ES3062897T3 - Compositions and methods of treating muscle dystrophy - Google Patents

Compositions and methods of treating muscle dystrophy

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ES3062897T3
ES3062897T3 ES21777033T ES21777033T ES3062897T3 ES 3062897 T3 ES3062897 T3 ES 3062897T3 ES 21777033 T ES21777033 T ES 21777033T ES 21777033 T ES21777033 T ES 21777033T ES 3062897 T3 ES3062897 T3 ES 3062897T3
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Venkata Ramana Doppalapudi
Michael Hood
Rob Burke
Michael Cochran
Beatrice Darimont
Yunyu Shi
Gulin Marelius
Barbora Malecova
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Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Composiciones y métodos para tratar la distrofia muscular
[0003] Referencia cruzada
[0004] La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos n.º 63/001.211, presentada el 27 de marzo de 2020.
[0005] Antecedentes de la divulgación
[0006] La supresión de genes mediante silenciamiento génico inducido por ARN proporciona varios niveles de control: inactivación de la transcripción, degradación del ARNm inducida por ARN de interferencia pequeño (ARNip) y atenuación transcripcional inducida por ARNip. En algunos casos, el ARN de interferencia (ARNi) proporciona un efecto duradero a lo largo de múltiples divisiones celulares. Como tal, el ARNi representa un método viable útil para la validación de dianas farmacológicas, análisis de la función génica, análisis de vías y terapéutica de enfermedades. El documento US2019/0298847A1 describe moléculas de ácido polinucleico para el tratamiento de la atrofia muscular o distrofia miotónica. El documento WO2020/028861A1 describe complejos que comprenden un agente dirigido al músculo unido covalentemente a una carga útil molecular, que supuestamente inhibe la expresión o la actividad de un alelo DMPK. Sugo at al (J Controlled Release 237 (2016) 1-13) describen el desarrollo de conjugados anticuerpo-ARNip dirigidos a músculos cardíacos y esqueléticos.
[0007] Sumario de la divulgación
[0008] En un aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido polinucleico conjugada como se define en las reivindicaciones. En otro aspecto, la invención también proporciona una composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones. En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido polinucleico de la invención para su uso en un método de tratamiento de la distrofia muscular en un sujeto, como se define en las reivindicaciones. En consecuencia, la materia objeto para la que se solicita protección es como se define mediante las reivindicaciones. Cualquier referencia a un "aspecto", "caso", "divulgación" o "realización" que no entre en el ámbito de las reivindicaciones se presenta únicamente a efectos explicativos y no forma parte de la invención.
[0009] Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía o métodos de diagnóstico in vivo divulgados en el presente documento deben interpretarse como referencias a compuestos de la presente invención para su uso en esos métodos.
[0010] En el presente documento se divulgan moléculas de ácido polinucleico y composiciones farmacéuticas para modular un gen asociado con distrofia muscular (por ejemplo, DM1). En algunas realizaciones, también se describen en el presente documento métodos para tratar la atrofia muscular con una molécula de ácido polinucleico o un conjugado de molécula de ácido polinucleico divulgado en el presente documento.
[0011] En el presente documento se divulga un conjugado de molécula de ácido polinucleico que comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK. El conjugado de moléculas de ácido polinucleico participa en la interferencia de ARN contra DMPK.
[0012] En algunas realizaciones, el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 EINPIX<1>GRSNYAX<2>KFQG, en donde X<1>se selecciona entre N o Q y X<2>se selecciona entre Q o E; y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, la región VH comprende la secuencia HDCR1 que comprende SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende una de SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, la región VL comprende la secuencia LCDR1 RTSENIYX<3>NLA, la secuencia LCDR2 AX<4>TNLAX<5>, y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX6, en donde X<3>se selecciona entre N o S, X<4>se selecciona entre A o G, X<5>se selecciona entre D o E, y X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F. En algunas realizaciones, la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 AATNLAX5 y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX<6>, en donde X<5>se selecciona entre D o E, y X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F. En algunas realizaciones, la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22 o SEQ ID NO: 27, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 28, y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, la región VH comprende la secuencia HDCR1 que comprende SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:18 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:23 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, la región VH comprende la secuencia HDCR1 que comprende SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:23 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, la región VH comprende la secuencia HDCR1 que comprende SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:21 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:25 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, la región VH comprende la secuencia HDCR1 que comprende SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 27, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:28 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, la región VH comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 29-33. En algunas realizaciones, la región VL comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 34-38. En algunas realizaciones, la región VH comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 30 y en donde la VL comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 34.
[0013] En algunas realizaciones, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende un IgG-scFv, nanocuerpo, BiTE, diacuerpo, DART, TandAb, scdiacuerpo, scDiacuerpo-CH3, triple cuerpo, mini-anticuerpo, minicuerpo, minicuerpo TriBi, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv-Fc KIH, FabscFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab')2-scFv2. scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, HCAb tetravalente, scdiacuerpo-Fc, diacuerpo-Fc, scFv-Fc en tándem o intracuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una estructura IgG1. Como alternativa, en algunas realizaciones, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una estructura IgG2. En algunos casos, la estructura IgG2 es la estructura IgG2b. Como alternativa, en algunas realizaciones, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una estructura IgG4.
[0015] En algunas realizaciones, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende además al menos una mutación en la región Fc. En algunas realizaciones, la al menos una mutación modula la función efectora o atenúa o elimina la unión al receptor Fc-γ. En algunas realizaciones, la al menos una mutación se encuentra en la posición del resto D265, N297, K322, L328 o P329, en donde la posición del resto se refiere a IgG1. En algunas realizaciones, la región Fc comprende dos o más, tres o más o cuatro o más mutaciones. En algunas realizaciones, la región Fc comprende mutaciones en L233 y L234, en donde los restos corresponden a las posiciones 233 y 234 de SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, la región Fc comprende mutaciones en D265 y N297. En algunas realizaciones, la región Fc comprende mutaciones en D265 y N297. En algunas realizaciones, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una secuencia de cadena pesada (HC) seleccionada entre las SEQ ID NO: 39-62 y una secuencia de cadena ligera (LC) seleccionada entre las SEQ ID NO: 63-66. En algunas realizaciones, el anticuerpo contra el receptor de transferrina se une específicamente al receptor de transferrina humano (TfR).
[0017] En algunas realizaciones, la cadena sentido y la cadena antisentido comprenden cada una independientemente al menos un nucleótido modificado en 2', al menos un enlace internucleotídico modificado o al menos una fracción abásica invertida. En algunas realizaciones, la cadena sentido comprende un nucleótido modificado 2'-O-metil en el extremo 5'. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena sentido comprende al menos dos nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 5'. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena de sentido comprende al menos tres, cuatro, cinco o seis nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 5'. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena sentido comprende seis nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 5'. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena sentido comprende al menos un nucleótido modificado con 2'-F. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena sentido comprende al menos dos, al menos tres nucleótidos modificados con 2'-F. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena sentido comprende al menos dos, al menos tres nucleótidos consecutivos modificados con 2'-F. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena sentido comprende un nucleótido modificado 2'-O-metil en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena sentido comprende al menos dos nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena de sentido comprende al menos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena sentido comprende diez nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena sentido comprende al menos dos enlaces internucleotídicos fosforotioato. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena sentido tiene una secuencia de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15.
[0018] En algunos casos, una cadena antisentido comprende un nucleótido modificado con 2'-O-metilo en el extremo 5'. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena antisentido comprende un nucleótido modificado con 2'-O-metilo en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena antisentido comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena antisentido comprende cinco nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena antisentido comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro nucleótidos modificados con 2'-F. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena antisentido comprende cuatro nucleótidos modificados con 2'-F, en donde dos cualesquiera de los cuatro nucleótidos modificados con 2'-F no son consecutivos. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena antisentido comprende dos nucleótidos salientes en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena antisentido comprende al menos dos, al menos tres enlaces internucleotídicos fosforotioato. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena antisentido tiene una secuencia de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. Como se define en las reivindicaciones, la cadena antisentido comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 4.
[0019] En algunas realizaciones, el conjugado de molécula de ácido polinucleico comprende un enlazador que conecta el anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo a la molécula de ácido polinucleico. En algunas realizaciones, el enlazador es el enlazador C6. En algunas realizaciones, el enlazador C6 es un enlazador 6-amino-1-hexanol. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador homobifuncional o un enlazador heterobifuncional, un grupo maleimida, una fracción dipeptídica, un grupo ácido benzoico o su derivado. En algunas realizaciones, el enlazador comprende 4-(N-maleimidometil)ciclohexano -1-amidato (SMCC). En algunas realizaciones, el enlazador se acopla al extremo 5' de la cadena sentido. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico se conjuga con un resto de cisteína del anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el resto de cisteína se encuentra en el dominio Fc del anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, una proporción entre la molécula de ácido polinucleico y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo es de aproximadamente 1:1, 2:1, 3:1, o 4:1.
[0021] En algunas realizaciones, la fracción de ácido polinucleico participa en la interferencia de ARN contra el gen DMPK humano que modula la atrofia muscular en un sujeto. En algunas realizaciones, la interferencia de ARN comprende la reducción de la expresión del transcrito de ARNm del gen DMPK en al menos un 50 %, al menos un 60 % o al menos un 70 % en comparación con una cantidad del transcrito de ARNm del gen DMPK en una célula afectada por una distrofia muscular. En algunas realizaciones, la distrofia muscular es distrofia miotónica de tipo 1 (DM1).
[0023] En el presente documento se divulga un conjugado de molécula de ácido polinucleico que comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK. La molécula de ácido polinucleico puede tener una cadena sentido que tenga una secuencia de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, o 15 y una cadena antisentido que tenga una secuencia de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, o 16, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende la SEQ ID NO: 23 y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo y la molécula de ácido polinucleico se conjuga mediante un enlazador que comprende 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-amidato (SMCC).
[0025] En el presente documento se divulga un conjugado de molécula de ácido polinucleico que comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK. La molécula de ácido polinucleico puede tener una cadena sentido que tenga una secuencia de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, o 15 y una cadena antisentido que tenga una secuencia de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, o 16, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región VH comprende al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 30 y en donde la VL comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 34, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo y la molécula de ácido polinucleico se conjuga mediante un enlazador maleimida.
[0027] En el presente documento se divulga un conjugado de molécula de ácido polinucleico que comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK. La molécula de ácido polinucleico puede tener una cadena sentido que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 y una cadena antisentido que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2, la cadena de sentido comprende al menos tres, cuatro, cinco o seis nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 5' y al menos dos, al menos tres nucleótidos modificados con 2'-F, el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región VH comprende al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 30 y en donde la VL comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 34, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo y la molécula de ácido polinucleico se conjuga mediante un enlazador maleimida.
[0029] En el presente documento se divulga un conjugado de molécula de ácido polinucleico que comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK. La molécula de ácido polinucleico puede tener una cadena sentido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1 y una cadena antisentido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 2, y la cadena antisentido comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3', y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro nucleótidos modificados con 2'-F y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende la SEQ ID NO: 23 y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo y la molécula de ácido polinucleico se conjuga mediante un enlazador de maleimida.
[0030] En el presente documento se divulga un conjugado de molécula de ácido polinucleico que comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK. La molécula de ácido polinucleico puede tener una cadena sentido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1 y una cadena antisentido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 2 y la cadena antisentido comprende nucleótidos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 5' y en el extremo 3', y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:18 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende la SEQ ID NO: 23 y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo y la molécula de ácido polinucleico se conjuga mediante un enlazador de maleimida.
[0032] En el presente documento se divulga un conjugado de molécula de ácido polinucleico que comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK. La molécula de ácido polinucleico puede tener una cadena sentido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1 y una cadena antisentido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 2, y la cadena antisentido comprende al menos cinco nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3' y cuatro nucleótidos modificados con 2'-F, en donde dos cualesquiera de los cuatro nucleótidos modificados con 2'-F no son consecutivos y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) y la región VH comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 30 y en donde la VL comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 34, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo y la molécula de ácido polinucleico se conjuga mediante un enlazador 6-amino-1-hexanol.
[0034] En el presente documento se divulga un conjugado de molécula de ácido polinucleico que comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK. La molécula de ácido polinucleico puede tener una cadena sentido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1 y una cadena antisentido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 2, y la cadena antisentido comprende al menos cinco nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3' y cuatro nucleótidos modificados con 2'-F, en donde dos cualesquiera de los cuatro nucleótidos modificados con 2'-F no son consecutivos y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) y la región VH comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 30 y en donde la VL comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 34, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo y la molécula de ácido polinucleico se conjuga mediante un enlazador 6-amino-1-hexanol.
[0036] En el presente documento se divulga, en determinadas realizaciones, es una composición farmacéutica que comprende un conjugado de molécula de ácido polinucleico tal como se describe en el presente documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula como una formulación de nanopartículas. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración parenteral. oral, intranasal, bucal, rectal o transdérmica.
[0038] En el presente documento se divulga, en determinadas realizaciones, un método para tratar la distrofia muscular en un sujeto que lo necesita, proporcionando un conjugado de ácido polinucleico o composiciones farmacéuticas como se describen en el presente documento y administrando el conjugado de ácido polinucleico al sujeto que lo necesita para tratar la distrofia muscular, en donde el conjugado de ácido polinucleico reduce una cantidad del transcrito de ARNm de la DMPK humana. En algunas realizaciones, la fracción de ácido polinucleico participa en la interferencia de ARN contra DMPK humana y modula la atrofia muscular en un sujeto. En algunas realizaciones, la distrofia muscular es distrofia miotónica de tipo 1 (DM1).
[0040] En el presente documento se divulga, en determinadas realizaciones, el uso de un conjugado de ácido polinucleico o de composiciones farmacéuticas como se describen en el presente documento para tratar en un sujeto diagnosticado o sospechoso de sufrir distrofia miotónica tipo 1 (DM1) o para fabricar un medicamento para tratar en un sujeto diagnosticado o sospechoso de sufrir distrofia miotónica tipo 1 (DM1). En el presente documento se divulga un kit que comprende un conjugado de ácido polinucleico o composiciones farmacéuticas como se describen en el presente documento.
[0041] Breve descripción de los dibujos
[0042] Diversos aspectos de la divulgación se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente divulgación haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la divulgación y los siguientes dibujos adjuntos. El archivo de solicitud de patente contiene al menos un dibujo realizado a color. La Oficina proporcionará copias de publicación de solicitud de patente con dibujo(s) a color previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.
[0043] La FIG. 1 ilustra un esquema del conjugado anticuerpo-ARNip.
[0044] La FIG. 2 ilustra una estructura esquemática de ARNip de DMPK.
[0045] La FIG. 3 ilustra un gráfico de la unión de TfR2 a anticuerpos anti-TfR mediante ELISA.
[0046] La FIG. 4 ilustra gráficos de la unión de anticuerpos anti-TfR a TfR1 en presencia de cofactores.
[0047] La FIG.5 ilustra gráficos de respuesta a la dosis in vivo de la eliminación de DMPK mediada por AOC en músculos esqueléticos de ratón.
[0048] La FIG. 6 ilustra gráficos del curso de tiempo de la eliminación de DMPK mediada por AOC en tejidos de ratón (izquierda) y la concentración de siDMPK.36 en tejidos de ratón en el tiempo (derecha).
[0049] La FIG. 7 ilustra un gráfico que muestra la eliminación de DMPK mediada por AOC en músculos esqueléticos de mono Cynomolgus en un curso de tiempo de hasta 12 semanas tras la dosis.
[0050] Descripción detallada de la divulgación
[0051] DM1 es un raro trastorno de expansión de repeticiones monogénico, autosómico dominante que afecta aproximadamente a 1 de cada 8.000 personas en EE.UU. según la constatación clínica. No obstante, un reciente estudio de base genética estimó la prevalencia de la DM1 en EE.UU. en 1 de cada 2.532 individuos. La DM1 está causada por una expansión del triplete repetido CTG que se encuentra en la región no codificante 3' del gen de la proteína cinasa de la distrofia miotónica (DMPK). La expansión oscila de <35 en sujetos sanos a muchos miles en pacientes con DM1. Cuando el gen mutante de DMPK se traduce en ARNm, las repeticiones CUG autocomplementarias inducen la formación de grandes bucles en horquilla y atrapan el ARNm de la DMPK en el núcleo, confiriendo una ganancia de función tóxico. La toxicidad no se debe a la traducción del ARNm en una proteína tóxica, sino más bien a la presencia de altas concentraciones de repeticiones de CUG en el núcleo, que actúan como una trampa para una proteína que se une CUG crítica, proteína muscle blindlike 1 (MBNL1). A través de su unión a las repeticiones de CUG de DMPK retenidas en el núcleo, la MBNL1 queda secuestrada en el núcleo y es incapaz de realizar su función normal de guiar el procesamiento del ARNm. Como resultado, múltiples ARNm que codifican proteínas clave se procesan mal. Las proteínas atípicas resultantes se traducen a partir de estos ARNm mal empalmados, son la causa última de los cambios fenotípicos característicos de la enfermedad.
[0052] La terapia con ácidos nucleicos (por ejemplo, ARNi) es una terapia dirigida con alta selectividad y especificidad. No obstante, en algunos casos, la terapia con ácidos nucleicos también se ve dificultada por su escasa captación intracelular, estabilidad en sangre limitada y estimulación inmunitaria inespecífica. Para abordar estos problemas, se exploran diversas modificaciones de la composición de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, nuevos enlazadores para una mejor estabilización y/o menor toxicidad, optimización de la fracción de unión para aumentar la especificidad de la diana y/o la liberación de la diana, y modificaciones del polímero de ácido nuclei
[0053] y/o reducir el efecto fuera de diana.
[0054] En algunas realizaciones, la disposición o el orden de los distintos componentes de la composición de ácido nucleico influye aún más en la absorción intracelular, la estabilidad, la toxicidad, y/o la estimulación inmunitaria inespecífica. Por ejemplo, si el componente de ácido nucleico incluye una fracción de unión, un polímero y una molécula de ácido polinucleico (o polinucleótido), el orden o la disposición de la fracción de unión, el polímero y/o la molécula de ácido polinucleico (o polinucleótido) (por ejemplo, fracción de unión-molécula de ácido polinucleico-polímero, fracción de unión-polímero-molécula de ácido polinucleico o polímero-fracción de unión-molécula de ácido polinucleico) efectúa además la absorción intracelular, la estabilidad, la toxicidad, y/o la estimulación inmunitaria inespecífica.
[0055] En algunas realizaciones, en el presente documento se describen moléculas de ácido polinucleico y conjugados de moléculas de ácido polinucleico para el tratamiento de la distrofia muscular. En algunos casos, los conjugados de moléculas de ácido polinucleico descritos en el presente documento mejoran la absorción intracelular, la estabilidad y/o la eficacia. En algunos casos, los conjugados de molécula de ácido polinucleico comprenden un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK. En algunos casos, los conjugados de moléculas de ácido polinucleico comprenden una molécula de Fórmula (I): A-X<1>-B.
[0056] Realizaciones adicionales descritas en el presente documento incluyen métodos para tratar la distrofia muscular, que comprenden administrar a un sujeto una molécula de ácido polinucleico o un conjugado de molécula de ácido polinucleico descrito en el presente documento.
[0057] Moléculas de ácido polinucleico
[0059] Una molécula de ácido polinucleico de acuerdo con la presente invención es capaz de hibridarse con una secuencia diana de un gen relacionado con la distrofia muscular. Preferentemente, entre los genes relacionados con la distrofia muscular, una molécula de ácido polinucleico descrita en el presente documento se hibrida con una secuencia diana del gen de la proteína cinasa de la distrofia miotónica (DMPK, también denominada DM, DM1, DM1PK, DMK, MDPK, MT-PK, Dm15, proteína cinasa de la distrofia miotónica, gen de la proteína cinasa DM1).
[0061] Un conjugado de molécula de ácido polinucleico de acuerdo con la invención reivindicada comprende una molécula de ácido polinucleico que se hibrida a una secuencia diana de DMPK, tiene una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena antisentido comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 4. Cualquier molécula de ácido polinucleico descrita en esta sección que no comprende estas características se divulga sólo como referencia.
[0063] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16.
[0065] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido. En algunos casos, el primer polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre la SEQ ID NO: 1. En algunos casos, el segundo polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre la SEQ ID NO: 2. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido. En algunos casos, el primer polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En algunos casos, el segundo polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16.
[0067] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido (por ejemplo, una cadena pasajero) y una cadena antisentido (por ejemplo, una cadena guía). En algunos casos, la cadena sentido (por ejemplo, la cadena pasajera) comprende una secuencia que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre la SEQ ID NO: 1. En algunos casos, la cadena antisentido (por ejemplo, la cadena guía) comprende una secuencia que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido (por ejemplo, una cadena pasajero) y una cadena antisentido (por ejemplo, una cadena guía). En algunos casos, la cadena sentido (por ejemplo, la cadena pasajera) comprende una secuencia que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15. En algunos casos, la cadena antisentido (por ejemplo, la cadena guía) comprende una secuencia que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16. La Tabla 1 presenta las secuencias de ácido nucleico y secuencias modificadas de las SEQ ID NO: 1-16.
[0068] TABLA 1
[0071]
[0074] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico descrita en el presente documento comprende ARN o ADN o PMO. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende ARN. En algunos casos, el ARN comprende ARN de interferencia corto (ARNic), ARN de horquilla corto (ARNhc), microARN (miARN), ARN monocatenario (ARNmc), ARN bicatenario (ARNbc), ARN de transferencia (ARNt), ARN ribosómico (ARNr) o ARN nuclear heterogéneo (ARNnh). En algunos casos, el ARN comprende ARNhp. En algunos casos, el ARN comprende miARN. En algunos casos, el ARN comprende el ARNbc. En algunos casos, el ARN comprende ARNt. En algunos casos, el ARN comprende ARNr. En algunos casos, el ARNh comprende ARNnh. En algunos casos, el ARN comprende ARNip. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende ARNip.
[0076] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico tiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 30, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, de aproximadamente 18 a aproximadamente 25, de aproximadamente 18 a aproximadamente 24, de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 o de aproximadamente 20 a aproximadamente 22 nucleótidos de longitud.
[0078] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 45 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 19 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 18 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 17 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 16 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 14 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 13 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 12 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 11 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 10 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene aproximadamente 8 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 45 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico tiene entre aproximadamente 12 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.
[0080] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende un primer polinucleótido. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende un segundo polinucleótido. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido. En algunos casos, el primer polinucleótido es una cadena sentido o cadena pasajera. En algunos casos, el segundo polinucleótido es una cadena antisentido o una cadena guía.
[0082] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico es un primer polinucleótido. En algunas realizaciones, el primer polinucleótido tiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer polinucleótido tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 30, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, de aproximadamente 18 a aproximadamente 25, de aproximadamente 18 a aproximadamente 24, de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 o de aproximadamente 20 a aproximadamente 22 nucleótidos de longitud.
[0084] En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 45 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 19 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 18 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 17 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 16 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 14 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 13 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 12 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 11 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 10 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene aproximadamente 8 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 45 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el primer polinucleótido tiene entre aproximadamente 12 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.
[0085] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico es un segundo polinucleótido. En algunas realizaciones, el segundo polinucleótido tiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el segundo polinucleótido tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 30, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, de aproximadamente 18 a aproximadamente 25, de aproximadamente 18 a aproximadamente 24, de aproximadamente 19 a aproximadamente 23 o de aproximadamente 20 a aproximadamente 22 nucleótidos de longitud.
[0087] En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 45 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 19 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 18 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 17 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 16 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 14 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 13 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 12 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 11 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 10 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene aproximadamente 8 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 45 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el segundo polinucleótido tiene entre aproximadamente 12 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud.
[0089] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende además un extremo romo, un saliente o una combinación de los mismos. En algunos casos, el extremo romo es un extremo romo en 5', un extremo romo en 3' o ambos. En algunos casos, el saliente es un saliente en 5', un saliente en 3' o ambos. En algunos casos, el saliente comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos sin apareamiento de bases. En algunos casos, el saliente comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos sin apareamiento de bases. En algunos casos, el saliente comprende 1, 2, 3, o 4 nucleótidos sin apareamiento de bases. En algunos casos, el saliente comprende 1 nucleótido sin apareamiento de bases. En algunos casos, el saliente comprende 2 nucleótidos sin apareamiento de bases. En algunos casos, el saliente comprende 3 nucleótidos sin apareamiento de bases. En algunos casos, el saliente comprende 4 nucleótidos sin apareamiento de bases. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido y la cadena antisentido incluye dos nucleótidos sin apareamiento de bases como un saliente en el extremo 3', mientras que la cadena sentido no tiene ningún saliente. Opcionalmente, en dichas realizaciones, los nucleótidos sin apareamiento de bases tienen una secuencia TT, dTdT o UU. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido tiene uno o más nucleótidos en el extremo 5' que son complementarios a la secuencia antisentido.
[0091] En algunas realizaciones, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico es de al menos el 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 99,5 % complementaria a una secuencia diana descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico es al menos un 50 % complementaria de una secuencia diana descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico es al menos un 60 % complementaria de una secuencia diana descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico es al menos un 70 % complementaria de una secuencia diana descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico es al menos un 80 % complementaria de una secuencia diana descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico es al menos un 90 % complementaria de una secuencia diana descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico es al menos un 95 % complementaria de una secuencia diana descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico es al menos un 99 % complementaria de una secuencia diana descrita en el presente documento. En algunos casos, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico es un 100 % complementaria de una secuencia diana descrita en el presente documento.
[0092] En algunas realizaciones, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico tiene 5 o menos apareamientos erróneos con una secuencia diana descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico tiene 4 o menos apareamientos erróneos con una secuencia diana descrita en el presente documento. En algunos casos, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico tiene 3 o menos apareamientos erróneos con una secuencia diana descrita en el presente documento. En algunos casos, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico tiene 2 o menos apareamientos erróneos con una secuencia diana descrita en el presente documento. En algunos casos, la secuencia de la molécula de ácido polinucleico tiene 1 o menos apareamientos erróneos con una secuencia diana descrita en el presente documento.
[0093] En algunas realizaciones, la especificidad de la molécula de ácido polinucleico que hibrida con una secuencia diana descrita en el presente documento tiene un 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % de complementariedad de secuencia de la molécula de ácido polinucleico con una secuencia diana. En algunos casos, la hibridación es una condición de hibridación muy estricta.
[0094] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico tiene un efecto fuera de la diana reducido. En algunos casos, "fuera de diana" o "efectos fuera de diana" se refieren a cualquier caso en el que un polímero de ácido polinucleico dirigido contra una diana determinada causa un efecto no deseado al interactuar directa o indirectamente con otra secuencia de ARNm, una secuencia de ADN o una proteína celular u otra fracción. En algunos casos, se produce un "efecto fuera del objetivo" cuando hay una degradación simultánea de otros transcritos debido a la homología parcial o complementariedad entre ese otro transcrito y la cadena sentido y/o antisentido de la molécula de ácido polinucleico.
[0095] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende bases o análogos nucleotídicos naturales o sintéticos o artificiales. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende combinaciones de ADN, ARN y/o análogos nucleotídicos. En algunos casos, las bases o análogos nucleotídicos sintéticos o artificiales comprenden modificaciones en una o más de la fracción de ribosa, fracción fosfato, fracción nucleósido o una combinación de los mismos.
[0096] En algunas realizaciones, los análogos nucleotídicos o bases nucleotídicas artificiales comprenden un ácido nucleico con una modificación en un grupo hidroxilo 2' de la molécula de ribosa. En algunos casos, la modificación incluye un H, O, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 o CN, en donde R es una fracción alquilo. Una fracción alquilo de ejemplo incluye, pero sin limitación, halógenos, azufres, tioles, tioéteres, tioésteres, aminas (primarias, secundarias o terciarias), amidas, éteres, ésteres, alcoholes y oxígeno. En algunos casos, la fracción alquilo comprende además una modificación. En algunos casos, la modificación comprende un grupo azo, un grupo ceto, un grupo aldehído, un grupo carboxilo, un grupo nitro, un grupo nitroso, un grupo nitrilo, un grupo heterociclo (por ejemplo, imidazol, hidrazino o hidroxilamino), un grupo isocianato o cianato, o un grupo que contiene azufre (por ejemplo, sulfóxido, sulfona, sulfuro y disulfuro). En algunos casos, la fracción alquilo comprende además una sustitución hetero. En algunos casos, el carbono del grupo heterocíclico está sustituido por un nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunos casos, la sustitución heterocíclica incluye pero sin limitación, morfolino, imidazol y pirrolidino.
[0097] En algunos casos, la modificación en el grupo hidroxilo 2' es una modificación 2'-O-metilo o una modificación 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE). En algunos casos, la modificación 2'-O-metilo añade un grupo metilo al grupo hidroxilo 2' de la fracción de ribosa, mientras que la modificación 2'O-metoxietilo añade un grupo metoxietilo al grupo hidroxilo 2' de la fracción de ribosa. A continuación se ilustran estructuras químicas ilustrativas de una modificación 2'-O-metilo de una molécula de adenosina y de una modificación 2'O-metoxietilo de una uridina.
[0100]
[0102] 2'-O-metil-adenosina 2'-O-metoxietil uridina En algunos casos, la modificación en el grupo hidroxilo 2' es una modificación 2'-O-aminopropilo en la que un grupo amina extendido que comprende un enlazador propilo une el grupo amina al oxígeno 2'. En algunos casos, esta modificación neutraliza la carga negativa global derivada del fosfato de la molécula de oligonucleótido introduciendo una carga positiva del grupo amina por azúcar y, de este modo, mejora las propiedades de absorción celular debido a sus propiedades zwitteriónicas. A continuación se ilustra una estructura química ilustrativa de un nucleósido 2'-O-aminopropilo fosforamidito.
[0105]
[0107] nucleósido 2'-O-aminopropilo fosforamidito
[0108] En algunos casos, la modificación en el grupo hidroxilo 2' es una modificación de ribosa bloqueada o puenteada (por ejemplo, ácido nucleico bloqueado o LNA) en la que la molécula de oxígeno unida al carbono 2' está unida al carbono 4' por un grupo metileno, formando así un monómero de ribonucleótido bicíclico enlazado con 2'-C,4'-C-oximetileno. A continuación se ilustran representaciones ilustrativas de la estructura química del LNA. La representación mostrada a la izquierda destaca las conectividades químicas de un monómero de LNA. La representación mostrada a la derecha destaca la conformación 3'-endo bloqueada (<3>E) del anillo de furanosa de un monómero de LNA.
[0111]
[0113] En algunos casos, la modificación en el grupo hidroxilo 2' comprende ácidos nucleicos etilénicos (ENA) como, por ejemplo, el ácido nucleico puenteado 2'-4'-etilénico, que bloquea la conformación del azúcar en una conformación de fruncido del azúcar C<3>'-endo. Los ENA forman parte de la clase de ácidos nucleicos modificados con puente que también comprende LNA. A continuación se ilustran estructuras químicas ilustrativas de los ENA y los ácidos nucleicos puente.
[0116]
[0118] 3'-amina-2',4'-BNA 2',4'-BNA-2-pirodina 2',4'-ENA 2',4'-BNA-1-isoquinolona En algunas realizaciones, las modificaciones adicionales en el grupo hidroxilo 2' incluyen 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), 2’-O-dimetilaminoetiloxietilo (2’-O-DMAEOE) o 2’-O--N- metilacetamido (2’-O-NMA).
[0119] En algunas realizaciones, los análogos nucleotídicos comprenden bases modificadas tales como, pero sin limitación, 5-propiniluridina, 5-propinilcitidina, 6-metiladenina, 6-metilguanina, N, N, -dimetiladenina, 2-propiladenina, 2propilguanina, 2-aminoadenina, 1-metilinosina, 3-metiluridina, 5-metilcitidina, 5-metiluridina y otros nucleótidos con una modificación en la posición 5, 5-(2- amino)propiluridina, 5-halocitidina, 5-halouridina, 4-acetilcitidina, 1-metiladenosina, 2-metiladenosina, 3-metilcitidina, 6-metiluridina, 2-metilguanosina, 7-metilguanosina, 2,2-dimetilguanosina, 5-metilaminoetiluridina, 5-metiloxiuridina, deazanucleótidos, tales como 7-deaza-adenosina, 6-azouridina, 6-azocitidina, 6-azotimidina, 5-metil-2-tiouridina, otras tiobases tales como 2-tiouridina y 4-tiouridina y 2-tiocitidina, dihidrouridina, pseudouridina, queuosina, arqueosina, grupos naftilo y naftilo sustituido, cualquier purina y pirimidina O-y N-alquilada, tal como N6-metiladenosina, 5-metilcarbonilmetiluridina, ácido uridina 5-oxiacético, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo y grupos fenilo modificados tales como aminofenol o 2, 4, 6-trimetoxibenceno, citosinas modificadas que actúan como nucleótidos G-clamp, adeninas y guaninas 8-sustituidas, uracilos y timinas 5-sustituidos, azapirimidinas, nucleótidos de carboxihidroxialquilo, nucleótidos de carboxialquilaminoalquilo y nucleótidos alquilcarbonilalquilo. Los nucleótidos modificados también incluyen aquellos nucleótidos que están modificados con respecto a la fracción de azúcar, así como los nucleótidos que tienen azúcares o análogos de los mismos que no son ribosilo. Por ejemplo, las fracciones de azúcar, en algunos casos son o se basan en, manosas, arabinosas, glucopiranosas, galactopiranosas, 4'-tioribosa y otros azúcares, heterociclos o carbociclos. El término nucleótido también incluye lo que se conoce en la técnica como bases universales. A modo de ejemplo, las bases universales incluyen, entre otras, el 3-nitropirrol, 5-nitroindol o nebularina.
[0121] En algunas realizaciones, los análogos nucleotídicos comprenden además morfolinos, ácidos peptidonucleicos (APN), nucleótidos de metilfosfonato, nucleótidos de tiolfosfonato, 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas, ácidos nucleicos de 1',5'-anhidrohexitol (HNA) o una combinación de los mismos. El morfolino o morfolino oligo fosforodiamidato (PMO) comprende moléculas sintéticas cuya estructura imita la del ácido nucleico natural desviándose de las estructuras normales de azúcar y fosfato. En algunos casos, el anillo de ribosa de cinco miembros se sustituye por un anillo de morfolino de seis miembros que contiene cuatro carbonos, uno de nitrógeno y otro de oxígeno. En algunos casos, los monómeros de ribosa están unidos por un grupo fosfordiamidato en lugar de un grupo fosfato. En dichos casos, las alteraciones del esqueleto eliminan todas las cargas positivas y negativas, lo que convierte a los morfolinos en moléculas neutras capaces de atravesar las membranas celulares sin la ayuda de agentes de liberación celular como los utilizados por los oligonucleótidos cargados.
[0124]
[0126] Morfolino
[0128] En algunas realizaciones, el ácido nucleico peptídico (PNA) no contiene anillo de azúcar ni enlace fosfato y las bases están unidas y espaciadas adecuadamente por moléculas similares a oligoglicina, por lo tanto, eliminando una carga de la estructura.
[0131]
[0134] En algunas realizaciones, una o más modificaciones se producen opcionalmente en el enlace internucleotídico. En algunos casos, enlace internucleotídico modificado incluye, pero sin limitación, fosforotioatos, fosforoditioatos, enlaces de metilfosfonatos, 5'-alquilenofosfonatos, 5'-metilfosfonato, 3'-alquilen fosfonatos, borontrifluoridatos, ésteres de borano fosfato y selenofosfatos de enlace 3'-5'o 2'-5', enlaces fosfotriésteres, tionoalquilfosfotriésteres, enlaces de fosfonato de hidrógeno, alquilfosfonatos, alquilfosfonotioatos, arilfosfonotioatos, fosforoselenoatos, fosforodiselenoatos, fosfinatos, fosforoamidatos, 3'-alquilfosforamidatos, aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, fosforopiperazidatos, fosforoanilotioatos, fosforoanilidatos, cetonas, sulfonas, sulfonamidas, carbonatos, carbamatos, metilenhidrazo, metilendimetilhidrazos, formacetales, tioformacetales, oximas, metileniminos, metilenmetiliminos, tioamidas, enlaces con grupos riboacetilo, aminoetilglicina, enlaces sililo o siloxano, enlaces alquilo o cicloalquilo con o sin heteroátomos de, por ejemplo, 1 a 10 carbonos saturados o insaturados y/o sustituidos y/ contienen heteroátomos, enlaces con estructuras morfolinas, amidas, poliamidas en donde las bases están unidas a los nitrógenos aza de la cadena principal directa o indirectamente, y combinaciones de las mismas. Los oligonucleótidos antisentido de fosforotioato (PS ASO) son oligonucleótidos antisentido que comprenden un enlace de fosforotioato. A continuación se ilustra un ejemplo de PS ASO.
[0137]
[0140] En algunos casos, la modificación es una modificación metilo o tiol, tal como la modificación metilfosfonato o tiolfosfonato. A continuación se ilustran ejemplos de nucleótidos de tiolfosfonato (izquierda) y metilfosfonato (derecha).
[0143]
[0146] En algunos casos, un nucleótido modificado incluye, pero sin limitación, 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas ilustradas como:
[0149]
[0151] N3'-P5' Fosforoamidato
[0153] En algunos casos, un nucleótido modificado incluye, pero sin limitación, ácido nucleico de hexitol (o 1', 5'- ácidos nucleicos de anhidrohexitol (HNA)) ilustrado como:
[0154]
[0157] En algunas realizaciones, una o más modificaciones incluyen opcionalmente modificaciones de la fracción ribosa, estructura de fosfato y el nucleósido, o modificaciones de los análogos nucleotídicos en los extremos 3' o 5'. Por ejemplo, el extremo 3' incluyen opcionalmente un grupo catiónico 3', o invirtiendo el nucleósido en el extremo 3' con un enlace 3'-3'. En otra alternativa, el extremo 3' está opcionalmente conjugado con un grupo aminoalquilo, por ejemplo, un dT 3' C5-aminoalquilo. En una alternativa adicional, el extremo 3' se conjuga opcionalmente con un sitio abásico, por ejemplo, con un sitio apurínico o apirimidínico. En algunos casos, el extremo 5' está conjugado con un grupo aminoalquilo, por ejemplo, un sustituyente 5'-O-alquilamino. En algunos casos, el extremo 5' se conjuga con un sitio abásico, por ejemplo, con un sitio apurínico o apirimidínico.
[0159] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende uno o más de los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25, o más de los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los análogos nucleotídicos artificiales incluyen 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropil, 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), 2’-O-dimetilaminoetiloxietilo (2’-O-DMAEOE) o 2’-O-N- metilacetamido (2’-O-NMA), ANB, ENA, APN, ANH, morfolino, nucleótidos de metilfosfonato, nucleótidos de tiolfosfonato, 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas o una combinación de los mismos. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25, o más de los análogos nucleotídicos artificiales seleccionados entre 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropil, 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), 2’-O-dimetilaminoetiloxietilo (2’-O-DMAEOE) o 2’-O--N- metilacetamido (2’-O--NMA), ANB, ENA, APN, ANH, morfolino, nucleótidos de metilfosfonato, nucleótidos de tiolfosfonato, 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas o una combinación de los mismos. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25, o más de los nucleótidos modificados con 2'-O-metilo. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25, o más de los nucleótidos modificados con 2'O-metoxietilo (2'-O-MOE). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25, o más de los nucleótidos tiolfosfonato.
[0160] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende al menos uno de: de aproximadamente 5 % a aproximadamente 100 % de modificación, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 % de modificación, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 % de modificación, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 100 % de modificación, de aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 % de modificación, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 % de modificación, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 % de modificación, de aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 % de modificación, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 % de modificación y de aproximadamente el 90 % a aproximadamente 100 % de modificación.
[0161] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende al menos uno de: de aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 % de modificación, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 % de modificación, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 90 % de modificación, de aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 % de modificación, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 % de modificación, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 90 % de modificación, de aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 % de modificación y de aproximadamente el 80 % a aproximadamente 100 % de modificación.
[0163] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende al menos uno de: de aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 % de modificación, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 % de modificación, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 80 % de modificación, de aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 % de modificación, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 % de modificación, de aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 % de modificación y de aproximadamente el 70 % a aproximadamente 80 % de modificación.
[0165] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende al menos uno de: de aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 % de modificación, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 70 % de modificación, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 % de modificación, de aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 % de modificación, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 % de modificación y de aproximadamente el 60 % a aproximadamente 70 % de modificación.
[0166] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende al menos uno de: de aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 % de modificación, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 % de modificación, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 % de modificación, de aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 % de modificación y de aproximadamente el 50 % a aproximadamente 60 % de modificación.
[0167] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende al menos uno de: de aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 % de modificación, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 % de modificación, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 % de modificación y de aproximadamente el 40 % a aproximadamente 50 % de modificación.
[0168] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende al menos uno de: de aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 % de modificación, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 % de modificación y de aproximadamente el 30 % a aproximadamente 40 % de modificación.
[0169] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende al menos uno de: de aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 % de modificación y de aproximadamente el 20 % a aproximadamente 30 % de modificación. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 % de modificación.
[0170] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende de aproximadamente 15 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 80 %, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 % o de aproximadamente el 40 % a aproximadamente 60 %.
[0171] En casos adicionales, la molécula de ácido polinucleico comprende al menos aproximadamente 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de modificación.
[0172] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende al menos aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22 o más modificaciones.
[0173] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende al menos aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22 o más nucleótidos modificados.
[0174] En algunos casos, de aproximadamente 5 % a aproximadamente 100 % de la molécula de ácido polinucleico comprenden los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de la molécula de ácido polinucleico comprenden los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 5 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 10 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 15 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 20 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 25 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 30 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 35 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 40 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 45 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 50 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 55 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 60 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 65 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 70 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 75 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 80 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 85 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 90 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 95 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 96 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 97 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 98 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 99 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunos casos, aproximadamente el 100 % de la molécula de ácido polinucleico comprende los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los análogos nucleotídicos artificiales incluyen 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropil, 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), 2’-O-dimetilaminoetiloxietilo (2’-O-DMAEOE) o 2’-O-N- metilacetamido (2’-O-NMA), ANB, ENA, APN, ANH, morfolino, nucleótidos de metilfosfonato, nucleótidos de tiolfosfonato, 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas o una combinación de los mismos.
[0176] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 modificaciones en las que la modificación comprende un análogo de nucleótido artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 1 modificación en la que la modificación comprende un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 2 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 3 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 4 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 5 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 6 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 7 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 8 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 9 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 10 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 11 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 12 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 13 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 14 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 15 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 16 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 17 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 18 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 19 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 20 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 21 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 19 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico comprende aproximadamente 22 modificaciones en las que las modificaciones comprenden un análogo nucleotídico artificial descrito en el presente documento.
[0178] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico se ensambla a partir de dos polinucleótidos separados, y un polinucleótido comprende la cadena sentido y el segundo polinucleótido comprende la cadena antisentido de la molécula de ácido polinucleico. En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido y los nucleótidos de pirimidina de la cadena sentido comprenden nucleótidos de 2'-O-metilpirimidina y los nucleótidos de purina de la cadena sentido comprenden nucleótidos de 2'-desoxi-purina. En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido y los nucleótidos de pirimidina de la cadena sentido comprenden nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoropirimidina y los nucleótidos de purina de la cadena sentido comprenden nucleótidos de 2'-desoxi-purina.
[0180] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y los nucleótidos de pirimidina cuando están presentes en dicha cadena antisentido son nucleótidos de pirimidina 2'-desoxi-2'-fluoro y los nucleótidos de purina cuando están presentes en dicha cadena antisentido son nucleótidos de purina 2'-O-metilo.
[0182] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y los nucleótidos de pirimidina cuando están presentes en dicha cadena antisentido son nucleótidos de pirimidina 2'-desoxi-2'-fluoro y los nucleótidos de purina cuando están presentes en dicha cadena antisentido comprenden nucleótidos de purina 2'-desoxi.
[0184] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido comprende un nucleótido modificado con 2'-O-metilo en el extremo 5'. Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido comprende al menos dos nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 5'. Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido comprende al menos tres, cuatro, cinco o seis nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 5'. Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido comprende seis nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 5'.
[0186] Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido comprende al menos un nucleótido modificado con 2'-F. Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido comprende al menos dos, al menos tres nucleótidos modificados con 2'-F. Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido comprende al menos dos, al menos tres nucleótidos consecutivos modificados con 2'-F.
[0188] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido comprende un nucleótido modificado con 2'-O-metilo en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido comprende al menos dos nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido comprende al menos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido comprende diez nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3'.
[0190] Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena antisentido comprende un nucleótido modificado con 2'-O-metilo en el extremo 5'. Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena antisentido comprende un nucleótido modificado con 2'-O-metilo en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena antisentido comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido comprende cinco nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3'. Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena antisentido comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro nucleótidos modificados con 2'-F. Como alternativa, y/o adicionalmente, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena antisentido comprende cuatro nucleótidos modificados con 2'-F y dos cualesquiera de los cuatro nucleótidos modificados con 2'-F no son consecutivos. En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena antisentido comprende dos nucleótidos salientes en el extremo 3'.
[0191] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido. En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena sentido incluye una fracción protectora terminal en el extremo 5', el extremo 3' o ambos extremos 5' y 3' de la cadena sentido. En otras realizaciones, la fracción protectora terminal es una fracción desoxi abásica invertida.
[0192] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena antisentido comprende una modificación de la estructura fosfato en el extremo 3' de la cadena antisentido. En algunos casos, la modificación de la estructura fosfato es un fosforotioato. En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena sentido comprende al menos dos enlaces internucleotídicos fosforotioato. Como alternativa, y/o adicionalmente, la cadena antisentido comprende al menos dos, al menos tres enlaces internucleotídicos fosforotioato. En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena antisentido comprende una modificación glicerilo en el extremo 3' de la cadena antisentido.
[0193] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena sentido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1 y una cadena antisentido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2, y la cadena sentido comprende al menos tres, cuatro, cinco o seis nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 5' y al menos dos o al menos tres nucleótidos modificados con 2'-F.
[0194] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena sentido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1 y una cadena antisentido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2 y la cadena antisentido comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3', y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro nucleótidos modificados con 2'-F.
[0195] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena sentido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1 y una cadena antisentido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2, y la cadena antisentido comprende nucleótidos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 5'- y en el extremo 3'.
[0196] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena sentido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1 y una cadena antisentido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2 y la cadena antisentido comprende al menos cinco nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3' y cuatro nucleótidos modificados con 2'-F, en donde dos cualesquiera de los cuatro nucleótidos modificados con 2'-F no son consecutivos.
[0197] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena sentido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1 y una cadena antisentido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2 y la cadena sentido y/o la cadena antisentido comprende al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o el 100 % de nucleótidos modificados de secuencias correspondientes de SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 4, respectivamente.
[0198] En algunos casos, uno o más de los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento son resistentes a nucleasas tales como, por ejemplo, ribonucleasas como RNasa H, desoxirribonucleasa, tales como DNasa, o exonucleasas, tales como exonucleasa 5'-3' y exonucleasa 3'-5', en comparación con las moléculas naturales de ácido polinucleico. En algunos casos, análogos nucleotídicos artificiales que comprenden 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropil, 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), 2’-O-dimetilaminoetiloxietilo (2’-O-DMAEOE) o 2’-O--N- metilacetamido (2’-O--NMA), ANB, ENA, APN, ANH, morfolino, nucleótidos de metilfosfonato, nucleótidos de tiolfosfonato, 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas o combinaciones de los mismos son resistentes a nucleasas tales como, por ejemplo, ribonucleasas tales como RNasa H, desoxirribonucleasas tales como DNasa, o exonucleasas tales como 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-O-metilo es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'O-metoxietilo (2'-O-MOE) es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-O-aminopropilo es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-desoxi es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-desoxi-2'-fluoro es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'O-aminopropilo (2'-O-AP) es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'O- dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE) es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'O- dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP) es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE) es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-O-metilacetamido (2'-O-NMA) es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con LNA es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con ENA es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con HNA es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, morfolinos es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, La molécula de ácido polinucleico modificada con PNA es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con nucleótidos de metilfosfonato es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con nucleótidos de tiolfosfonato es resistente a las nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico que comprende 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas es resistente a nucleasas (por ejemplo, RNasa H, DNasa, resistencia a 5'-3' exonucleasa y 3'-5' exonucleasa). En algunos casos, los conjugados 5' descritos en el presente documento inhiben la escisión exonucleolítica 5'-3'. En algunos casos, los conjugados 3' descritos en el presente documento inhiben la escisión exonucleolítica 3'-5'.
[0200] En algunas realizaciones, uno o más de los análogos nucleotídicos artificiales descritos en el presente documento tienen una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. El uno o más de los análogos nucleotídicos artificiales que comprenden 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropil, 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), 2’-O-dimetilaminoetiloxietilo (2’-O-DMAEOE) o 2’-O-N- metilacetamido (2’-O-NMA), ANB, ENA, APN, ANH, morfolino, nucleótidos de metilfosfonato, nucleótidos de tiolfosfonato o 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas tienen una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-O-metilo tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE) tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-O-aminopropilo tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-desoxi tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-desoxi-2'-fluoro tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP) tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-O- dimetilaminoetilo (2'-O-DAMOE) tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP) tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE) tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA) tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con LNA desoxi tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con ENA desoxi tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con PNA desoxi tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con HNA desoxi tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con morfolino desoxi tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con nucleótidos de metilfosfonato tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico modificada con nucleótidos de tiolfosfonato tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico que comprende 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas tiene una mayor afinidad de unión hacia su diana de ARNm en relación con una molécula de ácido polinucleico natural equivalente. En algunos casos, la mayor afinidad se ilustra con una Kd más baja, una temperatura de fusión (Tf) más alta o una combinación de las mismas.
[0202] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico descrita en el presente documento es una molécula de ácido polinucleico quiralmente pura (o estereopura), o una molécula de ácido polinucleico que comprende un solo enantiómero. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende L-nucleótido. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico comprende D-nucleótidos. En algún caso, una composición de molécula de ácido polinucleico comprende menos del 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos de su enantiómero especular. En algunos casos, una composición de molécula de ácido polinucleico comprende menos del 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos de una mezcla racémica. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico es una molécula de ácido polinucleico descrita en: las publicaciones de patentes de EE.UU. n.º: 2014/194610 y 2015/211006; y la publicación PCT n.º: WO2015107425.
[0204] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico descrita en el presente documento se modifica adicionalmente para incluir una fracción de conjugación de aptámeros. En algunos casos, la fracción de conjugación del aptámero es una fracción de conjugación del aptámero de ADN. En algunos casos, la fracción de conjugación de aptámeros es Alphamer (Centauri Therapeutics), que comprende una porción de aptámero que reconoce una diana específica de la superficie celular y una porción que presenta epítopos específicos para unirse a anticuerpos circulantes. En algún caso, una molécula de ácido polinucleico descrita en el presente documento se modifica adicionalmente para incluir una fracción de conjugación de aptámeros como se describe en las patentes de EE. UU. n.º: 8,604,184, 8,591,910 y 7,850,975.
[0206] En realizaciones adicionales, una molécula de ácido polinucleico descrita en el presente documento se modifica para aumentar su estabilidad. En alguna realización, la molécula de ácido polinucleico es ARN (por ejemplo, ARNip). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico se modifica mediante una o varias de las modificaciones descritas anteriormente para aumentar su estabilidad. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico se modifica en la posición 2’ hidroxilo, tal como mediante una modificación 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), 2'-O-aminopropil, 2'-desoxi, 2'-desoxi-2'-fluoro, 2'-O-aminopropilo (2'-O-AP), 2'-O-dimetilaminoetilo (2'-O-DMAOE), 2'-O-dimetilaminopropilo (2'-O-DMAP), 2'-O-dimetilaminoetiloxietilo (2'-O-DMAEOE), o 2'-O-N-metilacetamido (2'-O-NMA) o por una conformación de ribosa bloqueada o puenteada (por ejemplo, LNA o ENA). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico está modificada por 2'-O-metilo y/o 2'-O-metoxietil ribosa. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico también incluye morfolinos, PNA, ANH, nucleótidos de metilfosfonato, nucleótidos de tiolfosfonato y/o 2'-fluoro N3-P5'-fosforamiditas para aumentar su estabilidad. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico es una molécula de ácido polinucleico quiralmente pura (o estereopura). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico quiralmente pura (o estereo pura) se modifica para aumentar su estabilidad. Las modificaciones adecuadas del ARN para aumentar la estabilidad de la administración serán evidentes para el experto.
[0208] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico es una molécula polinucleotídica bicatenaria que comprende regiones en sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma y la región con sentido que tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico se ensambla a partir de dos polinucleótidos separados, donde una hebra es la hebra con sentido y la otra es la hebra antisentido, en donde las cadenas antisentido y sentido son autocomplementarias (por ejemplo, cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la otra hebra; tal como en los casos en los que la cadena antisentido y la cadena sentido forman un dúplex de estructura bicatenaria); por ejemplo, en donde la región bicatenaria tiene aproximadamente 19, 20, 21, 22, 23 o más pares de bases); en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma y la región con sentido que tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma. Como alternativa, la molécula de ácido polinucleico se ensambla a partir de un único oligonucleótido, donde las regiones sentido y antisentido autocomplementarias de la molécula de ácido polinucleico se unen mediante enlazadores a base o no de ácidos nucleicos.
[0210] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico es un polinucleótido con una estructura secundaria dúplex, dúplex asimétrico, horquilla u horquilla asimétrica, que tiene regiones con sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana separada o una porción de la misma y la región con sentido que tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma. En otros casos, la molécula de ácido polinucleico es un polinucleótido monocatenario circular que tiene dos o más estructuras de bucle y un tallo que comprende regiones sentido y antisentido autocomplementarias, en donde la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma y la región sentido que tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma y en donde el polinucleótido circular se procesa in vivo o in vitro para generar una molécula de ácido polinucleico activo capaz de mediar el ARNi. En casos adicionales, la molécula de ácido polinucleico también comprende un polinucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma (por ejemplo, cuando dicha molécula de ácido polinucleico no requiere la presencia dentro de la molécula de ácido polinucleico de la secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma), en donde el polinucleótido monocatenario comprende además un grupo fosfato terminal, tal como un 5'-fosfato (véase por ejemplo Martinez et al., 2002, Cell., 110, 563-574 y Schwarz et al., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568) o 5',3'-difosfato.
[0212] En algunos casos, una horquilla asimétrica es una molécula de ácido polinucleico lineal que comprende una región antisentido, una porción de bucle que comprende nucleótidos o no nucleótidos, y una región sentido que comprende menos nucleótidos que la región antisentido en la medida en que la región sentido tiene suficientes nucleótidos complementarios para formar un par de bases con la región antisentido y formar un dúplex con bucle. Por ejemplo, una molécula de ácido polinucleico de horquilla asimétrica comprende una región antisentido que tiene longitud suficiente para mediar en el ARNi en una célula o sistema in vitro (por ejemplo, de aproximadamente 19 a aproximadamente 22 nucleótidos) y una región de bucle que comprende de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 nucleótidos, y una región sentido que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 18 nucleótidos que son complementarios de la región antisentido. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico de horquilla asimétrica también comprende un grupo fosfato 5'-terminal químicamente modificado. En casos adicionales, la porción de bucle de la molécula de ácido polinucleico de horquilla asimétrica comprende nucleótidos, no nucleótidos, moléculas enlazadoras o moléculas conjugadas.
[0214] En algunas realizaciones, un dúplex asimétrico es una molécula de ácido polinucleico que tiene dos cadenas separadas que comprenden una región sentido y una región antisentido, en donde la región sentido comprende menos nucleótidos que la región antisentido hasta el punto de que la región sentido tiene suficientes nucleótidos complementarios para formar un par de bases con la región antisentido y formar un dúplex. Por ejemplo, una molécula de ácido polinucleico de dúplex asimétrica comprende una región antisentido que tiene longitud suficiente para mediar en el ARNi en una célula o sistema in vitro (por ejemplo, de aproximadamente 19 a aproximadamente 22 nucleótidos) y una región sentido que tiene de aproximadamente 3 a aproximadamente 18 nucleótidos que son complementarios de la región antisentido.
[0216] En algunos casos, una base universal se refiere a análogos de bases nucleotídicas que forman pares de bases con cada una de las bases naturales del ADN/ARN con poca discriminación entre ellas. Ejemplos no limitantes de bases universales incluyen C-fenilo, C-naftilo y otros derivados aromáticos, inosina, carboxamidas azólicas y derivados nitroazólicos tales como el 3-nitropirrol, 4-nitroindol, 5-nitroindol y 6-nitroindol como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Loakes, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447).
[0218] Síntesis de moléculas de ácido polinucleico
[0220] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico descrita en el presente documento se construye mediante síntesis química y/o reacciones de ligación enzimática utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una molécula de ácido polinucleico se sintetiza químicamente utilizando nucleótidos naturales o nucleótidos modificados de diversas formas, diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre la molécula de ácido polinucleico y los ácidos nucleicos diana. Algunos métodos ilustrativos incluyen los descritos en: las patentes de EE.UU. N.º 5.142.047; 5.185.444; 5.889.136; 6.008.400; y 6.111.086; la publicación PCT N.º WO2009099942; o la Publicación europea n.º 1579015. Métodos ilustrativos adicionales incluyen los descritos en: Griffey et al., "2'-O-aminopropil ribonucleótidos: a zwitterionic modification that enhances the exonuclease resistance and biological activity of antisense oligonucleotides," J. Med. Chem. 39(26):5100-5109 (1997)); Obika, et al. "Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3, -endo sugar puckering". Tetrahedron Letters 38 (50): 8735 (1997); Koizumi, M. "ENA oligonucleotides as therapeutics". Current opinion in molecular therapeutics 8 (2): 144-149 (2006); y Abramova et al., "Novel oligonucleotide analogues based on morpholino nucleoside subunits-antisense technologies: new chemical possibilities," Indian Journal of Chemistry 48B:1721-1726 (2009). Como alternativa, la molécula de ácido polinucleico se produce biológicamente utilizando un vector de expresión en el que se ha subclonado una molécula de ácido polinucleico en orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir de la molécula de ácido polinucleico insertada tendrá una orientación antisentido con respecto a una molécula de ácido polinucleico diana de interés).
[0221] En algunas realizaciones, se sintetiza una molécula de ácido polinucleico mediante una metodología de síntesis en tándem, en donde ambas cadenas se sintetizan como un único fragmento o cadena de oligonucleótidos contigua separada por un enlazador escindible que posteriormente se escinde para proporcionar fragmentos o cadenas separadas que se hibridan y permiten la purificación del dúplex.
[0223] En algunos casos, una molécula de ácido polinucleico también se ensambla a partir de dos cadenas o fragmentos distintos de ácido nucleico en los que un fragmento incluye la región sentido y el segundo fragmento incluye la región antisentido de la molécula.
[0224] Métodos de modificación adicionales para incorporar, por ejemplo, azúcar, las modificaciones de bases y fosfatos incluyen: Eckstein et al., publicación internacional PCT n-º WO 92/07065; Perrault et al. Nature, 1990, 344, 565-568; Pieken et al. Science, 1991, 253, 314-317; Usman y Cedergren, Trends in Biochem. Sci., 1992, 17, 334-339; Ladner et al. Publicación Internacional PCT N.º WO 93/15187; Sproat, patente de Estados Unidos n.º 5.334.711 y Beigelman et al., 1995, J. Biol. Chem., 270, 25702; Beigelman et al., publicación internacional PCT n.º WO 97/26270; Beigelman et al., patente de EE. UU. n.º 5.716.824; Usman et al., patente de EE. UU. n.º 5.627.053; Woolf et al., Publicación internacional PCT N.º WO 98/13526; Thompson et al., n.º de serie de EE.UU 60/082,404 que se presentó el 20 de abril de 1998; Karpeisky et al., 1998, Tetrahedron Lett., 39, 1131; Earnshaw y Gait, 1998, Biopolymers (Nucleic Acid Sciences), 48, 39-55; Verma y Eckstein, 1998, Annu. Rev. Biochem., 67, 99-134; y Burlina et al., 1997, Bioorg. Med. Chem., 5, 1999-2010. Dichas publicaciones describen métodos y estrategias generales para determinar el lugar de incorporación del azúcar, modificaciones de bases y/o fosfatos y similares en moléculas de ácido nucleico sin modular la catálisis.
[0225] En algunos casos, mientras que la modificación química de los enlaces internucleótidos de la molécula de ácido polinucleico con enlaces fosforotioato, fosforoditioato y/o 5'-metilfosfonato mejora la estabilidad, las modificaciones excesivas provocan a veces toxicidad o disminución de la actividad. Por lo tanto, a la hora de diseñar moléculas de ácidos nucleicos, la cantidad de estos enlaces internucleotídicos en algunos casos se reduce al mínimo. En dichos casos, la reducción de la concentración de estos enlaces disminuye la toxicidad, aumenta la eficacia y una mayor especificidad de estas moléculas.
[0226] Conjugados de moléculas de ácido polinucleico
[0227] Un conjugado de molécula de ácido polinucleico de acuerdo con la invención se define en las reivindicaciones, es decir, comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico. Cualquier molécula de ácido polinucleico conjugada descrita en esta sección que no comprende estas características se divulga sólo como referencia.
[0228] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico (B) se conjuga además con un polipéptido (A) para su administración a un lugar de interés. En algunos casos, al menos un polipéptido A se conjuga con al menos un B. En algunos casos, el al menos un polipéptido A se conjuga con el al menos un B para formar un conjugado A-B. En algunas realizaciones, al menos un A se conjuga con el extremo 5' de B, el extremo 3' de B, un sitio interno en B o en cualquiera de sus combinaciones. En algunos casos, el al menos un polipéptido A se conjuga con al menos dos B. En algunos casos, el al menos un polipéptido A se conjuga con al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o más B.
[0229] En algunas realizaciones, al menos un polipéptido A se conjuga en un extremo de al menos un B, mientras que al menos un C se conjuga en el extremo opuesto del al menos un B para formar un conjugado A-B-C. En algunos casos, al menos un polipéptido A se conjuga en un extremo del al menos un B mientras que al menos uno de C se conjuga en un sitio interno o terminal del al menos un B. En algunos casos, al menos un polipéptido A se conjuga directamente con al menos un C. En algunos casos, el al menos un B se conjuga indirectamente con el al menos un polipéptido A a través del al menos un C para formar un conjugado A-C-B.
[0230] En algunos casos, al menos un B y/o al menos un C, y opcionalmente al menos un D se conjugan con al menos un polipéptido A. En algunos casos, el al menos un B se conjuga en un extremo (por ejemplo, un extremo 5' o un extremo 3') con el al menos un polipéptido A o se conjugan a través de un sitio interno con el al menos un polipéptido A. En algunos casos, el al menos un C se conjuga directamente con el al menos un polipéptido A o indirectamente a través del al menos un B. Si indirectamente a través del al menos un B, el al menos un C se conjuga bien en el mismo extremo que el al menos un polipéptido A en B, en el extremo opuesto del al menos un polipéptido A o independientemente en un sitio interno. En algunos casos, al menos un polipéptido A adicional se conjuga además con el al menos un polipéptido A, a B, o a C. En casos adicionales, el al menos un D está opcionalmente conjugado directa o indirectamente con el al menos un polipéptido A, al al menos un B, o al al menos un C. Si directamente al al menos un polipéptido A, el al menos un D también se conjuga opcionalmente con el al menos un B para formar un conjugado A-D-B o se conjuga opcionalmente con el al menos un B y el al menos un C para formar un conjugado A-D-B-C. En algunos casos, el al menos un D se conjuga directamente con el al menos un polipéptido A e indirectamente con el al menos un B y el al menos un C para formar un conjugado D-A-B-C. Si indirectamente con el al menos un polipéptido A, el al menos un D también se conjuga opcionalmente con el al menos un B para formar un conjugado A-B-D o se conjuga opcionalmente con el al menos un B y el al menos un C para formar un conjugado A-D-B-C. En algunos casos, al menos un D adicional se conjuga además con el al menos un polipéptido A, B o C.
[0231] Fracción de unión
[0232] Un conjugado de molécula de ácido polinucleico de acuerdo con la invención se define en las reivindicaciones, es decir, comprende una fracción de unión que es un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo, conjugado con una molécula de ácido polinucleico. Cualquier molécula de ácido polinucleico conjugada descrita en esta sección que no comprende estas características se divulga sólo como referencia.
[0233] En algunas realizaciones, la fracción de unión A es un polipéptido, un ligando peptídico o no peptídico. En algunos casos, el polipéptido es un anticuerpo o su fragmento. En algunos casos, el fragmento es un fragmento de unión. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo, anticuerpo murino o fragmento de unión a antígeno del mismo, anticuerpo quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo, anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, Fab' monovalente, Fab<2>divalente, fragmentos F(ab)'<3>, fragmentos variables monocatenarios (scFv), bis-scFv, (scFv)<2>, diacuerpo, minicuerpo, nanocuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, proteína Fv estabilizada por disulfuro (dsFv), anticuerpo de un solo dominio (sdAb), Ig NAR, anticuerpo de camélido o fragmento de unión a antígeno del mismo, anticuerpo biespecífico o fragmento de unión del mismo, o un derivado químicamente modificado de los mismos. En algunas realizaciones, la fracción de unión A es un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo trifuncional o un minianticuerpo biespecífico. En algunos casos, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo trifuncional. En algunos casos, el anticuerpo trifuncional es un anticuerpo monoclonal de longitud completa que comprende sitios de unión para dos antígenos diferentes.
[0234] En algunos casos, el anticuerpo biespecífico es un minianticuerpo biespecífico. En algunos casos, el minianticuerpo biespecífico comprende Fab<2>divalente, fragmentos F(ab)'<3>, bis-scFv, (scFv)<2>, diacuerpo, minicuerpo, triacuerpo, tetracuerpo o un captador bi-específico de linfocitos T (BiTE). En algunas realizaciones, el captador biespecífico de linfocitos T es una proteína de fusión que contiene dos fragmentos variables de cadena simple (scFvs) en los que los dos scFv se dirigen a epítopos de dos antígenos diferentes.
[0235] En algunas realizaciones, la fracción de unión A es un minianticuerpo biespecífico. En algunos casos, A es un Fab<2>biespecífico. En algunos casos, A es un fragmento F(ab)'<3>biespecífico. En algunos casos, A es un bis-scFv biespecífico. En algunos casos, A es un (scFv)<2>biespecífico. En algunas realizaciones, A es un diacuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, A es un minicuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, A es un triacuerpo biespecífico. En otras realizaciones, A es un tetracuerpo biespecífico. En otras realizaciones, A es un captador bi-específico de linfocitos T (BiTE).
[0236] En algunas realizaciones, la fracción de unión A es un minianticuerpo triespecífico. En algunos casos, el anticuerpo triespecífico comprende fragmentos F(ab)'<3>o un tri-cuerpo. En algunos casos, A es un fragmento F(ab)'<3>triespecífico. En algunos casos, A es un triacuerpo. En algunas realizaciones, A es un anticuerpo triespecífico como el descrito en Dimas, et al, "Development of a trispecific antibody designed to simultaneously and efficiently target three different antigens on tumor cells," Mol. Pharmaceutics, 12(9): 3490-3501 (2015).
[0237] En algunas realizaciones, la fracción de unión A es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que reconoce una proteína de la superficie celular. En algunos casos, la fracción de unión A es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que reconoce una proteína de la superficie celular en una célula muscular. En algunos casos, la fracción de unión A es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que reconoce una proteína de la superficie celular en una célula muscular esquelética.
[0238] En algunas realizaciones, los anticuerpos ilustrativos incluyen, pero sin limitaciones, un anticuerpo anti-miosina, un anticuerpo contra el receptor de transferrina y un anticuerpo que reconoce la quinasa músculo-específica (MuSK). En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo contra el receptor de transferrina (anti-CD71).
[0239] En algunas realizaciones, cuando el anticuerpo es un anticuerpo contra el receptor de transferrina (anti-CD71), el anticuerpo contra el receptor de transferrina se une específicamente al receptor de transferrina humano (TfR), preferentemente, se une específicamente al receptor de transferrina 1 (TfR1), o más preferentemente, se une específicamente al receptor humano de transferrina 1 (TfR1) (o CD71 humano).
[0240] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina o región variable de la cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 EINPIX<1>GRSNYAX<2>KFQG, en donde X<1>se selecciona entre N o Q y X<2>se selecciona entre Q o E; y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19.
[0241] En algunas realizaciones, la región VH del anticuerpo antitranferrina comprende las secuencias HCDR1, HCDR2 y HCDR3 seleccionadas de la Tabla 2.
[0242] TABLA 2
[0245]
[0247] En algunas realizaciones, la región VH comprende la secuencia HDCR1 que comprende SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO: 18, 20, 21; y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19. En algunos casos, la región VH comprende la secuencia HDCR1 que comprende SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:18 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19. En algunos casos, la región VH comprende la secuencia HDCR1 que comprende SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19. En algunos casos, la región VH comprende la secuencia HDCR1 que comprende SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:21 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19.
[0248] En algunas realizaciones, la región VL del anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende la secuencia LCDR1 RTSENIYX<3>NLA, la secuencia LCDR2 AX<4>TNLAX<5>, y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX<6>, en donde X<3>se selecciona entre N o S, X<4>se selecciona entre A o G, X<5>se selecciona entre D o E, y X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F.
[0249] En algunas realizaciones, la región VL del anticuerpo antitranferrina comprende las secuencias LCDR1, LCDR2 y LCDR3 seleccionadas de la Tabla 3.
[0251] TABLA
[0254]
[0256] En algunos casos, la región VL comprende la secuencia LCDR1 RTSENIYX<3>NLA, la secuencia LCDR2 que comprende las SEQ ID NO: 23, 25 o 28 y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24 o 26, en donde X<3>se selecciona entre N o S.
[0257] En algunos casos, la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende la SEQ ID NO: 22 o 27, la secuencia LCDR2 AX<4>TNLAX<5>, y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24 o 26, en donde X<4>se selecciona entre A o G y X<5>se selecciona entre D o E.
[0258] En algunos casos, la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende la SEQ ID NO: 22 o 27, la secuencia LCDR2 de las SEQ ID NO: 23, 25, o 28 y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX<6>, en donde X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F.
[0259] En algunos casos, la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 AATNLAX5 y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX<6>, en donde X<5>se selecciona entre D o E, y X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F.
[0260] En algunos casos, la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:23 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 24.
[0261] En algunos casos, la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:25 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26.
[0262] En algunos casos, la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 27, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:28 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26.
[0263] En algunas realizaciones, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 EINPIX<1>GRSNYAX<2>KFQG, en donde X<1>se selecciona entre N o Q y X<2>se selecciona entre Q o E; y la secuencia HCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDR1 RTSENIYX<3>NLA, la secuencia LCDR2 AX<4>TNLAX<5>, y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX<6>, en donde X<3>se selecciona entre N o S, X<4>se selecciona entre A o G, X<5>se selecciona entre D o E, y X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F.
[0264] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 EINPIX<1>GRSNYAX<2>KFQG, en donde X<1>se selecciona entre N o Q y X<2>se selecciona entre Q o E; y la secuencia HCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDR1 RTSENIYX<3>NLA, la secuencia LCDR2 que comprende las SEQ ID NO: 23, 25 o 28 y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24 o 26, en donde X<3>se selecciona entre N o S.
[0265] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 EINPIX<1>GRSNYAX<2>KFQG, en donde X<1>se selecciona entre N o Q y X<2>se selecciona entre Q o E; y la secuencia HCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende la SEQ ID NO: 22 o 27, la secuencia LCDR2 AX<4>TNLAX<5>, y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24 o 26, en donde X<4>se selecciona entre A o G y X<5>se selecciona entre D o E.
[0266] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 EINPIX<1>GRSNYAX<2>KFQG, en donde X<1>se selecciona entre N o Q y X<2>se selecciona entre Q o E; y la secuencia HCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende la SEQ ID NO: 22 o 27, la secuencia LCDR2 de las SEQ ID NO: 23, 25, o 28 y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX<6>, en donde X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F.
[0267] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 EINPIX<1>GRSNYAX<2>KFQG, en donde X<1>se selecciona entre N o Q y X<2>se selecciona entre Q o E; y la secuencia HCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 AATNLAX5 y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX<6>, en donde X<5>se selecciona entre D o E, y X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F.
[0268] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 EINPIX<1>GRSNYAX<2>KFQG, en donde X<1>se selecciona entre N o Q y X<2>se selecciona entre Q o E; y la secuencia HCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:23 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 24. En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 EINPIX<1>GRSNYAX<2>KFQG, en donde X<1>se selecciona entre N o Q y X<2>se selecciona entre Q o E; y la secuencia HCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:25 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26. En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 EINPIX<1>GRSNYAX<2>KFQG, en donde X<1>se selecciona entre N o Q y X<2>se selecciona entre Q o E; y la secuencia HCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 27, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:28 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26. En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:18 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDR1 RTSENIYX<3>NLA, la secuencia LCDR2 que comprende las SEQ ID NO: 23, 25 o 28 y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24 o 26, en donde X<3>se selecciona entre N o S.
[0269] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:18 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende la SEQ ID NO: 22 o 27, la secuencia LCDR2 AX<4>TNLAX<5>, y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24 o 26, en donde X<4>se selecciona entre A o G y X<5>se selecciona entre D o E.
[0270] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:18 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende la SEQ ID NO: 22 o 27, la secuencia LCDR2 de las SEQ ID NO: 23, 25, o 28 y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX<6>, en donde X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F.
[0271] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:18 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 AATNLAX5 y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX<6>, en donde X<5>se selecciona entre D o E, y X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F.
[0272] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:18 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:23 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 24.
[0273] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:18 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:21 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26.
[0274] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:18 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 27, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:28 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26.
[0275] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDR1 RTSENIYX<3>NLA, la secuencia LCDR2 que comprende las SEQ ID NO: 23, 25 o 28 y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24 o 26, en donde X<3>se selecciona entre N o S.
[0276] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende la SEQ ID NO: 22 o 27, la secuencia LCDR2 AX<4>TNLAX<5>, y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24 o 26, en donde X<4>se selecciona entre A o G y X<5>se selecciona entre D o E.
[0277] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende la SEQ ID NO: 22 o 27, la secuencia LCDR2 de las SEQ ID NO: 23, 25, o 28 y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX<6>, en donde X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F.
[0278] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 AATNLAX5 y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX<6>, en donde X<5>se selecciona entre D o E, y X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F.
[0279] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:23 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 24.
[0280] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:25 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26.
[0281] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 27, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:28 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26.
[0282] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:21 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDR1 RTSENIYX<3>NLA, la secuencia LCDR2 que comprende las SEQ ID NO: 23, 25 o 28 y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24 o 26, en donde X<3>se selecciona entre N o S.
[0283] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:21 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende la SEQ ID NO: 22 o 27, la secuencia LCDR2 AX<4>TNLAX<5>, y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24 o 26, en donde X<4>se selecciona entre A o G y X<5>se selecciona entre D o E.
[0284] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:21 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende la SEQ ID NO: 22 o 27, la secuencia LCDR2 de las SEQ ID NO: 23, 25, o 28 y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX<6>, en donde X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F.
[0285] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende la SEQ ID NO: 21, y la secuencia HCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 19, y la región VL comprende la secuencia LCDR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 AATNLAX5 y la secuencia LCDR3 QHFWGTPLTX<6>, en donde X<5>se selecciona entre D o E, y X<6>está presente o ausente, y si está presente, es F.
[0286] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:21 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:23 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 24.
[0287] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:21 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:25 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26.
[0288] En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL, en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:21 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 27, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:28 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26.
[0289] En algunas realizaciones, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL en la que la secuencia de la región VH comprende aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 29-33 y la secuencia de la región VL comprende aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 34-38.
[0290] En algunas realizaciones, la región VH comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 29-33 (Tabla 4) y la región VL comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 34-38 (Tabla 5). Las regiones subrayadas en la Tabla 4 y la Tabla 5 denotan la secuencia CDR1, CDR2 o CDR3 respectiva.
[0291] TABLA 4
[0293]
[0296] TABLA
[0298]
[0300] En algunas realizaciones, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una región VH y una región VL como se ilustra en la Tabla 6.
[0302] TABLA
[0304]
[0305] En algunas realizaciones, un anticuerpo contra el receptor de transferrina descrito en el presente documento comprende una estructura IgG, una estructura IgA, una estructura IgE o una estructura IgM. En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una estructura IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una estructura IgG1. En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una estructura IgG2 (por ejemplo, una IgG2a o IgG2b). En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una estructura IgG2a. En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una estructura IgG2b. En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una estructura IgG3. En algunos casos, el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una estructura IgG4.
[0306] En algunos casos, un anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende una o más mutaciones en una región estructural, por ejemplo, en el dominio CH1, dominio CH2, dominio CH3, la región bisagra o una combinación de los mismos. En algunos casos, las una o más mutaciones son para estabilizar el anticuerpo y/o para aumentar la semivida. En algunos casos, las una o más mutaciones modulan las interacciones del receptor Fc, recuden o eliminan las funciones efectoras de Fc, tales como FcyR, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En casos adicionales, las una o más mutaciones modulan la glicosilación.
[0307] En algunas realizaciones, las una o más mutaciones están localizadas en la región Fc. En algunos casos, la región Fc comprende una mutación en la posición del resto L234, L235 o una combinación de los mismos. En algunos casos, las mutaciones comprenden L234 y L235. En algunos casos, las mutaciones comprenden L234A y L235A. En algunos casos, las posiciones de los restos se refieren a IgG1.
[0308] En algunos casos, la región Fc comprende una mutación en la posición del resto L234, L235, D265, N21, K46, L52 o P53, o una combinación de las mismas. En algunos casos, las mutaciones comprenden L234 y L235 en combinación con una mutación en la posición del resto K46, L52 u P53. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L234, L235 Y K46. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L234, L235 Y L52. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L234, L235 Y P53. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en D265 y N21. En algunos casos, la posición de los restos se refiere a IgG1.
[0309] En algunos casos, la región Fc comprende L234A, L235A, D265A, N21G, K46G, L52R o P53G, o una combinación de las mismas. En algunos casos, la región Fc comprende L234A y L235A en combinación con K46G, L52R u P53G. En algunos casos, la región Fc comprende L234A, L235A Y K46G. En algunos casos, la región Fc comprende L234A, L235A Y L52R. En algunos casos, la región Fc comprende L234A, L235A Y P53G. En algunos casos, la región Fc comprende D265A y N21G. En algunos casos, la posición de los restos se refiere a IgG1.
[0310] En algunos casos, la región Fc comprende una mutación en la posición del resto L235, L236, D265, N21, K46, L52 o P53, o una combinación de las mutaciones. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L235 y L236. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L235 y L236 en combinación con una mutación en la posición del resto K46, L52 u P53. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L235, L236 Y K46. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L235, L236 Y L52. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L235, L236 Y P53. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en D265 y N21. En algunos casos, la posición de los restos se refiere a IgG2b.
[0311] En algunas realizaciones, la región Fc comprende L235A, L236A, D265A, N21G, K46G, L52R o P53G, o una combinación de las mismas. En algunos casos, la región Fc comprende L235A y L236A. En algunos casos, la región Fc comprende L235A y L236A en combinación con K46G, L52R u P53G. En algunos casos, la región Fc comprende L235A, L236A Y K46G. En algunos casos, la región Fc comprende L235A, L236A Y L52R. En algunos casos, la región Fc comprende L235A, L236A Y P53G. En algunos casos, la región Fc comprende D265A y N21G. En algunos casos, la posición de los restos se refiere a IgG2b.
[0312] En algunas realizaciones, la región Fc comprende una mutación en la posición del resto L233, L234, D264, N20, K45, L51 o P52, en donde los restos corresponden a las posiciones 233, 234, 264, 20, 45, 51 y 52 de la SEQ ID NO: 39. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L233 y L234. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L233 y L234 en combinación con una mutación en la posición del resto K45, L51 u P52. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L233, L234 Y K45. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L233, L234 Y L51. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L233, L234 Y K45. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en L233, L234 Y P52. En algunos casos, la región Fc comprende mutaciones en D264 y N20. En algunos casos, se contemplan posiciones equivalentes al resto L233, L234, D264, N20, K45, L51 o P52 en una estructura IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunos casos, también se contemplan mutaciones en un resto que corresponde al resto L233, L234, D264, N20, K45, L51, o P52 de SEQ ID NO: 39 en una estructura IgG1, IgG2 o IgG4.
[0313] En algunas realizaciones, la región Fc comprende L233A, L234A, D264A, N20G, K45G, L51R o P52G, en donde los restos corresponden a las posiciones 233, 234, 264, 20, 45, 51 y 52 de la SEQ ID NO: 39. En algunos casos, la región Fc comprende L233A y L234A. En algunos casos, la región Fc comprende L233A y L234A en combinación con K45G, L51R u P52G. En algunos casos, la región Fc comprende L233A, L234A Y K45G. En algunos casos, la región Fc comprende L233A, L234A Y L51R. En algunos casos, la región Fc comprende L233A, L234A Y K45G. En algunos casos, la región Fc comprende L233A, L234A Y P52G. En algunos casos, la región Fc comprende D264A y N20G. En algunas realizaciones, la región constante de IgG humana se modifica para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), por ejemplo, con una modificación de aminoácidos descrita en Natsume et al., 2008 Cancer Res, 68(10): 3863-72; Idusogie et al., 2001 J Immunol, 166(4): 2571-5; Moore et al., 2010 AcMos, 2(2): 181 - 189; Lazar et al., 2006 PNAS, 103(11): 4005-4010, Shields et al., 2001 JBC, 276( 9): 6591 - 6604; Stavenhagen et al., 2007 Cancer Res, 67(18): 8882-8890; Stavenhagen et al., 2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164; Alegre et al, 1992 J Immunol, 148: 3461-3468; Revisado en Kaneko y Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1): 1-11.
[0314] En algunas realizaciones, un anticuerpo contra el receptor de transferrina descrito en el presente documento es un anticuerpo de longitud completa, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera (LC). En algunos casos, la cadena pesada (HC) comprende una secuencia seleccionada de la Tabla 7. En algunos casos, la cadena ligera (LC) comprende una secuencia seleccionada de la Tabla 8. La región subrayada indica las CDR respectivas.
[0316] TABLA
[0319]
[0320] (continuación)
[0321]
[0322] (continuación)
[0323]
[0324] (continuación)
[0325]
[0326] (continuación)
[0327]
[0328] (continuación)
[0329]
[0330] (continuación)
[0333]
[0336] TABLA
[0339]
[0341] En algunas realizaciones, un anticuerpo contra el receptor de transferrina descrito en el presente documento tiene una semivida sérica mejorada en comparación con un anticuerpo contra el receptor de transferrina de referencia. En algunos casos, la semivida sérica mejorada es de al menos 30 minutos, 1 hora, 1,5 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 14 días, 30 días o más que el anticuerpo contra el receptor de transferrina de referencia.
[0343] En algunas realizaciones, la fracción de unión A se conjuga con una molécula de ácido polinucleico (B) de forma no específica. En algunos casos, la molécula de unión A se conjuga con una molécula de ácido polinucleico (B) a través de un resto de lisina o un resto de cisteína, de forma no específica para cada lugar. En algunos casos, la fracción de unión A se conjuga con una molécula de ácido polinucleico (B) a través de un resto de lisina (por ejemplo, resto de lisina presente en la fracción de unión A) de manera no específica de sitio. En algunos casos, la fracción de unión A se conjuga con una molécula de ácido polinucleico (B) a través de un resto de cisteína (por ejemplo, resto de cisteína presente en la fracción de unión A) de manera no específica de sitio.
[0345] En algunas realizaciones, la fracción de unión A se conjuga con una molécula de ácido polinucleico (B) de forma específica de sitio. En algunos casos, la fracción de unión A se conjuga con una molécula de ácido polinucleico (B) a través de un resto de lisina, un resto de cisteína, en el extremo 5', en el extremo 3', un aminoácido no natural o un resto modificado enzimáticamente o catalizado enzimáticamente, de forma específica de sitio. En algunos casos, la fracción de unión A se conjuga con una molécula de ácido polinucleico (B) a través de un resto de lisina (por ejemplo, resto de lisina presente en la fracción de unión A) de manera específica de sitio. En algunos casos, la fracción de unión A se conjuga con una molécula de ácido polinucleico (B) a través de un resto de cisteína (por ejemplo, resto de cisteína presente en la fracción de unión A) de manera específica de sitio. En algunos casos, la fracción de unión A se conjuga con una molécula de ácido polinucleico (B) en el extremo 5' de forma específica de sitio. En algunos casos, la fracción de unión A se conjuga con una molécula de ácido polinucleico (B) en el extremo 3' de forma específica de sitio. En algunos casos, la fracción de unión A se conjuga con una molécula de ácido polinucleico (B) a través de un aminoácido no natural de una forma específica de sitio. En algunos casos, la fracción de unión A se conjuga con una molécula de ácido polinucleico (B) a través de un resto modificado enzimáticamente o catalizado enzimáticamente de forma específica de sitio.
[0347] En algunas realizaciones, una o más moléculas de ácido polinucleico (B) se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, o más moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 1 molécula de ácido polinucleico se conjuga con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 2 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 3 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 4 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 5 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 6 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 7 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 8 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 9 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 10 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 11 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 12 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 13 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 14 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 15 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, aproximadamente 16 moléculas de ácido polinucleico se conjugan con una fracción de unión A. En algunos casos, las una o más moléculas de ácido polinucleico son las mismas. En otros casos, las una o más moléculas de ácido polinucleico son diferentes.
[0349] En algunas realizaciones, el número de moléculas de ácido polinucleico (B) conjugadas con una fracción de unión A forma una proporción. En algunos casos, la relación se denomina relación DAR (fármaco-anticuerpo), en la que el fármaco al que se hace referencia en el presente documento es la molécula de ácido polinucleico (B). En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o mayor. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 1 o superior. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 2 o superior. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 3 o superior. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 4 o superior. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 5 o superior. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 6 o superior. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 7 o superior. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 8 o superior. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 9 o superior. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 10 o superior. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 11 o superior. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 12 o superior.
[0351] En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 1. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 2. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 3. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 4. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 5. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 6. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 7. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 8. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 9. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 10. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 11. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 12. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 13. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 14. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 15. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de aproximadamente 16.
[0353] En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es 1. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es 2. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es 4. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es 6. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es 8. En algunos casos, la relación DAR de la molécula de ácido polinucleico (B) con respecto a la fracción de unión A es 12.
[0355] En algunos casos, un conjugado que comprende una molécula de ácido polinucleico (B) y una fracción de unión A tiene una actividad mejorada en comparación con un conjugado que comprende una molécula de ácido polinucleico (B) sin una fracción de unión A. En algunos casos, la mejora de la actividad se traduce en un aumento de las funciones biológicamente relevantes, por ejemplo, mejores estabilidad, afinidad, unión, actividad funcional y eficacia en el tratamiento o la prevención de un estado patológico. En algunos casos, el estado de enfermedad es el resultado de uno o más exones mutados de un gen. En algunos casos, el conjugado que comprende la molécula de ácido polinucleico (B) y la fracción de unión A produce un aumento de la omisión de exón de uno o más exones mutados en comparación con el conjugado que comprende la molécula de ácido polinucleico (B) sin una fracción de unión A. En algunos casos, la omisión de exón se incrementa en al menos o aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más del 95 % en el conjugado que comprende la molécula de ácido polinucleico (B) y la fracción de unión A, en comparación con el conjugado que comprende la molécula de ácido polinucleico (B) sin la fracción de unión A.
[0357] En algunas realizaciones, un anticuerpo o su fragmento de unión se modifica adicionalmente mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, por ejemplo, mediante deleción, inserción, sustitución, adición, y/o por recombinación de aminoácidos y/o cualquier otra modificación (por ejemplo, modificaciones postraduccionales y químicas, tal como la glicosilación y la fosforilación) conocidas en la técnica, ya sea solas o combinadas. En algunos casos, la modificación comprende además una modificación para modular la interacción con los receptores Fc. En algunos casos, las una o más modificaciones incluyen las descritas en, por ejemplo, la publicación internacional n.º WO97/34631, que divulga restos de aminoácidos implicados en la interacción entre el dominio Fc y el receptor FcRn. Los métodos para introducir tales modificaciones en la secuencia de ácido nucleico subyacente a la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo o su fragmento de unión son bien conocidos por el experto en la materia.
[0359] En algunos casos, un fragmento de unión a anticuerpos abarca además sus derivados e incluye secuencias polipeptídicas que contienen al menos una CDR.
[0361] En algunos casos, la expresión "monocatenario", tal como se utiliza en el presente documento, significa que los dominios primero y segundo de una construcción biespecífica de cadena única están unidos covalentemente, preferentemente en forma de una secuencia de aminoácidos colineal codificable por una única molécula de ácido nucleico.
[0362] En algunos casos, una construcción biespecífica de anticuerpo de cadena simple se refiere a una construcción que comprende dos dominios de unión derivados de anticuerpos. En dichas realizaciones, la construcción de anticuerpo monocatenario bi-específico es bi-scFv en tándem o diacuerpo. En algunos casos, un scFv contiene un dominio VH y VL conectados por un péptido enlazador. En algunos casos, los enlazadores son de una longitud y secuencia suficientes para garantizar que cada uno de los dominios primero y segundo pueda, independientemente entre sí, conservan sus especificidades de unión diferenciales.
[0364] En algunas realizaciones, la unión a o la interacción con, tal como se utiliza en el presente documento, define una unión/interacción de al menos dos sitios de interacción de antígenos entre sí. En algunos casos, antígeno-interacciónsitio define un motivo de un polipéptido que muestra la capacidad de interacción específica con un antígeno específico o un grupo específico de antígenos. En algunos casos, también se entiende que la unión/interacción define un reconocimiento específico. En dichos casos, el reconocimiento específico se refiere a que el anticuerpo o su fragmento de unión es capaz de interactuar específicamente con y/o unirse a al menos dos aminoácidos de cada una de las moléculas diana. Por ejemplo, el reconocimiento específico se refiere a la especificidad de la molécula de anticuerpo, o a su capacidad para discriminar entre las regiones específicas de una molécula diana. En casos adicionales, la interacción específica del sitio de interacción del antígeno con su antígeno específico da lugar al inicio de una señal, por ejemplo, debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc. En realizaciones adicionales, la vinculación se ilustra con la especificidad de un "principio llave-cerradura". Así, en algunos casos, motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del sitio de interacción con el antígeno y el antígeno se unen entre sí como resultado de su primario, estructura secundaria o terciaria, así como el resultado de modificaciones secundarias de dicha estructura. En dichos casos, puede obtenerse la interacción específica del sitio de interacción de epítopo/antígeno con su epítopo/antígeno específico así como una unión sencilla de dicho sitio al antígeno.
[0366] En algunos casos, la interacción específica se refiere además a una menor reactividad cruzada del anticuerpo o de su fragmento de unión o a un menor efecto fuera de diana. Por ejemplo, el anticuerpo o su fragmento de unión que se unen al polipéptido/proteína de interés pero no se unen o no se unen esencialmente a ninguno de los otros polipéptidos se consideran específicos para el polipéptido/proteína de interés. Ejemplos para la interacción específica de un sitio de interacción con un antígeno específico comprenden la especificidad de un ligando para su receptor, por ejemplo, la interacción de un determinante antigénico (epítopo) con el sitio de unión antigénica de un anticuerpo.
[0368] Un conjugado de molécula de ácido polinucleico de acuerdo con la invención reivindicada comprende una molécula de ácido polinucleico que se hibrida a una secuencia diana de DMPK, tiene una cadena sentido y una cadena antisentido, y la cadena antisentido comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 4. Cualquier molécula de ácido polinucleico descrita en esta sección que no comprende estas características se divulga sólo como referencia.
[0370] Por lo tanto, en algunos casos, un conjugado de molécula de ácido polinucleico comprende molécula de ácido polinucleico que tiene una cadena sentido con una secuencia de al menos 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, y una cadena antisentido que tiene una secuencia al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO: 2, y un anticuerpo contra el receptor de la transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con el ácido polinucleico de tal manera que el conjugado de molécula de ácido polinucleico medie en la interferencia de ARN contra la DMPK.
[0372] En determinadas realizaciones, un conjugado de molécula de ácido polinucleico comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK, y la molécula de ácido polinucleico que tiene una cadena de sentido que tiene una secuencia de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o el 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, o 15 y una cadena antisentido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, o 16 y el anticuerpo anti-receptor anti-transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 de SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende la SEQ ID NO: 23 y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo y la molécula de ácido polinucleico se conjuga mediante un enlazador que comprende 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-amidato (SMCC).
[0374] En determinadas realizaciones, un conjugado de molécula de ácido polinucleico comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK, y la molécula de ácido polinucleico que tiene una cadena de sentido que tiene una secuencia de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o el 100 % idéntica a las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15 y una cadena antisentido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, o 16, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región VH comprende al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 30 y en donde la VL comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 34, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo y la molécula de ácido polinucleico se conjuga mediante un enlazador maleimida.
[0375] En determinadas realizaciones, un conjugado de molécula de ácido polinucleico comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK, y la molécula de ácido polinucleico que tiene una cadena de sentido que tiene una secuencia de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos 99 %, o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1, y una cadena antisentido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 2, y la cadena sentido comprende al menos tres, cuatro, cinco o seis nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 5' y al menos dos, al menos tres nucleótidos modificados con 2'-F y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región VH comprende al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 30 y en donde la VL comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 34, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo y la molécula de ácido polinucleico se conjuga mediante un enlazador maleimida.
[0377] En determinadas realizaciones, un conjugado de molécula de ácido polinucleico comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK, y la molécula de ácido polinucleico que tiene una cadena de sentido que tiene una secuencia de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, y una cadena antisentido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 2, y la cadena antisentido comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3', y al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro nucleótidos modificados con 2'-F y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende la SEQ ID NO: 23 y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo y la molécula de ácido polinucleico se conjuga mediante un enlazador de maleimida.
[0379] En determinadas realizaciones, un conjugado de molécula de ácido polinucleico comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK, y la molécula de ácido polinucleico que tiene una cadena de sentido que tiene una secuencia de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, y una cadena antisentido que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 2, y la cadena antisentido comprende nucleótidos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 5' y en el extremo 3', y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), y la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:18 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende la SEQ ID NO: 3 y la secuencia LCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 24, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo y la molécula de ácido polinucleico se conjuga mediante un enlazador de maleimida.
[0381] En determinadas realizaciones, un conjugado de molécula de ácido polinucleico comprende un anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que se hibrida con una secuencia diana de DMPK, y la molécula de ácido polinucleico que tiene una cadena de sentido que tiene una secuencia de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 y una cadena antisentido que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 2 y la cadena antisentido comprende al menos cinco nucleótidos consecutivos modificados con 2'-O-metilo en el extremo 3' y cuatro nucleótidos modificados con 2'-F, en donde dos cualesquiera de los cuatro nucleótidos modificados con 2'-F no son consecutivos y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) y la región VH comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 y en donde la VL comprende al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 34, y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo y la molécula de ácido polinucleico se conjuga mediante un enlazador 6-amino-1-hexanol.
[0383] Restos de unión adicionales
[0385] En algunas realizaciones, la fracción de unión es una proteína plasmática. En algunos casos, la proteína plasmática comprende albúmina. En algunos casos, la fracción de unión A es albúmina. En algunos casos, la albúmina se conjuga mediante una o varias de las químicas de conjugación descritas en el presente documento con una molécula de ácido polinucleico. En algunos casos, la albúmina se conjuga mediante química de ligación nativa con una molécula de ácido polinucleico. En algunos casos, la albúmina se conjuga mediante conjugación con lisina a una molécula de ácido polinucleico.
[0386] En algunos casos, la fracción de unión es un esteroide. Los esteroides ilustrativos incluyen colesterol, fosfolípidos, di y triacilgliceroles, ácidos grasos, hidrocarburos saturados, insaturados, comprenden sustituciones o combinaciones de los mismos. En algunos casos, el esteroide es colesterol. En algunos casos, la fracción de unión es colesterol. En algunos casos, el colesterol se conjuga mediante una o varias de las químicas de conjugación descritas en el presente documento con una molécula de ácido polinucleico. En algunos casos, el colesterol se conjuga mediante química de ligación nativa con una molécula de ácido polinucleico. En algunos casos, el colesterol se conjuga mediante conjugación con lisina a una molécula de ácido polinucleico.
[0387] En algunos casos, la fracción de unión es un polímero, incluidos, pero sin limitación, aptámeros de moléculas de ácido polinucleico que se unen a marcadores de superficie específicos de las células. En este caso, la fracción de unión es un ácido polinucleico que no hibrida con un gen o ARNm diana, sino que es capaz de unirse selectivamente a un marcador de la superficie celular de forma similar a un anticuerpo que se une a su epítopo específico de un marcador de la superficie celular.
[0388] En algunos casos, la fracción de unión es un péptido. En algunos casos, el péptido comprende entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3 kDa. En algunos casos, el péptido comprende entre aproximadamente 1,2 y aproximadamente 2,8 kDa, aproximadamente 1,5 y aproximadamente 2,5 o aproximadamente 1,5 y aproximadamente 2 kDa. En algunos casos, el péptido es un péptido bicíclico. En algunos casos, el péptido bicíclico es un péptido bicíclico restringido. En algunos casos, la fracción de unión es un péptido bicíclico (por ejemplo, los bicíclicos de Bicycle Therapeutics). En casos adicionales, la fracción de unión es una molécula pequeña. En algunos casos, la pequeña molécula es una pequeña molécula pequeña reclutadora de anticuerpos. En algunos casos, la molécula pequeña reclutadora de anticuerpos comprende un extremo de unión a la diana y un extremo de unión al anticuerpo, en los que el extremo de unión a la diana es capaz de reconocer e interactuar con un receptor de la superficie celular. Por ejemplo, en algunos casos, el extremo de unión a la diana que comprende un compuesto de urea glutamato permite la interacción con PSMA, de este modo, mejora la interacción de un anticuerpo con una célula que expresa PSMA. En algunos casos, una molécula de unión es una molécula pequeña descrita en Zhang et al., "A remote arene-binding site on prostate specific membrane antigen revealed by antibody-recruiting small molecules," J Am Chem Soc. 132(36): 12711-12716 (2010); o McEnaney, et al., "Antibody-recruiting molecules: an emerging paradigm for engaging immune function in treating human disease," ACS Chem Biol. 7(7): 1139-1151 (2012).
[0389] Producción de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos
[0390] En algunas realizaciones, los polipéptidos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión, anticuerpo contra el receptor de la transferrina o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) se producen utilizando cualquier método conocido en la técnica que sea útil para la síntesis de polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos), en particular, por síntesis química o mediante expresión recombinante, y se producen preferentemente mediante técnicas de expresión recombinante.
[0391] En algunos casos, un anticuerpo o su fragmento de unión del mismo se expresa de forma recombinante y el ácido nucleico que codifica el anticuerpo o su fragmento de unión se ensambla a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), que implica la síntesis de oligonucleótidos solapantes que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, la hibridación y la unión de dichos oligonucleótidos y a continuación la amplificación de los oligonucleótidos ligados mediante PCR. Como alternativa, una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo se genera opcionalmente a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpos o biblioteca de ADNc generada a partir de cualquier tejido o células que expresan la inmunoglobulina) mediante amplificación por PCR utilizando cebadores sintéticos hibridables a los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación utilizando una sonda oligonucleotídica específica para la secuencia génica particular.
[0392] En algunos casos, opcionalmente, se genera un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inmunizando a un animal, tal como un conejo, para generar anticuerpos policlonales o, más preferentemente, generando anticuerpos monoclonales, por ejemplo, como se describe en Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497) o, como se describe por Kozbor et al. (1983, Immunology Today 4:72) o Cole et al. (1985 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs.77-96). Como alternativa, un clon que codifica al menos la parte Fab del anticuerpo se obtiene opcionalmente por cribado de bibliotecas de expresión de Fab (por ejemplo, como se describe en Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para clones de fragmentos Fab que se unen al antígeno específico o cribando bibliotecas de anticuerpos (Véase, por ejemplo, Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hanes et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937).
[0393] En algunas realizaciones, se usan técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984 Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855). Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) mediante corte y empalme de genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad antigénica adecuada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica adecuada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que las distintas porciones se obtienen de distintas especies animales, tales como las que tienen una región variable obtenida de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana, por ejemplo, anticuerpos humanizados.
[0395] En algunas realizaciones, las técnicas descritas para la producción de los anticuerpos de cadena sencilla (patente de Estados Unidos N.º 4.694.778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54) se adaptan para producir anticuerpos monocatenarios. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman uniendo los fragmentos de la cadena pesada y ligera de la región Fv mediante un puente de aminoácidos, dando como resultado un polipéptido monocatenario. También se usan opcionalmente técnicas para el ensamblaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
[0397] En algunas realizaciones, un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de un anticuerpo o la secuencia de nucleótidos de un anticuerpo se transfiere a una célula hospedadora mediante técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación, transfección liposomal, y precipitación con fosfato de calcio), y las células transfectadas se cultivan a continuación mediante técnicas convencionales para producir el anticuerpo. En realizaciones específicas, la expresión del anticuerpo está regulada por un promotor constitutivo, inducible o específico de tejido.
[0399] En algunas realizaciones, se utilizan diversos sistemas de vectores de expresión en el hospedador para expresar un anticuerpo o su fragmento de unión descrito en el presente documento. Dichos sistemas de expresión en el hospedador representan vehículos mediante los cuales se producen secuencias de codificación del anticuerpo y posteriormente se purifican, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias que codifican los nucleótidos adecuados, expresan un anticuerpo o su fragmento de unión in situ. Estos incluyen, pero sin limitaciones, microorganismos, tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformados con ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o vectores de expresión de ADN cósmido que contienen un anticuerpo o sus secuencias codificantes de fragmentos de unión; levadura (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen un anticuerpo o sus secuencias codificantes de fragmentos de unión; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen un anticuerpo o sus secuencias codificantes de fragmentos de unión; sistemas celulares vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y virus del mosaico del tabaco (TMV)) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen un anticuerpo o sus secuencias codificantes de fragmentos de unión; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BH, 293, 293T, 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores procedentes del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7,5K del virus vaccinia).
[0401] A largo plazo, se prefiere la producción de alto rendimiento de proteínas recombinantes de expresión estable. En algunos casos, se diseñan opcionalmente mediante ingeniería genética líneas de células que expresan de forma estable un anticuerpo. Más bien que utilizar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación víricos, las células hospedadoras se transforman con ADN controlado por elementos de control de la expresión adecuados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador de selección. Después de la introducción del ADN exógeno, las células genomanipuladas pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido y, a continuación, cambiarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crecer para formar focos que a la vez se clonan y expanden en líneas de células. Este método puede utilizarse de forma ventajosa para diseñar mediante ingeniería genética líneas de células que expresan el anticuerpo o sus fragmentos de unión.
[0403] En algunos casos, se utilizan varios sistemas de selección, incluyendo, aunque no de forma limitativa timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22:817) se emplean genes en tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. De igual manera, se usa la resistencia antimetabolitos como la base de selección de los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O’Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; mayo de 1993, TIB TECH 11(5):155-215) e higro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que se pueden usar se describen en Ausubel et al. (eds., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol.150:1).
[0404] En algunos casos, se pueden aumentar los niveles de expresión de un anticuerpo mediante la amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vectores que expresa un anticuerpo es amplificable, un aumento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedadora aumentará el número de copias del gen marcador. Debido a que la región amplificada está asociada con la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, aumentará también la producción del anticuerpo (Crouse et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:257).
[0405] En algunos casos, se utiliza cualquier método conocido en la técnica para la purificación o el análisis de un anticuerpo o de conjugados de anticuerpos, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente mediante afinidad por el antígeno específico después de la Proteína A y cromatografía en columna de exclusión por tamaños), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Entre los métodos cromatográficos ilustrativos se incluyen, pero sin limitaciones, cromatografía de intercambio aniónico fuerte, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía líquida rápida de proteínas.
[0406] Química de conjugación
[0407] En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico B se conjuga con una fracción de unión. En algunas realizaciones, una molécula de ácido polinucleico B se conjuga con una fracción de unión en una fórmula A-X-B (X es un enlazador que conjuga A y B). En algunos casos, la fracción de unión comprende aminoácidos, péptidos, polipéptidos, proteínas, anticuerpos, antígenos, toxinas, hormonas, lípidos, nucleótidos, nucleósidos, azúcares, hidratos de carbono, polímeros tales como polietilenglicol y polipropilenglicol, así como análogos o derivados de todas estas clases de sustancias. Ejemplos adicionales de la fracción de unión también incluyen esteroides, tales como colesterol, fosfolípidos, di y triacilgliceroles, ácidos grasos, hidratos de carbono (por ejemplo, saturados, insaturados o con sustituciones), sustratos enzimáticos, biotina, digoxigenina y polisacáridos. En algunos casos, la fracción de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico se conjuga además con un polímero y, opcionalmente, con una fracción endosomolítica.
[0408] En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico se conjuga con la fracción de unión mediante un proceso de ligadura química. En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico se conjuga con la fracción de unión mediante un proceso de ligadura nativo. En algunos casos, la conjugación es como se describe en: Dawson, et al. "Synthesis of proteins by native chemical ligation," Science 1994, 266, 776-779; Dawson, et al. "Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through the Use of Thiol Additives," J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 4325-4329; Hackeng, et al. "Protein synthesis by native chemical ligation: Expanded scope by using straightforward methodology.," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 10068-10073; o Wu, et al. "Building complex glycopeptides: Development of a cysteine-free native chemical ligation protocol," Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4116-4125. En algunos casos, la conjugación es como se describe en la patente de Estados Unidos n.º 8.936.910. En algunas realizaciones, la molécula de ácido polinucleico se conjuga con la fracción de unión de forma específica de sitio o inespecífica mediante química de ligadura nativa.
[0409] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico se conjuga con la fracción de unión mediante un método dirigido al sitio que utiliza una tecnología de acoplamiento "sin rastro" (Philochem). En algunos casos, la tecnología de acoplamiento "sin " utiliza un grupo N-terminal de 1,2-aminotiol en la fracción de unión que se conjuga con una molécula de ácido polinucleico que contiene un grupo aldehído. (véase Casi et al., "Site-specific traceless coupling of potent cytotoxic drugs to recombinant antibodies for pharmacodelivery," JACS 134(13): 5887-5892 (2012))
[0410] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico se conjuga con la fracción de unión mediante un método dirigido al sitio utilizando un aminoácido de origen no natural incorporado a la fracción de unión. En algunos casos, el aminoácido de origen no natural comprende p-acetilfenilalanina (pAcPhe). En algunos casos, el grupo ceto del pAcPhe se acopla selectivamente a una fracción conjugadora derivada de alcoxiamina para formar un enlace oxima. (véase Axup et al., "Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids," PNAS 109(40): 16101-16106 (2012)).
[0411] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico se conjuga con la fracción de unión mediante un método dirigido al sitio que utiliza un proceso enzimático catalizado. En algunos casos, el método dirigido al sitio utiliza la tecnología SMARTag<™>(Catalent, Inc.). En algunos casos, la tecnología SMARTag<™>comprende la generación de un resto de formilglicina (FGly) a partir de cisteína por la enzima generadora de formilglicina (FGE) mediante un proceso de oxidación en presencia de un marcador aldehídico y la posterior conjugación de FGly con una molécula de ácido polinucleico funcionalizada con alquilhidracina mediante ligadura hidrazino-Pictet-Spengler (HIPS). (véase Wu et al., "Site-specific chemical modification of recombinant proteins produced in mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag," PNAS 106(9): 3000-3005 (2009); Agarwal, et al., "A Pictet-Spengler ligation for protein chemical modification," PNAS 110(1): 46-51 (2013))
[0412] En algunos casos, el proceso catalizado enzimáticamente comprende transglutaminasa microbiana (mTG). En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico se conjuga con la fracción de unión mediante un proceso microbiano catalizado por transglutaminasa. En algunos casos, la mTG cataliza la formación de un enlace covalente entre la cadena lateral amida de una glutamina dentro de la secuencia de reconocimiento y una amina primaria de una molécula de ácido polinucleico funcionalizada. En algunos casos, la mTG se produce a partir de Streptomyces mobarensis. (véase Strop et al., "Location matters: site of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates," Chemistry and Biology 20(2) 161-167 (2013))
[0413] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico se conjuga con la fracción de unión mediante un método descrito en la publicación PCT nº WO2014/140317, que utiliza una transpeptidasa específica de secuencia.
[0414] En algunos casos, la molécula de ácido polinucleico se conjuga con la molécula de unión mediante un método descrito en las publicaciones de patente de EE. UU. n.º 2015/0105539 y 2015/0105540.
[0415] Fracción de conjugación del polímero
[0416] En algunas realizaciones, una fracción polimérica C se conjuga además con una molécula de ácido polinucleico descrita en el presente documento, una fracción de unión descrita en el presente documento o en combinaciones de las mismas. En algunos casos, una fracción polimérica C se conjuga con una molécula de ácido polinucleico de fórmula AX<1>-B-X<2>-C (X<1>, X<2>como dos enlazadores que conjugan A y B, B y C, respectivamente. En algunos casos, una fracción polimérica C se conjuga con una fracción de unión. En otros casos, una fracción polimérica C se conjuga con una molécula de fracción de unión a molécula de ácido polinucleico. En casos adicionales, una fracción polimérica C se conjuga, como se ha ilustrado anteriormente.
[0417] En algunos casos, la fracción polimérica C es un polímero natural o sintético, consistente en largas cadenas de monómeros ramificados o no ramificado y/o una red reticulada de monómeros en dos o tres dimensiones. En algunos casos, la fracción polimérica C incluye un polisacárido, lignina, caucho u óxido de polialquileno (por ejemplo, polietilenglicol). En algunos casos, la al menos una fracción polimérica C incluye, pero sin limitación, alfa-, omegadihidroxilpolietilenglicol, polímero biodegradable a base de lactona, por ejemplo, ácido poliacrílico, ácido polilactida (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), polipropileno, poliestireno, poliolefina, poliamida, policianoacrilato, poliimida, tereftalato de polietileno (también conocido como poli(tereftalato de etileno), PET, PETG o PETE), politetrametilenglicol (PTG) o poliuretano, así como sus mezclas. Como se utiliza en el presente documento, una mezcla se refiere al uso de diferentes polímeros dentro del mismo compuesto, así como en referencia a copolímeros de bloques. En algunos casos, los copolímeros de bloques son polímeros en donde al menos una sección de un polímero se construye a partir de monómeros de otro polímero. En algunos casos, la fracción polimérica C comprende óxido de polialquileno. En algunos casos, la fracción polimérica C comprende PEG. En algunos casos, la fracción polimérica C comprende polietilenimida (PEI) o hidroxietilalmidón (HES).
[0418] En algunos casos, C es una fracción de PEG. En algunos casos, la fracción de PEG se conjuga en el extremo 5' de la molécula de ácido polinucleico, mientras que la fracción de unión se conjuga en el extremo 3' de la molécula de ácido polinucleico. En algunos casos, la fracción de PEG se conjuga en el extremo 3' de la molécula de ácido polinucleico, mientras que la fracción de unión se conjuga en el extremo 5' de la molécula de ácido polinucleico. En algunos casos, la fracción de PEG se conjuga con un sitio interno de la molécula de ácido polinucleico. En algunos casos, la fracción de PEG, la fracción de unión, o una combinación de las mismas, se conjugan con un sitio interno de la molécula de ácido polinucleico. En algunos casos, la conjugación es una conjugación directa. En algunos casos, la conjugación se realiza mediante ligadura nativa.
[0419] En algunas realizaciones, el óxido de polialquileno (por ejemplo, PEG) es un compuesto polidisperso o monodisperso. En algunos casos, el material polidisperso comprende una distribución dispersa de diferentes pesos moleculares del material, caracterizada por el tamaño medio (promedio en peso) y la dispersión. En algunos casos, el PEG monodisperso comprende un tamaño de moléculas. En algunas realizaciones, C es óxido de polialquileno poli o monodisperso (por ejemplo, PEG) y el peso molecular indicado representa un promedio del peso molecular del óxido de polialquileno, por ejemplo, moléculas de PEG.
[0420] En algunas realizaciones, el peso molecular del óxido de polialquileno (por ejemplo, PEG) es de aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3250, 3350, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4600, 4750, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10.000, 12.000, 20.000, 35.000, 40.000, 50.000, 60.000 o 100.000 Da. En algunas realizaciones, C es óxido de polialquileno (por ejemplo, PEG) y tiene un peso molecular de aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3250, 3350, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4600, 4750, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10.000, 12.000, 20.000, 35.000, 40.000, 50.000, 60.000 o 100.000 Da. En algunas realizaciones, C es PEG y tiene un peso molecular de aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3250, 3350, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4600, 4750, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10.000, 12.000, 20.000, 35.000, 40.000, 50.000, 60.000 o 100.000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 200 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 300 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 400 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 500 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 600 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 700 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 800 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 900 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 1000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 1100 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 1200 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 1300 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 1400 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 1450 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 1500 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 1600 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 1700 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 1800 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 1900 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 2000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 2100 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 2200 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 2300 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 2400 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 2500 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 2600 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 2700 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 2800 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 2900 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 3000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 3250 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 3350 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 3500 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 3750 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 4000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 4250 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 4500 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 4600 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 4750 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 5000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 5500 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 6000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 6500 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 7000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 7500 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 8000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 10.000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 12.000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 20.000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 35.000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 40.000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 50.000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 60.000 Da. En algunos casos, el peso molecular de C es de aproximadamente 100.000 Da.
[0422] En algunas realizaciones, el óxido de polialquileno (por ejemplo, PEG) comprende unidades discretas de óxido de etileno (por ejemplo, de cuatro a aproximadamente 48 unidades de óxido de etileno). En algunos casos, el óxido de polialquileno que comprende las unidades discretas de óxido de etileno es una cadena lineal. En otros casos, el óxido de polialquileno que comprende las unidades discretas de óxido de etileno es una cadena ramificada.
[0424] En algunos casos, la fracción polimérica C es un óxido de polialquileno (por ejemplo, PEG) que comprende unidades discretas de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C comprende entre aproximadamente 4 y aproximadamente 48 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C comprende aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41, aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47 o aproximadamente 48 unidades de óxido de etileno.
[0426] En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, entre aproximadamente 4 y aproximadamente 48 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26, aproximadamente 27, aproximadamente 28, aproximadamente 29, aproximadamente 30, aproximadamente 31, aproximadamente 32, aproximadamente 33, aproximadamente 34, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41, aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47 o aproximadamente 48 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 4 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 5 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 6 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 7 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 8 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 9 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 10 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 11 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 12 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 13 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 14 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 15 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 16 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 17 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 18 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 19 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 20 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 21 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 22 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 23 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 24 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 25 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 26 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 27 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 28 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 29 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 30 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 31 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 32 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 33 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 34 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 35 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 36 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 37 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 38 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 39 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 40 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 41 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 42 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 43 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 44 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 45 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 46 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 47 unidades de óxido de etileno. En algunos casos, la fracción polimérica C es un PEG discreto que comprende, por ejemplo, aproximadamente 48 unidades de óxido de etileno.
[0428] En algunos casos, la fracción polimérica C es dPEG<®>(Quanta Biodesign Ltd).
[0430] En algunas realizaciones, la fracción polimérica C comprende un polímero catiónico a base de ácido múcico (cMAP).
[0431] En algunos casos, cMAP comprende una o más subunidades de al menos una subunidad repetitiva y la estructura de la subunidad se representa como Fórmula (V):
[0434]
[0436] Fórmula V
[0437] en donde m es independientemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, preferentemente 4-6 o 5; y n es independientemente cada vez que aparece 1, 2, 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, m y n son, por ejemplo, aproximadamente 10.
[0438] En algunos casos, cMAP se conjuga además con una fracción de PEG, generando un copolímero cMAP-PEG, un polímero de tres bloques mPEG-cMAP-PEGm o un polímero de tres bloques cMAP-PEG-cMAP. En algunos casos, la fracción de PEG se encuentra en un intervalo de aproximadamente 500 Da a aproximadamente 50.000 Da. En algunos casos, la fracción de PEG se encuentra en un intervalo de aproximadamente 500 Da a aproximadamente 1000 Da, superior a de 1000 Da a aproximadamente 5000 Da, superior a de 5000 Da a aproximadamente 10.000 Da, superior a de 10.000 Da a aproximadamente 25.000 Da, superior a de 25.000 Da a aproximadamente 50.000 Da o cualquier combinación de dos o más de estos intervalos.
[0439] En algunos casos, la fracción polimérica C es un copolímero cMAP-PEG, un polímero de tres bloques mPEG-cMAP-PEGm o un polímero de tres bloques cMAP-PEG-cMAP. En algunos casos, la fracción polimérica C es un copolímero cMAP-PEG. En otros casos, la fracción polimérica C es un polímero de tres bloques mPEG-cMAP-PEGm. En casos adicionales, la fracción polimérica C es un polímero de tres bloques cMAP-PEG-cMAP.
[0440] En algunas realizaciones, la fracción polimérica C se conjuga con la molécula de ácido polinucleico, la fracción de unión, y opcionalmente con la fracción endosomolítica como se ha ilustrado anteriormente.
[0441] Fracción endosomolítica o de penetración en la membrana celular
[0442] En algunas realizaciones, una molécula de fórmula (I): A-X<1>-B-X<2>-C, comprende además una fracción de conjugación adicional. En algunos casos, la fracción de conjugación adicional es una fracción endosomolítica y/o una fracción de penetración en la membrana celular. En algunos casos, la fracción endosomolítica es un componente de liberación compartimental celular, tal como un compuesto capaz de liberarse de cualquiera de los compartimentos celulares conocidos en la técnica, tal como el endosoma, lisosoma, retículo endoplasmático (RE), el aparato de Golgi, microtúbulo, peroxisoma u otros cuerpos vesiculares con la célula. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido endosomolítico, un polímero endosomolítico, un lípido endosomolítico o una molécula endosomolítica pequeña. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido endosomolítico. En otros casos, la fracción endosomolítica comprende un polímero endosomolítico. En algunos casos, la fracción de penetración en la membrana celular comprende un péptido de penetración celular (PPC). En otros casos, la fracción de penetración en la membrana celular comprende un lípido de penetración celular. En otros casos, la fracción de penetración en la membrana celular comprende un molécula pequeña de penetración celular.
[0443] Polipéptidos endosomolíticos y de penetración en la membrana celular
[0444] En algunas realizaciones, una molécula de fórmula (I): A-X<1>-B-X<2>-C, se conjuga además con un polipéptido endosomolítico. En algunos casos, el polipéptido endosomolítico es un péptido activo de membrana dependiente del pH. En algunos casos, el polipéptido endosomolítico es un polipéptido anfipático. En casos adicionales, el polipéptido endosomolítico es un peptidomimético. En algunos casos, el polipéptido endosomolítico comprende INF, melitina, meucina o sus respectivos derivados. En algunos casos, el polipéptido endosomolítico comprende INF o sus derivados. En otros casos, el polipéptido endosomolítico comprende melitina o sus derivados. En casos adicionales, el polipéptido endosomolítico comprende meucina o sus derivados.
[0445] En algunos casos, INF7 es un polipéptido de 24 restos cuya secuencia comprende CGIFGEIEELIEEGLENLIDWGNA (SEQ ID NO: 67) o GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC (SEQ ID NO: 68). En algunos casos, INF7 o sus derivados comprenden una secuencia de: GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYGSGSCG (SEQ ID NO: 69), GLFEAIEGFIENGWEGMIDG WYG-(PEG)6-NH2 (SEQ ID NO: 70) o GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG-SGSC-K(GalNAc)2 (SEQ ID NO: 71).
[0446] En algunos casos, la melitina es un polipéptido de 26 restos cuya secuencia comprende CLIGAILKVLATGLPTLISWIKNKRKQ (SEQ ID NO: 72) o GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (SEQ ID NO: 73). En algunos casos, la melitina comprende una secuencia polipeptídica como la descrita en la patente de Estados Unidos n.º 8.501.930.
[0447] En algunos casos, la meucina es un péptido antimicrobiano (AMP) derivado de la glándula venenosa del escorpión Mesobuthus eupeus. En algunos casos, la meucina comprende meucina-13 cuya secuencia comprende IFGAIAGLLKNIF-NH<2>(SEQ ID NO: 74) y la meucina-18 cuya secuencia comprende FFGHLFKLATKIIPSLFQ (SEQ ID NO: 75).
[0448] En algunos casos, el polipéptido endosomolítico comprende un polipéptido en el que su secuencia tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con INF7 o sus derivados, melitina o sus derivados o meucina o sus derivados. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende INF7 o sus derivados, melitina o sus derivados o meucina o sus derivados.
[0449] En algunos casos, la fracción endosomolítica es INF7 o sus derivados. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 67-71. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 67. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 68-71. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende la SEQ ID NO: 67. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende las SEQ ID NO: 68-71. En algunos casos, la fracción endosomolítica consiste en la SEQ ID NO: 67. En algunos casos, la fracción endosomolítica consiste en las SEQ ID NO: 68-71.
[0450] En algunos casos, la fracción endosomolítica es melitina o sus derivados. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 72 o 73. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 72. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 73. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende la SEQ ID NO: 72. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende la SEQ ID NO: 73. En algunos casos, la fracción endosomolítica consiste en la SEQ ID NO: 72. En algunos casos, la fracción endosomolítica consiste en la SEQ ID NO: 73.
[0451] En algunos casos, la fracción endosomolítica es meucina o sus derivados. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 74 o 75. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 74. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido que tiene al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 75. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende la SEQ ID NO: 74. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende la SEQ ID NO: 75. En algunos casos, la fracción endosomolítica consiste en la SEQ ID NO: 74. En algunos casos, la fracción endosomolítica consiste en la SEQ ID NO: 75.
[0452] En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende una secuencia como la ilustrada en la Tabla 9.
[0455]
[0456] n in i n
[0458]
[0460] En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido Bak BH3 que induce apoptosis mediante la antagonización de dianas supresoras tales como Bcl-2 y/o Bcl-x<L>. En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido Bak BH3 descrito en Albarran, et al, "Efficient intracellular delivery of a pro-apoptotic peptide with a pH-responsive carrier," Reactive & Functional Polymers 71: 261-265 (2011).
[0461] En algunos casos, la fracción endosomolítica comprende un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido penetrador de células) como se describe en la publicación PCT n.º WO2013/166155 o documento WO2015/069587.
[0462] Lípidos endosomolíticos
[0463] En algunas realizaciones, la fracción endosomolítica es un lípido (por ejemplo, un lípido fusogénico). En algunas realizaciones, una molécula de fórmula (I): A-X<1>-B-X<2>-C, se conjuga además con un lípido endosomolítico (por ejemplo, lípido fusogénico). Los lípidos fusogénicos ilustrativos incluyen 1,2-dileoil-sn-3-fosfoetanolamina (DOPE), fosfatidiletanolamina (POPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ol (Di-Lin), N-metil(2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)-1,3-dioxolan-4-il)metanamina (DLin-k-DMA) y N-metil-2-(2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)-1,3-dioxolan-4-il)etanamina (XTC).
[0464] En algunos casos, una fracción endosomolítica es un lípido (por ejemplo, un lípido fusogénico) descrito en la Publicación PCT n.º WO09/126.933.
[0465] Moléculas endosomolíticas pequeñas
[0466] En algunas realizaciones, la fracción endosomolítica es una molécula pequeña. En algunas realizaciones, una molécula de fórmula (I): A-X<1>-B-X<2>-C, se conjuga además con una molécula endosomolítica pequeña. Las moléculas pequeñas ilustrativas adecuadas como moléculas endosomolíticas incluyen, pero sin limitaciones, quinina, cloroquina, hidroxicloroquinas, amodiaquinas (carnoquinas), amopiroquinas, primaquinas, mefloquinas, nivaquinas, halofantrinas, iminas de quinona o una combinación de las mismas. En algunos casos, las moléculas endosomolíticas de quinolina incluyen, pero sin limitaciones, 7-cloro-4-(4-dietilamino-1-metilbutil-amino)quinolina (cloroquina); 7-cloro-4-(4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-metilbutil-amino)quinoleína (hidroxicloroquina); 7 fluoro -4-(4-dietilamino-1-metilbutilamino)quinolina; 4-(4-dietilamino-1-metilbutilamino)quinolina; 7-hidroxi-4-(4-dietil-amino-1-metilbutilamino)quinolina; 7-cloro-4-(4-dietilamino-1-butilamino)quinolina (desmetilcloroquina); 7-fluoro-4-(4-dietilamino-1-butilamino)quinolina); 4-(4-dietil-amino-1-butilamino)quinolina; 7 hidroxi-4-(4-dietilamino-1-butilamino)quinolina; 7-cloro-4-(1-carboxi-4-dietilamino-1-butilamino)quinolina; 7-fluoro-4-(1-carboxi-4-dietil-amino-1-butilamino)quinolina; 4-(1-carboxi-4-dietilamino-1-butilamino)quinolina; 7 hidroxi-4-(1-carboxi-4-dietilamino-1-butilamino)quinolina; 7-cloro-4-(1-carboxi-4-dietilamino-1-metilbutilamino)quinolina; 7-fluoro-4-(1-carboxi-4-dietil-amino-1-metilbutilamino)quinolina; 4-(1-carboxi-4-dietilamino-1-metilbutilamino)quinolina; 7 hidroxi -4-(1-carboxi-4-dietilamino-1-metilbutilamino)quinolina; 7-fluoro-4-(4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-metilbutilamino)quinolina; 4-(4-etil-(2-hidroxi-etil)-amino-1-metilbutilamino-)quinolina; 7 hidroxi-4-(4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-metilbutilamino)quinolina; fosfato de hidroxicloroquina; 7-cloro-4-(4-etil-(2-hidroxietil-1)-amino-1-butilamino)quinolina (desmetilhidroxicloroquina); 7-fluoro-4-(4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-butilamino)quinolina; 4-(4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-butilamino)quinolina; 7-hidroxi-4-(4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-butilamino)quinolina; 7-cloro-4-(1-carboxi-4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-butilamino)quinolina; 7-fluoro-4-(1-carboxi-4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-butilamino)quinolina; 4-(1-carboxi 4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-butilamino)quinolina; 7-hidroxi-4-(1-carboxi-4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-butilamino)quinolina; 7-cloro-4-(1-carboxi-4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-metilbutilamino)quinolina; 7-fluoro-4-(1-carboxi-4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-metilbutilamino)quinolina; 4-(1-carboxi 4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-metilbutilamino)quinolina; 7 hidroxi -4-(1-carboxi-4-etil-(2-hidroxietil)-amino-1-metilbutilamino)quinolina; 8-[(4-aminopentil)amino-6-metoxidihidrocloruro quinolina; 1-acetil-1,2,3,4-tetrahidroquinolina; 8-[(4-aminopentil)amino]-6-metoxiquinoleína dihidrocloruro; 1-butiril-1,2,3,4-tetrahidroquinolina; 3-cloro-4-(4-hidroxi-alfa,alfa'-bis(2-metil-1-pirrolidinil)-2,5-xilidinoquinolina, 4-[(4-dietil-amino)-1-metilbutil-amino]-6-metoxiquinolina; 3-fluoro-4-(4-hidroxi-alfa,alfa'-bis(2-metil-1-pirrolidinil)-2,5-xilidinoquinolina, 4-[(4-dietilamino)-1-metilbutil-amino]-6-metoxiquinolina; 4-(4-hidroxi-alfa,alfa'-bis(2-metil-1-pirrolidinil)-2,5-xilidinoquinolina; 4-[(4-dietilamino)-1-metilbutil-amino]-6-metoxiquinolina; 3,4-dihidro-1-(2H)-quinolinacarboxialdehído; diyoduro de 1,1'-pentametileno diquinoleinio; 8-quinolinol sulfato y amino, aldehído, carboxílico, hidroxilo, halógeno, ceto, sulfhidrilo y derivados vinílicos o análogos de los mismos. En algunos casos, una fracción endosomolítica es una molécula pequeña descrita en Naisbitt et al (1997, J Pharmacol Exp Therapy 280:884-893) y en la patente de Estados Unidos n.º 5.736.557.
[0467] Polipéptido de penetración celular (PCC)
[0468] En algunas realizaciones, el polipéptido de penetración celular comprende péptidos cortos cargados positivamente con 5-30 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido de penetración celular comprende secuencias de aminoácidos ricas en arginina o lisina. En algunas realizaciones, el polipéptido de penetración celular incluye cualquier polipéptido o combinación de los mismos enumerados en la Tabla 10.
[0470] TABLA 1
[0473]
[0474] n in i n
[0477]
[0480] Enlazadores
[0482] En algunas realizaciones, un enlazador descrito en el presente documento es un enlazador escindible o un enlazador no escindible. En algunos casos, el enlazador es un enlazador escindible. En otros casos, el enlazador es un enlazador no escindible.
[0484] En algunos casos, el enlazador es un enlazador no polimérico. Un enlazador no polimérico se refiere a un enlazador que no contiene una unidad repetitiva de monómeros generados por un proceso de polimerización. Los enlazadores no poliméricos ilustrativos incluyen, pero sin limitaciones, grupo alquilo C<1>-C<6>(por ejemplo, un grupo alquilo C<5>, C<4>, C<3>, C<2>o C<1>), reticulantes homobifuncionales, reticulantes heterobifuncionales, enlazadores peptídicos, enlazadores sin rastro, enlazadores autoinmolantes, enlazadores a base de maleimida o combinaciones de los mismos. En algunos casos, el enlazador no polimérico comprende un grupo alquilo C<1>-C<6>(por ejemplo, un grupo alquilo C<5>, C<4>, C<3>, C<2>o C<1>), un reticulante homobifuncional, un reticulante heterobifuncional, un enlazador peptídico, un enlazador sin rastro, un enlazador autoinmolante, enlazadores a base de maleimida o una combinación de los mismos. En casos adicionales, el enlazador no polimérico no comprende más de dos enlazadores del mismo tipo, por ejemplo, más de dos enlaces reticulantes homobifuncionales o más de dos enlazadores peptídicos. En casos adicionales, el enlazador no polimérico comprende opcionalmente uno o más grupos funcionales reactivos.
[0486] En algunos casos, el enlazador no polimérico no abarca un polímero descrito anteriormente. En algunos casos, el enlazador no polimérico no abarca un polímero abarcado por la fracción polimérica C. En algunos casos, el enlazador no polimérico no abarca un óxido de polialquileno (por ejemplo, PEG). En algunos casos, el enlazador no polimérico no incluye un PEG.
[0488] En algunos casos, el enlazador comprende un enlazador homobifuncional. Los enlazadores homobifuncionales ilustrativos incluyen, pero sin limitaciones, reactivo de Lomant ditiobis (succinimidilpropionato) DSP, 3'3'-ditiobis(sulfosuccinimidilpropionato (DTSSP), suberato de disuccinimidilo (DSS), suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS), tartrato de disuccinimidilo (DST), tartrato de disulfosuccinimidilo (sulfo DST), etilenglicolbis(succinimidilsuccinato) (EGS), disuccinimidilglutarato (DSG), N,N'-disuccinimidilcarbonato (DSC), adipimidato de dimetilo (DMA), pimelimidato de dimetilo (DMP), suberimidato de dimetilo (DMS), dimetil-3,3'-ditiobispropionimidato (DTBP), 1,4-di-3'-(2'-piridilditio)propionamido)butano (DPDPB), bismaleimidohexano (BMH), compuesto que contiene haluro de arilo (DFDNB), tal como, por ejemplo, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno o 1,3-difluoro-4,6-dinitrobenceno, 4,4'-difluoro-3,3'-dinitrofenilsulfona (DFDNPS), bis-[β-(4-azidosalicilamido)etil]disulfuro (BASED), formaldehído, glutaraldehído, 1,4-butanodiol diglicidil éter, dihidrazida de ácido adípico, carbohidrazida, o-toluidina, 3,3'-dimetilbencidina, bencidina, α,α'-p-diaminodifenilo, ácido diyodo-p-xileno sulfónico, N,N'-etilen-bis(yodoacetamida), o N,N'-hexametilenbis(yodoacetamida).
[0490] En algunas realizaciones, el enlazador comprende un enlazador heterobifuncional. Los enlazadores heterobifuncionales ilustrativos incluyen, pero sin limitaciones, reticulantes amino-reactivos y sulfhidrilos, tales como N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (sPDP), N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato de cadena larga (LC-sPDP), propionato de N-succinimidilo 3-(2-piridilditio) de cadena larga soluble en agua (sulfo-LC-sPDP), succinimidiloxicarbonil-α-metil-α-(2-piridilditio)tolueno (SMPT), sulfosuccinimidil-6-metil-α-(2-piridiltio)toluamido]hexanoato) (Sulfo-LC-SMPT), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MB), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS), (4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo (sIAB), sulfosuccinimidil(4-yodo-acetil)aminobenzoato (sulfo-sIAB), 4-(pmaleimidofenil)butirato de succinimidilo (sMPB), 4-(p-maleimidofenil)butirato de sulfosuccinimidilo (sulfo-sMPB); éster de N-[γ-maleimidobutiriloxi]succinimida (GMBs), éster de N-(γ-maleimidobutiriloxi)sulfosuccinimida (sulfo-GMBs), 6-((yodoacetil)-amino)hexanoato de succinimidilo (sIAX); 6-[6-(((yodoacetil)amino)-hexanoil)amino]hexanoato de succinimidilo (sIAXX); 4-((yodoacetil)amino)metil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (sIAC); 6-((((4-(yodoacetil)amino)metil-ciclohexano-1-carbonil)amino)hexanoato de succinimidilo (sIACX); yodoacetato de p nitrofenilo (NPIA), reticulantes reactivos al carbonilo y al sulfhidrilo, tal como hidrazida del ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico (MPBH), 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxil-hidrazida-8 (M<2>C<2>H), 3-(2-piridilditio)-propionilhidrazida (PDPH), reticulantes reactivos a amina y fotorreactivos, tales como ácido N-hidroxisuccinimidil-4-azidosalicílico (NHs-AsA), ácido N-hidroxisulfosuccinimidil-4-azidosalicílico (sulfo-NHs-AsA), sulfosuccinimidil-(4-azidosalicilamido)hexanoato (sulfo-NHs-LC-AsA), sulfosuccinimidil-2-(p-azidosalicilamido)etil-1,3'-ditiopropionato (sAsD), N-hidroxisuccinimidil-4-azidobenzoato (HsAB), N-hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato (sulfo-HsAB), N-succinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato (sANPAH), sulfosuccinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)hexanoato (sulfo-sANPAH), N-5-azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida (ANB-NOs), sulfosuccinimidil-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-etil-1,3'-ditiopropionato (sAND), N-succinimidil-4(4-azidofenil)1,3'-ditiopropionato (sADP), N-sulfosuccinimidil(4-azidofenil)-1,3'-ditiopropionato (sulfo-sADP), sulfosuccinimidil 4-(p-azidofenil)butirato (sulfosAPB), sulfosuccinimidil 2-(7-azido-4-metilcumarin-3-acetamida)etil-1,3'-ditiopropionato (sAED), 7-azido-4-metilcumarina-3-acetato de sulfosuccinimidilo (sulfo-sAMCA), diazopiruvato p-nitrofenilo (pNPDP), p-nitrofenil-2-diazo-3,3,3-trifluoropropionato (PNP-DTP), reticulantes reactivos a sulfhidrilo y fotorreactivos, tales como 1-(ρazidosalicilamido)-4-(yodoacetamido)butano (AsIB), N-[4-(p-azidosalicilamido)butil]-3'-(2'-piridiltio)propionamida (APDP), benzofenona-4-yodoacetamida, reticulantes reactivos a benzofenona-4-maleimida carbonilo y fotorreactivos, tales como ρ-azidobenzoil hidrazida (ABH), reticulantes reactivos al carboxilato y fotorreactivos, tales como 4-(ρazidosalicilamido)butilamina (AsBA), y reticulantes reactivos a la arginina y fotorreactivos, tales como ρazidofenilglioxal (APG).
[0492] En algunos casos, el enlazador comprende un grupo funcional reactivo. En algunos casos, el grupo funcional reactivo comprende un grupo nucleófilo que es reactivo frente a un grupo electrófilo presente en una fracción de unión. Los grupos electrófilos ilustrativos incluyen grupos carbonilo, tales como aldehído, cetona, ácido carboxílico, éster, amida, enona, haluro de acilo o anhídrido ácido. En algunas realizaciones, el grupo funcional reactivo es aldehído. Los grupos nucleófilos ilustrativos incluyen hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina y arilhidrazida.
[0494] En algunas realizaciones, el enlazador comprende un grupo maleimida. En algunos casos, el grupo maleimida también se denomina espaciador maleimida. En algunos casos, el grupo maleimida comprende además un ácido caproico, que forma maleimidocaproilo (mc). En algunos casos, el enlazador comprende maleimidocaproilo (mc). En algunos casos, el enlazador es maleimidocaproilo (mc). En otros casos, el grupo maleimida comprende un grupo maleimidometilo, tal como succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sMCC) o sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-sMCC) descritos anteriormente.
[0496] En algunas realizaciones, el grupo maleimida es una maleimida autoestabilizadora. En algunos casos, la maleimida autoestabilizadora utiliza ácido diaminopropiónico (DPR) para incorporar un grupo amino básico adyacente a la maleimida para proporcionar catálisis intramolecular de la hidrólisis del anillo de tiosuccinimida, evitando así que la maleimida sufra una reacción de eliminación mediante una reacción retro-Michael. En algunos casos, la maleimida autoestabilizadora es un grupo maleimida descrito en Lyon, et al., "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat. Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014). En algunos casos, el enlazador comprende una maleimida autoestabilizadora. En algunos casos, el enlazador comprende una maleimida autoestabilizadora.
[0498] En algunas realizaciones, el enlazador comprende una fracción peptídica. En algunos casos, la fracción peptídica comprende al menos 2, 3, 4, 5 o 6 restos de aminoácidos más. En algunos casos, la fracción peptídica comprende como máximo 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 restos de aminoácidos. En algunos casos, la fracción peptídica comprende aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5 o aproximadamente 6 restos de aminoácidos. En algunos casos, la fracción peptídica es una fracción peptídica escindible (por ejemplo, enzimática o químicamente). En algunos casos, la fracción peptídica es una fracción peptídica no escindible. En algunos casos, la fracción peptídica comprende Val-Cit (valina-citrulina), Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO: 106), Phe-Lys, Val-Lys, Gly-Phe-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Val-Arg, Phe-Cit, Phe-Arg, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 107) o Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 108). En algunos casos, el enlazador comprende una fracción peptídica tal como: val-cit (valina-citrulina), Gly-Gly-Phe-Gly, Phe-Lys, Val-Lys, Gly-Phe-Lys, Phe-Phe-Lys, Ala-Lys, Val-Arg, Phe-Cit, Phe-Arg, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Leu-Ala-Leu o Gly-Phe-Leu-Gly. En algunos casos, el enlazador comprende Val-Cit. En algunos casos, el enlazador es Val-Cit.
[0500] En algunas realizaciones, el enlazador comprende un grupo ácido benzoico o sus derivados. En algunos casos, el grupo ácido benzoico o sus derivados comprenden ácido paraaminobenzoico (PABA). En algunos casos, el grupo ácido benzoico o sus derivados comprenden ácido gamma-aminobenzoico (GABA).
[0502] En algunas realizaciones, el enlazador comprende uno o más de un grupo maleimida, una fracción peptídica y/o un grupo ácido benzoico, en cualquier combinación. En algunas realizaciones, el enlazador comprende una combinación de un grupo maleimida, una fracción peptídica y/o un grupo ácido benzoico. En algunos casos, el grupo maleimida es maleimidocaproilo (mc). En algunos casos, el grupo peptídico es val-cit. En algunos casos, el grupo ácido benzoico es PABA. En algunos casos, el enlazador comprende un grupo mc-val-cit. En algunos casos, el enlazador comprende un grupo val-cit-PABA. En casos adicionales, el enlazador comprende un grupo mc-val-cit-PABA.
[0503] En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador autoinmolante o un enlazador autoeliminador. En algunos casos, el enlazador es un enlazador autoinmolante. En otros casos, el enlazador es un enlazador autoeliminador (por ejemplo, un enlazador de autoeliminación por ciclización). En algunos casos, el enlazador comprende un enlazador descrito en la patente de Estados Unidos n.º 9.089.614 o en la publicación PCT n.º WO2015038426.
[0504] En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador de tipo dendrítico. En algunos casos, el enlazador de tipo dendrítico comprende un enlazador multifuncional de ramificación. En algunos casos, el enlazador de tipo dendrítico se utiliza para aumentar la relación molar entre el polinucleótido B y la fracción de unión A. En algunos casos, el enlazador de tipo dendrítico comprende dendrímeros PAMAM.
[0505] En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador sin rastro o un enlazador en el que tras la escisión no deja atrás una fracción de enlazador (por ejemplo, un átomo o un grupo enlazador) a una fracción de unión A, un polinucleótido B, un polímero C o una fracción endosomolítica D. Los enlazadores sin rastro ilustrativos incluyen, pero sin limitaciones, enlazadores de germanio, enlazadores de silicio, enlazadores de azufre, enlazadores de selenio, enlazadores nitrogenados, enlazadores de fósforo, enlazadores de boro, enlazadores de cromo o enlazador de fenilhidrazida. En algunos casos, el enlazador es un enlazador aril-triazeno sin rastro tal como se describe en Hejesen, et al., "A traceless aryl-triazene linker for DNA-directed chemistry," Org Biomol Chem 11(15): 2493-2497 (2013). En algunos casos, el enlazador es un enlazador sin rastro descrito en Blaney, et al., "Traceless solid-phase organic synthesis," Chem. Rev. 102: 2607-2024 (2002). En algunos casos, un enlazador es un enlazador sin rastro como se describe en la patente de Estados Unidos n.º 6.821.783.
[0506] En algunos casos, el enlazador es un enlazador descrito en las patentes de Estados Unidos n.º 6.884.869; 7.498.298; 8.288.352; 8.609.105; u 8.697.688; las publicaciones de patente de Estados Unidos n.º 2014/0127239; 2013/028919; 2014/286970; 2013/0309256; 2015/037360; o 2014/0294851; o las publicaciones PCT n.º WO2015057699; WO2014080251; WO2014197854; WO2014145090; o WO2014177042.
[0507] En algunas realizaciones, X<1>y X<2>son cada uno independientemente un enlace o un enlazador no polimérico. En algunos casos, X<1>y X<2>son cada uno independientemente un enlace. En algunos casos, X<1>y X<2>son cada uno independientemente un enlazador no polimérico.
[0508] En algunos casos, X<1>es un enlace o un enlazador no polimérico. En algunos casos, X<1>es un enlace. En algunos casos, X<1>es un enlazador no polimérico. En algunos casos, el enlazador es un grupo alquilo C<1>-C<6>. En algunos casos, X<1>es un grupo alquilo C<1>~C<6>, tal como, por ejemplo, un grupo alquilo C<5>, un grupo alquilo C<4>, C<3>, C<2>o C<1>. En algunos casos, el grupo alquilo C<1>-C<6>es un grupo alquilo C<1>-C<6>no sustituido. Tal como se utiliza en el contexto de un enlazador, y en particular en el contexto de X<1>, alquilo significa un radical hidrocarbonado saturado, lineal o ramificado, que contiene hasta seis átomos de carbono. En algunos casos, X<1>incluye un enlazador homobifuncional o un enlazador heterobifuncional descrito anteriormente. En algunos casos, X<1>incluye un enlazador heterobifuncional. En algunos casos, X<1>incluye sMCC. En otros casos, X<1>incluye un enlazador heterobifuncional opcionalmente conjugado con un grupo alquilo C<1>-C<6>. En otros casos, X<1>incluye sMCC opcionalmente conjugado con un grupo alquilo C<1>-C<6>. En casos adicionales, X<1>no incluye un enlazador homobifuncional o un enlazador heterobifuncional descrito anteriormente. En algunos casos, X<2>es un enlace o un enlazador. En algunos casos, X<2>es un enlace. En otros casos, X<2>es un enlazador. En casos adicionales, X<2>es un enlazador no polimérico. En algunas realizaciones, X<2>es un grupo alquilo C<1>-C<6>. En algunos casos, X<2>es un enlazador homobifuncional o un enlazador heterobifuncional descrito anteriormente. En algunos casos, X<2>es un enlazador homobifuncional descrito anteriormente. En algunos casos, X<2>es un enlazador heterobifuncional descrito anteriormente. En algunos casos, X<2>comprende un grupo maleimida, tal como maleimidocaproilo (mc) o un grupo maleimida autoestabilizador descrito anteriormente. En algunos casos, X<2>comprende una fracción peptídica, tal como Val-Cit. En algunos casos, X<2>comprende un grupo ácido benzoico, tal como PABA. En casos adicionales, X<2>comprende una combinación de un grupo maleimida, una fracción peptídica y/o un grupo ácido benzoico. En casos adicionales, X<2>comprende un grupo mc. En casos adicionales, X<2>comprende un grupo mc-val-cit. En casos adicionales, X<2>comprende un grupo val-cit-PABA. En casos adicionales, X<2>comprende un grupo mc-val-cit-PABA.
[0509] Métodos de uso
[0510] Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía o métodos de diagnóstico in vivo divulgados en el presente documento deben interpretarse como referencias a compuestos de la presente invención para su uso en esos métodos.
[0511] La distrofia muscular se refiere a una pérdida de masa muscular y/o a un debilitamiento y degeneración progresivos de los músculos. En algunos casos, la pérdida de masa muscular y/o el debilitamiento y degeneración progresivos de los músculos se producen debido a una elevada tasa de degradación de las proteínas, a una baja tasa de síntesis proteica o a una combinación de ambas. En algunos casos, una tasa elevada de degradación de las proteínas musculares se debe al catabolismo de las proteínas musculares (es decir, la degradación de las proteínas musculares para utilizar los aminoácidos como sustratos para la gluconeogénesis).
[0512] En una realización, la distrofia muscular se refiere a una pérdida significativa de fuerza muscular. Por pérdida significativa de fuerza muscular se entiende una reducción de la fuerza en tejido muscular enfermo, dañado o no utilizado en un sujeto en relación con el mismo tejido muscular en un sujeto de control. En una realización, una pérdida significativa de fuerza muscular es una reducción de la fuerza de al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 % o más en relación con el mismo tejido muscular en un sujeto de control. En otra realización, por pérdida significativa de fuerza muscular se entiende una reducción de la fuerza en el tejido muscular no utilizado en relación con la fuerza muscular del mismo tejido muscular en el mismo sujeto antes de un periodo de no utilización. En una realización, una pérdida significativa de fuerza muscular es una reducción de al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 % o más en relación con la fuerza muscular del mismo tejido muscular en el mismo sujeto antes de un período de no utilización.
[0513] En otra realización, la distrofia muscular se refiere a una pérdida significativa de masa muscular. Por pérdida significativa de masa muscular se entiende una reducción del volumen muscular en tejido muscular enfermo, dañado o no utilizado en un sujeto en relación con el mismo tejido muscular en un sujeto de control. En una realización, una pérdida significativa de volumen muscular es de al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 % o más en relación con el mismo tejido muscular en un sujeto de control. En otra realización, por pérdida significativa de masa muscular se entiende una reducción del volumen muscular en el tejido muscular no utilizado en relación con el volumen muscular del mismo tejido muscular en el mismo sujeto antes de un periodo de no utilización. En una realización, una pérdida significativa de tejido muscular es de al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 % o más en relación con el volumen muscular del mismo tejido muscular en el mismo sujeto antes de un período de no utilización. El volumen muscular se mide opcionalmente evaluando el área de la sección transversal de un músculo, tal como por ejemplo mediante imágenes de resonancia magnética (por ejemplo, mediante un método de resonancia magnética de volumen muscular/área de la sección transversal (CSA)).
[0515] La distrofia miotónica es una enfermedad neuromuscular multisistémica que comprende dos tipos principales: distrofia miotónica tipo 1 (DM1) y distrofia miotónica tipo 2 (DM2). La DM1 está causada por una expansión de la repetición "CTG" heredada de forma dominante en el gen de la proteína DM cinasa (DMPK), que al transcribirse en ARNm, forma horquillas que se unen con gran afinidad a la familia de proteínas Muscleblind-like (MBNL). Las proteínas MBNL están implicadas en el corte y empalme postranscripcional y en la regulación del sitio de poliadenilatina, y la pérdida de las funciones de la proteína MBNL conduce a la acumulación de focos nucleares y al aumento de los eventos de corte y empalme erróneo y, posteriormente, a miotonía y a otros síntomas clínicos.
[0517] En algunas realizaciones, en el presente documento se describe un método para tratar la distrofia muscular (por ejemplo, DM1) en un sujeto, el método comprende proporcionar una molécula de ácido polinucleico descrita en el presente documento o un conjugado de molécula de ácido polinucleico descrito en el presente documento y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de ácido polinucleico o del conjugado de molécula de ácido polinucleico al sujeto que lo necesita para tratar la distrofia muscular, en donde el conjugado de ácido polinucleico reduce una cantidad del transcrito de ARNm de la DMPK humana. En algunas realizaciones, la administración del conjugado de molécula de ácido polinucleico al sujeto reduce la cantidad del transcrito de ARNm de la DMPK humana al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 % del nivel de expresión de ARNm de DMPK de un paciente sin el tratamiento con el conjugado de molécula de ácido polinucleico.
[0519] Formulaciones farmacéuticas
[0521] En algunas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento se administran a un sujeto por múltiples vías de administración, incluidas, pero sin limitación, parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), oral, intranasal, bucal, rectal o transdérmica. En algunos casos, la composición farmacéutica descrita en el presente documento está formulada para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intracerebral, intracerebroventricular o intracraneal). En otros casos, la composición farmacéutica descrita en el presente documento está formulada para administración oral. En aún otros casos, la composición farmacéutica descrita en el presente documento está formulada para administración intranasal.
[0523] En algunas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas incluyen, pero sin limitaciones, dispersiones líquidas acuosas, dispersiones autoemulsionantes, soluciones sólidas, dispersiones liposómicas, aerosoles, formas farmacéuticas sólidas, polvos, formulaciones de liberación inmediata, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de fusión rápida, comprimidos, cápsulas, píldoras, formulaciones de liberación retardada, formulaciones de liberación extendida, formulaciones de liberación pulsátil, formulaciones multiparticuladas (por ejemplo, formulaciones de nanopartículas) y formulaciones mixtas de liberación inmediata y controlada.
[0525] En algunos casos, la formulación farmacéutica incluye formulaciones multiparticuladas. En algunos casos, la formulación farmacéutica incluye formulaciones de nanopartículas. En algunos casos, las nanopartículas comprenden cMAP, ciclodextrina o lípidos. En algunos casos, las nanopartículas comprenden nanopartículas lipídicas sólidas, nanopartículas poliméricas, nanopartículas autoemulsionables, liposomas, microemulsiones o soluciones micelares. Otras nanopartículas ilustrativas incluyen, pero sin limitaciones, nanopartículas paramagnéticas, nanopartículas supermagnéticas, nanopartículas metálicas, materiales similares a los fullerenos, nanotubos inorgánicos, dendrímeros (tales como quelatos metálicos unidos covalentemente), nanofibras, nanohorns, nano-iones, nanovarillas, nanoropos y puntos cuánticos. En algunos casos, una nanopartícula es una nanopartícula metálica, por ejemplo, una nanopartícula de escandio, titanio, vanadio, cromo, manganeso, hierro, cobalto, níquel, cobre, cinc, itrio, circonio, niobio, molibdeno, rutenio, rodio, paladio, plata, cadmio, hafnio, tantalio, wolframio, renio, osmio, iridio, platino, oro, gadolinio, aluminio, galio, indio, estaño, talio, plomo, bismuto, magnesio, calcio, estroncio, bario, litio, sodio, potasio, boro, silicio, fósforo, germanio, arsénico, antimonio y combinaciones, aleaciones u óxidos de los mismos.
[0526] En algunos casos, una nanopartícula incluye un núcleo o un núcleo y una cobertura, tal como en una nanopartícula de núcleo-cobertura.
[0527] En algunos casos, una nanopartícula se recubre además con moléculas para la unión de elementos funcionales (por ejemplo, con una o más de una molécula de ácido polinucleico o una fracción de unión descrita en el presente documento). En algunos casos, un recubrimiento comprende condroitín sulfato, sulfato de dextrano, carboximetil dextrano, ácido algínico, pectina, carragenano, fucoidano, agaropectina, porfirano, goma karaya, goma gellan, goma xantana, ácido hialurónico, glucosamina, galactosamina, quitina (o quitosano), ácido poliglutámico, ácido poliaspártico, lisozima, citocromo C, ribonucleasa, tripsinógeno, quimotripsinógeno, α-quimotripsina, polilisina, poliarginina, histona, protamina, ovoalbúmina o dextrina o ciclodextrina. En algunos casos, una nanopartícula comprende una nanopartícula recubierta de grafeno.
[0528] En algunos casos, una nanopartícula tiene al menos una dimensión inferior a aproximadamente 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm o 100 nm.
[0529] En algunos casos, la formulación de nanopartículas comprende nanopartículas paramagnéticas, nanopartículas supermagnéticas, nanopartículas metálicas, materiales similares a los fullerenos, nanotubos inorgánicos, dendrímeros (tales como quelatos metálicos unidos covalentemente), nanofibras, nanohorns, nano-iones, nanovarillas, nanocuerdas o puntos cuánticos. En algunos casos, una molécula de ácido polinucleico o una fracción de unión descrita en el presente documento se conjuga directa o indirectamente con la nanopartícula. En algunos casos, al menos 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más moléculas de ácido polinucleico o moléculas de unión descritas en el presente documento se conjugan directa o indirectamente con una nanopartícula.
[0530] En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende un vector de administración, por ejemplo, un vector recombinante, la administración de la molécula de ácido polinucleico a las células. En algunos casos, el vector recombinante es un plásmido de ADN. En otros casos, el vector Recombinante es un vector viral. Los vectores virales ilustrativos incluyen vectores derivados de virus adeno-asociados, retrovirus, adenovirus o alfavirus. En algunos casos, los vectores recombinantes capaces de expresar las moléculas de ácido polinucleico proporcionan una expresión estable en las células diana. En casos adicionales, se utilizan vectores virales que permiten la expresión transitoria de moléculas de ácido polinucleico.
[0531] En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica incluye un vehículo o materiales vehículo seleccionados en función de su compatibilidad con la composición divulgada en el presente documento y de las propiedades del perfil de liberación de la forma farmacéutica deseada. Los materiales vehículo ilustrativos incluyen, por ejemplo, aglutinantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes, agentes de relleno, tensioactivos, solubilizantes, estabilizantes, lubricantes, agentes humectantes, diluyentes y similares. Los materiales vehículo farmacéuticamente compatibles incluyen, pero sin limitaciones, goma arábiga, gelatina, dióxido de silicio coloidal, glicerofosfato de calcio, lactato de calcio, maltodextrina, glicerina, silicato de magnesio, polivinilpirrollidona (PVP), colesterol, ésteres de colesterol, caseinato de sodio, lecitina de soja, ácido taurocólico, fosfotidilcolina, cloruro de sodio, fosfato tricálcico, fosfato dipotásico, celulosa y conjugados de celulosa, azúcares estearoil lactilato de sodio, carragenano, monoglicérido, diglicérido, almidón pregelatinizado y similares. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, decimonovena edición (Easton, Pa., Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, 1975; Liberman, H.A. y Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, Nueva York, N.Y., 1980; y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Séptima edición. (Lippincott Williams & Wilkins, 1999).
[0532] En algunos casos, la formulación farmacéutica incluye además agentes de ajuste del pH o agentes tamponadores que incluyen ácidos tales como los ácidos acético, bórico, cítrico, láctico, fosfórico y clorhídrico; bases tales como hidróxido de sodio, fosfato de sodio, borato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio, lactato de sodio y trishidroximetilaminometano; y tampones tales como citrato/dextrosa, bicarbonato de sodio y cloruro de amonio. Dichos ácidos, bases y tampones se incluyen en una cantidad necesaria para mantener el pH de la composición en un intervalo aceptable.
[0533] En algunos casos, la formulación farmacéutica incluye una o más sales en una cantidad necesaria para llevar la osmolalidad de la composición a un intervalo aceptable. Dichas sales incluyen aquellas que tienen sodio, cationes de potasio o amonio y aniones cloruro, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonato, sulfato, tiosulfato o bisulfito; las sales adecuadas incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, tiosulfato de sodio, bisulfito de sodio y sulfato de amonio. En algunos casos, la formulación farmacéutica incluye además diluyentes que se utilizan para estabilizar los compuestos porque proporcionan un entorno más estable. Las sales disueltas en soluciones tamponadas (que también proporcionan control o mantenimiento del pD) se utilizan como diluyentes en la técnica, incluidas, pero sin limitación, una solución salina tamponada con fosfato. En determinados casos, los diluyentes aumentan el volumen de la composición para facilitar la compresión o crear un volumen suficiente para una mezcla homogénea para el llenado de la cápsula. Dichos compuestos incluyen, por ejemplo, lactosa, almidón, manitol, sorbitol, dextrosa, celulosa microcristalina tal como Avicel<®>; fosfato cálcico dibásico, fosfato dicálcico dihidratado; fosfato tricálcico, fosfato de calcio; lactosa anhidra, lactosa secada por pulverización; almidón pregelatinizado, azúcar comprimible, tal como Di-Pac<®>(Amstar); manitol, hidroxipropilmetilcelulosa, estearato de acetato de hidroxipropilmetilcelulosa, diluyentes a base de sacarosa, azúcar de confitería; sulfato de calcio monobásico monohidratado, sulfato de calcio dihidratado; lactato de calcio trihidratado, dextratos; sólidos de cereales hidrolizados, amilosa; celulosa en polvo, carbonato de calcio; glicina, caolín; manitol, cloruro de sodio; inositol, bentonita y similares.
[0534] En algunos casos, la formulación farmacéutica incluye agentes de disgregación o disgregantes para facilitar la ruptura o disgregación de una sustancia. El término "disgregar" incluye tanto la disolución como la dispersión de la forma farmacéutica al entrar en contacto con el fluido gastrointestinal. Ejemplos de agentes de desintegración incluyen almidón, por ejemplo, un almidón natural tal como almidón de maíz o almidón de patata, un almidón pregelatinizado tal como National 1551 o Amijel<®>, o almidón glicolato sódico tal como Promogel<®>o Explotab<®>, una celulosa tal como un producto de la madera, celulosa metilcristalina, por ejemplo, Avicel<®>, Avicel<®>PH101, Avicel<®>PH102, Avicel<®>PH105, Elcema<®>P100, Emcocel<®>, Vivacel<®>, Ming Tia<®>y Solka-Floc<®>, metilcelulosa, croscarmelosa, o una celulosa reticulada, tal como carboximetilcelulosa sódica reticulada (Ac-Di-Sol<®>), carboximetilcelulosa reticulada o croscarmelosa reticulada, un almidón reticulado tal como glicolato sódico de almidón, un polímero reticulado tal como crospovidona, una polivinilpirrolidona reticulada, alginato, tal como ácido algínico o una sal del ácido algínico, tal como alginato de sodio, una arcilla tal como Veegum® HV (silicato de magnesio y aluminio), una goma tal como agar, goma guar, algarrobo, karaya, pectina o tragacanto, almidón glicolato de sodio, bentonita, una esponja natural, un tensioactivo, una resina tal como una resina de intercambio catiónico, pulpa de cítricos, laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de sodio en combinación con almidón y similares.
[0535] En algunos casos, la formulación farmacéutica incluye agentes de carga tal como lactosa, carbonato de calcio, fosfato de calcio, fosfato cálcico dibásico, sulfato de calcio, celulosa microcristalina, polvo de celulosa, dextrosa, dextratos, dextrano, almidones, almidón pregelatinizado, sacarosa, xilitol, lactitol, manitol, sorbitol, cloruro de sodio, polietilenglicol y similares.
[0536] Los lubricantes y deslizantes también se incluyen opcionalmente en las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento para prevenir, reducir o inhibir la adherencia o fricción de los materiales. Los lubricantes ilustrativos incluyen, por ejemplo, ácido esteárico, hidróxido de calcio, talco, estearilfumarato de sodio, un hidrocarburo tal como aceite mineral o aceite vegetal hidrogenado tal como aceite de soja hidrogenado (Sterotex<®>), ácidos grasos superiores y sus sales de metales alcalinos y alcalinotérreos, tales como aluminio, calcio, magnesio, cinc, ácido esteárico, estearatos de sodio, glicerol, talco, ceras, Stearowet<®>, ácido bórico, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, un polietilenglicol (por ejemplo, PEG-4000) o un metoxipolietilenglicol tal como Carbowax®, oleato de sodio, benzoato de sodio, behenato de glicerilo, polietilenglicol, lauril sulfato de magnesio o sodio, sílice coloidal tal como Syloid<™>, Cab-O-Sil<®>, un almidón tal como almidón de maíz, aceite de silicona, un tensioactivo y similares.
[0537] Los plastificantes incluyen compuestos utilizados para ablandar el material de microencapsulación o los recubrimientos peliculares para hacerlos menos quebradizos. Algunos plastificantes adecuados incluyen, por ejemplo, polietilenglicol tal como PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350 y PEG 800, ácido esteárico, propilenglicol, ácido oleico, trietilcelulosa y triacetina. Los plastificantes también pueden funcionar como agentes dispersantes o agentes humectantes.
[0538] Los solubilizantes incluyen compuestos tales como triacetina, citrato de trietilo, oleato de etilo, caprilato de etilo, laurilsulfato de sodio, docusato de sodio, vitamina E TPGS, dimetilacetamida, N-metilpirrolidona, N-hidroxietilpirrolidona, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilciclodextrinas, etanol, n-butanol, alcohol isopropílico, colesterol, sales biliares, polietilenglicol 200-600, glicofurol, transcutol, propilenglicol e isosorbida de dimetilo y similares.
[0539] Los estabilizadores incluyen compuestos tales como cualquier agente antioxidante, tampones, ácidos, conservantes y similares.
[0540] Los agentes de suspensión incluyen compuestos tales como polivinilpirrolidona, por ejemplo, polivinilpirrolidona K12, polivinilpirrolidona K17, polivinilpirrolidona K25 o polivinilpirrolidona K30, copolímero de vinilpirrolidona/acetato de vinilo (S630), polietilenglicol, por ejemplo, el polietilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 300 a aproximadamente 6000 o de aproximadamente 3350 a aproximadamente 4000 o de aproximadamente 7000 a aproximadamente 5400, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, estearato de acetato de hidroximetilcelulosa, polisorbato-80, hidroxietilcelulosa, alginato de sodio, gomas, tal como, por ejemplo, goma de tragacanto y goma arábiga, goma guar, xantanos, incluyendo goma xantana, azúcares, celulosas, tal como, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polisorbato-80, alginato de sodio, monolaurato de sorbitán polietoxilado, monolaurato de sorbitán polietoxilado, povidona y similares.
[0541] Los tensioactivos incluyen compuestos tales como lauril sulfato sódico, docusato de sodio, Tween 60 u 80, triacetina, vitamina E TPGS, monooleato de sorbitán, monooleato de polioxietilensorbitán, polisorbatos, polaxómeros, sales biliares, monoestearato de glicerilo, copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno, por ejemplo, Pluronic<®>(BASF) y similares. Algunos tensioactivos diferentes incluyen glicéridos de ácidos grasos de polioxietileno y aceites vegetales, por ejemplo, aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado (60); y alquiléteres y alquilfeniléteres de polioxietileno, por ejemplo, octoxinol 10, octoxinol 40. Algunas veces, pueden incluirse tensioactivos para mejorar la estabilidad física o para otros fines.
[0542] Entre los agentes mejoradores de la viscosidad se incluyen, por ejemplo, metilcelulosa, goma xantana, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, estearato de acetato de hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, carbómero, alcohol polivinílico, alginatos, goma arábiga, quitosanos y combinaciones de los mismos.
[0543] Los agentes humectantes incluyen compuestos tales como ácido oleico, monoestearato de glicerilo, monooleato de sorbitán, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, monooleato de polioxietilensorbitán, monolaurato de polioxietilen sorbitano, docusato de sodio, oleato de sodio, laurilsulfato de sodio, docusato de sodio, triacetina, Tween 80, vitamina E TPGS, sales de amonio y similares.
[0544] Pautas terapéuticas
[0545] Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía o métodos de diagnóstico in vivo divulgados en el presente documento deben interpretarse como referencias a compuestos de la presente invención para su uso en esos métodos.
[0546] En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se administran para aplicaciones terapéuticas. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra una vez al día, dos veces al día, tres veces al día o más. La composición farmacéutica se administra diariamente, cada día, en días alternos, cinco días a la semana, una vez a la semana, cada dos semanas, dos semanas al mes, tres semanas al mes, una vez al mes, dos veces al mes, tres veces al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, una vez cada seis meses o más. La composición farmacéutica se administra durante al menos 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 18 meses, 2 años, 3 años o más.
[0547] En algunas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas se administran simultáneamente, secuencialmente, o en un intervalo de tiempo. En algunas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas se administran simultáneamene. En algunos casos, una o más composiciones farmacéuticas se administran secuencialmente. En casos adicionales, una o más composiciones farmacéuticas se administran en un periodo de tiempo de intervalo (por ejemplo, la primera administración de una primera composición farmacéutica es el día uno seguido de un intervalo de al menos 1, 2, 3, 4, 5, o más días antes de la administración de al menos una segunda composición farmacéutica).
[0548] En algunas realizaciones, se coadministran dos o más composiciones farmacéuticas diferentes. En algunos casos, las dos o más composiciones farmacéuticas diferentes se coadminstran simultáneamente. En algunos casos, las dos o más composiciones farmacéuticas diferentes se coadministran secuencialmente sin un intervalo de tiempo entre administraciones. En otros casos, las dos o más composiciones farmacéuticas diferentes se coadministran secuencialmente con un intervalo de aproximadamente 0,5 hora, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 12 horas, 1 día, 2 días o más entre administraciones.
[0549] En el caso en donde el estado del paciente sí mejora, a discreción del médico, la administración de la composición se administra de forma continua; como alternativa, la dosis de la composición que se administra se reduce temporalmente o se suspende temporalmente durante un determinado periodo de tiempo (es decir, un "descanso farmacológico"). En algunos casos, la duración del descanso del fármaco varía entre 2 días y 1 año, incluyendo solamente a modo de ejemplo, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días, 12 días, 15 días, 20 días, 28 días, 35 días, 50 días, 70 días, 100 días, 120 días, 150 días, 180 días, 200 días, 250 días, 280 días, 300 días, 320 días, 350 días o 365 días. La reducción de la dosis durante el descanso del fármaco es del 10 %-100 %, incluidas, a modo de ejemplo únicamente, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %.
[0550] Una vez que se ha producido la mejoría de las afecciones del paciente, se administra una dosis de mantenimiento si es necesario. Posteriormente, la dosis o la frecuencia de administración, o ambas, pueden reducirse, en función de los síntomas, hasta un nivel en el que se conserva la enfermedad, trastorno o afección mejorada.
[0551] En algunas realizaciones, la cantidad de un agente concreto que corresponde a dicha cantidad varía dependiendo de factores tales como el compuesto en particular, la gravedad de la enfermedad, la identidad (por ejemplo, el peso) del sujeto o huésped que necesita tratamiento, pero puede determinarse de manera rutinaria de una manera conocida en la técnica de acuerdo con las circunstancias particulares que rodean el caso, incluidas, por ejemplo, el agente específico que se esté administrando, la vía de administración y el sujeto o huésped tratado. En algunos casos, la dosis deseada se presenta convenientemente en una sola dosis o como dosis divididas administradas simultáneamente (o durante un periodo corto de tiempo) o en intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más subdosis al día.
[0552] Los intervalos anteriores son meramente sugerentes, ya que el número de variables con respecto a un régimen de tratamiento individual es grande, y no son infrecuentes desviaciones considerables de estos valores recomendados. Dichas dosis se modifican dependiendo de una serie de variables, no limitadas a la actividad del compuesto utilizado, la enfermedad o afección a tratar, el modo de administración, los requisitos del sujeto individual, la gravedad de la enfermedad o afección que se está tratando, y el criterio del médico.
[0553] En algunas realizaciones, la toxicidad y la eficacia terapéutica de dichas pautas terapéuticas se determinan mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, incluyendo, pero sin limitación, la determinación de la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se expresa como la relación entre la DL50 y la DE50. Se prefieren los compuestos que presentan índices terapéuticos altos. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios animales se usan en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en un ser humano. La dosis de dichos compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con toxicidad mínima. La dosis varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada.
[0554] Kits/artículos de fabricación
[0555] En el presente documento se divulgan kits y artículos de fabricación para utilizar con uno o más de las composiciones y métodos descritos en el presente documento. Dichos kits incluyen un portador, envase o recipiente que está compartimentado para recibir uno o más recipientes tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada uno de los recipientes uno de los elementos separados que se usarán en un método descrito en el presente documento. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas y tubos de ensayo. En una realización, los recipientes se forman a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico.
[0556] Los artículos de fabricación proporcionados en el presente documento contienen materiales de envasado. Los ejemplos de materiales de acondicionamiento farmacéutico incluyen, pero sin limitaciones, envases alveolados, frascos, tubos, bolsas, recipientes, frascos y cualquier material de acondicionamiento adecuado para una formulación y un modo previsto de administración y de tratamiento.
[0557] Por ejemplo, el (los) recipiente(s) incluye(n) la molécula de ácido nucleico diana descrita en el presente documento. Dichos kits incluyen opcionalmente una descripción o etiqueta o instrucciones identificativas relativas a su uso en los métodos descritos en el presente documento.
[0558] Un kit incluye normalmente etiquetas con una lista del contenido y/o instrucciones de uso y prospectos con instrucciones de uso. Normalmente también se incluirá un conjunto de instrucciones.
[0559] En una realización, una etiqueta se encuentra sobre o asociada con el recipiente. En una realización, una etiqueta está sobre un recipiente cuando las letras, números u otros caracteres que forman la etiqueta se adhieren, moldean o graban en el propio recipiente; una etiqueta está asociada con un recipiente cuando está presente en un receptáculo o contenedor que también contiene al recipiente, por ejemplo, en forma de un prospecto. En una realización, se usa una etiqueta para indicar que el contenido se va a usar para una aplicación terapéutica específica. La etiqueta también indica instrucciones de uso del contenido, tal como en los métodos descritos en el presente documento.
[0560] En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se presentan en un paquete o dispositivo dispensador que contiene una o más formas farmacéuticas unitarias que contienen un compuesto proporcionado en el presente documento. El paquete, por ejemplo, contiene papel metálico o de plástico, tal como un envase de tipo blíster. En una realización, el paquete o dispositivo dispensador va acompañado de instrucciones para la administración. En una realización, el paquete o dispensador también va acompañado de una nota asociada con el contenedor en la forma indicada por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos, reflejando dicha nota la aprobación por el organismo de la forma del fármaco para la administración veterinaria o a seres humanos. Dicha nota, por ejemplo, es el etiquetado aprobado por la Administración de fármacos y alimentos de los Estados Unidos para fármacos con receta o el prospecto de producto aprobado. En una realización, las composiciones que contienen un compuesto proporcionado en el presente documento formulado en un transportador farmacéutico compatible también se preparan, disponen en un recipiente adecuado y marcan para el tratamiento de una afección indicada.
[0561] Terminología específica
[0562] A menos que definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la materia objeto reivindicada. Debe entenderse que la descripción general anterior y la siguiente descripción detallada son solo ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de ninguna materia objeto reivindicada. En la presente solicitud, el uso del singular incluye el plural, a menos que se indique específicamente otra cosa. Cabe señalar que, como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En la presente solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique otra cosa. De manera adicional, el uso de la expresión "que incluye", así como otras formas, tales como "incluyen", "incluye", e "incluido/a", no es limitante.
[0563] Como se utiliza en el presente documento, los intervalos y cantidades pueden expresarse como "aproximadamente" un valor o intervalo concreto. El término "aproximadamente" también incluye la cantidad exacta. Por lo tanto, "aproximadamente 5 µl" significa "aproximadamente 5 µl" y también "5 µl". En general, el término "aproximadamente" incluye una cantidad que pueda esperarse que se encuentre dentro del error experimental.
[0564] Los encabezados de sección utilizados en el presente documento tienen únicamente fines organizativos y no han de interpretarse como una limitación de la materia objeto descrita.
[0565] Como se utiliza en el presente documento, los términos "individuo(s)", "sujeto(s)" y "paciente(s)" significan cualquier mamífero. En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano. En algunas realizaciones, el mamífero no es humano. Ninguno de los términos requiere ni está limitado a situaciones caracterizadas por la supervisión (por ejemplo, constante o intermitente) de un profesional sanitario (por ejemplo, un médico, un profesional de enfermería acreditado, un profesional de enfermería facultativo, un medico asistente, un auxiliar o un trabajador de cuidados paliativos). La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un conjugado de molécula de ácido polinucleico que es suficiente para proporcionar un efecto terapéutico deseado en un sujeto mamífero. En algunos casos, la cantidad es la administración de una o más dosis a un paciente (tal como un ser humano) para tratar, prevenir, prevenir la aparición, curar, retrasar, reducir la gravedad, mejorar al menos un síntoma de un trastorno o trastorno recurrente o prolongar la supervivencia del paciente más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento. Naturalmente, los niveles de dosificación del conjugado de molécula de ácido polinucleico concreto empleado para proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz varían en función del tipo de lesión, la edad, el peso, el sexo, el estado médico del sujeto, la gravedad de la afección, la vía de administración y el inhibidor concreto empleado. En algunos casos, las cantidades terapéuticamente eficaces de conjugado de molécula de ácido polinucleico, como se describe en el presente documento, se estiman inicialmente a partir de cultivos celulares y modelos animales. Por ejemplo, los valores de CI<50>determinados en métodos de cultivo celular sirven opcionalmente como punto de partida en modelos animales, mientras que los valores de CI<50>determinados en modelos animales se utilizan opcionalmente para encontrar una dosis terapéuticamente eficaz en seres humanos.
[0566] El músculo esquelético o músculo voluntario, suele estar anclado al hueso mediante tendones y se utiliza generalmente para efectuar movimientos esqueléticos como la locomoción o el mantenimiento de la postura. Aunque generalmente se mantiene cierto control de los músculos esqueléticos como reflejo inconsciente (por ejemplo, los músculos posturales o el diafragma), los músculos esqueléticos reaccionan al control consciente. El músculo liso o músculo involuntario, se encuentra en las paredes de órganos y estructuras como el esófago, el estómago, los intestinos, el útero, la uretra y los vasos sanguíneos.
[0567] El músculo esquelético se divide a su vez en dos grandes tipos: Tipo I (o "contracción lenta") y Tipo II (o "contracción rápida"). Las fibras musculares de tipo I son densas en los capilares y ricas en mitocondrias y mioglobina, lo que da al tejido muscular de tipo I un color rojo característico. En algunos casos, las fibras musculares de tipo I transportan más oxígeno y mantienen la actividad aeróbica utilizando grasas o hidratos de carbono como combustible. Las fibras musculares de tipo I se contraen durante largos periodos de tiempo pero con poca fuerza. Las fibras musculares de tipo II se subdividen a su vez en tres subtipos principales (IIa, IIx, y IIb) que varían tanto en velocidad contráctil como en fuerza generada. Las fibras musculares de tipo II se contraen de forma rápida y potente, pero se fatigan muy rápidamente, por lo que sólo producen breves explosiones anaeróbicas de actividad antes de que la contracción muscular se vuelva dolorosa.
[0568] A diferencia del músculo esquelético, el músculo liso no está bajo control consciente.
[0569] El músculo cardíaco también es un músculo involuntario, pero su estructura se asemeja más a la del músculo esquelético y sólo se encuentra en el corazón. Los músculos cardíacos y esqueléticos son estriados en el sentido de que contienen sarcómeros agrupados en haces muy regulares. Por el contrario, las miofibrillas de las células musculares lisas no están dispuestas en sarcómeros y, por lo tanto, no son estriadas.
[0570] Las células musculares abarcan todas las células que contribuyen al tejido muscular. Algunos ejemplos de células musculares incluyen mioblastos, células satélite, miotubos y tejidos de miofibrillas.
[0571] Tal como se usa en el presente documento, la fuerza muscular es proporcional al área de la sección transversal (CSA) y la velocidad muscular es proporcional a la longitud de la fibra muscular. Por lo tanto, la comparación de las áreas transversales y las fibras musculares entre varios tipos de músculos es capaz de proporcionar una indicación de la atrofia muscular. En la técnica se conocen varios métodos para medir la fuerza del músculo y el peso muscular, véase, por ejemplo, "Musculoskeletal assessment: Joint range of motion and manual muscle strength" by Hazel M. Clarkson, publicado por Lippincott Williams & Wilkins, 2000. La producción de imágenes tomográficas de tejidos musculares seleccionados mediante tomografía axial computarizada y la evaluación ecográfica son métodos adicionales de medición de la masa muscular.
[0572] Ejemplos
[0573] Estos ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos únicamente y no limitan el alcance de las reivindicaciones proporcionadas en el presente documento.
[0574] Ejemplo 1. Anticuerpo conjugado con ARNip
[0575] El DMPK-AOC es un producto farmacológico conjugado de anticuerpo-ARNip formado por la conjugación de un anticuerpo IgG1 humanizado (anticuerpo contra el receptor de transferrina humano) dirigido al receptor de transferrina humano 1 y un oligonucleótido de ARNip de doble cadena (ARNip de DMPK) dirigido al ARNm de DMPK (FIG. 1). El enlazador maleimida SMCC está situado en el extremo 5' de la cadena pasajera y se conjuga con el anticuerpo a través de una de las cisteínas de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. El conjugado se une al receptor de transferrina humana en la superficie celular, se internaliza en la célula y lleva el oligonucleótido de ARNip al compartimento intracelular. Tras su absorción por las células, el ARNip se carga en el RISC e hidroliza el ARNm DMPK patogénico diana.
[0576] El anticuerpo contra el receptor de transferrina humano y el ARNip DMPK utilizados en la creación de DMPK-AOC se producen utilizando procesos de fabricación bien establecidos por Organizaciones de Desarrollo y Fabricación por Contrato (CDMO) comerciales que cumplen las normas de BPC. El anticuerpo contra el receptor de transferrina humano se produce utilizando tecnología de expresión de proteína recombinante en células CHO y el ARNip DMPK se produce utilizando química sintética estándar de fase sólida de fosforamidita. Como se utiliza en el presente documento, El ARNip de DMPK es un oligonucleótido de ARNip de doble cadena dirigido al ARNm DMPK que también está conjugado con el enlazador SMCC unido al extremo 5' de la cadena pasajera. Cada uno de ellos está completamente caracterizado y formalmente liberado. DMPK-AOC se produce utilizando una reacción estándar de bioconjugación de cisteína aleatoria del anticuerpo contra el receptor de transferrina humano con la maleimida del ARNip DMPK, seguida de una purificación por cromatografía de intercambio aniónico para aislar el conjugado a granel que se convierte en el DMPK-AOC acabado. A continuación, el DMPK-AOC terminado se libera formalmente utilizando la metodología estándar para las terapias proteicas. Una vez finalizada la fabricación, las pruebas y la liberación, cada uno de los anticuerpos y el ARNip de DMPK se bioconjugan juntos para formar la sustancia farmacológica.
[0577] Ejemplo 2. Fabricación del anticuerpo AV01AcMo
[0578] Banco celular - Se construyó un banco celular de investigación estable (RCB) de la línea celular estable utilizando células de trabajo huésped CHOK1SV y se confirmó que estaba libre de contaminación por micoplasmas, bacterias, mohos y levaduras. Se ha preparado un banco celular maestro (MCB) de 200 viales utilizando un vial del banco celular de investigación.
[0579] Producción de anticuerpos a partir del banco celular maestro - Las células de una ampolla del banco celular maestro se aumentaron progresivamente de volumen utilizando un medio libre de proteínas antes de inocularlas en el biorreactor de producción. Procesamiento posterior - Una vez finalizado el cultivo celular, las células y los restos celulares se eliminaron por filtración del cultivo.
[0580] Ejemplo 3. Caracterización estructural del anticuerpo contra el receptor de transferrina humano.
[0581] Estructura - Se ha determinado una secuencia de aminoácidos para las cadenas pesada y ligera a partir de la traducción de la secuencia de nucleótidos del anticuerpo receptor de transferrina antihumano.
[0582] Secuencia de la cadena pesada del anticuerpo contra el receptor de transferrina humano- SEQ ID NO: 48
[0583]
[0585] Secuencia de la cadena pesada del anticuerpo contra el receptor de transferrina humano- SEQ ID NO: 63
[0588]
[0590] Ejemplo 4: ARNip de DMPK
[0591] El ARNip de DMPK es un oligonucleótido dúplex sintético que contiene una cadena pasajera de 19 marcadores y una cadena guía complementaria de 21 marcadores con un saliente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la cadena guía. Un enlazador C6-SMCC {4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxiamida} se une al extremo 5' de la hebra pasajera para permitir la conjugación con el Intermedio de Anticuerpo. La secuencia de nucleótidos y los enlaces internucleotídicos se muestran en la Tabla 11.
[0593] TABLA 11
[0596]
[0598] Las cadenas simples de ARN (cadena guía y cadena pasajera) se producen individualmente mediante síntesis en fase sólida, utilizando métodos bien establecidos de síntesis en fase sólida de fosforamidita. A continuación, las cadenas simples purificadas y liofilizadas forman dúplex en proporciones equimolares para generar ARNip bicatenario. El enlazador SMCC se conjuga con el asa de conjugación de amina primaria en el extremo 5' de la cadena sentido del ARNip utilizando la química estándar de N-hidroxi succinimida. El exceso de enlazador SMCC sin reaccionar se elimina mediante la etapa UF/DF y se libera el SMCC-ARNip resultante.
[0599] Ejemplo 5: Selección de anticuerpos
[0600] Criterios de selección de anticuerpos: Se probaron varios anticuerpos contra el receptor de transferrina humano 1 (TfR1) mediante ELISA y se descubrió que se unen al receptor con gran afinidad. También se comprobó la unión de estos anticuerpos a TfR1 de mono cynomolgus para garantizar la reactividad cruzada entre especies. Se evaluó la especificidad de un anticuerpo monoclonal (AcMo) IgG2a de ratón que se une tanto al TfR1 humano como al del mono cynomolgus demostrando la ausencia de unión al receptor de transferrina 2 (TfR2), estrechamente relacionado, mediante ELISA (FIG. 3). El anticuerpo comercial anti-TfR2 B-6 muestra una clara unión a TfR2 mediante ELISA, Mientras que el AcMo de ratón anti-TfR1 humano no se une a TfR2 a concentraciones de hasta 10 µM. También se evaluó la unión del AcMo anti-TfR1 humano de ratón en presencia de los ligandos de unión a TfR1 transferrina (Tf) y regulador homeostático del hierro (HFE), con el AcMo de TfR1 manteniendo una fuerte unión a TfR1 incluso en presencia de ligandos de TfR1 (FIG.4). Como se muestra en la figura 4, los anticuerpos se unieron a TfR1 directamente o a TfR1 preunida a cofactores transferrina (Tf) o HFE. AF2474 es un anticuerpo disponible comercialmente que se sabe que se une al mismo epítopo TfR1 que la transferrina o el HFE. El AcMo anti-TfR1 humano de ratón muestra cierta pérdida de unión entre la interacción directa con TfR1 en comparación con el complejo cofactor, pero el cambio en la afinidad es mínimo en comparación con AF2474. De manera destacada, se espera que la competencia del AcMo de TfR1 con los ligandos naturales para TfR1 sea tóxica debido al potencial de bloqueo de la importación de hierro en las células; por lo tanto, el AcMo de TfR1 identificado debía unirse a un epítopo de TfR1 que minimizara la competencia con los ligandos naturales. Dado que cumplía todos estos criterios de selección, el AcMo IgG2a de ratón anti-TfR1 humano se trasladó a un programa de humanización para desarrollar un anticuerpo adecuado para el desarrollo clínico.
[0601] Ejemplo 6: Actividad in vivo
[0602] Las DMPK-AOC se utilizaron para estudios in vivo en ratones. Los estudios in vivo de AOC en ratones utilizaron un anticuerpo sustituto anti-TfR1 que se une a TfR1 de ratón, ya que el anticuerpo humano principal AV01Ab no presenta reacción cruzada con TfR1 de ratón (sólo humano y de mono). El siDMPK.36 de reacción cruzada de ratón se conjugó con AcMo anti-TfR1 de ratón y los conjugados se administraron a ratones CD-1 hembra de tipo salvaje (n=4 por grupo) mediante inyección IV, se recogieron los tejidos y se evaluó la reducción del ARNm de la DMPK 7 días después de la dosis. Los AOC se administraron en dosis de 3, 1, 0,3 y 0,1 mg/kg (basadas en el peso del ARNip), resultando en una reducción del 80 % en la expresión de DMPK en los músculos esqueléticos con la dosis de 3 mg/kg (FIG.5). El DMPK-AOC mostró una actividad robusta con una DE50 < 1 mg/kg y una CE50 de aproximadamente 3 nM. El ARNip de secuencia codificada de control negativo no mostró reducción del ARNm de DMPK, demostrando la especificidad de la actividad DMPK-AOC.
[0603] El DMPK-AOC reactivo cruzado de ratón se conjugó con AcMo anti-TfR1 de ratón y el conjugado se administró a ratones CD-1 hembra de tipo salvaje (n=4 por grupo) mediante inyección IV a 3 mg/kg (basado en el peso del ARNip). Se recogieron los tejidos y se evaluó la reducción del ARNm de la DMPK cada semana hasta 5 semanas después de la dosis (FIG.6). Entre 7 y 35 días después de la dosis, se alcanzó la máxima reducción de DMPK (aproximadamente el 75 %) en los músculos esqueléticos. En el corazón se consiguió una reducción ligeramente inferior de la DMPK (aproximadamente el 65 %), mientras que no se observó eliminación en hígado a pesar de la presencia de ARNip DMPK en hígado. La larga duración de la actividad tras una única dosis de AOC debería permitir una dosificación poco frecuente en los pacientes.
[0604] Datos de farmacología in vivo en primates no humanos: Se administró DMPK-AOC a monos Cynomolgus macho de tipo salvaje (n=3 por grupo) mediante infusión IV durante 30 minutos, seguido de la recogida de tejidos durante un periodo de 12 semanas tras la dosis. Los músculos esqueléticos se biopsiaron quirúrgicamente con anestesia con Ketamina/Xilacina. Tras la extracción final de sangre y biopsia muscular 12 semanas después de la dosis, los animales sedados fueron sacrificados mediante una sobredosis de solución de eutanasia. A continuación, se recogieron biopsias en sacabocados de tejido terminal de múltiples tejidos adicionales. Tras una única dosis IV de AOC a 2 mg/kg (basada en el peso del ARNip), la reducción del 75 % en la expresión de DMPK fue duradera y se mantuvo hasta 12 semanas después de la dosis (FIG. 7).

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de molécula de ácido polinucleico que comprende:
un anticuerpo contra el receptor de la transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una molécula de ácido polinucleico que hibrida con una secuencia diana de DMPK;
en donde la molécula de ácido polinucleico tiene una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena antisentido de la molécula de ácido polinucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 4; y
en donde el conjugado de molécula de ácido polinucleico participa en la interferencia de ARN contra DMPK.
2. El conjugado de molécula de ácido polinucleico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), en donde:
i) la región VH comprende la secuencia HDCR1 que comprende la SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:23 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 24; o
ii) la región VH comprende la secuencia HDCR1 que comprende la SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:18 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que compende SEQ ID NO:23 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 24; o
iii) la región VH comprende la secuencia HCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17, la secuencia HCDR2 que compende SEQ ID NO:21 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 22, la secuencia LCDR2 que compende SEQ ID NO:25 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26; o
iv) la región VH comprende la secuencia HDCR1 que comprende SEQ ID NO: 17; la secuencia HCDR2 que comprende SEQ ID NO:20 y la secuencia HCDR3 que comprende SEQ ID NO: 19; y la región VL comprende la secuencia LCDCR1 que comprende SEQ ID NO: 27, la secuencia LCDR2 que comprende SEQ ID NO:28 y la secuencia LCDR3 que comprende SEQ ID NO: 26; y
v) opcionalmente, la región VH comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 29-33 y la región VL comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 34-38.
3. El conjugado de molécula de ácido polinucleico de la reivindicación 2, en donde la región VH comprende la SEQ ID NO: 30 y en donde la región VL comprende la SEQ ID NO: 34.
4. El conjugado de molécula de ácido polinucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo o un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
5. El conjugado de molécula de ácido polinucleico de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende un IgG-scFv, nanocuerpo, BiTE, diacuerpo, DART, TandAb, scdiacuerpo, scDiacuerpo-CH3, triple cuerpo, mini-anticuerpo, minicuerpo, minicuerpo TriBi, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv-Fc KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab')2-scFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, HCAb tetravalente, scdiacuerpo-Fc, diacuerpo-Fc, scFv-Fc en tándem o intracuerpo.
6. El conjugado de molécula de ácido polinucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el anticuerpo contra el receptor de transferrina comprende además al menos una mutación en la región Fc, opcionalmente en donde la al menos una mutación se encuentra en la posición del resto D265, N297, K322, L328 o P329, en donde la posición del resto se refiere a IgG1 u, opcionalmente, la región Fc comprende mutaciones en L233 y L234, en donde los restos corresponden a las posiciones 233 y 234 de la SEQ ID NO: 39; opcionalmente en donde la al menos una mutación modula la función efectora o atenúa o elimina la unión al receptor Fc-γ.
7. El conjugado de molécula de ácido polinucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el anticuerpo contra el receptor de transferrina se une específicamente al receptor de transferrina humano (TfR).
8. El conjugado de molécula de ácido polinucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la cadena sentido tiene una secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15.
9. El conjugado de molécula de ácido polinucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el conjugado de molécula de ácido polinucleico comprende un enlazador que conecta el anticuerpo contra el receptor de transferrina o un fragmento de unión a antígeno del mismo a la molécula de ácido polinucleico; opcionalmente, el enlazador es un enlazador homobifuncional o un enlazador heterobifuncional, un grupo maleimida, una fracción dipeptídica, un grupo ácido benzoico o su derivado, opcionalmente, en donde el enlazador es un enlazador C6; opcionalmente el enlazador
C6 es un enlazador 6-amino-1-hexanol; opcionalmente, el enlazador comprende 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-amidato (SMCC).
10. El conjugado de molécula de ácido polinucleico de la reivindicación 9, en donde el enlazador se acopla al extremo 5' de la cadena sentido.
11. El conjugado de molécula de ácido polinucleico de la reivindicación 10, en donde la molécula de ácido polinucleico se conjuga con un resto de cisteína del anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo; opcionalmente en donde el resto de cisteína se encuentra en el dominio Fc del anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo.
12. La molécula de ácido polinucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde una proporción entre la molécula de ácido polinucleico y el anticuerpo contra el receptor de transferrina o fragmento de unión a antígeno del mismo es de aproximadamente 1:1, 2:1, 3:1, o 4:1.
13. Una composición farmacéutica que comprende:
un conjugado de molécula de ácido polinucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12; y
un excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. Un conjugado de molécula de ácido polinucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o una composición farmacéutica de la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular en un sujeto que lo necesite, que comprende:
proporcionar el conjugado de ácido polinucleico o la composición farmacéutica; y
administrar el conjugado de ácido polinucleico o la composición farmacéutica al sujeto que lo necesite para tratar la distrofia muscular, en donde el conjugado de ácido polinucleico o la composición farmacéutica reducen una cantidad del transcrito de ARNm de la DMPK humana.
15. El conjugado de molécula de ácido polinucleico o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la fracción de ácido polinucleico participa en la interferencia de ARN contra la DMPK humana y modula la atrofia muscular en un sujeto; opcionalmente en donde la distrofia muscular es distrofia miotónica de tipo 1 (DM1).
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