas de citrato. El tamaño y la polidispersión aumentan considerablemente con concentraciones de citrato por debajo de 25 mM. En la figura 7 se muestra que otros oligonucleótidos distintos de c-myc (Nº de ID de la Sec. 1) y también el ADN de plásmido pueden quedar eficientemente atrapados en liposomas de DSPC/Col/DODAV/VEG-CerC_{14}. La relación inicial en peso de nucleótidos-lípidos fue de 0,1 mg/mg y se usó tampón citrato 300 mM para el atrapamiento de los oligonucleótidos. El atrapamiento del ADNp se realizó en tampón citrato 50 mM con una relación en peso de ADNp-lípidos de 0,03. A diferencia de los oligonucleótidos antisentido fosforotioato, las moléculas que contienen fosfodiéster no se pueden encapsular con tampones de fuerzas iónicas altas como tampón citrato 300 mM. Es probable que este resultado refleje diferencias en las afinidades de unión (Semple y cols., 2000). Al contrario de la encapsulación eficiente de moléculas grandes, se pudo atrapar menos del 10% de ATP en los liposomas de DSPC/Col/DODAP/ PEG-CerC_{14} con una relación inicial de ATP-lípidos de 0,2 mg/mg. El atrapamiento de ATP se realizó con tampón citrato 50 mM. En la Tabla 5 se muestra que el procedimiento de atrapamiento se puede extender a otras composiciones lipídicas incluidos los sistemas DOPE. Los resultados preliminares con liposomas con carga negativa y con polielectrolitos con carga positiva, incluidas las polilisinas, demuestran que el atrapamiento es una característica general de la interacción de los polielectrolitos con liposomas de cargas opuestas en etanol.

Ejemplo 15

Se usó octilglucósido (OGP) en lugar de etanol. El detergente se añadió a los liposomas (1:1 v/v) hasta unas concentraciones finales que varían desde 30-40 mM. Todos los pasos posteriores se realizaron como se describe en el Ejemplo 5 excepto que el paso inicial de diálisis frente a un tampón citrato de pH 4 se prolongó hasta 5 h. Se demostró que los oligonucleótidos quedaban protegidos por el OliGreen añadido externamente, un colorante fluorescente que se une a los oligos. La relación inicial oligonucleótidos-lípidos fue de 0,23 (mg/mg). Los tamaños representan tamaños medios. DSPC/Col/DODAV/VEG-CerC_{14} (20/45/25/10 mol%). Las concentraciones observadas de encapsulación y el tamaño final de las partículas se resumen en la Tabla 11.

TABLA 11

11

Claims (12)

1. Un método para preparar las partículas del producto terapéutico totalmente encapsuladas en lípidos de un producto terapéutico con carga que comprende los pasos de

combinar una composición lipídica que comprende vesículas preformadas de lípido, un producto terapéutico con carga y un agente desestabilizante para formar una mezcla de vesículas preformadas y producto terapéutico en un disolvente de desestabilización, en el cual dicho disolvente de desestabilización es eficaz para desestabilizar la membrana de las vesículas preformadas de lípido sin romper las vesículas,

incubar la mezcla durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la encapsulación del producto terapéutico en el interior de las vesículas preformadas de lípido, y

eliminar el agente desestabilizante,

en el cual las vesículas preformadas de lípido comprenden un lípido cargado que tiene una carga que es opuesta a la carga del producto terapéutico con carga y un lípido modificado que tiene una estructura de barrera estérica para el control de la agregación, y en el cual el lípido modificado está presente en las vesículas preformadas en una cantidad eficaz para retardar, pero no prevenir, la agregación de las vesículas preformadas.

2. El método de la reivindicación 1, en el cual el lípido cargado en las vesículas preformadas de lípido comprende un lípido catiónico y el producto terapéutico es un producto terapéutico aniónico.

3. El método de la reivindicación 2, en el cual el producto terapéutico es un polinucleótido.

4. El método de la reivindicación 2 ó 3, en el cual el lípido catiónico se selecciona entre el grupo formado por

cloruro de dioleil-N,N-dimetilamónico ("DODAC");

cloruro de N-(2,3-dioleiloxi) propil)-N,N,N-trimetilamónico ("DOTMA");

bromuro de N,N-distearil-N,N-dimetilamónico ("DDAB"); cloruro de N-(2,3-dioleiloxi) propil)-N,N,N-trimetilamónico ("DOTAP");

3\beta-(N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil) colesterol ("DC-Col");

bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hydroxietil amónico ("DMRIE");

liposomas catiónicos que comprenden DOTMA y 1,2-dioleoil-sn-3-fosfoetanolamina ("DOPE");

liposomas catiónicos que comprenden trifluoroacetato de N-(1-(2,3-dioleiloxi) propil)-N-(2-(esperminecarboxa-
mido) etil)-N,N-dimetilamónico ("DOSPA") y DOPE;

lípidos catiónicos que comprenden dioctadecilamidoglicil carboxiesperminea ("DOGS") en etanol;

cloruro de N-(2,3-dioleiloxi) propil)-N,N-dimetilamónico ("DODMA") y

1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano ("DODAP").

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el cual la composición lipídica comprende 10 a 40 mol% del lípido cargado, 25 a 40 mol% de un lípido neutro; 35 a 55 mol% de un esterol, y 2,5 a 10 mol% del lípido modificado.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el cual el agente desestabilizante es etanol.

7. El método de la reivindicación 6, en el cual el etanol está presente en el disolvente de desestabilización en una concentración del 25%-40%.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el cual el agente desestabilizante es un detergente.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual el disolvente de desestabilización comprende además tampón citrato 25 - 300 mM.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el cual la mezcla se incuba a una temperatura de aproximadamente 40ºC.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el cual el lípido modificado es PEG-CerC_{14}.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el cual las vesículas preformadas de lípido comprende:

un lípido catiónico,

un lípido neutro seleccionado entre el grupo formado por DOPE y DSPC;

el lípido modificado, y

colesterol.