ES3063126T3 - Humanized antibody for treating or preventing cognitive disorders, process for producing the same, and agent for treating or preventing cognitive disorders using the same - Google Patents

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Anticuerpo humanizado para tratar o prevenir trastornos cognitivos, proceso para producir el mismo y agente para tratar o prevenir trastornos cognitivos usando el mismo

[0005] I. Campo técnico

[0007] La presente descripción se refiere a anticuerpos antitau fosforilada humanizados específicos para su uso en el tratamiento terapéutico o profiláctico de trastornos cognitivos, a un proceso de producción del anticuerpo humanizado, a un agente terapéutico o profiláctico para los trastornos cognitivos usando el anticuerpo y a métodos para el tratamiento o la prevención de trastornos cognitivos usando los agentes terapéuticos descritos en la presente memoria. Los anticuerpos antitau fosforilada humanizados de la invención tienen un efecto excelente de mejora de la función cognitiva.

[0009] II. Antecedentes de la invención

[0011] Un trastorno cognitivo, o demencia, es una afección en la que la inteligencia desarrollada se deteriora debido a alguna causa adquirida, provocando impedimentos para la adaptación social. Los trastornos cognitivos se clasifican en enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cognitivas vasculares, enfermedades priónicas, enfermedades infecciosas, enfermedades metabólicas/endocrinas, enfermedades traumáticas y quirúrgicas cerebrales y enfermedades tóxicas (véase Toshifumi Kishimoto y Shigeki Takahashi (Edit.), "STEP Series Seishinka" (documento japonés), 2.ª edición, Kaibashobo, 2008, pág. 103-104). En 2010 había aproximadamente 2,1 millones de pacientes con demencia en Japón, con una tasa de prevalencia de morbilidad de aproximadamente un 8 a un 10 %, o incluso más de un 10 %, entre las personas mayores de 65 años, y esto se ha reconocido como un problema grave en la sociedad mundial que envejece (Takashi Asada, "Igaku no Ayumi" (documento japonés), volumen complementario, "Cognitive disorders", Ishiyaku Publishing, 2011, pág. 5-10). Los datos sobre las enfermedades subyacentes de los trastornos cognitivos indican que la mayoría son enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer (AD) y la degeneración lobular frontotemporal (FTLD), siendo aproximadamente un 35 % AD, siendo aproximadamente un 15 % una combinación de AD y enfermedad cerebrovascular, y siendo un 5 % FTLD (Id.) Los trastornos cognitivos asociados con las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la aparición insidiosa de deterioro de la memoria y/o cambios de personalidad que progresan durante un periodo de al menos seis meses o más. Los procesos neurodegenerativos se correlacionan en gran medida con el grado de deterioro de la función cognitiva, y una característica constante implicada en los mismos es la presencia de ovillos neurofibrilares (NFT) (Alistair Burnset al.(Edit.), Dementia, 3.ª edición, 2005, CRC Press, pág.408-464).

[0013] La proteína tau es una proteína codificada por el gen MAPT, que está ubicado en el cromosoma 17 (17q21) del genoma humano. La proteína tau es una de las proteínas de unión a los microtúbulos expresada abundantemente en el sistema nervioso central. Se ha descubierto que tau es una proteína constituyente principal en los filamentos helicoidales emparejados y los filamentos rectos que forman los NFT en AD, una de las enfermedades neurodegenerativas más importantes, y se ha demostrado su acumulación intracelular en una variedad de afecciones neuropatológicas.

[0015] Tau se implicó por primera vez en las enfermedades neurodegenerativas basándose en la relación entre las mutaciones en el gen MAPT y la acumulación de tau en la demencia frontotemporal vinculada al cromosoma 17 con parkinsonismo (FTDP-17). Se han presentado más de 40 mutaciones génicas en el gen MAPT con respecto a FTDP-17 (Tetsuaki Arai, "Shinkei Naika" (documento japonés), vol. 72, número especial, (supl. 6), 2010, pág.46-51). Se sugiere que estas mutaciones génicas alteran las proporciones de las isoformas de tau o alteran la estructura y cambian la interacción entre tau mutante y los microtúbulos, contribuyendo, por tanto, al desarrollo de la patología. Sin embargo, a diferencia de las enfermedades neurodegenerativas familiares, las mutaciones en MAPT rara vez se observan en enfermedades neurodegenerativas esporádicas tales como AD. Además, la tau acumulada en las enfermedades neurodegenerativas se caracteriza por estar altamente modificada mediante fosforilación. Además, en pacientes que presentan un deterioro cognitivo leve (MCI), se observa una correlación entre el nivel de tau fosforilada en el líquido cefalorraquídeo y el grado de atrofia hipofisaria, lo que sugiere tau fosforilada como un biomarcador altamente fiable para la neurodegeneración en pacientes con taupatía (Wendy Nobleet al., Expert Opinion on Drug Discovery, 2011, vol. 6, n.º 8, pág. 797-810). En función de estos hallazgos, se han hecho intentos por desarrollar un tratamiento usando inhibidores contra las cinasas, que son enzimas implicadas en la fosforilación, y particularmente contra GSK-3 beta, para inhibir la fosforilación excesiva de tau (Id). Sin embargo, existe preocupación por los posibles efectos secundarios, ya que las cinasas tales como GSK-3 beta están implicadas no solo en afecciones patológicas, sino también en el control de las funciones en los procesos fisiológicos normales. De hecho, algunos de los sitios en los que tau se fosforila por GSK-3 beta coinciden con los sitios de fosforilación de tau observados en cerebros humanos fetales y normales (Burnes,et al., supra), lo que sugiere la posibilidad de que esta estrategia pueda afectar a la función normal de tau.

[0016] Aunque se creía que la tau extracelular se origina por la filtración de las células nerviosas degeneradas como consecuencia de la muerte celular, estudios recientes han sugerido que, tras una fosforilación intracelular excesiva, tau se procesa y luego se secreta activamente fuera de la célula. Se cree que la tau fosforilada secretada por la célula se desfosforila en determinados sitios de fosforilación y, posteriormente, actúa sobre los receptores de muscarina M1 y M3 de las células circundantes, provocando, por tanto, diversos efectos, tales como promover la fosforilación intracelular de tau y contribuir a la muerte celular (Miguel Diaz-Hernandeset al., Journal of Biological Chemistry, 2010, vol.285, n.º 42, pág.32539-32548 y Venessa Plouffeet al., PLoS ONE, 2012, vol. 7, pág. 36873). Se han presentado experimentos relacionados con inmunoterapia para taupatías usando la proteína tau como diana, como intentos dirigidos a ejecutar una acción específica contra tau (véase Noble, supra, Kishimoto, supra, Asada, supra y Burns, supra).

[0017] Los principales síntomas en los trastornos cognitivos humanos son el deterioro de la memoria y el deterioro de la función cognitiva, lo que es especialmente importante dado el papel de la función cognitiva en el sentido de la realidad, la comunicación y el rendimiento basados en la memoria. La función motora, por otro lado, aunque es un síntoma encontrado en la demencia frontotemporal vinculada al cromosoma 17 con parkinsonismo (FTDP-17) y la enfermedad de Alzheimer en estadio terminal, no es necesariamente un síntoma importante que se presente en los trastornos cognitivos. Por lo tanto, la principal cuestión a tener en cuenta para tratar los trastornos cognitivos es la mejora de las funciones cognitivas. Sin embargo, actualmente existen modelos animales adecuados para someter a prueba el deterioro de la función cognitiva asociado a taupatía que permitirían la identificación de un agente terapéutico o profiláctico para tratar los trastornos cognitivos. Además, no existe ningún agente de este tipo que presente efectos específicos y superiores contra los trastornos cognitivos.

[0018] El documento US 2015/183854 describe el anticuerpo Ta1505 monoclonal de ratón anti-pSer413 tau, que reconoce un péptido de tau fosforilado en la posición Ser413, y su uso en la mejora de la función cognitiva en un modelo de ratón.

[0019] En vista de las aplicaciones terapéuticas y profilácticas contra los trastornos cognitivos en sujetos humanos, existe una demanda de un anticuerpo antitau fosforilada humanizado que no solo tenga una alta afinidad de unión a tau fosforilada, sino que también presente una antigenicidad reducida para el cuerpo humano.

[0020] Frente a este trasfondo, entre un gran número de sitios fosforilados en la proteína tau que pueden experimentar una fosforilación anómala en las condiciones de la enfermedad de Alzheimer, los autores de la presente invención se centraron en el sitio fosforilado del residuo de serina en la posición 413 (Ser413), y lograron producir un anticuerpo policlonal de conejo y un anticuerpo monoclonal de ratón que son específicos para tau fosforilada en Ser413. Los autores de la presente invención también administraron los anticuerpos monoclonales de ratón a ratones modelo de trastornos cognitivos que mostraban expresión anómala de las proteínas tau fosforiladas, y confirmaron que observaba una mejora en las funciones cognitivas (documento WO2013/180238A).

[0021] III. Compendio de la invención

[0022] En general, la presente descripción proporciona proteínas, tales como anticuerpos, que incluyen una porción de unión a antígeno que se une específicamente a la proteína Tau que está fosforilada en el residuo de serina 413 (pS413-Tau). La presente descripción proporciona además ácidos nucleicos que codifican las proteínas. La presente descripción proporciona además células que incluyen dichos ácidos nucleicos que codifican las proteínas. La presente descripción proporciona además métodos para tratar una taupatía (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) mediante la administración de las proteínas, los ácidos nucleicos o las células descritas en la presente memoria a un paciente que lo necesite.

[0023] Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-pSer413 tau que comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 116 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 o SEQ ID NO: 103. Este anticuerpo corresponde al anticuerpo VL46/VH11 y sus derivados. En una realización, la invención proporciona un anticuerpo anti-pSer413 tau, en donde el dominio variable de la cadena pesada tiene SEQ ID NO: 116 y el dominio variable de la cadena ligera tiene SEQ ID NO: 114. Este anticuerpo corresponde al anticuerpo VL46_G34A-S28N/VH11.

[0024] La invención proporciona además un anticuerpo anti-pSer413 tau que comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 117 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene SEQ ID NO: 104. Este anticuerpo corresponde al anticuerpo VL47/VH65.

[0025] En una realización, el anticuerpo anti-pSer413 tau comprende un dominio constante de la cadena pesada seleccionado de SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO: 143; y/o un dominio constante de la cadena ligera seleccionado de SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 80.

[0026] En una realización, el anticuerpo anti-pSer413 tau correspondiente al anticuerpo VL46/VH11 y sus derivados comprende una cadena ligera que tiene SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182 o SEQ ID NO: 162; y una cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 151 o SEQ ID NO: 144. En una realización, el anticuerpo anti-pSer413 tau correspondiente al anticuerpo VL46_G34A-S28N/VH11 comprende una cadena ligera que tiene SEQ ID NO: 184 y una cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 152.

[0027] En una realización, el anticuerpo anti-pSer413 tau correspondiente al anticuerpo VL47/VH65 comprende una cadena ligera que tiene SEQ ID NO: 164 y una cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 153.

[0028] La siguiente tabla proporciona una descripción de las cadenas pesadas y ligeras y los dominios variables de los anticuerpos actualmente reivindicados:

[0030]

[0033] Los anticuerpos de la invención se definen en las reivindicaciones adjuntas.

[0034] La información técnica expuesta a continuación, en algunos aspectos, puede ir más allá de la descripción de la invención, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier información técnica adicional que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forma parte de la invención. Los anticuerpos de la invención provocan una reacción de antígeno-anticuerpo con una proteína tau o un péptido de tau fosforilado al menos en un residuo aminoacídico correspondiente a Ser413 de SEQ ID NO: 1. En algunos casos, el anticuerpo humanizado o fragmento o derivado del mismo tiene una constante de disociación en equilibrio de 1,86 × 10<-8>o menos para la proteína tau o el péptido de tau.

[0035] El anticuerpo de la invención tiene una afinidad selectiva mejorada con la proteína tau fosforilada (o el péptido de tau, por ejemplo, SEQ ID NO: 8) en comparación con una proteína tau no fosforilada (o el péptido de tau, por ejemplo, SEQ ID NO: 69).

[0036] El anticuerpo de la invención tiene una capacidad mejorada de entrar en el cerebro cuando se administra a la sangre.

[0037] El anticuerpo humanizado o fragmento o derivado del mismo descrito en la presente memoria comprende las CDR como sigue: como secuencia de CDR-H1, una secuencia de aminoácidos que tiene un 80 % o más de homología con la secuencia 1M; como secuencia de CDR-H2, una secuencia de aminoácidos que tiene un 84 % o más de homología con la secuencia 2M o 2H1; como secuencia de CDR-H3, una secuencia de aminoácidos que tiene un 80 % o más de homología con la secuencia 3M; como secuencia de CDR-L1, una secuencia de aminoácidos que tiene un 87 % o más de homología con la secuencia 4L1 o 4M; como secuencia de CDR-L2, una secuencia de aminoácidos que tiene un 85 % o más de homología con la secuencia 5M; y como secuencia de CDR-L3, una secuencia de aminoácidos que tiene un 77 % o más de homología con la secuencia 6M.

[0039] El anticuerpo humanizado o fragmento o derivado del mismo descrito en la presente memoria comprende las CDR como sigue: como secuencia de CDR-H1, la secuencia de aminoácidos de la secuencia 1M; como secuencia de CDR-H2, la secuencia de aminoácidos de la secuencia 2H1 o una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia 2H1 en que Ala en la posición 15 está sustituida por Asp; como secuencia de CDR-H3, la secuencia de aminoácidos de la secuencia 3M; como secuencia de CDR-L1, la secuencia de aminoácidos de la secuencia 4L1 o una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia 4L1 en que Ser en la posición 5 está sustituida por Asn; como secuencia de CDR-L2, la secuencia de aminoácidos de la secuencia 5M; y como secuencia de CDR-L3, la secuencia de aminoácidos de la secuencia 6M.

[0041] El anticuerpo humanizado o fragmento o derivado del mismo descrito en la presente memoria tiene las CDR como sigue: (1) como secuencia de CDR-H1, la secuencia de aminoácidos de 1M; como secuencia de CDR-H2, la secuencia de aminoácidos de 2H1; como secuencia de CDR-H3, la secuencia de aminoácidos de 3M; como secuencia de CDR-L1, la secuencia de aminoácidos de 4L1; como secuencia de CDR-L2, la secuencia de aminoácidos de 5M; y como secuencia de CDR-L3, la secuencia de aminoácidos de 6M, o (2) como secuencia de CDR-H1, la secuencia de aminoácidos de 1M; como secuencia de CDR-H2, la secuencia de aminoácidos de 2H1; como secuencia de CDR-H3, la secuencia de aminoácidos de 3M; como secuencia de CDR-L1, la secuencia de aminoácidos de 4M; como secuencia de CDR-L2, la secuencia de aminoácidos de 5M; y como secuencia de CDR-L3, la secuencia de aminoácidos de 6M, o (3) como secuencia de CDR-H1, la secuencia de aminoácidos de 1M; como secuencia de CDR-H2, la secuencia de aminoácidos de 2M; como secuencia de CDR-H3, la secuencia de aminoácidos de 3M; como secuencia de CDR-L1, la secuencia de aminoácidos de 4M; como secuencia de CDR-L2, la secuencia de aminoácidos de 5M; y como secuencia de CDR-L3, la secuencia de aminoácidos de 6M.

[0043] El anticuerpo humanizado o fragmento o derivado del mismo descrito en la presente memoria comprende: como región variable de la cadena pesada, una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de homología con una secuencia seleccionada de las secuencias VH11, VH12, VH47, VH61, VH62, VH64 y VH65; y como región variable de la cadena ligera, una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de homología con una secuencia seleccionada de las secuencias VL15, VL36, VL46, VL47, VL48 y VL50.

[0045] El anticuerpo humanizado o fragmento o derivado del mismo descrito en la presente memoria comprende: como región variable de la cadena pesada, la secuencia de aminoácidos de la secuencia VH65 o una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia VH65 en que comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de Ala por Thr en la posición 28 (numeración de Kabat: H28), una sustitución de Asn por Ser en la posición 30 (numeración de Kabat: H30), una sustitución de Val por Gly en la posición 49 (numeración de Kabat: H49), una sustitución de Ala por Asp en la posición 64 (numeración de Kabat: H61) y una sustitución de Gln por Lys en la posición 78 (numeración de Kabat: H75); y como región variable de la cadena ligera, la secuencia de aminoácidos de la secuencia VL47 o una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia VL47 en que comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de Asp por Glu en la posición 17 (numeración de Kabat: L17), una sustitución de Ser por Asn en la posición 28 (numeración de Kabat: L27A), una sustitución de Gln por Leu en la posición 42 (numeración de Kabat: L37), una sustitución de Gln por Arg en la posición 50 (numeración de Kabat: L45) y una sustitución de Arg por Leu en la posición 51 (numeración de Kabat: L46).

[0047] El anticuerpo humanizado o fragmento o derivado del mismo descrito en la presente memoria comprende cualquiera de las siguientes combinaciones de secuencias: (a) secuencia VH11 como región variable de la cadena pesada y secuencia VL15 como región variable de la cadena ligera; (b) secuencia VH11 como región variable de la cadena pesada y secuencia VL36 como región variable de la cadena ligera; (c) secuencia VH11 como región variable de la cadena pesada y secuencia VL46 como región variable de la cadena ligera; (d) secuencia VH11 como región variable de la cadena pesada y secuencia VL47 como región variable de la cadena ligera; (e) secuencia VH11 como región variable de la cadena pesada y secuencia VL48 como región variable de la cadena ligera; (f) secuencia VH11 como región variable dela cadena pesada y secuencia VL50 como región variable de la cadena ligera; (g) secuencia VH12 como región variable de la cadena pesada y secuencia VL48 como región variable de la cadena ligera; (h) secuencia VH47 como región variable de la cadena pesada y secuencia VL48 como región variable de la cadena ligera; (i) secuencia VH61 como región variable de la cadena pesada y secuencia VL48 como región variable de la cadena ligera; (j) secuencia VH62 como región variable de la cadena pesada y secuencia VL48 como región variable de la cadena ligera; (k) secuencia VH64 como región variable de la cadena pesada y secuencia VL47 como región variable de la cadena ligera; (l) secuencia VH64 como región variable de la cadena pesada y secuencia VL48, y (m) secuencia VH65 como región variable de cadena la pesada y secuencia VL47.

[0048] En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-pSer413 tau de la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de una taupatía, incluyendo enfermedad de Alzheimer, degeneración corticobasal, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, demencia por granos argirófilos (enfermedad por granos argirófilos), taupatía multisistémica con demencia presenil (MSTD), demencia frontotemporal y parkinsonismo ligados al cromosoma 17 (FTDP-17), demencia con ovillos neurofibrilares, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación (DNTC), taupatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares (WMT-GGI) o degeneración lobular frontotemporal con patología de tau (FTLD-tau).

[0049] En un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-pSer413 tau de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0050] Los anticuerpos anti-pSer413 tau descritos en la presente memoria comprenden: a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende una vhCDR1 que comprende SEQ ID NO: 86, una vhCDR2 que comprende SEQ ID NO: 115 y una vhCDR3 que comprende SEQ ID NO: 88; y b) un dominio variable de la cadena ligera que comprende un conjunto de vlCDR seleccionado del grupo que consiste en: i) una vlCDR1 que comprende SEQ ID NO: 102, una vlCDR2 que comprende SEQ ID NO: 82 y una vlCDR3 que comprende SEQ ID NO: 83; ii) una vlCDR1 que comprende SEQ ID NO: 91, una vlCDR2 que comprende SEQ ID NO: 82 y una vlCDR3 que comprende SEQ ID NO: 83; iii) una vlCDR1 que comprende SEQ ID NO: 92, una vlCDR2 que comprende SEQ ID NO: 82 y una vlCDR3 que comprende SEQ ID NO: 83; iv) una vlCDR1 que comprende SEQ ID NO: 93, una vlCDR2 que comprende SEQ ID NO: 82 y una vlCDR3 que comprende SEQ ID NO: 83; v) una vlCDR1 que comprende SEQ ID NO: 94, una vlCDR2 que comprende SEQ ID NO: 82 y una vlCDR3 que comprende SEQ ID NO: 83; vi) una vlCDR1 que comprende SEQ ID NO: 95, una vlCDR2 que comprende SEQ ID NO: 82 y una vlCDR3 que comprende SEQ ID NO: 83; vii) una vlCDR1 que comprende SEQ ID NO: 96, una vlCDR2 que comprende SEQ ID NO: 82 y una vlCDR3 que comprende SEQ ID NO: 83; viii) una vlCDR1 que comprende SEQ ID NO: 97, una vlCDR2 que comprende SEQ ID NO: 82 y una vlCDR3 que comprende SEQ ID NO: 83; ix) una vlCDR1 que comprende SEQ ID NO: 98, una vlCDR2 que comprende SEQ ID NO: 82 y una vlCDR3 que comprende SEQ ID NO: 83; x) una vlCDR1 que comprende SEQ ID NO: 99, una vlCDR2 que comprende SEQ ID NO: 82 y una vlCDR3 que comprende SEQ ID NO: 83; xi) una vlCDR1 que comprende SEQ ID NO: 100, una vlCDR2 que comprende SEQ ID NO: 82 y una vlCDR3 que comprende SEQ ID NO: 83; y xii) una vlCDR1 que comprende SEQ ID NO: 101, una vlCDR2 que comprende SEQ ID NO: 82 y una vlCDR3 que comprende SEQ ID NO: 83. En algunos casos, el anticuerpo tiene una relación de unión del anticuerpo al péptido fosforilado de SEQ ID NO: 8 a la unión del anticuerpo al péptido no fosforilado de SEQ ID NO: 69 de al menos aproximadamente 40.

[0051] Como se describe anteriormente, en la presente memoria se proporcionan anticuerpos anti-pSer413 tau que comprenden: a) un dominio variable de la cadena pesada seleccionado de SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 117; y b) un dominio variable de la cadena ligera seleccionado de SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 y SEQ ID NO: 114. En algunos casos, el anticuerpo tiene una relación de unión del anticuerpo al péptido fosforilado de SEQ ID NO: 8 a la unión del anticuerpo al péptido no fosforilado de SEQ ID NO: 69 de al menos aproximadamente 40. Entre estos, los que pertenecen a la invención se enumeran en las reivindicaciones.

[0052] En algunos casos, los anticuerpos descritos en la presente memoria comprenden un dominio constante de la cadena pesada seleccionado de SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO: 143. Entre estos, los que pertenecen a la invención se enumeran en las reivindicaciones.

[0053] En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden un dominio constante de la cadena ligera seleccionado de SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 80.

[0054] En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden un dominio variable de la cadena pesada seleccionado de SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 117.

[0055] En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden un dominio variable de la cadena ligera seleccionado de SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 y SEQ ID NO: 114.

[0056] Los anticuerpos descritos en la presente memoria comprenden cadenas pesadas y ligeras seleccionadas de los pares LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 144; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 145; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 146; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 147; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 148; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 149; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 150; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 151; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 152; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 153; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 154; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 155; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 156; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 157; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 158; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 159; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 160; LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 161; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 144; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 145; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 146; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 147; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 148; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 149; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 150; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 151; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 152; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 153; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 154; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 155; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 156; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 157; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 158; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 159; LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 160 y LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 161.

[0057] Un anticuerpo de la invención tiene una cadena ligera que comprende o consiste en SEQ ID NO: 184 y una cadena pesada que comprende o consiste en SEQ ID NO: 144.

[0058] Otro anticuerpo de la invención tiene una cadena ligera que comprende o consiste en SEQ ID NO: 184 y una cadena pesada que comprende o consiste en SEQ ID NO: 152.

[0059] Las composiciones de ácido nucleico descritas en la presente memoria comprenden: a) un primer ácido nucleico que codifica una cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184 y SEQ ID NO: 185; y b) un segundo ácido nucleico que codifica una cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 144; SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; SEQ ID NO: 147; SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 151; SEQ ID NO: 152; SEQ ID NO: 153; SEQ ID NO: 154; SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; SEQ ID NO: 157; SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; SEQ ID NO: 160 y SEQ ID NO: 161.

[0060] La invención proporciona además una composición de ácido nucleico que comprende: un primer ácido nucleico que codifica una cadena ligera que tiene SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182 o SEQ ID NO: 162 y un segundo ácido nucleico que codifica una cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 151 o SEQ ID NO: 144.

[0061] La invención proporciona además una composición de ácido nucleico que comprende una cadena ligera que tiene SEQ ID NO: 164 y un segundo ácido nucleico que codifica una cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 153.

[0062] En un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones de vector de expresión que comprenden un primer y un segundo ácido nucleico de la invención, en donde el primer ácido nucleico está contenido en un primer vector de expresión y el segundo ácido nucleico está contenido en un segundo vector de expresión. En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición de vector de expresión en donde el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico están contenidos en un solo vector de expresión.

[0063] En un aspecto adicional, la invención proporciona células hospedadoras que comprenden la composición de vector de expresión y métodos de preparación de un anticuerpo anti-pSer413 tau que comprenden cultivar la célula hospedadora en condiciones en donde dicho anticuerpo se expresa y recuperar dicho anticuerpo. En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo anti-pSer413 tau de la invención para su uso en métodos de tratamiento de una taupatía en un sujeto, que comprenden administrar el anticuerpo al sujeto.

[0064] IV. Breve descripción de los dibujos

[0065] La invención puede entenderse mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras:

[0066] Lafigura 1Ay lafigura 1Bmuestran colectivamente una alineación de diversas isoformas humanas de la proteína Tau, preparada usando ClustalW.

[0067] Lafigura 2Amuestra una alineación de las secuencias de la región variable de la cadena ligera, destacando las secuencias de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, según el sistema de numeración de Kabat, de varias proteínas de unión anti-pS413-Tau, según algunas realizaciones de la descripción.

[0068] Lafigura 2Bmuestra una alineación de las secuencias de la región variable de la cadena pesada, destacando las secuencias de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, según el sistema de numeración de Kabat, de varias proteínas de unión anti-pS413-Tau, según algunas realizaciones de la descripción.

[0069] Lafigura 3ilustra la afinidad de unión selectiva de varios anticuerpos anti-pS413-Tau por el péptido fosforilado PD17P, con respecto al péptido no fosforilado PD17, según algunas realizaciones de la descripción.

[0070] Lafigura 4ilustra la afinidad de unión de varios anticuerpos anti-pS413-Tau por Tau fosforilada en homogeneizado cerebral de un paciente con Alzheimer, según algunas realizaciones de la descripción. Lafigura 5Ay lafigura 5Bmuestran la farmacocinética de variantes de anticuerpos humanizados en plasma de ratón a lo largo del tiempo. Lafigura 5Ademuestra que cinco variantes iniciales de anticuerpos humanizados 2, 5, 6, 9 y 10 presentaron una eliminación rápida del plasma de ratón. Lafigura 5Bdemuestra que tres variantes de anticuerpos humanizados desarrolladas posteriormente, L15H11, L46H11 y L47H65, presentaban perfiles farmacocinéticos comparables a los del anticuerpo quimérico.

[0071] Lafigura 6Ay lafigura 6Bmuestran diferentes variantes de anticuerpos humanizados que tienen migración intracerebral diferente. Lafigura 6Amuestra la concentración de diversos anticuerpos humanizados en homogeneizado cerebral. Lafigura 6Bmuestra la relación del nivel de anticuerpos humanizados representativos en el cerebro al nivel de los anticuerpos correspondientes en el plasma.

[0072] Lafigura 7Ay lafigura 7Bmuestran la alineación de las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (figura 7A) y la región variable de la cadena pesada (figura 7B) de variantes representativas de anticuerpos humanizados con el anticuerpo de ratón original.

[0073] Lafigura 8A - figura 8Ddemuestran que el anticuerpo de ratón original (figuras 8A y 8B) y el anticuerpo quimérico (figuras 8C y 8D) se unen a un péptido fosforilado (figuras 8A y 8C), pero no al equivalente no fosforilado (figuras 8B y 8D).

[0074] Lafigura 9A - figura 9Cmuestran la unión de variantes representativas de anticuerpos humanizados al péptido pS413.

[0075] Lafigura 10A - figura 10Emuestran características de unión comparables del anticuerpo de ratón original (figura 10A), el anticuerpo quimérico (figura 10B) y variantes de anticuerpos humanizados seleccionadas (figura 10C-10E) a la proteína Tau fosforilada en S413 en homogeneizados cerebrales de pacientes con enfermedad de Alzheimer.

[0076] Lafigura 11A - figura 11Emuestran las regiones variables de la cadena pesada y variables de la cadena ligera de algunos de los anticuerpos humanizados antiproteína pSer413 tau de la descripción.

[0077] Lafigura 12muestra varios dominios constantes de IgG humanos diferentes que encuentran uso en combinaciones de las cadenas pesadas variables y ligeras variables de los anticuerpos anti-pSer413 tau. "Humana_IgG1 _" es el dominio constante (CH1-bisagra-CH2-CH3) de la IgG1 humana natural. "Humana_IgG1_L234A_L235A" es el dominio constante (CH1-bisagra-CH2-CH3) de la IgG1 humana natural silvestre con dos sustituciones aminoacídicas, L234A y L235A (a veces denominadas mutaciones "LALA") que reducen/eliminan la función efectora. "Humana_IgG1_ _L234A_L235A_D265S" es el dominio constante (CH1-bisagra-CH2-CH3) de la IgG1 humana natural con tres sustituciones aminoacídicas, L234A, L235A y D265S, que reducen/eliminan la función efectora. "Humana_IgG1_YTE" o "Human IgG1_YTE (M252Y_S254T_T256E)" es el dominio constante (CH1-bisagra-CH2-CH3) de la IgG1 humana natural con tres sustituciones aminoacídicas, M252Y, S254T y T256E, que aumentan la semivida del anticuerpo en suero. "Humana_IgG1_N297A_" es el dominio constante (CH1-bisagra-CH2-CH3) de la IgG1 humana natural con la sustitución aminoacídica N297A, que elimina un sitio de glucosilación y reduce/elimina la función efectora. "Humana_IgG1_N297Q_" es el dominio constante (CH1-bisagra-CH2-CH3) de la IgG1 humana natural con la sustitución aminoacídica N297Q, que elimina un sitio de glucosilación y reduce/anula la función efectora. "_Humana_IgG2" es el dominio constante (CH1-bisagra-CH2-CH3) de la IgG2 humana natural. "_Humana_IgG4" es el dominio constante (CH1-bisagra-CH2-CH3) de la IgG4 humana natural. "Humana_IgG4_S228P_" es el dominio constante (CH1-bisagra-CH2-CH3) de la IgG4 humana natural con una sustitución aminoacídica S228P para evitar el cambio de brazo.

[0078] Lafigura 13muestra cadenas pesadas de longitud completa para las regiones variables H11 y H65 junto con las cadenas principales de lafigura 12.

[0079] Una "barra" ("/") indica la unión de los dominios variables y constantes, y las CDR están subrayadas.

[0080] Lafigura 14muestra las cadenas ligeras de longitud completa para 12 dominios variables de la cadena ligera diferentes con los dominios constantes de la cadena ligera kappa o lambda humanos. Una "barra" ("/") indica la unión de los dominios variables y constantes, y las CDR están subrayadas.

[0081] Lafigura 15representa una matriz de posibles combinaciones de cadenas pesadas y ligeras. Una "A" en el recuadro indica que se usa el dominio constante de la cadena pesada "Humana_IgG1_". Una "B" en el recuadro indica que se usa el dominio constante de la cadena pesada "Humana_IgG1_L234A_L235A". Una "C" en el recuadro indica que se usa el dominio constante de la cadena pesada "Humana_IgG1_L234A_L235A_D265S". Una "D" en el recuadro significa que se usa el dominio constante de la cadena pesada "Humana_IgG1_YTE_". Una "E" en el recuadro significa que se usa el dominio constante de la cadena pesada "Humana _IgG1_N297A_". Una "F" en el recuadro significa que se usa el dominio constante de la cadena pesada "Humana _IgG1_N297Q_". Una "G" en el recuadro significa que se usa el dominio constante de la cadena pesada "_Humana_IgG2". Una "H" en el recuadro significa que se usa el dominio constante de la cadena pesada "_Humana_IgG4". Una "I" en el recuadro significa que se usa el dominio constante de la cadena pesada "Humana_IgG4_S22P_". Una "J" en el recuadro significa que se usa un dominio constante de IgG1 humana con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones aminoacídicas.

[0083] V. Descripción detallada

[0085] A. Perspectiva general

[0087] La presente descripción proporciona anticuerpos que incluyen una porción de unión a antígeno que se une específicamente a la proteína Tau que está fosforilada en el residuo de serina 413 (pSer413-Tau). También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican las proteínas, y células que incluyen dichos ácidos nucleicos. Los métodos y composiciones proporcionados se usan en el tratamiento de taupatías (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer).

[0089] Se ha identificado que el gen MAPT que codifica tau consiste en 13 exones dispuestos en el genoma, que pueden expresarse como múltiples isoformas proteínicas diferentes mediante empalme alternativo (véase Arai, supra). La proteína tau comprende un dominio ácido aminoterminal que contiene 0-2 secuencias repetitivas (N) de 29 aminoácidos dependiendo del empalme alternativo del exón 2 y el exón 3 (N0-N2), un dominio intermedio rico en prolina y un dominio de unión a microtúbulos carboxiterminal (codificado por los exones 9 a 12) que contiene 3 (3R) o 4 (4R) secuencias repetitivas (R) que contribuyen a la unión a los microtúbulos (Burns, supra, y Arai, supra). Por lo tanto, la tau humana tiene seis isoformas representativas: 3R0N (352 aminoácidos), 3R1N (381 aminoácidos), 3R2N (410 aminoácidos), 4R0N (383 aminoácidos), 4R1N (412 aminoácidos) y 4R2N (441 aminoácidos), dependiendo del número de secuencias repetitivas de 29 aminoácidos (N) y secuencias repetitivas de unión a microtúbulos (R) que contenga. De estas isoformas, solo 3R0N está presente en el cerebro embrionario, mientras que las seis isoformas están presentes en el cerebro humano adulto, siendo 4R la más abundante (Burns, supra). La diferencia entre las isoformas 3R y 4R se debe a si el exón 10 se elimina mediante empalme alternativo (3R) o si está presente (4R). Para identificar inequívocamente la posición de un residuo aminoacídico en cualquiera de estas isoformas de tau, se usan como referencia los números de aminoácidos (1 a 441) de la isoforma más larga, es decir, 4R2N (definida en SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, "Ser413" se refiere al residuo de serina en la posición del aminoácido 413 en 4R2N (definida en SEQ ID NO: 1), que corresponde a la serina en la posición 384 en 4R1N (definida en SEQ ID NO: 2), la posición 355 en 4R0N (definida en SEQ ID NO: 3), la posición 382 en 3R2N (definida en SEQ ID NO: 4), la posición 353 en 3R1N (definida en SEQ ID NO: 5) y la posición 324 en 3R0N (definida en SEQ ID NO: 6).

[0091] Tau tiene un residuo aminoacídico fosforilado en la posición correspondiente al residuo de serina en la posición 413 (Ser413, cuando se fosforila se denomina en la presente memoria "pSer413") de la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 1 (y, por tanto, la proteína tau fosforilada en Ser413 es "pSer413 tau" o "pSer413-tau"), que es un sitio fosforilado específicamente en AD. Como se muestra anteriormente en el documento WO 2013/180238, la administración de anticuerpos que participan en reacciones de antígenoanticuerpo específicas con PSer413-tau a ratones transgénicos que desarrollan un deterioro de la función cognitiva mientras maduran, dio como resultado el restablecimiento de las funciones cognitivas a casi el mismo nivel que el del grupo de control. Curiosamente, la administración de una concentración similar de un anticuerpo monoclonal contra una proteína tau que tiene un residuo aminoacídico fosforilado en la posición correspondiente a Ser396 de la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 1, que tiene una afinidad más fuerte por un antígeno equivalente que el anticuerpo anterior, no dio como resultado una mejora suficiente en las funciones cognitivas. Como no había información específica sobre una región que incluyera el residuo aminoacídico en la posición correspondiente a Ser413 de la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 1 con respecto a la estructura y las funciones de la tau, fue un resultado totalmente inesperado que el anticuerpo que se une a esta región tuviera dicho efecto fuerte de mejora de la función cognitiva.

[0093] Por consiguiente, la presente invención se refiere a anticuerpos anti-pSer413 tau humanizados y optimizados útiles como agente terapéutico o profiláctico para tratar trastornos cognitivos tales como taupatía en un sujeto humano.

[0095] El anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención presenta una alta afinidad de unión a tau fosforilada, a la vez que tiene una antigenicidad significativamente reducida para el cuerpo humano, y puede usarse eficazmente como agente terapéutico o profiláctico para trastornos cognitivos tales como taupatía en un sujeto humano. Adicionalmente, las modificaciones aminoacídicas dentro de las CDR en comparación con las CDR murinas reducen la desamidación, lo que da lugar a una estabilidad aumentada; véanse los ejemplos 8, 9 y 10.

[0096] B. Definiciones

[0097] Como se usa en la presente memoria, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado a él en esta sección.

[0098] Los artículos "un/o" y "una" se usan en la presente memoria para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

[0099] "Aproximadamente", como se usa en la presente memoria, cuando se hace referencia a un valor medible, tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de ±20 % o ±10 %, más preferiblemente ±5 %, incluso más preferiblemente ±1 % y aún más preferiblemente ±0,1 % del valor especificado, ya que dichas variaciones son apropiadas para llevar a cabo los métodos descritos.

[0100] En la presente memoria, por "anulación" se entiende una disminución o eliminación de la actividad. Por tanto, por ejemplo, "anular la unión al FcγR" significa que la variante aminoacídica de la región Fc tiene menos de un 50 % de la unión inicial en comparación con una región Fc que no contiene la variante específica, prefiriéndose una pérdida de actividad de menos de un 70-80-90-95-98 % y, en general, estando la actividad por debajo del nivel de unión detectable en un ensayo Biacore.

[0101] Por "ADCC" o "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos", como se usa en la presente memoria, se entiende la reacción mediada por células en donde las células citotóxicas no específicas que expresan los FcγR reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y, posteriormente, provocan la lisis de la célula diana. La ADCC se correlaciona con la unión al FcγRIIIa; la unión aumentada al FcγRIIIa da lugar a un aumento en la actividad de ADCC. Como se analiza en la presente memoria, muchas realizaciones de la invención anulan por completo la actividad de ADCC.

[0102] Por "ADCP" o fagocitosis celular dependiente de anticuerpos, como se usa en la presente memoria, se entiende la reacción mediada por células en donde las células citotóxicas no específicas que expresan los FCγR reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y, posteriormente, provocan la fagocitosis de la célula diana. Por "dominio de unión a antígeno" o "ABD", en la presente memoria se entiende un conjunto de seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que, cuando están presentes como parte de una secuencia polipeptídica, se unen específicamente a un antígeno diana como se analiza en la presente memoria. Por tanto, un "dominio de unión a antígeno" se une a un antígeno diana como se expone en la presente memoria. Como es conocido en la técnica, estas CDR están presentes generalmente como un primer conjunto de CDR pesadas variables (vhCDR o V<H>CDR o CDR-HC) y un segundo conjunto de CDR ligeras variables (VLCDR o V<L>CDR o CDR-LC), comprendiendo cada una tres CDR: vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3 para la cadena pesada y vlCDR1, vlCDR2 y vlCDR3 para la cadena ligera. Las CDR están presentes en los dominios variables de la cadena pesada y variables de la cadena ligera, respectivamente, y juntas forman una región Fv. Por tanto, en algunos casos, las seis CDR del dominio de unión a antígeno las aportada una cadena pesada variable y una cadena ligera variable. En un formato "Fab", al conjunto de 6 CDR contribuyen dos secuencias polipeptídicas diferentes, el dominio pesado variable (vh o V<H>; que contiene la vhCDR1, vhCDR2 y vhCDR3) y el dominio ligero variable (vl o V<L>; que contiene la vlCDR1, vlCDR2 y vlCDR3), estando el extremo C del dominio vh unido al extremo N del dominio CH1 de la cadena pesada y estando el extremo C del dominio vl unido al extremo N del dominio ligero constante (y formando, por tanto, la cadena ligera). En un formato scFv, los dominios vh y vl se unen covalentemente, generalmente a través del uso de un conecto como se expone en la presente memoria, en una sola secuencia polipeptídica, que puede ser (empezando desde el extremo N) vh-conector-vl o vl-conectorvh, prefiriéndose generalmente el primero (incluyendo conectores de dominio opcionales en cada lado, dependiendo del formato usado). Como se entiende en la técnica, las CDR están separadas por regiones flanqueantes en cada uno de los dominios pesados variables y ligeros variables: para el dominio variable de la cadena ligera, estos son FR1-vlCDR1-FR2-vlCDR2-FR3-vlCDR3-FR4, y para el dominio variable de la cadena pesada, estos son FR1-vhCDR1-FR2-vhCDR2-FR3-vhCDR3-FR4, mostrando las regiones flanqueantes una alta identidad con las secuencias de la estirpe germinal humana. Los dominios de unión a antígeno incluyen Fab, Fv y scFv.

[0103] Por "modificación", en la presente memoria se entiende una sustitución, inserción y/o eliminación aminoacídica en una secuencia polipeptídica o una alteración en un resto unido químicamente a una proteína. Por ejemplo, una modificación puede ser una estructura alterada glucídica o de PEG unida a una proteína. Por "modificación aminoacídica", en la presente memoria se entiende una sustitución, inserción y/o eliminación aminoacídica en una secuencia polipeptídica. Para mayor claridad, a menos que se indique lo contrario, la modificación aminoacídica es siempre en un aminoácido codificado por el ADN, por ejemplo, los 20 aminoácidos que tienen codones en el ADN y el ARN.

[0105] Por "sustitución aminoacídica" o "sustitución", en la presente memoria se entiende el remplazo de un aminoácido en una posición particular en una secuencia polipeptídica original por un aminoácido diferente. En particular, en algunas realizaciones, la sustitución es por un aminoácido que no se produce de forma natural en la posición particular, que no se produce de forma natural en el organismo o en ningún organismo. Por ejemplo, la sustitución M252Y se refiere a un polipéptido variante, en este caso una variante de Fc, en la que la metionina en la posición 252 se remplaza por tirosina. Para mayor claridad, una proteína que se ha diseñado para cambiar la secuencia codificante del ácido nucleico pero no cambiar el aminoácido inicial (por ejemplo, intercambiando CGG (que codifica arginina) por CGA (que sigue codificando arginina) para aumentar los niveles de expresión del organismo hospedador) no es una "sustitución aminoacídica"; es decir, a pesar de la creación de un nuevo gen que codifica la misma proteína, si la proteína tiene el mismo aminoácido en la posición particular con la que comienza, no es un sustitución aminoacídica.

[0107] Por "proteína variante" o "variante proteínica" o "variante", como se usa en la presente memoria, se entiende una proteína que difiere de la de una proteína original en virtud de al menos una modificación aminoacídica. La variante proteínica puede referirse a la propia proteína, a una composición que comprende la proteína o a la secuencia de aminoácidos que la codifica. Preferiblemente, la variante proteínica tiene al menos una modificación aminoacídica en comparación con la proteína original, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente setenta modificaciones aminoacídicas, y preferiblemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco modificaciones aminoacídicas en comparación con la original. Como se describe a continuación, en algunas realizaciones, el polipéptido parental, por ejemplo, un polipéptido original Fc, es una secuencia humana natural, tal como la región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La secuencia variante proteínica de la presente memoria poseerá preferiblemente al menos aproximadamente un 80 % de identidad con una secuencia proteínica original, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 90 % de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente un 95 %-98 %-99 % de identidad. La proteína variante puede referirse a la propia proteína variante, a composiciones que comprenden la variante proteínica o a la secuencia de ADN que la codifica.

[0109] Por consiguiente, por "variante de anticuerpo" o "anticuerpo variante", como se usa en la presente memoria, se entiende un anticuerpo que difiere de un anticuerpo original en virtud de al menos una modificación aminoacídica, por "variante de IgG" o "IgG variante", como se usa en la presente memoria, se entiende un anticuerpo que difiere de una IgG original (de nuevo, en muchos casos, de una secuencia de IgG humana) en virtud de al menos una modificación aminoacídica, y por "variante de inmunoglobulina" o "inmunoglobulina variante", como se usa en la presente memoria, se entiende una secuencia de inmunoglobulina que difiere de la de una secuencia de inmunoglobulina original en virtud de al menos una modificación aminoacídica. Por "variante de Fc" o "Fc variante", como se usa en la presente memoria, se entiende una proteína que comprende una modificación aminoacídica en un dominio Fc. Las variantes de Fc usadas en la presente memoria se definen según las modificaciones aminoacídicas que las componen. Por tanto, por ejemplo, M252Y o 252Y es una variante de Fc con tirosina de sustitución en la posición 252 con respecto al polipéptido Fc original, en donde la numeración es según el índice EU. Del mismo modo, M252Y/S254T/T256E define una variante de Fc con las sustituciones M252Y, S254T y T256E con respecto al polipéptido Fc original. La identidad del aminoácido WT puede no estar especificada, en cuyo caso la variante mencionada anteriormente se denomina 252Y/254T/256E. Se aprecia que el orden en el que se proporcionan las sustituciones es arbitrario, es decir, por ejemplo, que 252Y/254T/256E es la misma variante de Fc que 254T/252Y/256E, y así sucesivamente. Para todas las posiciones analizadas en la presente invención que se refieren a anticuerpos, a menos que se indique lo contrario, la numeración de las posiciones de los aminoácidos es según Kabat para la numeración del dominio variable y según el índice EU para los dominios constantes, incluyendo el dominio Fc. El índice EU o índice EU como en Kabat o esquema de numeración EU se refiere a la numeración del anticuerpo EU (Edelmanet al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85). La modificación puede ser una adición, eliminación o sustitución. Las sustituciones pueden incluir aminoácidos de origen natural y, en algunos casos, aminoácidos sintéticos.

[0111] Como se usa en la presente memoria, por "proteína" se entiende al menos dos aminoácidos unidos covalentemente, que incluye proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. El grupo peptidilo puede comprender aminoácidos y enlaces peptídicos de origen natural.

[0113] Por "Fab" o "región Fab", como se usa en la presente memoria, se entiende el polipéptido que comprende los dominios de inmunoglobulina VH, CH1, VL y CL. Fab puede referirse a esta región de forma aislada, o a esta región en el contexto de un anticuerpo de longitud completa, un fragmento de anticuerpo o una proteína de fusión de Fab.

[0114] Por "Fv" o "fragmento Fv" o "región Fv", como se usa en la presente memoria, se entiende un polipéptido que comprende los dominios VL y VH de un solo dominio de unión a antígeno (ABD). Como apreciarán los expertos en la técnica, estos generalmente se componen de dos cadenas, o pueden combinarse (generalmente con un conector como se analiza en la presente memoria) para formar un scFv.

[0115] Por "aminoácido" e "identidad de aminoácidos", como se usan en la presente memoria, se entiende uno de los 20 aminoácidos de origen natural que están codificados por el ADN y el ARN.

[0116] Por "función efectora", como se usa en la presente memoria, se entiende un acontecimiento bioquímico que resulta de la interacción de una región Fc de anticuerpo con un receptor o ligando de Fc. Las funciones efectoras incluyen, pero no se limitan a, ADCC, ADCP y CDC.

[0117] Por "receptor de Fc gamma", "FcγR" o "FcgammaR", como se usa en la presente memoria, se entiende cualquier miembro de la familia de proteínas que se une a la región Fc del anticuerpo IgG y está codificado por un gen de FcγR. En los seres humanos, esta familia incluye, pero no se limita a, FcyRI (CD64), que incluye las isoformas FcγRIA, FcγRIb y FcγRIc; FcγRII (CD32), que incluye las isoformas FcγRIIa (incluyendo los alotipos H131 y R131), FcγRIIb (incluyendo FcγRIIb-1 y FcγRIIb-2) y FcγRIIc (CD16), que incluye las isoformas FcγRIIIa (incluyendo los alotipos V158 y F158) y FcγRIIIb (incluyendo los alotipos FcγRIIB-NA1 y FcγRIIB-NA2) (Jefferiset al., 2002, Immunol Lett 82:57-65), así como cualquier FcγR humano no descubierto o isoformas o alotipos de FcγR. En algunos casos, como se expone en la presente memoria, la unión a uno o más de los receptores FcγR se reduce o se anula. Por ejemplo, reducir la unión a FcγRIIIa reduce la ADCC y, en algunos casos, se desea reducir la unión a FcγRIIIa y FcγRIIb.

[0118] Por "FcRn" o "receptor de Fc neonatal", como se usa en la presente memoria, se entiende una proteína que se une a la región Fc del anticuerpo IgG y está codificada, al menos en parte, por un gen de FcRn. El FcRn puede provenir de cualquier organismo, incluyendo, pero sin limitarse a, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Como se conoce en la técnica, la proteína FcRn funcional comprende dos polipéptidos, a menudo denominados cadena pesada y cadena ligera. La cadena ligera es beta-2-microglobulina y la cadena pesada está codificada por el gen de FcRn. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, el FcRn o una proteína de FcRn se refiere al complejo de la cadena pesada de FcRn con beta-2-microglobulina.

[0119] Por "polipéptido original", como se usa en la presente memoria, se entiende un polipéptido de partida que se modifica posteriormente para generar una variante. El polipéptido original puede ser un polipéptido de origen natural, o una variante o versión manipulada de un polipéptido de origen natural. El polipéptido original puede referirse al propio polipéptido, a composiciones que comprenden el polipéptido original o a la secuencia de aminoácidos que lo codifica. Por consiguiente, por "inmunoglobulina original", como se usa en la presente memoria, se entiende un polipéptido de inmunoglobulina no modificado que se modifica para generar una variante, y por "anticuerpo original", como se usa en la presente memoria, se entiende un anticuerpo no modificado que se modifica para generar un anticuerpo variante. Debe apreciarse que "anticuerpo original" incluye anticuerpos comerciales conocidos producidos de forma recombinante, como se expone a continuación. Por "región constante pesada", la presente memoria, se entiende la porción CH1-bisagra-CH2-CH3 de un anticuerpo, generalmente de IgG1, IgG2 o IgG4 humana.

[0120] Por "antígeno diana", como se usa en la presente memoria, se entiende la molécula a la que se une específicamente la región variable de un anticuerpo dado. En el presente caso, el antígeno diana es una proteína tau que está fosforilada en la posición Ser413 ("pSer413-tau").

[0121] Por "célula diana", como se usa en la presente memoria, se entiende una célula que expresa un antígeno diana. Por "región variable", como se usa en la presente memoria, se entiende la región de una inmunoglobulina que comprende uno o más dominios de Ig codificados sustancialmente por cualquiera de los genes V. kappa., V. lambda. y/o VH que componen los locus genéticos de inmunoglobulina de la cadena pesada, respectivamente. Por "natural o WT", en la presente memoria, se entiende una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que se encuentra en la naturaleza, incluyendo las variaciones alélicas. Una proteína WT tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que no se ha modificado intencionadamente. La expresión "proteína tau" usada en la presente memoria significa cualquiera de las seis isoformas de la proteína tau humana, que tienen las secuencias de aminoácidos definidas en SEQ ID NO: 1 a 6, es decir, 4R2N (definida en SEQ ID NO: 1), 4R1N (definida en SEQ ID NO: 2), 4R0N (definida en SEQ ID NO: 3), 3R2N (definida en SEQ ID NO: 4), 3R1N (definida en SEQ ID NO: 5) y 3R0N (definida en SEQ ID NO: 6), así como variantes génicas de las mismas. Como se explica anteriormente en la sección Antecedentes de la invención, se han implicado más de 40 mutaciones en FTDP-17, que es una enfermedad neurodegenerativa familiar relacionada con trastornos cognitivos. Sin embargo, los sitios de mutaciones en una proteína tau no deben limitarse a los implicados en FTDP-17. El número de mutaciones aminoacídicas introducidas en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a 6 no debe limitarse, pero puede ser de 1 a 50, particularmente de 1 a 30, más particularmente de 1 a 10. Sin embargo, el residuo aminoacídico correspondiente a la secuencia de aminoácidos definida en el residuo de serina en la posición 413 de SEQ ID NO: 1 (Ser413) debe conservarse preferiblemente. La proteína tau a la que se hace referencia en la presente memoria también abarca proteínas que tienen similitudes o identidades de un 80 % o más con la secuencia de aminoácidos de la proteína tau humana definida en SEQ ID NO: 1 según el método BLAST (con las condiciones predeterminadas de PBLAST proporcionadas por el NCBI) y sus isoformas. Dichas proteínas tau incluyen tau derivadas de especies no humanas tales como chimpancés, macacos, caballos, cerdos, perros, ratones, conejos y ratas. Es posible producir un agente terapéutico o profiláctico dirigido a tau derivada de dicho animal no humano con el propósito de mejorar la función cognitiva del animal objetivo.

[0122] La expresión "péptido de tau", usado en la presente memoria, significa un péptido que incluye una parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína tau. La posición y la longitud de la secuencia de aminoácidos del péptido de tau derivado de una proteína tau no deben limitarse, pero deben debe contener preferiblemente, por ejemplo, una serie de al menos tres aminoácidos consecutivos, particularmente al menos cinco aminoácidos consecutivos, más particularmente al menos ocho aminoácidos consecutivos, derivados de los residuos aminoacídicos correspondientes a los números de aminoácidos 410 a 421 de SEQ ID NO: 1, incluyendo al menos el aminoácido correspondiente a Ser413. La longitud del péptido de tau tampoco debe estar limitada, pero preferiblemente debe tener una longitud de aminoácidos de cuatro o más, particularmente de seis o más, más particularmente de ocho o más.

[0123] El término "tau", usado en la presente memoria, significa una proteína tau o un péptido de tau en conjunto. La expresión "antiproteína pSer413 tau" significa un anticuerpo como se describe en la presente memoria que se une con preferencia a una proteína tau que está fosforilada en la serina de la posición 413 en comparación con la unión de una proteína tau que no está fosforilada en la serina de la posición 413. La proteína tau fosforilada en Ser413 puede ser humana y/o murina.

[0124] Por "posición", como se usa en la presente memoria, se entiende una ubicación en la secuencia de una proteína. Las posiciones pueden numerarse secuencialmente o según un formato establecido, por ejemplo, el índice EU para la numeración de anticuerpos.

[0125] Por "residuo", como se usa en la presente memoria, se entiende una posición en una proteína y su identidad de aminoácido asociada. Por ejemplo, la asparagina 297 (también denominada Asn297 o N297) es un residuo en la posición 297 del anticuerpo humano IgG1.

[0126] En el contexto de la presente descripción, la posición de un residuo aminoacídico en una proteína tau o un péptido de tau se indica mediante un número de aminoácido, que se identifica en función de la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 1 para mayor claridad. Por ejemplo, el residuo aminoacídico correspondiente a Ser413 de SEQ ID NO: 1 significa el residuo de serina de la posición 413 de SEQ ID NO: 1 (4R2N), la posición 384 de SEQ ID NO: 2 (4R1N), la posición 355 de SEQ ID NO: 3 (4R0N), la posición 382 de SEQ ID NO: 4 (3R2N), la posición 353 de SEQ ID NO: 5 (3R1N) o la posición 324 de SEQ ID NO: 6 (3R0N). La correspondencia de las posiciones de los residuos aminoacídicos entre las isoformas de tau se muestra en la tabla 1 a continuación.

[0127] Tabla 1: Isoformas de la proteína tau humana

[0129]

[0130] Aunque la tabla 1 muestra las posiciones de los residuos aminoacídicos de estas isoformas correspondientes a las posiciones 410 a 421 de la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 1, la correspondencia de las posiciones de los residuos aminoacídicos en otras regiones puede reconocerse fácilmente en función de, por ejemplo, las figuras 1A y 1B. Un experto en la técnica podría determinar las posiciones correspondientes de los aminoácidos en isoformas u homólogos usando la alineación de secuencias por pares, tal como el método de Needleman-Wunsch o el método de Smith-Waterman, o la alineación de secuencias múltiples, tal como el método ClustalW o el método PRRP. Como ejemplo de análisis de las posiciones correspondientes, las figuras 1A y 1B muestran una alineación de las secuencias de aminoácidos de las seis isoformas humanas (indicadas con código de una letra) basada en ClustalW. Estas figuras indican que la estructura que rodea el residuo aminoacídico correspondiente a Ser413 de la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 1 se conserva entre las seis isoformas.

[0132] Los anticuerpos de la presente invención están generalmente aislados o son recombinantes. "Aislado", cuando se usa para describir los diversos polipéptidos descritos en la presente memoria, significa un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de una célula o cultivo celular a partir del que se expresó. Normalmente, un polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. Un "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas. "Recombinante" significa que los anticuerpos se generan usando técnicas de ácidos nucleicos recombinantes en células hospedadoras exógenas.

[0134] El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia proteínica se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos de la secuencia específica (original), después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversas formas que están dentro de las habilidades de la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible al público, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se están comparando. Un programa particular es el programa ALIGN-2 expuesto en los párrafos [0279] a [0280] de la publicación de EE. UU. n.º 20160244525. Otra alineación aproximada para las secuencias de ácido nucleico se proporciona por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489 (1981). Este algoritmo puede aplicarse a las secuencias de aminoácidos usando la matriz de puntuación desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 supl.3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EE. UU., y normalizado por Gribskov, Nucl. Acids Res.14(6):6745-6763 (1986).

[0136] Un ejemplo de una implementación de este algoritmo para determinar el porcentaje de identidad de una secuencia se proporciona por el Genetics Computer Group (Madison, WI) en la aplicación de utilidad "BestFit". Los parámetros predeterminados para este método se describen en el Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, versión 8 (1995) (disponible en Genetics Computer Group, Madison, WI). Otro método para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es usar el paquete de programas MPSRCH con derechos de autor de la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). A partir de este conjunto de paquetes, puede emplearse el algoritmo de Smith-Waterman cuando se usan los parámetros predeterminados para la tabla de puntuación (por ejemplo, una penalización por abertura de hueco de 12, una penalización por extensión de hueco de uno y un hueco de seis). A partir de los datos generados, el valor "Coincidencia" refleja la "identidad de secuencia". Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias son generalmente conocidos en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, usado con parámetros predeterminados. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP pueden usarse con los siguientes parámetros predeterminados: código genético = estándar; filtro = ninguno; hebra = ambas; límite = 60; expectativa = 10; matriz = BLOSUM62; descripciones = 50 secuencias; ordenar por = PUNTUACIÓN ALTA; bases de datos = no redundantes, GenBank EMBL DDBJ PDB GenBank CDS translations Swiss protein Spupdate PIR. Los detalles de estos programas pueden encontrarse en la dirección de Internet ubicada al colocar http://delante de blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

[0138] El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención ("secuencia de la invención") y la secuencia de aminoácidos original se calcula como el número de coincidencias exactas en una alineación de las dos secuencias, dividido por la longitud de la "secuencia de la invención" o la longitud de la secuencia original, la que sea más corta. El resultado se expresa en porcentaje de identidad.

[0140] En algunas realizaciones, dos o más secuencias de aminoácidos son al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % idénticas. En algunas realizaciones, dos o más secuencias de aminoácidos son al menos un 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso un 100 % idénticas.

[0141] "Unión específica" o "se une específicamente a" o es "específica para" un antígeno o un epítopo particular significa una unión que es mediblemente diferente de una interacción no específica. La unión específica puede medirse, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control, que generalmente es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica puede determinarse por competencia con una molécula de control que es similar a la diana.

[0143] El término "K<asoc>" o "K<a>", como se usa en la presente memoria, pretende referirse a la tasa de asociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "K<dis>" o "K<d>", como se usa en la presente memoria, pretende referirse a la tasa de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular. El término "K<D>", como se usa en la presente memoria, pretende referirse a la constante de disociación, que se obtiene de la relación de K<d>a K<a>(es decir, <K<d>>/<K<a>>) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de K<D>para los anticuerpos pueden determinarse usando métodos bien establecidos en la técnica. En algunas realizaciones, el método para determinar la K<D>de un anticuerpo es usando resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, usando un sistema de biosensor tal como un sistema BIACORE<®>. En determinadas realizaciones, el valor de K<D>se mide con una proteína Tau fosforilada. En algunas realizaciones, el valor de K<D>se mide con un péptido fosforilado. En algunas realizaciones, el valor de K<D>se mide con el antígeno (por ejemplo, la proteína Tau fosforilada o el péptido fosforilado) inmovilizado. En otras realizaciones, el valor de K<D>se mide con el anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo original de ratón, el anticuerpo quimérico o las variantes de anticuerpos humanizados) inmovilizado. En otras realizaciones más, el valor de K<D>se mide con una proteína Tau fosforilada como analito. En otras realizaciones más, el valor de KD se mide con un péptido fosforilado como analito. En determinadas realizaciones, el valor de KD se mide en un modo de unión bivalente. En otras realizaciones, el valor de KD se mide en un modo de unión monovalente.

[0145] Una "enfermedad" incluye un estado de salud de un animal, incluyendo un ser humano, en donde el animal no puede mantener la homeostasis y en donde, si la enfermedad no mejora, entonces la salud del animal continúa deteriorándose.

[0147] Por el contrario, un "trastorno" en un animal, incluyendo un ser humano, incluye un estado de salud en el que el animal puede mantener la homeostasis, pero en el que el estado de salud del animal es menos favorable de lo que sería en ausencia del trastorno. Si no se deja sin tratar, un trastorno no provoca necesariamente una mayor disminución del estado de salud del animal.

[0149] Los términos "tratamiento", "tratante", "tratar" y similares se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir total o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma o reducir la probabilidad de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en la presente memoria, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir la aparición de la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero que aún no se ha diagnosticado que la padece; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo o progresión; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad y/o aliviar uno o más síntomas de la enfermedad. "Tratamiento" también pretende abarcar la administración de un agente para proporcionar un efecto farmacológico, incluso en ausencia de una enfermedad o afección. Por ejemplo, "tratamiento" abarca la administración de una composición que puede provocar una respuesta inmunitaria o conferir inmunidad en ausencia de una enfermedad, por ejemplo, en el caso de una vacuna.

[0151] Cualquier referencia a métodos de tratamiento en esta memoria descriptiva debe interpretarse como referencia a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos correspondientes para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

[0153] Como se usa en la presente memoria, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, mamíferos del ordenRodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del ordenLagomorpha, tales como conejos. En algunas realizaciones, los mamíferos son del ordenCarnivora, incluyendo los félidos (gatos) y los cánidos (perros). En algunas realizaciones, los mamíferos son del ordenArtiodactyla, incluyendo bóvidos (vacas) y porcinos (cerdos) o del ordenPerssodactyla, incluyendo équidos (caballos). Lo más preferido es que los mamíferos sean del orden dePrimates, ceboides o simoides (monos) o del orden de losAntropoides(seres humanos y simios superiores). En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano.

[0154] El término "regresión", así como las palabras que derivan del mismo, como se usan en la presente memoria, no implican necesariamente una regresión de un 100 % o completa. Más bien, hay grados variables de regresión que un experto en la técnica reconoce que tienen beneficio o efecto terapéutico potencial. A este respecto, los métodos descritos pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de regresión de una taupatía en un mamífero. Además, la regresión proporcionada por el método de la invención puede incluir la regresión de una o más afecciones o síntomas de la enfermedad, por ejemplo, una taupatía. Además, para los propósitos de la presente memoria, "regresión" puede abarcar retardar la aparición de la enfermedad, retardar la aparición de un síntoma y/o retardar la aparición de una afección de la misma. Con respecto a las enfermedades y trastornos progresivos, "regresión" puede abarcar ralentizar la progresión de la enfermedad o trastorno, ralentizar la progresión de un síntoma de la enfermedad o trastorno y/o ralentizar la progresión de una afección de la misma.

[0156] Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de una composición incluye esa cantidad de la composición que es suficiente para proporcionar un efecto beneficioso al sujeto al que se administra la composición. Una "cantidad eficaz" de un vehículo de administración incluye esa cantidad suficiente para unir o administrar eficazmente una composición.

[0158] Por "individuo" u "hospedador" o "sujeto" o "paciente" se entiende cualquier sujeto mamífero para el que se desee diagnóstico, tratamiento o terapia, particularmente seres humanos. Otros sujetos pueden incluir ganado bovino, perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, etc.

[0160] La expresión "en combinación con", como se usa en la presente memoria, se refiere a usos donde, por ejemplo, una primera terapia se administra durante todo el ciclo de administración de una segunda terapia; donde la primera terapia se administra durante un periodo de tiempo que se superpone con la administración de la segunda terapia, por ejemplo, cuando la administración de la primera terapia comienza antes de la administración de la segunda terapia y la administración de la primera terapia termina antes de que termine la administración de la segunda terapia; donde la administración de la segunda terapia comienza antes de la administración de la primera terapia y la administración de la segunda terapia termina antes de que termine la administración de la primera terapia; donde la administración de la primera terapia comienza antes de que comience la administración de la segunda terapia y la administración de la segunda terapia termina antes de que termine la administración de la primera terapia; donde la administración de la segunda terapia comienza antes de que comience la administración de la primera terapia y la administración de la primera terapia termina antes de que termine la administración de la segunda terapia. Por tanto, "en combinación" también puede referirse a una pauta que implica la administración de dos o más terapias. "En combinación con", como se usa en la presente memoria, también se refiere a la administración de dos o más terapias que pueden administrarse en la misma formulación o en diferentes formulaciones, por la misma vía o por diferentes vías, y en el mismo tipo de forma farmacéutica o en un tipo diferente.

[0162] "Codificar" incluye la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, de servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de la misma. Por tanto, un gen codifica una proteína si, por ejemplo, la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la hebra codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y habitualmente se proporciona en las listas de secuencias, como la hebra no codificante, usada como molde para la transcripción de un gen o ADNc, pueden denominarse codificantes de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

[0164] La expresión "ácido nucleico" incluye moléculas de ARN o ADN que tienen más de un nucleótido en cualquier forma, incluyendo monocatenaria, bicatenaria, oligonucleotídica o polinucleotídica. La expresión "secuencia de nucleótidos" incluye el orden de los nucleótidos en un oligonucleótido o polinucleótido en una forma monocatenaria de ácido nucleico.

[0166] Por "construcción de ácido nucleico" se entiende una secuencia de ácido nucleico que se ha construido para que comprenda una o más unidades funcionales no encontradas juntas en la naturaleza. Ejemplos incluyen moléculas de ADN extracromosómicas (plásmidos) circulares, lineales, bicatenarias, cósmidos (plásmidos que contienen secuencias COS del fago lambda), genomas víricos que incluyen secuencias de ácido nucleico no naturales y similares.

[0168] La expresión "unido de forma funcional", como se usa en la presente memoria, incluye un polinucleótido en relación funcional con un segundo polinucleótido, por ejemplo, un resto de ácido nucleico monocatenario o bicatenario que comprende los dos polinucleótidos dispuestos dentro del resto de ácido nucleico de tal manera que al menos uno de los dos polinucleótidos puede ejercer un efecto fisiológico por el que se caracteriza, sobre el otro. A modo de ejemplo, un promotor unido de forma funcional a la región codificante de un gen puede promover la transcripción de la región codificante. El orden especificado cuando se indica unión funcional no es importante. Por ejemplo, las frases: "el promotor está unido de forma funcional a la secuencia de nucleótidos" y "la secuencia de nucleótidos está unida de forma funcional al promotor" se usan indistintamente en la presente memoria y se consideran equivalentes. En algunos casos, cuando el ácido nucleico que codifica la proteína deseada comprende además una secuencia promotora/reguladora, la secuencia promotora/reguladora se coloca en el extremo 5' de la secuencia codificante de proteína deseada de modo que dirige la expresión de la proteína deseada en una célula.

[0169] Las expresiones "oligonucleótido", "polinucleótido" y "molécula de ácido nucleico", usadas indistintamente en la presente memoria, se refieren a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por tanto, esta expresión incluye, pero no se limita a, ADN o ARN monocatenario, bicatenario o multicatenario, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina u otras bases nucleotídicas naturales, modificadas química o bioquímicamente, no naturales o derivatizadas. La cadena principal del polinucleótido puede comprender glúcidos y grupos fosfato (como pueden encontrarse típicamente en el ARN o el ADN), o glúcidos o grupos fosfato modificados o sustituidos.

[0170] El término "recombinante", como se aplica a un polinucleótido, significa que el polinucleótido es el producto de diversas combinaciones de etapas de clonación, restricción o ligamiento y otros procedimientos que dan como resultado una construcción distinta y/o diferente de un polinucleótido encontrado en la naturaleza. Los términos incluyen respectivamente réplicas de la construcción polinucleotídica original y la descendencia de la construcción vírica original.

[0171] El término "promotor", como se usa en la presente memoria, incluye una secuencia de ADN unida de forma funcional a una secuencia de ácido nucleico a transcribir, tal como una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula deseada. Un promotor generalmente se coloca anterior a una secuencia de ácido nucleico a transcribir y proporciona un sitio para la unión específica de la ARN polimerasa y otros factores de transcripción. Un "vector" puede transferir secuencias génicas a las células diana. Típicamente, "construcción de vector", "vector de expresión" y "vector de transferencia génica" se refieren a cualquier construcción de ácido nucleico que puede dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir secuencias génicas a las células diana, lo que puede conseguirse mediante integración genómica de todo o una parte del vector, o el mantenimiento transitorio o hereditario del vector como elemento extracromosómico. Por tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores de integración.

[0172] La expresión "elemento regulador", como se usa en la presente memoria, incluye una secuencia de nucleótidos que controla algún aspecto de la expresión de las secuencias de ácido nucleico. Ejemplos de elementos reguladores incluyen de manera ilustrativa un potenciador, un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES), un intrón, un origen de replicación, una señal de poliadenilación (pA), un promotor, un potenciador, una secuencia de terminación de la transcripción y un dominio regulador anterior, que contribuyen a la replicación, la transcripción y/o el procesamiento postranscripcional de una secuencia de ácido nucleico. En algunos casos, los elementos reguladores también pueden incluir elementos de ADN reguladores encis, así como elementos transponibles (TE). Los expertos en la técnica pueden seleccionar y usar estos y otros elementos reguladores en una construcción de expresión sin más que experimentación rutinaria. Las construcciones de expresión pueden generarse usando una estrategia recombinante genética o sintéticamente usando metodología bien conocida.

[0173] Un "elemento de control" o "secuencia de control" es una secuencia de nucleótidos implicada en una interacción de moléculas que contribuyen a la regulación funcional de un polinucleótido, incluyendo la replicación, duplicación, transcripción, empalme, traducción o degradación del polinucleótido. La regulación puede afectar a la frecuencia, velocidad o especificidad del proceso, y puede ser de naturaleza potenciadora o inhibidora. Los elementos de control conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, secuencias reguladoras de la transcripción tales como promotores y potenciadores. Un promotor es una región de ADN que puede, en determinadas condiciones, unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una región codificante habitualmente ubicada posteriormente (en la dirección 3') del promotor.

[0174] La afirmación de que un residuo aminoacídico está "fosforilado", usada en la presente memoria, significa que un grupo fosfato está unido por éster a la cadena lateral del residuo aminoacídico. Los residuos aminoacídicos típicos que pueden fosforilarse incluyen serina (Ser), treonina (Thr) y tirosina (Tyr).

[0175] VI. Anticuerpos

[0176] La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a la proteína tau humana que se ha fosforilado en la posición 413, como se define en las reivindicaciones.

[0177] Las unidades estructurales de anticuerpos tradicionales típicamente comprenden un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto típicamente por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (que típicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (que típicamente tiene un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. La presente invención se refiere a anticuerpos como se definen en las reivindicaciones, que generalmente se basan en la clase IgG, que tiene varias subclases, que incluyen, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En general, IgG1, IgG2 e IgG4 se usan con más frecuencia que IgG3. Cabe señalar que IgG1 tiene diferentes alotipos con polimorfismos en 356 (D o E) y 358 (L o M). Las secuencias representadas en la presente memoria usan el alotipo 356D/358L, sin embargo, el otro alotipo se incluye en la presente memoria. Es decir, cualquier secuencia que incluya un dominio Fc de IgG1 incluido en la presente memoria puede tener 356E/358M remplazando el alotipo 356D/358L.

[0178] Como apreciarán los expertos en la técnica, la numeración y ubicación exactas de las CDR pueden ser diferentes entre los diferentes sistemas de numeración. Sin embargo, debe entenderse que la descripción de una secuencia pesada variable y/o ligera variable incluye la descripción de las CDR asociadas (inherentes). Por consiguiente, la descripción de cada región pesada variable es una descripción de las vhCDR (por ejemplo, vhCDR1, vhCDR2 y vhCDR3) y la descripción de cada región ligera variable es una descripción de las vlCDR (por ejemplo, vlCDR1, vlCDR2 y vlCDR3).

[0179] Los métodos para identificar la secuencia de cada una de las CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de un anticuerpo incluyen: Método de Kabat (Kabatet al., The Journal of Immunology, 1991, vol.147, n.º 5, pág.1709-1719) y método de Chothia (Al-Lazikaniet al., Journal of Molecular Biology, 1997, vol.273, n.º 4, pág.927-948). Estos métodos están dentro del conocimiento técnico común para los expertos en la técnica, estando disponibles los compendios de los mismos, por ejemplo, en el sitio de Internet del Grupo del Dr. Andrew C.R. Martin (http://www.bioinf.org.uk/abs/).

[0180] Una comparación útil de la numeración de las CDR es como sigue, véase Lafrancet al., Dev. Comp. Inmunol.

[0181] 27(1):55-77 (2003):

[0182] Tabla 1

[0184]

[0187] A lo largo de la presente memoria descriptiva, el sistema de numeración de Kabat se usa generalmente cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente, los residuos 1-107 de la región variable de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la región variable de la cadena pesada) y el sistema de numeración EU para regiones constantes tales como las regiones Fc (por ejemplo, Kabatet al., supra (1991)). La presente descripción proporciona varios conjuntos de CDR diferentes. En este caso, un "conjunto completo de CDR" comprende las tres CDR ligeras variables y las tres pesadas variables, por ejemplo, vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 y vhCDR3. Estas pueden formar parte de un dominio ligero variable o pesado variable más grande, respectivamente. Además, como se expone más detalladamente en la presente memoria, los dominios pesados variables y ligeros variables pueden estar en cadenas polipeptídicas separadas, cuando se usa una cadena pesada y una ligera (por ejemplo, cuando se usan Fab), o en una sola cadena polipeptídica en el caso de secuencias scFv.

[0188] Las CDR contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno, o más específicamente, del sitio de unión a epítopo de los anticuerpos. "Epítopo" se refiere a un determinante que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo, conocido como parátopo. Los epítopos son agrupaciones de moléculas tales como cadenas laterales de aminoácidos o glucídicas y, habitualmente, tienen características estructurales específicas, así como características de carga específicas. Un solo antígeno puede tener más de un epítopo.

[0189] En el presente caso, el epítopo comprende no solo los residuos aminoacídicos directamente implicados en la unión de los anticuerpos descritos en la presente memoria, sino también la fosforilación en Ser413.

[0190] La porción carboxiterminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Kabatet al.recopilaron numerosas secuencias primarias de las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras. En función del grado de conservación de las secuencias, clasificaron las secuencias primarias individuales en CDR y flanqueantes e hicieron una lista de las mismas (véase SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5.ª edición, publicación NIH, n.º 91-3242, E. A. Kabatet al.).

[0191] En la subclase IgG de inmunoglobulinas, hay varios dominios de inmunoglobulina en la cadena pesada. Por "dominio de inmunoglobulina (Ig)" en la presente memoria se entiende una región de una inmunoglobulina que tiene una estructura terciaria distintiva. Son de interés en la presente invención los dominios de la cadena pesada, que incluyen los dominios pesados constantes (CH) y los dominios de bisagra. En el contexto de los anticuerpos IgG, los isotipos de IgG tienen cada uno tres regiones CH. Por consiguiente, los dominios "CH" en el contexto de IgG son como sigue: "CH1" se refiere a las posiciones 118-220 según el índice EU como en Kabat. "CH2" se refiere a las posiciones 237-340 según el índice EU como en Kabat, y "CH3" se refiere a las posiciones 341-447 según el índice EU como en Kabat.

[0192] Otro tipo de dominio de Ig de la cadena pesada es la región de bisagra. Por "bisagra" o "región de bisagra" o "región de bisagra del anticuerpo" o "región de bisagra de inmunoglobulina" en la presente memoria se entiende el polipéptido flexible que comprende los aminoácidos entre el primer y el segundo dominios constantes de un anticuerpo. Estructuralmente, el dominio CH1 de IgG termina en la posición EU 220, y el dominio CH2 de IgG comienza en el residuo de la posición EU 237. Por tanto, para IgG, la bisagra del anticuerpo se define en la presente memoria para incluir las posiciones 221 (D221 en IgG1) a 236 (G236 en IgG1), en donde la numeración es según el índice EU como en Kabat. En algunas realizaciones, por ejemplo, en el contexto de una región Fc, se incluye la bisagra inferior, refiriéndose "bisagra inferior" generalmente a las posiciones 226 o 230. Como se indica en la presente memoria, también pueden prepararse variantes de pI en la región de bisagra.

[0193] La cadena ligera generalmente comprende dos dominios, el dominio ligero variable (que contiene las CDR de la cadena ligera y, junto con los dominios pesados variables, forman la región Fv) y una región constante de la cadena ligera (a menudo denominada CL o Cκ).

[0194] Otra región de interés para sustituciones adicionales, expuesta a continuación, es la región Fc.

[0195] Por tanto, en la presente memoria se proporcionan diferentes dominios de anticuerpo. Como se describe en la presente memoria y como se conoce en la técnica, los anticuerpos comprenden diferentes dominios dentro de las cadenas pesadas y ligeras, que también pueden superponerse. Estos dominios incluyen, pero no se limitan a, el dominio Fc, el dominio CH1, el dominio CH2, el dominio CH3, el dominio de bisagra, el dominio constante pesado (dominio CH1-bisagra Fc o CH1-bisagra-CH2-CH3), el dominio pesado variable, el dominio ligero variable, el dominio constante ligero, los dominios Fab y los dominios scFv.

[0196] Por tanto, el "dominio Fc" incluye el dominio -CH2-CH3 y, opcionalmente, un dominio de bisagra. La cadena pesada comprende un dominio pesado variable y un dominio constante, que incluye un dominio CH1-bisagra-Fc que comprende un CH2-CH3. La cadena ligera comprende una cadena ligera variable y el dominio constante de la cadena ligera. Un scFv comprende una cadena pesada variable, un conector scFv y un dominio ligero variable. Las moléculas descritas en la presente memoria pueden comprender al menos un dominio scFv que, aunque no es de origen natural, generalmente incluye un dominio pesado variable y un dominio ligero variable, unidos conjuntamente mediante un conector scFv. Como se expone en la presente memoria, aunque el dominio scFv generalmente está orientado desde el extremo N al extremo C como vh-conector scFv-vl, esto puede invertirse para cualquiera de los dominios scFv (o aquellos construidos usando secuencias vh y vl de Fab), en vl-conector scFv-vh.

[0197] Como se muestra en la presente memoria, hay varios conectores scFv adecuados que pueden usarse, incluyendo los enlaces peptídicos tradicionales, generados mediante técnicas recombinantes. El péptido conector puede incluir predominantemente los siguientes residuos aminoacídicos: Gly, Ser, Ala o Thr. El péptido conector debe tener una longitud que sea adecuada para unir dos moléculas de tal manera que asuman la conformación correcta una con respecto a la otra para que conserven la actividad deseada. En un caso, el conector es de aproximadamente 1 a 50 aminoácidos de longitud, preferiblemente de aproximadamente 1 a 30 aminoácidos de longitud. En otro caso, pueden usarse conectores de 1 a 20 aminoácidos de longitud, encontrando uso de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 aminoácidos en algunas realizaciones. Conectores útiles incluyen polímeros de glicina-serina, que incluyen, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n y (GGGS)n, donde n es un número entero de al menos uno (y generalmente de 3 a 4), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros conectores flexibles. Como alternativa, una variedad de polímeros no proteínicos, que incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, pueden encontrar uso como conectores. Otras secuencias conectoras pueden incluir cualquier secuencia de cualquier longitud del dominio CL/CH1, pero no todos los residuos del dominio CL/CH1; por ejemplo, los primeros 5-12 residuos aminoacídicos de los dominios CL/CH1. Los conectores pueden derivar de la cadena ligera de inmunoglobulina, por ejemplo, Cκ o Cλ. Los conectores pueden derivar de cadenas pesadas de inmunoglobulina de cualquier isotipo, incluyendo, por ejemplo, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε y Cµ. Las secuencias conectoras también pueden derivar de otras proteínas tales como proteínas similares a Ig (por ejemplo, TCR, FcR, KIR), secuencias derivadas de la región de bisagra y otras secuencias naturales de otras proteínas.

[0198] En algunos casos, el conector es un "conector de dominio", usado para unir conjuntamente dos dominios cualesquiera, como se expone en la presente memoria. Aunque puede usarse cualquier conector adecuado, muchas realizaciones utilizan un polímero de glicina-serina, incluyendo, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n y (GGGS)n, donde n es un número entero de al menos uno (y generalmente de 3 a 4 a 5), así como cualquier secuencia peptídica que permita la unión recombinante de los dos dominios con suficiente longitud y flexibilidad para permitir que cada dominio conserve su función biológica.

[0200] A. Anticuerpos quiméricos y humanizados

[0202] Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden derivar de una mezcla de diferentes especies, por ejemplo, un anticuerpo quimérico y/o un anticuerpo humanizado. En general, tanto los "anticuerpos quiméricos" como los "anticuerpos humanizados" se refieren a anticuerpos que combinan regiones de más de una especie. Por ejemplo, los "anticuerpos quiméricos" comprenden tradicionalmente una o más regiones variables de un ratón (o rata, en algunos casos) y la o las regiones constantes de un ser humano. Los "anticuerpos humanizados" generalmente se refieren a anticuerpos no humanos a los que se les han intercambiado las regiones flanqueantes del dominio variable por secuencias encontradas en anticuerpos humanos. En general, en un anticuerpo humanizado, el anticuerpo completo, excepto las CDR, está codificado por un polinucleótido de origen humano o es idéntico a dicho anticuerpo excepto dentro de sus CDR. Las CDR, de las que algunas o todas están codificadas por ácidos nucleicos que se originan en un organismo no humano, se injertan en la región flanqueante en lámina beta de una región variable de un anticuerpo humano para crear un anticuerpo, cuya especificidad está determinada por las CDR injertadas. La creación de dichos anticuerpos se describe, por ejemplo, en el documento WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyenet al., 1988, Science 239:1534-1536. La "retromutación" de los residuos flanqueantes aceptadores seleccionados a los residuos donadores correspondientes se requiere a menudo para recuperar la afinidad que se pierde en la construcción injertada inicial (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213). El anticuerpo humanizado también comprenderá de manera óptima al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana y, por tanto, comprenderá típicamente una región Fc humana. Los anticuerpos humanizados también pueden generarse usando ratones con un sistema inmunitario genomanipulado. Roqueet al., 2004, Biotechnol. Prog.20:639-654. En la técnica se conoce bien una variedad de técnicas y métodos para humanizar y remodelar anticuerpos no humanos (véase Tsurushita y Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (EE. UU.), y referencias citadas en el mismo). Los métodos de humanización incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos en Joneset al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmannet al., 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyenet al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queenet al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; Heet al., 1998, J. Immunol.160: 1029-1035; Carteret al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Prestaet al., 1997, Cancer Res.57(20):4593-9; Gormanet al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connoret al., 1998, Protein Eng 11:321-8. La humanización u otros métodos para reducir la inmunogenia de las regiones variables de anticuerpos no humanos pueden incluir métodos de rebarnizado, como se describe, por ejemplo, en Roguskaet al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973.

[0204] En determinados casos, los anticuerpos de la descripción comprenden una región variable de la cadena pesada de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada de estirpe germinal particular y/o una región variable de la cadena ligera de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de estirpe germinal particular. Por ejemplo, dichos anticuerpos pueden comprender o consistir en un anticuerpo humano que comprende regiones variables de la cadena pesada o ligera que son "el producto de" o "derivados de" una secuencia de estirpe germinal particular. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana puede identificarse como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la estirpe germinal humana y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana que está más cerca en secuencia (es decir, el mayor % de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de la estirpe germinal, debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas de origen natural o a la introducción intencionada de una mutación dirigida al sitio. Sin embargo, un anticuerpo humanizado típicamente es al menos un 80 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana y contiene residuos aminoacídicos que identifican al anticuerpo como derivado de secuencias humanas en comparación con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la estirpe germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la estirpe germinal murina). En determinados casos, un anticuerpo humanizado puede ser al menos un 95, 96, 97, 98 o 99 %, o incluso al menos un 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la estirpe germinal. Típicamente, un anticuerpo humanizado derivado de una secuencia de la estirpe germinal humana particular no presentará más de 10-20 diferencias de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana. En determinados casos, el anticuerpo humanizado puede presentar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la estirpe germinal.

[0206] En un caso, el anticuerpo original se ha madurado en su afinidad, como se conoce en la técnica. Pueden emplearse métodos basados en la estructura para la humanización y la maduración de afinidad, por ejemplo, como se describe en la patente de EE: UU. Unidos n.º 7,657,380. Pueden emplearse métodos basados en selección para humanizar y/o madurar la afinidad de regiones variables de anticuerpos maduros, que incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos en Wuet al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al, 1997, J. Biol. Chem.272(16):10678-10684; Rosoket al., 1996, J. Biol. Chem.271(37): 22611-22618; Raderet al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krausset al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759. Otros métodos de humanización pueden implicar el injerto de solo partes de las CDR, incluyendo, pero sin limitarse a, los métodos descritos en Tanet al., 2002, J. Immunol.169:1119-1125; De Pascaliset al., 2002, J. Immunol.

[0207] 169:3076-3084.

[0209] El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio e incluye, por ejemplo, una inmunoglobulina intacta o una porción de unión a antígeno. Las porciones de unión a antígeno pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Por tanto, el término anticuerpo incluye anticuerpos tetraméricos tradicionales de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, así como fragmentos de unión a antígeno tales como Fv, Fab y scFv. En la presente memoria también se proporcionan anticuerpos biespecíficos que incluyen al menos un dominio de unión a antígeno como se expone en la presente memoria.

[0211] El anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención debe presentar preferiblemente cinética plasmática mejorada. La mejora en la cinética plasmática de un anticuerpo humanizado en la presente memoria significa que un parámetro que representa la cinética del anticuerpo humanizado en el plasma se altera en comparación con un anticuerpo no humanizado correspondiente al anticuerpo humanizado. Ejemplos de parámetros que representan la cinética plasmática incluyen: semivida plasmática, tiempo promedio de retención en plasma y eliminación del plasma. Que dicho parámetro esté "alterado" significa que el parámetro está aumentado o disminuido. El anticuerpo no humanizado "correspondiente" al anticuerpo humanizado significa un anticuerpo no humanizado usado como base para producir el anticuerpo humanizado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón o un anticuerpo quimérico.

[0213] La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más de otros anticuerpos. Un "anticuerpo con CDR injertadas" es un anticuerpo que comprende una o más CDR derivadas de un anticuerpo de una especie o isotipo particular y la región flanqueante de otro anticuerpo de la misma o diferente especie o isotipo.

[0215] VII. Composiciones

[0217] La presente invención proporciona varios dominios de unión a antígeno diferentes (generalmente incorporados en anticuerpos) que se unen a la proteína tau humana que está fosforilada en Ser413 (pSer413), en una "reacción de antígeno-anticuerpo" como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0219] La "reacción de antígeno-anticuerpo" se mide por la afinidad de un anticuerpo por una proteína Tau fosforilada o un péptido de Tau fosforilado, es decir, la constante de disociación en equilibrio (K<<D>>). En determinados casos, el valor de K<D>se mide con una proteína Tau fosforilada. En algunos casos, el valor de K<D>se mide con un péptido de Tau fosforilado. En un caso, el péptido de Tau fosforilado se fosforila solo en un residuo (por ejemplo, SEQ ID NO: 75). En otro caso, el péptido fosforilado se fosforila en múltiples residuos (por ejemplo, SEQ ID NO: 76 o SEQ ID NO: 78). En algunos casos, el valor de K<D>se mide con el antígeno (por ejemplo, la proteína Tau fosforilada o el péptido de Tau fosforilado) inmovilizado, en cuyo caso la medición de la afinidad incluye un componente de avidez, es decir, en un modo de unión bivalente. En otros casos, el valor de K<D>se mide con el anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo original de ratón, el anticuerpo quimérico o las variantes de anticuerpo humanizadas) inmovilizado, en cuyo caso la medición de la afinidad no incluye un componente de avidez, es decir, en un modo de unión monovalente. En otros casos más, el valor de K<D>se mide con el anticuerpo inmovilizado y con la proteína Tau fosforilada como analito. En otros casos más, el valor de K<D>se mide con el anticuerpo inmovilizado y con el péptido fosforilado como analito. En determinados casos, el valor de K<D>se mide en un modo de unión bivalente. En otros casos, el valor de K<D>se mide en un modo de unión monovalente.

[0221] Por tanto, en determinadas realizaciones, el valor de K<D>es 5×10<-8>M o menos; en algunas realizaciones, el valor de K<D>es 5×10<-9>M o menos; en otras realizaciones, el valor de K<D>es 5×10<-10>M o menos; en otras realizaciones más, el valor de K<D>es 1,86×10<-8>M o menos; en otras realizaciones más, el valor de K<D>es 2×10-9 M o menos; en otras realizaciones más, el valor de K<D>es 2×10<-10>M o menos. En una realización específica, el anticuerpo descrito en la presente memoria se une a una proteína Tau fosforilada o a un péptido de Tau fosforilado con una K<D>de 5×10<-8>M o menos, medida con el anticuerpo inmovilizado y la proteína tau fosforilada o el péptido de tau fosforilado como analito. En otra realización específica, el anticuerpo descrito en la presente memoria se une a una proteína Tau fosforilada o a un péptido de Tau fosforilado con una K<D>de 5 × 10<-9>M o menos, medida con la proteína Tau fosforilada o el péptido de Tau fosforilado inmovilizado y el anticuerpo como analito. En otra realización específica más, el anticuerpo descrito en la presente memoria se une a una proteína Tau fosforilada o a un péptido de Tau fosforilado con una K<D>de 2×10<-9>M o menos, medida con la proteína Tau fosforilada o el péptido de Tau fosforilado inmovilizado y el anticuerpo como analito. En otra realización específica, el anticuerpo descrito en la presente memoria se une a una proteína Tau fosforilada o a un péptido de Tau fosforilado con una K<D>de 5×10<-10>M o menos, medida con la proteína Tau fosforilada o el péptido de Tau fosforilado inmovilizado y el anticuerpo como analito. En otra realización específica, el anticuerpo descrito en la presente memoria se une a una proteína Tau fosforilada o a un péptido de Tau fosforilado con una K<D>de 2×10<-10>M o menos, medida con la proteína Tau fosforilada o el péptido de Tau fosforilado inmovilizado y el anticuerpo como analito.

[0223] Además, como se expone en la presente memoria, los anticuerpos de la invención se unen con preferencia a los péptidos o proteínas tau que están fosforilados en la posición S413 por encima de las proteínas o péptidos que no contienen un fosfato en la posición 413.

[0225] El anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención puede provocar una reacción de antígeno-anticuerpo con la proteína tau fosforilada en Ser413 o el péptido de tau fosforilado en Ser413.

[0226] Las proteínas tau y los péptidos de tau fosforilados con los que el anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención puede provocar una reacción de antígeno-anticuerpo son los que están fosforilados en el residuo aminoacídico serina en la posición 413, que está fosforilado específicamente en enfermedades neurodegenerativas tales como AD. Específicamente, dichas proteínas tau y péptidos de tau están fosforilados al menos en el residuo de serina en la posición 413 de la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 1 (Ser413), y también pueden fosforilarse en uno o más de los residuos aminoacídicos correspondientes a los números de aminoácidos 410 a 421, es decir, uno o más de los residuos aminoacídicos correspondientes al residuo de serina en la posición 412 (Ser412), el residuo de treonina en la posición 414 (Thr414) y el residuo de serina en la posición 416 (Ser416) de la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 1. Péptidos fosforilados típicos de este tipo incluyen, aunque no se limitan a: pSer412/pSer413(Cys-), que tiene la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 7; pSer413(Cys-), que tiene la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 8, y pSer409/pSer412/pSer413(Cys-), que tiene la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 9.

[0228] El péptido de tau fosforilado descrito anteriormente puede usarse en la producción del anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención, o como antígeno para estudiar la reactividad.

[0230] El péptido de tau fosforilado descrito anteriormente puede producirse por un experto en la técnica usando métodos de síntesis o métodos de genomanipulación apropiados. Ejemplos de métodos para producir el péptido fosforilado mediante síntesis incluyen el método Boc (Wakamiya T., Chemistry Letters, vol. 22, pág.

[0231] 1401, 1993), el método Fmoc (Perich, J. W., International Journal of Peptide and Protein Research, vol. 40, pág.134-140, 1992) y los documentos JP3587390B y WO2013/180238, aunque un experto en la técnica puede emplear cualquier otro método apropiado. Ejemplos de métodos para producir el péptido fosforilado mediante genomanipulación incluyen un método en el que se prepara un material genético (ADN o ARN) que tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido a producir o un precursor del mismo y, después de etapas opcionales tales como introducción en un vector de expresión y adición de una secuencia promotora, se introduce en un hospedador adecuado para su expresión o se somete a un sistema de síntesis de proteínas sin células. En este caso, el péptido puede fosforilarse en un sitio deseado provocando una reacción de fosforilación en el hospedador por medio de enzimas tales como cinasas, que pueden ser inherentes al hospedador o puede provocarse que se expresen mediante genomanipulación, o recuperando el péptido diana del hospedador y luego provocando una reacción de fosforilación usando enzimas tales como cinasas. En este último caso, la reacción de fosforilación puede producirsein vitrosometiendo el péptido diana a una enzima que se sabe que desempeña un papel en la reacción de fosforilación de tau, tal como la glucógeno sintasa cinasa 3 (GSK3) o la proteína cinasa 5 dependiente de ciclina (CDK5). De entre los péptidos fosforilados en el hospedador oin vitrosegún los métodos anteriores, los péptidos fosforilados en un residuo aminoacídico deseado pueden recuperarse, por ejemplo, seleccionando los que se unen específicamente al anticuerpo antitau fosforilada mencionado anteriormente mediante reacción de anticuerpo-antígeno.

[0233] El péptido de tau fosforilado puede modificarse en su secuencia aminoterminal y/o en su secuencia carboxiterminal con una sustancia que tiene otras funciones adecuadas para los propósitos deseados. Por ejemplo, al péptido de tau fosforilado se le puede añadir a su extremo aminoterminal y/o carboxiterminal, por ejemplo, un residuo de metionina, un grupo acetilo o ácido piroglutámico, o puede modificarse en su extremo N y/o extremo C con, por ejemplo, material fluorescente. Como alternativa, el extremo N y/o el extremo C del péptido de tau fosforilado pueden modificarse con, por ejemplo, un péptido o una proteína. Ejemplos de péptidos utilizables para dicha modificación incluyen secuencias de marca adecuadas (típicamente una marca de histidina o marca FLAG), péptidos que tienen secuencias de aminoácidos que pueden reconocerse por un receptor de linfocitos T (TCR) o un complejo principal de histocompatibilidad (MHC), proteínas derivadas de virus o bacterias o péptidos que tienen secuencias derivadas de dichas proteínas. Además, el péptido de tau fosforilado incluye los que tienen al menos un residuo aminoacídico distinto de los residuos aminoterminales y carboxiterminales modificado con cualquier otro compuesto o péptido. Un experto en la técnica podría llevar a cabo dicha modificación en un péptido de tau fosforilado usando cualquier método conocido, tal como los descritos en Hermansonet al., "Bioconjugate Techniques", (EE. UU.), Academic Press, 1996.

[0234] Un experto en la técnica podría llevar a cabo la medición de una reacción de antígeno-anticuerpo seleccionando un ensayo de unión apropiado en un sistema de fase sólida o fase líquida. Ejemplos de dichos ensayos incluyen, aunque no se limitan a: ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), inmunoensayo enzimático (EIA), resonancia de plasmones superficiales (SPR), transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y transferencia de energía por resonancia de luminiscencia (LRET). La medición de la afinidad de unión antígeno-anticuerpo se puede llevar a cabo, por ejemplo, marcando un anticuerpo y/o un antígeno con, por ejemplo, una enzima, un material fluorescente, un material luminiscente o un radioisótopo, y detectando la reacción de antígeno-anticuerpo usando un método adecuado para medir las propiedades físicas y/o químicas características del marcador usado.

[0236] El anticuerpo antitau fosforilada humanizado descrito en la presente memoria debe tener preferiblemente una afinidad de unión selectiva mejorada a una proteína tau o péptido de tau fosforilado por encima de su afinidad de unión a una proteína tau o péptido de tau no fosforilado. La mejora en la afinidad de unión selectiva de un anticuerpo a una proteína tau o péptido de tau fosforilado en este contexto significa que está aumentada la relación de la afinidad de unión del anticuerpo a la proteína tau o péptido de tau fosforilado respecto a su afinidad de unión a la correspondiente proteína tau o péptido de tau no fosforilado. Dicha afinidad de unión selectiva puede analizarse, por ejemplo, usando una placa en la que se ha inmovilizado la proteína tau o péptido de tau fosforilado y una placa en la que se ha inmovilizado la proteína tau o péptido de tau no fosforilado correspondiente, midiendo la afinidad de unión del anticuerpo a cada una de estas proteínas o péptidos mediante, por ejemplo, ELISA (por ejemplo, como un valor de DO de absorbancia de la longitud de onda de emisión) y dividiendo el valor de la afinidad de unión (por ejemplo, como un valor de DO de absorbancia) obtenido para la proteína tau o péptido de tau fosforilado por el valor obtenido para la correspondiente proteína tau o péptido de tau no fosforilado. Las condiciones específicas para ELISA pueden ser las que se describen en la sección de ejemplos a continuación.

[0238] El anticuerpo antitau fosforilada humanizado descrito en la presente memoria debe tener preferiblemente una relación de la afinidad de unión selectiva a la proteína tau o péptido de tau fosforilado respecto a la afinidad de unión a la proteína tau o péptido de tau no fosforilado de al menos aproximadamente 40 o más, particularmente al menos aproximadamente 50 o más, más particularmente al menos aproximadamente 60 o más, siempre que la afinidad de unión selectiva se obtenga según el método descrito en el ejemplo 2, a continuación. En una realización, la relación se calcula comparando la afinidad de unión de los anticuerpos anti-pSer413 tau a un péptido fosforilado tal como SEQ ID NO: 8 con la afinidad de unión al péptido no fosforilado de SEQ ID NO: 69.

[0239] El anticuerpo antitau fosforilada humanizado descrito en la presente memoria debe presentar preferiblemente una capacidad mejorada de entrar en el cerebro cuando se administra en la sangre. La mejora en la capacidad de un anticuerpo de entrar en el cerebro cuando se administra en la sangre en este contexto significa que, cuando el anticuerpo se administra en la sangre de un ser humano o cualquier otro mamífero (por ejemplo, un ratón o una rata), la relación de la concentración de anticuerpos en el cerebro a la concentración de anticuerpos en el plasma está aumentada. La capacidad de un anticuerpo de entrar en el cerebro puede analizarse, por ejemplo, administrando el anticuerpo a un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) mediante la sangre y, después de un periodo predeterminado (por ejemplo, una semana), recogiendo la sangre y preparando un homogeneizado cerebral, midiendo la concentración de anticuerpos en cada una de la muestra de plasma obtenida y la muestra de homogeneizado cerebral obtenida usando un método conocido (por ejemplo, ELISA de tipo sándwich con un anticuerpo policlonal antihumano) y dividiendo el concentración de anticuerpos en el cerebro por la concentración de anticuerpos en el plasma. Las condiciones específicas para el ELISA pueden ser las descritas en la sección de ejemplos a continuación. Se sabe que la concentración de un anticuerpo que entra en el cerebro es generalmente de aproximadamente un 0,1 a un 0,3 % de la del plasma.

[0241] El anticuerpo antitau fosforilada humanizado descrito en la presente memoria debe tener preferiblemente una relación de la concentración de anticuerpos en el cerebro a la concentración de anticuerpos en el plasma de un 0,30 % o más, particularmente de un 0,35 % o más, más particularmente de un 0,40 % o más, incluso más particularmente de un 0,45 % o más, siempre que la relación se obtenga según el método descrito en la sección "[7] Ejemplo 7: Análisis de la migración intracerebral" de los ejemplos a continuación.

[0243] A. Dominios de unión a antígeno

[0245] Los dominios de unión a antígeno de los anticuerpos de la invención se unen a la proteína pSer413 tau humana con preferencia por encima de la unión a proteínas tau que no están fosforiladas en Ser413, como se describe en la presente memoria.

[0247] La descripción proporciona dominios de unión a antígeno que comprenden una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 91, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 82; una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 83; una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 86; una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 115; y una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 88.

[0248] La descripción proporciona dominios de unión a antígeno que comprenden una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 92, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 82; una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 83; una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 86; una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 115; y una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 88.

[0249] La descripción proporciona dominios de unión a antígeno que comprenden una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 93, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 82; una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 83; una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 86; una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 115; y una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 88.

[0250] La descripción proporciona dominios de unión a antígeno que comprenden una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 94, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 82; una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 83; una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 86; una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 115; y una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 88.

[0251] La descripción proporciona dominios de unión a antígeno que comprenden una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 95, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 82; una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 83; una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 86; una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 115; y una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 88.

[0252] La descripción proporciona dominios de unión a antígeno que comprenden una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 96, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 82; una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 83; una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 86; una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 115; y una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 88.

[0253] La descripción proporciona dominios de unión a antígeno que comprenden una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 97, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 82; una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 83; una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 86; una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 115; y una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 88.

[0254] La descripción proporciona dominios de unión a antígeno que comprenden una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 98, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 82; una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 83; una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 86; una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 115; y una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 88.

[0255] La descripción proporciona dominios de unión a antígeno que comprenden una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 99, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 82; una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 83; una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 86; una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 115; y una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 88.

[0256] La descripción proporciona dominios de unión a antígeno que comprenden una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 100, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 82; una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 83; una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 86; una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 115; y una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 88.

[0257] La descripción proporciona dominios de unión a antígeno que comprenden una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 101, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 82; una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 83; una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 86; una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 115; y una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 88.

[0258] La descripción proporciona dominios de unión a antígeno que comprenden una vlCDR1 que tiene SEQ ID NO: 102, una vlCDR2 que tiene SEQ ID NO: 82; una vlCDR3 que tiene SEQ ID NO: 83; una vhCDR1 que tiene SEQ ID NO: 86; una vhCDR2 que tiene SEQ ID NO: 115; y una vhCDR3 que tiene SEQ ID NO: 88.

[0259] La invención proporciona dominios de unión a antígeno para la proteína pSer413 tau humana como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0260] Como se muestra en los ejemplos, se proporcionan varios dominios pesados variables y ligeros variables humanizados, que pueden combinarse en cualquier combinación, y pueden añadirse a los dominios constantes de IgG humanos en cualquier combinación.

[0261] En una realización, el dominio ligero variable Ta1505-VL46 (SEQ ID NO: 103) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116) para formar un dominio Fv que se une a la pSer413 tau. En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0262] En un caso descrito en la presente memoria, el dominio ligero variable Ta1505-VL46 (SEQ ID NO: 103) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0263] En un caso descrito en la presente memoria, el dominio ligero variable Ta1505-VL47 (SEQ ID NO: 104) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0264] En una realización, el dominio ligero variable Ta1505-VL47 (SEQ ID NO: 104) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). En esta realización, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0265] En una realización, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_G34A (SEQ ID NO: 105) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). En esta realización, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0266] En un caso descrito en la presente memoria, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_G34A (SEQ ID NO: 105) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0267] En un caso descrito en la presente memoria, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_G34S (SEQ ID NO: 106) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0268] En un caso descrito en la presente memoria, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_G34S (SEQ ID NO: 106) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0269] En una realización, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_G34T (SEQ ID NO: 107) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). En esta realización, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0270] En un caso descrito en la presente memoria, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_G34T (SEQ ID NO: 107) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0271] En una realización, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_N33Q (SEQ ID NO: 108) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). En esta realización, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0272] En un caso descrito en la presente memoria, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_N33Q (SEQ ID NO: 108) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0273] En una realización, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_N33Q_G34A (SEQ ID NO: 109) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). En esta realización, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0274] En un caso descrito en la presente memoria, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_N33Q_G34A (SEQ ID NO: 109) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0275] En una realización, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_N33D (SEQ ID NO: 110) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). En esta realización, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0276] En un caso descrito en la presente memoria, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_N33D (SEQ ID NO: 110) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0277] En una realización, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_N33S (SEQ ID NO: 111) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). En esta realización, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0278] En un caso descrito en la presente memoria, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_N33S (SEQ ID NO: 111) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0279] En una realización, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_N33T (SEQ ID NO: 112) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). En esta realización, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0280] En un caso descrito en la presente memoria, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_N33T (SEQ ID NO: 112) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0281] En una realización, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_S28N (SEQ ID NO: 113) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). En esta realización, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0282] En un caso descrito en la presente memoria, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_S28N (SEQ ID NO: 113) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0283] En una realización, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_G34A_S28N (SEQ ID NO: 114) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH11 (SEQ ID NO: 116). En esta realización, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0284] En un caso descrito en la presente memoria, el dominio ligero variable Ta1505-VL46_G34A_S28N (SEQ ID NO: 114) se combina con el dominio pesado variable Ta1505-VH65 (SEQ ID NO: 117). En este caso, el dominio constante pesado humano se selecciona de SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 y 126 y el dominio constante kappa ligero humano, SEQ ID NO: 52.

[0285] El anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención tiene una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera que tienen secuencias de aminoácidos específicas, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0286] Como región variable de la cadena pesada, los anticuerpos descritos en la presente memoria deben incluir preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tenga un 80 % o más, particularmente un 85 % o más, más particularmente un 90 % o más, incluso más particularmente un 95 % o más, incluso aún más particularmente un 100 % de identidad, con una secuencia seleccionada de la secuencia VH11 (definida en SEQ ID NO: 18), la secuencia VH12 (definida en SEQ ID NO: 20), la secuencia VH47 (definida en SEQ ID NO: 22), VH61 (definida en SEQ ID NO: 24), la secuencia VH62 (definida en SEQ ID NO: 26), la secuencia VH64 (definida en SEQ ID NO: 28) y la secuencia VH65 ( definido en SEQ ID NO: 30). En un caso, el anticuerpo podría incluir, como región variable de la cadena pesada, la secuencia de aminoácidos de la secuencia VH65, o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia VH65 mediante una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: sustitución de Ala en la posición 28 (n.º Kabat: H28) por Thr; sustitución de Asn en la posición 30 (n.º Kabat: H30) con Ser; sustitución de Val en la posición 49 (n.º Kabat: H49) con Gly; sustitución de Ala en la posición 64 (n.º Kabat: H61) por Asp; y sustitución de Gln en la posición 78 (n.º Kabat: H75) por Lys.

[0287] Como región variable de la cadena ligera, los anticuerpos descritos en la presente memoria deben incluir preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tenga un 80 % o más, particularmente un 85 % o más, más particularmente un 90 % o más, incluso más particularmente un 95 % o más, incluso aún más particularmente un 100 % de identidad, con una secuencia seleccionada de la secuencia VL15 (definida en SEQ ID NO: 32), la secuencia VL36 (definida en SEQ ID NO: 34), la secuencia VL46 (definida en SEQ ID NO: 36), la secuencia VL47 (definida en SEQ ID NO: 38), la secuencia VL48 (definida en SEQ ID NO: 40) y la secuencia VL50 (definida en SEQ ID NO: 42). Por ejemplo, una región variable de la cadena ligera puede incluir la secuencia de aminoácidos de la secuencia VL47, o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia VL47 mediante una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: sustitución de Asp en la posición 17 (n.º Kabat: L17) por Glu; sustitución de Ser en la posición 28 (n.º Kabat: L27A) por Asn; sustitución de Gln en la posición 42 (n.º Kabat: L37) por Leu; sustitución de Gln en la posición 50 (n.º Kabat: L45) por Arg; y sustitución de Arg en la posición 51 (n.º Kabat: L46) por Leu.

[0288] Los anticuerpos antitau fosforilada humanizados descritos en la presente memoria podrían incluir cualquier combinación seleccionada de:

[0289] (1) la secuencia VH11 (SEQ ID NO: 116) como región variable de la cadena pesada y la secuencia VL15 (SEQ ID NO: 32) como región variable de la cadena ligera;

[0290] (2) la secuencia VH11 (SEQ ID NO: 116) como región variable de la cadena pesada y la secuencia VL36 (SEQ ID NO: 34) como región variable de la cadena ligera;

[0291] (3) la secuencia VH11 (SEQ ID NO: 116) como región variable de la cadena pesada y la secuencia VL46 (SEQ ID NO: 36) como región variable de la cadena ligera;

[0292] (4) la secuencia VH11 (SEQ ID NO: 116) como región variable de la cadena pesada y la secuencia VL47 (SEQ ID NO: 38) como región variable de la cadena ligera;

[0293] (5) la secuencia VH11 (SEQ ID NO: 116) como región variable de la cadena pesada y la secuencia VL48 (SEQ ID NO: 40) como región variable de la cadena ligera;

[0294] (6) la secuencia VH11 (SEQ ID NO: 116) como región variable de la cadena pesada y la secuencia VL50 (SEQ ID NO: 42) como región variable de la cadena ligera;

[0295] (7) la secuencia VH12 (SEQ ID NO: 20) como región variable de la cadena pesada y la secuencia VL48 (SEQ ID NO: 40) como región variable de la cadena ligera;

[0296] (8) la secuencia VH47 (SEQ ID NO: 22) como región variable de la cadena pesada y la secuencia VL48 (SEQ ID NO: 40) como región variable de la cadena ligera;

[0297] (9) la secuencia VH61 (SEQ ID NO: 24) como región variable de la cadena pesada y la secuencia VL48 (SEQ ID NO: 40) como región variable de la cadena ligera;

[0298] (10) la secuencia VH62 (SEQ ID NO: 26) como región variable de la cadena pesada y la secuencia VL48 (SEQ ID NO: 40) como región variable de la cadena ligera;

[0299] (11) la secuencia VH64 (SEQ ID NO: 28) como región variable de la cadena pesada y la secuencia VL47 (SEQ ID NO: 38) como región variable de la cadena ligera;

[0300] (12) la secuencia VH64 (SEQ ID NO: 28) como región variable de la cadena pesada y la secuencia VL48 (SEQ ID NO: 40) como región variable de la cadena ligera;

[0301] (13) la secuencia VH65 (SEQ ID NO: 117) como región variable de la cadena pesada y la secuencia VL47 (SEQ ID NO: 37) como región variable de la cadena ligera.

[0302] Al seleccionar las secuencias de aminoácidos de las CDR y/o las regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera de las mencionadas anteriormente y combinarlas con secuencias de aminoácidos de las regiones flanqueantes y/o regiones constantes de una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo humano, según sea apropiado, un experto en la técnica podrá diseñar un anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención. Las secuencias de aminoácidos de las regiones flanqueantes y/o las regiones constantes de una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo humano pueden seleccionarse, por ejemplo, de las de los subtipos IgG, IgA, IgM, IgE e IgD humanos o variantes de los mismos.

[0303] B. Anticuerpos anti-pSer413 tau específicos

[0304] En la presente memoria se describen varios anticuerpos específicos que comprenden un par de las siguientes secuencias, una cadena pesada y una cadena ligera, por lo que algunos de los anticuerpos son los anticuerpos de la invención enumerados en las reivindicaciones:

[0305] mAb-aPT1: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 144

[0306] mAb-aPT2: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 145

[0307] mAb-aPT3: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 146

[0308] mAb-aPT4: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 147

[0309] mAb-aPT5: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 148

[0310] mAb-aPT6: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 149

[0311] mAb-aPT7: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 150

[0312] mAb-aPT8: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 151

[0313] mAb-aPT9: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 152

[0314] mAb-aPT10: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 153

[0315] mAb-aPT11: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 154

[0316] mAb-aPT12: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 155

[0317] mAb-aPT13: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 156

[0318] mAb-aPT14: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 157

[0319] mAb-aPT15: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 158

[0320] mAb-aPT16: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 159

[0321] mAb-aPT17: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 160

[0322] mAb-aPT18: LC SEQ ID NO: 184 y HC SEQ ID NO: 161

[0323] mAb-aPT19: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 144

[0324] mAb-aPT20: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 145

[0325] mAb-aPT21: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 146

[0326] mAb-aPT22: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 147

[0327] mAb-aPT23: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 148

[0328] mAb-aPT24: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 149

[0329] mAb-aPT25: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 150

[0330] mAb-aPT26: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 151

[0331] mAb-aPT27: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 152

[0332] mAb-aPT28: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 153

[0333] mAb-aPT29: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 154

[0334] mAb-aPT30: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 155

[0335] mAb-aPT31: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 156

[0336] mAb-aPT32: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 157

[0337] mAb-aPT33: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 158

[0338] mAb-aPT34: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 159

[0339] mAb-aPT35: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 160

[0340] mAb-aPT36: LC SEQ ID NO: 185 y HC SEQ ID NO: 161C. Anticuerpos que compiten por la unión

[0341] Además de los dominios de unión a antígeno y los anticuerpos que los contienen que se unen a la proteína tau humana que está fosforilada en la posición 413 (pSer413), en el presente documento se describen anticuerpos que compiten por la unión con los anticuerpos citados.

[0342] También se describe un anticuerpo humanizado que provoca la unión competitiva a pSer413 tau con el anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención. La expresión "unión competitiva" usada en la presente memoria significa que, cuando hay dos o más anticuerpos monoclonales junto con un antígeno, la unión de uno de los anticuerpos al antígeno se inhibe por la unión del otro anticuerpo al antígeno. La unión competitiva habitualmente puede medirse, por ejemplo, añadiendo, a una cantidad constante (concentración) de un anticuerpo monoclonal, otro anticuerpo monoclonal variando la cantidad (concentración) del mismo, y determinando la cantidad (concentración) del último anticuerpo monoclonal a la que se disminuye la cantidad de unión del primer anticuerpo monoclonal, que existe en cantidad constante. El grado de inhibición del mismo puede expresarse en la unidad de CI50 o Ki. El anticuerpo humanizado que provoca la unión competitiva con el anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención significa un anticuerpo que tiene una CI50 de 1 µM o menos, particularmente 100 nM o menos, más particularmente 10 nM o menos, cuando se mide una unión de antígeno-anticuerpo usando el anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención a 10 nM.

[0343] Los estudios de unión competitiva pueden hacerse como se conoce en la técnica, generalmente usando ensayos de unión SPR/BiaCore<®>u Octet<®>, así como ensayos ELISA y basados en células.

[0344] Los dominios pesados variables y ligeros variables de los anticuerpos de unión competitiva tienen al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad con al menos una de las regiones variables expuestas en la presente memoria, y en los dominios constantes, tienen al menos un 99 o 100 % de identidad con una secuencia de IgG humana expuesta en la figura 13.

[0345] D. Sustituciones aminoacídicas

[0346] Además de las secuencias expuestas en la presente memoria, se describen dominios de unión a antígeno y anticuerpos que los contienen que pueden tener una o más sustituciones aminoacídicas en comparación con la secuencia de partida original.

[0347] Por tanto, por ejemplo, para todos los dominios pesados y ligeros variables enumerados en la presente memoria, pueden hacerse variantes adicionales. Como se expone en la presente memoria, en algunos casos, el conjunto de 6 CDR puede tener 0, 1, 2, 3, 4 o 5 modificaciones aminoacídicas (encontrando las sustituciones aminoacídicas un uso particular). En estos casos, generalmente una sola CDR no tiene más de 1 o 2 sustituciones aminoacídicas, y las secuencias mutadas conservan la unión a la proteína pSer413 tau. Sin embargo, cuando se preparan variantes de aminoácidos en las CDR de las secuencias expuestas en la presente memoria, las CDR resultantes no son para las CDR murinas descritas en el documento WO2013/180238 (PCT/JP13/65090) y mostradas en SEQ ID NO: 81, 82 y 83 (CDR ligeras variables) y SEQ ID NO: 86, 87 y 88 (CDR pesadas variables).

[0348] En algunos casos, pueden realizarse cambios en la o las regiones flanqueantes de los dominios pesados y/o ligeros variables. En este caso, las variantes preferidas en las regiones flanqueantes (por ejemplo, excluyendo las CDR) conservan al menos aproximadamente un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia de la estirpe germinal humana. Por tanto, por ejemplo, las CDR idénticas a las descritas en la presente memoria pueden combinarse con diferentes secuencias flanqueantes de las secuencias de la estirpe germinal humana, siempre que las regiones flanqueantes conserven al menos un 80, 85, 90 o 95 % de identidad con una secuencia de la estirpe germinal humana.

[0349] En algunos casos, para las cadenas ligeras humanizadas descritas en la presente memoria, la estirpe germinal de la cadena ligera humana más cercana es IGKV2-30, que tiene una identidad de un 81 % con las secuencias de la presente memoria. Por tanto, pueden prepararse variantes adicionales en las regiones flanqueantes ligeras siempre que la identidad sea de al menos un 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con IGKV2-30. Para las cadenas pesadas humanizadas de la presente memoria, la estirpe germinal humana más cercana para la cadena pesada es IGHV3-73, que tiene un 85 % de identidad con las secuencias de la presente memoria. Por tanto, pueden prepararse variantes adicionales en las regiones flanqueantes ligeras siempre que la identidad sea de al menos un 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad con IGHV3-73.

[0350] Como alternativa, las CDR pueden tener modificaciones aminoacídicas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 modificaciones aminoacídicas en el conjunto de CDR (es decir, las CDR pueden modificarse siempre que el número total de cambios en el conjunto de 6 CDR sea de menos de 6 modificaciones aminoacídicas, cambiándose cualquier combinación de CDR; por ejemplo, puede haber un cambio en vlCDR1, dos en vhCDR2, ninguno en vhCDR3, etc.)), además de tener cambios en la región flanqueante, siempre que las regiones flanqueantes conserven al menos un 80, 85 o 90 % de identidad con una secuencia de la estirpe germinal humana y las CDR resultantes no sean las CDR murinas expuestas en el documento WO2013/180238 (PCT/JP13/65090) y mostradas en SEQ ID NO: 81, 82 y 83 (CDR ligeras variables) y SEQ ID NO: 86, 87 y 88 (CDR pesadas variables).

[0351] En general, el porcentaje de identidad para la comparación entre los anticuerpos anti-pSer413 tau es de al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, prefiriéndose al menos aproximadamente un 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad. El porcentaje de identidad puede estar a lo largo de toda la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, toda la cadena pesada o ligera o a lo largo de una porción de las cadenas. Por ejemplo, en la definición de los anticuerpos anti-pSer413 tau de la invención se incluyen aquellos que son idénticos a lo largo de toda la región variable.

[0352] VIII. Ácidos nucleicos de la invención

[0353] También se proporcionan composiciones de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-pSer413 tau de la invención, así como vectores de expresión que contienen los ácidos nucleicos y células hospedadoras transformadas con las composiciones de ácidos nucleicos y/o vectores de expresión. Como apreciarán los expertos en la técnica, las secuencias proteínicas representadas en la presente memoria pueden codificarse por gran cantidad de posibles secuencias de ácido nucleico, debido a la degeneración del código genético. Por tanto, la invención proporciona además composiciones de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención. Como apreciarán los expertos en la técnica, en el caso de dominios de unión a antígeno, las composiciones de ácidos nucleicos generalmente incluyen un primer ácido nucleico que codifica el dominio pesado variable y un segundo ácido nucleico que codifica el dominio ligero variable. En el caso de scFv, puede prepararse un solo ácido nucleico que codifique el dominio pesado variable y el ligero variable, separados por un conector proteínico. En el caso de los anticuerpos tradicionales, las composiciones de ácidos nucleicos generalmente incluyen un primer ácido nucleico que codifica la cadena pesada y un segundo ácido nucleico que codifica la cadena ligera, que, tras la expresión en una célula, se ensamblarán espontáneamente en el formato tetramérico "tradicional" de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras.

[0354] Como se conoce en la técnica, los ácidos nucleicos que codifican los componentes de la invención pueden incorporarse en vectores de expresión como se conoce en la técnica y, dependiendo de las células hospedadoras, usarse para producir los anticuerpos heterodiméricos de la invención. Como apreciarán los expertos en la técnica, estos dos ácidos nucleicos pueden incorporarse en un solo vector de expresión o en dos vectores de expresión diferentes. En general, los ácidos nucleicos se unen de forma funcional a gran cantidad de elementos reguladores (promotores, origen de replicación, marcadores de selección, sitios de unión al ribosoma, inductores, etc.). Los vectores de expresión pueden ser vectores extracromosómicos o de integración.

[0355] Los ácidos nucleicos y/o los vectores de expresión de la invención entonces se transforman en gran cantidad de tipos diferentes de células hospedadoras, como es bien conocido en la técnica, incluyendo células de mamífero, bacterianas, de levadura, de insecto y/o fúngicas, encontrado uso las células de mamífero (por ejemplo, células CHO) en muchas realizaciones.

[0356] Los anticuerpos de la invención se preparan cultivando células hospedadoras que comprenden el vector o vectores de expresión, como es bien conocido en la técnica. Una vez producidos, se realizan las etapas tradicionales de purificación de anticuerpos.

[0357] IX. Ensayos biológicos y bioquímicos

[0358] Los anticuerpos anti-pSer413 tau de la invención pueden ensayarse para su eficacia de varias maneras. Como cuestión preliminar, los anticuerpos pueden someterse a prueba para su unión a la proteína o péptidos de tau humana fosforilados en la posición S413 usando técnicas conocidas en la técnica, tales como técnicas de ELISA (véase, por ejemplo, el ejemplo 2(1)), Octet, Biacore o FACS, donde la unión a péptidos fosforilados (por ejemplo, SEQ ID NO: 8) se compara con la unión a péptidos no fosforilados (por ejemplo, SEQ ID NO: 69) como se expone en la presente memoria.

[0359] En algunas realizaciones, las eficacias de unión de los anticuerpos descritos en la presente memoria se miden mediante el ensayo Biacore. En determinadas realizaciones, el valor de K<D>se mide con una proteína Tau fosforilada. En algunas realizaciones, el valor de K<D>se mide con un péptido de Tau fosforilado. En una realización, el péptido de Tau fosforilado se fosforila solo en un residuo (por ejemplo, SEQ ID NO: 75). En otra realización, el péptido fosforilado se fosforila en múltiples residuos (por ejemplo, SEQ ID NO: 76 o SEQ ID NO: 78). En algunas realizaciones, el valor de K<D>se mide con el antígeno (por ejemplo, la proteína Tau fosforilada o el péptido de Tau fosforilado) inmovilizado, en cuyo caso la medición de la afinidad incluye un componente de avidez, es decir, en un modo de unión bivalente. En otras realizaciones, el valor de K<D>se mide con el anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo original de ratón, el anticuerpo quimérico o las variantes de anticuerpo humanizadas) inmovilizado, en cuyo caso la medición de la afinidad no incluye un componente de avidez, es decir, en un modo de unión monovalente. En otras realizaciones más, el valor de K<D>se mide con el anticuerpo inmovilizado y con la proteína Tau fosforilada como analito. En otras realizaciones más, el valor de K<D>se mide con el anticuerpo inmovilizado y con el péptido fosforilado como analito. En determinadas realizaciones, el valor de K<D>se mide en un modo de unión bivalente. En otras realizaciones, el valor de K<D>se mide en un modo de unión monovalente.

[0361] Además, los anticuerpos anti-pSer413 tau de la invención también pueden ensayarse para las afinidades de unión en homogeneizados cerebrales de AD humana, así como ensayarse en estudios de neutralización de semillas de au derivadas de AD en un ensayo de agregación de HEC293 Tau P301L, y/o en modelos de siembra y propagación de tau derivada de AD usando neuronas iPSC humanas en cámaras microfluídicas.

[0362] Adicionalmente, los anticuerpos anti-pSer413 tau de la invención también pueden usarse en ensayos inmunohistoquímicos de muestras de cerebro de pacientes con AD.

[0364] Adicionalmente, los anticuerpos anti-pSer413 tau de la invención pueden ensayarse para su eficacia en modelos animales de trastornos cognitivos, incluyendo enfermedad de Alzheimer (AD). Los animales para la investigación de agentes terapéuticos o profilácticos de la invención para trastornos cognitivos incluyen modelos animales de trastornos cognitivos, específicamente modelos animales de taupatías. Los modelos animales de taupatías son animales que expresan tau de tipo normal o mutante en el cerebro y, en particular, modelos animales que presentan un deterioro de la función cognitiva. Dichos animales que expresan tau de tipo normal o mutante en el cerebro pueden prepararse mediante genomanipulación, siendo un ejemplo típico los ratones transgénicos (ratones Tg). Los modelos animales, tales como ratones Tg, que expresan tau mutante son útiles como modelos de taupatías genéticas familiares, pero para el examen del efecto de un agente terapéutico o un agente profiláctico en taupatías esporádicas que constituyen la mayoría de los casos entre los seres humanos, preferiblemente se presenta un efecto en los ratones Tg que expresan tau de tipo normal. Los ratones más adecuados como Tg que expresan tau de tipo normal son los ratones preparados en los ejemplos de producción de la presente memoria, pero los ratones Tg presentados por Kambeet al.(Neurobiology of Disease, vol. 42, pág. 404-414, 2011) y Kimuraet al.(The EMBO J. vol. 26. Pág. 5143-5152, 2007), también pueden usarse, describiendo ambos específicamente la creación y uso de ratones transgénicos. Sin embargo, aunque el deterioro de la función cognitiva se observa en los ratones de Kambeet al.y Kimuraet al., aparece después de 14 meses de edad y 20 meses de edad, respectivamente y, por lo tanto, el inicio se produce hasta bien entrada la senescencia y los efectos del envejecimiento también pueden ser factores contribuyentes, mientras que los efectos y el trabajo de la reproducción a largo plazo también son problemas.

[0366] El método preferido para examinar el efecto de un agente terapéutico o agente profiláctico para los trastornos cognitivos en un modelo animal es un método para someter a prueba la función cognitiva, tal como una prueba de aprendizaje de la memoria. Dicho método puede ser una prueba de laberinto acuático de Morris, una prueba de aprendizaje gradual o una prueba de reconocimiento de objetos novedosos, pero preferiblemente es una combinación de pruebas de medición del comportamiento, tal como una prueba de campo abierto, para tener en cuenta las condiciones de cantidad de comportamiento y ansiedad de los animales.

[0368] Como métodos para examinar el efecto de un anticuerpo terapéutico o profiláctico de la invención para trastornos cognitivos, es posible usar métodos para examinar los niveles de proteína tau o tau fosforilada en el tejido cerebral, durante la administración a un modelo animal del trastorno cognitivo. En AD y otras enfermedades neurodegenerativas, los niveles de expresión de la proteína tau o tau fosforilada anómala aumentada están asociados con patología (Khalid Iqbalet al., Curr. Alzheimer Res., vol.7, pág.654-664, 2010). También es bien sabido que la reducción de la expresión de tau y los niveles anómalos de tau fosforilada en algunos animales de modelo patológico da lugar a una mejora de la función cognitiva y la función motora (K. Santa Cruzet al., Science, 30, vol. 9, pág. 476-481, 2005; Sylvie Le Correet al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 103, pág.9673-9678, 2006). Como método para examinar los cambios en la proteína tau o tau fosforilada, esto puede conseguirse mediante un método tal como transferencia de Western usando un homogeneizado de tejido cerebral, como se describe en los ejemplos, pero un experto en la técnica puede seleccionar otro método apropiado, tal como ELISA (Xiyun Chaiet al., J. Biol. Chem., vol. 286, pág. 34457-34467, 2011) o un método inmunohistoquímico (David J. Irwinet al., BRAIN, vol.135, pág.807-818, 2012).

[0370] X. Formulaciones

[0372] Las formulaciones de los anticuerpos usados según la presente invención se preparan para su almacenamiento mezclando un anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (como se expone en general en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.ª edición, Osol, A. Ed. [1980]), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas.

[0373] El anticuerpo terapéutico o profiláctico para trastornos cognitivos según la presente invención puede formularse en forma de una composición farmacéutica que contiene, además del anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención, un vehículo farmacéuticamente aceptable y/u otros excipientes. La formulación usando un vehículo farmacéuticamente aceptable y/u otros excipientes puede llevarse a cabo usando el método descrito, por ejemplo, en la Universidad de Ciencias de Filadelfia, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.ª edición", Lippincott Williams & Wilkins, 2000. Dicho agente terapéutico o profiláctico puede proporcionarse como una formulación líquida preparada disolviendo, suspendiendo o emulsionando los ingredientes en un medio acuoso o medio oleoso estéril, o como una formulación liofilizada del mismo. Un medio o disolvente para preparar dicha formulación puede ser un medio acuoso, cuyos ejemplos incluyen agua destilada para inyección y solución salina fisiológica, que puede usarse opcionalmente con la adición de un agente osmorregulador (por ejemplo, D-glucosa, D-sorbitol, D-manitol y cloruro de sodio), y/o en combinación con un adyuvante de disolución adecuado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol o polietilenglicol), o un tensioactivo no iónico (por ejemplo, polisorbato 80 o aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 50). Dicha formulación también puede prepararse con un medio oleoso o disolvente, cuyos ejemplos incluyen aceite de sésamo y aceite de soja, que pueden usarse opcionalmente en combinación con un adyuvante de disolución tal como benzoato de bencilo y alcohol bencílico. Dichos fármacos líquidos a menudo pueden prepararse usando aditivos apropiados tales como agentes tamponantes (por ejemplo, agentes tamponantes de fosfato y agentes amortiguadores de acetato), agentes calmantes (por ejemplo, cloruro de benzalconio y clorhidrato de procaína), estabilizantes (por ejemplo, seroalbúmina humana y polietilenglicol), conservantes (por ejemplo, ácido ascórbico, ácido eritórbico y sus sales), agentes colorantes (por ejemplo, clorofila de cobre, beta-caroteno, rojo n.º 2 y azul n.º 1), agentes antisépticos (por ejemplo, ésteres del ácido paraoxibenzoico, fenol, cloruro de bencetonio y cloruro de benzalconio), espesantes (por ejemplo , hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa y sus sales), estabilizantes (por ejemplo, seroalbúmina humana, manitol y sorbitol) y correctores del olor (por ejemplo, aromas de mentol y cítricos). Las diferentes formas de anticuerpos terapéuticos o profilácticos incluyen formulaciones sólidas tales como polvos, comprimidos, gránulos, cápsulas, pastillas, supositorios y pastillas para chupar. Para una formulación sólida a administrar de forma oral, pueden usarse aditivos tales como excipientes (por ejemplo, celulosa cristalina, lactosa y almidón), lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio y talco), aglutinantes (hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, macrogol y similares) y disgregantes (por ejemplo, almidón y carboximetilcelulosa cálcica). Si es necesario, pueden usarse aditivos tales como agentes antisépticos (por ejemplo, alcohol bencílico, clorobutanol, paraoxibenzoato de metilo y paraoxibenzoato de propilo), antioxidantes, agentes colorantes, edulcorantes y similares. Otras formas alternativas incluyen anticuerpos terapéuticos o profilácticos para su aplicación en las membranas mucosas, conteniendo dichas formulaciones a menudo aditivos tales como adhesivos sensibles a la presión, potenciadores sensibles a la presión, reguladores de la viscosidad, agentes espesantes y similares (por ejemplo, mucina, agar, gelatina, pectina, carragenina, alginato de sodio, goma garrofín, goma xantana, goma de tragacanto, goma arábiga, quitosano, pululano, almidón ceroso, sucralfato, celulosa y sus derivados (tales como hidroxipropilmetilcelulosa), ésteres de ácidos grasos de poliglicerol, copolímeros de ácido acrílico-(met)acrilato de alquilo, o sus sales y ésteres de ácidos grasos de poliglicerol), principalmente con el propósito de conferir propiedades de adsorción o retención en la mucosa. Sin embargo, la forma, el disolvente y los aditivos para los anticuerpos terapéuticos o profilácticos a administrar al organismo no se limitan a estos, y un experto en la técnica puede realizar una selección apropiada.

[0375] El agente terapéutico o profiláctico para trastornos cognitivos según la presente invención puede contener, además del anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención, otros fármacos conocidos que tienen el efecto de tratar o prevenir los trastornos cognitivos y, en particular, fármacos que tienen el efecto de inhibir la progresión de los trastornos cognitivos. Como alternativa, el agente terapéutico o profiláctico para trastornos cognitivos según la presente invención que contiene el anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención puede combinarse con otro agente terapéutico o profiláctico que contenga un fármaco conocido que tenga el efecto de tratar o prevenir trastornos cognitivos y, en particular, un fármaco que tenga el efecto de inhibir la progresión de los trastornos cognitivos, para fabricarse en forma de un kit. Los ingredientes que tienen los efectos de inhibir la progresión de los trastornos cognitivos incluyen, pero no se limitan a, donepezilo, galantamina, memantina y rivastigmina. La dosificación del ingrediente que tiene el efecto de inhibir la progresión de los trastornos cognitivos y la dosificación del agente terapéutico o profiláctico que contiene el ingrediente que tiene el efecto de inhibir la progresión de los trastornos cognitivos pueden estar dentro del alcance de las dosificaciones usadas para la terapia normal, pero pueden aumentarse o disminuirse dependiendo de las condiciones.

[0377] Aunque los autores de la presente invención indicaron los resultados de los experimentos, en el documento WO2013/180238A (documento de patente 4), que demuestran que el anticuerpo presenta un efecto farmacológico al actuar sobre el cerebro a través de la barrera hematoencefálica incluso cuando se administra periféricamente mediante administración intraperitoneal, también es posible preparar una formulación que suministre de manera eficiente el anticuerpo antitau fosforilada humanizado según la presente invención, que está contenido en el agente terapéutico o profiláctico para trastornos cognitivos según la presente invención, al tejido cerebral. Dichas formulaciones también están abarcadas por el agente terapéutico o profiláctico para trastornos cognitivos según la invención. Se conocen métodos para suministrar de manera eficiente anticuerpos o péptidos al tejido cerebral a través de la barrera hematoencefálica, tales como métodos para añadir sustancias de dirección o métodos para encapsular en liposomas o nanopartículas. Las sustancias a usar para dirección incluyen aquellas que experimentan un cambio total o parcial en las características de carga al unirse con un anticuerpo, o péptidos, proteínas u otros compuestos que tienen la propiedad de unirse a un receptor o transportador específico. Ejemplos de péptidos, proteínas u otros compuestos que tienen la propiedad de unirse a un receptor o proteína de membrana específico incluyen ligandos que se unen a ligandos de receptores o proteínas de membrana, y sus análogos, y anticuerpos, compuestos agonistas/compuestos antagonistas/moduladores alostéricos que se unen a ligandos de receptores o proteínas de membrana, y sus compuestos análogos. Ejemplos de ligandos de receptores o proteínas de membrana como dianas para un péptido, proteína u otro compuesto que tiene la propiedad de unirse a un receptor o transportador específico incluyen el receptor de transferrina (TfR), el receptor de insulina (IR), el receptor del factor de crecimiento insulínico (IGFR), la proteína relacionada con el receptor de LDL (LRP) y el receptor de la toxina diftérica (HB-EGF), sin ninguna limitación particular a estos (Angela R. Joneset al., Pharm. Res., 2007, vol.24, n.º 9, pág.

[0378] 1759-1771). Puede añadirse químicamente una sustancia de dirección al anticuerpo a usar para el agente terapéutico o profiláctico para trastornos cognitivos según la invención, siendo el método uno que puede llevar a cabo apropiadamente un experto en la técnica con referencia a un método conocido tal como se describe, por ejemplo, en Hermansonet al., Bioconjugate techniques, EE. UU., Academic Press, 1996. La sustancia de dirección también puede unirse a liposomas o nanopartículas que encapsulan el anticuerpo o péptido (Sonu Bhaskaret al., Particle and Fibre Toxicology, 2010, 7:3). Además, cuando la sustancia de dirección es un péptido o proteína, un experto en la técnica puede producirla como una proteína de fusión apropiada usando técnicas de genomanipulación, ya sea produciendo un péptido de fusión mediante síntesis química peptídica o combinando un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del péptido o proteína con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o péptido a usar.

[0380] El anticuerpo/agente terapéutico o profiláctico según la presente invención puede administrarse a un paciente que lo necesite por vía oral o parenteral, con el propósito de mejorar los síntomas. Para administración oral, puede seleccionarse una forma farmacéutica tal como gránulos, polvo, comprimidos, cápsulas, fármaco líquido, jarabe, emulsión, agente de suspensión o elixir. Para administración parenteral, puede prepararse un agente transnasal y puede seleccionarse un fármaco líquido, suspensión o formulación sólida. Una inyección puede prepararse como una forma diferente de administración parenteral, seleccionándose la inyección como inyección subcutánea, inyección intravenosa, infusión, inyección intramuscular, inyección intracerebroventricular o inyección intraperitoneal. Otras formulaciones usadas para administración parenteral incluyen supositorios, agentes sublinguales, agentes percutáneos y agentes de administración transmucosa distintos de los agentes transnasales. Además, la administración local intravascular es posible mediante un modo de adición o recubrimiento sobre una endoprótesis vascular u obturador intravascular.

[0382] La dosis de un anticuerpo/agente para el tratamiento o prevención según la invención diferirá dependiendo de la edad, el sexo, el peso corporal y los síntomas del paciente, el efecto terapéutico, el método de administración, el tiempo de tratamiento o los tipos de ingredientes activos en la composición médica, pero normalmente puede administrarse en el intervalo de 0,1 mg a 1 g y preferiblemente en el intervalo de 0,5 mg a 200 mg de compuesto activo por administración para adultos. Sin embargo, como la dosis variará dependiendo de una variedad de condiciones, pueden ser suficientes dosis más bajas que las mencionadas anteriormente, o pueden ser necesarias dosis que superen estos intervalos. El agente para el tratamiento o prevención según la invención puede presentar un efecto en un periodo de administración corto.

[0384] XI. Administración de anticuerpos

[0386] Una vez preparados, los anticuerpos de la invención encuentran uso en el tratamiento de trastornos cognitivos tales como taupatías. Como se analiza en la presente memoria, la acumulación intracelular de la proteína tau se ha demostrado en una diversidad de afecciones neuropatológicas. Las enfermedades provocadas por dicha acumulación intracelular de tau se denominan colectivamente "taupatías" (véase Arai, supra, que describe los trastornos descritos en el mismo). Las taupatías incluyen enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer (AD), degeneración corticobasal (CBD) o síndrome corticobasal (CBS), parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, demencia por granos argirófilos (enfermedad por granos argirófilos), taupatía multisistémica con demencia (MSTD), demencia frontotemporal ligada al cromosoma 17 con parkinsonismo (FTDP-17), demencia con ovillos neurofibrilares, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación (DNTC), taupatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares (WMT-GGI), degeneración lobular frontotemporal con inclusiones positivas a tau (FTLD-tau). Las taupatías también incluyen enfermedades no neurodegenerativas que incluyen: enfermedades infecciosas tales como secuelas por encefalitis de Economo y panencefalitis esclerosante subaguda; y afecciones inducidas por traumatismos, tales como la encefalopatía del boxeador.

[0388] Los trastornos cognitivos se definen como un tipo de deterioro intelectual que implica un estado donde la función intelectual, una vez desarrollada o adquirida, ha disminuido ("New Psychiatry (Nankodo's Essential Well-Advanced Series)" (libro japonés), editado por Kunitoshi Kamijima y Shin-ichi Niwa, Nankodo Co., Ltd., 2008, pág. 69-70), pero se consideran, en un sentido amplio, enfermedades que presentan deterioro intelectual y/o deterioro de la memoria. En el diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas tales como AD, se determina si la afección es "neurodegenerativa", por ejemplo, analizando si existe ovillo neurofibrilar (NFT) mediante un análisis histológico después de la muerte, mientras que los médicos diagnostican los trastornos cognitivos, especialmente como enfermedades neurodegenerativas, usando diversos medios, por ejemplo: exámenes neuropsicológicos mediante preguntas, tales como la escala de demencia de Hasegawa para un examen revisado (HDS-R) y un miniexamen del estado mental (MMSE); exámenes neuropsicológicos mediante observaciones, tales como la calificación clínica de demencia (CDR) o la estadificación de evaluación funcional (FAST); exámenes bioquímicos basados, por ejemplo, en el aumento de los niveles de tau y tau fosforilada o en el aumento del nivel de Aβ en el líquido cefalorraquídeo; e inspección de imágenes basada en información obtenida, por ejemplo, mediante tomografía computarizada de la cabeza, resonancia magnética de la cabeza, SPECT o PET. El agente terapéutico o profiláctico para trastornos cognitivos según la presente invención se administra a un paciente al que un médico ha diagnosticado que padece un trastorno cognitivo, y tiene el efecto de mejorar la afección del paciente en comparación con el estado anterior a la administración, controlar la progresión de la afección mediante administración o mantener la afección en el estado anterior a la administración o recuperar la afección en el estado anterior a la administración, en función de al menos uno de los índices de diagnóstico de enfermedad neurodegenerativa.

[0389] El anticuerpo/agente terapéutico o profiláctico para trastornos cognitivos según la presente invención también puede tener el efecto de mejorar la función cognitiva, o inhibir una disminución de la función cognitiva, o mantener la función cognitiva, en un ser humano o animal no humano. Ejemplos de dichos animales no humanos deben ser preferiblemente aquellos que expresan tau que tienen alta homología con tau humana, e incluyen, aunque no se limitan a: chimpancé, macaco, caballo, cerdo, perro, ratón, conejo, rata y gato.

[0390] XII. Ejemplos

[0391] A. Ejemplo 1: Producción de anticuerpos

[0392] 1. Anticuerpo de ratón (anticuerpo original)

[0393] El anticuerpo de ratón Ta1505 se usó como anticuerpo original de un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado. Los detalles del anticuerpo de ratón Ta1505 se describen en los ejemplos de la publicación internacional n.º WO2013/180238A. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo de ratón Ta1505 se define en SEQ ID NO: 44, y la secuencia de nucleótidos que la codifica se define en SEQ ID NO: 45. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo de ratón Ta1505 se define en SEQ ID NO: 46, y la secuencia de nucleótidos que la codifica se define en SEQ ID NO: 47.

[0394] 2. Anticuerpo quimérico

[0395] El anticuerpo quimérico se produjo combinando las regiones variables de la cadena ligera (cadena L) y la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo de ratón Ta1505 con, respectivamente, las regiones constantes de la cadena L y la cadena H de inmunoglobulina humana (Ig) G1(κ). La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo quimérico se define en SEQ ID NO: 48, y la secuencia de nucleótidos que la codifica se define en SEQ ID NO: 49. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo quimérico se define en SEQ ID NO: 50, y la secuencia de nucleótidos que la codifica se define en SEQ ID NO: 51. En toda la memoria descriptiva, este anticuerpo quimérico se denomina "el anticuerpo quimérico" o "anticuerpo quimérico Ta1505".

[0396] 3. Anticuerpo humanizado

[0397] a. Diseño de VL y VH

[0398] Las secuencias primarias que tenían alta homología se seleccionaron de la estirpe germinal humana y la humanización se llevó a cabo mediante injertos de la región determinante de la complementariedad (CDR) para diseñar una variedad de anticuerpos humanizados.

[0399] En detalle, las regiones flanqueantes humanas que tenían alta homología se seleccionaron de una base de datos; la región CDR del anticuerpo de ratón Ta1505 se insertó en cada una de las regiones flanqueantes; y se llevaron a cabo sustituciones aminoacídicas para, por ejemplo, reducir la inmunogenia mientras se mantenía la actividad. De este modo, se diseñaron secuencias de aminoácidos de diversas regiones variables de la cadena ligera (VL) y regiones variables de la cadena pesada (VH). Los números de SEQ ID de las secuencias de aminoácidos de las VL y los números de SEQ ID de las secuencias de nucleótidos de los genes que las codifican se muestran en la tabla 2A, y los números de SEQ ID de las secuencias de aminoácidos de las VH y las secuencias de nucleótidos de los genes que las codifican se muestran en la tabla 2B. Las alineaciones de las secuencias de aminoácidos de las VL y VH se muestran en la figura 2A y la figura 2B, respectivamente.

[0400] Tabla 2A: Región variable de la cadena ligera (VL)

[0403]

[0405] Tabla 2B: Región variable de la cadena pesada (VH)

[0408]

[0410] b. Selección de la combinación de VL y VH en función de la puntuación de inmunogenia

[0411] Las VL y las VH diseñadas mediante el procedimiento descrito anteriormente se combinaron arbitrariamente, y la puntuación de inmunogenia (puntuación DRB 1) de cada combinación se calculó mediante el programa informático de ensayoin vitroEpibase (Lonza). Las combinaciones de VL y VH a usar en los experimentos posteriores se seleccionaron de las combinaciones que mostraban baja inmunogenia con puntuaciones de inmunogenia iguales o inferiores a un valor predeterminado (puntuación DRB 1: 1500). Las combinaciones seleccionadas de VL y VH se muestran en la tabla 3A, y las puntuaciones de inmunogenia (puntuaciones DRB1) de estas combinaciones se muestran en la tabla 3B.

[0412] Tabla 3A: Combinaciones seleccionadas de VL y VH

[0414]

[0417] Tabla 3B: Puntuación de inmunogenia (puntuación DRB1)

[0419]

[0421] c. Cultivo de expresión y purificación de anticuerpos humanizados

[0422] Para cada combinación de VL y VH seleccionada mediante el procedimiento descrito anteriormente, se prepararon los genes que codifican las secuencias de aminoácidos de la VL y la VH. El gen de VL se fusionó dentro del marco de lectura con un gen de la región constante de la cadena L (CL) kappa de inmunoglobulina humana (la secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la misma se definen en SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 53, respectivamente), y el gen de VH se fusionó dentro del marco de lectura con un gen de la región constante de la cadena H (CH) gamma-1 de inmunoglobulina humana (la secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la misma se definen en SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55, respectivamente), de modo que no debe producirse ninguna mutación o defecto en cada sitio de unión. Los extremos 5' del gen de VL y el gen de VH se fusionaron dentro del marco de lectura con, respectivamente, una secuencia señal derivada del gen de la cadena L kappa de inmunoglobulina humana (la secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la misma se definen en SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57, respectivamente) y una secuencia señal derivada del gen de la cadena H gamma-1 de inmunoglobulina humana (la secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la misma se definen en SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59, respectivamente), de modo que no debe producirse ninguna mutación o defecto en cada sitio de unión. Las construcciones de ácido nucleico que codifican, respectivamente, las cadenas L y H fusionadas con la secuencia señal diseñadas mediante el procedimiento descrito anteriormente se incorporaron cada una en un vector de expresión para la expresión en células animales y, a continuación, se cultivaron usando ExPiCHO (fabricado por Thermo Fisher Scientific K.K.) según el protocolo convencional para expresar anticuerpos. Cada cultivo se aclaró mediante centrifugación y el sobrenadante de cultivo resultante se aplicó a una columna de afinidad de proteína A para purificar el anticuerpo humanizado. La fracción eluida con una solución ácida que tenía un pH de 2,8 a 3,5 se neutralizó rápidamente, se concentró y se aplicó a una columna de filtración en gel para eliminar el agregado. El tampón se cambió a solución salina tamponada con fosfato (PBS) para recoger la fracción principal, que se diluyó con un disolvente en una concentración apropiada y luego se usó en las siguientes pruebas.

[0423] En las siguientes descripciones, cada anticuerpo humanizado producido mediante el procedimiento descrito anteriormente puede abreviarse usando una combinación de los nombres en clave de su VL y VH. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado producido usando L15 como VL y H11 como VH se denomina L15H11.

[0424] En las siguientes pruebas, se usó BSA/PBS al 3 % como disolvente para ajustar la concentración de un anticuerpo, sin especificar lo contrario.

[0425] B. Ejemplo 2: Análisis ELISA de la afinidad de unión al péptido antigénico

[0426] 1. Análisis ELISA de la afinidad de unión al péptido antigénico

[0427] Algunos de los anticuerpos humanizados que tienen combinaciones de VL y VH mostradas en la tabla 3A se analizaron para la afinidad de unión a un péptido antigénico mediante ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA).

[0428] Un péptido de tau no fosforilado PD17(Ser413) y un péptido de tau fosforilado PD17P(pSer413), en los que Ser413 estaba fosforilada, se diluyeron cada uno con PBS enfriado hasta 1 µg/ml, y las soluciones resultantes se dispensaron cada una en una placa a 50 µl/pocillo y se dejaron reposar a 4 °C durante la noche. La solución se retiró y, a continuación, se dispensó un tampón de bloqueo (seroalbúmina bovina (BSA)-PBS al 3 %) a 270 µl/pocillo, y la placa se dejó reposar a 4 °C durante la noche. Después de retirar la solución, se diluyó una solución de anticuerpo de forma escalonada con BSA-PBS al 3 % y luego se añadió a la placa a 50 µl/pocillo para permitir una reacción a temperatura ambiente durante 90 minutos. Las secuencias de aminoácidos del péptido de tau no fosforilado PD17(Ser413) y del péptido de tau fosforilado PD17P(pSer413) se definen en SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 8, respectivamente.

[0429] Cada pocillo se lavó con solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBS-T), que contiene un 0,05 % de Tween 20. Un anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con fosfatasa alcalina (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.) diluido 2000 veces con tampón de dilución (BSA-PBS al 3 %) se añadió a la placa a 50 μl/pocillo para permitir una reacción a temperatura ambiente durante 60 minutos. Después de lavar con TBS-T, se añadió una solución cromógena (solución de 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato (pNPP)) a la placa a 100 µl/pocillo para el desarrollo de color durante 40 minutos. La absorbancia (valor de densidad óptica (DO)) se midió a una longitud de onda de 405 nm.

[0430] La reactividad se evaluó determinando la relación del valor de DO de cada anticuerpo respecto al valor de DO del anticuerpo quimérico 0,25 nM, y calificando la relación resultante en la siguiente escala de tres puntos: : reactividad suficiente (0,6 ≤ ratio de DO),

[0431] ±: reactividad muy ligera (0,15 < relación de DO < 0,6), y

[0432] -: sin reactividad (relación de DO ≤ 0,15).

[0433] La tabla 4A muestra los resultados de la evaluación de la reactividad de los anticuerpos con el péptido de tau fosforilado PD17P. La tabla 4B muestra los resultados de la evaluación de la reactividad de los anticuerpos con el péptido de tau no fosforilado PD17. En comparación con el anticuerpo quimérico, todos los anticuerpos humanizados presentaron mayor reactividad con el péptido de tau fosforilado PD17P, pero menor reactividad con el péptido de tau no fosforilado PD17. Estos resultados demuestran que los anticuerpos humanizados tienen reactividad selectiva con el péptido de tau fosforilado.

[0434] Tabla 4A: Análisis ELISA de reactividad con el péptido fosforilado PD17P

[0436]

[0438] Tabla 4B: Análisis ELISA de la reactividad con el péptido no fosforilado PD17

[0440]

[0442] 2. Análisis ELISA de la afinidad de unión selectiva al péptido de tau fosforilado

[0443] Algunos de los anticuerpos humanizados que tienen combinaciones de VL y VH mostradas en la tabla 3A se analizaron para la afinidad de unión selectiva de los anticuerpos humanizados antitau a un péptido de tau fosforilado mediante ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), usando el anticuerpo quimérico Ta1505 como anticuerpo de referencia.

[0444] Se dispensó una solución que contenía 1 µg/ml de péptido no fosforilado PD17 o péptido fosforilado PD17P en una placa a 50 µl/pocillo y se dejó reposar a 4 °C durante la noche. Después de retirar la solución, se dispensó un tampón de bloqueo (seroalbúmina bovina (BSA)-PBS al 3 %) a 270 µl/pocillo, y la placa se dejó reposar a 4 °C durante la noche, para producir de ese modo placas en las que el péptido no fosforilado PD17 o el péptido fosforilado PD17P se inmovilizaron en cada pocillo.

[0445] Se preparó una serie de cinco concentraciones de cada anticuerpo mediante dilución en serie de factor 4, partiendo de una concentración inicial de 0,6 µg/ml (4 nM). Cada solución se añadió a un pocillo de las placas a 50 µl/pocillo para permitir una reacción a temperatura ambiente durante una hora. Después del proceso de lavado, un anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con fosfatasa alcalina (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.) se diluyó 2000 veces y, a continuación, se añadió a cada pocillo a 50 μl/pocillo para permitir una reacción durante una hora.

[0446] Después del proceso de lavado, se añadió 1 mg/ml de solución de p-nitrofenilfosfato (pNPP) a cada pocillo a 100 µl/pocillo para permitir una reacción durante 20 minutos. La absorbancia (DO) se midió a una longitud de onda de 405 nm.

[0447] Los datos de la DO de absorbancia a las concentraciones respectivas de cada anticuerpo preparado se analizaron con el programa informático SoftMax Pro, versión 6.5 (Molecular Devices Corporation) para determinar los siguientes valores numéricos A a D, que se asignaron a la curva de regresión logística de cuatro parámetros mostrada a continuación:

[0450]

(Ecuación I)

[0451] donde

[0452] x representa la concentración del anticuerpo, e

[0453] y representa la absorbancia (valor de DO).

[0454] El valor de DO de absorbancia del péptido no fosforilado PD17 a una concentración de 1 nM se introdujo en la expresión para calcular la concentración x de cada anticuerpo correspondiente al valor de DO. Como la concentración de PD17 era 1 nM, el factor de escala de la afinidad de unión al péptido de tau fosforilado PD17P basado en la afinidad de unión a PD17 para cada péptido se calculó en 1/x, y se usó como indicador de la afinidad de unión selectiva a un péptido de tau fosforilado.

[0455] Los resultados se muestran en el gráfico de la figura 3. La afinidad de unión del anticuerpo quimérico Ta1505 al péptido de tau fosforilado PD17P fue 30 veces más fuerte que al péptido no fosforilado PD17. Por el contrario, la afinidad de unión selectiva en los anticuerpos humanizados mostró alta selectividad con un factor de escala de 40 a 210 veces. Los resultados demuestran que los anticuerpos humanizados tienen afinidad de unión específica al péptido fosforilado.

[0456] 3. Análisis ELISA de la afinidad de unión selectiva al sitio de fosforilación Ser413 usando el péptido de tau fosforilado

[0457] Cada uno de los anticuerpos humanizados que tienen las combinaciones de VL y VH mostradas en la tabla 3A se analizó para su capacidad de unirse selectivamente al sitio de fosforilación Ser413 entre los principales sitios de fosforilación de la proteína, mediante ELISA usando una variedad de péptidos fosforilados.

[0458] Se usaron doce péptidos fosforilados como se muestra en la tabla 5. La columna denominada "epítopo" indica el o los sitios fosforilados de la proteína tau de tipo 4R2N (por ejemplo, "pS46" en el péptido n.º 1 indica que el sitio de Ser46 es un epítopo fosforilado, y las descripciones de múltiples epítopos indican que un péptido tiene dos o tres sitios fosforilados), con la excepción de que el péptido n.º 12 tiene un epítopo que incluye el sitio Ser413, pero no está fosforilado (PD17).

[0459] Tabla 5: Péptido para el análisis de la unión específica al sitio de fosforilación Ser413 de la proteína tau

[0461]

[0464] Los doce péptidos mostrados en la tabla 5, es decir, los péptidos n.º 1 a 12, o conjugados de estos péptidos con seroalbúmina bovina (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH), se diluyeron cada uno con PBS enfriado hasta 4 °C a 1 µg/ml, y la solución resultante se dispensó en una placa a 50 µl/pocillo y se dejó reposar a 4 °C durante la noche. La solución se retiró y, a continuación, se dispensó un tampón de bloqueo (BSA-PBS al 3 %) a 270 µl/pocillo, y la placa se dejó reposar a 4 °C durante la noche. Tras retirar la solución, el anticuerpo purificado se diluyó con BSA-PBS al 3 % hasta 150 ng/ml y, a continuación, se añadió a la placa a 50 µl/pocillo para permitir una reacción a temperatura ambiente durante 90 minutos. Cada pocillo se lavó con solución salina tamponada con Tris (TBS-T) que contenía Tween 20 al 0,05 %. Un anticuerpo de cabra anti-IgG (H+L) humana marcado con fosfatasa alcalina (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.) diluido 2000 veces con un tampón de dilución (BSA-PBS al 3 %) se añadió a la placa a 50 μl/pocillo para permitir la reacción a temperatura ambiente durante 60 minutos. Después de lavar con TBS-T, se añadió una solución cromógena (solución de 1 mg/ml de pNPP) a la placa a 100 µl/pocillo para el desarrollo de color durante 40 minutos. La absorbancia (valor de DO) se midió a una longitud de onda de medición de 405 nm y una longitud de onda de referencia de 550 nm. La reactividad se evaluó en la siguiente escala de tres puntos:

[0465] +: reactividad suficiente (1,0 ≤ valor de DO),

[0466] ±: reactividad muy ligera (0,5 ≤ valor de DO < 1,0), y

[0467] -: sin reactividad (valor de DO < 0,5).

[0468] Los resultados se muestran en la tabla 6. Todos los anticuerpos humanizados mostraron fuerte afinidad de unión solo al péptido n.º 9 (pSer412/pSer413: PRHLSNV(pS)(pS)TGSIDMVD), péptido n.º 10 (pSer413: PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD) y péptido n.º 11 (pSer409/pSer412/pSer413: PRHL(pS)NV(pS)(pS)TGSIDMVD, pero no se unió a los otros péptidos, cuyo sitio correspondiente a Ser413 de la proteína tau no estaba fosforilado. El patrón y la fuerza de la unión fueron sustancialmente iguales que los de la quimera (anticuerpo quimérico Ta1505). Estos resultados indican que los anticuerpos humanizados tienen afinidad de unión específica a la proteína tau que tiene un sitio Ser413 fosforilado.

[0469] Tabla 6: Resultados del análisis ELISA de la reactividad con diversos péptidos de tau fosforilados

[0471]

[0474] C. Ejemplo 3: Análisis ELISA de la afinidad de unión a la proteína antigénica

[0475] Algunos de los anticuerpos humanizados que tienen combinaciones de VL y VH mostradas en la tabla 3A se analizaron para la afinidad de unión a una proteína antigénica mediante ELISA.

[0476] Para preparar una proteína tau fosforilada pTau, la proteína tau 4R2N se expresó en células de insecto usando un sistema de baculovirus. Además, para preparar una proteína tau hiperfosforilada hpTau, se produjo un baculovirus recombinante que podía expresar simultáneamente una proteína tau y GSK3β.

[0477] En la producción de un baculovirus recombinante, se usaron los vectores pFastBac1 y pFastBac Dual. Para la proteína tau fosforilada pTau, se insertó en pFastBac1 un ADNc que codificaba la proteína tau 4R2N con un extremo C- marcado con His. Para la proteína tau hiperfosforilada hpTau, se insertaron en pFastBac Dual un ADNc que codificaba la proteína tau 4R2N con un extremo C- marcado con His y un ADNc que codificaba GSK3β. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la proteína tau 4R2N marcada con His se definen en SEQ ID NO: 70 y 71, respectivamente. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de GSK3β se definen en SEQ ID NO: 72 y 73, respectivamente.

[0478] Cada uno de los vectores resultantes se introdujo en la línea celular Sf9 mediante lipofección, y las células se cultivaron para preparar baculovirus recombinantes. Los baculovirus recombinantes resultantes se usaron a continuación para infectar la línea celular Sf9 o Tn5, para expresar de ese modo la proteína tau fosforilada (pTau) y la proteína tau hiperfosforilada (hpTau).

[0479] Las células que expresaban la proteína deseada se recogieron y se sometieron a sonicación y centrifugación para obtener un lisado celular, que luego se aplicó a una columna de Ni-NTA para purificar la proteína tau. La concentración de la proteína tau purificada se determinó mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA), usando seroalbúmina bovina (BSA) como muestra patrón.

[0480] La proteína tau hiperfosforilada (hpTau) y la proteína tau fosforilada (pTau) resultantes se diluyeron con PBS enfriado a 1 µg/ml, y las soluciones diluidas se dispensaron en una placa a 50 µl/pocillo y se dejaron reposar a 4 °C durante la noche. Después de retirar las soluciones, se dispensó entonces un tampón de bloqueo (BSA-PBS al 3 %) a 270 µl/pocillo, y la placa se dejó reposar a 4 °C durante la noche. Después de la retirada de la solución de tampón, se añadió a la placa una serie de soluciones de anticuerpos preparadas mediante dilución en serie con BSA-PBS al 3 % a 50 µl/pocillo para permitir una reacción a temperatura ambiente durante 90 minutos.

[0481] Los pocillos se lavaron luego con solución salina tamponada con Tris (TBS-T) que contenía Tween 20 al 0,05 %. Un anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con fosfatasa alcalina (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.) diluido 2000 veces con tampón de dilución (BSA-PBS al 3 %) se añadió a la placa a 50 μl/pocillo para permitir una reacción a temperatura ambiente durante 60 minutos. Después de lavar con TBS-T, se añadió una solución cromógena (solución de 1 mg/ml de pNPP) a la placa a 100 µl/pocillo para el desarrollo de color durante 40 minutos. La absorbancia (valor de DO) se midió a una longitud de onda de 405 nm.

[0482] La reactividad se evaluó determinando la relación del valor de DO de cada anticuerpo respecto al valor de DO del anticuerpo quimérico 0,25 nM, y calificando la relación resultante en la siguiente escala de tres puntos: : reactividad suficiente (0,6 ≤ ratio de DO),

[0483] ±: reactividad muy ligera (0,15 < relación de DO < 0,6), y

[0484] -: sin reactividad (relación de DO ≤ 0,15).

[0485] La tabla 7A muestra los resultados de la reactividad evaluada de los anticuerpos humanizados con la proteína tau hiperfosforilada hpTau. La tabla 7B muestra los resultados de la reactividad evaluada de los anticuerpos humanizados con la proteína tau fosforilada pTau. Los resultados demuestran que todos los anticuerpos humanizados tienen alta reactividad tanto con la proteína tau hiperfosforilada hpTau como con la proteína tau fosforilada pTau, en comparación con la del anticuerpo quimérico.

[0486] Tabla 7A: Resultado del análisis ELISA de la reactividad con la proteína tau hiperfosforilada hpTau

[0488]

[0490] Tabla 7B: Resultado del análisis ELISA de la reactividad con la proteína tau fosforilada pTau

[0492]

[0494] D. Ejemplo 4: Análisis de la afinidad de unión mediante SPR

[0495] Algunos de los anticuerpos humanizados que tenían combinaciones de VL y VH mostradas en la tabla 3A se sometieron a análisis de afinidad de unión mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando el anticuerpo quimérico Ta1505 como anticuerpo de referencia.

[0496] La proteína tau hiperfosforilada 4R2N (hpTau: véase el ejemplo 3) se usó como proteína antigénica, y una proteína tau no fosforilada producida porEscherichia coli(Tau: proteína tau no fosforilada 4R0N marcada con His: ATGen Co. Ltd., Cat. n.º: ATGP0795) se usó como control negativo. Los péptidos antigénicos usados fueron un péptido de tau monofosforilado (1×P), en el que solo Ser413 estaba fosforilada, y un péptido de tau trifosforilado (3×P), en el que Ser409 y Ser412 estaban fosforiladas adicionalmente además de Ser413. Las secuencias de aminoácidos de estos péptidos se muestran en la tabla 8. Un péptido de control negativo usado fue un péptido de tau no fosforilado (no P), cuya secuencia de aminoácidos también se muestra en la tabla 8. La secuencia de aminoácidos de la proteína tau no fosforilada marcada con His 4R0N se define en SEQ ID NO: 74. Las secuencias de aminoácidos del péptido de tau monofosforilado 1×P, el péptido de tau trifosforilado 3×P y el péptido tau no fosforilado sin P se definen en SEQ ID NO: 75, 76 y 77, respectivamente.

[0497] Tabla 8: Péptido antigénico usado en SPR

[0499]

[0500] Las afinidades de unión de la proteína tau hiperfosforilada 4R2N (hpTau), la proteína tau no fosforilada 4R0N, el péptido de tau monofosforilado 1×P, el péptido de tau trifosforilado 3×P y el péptido tau no fosforilado sin P con cada anticuerpo se midieron con un sistema de SPR Biacore T200 (GE Healthcare Japón), según el manual de instrucciones de evaluación adjunto al sistema.

[0502] La afinidad de unión se midió mediante un método que incluía: preparar un chip sensor de NTA (que incluye una capa de carboximetildextrano en la que ya estaba inmovilizado ácido nitrilotriacético (NTA): n.º de código BR-1005-32); inmovilizar cada uno de los péptidos anteriormente mencionados fusionados con la marca de His y cada uno de los péptidos antigénicos mostrados en la tabla 8 en el chip sensor mediante enlaces covalentes a través de una reacción de acoplamiento de amina usando un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare Japón, n.º de código BR-1006-33); y medir la cinética de unión de los anticuerpos a las proteínas y péptidos inmovilizados.

[0504] Cada una de las proteínas hpTau o Tau marcadas con His se inmovilizó en un chip sensor usando un tampón HBS-N (n.º de código BR-1003-69) como solución de reacción de inmovilización y permitiendo que una solución de cloruro de níquel reaccione con el chip sensor de NTA para unir Ni al NTA. Posteriormente, el chip sensor se activó con una solución mezclada de clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida: EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS). Se aplicó al chip sensor una solución de cada una de las proteínas marcadas con His, ajustadas a una concentración de 100 a 500 ng/ml con un tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) (HEPES 0,01 M, KCl 150 mM, DTT 2 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2), por los que se inmovilizó la proteína en el chip sensor a través de enlaces covalentes con el Ni-NTA. El NHS activo restante se bloqueó con etanolamina y los iones de Ni se retiraron con una solución de EDTA (acoplamiento de amina por afinidad a Ni: véase la publicación internacional n.º WO2005/022156). Los péptidos antigénicos (1×P, 3×P y no P) se inmovilizaron cada uno en un chip sensor activando el chip sensor de NTA con una solución mezclada de clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS), y luego aplicando una solución del péptido antigénico diluido con un tampón de acetato de sodio 10 mM (pH: 4 a 4,5) a 1 hasta 10 µM al chip sensor, por lo que el péptido se unió covalentemente al chip sensor. El NHS activo restante se bloqueó con etanolamina. Por tanto, se produjeron chips sensores inmovilizados respectivamente con las proteínas y los péptidos mencionados anteriormente.

[0506] Se aplicó un tampón CAPS (pH 10,5) a estos chips sensores a 37 °C para estabilizar las superficies inmovilizadas con proteínas o péptidos de los chips sensores. Se aplicó una solución de cada anticuerpo, preparada con un tampón HEPES (pH 7,2) como solución de reacción de unión específica, a la superficie del chip sensor a concentraciones que variaban de 0,2 a 1 nM (aproximadamente la constante de disociación de unión estimada [KD]) durante 150 segundos (uniforme en la misma evaluación) para una reacción, y se midió la cinética de unión. Los datos resultantes se analizaron usando el programa informático de análisis Biacore (programa informático de evaluación Biacore T200, versión 3.0).

[0508] La cinética de unión de cada anticuerpo se corrigió restando la cinética de unión de la proteína no fosforilada 4R0N al chip sensor como control negativo de la cinética de unión de la proteína antigénica 4R2N (hpTau) al chip sensor. La cinética de unión de cada péptido antigénico se corrigió restando la cinética de unión del péptido no fosforilado sin P al chip sensor como control negativo de la cinética de unión de cada uno de los péptidos antigénicos 1×P y 3×P. No se observó unión de cada anticuerpo a la proteína tau no fosforilada 4R0N o al péptido no fosforilado sin P dentro del intervalo de concentraciones de muestra sometidas a medición.

[0510] La tabla 9A muestra las actividades de unión de los anticuerpos humanizados a la proteína tau fosforilada 4R2N (hpTau). La tabla 9B muestra los resultados de las actividades de unión de los anticuerpos humanizados al péptido de tau monofosforilado 1×P y al péptido de tau trifosforilado 3×P. Los resultados demuestran que cada anticuerpo humanizado presentaba alta actividad de unión a todos de la proteína tau hiperfosforilada hpTau, el péptido de tau monofosforilado 1×P y el péptido de tau trifosforilado 3×P.

[0512] Tabla 9A: Actividad de unión de anticuerpos humanizados a la proteína tau fosforilada (hpTau) (modelo de unión 1:1)

[0514]

[0515]

[0517] Tabla 9B: Actividad de unión de anticuerpos humanizados a péptidos fosforilados (1×P, 3×P) (modelo de unión 1:1)

[0519]

[0521] E. Ejemplo 5: Análisis de afinidad de unión de pSer413-Tau en un homogeneizado cerebral de un paciente con AD

[0522] Entre los anticuerpos humanizados que tienen combinaciones de VL y VH mostradas en la tabla 3A, se evaluó la afinidad de unión de L15H11, L46H11 y L47H65 a la proteína tau fosforilada en Ser413 (pSer413-Tau) derivada de una muestra clínica de un paciente con enfermedad de Alzheimer (AD) en fase líquida, usando un anticuerpo de ratón Ta1505 y un anticuerpo quimérico como anticuerpos de referencia.

[0523] Los anticuerpos humanizados, el anticuerpo de ratón y el anticuerpo quimérico se biotinilaron cada uno usando N-hidroxisuccinimida-LC-biotina (NHS-LC-biotina) (Thermo Fisher Scientific K.K.), seguido de diálisis con PBS. Se añadió tejido de hipocampo congelado (160 mg) del cerebro de un paciente con AD en estadio V/VI de Braak a 0,8 ml de TBS-I (solución salina tamponada con Tris, cóctel de inhibidores de proteasa, cóctel de inhibidores de fosfatasa) y se sonicó en agua helada. La solución sonicada se centrifugó a 3000×g a 4 °C durante 10 minutos, y el sobrenadante se recogió y se ultracentrifugó adicionalmente a 100000×g a 4 °C durante 15 minutos para obtener un homogeneizado cerebral. El kit Innotest pTau (pT181) (Fijirebio Inc.) se usó como sistema de ELISA de la proteína tau fosforilada en Ser413 (pSer413-Tau), pero el anticuerpo biotinilado incluido en el kit (etiquetado como CONJ1) se remplazó por los anticuerpos biotinilados producidos anteriormente.

[0524] Cada uno de los anticuerpos biotinilados producidos anteriormente se preparó en una solución a una concentración 0,1 nM y se añadió a una placa MT inmovilizada con anticuerpos HT7 (incluida en el kit), junto con una dilución de factor 1000 del homogeneizado cerebral. La muestra resultante se mezcló y se incubó a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, se lavó la placa y se añadió a la placa estreptavidina marcada con HRP (incluida en el kit como CONJ2), seguida de incubación durante una hora. Después del lavado, se añadió un reactivo de color TMB, seguido de incubación bajo protección contra la luz a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, la reacción se detuvo con una solución terminadora de reacción (incluida en el kit como solución STOP) y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm.

[0525] Los resultados se muestran en la figura 4. Como se muestra en el gráfico de la figura 4, todos los anticuerpos humanizados L15H11, L46H11 y L47H65 presentaban alta afinidad de unión a la proteína tau fosforilada en Ser413 (pSer413-Tau) derivada de la muestra clínica de un paciente con AD.

[0526] F. Ejemplo 6: Prueba de cinética en sangre

[0527] Se sometieron a prueba cinco variantes iniciales de anticuerpo humanizado para la farmacocinética en ratones normales, en comparación con un anticuerpo disponible en el mercado Herceptin (Genentech, sur de San Francisco, CA) y el anticuerpo quimérico Ta1505. La cadena ligera y la cadena pesada de cada variante de anticuerpo humanizado se resumen en latabla 10a continuación.

[0528] Tabla 10. Cadena ligera y cadena pesada de algunas variantes iniciales de anticuerpo humanizado

[0531]

[0533] Los anticuerpos se inyectaron por vía intraperitoneal a una dosis de 10 mg/kg a ratones C57BL/6J macho de 11 semanas de edad (Charles River Laboratories Japan, Inc.). Se obtuvo plasma de la sangre recogida 1, 3, 8, 24 y 72 horas después de la dosis. El tamaño de la muestra fue de 2 animales por anticuerpo.

[0534] Se usó un ELISA de tipo sándwich con anticuerpos policlonales anti-IgG humana para determinar las concentraciones de anticuerpos en plasma. Se trazó una curva de calibración mediante dilución en serie de cada anticuerpo con plasma de ratón.

[0535] El plasma se diluyó en un factor de 1000 y se midió la concentración de anticuerpos.

[0536] Se pipeteó una solución de PBS de 1 µg/ml de anticuerpos policlonales de cabra anti-IgG (Fc) humana en una placa de 96 pocillos (MaxSorp (NUNC)) y se dejó reposar a 4 °C durante la noche. A continuación, se consiguió el bloqueo con BSA/PBS al 3 % para preparar una placa con anticuerpos policlonales de cabra anti-IgG (Fc) humana inmovilizados. Se usó plasma de ratón para diluir en serie los anticuerpos y obtener la sustancia patrón. El plasma y la sustancia patrón se diluyeron con BSA/PBS al 3 % y se pipetearon en la placa con anticuerpos policlonales de cabra anti-IgG (Fc) humana inmovilizados a 50 µl/pocillo. Las mezclas se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1,5 horas y, a continuación, la placa se lavó con TBS-T (TBS, Tween 20 al 0,05 %). A continuación, una solución preparada al diluir anticuerpos policlonales anti-IgG (H+L) humana marcados con fosfatasa alcalina (Southern Biotech, Cat. n.º 2087-04) en un factor de 2000 con BSA/PBS al 3 % se pipeteó a 50 µl/pocillo, y la reacción se dejó continuar durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la placa se lavó con TBS-T, se añadió el reactivo colorante a 100 µl/pocillo y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se usó un lector de placas para medir la absorbancia a 405 nm y 550 nm.

[0537] Se trazó una curva de calibración con la sustancia patrón y se usó para calcular las concentraciones de anticuerpos en plasma. Los resultados se muestran en la figura 5A.

[0538] Las variantes humanizadas iniciales sometidas a prueba (variantes 2, 5, 6, 9 y 10) mostraron una rápida disminución de la concentración plasmática 8 horas después de la administración, en comparación con el nivel de Herceptin y el anticuerpo quimérico, que se mantuvo alto y estable hasta 3 días después de la inyección. Estos anticuerpos humanizados iniciales presentaban una semivida más corta y un perfil PK deficiente en comparación con el anticuerpo quimérico, lo que probablemente sea atribuible a los altos valores de pI de estas variantes. Se requirió una mejora adicional para alcanzar la PK del anticuerpo quimérico.

[0539] Entre los anticuerpos humanizados que tienen las combinaciones de VL y VH mostradas en la tabla 3A, L15H11, L46H11 y L47H65 se sometieron a una prueba de cinética en sangre. Los anticuerpos de referencia usados fueron el anticuerpo quimérico Ta1505 y los anticuerpos humanizados conocidos usados en estudios de ensayos clínicos para el tratamiento de AD, que se produjeron mediante expresión recombinante basada en la información de secuencia de aminoácidos descrita en la información de patentes o en la información de bases de datos. Específicamente, se hizo referencia a la base de datos del sistema internacional de información ImMunoGeneTics (marca registrada) (IMGT) (http://www.imgt.org) para solanezumab (anticuerpo anti-A□, Eli Lilly and Company); la secuencia de aminoácidos del VH2Vk3 descrita en el documento WO2014/200921 A1 se usó para IPN007 (anticuerpo antiextremo N de Tau, Bristol-Myers Squibb iPierian); y la secuencia de aminoácidos de VH32VL21 descrita en el documento WO2015/091656A1 se usó para MAb32211 (anticuerpo anti-TAU-pS422, Roche Diagnostics K.K.).

[0540] Cada uno de los anticuerpos se administró por vía intraperitoneal a ratones C57BL/6J macho de 11 semanas de edad (Charles River Laboratories Japan, Inc.) a una concentración de 10 mg/kg cada uno. Se extrajo sangre a 1, 3, 8 y 24 horas y, posteriormente, al tercer y séptimo día después de la administración para recoger plasma. Cada anticuerpo se sometió a prueba por triplicado (N = 3).

[0541] La concentración del anticuerpo en el plasma se midió mediante ELISA de tipo sándwich usando un anticuerpo policlonal antihumano. Específicamente, se añadió una solución de PBS que contenía 1 µg/ml de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG (Fc) humana (Southern Biotech) a una placa de 96 pocillos (Max Sorp (NUNC)) para su inmovilización a 4 °C durante la noche, seguida de bloqueo con BSA-PBS al 3 % para producir de ese modo una placa inmovilizada con anticuerpos policlonales de cabra anti-IgG (Fc) humana.

[0542] Por separado, se preparó una serie de muestras de anticuerpos patrón de concentraciones conocidas mediante dilución en serie de cada anticuerpo con plasma tomado de un ratón al que no se le administró el anticuerpo, y se midieron para la preparación de una curva de calibración.

[0543] Las muestras de plasma y las muestras patrón a medir se diluyeron cada una 10000 veces y se añadieron a una placa inmovilizada con anticuerpos policlonales de cabra anti-IgG (Fc) humana a 50 µl/pocillo reacción a temperatura ambiente durante una hora y 30 minutos, y la placa se lavó a continuación con TBS-T (solución salina tamponada con Tris, Tween 20 al 0,05 %). Posteriormente, se añadió a la placa una solución de anticuerpo policlonal anti-IgG (H+L) humana marcado con fosfatasa alcalina (Southern Biotech) diluido 2000 veces con BSA-PBS al 3 % a 50 µl/pocillo para permitir una reacción a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar con TBS-T, se añadió una solución cromógena (solución de 1 mg/ml de pNPP) a la placa a 100 µl/pocillo, seguida de incubación a temperatura ambiente durante una hora. La absorbancia se midió entonces con un lector de placas a una longitud de onda de medición de 405 nm y una longitud de onda de referencia de 550 nm. Se preparó una curva de calibración basada en los resultados de medición de las muestras patrón, y la concentración de anticuerpos en cada muestra de plasma se calculó usando la curva de calibración.

[0544] La figura 5B es un gráfico que muestra los cambios en las concentraciones de anticuerpos en el plasma a lo largo del tiempo. Como se desprende del gráfico, los anticuerpos humanizados L15H11 (LC SEQ ID NO: 32 HC SEQ ID NO: 18), L46H11 (LC SEQ ID NO: 36, HC SEQ ID NO: 18) y L47H65 (LC SEQ ID NO: 38, HC SEQ ID NO: 30) (todos usando con IgG1 humana (SEQ ID NO: 135) y kappa humana (SEQ ID NO: 79)) mostraron sustancialmente la misma cinética en sangre que la del anticuerpo quimérico Ta1505. La cinética de estos anticuerpos humanizados L15H11, L46H11 y L47H65 en sangre fue comparable a la de los anticuerpos humanizados conocidos IPN007 y MAb32211, y significativamente superior a la del anticuerpo humanizado conocido solanezumab.

[0545] G. Ejemplo 7: Análisis de la migración intracerebral

[0546] Se realizó un estudio para analizar la concentración cerebral de las variantes humanizadas con farmacocinética plasmática mejorada.

[0547] Se extrajo sangre de los ratones a los que se les inyectó el anticuerpo de ratón original, el anticuerpo quimérico o las variantes de anticuerpo humanizado (L15H11, L36H11, L46H11, L48H12, L48H47, L48H64, L47H65 o L48H11) 1 semana después de la inyección de los anticuerpos. A continuación, los animales se anestesiaron con un cóctel de 3 anestésicos, se laparotomizaron y se desangraron a través de la aorta abdominal. Luego, se recolectó tejido cerebral. Este tejido cerebral recogido se dividió en los hemisferios izquierdo y derecho, se congeló en hielo seco/etanol y se almacenó a -80 °C. Cada hemisferio congelado se pesó y se transfirió a un tubo de 2 ml. A continuación, se añadieron 0,8 ml de TBS-I (solución salina tamponada con Tris, cóctel de inhibidores de proteasa y cóctel de inhibidores de fosfatasa) y la mezcla se sonicó en agua helada. La mezcla sonicada se centrifugó a 3000×g y 4 °C durante 10 minutos, y se recogió el sobrenadante. El sobrenadante se centrifugó adicionalmente a 100000×g y 4 °C durante 15 minutos para obtener un homogeneizado cerebral. Se pipeteó una solución de PBS de 10 µg/ml de anticuerpos policlonales de cabra anti-IgG (Fc) humana en una placa de 96 pocillos (MaxSorp (NUNC)) y se dejó reposar a 4 °C durante la noche. A continuación, se consiguió el bloqueo con BSA/PBS al 3 % para preparar una placa con anticuerpos policlonales de cabra anti-IgG (Fc) humana inmovilizados. El homogeneizado cerebral obtenido de ratones a los que no se les inyectaron anticuerpos se usó para diluir en serie los anticuerpos y obtener la sustancia patrón.

[0548] Los homogeneizados cerebrales y la sustancia patrón se diluyeron en un factor de 10 y se pipetearon en la placa con anticuerpos policlonales de cabra anti-IgG (Fc) humana inmovilizados a 50 µl/pocillo. Las mezclas se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas y, a continuación, la placa se lavó con TBS-T (TBS, Tween 20 al 0,025 %). A continuación, una solución preparada al diluir anticuerpos policlonales de cabra anti-IgG (H+L) humana marcados con fosfatasa alcalina (Sigma, Cat. n.º SAB3701337-1MG) en un factor de 2000 con BSA/PBS al 3 % se pipeteó a 50 µl/pocillo, y la reacción se dejó continuar durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la placa se lavó con TBS-T, se añadió el reactivo colorante pNPP (Sigma, Cat. n.º P7998) a 100 µl/pocillo y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se usó un lector de placas para medir la absorbancia a 405 nm y 550 nm.

[0549] Se trazó una curva de calibración con la sustancia patrón y se usó para calcular las concentraciones de anticuerpos en el homogeneizado cerebral. Se determinó la concentración de anticuerpos por peso cerebral (volumen cerebral total) y se calculó la relación con respecto a la concentración plasmática.

[0550] Lafigura 6Ademuestra que las variantes de anticuerpo humanizado con buena farmacocinética (por ejemplo, L15H11, L46H11 y L47H65 según la figura 5B) tenían concentración mejorada en el cerebro.

[0551] Se analizó la migración intracerebral de cada uno de los anticuerpos humanizados L15H11, L46H11 y L47H65, usando el anticuerpo quimérico Ta1505 y los anticuerpos humanizados conocidos solanezumab, IPN007 y MAb32211, que se usaron en estudios de ensayos clínicos para el tratamiento de AD, como anticuerpos de referencia.

[0552] Una semana después de la administración de cada anticuerpo en el ejemplo 6, se extrajo sangre de ratones, que luego se sometieron a laparotomía bajo anestesia mediante tres tipos de agentes anestésicos mixtos. Tras la muerte por desangramiento de la vena cava abdominal, se recogió el tejido cerebral. El tejido cerebral recogido se dividió en los hemisferios derecho e izquierdo, que se congelaron en etanol con hielo seco y se almacenaron a -80 °C. Cada uno de los hemisferios congelados se pesó y se transfirió a un tubo de 2 ml, al que se añadieron 0,8 ml de TBS-I (solución salina tamponada con Tris, cóctel de inhibidores de proteasa y cóctel de inhibidores de fosfatasa). A continuación, cada hemisferio se sonicó en agua helada. La solución sonicada se centrifugó a 3000×g a 4 °C durante 10 minutos, y el sobrenadante se recogió y se ultracentrifugó adicionalmente a 100000×g a 4 °C durante 15 minutos para obtener un homogeneizado cerebral.

[0553] El nivel de anticuerpos en el homogeneizado cerebral se midió mediante ELISA de antígeno usando un anticuerpo policlonal antihumano. Específicamente, se añadió una solución de PBS que contenía 10 µg/ml de anticuerpo de cabra anti-IgG Fc humana a una placa de 96 pocillos (Max Sorp (NUNC)) para su inmovilización a 4 °C durante la noche, seguida de bloqueo con BSA-PBS al 3 % para producir de ese modo una placa inmovilizada.

[0554] Por separado, se preparó una serie de muestras patrón de anticuerpos de concentraciones conocidas mediante dilución en serie de cada anticuerpo con homogeneizado cerebral tomado de un ratón al que no se le administró el anticuerpo, y se midieron para la preparación de una curva de calibración.

[0555] Los homogeneizados cerebrales y las muestras patrón a medir se diluyeron cada una 10 veces con leche desnatada al 0,1 %-BSA-PBS al 3 %, y se añadieron a la placa inmovilizada con PD17(P) a 50 µl/pocillo para reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. La placa se lavó luego con TBS-T (TBS, Tween 20 al 0,05 %). Posteriormente, una solución de anticuerpo policlonal anti-IgG (H+L) humana marcado con fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich Co. LLC., Cat. n.º SAB3701337: 1 mg) diluida 2000 veces con leche desnatada al 0,1 %-BSA-PBS al 3 % se añadió a la placa a 50 µl/pocillo para permitir una reacción a temperatura ambiente durante una hora. Tras lavar la placa con TBS-T, se añadió pNPP (Sigma-Aldrich Co. LLC., Cat. n.º P7998: 100 ml) como sustrato cromógeno a 100 µl/pocillo, seguido de incubación a temperatura ambiente durante una hora. La absorbancia se midió entonces con un lector de placas a una longitud de onda de medición de 405 nm y una longitud de onda de referencia de 550 nm. Se preparó una curva de calibración basada en los resultados de medición de las muestras patrón, y el nivel de anticuerpos en cada muestra de homogeneizado cerebral se determinó usando la curva de calibración y se evaluó como el nivel de anticuerpos en el cerebro.

[0556] Además, el nivel de anticuerpos en el plasma se determinó usando sangre extraída antes de la laparotomía de la misma manera que en el ejemplo 6, y se calculó la relación del nivel de anticuerpos en el cerebro con respecto al del plasma.

[0557] La figura 6B es un gráfico que muestra la relación del nivel de cada anticuerpo en el cerebro con respecto el nivel del anticuerpo correspondiente en el plasma. Las relaciones de las concentraciones de anticuerpos en el cerebro con respecto a las concentraciones de anticuerpos en el plasma de los anticuerpos humanizados L15H11, L46H11 y L47H65 fueron altas en comparación con las del anticuerpo quimérico Ta1505 y los anticuerpos humanizados conocidos IPN007, MAb32211 y solanezumab. Los resultados indican que estos anticuerpos humanizados tienen alta migración al cerebro.

[0558] Ejemplo 8: Desarrollo adicional de anticuerpos humanizados selectivos

[0559] Se introdujeron mutaciones adicionales en la secuencia CDR1 de VL46 para eliminar un punto crítico de desamidación y/o para revertir la secuencia CDR a la secuencia de ratón original.La tabla 11resume las mutaciones introducidas en la CDR1 de VL46.

[0560] Tabla 11. Mutaciones introducidas en CDR1 de VL46

[0562]

[0563]

[0565] Además, se sometieron a prueba diferentes isotipos de IgG, incluyendo IgG1 e IgG4 con la mutación S228P, en las variantes de anticuerpo humanizado recién generadas.La tabla 12resume la cadena ligera y la cadena pesada de las variantes de anticuerpo humanizado recién generadas junto con el anticuerpo de ratón original y el anticuerpo quimérico.

[0566] Tabla 12. Cadena ligera y cadena pesada de anticuerpos específicos

[0568]

[0570] H. Ejemplo 9: Análisis de unión Biacore™ de las variantes de anticuerpo humanizado recién generadasLas afinidades de unión de las variantes de anticuerpo humanizado recién generadas se midieron usando biosensores Biacore<™>T200 y 4000 (GE Healthcare, Chicago, IL). El siguiente tampón de migración: HEPES 10 mM (GE Healthcare, BR100671), NaCl 150 mM (GE Healthcare, BR100671), tensioactivo P20 al 0,05 % v/v (GE Healthcare, BR100671), DTT 2 mM (Sigma, 10708984001, St. Louis, MO) y EDTA 1 mM (GE Healthcare, 28995043), se usó para la inmovilización, la dilución de muestras y la recopilación de datos, a menos que se indique lo contrario a continuación.

[0571] La proteína inmovilizada se refiere a la proteína Tau fosforilada humana recombinante inmovilizada en el chip; el péptido 1xP inmovilizado se refiere al péptido fosforilado (TSPRHLSNVS(pS)TGSIDMVDSPC, SEQ ID NO: 75) inmovilizado en el chip. Ambos métodos tienen un componente de avidez en la medición de la afinidad. El analito peptídico 4xP tiene el anticuerpo capturado en el chip y el péptido fosforilado 4x (GAEIVYK(pS)PVVSGDT(pS)PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD(pS)PQLATLADEVSASLAKQG L, SEQ ID NO: 78) en solución.

[0572] La unión del anticuerpo a la proteína Tau fosforilada inmovilizada se midió usando chips sensores NTA de la serie S (GE Healthcare, BR100034). El tampón de migración para la inmovilización fue HEPES 10 mM, NaCl<2>150 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, pH 7,4 (GE Healthcare, BR100671) y el caudal fue de 10 µl/minuto. Se inyectó EDTA 350 mM durante 1 minuto para limpiar el chip, seguido de una inyección de 2 minutos de NiCl<2>0,5 mM (GE Healthcare, kit de reactivos NTA) para preparar el chip para capturar la proteína marcada con His. El chip se activó según las instrucciones del fabricante usando un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare, BR100633), luego se inyectó proteína Tau fosforilada (80AWB) 300 nM hasta que se inmovilizó la cantidad deseada de proteína. El chip se bloqueó con etanolamina del kit de acoplamiento de amina. Cada experimento usó múltiples niveles de proteína Tau fosforilada inmovilizada. El nivel más bajo varió de 54 unidades de resonancia (UR) a 452 UR, y el nivel más alto varió de 463 UR a 1020 UR. Para medir la afinidad de la unión del anticuerpo Ta1505 a la proteína Tau fosforilada inmovilizada, se preparó una serie de diluciones de factor 3 de 5 miembros de cada anticuerpo, lo que dio como resultado concentraciones de 0,37 nM a 30 nM. Cada concentración y varios blancos de tampón se inyectaron durante 3 minutos a un caudal de 45 µl/minuto. La disociación del anticuerpo se supervisó durante 15 minutos, después la superficie se regeneró con una inyección de 30 segundos a 1 minuto de CAPS 100 mM (Sigma, C6070), KCl 1 M (Sigma, P9541), EDTA 1 mM, DTT 2 mM, pH 10,5.

[0574] La unión del anticuerpo al péptido de Tau fosforilado inmovilizado se midió usando un chip sensor CM3 de la serie S (GE Healthcare, BR100536). El chip se activó usando un kit de acoplamiento de amina y, a continuación, se inyectaron 30 µg/ml de péptido de Tau fosforilado (SEQ ID NO: 75) en acetato de sodio 10 mM, pH 5,0, hasta que se inmovilizaron 51 UR. El chip se bloqueó con etanolamina. Se preparó una superficie de referencia de control negativo de manera similar, usando el péptido de Tau no fosforilado (TSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPC, SEQ ID NO: 77). Para medir la afinidad de la unión del anticuerpo Ta1505 al péptido de Tau fosforilado inmovilizado, se preparó una serie de diluciones de factor 3 de 5 miembros de cada anticuerpo, lo que dio como resultado concentraciones de 0,37 nM a 30 nM. Cada concentración y varios blancos de tampón se inyectaron durante 3 minutos a un caudal de 45 µl/minuto. La disociación del anticuerpo se supervisó durante 15 minutos. La superficie se regeneró con una inyección de 30 segundos de ácido clorhídrico 100 mM (Fisher Scientific, SA56-1, Waltham, MA).

[0576] La unión del péptido de Tau fosforilado al anticuerpo inmovilizado se midió usando chips sensores CM5 de la serie S (GE Healthcare, 29149603). El chip se activó usando un kit de acoplamiento de amina y, a continuación, se inyectó de 1 a 3 µg/ml de anticuerpo en acetato de sodio 10 mM, pH 5,0 (Ge Healthcare, BR100351) hasta que se habían inmovilizado de 280 a 9100 UR de anticuerpo. El chip se bloqueó con etanolamina. Para medir la afinidad del péptido de Tau fosforilado (SEQ ID NO: 78) que se une a los anticuerpos Ta1505 inmovilizados, se preparó una serie de diluciones de factor 2,5 de 6 miembros del péptido, lo que dio como resultado concentraciones de 5,1 nM a 500 nM. Las muestras y varios blancos de tampón se inyectaron a una 30 a 50 µl/minuto durante 3 minutos, y la disociación se supervisó durante 15 minutos. La superficie se regeneró con una inyección de 30 segundos de acetato de sodio 20 mM, pH 4,5, sin ajustar o con el pH ajustado a 3,5 con ácido clorhídrico.

[0578] Los datos se procesaron y ajustaron usando el programa informático de evaluación Biacore<™>T200 versión 2.0 o el programa informático de evaluación Biacore<™>4000 versión 1.1 (GE Healthcare). Los datos se "referenciaron dos veces" restando la respuesta de una cubeta de lectura de control negativo y restando la respuesta de una inyección de tampón o la respuesta promedio de dos inyecciones de tampón. A continuación, los datos se ajustaron con el modelo de "unión 1: 1" para determinar la constante de velocidad de asociación, k<a>(M<-1>s<-1>, donde "M" es igual a molar y "s" es igual a segundos) y la constante de velocidad de disociación, k<d>(s<-1>). Estas constantes de velocidad se usaron para calcular la constante de disociación en equilibrio, K<D>(M) = k<d>/k<a>. Latabla 13resume los valores de K<D>de las variantes de anticuerpo humanizado recién generadas en comparación con los del anticuerpo de ratón original y el anticuerpo quimérico.

[0580] Tabla 13. Valores de KD (nM) de anticuerpos contra la proteína o péptido de tau fosforilado

[0582]

[0583]

[0585] I. Ejemplo 10: Análisis de unión por ELISA del anticuerpo de ratón original, el anticuerpo quimérico y algunas variantes de anticuerpo humanizado

[0586] La unión del anticuerpo de ratón original, el anticuerpo quimérico y las variantes de anticuerpo humanizado recién generadas a un péptido fosforilado (PRHLSNVS(pS)TGSIDMVD, SEQ ID NO: 79) y el correspondiente péptido no fosforilado (PRHLSNVSTGSIDMVD, SEQ ID NO: 80) se analizó mediante ELISA.

[0587] Se añadieron cincuenta microlitros de péptido fosforilado o no fosforilado a 1 µg/ml en PBS a cada pocillo de placas ELISA y las placas se incubaron a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, las placas se lavaron 3 veces y se bloquearon con 200 µl de Superblock a 4 °C durante la noche. Al tercer día, las placas se lavaron 3 veces. A continuación, se añadieron 50 μl de anticuerpos en una dilución en serie 1:3 en el tampón ELISA, comenzando a 10 μg/ml, a cada pocillo de la placa, se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, después se lavaron 3 veces. Se añadieron cincuenta microlitros de una dilución 1:3000 de anticuerpo de cabra antirratón-HRP (Southern Biotech, 1030-05) para medir el anticuerpo de ratón original. Se añadieron cincuenta microlitros de una dilución 1:3000 de anticuerpo de cabra antihumano-HRP (Jackson Immunologics, 109-036-098) para medir el anticuerpo quimérico y los anticuerpos humanizados. Las placas ELISA se incubaron a temperatura ambiente durante 45 minutos, se lavaron 3 veces, después se revelaron con ABTS a temperatura ambiente durante 5 minutos. Posteriormente, se usó un lector de placas para medir la absorbancia a 405 nm. Lasfiguras 8A y 8Bmuestran que el anticuerpo original generado por hibridoma o método recombinante se unió al péptido fosforilado(figura 8A), pero no al péptido no fosforilado(figura 8B).Del mismo modo, los anticuerpos quiméricos (con cadena principal de IgG1 o IgG4) se unieron al péptido fosforilado(figura 8C), pero no al péptido no fosforilado(figura 8D).

[0588] Lasfiguras 9A-9Cdemuestran que la mayoría de las variantes de anticuerpo humanizado recién generadas se unieron al péptido fosforilado con afinidad comparable a la del anticuerpo IgG4 quimérico, mientras que unas pocas variantes perdieron afinidad de unión al péptido fosforilado. En particular, en lafigura 9B,la variante huVL46/VH11_N33D_IgG4, que imita la desamidación total del aminoácido N33 en D, tenía una unión muy reducida al péptido fosforilado, lo que sugiere que el anticuerpo completamente desamidado perdería drásticamente su afinidad de unión a la proteína Tau fosforilada. Por tanto, la reducción de la desamidación en N33 en las variantes de anticuerpo humanizado es imperativa.

[0589] XIII. Ejemplo 11: Análisis de la unión al antígeno de las variantes de anticuerpo humanizado recién generadas en homogeneizados cerebrales de pacientes con enfermedad de Alzheimer

[0590] El anticuerpo de ratón original, el anticuerpo quimérico y las variantes de anticuerpo humanizado seleccionadas se evaluaron para su potencia de unión a la proteína Tau fosforilada en Ser413 (pSer413-Tau) derivada de muestras clínicas de pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD) en fase líquida.

[0591] Como se describe en lasfiguras 10A-10E,la ocupación del anticuerpo en pSer413-Tau se determinó mediante la diferencia entre la unión al antígeno total y libre detectada usando el anticuerpo IgG2a Ta1505 biotinilado de ratón tras incubación de las muestras cerebrales con AD con una concentración creciente de IgG humana de control (Sigma, Cat. n.º I2511) y variantes de anticuerpo seleccionadas, respectivamente.

[0592] La detección con el mismo anticuerpo IgG2a Ta1505 biotinilado de ratón permite una comparación directa de la potencia de unión entre las variantes de anticuerpo. El anticuerpo IgG2a Ta1505 de ratón se biotiniló usando N-hidroxisuccinimida-LC-biotina (NHS-LC-biotina) (Thermo Fisher Scientific K.K.), seguido de diálisis con PBS. Se añadió tejido congelado de la corteza prefrontal (100 mg) del cerebro de un paciente con AD a 1 ml de TBS-I (solución salina tamponada con Tris, Cat. n.º BP2471-1, Thermo Fisher Scientific) que contenía un cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa (Thermo Fisher Scientific, Cat. n.º 1861281) y se lisó en agua helada usando Qiagen Tissue Lyzer II. La muestra homogeneizada se centrifugó a 27000g (rotor TLA-55) a 4 °C durante 20 minutos en la ultracentrífuga Beckman Coulter Optima Max-XP, y el sobrenadante se recogió y se centrifugó adicionalmente a 150000×g (rotor TLA-55) a 4 °C durante 20 minutos en la ultracentrífuga Beckman Coulter Optima Max-XP para obtener un sedimento denominado fracción P2. La fracción P2 se resuspendió en el tampón de homogeneización TBS-I mediante sonicación. La concentración de proteína de la fracción P2 se determinó usando el kit de ensayo de proteínas BCA Pierce<™>(Thermo Fisher Scientific, Cat. n.º 23225) según las instrucciones del fabricante. La concentración de proteína se ajustó a 4 µg/ml.

[0593] El kit de pTau (pT181) INNOTEST<®>(Fijirebio Inc., Cat. n.º 81581) se usó como sistema de ELISA para la proteína Tau fosforilada en Ser413 (pSer413-Tau), pero el anticuerpo biotinilado incluido en el kit (etiquetado como CONJ1) se remplazó por el anticuerpo IgG2a Ta1505 de ratón biotinilado producido anteriormente. El anticuerpo de ratón original, el anticuerpo quimérico, las variantes de anticuerpo humanizado o la IgG humana de control se diluyeron a 200 nM a partir de reservas en tampón diluyente de muestra (proporcionado por el kit INNOTEST<®>). A continuación, las soluciones de anticuerpos se diluyeron en serie y se incubaron con fracciones P2 de cerebro con AD previamente diluidas a 1/1000 en una placa de ensayo durante 4 horas a temperatura ambiente. La mezcla de anticuerpo-antígeno se añadió entonces a una placa MT inmovilizada con anticuerpos HT7 (incluida en el kit), junto con el anticuerpo IgG2a Ta1505 de ratón biotinilado diluido (1/10 en CONJ DIL 1, proporcionado por el kit INNOTEST<®>). La muestra resultante se mezcló y se incubó a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, se lavó la placa y se añadió a la placa estreptavidina marcada con HRP (incluida en el kit como CONJ2), seguida de incubación durante una hora. Después del lavado, se añadió un reactivo de color TMB, seguido de incubación bajo protección contra la luz a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se detuvo entonces con una solución terminadora de reacción (incluida en el kit como solución STOP) y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm.

[0594] El análisis no lineal de la curva de concentración-respuesta ilustrada en lasfiguras 10A-10Epermite la determinación de la concentración de cada anticuerpo requerida para la ocupación del 50 % de Tau pSer413 en homogeneizados cerebrales con AD, así como el porcentaje del nivel máximo de ocupación para cada anticuerpo.Las figuras 10A-10Edemuestran características de unión comparables, que incluyen el nivel de ocupaciónin vitroy la unión máxima del antígeno pSer413 Tau, para el anticuerpo de ratón original, el anticuerpo quimérico y variantes de anticuerpo humanizado seleccionadas en homogeneizados cerebralesde pacientes con AD.

[0595] XIV. Ejemplo 12: Análisis de estabilidad y pureza de las variantes de anticuerpo humanizado recién generadas

[0596] La estabilidad de diversos anticuerpos se determinó midiendo la temperatura de fusión (Tm1) y la temperatura de agregación (Tag) mediante nano-DSF. La pureza de cada anticuerpo se midió mediante SEC y SDS capilar no reducido (NR-cSDS).

[0597] Determinación de la Tm y la Tag:la Tm y la Tag se determinaron mediante nano-DSF usando un fluorímetro de barrido diferencial Prometheus NT.48 (Nanotemper Technologies) controlado por el programa informático PR.ThermControl v2.0.4. La potencia de excitación fue de un 40 % y la temperatura se aumentó de 20 °C a 95 °C a una tasa de 1 °C/min. La Tm y Tag se midieron automáticamente. Las muestras se prepararon diluyéndolas a 1 mg/ml en acetato de sodio 20 mM, pH 5,5, tampón y se extrajeron por acción capilar en un capilar de vidrio Prometheus (PR-L002).

[0598] Determinación de la pureza mediante SEC:Se llevó a cabo SEC en un sistema ACQUITY UPLC de clase H. La columna usada fue una columna ACQUITY UPLC Protein BEH SEC (número de pieza 186005225, 1,7 µm, 200 A, 4,6 mm x 150 mm) de Waters (Milford, MA). La temperatura de la columna era de 25 °C y se inyectaron 10 µl de muestra a 1 mg/ml usando un caudal del sistema de 0,5 ml/min. La fase móvil era fosfato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 200 mM y azida de sodio al 0,02 %, pH 7,0. Los datos se cuantificaron tanto a 214 como a 280 nm y se analizaron usando el programa informático Empower 3. Se inyectó una mezcla convencional de proteínas BEH200 SEC (número de pieza 186006518) de Waters (Milford, MA) a 10 µg y se midieron la resolución USP, las placas teóricas y la cola.

[0599] Determinación de la pureza mediante NR-cSDS:Para evaluar la pureza mediante NR-cSDS, se mezclaron 5 μl de cada muestra a 1 mg/ml en una placa de 96 pocillos con 35 μl de tampón de carga (tampón de muestra HT Protein Express (Perkin Elmer)) que contenía yodoacetamida 50 mM. La placa se incubó a 70 °C durante 20 minutos y se añadieron 75 µl de agua a cada pocillo. Cada muestra se analizó en un sistema LabChip GXII (Perkin Elmer) usando un chip HT Protein Express (Perkin Elmer). Los electroferogramas se recogieron midiendo la fluorescencia de la muestra a lo largo del tiempo y se integraron usando el programa informático LabChip GX V4.1.1619.0 SP1 (Perkin Elmer).

[0600] La tabla 14resume la estabilidad y la pureza de los anticuerpos sometidos a prueba.

[0601] Tabla 14. Estabilidad y pureza de diversos anticuerpos

[0603]

[0605] Todas las variantes de anticuerpo humanizado recién generadas mantuvieron o mejoraron la estabilidad y la pureza en comparación con el anticuerpo de ratón original o los anticuerpos quiméricos. Una de las variantes humanizadas originales, huVL47/VH65 _IgG1, destacó por tener estabilidad reducida medida por Tm1/Tag.

[0606] XV. a

[0607] Se determinó el nivel de desamidación del aminoácido N33 en la CDR1 de la cadena ligera de diversos anticuerpos. Se sometieron a prueba condiciones de agresión, tales como incubación a 50 °C o pH 10. Se realizó una incubación a 4 °C como control.

[0608] Incubación a 4 °C y 50 °C:Las muestras formuladas en acetato de sodio 20 mM, pH 5,5, a 2 mg/ml se mantuvieron a 50 °C en una cámara de estabilidad a temperatura controlada durante una semana. Las muestras se mantuvieron a 4 °C para el control de 4 °C con propósitos comparativos.

[0609] Incubación a pH 10:Las muestras formuladas en acetato de sodio 20 mM, pH 5,5, a 2 mg/ml se ajustaron a pH 10 usando NaOH 0,5 M y se mantuvieron a 25 °C durante una semana en una cámara de estabilidad a temperatura controlada. Posteriormente, las muestras se intercambiaron por tampón de acetato de sodio 20 mM, pH 5,5, usando columnas de desalado Zeba Spin (7K MWCO, Thermo Fisher 2 ml, 89890).

[0610] Análisis de desamidación mediante cartografiado de péptidos:Para el cartografiado de péptidos mediante espectrometría de masas, se desnaturalizaron 100 µg de cada muestra con 30 µl de solución de guanidina 8 M/clorhidrato de Tris 1 M (15:1), se redujeron con 2 µl de DTT 1 M durante 30 minutos a 60 °C y se alquilaron con 5 µl de yodoacetamida 1 M durante 45 minutos en la oscuridad. Antes de la digestión, las muestras se intercambiaron de tampón a bicarbonato de amonio 50 mM usando cartuchos ZEBA con un límite de peso molecular de 7 kDa. Las muestras se dividieron en diferentes tubos y se digirieron en paralelo con 2 µg de tripsina y quimotripsina durante 2 horas a 37 °C. La digestión se interrumpió mediante la adición de 3 µl de clorhidrato 5 M a cada muestra. Se inyectaron 2 µl de muestra en la columna de UPLC Waters de 1x50 mm BEH-C18 de péptidos (n.º de pieza 186005592) mantenida a 40 °C. Los datos se adquirieron en un espectrómetro de masas Dionex/QE plus usando un gradiente lineal durante 50 minutos de acetonitrilo del 2 % al 36 % en ácido fórmico al 0,1 %. Las muestras se analizaron usando PEAKS DB (Bioinformatics Solutions Inc.) para la búsqueda en bases de datos, así como PepFinder (Thermo Fisher Scientific) y la verificación manual para la evaluación del porcentaje de cambio. Latabla 15resume el porcentaje de desamidación del aminoácido N33 en la CDR1 de la cadena ligera de los anticuerpos sometidos a prueba.

[0612] Tabla 15. Porcentaje de desamidación de N33 en la CDR1 de la cadena ligera en diversas condiciones

[0614]

[0617] En comparación con el anticuerpo de ratón original y el anticuerpo IgG1 o IgG4 variante humanizado original (VL46/VH11), las variantes de anticuerpo humanizado recién generadas presentaron una reducción significativa en el nivel de desamidación de N33 en la CDR1 de la cadena ligera.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-pSer413 tau que comprende:

(i) un dominio variable de la cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 116 y

un dominio variable de la cadena ligera que tiene SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 o SEQ ID NO: 103; o (ii) un dominio variable de la cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 117 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene SEQ ID NO: 104.

2. El anticuerpo anti-pSer413 tau de la reivindicación 1(i), en donde el dominio variable de la cadena pesada tiene SEQ ID NO: 116 y el dominio variable de la cadena ligera tiene SEQ ID NO: 114.

3. El anticuerpo anti-pSer413 tau de la reivindicación 1(ii), en donde el dominio variable de la cadena pesada tiene SEQ ID NO: 117 y el dominio variable de la cadena ligera tiene SEQ ID NO: 104.

4. El anticuerpo anti-pSer413 tau según la reivindicación 1(i) o 2, en donde el anticuerpo comprende: un dominio constante de la cadena pesada seleccionado de SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO: 143; y/o

un dominio constante de la cadena ligera seleccionado de SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 80.

5. El anticuerpo anti-pSer413 tau según la reivindicación 1 o 4, en donde:

la cadena ligera tiene SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182 o SEQ ID NO: 162; y

la cadena pesada tiene SEQ ID NO: 152; SEQ ID NO: 151 o SEQ ID NO: 144.

6. El anticuerpo anti-pSer413 tau según una cualquiera de las reivindicaciones 1(i), 2 y 4, en donde la cadena ligera tiene SEQ ID NO: 184 y la cadena pesada tiene SEQ ID NO: 152.

7. El anticuerpo anti-pSer413 tau según una cualquiera de las reivindicaciones 1(ii), 3 y 4, en donde la cadena ligera tiene SEQ ID NO: 164 y la cadena pesada tiene SEQ ID NO: 153.

8. Una composición de ácido nucleico que comprende:

(i) un primer ácido nucleico que codifica una cadena ligera que tiene SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182 o SEQ ID NO: 162 y

un segundo ácido nucleico que codifica una cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 151 o SEQ ID NO: 144; o

(ii) un primer ácido nucleico que codifica

una cadena ligera que tiene SEQ ID NO: 164 y un segundo ácido nucleico que codifica una cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 153.

9. La composición de ácido nucleico de la reivindicación 8(i), en donde el primer ácido nucleico codifica una cadena ligera que tiene SEQ ID NO: 184 y el segundo ácido nucleico codifica una cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 152.

10. La composición de ácido nucleico de la reivindicación 8(ii), en donde el primer ácido nucleico codifica una cadena ligera que tiene SEQ ID NO: 164, y el segundo ácido nucleico codifica una cadena pesada que tiene SEQ ID NO: 153.

11. Una composición de vector de expresión que comprende la composición de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde:

(a) el primer ácido nucleico está contenido en un primer vector de expresión y el segundo ácido nucleico está contenido en un segundo vector de expresión; o

(b) el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico están contenidos en un vector de expresión.

12. Una célula hospedadora que comprende la composición de vector de expresión de la reivindicación 11.

13. Un método para preparar un anticuerpo anti-pSer413 tau, que comprende las etapas de cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 12 en condiciones en donde se expresa el anticuerpo, y recuperar el anticuerpo.

14. Un anticuerpo anti-pSer413 tau como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en un método de tratamiento de una taupatía en un sujeto, en donde el método comprende administrar el anticuerpo anti-pSer413 tau al sujeto.

15. El anticuerpo anti-pSer413 tau para el uso de la reivindicación 14, en donde la taupatía se selecciona de un grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, degeneración corticobasal, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Pick, demencia por granos argirófilos, enfermedad por granos argirófilos, taupatía multisistémica con demencia presenil (MSTD), demencia frontotemporal y parkinsonismo ligados al cromosoma 17 (FTDP-17), demencia con ovillos neurofibrilares, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación (DNTC), taupatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares (WMT-GGI), degeneración lobular frontotemporal con patología de tau (FTLD-tau), secuelas por encefalitis de Economo, panencefalitis esclerosante subaguda y encefalopatía del boxeador.