ES3064312T3 - Anti-tl1a antigen binding proteins and uses thereof - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a proteínas de unión a antígenos que se unen a TL1A, incluyendo proteínas de unión a antígenos biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos) para TL1A y TNF-α. Dichos anticuerpos biespecíficos pueden presentarse en formato de inmunoglobulina tetramérica, donde un par de cadena pesada-cadena ligera del anticuerpo se dirige a TL1A y el otro a TNF-α. Las proteínas de unión a antígenos biespecíficas también pueden estar formadas por una fusión IgG-scFv, en la que un anticuerpo tetramérico convencional dirigido a un antígeno se fusiona con un par de unidades Fv de cadena simple dirigidas al otro. Asimismo, la proteína de unión a antígenos biespecífica puede estar formada por una fusión IgG-Fab, en la que una molécula Fab que se une a un antígeno se fusiona con cada cadena pesada de un anticuerpo tetramérico convencional dirigido al otro antígeno. La invención también se refiere a los usos de las proteínas de unión anti-TL1A y las proteínas de unión a antígenos anti-TL1A/anti-TNF-α, así como a sus formulaciones farmacéuticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Proteínas de unión a antígeno anti-tl1a y usos de las mismas

[0003] Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud N. PCT/US2016/052006, presentada el 15 de septiembre de 2016, y las Solicitudes provisionales de los EE. UU. N.º: 62/268.432, presentada el 16 de diciembre de 2015, y 62/333.063, presentada el 6 de mayo de 2016.

[0004] Campo de la invención

[0005] La invención se refiere a una proteína de unión a antígeno específica para TL1A, en donde la proteína de unión a antígeno comprende una combinación de secuencias para LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 seleccionada de la siguiente Tabla A, en donde la combinación de secuencias para LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 se selecciona de las filas que se muestran en la Tabla A:

[0007]

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[0011] La invención describe además ácidos nucleicos, vectores de expresión, una célula hospedadora, un método para la preparación, una composición farmacéutica y usos médicos relacionados con la proteína de unión a antígeno específica para TL1A de la invención.

[0012] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0013] Las citocinas son proteínas pequeñas y solubles que median una diversidad de efectos biológicos relacionados con el sistema inmunitario. Dichos efectos biológicos incluyen la inducción de la proliferación, desarrollo, diferenciación y/o migración de células inmunitarias; la regulación del crecimiento y diferenciación de muchos tipos celulares; una respuesta inflamatoria a través de la acumulación local o sistémica de células inmunitarias; y efectos protectores del hospedador. Véase, por ejemplo, Araiet al.,Annu.Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann,Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paulet al.,Cell, 76:241 (1994)). Dichos efectos inmunitarios pueden producir consecuencias patológicas cuando el efecto conduce a una inflamación excesiva y/o crónica, como en trastornos autoinmunitarios (tales como esclerosis múltiple) y enfermedades cancerosas/neoplásicas. Oppenheimet al., eds.,Cytokine Reference, Academic Press, San Diego, Calif. (2001); von Andrianet al.,New Engl. J. Med., 343:1020 (2000); Davidsonet al.,New Engl. J. Med., 345:340 (2001); Luet al.,Mol. Cancer Res., 4:221 (2006); Dalgleishet al.,Cancer Treat Res., 130:1 (2006).

[0014] TLIA (TNFSF15) es una citocina, un miembro de la familia de TNF-α implicado en la activación de linfocitos T (Richardet al.,J Leukoc Biol. Septiembre de 2015, 98(3):333-45). Es el ligando del Receptor de muerte 3 (DR3), también conocido como TNFRSF25. TL1A se expresa principalmente a nivel basal bajo en monocitos, células dendríticas y células endoteliales, pero se induce en gran medida después de la estimulación de complejos inmunitarios, citocinas y microbios. Múltiples estudios de asociación de todo el genoma (GWAS, por sus siglas en inglés) demostraron polimorfismos de un solo nucleótido TL1A (SNP, por sus siglas en inglés) asociados a la enfermedad de Crohn en diversas poblaciones étnicas. Además, se informó que los SNP de riesgo de enfermedad inflamatoria intestinal (EII) de TL1A estaban asociados a la gravedad de la enfermedad de Crohn (Hirano, EII 19: 526, 2013). En los estudios preclínicos, el tratamiento con proteína TL1A exacerbó el desarrollo de la colitis en ratones mdr1a-/- propensos a colitis, pero no en ratones de tipo silvestre. En conjunto, los datos genómicos humanos y los datos del modelo de colitis preclínica demuestran que TL1A desempeña una función importante en el desarrollo de la EII, y su bloqueo será beneficioso para el tratamiento de la EII.

[0015] El factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) es una citocina implicada en la regulación de diversos procesos fisiológicos y patológicos (Buetler,et al.,J Rheumatol Suppl. 57: 16-21, 1999). Está implicado en la regresión tumoral, el choque séptico, la caquexia y una serie de afecciones inflamatorias y autoinmunitarias. Fransenet al. (Junio de 1985), "Molecular Cloning of mouse tumor necrosis factor cDNA and its eucariyotic expression",Nucleic Acids Res.

[0016] 13 (12) 4417-29; Kriegleret al. (Abril de 1988), "A novel form of TNF-α /cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein: ramifications for the complex physiology of TNF-α,"Cell53 (1): 45-53. Los inhibidores de TNF-α son una clase de agentes terapéuticos aprobados para tratar la artritis reumatoide, artritis psoriásica, artritis idiopática juvenil, espondilitis anquilosante, psoriasis en placa, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa (Sethiet al.,Adv Exp Med Biol. 2009;647:37∼51). Los inhibidores de TNF-α incluyen etanercept, adalimumab, certolizumab pegol, infliximab y golimumab.

[0017] El documento US 2012/114654 A1 se refiere a anticuerpos humanos contra el ligando 1A similar a TNF humano (TL1A).

[0018] El documento WO 2014/144600 A2 se refiere a complejos multiespecíficos multivalentes y monovalentes y sus usos.

[0019] El documento WO 2014/161845 A1 se refiere a anticuerpos biespecíficos para FAP y DR5, anticuerpos específicos para DR5 y métodos de uso.

[0020] Wu X.et al.,mAbs, vol. 7:3, Mayo/junio de 2015, páginas 470-482, se refiere a formatos de anticuerpos biespecíficos basados en Fab con propiedades biofísicas y actividad biológica robustas.

[0021] Lewiset al.,Nature Biotechnology, vol.32(2), 26 de enero de 2014, páginas 191-198, se refiere a la generación de anticuerpos IgG biespecíficos mediante el diseño basado en la estructura de una interfaz de Fab ortogonal. Cainet al.,Science Business Exchange: SCIBX, Nature Publishing Group, vol. 4, n.º 28, 21 de julio de 2011, páginas 1-3, se refiere a formas de producir anticuerpos biespecíficos.

[0022] Fischeret al.,Arthritis & Rheumatology, vol. 67(1), Enero de 2015, páginas 51-62, describe el desarrollo y caracterización de un anticuerpo biespecífico novedoso.

[0023] Aproximadamente el 50 % de los pacientes responden al tratamiento con inhibidores del TNF. Sin embargo, sólo aproximadamente el 40 % de esos pacientes mantienen respuestas después de un año de tratamiento. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de agentes terapéuticos con un tamaño de efecto grande con una respuesta duradera. Los presentes inventores plantean la hipótesis de que el direccionamiento a múltiples vías inflamatorias, tales como TNF y TL1A, probablemente conseguirá un mayor efecto con un perfil de seguridad previsto.

[0024] SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0025] La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.

[0026] Un aspecto no cubierto por las reivindicaciones se refiere a

[0027] proteínas de unión a antígeno biespecíficas, particularmente anticuerpos biespecíficos. Las proteínas de unión a antígeno biespecíficas de la invención comprenden una entidad de unión a TL1A y una entidad de unión a TNF-α. Las proteínas bloqueantes de TL1A y las proteínas bloqueantes de TNF-α tienen diferentes efectos en estudios que miden la inhibición de la inducción de citocinas IFNy, IL-5, IL-6, IL-8 e IL-10. TL1A, pero no TNF-α, induce la activación de linfocitos Tin vivo. TL1A y TNF-α inducen NF-κB en diferentes tipos celulares en monocitos de sangre periférica humana (PBMC, por sus siglas en inglés). TL1A y TNF-α inducen además diferentes citocinas en PBMC humanas. TL1A y TNF-α inducen algunos de los mismos genes pero en diferentes tipos celulares (16 genes superpuestos inducidos por TL1A en sangre completa y TNF-α en células NCM460; 13 genes superpuestos inducidos por TL1A en sangre completa y TNF-α en PBMC). Existe una fuerte asociación genética de TL1A con la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y se validan agentes anti-TNF clínicamente para el tratamiento de la EII. Por lo tanto, dichas proteínas de unión a antígeno biespecíficas son útiles para el tratamiento de la EII y otras afecciones autoinmunitarias e inflamatorias. Por estas y otras razones, existe un beneficio de las proteínas de unión a antígeno biespecíficas que se unen específicamente a TL1A y TNF-α.

[0028] Un formato para dichas proteínas de unión a antígeno biespecíficas es inmunoglobulinas heterodiméricas (Ig hetero). Dichas proteínas de unión a antígeno Ig hetero tienen un par cadena pesada-cadena ligera dirigido a TL1A y otro dirigido a TNF-α.

[0029] Otro formato para dichas proteínas de unión a antígeno biespecíficas es moléculas de IgG-scFv. En una IgG-scFv, cada cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a una diana está unida a un anticuerpo de cadena única (scFv) que se une específicamente a la otra diana. La porción de scFv puede unirse a la cadena pesada de la porción de IgG directamente o a través de un enlazador peptídico. En el formato IgG-scFv, la IgG se dirige a TL1A y la porción de scFv a TNF-α o viceversa. Las proteínas de unión a antígeno biespecíficas en el formato IgG-scFv tienen la ventaja de ser bivalentes para ambos de sus antígenos diana.

[0030] La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.

[0031] Un formato adicional para dichas proteínas de unión a antígeno biespecíficas es moléculas de IgG-Fab. En este formato, la proteína de unión a antígeno tiene una estructura de manera que una molécula de Fab que se une a una diana se fusiona con cada cadena pesada de una molécula de IgG que se une a otra diana. Una cadena de una porción de Fab puede unirse directamente o a través de un enlazador peptídico al extremo C de una cadena pesada de la porción de IgG. La molécula resultante tiene la ventaja de ser tetravalente y biespecífica. Todas las variaciones del formato IgG-Fab comprenden preferentemente las secuencias de CDR de las Tablas 21.2A y 21.2B a continuación en el presente documento. Las secuencias de cadena pesada y ligera preferidas de moléculas de IgG-Fab aparecen en la Tabla 21.1 a continuación en el presente documento.

[0032] Aspectos no cubiertos por las reivindicaciones son proteínas de unión a antígeno biespecíficas, tales como moléculas de IgG-Fab. En este formato, cada cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a una diana está unida a un fragmento Fab que se une específicamente a la otra diana. En el formato IgG-Fab, la IgG se dirige a TL1A y la porción de Fab a TNF-α o viceversa. Las proteínas de unión a antígeno biespecíficas en el formato IgG-Fab tienen la ventaja de ser bivalentes para ambos de sus antígenos diana. A continuación se describen otros formatos para proteínas de unión a antígeno biespecíficas dentro del alcance de esta invención. La invención también se refiere a ácidos nucleicos aislados que codifican las proteínas de unión a antígeno específicas de TL1A de la invención, así como vectores que comprenden los ácidos nucleicos, células hospedadoras que comprenden los vectores y métodos de fabricación y uso de las proteínas de unión a antígeno específicas de TL1A.

[0033] La invención también se refiere a ácidos nucleicos aislados que codifican las proteínas de unión a antígeno de la invención, así como vectores que comprenden los ácidos nucleicos, células hospedadoras que comprenden los vectores y métodos de fabricación y uso de las proteínas de unión a antígeno biespecíficas.

[0034] En otras realizaciones, la presente invención proporciona composiciones que comprenden las proteínas de unión a antígeno específicas de TL1A, y kits que comprenden las proteínas de unión a antígeno anti-TL1A, así como artículos de fabricación que comprenden las proteínas de unión a antígeno anti-TL1A.

[0035] Las proteínas de unión a antígeno específicas de TL1A de la invención son para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria caracterizada por la presencia de niveles elevados de TL1A en un paciente que lo necesite, como se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión a antígeno específica de TL1A y un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0036] Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia en esta descripción han de interpretarse como referencias a las proteínas de unión a antígeno específicas de TL1A y composiciones farmacéuticas de la invención para su uso en esos métodos.

[0037] La invención se refiere además a métodos de tratamiento que usan las proteínas de unión a antígeno específicas de TL1A. Las proteínas de unión a antígeno específicas de TL1A de la presente invención son útiles para la inhibición de la citocina proinflamatoria TL1A. Los anticuerpos pueden usarse para reducir, limitar, neutralizar o bloquear los efectos proinflamatorios de TL1A. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invención se refiere al tratamiento de la EII y otras afecciones autoinmunitarias o inflamatorias usando las proteínas de unión a antígeno específicas de TL1A.

[0038] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0039] La Figura 1 muestra una representación esquemática de cuatro formatos de Ig hetero biespecíficas utilizados para generar proteínas de unión a antígeno biespecíficas anti-TL1A/anti-TNF-α. Como se muestra, una cadena pesada dirigida a un antígeno está unida por disulfuro a una cadena pesada dirigida a un antígeno diferente. Una cadena ligera para cada antígeno está unida por disulfuro a la cadena pesada para el antígeno correspondiente. La Figura 1 muestra una realización preferida, en la que las cadenas pesadas y ligeras comprenden mutaciones de carga para ayudar a la correcta asociación de las cadenas pesadas y ligeras. El esquema de numeración Kabat-EU se usa para indicar las posiciones de mutaciones de pares de carga dentro de cada una de las cadenas y para todas las secuencias a lo largo de esta memoria descriptiva. Este formato de proteína de unión a antígeno biespecífico similar a IgG es un heterotetrámero que comprende dos cadenas ligeras diferentes y dos cadenas pesadas diferentes. HC1 y LC1 se refieren a la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente, de un brazo de unión a Fab, y HC2 y LC2 se refieren a la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente, del segundo brazo de unión a Fab. Por ejemplo, en el esquema, HC1 y LC1 corresponden al brazo de unión anti-receptor de TL1A y HC2 y LC2 corresponden al brazo de unión anti-TNF-α. Sin embargo, los dos brazos de unión pueden cambiarse de manera que HC1 y LC1 correspondan al brazo de unión anti-TNF-α y HC2 y LC2 correspondan al brazo de unión anti-receptor de TL1A. La Figura 1 es únicamente para referencia.

[0040] La Figura 2 muestra una representación esquemática del formato IgG-scFv utilizado para generar proteínas de unión a antígeno biespecíficas anti-TL1A/anti-TNF-α. Como se muestra, la estructura incorpora una IgG tetramérica completa dirigida a un antígeno. Un fragmento variable de cadena única (scFv), que comprende dominios variables de un segundo anticuerpo unidos entre sí por un enlazador de glicina-serina, se fusiona con el extremo carboxilo de la cadena pesada de un primer anticuerpo a través de un enlazador peptídico para producir una cadena pesada modificada. Aunque se muestra la orientación VH-VL de los dominios variables dentro del scFv, los dominios variables también pueden organizarse en una orientación VL-VH. La molécula completa es un multímero que comprende dos cadenas pesadas (pero una única secuencia de cadena pesada) y dos cadenas ligeras (pero una única secuencia de cadena ligera) del primer anticuerpo. La Figura 2 es únicamente para referencia.

[0041] La Figura 3 se refiere a la cromatografía de afinidad MabSelect Sure de una Ig-Hetero anti-TL1A/anti-TNF-α. Muestra un cromatograma de captura por afinidad de proteína A FPLC representativo de una Ig-hetero anti-TL1A/anti-TNF-α. La proteína se eluyó con un gradiente por etapas de ácido acético 100 mM (conductividad: trazo negro, discontinuo), pH 3,6 y se agruparon basándose en el A280 (trazo negro, continuo).

[0042] La Figura 4 muestra un cromatograma de purificación de sefarosa de alto rendimiento de FPLC SP representativo de una Ig-hetero anti-TL1A/anti-TNF-α. La proteína se eluyó con un gradiente de sal creciente (conductividad : trazo negro, discontinuo) y se agrupó basándose en el perfil de elución de A280 (trazo negro, sólido) y el análisis por Caliper LabChip de las fracciones.

[0043] La Figura 5 muestra un cromatograma de purificación de sefarosa de alto rendimiento de FPLC SP representativo de una Ig-hetero anti-TL1A/anti-TNF-α. La proteína se eluyó con un gradiente decreciente de sulfato de amonio (conductividad : trazo negro, discontinuo) y se agrupó basándose en el perfil de elución de A280 (trazo negro, sólido) y el análisis Caliper LabChip de las fracciones.

[0044] Figura 6 se refiere al análisis por Caliper de una Ig-hetero contra TL1A/TNF-α. Muestra el análisis por Caliper reducido y no reducido de una Ig-hetero anti-TL1A/anti-TNF-α.

[0045] La Figura 7 se refiere al análisis por SE-HPLC de una Ig-hetero anti-TL1A/anti-TNF-α. Muestra una cromatografía de exclusión por tamaño en 30 µg del producto final Ig-hetero anti-TL1A/anti-TNF-α inyectado en una columna Sepax Zenix-C SEC-300 (7.8 x 300 mm) en NaH<2>PO<4>50 mM, NaCl 250 mM, pH 6,9 a 1 ml/min, observando la absorbancia a 280 nm (trazo negro).

[0046] La Figura 8 se refiere a LC-MS de Ig-hetero no reducida (Masa teórica: 145495 Da). La Figura 8 muestra el análisis de masas de 20 µg de Ig-hetero anti-TL1A/anti-TNF-α no reducida eluida de un gradiente de HPLC de fase inversa usando una columna Agilent Zorbax 300SB-C8 (2,1 x 50 mm 3,5 µm) y fases móviles de TFA al 0,1 % y n-propanol al 90 %/TFA al 0,1 % (fases móviles A y B, respectivamente), equipada con un espectrómetro de masas Agilent 6230 ESI-TOF.

[0047] La Figura 9 muestra el análisis de masas de 20 µg de Ig-hetero contra TL1A/TNF-α después de la digestión limitada de Lisil Endoproteinasa C durante 30 minutos en TRIS 100 mM, pH 8. La HPLC de fase inversa se realizó usando una columna Agilent Zorbax 300SB-C8 (2,1 x 50 mm 3,5 µm) y fases móviles de TFA al 0,1 % y n-propanol al 90 %/TFA al 0,1 % (fases móviles A y B respectivamente) y detección de masas en un espectrómetro de masas Agilent 6230 ESI-TOF. Las masas teóricas para Fab de TL1A, Fab de TNF y Fc son 47350 Da, 48002 Da y 50175 Da, respectivamente.

[0048] La Figura 10 se refiere a la cromatografía de afinidad MabSelect Sure de uns IgG-scFv anti-TL1A/anti-TNF-α. Muestra un cromatograma de captura por afinidad de proteína A FPLC representativo de una IgG-scFv anti-TL1A/anti-TNF-α. La proteína se eluyó con un gradiente por etapas de ácido acético 100 mM, pH 3,6 y se agruparon basándose en el A280 (trazo negro).

[0049] La Figura 11 se refiere a cromatografía de alto rendimiento de SP Sepharose de un IgG-scFv anti-TL1A/anti-TNF-α. Muestra un cromatograma de purificación de FPLC Superdex 200 representativo de una IgG-scFv anti-TL1A/anti-TNF-α. La proteína se eluyó con gradiente isocrático de tampón y se agrupó basándose en el perfil de elución de A280 (trazo negro) y el análisis por SE-HPLC de las fracciones.

[0050] La Figura 12 muestra el análisis por Caliper reducido y no reducido de una IgG-scFv anti-TL1A/anti-TNF-α. La Figura 13 se refiere al análisis por SE-HPLC de una IgG-scFv anti-TL1A/anti-TNF-α. Muestra una cromatografía de exclusión por tamaño en 30 µg del producto final IgG-scFv anti-TL1A/anti-TNF-α inyectado en una columna Sepax Zenix-C SEC-300 (7.8 x 300 mm) en NaH<2>PO<4>50 mM, NaCl 250 mM, pH 6,9 a 1 ml/min, observando la absorbancia a 280 nm.

[0051] La Figura 14 se refiere a Ig-scFv digerida con Proteasa IDEs. Muestra el análisis de masas de 20 µg de Ig-scFv usando separación por HPLC de fase inversa en una columna Agilent Zorbax 300SB (2,1 x 50 mm, 3,5 µm) con fases móviles de TFA al 0,1 % y n-propanol al 90 %/TFA al 0,1 % (fases móviles A y B, respectivamente), y detección en un espectrómetro de masas Agilent 6230 ESI-TOF.

[0052] La Figura 15 muestra el genotipado de SNP de TL1A. Para evaluar la posible asociación del genotipo de TL1A con la expresión, se aisló ADN genómico (ADNg) de donantes de PBMC sanos usando el kit de tejido Gentra Puregene de Qiagen. El ADN genómico se genotipó usando ensayos de genotipado de SNP TaqMan para ensayos rs7848647, rs6478109, rs6478108 y rs3810936 de LifeTech y protocolos estándar en la plataforma de PCR digital de gotitas Bio-Rad. Los donantes se consideraron haplotipo de riesgo homocigoto si sólo había presentes alelos de riesgo en los 4 SNP genotipados (rs7848647, rs6478109, rs6478108 y rs3810936). Los donantes se consideraron haplotipo homocigoto no de riesgo si sólo había presentes alelos de no riesgo en los 4 SNP genotipados. Los donantes se consideraron haplotipo heterocigoto si había presentes alelos tanto de riesgo como de no riesgo en los 4 SNP genotipados. Los donantes que se consideraron "recombinantes" sólo tenían alelos de riesgo homocigotos a rs7848647, rs6478109 y rs6478108, pero eran heterocigotos (alelos de riesgo y no de riesgo presentes) a rs3810936.

[0053] Las Figuras 16A y 16B muestran una inducción mayor del alelo de riesgo de TL1A que el alelo no de riesgo en un estudio AEI de PBMC heterocigota. La frecuencia de riesgo frente al uso de alelo no de riesgo en PBMC heterocigotas a nivel basal o después de la estimulación por complejo inmunitario en diversos puntos temporales se examinó mediante PCR dígital de gotitas (ddPCR) usando sondas fluorescentes específicas alélicas de SNP sinónimo (rs3810936). La relación de expresión alélica se calculó dividiendo las copias/ml del alelo de riesgo por las copias/ml del alelo no de riesgo. El número total de copias de cada alelo se normalizó mediante la cantidad de entrada de ADNc (copias/ng) y el factor de inducción para cada alelo en cada punto temporal se calculó dividiendo las copias/ng en el punto temporal de interés por las copias/ng en el momento basal (0 h).

[0055] La Figura 17 muestra que los SNP de TL1A en el promotor e intrón contribuyen a la regulación del desequilibrio de expresión alélica. El inventor o inventores identificaron un pequeño número de donantes homocigotos para alelos de riesgo en rs7848647, rs6478109 y rs6478108, pero heterocigotos en rs3810936, probablemente debido a la recombinación entre rs6478109 y SNP sinónimo rs3810936. La frecuencia de riesgo frente al uso de alelo no de riesgo en PBMC de donantes heterocigotos o recombinantes se examinó mediante PCR digital de gotitas (ddPCR) usando sondas fluorescentes específicas alélicas de SNP sinónimo (rs3810936). En comparación con los donantes heterocigotos, no se detectó desequilibrio de expresión alélica en estos individuos recombinantes antes o después de la estimulación por complejo inmunitario.

[0057] Las Figuras 18A y 18B muestran que los SNP de riesgo de TL1A se asocian a locus de rasgos cuantitativos de expresión (eQTL), donantes de PBMC con alelo de riesgo de TL1A homocigoto, alelos no de riesgo homocigotos o alelos heterocigotos se trataron con complejo inmunitario. La expresión total de TL1A (TNFSF15) en cada donante se determinó mediante PCR digital. En resumen, se mezcló ADNc de cada muestra con ddPCRTM Supermix para Sondas (Bio-Rad) y el ensayo de qPCR PrimeTime<®>ID HS.Pt.56a.41003970. Se generaron gotitas para cada reacción usando el generador de gotitas QX100<™>(Bio-Rad) y se sometieron a ciclos térmicos en un ciclador térmico C1000 Touch<™>(Bio-Rad). Después de la amplificación, se leyó la fluorescencia de gotitas en un lector de gotitas QX100<™>(Bio-Rad). Los datos se analizaron usando el software QuantaSoft (Bio-Rad) y se determinaron copias/µl de TL1A y se normalizaron para determinar la cantidad de ADNc de entrada (copias/ng). Los valores de P para las diferencias en los niveles de expresión de TL1A entre diferentes haplotipos de TNFSF15 se determinaron usando el ensayo t de Student. A nivel basal, las PBMC de donantes homocigotos para los SNP de riesgo de TL1A tienen un ARNm de TL1A menor en comparación con donantes homocigotos no de riesgo. Sin embargo, después de la estimulación por complejo inmunitario, las PBMC de donantes homocigotos para los SNP de riesgo de TL1A tienen una expresión de TL1A mayor en comparación con donantes homocigotos no de riesgo.

[0058] Las Figuras 19A y 19B muestran la regulación específica de tipo celular del desequilibrio de expresión alélica de SNP sinónimo de TL1A. Se genotiparon células HUVEC de diversos donantes como se describió previamente. Se trataron células HUVEC genotipadas de diversos donantes con IL-1 en diversos puntos temporales. El número total de copias de cada alelo se midió como se ha descrito previamente. La relación de expresión alélica se calculó dividiendo las copias/ml del alelo de riesgo por las copias/ml del alelo no de riesgo. No se observó desequilibrio de expresión alélica en células HUVEC con o sin tratamiento con IL-1.

[0060] Las Figuras 20A y 20B muestran que el tratamiento profilactivo con anticuerpo monoclonal anti-TL1A inhibió el desarrollo de colitis espontánea en ratones mdr1a<-/->. Se aleatorizaron ratones (n=10, 6-7 semanas de edad) a diferentes grupos y se trataron por vía intraperitoneal una vez a la semana con 500 µg de anticuerpo anti-TL1A de ratón, anticuerpo anti-IL23p19, anticuerpo anti-IL17RA de ratón o control de isotipo de ratón o sin tratamiento una vez a la semana durante 8 semanas. La actividad clínica de la enfermedad se monitorizó mediante la evaluación de la inflamación anal y la consistencia de las heces. Se sometieron secciones del intestino a análisis histopatológico. El análisis estadístico se realizó usando ANOVA unidireccional con Dunett en comparación con el grupo de mIgG1.

[0062] Las Figuras 21A y 21B muestran que TL1A exacerbó la colitis en ratones mdr1a<+>. Se trataron ratones mdr1a<-/->o ratones de control de tipo silvestre a las 6-8 semanas de edad por vía intraperitoneal una vez a la semana con 150 µg de proteína de fusión mFc-TL1A recombinante o control de isotipo tres veces a la semana durante 4 semanas. La actividad clínica de la enfermedad se monitorizó evaluando la inflamación anal y la consistencia de las heces como se describió previamente. Después de 4 semanas de tratamiento, los ratones se sacrificaron, se sometieron secciones del intestino a análisis histopatológico. El análisis estadístico se realizó usando ANOVA unidireccional con Dunett en comparación con el grupo de mIgG1.

[0064] Las Figuras 22A a 22F muestran un aumento de las células inflamatorias en la lámina propia de ratones mdr1a<-/->expuestos a Fc-TL1A. Se trataron ratones mdr1a-/- o ratones de control de tipo silvestre a las 6-8 semanas de edad por vía intraperitoneal una vez a la semana con 150 µg de proteína de fusión mFc-TL1A recombinante o control de isotipo tres veces a la semana durante 4 semanas. Se aislaron linfocitos de lámina propia y se tiñeron para antígenos de superficie y se analizaron mediante FACS. La exposición a TL1A en ratones mdr1a<-/->dio como resultado un aumento de células inflamatorias en la lámina propia.

[0066] Las Figuras 23A a 23E muestran una inducción de citocinas distinta por exposición a TL1A y TNF en ratones. Para evaluar si la exposición a TL1A y TNF da como resultado efectos farmacodinámicos similares o diferentes, en primer lugar se inyectaron ratones C57Bl/6 (8 semanas, hembra) por vía intraperitoneal 500 µg/ratón de anti TL1A de ratón, anti TNF-α de ratón o PBS. Después de 4 horas, los ratones se expusieron después con 100 µg/ratones de TL1A o 10 µg/ratón de TNF-α o sin exposición. Los sueros se recogieron después de 24 horas. Las citocinas se midieron mediante MSD (IL-22 se midió mediante ELISA).

[0067] Las Figuras 24A a 24F muestran una inducción de citocinas distinta mediante tratamiento con TL1A y TNF en PBMC humanas. Se cultivaron PBMC recién aisladas de sangre humana en medio (RPMI1640 complementado con FBS al 10 %, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, 2-ME 5 X 10<-5>M y antibióticos) en presencia de 100 ng/ml de TL1A o TNF-α humano. El sobrenadante se recogió después de 72 horas. Las citocinas en el sobrenadante se midieron mediante MSD (IL-22 se midió mediante ELISA).

[0068] La Figura 25 representa una representación esquemática de un formato IgG-Fab biespecífico para una proteína de unión a antígeno biespecífica anti-TL1A anti-TNF-α dentro de la presente invención. En este formato, una cadena polipeptídica de un fragmento Fab de un segundo anticuerpo (por ejemplo, la cadena pesada (VH2-CH1) se fusiona con el extremo carboxilo de cada cadena pesada de un primer anticuerpo a través de un enlazador peptídico para producir una cadena pesada modificada. La molécula completa es un homohexámero que comprende dos cadenas pesadas modificadas, dos cadenas ligeras del primer anticuerpo y dos cadenas polipeptídicas que contienen la otra mitad del fragmento Fab del segundo anticuerpo (por ejemplo, la cadena ligera (VL2-CL)). Las mutaciones de pares de carga (representadas por los círculos) pueden introducirse en las regiones Fab del primer anticuerpo (Fab 1) y/o segundo anticuerpo (Fab 2) para promover el emparejamiento correcto cadena pesada-cadena ligera.

[0069] La Figura 26 representa una representación esquemática de un formato IgG-Fab biespecífico para una proteína de unión a antígeno biespecífica anti-TL1A anti-TNF-α dentro de la presente invención usando el entrecruzamiento de dominio de inmunoglobulina. En esta variación del formato IgG-Fab, una cadena polipeptídica de un fragmento Fab de un segundo anticuerpo (por ejemplo, la cadena pesada (VH2-CH1) se fusiona con el extremo carboxilo de la cadena pesada que comprende una CL en lugar de un dominio CH1 de un primer anticuerpo a través de un enlazador peptídico para producir una cadena pesada modificada. De esta manera, los dominios CH1 y CL de Fab 1 están "intercambiados". Este intercambio se denomina un intercambio de Fab1 o un intercambio N-terminal en el presente documento. La molécula completa es un homohexámero que comprende dos cadenas pesadas modificadas, dos cadenas ligeras del primer anticuerpo que comprende un dominio CH1 en lugar de un dominio CL, y dos cadenas polipeptídicas que contienen la otra mitad del fragmento Fab del segundo anticuerpo (por ejemplo, la cadena ligera (VL2-Cl)). Las mutaciones de pares de carga (representadas por los círculos) pueden introducirse en las regiones Fab del primer anticuerpo (Fab 1) y/o segundo anticuerpo (Fab 2) para promover los pares correctos cadena pesada-cadena ligera. No se muestran, pero también dentro del alcance de esta invención, moléculas de IgG-Fab en las que (i) se intercambian los dominios CH1 y CL de Fab 2 en lugar de los de Fab 1 (denominado en el presente documento intercambio de Fab 2 o intercambio C-terminal) o (ii) se intercambian ambos dominios CH1 y CL de Fab 1 y se intercambian los dominios CH1 y CL de Fab 2 (denominado en el presente documento intercambio dual).

[0070] La Figura 27 compara el título de expresión de IgG-Fab basándose en el formato de intercambio de dominios. La Figura 28 compara el título de expresión de IgG-Fab basándose en el tipo de mutación o mutaciones de pares de carga.

[0071] La Figura 29 compara la pureza de IgG-Fab basándose en el formato de intercambio de dominios.

[0072] La Figura 30 compara la potencia anti-TL1A de IgG-Fab basándose en el formato de intercambio de dominios. La Figura 31 compara la potencia anti-TNF-α de IgG-Fab basándose en el formato de intercambio de dominios. La Figura 32 compara la potencia anti-TL1A de IgG-Fab basándose en el tipo de mutación o mutaciones de pares de carga.

[0073] La Figura 33 compara la potencia anti-TNF-α de IgG-Fab basándose en el tipo de mutación o mutaciones de pares de carga.

[0074] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0075] Definición de términos

[0076] En la descripción a continuación, se usan extensamente varios términos. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de la invención.

[0077] A menos que se especifique lo contrario, "un", "una", "el", "la" y "al menos uno" se usan indistintamente y significan uno o más de uno.

[0078] Una "entidad de unión", como se usa en el presente documento, significa cualquier proteína o fragmento de proteína monomérica o multimérica que se une específicamente a un antígeno diana especificado. La expresión "entidad de unión" incluye, pero sin limitación, anticuerpos y partes de unión de los mismos, tales como fragmentos inmunológicamente funcionales. Los pepticuerpos y los péptidos son otros ejemplos de entidades de unión. La expresión "fragmento inmunológicamente funcional" (o simplemente "fragmento") de una entidad de unión de anticuerpo o cadena de inmunoglobulina (cadena pesada o ligera), como se usa en el presente documento, es una especie de entidad de unión que comprende una porción (independientemente de cómo se obtenga o sintetice esa porción) de un anticuerpo que carece de al menos algunos de los aminoácidos presentes en una cadena de longitud completa, pero que aún es capaz de unirse específicamente a un antígeno. Dichos fragmentos son biológicamente activos, ya que se unen al antígeno diana y pueden competir con otras entidades de unión, incluyendo anticuerpos intactos, por la unión a un epítopo dado. En algunas realizaciones, los fragmentos son fragmentos neutralizantes. En algunas realizaciones, los fragmentos pueden bloquear o reducir la probabilidad de interacción entre el antígeno diana (TL1A o TNF-α) y su receptor. En un aspecto, un fragmento de este tipo conservará al menos una CDR presente en la cadena ligera o pesada de longitud completa y en algunas realizaciones comprenderá una única cadena pesada y/o cadena ligera o porción de la misma. Estos fragmentos biológicamente activos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante, o pueden producirse mediante la escisión enzimática o química de entidades de unión, incluyendo anticuerpos intactos. Los fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales incluyen, pero sin limitación, Fab, un diacuerpo (dominio variable de cadena pesada en el mismo polipéptido que un dominio variable de cadena ligera, conectado a través de un enlazador peptídico corto que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena), Fab', F(ab')<2>, Fv, anticuerpos de dominio y anticuerpos de cadena única, y pueden derivar de cualquier fuente de mamífero, incluyendo, pero sin limitación, ser humano, ratón, rata, camélido o conejo. Se contempla además que una porción funcional de las entidades de unión divulgadas en el presente documento, por ejemplo, una o más CDR, podrían unirse covalentemente a una segunda proteína o a una molécula pequeña para crear un agente terapéutico dirigido a una diana particular en el cuerpo, que posee propiedades terapéuticas bifuncionales, o que tiene una semivida en suero prolongada. Como apreciará un experto en la materia, una entidad de unión puede incluir componentes no proteicos. En algunas secciones de la presente divulgación, los ejemplos de entidades de unión se nombran en el presente documento en términos de "número/letra/número" (por ejemplo, 23B3), con algunas entidades de unión identificadas adicionalmente mediante combinaciones de letras/números adicionales (por ejemplo, VH4). En estos casos, el nombre exacto indica un anticuerpo específico. Es decir, una entidad de unión denominada 23B3 puede tener cierto grado de identidad de secuencia con, pero no es la misma que, un anticuerpo denominado 23B3 VH4 (a menos que se enseñe explícitamente que son los mismos en la memoria descriptiva).

[0080] Una "entidad de unión a TL1A" es una entidad de unión que se une específicamente a TL1A humano; es decir, una entidad de unión para la que el TL1A humano es el antígeno diana.

[0082] Una "entidad de unión a TNF-α" es una entidad de unión que se une específicamente a TNF-α humano; es decir, una entidad de unión para la que TNF-α humano es el antígeno diana.

[0084] "Proteína de unión a antígeno" se refiere a una proteína o polipéptido que comprende una región de unión a antígeno o porción de unión a antígeno que tiene una fuerte afinidad por otra molécula a la que se une (antígeno). Las proteínas de unión a antígeno abarcan anticuerpos, pepticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos, análogos de anticuerpos, proteínas de fusión, y receptores de antígenos incluyendo receptores de antígeno quiméricos (CAR).

[0086] Los "anticuerpos" (Ab) e "inmunoglobulinas" (Ig) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión por un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad por antígenos. Los polipéptidos del último tipo son producidos, por ejemplo, en bajos niveles por el sistema linfático y en niveles elevados por mielomas. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" o la expresión "péptido(s) de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto, un anticuerpo que compite por la unión específica con un anticuerpo divulgado en esta memoria descriptiva, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica e incluye anticuerpos quiméricos, humanizados, totalmente humanos y biespecíficos. En determinadas realizaciones, los fragmentos de unión a antígeno se producen, por ejemplo, mediante técnicas de ADN recombinante. En realizaciones adicionales, los fragmentos de unión a antígeno se producen por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión a antígeno incluyen, pero sin limitación, Fab, Fab', F(ab)<2>, F(ab')<2>, Fv y anticuerpos de cadena única.

[0088] La expresión "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta obtener más del 95 % en peso de anticuerpo, como se determina mediante el método de Lowry, y mucho más preferentemente superior al 99 % en peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpoin situdentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, normalmente se preparará anticuerpo aislado mediante al menos una etapa de purificación.

[0090] El término "agonista" se refiere a cualquier compuesto que incluya una proteína, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula grande, o molécula pequeña (menos de 10 kD), que aumenta la actividad, activación o función de otra molécula.

[0092] El término "antagonista" se refiere a cualquier compuesto que incluya una proteína, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula grande, o molécula pequeña (menos de 10 kD), que disminuye la actividad, activación o función de otra molécula.

[0094] La expresión "unión" de un antígeno u otro polipéptido incluye, pero sin limitación, la unión de un polipéptido ligando de la presente invención a un receptor; la unión de un polipéptido receptor de la presente invención a un ligando; la unión de un anticuerpo de la presente invención a un antígeno o epítopo; la unión de un antígeno o epítopo de la presente invención a un anticuerpo; la unión de un anticuerpo de la presente invención a un anticuerpo antiidiotípico; la unión de un anticuerpo anti-idiotípico de la presente invención a un ligando; la unión de un anticuerpo anti-idiotípico de la presente invención a un receptor; la unión de un anticuerpo anti-idiotípico de la presente invención a un ligando, receptor o anticuerpo, etc.

[0096] Una proteína de unión a antígeno "biespecífica" es una molécula con entidades de unión derivadas tanto de una primera proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo) que se une específicamente a una primera molécula diana de interés como de una segunda proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo) que se une específicamente a una segunda molécula diana de interés. Las proteínas de unión a antígenos biespecíficas pueden producirse mediante una diversidad de métodos, incluyendo, pero sin limitación, la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilaiet al.,Clin. CAD. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelnyet al.,J. Immunol., 148:1547-1553 (1992), las moléculas en los formatos representados en las Figuras 1 y 2 son proteínas de unión a antígeno biespecíficas de acuerdo con esta definición. Diversos formatos adicionales de proteínas de unión a antígeno biespecíficas dentro de esta definición se divulgan en los documentos WO 2014/159725; WO 2013/041687; la Pat. de los EE. UU. N.º 8.945.553; la Pat. de los EE. UU. N.º 8.945.553; la Pat. de los EE. UU. N.º 8.258.268; la Solicitud de Pat. de los EE. UU. N.º 2012/ 0195900; la solicitud de patente internacional WO 2012/088302; la Solicitud prov. de los EE. UU.62/218,977; Fischer y Leger (2007),Pathobiology74:3-14;_van Sprielet al. (2000),Immunology Today21(8): 391-7; Kuferet al. (2004),Trends in Biotechnology22(5): 238-44; Byrneet al. (2013),Trends in Biotechnology31(11): 621-31; Muller y Kontermann (2010),Biodrugs24(2): 89-98; Chames y Baty (2009), http://dx.doi.org/10.4161/mabs.1.6.10015; Kontermann (2012), http://dx.doi.ore/10.4161/mabs.4.2.19000; Holligeret al. (1993),Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-8; Speisset al.,Mol. Immunol. (2015), 67: 95-106, http://dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003; Holligeret al. (1993),Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-8; Speisset al.,Mol. Immunol. (2015), http://dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003; Ridgwayet al., (1996),Protein Eng. 9: 617; Gunasekaranet al. (2010),J. Biol. Chem. 285:19637; Davis (2010),Protein Eng. Des. & Sel.23:195; DiGiammarinoet al. (2012),Methods Mol. Biol.899:145, 2012); Lindhoferet al. (1995),J. Immunol.155: 219: Schaeferet al. (2011),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108: 11187; Regula et al., Solicitud de Patente de los EE. UU. N.º: 2010/0322934; Bostromet al. (2009),Science323:1610; Solicitud de Pat. de los EE. UU. N.º 2011/0076722; Rossiet al. (2008),Cancer Res.

[0097] 68:8384.

[0099] El término "epítopo" se refiere a la porción de un antígeno a la que se une específicamente un anticuerpo. Por lo tanto, el término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T. Los determinantes epitópicos por lo general consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares, y por lo general tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Más específicamente, la expresión "epítopo de IL-17", "epítopo de TNF-α" y/o "epítopo de TNF-α /p19", como se usa en el presente documento, se refiere a una porción del polipéptido correspondiente que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferentemente en un mamífero, y mucho más preferentemente en un ratón o un ser humano. Un epítopo que tiene actividad inmunogénica es una porción de, por ejemplo, un polipéptido IL-17A o IL-17F o TNF-α /p19 que provoca una respuesta de anticuerpo en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica es una porción de, por ejemplo, un polipéptido IL-17A o IL-17F o TNF-α /p19 al que se une inmunoespecíficamente un anticuerpo como se determina mediante cualquier método bien conocido en la técnica, por ejemplo, mediante inmunoensayos, digestión de proteasas, cristalografía o intercambio de HID. Los epítopos antigénicos no necesitan ser necesariamente inmunogénicos. Dichos epítopos pueden ser de naturaleza lineal o pueden ser un epítopo discontinuo. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, la expresión "epítopo conformacional" se refiere a un epítopo discontinuo formado por una relación espacial entre aminoácidos de un antígeno distinto de una serie ininterrumpida de aminoácidos.

[0100] El término "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina. Una forma de inmunoglobulina constituye la unidad estructural básica de un anticuerpo. Esta forma es un tetrámero y consiste en dos pares idénticos de cadenas de inmunoglobulina, teniendo cada par una cadena ligera y una pesada. En cada par, las regiones variables de cadena ligera y pesada son conjuntamente responsables de la unión a un antígeno, y las regiones constantes son responsables de las funciones efectoras de anticuerpos.

[0102] Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 Kd o aproximadamente 214 aminoácidos) están codificadas por un gen de región variable en el extremo NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de región constante kappa o lambda en el extremo COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 Kd o aproximadamente 446 aminoácidos), están codificadas de manera similar por un gen de región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de región constante mencionados anteriormente (aproximadamente 330 aminoácidos). Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG (tal como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgM, IgA, IGD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. (Véase en general,Fundamental Immunology(Paul, W., ed., 2.ª edición, Raven Press, NY (1989)), Capítulo 7

[0103] Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina consiste en una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables. Por lo tanto, la expresión "región hipervariable" se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende restos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.ª Edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos restos de un "bucle hipervariable" (Chothiaet al.,J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)) Los restos de "región marco" o "FR" son aquellos restos de dominio variable distintos de los restos de región hipervariable como se definen en el presente documento. Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie. Por lo tanto, una "región marco humana" es una región marco que es sustancialmente idéntica (aproximadamente un 85 % o más, por lo general un 90-95 % o más) a la región marco de una inmunoglobulina humana de origen natural. La región marco de un anticuerpo, que es las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR. Las CDR son principalmente responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. En consecuencia, la expresión inmunoglobulina "humanizada" se refiere a una inmunoglobulina que comprende una región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (por lo general de ratón o rata). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina "aceptora". No es necesario que haya regiones constantes presentes, pero si las hay, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente un 85-90 %, preferentemente aproximadamente un 95 % o más idénticas. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de secuencias de inmunoglobulina humana natural. Además, uno o más restos en la región marco humana pueden retromutarse a la secuencia parental para conservar la afinidad y especificidad de unión a antígeno óptimas. De esta manera, determinados restos marco del anticuerpo parental no humano se conservan en el anticuerpo humanizado con el fin de conservar las propiedades de unión del anticuerpo parental a la vez que se minimiza su inmunogenicidad. La expresión "región marco humana", como se usa en el presente documento, incluye regiones con dichas retromutaciones. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una cadena ligera humanizada y una inmunoglobulina de cadena pesada humanizada. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado no abarcaría un anticuerpo quimérico típico como se ha definido anteriormente, por ejemplo, debido a que la región variable completa de un anticuerpo quimérico no es humana.

[0105] Como se usa en el presente documento, la expresión "cadena pesada modificada" se refiere a una proteína de fusión que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina, particularmente una cadena pesada de IgG1 humana o IgG2 humana, y un fragmento de anticuerpo funcional (por ejemplo, un Fab o scFv) o porción del mismo (por ejemplo, cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento Fd), en donde el fragmento o la porción del mismo se fusiona en su extremo N terminal, opcionalmente a través de un enlazador peptídico, al extremo C terminal de la cadena pesada.

[0107] El término inmunoglobulina "humanizada" se refiere a una inmunoglobulina que comprende una región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana, por ejemplo, de ratón, rata o conejo. La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina "aceptora". No es necesario que ha presentes regiones constantes, pero si las hay, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente un 85-90 %, preferentemente aproximadamente un 95 % o más idénticas. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR y posiblemente unos pocos restos de aminoácidos retromutados en la región marco (por ejemplo, 1-15 restos), son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de secuencias de inmunoglobulina humana natural. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una cadena ligera humanizada y una inmunoglobulina de cadena pesada humanizada.

[0108] Por ejemplo, un anticuerpo humanizado no abarcaría un anticuerpo quimérico típico como se ha definido anteriormente, por ejemplo, debido a que la región variable completa de un anticuerpo quimérico no es humana. Los términos "anticuerpo humano" y "anticuerpo totalmente humano" se refieren cada uno a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana, que incluye anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas; por ejemplo, anticuerpos Xenomouse y anticuerpos como se describen por Kucherlapati et al. en la patente de los EE. UU. N.º 5.939.598.

[0109] La expresión "anticuerpos genéticamente alterados" significa anticuerpos en donde la secuencia de aminoácidos ha variado con respecto a la de un anticuerpo nativo. Debido a la relevancia de las técnicas de ADN recombinante en la generación de anticuerpos, no se necesita estar confinado a las secuencias de aminoácidos descubiertas en los anticuerpos naturales; los anticuerpos pueden ser rediseñados para obtener características deseadas. Las posibles variaciones son muchas y varían de cambiar a sólo un aminoácido, o unos pocos, al rediseño completo de, por ejemplo, la región variable y/o constante. Los cambios en la región constante se harán, en general, para mejorar o alterar las características, tales como fijación del complemento, interacción con membranas y otras funciones efectoras. Los cambios en la región variable se realizarán con el fin de mejorar las características de unión a antígeno.

[0110] Un "fragmento Fab" se compone de una cadena ligera y las regiones C<H1>y variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula de Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una cadena pesada que contiene más de la región constante, entre los dominios C<H1>y C<H2>, de manera que se pueda formar un enlace disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas para formar una molécula de F(ab')<2>.

[0111] Un "fragmento F(ab')<2>" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios C<H1>y C<H2>, de manera que se pueda formar un enlace disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas.

[0112] La expresión "Fc nativo" se refiere a una molécula o secuencia que comprende la secuencia de un fragmento de no unión a antígeno resultante de la digestión del anticuerpo completo, ya sea en forma monomérica o multimérica. La fuente de inmunoglobulina original del Fc nativo es preferentemente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque se prefieren IgG1, IgG2 e IgG4. Los Fc nativos están compuestos por polipéptidos monoméricos que pueden unirse en formas diméricas o multiméricas mediante asociación covalente (es decir, enlaces disulfuro) y no covalente. El número de enlaces disulfuro intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas de Fc nativas varía de 1 a 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgE) o subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgGA2). Un ejemplo de un Fc nativo es un dímero unido a disulfuro resultante de la digestión con papaína de una IgG (véase Ellisonet al. (1982),Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). La expresión "Fc nativo", como se usa en el presente documento, es genérica para las formas monoméricas, diméricas y multiméricas.

[0113] La expresión "variante de Fc" se refiere a una molécula o secuencia que se modifica a partir de un Fc nativo pero que todavía comprende un sitio de unión para el receptor de rescate, FcRn. Las solicitudes internacionales WO 97/34631 (publicadas el 25 de septiembre de 1997) y WO 96/32478 describen variantes de Fc de ejemplo, así como la interacción con el receptor de rescate. Por lo tanto, la expresión "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que se humaniza a partir de un Fc nativo no humano. Además, un Fc nativo comprende sitios que pueden eliminarse porque proporcionan características estructurales o actividad biológica que no son necesarias para las moléculas de fusión de la presente invención. Por lo tanto, la expresión "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o restos Fc nativos que afectan o están implicados en (1) la formación de enlaces disulfuro, (2) la incompatibilidad con una célula hospedadora seleccionada, (3) la heterogeneidad N-terminal tras la expresión en una célula hospedadora seleccionada, (4) la glicosilación, (5) la interacción con el complemento, (6) la unión a un receptor Fc distinto de un receptor de rescate o (7) la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Se describen variantes de Fc con más detalle a continuación en el presente documento.

[0114] La expresión "dominio Fc" abarca moléculas y secuencias variantes de Fc y Fc nativas como se han definido anteriormente. Al igual que con las variantes de Fc y Fc nativas, la expresión "dominio Fc" incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sea digeridas a partir de anticuerpo completo o producidas por otros medios. El término "multímero", como se aplica a dominios Fc o moléculas que comprenden dominios Fc, se refiere a moléculas que tienen dos o más cadenas polipeptídicas asociadas de manera covalente, no covalente o por interacciones tanto covalentes como no covalentes. Las moléculas de IgG normalmente forman dímeros; IgM, pentámeros; IgD, dímeros; e IgA, monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. Los multímeros pueden formarse explotando la secuencia y la actividad resultante de la fuente de Ig nativa del Fc o derivatizando (como se define a continuación) un Fc nativo de este tipo.

[0115] El término "dímero", como se aplica a dominios Fc o moléculas que comprenden dominios Fc, se refiere a moléculas que tienen dos cadenas polipeptídicas asociadas de manera covalente o no covalente. Por lo tanto, los dímeros de ejemplo dentro del alcance de esta invención son como se muestran en la Figura 2.

[0117] Las expresiones "fragmento Fv" y "anticuerpo de cadena única" se refieren a polipéptidos que contienen regiones variables del anticuerpo de las cadenas tanto pesadas como ligeras, pero que carecen de regiones constantes. Al igual que un anticuerpo completo, es capaz de unirse selectivamente a un antígeno específico. Con un peso molecular de sólo aproximadamente 25 kDa, los fragmentos Fv son mucho más pequeños que los anticuerpos comunes (150-160 kD) que se componen de dos cadenas proteicas pesadas y dos cadenas ligeras, e incluso más pequeños que los fragmentos Fab (aproximadamente 50 kDa, una cadena ligera y la mitad de una cadena pesada).

[0118] Un "anticuerpo de dominio único" es un fragmento de anticuerpo que consiste en una única unidad de dominio Fv, por ejemplo, V<H>o V<L>. Al igual que un anticuerpo completo, es capaz de unirse selectivamente a un antígeno específico. Con un peso molecular de sólo 12-15 kDa, los anticuerpos de un solo dominio son mucho más pequeños que los anticuerpos comunes (150-160 kDa) que se componen de dos cadenas proteicas pesadas y dos cadenas ligeras, e incluso más pequeños que los fragmentos Fab (aproximadamente 50 kDa, una cadena ligera y la mitad de una cadena pesada) y fragmentos variables de cadena única (aproximadamente 25 kDa, dos dominios variables, uno de una cadena ligera y uno de una cadena pesada). Los primeros anticuerpos de un solo dominio se modificaron por ingeniería genética a partir de anticuerpos de cadena pesada encontrados en camélidos. Aunque la mayoría de las investigaciones sobre anticuerpos de dominio único se basan actualmente en dominios variables de cadena pesada, también se ha demostrado que los dominios variables de cadena ligera y los nanocuerpos derivados de cadenas ligeras se unen específicamente a epítopos diana.

[0120] La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, no se limita a los anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridomas. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que deriva de un único clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o fago, y no al método mediante el cual se produce.

[0122] En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno anti-TL1A, la proteína de unión a antígeno biespecífico o el fragmento funcional de cualquiera de las mismas de los que deriva el dominio de unión anti-TL1A inhibe selectivamente el TL1A humano con respecto a los ligandos de la superfamilia de TNF. Un anticuerpo o fragmento funcional del mismo "inhibe selectivamente" un receptor o ligando específico con respecto a otros receptores o ligandos cuando la CI50 del anticuerpo en un ensayo de inhibición del receptor específico es al menos 50 veces menor que la CI50 en un ensayo de inhibición de otro ligando o receptor de "referencia". Una "CI50" es la dosis/concentración requerida para conseguir un 50 % de inhibición de una función biológica o bioquímica. Con ligandos radiactivos, la CI50 es la concentración de un ligando competidor que desplaza el 50 % de la unión específica del ligando radiactivo. La CI50 de cualquier sustancia o antagonista particular puede determinarse construyendo una curva de dosis-respuesta y examinando el efecto de diferentes concentraciones del fármaco o antagonista sobre la inversión de la actividad agonista en un ensayo funcional particular. Los valores de CI50 pueden calcularse para un antagonista o fármaco dado determinando la concentración necesaria para inhibir la mitad de la respuesta biológica máxima del agonista. Por lo tanto, el valor de CI50 para cualquier anticuerpo anti-TL1A o fragmento funcional del mismo puede calcularse determinando la concentración del anticuerpo o fragmento necesaria para inhibir la mitad de la respuesta biológica máxima de TL1A en la activación del receptor de TL1A humano en cualquier ensayo funcional, tal como el ensayo descrito en el Ejemplo 14 a continuación en el presente documento. Se entiende que un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que inhibe selectivamente un ligando o receptor específico es un anticuerpo neutralizante o fragmento neutralizante con respecto a ese ligando o receptor. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el anticuerpo anti-TL1A o fragmento funcional del mismo del que deriva el dominio de unión anti-TL1A de las proteínas de unión a antígeno biespecíficas de la invención es un anticuerpo neutralizante o fragmento de TL1A humano.

[0124] Las regiones variables o regiones CDR de cualquier anticuerpo anti-TL1A o fragmento funcional del mismo pueden usarse para construir la entidad de unión anti-TL1A de cualquiera de las proteínas de unión a antígeno biespecíficas descritas en el presente documento. Análogamente, las regiones variables o secuencias de CDR de cualquier anticuerpo anti-TNF-α o fragmento funcional del mismo pueden usarse para construir la entidad de unión anti-TNF-α de cualquiera de las proteínas de unión a antígeno biespecíficas descritas en el presente documento. Por ejemplo, el dominio de unión anti-TL1A de las proteínas de unión a antígeno biespecíficas de la invención puede comprender regiones VH y/o VL o una o más CDR de cualquiera de los anticuerpos anti-TL1A humano descritos en la Pat. de los EE. UU: N.º 7.820.798; la Solicitud de Pat. de los EE. UU.2008/0003221; la Pat. de los EE. UU. N.º 8.263.743; la Solicitud de Pat. de los EE. UU.2011/0217310; la Solicitud de Pat. de los EE. UU.2012/0263718; la Solicitud de Pat. de los EE. UU.2014/0308271; el documento WO 2012/161856; el documento WO 2013/044298; el documento WO 2005/018571; la Solicitud de Pat. de los EE. UU. 2014/0120109; la Solicitud de Pat. de los EE. UU. 6.521.422; la Solicitud de Pat. de los EE. UU. 2014/0255302; y la Solicitud de Pat. de los EE. UU.

[0125] 2015/0132311 En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-TL1A del que deriva la entidad de unión anti-TL1A bloquea de forma cruzada uno o más de los anticuerpos anti-TL1A humanos descritos en una de las referencias que se acaban de mencionar o uno o más de los anticuerpos anti-TL1A humanos que se describen a continuación.

[0126] Las expresiones "bloqueo cruzado", "bloqueado de forma cruzada" y "bloqueo de forma cruzada" se usan indistintamente en el presente documento para indicar la capacidad de un anticuerpo para interferir con la unión de otros anticuerpos o fragmentos de unión a una diana (por ejemplo, TL1A humano). La medida en que un anticuerpo o fragmento de unión es capaz de interferir con la unión de otro a una diana (por ejemplo, TL1A humano) y, por lo tanto, si se puede decir que bloquea de forma cruzada, puede determinarse usando ensayos de unión competitiva. En algunas realizaciones, un anticuerpo de bloqueo cruzado o fragmento de unión del mismo reduce la unión a TL1A humano de un anticuerpo de referencia entre aproximadamente el 40 % y el 100 %, tal como aproximadamente el 60 % y aproximadamente el 100 %, específicamente preferentemente entre aproximadamente el 70 % y el 100 %, y más específicamente preferentemente entre aproximadamente el 80 % y el 100 %. Un ensayo cuantitativo particularmente adecuado para detectar el bloqueo cruzado usa una máquina Biacore que mide el alcance de las interacciones usando la tecnología de resonancia de plasmón superficial. Otro ensayo de bloqueo cruzado cuantitativo adecuado usa un enfoque basado en FACS para medir la competencia entre anticuerpos en términos de su unión a TL1A humano. Un ensayo de ejemplo con respecto a dicho bloqueo cruzado aparece en la Solicitud de Pat. de los EE. UU.2015/0132311, ejemplo 2, párrafos [0922]-[0924],

[0127] La expresión "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquiera de ligadura, escisión, acción de endonucleasa y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas de monómeros que son nucleótidos de origen natural (tales como ADN y ARN) o análogos de nucleótidos de origen natural (por ejemplo, formas alfa-enantioméricas de nucleótidos de origen natural), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcar y/o en restos de base de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcar incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o azúcares que pueden funcionalizarse como éteres o ésteres. Además, todo el resto de azúcar puede reemplazarse por estructuras estérica y electrónicamente similares, tales como azaazúcares y análogos de azúcar carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en un resto base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden unirse mediante enlaces fosfodiéster o análogos de dichas uniones. Los análogos de uniones fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares. La expresión "molécula de ácido nucleico" también incluye los denominados "ácidos nucleicos peptídicos", que comprenden bases de ácido nucleico de origen natural o modificadas unidas a una cadena principal de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.

[0129] La expresión "complemento de una molécula de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria y orientación inversa en comparación con una secuencia de nucleótidos de referencia.

[0131] La expresión "secuencia de nucleótidos degenerada" indica una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados en comparación con una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido. Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo resto de aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC codifican cada uno Asp).

[0133] Una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que se ha separado del ADN genómico de una célula es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico sintetizada químicamente que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que se ha aislado de una especie particular es más pequeña que la molécula de ADN completa de un cromosoma de esa especie

[0135] Una "construcción de molécula de ácido nucleico" es una molécula de ácido nucleico, ya sea monocatenaria o bicatenaria, que se ha modificado mediante la intervención humana para contener segmentos de ácido nucleico combinados y yuxtapuestos en una disposición no existente en la naturaleza

[0137] "ADN complementario (ADNc)" es una molécula de ADN monocatenario que se forma a partir de un molde de ARNm por la enzima transcriptasa inversa. Normalmente, se emplea un cebador complementario a porciones de ARNm para el inicio de la transcripción inversa. Los expertos en la materia también usan el término "ADNc" para referirse a una molécula de ADN bicatenario que consiste en dicha molécula de ADN monocatenario y su cadena de ADN complementaria. El término "ADNc" también se refiere a un clon de una molécula de ADNc sintetizada a partir de un molde de ARN.

[0139] Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. Normalmente, un promotor está ubicado en la región no codificante 5' de un gen, proximal al sitio de inicio de la transcripción de un gen estructural. Los elementos de secuencia dentro de los promotores que actúan en el inicio de la transcripción con frecuencia se caracterizan por secuencias de nucleótidos consenso. Estos elementos promotores incluyen sitios de unión a ARN polimerasa, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos específicos de diferenciación (DSE; McGeheeet al.,Mol. Endocrinol., 7:551 (1993)), elementos de respuesta de AMP cíclico (CRE), elementos de respuesta de suero (SRE; Treisman,Seminars in Cancer Biol., 1:47 (1990)), elementos de respuesta a glucocorticoides (GRE) y sitios de unión para otros factores de transcripción, tales como CRE/ATF (O'Reillyet al.,J. Biol. Chem., 267:19938 (1992)), AP2 (Yeet al.,J. Biol. Chem., 269:25728 (1994)), SP1, proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc (CREB; Loeken,Gene Expr., 3:253 (1993)) y factores octaméricos (véase, en general, Watsonet al., eds.,Molecular Biology of the Gene, 4.ª edición, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1987), y Lemaigreet al.,Biochem. J., 303:1 (1994)). Si un promotor es un promotor inducible, entonces la tasa de transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor. Por el contrario, la tasa de transcripción no está regulada por un agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo. También se conocen promotores reprimibles.

[0140] Un "elemento regulador" es una secuencia de nucleótidos que modula la actividad de un promotor central. Por ejemplo, un elemento regulador puede contener una secuencia de nucleótidos que se une a factores celulares que permiten la transcripción exclusiva o preferentemente en células, tejidos u orgánulos particulares. Estos tipos de elementos reguladores se asocian normalmente a genes que se expresan de una manera "específica de célula", "específica de tejido" o "específica de orgánulo".

[0141] Un "potenciador" es un tipo de elemento regulador que puede aumentar la eficacia de la transcripción, independientemente de la distancia u orientación del potenciador con respecto al sitio de inicio de la transcripción. "ADN heterólogo" se refiere a una molécula de ADN, o una población de moléculas de ADN, que no existe de forma natural dentro de una célula hospedadora dada. Las moléculas de ADN heterólogas a una célula hospedadora particular pueden contener ADN derivado de la especie de célula hospedadora (es decir, ADN endógeno) siempre que ese ADN hospedador se combine con ADN no hospedador (es decir, ADN exógeno). Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN no hospedador que codifica un polipéptido unido operativamente a un segmento de ADN hospedador que comprende un promotor de la transcripción se considera una molécula de ADN heteróloga. A la inversa, una molécula de ADN heteróloga puede comprender un gen endógeno unido operativamente con un promotor exógeno. Como otra ilustración, una molécula de ADN que comprende un gen derivado de una célula de tipo silvestre se considera ADN heterólogo si esa molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen de tipo silvestre.

[0142] Un "vector de expresión" es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula hospedadora. Normalmente, un vector de expresión comprende un promotor de la transcripción, un gen y un terminador de la transcripción. La expresión génica se coloca por lo general bajo el control de un promotor, y se dice que dicho gen está "unido operativamente a" el promotor. De manera similar, un elemento regulador y un promotor central están unidos operativamente si el elemento regulador modula la actividad del promotor central. Un "hospedador recombinante" es una célula que contiene una molécula de ácido nucleico heteróloga, tal como un vector de clonación o vector de expresión. En el presente contexto, un ejemplo de un hospedador recombinante es una célula que produce un antagonista de la presente invención a partir de un vector de expresión. Por el contrario, un antagonista de este tipo puede ser producido por una célula que es una "fuente natural" de dicho antagonista, y que carece de un vector de expresión.

[0143] Las expresiones "amino-terminal" y "carboxilo-terminal" se usan en el presente documento para indicar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estos términos se usan con referencia a una secuencia o porción particular de un polipéptido para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una determinada secuencia posicionada en el extremo carboxilo con respecto a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido está ubicada cerca del extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.

[0144] Una "proteína de fusión" es una proteína híbrida expresada por una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos de al menos dos genes. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender al menos parte de un polipéptido IL-17RA fusionado con un polipéptido que se une a una matriz de afinidad. Una proteína de fusión de este tipo proporciona un medio para aislar grandes cantidades de IL-17A usando cromatografía de afinidad.

[0145] El término "receptor" indica una proteína asociada a células que se une a una molécula bioactiva denominada "ligando". Esta interacción media el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores pueden estar unidos a membrana, ser citosólicos o nucleares; monoméricos (por ejemplo, receptor de la hormona estimulante de la tiroides, receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (por ejemplo, receptor de PDGF, receptor de la hormona del crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6). Los receptores unidos a membrana se caracterizan por una estructura de múltiples dominios que comprende un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio efector intracelular que normalmente está implicado en la transducción de señales. En determinados receptores unidos a membrana, el dominio de unión a ligando extracelular y el dominio efector intracelular están ubicados en polipéptidos separados que comprenden el receptor funcional completo. En general, la unión del ligando al receptor da como resultado un cambio conformacional en el receptor que provoca una interacción entre el dominio efector y otra molécula o moléculas en la célula, lo que a su vez conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos que con frecuencia están ligados a las interacciones receptor-ligando incluyen transcripción génica, fosforilación, desfosforilación, aumentos en la producción de AMP cíclico, movilización de calcio celular, movilización de lípidos de membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos.

[0146] El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión implica la transcripción del gen estructural en ARNm y la traducción de ARNm en uno o más polipéptidos.

[0147] La expresión "par complemento/anticomplemento" indica restos no idénticos que forman un par estable asociado de forma no covalente en condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de un par complemento/anticomplemento. Otros pares complemento/anticomplemento ilustrativos incluyen pares receptor/ligando, pares anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítopo), pares de polinucleótidos sentido/antisentido y similares. Cuando es deseable la disociación posterior del par complemento/anticomplemento, el par complemento/anticomplemento tiene preferentemente una afinidad de unión inferior a 10<9>M<-1>.

[0148] Un "marcador detectable" es una molécula o átomo que puede conjugarse con un resto de anticuerpo para producir una molécula útil para el diagnóstico. Los ejemplos de marcadores detectables incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos u otros restos marcadores.

[0149] La expresión "marcador de afinidad" se usa en el presente documento para indicar un segmento polipeptídico que puede unirse a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o detección del segundo polipéptido o proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, puede usarse cualquier péptido o proteína para el que esté disponible un anticuerpo u otro agente de unión específico como un marcador de afinidad. Los marcadores de afinidad incluyen un tracto de polihistidina, proteína A (Nilssonet al.,EMBO J., 4:1075 (1985); Nilssonet al.,Methods Enzymol., 198:3 (1991)), glutatión S transferasa (Smithet al.,Gene, 67:31 (1988)), marcador de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyeret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7952 (1985)), sustancia P, péptido FLAG<®>(Hoppet al.,Biotechnology, 6:1204 (1988)), péptido de unión a estreptavidina u otro epítopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Fordet al.,Protein Expression and Purification, 2:95 (1991). Las moléculas de ADN que codifican marcadores de afinidad están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.).

[0150] La expresión "resto ácido" se refiere a restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales que comprenden grupos ácidos. Los restos ácidos de ejemplo incluyen D y E.

[0151] La expresión "resto amida" se refiere a aminoácidos que tienen cadenas laterales que comprenden derivados de amida de grupos ácidos. Los restos de ejemplo incluyen N y Q.

[0152] La expresión "resto aromático" se refiere a restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales que comprenden grupos aromáticos. Los restos aromáticos de ejemplo incluyen F, Y y W.

[0153] La expresión "resto básico" se refiere a restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales que comprenden grupos básicos. Los restos básicos de ejemplo incluyen H, K y R.

[0154] La expresión "resto hidrófilos" se refiere a restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales que comprenden grupos polares. Los restos hidrófilos de ejemplo incluyen C, S, T, N y Q.

[0155] La expresión "resto no funcional" se refiere a restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales que carecen de grupos ácidos, básicos o aromáticos. Los restos de aminoácidos no funcionales de ejemplo incluyen M, G, A, V, I, L y norleucina (Nle).

[0156] Tanto el índice EU como Kabatet al. (1991),Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.ª Ed. Servicio de Salud Pública, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD como los esquemas de numeración AHo (Honegger y Plückthun (2001),J Mol Biol. 8;309(3): 657-70) pueden usarse en la presente invención. Las posiciones de aminoácidos y las CDR y FR de un anticuerpo determinado pueden identificarse usando cualquiera de los dos sistemas. Por ejemplo, las posiciones de la cadena pesada de EU 39, 44, 183, 356, 357, 370, 392, 399 y 409 son equivalentes a las posiciones de la cadena pesada de AHo 46, 51, 230, 484, 485, 501, 528, 535 y 551, respectivamente. De manera similar, las posiciones de la cadena ligera de EU 38, 100 y 176 son equivalentes a las posiciones de la cadena ligera de AHo 46141 y 230, respectivamente. Las tablas (i), (ii) y (iii) a continuación demuestran la equivalencia entre las posiciones de numeración para las versiones v1, v2 y v3 de las posiciones de carga para ayudar al correcto ensamblaje de, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno biespecíficas IgG-Fab.

[0157] Tabla (i)- v1

[0160]

[0162] Tabla (ii) - v2

[0164]

[0166] Tabla (iii) - v3

[0168]

[0170] La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Los formatos de proteína de unión a antígeno biespecífica no están cubiertos por las reivindicaciones.

[0171] Un aspecto de la invención se refiere a proteínas y anticuerpos de unión a antígeno específicos de TL1A novedosos. Dichos anticuerpos son útiles para tratar afecciones conocidas en la técnica y que se describen a continuación en el presente documento que son susceptibles de tratamiento mediante la inhibición de la actividad biológica de TL1A, como se define en las reivindicaciones. Otro aspecto no cubierto por las reivindicaciones se refiere a proteínas de unión a antígeno biespecíficas en las que un par cadena ligera-cadena pesada se une específicamente a TL1A y otro par cadena ligera-cadena pesada se une a TNF-α. Dichas proteínas de unión a antígeno biespecíficas pueden ser anticuerpos completos (véase la Figura 1) o fragmentos F(ab')<2>. En este aspecto, la entidad de unión a TL1A es monovalente para TL1A y la entidad de unión a TNF-α es monovalente para TNF-α.

[0172] En otro aspecto de proteína de unión a antígeno biespecífica, la entidad de unión a TL1A y la entidad de unión a TNF-α se disponen en una estructura global denominada en el presente documento IgG-scFv. En esta realización, una primera entidad de unión tiene la estructura de un anticuerpo, es decir, dos pares de cadenas de inmunoglobulina, teniendo cada par una cadena ligera y una cadena pesada. Una segunda entidad de unión comprende la estructura de un par unidades Fv, es decir, cada miembro del par tiene un dominio variable de una cadena pesada y un dominio variable de una cadena ligera unida en tándem como una cadena única. En la configuración IgG-scFv, cada unidad de Fv está unida de forma covalente al extremo C de un dominio constante de cadena pesada (Fc) de la primera entidad de unión (véase la Figura 2). Cada unidad Fv puede unirse al dominio Fc de la primera entidad de unión directamente o a través de un enlazador. En esta realización de la invención, cada entidad de unión es bivalente para su antígeno diana. En una realización preferida, la entidad de unión a TL1A tiene la estructura de un anticuerpo y la entidad de unión a TNF-α tiene la estructura de un par unidades Fv. Un aspecto adicional no cubierto por las reivindicaciones se refiere a anticuerpos biespecíficos con mutaciones para ayudar al emparejamiento correcto de cadena pesada-pesada y pesada-ligera. Dichas mutaciones se describen en los documentos US 8.592.562; WO 2009/089004; WO 2006/106905; WO 2014/4082179; WO 2014/081955; Speisset al.,Mol. Immunol. (2015), http://dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003.

[0173] No está cubierta por las reivindicaciones una entidad de unión a TL1A y una entidad de unión a TNF-α dispuestas en otros formatos de proteína de unión a antígeno biespecífica conocidos en la técnica. Específicamente, la invención se refiere a las entidades de unión a TL1A y TNF-α en los formatos descritos en: el documento WO 2014/159725; el documento WO 2013/041687; la Pat. de los EE. UU. N.º 8.945.553; la Pat. de los EE. UU. N.º 8.945.553; la Pat. de los EE. UU. N.º 8.258.268; la Solicitud de Pat. de los EE. UU. N.º 2012/ 0195900; la solicitud de patente internacional WO 2012/088302; la Solicitud prov. de los EE. UU. 62/218,977; Fischer y Leger (2007),Pathobiology74:3-14;_van Sprielet al. (2000),Immunology Today21(8): 391-7; Kuferet al. (2004),Trends in Biotechnology22(5): 238-44; Byrneet al. (2013),Trends in Biotechnology31(11): 621-31; Muller y Kontermann (2010),Biodrugs24(2): 89-98; Chames y Baty (2009), http://dx.doi.org/10.4161/mabs.1.6.10015; Kontermann (2012), http://dx.doi.org/10.4161/mabs.4.2.19000; Holligeret al. (1993),Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-8; Speisset al.,Mol. Immunol. (2015), http://dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003; el documento WO 2009/089004, publicado el 16 de julio de 2009; Holligeret al. (1993),Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-8; Speisset al.,Mol. Immunol. (2015), http://dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003; Ridgwayet al., (1996),Protein Eng.

[0174] 9: 617; Gunasekaranet al. (2010),J. Biol. Chem. 285:19637; Davis (2010),Protein Eng. Des. & Sel.23:195; DiGiammarinoet al. (2012),Methods Mol. Biol. 899:145, 2012); Lindhoferet al. (1995),J. Immunol. 155: 219: Schaeferet al. (2011),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108: 11187; Regula et al., Solicitud de Patente de los EE. UU. N.º: 2010/0322934; Bostromet al. (2009),Science323:1610; Solicitud de Pat. de los EE. UU. N.º 2011/0076722; Rossiet al. (2008),Cancer Res.68:8384.

[0175] Realizaciones preferidas

[0176] La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de unión a antígeno y entidades de unión se basan preferentemente en las secuencias de anticuerpos monoclonales humanos y/o humanizados contra TL1A. La invención también comprende secuencias que tienen al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con las secuencias preferidas que se exponen a continuación en el presente documento. Las secuencias de aminoácidos que se muestran en las siguientes tablas se prefieren para las proteínas de unión a antígeno de esta invención, incluyendo las proteínas de unión a antígeno biespecíficas en cualquier formato.

[0177] Proteínas de unión a antígeno específicas de TL1A

[0178] Las proteínas de unión a antígeno específicas de TL1A y las entidades de unión a antígeno comprenden preferentemente las secuencias de la región determinante de la complementariedad (CDR) derivadas de anticuerpos contra TL1A preferidos divulgados en el presente documento. La Tabla A muestra las secuencias de CDR preferidas, junto con los anticuerpos preferidos de los que derivaron. A lo largo de todo el documento, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 se refieren a las CDR de cadena ligera; HCDR1, HCDR2 y HCDR3 a las CDR de cadena pesada. A lo largo de todo el documento, el número de identificación de secuencia (SEQ ID NO) para cada secuencia aparece entre paréntesis después de la secuencia en la tabla.

[0179] Tabla A: Secuencias de CDR de unión a TL1A preferidas

[0181]

[0182]

[0183]

[0185] Cada una de las secuencias anteriores está codificada por la secuencia de ácido nucleico que la precede inmediatamente en el Listado de Secuencias. A lo largo de todo el documento, se prefieren las secuencias de los anticuerpos 9C8 y 3B3.

[0186] En las proteínas de unión a antígeno de esta invención, es preferible evitar sitios de isomerización. Las secuencias de dos aminoácidos DG, DH, DS y DT son sitios de isomerización conocidos. La presente invención también se refiere a proteínas de unión a antígeno en las que las secuencias de anticuerpos de origen, incluyendo las secuencias de CDR, se modifican para eliminar sitios de isomerización. Con esa consideración, la invención se refiere a proteínas de unión a antígeno en donde HCDR2 es una forma modificada de la HCDR2 del anticuerpo de origen 3C6 que tiene la secuencia VISYDXNNKLYTDXVKG (SEQ ID NO: 204) en donde cada X es independientemente un resto distinto de G, H, S o T (es decir, A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W o Y), prefiriéndose A. La invención se refiere además a proteínas de unión a antígeno en las que HCDR2 es una forma modificada de la HCDR2 del anticuerpo de origen 3C6 en la que el resto ácido D se reemplaza por E para eliminar los sitios de isomerización, dando como resultado la secuencia VISYEGNNKLYTESVKG (SEQ ID NO: 678). La invención se refiere además a proteínas de unión a antígeno en donde HCDR3 es una forma modificada de HCDR3 del anticuerpo de origen 23B3 que tiene la secuencia EDGDXYYRYGMDV (SEQ ID NO: 676). La invención se refiere además a proteínas de unión a antígeno en donde el sitio de isomerización de HCDR3 del anticuerpo de origen 23B3 se elimina reemplazando el resto ácido D por E, dando como resultado la secuencia EEGESYYRYGMDV (SEQ ID NO: 657).

[0187] En las proteínas de unión a antígeno de esta invención, es preferible evitar sitios de desamidación. Las secuencias de dos aminoácidos NG, NH, NS y NT son sitios de desamidación conocidos. La presente invención también se refiere a proteínas de unión a antígeno en las que las secuencias de anticuerpos de origen, incluyendo las secuencias de CDR, se modifican para eliminar sitios de desamidación. Una forma de eliminar los sitios de desamidación es reemplazar el segundo resto de aminoácido en los sitios NG, NH, NS y NT con un resto distinto de G, H, S o T (es decir, A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W o Y). Una manera preferida de eliminar los sitios de desamidación es reemplazar el N en NG, NH, NS y NT por Q. Con esa consideración, la invención se refiere a proteínas de unión a antígeno que tienen las siguientes secuencias además de las enumeradas en la Tabla A: LCDR3 puede tener la secuencia LQHQSYPPT (SEQ ID NO: 631) basada en la modificación de la secuencia del anticuerpo de origen 3C6;

[0188] HCDR1 puede tener la secuencia TQSVAWN (SEQ ID NO: 632) basada en la modificación de la secuencia del anticuerpo de origen 23B3 VH4;

[0189] HCDR2 puede tener las secuencias YIYYSGQTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 633) o EIQHAGQTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 677) basadas en la modificación de las secuencias de los anticuerpos de origen 9C8 y 3B3, respectivamente. Las proteínas de unión a antígeno de esta invención pueden ser resultado además de la sustitución de un resto ácido por otro resto ácido, un resto amida por otro resto amida, y asimismo por restos aromáticos, restos básicos, restos hidrófilos, restos no funcionales, restos polares neutros y restos hidrófobos polares. Dichas sustituciones de restos no funcionales de las CDR de anticuerpos de origen dan como resultado las secuencias de la invención que se muestran en la Tabla B, en donde cada X es independientemente M, G, A, V, I o L.

[0190] Tabla B: Secuencias de CDR de unión a TL1A con sustituciones

[0191]

[0192]

[0193]

[0194]

[0195]

[0196]

[0198] También se prefieren proteínas de unión a antígeno que comprenden las secuencias de la estirpe germinal de CDR relacionadas con los anticuerpos que se muestran en la Tabla A. Dichas secuencias se muestran en la Tabla C.

[0199] Tabla C: Secuencias de CDR de estirpe germinal relacionadas de anticuerpos anti-TL1A

[0200]

[0201]

[0202]

[0203]

[0206] Se prefieren además proteínas de unión a antígeno que comprendan las secuencias de dominio variable de los anticuerpos anti-TL1A preferidos, como se muestra en la Tabla D. A lo largo de todo el documento, "VH", como se muestra en la Tabla D, se refiere al dominio variable de la cadena pesada, "VL" al de la cadena ligera. Las moléculas dentro de esta invención pueden incorporar modificaciones a las secuencias que se muestran en la Tabla D, incluyendo truncamientos o sustituciones para la estabilidad u otra funcionalidad o la eliminación de puntos calientes (modificación química o física de aminoácidos). También se incluyen en la invención moléculas que tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia con las secuencias que se muestran en la Tabla D.

[0208] Tabla D: Secuencias de dominio variable de anticuerpos anti-TL1A preferidos

[0210]

[0211]

[0212]

[0213]

[0216] Cada uno de los polipéptidos anteriores está codificado por un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que precede inmediatamente a la secuencia polipeptídica en el Listado de secuencias. Se prefieren las secuencias de los anticuerpos 9C8 y 3B3.

[0217] Se prefieren las secuencias de anticuerpo anti-TL1A completas que se muestran en la Tabla E para los anticuerpos anti-TL1A. LC se refiere a la cadena ligera de anticuerpo, HC a la cadena pesada. En la invención también se incluyen moléculas que tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia con una o ambas de las secuencias de cadena ligera y cadena pesada en la Tabla E.

[0218] Tabla E: Anticuerpos anti-TL1A preferidos

[0220]

[0222] Cada una de las secuencias de aminoácidos de la Tabla E está codificada por la secuencia de ácido nucleico que la precede inmediatamente en el Listado de Secuencias. Se prefieren las secuencias de los anticuerpos 9C8 y 3B3.

[0223] Las proteínas antigénicas biespecíficas no están cubiertas por las reivindicaciones

[0224] Afinidad de unión y actividad biológica

[0225] En otra realización de los aspectos anteriores de la invención, un anticuerpo anti-TL1A (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se une a TL1A con una afinidad de unión (K<D1>) de al menos 1 x 10<-10>M<-1>, al menos 5 x 10-10 M<-1>, al menos 1 x 10<-10>M -1, al menos 5 x 10<-10>M<-1>, al menos 8 x 10<-10>M<-1>o al menos 1 x 10<-10>M<-1>en donde la afinidad de unión se mide mediante resonancia de plasmón superficial, tal como Biacore. Más particularmente, la invención se refiere a las siguientes realizaciones:

[0226] un anticuerpo anti-TL1A (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se une a TL1A humano cuando el anticuerpo se inmoviliza en un chip sensor SCM5 con una afinidad de unión de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 kD pM o a TL1A de macaco cangrejero cuando el anticuerpo se inmoviliza en un chip sensor SCM5 con una afinidad de unión de aproximadamente 1<-10>a aproximadamente 7,5 -10 M -1 KD;

[0227] Más detalles sobre TL1A y unión aparecen en los Ejemplos 13 y 15 a continuación en el presente documento. En otras realizaciones de los aspectos anteriores de la invención:

[0228] un anticuerpo anti-TL1A (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) neutraliza o inhibe el TL1A humano en una estirpe celular indicadora TF-1 NF-κB con una CI<50>de aproximadamente 0,08 a aproximadamente 3 nM, TL1A TL1A de macaco cangrejero en una estirpe celular indicadora TF-1 NF-κB con una CI<50>de aproximadamente 0,375 a aproximadamente 10 nM;

[0229] Más detalles sobre la inhibición de TL1A aparecen en los Ejemplos 14 y 16 a continuación en el presente documento. Los anticuerpos biespecíficos no están cubiertos por las reivindicaciones.

[0230] Inmunoconjugados, derivados, variantes

[0231] Los anticuerpos de la invención pueden usarse solos o como inmunoconjugados con un agente terapéutico (por ejemplo, un agente citotóxico). En algunas realizaciones, el agente es un agente quimioterápico. En algunas realizaciones, el agente es un radioisótopo, que incluye, pero sin limitación, Plomo-212, Bismuto-212, Astatina-211, Yodo-131, Escandio-47, Renio-186, Renio-188, Ytrio-90, Yodo-123, Yodo-125, Bromo-77, Yndio-111 y núclidos fisionables tales como Boro-10 o un Actínido. En otras realizaciones, el agente es una toxina o fármaco citotóxico, incluyendo, pero sin limitación, ricina, abrina, enterotoxina A de Pseudomonas modificada, exotoxina de Pseudomonas, caliqueamicina, adriamicina, 5-fluorouracilo, toxina diftérica y similares. Los métodos de conjugación de anticuerpos con dichos agentes son conocidos en la bibliografía, e incluyen conjugación directa e indirecta.

[0232] Las moléculas detectables adecuadas pueden unirse directa o indirectamente a los anticuerpos y anticuerpos biespecíficos de la presente invención. Las moléculas detectables adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Para la unión indirecta de una molécula detectable o citotóxica, la molécula detectable o citotóxica puede conjugarse con un miembro de un par complementario/anticomplementario, donde el otro miembro está unido al polipéptido de unión o porción de anticuerpo. Para estos fines, biotina/estreptavidina es un par complementario/anticomplementario de ejemplo.

[0233] Los anticuerpos de la invención también incluyen derivados que se modifican, por ejemplo, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de modo que la unión covalente no evite que el anticuerpo se una a su epítopo. Los ejemplos de derivados adecuados incluyen, pero sin limitación, anticuerpos o anticuerpos biespecíficos que están fucosilados, glicosilados, acetilados, pegilados, fosforilados o amidados. Los anticuerpos y derivados de los mismos de la invención pueden derivatizarse por sí mismos mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otras proteínas, y similares. En algunas realizaciones de la invención, al menos una cadena pesada del anticuerpo o proteína de unión a antígeno biespecífica está PEGilada. En algunas realizaciones, la PEGilación está unida a N o está unida a través de la cadena lateral de un aminoácido (por ejemplo, lisina).

[0234] La glicosilación puede contribuir a la función efectora de los anticuerpos, particularmente los anticuerpos IgG1. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno de la invención pueden comprender una o más sustituciones de aminoácidos que afectan al nivel o tipo de glicosilación de las proteínas de unión. La glicosilación de polipéptidos normalmente es unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la fijación del resto carbohidrato a la cadena lateral de un resto asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina son las secuencias de reconocimiento para la fijación enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación unida a O se refiere a la fijación de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, mucho más habitualmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

[0235] En determinadas realizaciones, la glicosilación de las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento aumenta al añadir uno o más sitios de glicosilación, por ejemplo, a la región Fc de la proteína de unión. La adición de sitios de glicosilación a la proteína de unión a antígeno puede realizarse convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación unida a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición o sustitución de uno o más restos de serina o treonina a la secuencia de partida (para los sitios de glicosilación unida a O). Para mayor facilidad, la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión a antígeno puede alterarse a través de cambios a nivel del ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido diana en bases preseleccionadas de manera que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

[0237] La invención también abarca la producción de proteínas de unión a antígeno biespecíficas con estructura de carbohidrato alterada que da como resultado una actividad efectora alterada, incluyendo proteínas de unión a antígeno con fucosilación ausente o reducida que muestran una actividad ADCC mejorada. Se conocen en la técnica diversos procedimientos para reducir o eliminar la fucosilación. Por ejemplo, la actividad efectora de ADCC está mediada por la unión de la molécula de anticuerpo al receptor FcγRIII, que se ha demostrado que depende de la estructura de carbohidratos de la glicosilación unida a N en el resto N297 del dominio CH2. Los anticuerpos no fucosilados se unen a este receptor con mayor afinidad y desencadenan funciones efectoras mediadas por FcyRIII de forma más eficaz que los anticuerpos fucosilados nativos. Por ejemplo, la producción recombinante de anticuerpo no fucosilado en células CHO en las que la enzima alfa-1,6-fucosil transferasa se ha eliminado da como resultado un anticuerpo con una actividad ADCC aumentada 100 veces (véase Yamane-Ohnukiet al.,Biotechnol Bioeng. 87(5):614-22, 2004). Se pueden lograr efectos similares disminuyendo la actividad de la enzima alfa-1,6-fucosil transferasa u otras enzimas en la vía de fucosilación, por ejemplo, mediante tratamiento con ARNip o ARN antisentido, mediante modificación por ingeniería genética de estirpes celulares para inactivar la enzima o enzimas, o mediante cultivo con inhibidores selectivos de la glicosilación (véase Rothmanet al.,Mol Immunol.26(12):1113-23, 1989). Algunas cepas de células hospedadoras, por ejemplo, la estirpe celular YB2/0 de hibridoma de rata o Lec13 producen de forma natural anticuerpos con niveles de fucosilación más bajos (véase Shieldset al.,J Biol Chem.277(30):26733-40, 2002 y Shinkawaet al.,J Biol Chem.278(5):3466-73, 2003). También se ha determinado que un aumento en el nivel de carbohidratos bisecados, por ejemplo, a través de la producción de anticuerpos de manera recombinante en células que sobreexpresan la enzima GnTIII, aumenta la actividad de ADCC (véase Umanaet al.,Nat Biotechnol.17(2):176-80, 1999).

[0239] En otras realizaciones, la glicosilación de las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento se reduce o se elimina eliminando uno o más sitios de glicosilación, por ejemplo, de la región Fc de la proteína de unión. Las sustituciones de aminoácidos que eliminan o alteran los sitios de glicosilación unida a N pueden reducir o eliminar la glicosilación unida a N de la proteína de unión a antígeno. En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno biespecíficas descritas en el presente documento comprenden una mutación en la posición N297 (numeración EU), tal como N297Q, N297A o N297G. En una realización particular, las proteínas de unión a antígeno biespecíficas de la invención comprenden una región Fc de un anticuerpo IgG1 humano con una mutación N297G. Para mejorar la estabilidad de moléculas que comprenden una mutación N297, la región Fc de las moléculas puede modificarse adicionalmente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, uno o más aminoácidos en la región Fc se sustituyen por cisteína para promover la formación de enlaces disulfuro en el estado dimérico. Los restos correspondientes a V259, A287, R292, V302, L306, V323 o I332 (numeración EU) de una región Fc de IgG1 pueden, por lo tanto, sustituirse por cisteína. En una realización, los pares específicos de restos se sustituyen por cisteína de manera que formen preferentemente un enlace disulfuro entre sí, limitando o evitando de este modo la desorganización del enlace disulfuro. En determinadas realizaciones, los pares incluyen, pero sin limitación, A287C y L306C, V259C y L306C, R292C y V302C, y V323C e I332C. En realizaciones particulares, las proteínas de unión a antígeno biespecíficas descritas en el presente documento comprenden una región Fc de un anticuerpo IgG1 humano con mutaciones en R292C y V302C. En dichas realizaciones, En dichas realizaciones, la región Fc también puede comprender una mutación N297G.

[0241] También pueden ser deseables modificaciones de las proteínas de unión a antígeno de la invención para aumentar la semivida en suero, por ejemplo, mediante la incorporación o la adición de un epítopo de unión al receptor de rescate (por ejemplo, mediante mutación de la región apropiada o mediante incorporación del epítopo en un marcador peptídico que después se fusiona con la proteína de unión a antígeno en cualquier extremo o en el medio, por ejemplo, mediante síntesis de ADN o péptido; véase, por ejemplo, el documento WO96/32478) o la adición de moléculas tales como PEG u otros polímeros solubles en agua, incluyendo polímeros de polisacáridos. El epítopo de unión al receptor de rescate constituye preferentemente una región en donde uno cualquiera o más restos de aminoácidos de uno o dos bucles de una región Fc se transfieren a una posición análoga en la proteína de unión a antígeno. En una realización, se transfieren tres o más restos de uno o dos bucles de la región Fc. En una realización, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, una región Fc de IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3 o VH, o más de una región de este tipo, de la proteína de unión a antígeno. Como alternativa, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región CL o región VL, o ambas, de la proteína de unión a antígeno. Véanse las solicitudes internacionales WO 97/34631 y WO 96/32478 para una descripción de variantes de Fc y su interacción con el receptor de rescate.

[0243] Los anticuerpos de la invención incluyen variantes que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o reemplazos de aminoácidos únicos o múltiples que conservan sus propiedades biológicas (por ejemplo, bloquear la unión de TL1A a sus respectivos receptores, inhibiendo la actividad biológica de TL1A). Un experto en la materia puede producir variantes que tengan sustituciones, deleciones, adiciones o reemplazos de aminoácidos únicos o múltiples. Estas variantes pueden incluir, entre otras cosas: (a) variantes en las que uno o más restos de aminoácidos están sustituidos con aminoácidos conservadores o no conservadores, (b) variantes en las que uno o más aminoácidos se añaden o suprimen del polipéptido, (c) variantes en las que uno o más aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, y (d) variantes en las que el polipéptido se fusiona con otro péptido o polipéptido tal como un compañero de fusión, un marcador proteico u otro resto químico, esto puede conferir propiedades útiles al polipéptido, tales como, por ejemplo, un epítopo para un anticuerpo, una secuencia de polihistidina, un resto de biotina y similares. Los anticuerpos y anticuerpos biespecíficos de la invención pueden incluir variantes en las que los restos de aminoácidos de una especie se sustituyen por el resto correspondiente en otra especie, ya sea en las posiciones conservadas o no conservadas. En otra realización, los restos de aminoácidos en posiciones no conservadas se sustituyen por restos conservadores o no conservadores. Las técnicas para obtener estas variantes, incluyendo técnicas genéticas (supresiones, deleciones, mutaciones, etc.), químicas y enzimáticas, son conocidas por la persona con experiencia habitual en la técnica.

[0245] Ácidos nucleicos, vectores, células hospedadoras

[0247] La invención también incluye ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos biespecíficos de la invención, que incluyen, por ejemplo, la cadena ligera, región variable de cadena ligera, región constante de cadena ligera, cadena pesada, región variable de cadena pesada, región constante de cadena pesada, enlazadores y todos y cada uno de los componentes y combinaciones de los mismos de los anticuerpos biespecíficos divulgados en el presente documento. Los ácidos nucleicos de la invención incluyen ácidos nucleicos que tienen al menos un 80 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 90 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 95 % y mucho más preferentemente al menos aproximadamente un 98 % de homología con ácidos nucleicos de la invención. Las expresiones "porcentaje de similitud", "porcentaje de identidad" y "porcentaje de homología" cuando se refieren a una secuencia particular se usan como se expone en el programa de software GCG<®>de la Universidad de Wisconsin. Los ácidos nucleicos de la invención también incluyen ácidos nucleicos complementarios. En algunos casos, las secuencias serán totalmente complementarias (sin emparejamientos erróneos) cuando estén alineadas. En otros casos, puede haber hasta aproximadamente un 20 % de emparejamientos erróneos en las secuencias. En algunas realizaciones de la invención se proporcionan ácidos nucleicos que codifican tanto una cadena pesada como una cadena ligera de un anticuerpo de la invención.

[0248] Los ácidos nucleicos de la invención se pueden clonar en un vector, tal como un plásmido, cósmido, bácmido, fago, cromosoma artificial (BAC, YAC) o virus, en el que puede insertarse otra secuencia o elemento genético (ya sea ADN o ARN) para provocar la replicación de la secuencia o elemento unido. En algunas realizaciones, el vector de expresión contiene un segmento promotor constitutivamente activo (tal como, pero sin limitación, secuencias de CMV, SV40, factor de elongación o LTR) o una secuencia promotora inducible tal como el vector pIND inducible por esteroides (Invitrogen), donde la expresión del ácido nucleico puede regularse. Los vectores de expresión de la invención pueden comprender además secuencias reguladoras, por ejemplo, un sitio de entrada ribosómico interno. El vector de expresión puede introducirse en una célula mediante transfección, por ejemplo.

[0250] En otra realización, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende los siguientes elementos unidos operativamente; un promotor de la transcripción; una primera molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de una proteína de unión a antígeno biespecífica, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención; una segunda molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de una proteína de unión a antígeno biespecífica, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención; y un terminador de la transcripción. En otra realización, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende los siguientes elementos unidos operativamente; un primer promotor de la transcripción; una primera molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada de una proteína de unión a antígeno biespecífica, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención; un primer terminador de la transcripción; un segundo promotor de la transcripción, una segunda molécula de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de una proteína de unión a antígeno biespecífica, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención; y un segundo terminador de la transcripción.

[0252] Una secuencia de péptido señal secretora también puede, opcionalmente, estar codificada por el vector de expresión, unida operativamente a la secuencia codificante de interés, de modo que el polipéptido expresado pueda ser secretado por la célula hospedadora recombinante, para facilitar el aislamiento del polipéptido de interés de la célula, si se desea. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las secuencias de péptidos señal pueden añadirse/fusionarse al extremo amino de cualquiera de las secuencias polipeptídicas enumeradas en las Tablas E, J, K y L. En determinadas realizaciones, un péptido señal que tiene la secuencia de aminoácidos de MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 499) se fusiona al extremo amino de cualquiera de las secuencias polipeptídicas de las Tablas D, I, J y K. En otras realizaciones, un péptido señal que tiene la secuencia de aminoácidos de METPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 501) se fusiona al extremo amino de cualquiera de las secuencias polipeptídicas de las Tablas E, J, K y L. En otras realizaciones más, un péptido señal que tiene la secuencia de aminoácidos de MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC (SEQ ID NO: 503) se fusiona con el extremo amino de cualquiera de las secuencias polipeptídicas de las Tablas E, J, K y L. Cada uno de los péptidos señal anteriores está codificado por el ácido nucleico que tiene una secuencia que lo precede inmediatamente en el Listado de Secuencias. Otras secuencias de péptidos señal adecuadas que pueden fusionarse al extremo amino terminal de las secuencias polipeptídicas descritas en el presente documento incluyen: MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 504), MEWTWRVLFLVAAATGAHS (SEQ ID NO: 505) y MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (SEQ ID NO: 506). Otros péptidos señal son conocidos por los expertos en la materia y pueden fusionarse con cualquiera de las cadenas polipeptídicas enumeradas en las Tablas E, J, K y L, por ejemplo, para facilitar u optimizar la expresión en células hospedadoras particulares.

[0254] También se proporcionan células hospedadoras recombinantes que comprenden dichos vectores y que expresan las cadenas pesada y ligera.

[0256] Las células productoras de anticuerpos y las células productoras de proteínas de unión a antígeno biespecíficas contienen, dependiendo del formato de proteína de unión a antígeno biespecífica, ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada, cadena ligera, construcción de cadena pesada-scFv, construcción de dominio variable de cadena pesada-cadena pesada de Fab y dominio variable de cadena ligera de Fab. Dichos ácidos nucleicos pueden usarse para producir los anticuerpos o anticuerpos biespecíficos de la invención de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica La presente invención, en una realización, proporciona un método para producir una proteína o anticuerpo de unión a antígeno biespecífico que comprende cultivar una célula hospedadora recombinante que expresa las cadenas pesada y ligera u otras construcciones indicadas anteriormente y aislar la proteína de unión a antígeno biespecífica o anticuerpo producido por la célula.

[0258] La célula hospedadora recombinante puede ser una célula procariota, por ejemplo, una célula de E. coli, o una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero o una célula de levadura. Las células de levadura incluyen células de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris. Las células de mamífero incluyen VERO, HeLa, ovario de hámster chino (CHO), W138, riñón de hámster bebé (BHK), COS-7, MDCK, estirpe de riñón embrionario humano 293, estirpes celulares de riñón de perro normal, estirpes celulares de riñón de gato normal, células de riñón de mono verde africano, células COS y células de mioblasto G8 de ratón no tumorigénicas, estirpes celulares de fibroblastos, estirpes celulares de mieloma, células NIH/3T3 de ratón, células LMTK31, células de sertoli de ratón, células de carcinoma cervical humano, células de hígado de rata búfalo, células de pulmón humanas, células de hígado humano, células tumorales mamarias de ratón, células TRI, células MRC 5 y células FS4. Las células productoras de proteínas de unión a antígeno biespecíficas y productoras de anticuerpos de la invención también incluyen cualquier estirpe celular de expresión de insectos conocida, tal como, por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda. En una realización preferida, las células son células de mamífero. En una realización más preferida, las células de mamífero son células CHO.

[0260] Las células productoras de anticuerpos están preferentemente sustancialmente exentas de competidores de unión a TL1A y TNF-α. En realizaciones preferidas, las células productoras de anticuerpos comprenden menos de aproximadamente el 10 %, preferentemente menos de aproximadamente el 5 %, más preferentemente menos de aproximadamente el 1 %, más preferentemente menos de aproximadamente el 0,5 %, más preferentemente menos de aproximadamente el 0,1 % y mucho más preferentemente el 0 % en peso de competidores de unión a TL1A o TNF-α. En algunas realizaciones, los anticuerpos y anticuerpos biespecíficos producidos están sustancialmente exentos de competidores de TL1A y TNF-α. En realizaciones preferidas, los anticuerpos y anticuerpos biespecíficos producidos comprenden menos de aproximadamente el 10 %, preferentemente menos de aproximadamente el 5 %, más preferentemente menos de aproximadamente el 1 %, más preferentemente menos de aproximadamente el 0,5 %, más preferentemente menos de aproximadamente el 0,1 % y mucho más preferentemente el 0 % en peso de competidores de unión a TL1A y TNF-α.

[0262] Purificación

[0264] Los métodos de purificación de anticuerpos son conocidos en la técnica y pueden emplearse con la producción de los anticuerpos y anticuerpos biespecíficos de la presente invención. En algunas realizaciones de la invención, los métodos para la purificación de anticuerpos incluyen filtración, cromatografía en columna de afinidad, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico y concentración. La etapa de filtración comprende preferentemente ultrafiltración y más preferentemente ultrafiltración y diafiltración. La filtración se realiza preferentemente al menos aproximadamente 5-50 veces, más preferentemente de 10 a 30 veces y mucho más preferentemente de 14 a 27 veces. La cromatografía en columna de afinidad puede realizarse usando, por ejemplo, cromatografía de afinidad PROSEP<®>(Millipore, Billerica, Mass.). En una realización preferida, la etapa de cromatografía de afinidad comprende cromatografía en columna PROSEP<®>-VA. El eluato puede lavarse en un detergente disolvente. La cromatografía de intercambio catiónico puede incluir, por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico SP-Sepharose. La cromatografía de intercambio aniónico puede incluir, por ejemplo, pero sin limitación, el intercambio aniónico de flujo rápido de Q-Sepharose. La etapa de intercambio aniónico es preferentemente no de unión, permitiendo de este modo la eliminación de contaminantes que incluyen ADN y BSA. El producto de anticuerpo está preferentemente nanofiltrado, por ejemplo, usando un nanofiltro Pall DV 20. El producto de anticuerpo puede concentrarse, por ejemplo, usando ultrafiltración y diafiltración. El método puede comprender además una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar agregados. Otros parámetros de purificación aparecen en los ejemplos de trabajo a continuación en el presente documento.

[0266] Los anticuerpos, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno biespecíficos también pueden producirse mediante otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante acoplamiento químico de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo.

[0267] Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia en esta descripción han de interpretarse como referencias a las proteínas de unión a antígeno específicas de TL1A y composiciones farmacéuticas de la invención para su uso en esos métodos.

[0269] Usos de los anticuerpos monoespecíficos de la invención

[0271] Los anticuerpos monoespecíficos de la presente invención son útiles, por ejemplo, para la inhibición de citocinas proinflamatorias, tales como TL1A. Los anticuerpos monoespecíficos de la invención pueden usarse para tratar trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunitarias, tales como enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn (EC), colitis ulcerosa (CU), síndrome del intestino irritable (SII), síndrome de la vejiga/cistitis intersticial, disfunción intestinal y urinaria, sepsis, uveítis, encefalomielitis, miastenia grave, síndrome de Sjogren (SS), esclerodermia, esclerosis múltiple (EM), fibrosis quística (FQ), inflamación en la enfermedad renal crónica (ERC), psoriasis (PSO), artritis psoriásica (APs), espondilitis anquilosante (EA), artritis reumatoide (AR), artritis reumatoide juvenil (ARJ), osteoartritis (OA), espondiloartropatía, colangitis esclerosante primaria, cirrosis biliar primaria, ateroesclerosis, esplenomegalia, inflamación en la enfermedad renal crónica (ERC), dermatitis atópica (EA), dermatitis eccematosa, dermatitis de contacto, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis lúpica (NL), lupus eritematoso cutáneo, tiroiditis autoinmunitaria, nefropatía por IgA, enfermedad renal diabética, vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ACAN), enfermedad de cambio mínimo (nefrosis lipoide), glomeruloesclerosis segmentaria focal (GESF), fibrosis sistémica nefrogénica (FSN), dermopatía fibrosante nefrogénica, hepatitis colestásica fibrosante, fascitis eosinofílica (síndrome de Shulman), escleromixedema (mucinosis papular), esclerodermia, liquen escleroso y atrófico, lesión pulmonar inflamatoria tal como fibrosis pulmonar idiopática, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), hipersensibilidad de las vías respiratorias, bronquitis crónica, asma alérgica, eccema, infección por Helicobacter pylori, adherencias intraabdominales y/o abscesos como resultado de inflamación peritoneal (por ejemplo, de infección, lesión, etc.), síndrome nefrótico, polineuropatía desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, rechazo de trasplante, rechazo de aloinjerto de órgano, enfermedad de injerto contra hospedador (EICH) (por ejemplo, de un trasplante, tal como sangre, médula ósea, riñón, páncreas, hígado, hígado ortotópico, pulmón, corazón, intestino, intestino delgado, intestino grueso, timo, células madre alógenas, alogénico de intensidad reducida, hueso, tendón, córnea, piel, válvulas cardíacas, venas, arterias, vasos sanguíneos, estómago y testículo), nefropatía por IgA, enfermedad renal diabética, diabetes mellitus, enfermedad de cambio mínimo (nefrosis lipoide), fibrosis sistémica nefrogénica (FSN), dermopatía fibrosante nefrogénica, hepatitis colestásica fibrosante, fascitis eosinofílica (síndrome de Shulman), escleromixedema (mucinosis papular), esclerodermia, liquen escleroso y atrófico, enfermedad de Takatsuki (o síndrome PEP), síndrome nefrótico, síndrome POEMs, síndrome de Crow-Fukase, síndrome nefrótico, anticuerpos citoplasmáticos anti-neutrófilos, vasculitis, arteritis de células gigantes y enfermedad ósea lítica inducida por mieloma múltiple, artritis inducida por la pared celular estreptocócica (PCE), gingivitis/periodontitis, queratitis estromal herpética, reestenosis por enteropatía sensible al gluten, enfermedad de Kawasaki y enfermedades renales inmuno-mediadas. Los anticuerpos monoespecíficos descritos en el presente documento también pueden usarse para tratar el cáncer, incluyendo la angiogénesis.

[0273] En una realización, la invención se refiere a métodos de tratamiento de una o más de las enfermedades y trastornos mencionados anteriormente en un mamífero que necesita dicho tratamiento mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a antígeno monoespecífica de la presente invención. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano. En otra realización preferida, la enfermedad o trastorno es EII, EC o CU.

[0275] Las proteínas de unión a antígeno específicas de TL1A de la invención son para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria caracterizada por la presencia de niveles elevados de TL1A en un paciente que lo necesite, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0277] En consecuencia, en una realización, la presente invención proporciona un método de inhibición de una o más de las citocinas proinflamatorias, por ejemplo, TL1A, en un mamífero que necesita dicho tratamiento, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo biespecífico o monoespecífico de la invención a un mamífero que necesita dicho tratamiento. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano. El método puede usarse para tratar un trastorno caracterizado por una expresión o actividad elevada de TL1A. La proteína de unión a antígeno monoespecífica puede administrarse con otro agente farmacéutico, ya sea en la misma formulación o por separado.

[0279] En otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una proteína de unión a antígeno monoespecífica como se describe en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención puede formularse de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante las cuales los anticuerpos terapéuticos se combinan en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición comprende un "portador farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un portador farmacéuticamente aceptable. Otros portadores adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia Véase, por ejemplo, Getman), ed.,Remington's Pharmaceutical Sciences, 19.ª edición, Mack Publishing Company (1995).

[0281] Para su uso farmacéutico, se formula un anticuerpo de la presente invención para el suministro parenteral, particularmente intravenoso o subcutáneo, de acuerdo con métodos convencionales. La administración intravenosa puede ser mediante inyección en embolada, liberación controlada, por ejemplo, usando minibombas u otra tecnología apropiada, o mediante infusión durante un período típico de una a varias horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán un anticuerpo de la invención en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina tamponada, dextrosa al 5 % en agua o similares. Las formulaciones pueden incluir además uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes tamponantes, albúmina para impedir la pérdida de proteínas en las superficies del vial, etc. Cuando se usa una terapia de combinación de este tipo, los anticuerpos pueden combinarse en una única formulación o pueden administrarse en formulaciones separadas. Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y se divulgan, por ejemplo, en Gennaro, ed.,Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa. (1990), que se incorpora en el presente documento por referencia. Las dosis terapéuticas estarán generalmente en el intervalo de 0,1 a 100 mg/kg de peso del paciente al día, preferentemente 0.5-20 mg/kg al día, con la dosis exacta determinada por el médico de acuerdo con las normas aceptadas, teniendo en cuenta la naturaleza y gravedad de la afección a tratar, los rasgos del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel del experto en la materia. Más habitualmente, los anticuerpos se administrarán durante una semana o menos, con frecuencia durante un período de uno a tres días. En general, la dosificación de los anticuerpos administrados variará dependiendo de factores tales como la edad, peso, estatura, sexo, estado médico general y antecedentes médicos previos del paciente. Normalmente, es deseable proporcionar al receptor una dosis de anticuerpos que esté en el intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de agente/peso corporal del paciente), aunque también puede administrarse una dosis menor o mayor según dicten las circunstancias.

[0283] La administración de un anticuerpo de la invención a un sujeto puede ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, por perfusión a través de un catéter regional o por inyección intralesional directa. Cuando se administran anticuerpos terapéuticos mediante inyección, la administración puede ser mediante infusión continua o mediante emboladas únicas o múltiples.

[0285] Las vías de administración adicionales incluyen oral, mucosa-membrana, pulmonar y transcutánea. El suministro oral es adecuado para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas proteinoides, microesferas de policianoacrilato y sistemas basados en lípidos (véase, por ejemplo, DiBaseet al., "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins", en Sanders et al., eds.,Protein Delivery: Physical Systems, págs. 255-288, Plenum Press (1997)). La viabilidad de un suministro intranasal se ejemplifica por un modo de este tipo de administración de insulina (véase, por ejemplo, Hinchcliffe et al.,Adv. Drug Deliv. Rev., 35:199 (1999)). Las partículas secas o líquidas que comprenden anticuerpos de la invención pueden prepararse e inhalar con la ayuda de dispersadores de polvo seco, generadores de aerosol líquido o nebulizadores (por ejemplo, Pettitet al., TIBTECH, 16:343 (1998); Pattonet al.,Adv.Drug Deliv. Rev., 35:235 (1999)). Este enfoque está ilustrado por el sistema de manejo de la diabetes AERX<®>, que es un inhalador electrónico de mano que suministra insulina aerosolizada a los pulmones. Los estudios han demostrado que se han suministrado proteínas de hasta 48.000 kDa a través de la piel a concentraciones terapéuticas con la ayuda de ultrasonido de baja frecuencia, lo que ilustra la viabilidad de la administración transcutánea (Mitragotriet al.,Science, 269:850 (1995)). El suministro transdérmico usando electroporación proporciona otro medio para administrar una molécula que tiene actividad de unión a IL-17 y TNF-α /p19 (Pottset al.,Pharm.Biotechnol., 10:213 (1997)).

[0287] Con fines de terapia, las composiciones que comprenden un anticuerpo de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable se administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que una combinación de un anticuerpo de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable se administra en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor. Por ejemplo, un agente utilizado para tratar la inflamación es fisiológicamente significativo si su presencia alivia la respuesta inflamatoria. El tratamiento eficaz se puede evaluar de diversas maneras. En una realización, el tratamiento eficaz se determina mediante inflamación reducida. En otras realizaciones, el tratamiento eficaz está marcado por la inhibición de la inflamación. En otras realizaciones más, la terapia eficaz se mide mediante un aumento del bienestar del paciente que incluye signos tales como aumento de peso, recuperación de la fuerza, disminución del dolor, mejoría e indicaciones subjetivas del paciente de mejor salud.

[0288] Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención puede proporcionarse en forma líquida, en un aerosol o en forma sólida. Las formas líquidas se ilustran mediante soluciones inyectables y suspensiones orales. Las formas sólidas de ejemplo incluyen cápsulas, comprimidos y formas de liberación controlada. Esta última forma se ilustra mediante bombas e implantes miniosmóticos (Bremeret al.,Pharm.Biotechnol., 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", en Ranadeet al., eds.,Drug Delivery Systems, págs. 95-123, CRC Press (1995); Bremeret al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", en Sanderset al., eds.,Protein Delivery: Physical Systems, págs.239-254, Plenum Press (1997); Yeweyet al., "Delivery of Proteins froma Controlled Release Injectable Implant

", en Sanderset al., eds.,Protein Delivery: Physical Systems, págs. 93 a 117, Plenum Press (1997).

[0289] Los liposomas proporcionan un medio para suministrar polipéptidos terapéuticos a un sujeto por vía intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutánea, o mediante administración oral, inhalación o administración intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que consisten en una o más bicapas lipídicas que rodean los compartimentos acuosos (véase, en general, Bakker-Woudenberget al.,Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 12(Supl. 1):561 (1993), Kim,Drugs, 46:618 (1993) y Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", en Ranadeet al., eds.,Drug Delivery Systems, págs. 3-24, CRC Press (1995)). Los liposomas son de composición similar a las membranas celulares y como resultado, los liposomas pueden administrarse de forma segura y son biodegradables. Dependiendo del método de preparación, los liposomas pueden ser unilamelares o multilamelares, y los liposomas pueden variar en tamaño con diámetros que varían de 0,02 mu.m a más de 10 mu.m. Se puede encapsular una diversidad de agentes en liposomas: reparto de agentes hidrófobos en las bicapas y reparto de agentes hidrófilos dentro del espacio o espacios acuosos internos (véase, por ejemplo, Machyet al.,Liposomes in Cell Biology and Pharmacology, John Libbey (1987), y Ostroet al.,American J. Hosp.Pharm., 46:1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño del liposoma, el número de bicapas, la composición lipídica, así como las características de carga y superficie de los liposomas.

[0290] Los liposomas pueden absorber prácticamente cualquier tipo de célula y después liberar lentamente el agente encapsulado. Como alternativa, un liposoma absorbido puede ser endocitosado por células que son fagocíticas. La endocitosis va seguida de la degradación intralisosomal de los lípidos liposomales y la liberación de los agentes encapsulados (Scherphofet al., Ann. N.Y.Acad. Sci., 446:368 (1985)). Después de la administración intravenosa, los liposomas pequeños (0,1 a 1,0 mu.m) son normalmente absorbidos por las células del sistema reticuloendotelial, localizadas principalmente en el hígado y el bazo, mientras que los liposomas mayores de 3,0 mu.m se depositan en el pulmón. Esta captación preferencial de liposomas más pequeños por las células del sistema reticuloendotelial se ha utilizado para suministrar agentes quimioterápicos a macrófagos y tumores del hígado.

[0291] El sistema reticuloendotelial puede eludirse mediante varios métodos que incluyen saturación con grandes dosis de partículas de liposoma, o inactivación selectiva de macrófagos por medios farmacológicos (Claassenet al.,Biochim. Biophys. Acta, 802:428 (1984)). Además, se ha demostrado que la incorporación de fosfolípidos derivados de glicolípidos o polietelenglicol en membranas de liposomas da como resultado una captación significativamente reducida por el sistema reticuloendotelial (Allenet al.,Biochim. Biophys. Acta, 1068:133 (1991); Allenet al.,Biochim. Biophys. Acta, 1150:9 (1993)).

[0292] También pueden prepararse liposomas para dirigirse a células u órganos particulares mediante la variación de la composición de fosfolípidos o insertando receptores o ligandos en los liposomas. Por ejemplo, se han utilizado liposomas, preparados con un alto contenido de un tensioactivo no iónico, para dirigirse al hígado (Hayakawaet al., Patente Japonesa N.º 04-244,018; Katoet al.,Biol. Pharm. Bull., 16:960 (1993)). Estas formulaciones se prepararon mezclando fosfatidilcolina de soja, alfa - tocoferol y aceite de ricino hidrogenado etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla al vacío y después reconstituyendo la mezcla con agua. También se ha demostrado que una formulación liposomal de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esterilglucósido (SG) derivado de soja y colesterol (Ch) tiene como diana el hígado (Shimizuet al.,Biol. Pharm.Bull., 20:881 (1997)).

[0293] Como alternativa, pueden unirse diversos ligandos de direccionamiento a la superficie del liposoma, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, carbohidratos, vitaminas, y proteínas de transporte. Por ejemplo, los liposomas pueden modificarse con derivados de galactosillípidos de tipo ramificado para dirigirse a receptores de asialoglicoproteína (galactosa), que se expresan exclusivamente en la superficie de las células hepáticas (Katoet al.,Crit. Rev. Ther.Drug Carrier Syst., 14:287 (1997); Murahashiet al.,Biol. Pharm.Bull., 20:259 (1997)). De manera similar, Wuet al.,Hepatology, 27:772 (1998), han demostrado que el marcaje de liposomas con asialofetuina condujo a una semivida plasmática de liposomas acortada y a una captación muy potenciada de liposoma marcado con asialofetuina por los hepatocitos. Por otro lado, la acumulación hepática de liposomas que comprenden derivados de galactosilípidos de tipo ramificado puede inhibirse mediante la preinyección de asialofetuina (Murahashiet al.,Biol. Pharm.Bull., 20:259 (1997)). Los liposomas de albúmina sérica humana poliaconitilados proporcionan otra estrategia para dirigir liposomas a células hepáticas (Kampset al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 94:11681 (1997)). Además, Gehoet al. Pat. de los EE. UU. N.º 4.603.044, describen un sistema de suministro de vesículas liposomales dirigidas a hepatocitos, que tiene especificidad por receptores hepatobiliares asociados a las células metabólicas especializadas del hígado.

[0294] En un enfoque más general para el direccionamiento tisular, las células diana se premarcan con anticuerpos biotinilados específicos para un ligando expresado por la célula diana (Harasymet al.,Adv.Drug Deliv. Rev., 32: 99 (1998)). Después de la eliminación plasmática del anticuerpo libre, se administran liposomas conjugados con estreptavidina. En otra estrategia, los anticuerpos de direccionamiento se unen directamente a los liposomas (Harasymet al.,Adv.Drug Deliv. Rev., 32: 99 (1998)).

[0295] Los anticuerpos pueden encapsularse dentro de los liposomas usando técnicas convencionales de microencapsulación de proteínas (véase, por ejemplo, Andersonet al.,Infect.Immun., 31:1099 (1981), Andersonet al.,Cancer Res., 50:1853 (1990) y Cohenet al.,Biochim. Biophys. Acta, 1063:95 (1991), Alvinget al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", en Gregoriadis, ed.,Liposome Technology, 2.ª Edición, Vol. III, pág.317, CRC Press (1993), Wassefet al.,Meth. Enzymol., 149:124 (1987)). Como se ha señalado anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener una diversidad de componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados lipídicos de poli(etilenglicol) (Allenet al.,Biochim. Biophys. Acta, 1150:9 (1993)).

[0297] Se han diseñado microesferas poliméricas degradables para mantener niveles sistémicos altos de proteínas terapéuticas. Las microesferas se preparan a partir de polímeros degradables tales como poli(lactida-co-glicolida) (PLG), polianhídridos, poli (orto ésteres), polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables, en los que las proteínas están atrapadas en el polímero (Gombotzet al.,Bioconjugate Chem., 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", en Ranadeet al., eds.,Drug Delivery Systems, págs.51-93, CRC Press (1995); Roskoset al., "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", en Sanderset al., eds.,Protein Delivery:Physical Systems, págs.45-92, Plenum Press (1997); Bartuset al.,Science, 281:1161 (1998); Putneyet al.,Nature Biotechnology, 16:153 (1998); Putney,Curr. Opin. Chem. Biol., 2:548 (1998)). Las nanoesferas recubiertas con polietilenglicol (PEG) también pueden proporcionar portadores para la administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Grefet al.,Pharm.Biotechnol., 10:167 (1996).

[0299] La formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellas actividades complementarias que no se ven afectadas adversamente entre sí. Como alternativa, o además, la composición puede comprender un agente que potencie su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterápico o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moléculas se presentan adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto.

[0301] En una realización, un anticuerpo de la invención se administra en terapia de combinación, es decir, se combina con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, que son útiles para tratar afecciones o trastornos patológicos, tales como trastornos autoinmunitarios y enfermedades inflamatorias. El término "en combinación" en este contexto significa que los agentes se administran sustancialmente contemporáneamente, ya sea simultánea o secuencialmente. Si se administra secuencialmente, al inicio de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos es preferentemente aún detectable a concentraciones eficaces en el sitio de tratamiento.

[0303] Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir uno o más anticuerpos de la invención coformulados con, y/o coadministrados con, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, uno o más inhibidores de citocinas y factores de crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos y/o agentes citotóxicos o citostáticos, como se describe con más detalle a continuación. Además, uno o más anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos descritos en el presente documento. Dichas terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando de este modo posibles toxicidades o complicaciones asociadas a las diversas monoterapias.

[0305] Los agentes terapéuticos preferidos utilizados en combinación con un anticuerpo de la invención son aquellos agentes que interfieren en diferentes fases en una respuesta inflamatoria. En una realización, uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, descritos en el presente documento pueden coformularse con, y/o coadministrarse con, uno o más agentes adicionales tales como otras citocinas o antagonistas del factor de crecimiento (por ejemplo, receptores solubles, inhibidores peptídicos, moléculas pequeñas, fusiones de ligando); o anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a otras dianas (por ejemplo, anticuerpos que se unen a otras citocinas o factores de crecimiento, sus receptores u otras moléculas de la superficie celular); y citocinas antiinflamatorias o agonistas de las mismas. Los ejemplos no limitantes de los agentes que pueden usarse en combinación con los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, antagonistas de una o más interleucinas (IL) o sus receptores, por ejemplo, antagonistas de IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL17A-F, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-25 e IL-31; antagonistas de citocinas o factores de crecimiento o sus receptores, tales como LT, EMAP-II, GM-CSF, FGF y PDGF. Los anticuerpos de la invención también pueden combinarse con inhibidores de, por ejemplo, anticuerpos contra moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD20 (por ejemplo, el inhibidor de CD20 rituximab (RITUXAN<®>), CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, o sus ligandos, incluyendo CD154 (gp39 o CD40L), o LFA-1/ICAM-1 y VLA-4/VCAM-1 (Yusuf-Makagiansaret al.,Med. Res. Rev., 22:146-167 (2002)). Los antagonistas preferidos que pueden usarse en combinación con uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, descritos en el presente documento incluyen antagonistas de IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α, IL-15, IL-18, IL-20, IL-22 e IL-31.

[0306] Los ejemplos de estos agentes incluyen antagonistas de IL-12, tales como anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o generadosin vitro(o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) que se unen a IL-12 (preferentemente IL-12 humana), por ejemplo, el anticuerpo divulgado en el documento WO 00/56772; inhibidores del receptor de IL-12, por ejemplo, anticuerpos contra el receptor de IL-12 humano; y fragmentos solubles del receptor de IL-12, por ejemplo, receptor de IL-12 humano. Los ejemplos de antagonistas de IL-15 incluyen anticuerpos (o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) contra IL-15 o su receptor, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o generadosin vitrocontra IL-15 humana o su receptor, fragmentos solubles del receptor de IL-15 y proteínas de unión a IL-15. Los ejemplos de antagonistas de IL-17 incluyen brodalumab, secukinumab e ixekizumab. Los ejemplos de antagonistas de IL-18 incluyen anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o generadosin vitro(o fragmentos de unión a antígeno de los mismos), contra IL-18 humana, fragmentos solubles del receptor de IL-18 y proteínas de unión a IL-18 (IL-18BP). Los ejemplos de antagonistas de IL-1 incluyen inhibidores de la enzima convertidora de interleucina-1 (ICE), tales como Vx740, antagonistas de IL-1, por ejemplo, RA de IL-1 (anakinra, Kineret<®>), sIL1RII y anticuerpos anti-receptor de IL-1 (o fragmentos de unión a antígeno de los mismos).

[0308] En otras realizaciones, uno o más anticuerpos descritos en el presente documento pueden administrarse en combinación con uno o más de los siguientes: antagonistas de IL-13, por ejemplo, receptores de IL-13 solubles (sIL-13) y/o anticuerpos contra IL-13; antagonistas de IL-2, por ejemplo, DAB 486-IL-2 y/o DAB 389-IL-2 (proteínas de fusión de IL-2, Seragen), y/o anticuerpos contra IL-2R, por ejemplo, anti-Tac (anti-IL-2R humanizado, Protein Design Labs). Otra combinación más incluye uno o más anticuerpos de la invención, moléculas pequeñas antagonistas y/o anticuerpos inhibidores en combinación con inhibidores anti-CD4 no agotadores (DEC-CE9.1/SB 210396; anticuerpo anti-CD4 primatizado no agotador; IDEC/SmithKline). Otras combinaciones preferidas más incluyen antagonistas de la vía coestimuladora CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2), incluyendo anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagonistas; así como ligando de glicoproteína p-selectina (PSGL), citocinas antiinflamatorias, por ejemplo, IL-4 (DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; IL-10 recombinante DNAX/Schering); IL-13 y TGF-beta, y agonistas de los mismos (por ejemplo, anticuerpos agonistas).

[0310] En otras realizaciones, uno o más anticuerpos de la invención se pueden coformular con, y/o coadministrar con, uno o más fármacos antiinflamatorios, inmunosupresores o inhibidores metabólicos o enzimáticos. Los ejemplos no limitantes de los fármacos o inhibidores que pueden usarse en combinación con los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, uno o más de: fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), por ejemplo, ibuprofeno, tenidap, naproxeno, meloxicam, piroxicam, diclofenaco e indometacina; sulfasalazina; corticoesteroides tales como prednisolona; fármacos antiinflamatorios supresores de citocinas (AISC); inhibidores de la biosíntesis de nucleótidos, por ejemplo, inhibidores de la biosíntesis de purina, antagonistas de folato (por ejemplo, metotrexato (ácido N-[4-[[(2,4-diamino-6-pteridinil)metil]metilamino]benzoil]-glutámico); e inhibidores de la biosíntesis de pirimidina, por ejemplo, inhibidores de dihidrogenasa (DHODH). Los agentes terapéuticos preferidos para su uso en combinación con uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención incluyen AINE, AISC, inhibidores (DHODH) (por ejemplo, leflunomida) y antagonistas de folato (por ejemplo, metotrexato).

[0312] Los ejemplos de inhibidores adicionales incluyen uno o más de: corticoesteroides (orales, inhalados e inyección local); inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus (FK-506); e inhibidores de mTOR, por ejemplo, sirolimus (rapamicina--RAPAMUNE<®>o derivados de rapamicina, por ejemplo, derivados solubles de rapamicina (por ejemplo, derivados de rapamicina de éster, por ejemplo, CCI-779); agentes que interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias tales como IL-1 (por ejemplo, inhibidores de IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP cinasa); inhibidores de la COX2, por ejemplo, celecoxib, rofecoxib, rofecoxib y variantes de los mismos; inhibidores de la fosfodiesterasa, por ejemplo, R973401 (inhibidor de la fosfodiesterasa de tipo IV); inhibidores de la fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de la fosfolipasa citosólica 2 (cPLA2) (por ejemplo, análogos de trifluorometilcetona); inhibidores del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares o receptor del factor de crecimiento, por ejemplo, inhibidor de VEGF y/o inhibidor de VEGF-R; e inhibidores de la angiogénesis. Los agentes terapéuticos preferidos para su uso en combinación con los anticuerpos de la invención son inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus (FK-506); inhibidores de mTOR, por ejemplo, sirolimus (rapamicina) o derivados de rapamicina, por ejemplo, derivados solubles de rapamicina (por ejemplo, derivados de rapamicina de éster, por ejemplo, CCI-779); inhibidores de COX2, por ejemplo, celecoxib y variantes del mismo; e inhibidores de fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de la fosfolipasa 2 citosólica (cPLA2), por ejemplo, análogos de trifluorometilcetona.

[0313] Los ejemplos adicionales de agentes terapéuticos que pueden combinarse con un anticuerpo de la invención incluyen uno o más de: 6-mercaptopurinas (6-MP); azatioprina sulfasalazina; mesalazina; olsalazina; cloroquina/hidroxicloroquina (PLAQUENIL<®>); penicilamina; aurotiomalato (intramuscular y oral); azatioprina; colchicina; agonistas del adrenorreceptor beta-2 (salbutamol, terbutalina, salmeteral); xantinas (teofilina, aminofilina); cromoglicato; nedocromil; cetotifeno; ipratropio y oxitropio; micofenolato mofetilo; agonistas de la adenosina; agentes antitrombóticos; inhibidores del complemento; y agentes adrenérgicos.

[0315] Los anticuerpos anti-TL1A de la invención pueden combinarse con antagonistas de TNF-α para el tratamiento de las mismas afecciones que se indican en el presente documento para las proteínas de unión a antígeno biespecíficas anti-TL1A/anti-TNF-α. Dichos antagonistas de TNF-α incluyen, por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab, golimumab y certolizumab pegol.

[0317] Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar o prevenir trastornos artríticos (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis inflamatoria, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide, osteoartritis y artritis psoriásica), con lod que puede combinarse un anticuerpo, por ejemplo, proteína de unión a antígeno biespecífica, de la invención incluye uno o más de los siguientes: antagonistas de IL-12 como se describen en el presente documento; AINE; AISC; anticuerpos anti-CD4 no agotadores como se describen en el presente documento; antagonistas de IL-2 como se describen en el presente documento; citocinas antiinflamatorias, por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGF-α, o agonistas de las mismas; antagonistas de los receptores de IL-1 o IL-1 como se describen en el presente documento; inhibidores de la fosfodiesterasa como se describen en el presente documento; inhibidores de la Cox-2 como se describen en el presente documento; iloprost: metotrexato; talidomida y fármacos relacionados con la talidomida (por ejemplo, Celgen); leflunomida; inhibidor de la activación de plasminógeno, por ejemplo, ácido tranexámico; inhibidor de citocinas, por ejemplo, T-614; prostaglandina E1; azatioprina; un inhibidor de la enzima convertidora de interleucina-1 (ICE); zap-70 y/o inhibidor de 1 ck (inhibidor de la tirosina cinasa zap-70 o 1 ck); un inhibidor del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares o receptor del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares como se describen en el presente documento; un inhibidor de la angiogénesis como se describe en el presente documento; fármacos antiinflamatorios corticoesteroideos (por ejemplo, SB203580); inhibidores de la convertasa de TNF-α ; inhibidores de IL-1; IL-13; IL-17; oro; penicilamina; cloroquina; hidroxi cloroquina; clorambucilo; ciclofosfamida; ciclosporina; irradiación linfoide total; globulina antitimocitaria; toxinas de CD5; péptidos y colágeno administrados por vía oral; lobenzarit disódico; agentes reguladores de citocinas (CRA) HP228 y HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); oligodesoxinucleótidos de fosforotioato antisentido ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor del complemento soluble 1 (TP 10; T Cell Sciences, Inc.); prednisona; orgoteína; polisulfato de glicosaminoglicano; minociclina (MINOCIN<®>); anticuerpos anti-IL2R; lípidos marinos y botánicos (ácidos grasos de peces y semillas de plantas); auranofina; fenilbutazona; ácido meclofenámico; ácido flufenámico; inmunoglobulina intravenosa; zileutón; ácido micofenólico (RS-61443); tacrolimus (FK-506); sirolimus (rapamicina); amipriosa (terafectina); cladribina (2-clorodesoxiadenosina); y azaribina. Las combinaciones preferidas incluyen uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención en combinación con metotrexato o leflunomida, y en casos de artritis reumatoide moderada o grave, ciclosporina.

[0319] Los ejemplos preferidos de inhibidores para usar en combinación con una o más proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno biespecíficas, de la invención para tratar trastornos artríticos incluyen antagonistas de IL-12, IL-15, IL-18, IL-22; agentes agotadores de linfocitos T y linfocitos B (por ejemplo, anticuerpos anti-CD4 o anti-CD22); inhibidores de molécula pequeña, por ejemplo, metotrexato y leflunomida; sirolimus (rapamicina) y análogos del mismo, por ejemplo, CCI-779; inhibidores de la cox-2 y cPLA2; AINE; inhibidores de p38, inhibidores de TPL-2, Mk-2 y NFκB; RAGE o RAGE soluble; inhibidores de P-selectina o PSGL-1 (por ejemplo, inhibidores de molécula pequeña, anticuerpos contra PSGL-1, anticuerpos contra P-selectina); agonistas del receptor de estrógeno beta (ERB) o antagonistas de ERB-NFκB. Los agentes terapéuticos adicionales mucho más preferidos que pueden coadministrarse y/o coformularse con uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención incluyen uno o más de: metotrexato, leflunomida o un sirolimus (rapamicina) o un análogo del mismo, por ejemplo, CCI-779.

[0321] Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno inflamatorio (por ejemplo, EII, EC, CU, SII) con los que puede combinarse un anticuerpo, por ejemplo, proteína de unión a antígeno biespecífica, de la invención incluyen los siguientes: budenosida; factor de crecimiento epidérmico; corticoesteroides; ciclosporina; sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de la lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas del receptor de IL-1; anticuerpos monoclonales anti-IL-1; anticuerpos monoclonales anti-IL-6 (por ejemplo, anticuerpos anti-receptor de IL-6 y anticuerpos anti-IL-6); factores de crecimiento; inhibidores de la elastasa; compuestos de piridinil-imidazol; citocinas IL-4, IL-10, IL-13 y/o TGF.beta. o agonistas de las mismas (por ejemplo, anticuerpos agonistas); IL-11; profármacos conjugados con glucurónido o dextrano de prednisolona, dexametasona o budesonida; oligodesoxinucleótidos de fosforotioato antisentido ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor del complemento soluble 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); mesalazina de liberación lenta; metotrexato; antagonistas del factor activador de plaquetas (PAF); ciprofloxacino; y lignocaína.

[0323] Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar o prevenir la esclerosis múltiple con uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención que pueden combinarse incluyen los siguientes: Interferones, por ejemplo, interferón-α (por ejemplo, AVONEX<®>, Biogen) e interferón-1b (BETASERON<®>, Chiron/Berlex); Copolímero 1 (COP-1; COPAXONE<®>, Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); fumarato de dimetilo (por ejemplo, BG-12; Biogen); oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; cladribina; corticoesteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina: ciclosporina A, metotrexato; 4-aminopiridina; y tizanidina. Los antagonistas adicionales que pueden usarse en combinación con anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos contra o antagonistas de otras citocinas humanas o factores de crecimiento, por ejemplo, LT, IL-1, IL-2, IL-6, EL-7, IL-8, IL-12 IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF y PDGF. Los anticuerpos como se describen en el presente documento pueden combinarse con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Uno o más anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención también pueden combinarse con agentes tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, AINE, por ejemplo, ibuprofeno, corticoesteroides tales como prednisolona, inhibidores de la fosfodiesterasa, agonistas de la adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias como se describen en el presente documento, inhibidores de la enzima convertidora de IL-1b (por ejemplo, Vx740), inhibidores anti-P7, PSGL, TACE, inhibidores de la señalización de linfocitos T tales como inhibidores de cinasas, inhibidores de la metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores de citocinas solubles y derivados de los mismos, como se describen en el presente documento, y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGF).

[0325] Los ejemplos preferidos de agentes terapéuticos para la esclerosis múltiple con los que pueden combinarse los anticuerpos de la invención incluyen fumarato de dimetilo (por ejemplo, BG-12; Biogen), interferón-beta, por ejemplo, IFN-β-1a e IFN-β-1b; COPAXONA<®>, corticoesteroides, inhibidores de IL-1, anticuerpos contra ligando de CD40 y CD80, antagonistas de IL-12.

[0327] Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar o prevenir la psoriasis con los que puede combinarse un anticuerpo, por ejemplo, proteína de unión a antígeno biespecífica, de la invención incluyen los siguientes: corticoesteroides; vitamina. D<3>y análogos de la misma; retinoides (por ejemplo, soriatano); metotrexato; ciclosporina, 6-tioguanina; Accutane; hydrea; hidroxiurea; sulfasalazina; micofenolato mofetilo; azatioprina; tacrolimus; ésteres de ácido fumárico; productos biológicos tales como AMEVIVE<®>, Raptiva ustekinumab y XP-828L; fototerapia; y fotoquimioterapia (por ejemplo, psoraleno y fototerapia ultravioleta combinados).

[0329] Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar o prevenir la enfermedad inflamatoria de las vías respiratorias/respiratoria (por ejemplo, trastorno pulmonar obstructivo crónico, asma) con los que puede combinarse un anticuerpo, por ejemplo, proteína de unión a antígeno biespecífica, de la invención incluyen los siguientes: agonistas de adrenorreceptores beta2 (por ejemplo, salbutamol (albuterol), levalbuterol, terbutalina, bitolterol); agonistas de adrenorreceptores beta2 de acción prolongada (por ejemplo, salmeterol, formoterol, bambuterol); agonistas adrenérgicos (por ejemplo, epinefrina inhalada y comprimidos de efedrina); medicamentos anticolinérgicos (por ejemplo, bromuro de ipratropio); combinaciones de esteroides inhalados y broncodilatadores de acción prolongada (por ejemplo, fluticasona/salmeterol (ADVAIR<®>en los Estados Unidos, y Seretide en el Reino Unido)) o budesonida/formoterol (SYMBICORT<®>)); glucocorticoides inhalados (por ejemplo, ciclesonida, beclometasona, budesonida, flunisolida, fluticasona, mometasona, triamcinolona); modificadores de leucotrieno (por ejemplo, montelukast, zafirlukast, pranlukast y zileutón); estabilizadores de mastocitos (por ejemplo, cromoglicato (cromolina) y nedocromil); antimuscarínicos/anticolinérgicos (por ejemplo, ipratropio, oxitropio, tiotropio); metilxantinas (por ejemplo, teofilina, aminofilina); antihistamínicos; bloqueantes de IgE (por ejemplo, omalizumab); antagonistas muscarínicos de M<3>(anticolinérgicos) (por ejemplo, ipratropio, tiotropio); cromonas (por ejemplo, cromoglicato, nedocromil); zantinas (por ejemplo, teofilina); inhibidores de IL-17 (por ejemplo, brodalumab, secukinumab, ixekizumab), inhibidores de IL-4; e inhibidores de IL-13.

[0331] En una realización, un anticuerpo de la invención puede usarse en combinación con uno o más anticuerpos dirigidos a otras dianas implicadas en la regulación de las respuestas inmunitarias, por ejemplo, rechazo de trasplante.

[0333] Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar o prevenir respuestas inmunitarias con las que puede combinarse un anticuerpo, por ejemplo, proteína de unión a antígeno biespecífica, de la invención incluyen los siguientes: anticuerpos contra otras moléculas de la superficie celular, incluyendo, pero sin limitación, CD25 (receptor-α de interleucina-2), CD11a (LFA-1), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4 (CD80 (B7.1), por ejemplo, CTLA4 Ig (abatacept , ORENCIA<®>), ICOSL, ICOS y/o CD86 (B7.2). En otra realización más, un anticuerpo de la invención se usa en combinación con uno o más agentes inmunosupresores generales, tales como ciclosporina A o FK506.

[0334] En otras realizaciones, los anticuerpos se usan como adyuvantes de vacuna contra trastornos autoinmunitarios, enfermedades inflamatorias, etc. La combinación de adyuvantes para el tratamiento de estos tipos de trastornos es adecuada para su uso en combinación con una amplia variedad de antígenos de autoantígenos dirigidos, es decir, autoantígenos, implicados en la autoinmunidad, por ejemplo, proteína básica de mielina; autoantígenos inflamatorios (por ejemplo, proteína peptídica amiloide) o antígenos de trasplante (por ejemplo, aloantígenos). El antígeno puede comprender péptidos o polipéptidos derivados de proteínas, así como fragmentos de cualquiera de los siguientes: sacáridos, proteínas, polinucleótidos u oligonucleótidos, autoantígenos, proteína peptídica amiloide, antígenos de trasplante, alérgenos u otros componentes macromoleculares. En algunos casos, se incluye más de un antígeno en la composición antigénica.

[0336] Por ejemplo, las vacunas deseables para moderar las respuestas a alérgenos en un hospedador vertebrado, que contienen las combinaciones adyuvantes de esta invención, incluyen aquellas que contienen un alérgeno o fragmento del mismo. Los ejemplos de dichos alérgenos se describen en la Pat. de los EE. UU. N.º 5.830.877 y la Publicación PCT N.º WO 99/51259, e incluyen polen, venenos de insectos, caspa animal, esporas fúngicas y fármacos (tales como penicilina). Las vacunas interfieren con la producción de anticuerpos IgE, una causa conocida de reacciones alérgicas. En otro ejemplo, las vacunas deseables para prevenir o tratar una enfermedad caracterizada por la deposición de amiloides en un hospedador vertebrado, que contienen las combinaciones adyuvantes de esta invención, incluyen aquellas que contienen porciones de proteína peptídica amiloide (APP). Esta enfermedad se denomina de forma variada enfermedad de Alzheimer, amiloidosis o enfermedad amiloidogénica. Por lo tanto, las vacunas de esta invención incluyen las combinaciones adyuvantes de esta invención más péptido A.beta, así como fragmentos de péptido Aβ y anticuerpos contra péptido Aβ o fragmentos del mismo.

[0337] En otra realización, las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse como un kit que comprende un recipiente que comprende un anticuerpo, proteína de unión a antígeno biespecífica o fragmento de unión a antígeno de la invención. Los anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, de la invención pueden proporcionarse en forma de una solución inyectable para dosis únicas o múltiples, o como un polvo estéril que se reconstituirá antes de la inyección. Como alternativa, un kit de este tipo puede incluir un dispersador de polvo seco, generador de aerosol líquido o nebulizador para la administración de la proteína de unión a antígeno. Un kit de este tipo puede comprender además información escrita sobre las indicaciones y el uso de la composición farmacéutica. Además, dicha información puede incluir una declaración de que la composición de anticuerpos está contraindicada en pacientes con hipersensibilidad conocida a TL1A y TNF-α.

[0338] En una realización adicional, la invención proporciona un artículo de fabricación que comprende: (a) una composición de materia que comprende un anticuerpo, proteína de unión a antígeno biespecífica o fragmento de unión a antígeno como se describe en el presente documento; (b) un recipiente que contiene dicha composición; y (c) una etiqueta fijada a dicho recipiente, o un prospecto incluido en dicho recipiente que se refiere al uso de dicho anticuerpo en el tratamiento de una enfermedad relacionada con la inmunidad.

[0339] En otro aspecto, la composición comprende un principio activo adicional, que puede ser, por ejemplo, un anticuerpo adicional o un agente antiinflamatorio, citotóxico o quimioterápico. Preferentemente, la composición es estéril. Los anticuerpos, como se describen en el presente documento, también son útiles para preparar medicinas y medicamentos para el tratamiento de enfermedades inmunitarias e inflamatorias, incluyendo, por ejemplo, SII, EII, EC, CU. En un aspecto específico, dichas medicinas y medicamentos comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a antígeno biespecífica, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención con un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, la mezcla es estéril.

[0340] Las proteínas de unión a antígeno biespecíficas que no están cubiertas por las reivindicaciones pueden usarse con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar o monitorizar enfermedades y/o afecciones que se asocian a TL1A y/o TNF-α. También se proporcionan métodos para la detección de la presencia de TL1A y/o TNF-α en una muestra usando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Tijssen (1993),Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon y P.H. van Knippenberg, Elsevier, Ámsterdam); Zola (1987),Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs.147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanenet al. (1985),J. Cell. Biol.101:976-985; Jalkanenet al. (1987),J. Cell Biol.105:3087-3096. La detección de TL1A y/o TNF-α puede realizarsein vivooin vitro.

[0341] Las aplicaciones de diagnóstico proporcionadas en el presente documento incluyen el uso de las proteínas de unión a antígeno para detectar la expresión de TL1A y/o TNF-α y la unión de estos ligandos a sus receptores. Los ejemplos de métodos útiles en la detección de la presencia del ligando incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA).

[0342] Para aplicaciones de diagnóstico, la proteína de unión a antígeno se marcará normalmente con un grupo marcador detectable. Los grupos marcadores adecuados incluyen, pero sin limitación, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lantánidos fluorescentes), grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, βgalactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos de biotinilo o epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcadores epitópicos). En algunas realizaciones, el grupo marcador se acopla a la proteína de unión a antígeno mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. Se conocen en la técnica y pueden usarse diversos métodos para marcar proteínas.

[0343] La proteína de unión a antígeno bispecífica, aunque no forma parte de las reivindicaciones, puede usarse para identificar una célula o células que expresan TL1A y/o TNF-α. En una realización específica, la proteína de unión a antígeno se marca con un grupo marcador y se detecta la unión de la proteína de unión a antígeno marcada a TL1A y/o TNF-α. En una realización específica adicional, la unión de la proteína de unión a antígeno a TL1A y/o TNF-α se detecta in vivo. En una realización específica adicional, la proteína de unión a antígeno biespecífica se aísla y mide usando técnicas conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988,Antibodies: ALaboratory Manual

, Nueva York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 y suplementos periódicos); John E. Coligan, ed., 1993,Current Protocols In Immunology, Nueva York: John Wiley & Sons.

[0344] EJEMPLOS DE TRABAJO

[0345] La invención se ilumina adicionalmente mediante los siguientes ejemplos de trabajo, que ejemplifican, pero no limitan, el alcance de la invención. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0346] EJEMPLO 1

[0347] Preparación de anticuerpos monoclonales anti-TL1A XenoMouse®

[0348] Cepas de ratones

[0349] Se generaron anticuerpos totalmente humanos contra TL1A humano mediante la inmunización de ratones transgénicos XENOMOUSE<®>. Pat. de los EE. UU. N.º 6.114.598; 6.162.963;6.833.268; 7.049.426; 7.064.244, que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad; Greenet al. (1994),Nature Genetics7:13-21; Mendezet al. (1997),Nature Genetics15:146-156; Green y Jakobovitis (1998),J. Ex. Med, 188:483-495; Kellerman y Green (2002),Current Opinion in Biotechnology13, 593-597; cada uno de los cuales se incorpora por referencia en su totalidad. Se usaron animales de las cepas XMG1-KL, XMG2-K, XMG2-K/Balbc, XMG2-KL, XMG4-K y XMG4-KL XENOMOUSE<®>para todas las inmunizaciones.

[0350] Generación de inmunógeno de TL1A

[0351] Se generaron polipéptidos TL1A que contenían el marcador de His N-terminal (H6), de los cuales los primeros 22 aminoácidos son el péptido señal VK1, transfectando transitoriamente células 293HEK con los ADNc correspondientes. Se empleó el marcador de poliHis habitualmente empleado para facilitar la detección y posterior purificación.

[0352] Se transfectaron células 293-6E a razón de 9.48x10<5>células/ml con ADN 0,5 mg/l (His-TL1A 0,1 mg/l en vector pTT5 con vector pTT5 vacío 0,4 mg/l) (Durocheret al. (2002) NRCC,Nucleic Acids. Res.30, e9) con 3 ml de PEI/mg de ADN en medio Freestyle 293 (Invitrogen). Se añadió triptona N1 a los cultivos 1 hora después de la transfección. Las células se cultivaron en suspensión en medio de expresión Freestyle 293 complementado con Pluronic F68 al 0,1 % y Geneticina 50 µg/ml durante 7 días y se recogieron para su purificación.

[0353] EJEMPLO 2

[0354] Generación de TL1A

[0355] Se generaron polipéptidos TL1A que contenían el marcador de His N-terminal (H6), de los cuales los primeros 22 aminoácidos son el péptido señal VK1, transfectando transitoriamente células 293HEK con los ADNc correspondientes. Se empleó el marcador de poliHis habitualmente empleado para facilitar la detección y posterior purificación.

[0356] Se transfectaron células 293-6E a razón de 9.48x10<5>células/ml con ADN 0,5 mg/l (His-TL1A 0,1 mg/l en vector pTT5 con vector pTT5 vacío 0,4 mg/l) (Durocheret al. NRCC,Nucleic Acids. Res.(2002) 30, e9) con 3 ml de PEI/mg de ADN en medio Freestyle 293 (Invitrogen). Se añadió triptona N1 a los cultivos 1 hora después de la transfección. Las células se cultivaron en suspensión en medio de expresión Freestyle 293 complementado con Pluronic F68 al 0,1 % y Geneticina 50 µg/ml durante 7 días y se recogieron para su purificación.

[0357] Inmunizaciones

[0358] Se realizan inmunizaciones usando una o más formas adecuadas de antígeno de TL1A, incluyendo TL1A humano recombinante expresado en células y proteína soluble TL1A humana recombinante o combinaciones de los mismos.

[0359] Para la inmunización inicial en XenoMouse<®>se usa una cantidad adecuada de inmunógeno (es decir, 10 µg de proteína suministrada por inyección en el abdomen). Después de la inmunización inicial, se administran inmunizaciones de refuerzo posteriores del inmunógeno (es decir, 2 x 10 células e6 o 5 µg de proteína) según un programa y durante el tiempo necesario para inducir un título adecuado de anticuerpo anti-TL1A en los ratones. Los títulos se determinan mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, inmunoensayo enzimático o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

[0360] Se usaron múltiples inmunógenos y vías de inmunización para generar respuestas inmunitarias anti-TL1A humano. Para las inmunizaciones genéticas, los ratones se inmunizaron 12-16 veces durante 6-8 semanas usando el sistema Helios Gene Gun de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BioRad, Hercules, California).

[0361] Brevemente, se aplicaron vectores de expresión que codificaban TL1A humano o de macaco cangrejero de tipo silvestre como recubrimiento sobre perlas de oro (BioRad, Hercules, California) y se suministraron a la epidermis de un abdomen de ratón afeitado. Para las inmunizaciones basadas en células, los ratones se inmunizaron con una estirpe celular CHO-K1 adaptada a suspensión (Invitrogen, Carlsbad, California), transfectada de forma estable con un vector de expresión que codificaba TL1A humano. Los animales se inmunizaron con células mezcladas con alumbre preparado a partir de sulfato de aluminio y potasio (EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ) y CpG-ODN (Eurofins MWG Operon LLC, Huntsville, AL) 10-12 veces durante 6-8 semanas usando un protocolo que alternaba entre inyecciones subcutáneas e intraperitoneales. El refuerzo inicial comprendía 4x10<6>células mientras que los refuerzos posteriores contenían células 2x10<6>. Para las inmunizaciones de proteínas recombinantes solubles, los ratones se inmunizaron con una forma trimérica marcada con His 6x del dominio extracelular de TL1A humano y de macaco cangrejero (aminoácidos 72-251 de las secuencias de TL1A). Los animales se inmunizaron con proteína recombinante mezclada con alumbre y CpG-ODN, 8-12 veces durante 4-8 semanas usando inyecciones subcutáneas. El refuerzo inicial comprendía 10 µg mientras que los refuerzos posteriores contenían 5 µg. Los títulos séricos específicos de TL1A humano se monitorizaron mediante análisis por FACS de células vivas en un citómetro de flujo Accuri o FacsCalibur (BD Biosciences). Los animales con los títulos séricos específicos de antígeno más altos dirigidos contra TL1A humano y de macaco cangrejero se sacrificaron y se usaron para la generación de hibridomas (Kohler y Milstein, 1975).

[0362] EJEMPLO 3

[0363] Preparación de anticuerpos monoclonales

[0364] Generación de hibridomas

[0365] Se identifican animales que presentan títulos adecuados y se obtienen linfocitos de ganglios linfáticos drenantes y, si es necesario, se agrupan para cada cohorte. Los linfocitos agrupados (de cada cohorte de inmunización) se disociaron del tejido linfoide mediante trituración en un medio adecuado (por ejemplo, Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM); Invitrogen, Carlsbad, CA). Pueden seleccionarse y/o expandirse linfocitos B usando un método adecuado, y fusionarse con un compañero de fusión adecuado; por ejemplo, células P3X63Ag8.653 de mieloma no secretor (American Type Culture Collection CRL 1580; Kearneyet al.,J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550), usando técnicas que son conocidas en la técnica Se seleccionaron y/o se expandieron linfocitos B usando métodos convencionales, y se fusionaron con un compañero de fusión adecuado usando técnicas que eran conocidas en la técnica.

[0366] En un método de fusión adecuado, los linfocitos se mezclan con células compañeras de fusión en una relación de 1:4. La mezcla celular se sedimenta suavemente mediante centrifugación a 400 x g durante 4 minutos, el sobrenadante se decanta y la mezcla celular se mezcla suavemente (por ejemplo, usando una pipeta de 1 ml). La fusión se induce con PEG/DMSO (polietilenglicol/dimetilsulfóxido; obtenible de Sigma-Aldrich, St. Louis MO; 1 ml por millón de linfocitos). Se añade PEG/DMSO lentamente con agitación suave durante un minuto seguido de un minuto de mezcla. Después, se añade IDMEM (DMEM sin glutamina; 2 ml por millón de linfocitos B) durante 2 minutos con agitación suave, seguido de IDMEM adicional (8 ml por millón de linfocitos B) que se añade durante 3 minutos.

[0367] Las células fusionadas se sedimentan suavemente (400 x g, 6 minutos) y se resuspenden en 20 ml de medio de selección (por ejemplo, DMEM que contenía azaserina e hipoxantina [HA] y otros materiales complementarios según sea necesario) por millón de linfocitos B. Las células se incuban durante 20-30 minutos a 37 C y después se resuspenden en 200 ml de medio de selección y se cultivan durante tres a cuatro días en matraces T175 antes de la siembra en placas de 96 pocillos.

[0368] Las células se distribuyen en placas de 96 pocillos usando técnicas convencionales para maximizar la clonalidad de las colonias resultantes. Después de varios días de cultivo, se recogen los sobrenadantes y se someten a ensayos de cribado como se detalla en los ejemplos a continuación, que incluyen la confirmación de la unión al TL1A humano, la evaluación de la reactividad cruzada con TL1A de otras especies (por ejemplo, TL1A de mono de macaco cangrejero) y la capacidad de inhibir la actividad de TL1A. Las células positivas se seleccionan adicionalmente y se someten a técnicas de clonación y subclonación convencionales. Las estirpes clonales se pueden expandirsein vitroy los anticuerpos humanos secretados pueden obtenerse para su análisis.

[0369] De esta manera, se inmunizaron ratones con proteína soluble TL1A humana recombinante durante un total de 15 inmunizaciones durante un período de aproximadamente 2 meses; se obtuvieron varias estirpes celulares de hibridoma que secretaban anticuerpos específicos de TL1A, y los anticuerpos se caracterizaron adicionalmente. Las secuencias de las mismas se presentan en el Listado de Secuencias y en las Tablas A, C y D y los resultados de diversos ensayos que usan estos anticuerpos se muestran en el presente documento.

[0370] Las Tablas A a E del presente documento muestran las secuencias de anticuerpos anti-TL1A preparados de acuerdo con este ejemplo de trabajo.

[0371] EJEMPLO 4

[0372] Enriquecimiento antigénico de grupos de hibridoma

[0373] Se usaron grupos de hibridomas fusionados de la recogida de tejido inmunitario seleccionada como fuente de material para el enriquecimiento basado en FACS. Para enriquecer en hibridomas que expresaban anticuerpos específicos de TL1A humano nativo (de longitud completa, en la célula) se prepararon membranas a partir de células 293T que expresaban transitoriamente la construcción de ADNc de TL1A. 24 horas después de la transfección usando 293Fectin<™>(ThermoFisher Scientific Inc.), las células se biotinilaron con E-Z link NHS-LC-LC-Biotina de acuerdo con la recomendación del fabricante (ThermoFisher Scientific Inc.). Después de la biotinilación, las células se homogeneizaron con una aguja y una jeringa para formar fragmentos de membrana y se denominaron "preparaciones de membrana". Después, las preparaciones de membrana biotiniladas se usaron para detectar hibridomas que expresaban anticuerpos de superficie específicos para la diana de interés mediante química de biotina-estreptavidina convencional.

[0374] Para enriquecer los grupos de hibridoma en el antígeno de interés, se incubaron primero con la sonda de preparación de membrana. Después, la sonda no unida se eliminó por lavado y los hibridomas específicos de antígeno se identificaron mediante detección simultánea de IgG de superficie (con un anticuerpo secundario anti-Fc humano Gt conjugado con Alexa 488; Jackson ImmunoResearch) y la sonda TL1A de preparación de membrana biotinilada (estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 647; Jackson ImmunoResearch). Se detectaron hibridomas que expresaban IgG de superficie y antígeno de unión mediante análisis por FACS en un citómetro de flujo Accuri. Los eventos positivos duales se clasificaron como células individuales en placas de 384 pocillos en un clasificador de células FACS Aria (BD Biosciences). Después de varios días de cultivo, los sobrenadantes de hibridoma que contenían anticuerpos monoclonales se recogieron y se usaron en los ensayos de cribado que se describen en los ejemplos a continuación.

[0375] EJEMPLO 5

[0376] Selección inicial de anticuerpos de unión específicos de TL1A

[0377] Se expresó TL1A humano en células hospedadoras de riñón embrionario humano 293 mediante transfección usando un vector de expresión que expresaba ADNc de huTL1A, medio Gibco<™>Opti-MEM<®>(Gibco, N.º de Cat.

[0378] 31985088) yreactivo 293Fectina<™>(Invitrogen, N.º de Cat. 12347019) siguiendo el protocolo establecido por el fabricante. Los sobrenadantes de hibridoma se cribaron para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales específicos de huTL1A usando el sistema de cribado FMAT 8200 (Molecular Devices) y la plataforma de formación de imágenes de alto contenido CellInsight<™>(ThermoFisher Scientific). El número de pocillos positivos para huTL1A (es decir, aquellos que tienen señal sobre sobrenadante de hibridoma irrelevante) se presenta en la Tabla 5.1. Para los cribados de CellInsight, se añadieron 15 µl/pocillo de sobrenadante de hibridoma (y controles positivos y negativos) a placas negras de fondo transparente de 384 pocillos (Corning Can. N.º 3712) seguido de la adición de 30 µl/pocillo de una mezcla de células TL1A/293T, tinción nuclear Hoescht (Pierce, N.º de Cat. 62249) y Alexa 488-anticuerpo de cabra anti-IgG humana (H+L) (Jackson, N.º de Cat. 109-545-088). Después de 3 horas de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron 2 veces en un lavador de placas AquaMax 4000 (equipado con un cabezal de lavado celular de 384 pocillos) y se leyeron en el instrumento CellInsight de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para los cribados basados en FMAT, se añadieron 20 µl/pocillo de sobrenadante de hibridoma (y controles positivos y negativos) a placas negras de fondo transparente de 384 pocillos seguido de la adición de 40 µl/pocillo de una mezcla de células TL1A/293T, células parentales 293T y Cy5-anticuerpo de cabra anti-IgG humana (Fc) (Jackson, N.º de Cat. 109-075). Después de 3 horas de incubación a temperatura ambiente, las placas se leyeron en el sistema FMAT 8200 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

[0379] Tabla 5.1: Anticuerpos específicos de TL1A seleccionados

[0381]

[0383] EJEMPLO 6

[0384] Identificación de anticuerpos bloqueantes de receptor de TL1A-ligando

[0385] Se preparó huTL1A biotinilado haciendo reaccionar 100 µg/ml de NHS LC biotina (Pierce, N.º de Cat. 21338) y 100 µg de huTL1A (preparado como se describe en el Ejemplo 2) en 1 ml de PBS pH 8,5 durante 1 h a temperatura ambiente. La biotina que no reaccionó se eliminó mediante ultra-filtración usando una columna de centrifugación Amicon Ultra de 5 kDa (Millipore, N.º de Cat. UFC8 005). Los sobrenadantes de hibridoma que contenían anticuerpos de unión a huTL1A se sometieron a ensayo para determinar su capacidad de bloquear la unión de huTL1A al receptor de muerte humano 3 (huDR3) mediante un ensayo de receptor-ligando basado en ELISA. Se recubrieron placas de ELISA (Corning, N.º de Cat. 3702) con 40 µl/pocillo de quimera DR3-Fc humana (1 µg/ml) (R&D Systems, N.º de Cat.943-D3) en tampón de recubrimiento (PBS 1x/azida al 0,05 %), después se incubaron durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron con agua 3 veces y se bloquearon con 90 µl de diluyente (PBS 1x/leche al 1 %) durante 30 min a temperatura ambiente. Se preincubaron 15 µl de sobrenadante de hibridoma anti-TL1A con 45 µl de TL1A biotinilado (30 ng/ml final) en placas de almacenamiento de 96 pocillos (Sigma, N.º de Cat. P6866) en diluyente de ensayo durante 2 h a temperatura ambiente antes de la adición a las placas de ELISA de DR3 prebloqueadas. Después, las placas de ensayo se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas de muestra se lavaron posteriormente 3 veces seguido de la adición de 40 µl/pocillo de estreptavidina-HRP (Pierce, N.º de Cat.21126) y otra incubación de 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces adicionales y se añadieron 40 µl de TMB (Neogen, N.º de Cat. 308177). La reacción de TMB se incubó durante 30 min a temperatura ambiente y después se desactivó con 40 µl/pocillo de ácido clorhídrico 1 N. Por último, las placas se leyeron en un lector de placas ELISA a una longitud de onda de 450 nm. Los límites se fijaron a < 38 % de la señal de control negativo, ESN irrelevantes (sobrenadantes agotados). Los números de muestras capaces de bloquear la interacción huTL1A-DR3 (como se define por este corte) se indican en la Tabla 6.1.

[0387] Tabla 6.1: Bloqueantes de TL1A/DR3 seleccionados

[0389]

[0392] EJEMPLO 7

[0394] Ensayos de bloqueo funcional de TL1A

[0396] Con el fin de cribar hibridomas capaces de bloquear la actividad funcional de TL1A, se empleó la liberación de IFNγ de linfocitos T primarios o un ensayo indicador de NF-κB en linfocitos TF1. Para el ensayo de liberación de IFNγ, se estimularon linfocitos T humanos primarios purificados (Biological Speciality Corp., N.º de Cat.215-01-10) con TL1A humano soluble en presencia o ausencia de sobrenadantes de hibridoma específicos de TL1A. Se estimularon 2 x 10<5>linfocitos T humanos primarios con TL1A humano 8 - 16 ng/ml (Amgen), IL-12 1 - 2 ng/ml (Peprotech) y IL-18 0,5 - 1 ng/ml (R&D Systems) en presencia de sobrenadantes de hibridoma que contenían anticuerpos anti-TL1A en placa de fondo redondo de 96 pocillos a 37 °C durante 72 horas. Después, los sobrenadantes de cultivo se sometieron a ensayo para determinar el nivel de IFNγ mediante ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems). Para el ensayo indicador sensible a TL1A, se estimuló una estirpe celular indicadora de TF-1 NF-κB (Amgen) con TL1A humano soluble o unido a membrana o TL1A de macaco cangrejero soluble. Se incubaron 0,2 - 3 nM o 2 - 20 nM de TL1A humano o de macaco cangrejero soluble (respectivamente) con 10<4>- 10<5>células indicadoras TF-1 NF-κB en presencia de sobrenadantes de hibridoma diluidos en serie (o controles) en placas de 96 o 384 pocillos a 37 °C durante la noche. Para evaluar muestras contra TL1A unido a membrana, se realizaron ensayos de actividad cocultivando la estirpe celular indicadora TF-1 NF-κB con células AM1D que expresaban TL1A humano. Se cocultivaron 10<5>células indicadoras TF-1 NF-κB y 10<3>células AM1D en presencia de 5 ug/ml de anticuerpo anti-TL1A (o controles) en una placa de 384 pocillos a 37 °C durante la noche. La señal indicadora en cada pocillo se determinó usando el sistema de ensayo de luciferasa Steady-Glo de acuerdo con la recomendación del fabricante (Promega).

[0398] EJEMPLO 8

[0400] Rescate molecular y secuenciación de anticuerpos bloqueantes de receptor de TL1A-ligando

[0402] El ARN (total o ARNm) se purificó a partir de pocillos que contenían células de hibridoma productoras de anticuerpos neutralizantes de TL1A usando un Qiagen RNeasy mini o el kit Invitrogen ARNm catcher plus. El ARN purificado se usó para amplificar los genes de la región variable (V) de la cadena ligera y pesada del anticuerpo usando síntesis de ADNc a través de la transcripción inversa, seguido de una reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). La cadena pesada gamma del anticuerpo totalmente humano se obtuvo usando el Qiagen One Step Reverse Transcriptase PCR kit (Qiagen). Este método se usó para generar el ADNc de la primera cadena a partir del molde de ARN y después para amplificar la región variable de la cadena pesada gamma usando PCR múltiple (véase la Tabla 8.1 para consultar la lista completa de cebadores, SEQ ID NO: 1191 a 1252, respectivamente). El cebador 5' específico de la cadena gamma se hibrida con la secuencia señal de la cadena pesada del anticuerpo, mientras que el cebador 3' se hibrida con una región del dominio constante gamma. La cadena ligera kappa totalmente humana se obtuvo usando el kit Qiagen One Step Reverse Transcriptase PCR (Qiagen). Este método se usó para generar el ADNc de la primera cadena a partir del molde de ARN, y después para amplificar la región variable de la cadena ligera kappa usando PCR múltiple. El cebador 5' específico de la cadena ligera kappa se hibrida con la secuencia señal de la cadena ligera del anticuerpo, mientras que el cebador 3' se hibrida con una región del dominio constante kappa. La cadena ligera lambda totalmente humana se obtuvo usando el kit Qiagen One Step Reverse Transcriptase PCR (Qiagen). Este método se usó para generar el ADNc de la primera cadena a partir del molde de ARN, y después para amplificar la región variable de la cadena ligera lambda usando PCR múltiple. El cebador 5' específico de la cadena ligera lambda se hibrida con la secuencia señal de la cadena ligera, mientras que el cebador 3' se hibrida con una región del dominio constante lambda.

[0403] El ADNc amplificado se purificó enzimáticamente usando exonucleasa I y fosfatasa alcalina, y el producto de PCR purificado se secuenció directamente. Las secuencias de aminoácidos se dedujeron bioinformáticamente a partir de las correspondientes secuencias de ácidos nucleicos. Se completaron dos ciclos independientes adicionales de amplificación y secuenciación de RT-PCR para cada muestra de hibridoma con el fin de confirmar que cualquier mutación observada no era consecuencia de la PCR. Después, las secuencias de aminoácidos derivadas se analizaron para determinar el origen de la secuencia de la estirpe germinal de los anticuerpos y para identificar las desviaciones de la secuencia de la estirpe germinal. Las secuencias de aminoácidos correspondientes a las CDR de los anticuerpos secuenciados se alinearon, y estas alineaciones se usaron para agrupar los clones por similitud. Tabla 8.1: Cebadores múltiple utilizados para amplificar genes del anticuerpo V.

[0405]

[0406]

[0408] (donde K = G T)

[0409] EJEMPLO 9 - Ejemplo de referenciaPreparación de construcciones de Ig hetero

[0410] La generación de un anticuerpo biespecífico mediante la coexpresión de dos anticuerpos diferentes conduce a contaminantes que consisten principalmente en cadenas pesadas y ligeras emparejadas erróneamente. La molécula heterotetramérica biespecífica preferida con dos cadenas pesadas diferentes asociadas a cadenas ligeras correctamente emparejadas es sólo una minoría de la cantidad total de combinaciones que pueden ensamblarse. Los contaminantes se producen principalmente por dos razones diferentes. La primera razón es que la cadena pesada que se une en la región Fc del anticuerpo puede homodimerizarse, conduciendo a un anticuerpo monoespecífico convencional, o heterodimerizarse, conduciendo a un posible anticuerpo biespecífico. La segunda razón es que la cadena ligera es promiscua y puede emparejarse con cualquiera de las cadenas pesadas, lo que conduce a un conjunto Fab de cadena ligera-pesada emparejado erróneamente que puede no conservar la unión a la diana deseada. Por estas razones, la ingeniería biespecífica es un proceso de dos etapas. El primer objetivo es evitar la homodimerización de las cadenas pesadas y fomentar la heterodimerización. Esto puede conseguirse a través de modificación genética de la región Fc de los anticuerpos, usando, por ejemplo, las estrategias de mutaciones de botones en ojales o pares de carga. El segundo objetivo es modificar genéticamente la interfaz cadena ligera-pesada de manera que la cadena ligera se asocie específicamente sólo a su cadena pesada afín. La tecnología de plataforma "Ig-hetero" (véanse, por ejemplo, los documentos WO2009089004 y WO2014081955) aprovecha el mecanismo de dirección electrostática para superar los problemas de emparejamiento mencionados anteriormente. Específicamente, se introducen o aprovechan restos cargados para impulsar la heterodimerización de la cadena pesada y corregir la asociación cadena ligera-pesada. Las mutaciones de pares de carga (CPM) en el dominio CH3 de la región Fc impulsan la heterodimerización de las dos cadenas pesadas diferentes a través de cargas opuestas que provocan atracción electrostática (véase, por ejemplo, el documento WO2009089004 y la Patente de los EE. UU. N.º 8.592.562); las dos combinaciones de cadenas pesadas idénticas tienen cargas yuxtapuestas idénticas y, por lo tanto, se repelen.

[0411] El emparejamiento correcto cadena pesada-cadena ligera se facilita por las CPM en la interfaz de unión HC/LC o la interfaz de unión HC1/HC2 (véase la Figura 1). Las combinaciones cadena pesada-cadena ligera correctas tendrán cargas opuestas y, por lo tanto, se atraerán entre sí, mientras que las combinaciones cadena pesadacadena ligera incorrectas tendrán las mismas cargas yuxtapuestas, dando como resultado la repulsión. En la Figura 1, las moléculas de Ig-hetero ensambladas correctamente tienen dos o tres CPM HC1/HC2 y de dos a cuatro CPM HC/LC que impulsan el ensamblaje del heterotetrámero preferido que comprende dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas ligeras diferentes de manera que el heterotetrámero será el componente mayoritario generado por el sistema de expresión. Los ADN que codifican Ig hetero anti-TL1A/anti-TNF-α contienen fragmentos que codifican la cadena pesada anti-TL1A (o anti-TNF-α) y Fab anti-TNF-α (o anti-TL1A). Los ADN se clonaron en el vector pTT5.1. Después, estos vectores de expresión se usaron para transfectar y expresar biespecíficos anti-TL1A/anti-TNF-α en células 2936E humanas.

[0412] Se usaron anticuerpos anti-TNF-α 3.2, 234 y certolizumab con anticuerpos anti-TL1A 3B3, 2G11, 23B3 VH3, 23B3 VH4 y 3C6 para modificar por ingeniería genética moléculas de Ig hetero como se describe en la Tabla J usando clonación, expresión y purificación de alto rendimiento. Cada una de las moléculas de Ig hetero biespecíficas tenía uno de los cuatro formatos que se muestran en la Figura 1 usando el armazón sin función efectora de IgG1 o un armazón de IgG2. Las moléculas de IgG preferidas incorporan las mutaciones de carga que se muestran en la Figura 1 (v2), que se muestran en la Tabla M. El armazón sin función efectora de IgG1 comprende las sustituciones R292C y V302C y también puede comprender la sustitución N297G (también conocido como armazón SEFL2).

[0413] EJEMPLO 10 - Ejemplo de referencia

[0414] Método para la expresión y purificación de moléculas de Ig-hetero anti-TL1A/anti-TNFα

[0415] La expresión de Ig-hetero se realizó mediante transfección transitoria de células 293-6E. Un día antes de la transfección, se configuró el cultivo N-1 en una bolsa Wave de 20 l, a 36 °C-37 °C, 5 % de CO<2>, superposición 0,2 LPM con un volumen total de 9 l de cultivo a 8,5 E5 vc/ml en medio Freestyle F-17 (Thermo Fisher). Después, el complejo de transfección se preparó mezclando medio F-17 Freestyle, precalentado con ADN de transfección 0,5 mg/l, con una relación de cadena de ADN plasmídico 1:1:1:1. El volumen del complejo de transfección (medio+ADN+reactivo PEI) fue del 10 % del volumen de cultivo final. Cuatro horas después de la transfección, se añadió una alimentación de yeastolato y glucosa. El cultivo se recogió el día seis a una concentración de 2,11 células E6/ml y una viabilidad del 78,2 %. El título de expresión se midió usando el sistema ForteBio Octet Q a 84,0 mg/l. El medio acondicionado se recogió por centrifugación y se filtró usando un filtro de acetato de celulosa de 0,2 µm usando una bomba peristáltica.

[0416] Para la purificación, las moléculas de Ig-hetero se capturaron por afinidad mediante cromatografía MabSelect Sure (GE Life Sciences, Piscataway, NJ), usando PBS de Dulbecco sin cationes divalentes (Invitrogen, Carlsbad, CA) como tampón de lavado y ácido acético 100 mM, pH 3,6 como tampón de elución (Figura 3). Todas las separaciones se realizaron a temperatura ambiente. El pico de elución se agrupó basándose en el cromatograma, se neutralizó a pH 7,0 usando una base de tris 2 M, se diluyó con 5 volúmenes de agua y se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,22 µm. Para eliminar la mitad de las especies de anticuerpos, la muestra se cargó después en una columna de sefarosa SP-HP (GE Life Sciences, Piscataway, NJ) y se lavó con 8 volúmenes de columna de SP-Tampón A (fosfato de sodio 20 mM, pH 7,0) seguido de elución usando un gradiente de volumen de columna de 20 hasta el 60 % de SP-Tampón B (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 1 M, pH 7,0) (Figura 4). Se generó un grupo basándose en el análisis de las fracciones por cromatograma y Caliper LabChip (Perkin Elmer, Waltham, MA). El grupo se acondicionó con un volumen igual de tampón HIC 2X (fosfato de sodio 200 mM, sulfato de amonio 1,5 M, pH 7,0) y se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,22 µm. Para eliminar las especies emparejadas erróneamente, la muestra se cargó en una columna de sefarosa Butil-HP (GE Life Sciences, Piscataway, NJ) y se lavó con 8 volúmenes de columna de Butil-Tampón A (fosfato de sodio 50 mM, sulfato de amonio 0,75 M, pH 7,0) seguido de elución usando un gradiente de volumen de columna de 20 hasta el 100 % de Butil-Tampón B (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0) (Figura 5). Se generó un grupo basándose en el análisis de las fracciones por cromatograma y Caliper LabChip (Perkin Elmer, Waltham, MA) en condiciones no reductoras y reductoras. El grupo se diafiltró frente a aproximadamente 30 volúmenes de acetato de sodio 10 mM, sacarosa al 9 %, pH 5,2 usando casetes de diálisis Slide-A-Lyzer con una membrana de corte de 10 kDa (Pierce, Rockford, IL) y se concentró adicionalmente usando un concentrador centrífugo Vivaspin-20 con una membrana de corte de 10 kDa (Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Alemania). Después, el material concentrado se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,8/0,2 µm y la concentración se determinó mediante la absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción de aproximadamente 212,000. La pureza de la muestra se determinó mediante análisis por Caliper LabChip en condiciones reductoras (con 2-mercaptoetanol al 2 %) y no reductoras (con yodoacetamida 25 mM) (Figura 6). La SEC analítica se realizó usando una columna Zenix-C SEC-300 (Sepax Technologies, Newark, DE) con una elución isocrática en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 250 mM, pH 6,9 durante 18' (Figura 7).

[0418] Con el fin de evaluar tanto la integridad de Ig-hetero como confirmar el emparejamiento cadena pesada-cadena ligera, se realizó LC-MS en Ig-hetero no reducida, así como Ig-hetero después de la digestión limitada de lisil endoproteinasa C (Wako, Richmond, VA) para producir las regiones Fab' de Ig-hetero (fragmento de unión a antígeno) de la Ig-hetero. El análisis de Ig-hetero no reducida se realizó mediante dilución simple de 30 µg de muestra de Ig-hetero nativa, 1:1 en TFA al 0,1 % e inyección de 20 µg. El análisis de Fab' se logró mediante incubación de Ig-hetero en presencia de lisil endoproteinasa C usando una relación enzima/sustrato 1:400 en presencia de Tris 100 mM, ajustada a pH 8, durante 30 minutos a 37 °C. Después, la reacción se detuvo por dilución en un volumen igual de TFA al 0,1 %. La escisión inicial del anticuerpo por la lisil endoproteinasa C está justo por encima de los disulfuros de bisagra después de la lisina en el motivo de secuencia SCDK/THTCPPC que produce fragmentos Fab y Fc.

[0420] El análisis de masas se realizó usando un espectrómetro de masas Agilent 6230 ESI-TOF y un sistema de HPLC cuaternaria 1260 equipado con una columna Zorbax 300SB-C8, 2,1 x 50 mm 3,5 µm (Agilent, Santa Clara, CA). La fase móvil A consistió en TFA al 0,1 %, y la fase móvil B consistió en n-propanol al 90 %, TFA al 0,1 % en agua. Las condiciones de gradiente cromatográfico para el análisis de Ig-hetero no reducida fueron las siguientes: 20 % de fase móvil B durante 1 minuto; 1-9 min, 20-70 % de B; 9-10 min, 70-100 % de B; 10-11 min, 100 % de B. La temperatura de la columna se mantuvo a 75 °C y después se realizó el equilibrado de la columna a 20 % de fase móvil B durante 7 minutos antes de la inyección de la siguiente muestra. Los ajustes de ESI-TOF fueron los siguientes: voltaje capilar, 5900 V; temperatura del gas, 340 °C; gas seco, 13 l/min; presión del nebulizador, 172,37 kPa (25 psig); voltaje del fragmentador 460 V y voltaje del skimmer, 95 V (figura 8).

[0422] El análisis de Ig-hetero digerida con lisl endoproteinasa C se realizó inyectando 20 µg en la columna de HPLC de fase inversa y eluyendo usando el siguiente gradiente de LC: 2 % de fase móvil mantenida durante 2 minutos; 2-12 min, 2-45 % de B; 12-16 min, 45-90 % de B; 16-17 min, 90 % de B. La temperatura de la columna se mantuvo a 75 °C y después se realizó el equilibrado de la columna a 20 % de fase móvil B durante 7 minutos antes de la inyección de la siguiente muestra (figura 9).

[0424] EJEMPLO 11 - Ejemplo de referencia

[0426] Preparación de construcciones IgG-scFv

[0428] Cada proteína de unión a antígeno IgG-scFv anti-TL1A / anti-TNF-α consiste en dos dominios de unión a antígeno, uno dirigido contra TL1A y el otro contra TNF-α. Los ADN que codifican IgG-scFv anti-TL1A / anti-TNF-α contienen fragmentos que codifican la cadena pesada (HC) anti-TL1A (o anti-TNF-α) en los que el extremo C se fusiona con Fv de cadena única (scFv) del anticuerpo anti-TNF-α (o anti-TL1A) (véase la Figura 2) con o sin pinza de cisteína con el fin de mejorar las propiedades biofísicas. Con el fin de introducir la pinza de cisteína, las posiciones 44 (numeración de Kabat) en VH y 100 (numeración de Kabat) en VL se mutaron a cisteína. Los ADN se clonaron en el vector pTT5.1. Después, estos vectores de expresión se usaron para transfectar y expresar biespecíficos anti-TL1A/anti-TNF-α en células 293-6E humanas. Las secuencias completas para las proteínas de unión a antígeno IgG-scFv anti-TL1A / anti-TNF-α producidas se muestran en las Tablas L y M.

[0430] EJEMPLO 12 - Ejemplo de referencia

[0431] Método para purificar moléculas de IgG-scFv anti-TL1A/anti-TNFα

[0432] La expresión de IgG-scFv se realizó mediante producciones transitorias de 293. Un día antes de la transfección, los cultivos se establecieron en ocho matraces Thompson Ultra Rendimiento de 5 l, con un volumen total de 2,250 l de cultivo a 8,5E5 vc/ml cada uno en medio Freestyle F-17 (Thermo Fisher). Los cultivos se mantuvieron a 36 °C-37 °C, 5 % de CO<2>y se agitaron a 120 RPM. El complejo de transfección se preparó mezclando medio F-17 Freestyle con ADN 0,5 mg/l, usando un 20 % de plásmido codificante y un 80 % de vector pTT5 vacío y PEI con un volumen de cultivo final del 10 %. Cuatro horas después se añadió un lisado de levadura y alimentación de glucosa a cada matraz. Seis días después de la transfección, las células se recogieron mediante centrifugación, se agruparon y se filtraron. El título promedio se midió mediante Forte Bio Octet a 25 mg/l.

[0433] Las moléculas de IgG-scFv se capturaron por afinidad mediante cromatografía MabSelect Sure (GE Life Sciences, Piscataway, NJ), usando PBS de Dulbecco sin cationes divalentes (Invitrogen, Carlsbad, CA) como tampón de lavado y ácido acético 100 mM, pH 3,6 como tampón de elución (Figura 10). Las separaciones se realizaron a temperatura ambiente. El pico de elución se agrupó basándose en el cromatograma, se neutralizó a pH 7,0 usando una base tris 2 M, se diluyó con un volumen de citrato 10 mM, lisina 75 mM, trehalosa al 4 %, pH 7,0, y se concentró a aproximadamente 20 mg/ml usando un concentrador centrífugo Vivacell-100 con una membrana de corte de 30 kDa (Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Alemania). Para eliminar los agregados de alto peso molecular, la muestra se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,8/0,2-µm, después se cargó en una columna Superdex 200 Prep Grade (GE Life Sciences, Piscataway, NJ) equilibrada con citrato 10 mM, lisina 75 mM, trehalosa al 4 %, pH 7,0 y se eluyó con un gradiente isocrático con el mismo tampón (Figura 11). Las separaciones por filtración en gel se realizaron a aproximadamente 7 °C. Se generó un grupo basado en el cromatograma y la SEC analítica de las fracciones usando una columna Zenix-C SEC-300 (Sepax Technologies, Newark, DE). La mezcla se concentró adicionalmente usando un concentrador centrífugo Vivaspin-20 con una membrana de corte de 30 kDa (Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Alemania) y se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,8/0,2 µm. La concentración se determinó mediante la absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción de aproximadamente 341.000. La pureza de la muestra se determinó mediante análisis por Caliper LabChip en condiciones reductoras (con 2-mercaptoetanol al 2 %) y no reductoras (con yodoacetamida 25 mM) (Figura 12). La SEC analítica se realizó usando una columna Zenix-C SEC-300 (Sepax Technologies, Newark, DE) con una elución isocrática en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 250 mM, pH 6,9 durarte 18' (Figura 13).

[0434] Debido al gran tamaño de los Ig-scFv, no se pudo lograr una masa exacta de 200 kDa o superior mediante análisis de masa por ESI-TOF. Con el fin de verificar la masa y evaluar la calidad, los Ig-scFv se analizaron después de la digestión con proteasa IdeS (Promega, Madison WI), que escinde justo debajo de los disulfuros de bisagra de IgG, entre glicinas en el motivo de secuencia, CPPCPAPELLG/GP produciendo (Fab)<2>y Fc con scFv fusionado C-terminalmente. Los Ig-scFv se incubaron en presencia de proteasa IdeS usando una relación de sustrato enzimático 1:10 durante 1 hora a 37 °C. La muestra se diluyó 1:1 en TFA al 0,1 % y se inyectaron 20 µg en LC-MS.

[0435] El análisis de masas se realizó usando un espectrómetro de masas Agilent 6230 ESI-TOF y un sistema de HPLC cuaternaria 1260 equipado con una columna Zorbax 300SB-C8, 2,1 x 50 mm 3,5 µm (Santa Clara, CA). La fase móvil A consistió en TFA al 0,1 %, y la fase móvil B consistió en n-propanol al 90 %, TFA al 0,1 % en agua. El análisis de Ig-scFv digerido con proteasa IdeS se realizó inyectando 20 µg y eluyendo usando el siguiente gradiente de LC: 2 % de fase móvil mantenida durante 2 minutos; 2-12 min, 2-45 % de B; 12-16 min, 45-90 % de B; 16-17 min, 90 % de B. La temperatura de la columna se mantuvo a 75 °C y después se realizó el equilibrado de la columna a 20 % de fase móvil B durante 7 minutos antes de la inyección de la siguiente muestra (figura 14).EJEMPLO 13

[0436] Ensayo de unión a TL1A

[0437] Se inmovilizó en primer lugar Fc anti-humano de cabra (Jackson Lab, N.º de Cat.109-005-098) en un chip sensor SCM5 usando acoplamiento de amina. Se inyectaron anticuerpos monoclonales anti-TL1A, fragmento Fab (usando anticuerpo anti-huFab, GE Healthcare N.º de Cat.28-9583-25) o moléculas biespecíficas anti-TL1A/anti-TNF-α en el chip a 10 µl/min durante 1 minuto. Se inyectaron diversas concentraciones de proteína TL1A humana o de macaco cangrejero de 0,78 a 25 nM en tampón de muestra (PBS, P20 al 0,005 %, BSA 0,1 mg/ml) a una tasa de flujo de 50 µl/min durante 3 min de asociación, 10 min de disociación. La constante de asociación, la constante de disociación y la constante de disociación de equilibrio se calcularon usando un modelo de unión 1:1 en el software BIAevaluation.

[0438] Las Tablas 13.1-13.3 muestran datos de unión anti-TL1A para anticuerpos anti-TL1A, anticuerpos biespecíficos de Ig hetero y anticuerpos biespecíficos IgG-scFv.

[0439] Tabla 13.1: Unión a TL1A de anticuerpos anti-TL1A

[0440]

[0442] Tabla 13.2: Unión a TL1A del fragmento Fab anti-TL1A

[0444]

[0446] Tabla 13.3: Unión a TL1A de anticuerpos biespecíficos de Ig hetero

[0448]

[0450] EJEMPLO 14

[0451] Ensayo de actividad de TL1A

[0452] El ensayo de actividad de TL1A se realizó usando la estirpe celular indicadora TF-1 NF-κB. En resumen, se incubaron 30 ng/ml (CE90) de TL1A humano o de macaco cangrejero con 10<4>células indicadoras TF-1 NF-κB en presencia de anticuerpos anti-TL1A diluidos en serie o moléculas biespecíficas anti-TL1A/anti-TNF-α en placa de 96 pocillos a 37 °C durante la noche. Cada pocillo se complementó con 50 µl de solución de ensayo de luciferasa Steady-glo (Promega). La placa se cubrió y se incubó mientras se agitaba durante 10 minutos. La actividad de luciferasa se analizó mediante lector microbeta.

[0453] Las Tablas 14.1-14.3 muestran el control de calidad (CC) anti-TL1A y datos de actividad para anticuerpos anti-TL1A, anticuerpos biespecíficos de Ig hetero, anticuerpos biespecíficos IgG-scFv y Fab' con TL1A tanto humano como de macaco cangrejero.

[0454] Tabla 14.1: Actividad anti-TL1A de anticuerpos anti-TL1A y fragmentos Fab

[0455]

[0456]

[0459] 

[0462] 

[0464] EJEMPLO 15

[0465] Ensayo de unión a TNF-α

[0466] Se inmovilizó en primer lugar Fc anti-humano de cabra en un chip sensor SCM5 usando acoplamiento de amina. Se inyectaron anticuerpos monoclonales anti-TNF, fragmento Fab o biespecíficos TL1A/TNF en el chip a 10 µl/min durante 1 min. Se inyectaron diversas concentraciones de proteína TNF humana o de macaco cangrejero desde 0,78 hasta 25 nM en tampón de muestra (PBS, P20 al 0,005 %, BSA al 0,1 mg/ml) a un caudal de 50 µl/min durante 3 min de asociación, 10 min de disociación. La constante de asociación, la constante de disociación y la constante de disociación de equilibrio se calcularon usando un modelo de unión 1:1 en el software BIAevaluation.

[0467] Las Tablas 15.1-15.3 muestran datos de actividad de unión a TNF-α para anticuerpos anti-TNF-α, anticuerpos biespecíficos de Ig hetero, anticuerpos biespecíficos IgG-scFv y anticuerpos biespecíficos IgG-Fab.

[0468] Tabla 15.1: Actividad de unión a TNF-α de anticuerpos anti-TNF-α y fragmento Fab

[0470]

[0472] Tabla 15.2: Actividad de unión a TNF-α de anticuerpos biespecíficos de Ig hetero

[0474]

[0476] Tabla 15.3: Actividad de unión a TNF-α de anticuerpos biespecíficos IgG-scFv

[0478]

[0479]

[0481] EJEMPLO 16

[0482] Ensayos de actividad de TNF-α

[0483] El ensayo de actividad de TNF-α se realizó usando la estirpe celular indicadora TF-1 NF-kB. En resumen, se incubaron 1 ng/ml (CE90) de TNF-α humano o de macaco cangrejero con 10<4>células indicadoras TF-1 NF-κB en presencia de anticuerpos anti-TNF-α diluidos en serie o moléculas biespecíficas TL1A/TNF-α en placa de 96 pocillos a 37 °C durante la noche. Se añadieron a cada pocillo 50 µl de solución de ensayo de luciferasa Steadyglo (Promega). La placa se cubrió y se incubó mientras se agitaba durante 10 minutos. La actividad de luciferasa se analizó mediante lector microbeta.

[0484] La Tabla 16.1 muestra datos de CC y actividad anti-TNF-α para anticuerpos anti-TNF. Las Tablas 14.2 y 14.3 muestran la actividad de unión anti-TNF-α para proteínas de unión a antígeno biespecíficas de Ig hetero y proteínas de unión a antígeno biespecíficas IgG-scFv, respectivamente.

[0485] Tabla 16.1: Actividad anti-TNF-α de anticuerpos contra TNF-α y fragmentos Fab

[0487]

[0489] EJEMPLO 17

[0490] Actividad molecular biespecífica

[0491] Las actividades de unión a TL1A y TNF-α humanos y de macaco cangrejero de proteínas de unión a antígeno biespecíficas se determinaron como se describe en los Ejemplos 13 y 15. Los datos se muestran en la Tabla 17.1. Tabla 17.1: Actividades de unión a TL1A y TNF humanos y de macaco cangrejero

[0492]

[0494] Las actividades de bloqueo de TL1A y TNF-α humanos y de macaco cangrejero de proteínas de unión a antígeno biespecíficas se determinaron como se describe en los Ejemplos 14 y 16. Los datos se muestran en la Tabla 17.2. Tabla 17.2: Actividades de bloqueo de TL1A y TNF-α humanos y de macaco cangrejero

[0496]

[0498] EJEMPLO 18

[0499] Genotipado de SNP

[0500] Para evaluar la posible asociación del genotipo de TL1A con la expresión, se aisló ADN genómico (ADNg) de donantes de PBMC sanos usando el kit de tejido Gentra Puregene de Qiagen. El ADN genómico se genotipó usando ensayos de genotipado de SNP TaqMan para ensayos rs7848647, rs6478109, rs6478108 y rs3810936 de LifeTech y protocolos estándar en la plataforma de PCR digital de gotitas Bio-Rad. Brevemente, se mezclaron 10 ng de ADNg de cada donante con ddPCR<™>Supermix para sondas (Bio-Rad) y ensayo de genotipado de SNP Taqman (LifeTech) para cada SNP de interés. Se generaron gotitas para cada reacción usando el generador de gotitas QX100<™>(Bio-Rad) y se sometieron a ciclos térmicos en un ciclador térmico C1000 Touch<™>(Bio-Rad). Después de la amplificación, se leyó la fluorescencia de gotitas en un lector de gotitas QX100<™>(Bio-Rad) y los datos se analizaron usando el software QuantaSoft (Bio-Rad). Los donantes se consideraron haplotipo de riesgo homocigoto si sólo había presentes alelos de riesgo en los 4 SNP genotipados (rs7848647, rs6478109, rs6478108 y rs3810936). Los donantes se consideraron haplotipo homocigoto no de riesgo si sólo había presentes alelos de no riesgo en los 4 SNP genotipados. Los donantes se consideraron haplotipo heterocigoto si había presentes alelos tanto de riesgo como de no riesgo en los 4 SNP genotipados. Los donantes que se consideraron "recombinantes" sólo tenían alelos de riesgo homocigotos a rs7848647, rs6478109 y rs6478108, pero eran heterocigotos (alelos de riesgo y no de riesgo presentes) a rs3810936.

[0501] La presencia de SNP sinónimo (rs3810936) en el exón 4 del gen TL1A permitió rastrear la expresión de alelo de riesgo frente a la expresión de alelo no de riesgo mediante PCR digital de gotitas (ddPCR) usando sondas fluorescentes específicas alélicas en el estudio de desequilibrio de expresión alélica (AEI). La frecuencia de uso de alelo de riesgo frente a no de riesgo en PBMC heterocigotas a nivel basal o después de la estimulación por complejo inmunitario se evaluó en diversos puntos temporales. En resumen, se trataron PBMC heterocigotas para el genotipo de TL1A con complejo inmunitario durante diversos períodos de tiempo. Después, se aisló el ARN de PBMC usando un mini kit RNeasy con digestión con DNasa I en columna de Qiagen. El ARN de cada muestra se convirtió en ADNc usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante (LifeTech). La expresión específica de alelo en rs3810936 se determinó usando el ensayo de genotipado de SNP TaqMan específico para rs3810936 (LifeTech) y protocolos convencionales en la plataforma de PCR digital de gotitas Bio-Rad. En resumen, la cantidad de ADNc de entrada se optimizó primero para la expresión de TNFSF15 en cada punto temporal con el fin de aumentar la precisión maximizando el número de gotitas positivas contadas para cada muestra mediante el software QuantaSoft. La cantidad óptima de ADNc por muestra se mezcló con ddPCR<™>Supermix para sondas (Bio-Rad) y ensayo de genotipado de SNP Taqman (LifeTech) para rs3810936. Se generaron gotitas para cada reacción usando el generador de gotitas QX100<™>(Bio-Rad) y se sometieron a ciclos térmicos en un ciclador térmico C1000 Touch<™>(Bio-Rad). Después de la amplificación, se leyó la fluorescencia de gotitas en un lector de gotitas QX100<™>(Bio-Rad). Los datos se analizaron usando el software QuantaSoft (Bio-Rad) y se determinaron copias/ml de cada alelo en rs3810936. La relación de expresión alélica se calculó dividiendo las copias/ml del alelo de riesgo por las copias/ml del alelo no de riesgo. El número total de copias de cada alelo se normalizó mediante la cantidad de entrada de ADNc (copias/ng) y el factor de inducción para cada alelo en cada punto temporal se calculó dividiendo las copias/ng en el punto temporal de interés por las copias/ng en el momento basal (0 h). Se observó una mayor inducción del alelo de riesgo de TL1A en PBMC después del tratamiento con complejo inmunitario en comparación con el alelo no de riesgo en PBMC heterocigotas en el estudio de desequilibrio de expresión alélica.

[0503] El inventor o inventores identificaron un pequeño número de donantes homocigotos para alelos de riesgo en rs7848647, rs6478109 y rs6478108, pero heterocigotos en rs3810936, probablemente debido a la recombinación entre rs6478109 y SNP sinónimo rs3810936. Puesto que estos donantes son heterocigotos en el SNP sinónimo rs381093, el o los inventores podrían rastrear el uso de alelo de riesgo y alelo no de riesgo y evaluar si el desequilibrio de expresión alélica aún se conservaba en estos donantes. Curiosamente, en comparación con los donantes heterocigotos, no se detectó desequilibrio de expresión alélica en estos individuos recombinantes antes o después de la estimulación por complejo inmunitario. Esto demuestra que el SNP sinónimo rs381093 en sí no es responsable de la regulación del desequilibrio alélico. Los SNP reguladores probablemente derivan de rs7848647, rs6478109, rs6478108 y/u otros SNP 5' al SNP sinónimo rs3810936.

[0505] Para evaluar si los datos de desequilibrio de expresión alélica de TL1A se correlacionan con locus de rasgos cuantitativos de expresión (eQTL), donantes de PBMC con alelo de riesgo de TL1A homocigoto, alelos no de riesgo homocigotos o alelos heterocigotos se trataron con complejo inmunitario. Se aisló ARN de cada muestra y después se convirtió en ADNc como se describió previamente. La expresión total de TL1A (TNFSF15) en cada donante se determinó mediante PCR digital. En resumen, se mezcló ADNc de cada muestra con ddPCR<™>Supermix para Sondas (Bio-Rad) y el ensayo de qPCR PrimeTime<®>ID HS.Pt.56a.41003970. Se generaron gotitas para cada reacción usando el generador de gotitas QX100<™>(Bio-Rad) y se sometieron a ciclos térmicos en un ciclador térmico C1000 Touch<™>(Bio-Rad). Después de la amplificación, se leyó la fluorescencia de gotitas en un lector de gotitas QX100<™>(Bio-Rad). Los datos se analizaron usando el software QuantaSoft (Bio-Rad) y se determinaron copias/µl de TL1A y se normalizaron para determinar la cantidad de ADNc de entrada (copias/ng). Los valores de P para las diferencias en los niveles de expresión de TL1A entre diferentes haplotipos de TNFSF15 se determinaron usando el ensayo t de Student. TL1A se expresa a un nivel basal muy bajo en PBMC, pero se induce fuertemente después de la estimulación del complejo inmunitario. A nivel basal, las PBMC de donantes homocigotos para los SNP de riesgo de TL1A tienen menor ARNm de TL1A en comparación con donantes homocigotos no de riesgo, aunque con un número de copias muy bajo, coherente con el estudio de desequilibrio de expresión alélica que demostró una menor relación de alelo de riesgo frente al alelo no de riesgo sin estimulación. Sin embargo, después de la estimulación por complejo inmunitario, las PBMC de donantes homocigotos para los SNP de riesgo de TL1A tienen una mayor expresión de TL1A en comparación con donantes homocigotos no de riesgo. Estos datos, juntos, demostraron que los SNP de riesgo de TL1A regulan una inducción de TL1A mayor. El inventor o inventores especulan que en afecciones inflamatorias tales como la EII, los donantes que portan SNP de riesgo de TL1A probablemente encuentren una inducción de TLIA mayor tras el encuentro de estímulos tales como citocinas, microbios opsonizados o no opsonizados. Por lo tanto, podrían usarse SNP de riesgo de TL1A para la estratificación de pacientes para inhibidor de TL1A o inhibidores biespecíficos anti-TL1A/anti-TNF-α.

[0507] Para evaluar si la regulación de la expresión mediada por el genotipo de TL1A es específica de tejido, se genotiparon células HUVEC de diversos donantes como se ha descrito previamente. Se trataron células HUVEC genotipadas de diversos donantes con IL-1 en diversos puntos temporales. El número total de copias de cada alelo se midió como se ha descrito previamente. La relación de expresión alélica se calculó dividiendo las copias/ml del alelo de riesgo por las copias/ml del alelo no de riesgo. No se observó desequilibrio de expresión alélica en células HUVEC con o sin tratamiento con IL-1.

[0509] EJEMPLO 19

[0511] Modelos de EII en ratón

[0513] Para evaluar el papel de TL1A en la EII, se realizaron una serie de experimentos preclínicos en modelos de EII en ratón. El efecto de la inhibición de TL1A se evaluó en el modelo de colitis espontánea en ratón mdrla-/-. El gen mdrla codifica el gen de resistencia a múltiples fármacos para la glicoproteína P 170. Los ratones con supresión del gen mdr1a son propensos a desarrollar colitis espontánea a partir de las 12 semanas de edad debido a la barrera intestinal debilitada. La evolución de la enfermedad se ve afectada por los microbios intestinales. En el experimento de los presentes inventores, se obtuvieron controles de Mdr1a<-/->o FVB de tipo silvestre hembras de Taconic a las 4-6 semanas de edad. Se monitorizaron regularmente el peso de los animales y la actividad de la enfermedad clínica. La puntuación de actividad de la enfermedad clínica se alcanzó usando una suma de las puntuaciones obtenidas evaluando la inflamación anal (0=ninguna, 1=leve, 2=moderada, 3=grave, 4=prolapso rectal) y la consistencia de las heces (0=normal, 1=húmeda/pegajosa, 2=blanda, 3=diarrea, 4=sangre). Se aleatorizaron ratones (n=10, 6-7 semanas de edad) a diferentes grupos basándose en las mediciones de la actividad de la enfermedad clínica basal, y se trataron por vía intraperitoneal una vez a la semana con 500 µg de anticuerpo anti-TL1A de ratón, anticuerpo anti-IL23p19, anticuerpo anti-IL17RA de ratón o control de isotipo de ratón o sin tratamiento una vez a la semana durante 8 semanas. Después, los ratones se sacrificaron, se tomaron secciones del intestino y se procesaron para la tinción con HyE antes de puntuar la enfermedad por un patólogo. La siguiente puntuación se asignó basándose en la histopatología: 0 = normal; 1 = mínima, infiltrado mononuclear y/o hipertrofia/hiperplasia epitelial; 2 = leve, infiltrado mononuclear y/o hipertrofia/hiperplasia epitelial; 3 = moderada, infiltrado mononuclear y/o hipertrofia/hiperplasia epitelial con abscesos de cripta raros; 4 = marcada, igual que para 3 más abscesos de cripta abundantes y/o ulceración focal; 5 = grave, igual que para 4 pero con grandes áreas de pérdida de cripta y/o extensas áreas de ulceración. El análisis estadístico se realizó usando ANOVA unidireccional con Dunett en comparación con el grupo de mIgG1. En conclusión, el tratamiento profiláctico con mAb anti-TL1A inhibió el desarrollo de colitis espontánea en ratones mdr1a<-/->.

[0514] El inventor o inventores también evaluaron si la exposición a la proteína TL1A exacerbaría el desarrollo de colitis en ratones mdr1a<-/->, que son propensos a desarrollar colitis espontánea a partir de las 12 semanas de edad debido a una barrera intestinal debilitada. Se trataron ratones mdr1a-/- o ratones de control de tipo silvestre a las 6-8 semanas de edad por vía intraperitoneal una vez a la semana con 150 µg de proteína de fusión mFc-TL1A recombinante o control de isotipo tres veces a la semana durante 4 semanas. La actividad clínica de la enfermedad se monitorizó evaluando la inflamación anal y la consistencia de las heces como se describió previamente. Después de 4 semanas de tratamiento, los ratones se sacrificaron, se tomaron secciones del intestino y se procesaron para la tinción con HyE antes de puntuar la enfermedad como se describió previamente. El análisis estadístico se realizó usando ANOVA unidireccional con Dunett en comparación con el grupo de mIgG1. La exposición a la proteína TL1A exacerbó gravemente el desarrollo de colitis en ratones mdr1a<-/->pero no en ratones de tipo silvestre.

[0515] El inventor o inventores examinaron adicionalmente el impacto de la exposición a TL1A en linfocitos de lámina propia en ratones mdr1a<-/->frente a ratones de tipo silvestre. En resumen, se aislaron linfocitos de lámina propia como se describió previamente (D'Souza WNet al.,JI, V168:5566-5572, 2002). En resumen, se aislaron intestinos, se cortaron abiertos longitudinalmente, se aclararaon con tampón y se cortaron en trozos de 0,5 cm. Después, se lavaron dos veces en EDTA y los sobrenadantes se descartaron. Los trozos se lavaron con RPMI y se incubaron en colagenasa/DNasa durante 30 minutos. Las células aisladas se ejecutaron a través de un gradiente de percoll y las células recogidas en la interfase se tiñeron para los antígenos de superficie y se analizaron mediante FACS. La exposición a TL1A en ratones mdr1a<-/->dio como resultado un aumento de células inflamatorias en la lámina propia.

[0516] EJEMPLO 20

[0517] Estudios farmacodinámicos

[0518] Para evaluar si las exposiciones a TL1A y TNF dan como resultado efectos farmacodinámicos similares o diferentes, en primer lugar se inyectaron ratones C57Bl/6 (8 semanas, hembra) por vía intraperitonial 500 µg/ratón de anti-TL1A de ratón, anti-TNF-α de ratón o PBS. Después de 4 horas, los ratones se expusieron después con 100 µg/ratones de TL1A o 10 µg/ratón de TNF-α o sin exposición. Los sueros se recogieron después de 24 horas. Las citocinas se midieron mediante MSD (IL-22 se midió mediante ELISA). La exposición a la proteína TL1A o TNF en ratones dio como resultado una inducción de citocinas distinta. La exposición a TL1A indujo principalmente IFN-y e IL-5, mientras que la exposición a TNF indujo IL-6, IL-8 e IL-10.

[0519] El inventor o inventores evaluaron la inducción de citocinas mediante tratamiento con TL1A o TNF en PBMC humanas. En resumen, se cultivaron PBMC recién aisladas de sangre humana en medio (RPMI1640 complementado con FBS al 10 %, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, 2-ME 5 X 10<-5>M y antibióticos) en presencia de 100 ng/ml de TL1A o TNF-α humano. El sobrenadante se recogió después de 72 horas. Las citocinas en el sobrenadante se midieron mediante MSD (IL-22 se midió mediante ELISA). De manera similar al experimento de exposición en ratones, el tratamiento con TL1A de PBMC humana dio como resultado la inducción de IFN-y, IL-5 e IL-22, mientras que el tratamiento con TNF dio como resultado un aumento de IL-8, IL-10 y MCP-1. Por lo tanto, TL1A y TNF inducen perfiles de citocinas distintos en PBMC humanas.

[0520] EJEMPLO 21 - Ejemplo de referencia

[0521] Moléculas de IgG-Fab

[0522] Se prepararon proteínas de unión a antígeno biespecíficas con un subconjunto de los anticuerpos anti-TNFα y anti-TL1A. En algunas realizaciones de este formato IgG-Fab, un polipéptido que comprende un dominio VH-CH1 de un segundo anticuerpo se fusiona a través de un enlazador peptídico al extremo carboxilo de la cadena pesada de un primer anticuerpo para formar una cadena pesada modificada. Un polipéptido que comprende los dominios restantes del fragmento Fab del primer anticuerpo (es decir, un dominio VL-CL) se coexpresa con la cadena ligera del primer anticuerpo y la cadena pesada modificada para producir la molécula completa. El ensamblaje de la molécula completa crea una proteína de unión tetravalente que tiene dos dominios de unión a antígeno contra un primer antígeno ubicado en el lado amino terminal de una región Fc de inmunoglobulina dimerizada y dos dominios de unión a antígeno contra un segundo antígeno ubicado en el lado carboxilo terminal de la región Fc dimerizada.

[0523] El IgG-Fab TNFα/TL1A consiste en dos dominios de unión a antígeno, uno dirigido contra TNFα y el otro contra TL1A. Las moléculas de ADN que codifican moléculas de IgG-Fab TNFα/TL1A contienen fragmentos que codifican una cadena ligera del anticuerpo anti-TNFα (o anti-TL1A), una cadena pesada del anticuerpo anti-TNFα (o anti-TL1A) en la que el extremo C se fusiona a (i) una cadena ligera del anticuerpo anti-TL1A (o anti-TNFα ) o (ii) un Fd anti-TL1A (o anti-TNFα ) (VH-CH1) y un tercer polipéptido que comprende la otra mitad del fragmento Fab para completar el dominio de unión carboxi-terminal; por ejemplo, (i) un Fd anti-TL1A (o anti-TNFα) o (ii) una cadena ligera de anticuerpo anti-TL1A (o anti-TNFα). Las moléculas biespecíficas de IgG-Fab contienen mutaciones de pares de carga introducidas en los dominios CH1 y CL de cada región Fab (Fab 1 y Fab 2 como se ilustra en la Figura 3). Los pares de carga están diseñados para permitir el ensamblaje preferencial del par cadena ligera anti-TNFAR/VHCH1(Fd) y el par cadena ligera anti-TL1A/VHCH1 (Fd). Como una estrategia adicional para promover el emparejamiento correcto del par cadena ligera/VHCH1 (Fd), para un subconjunto de las moléculas de IgG-Fab generadas, las regiones CL y CH1 en el Fab carboxilo-terminal (es decir, Fab 2) se intercambiaron de manera que el polipéptido fusionado a la región carboxilo-terminal de la cadena pesada del segundo anticuerpo comprendía regiones VL y CH1 del primer anticuerpo y el segundo polipéptido comprendía regiones VH y CL del primer anticuerpo. Véanse las moléculas enumeradas en las Tablas 21.1 y 21.3, con las CDR de VL y VH enumeradas en la Tabla 21.2A y 21.2B y la pureza enumerada en la Tabla 21.4. Las moléculas de ADN se generaron mediante gBlocks sintetizados y se clonaron en el vector pTT5.1. Estos vectores de expresión se usaron para transfectar y expresar las moléculas biespecíficas TNFα/TL1A en células 293-6E humanas. Se generaron 144 moléculas biespecíficas de IgG-Fab diferentes. Las secuencias completas para cada molécula se exponen en la Tabla 21.1 y el Listado de Secuencias.

[0525] Las moléculas de IgG-Fab se purificaron usando afinidad capturada por cromatografía MabSelect Sure (GE Life Sciences, Piscataway, NJ) usando un automuestreador de gran formato (LFAS, Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA). El medio acondicionado clarificado se cargó en una columna HiTrap MabSelect Sure de 1 ml (GE Life Sciences, Piscataway, NJ) equilibrada con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin cationes divalentes (D-PBS, Life Technologies, Grand Island, NY). Las columnas MabSelect se lavaron con 8 volúmenes de columna de D-PBS y se eluyeron con ácido acético 100 mM, pH 3,6. Cuando los eluidos de proteína A tenían una absorbancia por encima de 5 mUA a 280 nm, el eluyente se cargó directamente en una columna de desalación HiTrap (GE Life Sciences, Piscataway, NJ) y se desarrolló con 1,2 volúmenes de columna de acetato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5,0. Cuando los eluidos de desalación tenían una absorbancia por encima de 3 mUA a 280 nm, se desencadenó la recogida de muestras y las fracciones se recogieron en bloques de 96 pocillos profundos hasta un máximo de 2 ml cada uno. La pureza de la muestra se determinó mediante análisis por Caliper LabChip en condiciones reductoras (con 2-mercaptoetanol al 2 %) y no reductoras (con yodoacetamida 25 mM). La SEC analítica se realizó usando una columna Zenix-C SEC-300 (Sepax Technologies, Newark, DE) con una elución isocrática en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 250 mM, pH 6,9 durante 8'.

[0527] Las moléculas de IgG-Fab se sometieron a ensayo para determinar su capacidad de expresión (título y recuperación) y actividad. Los resultados se muestran en las Figuras 27 a 33 y en la Tabla 21.3. En la Tabla 21.3 y en todo el documento, "ada" se refiere a adalimumab.

[0529] El ensayo de actividad de TL1A se realizó usando la estirpe celular indicadora TF-1 NF-κB. En resumen, se incubaron 30 ng/ml (CE90) de TL1A humano o de macaco cangrejero con 10<4>células indicadoras TF-1 NF-κB en presencia de anticuerpos anti-TL1A diluidos en serie o moléculas biespecíficas TL1A/TNF-α en placa de 96 pocillos a 37 °C durante la noche. Cada pocillo se complementó con 50 µl de solución de ensayo de luciferasa Steady-glo (Promega). La placa se cubrió y se incubó mientras se agitaba durante 10 minutos. La actividad de luciferasa se analizó mediante lector microbeta.

[0531] El ensayo de actividad de TNFα se realizó usando la estirpe celular indicadora TF-1 NF-κB. En resumen, se incubaron 1 ng/ml (CE90) de TNF-α humano o de macaco cangrejero con 10<4>células indicadoras TF-1 NF-κB en presencia de anticuerpos anti-TNF-α diluidos en serie o moléculas biespecíficas TL1A/TNFα en placa de 96 pocillos a 37 °C durante la noche. Se añadieron a cada pocillo 50 µl de solución de ensayo de luciferasa Steady-glo (Promega). La placa se cubrió y se incubó mientras se agitaba durante 10 minutos. La actividad de luciferasa se analizó mediante lector microbeta.

[0533] Tabla 21.1: Secuencias de aminoácidos de moléculas de IgG-Fab anti-TL1A anti-TNF-α

[0534]

[0535]

[0536]

[0537]

[0538]

[0539]

[0542] Las secuencias de aminoácidos anteriores están codificadas por las secuencias de ácido nucleico que las preceden inmediatamente en el Listado de secuencias.

[0544] Las secuencias de CDR de los dominios VL y VH de las anteriores son como se muestran en las Tablas 21.2A y 21.2B a continuación.

[0545]

[0546]

[0547] Tabla 21.3: Título, recuperación y actividad de IgG-Fab

[0548]

[0549]

[0550]

[0551]

[0552]

[0553]

[0554]

[0555]

[0556]

[0557]

[0558]

[0559]

[0560]

[0561]

[0562]

[0563] Se entiende que la invención descrita no se limita a la metodología, protocolos y materiales particulares descritos, ya que estos pueden variar. También se entiende que la terminología utilizada en esta memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende limitar el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

[0564] Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de determinar, usando únicamente una experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita en el presente documento.

[0566] ABREVIATURAS

[0568] Los términos abreviados utilizados a lo largo de esta memoria descriptiva se definen de la siguiente manera. aa, AA aminoácido

[0569] AEI desequilibrio de expresión alélica

[0570] ANOVA análisis de la varianza

[0571] BSA albúmina sérica bovina

[0572] CDR regiones determinantes de la complementariedad

[0573] CHO células de ovario de hámster chino

[0574] CPM mutación de par de carga

[0575] DMEM Medio Eagle modificado de Dulbecco

[0576] DMSO sulfóxido de dimetilo

[0577] ELISA ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

[0578] eQTL locus de rasgos cuantitativos de expresión

[0579] ESI-TOF ionización por electronebulización-tiempo de vuelo

[0580] ESN sobrenadante agotado

[0581] FACS clasificación celular activada por fluorescencia

[0582] FBS suero bovino fetal

[0583] FPLC cromatografía de líquidos de proteínas rápida

[0584] FVB una cepa de ratones endogámicos para el alelo del virus de la leucemia Friend 1b (Fvlb) HyE Hematoxilina y eosina

[0585] HA hipoxantina

[0586] HIC cromatografía de interacción hidrófoba

[0587] HPLC cromatografía de líquidos de alto rendimiento

[0588] HRP peroxidasa de rábano picante

[0589] HUVEC célula epitelial de la vena umbilical humana

[0590] EII enfermedad inflamatoria intestinal

[0591] IDMEM DMEM sin glutamina

[0592] IFN interferón

[0593] IL interleucina

[0594] MCP proteína quimiotáctica monocítica

[0595] MSD base de datos de estructura macromolecular

[0596] NA ácidos nucleico

[0597] PBMC células mononucleares de sangre periférica

[0598] PBS solución salina tamponada con fosfato

[0599] PCR reacción en cadena de la polimerasa

[0600] PEG polietilenglicol

[0601] PEI polietilenimina

[0602] QTL locus de rasgos cuantitativos

[0603] RPMI medio desarrollados en el Roswell Park Memorial Institute

[0604] RT-PCR reacción en cadena de la polimerasa a temperatura ambiente

[0605] SNP polimorfismo de un solo nucleótido

[0606] TFA ácido trifluoroacético

[0607] TL1A Ligando 1A similar a TNF (TNFSF15)

[0608] TMB tetrametilbenceno

[0609] TNF factor de necrosis tumoral α

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión a antígeno específica para TL1A, en donde la proteína de unión a antígeno comprende una combinación de secuencias para LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 seleccionada de la siguiente Tabla A, en donde la combinación de secuencias para LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, y HCDR3 se selecciona de las filas que se muestran en la Tabla A:

2. La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde la combinación de secuencias de LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3 se selecciona de:

a. anticuerpo 9C8, SEQ ID NO.110, 112, 108, 170, 178 y 180; y

b. anticuerpo 383, SEQ ID NO.122, 124, 126, 188, 190 y 192.

3. La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 1 que comprende combinaciones de secuencias de dominio variable de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia con proteínas de unión a antígeno seleccionadas de la Tabla D, SEQ ID NO:

a. 6 y 8;

b. 10 y 12;

c. 14 y 16;

d. 18 y 20;

e. 22 y 24;

f. 26 y 28;

g. 30 y 32;

h. 491 y 495;

i. 493 y 497;

j. 866 y 868;

k. 870 y 872;

l. 874 y 876;

m. 878 y 880;

n. 882 y 884;

o. 890 y 892;

p. 894 y 896;

q. 898 y 900;

r. 902 y 904;

s. 906 y 908;

t. 910 y 912;

u. 914 y 916;

v. 918 y 920;

w.922 y 920;

x. 924 y 926;

y. 928 y 930; y

z. 932 y 934.

4. La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 3 que comprende combinaciones de secuencias de dominio variable de cadena ligera y pesada de proteínas de unión a antígeno seleccionadas de:

a. anticuerpo 9C8, SEQ ID NO: 14 y 16; y

b. anticuerpo 383, SEQ ID NO: 22 y 24.

5. La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 1 que comprende una combinación de secuencias de cadena ligera y pesada que tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia con una combinación de secuencias de cadena ligera y pesada seleccionadas de la Tabla E, SEQ ID NO:

a. 50 y 52,

b. 54 y 56,

c. 58 y 60,

d. 62 y 64,

e. 66 y 68,

f. 70 y 72,

g. 74 y 76,

h. 455 y 457,

i, 459 y 461

j. 1116 y 1118,

k. 1120 y 1122,

I. 1124 y 1126,

m. 1128 y 1130,

n. 1132 y 1134,

o. 1136 y 1138,

p. 1140 y 1142,

q. 1144 y 1146,

r. 1148 y 1150,

s. 1152 y 1154,

t. 1156 y 1158,

u. 1160 y 1162,

v. 1164 y 1166,

w.1168 y 1170,

x. 1172 y 1174,

y. 1176 y 1178,

z. 1180 y 1182,

aa. 1184 y 1186, y

bb. 1188 y 1190.

6. La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 5, en donde la proteína comprende una combinación de secuencias de cadena ligera y pesada seleccionadas de:

a. SEQ ID NO.54 y 56; y

b. SEQ ID NO.58 y 60.

7. La proteína de unión a antígeno de las reivindicaciones 1-6, en donde la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo.

8. La proteína de unión a antígeno de las reivindicaciones 1-6, en donde la proteína de unión a antígeno comprende un fragmento de anticuerpo.

9. Uno o más ácidos nucleicos aislados que codifican la proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Uno o más vectores de expresión que comprenden el ácido o ácidos nucleicos de la reivindicación 9.

11. Una célula hospedadora que comprende el uno o más vectores de expresión de la reivindicación 10.

12. Un método para la preparación de una proteína de unión a antígeno, que comprende:

a. cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 11 en condiciones que permiten la expresión de la proteína de unión a antígeno; y

b. recuperar la proteína de unión a antígeno del cultivo.

13. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.

14. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composición farmacéutica de la reivindicación 13 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad mediante terapia.

15. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composición farmacéutica de la reivindicación 13 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoriacaracterizadapor la presencia de niveles elevados de TL1A en un paciente que lo necesite, en donde el método comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de la proteína de unión a antígeno o la composición farmacéutica.

16. La proteína de unión a antígeno o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la enfermedad inflamatoriacaracterizada porla presencia de niveles elevados de TL1A es la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la enfermedad de Crohn (EC) o la colitis ulcerosa (CU).

17. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composición farmacéutica de la reivindicación 13 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un paciente que lo necesite, en donde el método comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de la proteína de unión a antígeno o la composición farmacéutica y en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn (EC), colitis ulcerosa (CU), síndrome del intestino irritable (SII), síndrome de vejiga/cistitis intersticial, disfunción intestinal y urinaria, sepsis, uveítis, encefalomielitis, miastenia grave, síndrome de Sjogren (SS), esclerodermia, esclerosis múltiple (EM), fibrosis quística (FQ), inflamación en la enfermedad renal crónica (ERC), psoriasis (PSO), artritis psoriásica (APs), espondilitis anquilosante (EA), artritis reumatoide (AR), artritis reumatoide juvenil (ARJ), osteoartritis (OA), espondiloartropatía, colangitis esclerosante primaria, cirrosis biliar primaria, ateroesclerosis, esplenomegalia, inflamación en la enfermedad renal crónica (ERC), dermatitis atópica (DA), dermatitis eccematosa, dermatitis de contacto, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis lúpica (NL), lupus eritematoso cutáneo, tiroiditis autoinmunitaria, nefropatía por IgA, enfermedad renal diabética, vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ACAN), enfermedad de cambio mínimo (nefrosis lipoide), glomeruloesclerosis focal segmentaria (GEFS), fibrosis sistémica nefrogénica (FSN), dermopatía fibrosante nefrogénica, hepatitis colestásica fibrosante, fascitis eosinofílica (síndrome de Shulman), escleromixedema (mucinosis papular), esclerodermia, liquen escleroso y atrófico, lesión pulmonar inflamatoria, fibrosis pulmonar idiopática, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), hipersensibilidad de las vías respiratorias, bronquitis crónica, asma alérgica, eccema, infección porHelicobacter pylori, adherencias intraabdominales y/o abscesos como resultado de inflamación peritoneal, síndrome nefrótico, polineuropatía desmielinizante idiopática, síndrome de Guillain-Barré, rechazo de trasplante, rechazo de aloinjerto de órgano, enfermedad de injerto contra hospedador (EICH), nefropatía por IgA, enfermedad renal diabética, diabetes mellitus, enfermedad de cambio mínimo (nefrosis lipoide), fibrosis sistémica nefrogénica (FSN), dermopatía fibrosante nefrogénica, hepatitis colestásica fibrosante, fascitis eosinofílica (síndrome de Shulman), escleromixedema (mucinosis papular), esclerodermia, liquen escleroso y atrófico, enfermedad de Takatsuki (síndrome PEP), síndrome nefrótico, síndrome POEMs, síndrome de Crow-Fukase, síndrome nefrótico, anticuerpos antineutrófilos citoplasmáticos, vasculitis, arteritis de células gigantes y enfermedad ósea lítica inducida por mieloma múltiple, artritis inducida por la pared celular estreptocócica (PCE), gingivitis/periodontitis, queratitis estromal herpética, reestenosis por enteropatía sensible al gluten, enfermedad de Kawasaki, enfermedades renales inmunomediadas, cáncer y angiogénesis.