ES3063473T3 - Method for the vitrification of human semen - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un método para la vitrificación de semen humano que comprende proporcionar semen humano licuado; disponer de un medio de vitrificación, en donde el medio de vitrificación comprende: (a) un medio tampón o buffer de semen, y (b) una mezcla de crioprotectores que comprende un crioprotector permeable y un crioprotector no permeable; mezclar el semen licuado con el medio de vitrificación; proveer una pajuela de semen y cargar dicha pajuela con 0,25 a 0,5 mL de la mezcla obtenida; sellar la pajuela con calor; e introducir la pajuela en posición vertical en un recipiente con nitrógeno líquido para vitrificar la mezcla. La presente invención describe además proporciona un kit portátil que hace fácil implementar el método, comprendiendo dicho kit un medio de vitrificación, unas pajuelas, un recipiente, instrucciones de uso, entre otros.

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0003] Método para la vitrificación de semen humano

[0005] CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0006] La presente invención proporciona un método simple, rápido y eficaz de vitrificación de semen humano que permite obtener una recuperación de motilidad progresiva espermática post-desvitrificación significativamente más alta que los métodos actuales de congelación lenta. Este nuevo método de vitrificación se aplica tanto a la vitrificación de muestras de semen de donante en bancos de semen como de muestras de pacientes que vayan a utilizarse posteriormente en ciclos de reproducción asistida.

[0008] ESTADO DE LA TÉCNICA

[0009] Los métodos desarrollados no asépticos comprenden en su mayoría la vitrificación del semen por contacto directo con nitrógeno líquido. La recuperación de motilidad post-desvitrificación utilizando dichos métodos no asépticos es del orden del 20% al 30%.

[0011] En Europa se congelan una media de unas 150.000 muestras de semen de donante al año en bancos de semen y una media de 50.000 muestras de semen de pacientes en clínicas de reproducción asistida en las que se estima que se realizan unos 400.000 ciclos de reproducción asistida por año. El precio promedio de los medios de congelación que se utilizan está alrededor de los 150 a 200 euros por vial. Cada vial sirve para congelar aproximadamente unas 15 muestras equivalentes a unas 40 a 60 pajuelas de semen.

[0013] Existen varios productos en el mercado relacionados con pajuelas de vitrificación y sistemas de sellado para estas pajuelas. Por ejemplo, las pajuelas de vitrificación de alta seguridad CBS<TM>(Cryo Bio Systems) son pajuelas que contienen esperma y que se sellan térmicamente y, una vez llenas, se colocan en un tubo de plástico en forma de V que a su vez se coloca en un recipiente de plástico para su congelación/vitrificación en un recipiente con nitrógeno líquido. El sistema de sellado "SYMS III" está diseñado para sellar térmicamente estas pajuelas de vitrificación de alta seguridad CBSTM para una criopreservación óptima de muestras biológicas. Sin embargo, ninguno de los folletos de los proveedores para estos productos describe un método para la vitrificación aséptica del semen humano.

[0015] Creemers, E., et al. "Cryopreservation of human sperm: efficacy and use of a new nitrogen‐free controlled rate freezer versus liquid nitrogen vapour freezing." Andrologia 43.6 (2011): 392-397, revela un método para la criopreservación de esperma humano que incluye los pasos de (a) proporcionar un volumen de esperma humano licuado, (b) proporcionar tres veces el volumen de "Sperm CryoProtect<TM>II" como medio que consiste en una solución de sal estéril que contiene glicerol y glucosa, (c) mezclar el esperma licuado con el medio, (d) limar la mezcla en una pajuela de espermatozoides, (e) sellar la pajuela, equilibrar la suspensión de espermatozoides horizontalmente a 6ºC durante 30 minutos, enfriarla horizontalmente durante 30 minutos en vapor de nitrógeno líquido y (f) sumergir la pajuela en nitrógeno líquido. Sin embargo, el artículo no ofrece detalles específicos sobre si las pajuelas llenas y selladas, al sumergirse en nitrógeno líquido, están posicionadas en disposición horizontal o vertical. Esta característica es fundamental para la motilidad post-deshielo.

[0017] El documento WO2012028967A2 describe un método para la criopreservación de espermatozoides que comprende las etapas de aislar espermatozoides libres de líquido seminal mediante un gradiente de densidad o swim-up, resuspender y mezclar los espermatozoides con un medio de vitrificación que comprende un medio tampón o buffer y un crioprotector no permeable como sucrosa, mezclar y ajustar la concentración final de espermatozoides, depositar la suspensión de espermatozoides en el medio de vitrificación en un recipiente termoconductor que comprende un sistema de dos pajuelas de plástico colocadas horizontalmente, sumergir las pajuelas selladas que contienen los espermatozoides en nitrógeno líquido, mantener las pajuelas a una temperatura inferior a -75 °C después de vitrificar los espermatozoides, y desvitrificar la muestra en un medio de desvitrificación a 37 ºC. Asimismo, también se proporciona un kit que contiene medio suficiente para 50 pajuelas (véase resumen de WO2012028967A2).

[0019] Sin embargo, este documento no menciona el uso de crioprotectores permeables, más aún, enseña lo contrario en el último párrafo de la página 6 (“…formulación sin crioprotectores permeables…”). Adicionalmente, la presente invención utiliza semen licuado completo, mientras que el documento WO2012028967A2 menciona el uso de espermatozoides libre de plasma seminal para mantener las condiciones de asepsia. Por último, el documento WO 12028967 utiliza un contenedor que consiste en una pajuela dentro de otra en posición horizontal, mientras que el contenedor de la presente invención consiste en una pajuela que se deposita dentro de un contenedor trapezoidal en posición vertical para sumergirse en nitrógeno líquido. El colocar la pajuela en posición vertical es un paso crítico en este nuevo método de vitrificación aséptica del semen ya que si la pajuela se colocase en posición horizontal la motilidad post-descongelación sería inferior al 5%.

[0021] El documento CN106962323 proporciona un método de conservación y reanimación en refrigeración de espermatozoides de primates no humanos que comprende la licuación de los espermatozoides a temperatura ambiente, los espermatozoides se diluyen con una solución de cultivo HTF, se agrega glicerina en base al volumen de la esperma; la mezcla obtenida se sub-empaca en tubos de criopreservación, se almacena en suspensión sobre nitrógeno líquido, y luego se almacena en nitrógeno líquido; en la reanimación, los tubos de crioconservación almacenados en nitrógeno líquido se agitan ligeramente en un baño de agua a 37°C. Sin embargo, este documento hace referencia a un método de mantener las muestras a 4°C por 30 minutos y después transferir a nitrógeno líquido, pero solo sobre la superficie líquida, no en contacto con la superficie del líquido. Por el contrario, la presente invención si contacta las muestras con nitrógeno líquido, por lo que la etapa de congelación es mucho más rápida.

[0022] La presente invención proporciona un método simple, rápido y eficaz de vitrificación del semen que permite obtener una recuperación de motilidad progresiva espermática pos-desvitrificación del 80 al 95%, ya sea en muestras de pacientes normozoospérmicos como de pacientes oligospérmicos y/o pacientes con otras alteraciones en los parámetros seminales. El tiempo de vitrificación es de unos 10 segundos y el tiempo de desvitrificación de unos 50 segundos, lo cual permite la fácil incorporación del método en laboratorios de andrología de bancos de semen como de clínicas de reproducción asistida. La invención puede aplicarse a la vitrificación de muestras de semen de donante en bancos de semen como de muestras de pacientes que vayan a utilizarse posteriormente en ciclos de reproducción asistida.

[0024] Además, la vitrificación aséptica descrita por la invención presenta mejoras en tiempos de vitrificación y desvitrificación, así como en el porcentaje de la recuperación de motilidad. En los métodos de vitrificación no aséptica se suele utilizar alrededor de 5 minutos para la vitrificación y un período de tiempo similar para la desvitrificación. Por el contrario, la invención proporciona un método de vitrificación aséptica que comprende aproximadamente un tiempo de vitrificación de 10 segundos y un tiempo de desvitrificación de 50 segundos. Así también, la tasa de recuperación de motilidad, que es aproximadamente del 80 al 95% en la invención, es superior a la tasa de recuperación de motilidad de los métodos no asépticos que es de alrededor del 20 al 30%.

[0026] BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0027] Figura 1: Motilidad (A) y viabilidad espermática (B) en espermatozoides post descongelación cuando se comparan dos métodos de preservación. N=50. Diferentes letras muestran diferencias significativas (p<0,05). Inicial corresponde a las muestras antes de someterse a los métodos de preservación. Post-V corresponde a los resultados obtenidos por el método de la presente invención. Post-CL corresponde a los resultados obtenidos con un método de congelación lenta.

[0029] Figura 2: Se muestra la integridad acrosomal (A) y fragmentación del ADN (B) en espermatozoides post descongelación cuando se comparan dos métodos de preservación. N=50. Diferentes letras muestran diferencias significativas (p<0,05). Inicial corresponde a las muestras antes de someterse a los métodos de preservación. Post-V corresponde a los resultados obtenidos por el método de la presente invención. Post-CL corresponde a los resultados obtenidos con un método de congelación lenta.

[0031] DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0032] La invención describe un método para la vitrificación aséptica del semen humano que comprende las siguientes etapas:

[0034] (i) proporcionar semen humano licuado;

[0035] (ii) disponer de un medio de vitrificación, en donde el medio de vitrificación comprende:

[0036] a. un medio tampón o buffer de semen;

[0037] b. una mezcla crioprotectora que comprende un crioprotector permeable y un crioprotector no permeable;

[0038] (iii) mezclar el semen licuado de la etapa (i) con el medio de vitrificación de la etapa (ii);

[0039] (iv) proveer una pajuela de semen y cargar dicha pajuela con 0,25 a 0,5 mL de la mezcla obtenida en la etapa (iii);

[0040] (v) sellar ambos extremos de la pajuela con calor; y

[0041] (vi) sujetar la pajuela sellada térmicamente de la etapa (v) por la parte superior y sumergirla verticalmente en nitrógeno líquido en un trapezoidal o rectangular o en forma de "V" durante un periodo de tiempo entre 10 y 20 segundos para vitrificar la mezcla.

[0043] En una especificación de la invención la proporción de semen licuado usado en el método de la invención se encuentra en una proporción de volumen de semen licuado a volumen de pajuela en el rango de 1:2 a 1,7:2. Preferentemente, se proporciona una cantidad no menor de 0,25 mL de semen licuado para una pajuela de 0,5 mL.

[0045] Preferentemente, el crioprotector permeable es glicerol, dimetilsulfóxido, propanodiol u otros crioprotectores permeables, y se usa para la preparación del medio de vitrificación a una concentración no diluida en un rango entre 10% y 30% v/v.

[0046] Por otro lado, el crioprotector no permeable corresponde a azúcares no permeables como rafinosa, sacarosa, lactosa, la trehalosa u otros azúcares no permeables, y se usa para la preparación del medio de vitrificación a una concentración no diluida en un rango entre 10% y 30% v/v.

[0047] En una especificación de la invención, los crioprotectores se encuentran diluidos en el medio tampón de semen a una dilución 1:2 v/v, en donde el tampón de semen corresponde a cualquier tampón de semen disponible. Preferentemente, el medio tampón comprende albúmina sérica humana, piruvato, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES), rojo de fenol, entre otros.

[0048] En una especificación de la invención, la concentración final del crioprotector permeable en el medio de vitrificación está en el rango entre 3% y 10%, y la concentración final del crioprotector no permeable en el medio de vitrificación es de entre 3% y 10%.

[0049] En una especificación de la invención, la relación de la mezcla de semen licuado y medio de vitrificación de la etapa (iii) es 1:1 v/v, para obtener una concentración final del crioprotector permeable en el rango entre 1,5% y 10% y una concentración final del crioprotector no permeable en el rango entre 3% y 15%.

[0050] En una modalidad preferida de la invención el recipiente usado en la etapa (vi) es un tubo de plástico o gobelet, donde el gobelet tiene forma trapezoidal, rectangular, en forma de “V”, o similar. En una modalidad aún más preferida, el recipiente es un gobelet de plástico de forma trapezoidal con las dimensiones de 10 a 12 cm de altura x 1,5 a 2,0 cm de fondo x 1,0 a 1,5 cm de anchura mayor x 0,25 a 0,5 cm de anchura menor. En una modalidad preferida la pajuela se coloca en el centro de la parte más ancha del gobelet. Esta configuración proporciona los mejores resultados en términos de motilidad post-desvitrificación.

[0051] En una especificación de la invención, la pajuela termosellada se sumerge en posición vertical en nitrógeno líquido en un recipiente con forma trapezoidal o similar y en un rango entre 8 y 16 cm de altura, con la almohadilla de algodón de la pajuela hacia arriba durante un período de tiempo entre 10 y 20 segundos, la pajuela termosellada que se sumerge en el centro de la base del recipiente mientras se presiona la parte superior de la pajuela hacia la parte inferior del recipiente. Esta configuración es la que proporciona los mejores resultados de motilidad postdesvitrificación.

[0052] Opcionalmente las pajuelas se pueden marcar antes de la vitrificación mediante marcaje térmico automatizado (o con un simple rotulador); o se puede colocar etiqueta tipo FreezerBondz después de vitrificar la pajuela.

[0053] Opcionalmente, posterior a la vitrificación se almacena la pajuela en un canister de tanque de nitrógeno líquido. Opcionalmente también, se desvitrifican las pajuelas mediante su introducción en un baño de agua que está a una temperatura en un rango entre 38 °C y 46 °C, durante un rango de tiempo entre 40 y 60 segundos.

[0055] EJEMPLO

[0056] A modo de ejemplo, la invención proporciona un método de vitrificación aséptico de semen. Este método se realizó con 50 muestras de semen obtenidas del banco de semen ANDROGEN y se comparó con un procedimiento estándar de congelación lenta en la misma cantidad de muestras. Un método comparativo se llevó a cabo del siguiente modo:

[0057] (a) se mezcló 0,25 mL de semen licuado con 0,25 mL del crioprotector Sperm Cryoprotect-II (SCP-II) (Nidacon) diluido 1:1 con medio de cultivo SpermWash (CRYOS International);

[0058] (b) se cargaron 0,5 mL de la mezcla de semen/SCP-II en pajuelas de CBS de 0,5 mL y se termosellaron ambos extremos mediante el uso de un termosellador Press Sealing de Cryo Bio Systems;

[0059] (c) las pajuelas fueron transferidas al canister de un tanque de nitrógeno líquido saturado con vapores durante 5 minutos;

[0060] (d) finalizada la congelación las pajuelas fueron transferidas a una de las cajas de gobelets del tanque de almacenamiento y sumergidas en nitrógeno líquido;

[0061] (e) para la descongelación las pajuelas fueron sumergidas en un baño de agua a 37ºC durante 5 minutos. Para la vitrificación de la presente invención se realizó el siguiente procedimiento:

[0062] (a) se proporcionó 0,25 mL de semen licuado para una pajuela de 0,5 mL;

[0063] (b) se preparó 20 mL de un medio de vitrificación que comprende:

[0064] (i) un medio tampón/buffer de esperma SpermWash Medium (CRYOS International®), y (ii) un crioprotector permeable correspondiente a glicerol (CryoSperm (Origio®)) a una concentración stock sin diluir de 20% v/v; y un crioprotector no permeable correspondiente a rafinosa (Sigma-Aldrich No. R0250) a una concentración stock sin diluir de 18% v/v; donde se diluyó los crioprotectores con el medio tampón en una proporción volumétrica de 1:2 hasta obtener una concentración de glicerol del 6,6% y de rafinosa del 6%, y

[0065] (c) se mezcló inmediatamente los 0,25 mL de semen licuado con 0,25 mL del medio de vitrificación (en una relación 1:1 v/v) hasta que se obtuvo una concentración final de glicerol de 3,3% y una concentración final de rafinosa de 3%;

[0066] (d) se cargó 0,5 mL de la mezcla de semen/crioprotector en pajuelas de alta seguridad de 0,5 mL hechas de plástico; y se termoselló ambos extremos de la pajuela mediante el uso de un termosellador Press Sealing de Cryo Bio Systems;

[0067] (e) se sumergió la pajuela termosellada en posición vertical en nitrógeno líquido en un recipiente con forma trapezoidal (0,5 x 2 x 1,7 cm) y a 12 cm de altura, con la parte de la almohadilla de algodón de la pajuela hacia arriba durante un período de tiempo de 15 segundos, la pajuela termosellada que se sumergió en el centro de la base del recipiente mientras se presionó la parte superior de la pajuela hacia la parte inferior del recipiente; y (d) se desvitrificó las pajuelas mediante su introducción en un baño de agua a 42,5ºC, durante 50 segundos.

[0068] Una vez terminado el procedimiento se realizó una medición de la motilidad por microscopía de fase, viabilidad espermática por microscopia de campo claro tras tinción con eosina, integridad acrosomal mediante microscopia de campo claro a 1000x y fragmentación del ADN de espermatozoides por test TUNEL post descongelación en los dos métodos (vitrificación de la presente invención y el método de congelación lenta).

[0069] A continuación, se muestran las tablas con los resultados obtenidos, donde V: vitrificación; CL: congelación lenta; MOT: motilidad progresiva; VIAB: viabilidad; ACRO: acrosoma; FADN: fragmentación de ADN.

[0070] Tabla 1: Comparación de la motilidad espermática antes y después de ambos métodos de preservación.

[0071] Tabla 2: Comparación de la viabilidad espermática antes y después de ambos métodos de preservación.

[0072] Tabla 3: Integridad Acrosomal de espermatozoides antes y después de ambos métodos de preservación.

[0073] Tabla 4: Fragmentación del ADN de espermatozoides antes y después de ambos métodos de preservación.

[0074] Tabla 1

[0076]

[0077] Tabla 2

[0079]

[0080] Tabla 3

[0082]

[0083] Tabla 4

[0085]

[0086] La tabla 1 muestra que el método de la presente invención logra una motilidad espermática de un 80-90% después de la vitrificación respecto de la motilidad inicial, mientras que un método de congelación lenta solo obtiene un 50-60% de motilidad.

[0087] La tabla 2 muestra que el método de la presente invención logra una viabilidad espermática de un 90-95% después de la vitrificación respecto de la viabilidad inicial, mientras que el método de congelación lenta solo obtiene un 65-70% de viabilidad.

[0088] La tabla 3 muestra que el método de la presente invención logra una integridad acrosomal de espermatozoides de un 85-90% después de la vitrificación respecto de la integridad acrosomal inicial, mientras que el método de congelación lenta obtiene un 45-55% de integridad.

[0089] La tabla 4 muestra que el método de la presente invención reduce la fragmentación del ADN de espermatozoides respecto a otros métodos. Con el presente método se obtiene un aumento del 30-35% de fragmentación, mientras que con el método de congelación lenta se obtiene un 90-100% de fragmentación del ADN.

[0090] De acuerdo a lo que se mostró anteriormente, la invención puede aplicarse tanto a la vitrificación de muestras de semen de donante en bancos de semen como a la vitrificación de muestras de pacientes que, o bien van a realizar ciclos de reproducción asistida, o van a ser intervenidos de una vasectomía o van a recibir tratamientos de quimio y/o radioterapia. En el caso de los bancos de semen, la vitrificación aséptica del semen supone no sólo un ahorro significativo en tiempo de personal sino también una mejora en la tasa de recuperación de la motilidad espermática tras la desvitrificación. En el caso de clínicas de reproducción asistida, el aumento de la recuperación de la motilidad espermática pos-desvitrificación, como se muestra en el ejemplo, va a suponer un aumento en la recuperación de espermatozoides móviles aislados por gradiente de densidad o swim-up (REM) y una mejora significativa en los resultados clínicos obtenidos en técnicas de reproducción asistida.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para la vitrificación aséptica de semen humano, CARACTERIZADO porque comprende las siguientes etapas:

(i) proporcionar semen humano licuado;

(ii) disponer de un medio de vitrificación, en donde el medio de vitrificación comprende:

a. un medio tampón o buffer de semen;

b. una mezcla crioprotectora que comprende un crioprotector permeable y un crioprotector no permeable;

(iii) mezclar el semen licuado de la etapa (i) con el medio de vitrificación de la etapa (ii);

(iv) proveer una pajuela de semen y cargar dicha pajuela con 0,25 a 0,5 mL de la mezcla obtenida en la etapa (iii);

(v) sellar ambos extremos de la pajuela con calor; y

(vi) presionar la parte superior de la pajuela sellada térmicamente de la etapa (v) y sumergirla verticalmente en nitrógeno líquido hacia el fondo del recipiente trapezoidal o rectangular o en forma de "V" durante un periodo de tiempo entre 10 y 20 segundos para vitrificar la mezcla.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque la proporción de semen licuado se encuentra en una proporción de volumen de semen licuado a volumen de pajuela en el rango de 1:2 a 1,7:2.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque el crioprotector permeable es glicerol, dimetilsulfóxido o propanodiol.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque dicho crioprotector permeable se usa a una concentración no diluida en un rango entre 10% y 30% v/v.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque el crioprotector no permeable son azúcares no permeables como rafinosa, sacararosa, lactosa o trehalosa.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque dicho crioprotector no permeable se usa a una concentración no diluida en un rango entre 10% y 30% v/v.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque los crioprotectores se encuentran diluidos en el medio tampón de semen a una dilución 1:2 v/v.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, CARACTERIZADO porque el tampón de semen corresponde a cualquier tampón de semen disponible, donde dicho medio tampón comprende albúmina sérica humana, piruvato, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES), rojo de fenol.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque la concentración final del crioprotector permeable en el medio de vitrificación está en el rango entre 3% y 10%, y la concentración final del crioprotector no permeable está entre 3% y 10%.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque la relación de la mezcla de semen licuado y medio de vitrificación de la etapa (iii) es 1:1 v/v, para obtener una concentración final del crioprotector permeable en el rango entre 1,5% y 10% y una concentración final del crioprotector no permeable en el rango entre 3% y 15%.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque las pajuelas están hechas de un material termoconductor, tal como plástico.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque el recipiente usado en la etapa (vi) es un gobelet tiene forma trapezoidal.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque se introduce la pajuela en posición vertical en el centro de la parte más ancha de un recipiente con nitrógeno líquido.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque posterior a la vitrificación de la etapa (vi) se almacena la pajuela en un canister de tanque de nitrógeno líquido.